CN114181993B - 产生基于类泛素或泛素蛋白的生化工具的方法 - Google Patents
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- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
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Abstract
本发明提供了产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法，包括：在蛋白酶Lbpro的存在下，使成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体与甘氨酰化工具分子接触，从而获得所述用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
Description
技术领域
本发明涉及生化技术领域，具体地，涉及产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法。
背景技术
类泛素或泛素蛋白在机体的几乎全部生命过程中扮演重要角色，与包括新冠病毒在内的病毒免疫和逃逸过程息息相关。基于类泛素或泛素蛋白的生化工具的研究和开发为研究类泛素或泛素蛋白的相关功能、机制和活性分子调控过程提供了巨大帮助。然而，类泛素和泛素蛋白生化工具的传统制备方法存在产率低、杂质多、时间长的缺陷，这限制了对基于类泛素和泛素蛋白去修饰酶活性的病毒免疫和逃逸的致病机制和病理病因的深入研究。
因此，基于类泛素或泛素蛋白的生化工具有待进一步的开发。
发明内容
本发明旨在至少解决相关技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法，所述方法在室温下通过一步法即可在较短时间内以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
本发明在一些实施方案中提供了产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法。在本发明的实施方案中，所述方法包括：在蛋白酶Lbpro的存在下，使成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体与甘氨酰化工具分子接触，从而获得所述用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
根据本发明实施方案的方法，蛋白酶Lbpro特异性切割成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的C最末端两个甘氨酸前的肽键，从而形成Lbpro-成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的硫脂中间体；与此同时，该Lbpro-成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的硫脂中间体与甘氨酰化工具分子进行胺解反应，从而获得所述用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。所述方法通过一步法即可在较短时间内以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
另外，根据本发明实施方案的方法还可以具有如下附加技术特征：
在本发明的一些实施方案中，所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自：具有SEQ ID NO:2所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15、具有SEQ ID NO:3所示序列的成熟化类泛素蛋白NEDD8、具有SEQ ID NO:4所示序列的成熟化泛素Ub或具有SEQ ID NO:5所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15(C78S)突变体。由此，可以高效获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具，同时副产物少并且适用范围广。
在本发明的一些实施方案中，所述甘氨酰化工具分子选自Gly-PA、Gly-Br3、Gly-VME、Gly-Gly-AMC或Gly-Gly-Rho-Gly-Gly。由此，可以以较低成本方便地获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具，并且适用范围广。
在本发明的一些实施方案中，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至1000:1，优选地50:1至800:1，更优选地400:1至500:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-PA、Gly-Br3或Gly-VME。由此，可以提高胺解反应的效率，以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
在本发明的一些实施方案中，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至100:1，优选地50:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-Gly-AMC。由此，可以进一步提高胺解反应的效率，以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
在本发明的一些实施方案中，所所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至80:1，优选地40:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-Gly-Rho-Gly-Gly。由此，可以最大限度地提高胺解反应的效率，以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
在本发明的一些实施方案中，所述蛋白酶Lbpro与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为1:100至1:2000，任选地1:500至1:1000，其中所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自具有SEQ ID NO:2所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15或具有SEQID NO:5所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15(C78S)突变体。由此，可以提高蛋白酶对类泛素或泛素蛋白或其变体切割的特异性。
在本发明的一些实施方案中，所述蛋白酶Lbpro与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为1:20至1:30，优选地1:25，其中所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自具有SEQ ID NO:3所示序列的成熟化类泛素蛋白NEDD8或具有SEQ ID NO:4所示序列的成熟化泛素Ub。由此，可以进一步提高蛋白酶对类泛素或泛素蛋白或其变体切割的特异性和效率。
在本发明的一些实施方案中，所述方法在室温下进行，可选地，pH为7-9，优选为8.5。由此，可以便捷高效地获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
在本发明的一些实施方案中，所述方法在Tris-HCl或Tris-HCl:DMSO中进行，任选地Tris-HCl与DMSO的体积比为1:10至10:1、优选为1:5至5:1、更优选地为1:1。由此，可以促进反应体系的溶解度。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了相关技术中基于Intein合成法以ISG15为例的流程示意图。其中，五角星代表可以与相关去修饰酶进行反应的具有不同反应原理的官能团；黑体虚线框代表获得的生化工具；Mesna是美司钠，化学式为HS-(CH2)2-SO3Na。
图2显示了根据本发明实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法以ISG15为例的流程示意图。其中，五角星代表可以与相关去修饰酶进行反应的具有不同反应原理的官能团；黑体虚线框代表获得的生化工具。
图3显示了根据本发明实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法以ISG15为例的原理示意图。其中，五角星代表可以与相关去修饰酶进行反应的具有不同反应原理的官能团；黑体虚线框代表获得的生化工具；括号内是推测出的反应所经历的过渡态。
图4显示了根据本发明具体实施例的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法以ISG15-PA为例的流程示意图。
图5显示了根据本发明一个实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法过程中监测原料和产物的高效液相色谱图。
图6是利用根据本发明一个实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法获得的ISG15-PA的高效液相色谱图(6A)和质谱图(6B)。
图7是利用根据本发明一个实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法获得的ISG15-Br3的高效液相色谱图(7A)和质谱图(7B)。
图8是利用根据本发明一个实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法获得的ISG15-AMC的高效液相色谱图(8A)和质谱图(8B)。
图9是利用根据本发明一个实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法获得的ISG15(C78S)-VME的高效液相色谱图(9A)和质谱图(9B)。
图10是利用根据本发明一个实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法获得的ISG15-Rho-Gly-Gly的高效液相色谱图(10A)和质谱图(10B)。
图11是利用根据本发明一个实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法获得的Ub-PA的高效液相色谱图(11A)和质谱图(11B)。
图12是利用根据本发明一个实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法获得的Ub-AMC的高效液相色谱图(12A)和质谱图(12B)。
图13是利用根据本发明一个实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法获得的NEDD8-PA的高效液相色谱图(13A)和质谱图(13B)。
图14是利用根据本发明一个实施方案的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法获得的NEDD8-AMC的高效液相色谱图(14A)和质谱图(14B)。
图15显示了根据本发明实施例的ISG15、NEDD8和Ub序列的对比图。
具体实施方案
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
干扰素刺激基因15(ISG15，Interferon-Stimulated Gene15)编码的ISG15蛋白(如SEQ ID NO:1所示)是类泛素家族的一员，能够通过与泛素(Ub，Ubiquitin)类似的方式对底物蛋白进行翻译后修饰，进而参与外源性病原体入侵时宿主的免疫防御过程。具体地，在外源性病原体(例如细菌或病毒)的刺激下，免疫系统中的免疫细胞会释放大量干扰素，从而诱导下游基因的表达以进一步放大免疫信号传导。翻译出来的ISG15蛋白是一个含165个氨基酸的前体形式(即前体ISG15，pro-ISG15)，其在免疫激活下经过简单的蛋白酶加工而成熟化(即成熟(化)ISG15，mature ISG15)，即通过酶切掉C端的8个氨基酸而暴露甘氨酸(Gly，Glycine)可以继续进行共价修饰的活性位点。接着，与泛素化修饰过程类似，成熟ISG15的C端甘氨酸和活化酶E1的活性位点半胱氨酸形成高能硫酯键；被活化的ISG15接着转移到结合酶E2的半胱氨酸，同样以硫酯键的形式共价连接；最后在连接酶E3的作用下，ISG15修饰到底物蛋白上，其中成熟ISG15的C端甘氨酸的羧基和底物蛋白赖氨酸残基的ε-氨基形成异肽键。另一方面，ISG15的去修饰酶(例如USP18)能够将ISG15从被修饰的底物上水解下来(即，“去ISG15化”反应)，从而实现对ISG15修饰底物过程(即，“ISG化”反应，ISGylation)的反向调控。此外，近期研究发现一些病毒编码的蛋白酶也能催化“去ISG15化(DeISGylation)”反应来弱化宿主的免疫响应，例如新冠病毒的蛋白酶PLpro可以水解宿主免疫相关蛋白IRF3和MDA5上的ISG15化修饰而实现免疫逃逸。本领域技术人员可以理解的是，NEDD8和Ub在体内经历与上述相似的修饰化和去修饰化过程，并且在蛋白降解、DNA损伤修复等重要生理过程中发挥作用。
需要说明的是，在本文中“成熟(化)ISG15”与“ISG(1-157)”可互换使用。
鉴于ISG15和Ub的类泛素和泛素广泛参与了各种细胞进程，围绕类泛素和泛素生化事件的检测、酶学结构解析以及活性分子的筛选和评价成为了新兴研究。这一领域催生出一系列包括例如ISG15-PA和-AMC在内的生化工具，而这些生化工具又反过来大大促进了对类泛素和泛素相关功能的认知。例如ISG15-PA与USP18交联复合物的晶体结构阐释了USP18特异性水解ISG15修饰的分子机制(Nat.Struct.Mol.Biol.,24,2017)；ISG15-AMC对新冠病毒木瓜样蛋白酶PLpro(Papain-Like protease)抑制剂GRL-0617的抑制活性评价，为后续活性分子的开发建立了标准(Nature,587,2020)。然而，上述工具的获取主要依赖基于Intein法的蛋白合成策略和少量全合成的案例，具有产率低、杂质多、时间长的缺陷，限制了类泛素和泛素生化工具的发展和进一步应用。
需要解释的是，基于Intein法的蛋白合成策略，以ISG15为例，包括以下主要步骤：ISG15-Intein的表达、ISG15-美司钠硫脂的合成和ISG15生化工具的胺解(参见图1)。ISG15-intein的表达量较低，每升得到不超过20mg蛋白(分子量超过40kD，约0.5μmol)；而ISG15表达量很高，每升可以得到约50mg蛋白(分子量17kD，约3μmol)。从产率上看，ISG15-美司钠硫脂的合成产率为80％左右，ISG15生化工具的胺解法获取产率为50％左右，总产率不高于40％。从产量来看，每升培养基最终可以获得约0.5mg目标产物。从原料出发的反应耗时上来看，ISG15-美司钠硫脂的合成需要1天，ISG15生化工具的胺解法获取也需要1天，总计需要2天的反应时间。
本发明提出一种产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法，所述方法在室温下通过一步法即可在较短时间内以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。该方法包括：在蛋白酶Lbpro的存在下，使成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体与甘氨酰化工具分子接触，从而获得所述用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
本发明的发明人利用手足口病病毒编码的蛋白酶Lbpro(如SEQ ID NO:6)对成熟化ISG15蛋白C最末端两个甘氨酸前肽键的特异性切割活性，并利用化学合成的甘氨酰化工具分子胺解所形成的Lbpro～ISG15(1-155)硫脂中间体，由此该方法通过一步法即可在较短时间内以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
需要说明的是，Lbpro是一种木瓜样半胱氨酸蛋白酶，是手足口病病毒编码的14种成熟蛋白之一，既是一个对病毒自身蛋白翻译过程必要的蛋白酶，又是一个可以逃避宿主免疫响应的去泛素化蛋白酶。Lbpro可以水解成熟化类泛素ISG15、成熟化类泛素NEDD8和成熟化泛素Ub修饰的底物蛋白，并且与已知ISG去修饰酶切割ISG15与底物蛋白之间的异肽键不同，Lbpro特异性水解成熟化ISG15、成熟化NEDD8或成熟化泛素Ub C最末端两个甘氨酸前的肽键，产生例如由155个氨基酸残基组成的ISG15(1-155)(参见图3)。
具体地，Lbpro在水解具有157个氨基酸的成熟化ISG15蛋白时，Lbpro蛋白酶中作为活性位点的Cys会首先进攻ISG15(1-157)C最末端两个甘氨酸前的肽键，两个甘氨酸离去后形成活性较高的Lbpro～ISG15(1-155)硫脂中间体，其很容易自发水解产生ISG15(1-155)-COOH。然而，本发明发明人出乎意料的发现，在过量一级胺的存在下，Lbpro～ISG15(1-155)硫脂中间体会被竞争性胺解而生成新的酰胺键。在此过程中，甘氨酰化工具分子的化学基团与ISG15(1-155)的C端共价连接而获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具(参见图3)。
与传统基于Intein的合成策略相比，基于Lbpro方法合成类泛素或泛素蛋白生化工具的合成方法所需的反应步骤更少，也不需要较为复杂的Intein蛋白的转硫脂步骤和胺解步骤(参见图1)，由此在较短时间内以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
在具体实施方案中，所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自：具有SEQ IDNO:2所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15、具有SEQ ID NO:3所示序列的成熟化类泛素蛋白NEDD8、具有SEQ ID NO:4所示序列的成熟化泛素Ub或具有SEQ ID NO:5所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15(C78S)突变体。由此，可以高效获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具，同时副产物少并且适用范围广。
需要说明的是，成熟化泛素Ub和成熟化类泛素NEDD8的C末端序列与成熟化ISG15蛋白极为相似(如参见图15)，同样具有可以被Lbpro特异性切割的C最末端两个甘氨酸，因此基于前述相同的反应原理，可以利用上述方法合成出包括ISG15、NEDD8和Ub在内的多种生化工具，包括ISG15-PA、ISG15-Br3、ISG15(C78S)-VME和ISG15-AMC和ISG15-Rho-Gly-Gly。ISG15-Rho-Gly-Gly和ISG15-AMC可以用于新冠蛋白酶PLpro新骨架抑制剂的筛选和评价，其余ISG生化工具可以特异性交联ISG15去修饰酶。
进一步地，发明人发现，将ISG15蛋白中第78位存在的半胱氨酸Cys突变为丝氨酸可以进一步降低ISG15与甘氨酰化工具分子的交叉反应活性，从而使其与甘氨酰化工具分子(特别是Gly-VME)的胺解反应的效率更高，减少副反应。
在具体实施方案中，所述甘氨酰化工具分子选自Gly-PA、Gly-Br3、Gly-VME、Gly-Gly-AMC或Gly-Gly-Rho-Gly-Gly。由此，可以以较低成本方便地获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具，并且适用范围广。其中各个甘氨酰化工具分子的化学基团为：
需要说明的是，-PA、-VME和-Br3主要用于与去修饰酶活性位点进行交联，其各自的交联机理稍有不同，分别是1,2加成，1,4加成和亲核取代；而-AMC和-Rho分子主要用于去修饰酶的活性检测，由于其切割产物是游离态的AMC或Rho分子，具有灵敏的特定波长的荧光信号，因此被广泛用于活性分子的筛选。
在具体实施方案中，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至1000:1，优选地50:1至800:1，更优选地400:1至500:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-PA、Gly-Br3或Gly-VME。由此，可以提高胺解反应的效率，以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
在具体实施方案中，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至100:1，优选地50:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-Gly-AMC。由此，可以进一步提高胺解反应的效率，以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
在具体实施方案中，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至80:1，优选地40:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-Gly-Rho-Gly-Gly。由此，可以最大限度地提高胺解反应的效率，以高产率获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。在本发明的一个具体实例中，采用400-500倍的甘氨酰化工具分子时，几乎100％的成熟化ISG15转化为目标产物。
在具体实施方案中，所述蛋白酶Lbpro与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为1:100至1:2000，任选地1:500至1:1000，其中所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自具有SEQ ID NO:2所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15或具有SEQ ID NO:5所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15(C78S)突变体。由此，可以提高蛋白酶对类泛素或泛素蛋白或其变体切割的特异性。
在具体实施方案中，所述蛋白酶Lbpro与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为1:20至1:30，优选地1:25，其中所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自具有SEQ ID NO:3所示序列的成熟化类泛素蛋白NEDD8或具有SEQ ID NO:4所示序列的成熟化泛素Ub。由此，可以进一步提高蛋白酶对类泛素或泛素蛋白或其变体切割的特异性。
在具体实施方案中，所述方法在室温下进行，可选地，pH为7-9，优选为8.5。由此，可以便捷高效地获得用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
在具体实施方案中，所述方法在Tris-HCl或Tris-HCl:DMSO中进行，任选地Tris-HCl与DMSO的体积比为1:10至10:1、优选为1:5至5:1、更优选地为1:1。由此，可以促进反应体系的溶解度。
根据本发明实施方案提供的产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法相对于相关技术的基于Intein合成方法的优势体现在以下几个方面(参见表1)：从原料表达来看，ISG15的表达量为每升3μmol左右，是ISG-intein表达量的6倍；基于Lbpro的化学酶法是一步法反应，比Intein法少一步；从产率上看，小分子胺解产率超过95％，远高于Intein法的产率；从产量来看，每升培养基可以获得40mg左右的目标产物，比intein法高了近2个数量级；从反应耗时上看，由于Lbpro的高活性和高特异性，反应在2小时内即可完成，远小于intein法的2天。
需要特别指出的是，-PA、-VME和-Br3的合成所用到的小分子在水相中的溶解性能优良，投入400-500倍过量的分子后转化率即可达到95％以上，即使浓度降至50倍过量，反应的转化率依然有30％(副产物为水解产物)，远高于intein法。由于-AMC和-Rho工具在合成时用到了AMC和Rho分子的衍生物，在水相中的溶解度较差，需要置换为DMSO:Tris-HCl＝1:1(体积比)的反应体系，反应转化率为40％左右(副产物为水解产物)，仍然远高于intein法。
表1 本发明基于Lbpro的合成方法与基于Intein的合成方法的对比
需要特别说明的的是，对于Gly-AMC和Gly-Gly-Rho-Gly-Gly两个甘氨酰化工具分子，由于溶解性很差，因此利用基于Intein的合成方法合成目的工具分子的难度相对于其他工具分子更大，反应速度非常缓慢，而利用本发明提供的基于Lbpro的合成方法仍然可以在2小时内实现约40％的产率，弥补了相关技术中的缺陷。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下提供本发明的具体实施例，其目的在于解释说明书本发明的技术方案，而不以任何方式限制本发明技术的范围。
实施例1 蛋白表达和纯化
将转化有ISG15-His蛋白的大肠杆菌单克隆菌落挑取至10ml含有对应抗性的LB培养基中，将转化有ISG15(C78S)-His蛋白的大肠杆菌单克隆菌落挑取至10ml含有对应抗性的LB培养基中，将转化有Lbpro蛋白的大肠杆菌单克隆菌落挑取至另一个10ml含有对应抗性的LB培养基中，将转化有NEDD8蛋白的大肠杆菌单克隆菌落挑取至再另一个10ml含有对应抗性的LB培养基中，将转化有Ub蛋白的大肠杆菌单克隆菌落挑取至又另一个10ml含有对应抗性的LB培养基中。将上述5种菌液在37℃以220rpm摇动下孵育14-16小时，然后将孵育后的5种菌液各自按体积比1:100放大至5个1L含有对应抗性的新鲜LB培养基中，继续在37℃以220rpm摇动下继续孵育直到检测出菌液的OD600吸光值达到1.0，各自加入终浓度为400μM的IPTG并在16℃以220rpm摇动下继续孵育16小时，以诱导各个蛋白的原核表达。
对经过蛋白表达诱导的各个菌液进行离心，弃去上清后用裂解缓冲液(50mMTris-HCl，150mM NaCl，pH＝7.4)将所得菌体充分重悬(每1L LB培养基所得菌体重悬于20mL裂解缓冲液中)，然后使用超声破碎仪进行裂解。接下来，使用高速冷冻离心机对裂解后的菌液以13000rpm在4-8℃离心30分钟。对于ISG15-His、ISG15(C78S)-His和Lbpro，分别将离心后的上清液与镍柱进行孵育、清洗并用高浓度咪唑洗脱，从而分别得到经过纯化的ISG15-His蛋白溶液、ISG15(C78S)-His蛋白溶液和Lbpro蛋白溶液。对于Ub，按照100:1的体积比向将离心后的上清液加入高氯酸，以便沉淀出杂质蛋白。然后以13000rpm在4-8℃高速离心30分钟，收集上清液，从而得到经过纯化的Ub蛋白溶液。对于NEDD8，其表达形式为不溶性的包涵体，需要弃掉上清后用一定体积pH 8.0的8M尿素溶液将沉淀溶解，超声20分钟，然后以13000rpm在4-8℃高速离心30分钟，收集上清液，从而得到经过纯化的NEDD8蛋白溶液。
将上述各个经过初步纯化的蛋白溶液转移至对应的3000Da透析袋中，并置于透析缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH＝7.4)中透析12小时，然后更换新鲜透析缓冲液，再次透析12小时。然后，将各个经过透析的蛋白溶液用0.22μm的滤膜过滤，再用Superdex75 10/300GL的体积排阻色谱柱(GE Healthcare公司)进行分子筛分离，从而获得各个目标蛋白溶液。将每种目标蛋白溶液在液氮中快速冷冻后储存到-80℃冰箱中待用。
实施例2 合成ISG15-PA
示例2.1室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与2.24mg商业购买的Gly-PA分子(终浓度20mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 8的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入10μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度2μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-PA探针。120分钟时获得ISG15-PA探针的产率为：15％。
示例2.2室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与112mg商业购买的Gly-PA分子(终浓度1000mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 9的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入10μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度2μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-PA探针。120分钟时获得ISG15-PA探针的产率为：95％。
示例2.3室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与89.6mg商业购买的Gly-PA分子(终浓度800mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 7的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入10μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度2μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-PA探针。120分钟时获得ISG15-PA探针的产率为：95％。
示例2.4室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与5.6mg商业购买的Gly-PA分子(终浓度50mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入10μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度2μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-PA探针。120分钟时获得ISG15-PA探针的产率为：30％。
示例2.5室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与44.8mg商业购买的Gly-PA分子(终浓度400mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 7.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入10μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度2μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-PA探针。120分钟时获得ISG15-PA探针的产率为：85％。
示例2.6室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与56mg商业购买的Gly-PA分子(终浓度500mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入10μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度2μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-PA探针。120分钟时获得ISG15-PA探针的产率为：90％。
如图5所示，在0小时HPLC色谱图只能看到原料ISG15蛋白对应的色谱，随着时间的推移，越来越多的原料被消耗，而生成产物相应的越来越多，并且渐渐接近初始原料的量。
图6示出了示例2.6获得的ISG15-PA探针的高相液相色谱图和质谱图，其中色谱为单峰，质谱中产物的分子离子峰十分明显，杂质峰几乎不可见，证明产物纯度较高。
实施例3 合成ISG15-Br3
示例3.1室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与3.9mgGly-Br3分子(20mM，发明人实验室合成)在pH 8的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-Br3探针。120分钟时获得ISG15-Br3探针的产率为：15％。
示例3.2室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与195mgGly-Br3分子(1000mM，发明人实验室合成)在pH9的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-Br3探针。120分钟时获得ISG15-Br3探针的产率为：95％。
示例3.3室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与156mgGly-Br3分子(800mM，发明人实验室合成)在pH 7的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-Br3探针。120分钟时获得ISG15-Br3探针的产率为：95％。
示例3.4室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与9.75mgGly-Br3分子(50mM，发明人实验室合成)在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-Br3探针。120分钟时获得ISG15-Br3探针的产率为：30％。
示例3.5室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与78mgGly-Br3分子(400mM，发明人实验室合成)在pH 7.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-Br3探针。120分钟时获得ISG15-Br3探针的产率为：85％。
示例3.6室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与97.5mgGly-Br3分子(500mM，发明人实验室合成)在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-Br3探针。120分钟时获得ISG15-Br3探针的产率为：90％。
图7使出了示例3.6获得的ISG15-Br3探针的高相液相色谱图和质谱图，其中色谱为单峰，质谱中产物的分子离子峰十分明显，杂质峰几乎不可见，证明产物纯度较高。
实施例4 合成ISG15-AMC
预先将商业购买的Gly-Gly-AMC溶解在DMSO中，配制成饱和溶液。
室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与1ml商业购买的Gly-Gly-AMC分子(上述DMSO饱和溶液(约50mM)，毕得医药，货号BD636909-0.5g)在pH 8.5的条件下混合后(Tris-HCl:DMSO＝1:1)，并且加入10μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度2μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-AMC探针。120分钟时获得ISG15-AMC探针的产率为：40％。
图8使出了示例4获得的ISG15-AMC探针的高相液相色谱图和质谱图，其中色谱为单峰，质谱中产物的分子离子峰十分明显，杂质峰几乎不可见，证明产物纯度较高。
实施例5 合成ISG15(C78S)-VME
示例5.1室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15(C78S)-His蛋白溶液(1mM)与3.44mg Gly-VME分子(20mM，发明人实验室合成)在pH 8的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15(C78S)-VME探针。120分钟时获得ISG15(C78S)-VME探针的产率为：15％。
示例5.2室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15(C78S)-His蛋白溶液(1mM)与172mg Gly-VME分子(1000mM，发明人实验室合成)在pH 9的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15(C78S)-VME探针。120分钟时获得ISG15(C78S)-VME探针的产率为：95％。
示例5.3室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15(C78S)-His蛋白溶液(1mM)与137.6mg Gly-VME分子(800mM，发明人实验室合成)在pH 7的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15(C78S)-VME探针。120分钟时获得ISG15(C78S)-VME探针的产率为：95％。
示例5.4室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15(C78S)-His蛋白溶液(1mM)与8.6mg Gly-VME分子(50mM，发明人实验室合成)在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15(C78S)-VME探针。120分钟时获得ISG15(C78S)-VME探针的产率为：30％。
示例5.5室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15(C78S)-His蛋白溶液(1mM)与68.8mg Gly-VME分子(400mM，发明人实验室合成)在pH 7.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15(C78S)-VME探针。120分钟时获得ISG15(C78S)-VME探针的产率为：85％。
示例5.6室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15(C78S)-His蛋白溶液(1mM)与86mg的Gly-VME分子(500mM，发明人实验室合成)在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入5μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度1μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15(C78S)-VME探针。120分钟时获得ISG15(C78S)-VME探针的产率为：90％。
图9使出了示例5.6获得的ISG15(C78S)-VME探针的高相液相色谱图和质谱图，其中色谱为单峰，质谱中产物的分子离子峰十分明显，杂质峰几乎不可见，证明产物纯度较高。
实施例6 合成ISG15-Rho-Gly-Gly
预先将商业购买的Gly-Gly-Rho-Gly-Gly溶解在DMSO中，配制40mM的储液。
室温下，将1ml实施例1中获得的目标ISG15-His蛋白溶液(1mM)与1ml商业购买的Gly-Gly-Rho-Gly-Gly分子(上述40mM的储液，发明人实验室合成)在pH 8.5的条件下混合后(Tris-HCl:DMSO＝1:1)，并且加入10μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度2μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到ISG15-Rho-Gly-Gly探针。120分钟时获得ISG15-Rho-Gly-Gly探针的产率为：40％。
图10使出了示例6获得的ISG15-Rho-Gly-Gly探针的高相液相色谱图和质谱图，其中色谱为单峰，质谱中产物的分子离子峰十分明显，杂质峰几乎不可见，证明产物纯度较高。
实施例7 合成Ub-PA
示例7.1室温下，将1ml实施例1中获得的目标Ub蛋白溶液(1mM)与2.24mg商业购买的Gly-PA分子(20mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 8的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到Ub-PA探针。120分钟时获得Ub-PA探针的产率为：15％。
示例7.2室温下，将1ml实施例1中获得的目标Ub蛋白溶液(1mM)与112mg商业购买的Gly-PA分子(1000mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 9的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到Ub-PA探针。120分钟时获得Ub-PA探针的产率为：95％。
示例7.3室温下，将1ml实施例1中获得的目标Ub蛋白溶液(1mM)与89.6mg商业购买的Gly-PA分子(800mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 7的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到Ub-PA探针。120分钟时获得Ub-PA探针的产率为：95％。
示例7.4室温下，将1ml实施例1中获得的目标Ub蛋白溶液(1mM)与5.6mg商业购买的Gly-PA分子(50mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到Ub-PA探针。120分钟时获得Ub-PA探针的产率为：30％。
示例7.5室温下，将1ml实施例1中获得的目标Ub蛋白溶液(1mM)与44.8mg商业购买的Gly-PA分子(400mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 7.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到Ub-PA探针。120分钟时获得Ub-PA探针的产率为：85％。
示例7.6室温下，将1ml实施例1中获得的目标Ub蛋白溶液(1mM)与56mg商业购买的Gly-PA分子(500mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到Ub-PA探针。120分钟时获得Ub-PA探针的产率为：90％。
图11使出了示例7.6获得的Ub-PA探针的高相液相色谱图和质谱图，其中色谱为单峰，质谱中产物的分子离子峰十分明显，杂质峰几乎不可见，证明产物纯度较高。
实施例8 合成Ub-AMC
预先将商业购买的Gly-Gly-AMC溶解在DMSO中，配制成饱和溶液。
室温下，将1ml实施例1中获得的目标Ub蛋白溶液(1mM)与1ml商业购买的Gly-Gly-AMC分子(上述DMSO饱和溶液(约50mM)，毕得医药，货号BD636909-0.5g)在pH 8.5的条件下混合后(Tris-HCl:DMSO＝1:1)，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到Ub-AMC探针。120分钟时获得Ub-AMC探针的产率为：40％。
图12使出了示例8获得的Ub-AMC探针的高相液相色谱图和质谱图，其中色谱为单峰，质谱中产物的分子离子峰十分明显，杂质峰几乎不可见，证明产物纯度较高。
实施例9 合成NEDD8-PA
示例9.1室温下，将1ml实施例1中获得的目标NEDD8蛋白溶液(1mM)与2.24mg商业购买的Gly-PA分子(20mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 8的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到NEDD8-PA探针。120分钟时获得NEDD8-PA探针的产率为：15％。
示例9.2室温下，将1ml实施例1中获得的目标NEDD8蛋白溶液(1mM)与112mg商业购买的Gly-PA分子(1000mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 9的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到NEDD8-PA探针。120分钟时获得NEDD8-PA探针的产率为：95％。
示例9.3室温下，将1ml实施例1中获得的目标NEDD8蛋白溶液(1mM)与89.6mg商业购买的Gly-PA分子(800mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 7的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到NEDD8-PA探针。120分钟时获得NEDD8-PA探针的产率为：95％。
示例9.4室温下，将1ml实施例1中获得的目标NEDD8蛋白溶液(1mM)与5.6mg商业购买的Gly-PA分子(50mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到NEDD8-PA探针。120分钟时获得NEDD8-PA探针的产率为：30％。
示例9.5室温下，将1ml实施例1中获得的目标NEDD8蛋白溶液(1mM)与44.8mg商业购买的Gly-PA分子(400mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 7.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到NEDD8-PA探针。120分钟时获得NEDD8-PA探针的产率为：85％。
示例9.6室温下，将1ml实施例1中获得的目标NEDD8蛋白溶液(1mM)与56mg商业购买的Gly-PA分子(500mM，毕得医药，货号BD01061797-1.5g)在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液和混合后，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到NEDD8-PA探针。120分钟时获得NEDD8-PA探针的产率为：90％。
图13使出了示例9.6获得的NEDD8-PA探针的高相液相色谱图和质谱图，其中色谱为单峰，质谱中产物的分子离子峰十分明显，杂质峰几乎不可见，证明产物纯度较高。
实施例10 合成NEDD8-AMC
预先将商业购买的Gly-Gly-AMC溶解在DMSO中，配制成饱和溶液。
室温下，将1ml实施例1中获得的目标NEDD8蛋白溶液(1mM)与1ml商业购买的Gly-Gly-AMC分子(上述DMSO饱和溶液(约50mM)，毕得医药，货号BD636909-0.5g)在pH 8.5的条件下混合后(Tris-HCl:DMSO＝1:1)，并且加入200μL(200μM)实施例1中获得的目标Lbpro蛋白溶液(终浓度约40μM)。通过HPLC高效液相色谱法(XBC4柱，流动相分别为含有1‰TFA的H2O和1‰TFA的乙腈，程序为乙腈浓度为30％-60％-30min)分别在0、30、60和120min的时间点监测反应进程，反应结束后通过半制备HPLC或离子交换色谱进行分离，可以通过梯度稀释复性得到或直接得到NEDD8-AMC探针。120分钟时获得NEDD8-AMC探针的产率为：40％。
图14使出了示例10获得的NEDD8-AMC探针的高相液相色谱图和质谱图，其中色谱为单峰，质谱中产物的分子离子峰十分明显，杂质峰几乎不可见，证明产物纯度较高。
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 清华大学
<120> 产生基于类泛素或泛素蛋白的生化工具的方法
<130> C1215509
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 165
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gly Trp Asp Leu Thr Val Lys Met Leu Ala Gly Asn Glu Phe Gln
1 5 10 15
Val Ser Leu Ser Ser Ser Met Ser Val Ser Glu Leu Lys Ala Gln Ile
20 25 30
Thr Gln Lys Ile Gly Val His Ala Phe Gln Gln Arg Leu Ala Val His
35 40 45
Pro Ser Gly Val Ala Leu Gln Asp Arg Val Pro Leu Ala Ser Gln Gly
50 55 60
Leu Gly Pro Gly Ser Thr Val Leu Leu Val Val Asp Lys Cys Asp Glu
65 70 75 80
Pro Leu Ser Ile Leu Val Arg Asn Asn Lys Gly Arg Ser Ser Thr Tyr
85 90 95
Glu Val Arg Leu Thr Gln Thr Val Ala His Leu Lys Gln Gln Val Ser
100 105 110
Gly Leu Glu Gly Val Gln Asp Asp Leu Phe Trp Leu Thr Phe Glu Gly
115 120 125
Lys Pro Leu Glu Asp Gln Leu Pro Leu Gly Glu Tyr Gly Leu Lys Pro
130 135 140
Leu Ser Thr Val Phe Met Asn Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly Thr Glu
145 150 155 160
Pro Gly Gly Arg Ser
165
<210> 2
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
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Val Ser Leu Ser Ser Ser Met Ser Val Ser Glu Leu Lys Ala Gln Ile
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100 105 110
Gly Leu Glu Gly Val Gln Asp Asp Leu Phe Trp Leu Thr Phe Glu Gly
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Lys Pro Leu Glu Asp Gln Leu Pro Leu Gly Glu Tyr Gly Leu Lys Pro
130 135 140
Leu Ser Thr Val Phe Met Asn Leu Arg Leu Arg Gly Gly
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<210> 3
<211> 76
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
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Ile Glu Pro Thr Asp Lys Val Glu Arg Ile Lys Glu Arg Val Glu Glu
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35 40 45
Gln Met Asn Asp Glu Lys Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ser Val Leu His Leu Val Leu Ala Leu Arg Gly Gly
65 70 75
<210> 4
<211> 76
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
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Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75
<210> 5
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ISG15(1-155)(C78S)
<220>
<221> VARIANT
<222> 78
<223> 成熟化ISG15的C78S突变体
<400> 5
Met Gly Trp Asp Leu Thr Val Lys Met Leu Ala Gly Asn Glu Phe Gln
1 5 10 15
Val Ser Leu Ser Ser Ser Met Ser Val Ser Glu Leu Lys Ala Gln Ile
20 25 30
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Pro Ser Gly Val Ala Leu Gln Asp Arg Val Pro Leu Ala Ser Gln Gly
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Leu Gly Pro Gly Ser Thr Val Leu Leu Val Val Asp Lys Ser Asp Glu
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Pro Leu Ser Ile Leu Val Arg Asn Asn Lys Gly Arg Ser Ser Thr Tyr
85 90 95
Glu Val Arg Leu Thr Gln Thr Val Ala His Leu Lys Gln Gln Val Ser
100 105 110
Gly Leu Glu Gly Val Gln Asp Asp Leu Phe Trp Leu Thr Phe Glu Gly
115 120 125
Lys Pro Leu Glu Asp Gln Leu Pro Leu Gly Glu Tyr Gly Leu Lys Pro
130 135 140
Leu Ser Thr Val Phe Met Asn Leu Arg Leu Arg Gly Gly
145 150 155
<210> 6
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Glu Leu Thr Leu Tyr Asn Gly Glu Lys Lys Thr Phe Tyr Ser Arg Pro
1 5 10 15
Asn Asn His Asp Asn Cys Trp Leu Asn Ala Ile Leu Gln Leu Phe Arg
20 25 30
Tyr Val Glu Glu Pro Phe Phe Asp Trp Val Tyr Ser Ser Pro Glu Asn
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Phe Leu Lys Gly Gln Glu His Ala Val Phe Ala Cys Val Thr Ser Asn
115 120 125
Gly Trp Tyr Ala Ile Asp Asp Glu Asp Phe Tyr Pro Trp Thr Pro Asp
130 135 140
Pro Ser Asp Val Leu Val Phe Val Pro Tyr Asp Gln Glu Pro Leu Asn
145 150 155 160
Gly Glu Trp Lys Ala Lys
165
Claims (20)
1.一种产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法，其特征在于，在蛋白酶Lbpro的存在下，使成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体与甘氨酰化工具分子接触，从而获得所述用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具，
其中所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至1000:1，
其中所述蛋白酶Lbpro的序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自：具有SEQ ID NO:2所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15、具有SEQ ID NO:3所示序列的成熟化类泛素蛋白NEDD8、具有SEQ ID NO:4所示序列的成熟化泛素Ub或具有SEQ ID NO:5所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15(C78S)突变体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子选自Gly-PA、Gly-Br3、Gly-VME、Gly-Gly-AMC或Gly-Gly-Rho-Gly-Gly。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为50:1至800:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-PA、Gly-Br3或Gly-VME。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为400:1至500:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-PA、Gly-Br3或Gly-VME。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至100:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-Gly-AMC。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为50:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-Gly-AMC。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至80:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-Gly-Rho-Gly-Gly。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为40:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-Gly-Rho-Gly-Gly。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶Lbpro与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为1:100至1:2000，其中所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自具有SEQ ID NO:2所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15或具有SEQID NO:5所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15(C78S)突变体。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶Lbpro与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为1:500至1:1000，其中所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自具有SEQ ID NO:2所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15或具有SEQID NO:5所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15(C78S)突变体。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶Lbpro与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为1:20至1:30，其中所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自具有SEQ ID NO:3所示序列的成熟化类泛素蛋白NEDD8或具有SEQ IDNO:4所示序列的成熟化泛素Ub。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶Lbpro与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为1:25，其中所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自具有SEQ ID NO:3所示序列的成熟化类泛素蛋白NEDD8或具有SEQ ID NO:4所示序列的成熟化泛素Ub。
14.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在室温下进行。
15.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在pH为7-9下进行。
16.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在pH为8.5下进行。
17.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在Tris-HCl或Tris-HCl:DMSO中进行。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl与所述DMSO的体积比为1:10至10:1。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl与所述DMSO的体积比为1:5至5:1。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl与所述DMSO的体积比为1:1。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US6159721A (en) * | 1997-08-20 | 2000-12-12 | Hercules Incorporated | Amine modified polysaccharides |
| CN112062817A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-12-11 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | Lpro蛋白的新用途以及FMDV L基因缺失突变毒株的应用 |
-
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- 2021-11-04 CN CN202111301856.9A patent/CN114181993B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6159721A (en) * | 1997-08-20 | 2000-12-12 | Hercules Incorporated | Amine modified polysaccharides |
| CN112062817A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-12-11 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | Lpro蛋白的新用途以及FMDV L基因缺失突变毒株的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Specific and Covalent Targeting of Conjugating and Deconjugating Enzymes of Ubiquitin-Like Proteins;Joris Hemelaar等;《MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY》;第24卷(第1期);第86页左栏第1-2段以及第87页图1A * |
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