CN106496321B - 一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因工程新药‑重组人卵泡抑素蛋白的高效纯化方法。一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法，该方法包括（1）菌体超声裂解，包涵体经过洗涤，用6M盐酸胍助溶；（2）利用6His标签，进行镍柱亲和层析；（3）利用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析，得到高纯度重组人卵泡抑素蛋白。本发明纯化蛋白得率高，蛋白纯度高，具有步骤简单，经济实用，便于大规模生产纯化的特点。

Description

一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种基因工程新药-重组人卵泡抑素蛋白的高效纯化方法。
背景技术
卵泡抑素（Follistatin）是1987年由Robertson和Ueno分别从牛和猪的卵泡液中分离出的一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽，对卵泡刺激素有较强的抑制作用。卵泡抑素分布较为广泛，在不同组织中均能检测到卵泡抑素。卵泡抑素（Follistatin）作为Activin的结合蛋白，它可以通过Activin/ Follistatin系统来调节动物的生殖活动。近年来的实验表明，卵泡抑素可以通过其作用系统，参与机体多种生理机能的调节，对卵巢颗粒细胞分化、胚胎发育、红细胞生成和成骨细胞功能的调节均起重要的作用，具有重要的生物学意义。
卵泡抑素（Follistatin）可用于治疗肌肉疾病和病症，尤其是肌肉组织的增加将有利于治疗的疾病，也可用于治疗与代谢、脂肪组织及骨变性相关的疾病和病症。
利用基因工程发酵方法，表达重组人卵泡抑素蛋白，表达量较高，但是由于蛋白疏水性较高，含丰富的二硫键，蛋白多为包涵体形式存在。本发明提供了一种高效的纯化工艺，可以得到高纯度的重组人卵泡抑素蛋白。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法，该方法纯化得率高，蛋白纯度高，纯化工艺简单。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法，该方法包括以下的步骤：
1）菌体破碎：从低温冰箱中取出冻存的菌体，敲碎成小块，加入菌体重量10~50倍体积的10~30mM PB溶液，并加入终浓度20~30mg/L的溶菌酶，用机械搅拌器搅拌0.5~2小时；在冰浴条件下，分批次用超声波破碎仪进行破碎菌体，确保破碎后的液体不再粘稠；用大容量冷冻高速离心机，6000~8000rpm/min，1~5℃离心10~30分钟，去掉上清液体，沉淀为包涵体蛋白即粗制重组人卵泡抑素蛋白；
2）包涵体洗涤、溶解：上述包涵体蛋白用洗涤溶液去除杂质；包涵体蛋白经过洗涤后用助溶溶液助溶包涵体蛋白，按原始菌体重量:溶液体积=1:3~10的比例溶解，磁力搅拌器室温搅拌3~6小时或者1~5℃搅拌过夜；用大容量冷冻高速离心机，6000~8000rpm/min，1~5℃离心5~20分钟，收集上清即为重组人卵泡抑素蛋白裂解液；
3）重组蛋白粗纯化：将重组人卵泡抑素蛋白裂解液通过镍亲和层析柱，用包含咪唑的缓冲液进行清洗，最终洗脱的为重组蛋白粗制品；
4）重组蛋白精细纯化：将重组蛋白粗制品通过DEAE Sepharose阴离子交换柱和Q-Sepharose阴离子交换柱，用包含Nacl的缓冲液进行清洗，最终洗脱的为重组蛋白精制品。
作为优选，所述的步骤2）中洗涤溶液含有2M 尿素、0.5mM Nacl、1% Triton-100的20mM PB（pH8.0）；洗涤溶液分三次洗涤包涵体蛋白。
作为优选，所述的步骤2）中助溶溶液含有6M盐酸胍，2mM DTT的20mM PB（pH8.0）。
作为优选，所述的步骤3）中镍亲和层析柱用含8M尿素、0.5mM DTT的20mM PB（pH8.0）平衡缓冲液平衡层析柱，以80cm/h线速度平衡2个柱体积后，保持pH值、UV、电导率基线平稳。
作为优选，所述的步骤3）中重组人卵泡抑素蛋白裂解液以30~50cm/h线速度上样，洗脱先用含25mM咪唑的缓冲液，以80cm/h的线速度洗脱杂蛋白，直到UV，电导率等基线平稳；再用含300mM咪唑的缓冲液，以40cm/h线速度洗脱蛋白。
作为优选，所述的步骤4）中用含8M尿素、1.0mM DTT的20mM PB（pH8.0）平衡缓冲液平衡DEAE Sepharose FF阴离子交换柱，以80cm/h线速度平衡2个柱体积后，保持pH值、UV、电导率基线平稳。
作为优选，所述的步骤4）中重组蛋白粗制品以40cm/h线速度上样DEAE Sepharose阴离子交换柱，先用含100mM Nacl的缓冲液，以80cm/h的线速度洗脱杂蛋白，直到UV，电导率等基线平稳，再用含150mM Nacl的缓冲液，以40cm/h线速度洗脱蛋白。
作为优选，所述的步骤4）中通过DEAE Sepharose阴离子交换柱后的重组人卵泡抑素蛋白，使用PALL超滤系统处理，再用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱纯化，用包含150mM NaCl的20mM PB缓冲液洗脱，收集重组人卵泡抑素蛋白。
本发明的重组人卵泡抑素蛋白的纯化工艺，包括：菌体破碎→包涵体洗涤、溶解→目的蛋白粗纯化→目的蛋白精细纯化。本发明的特点和优点有：
1.通过上述步骤得到的重组人卵泡抑素蛋白，经过高效液相色谱法检测，目的蛋白纯度＞98%；
2.生产工艺简单，产物收率高，生产成本低。
具体实施方式
本发明重组人卵泡抑素的高效纯化工艺：菌体破碎→包涵体洗涤、溶解→目的蛋白粗纯化→目的蛋白精细纯化。
具体过程如下：
1.菌体破碎：
1.1 从低温冰箱中取出冻存的菌体，敲碎成2立方厘米左右的小块，放入大烧杯中，加入菌体重量20倍体积的20mM PB溶液，并加入终浓度25mg/L的溶菌酶，用机械搅拌器搅拌1小时。
1.2 在冰浴条件下，分批次用超声波破碎仪进行破碎菌体，确保破碎后的液体不再粘稠。
1.3 用大容量冷冻高速离心机，7000rpm/min，4℃离心20分钟，去掉上清液体，沉淀为包涵体蛋白即粗制重组人卵泡抑素蛋白。
2.包涵体洗涤、溶解：
2.1 包涵体洗涤：上述包涵体蛋白包含较多杂质，须用包涵体洗涤液清洗。用含有2M 尿素、0.5mM Nacl、1% Triton-100的20mM PB（pH8.0）溶液悬浮包涵体蛋白，磁力搅拌至无大颗粒。用冷冻高速离心机，7000rpm/min，4℃离心20分钟后，弃上清液体。重复洗涤步骤3次。
2.2 包涵体溶解：包涵体蛋白经过洗涤，去除了大部分细胞壁碎片，脂蛋白，部分杂蛋白。大部分包涵体难溶于水，需用8M尿素或者6M盐酸胍助溶。按原始菌体重量:溶液体积=1:5的比例，用含有6M盐酸胍，2mM DTT的20mM PB（pH8.0）溶液助溶包涵体蛋白，磁力搅拌器室温搅拌4小时或者4℃搅拌过夜。
2.3 裂解液除杂：用大容量冷冻高速离心机，7000rpm/min，4℃离心20分钟，然后用0.45um滤膜过滤除去小颗粒杂质，收集上清即为重组人卵泡抑素蛋白裂解液。
3. 重组人卵泡抑素蛋白粗纯化
3.1 层析柱平衡：用含8M尿素、0.5mM DTT的20mM PB（pH8.0）平衡缓冲液平衡层析柱，以80cm/h线速度平衡2个柱体积后，保持pH值、UV、电导率基线平稳。
3.2 蛋白上样：过滤后的蛋白裂解液以40cm/h线速度上样，重组蛋白上带有6His，能特异性的与固定在凝胶上的镍结合，上样完毕用平衡缓冲液冲洗层析柱1个柱体积。
3.3 蛋白洗脱：先用含25mM咪唑的缓冲液，以80cm/h的线速度洗脱杂蛋白，直到UV，电导率等基线平稳。再用含300mM咪唑的缓冲液，以40cm/h线速度洗脱蛋白，分部收集，取样检测。
4. 重组人卵泡抑素蛋白的精纯化
从此步骤开始，所有配制缓冲溶液所需的水、无机盐试剂和相关容器需为无热源或医用级。
4.1 层析柱平衡：用含8M尿素、1.0mM DTT的20mM PB（pH8.0）平衡缓冲液平衡DEAESepharose FF阴离子交换柱，以80cm/h线速度平衡2个柱体积后，保持pH值、UV、电导率基线平稳。
4.2 蛋白上样：上述步骤3.3洗脱的蛋白溶液以40cm/h线速度上样，重组蛋白等电点为5.2，在pH8.0时带有负电荷，能特异性的与带正电荷的凝胶基团结合，上样完毕用平衡缓冲液冲洗层析柱1个柱体积。
4.3 蛋白洗脱：先用含100mM Nacl的缓冲液，以80cm/h的线速度洗脱杂蛋白，直到UV，电导率等基线平稳。再用含150mM Nacl的缓冲液，以40cm/h线速度洗脱蛋白，分部收集，取样检测。
4.4 将上一步骤收集得到的重组人卵泡抑素蛋白，使用PALL超滤系统处理，除去溶液中的盐分并适当缩小体积，再用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱纯化，用包含150mM NaCl的20mM PB缓冲液洗脱，收集重组人卵泡抑素蛋白，此步骤是为了进一步纯化目的蛋白并去除蛋白溶液中的内毒素。
收集的重组人卵泡抑素蛋白经过SDS-PAGE电泳显示目的条带为36KD，与预测分子量一致，条带单一无可见杂带；使用高效液相色谱分析，蛋白纯度达到98.45%。
本发明提供了一种高效纯化重组人卵泡抑素蛋白的工艺，蛋白纯度高，工艺步骤简单，蛋白得率高，可进行规模化生产。

Claims (5)

1.一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）菌体破碎：从低温冰箱中取出冻存的菌体，敲碎成小块，加入菌体重量10~50倍体积的10~30mM PB溶液，并加入终浓度20~30mg/L的溶菌酶，用机械搅拌器搅拌0.5~2小时；在冰浴条件下，分批次用超声波破碎仪进行破碎菌体，确保破碎后的液体不再粘稠；用大容量冷冻高速离心机，6000~8000rpm/min，1~5℃离心10~30分钟，去掉上清液体，沉淀为包涵体蛋白即粗制重组人卵泡抑素蛋白；
2）包涵体洗涤、溶解：上述包涵体蛋白用洗涤溶液去除杂质；包涵体蛋白经过洗涤后用助溶溶液助溶包涵体蛋白，按原始菌体重量：溶液体积=1：3~10的比例溶解，磁力搅拌器室温搅拌3~6小时或者1~5℃搅拌过夜；用大容量冷冻高速离心机，6000~8000rpm/min，1~5℃离心5~20分钟，然后用滤膜过滤出去小颗粒杂质，收集上清即为重组人卵泡抑素蛋白裂解液；
3）重组蛋白粗纯化：将重组人卵泡抑素蛋白裂解液通过镍亲和层析柱，用包含咪唑的缓冲液进行清洗，最终洗脱的为重组蛋白粗制品，重组蛋白上带有6His标签；
4）重组蛋白精细纯化：用含8M尿素、1.0mM DTT的pH8.0的20mM PB平衡缓冲液平衡DEAESepharose FF阴离子交换柱，以80cm/h线速度平衡2个柱体积后，保持pH值、UV、电导率基线平稳；重组蛋白粗制品以40cm/h线速度上样DEAE Sepharose阴离子交换柱，上样完毕用平衡缓冲液冲洗层析柱1个柱体积；先用含100mM NaCl的缓冲液，以80cm/h的线速度洗脱杂蛋白，直到UV，电导率等基线平稳；再用含150mM NaCl的缓冲液，以40cm/h线速度洗脱蛋白；再使用PALL超滤系统处理，最后用Q- Sepharose阴离子交换柱纯化，用包含150mM NaCl的20mM PB缓冲液进行清洗，最终洗脱的为重组蛋白精制品。
2.根据权利要求1所述的一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法，其特征在于步骤2）中洗涤溶液含有2M尿素、0.5mM NaCl、1% Triton-100的pH8.0的20mM PB；洗涤溶液分三次洗涤包涵体蛋白。
3. 根据权利要求1或2所述的一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法，其特征在于步骤2）中助溶溶液含有6M盐酸胍，2mM DTT的pH8.0的20mM PB。
4. 根据权利要求1所述的一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法，其特征在于步骤3）中镍亲和层析柱用含8M尿素、0.5mM DTT的pH8.0的20mM PB平衡缓冲液平衡层析柱，以80cm/h线速度平衡2个柱体积后，保持pH值、UV、电导率基线平稳。
5.根据权利要求1或4所述的一种重组人卵泡抑素蛋白的纯化方法，其特征在于步骤3）中重组人卵泡抑素蛋白裂解液以30~50cm/h线速度上样，洗脱先用含25mM咪唑的缓冲液，以80cm/h的线速度洗脱杂蛋白，直到UV，电导率等基线平稳；再用含300mM咪唑的缓冲液，以40cm/h线速度洗脱蛋白。
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