CN102920992A - 注射用重组卵泡抑素制剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了注射用重组卵泡抑素制剂配方和制备工艺，每支制剂含：a)1.0-5.0mg重组卵泡抑素的冻干粉；b)1％-5％甘露醇；c)0.2％-1％甘氨酸。本发明还公开了上述制剂的制备方法及该制剂的用途。本发明具有表达量高，活性高，纯化工艺简单等优点。

Description

注射用重组卵泡抑素制剂及制备方法

技术领域

本发明涉及卵泡抑素，尤其涉及一种注射用重组卵泡抑素制剂及其制备方法。

背景技术

卵泡抑素(Follistatin)是1987年由Robertson和Ueno分别从牛和猪的卵泡液中分离出的一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽，对卵泡刺激素有较强的抑制作用。卵泡抑素分布较为广泛，在不同组织中均能检测到卵泡抑素。目前发现卵泡抑素至少有32KD，35KD，39KD三种不同的分子形式。

卵泡抑素(Follistatin)作为Activin的结合蛋白，它可以通过Activin/Follistatin系统来调节动物的生殖活动。近年来的实验表明，卵泡抑素可以通过其作用系统，参与机体多种生理机能的调节，对卵巢颗粒细胞分化、胚胎发育、红细胞生成和成骨细胞功能的调节均起重要的作用，具有重要的生物学意义。

卵泡抑素(Follistatin)可用于治疗肌肉疾病和病症，尤其是肌肉组织的增加将有利于治疗的疾病，也可用于治疗与代谢、脂肪组织及骨变性相关的疾病和病症。

发明内容

本发明解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种表达量高、活性高、纯化工艺简单的重组卵泡抑素制备工艺；以及一种不含保护剂和防腐剂、有效期长的注射用重组卵泡抑素制剂配方。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种注射用重组卵泡抑素制剂，所述制剂包含：

重组卵泡抑素的冻干粉、甘露醇、甘氨酸。

根据上述的制剂，优选的，所述制剂以每支计算包含：

1.0-5.0mg重组卵泡抑素的冻干粉；

1％-5％重量百分比的甘露醇；

0.2％-1％重量百分比的甘氨酸。

根据上述的制剂，优选的，所述制剂以每支计算包含：

2mg±0.2mg重组卵泡抑素的冻干粉；

1％重量百分比的甘露醇；

0.2％重量百分比的甘氨酸。

本发明的目的还通过以下技术方案实现的：

上述的制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(A1)建立菌种库：

取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，并在恒温箱培养，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，振荡若干时间，取菌液和等量灭菌甘油混匀，分装并保存；传代若干次后，菌种应重新激活培养保存；

(A2)种子液培养；从保存的菌种管子用接种环在kan抗性LB平板上划线，培养若干时间，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至OD600为0.4-0.8之间；

(A3)发酵培养；

在发酵培养基中培养，并以一定速度补料，当OD600为7-12时，加入IPTG诱导剂，继续发酵培养若干时间后，终止培养；

(A4)收集和破碎菌体；

收集菌体：诱导完的菌液用离心机离心；

破碎菌体：将离心后菌体用缓冲液悬浮均匀，使用细胞破碎机进行碎菌，再用离心机离心，收集上清液，即粗制重细卵泡抑素蛋白溶液；

(A5)目的蛋白纯化：

将所述上清液通过亲和层析柱，用包含不同浓度咪唑的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白粗制品；

再通过阴离子交换柱，用包含不同浓度Nacl的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白精制品；

(A6)浓缩半成品：

通过过滤系统去除多余的盐和水，将液体浓缩至合适的体积，加入1-5％甘露醇和0.2-1％甘氨酸，混合均匀后过滤，即制成重组卵泡抑素半成品；

(A7)冷冻干燥：

将所述重组卵泡抑素半成品稀释，分装于西林瓶中，在冷冻干燥机上进行冻干处理若干时间，最后进行压盖、封口处理。

根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(A1)进一步包括如下步骤：

(B1)菌种进行以下鉴定，鉴定合格后投入生产：

形态特征观察：将所述菌种划线于kan抗性的LB平板，并培养，观察菌种克隆是否具有大肠杆菌典型的形状特征，是否有杂菌生长；

表达量检测：挑取单克隆菌，接种于1-3ml含kan的LB液体培养基，30-45℃摇床振荡1-5小时，检测OD600为0.4-0.6时，加入IPTG诱导，继续振荡3-4小时后收菌，经过SDS-PAGE检测蛋白表达量；

质粒检查：抽取质粒DNA，用限制性内切酶双酶切，检查酶切图谱与原始酶切图谱是否一致。

根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A1)进一步包括以下步骤：

从-70℃冰箱取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，37℃恒温箱培养16小时，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，37℃摇床振荡12小时，取菌液和等量30％灭菌甘油混匀，使甘油终浓度为15％。用灭菌后的1.5ml EP管分装数管，保存于-70℃冰箱。传代3次后，菌种应重新激活培养保存。

根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A2)进一步包括以下步骤：

从保存的菌种管子用接种环在kan抗性LB平板上划线，在37℃培养16小时，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至OD600为0.4-0.8之间，即可用来接种发酵培养使用。

根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A3)中，发酵培养基配方为：

酵母提取物(Yeast)  5g/L

蛋白胨(Typtone)    10g/L

氯化钠(NaCl)       10g/L

补料培养基配方为：

酵母提取物(Yeast)  50g/L

蛋白胨(Typtone)    100g/L

甘油(glycerole)    50g/L；

发酵条件：37℃培养，以200ml/小时速度补料，当OD600为7-12时，加入IPTG诱导剂，浓度为0.5mM，继续发酵培养4小时后，终止培养。

根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A4)中，诱导完的菌液用大容量冷冻高速离心机，5000rpm/min，4℃离心10分钟，收集菌体；

破碎菌体：将离心后菌体，用1xPBS、pH7.4缓冲液悬浮均匀，冰浴条件下使用超声波细胞破碎机进行碎菌，20分钟后，用大容量冷冻高速离心机，10000rpm/min，4℃离心10分钟，收集上清即为粗制重组卵泡抑素蛋白溶液。

根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A5)中，

重组蛋白粗纯化：将粗制的重组蛋白通过镍离子亲和层析柱，用包含不同浓咪唑的缓冲液进行清洗，最终洗脱的为重组蛋白粗制品；

重组蛋白精细纯化：将重组蛋白粗制品通过Q-Sepharose阴离子交换柱，用包含不同浓度Nacl的缓冲液进行清洗，最终洗脱的为重组蛋白精制品。

根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A6)中，

超滤浓缩半成品：将重组蛋白精制品通过Millipore超滤系统，去除多余的盐和水，将液体浓缩至合适的体积，加入1％甘露醇和0.2％甘氨酸，混合均匀后用0.22um过滤器过滤，即制成重组卵泡抑素半成品。

根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A7)中，

分装，冷冻干燥：将重组卵泡抑素半成品稀释成合适的浓度，分装于3ml西林瓶中，每瓶1ml液体，随后在冷冻干燥机上进行冻干处理，整个升温过程不超过30℃，24小时后冻干结束，进行压盖，封口处理。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、得到的重组卵泡抑素纯度＞95％，每一剂量所含重组卵泡抑素为2mg左右，是因为临床最佳用量是50ug/kg；

2、得到的重组卵泡抑素比活性高，实验结果表明，比活性大于7000IU/mg；

3、生产工艺简单，产物收率高，生产成本低。

附图说明

参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：

图1本发明实施例1的制备方法的流程图。

具体实施方式

图1和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此，本发明并不局限于下述可选实施方式，而仅由权利要求和它们的等同物限定。

实施例1：

图1示意性地给出了本发明实施例的注射用重组卵泡抑素制剂制备方法的流程图，如图1所示，所述制备方法包括以下步骤：

(A1)建立菌种库：

取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，并在恒温箱培养，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，振荡若干时间，取菌液和等量灭菌甘油混匀，分装并保存；传代若干次后，菌种应重新激活培养保存；

(A2)种子液培养；从保存的菌种管子用接种环在kan抗性LB平板上划线，培养若干时间，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至OD600为0.4-0.8之间；

(A3)发酵培养；

在发酵培养基中培养，并以一定速度补料，当OD600为7-12时，加入IPTG诱导剂，继续发酵培养若干时间后，终止培养；

(A4)收集和破碎菌体；

收集菌体：诱导完的菌液用离心机离心；

破碎菌体：将离心后菌体用缓冲液悬浮均匀，使用细胞破碎机进行碎菌，再用离心机离心，收集上清液，即粗制重组卵泡抑素蛋白溶液；

(A5)目的蛋白纯化：

将所述上清液通过亲和层析柱，用包含不同浓度咪唑的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白粗制品；

再通过阴离子交换柱，用包含不同浓度Nacl的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白精制品；

(A6)浓缩半成品：

通过过滤系统去除多余的盐和水，将液体浓缩至合适的体积，加入1-5％甘露醇和0.2-1％甘氨酸，混合均匀后过滤，即制成重组卵泡抑素半成品；

(A7)冷冻干燥：

将所述重组卵泡抑素半成品稀释，分装于西林瓶中，在冷冻干燥机上进行冻干处理若干时间，最后进行压盖、封口处理。

上述制备方法制得的注射用重组卵泡抑素制剂，所述制剂包含：

重组卵泡抑素的冻干粉、甘露醇、甘氨酸。优选的，所述制剂以每支计算包含：1.0-5.0mg重组卵泡抑素的冻干粉；

1％-5％重量百分比的甘露醇；

0.2％-1％重量百分比的甘氨酸。

实施例2：

根据实施例1所述的制剂及制备方法的应用例，在该应用例中，所述制备方法具体过程为：

(A1)菌种库的建立：

从-70℃冰箱取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，37℃恒温箱培养16小时，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，37℃摇床振荡12小时，取菌液和等量30％灭菌甘油混匀，使甘油终浓度为15％。用灭菌后的1.5ml EP管分装数管，保存于-70℃冰箱。传代3次后，菌种应重新激活培养保存。

每批生产菌种应进行以下鉴定后，鉴定合格后防可投入生产，具体方式为：

形态特征观察：将上述菌种划线于kan抗性的LB平板，37℃培养16小时后，观察菌种克隆是否具有大肠杆菌典型的形状特征，是否有杂菌生长。

表达量检测：挑取单克隆菌，接种于2ml含kan的LB液体培养基，37℃摇床振荡3小时，检测OD600为0.4-0.6时，加入IPTG诱导，继续振荡3-4小时后收菌，经过SDS-PAGE检测蛋白表达量。

质粒检查：抽取质粒DNA，用限制性内切酶双酶切，检查酶切图谱与原始酶切图谱是否一致。

(A2)种子液培养：从保存的生产菌种，接种于含有kan抗性的LB平板上，37℃培养16小时后，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至OD600为0.4之间，即可用来接种发酵培养使用。

(A3)发酵培养：

3.1发酵用培养基成份

3.1.1基础发酵培养基溶液(1升)

酵母提取物(Yeast)   5g

蛋白胨(Typtone)     10g

氯化钠(NaCl)        10g

3.1.2补料培养基溶液(1升)

酵母提取物(Yeast)   50g

蛋白胨(Typtone)     100g

甘油(glycerole)     50g

3.2发酵罐的灭菌和种子液的接种

往10L发酵罐中加入6升基础发酵培养基，蒸汽灭菌，121℃维持20分钟，冷却发酵罐温度到发酵温度后，再按1∶10接入种子液。

发酵条件

发酵温度和时间：37℃培养，以200ml/小时的速度添加补料培养基，当OD600为7时，加入IPTG诱导剂，浓度为0.5mM，继续发酵培养4小时后，终止发酵培养。

培养基总量：约7升

通气量：保持发酵液中溶氧大于40％

搅拌速度：250rpm

酸碱度：6.5-7.0

发酵要求：整个发酵过程必须无菌操作，发酵完毕，必须清洗发酵罐内壁和搅拌器。

(A4)收集菌体：发酵终止后，放出菌液，在大型冷冻离心机上以5000rpm/min，4℃离心10分钟，收集菌体，离心上清液舍弃，将湿菌体称重，-20℃保存。

菌体破碎：取湿菌体，用1xPBS缓冲液按1∶10比例悬浮(菌体与缓冲液比例为1∶20)，冰浴条件下用超声波细胞破碎仪进行破菌，10000rpm/min，4℃离心20分钟，收集上清即为可溶的卵泡抑素蛋白粗制品溶液。

(A5)重组卵泡抑素蛋白的分离纯化：

卵泡抑素蛋白粗制品的制备及初步纯化：菌体裂解后，10000rpm/min，4℃离心20分钟，收集上清即为可溶的卵泡抑素粗制品。将卵泡抑素蛋白粗制品通过Ni离子层析柱结合蛋白，再用含有不同浓度咪唑的缓冲液处理，去除大部分杂蛋白，得到初步纯化的卵泡抑素蛋白。

卵泡抑素蛋白粗制品的精细纯化：从此步骤开始，所有配制缓冲溶液所需的水、无机盐试剂和相关容器需为无热源或医用级。将上一步骤得到的初步纯化的卵泡抑素蛋白，经过平板超滤系统处理，除去溶液中的盐分并适当缩小体积，再用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱纯化，用包含0.5M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液洗脱，收集卵泡抑素蛋白，此步骤是为了进一步纯化目的蛋白并去除蛋白溶液中的内毒素。

(A6)超滤浓缩半成品：将Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱洗脱得到的蛋白溶液，用Millipore超滤浓缩系统，去除多余的盐和水，将蛋白溶液浓缩至合适的体积，加入1％甘露醇和0.2％甘氨酸，混合均匀后用0.22um过滤器过滤，即制成重组卵泡抑素半成品。

(A7)分装，冷冻干燥：

将重组卵泡抑素半成品用超纯水稀释到浓度为2mg/ml，分装于3ml西林瓶中，每瓶1ml液体，随后在冷冻干燥机上进行冻干处理，整个升温过程不超过30℃，24小时后冻干结束，进行压盖，封口处理，保存于4℃。最终每支针剂含有2mg的重组卵泡抑素冻干粉，其余由20mg甘露醇和4mg甘氨酸组成，使用前用1ml注射用水溶解。分装，冻干，压盖，封口的处理的过程都必须在无菌条件下进行，冻干后的制品水份含量低于3％，同机一次冻干的制品作为一批。

根据上述制备方法制得的制剂，以每支计算包含：

2.0mg±0.2mg重组卵泡抑素的冻干粉；

1％重量百分比的甘露醇；

0.2％重量百分比的甘氨酸。

根据本发明实施例1达到的益处在于：得到的重组卵泡抑素纯度＞95％；得到的重组卵泡抑素比活性高，实验结果表面，比活性大于7000IU/mg；生产工艺简单，产物收率高，生产成本低。

实施例3：

根据实施例1所述的制剂及制备方法的应用例，在该应用例中，所述制备方法具体过程为：

(A1)菌种库的建立：

从-70℃冰箱取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，37℃恒温箱培养16小时，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，37℃摇床振荡12小时，取菌液和等量30％灭菌甘油混匀，使甘油终浓度为15％。用灭菌后的1.5ml EP管分装数管，保存于-70℃冰箱。传代3次后，菌种应重新激活培养保存。

每批生产菌种应进行以下鉴定后，鉴定合格后防可投入生产，具体方式为：

形态特征观察：将上述菌种划线于kan抗性的LB平板，37℃培养16小时后，观察菌种克隆是否具有大肠杆菌典型的形状特征，是否有杂菌生长。

表达量检测：挑取单克隆菌，接种于2ml含kan的LB液体培养基，37℃摇床振荡3小时，检测OD600为0.4-0.6时，加入IPTG诱导，继续振荡3-4小时后收菌，经过SDS-PAGE检测蛋白表达量。

质粒检查：抽取质粒DNA，用限制性内切酶双酶切，检查酶切图谱与原始酶切图谱是否一致。

(A2)种子液培养：从保存的生产菌种，接种于含有kan抗性的LB平板上，37℃培养16小时后，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至OD600为0.8之间，即可用来接种发酵培养使用。

(A3)发酵培养：

3.1发酵用培养基成份

3.1.1基础发酵培养基溶液(1升)

酵母提取物(Yeast)  5g

蛋白胨(Typtone)    10g

氯化钠(NaCl)       10g

3.1.2补料培养基溶液(1升)

酵母提取物(Yeast)  50g

蛋白胨(Typtone)    100g

甘油(glycerole)    50g

3.2发酵罐的灭菌和种子液的接种

往10L发酵罐中加入6升基础发酵培养基，蒸汽灭菌，121℃维持20分钟，冷却发酵罐温度到发酵温度后，再按1∶10接入种子液。

发酵条件

发酵温度和时间：37℃培养，以200ml/小时的速度添加补料培养基，当OD600为12时，加入IPTG诱导剂，浓度为0.5mM，继续发酵培养4小时后，终止发酵培养。

培养基总量：约7升

通气量：保持发酵液中溶氧大于40％

搅拌速度：250rpm

酸碱度：6.5-7.0

发酵要求：整个发酵过程必须无菌操作，发酵完毕，必须清洗发酵罐内壁和搅拌器。

(A4)收集菌体：发酵终止后，放出菌液，在大型冷冻离心机上以5000rpm/min，4℃离心10分钟，收集菌体，离心上清液舍弃，将湿菌体称重，-20℃保存。

菌体破碎：取湿菌体，用1xPBS缓冲液按1∶10比例悬浮(菌体与缓冲液比例为1∶20)，冰浴条件下用超声波细胞破碎仪进行破菌，10000rpm/min，4℃离心20分钟，收集上清即为可溶的卵泡抑素蛋白粗制品溶液。

(A5)重组卵泡抑素蛋白的分离纯化：

卵泡抑素蛋白粗制品的制备及初步纯化：菌体裂解后，10000rpm/min，4℃离心20分钟，收集上清即为可溶的卵泡抑素粗制品。将卵泡抑素蛋白粗制品通过Ni离子层析柱结合蛋白，再用含有不同浓度咪唑的缓冲液处理，去除大部分杂蛋白，得到初步纯化的卵泡抑素蛋白。

卵泡抑素蛋白粗制品的精细纯化：从此步骤开始，所有配制缓冲溶液所需的水、无机盐试剂和相关容器需为无热源或医用级。将上一步骤得到的初步纯化的卵泡抑素蛋白，经过平板超滤系统处理，除去溶液中的盐分并适当缩小体积，再用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱纯化，用包含0.5M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液洗脱，收集卵泡抑素蛋白，此步骤是为了进一步纯化目的蛋白并去除蛋白溶液中的内毒素。

(A6)超滤浓缩半成品：将Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱洗脱得到的蛋白溶液，用Millipore超滤浓缩系统，去除多余的盐和水，将蛋白溶液浓缩至合适的体积，加入5％甘露醇和1％甘氨酸，混合均匀后用0.22um过滤器过滤，即制成重组卵泡抑素半成品。

(A7)分装，冷冻干燥：

将重组卵泡抑素半成品用超纯水稀释到浓度为2mg/ml，分装于3ml西林瓶中，每瓶1ml液体，随后在冷冻干燥机上进行冻干处理，整个升温过程不超过30℃，24小时后冻干结束，进行压盖，封口处理，保存于4℃。最终每支针剂含有2mg的重组卵泡抑素冻干粉，其余由20mg甘露醇和4mg甘氨酸组成，使用前用1ml注射用水溶解。分装，冻干，压盖，封口的处理的过程都必须在无菌条件下进行，冻干后的制品水份含量低于3％，同机一次冻干的制品作为一批。

根据上述制备方法制得的制剂，以每支计算包含：

5.0mg±0.2mg重组卵泡抑素的冻干粉；

5％重量百分比的甘露醇；

1％重量百分比的甘氨酸。

上述实施例仅是示例性地给出了时间、转速、含量等参数的数值，如每支制剂含有的重组卵泡抑素的冻干粉的量为2、5mg，当然还可以是其它处于数值范围内的数值，如1mg。这对于本领域内的技术人员来说，实施效果是可以预料到的，是能够实现本发明的目的的。

Claims (12)

1.一种注射用重组卵泡抑素制剂，所述制剂包含：

重组卵泡抑素的冻干粉、甘露醇、甘氨酸。

2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述制剂以每支计算包含：

1.0-5.0mg重组卵泡抑素的冻干粉；

1％-5％重量百分比的甘露醇；

0.2％-1％重量百分比的甘氨酸。

3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述制剂以每支计算包含：2mg±0.2mg重组卵泡抑素的冻干粉；

1％重量百分比的甘露醇；

0.2％重量百分比的甘氨酸。

4.根据权利要求1-3任一所述的制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(A1)建立菌种库：

取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，并在恒温箱培养，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，振荡若干时间，取菌液和等量灭菌甘油混匀，分装并保存；传代若干次后，菌种应重新激活培养保存；

(A2)种子液培养；从保存的菌种管子用接种环在kan抗性LB平板上划线，培养若干时间，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至OD600为0.4-0.8之间；

(A3)发酵培养；

在发酵培养基中培养，并以一定速度补料，当OD600为7-12时，加入IPTG诱导剂，继续发酵培养若干时间后，终止培养；

(A4)收集和破碎菌体； 

收集菌体：诱导完的菌液用离心机离心；

破碎菌体：将离心后菌体用缓冲液悬浮均匀，使用细胞破碎机进行碎菌，再用离心机离心，收集上清液，即粗制重组卵泡抑素蛋白溶液；

(A5)目的蛋白纯化：

将所述上清液通过镍离子亲和层析柱，用包含不同浓度咪唑的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白粗制品；

再通过阴离子交换柱，用包含不同浓度Nacl的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白精制品；

(A6)浓缩半成品：

通过过滤系统去除多余的盐和水，将液体浓缩至合适的体积，加入1-5％甘露醇和0.2-1％甘氨酸，混合均匀后过滤，即制成重组卵泡抑素半成品；

(A7)冷冻干燥：

将所述重组卵泡抑素半成品稀释，分装于西林瓶中，在冷冻干燥机上进行冻干处理若干时间，最后进行压盖、封口处理。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(A1)进一步包括如下步骤：

(B1)菌种进行以下鉴定，鉴定合格后投入生产：

形态特征观察：将所述菌种划线于kan抗性的LB平板，并培养，观察菌种克隆是否具有大肠杆菌典型的形状特征，是否有杂菌生长；

表达量检测：挑取单克隆菌，接种于1-3ml含kan的LB液体培养基，30-45℃摇床振荡1-5小时，检测OD600为0.4-0.6时，加入IPTG诱导，继续振荡3-4小时后收菌，经过SDS-PAGE检测蛋白表达量；

质粒检查：抽取质粒DNA，用限制性内切酶双酶切，检查酶切图谱与原始酶切图谱是否一致。

6.根据权利要求4所述的制备方法其特征在于：所述步骤(A1)进一步 包括以下步骤：

从-70℃冰箱取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，37℃恒温箱培养16小时，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，37℃摇床振荡12小时，取菌液和等量30％灭菌甘油混匀，使甘油终浓度为15％；用灭菌后的1.5ml EP管分装数管，保存于-70℃冰箱；传代3次后，菌种应重新激活培养保存。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(A2)进一步包括以下步骤：

从保存的菌种管子用接种环在kan抗性LB平板上划线，在37℃培养16小时，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至OD600为0.4-0.8之间，即可用来接种发酵培养使用。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(A3)中，发酵培养基配方为：

酵母提取物(Yeast) 5g/L

蛋白胨(Typtone)   10g/L

氯化钠(NaCl)      10g/L

补料培养基配方为：

酵母提取物(Yeast) 50g/L

蛋白胨(Typtone)   100g/L

甘油(glycerole)   50g/L；

发酵条件：37℃培养，以200ml/小时速度补料，当OD600为7-12时，加入IPTG诱导剂，浓度为0.5mM，继续发酵培养4小时后，终止培养。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(A4)中，诱导完的菌液用大容量冷冻高速离心机，5000rpm/min，4℃离心10分钟，收集菌体；

破碎菌体：将离心后菌体，用1xPBS、pH7.4缓冲液悬浮均匀，冰浴条件下 使用超声波细胞破碎机进行碎菌，20分钟后，用大容量冷冻高速离心机，10000rpm/min，4℃离心10分钟，收集上清即为粗制重组卵泡抑素蛋白溶液。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(A5)中，

重组蛋白粗纯化：将粗制的重组蛋白通过镍离子亲和层析柱，用包含不同浓咪唑的缓冲液进行清洗，最终洗脱的为重组蛋白粗制品；

重组蛋白精细纯化：将重组蛋白粗制品通过Q-Sepharose阴离子交换柱，用包含不同浓度Nacl的缓冲液进行清洗，最终洗脱的为重组蛋白精制品。

11.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(A6)中，

超滤浓缩半成品：将重组蛋白精制品通过Millipore超滤系统，去除多余的盐和水，将液体浓缩至合适的体积，加入1％甘露醇和0.2％甘氨酸，混合均匀后用0.22um过滤器过滤，即制成重组卵泡抑素半成品。

12.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(A7)中，

分装，冷冻干燥：将重组卵泡抑素半成品稀释成合适的浓度，分装于3ml西林瓶中，每瓶1ml液体，随后在冷冻干燥机上进行冻干处理，整个升温过程不超过30℃，24小时后冻干结束，进行压盖，封口处理。 

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