JPH03164173A - 新規なアルギニンデイミナーゼ、その製造法及び該酵素を有効成分とする制癌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮１上旦祉且北韮 本発明は、新規なアルギニンデイミナーゼ（ａｒｇｉｎ
ｉｎｅ　ｄｅｉｍｉｎａｓｅ）及びその製造法に関する
。

本発明のアルギニンデイξナーゼは、アルギニン分解能
を有するマイコプラズマから産生され、ヒト癌細胞に対
して増殖阻害活性を示し、また担癌マウスに対して優れ
た延命効果を示すので制癌剤として有用である． 従来技歪 近年、癌治療の新しい試みとして癌細胞の栄養要求性に
基づいた酵素療法が注目されている。すなわち、これは
、癌細胞の生育に要求される栄養戒分を酵素によって分
解し、栄養源を遮断し、それによって癌細胞の増殖を阻
止あるいは死滅させようとする試みであって、このよう
な抗腫瘍酵素としてＬ−アスパラギナーゼ（Ｅ　Ｃ　３
．５．１．１．）（Ｎａｔｕｒｅ，　２２９　，　１６
８（１９７１）　）やＬ−アルギナーゼ（Ｅ　Ｃ　３．
５．３．１．）　（Ｂｒ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓ’
ＪＪ，　３７９（１９６５）　３等が知られている．し
かし、Ｌ−アスパラギナーゼは、し−アスパラギン従属
性の癌が少いので、白血病、悪性リンパ腫等の一部の癌
にしか有効ではなく、またＬ−アルギナーゼは、種々の
癌細胞に対して増殖阻害活性を示すものの、ｉｎｖｉｖ
ｏでは制癌活性を示さないという欠点があった（Ｂｒ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，　３０、５０（１９７４）　）　．
また、アルギニンデイ果ナーゼは、マイコプラズマ及び
他の微生物から得られていたが（Ｊ．Ｂ．Ｃ．４　２２
２８　〜２２３６（１９６６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅ
ｍ．　’１５１．　２６１５　〜２６２０　（１９８７
）、Ｊ．Ｂｉｏ１．ｃｈｅ＋ｗ．困虹４５８０〜４５８
３（１９７５）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．６０、１８６　〜１９７（１９５７）等〕、
制癌活性については明らがにされていない． Ｂ　＜”しよ゛　　る量 本発明は、Ｌ−アスパラギナーゼやし−アルギナーゼの
このような欠点を解決するためになされたものであって
、アルギニン分解能を有し、癌細胞増殖阻害活性の強い
新規なＬ−アルギニン分解酵素を探索し、これを制癌剤
として利用しようとするものである． ４　　　″゜　　ｔ−めの 本発明者らは、シェードモナス、ストレブトコッカス及
びマイコブラズマ等の微生物に由来する多数のアルギニ
ンデイミナーゼについて新規酵素を探索研究した． その結果、マイコプラズマ由来の菌体抽出液の中に新規
なアルギニンデイミナーゼが存在し、その至適ｐＨが生
理的条件下にあり、しかも高い安定性を示し、このため
癌細胞増殖阻害活性が強いことを見出し、本発明をなす
に至った。

アルギニンディミナーゼ（Ｅ　Ｃ　３．５．３．６．）
はＬ−アルギニンのアミジノ基を加水分解してＬ−シト
ルリンとアンモニアとを生戒するする酵素であって、別
名、アルギニンジヒドロラーゼ、アルギニンデスイミナ
ーゼ、グアニジノデスイξナーゼと称されている．そし
て、ある種の微生物においては生じたシトルリンはオル
ニチンとカルバモイルリン酸とになり、カルバモイルリ
ン酸はアンモニアと水とに分解される．このさいＡＴＰ
が生成する。すなわち、細菌や酵母中でアルギニンのア
ミジノ基の代謝と関連してＡＴＰを生成する経路におい
てアルギニンデイミナーゼはこの経路の最初の段階で関
与する酵素である． 本発明のアルギニンデイξナーゼは次の理化学的性質を
有する． （イ）作用 Ｌ−アルギニンのアミジノ基を加水分解してし−シトル
リンとアンモニアを生處する．（口）至適ｐＨ　　　６
．０〜７．５ （ハ）安定ｐＨ　　　４．５〜９．０ （二）至適温度　　約５０゜Ｃ （ホ）　　Ｋｍ　｛ｉｆ　　　　ｔＰＪ０．２＋ａＭ（
へ）等電点（ｐＩ）約４．７ （ト）分子量　　　約４５，０００ （ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による） 約９０，０００ （ゲル濾過　ＨＰＬＣ法による） （チ）Ｎ末端からのア≧ノ酸配列 Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−　Ｉ　１ｅＨｉｓ−Ｖａｌ−Ｔ
ｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕさらに、本発明のアルギニンディ
ミナーゼは第４図に示すアミノ酸配列を含有する． 本発明のアルギニンディミナーゼは次の方法によって調
製される． マイコプラズマは、上記本発明のアルギニンデイミナー
ゼを産生ずる能力があるならばどのようなものを用いて
もよい．このような菌株の例としては、マイコプラズマ
・アルギニイニ（ａｒｇｔｎｉｎｉ）、ホミニス（ｈｏ
ｍｉｎｉｓ）、サリバリウム（ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）
、ガリナルム（ｇａｌｌｉｎａｒｕａ＋）、オラーレ（
ｏｒａ　ｌｅ）等をを挙げることができる．特に、好適
な菌株は、（財）発酵研究所、ＡＴＣＣ又はＮＣＴＣか
ら入手することができるマイコプラズマ・アルギニイニ
（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎ＋）　（　ｌ　Ｆ　ＯカタログＮ
ｌｌｌ４４７６、ＡＴＣＣカタログ阻２３８３８又はＮ
ＣＴＣカタログＮｎｌ０１２９）である。

本発明では、上記マイコプラズマをアルギニンを添加し
た液体培地で３７゜Ｃ前後でｌ日〜数日静置培養を行う
．尚、このマイコブラズマは通性姥気性菌であり、嫌気
性下又は酸素存在下のいずれかにおいても増殖可能であ
る。培地としては例えば、ＰＰＬ○培地（ＤＩＦＣＯ社
製）等が用いられ、アルギニンの添加量は、培地１ｆｆ
ｉ当り１〜２０ｇが適当である． 培養後、菌体を集菌し、これを緩衝液、例えばリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、超音波破砕等によって
菌体を破砕し、遠心分離等の手段によって不溶物を除去
する．得られる上清を菌体抽出液とし、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティク口マトグラフィー等のクロマトグラフィーを用
いて分離精製を行って上記した理化学的性質をもつアル
ギニンデイミナーゼを得ることができる。

本発明のアルギニンデイミナーゼは、文献記載の公知の
アルギニンディξナーゼと比較すると第１表のようにな
り、明らかに、これらとは相違する． また、一般の蛋白質と本発明のアルギニンデイミナーゼ
のＮ末端アミノ酸配列についてコンピューターのデータ
ーベースを用いて検索したが、いずれの蛋白質とも本発
明のアルギニンデイミナーゼのＮ末端アミノ酸配列は類
似性を示さず、これらの点から本発明のアルギニンデイ
ξナーゼを新規なものと判断した。

さらに、本発明では、マイコプラズマ　アルギニイニの
菌体から得られたゲノムＤＮＡからマイコプラズマ　ア
ルギニイニ　アルギニンデイξナーゼの遺伝子を単離同
定した。単離したアルギニンデイミナーゼの全塩基配列
を決定した結果、アルギニンデイミナーゼを構成するポ
リペブチドのアミノ酸配列及び塩基配列は図４に示すも
のであることが判明した。従って、アルギニンデイミナ
ーゼは全４０９個のアミノ酸から構成され、分子量は４
６３７５．３８となり、蛋白のＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動より求めた分子量とほぼ一致した。

本発明のアルギニンディミナーゼは、試験例１〜６に示
すように白血病細胞、線維芽肉腫細胞、大腸癌細胞、肉
腫細胞、腹水肝癌細胞等を移植した担癌マウスに対して
優れた延命効果を示す。このことから、ヒトの各種腫瘍
、特に悪性腫瘍の治療に有効なことは明白である。

アルギニンデイミナーゼの活性は、Ｆｅｎｓｋｅらの方
法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、皿、５０１　〜５１０
（１９７６）　）によってシトルリンを生成させ、その
量をＡｒｃｈｉｂａｌｄの方法（Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅ
ｍ．、１５６、１２１〜１４２（１９４４）　）によっ
て測定することによって求めることができる． すなわち、１０ｍＭアルギニン溶液（０．　ＩＭリン酸
緩衝液（ｐＨ　７．０）に溶解〕１．ＯＩｄｌに、アル
ギニンディミナーゼ試料溶液２０μｌを添加し、３７゜
Ｃで５〜３０分間酵素反応を行った後、酸混合液（Ｈｔ
ＳＯａ：ＨｚＰＯａ−１：３）ｌｍを添加し酵素反応を
停止させる。

反応液に３％ジアセチルモノオキシム水溶液２５μｉを
添加し、遮光下で１００゜Ｃで２０分間加熱した後、室
温で３０分間放冷し、４９０ｎｍにおける吸光度を測定
することにより、生戒したシトルリンを定量する。尚、
１分間に１μｍｏｌのシトルリンを生或するアルギニン
ディミナーゼ活性を１ユニット（Ｕ）と定義する． アルギニンデイミナーゼの急性毒性については、これを
マウスに経口的あるいは尾静脈内の１　ｇ／ｋｇ以下の
投与で死亡例がなく、また投与後解剖した所見によると
各臓器には何等の異常が観察されず、きわめて安全であ
ることが分かった。

次に本発明の実施例を示す． 実施例１ アルギニンデイミナーゼの調製 （１）マイコプラズマ・アルギニイニ（Ｍ．ａｒｇｉｎ
ｉｎｉ）の培養 財団法人発酵研究所より人手したマイコプラズマ・アル
ギニイニ（Ｍ，ａｒｇｉｎｉｎｉ）株（ＩＦＯカタログ
Ｎａ　１４４７６）を培養液（Ｐ　Ｐ　Ｌ　Ｏ　ｂｒｏ
ｔｈ　ｗ／ｏＣ　Ｖ（ＤＩＦＣＯ社製）Ｌ−アルギニン
１０ｇ，ウマ血清２００ｄ、２５％新鮮イーストエキス
１０ｋ，０．４％フェノールレッド液５＋＋ｄ，蒸留水
７００−の組戒よりなり、ｐＨ　７．０に調整した培養
液〕に接種し、５％Ｃ（ｈインキュベーター内で３７℃
において２日間静置培養した． （２〉　アルギニンディミナーゼの分離・精製（Ａ）マ
イコブラズマ・アルギニイニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）
菌体抽出液の調製 上記（１）によって得られた培養液２ｌを７０００ｒｐ
ｍで、２０分間遠心することにより集菌し菌体２ｇを得
、これを、ｐＨ　７．０の１０ｅＭリン酸緩衝液３ｏ一
に懸濁した．この懸濁液を超音波処理してその中に含ま
れる菌体を破砕し、遠心分離によって不溶物を除き、得
られる上清をマイコプラズマ・アルギニイニ（Ｍ，ａｒ
ｇｉｎｔｎｉ）の菌体抽出液とした。

（Ｂ）アルギニンデイミナーゼの分離精製上記（Ａ）に
よって得られた菌体抽出液を以下に示す３種のクロマト
グラフィーにより処理してアルギニンデイミナーゼを分
離精製した．（１）ゲル濾過クロマトグラフィー 上記菌体抽出液を、セル口ファイン（Ｃｅｌｌｕｌｏｆ
ｉｎｅ）ｃ　ｃ　ｔ．　−２０００ｍ　（チッソ社製）
を用い、次に示す条件でゲル濾過クロマトグラフィーを
行った．がラムの大きさ：２．６Ｘ９０ｃ鵬 ゲル充填量　　：　　４８０ａｄ 流速　　　　　：　２４ｄ／ｈｒ 画分量　　　　：　各６一 溶出液　　　　：　１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０
）＋０．５Ｍ塩化ナトリウム 得られ各両分について２８０ｎｍの吸光度及びアルギニ
ンデイξナーゼ活性を前記方法により測定した。その結
果を第１図に示す。この結果、アルギニ／デイミナーゼ
は、百分４２〜５２に含まれていることが判明した． （１１）イオン交換クロマトグラフィー上記（ｉ）で得
られた百分４２〜５２を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
．０）に対して透析を２４時間行った．得られた透析内
液をＤＥＡＥ−　トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）〔
東ソー社製〕を用い、次に示す条件でイオン交換クロマ
トグラフィーを行った。

カラムの大きさ：　２．６Ｘ３０ｃｍ ゲル充填量　　：　　３２（ｌａｄ 流速　　　　　：　　６０ｄ／ｈｒ 画分量　　　　：　各１０ｍ 溶出液　　　　：　１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．
０）（０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム 濃度勾配） すなわち、透析したアルギニンデイミナーゼ含有画分を
、同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−｝ヨバール力ラム
に添加し、アルギニンデイミナーゼを吸着させ、緩衝液
中の塩化ナトリウム濃度のＯＭから０．５Ｍの直線濃度
勾配で流速６０ａｄ／ｈｒで溶出を行い、１０１ＩＩ１
ごとに各画分を採取した．得られた各百分について上記
（ｉ）と同様に２８０ｒｖ＋の吸光度及びアルギニンデ
イミナーゼ活性を測定した．その結果を第２図に示す．
この結果、アルギニンデイミナーゼは画分５０〜５３に
含まれていることが判明した。

（　ｉｉｉ　）アフィニティクロマトグラフィー上記（
ｉｉ）で得られた画分５０〜５３を、１０ｎ＋ＭリンＭ
緩衝液（ｐＨ７．０＞に対して透析を２４時間行った。

得られた透析内液をアルギニンーセファロース（Ａｒｇ
ｉｎｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ　（ファルマシ
ア社製）を用い、次に示す条件でアフィニティクロマト
グラフィーを行った。

カラムの大きさ：２．２ＸＩＯｃｍ ゲル充填量　　：　　３ＢＭｉ 流速　　　　　：　　５０ｍ／ｈｒ 画分量　　　　：　各８ｗＩ１ 溶出液　　　　：１０−リン酸緩衝液（ｐＨ　７．０）
（０〜１，ＯＭ塩化ナトリウム 濃度勾配〉 すなわち、透析したアルギニンデイだナーゼ含有画分を
、透析に使用したものと同じ緩衝液で平衡化したアルギ
ニンーセファロース４Ｂカラムに添加してアルギニンデ
イミナーゼを吸着させ、緩衝液中の塩化ナトリウム濃度
のＯＭから１．０Ｍの直線濃度勾配で流速５０ｄ／ｈｒ
で溶出を行い、溶出液８一ごとに各両分を採取した。得
られた各両分について上記（１１）と同様に２８０ｎｒ
ａの吸光度及びアルギニンデイξナーゼ活性を測定した
． この結果を第３図に示す。この結果アルギニンデイミナ
ーゼは画分７１〜８１に含まれていることが判明した． （ｉｖ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上記
（ｉｉｉ）で得られた画分７１〜８ｌをＬａｅｍｍｌｉ
らの方法（Ｎａｔｕｒｅ，　１１１、６８０　〜６８５
（１９７０）　）に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行ったところ、分子量４５．　０００の
位置に単一バンドとして検出され、完全に精製されたア
ルギニンデイミナーゼが得られたことが確ＬｆＪされた
。

（Ｃ）アルギニンデイミナーゼの物性値上記（Ｂ）（ｉ
ｊ）で得られた酵素液を用いて測定した． （ｉ）至適ｐＨ　、至適温度、安定ｐＨ、安定温度至適
範囲ｐＨは６．０　〜７．５で、４゜Ｃで２４時間処理
したときの安定ｐＨ範囲は４．５〜９．０である。

活性は４５〜５５゜Ｃ付近が最も高く、温度に対する安
定性については９５゜Ｃ、５分処理あるいは、６０゜Ｃ
、３０分処理すると活性を失う。

（ｉｉ）基質特異性 Ｌ−アルギニンを加水分解してＬ−シトルリンとアンモ
ニアに分解する． （　ｉｉｉ　）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
した結果、分子量は約４５．０００であった．また、Ｔ
ＳＫ　Ｃ３０００ＳＷＸＬ　（東ソー社製）カラムを用
いたゲル濾過ＨＰＬＣ法により測定した結果、分子量は
約９０，０００であった．（１ｖ〉等電点 等電点電気泳動法により等電点を測定した結果、等電点
は約４．７であった。

（ｖ）　Ｋｒａ値、Ｖｍａｘ値 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔにより、Ｋ
ｌｌｌ　，　Ｖｍａｘを測定したところそれぞれ約０．
２ｍＭ、約５０１１／ｍｇであった。（ｖｉ）　Ｎ末端
アミノ酸配列 アくノ酸シーケンサ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍ社製）によってＮ末端アξノ酸配列を決定したと
ころ、Ｓｅｒ−　Ｖａ　Ｉ−　Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ
−Ｌｙｓ−　Ｐｈｅ−　Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−　１　１ｅ
−１ｔ　ｉｓＶａｔ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−であっ
た。

（ｖｉ）生理活性 癌細胞に対し増殖阻害活性を示し、また担癌マウスに対
し、試験例に示すように優れた延命効果を示す。

実施例２ アルギニンデイミナーゼ遺伝子の解析 （１）マイコブラズマゲノムＤＮＡの調製マイコプラズ
マ　アルギニ一二（ＩＦＯカタログＮａｌ４４７６）菌
体をＳＤＳ″ｉ？溶菌させ、ブロテイナーゼＫ，ＲＮａ
　ｓ　ｅＡの順に処理した後、フェノール抽出、クロロ
ホルム抽出を行い、水層をｌＱｍＭ｝リス塩酸緩衝液（
ｐＨ８．０　）　１　ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡに対して透析し
てゲノムＤＮＡを調製した．（２）マイコプラズマ遺伝
子ライブラリーの作戒（１）で調製したマイコプラズマ
ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、プラスミ
ドベクターｐＵｃ１９（東洋紡績社製〕に連結して大腸
菌ＨＢＩＯＩ株〔宝酒造社よりコンビタントセルを購入
〕に導入し、これをマイコプラズマ遺伝子ライブラリー
とした。

（３）プローブ用オリゴヌクレオチドの設計アルギニン
デイミナーゼ蛋白から決定した３０個のＮ未アミノ酸配
列の適当な位置より、マイコプラズマのＤＮＡは非常に
ＧＣ含量が低い（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．
　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４　１６６〜１６９（１９８７）
）という知見をもとに、２４塩基のオリゴヌクＩ／オチ
ド（４種の混合物、配列は第５〜８図参照）を設計し、
ＤＮＡ合戒機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｔｏｓｙｓｔｅｍ社
製モデル３０８Ｂ）にて合成した。

（４）コロニーハイブリダイゼーションによるスクリニ
ング （３）で合威したオリゴヌクレオチドを３ｔｐで標識し
、これをブローブとして（２）で作威したマイコプラズ
マ遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、ポジティブ
クローンを単離した．（５）アルギニンデイξナーゼ遺
伝子の単離と塩基配列の決定 （４）で得られたクローンよりブラスミドＤＮＡを調製
し、プローブにハイプリダイズする領域周辺のＤＮＡ断
片を、Ｍ１３＋ｐｌ９　（東洋紡績社製〕に組込み１本
鎖ＤＮＡを調製した。得られた１本鎖Ｄ　Ｎ　Ａを鋳型
として約２００ｂｐごとの合成プライマ−（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製モデル３８０Ｂにて合戒
）を用い、ジデオキシ法により塩基配列を決定した。塩
基配列はＤＮＡの両鎖について行った。

この結果を第４図に示す。

すなわち、塩基配列を決めた領域より、アルギニンデイ
ξナーゼ蛋白から決めた３０個のＮ末アξノ酸配列に対
応する塩基配列を含む１２３０ｂｐのオープンリーディ
ングフレームが見いだされ、開始コドンＡＴＧに続＜　
１２２７ｂｐの塩基配列をマイコプラズマ　アルギニイ
ニ　アルギニンデイξナーゼ遺伝子蛋白コード６Ｈ域と
同定した（第４図参照）。

ただし、マイコプラズマにおいてはＴＧＡコドンはトリ
プトファンコドンとして認識されていることが知られて
いるので（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ　８２、２３０６〜２３０９（１９８５）　）
遺伝子中に５カ所存在するＴＧＡコドンは、トリプトフ
ァンコドンと考え、柊止コドンはＴＡＡとＴＡＧの２つ
のみとして解析した。

アルギニンデイミナーゼを構成する全４０９個のアミノ
酸より算出した分子量は、４６３７５となり、蛋白のＳ
ＤＳ−ポリアクリルアξドゲル電気泳動より求めた分子
量とほぼ一致した。

実施例３ アルギニンデイミナーゼ製剤の製法 実施例１　（２）　（　ｉｉｉ　）で得られた両分７１
〜８ｌをリン酸緩衝液（ｐｔ＋　７．４）を含む生理食
塩水（ＰＢＳ）に対して２４時間透析後、０．２〜２．
０ｍｇ／ｄの蛋白濃度？なるようにＰＢＳで希釈した。

投与に際して、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌
し、水溶液型のアルギニンデイミナーゼ製剤を製造した
。

さらに、本発明のアルギニンデイξナーゼの制癌効果に
ついて試験した結果を試験例として示す。

試験例　アルギニンデイミナーゼの制癌効果試験例１　
各種のヒト培養癌細胞株を用いる方法ｌＯ％牛胎児血清
を含むＤＭＥ培地１．０ｄの入った２４穴マイクロプレ
ートに各癌細胞を１×ｌＯ４個まき、上記で調製したア
ルギニンデイξナーゼ製剤を培地中の濃度が５ｎｇ／ｒ
ｄ．あるいはＬＯｎｇ／一になるように添加した．５％
ＣＯ■インキュベーターで３７゜Ｃで３日間培養後の細
胞数を自動細胞数計測装置（コールターカウンター）　
　（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製〕で計測した．この時アルギニ
ンデイミナーゼの代わりに同容量のＰＢＳを添加したも
のを対照とした．細胞増殖阻害活性は、対照の細胞数を
１００とした場合の試料の相対的な細胞数で示した．こ
の時の結果を第２表に示す。

第 ２ 表 試験例２　マウス白血病細胞Ｌ　１２１０を用いる方法
７週齢の雄性ＣＤＦ，？ウス（ＢＡＬＢ／ｃ♀ｘＤＢＡ
／２♂）２１匹にＩＸＩＯ’個の白血病細胞Ｌ　１２１
０を腹腔内に移植し、無作為に対照群９匹、試験群６匹
（２群）に群分けした． 上記のアルギニンデイミナーゼ製剤の投与法は、ｄａｙ
　Ｏを移植日とした場合、ｄａｙｌ〜８に１日１回腹腔
内に投与した。対照群にはＰＢＳを投与した．試験例３
　マウス線維芽肉ｉ１ｊＭｅｔｈ＾を用いる方法７週齢
の雄性ＣＤＦ．マウス（ＢＡＬＢ／ｃ♀×ＤＢＡ／２♂
）２７匹にＩＸＩＯ’個の線維芽肉腫Ｍｅ　ｔｈＡを腹
腔内に移植し、無作為に対照群９匹、試験群９匹（２群
）に群分けした。アルギニンデイミナーゼ製剤の投与法
はｄａｙ　Ｏを移植日とした場合、ｄａｙｌ＝１０に１
日１回腹腔内に投与した。対照群にはＰＢＳを投与した
． 試験例４　マウス大腸癌細胞ｃｏｌｏｎ２６を用いる方
法 ７週齢の雄性ＣＤＦ，マウス（ＢＡＬＢ／ｃ♀ｘＤＢＡ
／２♂）２５匹にＩＸＩＯ’個の大腸癌細胞ｃｏｌｏｎ
２６を腹腔内に移植し、無作為に対照群９匹、試験群８
匹（２群）に群分けした。アルギニンデイミナーゼ製剤
の投与法はｄａｙ　Ｏを移植日とした場合、ｄａｙｌ＝
１４にｌ日１回腹腔内に投与した．対照群にはＰＢＳを
投与した． 試験例５　マウス肉腫細胞Ｓａｒｃｏｍａｌ８０を用い
る方法７週齢の雄性ＩＣＲマウス２４匹にＩＸＩＯ’個
の肉腫細胞Ｓａｒｃｏ＋＊ａＬ８０を腹腔内に移植し、
無作為に対照群８匹、試験群８匹（２群）に群分けした
．上記のアルギニンデイミナーゼ製剤の投与法は、ｄａ
ｙ　Ｏを移植日とした場合、ｄａｙｌ〜ｌ４に１日１回
腹腔内に投与した．対照群にはＰＢＳを投与した．試験
例６　マウス腹水肝癌細胞ＭＨ　１３４を用いる方法７
週齢の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス２６匹に１×１０“個
の腹水肝癌細胞ＭＨ　１３４を腹腔内に移植し、無作為
に対照群１０匹、試験群８匹（２群）に群分けした．ア
ルギニンデイミナーゼ製剤の投与法はｄａｙ　Ｏを移植
日とした場合、ｄａｙｌ〜ｌ４に１日１回腹腔内に投与
した。対照群にはＰＢＳを投与した。

制癌効果の判定は、対照群マウスの平均生存日数に対す
る治療群のそれの百分率（Ｔ／Ｃ％）で示した．上記試
験例２乃至６の結果を第３乃至７表に示す． 第３表（Ｌ　１２１０） 第 ４ 表 （門ｅｔｈ　Ａ） 第 ５ 表 （Ｃｏｌｏｎ　２６） 第 ６ 表 （Ｓａｒｃｏｓ＋ａ １８０） 第 ７ 表 （Ｍｌｌ １３４） 実施例４ 形質転換体によるアルギニンデイミナーゼの発現（１）
変異遺伝子の作戒 Ｋｕｎｋｅｌの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａ
ｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ＋皿，　４８８（１９８５）　
）に従い、５種類のオリゴヌクレオチドをプライマーと
して第４図に記載したアルギニンデイミナーゼ遺伝子中
の５つのＴＧ＾コドンすべてを、大腸菌のトリプトファ
ンコドンであるＴＧＧコドンに置換するポイントミュー
テーションを行った。５つのＴＧＡコドンがすべてＴＧ
Ｇコドンに置換したクローンを、変異導入に用いたオリ
ゴヌクレオチドをプロープとしたプラークハイブリダイ
ゼーシゴンにより選択し、得られたクローンのシーケン
スを行い、５つのＴＧＡコドンがすぺてＴＧＧに置換し
ていることを確認した。

（２）アルギニンデイミナーゼ発現ベクターｐＡＤ１２
の作或 上記（１）によって得られた変異アルギニンデイξナー
ゼ遺伝子の構造遺伝子とその上流２４０　ｂｐの調節遺
伝子を含む遺伝子をプラス旦ドｐ［Ｉｃ１９のＳａｃ　
ＩＨｉｎｄ［［ｌサイトに挿入し、プラスミドｐＡＤ１
２を作威した。ｐＡ［］１２はマイコプラズマ　アルギ
ニイニアルギニンデイごナーゼ遺伝子由来のプロモータ
ー配列を有し、その塩基配列を解析したところ、原核細
胞のプロモーターのコンセンサス配列（ＳＤ配列、−１
０配列、−３５配列）を持つことが明らかとなり、ｐＡ
Ｄ１２は大腸菌におけるアルギニンデイミナーゼ発現ベ
クターとなり得ることが期待された。

（３）形質転換体の培養と菌体抽出物の調製（２）で作
威したｐＡＤ１２を大腸菌ＨＢＩＯＩ　（宝酒造社）に
導入し、得られた形質転換株を５戚のＬＢ培地（１，０
％Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ　　（ＤｒＦＣＯ社製
）　、０．５％Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃ
ｔ　　（ＤＩＦＣＯ社製）　、０．２％Ｇｌｕｃｏｓｅ
，　１．０％Ｎａｃ　Ｉ！、ｐＨ７．５）を用い、３７
゜Ｃで一晩前培養した．得られた前培養液１−を２５０
１１！ｉｔのＬＢ培地に加え、３７゜Ｃで一晩培養後、
遠心分離により集菌した．得られた菌体を生理食塩水で
２回洗浄した後、Ｏ．ｌＭＩＪン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）２ｍに懸濁し、超音波により菌体を破砕し、
遠心分離により不溶物を除去した上清を菌体抽出物とし
た。

また、アルギニンディミナーゼ遺伝子を含まないｐＵｃ
１９を保持した｝ＩＢＩＯＩの菌体抽出物を上記と同し
操作により調製し、対照として用いた。

（４）アルギニンデイミナーゼ活性の測定（３）で調製
したｐＡＤ１２保持１１ＢＩＯＩ菌体抽出物とｐｌｌｃ
１９保持ＨＢＩＯＩ菌体抽出物（対照）をそれぞれ０．
１）Ｉリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍に
希釈し、その１０μｉにつき、３７゜Ｃで５時間インキ
ユベートしたときのシトルリンの生産量を前述の方法に
より測定した，　ｐＡＤ１２保持ＨＢＩＯＩのアルギニ
ンデイミナーゼ発現量をｐＡＤ１２保持ＨＢＩＯＩによ
るシトルリン生産量から、対照のｐＵｃ１９保持ＨＢＩ
ＯＩによるシトルリン生産量を差し引いた値から算定し
た結果、２５０一のＬＤ培地当り１．２ユニットのアル
ギニンデイミナーゼ活性が確認された。

発づＲｌ尭果 本発明のアルギニンデイミナーゼは、新規な酵素であっ
て、ｉｎ　ｖｉｔｒｏばかりでなく、ｉｎ　ｖｉｖｏに
おいても制癌活性を示すので、抗腫瘍酵素として制癌剤
に有効に利用できる。また、このマイコブラズマ　アル
ギニイニ　アルギニンデイミナーゼのＤＮＡ配列が同定
されたので、これを用いて遺伝子工学的手法により工業
的にアルギニンデイミナーゼの生産が可能となり、アル
ギニンデイミナーゼを有効成分とする制癌剤を高純度で
大量に生産することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によるマイコプラズマ・アルギニイニ
（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）の菌体抽出液のゲル濾過クロ
マトグラフィーの結果を、第２図はその両分４２〜５２
のイオン交換クロマトグラフィーの結果を、第３図はそ
の百分５０〜５３のアフィニテイクロマトグラフィーの
結果をそれぞれ示す。第４図は、アルギニンデイミナー
ゼを構成するポリベブチドのアξノ酸配列及びその塩基
配列を示す。第５〜８図はブロープとして用いられたオ
リゴヌクレオチドの塩基配列及びそれに相当するアミノ
酸配列を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次の理化学的性質を有する新規なアルギニンデイ
   ミナーゼ （イ）作用及び基質特異性 Ｌ−アルギニンのアミジノ基を加水分解してＬ−シトル
   リンとアンモニアを生成する。 （ロ）至適ｐＨ　６．０〜７．５ （ハ）安定ｐＨ　４．５〜９．０ （ニ）至適温度　約５０℃ （ホ）Ｋｍ値　約０．２ｍＭ （ヘ）等電点（ｐＩ）約４．７ （ト）分子量　約４５，０００ （ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による） 約９０，０００ （ゲル濾過ＨＰＬＣ法による） （チ）Ｎ末端からのアミノ酸配列 Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
   ｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔ
   ｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−（２）第４図のアミノ酸配列を
   含有する新規なアルギニンデイミナーゼ （３）アルギニン分解能を有するマイコプラズマを培養
   し、菌体培養物を抽出し、抽出物から分離精製して採取
   することを特徴とする、請求項（１）または請求項（２
   ）に記載の理化学的性質を有する新規なアルギニンデイ
   ミナーゼの製造法。 （４）、アルギニン分解能を有するマイコプラズマが、
   マイコプラズマ・アルギニイニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ
   ａｒｇｉｎｉｎｉ）である請求項（３）に記載の新規な
   アルギニンデイミナーゼの製造法。 （５）請求項（１）または請求項（２）に記載の理化学
   的性質を有するアルギニンデイミナーゼを有効成分とす
   る制癌剤。 （６）アルギニンデイミナーゼを構成するポリペプチド
   をコードする塩基配列が第４図のアミノ酸配列をコード
   する塩基配列を含むものであるＤＮＡ。 （７）請求項（６）に記載したＤＮＡを保持する形質転
   換体を培養し、当該培養物から請求項（１）または（２
   ）に記載のアルギニンデイミナーゼを採取することを特
   徴とするアルギニンデイミナーゼの製造方法。