JPH05508999A - バシルスステアロサーモフィルスおよびバシルスカルドテナクス由来スーパーオキシドジスムターゼを含有する薬物組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 バシルス　ステアロサーモフィルスおよびバシルス　カルドテナクス由来スーパ ーオキシドジスムターゼを含有する薬物組成物 〔技術分野〕 本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ活性を有する酵素類の製法、新規なス ーパーオキシドジスムターゼ酵素類、スーパーオキシドジスムターゼ活性を有す る酵素類を含有する新規な薬物組成物類に関するものである〔背景技術〕 酸化代謝の結果のひとつに、生物の細胞構成成分の広範な損傷をもたらすスーパ ーオキシドラジカル類（０２−）の発生がある。○、″から過酸化水素（Ｈｔｏ ｔ）と酸素（０２）への分子不均化反応は、スーパーオキシドジスムターゼ類（ ＳＯＤｓ）と呼ばれる遍在する金属含有酵素類により触媒される。他の略語類は 、図の説明の前にある付録の欄に記載しである。分子０２との接触に耐えるすべ ての生物に５ＯＤｓが存在することは、これらの酵素類が酸素による損傷に対す る細胞の最初の防御線を形成していることを示唆している（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ 、１９７５）。

酵素中の金属により、ＳＯＤは３つに分類される：Ｃｕ　／　Ｚ　ｎ−１ｎ−１ Ｆｅ−１含有酵素類。どの形態の酵素も同一の反応を触媒するが、’Ｆｅ−含有 ５ＯＤｓ　（ＦｅＳＯＤ）は主に原核生物に限定され、Ｃｕ　／　Ｚ　ｎ酵素類 （Ｃｕ／Ｚｎ５ＯＤ）は真核生物で優勢である。Ｍｎ−含有５ＯＤｓ　（ＭｎＳ ＯＤ）は普遍的に存在する。

真核生物では、Ｍｎ５ＯＤｓはミトコンドリアに局在するか、Ｃｕ／Ｚｎ５ＯＤ ｓはサイドシール中に存在する（Ｇｅｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｗｉｎｇｅ、　１９８ ４）ｏ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）は３種類のＳＯＤアイソザ イムをもつ：Ｍｎ５ＯＤ　（ｓｏｄＡ）、Ｆｅ５ＯＤ　（ｓｏｄＢ）　、マンガ ンと鉄を両方含有するバイブリド酵素（Ｈａｓｓａｎ　ａｎｄ　Ｆｒ１ｄｏｖｉ ｃｈ、１９７７）。

さまざまな起源由来の５ＯＤｓは、酸化損傷治療の可能性の観点から、現在非常 に注目されている。さまざまな病気の治療のため、これらの酵素を臨床で使用す ることが提唱されてきたｏ　（Ｂｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８８を見よ。） これらには、：　（ｉ）腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍浸潤、ＵＶ損傷の抑制；（ｉ ｉ）虚血後の再潅流による小組織の損傷に対する防御；（ｉｉｉ）抗炎症剤とし て；　（ｉｖ）抗癌剤の細胞毒性作用および心臓毒性作用の軽減；　（Ｖ）生細 胞の寿命の延長；を含む。事実、現在、ウシ由来Ｃｕ　／　Ｚ　ｎ　Ｓ　ＯＤは 、ウマの腿の炎症の治療やヒトの変形性関節症の治療に使用されている（Ｐｕｈ ｌｅｔ　ａｌ、、１９８４）。

治療用に現在提唱されている５ＯＤｓは、投与による抗体反応のため免疫原性が 高くなるという重大な欠点をもつので、あまり臨床使用できないことが判明した 。その他の利用可能な５ＯＤｓ、特に哺乳動物由来の５ＯＤＳは、細胞中の酵素 濃度が低いために大量に酵素を得るのは難しく、満足できる程度の純度の酵素を 製造するためには煩雑な精製操作が必要となる。

これゆえ、例えば欧州特許公開第０　１７２　５７７号（ＥＰ−Ａ−０１７２５ ７７、Ｔａｋｅｄａ）では、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ） 由来Ｍｎ５ＯＤを抗炎症剤として薬物使用することを記載しているが、ここに記 載された投与形態は腸カプセル剤か錠剤だけである。同様に、特開昭６３−２４ ５６７１　（ＪＰ−Ａ−６３２４５６７１，５ｈｏｂｏ　Ｋ、に、　ａｎｄ　Ｕ ｎｉｃｈｉｋａ　Ｋ、に、）では、化粧品や薬品の分野において、バシルス　ス テアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ。

ｐｈｉｌｕｓ）由来の修飾Ｍｎ５ＯＤを薬物使用することを提唱している。修飾 していない酵素は抗原性があるため使用に適さないと記載されており、ポリアル キレングリコールを使用した修飾法が明細書に規定されている英国特許公開第２ １８３６５８号（ＧＢ−Ａ−２１８３６５８）では、ヒト由来Ｍｎ５ＯＤの大腸 菌内発現を記載しており、得られた産物のさまざまな薬物使用を提唱している。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉＳ由来のＳＯＤの薬物使用も、欧州特 許公開第０２８９６６７号（ＥＰ−Ａ−０２８９６６７）に記載されている。

利用可能なＳＯＤ酵素は、溶液中での半減期が比較的短い、ｐＨ７以下で活性を 失う、抗原性が高いなどの欠点があるため、臨床使用か限定されている。その結 果、従来まで、スーパーオキシドラジカルが組織に存在するために起こる有害な 作用を打ち消すための有効な薬物組成物を製造することができなかった。

〔発明の開示〕

本発明では、驚くべきことに、バシルス　ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　ｌｕｓ、ＢＳ）およびバシルス　カ ルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、ＢＣ）由来のＭｎ５ ＯＤ酵素が、天然堅つまり化学的に修飾していない形態のとき、真核細胞由来の ものに比べて非常に低い抗原性をもち、より有効に治療に使用できることを発見 した。

特開昭６３−２４５６７１　（ＪＰ−Ａ−６３２４５６７１）の記載に反し、本 発明の薬物組成物の製造に使用するＢＳおよびＢＣ由来Ｍｎ５ＯＤ酵素は、天然 型で、実質的に非抗原性であることが見い出された。特開昭６３−２４５６７１ 　（ＪＰ−Ａ−６３２４５６７１）でＢＳ由来Ｍｎ５ＯＤが高い抗原性をもつと 記載されているのは、そこに記載した方法で使用した酵素がかなり不純であった ためであろう。我々の発見によると、ＢＳおよびＢＣ微生物の細胞構成成分に結 合した発熱性不純物質を除去するための精製操作を行ったとき、あるいは組み換 え技術によりそのような不純物の存在を必然的に避けて製造したとき、ＢＳ酵素 およびＢＣ酵素はどちらも（利用可能な免疫測定技術の範囲において）実質的に 非抗原性である。

これゆえ、本発明のひとつの側面は、スーパーオキシドラジカル類の存在に起図 する病的状態の予防や治療に使用するための、Ｍｎ５ＯＤ酵素および薬物的に利 用できる賦形剤から成る薬物組成物を提供するものであり、Ｍｎ５ＯＤ酵素が天 然型であり本質的にＢＳあるいはＢＣ由来Ｍｎ５ＯＤのアミノ酸配列をもつこと を特徴とする。

Ｍｎ５ＯＤ酵素は、望ましくは（ａ）ＭｎＳＯＤ酵素培養菌体を生産し、（ｂ） 培養菌体からＭｎ５ＯＤ酵素を単離し、（Ｃ）単離したＭｎ５ＯＤ酵素を精製し て（ａ）の段階で生産したＭｎ５ＯＤ含有培養菌体中に存在するＭｎ５ＯＤ酵素 と比較して本質的に化学修飾されていない精製酵素を製造することにより、天然 型として得られる。

培養液にはマンガンを加えることが望ましい。高いＭｎ５ＯＤ発現レベルを得る ためには、一般に、０．０１ｍＭ以上の濃度のマンガンか必要である。これゆえ 、（全可溶性蛋白質に対する発現の割合で）１０％程度のＭｎ５ＯＤ発現レベル を得るためには、０．０１ｍＭのマンガン塩を加えなければならない。

本発明の薬物組成物は、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓあるいはＢ 、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ固有の巨大分子物質である発熱性物質類をほとんど含ま ないことが望ましい。これは、例えば、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　 ｌｕｓあるいはＢ、ｃａｌｄｏｔｅｎａＸ以外の種の形質転換微生物を培養して Ｍ　ｎ　Ｓ　ＯＤ酵素を製造することにより、成し遂げることができる。

Ｍ　ｎ　Ｓ　ＯＤ酵素は、 （ｉ）　図３に示すＢＣ由来Ｍｎ５ＯＤのアミノ酸配列（ｉｉ）図１２に示すＢ Ｓ由来Ｍ　ｎ　Ｓ　ＯＤのアミノ酸配列、 （ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の配列中の１〜３ｏアミノ酸が挿入、欠失、置 換したアミノ酸配列、から選択したアミノ酸配列であることが望ましい。

配列（ｉｉｉ）は、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）の配列中の１〜２０アミノ酸 が、望ましくは１〜１ｏアミノ酸が挿入、欠失、置換したアミノ酸配列である。

最も望ましい配列（ｉｉｉ）は、（ｉ）および（ｉｉ）の配列中の１〜５アミノ 酸例えばｌ、２．３アミノ酸が挿入、欠失、置換したアミノ酸配列である。

本発明の薬物組成物は、（ａ）注射用溶液、あるいは（ｂ）外科手術あるいは移 植手術の際に組織に潅流させるのに適した溶液の形態で調製することができる。

このような組成物は、通常、上記Ｍｎ５ＯＤ酵素を０．００１から１．ｏｍｇ／ ｌ、望ましくはｏ、ｏｉから１．　０ｍｇ／Ｉ含有し、最も望ましくは上記Ｍｎ ５ＯＤ酵素を０．０５から０．５ｍｇ／ｌの含有する。

本発明のさらなる側面は、（ａ）ＭｎＳＯＤ酵素を産生ずる微生物を培養してＭ ｎ５ＯＤ酵素を含有する培養菌体を生産し、（ｂ）培養菌体からＭｎ５ＯＤ酵素 を単離し、（Ｃ）単離したＭｎ５ＯＤ酵素を精製して（ａ）の段階で生産したＭ ｎ５ＯＤ含有培養菌体中に存在するＭｎ５ＯＤ酵素と比較して本質的に化学修飾 されていない精製酵素を製造し、（ｄ）化学修飾されていないＭｎ５ＯＤ酵素を 薬物的に利用できる賦形剤と混合することにより、薬物組成物を製造する方法を 提供するものであり、上記Ｍ　ｎ　Ｓ　ＯＤ酵素が本質的にＢＳあるいはＢＣ由 来Ｍｎ５ＯＤのアミノ酸配列をもっことを特徴とする。

本明細書に記載したように、（ａ）の段階における望ましい形質転換微生物は、 Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓあるいはＢ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ 以外の種の形質転換微生物である。

さらに本発明は、スーパーオキシドラジカル類の存在に起因する病的状態の予防 や治療に使用するための薬物組成物の製造における、天然型で本質的にＢＳある いはＢＣ由来Ｍ　ｎ　Ｓ　ＯＤのアミノ酸配列をもつことを特徴とする、Ｍｎ５ ＯＤ酵素の用途を提供する。

ＢＳおよびＢＣ由来Ｍｎ５ＯＤ酵素は、外科手術あるいは移植手術の際に組織に 潅流させる溶液の製造に特に有用であることか見い出された。

これゆえ、本発明のさらなる特定な用途として、外科手術あるいは移植手術の際 に組織（特に通常の血液供給から取り出した組織）に潅流させる溶液を製造する ためにＭｎ５ＯＤ酵素を使用するものがあり、ここでＭｎ５ＯＤ酵素は天然型で 本質的にＢＳあるいはＢＣ由来Ｍｎ５ＯＤのアミノ酸配列をもつ。

本発明で使用するＢＣおよびＢＳ由来Ｍｎ５ＯＤ酵素は、以前使用された５ＯＤ ｓに比べて明確な利点となる性質を有する。特に （ａ）ＢＳおよびＢＣ由来Ｍｎ５ＯＤｓの、ｐＨ７，５、Ｍｎ５ＯＤ蛋白濃度０ ．５ｍｇ／ｍｌの溶液中の半減期は、どちらも６０°Ｃで２時間以上、６５°Ｃ で３０分間以上、７０℃で少なくとも１０分間、７５°Ｃで少なくとも２分間で ある。

（ｂ）ＢＣおよびＢＳ由来Ｍｎ５ＯＤは、どちらも７以下６以上のｐＨで全触媒 活性の少なくとも１０％の活性を保つ。

（ｃ）両酵素の抗原性は非常に低く、定量することができない。これゆえ、Ｓ、 １ａｃｔｉｓやＳ、ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来５ＯＤｓなどの酵素の抗原性は、 ウサギの抗体価を測定して決定できるのに対し、ＢＣあるいはＢＳ由来天然型Ｍ ｎ５ＯＤｓは、組み換え法により製造したものも、ＢＣあるいはＢＳから抽出し た後、精製して発熱性物質を除去して製造したものも、通常の方法では抗体反応 を引き起こすことができない。

（ｄ）ＢＣおよびＢＳ由来Ｍｎ５ＯＤの、ｐＨ７，５、蛋白濃度０．５ｍｇ／ｍ ｌの無菌溶液中の半減期は、どちらも４°Ｃで１年以上、室温（１５〜２０℃） で３か月収上である。５０％グリセロール中−２０°Ｃ（両酵素はこの条件でも 液体状態のままである）での半減期は、５年以上である。

本明細に記載した特定の薬物用途に加え、本発明のＢＳおよびＢＣ由来Ｍｎ５Ｏ Ｄ酵素は、以下に記載するように工業的にも使用できる。（ｉ）診断試験におけ る過酸化水素の発生。さまざまな酵素や試薬が、過酸化水素を測定／監視するた めに利用できる。（ｉ　ｉ）工業システムにおける、スーパーオキシドの除去。

香料や嫌気工程など含め、工業ではさまざまなスーパーオキシド捕捉剤が使用さ れている。（ｉｉｉ）食品などにおける（風味を分解して損なわせる）スーパー オキシドの除去。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＭｎＳＯＤ酵素は、これまで単 離されたり報告されたことがない新規な物質であり、本発明のさらなる側面とな る。

これゆえ、本発明はさらに、はぼ純粋な形の、本質的にＢ、ｃａｌｄｏｔｅｎａ ｘのアミノ酸配列をもつ、Ｍｎ５ＯＤ酵素を提供するものであり、そのアミノ酸 配列は、 （ｉ）図３に示すアミノ酸配列、 （ｉｉ）（ｉ）の配列中の１〜３０アミノ酸が挿入、欠失、置換したアミノ酸配 列、 から選択される。ただし、上記アミノ酸配列（ｉｉ）の１０３位はＧｌｕてあり 、かつ／あるいは１８８位はＩｌｅである。

配列（ｉ　ｉ）は、例えば（ｉ）の配列中の１〜２０アミノ酸が、望ましくは１ 〜ＩＯアミノ酸が挿入、欠失、置換したアミノ酸配列である。

現在までに、ヒトＣｕ／Ｚｎ５ＯＤｓ　（Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９ ８３）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｂｅｒｍｉｎｇ ｈａｍｅｔ　ａｌ、、１９８８）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　（Ｓｅｔｏ　ｅｔ　 ａｌ、、１９８９）、ヒトＭｎ　ＳＯＤ（ＭｃＣｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、１９７ ７）、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓのＦｅ５ＯＤ　（Ｌａｕｄｅｎｂ ａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９）、大腸菌のＭｎ５ＯＤ（Ｔｏｕａｔｉ　ｅｔ 　ａｌ、、１９８３）とＦｅ５ＯＤ　（Ｓａｋａｍｏｔｏ　ａｎｄ　Ｔｏｕａｔ 　ｉ、１９８４）を含め、多数の真核細胞や原核細胞から、さまざまな５ＯＤｓ をコードする構造遺伝子がクローン化されている。ＢＳのＭ　ｎ　Ｓ　ＯＤ遺伝 子のクローニングおよびその酵母内での発現も、既に報告されている（Ｂｏｗｌ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０）。

本明細ではさらに、グラム陽性好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ のＭｎ５ＯＤのクローニング、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ ｈｉｌｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来両Ｍｎ５ＯＤ酵 由来全Ｍｎ５ＯＤ酵素、両酵素の大腸菌内大量発現について、記載する。

これゆえ、本発明はさらに、上記で定義したＢＣ由来Ｍｎ５ＯＤ酵素をコードす るＤＮＡ配列から成る組み換えＤＮＡ分子を提供する。

そのような組み換えＤＮＡ分子は、（ａ）図３に示すＤＮＡコード配列、（ｂ） 遺伝暗号に従って上記配列を縮重させたＤＮＡ配列から選択される。

本明細書に記載したように、我々はＢＣおよびＢＳ由来のＭｎ５ＯＤを大腸菌内 で大量発現させる方法を開発し、これは本発明のさらなる側面となる。

これゆえ、本発明のさらなる側面は、プロモーターと効果的に連結したＭ　ｎ　 Ｓ　ＯＤ酵素をコードする構造遺伝子を少なくともひとつ含む組み換えプラスミ ドもつ形質転換大腸菌株を培養し、Ｍ　ｎ　Ｓ　ＯＤ酵素を製造する方法を提供 するものであり、そのプロモーターが大腸菌固有のｔｒｐプロモーター、あるい はｔｒｐプロモーターに類似した塩基配列をもち、ｔｒｐプロモーターとの違い はそのプロモーター活性がほぼ維持される程度のものである関連プロモーターで あることを特徴とする。

プロモーター配列の具体例を以下に示す。

（ｉ）配列ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴ　（ Ｉ）。

（ｉ　ｉ）配列（１）に類似のＤＮＡ配列で、配列（Ｉ）との違いはそのプロモ ーター活性がほぼ維持される程度のもの。

（ｉｉｉ）配列（Ｉ）と少なくとも５０％、望ましくは少なくとも７５％、最も 望ましくは少なくとも９５％のホモロジーをもつ配列。

（１ｖ）配列（Ｉ）との違いがｌθ以下の欠失、望ましくは５以下、最も望まし くは２以下の挿入や置換である配列。

（Ｖ）１２から５０塩基、望ましくは２０から３５塩基、最も望ましくはおおよ そ２９塩基から成る（ｉ）から（ｉｖ）で定義された配列。

（ｖｉ）５’端の配列がＴＴＧＡＣＡで３°端の配列かＴＴＡＡＣＴである（ｉ ）から（Ｖ）で定義された塩基配列。

（ｖｉ）５’端の配列かＴＣＡＡＴＴで３“端の配列かＡＣＡＧＴＴである（ｉ ）から（ｖ　ｉ）で定義された塩基配列。

（ｖｉｉ）３’　と５′配列の間にＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧあるい はプロモーター活性がほぼ維持される程度の違いをもつ、それと類似の配列から 選択される介在配列をもつ（ｉ）から（ｖｉ）で定義された配列（ｖ　ｉ　１） ＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧとの違いが１０以下、望ましくは５以下、 最も望ましくは２以下の欠失、挿入、置換である介在配列をもつ、（ｉ）から（ ｖｉ）で定義された配列。

配列ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴの前に、配 列ＧＣＴＴＡＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＧを、 後に配列ＡＧＴＡＣＧＣＡＧＣＴＴＧＧＣを置くことかできる。

Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｏｄ遺伝子の分子クローニゲの ため、以下の方法を採用したコード遺伝子をクロニングする第一段階として、Ｄ ＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション実験による遺伝子検出に用いるための、構 造遺伝子と充分なホモロジーをもつオリゴヌクレオチドを設計した。アミノ酸配 列の解析により、１７番目から３４番目のアミノ酸から成るペプチドの翻訳縮重 が最小であることがわかった。そこで、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ ｕｓの遺伝子で最も高い頻度で使用されているコドンを縮重の位置の塩基に使用 し、５０ｍｅ　ｒのアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した（図１）。合成 したオリゴヌクレオチドがＢ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノム 中の特定の配列にハイブリダイズすることを確認するため、サザンプロット実験 を行った。オリゴヌクレオチドを放射標識し、さまざまな制限酵素で切断したＢ 、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＮＣＡ１５０３ゲノムＤＮＡに対する ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション反応に使用した。

採用した条件（以下の実施例を見よ）下で、プローブは以下の制限酵素切断断片 に強くハイブリダイズすることがわかった；２．４５ｋｂのＢｃｌｌ断片、５． １ｋｂのＣ１ａＩ断片、６．８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、３゜４ｋｂのＨｉｎｄＩ ＩＩ断片、２０ｋｂのＰｓｔＩ断片、３．２ｋｂの５ａｌＩ断片、３．５ｋｂの ５ｓｔＩ断片、１７ｋｂのＸｈｏｌ断片。

オリゴヌクレオチドプローブの特異性が確認されたため、約８ｋｂの長さに部分 分解（Ｓａｕ３ａ）した染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断したｐＡＴｌ　５３Ｄ ＮＡと連結し、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓゲノムのプラスミド ライブラリーを構築した。得られた連結混合液を大腸菌Ｗ５４４５株に導入し、 形質転換体をアンピシリンを含むＬ寒天培地上で選択した。得られた６、０００ 個のアンピシリン耐性形質転換体の中で、４．１２５個がテトラサイクリン感受 性であることがわかった。組み換えクローンであると推定される４、１２５個の クローンの代表として無作為に５０個のプラスミドを解析した結果、４６個に挿 入断片を含むことが示された。放射標識したオリゴヌクレオチドをプローブとし て使用し、それぞれのアンピシリン耐性テトラサイクリン感受性組み換えクロー ンを、ｉｎ　５ｉｔｕコロニーハイブリダイゼーシヨンによりスクリーニングし た。プローブは、独立の２つのクローンに強くハイブリダイズした。それぞれの クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、ｐＢｃＭｌおよび９８０Ｍ２と命名し た。これら２つのプラスミドの制限酵素切断地図を図２に示す。この地図は、ｐ ＢｃＭｌの挿入断片の長さが４．７ｋｂで、９８０Ｍ２の挿入断片の長さが６． ８５ｋｂであることを示している。さまざまな制限酵素（単独あるいは２つの組 み合わせ）で切断して得たＤＮＡ断片を比較解析した結果、９８０Ｍ２の挿入断 片はＩ）ＢＣＭＩの挿入断片全体を含んでおり、ｐＢＣＭＩの挿入断片のベクタ ーに対する相対方向は９８０Ｍ２のものと逆であることが明らかになった。

ｐＢＣＭＩおよび１）８０Ｍ２中にクローン化されたＤＮＡの中のｓｏｄ構造遺 伝子の位置を特定するため、それぞれのプラスミドをさまざまな制限酵素で切断 し、得られた断片についてサザンプロット分析を行った。オリゴプローブにハイ ブリダイズする最小の制限酵素切断断片のひとつは、両プラスミドに共通する１ 、６ｋｂのＥｃｏＲＩ／５ｓｔＩ断片であった。

そこで、この断片をｐＢＣＭ２ＤＮＡからゲル精製し、同じＥｃｏＲＩと５ｓｔ Ｉで切断したＭｌ　３ｍｐ　１８およびＭｌ　３ｍｐ　１９に連結した。連結混 合液を大腸菌ＴＧＩに導入し、ＸＧａ１とＩＰＴＧを含むＨ上層寒天培地中に加 え、２ＸＹＴ寒天培地上に積層した。無色の外観から同定される組み換えプラー クを、鋳型ＤＮＡの調製に使用した。各Ｍ１３ベクターの代表の鋳型について、 ユニバーサルブライマーを使用した塩基配列分析を行った。両鍔型から得られた ＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳した結果、報告されたＭｎ５ＯＤ配列に相同性 のあるポリペプチドをコードするＯＲＦは見い出されなかった。この結果は、ｓ ｏｄがこの断片の中央部分に位置していることを示している。その後、挿入断片 の全配列を、２つの異なる方法で決定した＝　（ｉ）上記２つの鋳型から得られ た配列に特異的なオリゴヌクレオチドを合成し、決定した配列を延長するために 使用した；（ｉｉ）クローン化した１、６ｋｂのＥｃｏＲＩ／５ｓｔＩ断片を含 む９８０Ｍ２の３．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を電気抽出により単離し、自己 連結により環状化し、超音波処理により断片化し、Ｔ４ポリメラーゼ処理により 不揃いの末端をプラントエンド化し、ゲル精製した５００からｔｏｏｏｂｐの断 片をＭ１３ｍｐ８のＳｍａＩサイトに挿入した。

得られた組み換えクローンのうち１００クローンから鋳型ＤＮＡを調製した。得 られた塩基配列データを、ＤＮＡ５ＴＡＲ社のコンピューターソフトを使用し、 ひとつの連続した配列にまとめた。図３に示す配列は、得られた配列のうち、Ｄ ＮＡの両方の鎖から決定したｓｏｄ構造遺伝子を含む１２９４ｂｐの部分である 。

図３に示す塩基配列を翻訳した結果、ＡＵＧコドン（ｎ　ｔ　３８７）で始まり ＵＡＡコドン（ｎｔｌｏｏｌ）で終わる６１５ｂｐのＯＲＦが存在することが明 らかになった。推定ポリペプチドの長さは２０４ａａであり、Ｎ末端のＭｅｔを 除き、実験的に決定したＭｎ５ＯＤのアミノ酸配列（Ｂｒｏｃｋ　ａｎｄ　Ｗａ ｌｋｅｒ、１９８０）と完全に一致した。

４３８で始まり４８８で終わる配列は、遺伝子を同定するために使用したオリゴ プローブとほぼ完全な相補性を示した。ミスマツチがある３か所（ｎ　ｔ　４６ ５．４７７．４８３）はいずれも弱いＧＴペアを形成でき、ＳＯｄをコードする Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌＵＳ由来ＤＮＡにオリゴヌクレオチドが 充分結合したことの説明となる。翻訳開始コドンの前の配列（５’　−ＣＡＡＡ ＡＧＧＡＧＧＡＧＡ−３’　）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓの１６ ＳｒＲＮＡの３′端（３′−ＵＣＵＵＵＣＣＵＣＣＡＣＵ−５″）と強い相補性 を示した。翻訳終止コドンのすぐ３′側（ｎｔ１００７からＩ　Ｏ３６）に２回 対称を示す配列が存在し、それはＲｈｏ−非依存性転写ターミネータ−であると 考えられる。形成される推定ＲＮＡのステム／ループ構造のＤＧは−２２，２ｋ ｃａｌとなる。ｎ’ｔｌ１３３のＡＵＧ：］トンで開始し、上流にＢ、５ｕｂｔ ｉｌｉｓの１６ＳｒＲＮＡと適度な相補性を示す配列がある第二の推定ＯＲＦが 、ｓｏｄの３′側に同定された。コードする推定ポリペプチドは、現在のＰＩＲ データベース中のどの蛋白ともホモロジーを示さなかった。ｓｏｄ構造遺伝子の ＧＣ含量は５３．１％であり、表２にそのコドン使用を示すｓｏｄを大腸菌内で 大量発現させるため、本研究所で最近構築された一連の発現ベクターの一部であ るプラスミドｐＭＴＬ１００３およびｐＭＴＬ１０１３を使用した。ｐＭＴＬ１ ００３は、ｐＭＴＬ４　（Ｃｈａｍｂｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）に由来 し、変異Ｃｏ１Ｅルブリコン（１細胞あたり６００コピー；　Ｍ　ｉ　ｎ　ｔ　 。

ｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）から複製し、ｐｕｃｓ由来ｂｌａおよび１ａｃＺ ’　（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄＶｉｅｒｉａ、１９８２）をコードし、ｐｓｃｔ ｏｔの分配機能（ｐａｒ；Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３）および大腸 菌ｒｒｎＢダブルターミネータ−（Ｂｒｏｓｉｕｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１） およびｐＭＴＬ２０のポリリンカークローニング領域（Ｃｈａｍｂｅｒｓ　ｅｔ 　ａｌ、、１９８８）を取り入れたものである。１ａｃＺ’　の転写は合成ｔｒ ｐプロモーターの支配下にある。ｐＭＴＬＩＯ１３は、ｂｌａ遺伝子（アンピシ リン耐性遺伝子）がｔｅｔ遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子）に置換してい る点だけがｐＭＴＬ　１００３と異なる。以下の方法でこれらの発現ベクターを 作製した（詳細は図４を見よ）。

プラスミドｐＫＫ２２３−３から８３１ｂｐの５ｃａ１／ＳｍａＩ断片としてｂ ｌａ遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）の５′端とｒｒｎＢオペロンの転写ダブ ルターミネータ−シグナル（ＴＩとＴ２）を同時に単離し、ｐＭＴＬ４のＥｃｏ ＲＶサイトと５ｃａｌサイトの間に挿入し、ｐＭＴＬ７を得た。その後、ｐＳＣ １０１のｐａｒ安定性決定因子（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３）を含 む３８５ｂｐのＴａｑＩ断片をＥｃｏＲＶサイトとＳｃａ　Ｉサイトの間に挿入 し、ｐＭＴＬ８を得た。残りの操作は、最終ベクターのサイズを小さくし、不要 な制限酵素サイトを除去するために行った。ｐＭＴＬ８を５ａｉｌとＥｃｏ４７ で切断し、Ｓ１ヌクレアーゼでプラントエンド化し、自己連結させてｐＭＴＬ９ を得た。この５８ｂｐの欠失により、ユニークな５ａｌＩサイト、Ｅｃｏ４７サ イト、ＢａｍＨＩサイトが除去され、多数のＴａｑＩサイトとＨａｅＩＩサイト が除去された。その後、ｐＭＴＬ９から３２２ｂｐのＨａｅｌｌ断片を欠失させ 、最終ベクターｐＭＴＬ　１０のＨａｅＩＩサイトとＴａｑＩサイトをひとつず つ減らし、ユニークなＰｓｔｌサイトとＨｉｎｄＩＩサイトを除去した。

この欠失操作によりｐｓｃ　１０１のｐａｒ断片の一部か除去されるが、ｐＭＴ Ｌ　１０は、抗生物質による選択をせずに培養した実験で１００％の細胞内分配 安定性を示した。ベクターの基本骨格への最終修飾として、ｐａｒとＣｏ１Ｅ１ 複製開始点の間にユニークなＲｃｏＲＶサイトを導入するため、ｓｉｔｅ−ｄｉ ｒｅｃｔｅｄ−ｍｕｔａｇｅｎｅｓ　ｉ　ｓを行った。

この変異導入のため、まず、ｐＭＴＬ　１０のその領域を含む５３０ｂｐのＴａ ｑＩ断片を、Ｍ１３ｍｐ８のＡｃｃＩサイトにクローン化した。その後、変異導 入用オリゴヌクレオチドを用いて、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｍｕｔａｇｅ ｎｅｓ　ｉｓの手法により、希望のＲｃｏＲＶサイトを導入した。その後、変異 を導入したＴａｑＩ断片を再び単離し、ｐＭＴＬｌｏの１．４４ｋｂと４３０ｂ ｐのＴａｑＩ断片と連結した。得られた修飾ベクターをｐＭＴＬ　１００と命名 した。

異種プロモーターの転写制御下で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子 を適当な転写シグナルの近くに正しい方向で挿入することが必要である。そのよ うな操作は、方向性のあるクローニングのための便宜や、外来ＤＮＡの挿入を検 出するための手段があると、非常に容易になる。

最も簡単な方法のひとつに、ｐＵＣおよびＭ１３シリーズのベクター類（Ｖｉｅ ｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、１９８２）に例証される、１　ａ　ｃ　Ｚ’ 　にコードされたｂ−ガラクトシダーゼ　ａ−ペプチドの不活性化を利用するも のがある。機能する１　ａ　ｃ　Ｚ’　をもつベクターは、発色基質であるＸＧ ａ１の存在下で、適当な大腸菌宿主のコロニーやプラークを青色に着色する。（ 例えば外米遺伝子の挿入により）１ａｃＺ’遺伝子を不活性化すると、無色（白 色）のコロニー／プラークとなる。

ｐＵＣおよびＭ１３ベクター中のＩａｃＺ’遺伝子の上流には、固有のｌａｃ　 ｐｏプロモーター領域がある。

ｐＭＴＬ１００３およびｐＭＴＬ１０１３ベクター中に１ａｃＺ’選択のシステ ムを残しつつ、ｌａｃプロモーターをｔｒｐプロモーターを交換したいと考えた 。そのために、Ｍｌ　３ｍｔ　１２０ＤＮＡに部位特異的変異を導入し、１ａｃ Ｚ’　の３′端のＰｖｕＩＴサイトを除去して（ｌａｃ　ｐｏの５′端のＰｖｕ 　Ｉ　Ｉサイトをユニークサイトとして残し）、ｌａｃ　ｐｏの＋１位の３′側 にユニークなＨｐａＩサイトを導入すると同時に、ＮｄｅＩの認識配列（ＣＡＴ ＡＴＧ）中のＡＴＧが１ａｃＺ′の転写開始コドンのＡＵＧに相当するように１ ａｃＺ°遺伝子の開始部分にＮｄｅＩサイトを導入した。

この発現ベクターがＳＯＤの発現に適切でなくても、将来、例えば発現させよう とする外来遺伝子の同じ位置にＮｄｅＩサイトを導入した後、修飾１　ａ　ｃ　 Ｚ’のＮｄｅｌサイトに遺伝子を挿入することにより、他の遺伝子の発現にも利 用できる。この方法により、発現させようとする遺伝子のＡＵＧ開始コドンの位 置を、１ａｃＺ’遺伝子のシャインダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ ）配列と最適な距離にすることかてき、その後のＲＮＡ転写物の翻訳を最大限に することができる。合成大腸菌ｔｒｐプロ％−ターを含む８３０ｂｐＨｉｎｄ１ １１／Ｐｓｔｌ制限酵素断片をプラスミドｐＤＲ７２０（Ｒｕｓｓｅｌｌ　ａｎ ｄ　Ｂｅｎｎｅｔｔ、１９８２）から単離し、Ｐｏ１ｌｋ処理によりプラントエ ンド化し、修飾Ｍ１３ｍｔ１２０ベクターのＰｖｕ　Ｉ　ＩとＨｐａＩサイトの 間に挿入した。この操作により、固有の１ａＣプロモーターをｔｒｐプロモータ ーに効率的に交換することかできる（同様な方法で、ｌａｃ　ｐｏを他のすへて のプロモーター配列に交換することかできる）。

その後、ｔｒｐプロモーター／１ａｃＺ’／ポリリンカー領域をＭ１３ベクター から３８　ａｂｐのＨａｅｌｌ断片として取り出し、ｐＭＴＬ　１００のふたつ のＨａｅｌＩサイトのうちのひとつに（図５に示す方向に）クローン化し、Ｉ） ＭＴＬ１００３を得た。

ベクターｐＭＴＬ１０１３はｐＭＴＬｌ　００３のアナログであり、ｂｌａ遺伝 子かｐＢＲ３２２のｔｅｔ遺伝子に置換されている点だけが異なる。ｔｅｔ遺伝 子はｐＢＲ３２２から１．４３ｋｂのＥ　ｃ　ｏＲＩ／Ａｖ　ａ　Ｉ断片として 単離しくＢａ１ｂａｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６）、Ｐｏ１ｌｋによりプラント エンド化し、Ｍ　１３　ｍｐｌＯのＳｍａｌサイトに挿入した。その後、部位特 異的変異を導入し、ＣＩａＩサイト、ＨｉｎｄＩＩＩサイト、ＥｃｏＲＶサイト 、ＢａｍＨＩサイト、５ｐｈｉサイト、５ａｉｌサイトを除去した。それぞれの 塩基置換は・ｎｔ２７におけるＡからＴ；ｎｔ２８におけるＴからＡ；ｎｔ１８ ７におけるＴからＣ；ｎｔ３７９におけるＣからＴ；ｎｔ５６５におけるＴから Ｃ；ｎｔ６５６におけるＣからＴである（塩基番号はｐＢＲ３２２の配列のもの 、Ｂａ１ｂａｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６）。

その後、修飾ｔｅｔ遺伝子を約１．４３ｋｂＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片として 単離してｐＭＴＬ２８（図６を見よ）のＨｐａｌルミｌサイトし、ＢａｍＨＩ／ Ｂｃｌ■断片として再単離し、ｐＭＴＬ１００３をＳｓｐ　ＩとＤｒａＩで切断 して得た１、８５ｋｂ断片に連結した。

得られた最終プラスミドを、ｐＭＴＬ１０１３（図７）と命名した。

ｓｏｄ遺伝子は、ｐＢＧＭ２から１．３ｋｂのＮｒｕＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌ断片と して単離（図３）し、ｐＵＣ９のＳｍａＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に クローン化した後、同じ大きさのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として再単離 した。その後、この断片をＰｏ１Ｉｋ処理によりプラントエンド化した後、ｐＭ ＴＬ１００３のＳｍａＩサイトに挿入した。クローン化した断片の挿入方向か異 なる２種類の組み換えプラスミド（ｐＢＣＭ３とｐＢＣＭ４）を、さらなる研究 のために選択した、ｐＢＣＭ３の場合（図８）、ベクターのｔｒｐプロモーター から連続して転写されることにより発現か促進されると思われる方向に、ｓｏｄ がある。ｐＭＴＬ　１００３の代わりにｐＭＴＬ１０１３を使用することにより 、ふたつのアナログプラスミドｐＢＣＭ５　（ｐＢＣＭ３と同等のもの）および ｐＢＣＭ６　（ｐＢＣＭ４と同等のもの）を得た。

ｐＢＣＭ３およびｐＢＣＭ４をもつ細胞を１００μＭの硫酸マンガンを含む複合 培地（２ＸＹＴ）中で培養し、対数増殖期の後期にインドールアクリル酸（２０ μｇ／ｍ１）を加えてベクターのｔｒｐプロモーターからの転写を誘導した。１ 時間ごとに培地から細胞を採取し、超音波処理により破砕し、遠心して細胞の残 骸を除去した後、抽出物のＳＯＤ活性を測定した。

ｐＢＣＭ３をもつ細胞が生産するＭ　ｎ　Ｓ　ＯＤ量は、１０時間後、最高値で ある培養１ｍｌあたり６２，２７５ユニツト（可溶性蛋白１ｍｇあたり１２．２ １０ユニツトと同等）に達した（図９）。純粋なＭｎ５ＯＤの比活性値（２５， ０００ｕ／ｍｇ）を参考にすると、この発現量は細胞の可溶性蛋白の４７％に相 当する、二とになる。全細胞抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥした後、クマシーブルー で染色したゲルをデンシトメーターを用いて読み取り、この発現量を確認した（ 図１０を見よ）。

ｐＢＣＭ４をもつ細胞か生産するＳＯＤ量は低い値（培養１ｍｌあたりｌＯ１９ ユニット）であることから、この高い発現量はベクターのｔｒｐプロモーター（ こ起因することがわかる。Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　１ｕｓのｓｏ ｄ遺伝子を大量に発現させる大腸菌の驚くべき能力は、コード領域にほとんどモ ジュレータ−コドンを使用していないこと（ＣＧＧコドンとＧＧＡコドンをひと つずつしか使用していなしり、コード領域のコドン使用が大量に発現している大 腸菌遺伝子のものと同じ特徴をもつこと、コード領域のすぐ上流にリポソーム結 合部位のコンセンサス配列があることを考えると矛盾しない。

固有のＳＯＤ活性量が異なるさまざまな大腸菌宿主における、ｐＢＣＭ３による ｓｏｄ発現レベル量を調べた（表３）。この場合、実施例に記載したように、最 小塩培地中のトリプトファンか枯渇した後の対数増殖期の後期に、ｔｒｐプロモ ーターからの転写を誘導した。不可解なことに、５ｏｄＡ宿主やｗｔ宿主のもの と比較して、変異ｓ　ｏｄＢ遺伝子座をもつ宿主の組み換えＳＯＤ発現量はかな り低かった。

ｓｏｄ変異株は、大腸菌中でスーパーオキシドフリーラジカルを生成するとして 知られる市販の除草剤メチルビオロゲン（ｒｎｅｔｈｙｌ　ｖｉｏｌｏｇｅｎ： Ｃａｒｌｉｏｚ　ａｎｄ　Ｔｏｕａｔｉ、１９８６）に対する感受性か増大して いることか報告されている。それゆえ、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ ｕｓの酵素が、大腸菌Ｑ（ニア８１株の増大したメチルビオロゲンに対する感受 性を相補することができるか興味がもたれた。

そこで、ｐＢＣＭ３をもつＱＣ７８１株とｐＢＣＭ３をもたないＱＣ７８１株を １０−５Ｍメチルビオロゲン存在下で培養し、増殖速度に対す名作用を調べた。

結果を図ＩＩに示す。組み換えＳＯＤの発現は、薬物による増殖阻害作用を軽減 はするが、メチルビオロゲン非存在下のＱＣ７８１株の増殖速度を達成するまで 完全回復はしなかった。この結果は、クローン化した酵母のＭｎ５ＯＤを用いて 行われた同様の実験（Ｓｃｈｒａｎｋ　ｅｔａｌ、、１９８８）の結果と異なる 。

以下の実施例で、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　ｌｕｓおよびＢ、ｃａ ｌｄｏｔｅｎａｘ由来Ｍｎ５ＯＤの生産について、さらに詳細に記載する。使用 した菌株や組み換えベクターを、表１に記載した。

実施例１ （ａ）培地および培養条件 Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、以下の培地中で５８°Ｃ，ｐＨ ７，０、空気流入速度１ｖｖｍの条件で培養した：ショ糖（４％）、酵母抽出物 （５％）　、ＫＨ，ＰＯ，（１％）　、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０（０，０５４％） 　、ＭｎＣ１，’　４Ｈ２０（０，ＯＯ３％）、ＦｅＣｌ、−Ｈ，Ｏ（０，００ １４％）、クエン酸−水和物（０，０６４％）、ポリプロピレングリコールＰ− ２０００（０，０１％）。大腸菌は、Ｌ培地（１％トリプトン、０．５％酵母抽 出物、０．５％塩化ナトリウム）中で、常套的に培養した。固体培地（Ｌ寒天培 地）は、Ｌ培地に２％（ｗ／ｖ）の寒天（Ｂａｃｔｏ−Ｄｉｆｃｏ）を加えたも のである。形質転換体の維持および形質転換体の選択に使用した抗生物質濃度は 、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン１５μｇ／ｍｌ、カナマイシ ン３０μｇ／ｍｌ　クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌである。ｔｒｐプロモー ターの抑制が必要なときは、培地中に過剰のトリプトファン（１００μｇ／ｍ］ ）を加えた。大腸菌中の組み換えＳＯＤをパイロットスケールで生産するための 培地は、ブドウ糖（１゜４％）、硫酸アンモニウム（０，２５％）　、ＫＨ，Ｐ Ｏ４（０，３％）　、ＫｔＨＰＯ４（０，２％）、クエン酸ナトリウム（０，０ ０５％）、酵母抽出物−Ｄｉｆｃ。

（０，５％）、硫酸マグネシウム（１％）、微量成分（１，０％）である。微量 成分のストック溶液は、ＥＤＴＡ−Ｎａｇ　（０，５％）　、ＦｅＣｌｓ−６８ ２０（ｏ。

０５％）、ＺｎＯ（０，００５％）　、ＣｕＣ１，−Ｈ２Ｏ（０，００１％）　 、Ｃ０ＮＯ３”　６Ｈ，０（０，Ｏ０１％）　、ＮＨ，ＭＯ□Ｏｖａ　（０，Ｏ Ｏ１％）である。培養菌体は、３７℃、ｐＨ７，０＋０．１、空気流入速度ｌｖ ｖｍの条件で培養した。この条件下で約８時間後に試験増殖を停止し、培養菌体 を集菌した。

（ｂ）ＤＮＡの精製 Ｂｒ１ｊ溶解法（Ｃｌｅｗｅｌ　１　ｅｔ　ａｌ、、１９６９）により調製した 透明な溶解物を塩化セシウム／臭化エチジウム密度勾配遠心（Ｃｏｌｍａｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、１９７８）Ｌ、プラスミドを精製した。迅速小スケールプラスミド 精製技術（Ｈｏｌｍｅｓ　ａｎｄ　Ｑｕｉｇｌｅｙ、１９８１）も、スクリーニ ングのために使用した。ＤＮＡ供与体であるＢ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉｌｕｓの染色体ＤＮＡは、基本的にＭａｒｍａｒ（１９６１）により報告され た方法で調製した。

（Ｃ）制限酵素切断、連結、形質転換法制限酵素およびＤＮＡリガーゼは、Ｂｅ ｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）から購入 し、製造元が推奨するバッファーおよび条件で使用した。大腸菌の形質転換は、 基本的にＣｏｈｅｎら（１９７２）により報告された方法で行った。

（ｄ）アガロースゲル電気泳動 制限酵素切断物は、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液を使用し、標準水平システ ム（ＢＲＬモデルＨ４）上の１％アガローススラブゲル中で電気泳動した。切断 していないＤＮＡは１２５Ｖ、５０ｍＡで３時間電気泳動し、切断したＤＮＡは １５Ｖ、１０ｍＡで１６時間電気泳動した。断片の大きさは、λフアージＤＮＡ をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとて切断した断片と比較することにより、見積も った。電気抽出（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９７７）により、ゲル から断片を単離した。

（ｅ）塩基配列の決定 Ｍ１３バクテリオファージクローンの塩基配列を、バクテリオファージＴ７のＤ ＮＡポリメラーゼを修飾した“５ｅｑｕｅｎａｓｅＲ″　（Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ 　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９８７）を用い、Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）によ るジデオキシヌクレオチド法により、決定した。実験条件は、製造元（ＵＳＢ社 ）が記載したものを使用した。２本鎖ＤＮＡプラスミドの塩基配列の決定は、Ｃ ｈｅｎとＳｅｅｂｕｒｇ　（１９８５）により開発されたクレノウボリメラーゼ ／ジチオキシヌクレオチド法の変法を用いて行った。実験条件は、製造元（ＢＣ Ｌ社）が記載したものを使用した。

（ｆ）ＤＮＡのサザントランスファー 制限酵素切断したＤＮＡ断片は、ＲｅｅｄとＭ　ａ　ｎ　ｎ（１９８５）の方法 により、アガロースゲルから“ｚｅｔａ　ｐｒｏｂｅ”ナイロン膜に移した。ゲ ルを０，４Ｍ水酸化ナトリウム転写溶液に移す前に、０．２５Ｍ塩酸（１５分間 ）で部分的に脱プリン化した。毛細管現象による転写を４〜１６時間行った後、 ハイブリダイゼーションに用いた。

（ｇ）ｉｎ　５ｉｔｕ　コロニーハイブリダイゼーショント 希望の組み換えプラスミドを得るため、ニトロセルロースフィルターディスク（ Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｌｌ、０．２２μｍ）を使用し、Ｇｒ ｕｎｓｔｅｉｎとＨｏｇｎｅｓｓ　（１９７７）が報告したｉｎ　５ｉｔｕコロ ニーハイブリダイゼーシヨン法により、菌コロニーをスクリーニングした。

（ｈ）オリゴヌクレオチドの放射標識 オリゴヌクレオチドプローブは、〔γ−”Ｐ）ＡＴＰを加えてＴ４ポリヌクレオ チドキナーゼ処理し、５゛　−水酸末端を末端標識した（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　 Ｇｉ　１ｂｅｒｔ、１９７７）。取り込まれなかったヌクレオチドは、（Ｐｈａ ｒｍａｃ　ｉ　ａ）社が製造した使い捨てセファデックスＧ−２５カラムを通す カラムクロマトグラフィーにより、除去した。

（ｉ）ハイブリダイゼーション条件 ５′末端を標識した５　０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプローブを使用したハイ ブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）が報告した方法により 、５５゛Ｃの温度で２時間以上行った。フィルターの洗浄は、４５°Ｃで、５分 間ずつ数回行った。

（Ｄ部位特異的変異の導入 カップルブライミングオリゴヌクレオチドを用いた特異的変異の導入は、Ｃａｒ ｔｅｒら（１９８５）のサプレッサー選択法を用いて行った。放射標識したオリ ゴヌクレオチドをプローブとして使用し、Ｃａｒｔｅｒら（１９８４）が報告し たディファレンシャルテンブリチャーハイブリダイゼーション法（ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔｉａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ　ｍｅｔ ｈｏｄ）により、変異株を同定した。

（ｋ）分配安定性 連続培養菌体を用い、プラスミドベクターの分配安定性を解析した。細胞を、Ｌ Ｈ５００シリーズの発酵槽と６００ｍ１の液量で使用する１リツトル連続培養槽 のコントロールパッケージで増殖させた。使用した増殖培地は、Ｔｅｍｐｅ　ｓ 　ｔ　（１９６９）の単純塩培地である。

培養菌体を、３７°Ｃ，ｐＨ７，０、空気流入速度１ｖｖｍで維持した。接種後 、培養菌体をバッチで４〜５時間増殖させてから、新鮮な培地の流入を開始した 。サンプルを定期的に採取し、連続的に希釈して感受性試験寒天培地に塗布し、 コロニーのｂ−ラクタマーゼ産生をコードするプラスミドをスクリーニングした 。

（１）スーパーオキシドジスムターゼ活性の測定歯を１リツトルバツチ培養し、 増殖のさまざまな段階で１００ｍ１のサンプルを採取した。サンプルを氷冷し、 １’３，０００ｇで１２０分間遠心し、５ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７ ，８）に再懸濁し、凍結した。

ＭＳＥ超音波破砕機（１５０Ｗ）を用い、周波数を中程度、振幅を２に設定し、 細胞を氷上で３回（各３０秒間）破砕した。細胞の残骸を、ｔｏ、０００ｇで５ 分間遠心して除去した。ＳＯＤ活性は、ＭｃＣｏｒｄとＦｒ１ｄｏｖｉｃｈ　（ １９７９）が報告したチトクロームＣ第二鉄の還元阻害反応により、測定した。

蛋白濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ　（１９７６）の方法で測定した。ＰＡＧＥ後のゲ ルをニトロブルーテトラゾリウム試薬に浸した後、リボフラビンを加えることに より、ＳＯＤ活性を視覚化した。この方法は、ＢｅａｕｃｈａｐとＦｒ　ｉ　ｄ ｏｖｉｃｈ（１９７１）の報告にすべて記載されている。

（ｍ）ｐＢＣＭ３を含む大腸菌ＴＧＩの小スケール発酵バッチ培養では高い組み 換えＳＯＤ発現量か得られたが、組み換え蛋白の商業的生産に使用する条件によ り類似した条件でもこの高い発現量が維持されるか興味がもたれた。そこで、本 明細に記載した最小塩培地を使用し、８リツトルパイロツトスケール培養を行っ た。接種する種菌は、プロモーターの抑制および選択のためにトリプトファン（ １００μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたし寒天培 地上に新たに生育させた形質転換細胞から調製した。硫酸マンガン、アンピシリ ン、トリプトファンを含む５００ｍ１の２ＸＬＢ培地で培養し、種菌を得た。種 菌を３７°ＣＣ１２０Ｏｒｐて７時間培養した。ひとたび接種したら、細胞密度 が最も高くなる対数増殖期の後期にトリプトファン枯渇によりｔｒｐプロモータ ーのスイッチが入ることを期待し、集菌するまで培養菌体をフルコースで培養し た。遠心して細胞を集菌し、細胞のペーストを袋に入れ、瞬間凍結し、抽出する まで一８０°Ｃて保存した。パイロットスケール培養で得られたＳＯＤ発現量は 、振どうフラスコ実験で得られたものと一致した。精製した後、精製組み換えＳ ＯＤはダイマー蛋白であり、各サブユニットの分子量はおおよそ２１，０００ｄ ａｌ、等電点５．５であることが同定された。

上記の結果から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由 来Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子（ｓｏｄ）が大腸菌 中にクローン化され、その全ヌクレオチド配列が決定されたことがわかる。翻訳 後に切断されるＮ末端のメチオニン残基の例外を除き、推定アミノ酸配列は、以 前に報告されたアミノ酸配列と１００％一致した。組み換えＭｎ５ＯＤは、大腸 菌中でｉｎ　ｖｉｔｒｏでもｉｎ　ｖｉｖＯでも酵素活性があり、大腸菌のｔｒ ｐプロモーターと転写をカップリングさせると、細胞の可溶性蛋白の４７％に相 当する量のＭｎ５ＯＤが発現した。

実施例２ （ａ）Ｂ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来ｓｏｄ遺伝子の分子クローニング Ｂ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ遺伝子をクローニングするためのオリゴヌクレオチド プローブを放射標識し、さまざまな制限酵素で切断したＢ、ｃａｌｄｏｔｅｎａ ｘＹＴ１ゲノムＤＮＡに対するＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション反応に使 用した。使用した条件（以下を見よ）下で、プローブは、４．１ｋｂＨｉｎｄｌ ＩＩ断片を含め、さまざまな制限酵素切断断片に強くハイブリダイズした。よっ て、おおよそその大きさのＨｉｎｄＩＩＩ−切断ゲツムＤＮＡをアガロースゲル から単離し、Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで切断したｐＵＣｌ　９プラスミドＤＮＡに 連結した。得られた連結混合液を、大腸菌ＴＧＩ株に導入し、形質転換体をアン ピシリンとＸＧａ１を含むＬ寒天培地上で選択した。全部で独立の１１００個の 組み換え体（白色コロニー）を、放射標識したオリゴヌクレオチドをプローブと したｉｎ　５ｉｔｕコロニーハイブリタイゼーシヨンによりスクリーニングした 。プローブは４個の異なる組み換えクローンに強くハイブリダイズした。これら のクローンのひとつからプラスミドＤＮＡを単離し、ｐＭＣＢ７と命名した。

（ｂ）Ｂ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来ｓｏｄ遺伝子の塩基配列の決定 ｐＭＣＢ７にクローン化したＤＮＡ中のｓｏｄ構造遺伝子の位置を決めるために 、プラスミドＤＮＡをさまざまな制限酵素で切断し、得られた断片についてサザ ンプロット分析を行った。

オリゴプローブにハイブリダイズする最も小さな制限酵素切断断片のひとつは、 １．９ｋｂのＡｃｃＩ断片であった。この断片をｐＭＣＢ７からゲル精製し、自 己連結によりＤＮＡを環状化し、超音波処理により断片化し、不揃いの末端をＴ ４ポリメラーゼ処理によりプラントエンド化し、ゲルから精製した５００から１ ０００ｂｐの断片を、Ｍ１３ｍｐ８のＳｍａＩサイトに挿入した。

得られた組み換えクローンのうち、１００クローンから鋳型ＤＮＡを調製した。

ＤＮＡ５ＴＡＲ社のコンピューターソフトを使用し、得られた塩基配列を連続し た配列にまとめた。図１２に示す配列は、得られた配列のうち、ＤＮＡの両方の 鎖から決定したｓｏｄ構造遺伝子を含む７８０ｂｐの部分である。

図１２に示す塩基配列を翻訳すると、ＡＵＧコドン（ｎｔ３０）から始まりＵＡ Ａコドン（ｎｔ６４３）で終わる６１５ｂｐのＯＲＦが存在することが明らかに なった。図１２に示す領域には、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　Ｉｕｓ ゲノムの相当する領域と比較し、３５塩基の違いがあった。これらのうち２１個 が遺伝子コード領域中にあり、それに起因してコードされるふたつのポリペプチ ドにはアミノ酸２個の違いがあった。これゆえ、ＢＣＭｎＳＯＤは１０３位、１ ８８位にそれぞれアミノ酸残基Ｇｌｕ、Ｉｌｅを含むのに対し、Ｂ　ＳＭｎ　Ｓ ＯＤはそれぞれ相当する位置にアミノ酸、６，５ｐＳＶａｌを含む。Ｂ、ｓｔｅ ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの遺伝子と同様に、転写開始コドンの上流に配 列（５°　−ＣＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡ−３’　）があり、この配列はＢａｃ ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓの１６ｓｒＲＮＡの３′端（３’　−ＵＣＵＵＵ ＣＣＵＣＣＡＣＵ−５’）と強い相補性を示した。同様に、転写終止コドンのす ぐ３′側に２回対称を示す配列（ｎ　ｔ　６５４から６７７）があり、それは恐 ら＜Ｒｈｏ−非依存性転写ターミネータ−であると考えられる。しかしこの場合 、形成する推定ＲＮＡステム／ループ構造のＤＧ（−２６，４ｋｃａｌ）は、Ｂ 、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子の下流の相当する構造のもの（ ＤＧ−２２，２ｋｃａｌ）に比べて高く、これは、ＴからＣへの置換という１個 の塩基の違いに起因する。ｓｏｄ構造遺伝子のＧＣ含量は５２．８％であり、そ のコドン使用を表２に記載する。

（ｃ）ＢＣＭｎＳＯＤの大量発現 ＢＣＭｎＳＯＤ遺伝子の大量発現のために、上記と同様なプラスミドを構築した 。この場合、１．９ｋｂのＡｃｃＩ断片をｐＭＴＬ１００３のＡｃｃＩサイトに 挿入し、組み換えプラスミドｐＢＣＭ８　（図１３を見よ）およびｐＢＣＭ９を 得た。９８０Ｍ８　（図１３）の場合、ｓｏｄはベクターのｔｒｐプロモーター から連続して転写されることにより発現が促進される方向にあった。ｐＭＴＬ１ ００３の代わりにｐＭＴＬ１０１３を使用することにより、ふたつのアナログプ ラスミドｐＢＣＭＩＯ（９８０Ｍ８と同等）およびｐＢｃＭｌ　１　（ｐＢＣＭ ９と同等）を作製した。

９８０Ｍ８およびｐＢＣＭ９をもつ細胞を１００μＭ硫酸マンガンを含む複合培 地（２ＸＹＴ）中で培養し、対数増殖期の後期にインドールアクリル酸（２０μ ｇ／ｍｌ）を加えることによりｔｒｐプロモーターからの転写を誘導した。１時 間ごとに細胞を培地から採取し、超音波処理により破砕し、遠心して細胞の残骸 を除去した後、抽出物のＳＯＤ活性を測定した。Ｂ、５ｔｅａｒ。

ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　ｌｕｓの組み換えクローンのものと同様な発現量が得られ た。つまり１０時間後、９８０Ｍ８をもつ細胞により生産されるＭｎ５ＯＤは、 最大量である培養１ｍｌあたり９０．７１０ユニツト（可溶性蛋白１ｍｇあたり ９．９１３ユニツトと同等）に達した（図９）。純粋なＭｎ５ＯＤの比活性（２ ５，０００ｕ／ｍｇ）と比較すると、この値は細胞の可溶性蛋白の４０％に相当 する。全細胞抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥした後クマシーブルー染色したゲルをデ ンシトメーターで読み取り、この発現量を確認した（図１０を見よ）。ｐＢＣＭ ９をもつ細胞が生産するＳＯＤ量は低い（培養１ｍｌあたり８．９ユニツト）こ とから、この高い発現量はベクターのｔｒｐプロモーターに起因することか明ら かになった。Ｂ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来ｓｏｄ遺伝子を大量発現させる大腸 菌の能力は、コード領域にモジュレータ−コドンをほとんど使用していないこと （ＣＧＧとＧＧＧコドンをひとつずつしか使用していない）、大腸菌で大量発現 している遺伝子のコドン使用（Ｇｒｏｓｊｅａｎ　ａｎｄ　Ｆｒ１ｅｒｓ、１９ ８２）と同じ特徴を示すこと、リボゾーム結合サイトのコンセンサス配列かすぐ 上流にあることを考えると矛盾しない。

実施例３ 精製した発熱性物質を含まないＢ５Ｍｎ５ＯＤは、以下の方法でＢＳの培養菌体 から製造した。

集菌した後、ＢＳ細胞を高圧ホモゲナイズで破砕し、クルードな抽出物をＤＥ− ２３セルロースから分画溶出してバッチ精製した。Ｍｎ５ＯＤを含む０．４ｍ分 画を順次以下に示すクロマトグラフィーにかけた：（ｉ）ｐＨ８，０におけるＤ ＥＡＥ−セファロースを用いたイオン交換グラジェントクロマトグラフィー、（ ｉ　１）ｐＨ６，８におけるリン酸グラジェントを使用したヒドロキシアパタイ トクロマトグラフィー。

純度３０％の酵素を、ｐＨ７，５におけるＱ−セファロースを用いたイオン交換 グラジェントクロマトグラフィーおよびセファクリル（Ｓｅｐｈａｅｎｙｌ）Ｓ −２００を用いたゲル濾過により、発熱性物質を除去し、単一に精製した。

薬物試験 （ａ）血清中での半減期 Ｂ５Ｍｎ５ＯＤの半減期を、モルモットモデルを用いて評価した。赤血球の溶血 に起因する固有Ｃｕ　／　Ｚ　ｎ　ＳＯＤの妨害反応は、アッセイ系に５ｍＭシ アニドを加えることにより抑制した。

半減期は約６時間となった。

（ｂ）抗原性 （１グループあたり４匹）のモルモット（ｎ＝１２）のグループに、それぞれ１ ，２．１０ｍｇ／体重ｋｇ／６時間を腹腔内投与したが、抗原性はみられなかっ た。

４８時間後および９６時間後（２匹／量／時間）に殺した動物の死後解剖の結果 、内部組織に有害な作用はなく、全病理は正常であった。

（Ｃ）心濯流における保護作用 心潅流用標準（リンガ−）溶液に、５ｍｇの酵素と１０ｍｇの乳糖と５μｍｏｌ のトリス塩酸を含有するバイアルから、０．１ｍｇ／ｌとなるよう、Ｂ５Ｍｎ５ ＯＤを加えた。　６匹のミニブタを３匹ずつの２グループに分け、ヒトの心臓手 術を模倣した手術を行った。特に、試験溶液を潅流している間、２時間にわたり 動物の大動脈を結紮した。

試験の最後に結紮をはずして通常の血液供給に再結合し、標準法により正常な洞 リズムを回復させた。

手術後に動物を観察した結果、（ＭｎＳＯＤ含有溶液を潅流した）試験動物はほ ぼ正常な心機能を示し、病理学的試験のために殺す（１か月後）まで生存した。

心筋梗塞の兆候や、他の心組織の病理学的異常はみられなかった。

コントロールグループの動物は心不調を示し、１週間後にすべて死亡した。

付　録 略語：ａａ、アミノ酸：Ａｐ、アンピシリン；ＢＣＭｎＳＯＤ、Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　ｅａｌｄｏｔｅｎａｘ由来Ｍｎ５ＯＤ　；　ｂｐ、塩基対；　Ｂ５Ｍｎ５Ｏ Ｄ、Ｂａｃ　１１１ｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来Ｍｎ５Ｏ Ｄ　；　Ｃｕ５ＯＤ、銅含有ＳＯＤ　；　ｄ　ａ　１、ダルトン：Ｆｅ５ＯＤ、 鉄含有ＳＯＤ　、ｋｂ、キロベースあるいは１０００塩基対：ｋｃａｌ、キロカ ロリー：１ａｃＺ’　、ｂ−ガラクトシダーゼ　ａ−ペプチドをコードする遺伝 子；Ｍｎ５ＯＤ、マンガン含有ＳＯＤ；　ｎｔ、ヌクレオチド：オリゴ、オリゴ デオキシヌクレオチド；○ＲＦ、オーブンリーディングフレーム；ＯＲＩ、複製 開始点、０．−、スーパーオキシドラジカル：　ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動；ｐａｒ、プラスミドｐｓｃ　１ｏ　ｉの分配機能：ｐｏ、プロモ ーターオペレーター領域；Ｐｏ１ｌｋ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ （ラージ）断片：Ｒ１耐性；Ｓ；感受性；ＳＤＳ、　ドデシル硫酸ナトリウム； ＳＯＤ、スーパーオキシドジスムターゼ；ｓｏｄ、ＳＯＤをコードする遺伝子： Ｔｃ、テトラサイクリン；ｖｖｍ、容量計による１分間あたりの容量：ｗｔ、野 性型；ＸＧａ１．５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクト シド；Ｚｎ５ＯＤ、亜鉛含有ＳＯＤ。

〔図面の簡単な説明〕

図１）　Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｓｏｄ遺伝子を検出する ために使用したオリゴヌクレオチドプローブ ＢｒｏｃｋとＷａｌｋｅｒ　（１９８０）が決定した１７番残基から３４番残基 のアミノ酸配列を示す（１文字表記、上の行）。目的のアミノ酸配列をコードす るＤＮＡｔｉｊｌに相補するように設計した５　０ｍｅ　ｒのオリゴヌクレオチ ドを合成し、標識してプローブとした。１７番残基から３４番残基のアミノ酸を コードする真のＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列（ｎｔ配列と記載）の上 に示す。真の配列とプローブが相補する位置を１で、弱い塩基対をつくる位置を コロンで示す。

図２）　ｐＢｃＭｌおよびｐＢＣＭ２の制限酵素地図制限酵素切断サイトを示す 。ｐＡＴ　１５３由来のＤＮＡを太い線で、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉｌｕｓ由来挿入ＤＮＡを細い線で示す。５ｏｄ（ＳＯＤ）遺伝子およびｂ　１ 　ａ　（ＡｐＲ）遺伝子の位置および転写方向とＣｏ１Ｅ１複製開始点（ＯＲＩ ）を適当な矢印で示す。図中に示す３．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片と１．６ｋ ｂのＥｃｏＲＩ／Ｓｓ　ｔ　Ｉ断片は、文中に記載したように、塩基配列を決定 するために単離した。制限酵素切断サイトは：Ｃ，Ｃ１ａＩ　；Ｈ，ＨｉｎｄＩ ＩＩ；Ｎ、Ｎｒｕ　Ｉ　；Ｐ、Ｐｖｕ　Ｉ　：Ｒ１，ＥｃｏＲＩ　；Ｓａ、５ａ ｌＩ；Ｓｌ、５ｓｔｌ；Ｓ２，５ｓｔＩＩ、Ｘ。

ＸｈｏＩである。

図３）　Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＭｎ５ＯＤをコードする 遺伝子の塩基配列ｐＢＣＭ２　（図２を見よ）由来の１２９４ｂｐのＨｉｎｄ　 Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｎｒｕ　Ｉ制限酵素断片領域を示す。ふたつのＯＲＦの中で、０Ｒ Ｆ−Ａはｓｏｄ遺伝子に対応し、０ＲＦ−Ｂは未同定の推定遺伝子に対応する。

両ＯＲＦの上流にある推定リポソーム結合部位を、下線およびＳ、Ｄ、で示す。

ｓｏｄの転写ターミネータ−と考えられる２回対称の領域を、配列上の向かい合 う矢印で示す。

図４）　ｐＭＴＬ　１０（７）構築 ｐＭＴＬ４を構築するための詳細な操作は、文中に記載した。制限酵素切断サイ トは：Ｓｃ、５ｃａＩ　；Ｈｄ、ＨｉｎｄｌＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ：Ｓ、５ａｌＩ ；Ｂ。

ＢａｍＨＩ　；Ｓｍ、Ｓｍａ　Ｉ　：ＲＶ、ＥｃｏＲＶ；Ｅ７、Ｅｃｏ４７；Ｒ １，ＥｃｏＲＩ；Ｔ、Ｔａｑｌ；Ｈａ、ＨａｅＩＩである。プラスミド中の他の 特別なエレメントは：Ｃｏ１Ｅ１複製特異的転写物、ＲＮＡＩおよびＲＮＡＩ　 Ｉ　；ｐｓｃｌｏ　１（７）分配機能、ＰＡＲ、大腸菌のｔｒｐプロモーター、 ｔｒｐ；ｂ−ガラクトシダーゼａ−ペプチド、１ａｃＺ’　；大腸菌ｒｒｎＢオ ペロンの転写ターミネータ−シグナル、Ｔ１およびＴ２；ｂｌａ遺伝子およびｔ ｅｔ遺伝子、ＡｐおよびＴｃである。

図５）　ｐＭＴＬ１００３の制限酵素地図ｔｒｐ／１ａｃＺ’／ボ’）す’、ｈ −４−含む３８８ｂｐのＨａｅＩＩ断片を、ｐＭＴＬ　１　（１）ｐＳＣ１０Ｌ ノｐａｒエレメントのすぐ隣のＨａｅＩＩサイトに挿入することにより、ｐＭＴ Ｌｌｏ（図４を見よ）からプラスミドｐＭＴＬ１００３を作製した（詳細は文中 ）。図中に示すエレメントは：Ｃｏ１Ｅ１複製開始点、ＯＲＩ；ｐＳＣＩＯＩの 分配機能、ＰＡＲ、大腸菌のｔｒｐプロモーター、ｔｒｐ；ｂ−ガラクトシダー ゼ　ａ−ペプチド、１ａｃＺ’　；アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）、ＡｐＲ ；大腸菌ｒｒｎＢオペロン転写ターミネータ−シグナル、Ｔ１およびＴ２である 。

図６）　ｐＭＴＬ２８のポリリンカークローニング領域の塩基配列 ｐＭＴＬ２０クローニングベクターシリーズ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、 、１９８８）中で使用できるポリリンカー領域を示す。ｐＭＴＬ２８は、適当な オリゴヌクレオチド（５’　−ＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴ ＡＴＣＴＧＡＴＣＡＧＴＴＡＡＣＡＧ−ＡＴＣＴＧ−３’および５’　−ＡＡＴ ＴＣＡＧＡＴＣＴＧＴＴＡＡＣＴＧＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧ− ＧＡＧＡＴＣ−３”）を化学的に合成し、それらをアニールさせ、ｐＭＴＬ２３ のＸｈｏＩサイトとＥｃｏＲＩサイトの間に挿入することにより作製した。

図７）　ｐＭＴＬ　Ｉ　Ｏ１３の制限酵素地図プラスミドｐＭＴＬ１０１３は、 ｂｌａ遺伝子をｔｅｔ遺伝子に置換することによりｐＭＴＬ　１００３から構築 した（詳細は文中）。図中に示すエレメントは：Ｃ０ＩＥＩ複製開始点、ＯＲＩ ；ｐｓｃｌｏｌの分配機能、ＰＡＲ、大腸菌のｔｒｐプロモーター、ｔｒｐ；ｂ −ガラクトシダーゼ　ａ−ペプチド、１ａｃＺ’　；テトラサイクリン耐性遺伝 子（ｔｅｔ）、ＴｃＲ；大腸菌ｒｒｎＢオペロン転写ターミネータ−シグナル、 Ｔ１およびＴ２である。

図８　）　ｐ　Ｂ　ＣＭ　３の制限酵素地図プラスミドｐＢＣＭ３は、ｐＢＧＭ ２のｓｏｄ遺伝子を１．３ｋｂＮｒｕ　Ｉ／Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片として 単離しく図３）、ｐＵＣ９のＳｍａＩサイトとＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ■の間にクロー ン化した後、同じ大きさのＥｅｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として再単離するこ とにより構築した。その後、この断片をＰｏ１Ｉｋ処理によりプラントエンド化 した後、ベクターのｔｒｐプロモーターからＳＯｄが連続して転写されるように 、ｐＭＴＬ１００３のＳｍａｌサイ１〜に挿入した。Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ ｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＤＮＡ挿入断片を太い線で示す。

他の特徴は：Ｃｏ１Ｅ１複製開始点、ＯＲＩ；ｐｓｃｌｏｌの分配機能、ＰＡＲ ，ｔｒｐプロモーター、ｔｒｐ；ｒｒｎＢ転写ターミネータ−１ＴＩおよびＴ２ ；アンピシリン耐性マーカー；Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ。

ｐｈｉ　ｌｕｓ由来Ｍｎ５ＯＤ遺伝子、ＳＯＤである。

図９）　ｐＢＣＭ３をもつ大腸菌中の組み換えＭ　ｎ　Ｓ　０Ｄの生産 ９８０Ｍ３をもつ細胞を１００μＭ硫酸マンガンを含む複合培地（２ＸＹＴ）中 で培養し、対数増殖期の後期（矢印で示す）にインドールアクリル酸（２０μｇ 　／　ｍｌ）を加え、ベクターのｔｒｐプロモーターからの転写を誘導した。１ 時間ごとに培地から細胞を採取し、超音波破砕し、遠心して細胞の残骸を除去し た後、抽出物のＳＯＤ活性を測定した。

図１０）　９８０Ｍ３をもつＴＧＩ細胞の全細胞抽出物のＳ’ＤＳ−ＰＡＧＥ 図９に示した実験の１０時間後のサンプルから調製した全細胞抽出物について、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

レーン１、精製したＢ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　ｌｕｓのＭｎ５ＯＤ ：レーン２、分子量マーカー：レーン３．９８０Ｍ３をもつＴＧＩの可溶性細胞 溶解物である。

図１１）　９８０Ｍ３の大腸菌５ｏｄＡ変異株を相補する能力 ９８０Ｍ３をもつＱＣ７８１株（＋）および９８０Ｍ３をもたないＱＣ７８１株 （○）を、１０−５Ｍメチルビオロゲンの存在下で培養した。比較のため、プラ スミドをもたないＱＣ７８１株（・）の増殖曲線も示す。

図１２）　ＢＣＭｎＳＯＤをコードするＢ、ｃａｌｄ。

ｔｅｎａｘの遺伝子の塩基配列。

ｐＭＣＢ８に含まれる１、９ｋｂＡｃｃｌ断片のうち、７８０ｂｐの領域を示す 。Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの配列と異なる点は、配列の上に 塩基を記載して示す（−は、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ。

ｐｈｉｌｕｓＤＮＡの配列に欠失していることを示す）、Ｂ５Ｍｎ５ＯＤとＢＣ ＭｎＳＯＤのアミノ酸が異なる点は、ＢＣＭｎＳＯＤの配列の下の適当な所にＢ 　Ｓ　Ｍ　ｎ５ＯＤのアミノ酸を記載することにより示す（１０３位ではＧｌｕ の代わりにＡｓｐＳ　１８８位ではｌｉｅの代わりにＶａ　１）。ｓｏｄ遺伝子 の上流のリポソーム結合サイトは、下線とＳ、Ｄ、で示す。ｓｏｄの転写ターミ ネータ−と考えられる２回対称領域は、配列の上の向かい合う矢印で示す。

図１３）　ｐＢＣＭ８の制限酵素地図 プラスミドｐＢＣＭ８は、Ｂ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘのｓｏｄ遺伝子をｐＢＣＭ ７から１．９ｋｂのＡｃｃｌ断片して単離し、ｐＭＴＬ１００３のＡｃｃＩサイ トにベクターのｔｒｐプロモーターから連続して転写されるようにクローン化す ることにより構築する。Ｂ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来ＤＮＡ挿入断片を太い線 で示す。他の特徴は：Ｃｏ１Ｅ１複製開始点、ＯＲＩ；ｐｓｃｌｏｌの分配機能 、ＰＡＲ；ｔｒｐプロモーター、ｔｒｐ；ｒｒｎＢ転写ターミネータ−１ＴＩお よびＴ２：アンビシリン耐性マーカー；Ｂ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来Ｍｎ５Ｏ Ｄ遺伝子、ＳＯＤである。

表１　ａ株およびプラスミド／ファージベクター薗株／プラスミド　特徴　由来 Ｂ、　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋５ｏｐｈｉｌｕｓ　ＮＣＡ１５０３Ｂ、　ｃａｌ ｄｏｔｅｎａｘ　ＹＴＩ Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＴＧＩ　Ｐ２ｔＤ！！３Ｉ：ｒｏＡｓ２ｐＬｔＶＡＪ５！Ｄ、 ｕイ、　Ｃ６Ｑｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｅ、ｙＢｊ４Ｅ４４５　ｐＬｒｏＩＨｕ、ｉ、ｈｉｈｌＢｕｐ［４４１ａｃＹ　 Ｍｉｎｔｏｎｅｔａｌ、。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＱＣ７７３ＧＣ４４６８［１（ｓｏｄＢ−ｋａｎ）１−Ｄ２　 ｈＲＤ、　ＴｏｕａｔｉＥ、　ｃｏｌｉ　ＱＣ７９９５ｏｄＡ　５ｏｄＢ、　Ｃ ｄ　ｈＲＤ、　ＴｏｕａｔｉＥ、　ｃｏｌｉ　ＢＭＨ７１−１８Ｋ〒！ＹｂＤＪ Ｊａｃ邦Ｎｏ！ｓｊＨｇ［！、ＡｈｊＱ！ｕδムｉ５　Ｋ、ｇ２ｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、。

ＬＬ 表２　Ｂ５Ｍｎ５ＯＤ遺伝子およびＢＣＭｎＳＯＤ遺伝子のコドン使用ＢＳ　Ｂ ＣＢＳ　ＢＣＢＳ　ＢＣＯ３８ＣＵＵＩＪＰｂｅ２　３ＵＣＵ　Ｑ　Ｉ　ＵＡＵ Ｔｙｒ　２　２ＵＧＵＣｙｓ　Ｏ０ＵＵＣ６５ＵＣＣ３ｅｒ　ｌ　０ＵＡＣ６６ ＵＧＣＯＯ聞＾ＬｅｕＯ０ＵＣＡ　Ｏ０ＵＡＡＴｅｒ　１　１ＵＧＡＴｅｒ　Ｏ ０ＵＵＧ　８　９ＵＣＧ　５　５ＵＡＧ　Ｏ０ＵＧＧＴｒｐ　６　８ＣＵＵ　４ 　５ＣＣＵ　Ｏ０ＣＡＵＨｉｓ　４　４ＣＧＵ　２　２ＣＵＣＬｅｕ３　３ＣＣ ＣＰｒｏ　０　０ＣＡＣ５５ＣＧＣＡｒｇ　３　３ＣＵＡ　Ｏ０ＣＣＡ　３　３ ＣＭＧＩｎ　３　３ＣＧＡ　Ｏ０ＣＵＧ　４　２　ＣＣＧ　１０　１０　ＣＡＧ 　ＯＯＣＧＧ　ｌ　１ＡＵＬＩ　５　７ＡＣＵ　Ｏ０ＡＡＵＡｓｎ　４　４ＡＧ ＵＳｅｒ　Ｏ０ＡＵＣＩｌｅ４　３ＡＣＣＴｈｒ　１　１ＭＣ１３１３ＡＧＣ５ ５ＡＵＡ　Ｏ０ＡＣＡ　３　２ＡＡＡＬｙｓ　１１　１０ＡＧＡＡｒｇ　ＯＯＡ ＵＧＭｅｔ３３ＡＣＧ　７８ＭＧ　１２ＡＧＧ　００ＧＵＵ　３　２ＧＣＵ　２ 　１ＧＡＵＡｓｐ　３　２ＧＧＵ　３　４ＧＵＣＩ／ａｔ　２　２ＧＣＣＡｌａ 　４　３ＧＡＣ５５ＧＧＣＧｌｙ　１１　１０ＧＵＡ　Ｏ０ＧＣＡ　５　５ＧＭ ＧＩｕ　１２　１２ＧＧＡ　１　０ＧＵＧ　３　３　ＧＣＧ　９　１１　ＧＡＧ 　６　７　ＧＧＧ　ＯＩＴｙｒ−転写終止コドン ＢＣ−Ｂ、　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ遺伝子ＢＳ　−Ｂ、　ｓＬｅａｒｏｔｈｅｒ ｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子太字のコドンは、大腸菌において転写モジュレータ−と して認識されるコドンである。

表３　大腸菌中の固有ＳＯＤおよび組み換えＳＯＤの発現量宿主　フェノタイプ 　プラスミド　ＳＯＤ比活性ＴＧＩ　Ａ＋、Ｂ＋　５５．５ ＱＣ７８１Ａ−、Ｂ＋　３６ ＱＣ７７３Ａ＋、Ｂ−１，９ ＱＣ７９９Ａ−、Ｂ−１，６ ＴＧＩ　Ａ＋、Ｂ＋　ｐＢＣＭ３　１２．０００ＱＣ７８１Ａ−、Ｂ＋　１２． ｏ００ ＱＣ？７３　Ａ＋、Ｂ−５，０００ ＱＣ７９９Ａ−、Ｂ−４，０００ ＴＣＩ　Ａ＋、Ｂ＋　ｐＢＣＭ８　９．９１３ＱＣ７８１Ａ−、Ｂ＋　３．６５ ０ ＱＣ７７３Ａ＋、Ｂ−２，５８１ ＱＣ７９９Ａ−、Ｂ−１，９４４ ａ−フェノタイプＡおよびフェノタイプＢは、それぞれ５ｏｄＡ遺伝子およびｓ ｏｄ　Ｂ遺伝子に起因し、十と−はその遺伝子が機能している（＋）か機能して いない（−）かを示す。

ｂ−固有のＳＯＤ活性量が異なるさまざまな大腸菌宿主におけるｐＢＣＭ３／８ によるｓｏｄを発現量を、細胞抽出物のＳＯＤ活性を測定することにより調べた 。この場合、培地（２ｘＹＴ）中のトリプトファンが枯渇した対数繁殖期の後期 にｔｒｐプロモーターからの転写を誘導した。

Ｋ　工　Ｄ　Ｋ３　Ｔ　Ｍ　Ｎ　工　Ｋ−−−ＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡ　ＧＡ Ａ　ＡＣＧ　ＡＴＧ　ＡＡＣＡＴＴ　ＣＡＣＩｌｌ　Ｉｌｌ　ＩＩＩ　ＩＩＩ　 ＩＩＩ　ＩＩＩ　Ｉｌｌ　Ｉｌｌ　ＩＩ：　ｌ１１３１−　ＧＴＧ　ＴＡＧ　Ｃ ＴＧ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＴＧＣ’Ｉ’ＡＣＴＴＧ　ＴＡＧ　ＧＴＧＨＴＫＨＩ（ ＮＴ−ａａ　配置す ＧＴＧ　ＴＧＣＴＴＴ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＴＴＧ　ＴＧ　−５１７０−アＥｃｏ ＲＶ 図７ ｃｏＲＶ ４Ｒ＃１（ｈ） ＥｃｏＲＶ 要約書 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢａｃｉｌｌ ｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼをコード する遺伝子（ｓｏｄ）を大腸菌中にクローン化し、その全塩基配列を決定した。

翻訳後に切断されるＮ端のメチオニン残基を例外として、Ｂ、ｓｔｅａｒｏｔｈ ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来酵素（ＢＳＭｎＳＯＤ）の推定アミノ酸配列は、以前 決定されたアミノ酸配列と１００％一致した。Ｂ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来酵 素（ＢＣＭｎＳＯＤ）は、Ｂ　Ｓ　Ｍ　ｎ　Ｓ　ＯＤと２アミノ酸異なる。両組 み換えＭｎ５ＯＤは大腸菌中でｉｎ　ｖｉｔｒｏでも１ｎｖｉｖｏでも酵素活性 があり、大腸菌のｔｒｐプロモーターと転写をカップリングさせると、細胞の可 溶性蛋白の４７％に相当する量のＭｎ５ＯＤが発現した。これらの細菌由来スー パーオキシドジスムターゼの薬物用途を記載した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．スーパーオキシドラジカルの存在に起因する病的状態を予防かつ／あるいは 治療するために使用する、ＭｎＳＯＤが天然型であり本質的にＢＳあるいはＢＣ 由来ＭｎＳＯＤのアミノ酸配列をもつことを特徴とする、ＭｎＳＯＤ酵素と薬物 的に使用できる賦形剤を含む薬物組成物。 ２．（ａ）ＭｎＳＯＤ酵素産生微生物を培養してＭｎＳＯＤ酵素含有培養菌体を 生産し、（ｂ）培養菌体からＭｎＳＯＤ酵素を単離し、（ｃ）単離したＭｎＳＯ Ｄ酵素を精製して（ａ）の段階で生産したＭｎＳＯＤ含有培養菌体中に存在する ＭｎＳＯＤ酵素と比較して本質的に化学修飾されていない精製酵素を得ることに より、天然型のＭｎＳＯＤ酵素を得ることを特徴とする請求項１記載の薬物組成 物。 ３．Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓあるいはＢ．ｃａｌｄｏｔｅｎ ａｘ固有の巨大分子物質である発熱性物質をほとんど含まないことを特徴とする 請求項１あるいは請求項２記載の薬物組成物。 ４．Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓあるいはＢ．ｃａｌｄｏｔｅｎ ａｘ以外の種の形質転換微生物を培養することによりＭｎＳＯＤ酵素を生産する ことを特徴とする上記すべての請求項記載の薬物組成物。 ５．ＭｎＳＯＤ酵素のアミノ酸配列が、（ｉ）図３に示すＢＣＭｎＳＯＤのアミ ノ酸配列、（ｉｉ）図１２に示すＢＳＭｎＳＯＤのアミノ酸配列、（ｉｉｉ）（ ｉ）および（ｉｉ）の配列中の１〜３０アミノ酸が挿入、欠失、置換したアミノ 酸配列、から選択したものであることを特徴とする上記すべての請求項記載の薬 物組成物。 ６．アミノ酸前列（ｉｉｉ）が、（ｉ）および（ｉｉ）の配列中の１〜２０アミ ノ酸が挿入、欠失、置換したアミノ酸配列であることを特徴とする請求項５記載 の薬物組成物。 ７．アミノ酸配列（ｉｉｉ）が、（ｉ）および（ｉｉ）の配列中の１〜１０アミ ノ酸が挿入、欠失、置換したアミノ酸配列であることを特徴とする請求項５記載 の薬物組成物。 ８．アミノ酸配列（ｉｉｉ）が、（ｉ）および（ｉｉ）の配列中の１〜５アミノ 酸が挿入、欠失、置換したアミノ酸配列であることを特徴とする請求項５記載の 薬物組成物。 ９．アミノ酸配列（ｉｉｉ）が、（ｉ）および（ｉｉ）の配列中の１あるいは２ あるいは３アミノ酸が挿入、欠失、置換したアミノ酸配列であることを特徴とす る請求項５記載の薬物組成物。 １０．（ａ）注射用溶液、あるいは（ｂ）外科手術あるいは移植手術の際に組織 に灌流させるのに適した溶液の形態であることを特徴とする上記すべての請求項 記載の薬物組成物。 １１．ＭｎＳＯＤ酵素を０．００１から１．０ｍｇ／１望ましくは０．０ｌから １．０ｍｇ／１含むことを特徴とする請求項１０記載の薬物組成物。 １２．ＭｎＳＯＤ酵素を０．００１から１．０ｍｇ／１望ましくは０．０５から ０．５ｍｇ／１含むことを特徴とする請求項１１記載の薬物組成物。 １３．ＭｎＳＯＤ酵素が本質的にＢＳあるいはＢＣＭｎＳＯＤのアミノ酸配列を もつことを特徴とする、（ａ）ＭｎＳＯＤ酵素産生微生物を培養してＭｎＳＯＤ 酵素含有培養菌体を生産し、（ｂ）培養菌体からＭｎＳＯＤ酵素を単離し、（ｃ ）単離したＭｎＳＯＤ酵素を精製して（ａ）の段階で生産したＭｎＳＯＤ含有培 養菌体中に存在するＭｎＳＯＤ酵素と比較して本質的に化学修飾されていない精 製酵素を生産し、（ｄ）化学的に修飾されていないＭｎＳＯＤ酵素を薬物的に使 用できる賦形剤と混合して薬物組成物を製造する方法。 １４．微生物が、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓあるいはＢ．ｃａ ｌｄｏｔｅｎａｘ以外の種の形質転換微生物であることを特徴とする請求項１３ 記載の方法。 １５．ＭｎＳＯＤ酵素が請求項５から請求項９で定義されたものであることを特 徴とする請求項１３あるいは請求項１４の方法。 １６．ＭｎＳＯＤ酵素が天然型で本質的にＢＳあるいはＢＣＭｎＳＯＤのアミノ 酸配列をもつことを特徴とし、スーパーオキシドラジカルの存在に起因する病的 状態を予防かつ／あるいは治療するために使用する薬物組成物を製造するために ＭｎＳＯＤ酵素を使用するという、ＭｎＳＯＤ酵素の用途。 １７．ＭｎＳＯＤ酵素が天然型で本質的にＢＳあるいはＢＣＭｎＳＯＤのアミノ 酸配列をもつことを特徴とし、外科手術あるいは移植手術の際に組織（特に通常 の血液供給中から取り出したような組織）に灌流させるための溶液を製造するた めにＭｎＳＯＤ酵素を使用するという、ＭｎＳＯＤ酵素の用途。 １８．ＭｎＳＯＤ酵素が請求項５から請求項９で定義されたものであることを特 徴とする、請求項１６あるいは請求項１７記載の用途。 １９．アミノ酸配列が、 （ｉ）図３に示すアミノ酸配列、 （ｉｉ）（ｉ）の配列中の１〜３０アミノ酸が挿入、欠失、置換したアミノ酸配 列、 から選択され、ただしアミノ酸配列（ｉｉ）の１０３位はＧｌｕかつ／あるいは １８８位はＩｌｅである、ほとんど純粋な形態の本質的にＢ．ｃａｌｄｏｔｅｎ ａｘのアミノ酸配列をもつＭｎＳＯＤ酵素。 ２０．請求項１９で定義されたＭｎＳＯＤ酵素をコードするＤＮＡ配列から成る 組み換えＤＮＡ分子。 ２１．（ａ）図３に示すＤＮＡコード配列あるいは（ｂ）（ａ）の配列の遺伝子 コドンが縮重したＤＮＡ配列から選択される、請求項２０記載の組み換えＤＮＡ 分子。 ２２．プロモーターが大腸菌固有のｔｒｐプロモーター、あるいはｔｒｐプロモ ーターとの違いはそのプロモーター活性がほぼ維持される程度のものであるｔｒ ｐプロモーターに類似した塩基配列をもつ関連プロモーターであることを特徴と する、プロモーターと連結したＭｎＳＯＤ酵素をコードする構造遺伝子を少なく ともひとつ含む組み換えプラスミドをもつ形質転換大腸菌を培養してＭｎＳＯＤ 酵素を製造する方法。 ２３．プロモーターの配列が【配列があります】（Ｉ）、あるいは （Ｉ）との違いはそのプロモーター活性がほぼ維持される程度のものである（Ｉ ）に類似したＤＮＡ配列をもつプロモーターであることを特徴とする、請求項２ ２記載の方法。 ２４．プロモーターが配列（Ｉ）と少なくとも５０％のホモロジーを示すことを 特徴とする請求項２２記載の方法。 ２５．プロモーターが配列（Ｉ）と少なくとも７５％のホモロジーを示すことを 特徴とする請求項２２記載の方法。 ２６．プロモーターが配列（Ｉ）と少なくとも９５％のホモロジーを示すことを 特徴とする請求項２２記載の方法。 ２７．配列（Ｉ）との違いが１０以下の欠失、挿入、置換である配列のプロモー ターを特徴とする請求項２２から請求項２６記載すべての方法。 ２８．配列（Ｉ）との違いが５以下の欠失、挿入、置換である配列のプロモータ ーを特徴とする請求項２２から請求項２６記載すべての方法。 ２９．配列（Ｉ）との違いが２以下の欠失、挿入、置換である配列のプロモータ ーを特徴とする請求項２２から請求項２６記載すべての方法。 ３０．関連プロモーターが１２から５０塩基から成ることを特徴とする請求項２ ２から請求項２９記載すべての方法。 ３１．関連プロモーターが２０から３５塩基から成ることを特徴とする請求項２ ２から請求項３０記載すべての方法。 ３２．関連プロモーターがおおよそ２９塩基から成ることを特徴とする請求項２ ２から請求項３１記載すべての方法。 ３３．５′端の配列がＴＴＧＡＣＡで３′端の配列がＴＴＡＡＣＴである塩基配 列のプロモーターを特徴とする請求項２２から請求項３２記載すべての方法。 ３４．５′端の配列がＴＣＡＡＴＴで３′端の配列がＡＣＡＧＴＴである塩基配 列のプロモーターを特徴とする請求項２２から請求項３３記載すべての方法。 ３５．３′と５′配列の間に【配列があります】あるいはプロモーター活性がほ ぼ維持される程度の違いをもつ関連介在配列から選択される介在配列をもつプロ モーターを特徴とする請求項２２から請求項３４記載すべての方法。 ３６．【配列があります】との違いが １０以下の欠失、挿入、置換である介在配列を特徴とする請求項３５記載の方法 。 ３７．【配列があります】との違いが ５以下の欠失、挿入、置換である介在配列を特徴とする請求項３６記載の方法。 ３８．【配列があります】との違いが ２以下の欠失、挿入、置換である介在配列を特徴とする請求項３７記載の方法。 ３９．プロモーターの塩基配列が【配列があります】であることを 特徴とする請求項３７記載の方法。