DE69128286T2

DE69128286T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen die superoxiddismutase aus bacillus stearothermophilus und bacillus caldotenax enthalten

Info

Publication number: DE69128286T2
Application number: DE69128286T
Authority: DE
Inventors: Anthony Porton Down Salisbury Wilts Sp4 0Jg Atkinson; Kevin John Porton Down Salisbury Wilts Sp4 0Jg Bown; John Karl Porton Down Salisbury Wilts Sp4 0Jg Brehm; Stephen Phillip Porton Down Salisbury Wilts Sp4 0Jg Chambers; Nigel Peter Porton Down Salisbury Wilts Sp4 0Jg Minton
Original assignee: Microbiological Research Authority
Current assignee: Microbiological Research Authority
Priority date: 1990-08-03
Filing date: 1991-08-02
Publication date: 1998-03-19
Anticipated expiration: 2011-08-03
Also published as: DK0548095T3; ATE160586T1; EP0548095A1; AU657695B2; EP0548095B1; WO1992002625A1; DE69128286D1; AU8331191A; CA2088574C; GB9017037D0; JPH05508999A; CA2088574A1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfanren zur Herstellung von Enzymen mit Superoxiddismutaseaktivität, neue Superoxiddismutaseenzyme und neue pharmazeutische Zubereitungen, die Enzyme mit Superoxiddismutaseaktivität enthalten.
Eine Folge des oxidativen Stoffwechsels ist die Erzeugung von Superoxidradikalen (O&sub2;&supmin;), die übermäßige Schäden an Zellkomponenten lebender Organismen hervorrufen. Die molekulare Dismutation von O&sub2;&supmin; zu Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;) und Sauerstoff (O&sub2;) wird durch eine ubiquitäre Klasse von Metallenzymen katalysiert, die als Superoxiddismutasen (SOD) bezeichnet werdenen. Weitere Abkürzungen sind im Anhang vor den Zeichnungen aufgeführt. Die Anwesenheit von SODs in allen lebenden Organismen, die die Exposition an molekulares O&sub2; tolerieren, hat zu der plausiblen Annahme geführt, daß diese Enzyme die erste Linie des Verteidigungsmechanismus der Zelle gegen Sauerstoffschäden bilden (Fridovich, 1975).
Auf der Basis ihres Metall ionengehalts unterscheidet man drei SOD-Klassen: Cu/Zn-, Fe- und Mn-haltige Enzyme. Während alle drei Formen die gleiche Reaktion katalysieren, sind die Fe-haltigen SODs (FeSOD) überwiegend auf Prokaryonten und die Cu/Zn-Enzyme (Cu/ZnSOD) überwiegend auf Eukaryonten beschränkt. Mn-haltige SODs (MnSOD) sind überall anzutreffen. In Eukaryonten befinden sich MnSODs in den Mitochondrien, während die Cu/Zn-SODs im Cytosol anzutreffen sind (Geller und Winge, 1984). Escherichia coli enthält drei isoenzymatische SOD-Formen: eine MnSOD (sodA), eine FESOD (sodB) und ein Hybridenzym, das sowohl Mangan als auch Eisen enthält (Hassan und Fridovich, 1977).
SODs aus verschiedenen Quellen sind derzeit für die mögliche Therapie von durch Sauerstoff verursachten Schäden von großem Interesse. Ihre Verwendung im klinischen Umfeld für die Behandlung verschiedener Störungen ist bereits vorgeschlagen worden (siehe Beck et al., 1988).
Dazu gehören (i) die Verhinderung der Entstehung bzw. des Wachstums und der Durchdringungsfähigkeit von Tumoren sowie von durch UV-Licht induzierten Schäden, (ii) der Schutz von Herzgewebe vor post-ischämischen Reperfusionsschäden, (iii) der Einsatz als entzündungshemmendes Mittel, (iv) die Verringerung der cyto- und cardiotoxischen Wirkungen von Mitteln gegen Krebs sowie (v) die Verlängerung der Lebensdauer lebender Zellen. Tatsächlich wird derzeit eine Cu/Zn-SOD vom Rind zur Behandlung entzündeter Sehnen bei Pferden und der Osteoarthritis beim Menschen verwendet (Puhl et al., 1984).
Die derzeit für eine Therapie vorgeschlagenen SODs haben den großen Nachteil, daß sie hoch immunogen sind; deshalb haben sie sich aufgrund der bei der Verabreichung hervorgerufenen Antikörperantwort als wenig nützlich für die klinische Anwendung erwiesen. Weitere zur Verfügung stehende SODs, vor allem solche, die von Säugetieren stammen, sind angesichts ihrer geringen Konzentration in Säugetierzellen und der aufwendigen Isolationsverfahren, die dazu erforderlich sind, sie in zufriedenstellender Reinheit zu produzieren, nur schwer in größeren Mengen zu erhalten.
So beschreibt EP-A-0 172 577 (Takeda) beispielsweise die pharmazeutische Verwendung der MnSOD von Serratia marcescens als Mittel gegen Entzündungen, aber die einzigen beschriebenen Dosierungsfomen sind enterische Kapseln und Tabletten. Ähnlich schlägt JP-A- 63245671 (Shobe K.K. und Unichika K.K.) den pharmazeutischen Einsatz einer modifizierten MnSOD von Bacillus stearothermophilus in der Kosmetik und Pharmazie vor. Wie es heißt, ist das unmodifierte Enzym aufgrund seiner Antigenität nicht zur Verwendung geeignet, und in der Beschreibung wird eine Modifizierung unter Verwendung eines Polyalkylenalkohols vorgeschrieben.
GB-A-2183658 beschreibt die Expression einer menschlichen MnSOD in E. coli und schlägt verschiedene pharmakologische Verwendungen für das resultierende Produkt vor. Außerdem ist die pharmazeutische Anwendung der SOD von Streptococcus lacti£ in EP-A-0 289 667 beschrieben.
Derzeit zur Verfügung stehende SOD-Enzyme weisen Nachteile auf, die ihre klinische Anwendbarkeit einschränken, darunter eine relativ kurze Halbwertzeit in Lösung, ein Aktivitätsverlust bei pH-Werten unter 7 und eine stark ausgeprägte Antigenität. Daher war es bisher nicht möglich, effektive pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen, mit denen die unangenehmen Auswirkungen, die man mit der Gegenwart von Superoxidradikalen in Geweben in Verbindung bringt, bekämpft werden können.
Wir haben jetzt überraschend herausgefunden, daß die MnSOD-Enzyme von B. stearothermophilus (BS) und B. caldotenwc (BC) dann, wenn sie in nativer, d.h. chemisch nicht modifizierter Form vorliegen, eine wesentlich geringe Antigenität aufweisen als solche, die von eukaryontischen Zellen abgeleitet sind, und mit besserer therapeutischer Wirkung verwendet werden können.
Im Gegensatz zur Lehre von JP-A-63245671 sind die zur Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen verwendeten BS- und BC-MnSOD-Enzyme in ihrer nativen Form im wesentlichen ohne antigene Wirkung. Die in JP-A-63245671 vorgebrachte Annahme, daß BS-MnSOD stark antigen wirkt, kann darauf zurückzuführen sein, daß das im beschriebenen Verfahren verwendete Enzym stark verunreinigt war. Nach unseren Erkenntnissen ist sowohl das BS- als auch das BC-Enzym (soweit mit Immunoassaytechniken nachweisbar) im wesentlichen nicht antigen, und zwar sowohl dann, wenn es einem Reinigungsverfahren zur Entfernung von mit Zellkomponenten des BS- und BC-Organismus in Verbindung gebrachten pyrogenen Verunreinigungen unterzogen wird, als auch wenn man es mit rekombinanten Techniken herstellt, die die Gegenwart solcher Verunreinigungen notwendigerweise vermeiden.
Somit werden in einem Aspekt der Erfindung pharmazeutische Zubereitungen zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung pathologischer Zustände aufgrund der Anwesenheit von Superoxidradikalen zur Vefügung gestellt, welche ein MnSOD-Enzym und einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das MnSOD-Enzym (i) in nativer Form vorliegt, (ii) die Dismutation von Superoxidradikalen katalysiert und (iii) (a) entweder die Aminosäuresequenz von Bacillus stearothermophilus (BS) oder Bacillus caldotenax (BC) MnSOD oder (b) eine abweichende Sequenz aufweist, die sich von den Sequenzen in (a) durch 1 bis 20 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen unterscheidet.
Vorzugsweise ist das MnSOD-Enzym in nativer Form im Vergleich zu dem MnSOD- Enzym, das in einer Kultur eines MnSOD erzeugenden BC- oder BS-Mikroorganismus vorhanden ist, im wesentlichen chemisch unmodifiziert.
Das Kulturmedium sollte mit Mangan ergänzt werden. Um ein hohes Maß an MnSOD-Expression zu erreichen, ist im allgemeinen mehr als 0,01 mM Mangan erforderlich. Um also ein Expressionsniveau von etwa 10 % MnSOD (als Prozentsatz des gesamten löslichen Proteins ausgedrückt) zu erreichen, sollte 0,01 mM Mangansalz mitverwendet werden.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen im wesentlichen frei von Pyrogenen, die aus zu B. stearothermophilus oder ß. Caldotenar gehörenden makromolekularen Substanzen bestehen. Dies kann man beispielsweise dadurch erreichen, daß man das MnSOD-Enzym durch Kultivieren eines transformierten Mikroorganismus einer anderen Spezies als B. stearothermophilus oder B. caldotenax herstellt.
Die MnSOD-Enzyme haben vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die aus (i) der in Fig. 12 für die BC-MnSOD gezeigten Aminosäuresequenz, (ii) der in Fig. 3 für BC-MnSOD gezeigten Aminosäuresequenz und (iii) Aminosäuresequenzen, die sich durch 1 bis 10 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen von den Sequenzen (i) und (ii) unterscheiden, ausgewählt ist.
Am meisten bevorzugt unterscheiden sich die Aminosäuresequenzen (iii) durch 1 bis 5 z.B. 1, 2 oder 3 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen von den Sequenzen (i) und (ii).
Erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen können in Form (a) einer injizierbaren Lösung oder (b) einer Lösung, die sich zur Perfusion von Geweben während chirurgischer Eingriffe oder Transpiantationen eignet, zubereitet werden. Solche Zusammensetzungen enthalten typischerweise 0,001 bis 1,0, vorzugsweise 0,01 bis 1,0 mg/l, noch bevorzugter 0,05 bis 0,5 mg/l des MnSOD-Enzyms.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung mit folgenden Schritten zur Verfügung gestellt: (a) Kultivieren eines ein MnSOD-Enzym erzeugenden Mikroorganismus, um eine das MnSOD-Enzym enthaltende Kultur herzustellen, (b) Isolieren des MnSOD-Enzyms aus der Kultur; (c) Reinigen des isolierten MnSOD-Enzyms zur Herstellung von gereinigtem Enzym, das im Vergleich zu dem in der in Schritt (a) hergestellten MnSOD enthaltenden Kultur vorhandenen MnSOD- Enzym chemisch im wesentlichen unmodifiziert ist, und (d) Vermischen des chemisch unmodifizierten MnSOD-Enzyms mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff, dadurch gekennzeichnet, daß das MnSOD-Enzym (i) in nativer Form vorliegt, (ii) die Dismutation von Superoxidradikalen katalysiert und (iii) (a) entweder die Aminosäuresequenz von Bacillus stearothermophilus (DS) oder Bacillus caldotenax (BC) MnSOD oder (b) eine abweichende Sequenz aufweist, die sich von den Sequenzen in (a) durch 1 bis 20 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen unterscheidet.
Wie angegeben, ist der in Schritt (a) erwähnte transformierte Mikroorganismus ein transformierter Mikroorganismus einer anderen Spezies als B. stearothermophilus oder B. caldotenar.
Erfindungsgemäß wird außerdem die Verwendung eines erfindungsgemäßen MnSOD- Enzyms für die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung für die Prophylaxe und/ oder Behandlung pathologischer Zustände aufgrund der Anwesenheit von Superoxidradikalen zur Verfügung gestellt.
BS- und BC-MnSOD-Enzyme haben sich als besonders geeignet für die Herstellung von Infusionsiösungen für Organe erwiesen, die operiert oder transplantiert werden.
Folglich besteht eine spezifischere erfindungsgemäße Anwendung darin, ein MnSOD- Enzym zur Herstellung einer Infusionslösung für Organe zu verwenden, die operiert oder transplantiert werden, besonders solcher Organe, die von der normalen Blutzufuhr abgeschnitten sind, wobei das MnSOD-Enzym in nativer Form vorliegt und im wesentlichen die Aminosäuresequenz der BS- oder BC-MnSOD aufweist.
Die erfindungsgemäß verwendeten BC- und BS-MnSOD-Enzyme haben Eigenschaften, die im Vergleich zu früher verwendeten SODs deutliche Vorteile darstellen. Insbesondere:
(a) haben sowohl BS- und BC-MnSODs eine Halbwertzeit in Lösung
von mehr als 2 Stunden bei 60ºC,
mehr als 30 Minuten bei 65ºC,
mindestens 10 Minuten bei 70ºC,
mindestens 2 Minuten bei 75ºC
bei einem pH von 7,5 und einer MnSOD-Proteinkonzentration von 0,5 mg/ml.
(b) behalten sowohl BC- als auch BS-MnSODs behalten bei pH-Werten unter 7 und über 6 mindestens 10 % ihrer vollen katalytischen Aktivität.
(c) ist die Antigenität beider Enzyme so gering, daß sie nicht quantifiziert werden kann. Während also Enzyme wie die S. lactis- und S. marcescens-SODs eine Antigenität aufweisen, die durch die Untersuchung von Antikörpertitern bei Kaninchen bestimmt werden kann, erhält man bei normaler Vorgehensweise keine Antikörperantwort für native BC- oder BS-MnSODs, unabhängig davon, ob sie durch rekombinante Techniken hergestellt oder aus BC oder BS extrahiert und anschließend zur Entfernung von Pyrogenen gereinigt wurden.
(d) haben sowohl die BC- als auch BS-MnSOD in steriler Lösung mit einem pH von 7,5 und einer Proteinkonzentration von 0,5 mg/ml eine Halbwertzeit von mehr als 1 Jahr bei 4ºC und mehr als 3 Monaten bei Umgebungstemperaturen (15 bis 20ºC). In 50 %igem Glycerin bei -20ºC (wo beide Enzyme noch im flüssigen Zustand sind) ist die Halbwertzeit länger als 5 Jahre.
Zusätzlich zu den spezifischen hier beschriebenen pharmakologischen Anwendungen, können die BS- und BC-MnSOD-Enzyme für folgende Zwecke auch industriell eingesetzt werden:
(1) Erzeugung von Wasserstoffperoxid in diagnostischen Versuchen. Viele Enzyme und Reagenzien stehen für die Schätzung/Überwachung von Wasserstoffperoxid zur Verfügung.
(2) Entfernung von Superoxid in industriellen Systemen. In der Industrie, vor allem bei der Herstellung von Parfums und in anaeroben Verfahren werden viele Superoxidradikalfänger verwendet.
(3) Entfernung von Superoxid (als Geschmacksverderber) aus Lebensmitteln usw..
Das MnSOD-Enzym von B. caldotenax ist bisher niemals isoliert oder beschrieben worden. Es ist eine neue Substanz, die einen weiteren Aspekt der Erfindung darstellt.
Somit stellt die Erfindung außerdem ein MnSOD-Enzym zur Verfügung, das im wesentlichen in reiner Form vorliegt und im wesentlichen die Aminosäuresequenz von B. caldotenax aufweist, wobei die Aminosäuresequenzen aus (i) der in Fig. 12 gezeigten Aminosäuresequenz und (ii) Aminosäuresequenzen, die sich von der Sequenz (i) durch 1 bis 30 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen unterscheiden mit der Maßgabe ausgewählt sind, daß die Aminosäuresequenzen (ii) Glu an der mit 103 bezeichneten Position und/oder Ile an der mit 188 bezeichneten Position aufweisen.
Die Sequenzen (ii) können sich beispielsweise von der Sequenz (i) durch 1 bis 20, vorzugsweise 1 bis 10 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen unterscheiden.
Bisher wurden verschiedene SODs codierende Strukturgene aus einer Vielzahl verschiedener eukaryontischer und prokaryontischer Quellen gedont, darunter Cu/ZnSODs des Menschen (Sherman et al., 1983), Saccharomyces cerevisiae (Bermingham et al., 1988) und Drosophila (Seto et al., 1989), die menschliche MnSOD (McCord et al., 1977), die FeSOD von Anacystis nidulans (Laudenbach et al., 1989) sowie die MnSOD (Touati et al., 1983) und FeSOD (Sakamoto und Touati, 1984) von E. coli. Das Clonen der MnSOD von BS und ihre Expression in Hefe ist ebenfalls beschrieben worden (Bowler et al., 1990).
Die Erfindung beschreibt außerdem das Clonen der MnSOD des grampositiven thermophilen Bacillus caldotenar, die Bestimmung der gesamten Nucleotidsequenzen der MnSOD- Enzyme sowohl von Bacillus stearothermophilus als auch Bacillus caldotenax sowie die Superexpression beider Enzyme in E. coli.
Somit stellt die Erfindung außerdem ein rekombinantes DNA-Molekül zur Verfügung, welches eine DNA-Sequenz aufweist, die ein wie vorstehend definiertes MnSOD-Enzym codiert.
Solche rekombinanten DNA-Moleküle können (a) aus der in Fig. 12 gezeigten codierenden DNA-Sequenz und (b) aus DNA-Sequenzen, die nach dem genetischen Code dieser Sequenz degeneriert sind, ausgewählt werden.
Wie bereits ausgeführt, haben wir jetzt ein Verfahren für die Superexpress ion der MnSOD von BC und BS in E. coli gefunden, welches einen weiteren Aspekt der Erfindung darstellt.
Somit wird nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines MnSOD-Enzyms zur Verfügung gestellt, bei dem man einen transformierten Stamm von E. coli, der ein rekombinantes Plasmid, das mindestens ein Strukturgen aufweist, das für ein MnSOD-Enzym codiert und mit einem Promotor operativ verknüpft ist, kultiviert, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der native trp-Promotor von E. coli ist.
Beispiele für spezifische Promotorsequenzen sind folgende:
(1) Promotor mit einer Basensequenz, die die Sequenz TTGACA am 5'-Ende und die Sequenz TTAACT am 3'-Ende aufweist.
(2) Promotor mit einer Basensequenz, die die Sequenz TCAATT am 5'-Ende und die Sequenz ACAGTT am 3'-Ende aufweist.
(3) Promotor, der die folgende intervenierende, zwischen der 3'- und 5'-Sequenzen von (1) oder (2) befindliche Sequenz aufweist:
(4) Promotor, der die folgende Basensequenz aufweist:
Der Sequenz
kann die Sequenz
vorausgehen und die Sequenz
folgen.
Folgendes Protokoll wurde für das molekulare Clonen des B. stearothermophilus sod- Gens verwendet:
Der erste Schritt beim Clonen des codierenden Gens bestand darin, ein Oligonucleotid zu entwerfen, das eine ausreichende Homologie zum Strukturgen aufweist, um seinen Nachweis durch DNA/DNA-Hybridisierungsexperimente zu ermöglichen. Die Analyse der Aminosäuresequenz zeigte, daß die Aminosäuren 17 bis 34 ein Peptid darstellen, das eine minimale Translationsdegeneration aufweist. Folglich wurde ein Antisense-(50'iger)-Oligonucleotid synthetisiert (Fig. 1), in dem die in den Positionen der Codondegeneration verwendeten Nucleotidbasen denen entsprachen, die am häufigsten in B. stearothermophilus verwendet werden. Um zu testen, ob das synthetisierte Oligonucleotid mit einer spezifischen Sequenz im B. stearotherinophilus-Genom hybrisisierte, wurden Southern-Blot-Experimente durchgeführt. Das Oligonucleotid wurde radioaktiv markiert und in DNA/DNA- Hybridisierungsreaktionen gegen B. stearothermophilus NCA 1503 Genom-DNA verwendet, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten war.
Unter den verwendeten Versuchsbedingungen (siehe folgende Beispiele) zeigte sich, daß die Sonde stark mit den folgenden diskreten Restriktionsfragmenten hybridisierte: a 2,45 kb BclI, 5,1 kb ClaI, 6,8 kb EcoRI, 3,4 kb HindIII, 20 kb PstI, 3,2 kb SalI, 3,5 kbSstI und einem 17 kb XhoI Fragment.
Nachdem die Spezifität der Oligonucleotidsonde nachgewiesen war, wurde eine Plasmidbibliothek des B. stearothermophilus-Genoms dadurch hergestellt, daß man nach Größe gewählte (etwa 8 kb), teilweise gespaltene (Sau3a) chromosomale DNA mit BamHI- gespaltener pAT153-DNA ligierte. Die resultierenden Ligationsgemische wurden in E. coli W5445 transformiert und die Transformanten auf Ampicillin enthaltendem L-Agar gewählt. Von den erhaltenen 6.000 ApR-Transformanten erwiesen sich 4, 125 als TcS. Bei den Analyse der Plasmiden von 50 willkürlich gewählten Vertretern der 4.125 präsumptiven rekombinanten Clone, zeigte sich, daß 46 Insertionen enthielten.
Jeder rekombinante APR TcS-Clon wurde durch in-situ-Koloniehybrisierung individuell geprüft, wozu man das radiomarkierte Oligonucleotid als Sonde verwendete. Es zeigte sich, daß die Sonde stark mit zwei verschiedenen rekombinanten Clonen hybrisierte. Plasmid-DNA wurde aus jedem Clon isoliert und mit pBCM1 und pBCM2 bezeichnet. Eine Restriktionskarte dieser beiden Plasmide ist in Fig. 2 gezeigt. Diese Karten zeigen, daß die pBCM1-Insertion 4,7 kb hatte, während die pBCM2-Insertion 6,85 kb groß war. Die vergleichende Analyse von DNA-Fragmenten, die durch Spaltung (einzeln oder in Zweierkombinationen) mit verschiedenen Restriktionsenzymen erzeugt wurden, zeigte, daß die pBCM2-Insertion die pBCM1-Insertion vollständig enthielt; außerdem war die pBCM 1-Insertion, bezogen auf den Vektor der pBCM2-Insertion, entgegengesetzt orientiert.
Um die Position des sod-Strukturgens innerhalb der in pBCM 1 und pBCM2 vorhandenen geclonten DNA zu lokalisieren, wurde jedes Plasmid einer Restriktion mit verschiedenen Endonudeasen unterzogen und die resultierenden Fragmente mit der Southern-Blot- Analyse untersucht. Eines der kleinsten Restriktionsfragmente, das mit der Oligosonde hybridisierte, erwies sich als ein 1,6 kb EcoRI-SstI-Fragment, das beide Plasmide gemeinsam haben.
Folglich wurde dieses Fragment aus pBCM2-DNA gelgereinigt und an M13mp18 und M13mp19 ligiert, die gleichermaßen mit EcoRI und SstI gespalten worden waren. Die Ligationsgemischen wurden in E. coli TG1 transfomiert und auf 2XYT-Agar in H-Top- Agar-Deckschichten plattiert, die XGal und IPTG enthielten. Rekombinante Plaques, die durch ihr farbloses Aussehen identifiziert wurden, wurden zur Herstellung von DNA- Templates verwendet. Dann wurden von jedem M13-Vektor abgeleitete, repräsentative Templates unter Verwendung eines Universalprimers einer Analyse der Nuceotidsequenz unterzogen. Die Translation der aus beiden Templates erhaltenen DNA-Sequenz in die Aminosäuresequenz ergab keinen offenen Leserahmen (ORF = open reading frame), der ein zur veröffentlichten MnSOD-Sequenz homologes Polypetid codiert. Dies zeigte, daß sod sich innerhalb des Mittelteus dieses Fragments befand. Danach wurde die vollständige Sequenz der Insertion mit zwei verschiedenen Strategien bestimmt: (i) Oligonudeotide, die für die von den vorstehenden beiden Templates abgeleitete Sequenz spezifisch waren, wurden synthetisisert und dazu verwendet, die zuvor bestimmte Sequenz zu verlängern; (ii) das 3,0 kb HindIII- Fragment von pBCM2, das das geclonte 1,6 kb EcoRI-SstI- Fragment einschloß, wurde durch Elektroelution isoliert, durch Selbstligierung zyklisiert, durch Ultraschall fragmentiert, die erzeugten sticky-Ends durch Behandlung mit T4- Polymerase in blunt-Ends umgewandelt und die gelgereinigten Fragmente von 500 bis 1000 bp in die Smai-Stelle von M13mp8 eingefügt.
Aus 100 der erhaltenen rekombinanten Clone wurde Template-DNA hergestellt. Die erhaltenen Nucleotidsequenzdaten wurden mit Hilfe der Computersofiware von DNASTAR Inc. zu einer lückenlosen Sequenz zusammengefügt. Die in Fig. 3 gezeigte Sequenz stellt einen 1294 bp-Teilstück der erhaltenen Sequenz dar, das das sod-Strukturgen umfaßt, und wurde an beiden DNS-Strängen bestimmt.
Die Translation der in Fig. 3 gezeigten Nucleotidsequenz zeigt die Gegenwart eines ORF von 615 bp an, der mit einem AUG-Codon (Nucleotid (nt) 387) beginnt und mit einem UAA-Codon (nt 1001) endet. Das abgeleitete Polypeptid wies eine Länge von 204 Aminosäuren (aa) auf und war mit Ausnahme des N-endständigen Met perfekt konform mit der experimentell bestimmten Aminosäure-Sequenz der MnSOD (Brock und Walker, 1980).
Eine Sequenz, die bei 438 begann und bei 488 endete, war nahezu perfekt komplementär zu der Oligosonde, die man zur Identifikation des Gens verwendet hatte. Die drei Positionen, an denen keine Übereinstimmung erzielt wurde (nt 465, 477 und 483) führten alle zu einer neutralen G.T.-Paarung, was für die effiziente Bindung des Oligo an von B. stearothermophilus abgeleitete und sod codierende DNA verantwortlich ist. Vor dem Translationsinitiationscodon stand eine Sequenz (5'-CAAAAGGAGGAGA-3'), die stark komplementär zum 3'-Terminus der Bacillus subtilis 165 rRNA (3'-UCUUUCCUCCACU-5') war. Eine Sequenz, die Dyadensymmetrie aufweist, befindet sich unmittelbar 3' zum Translationsstopcodon (nt 1007 bis 1036) auf und stellt vermutlich einen Rho-unabhängigen Transcriptionsterminator dar. Die gebildete mutmaßliche RNA-Stem-loop-Struktur hätte ein DG von -22,2 kcal. Ein zweiter mutmaßlicher ORF wurde 3' von sod identifiziert, beginnend mit einem AUG-Codon bei nt 1133, dem eine Sequenz vorangeht, die angemessen komplementär zur B. subtilis 165 rRNA ist. Das codierte mutmaßliche Polypeptid weist keine Homologie zu irgendeinem Protein auf, das derzeit in der PIR-Datenbank zu finden ist. Das sod-Strukturgen weist einen G+C-Gehalt von 53,1 % auf; seine Codonverwendung (Codon-usage) ist in Tabelle 2 aufgeführt.
Um die Superexpression von sod in E. coli hervorzurufen, verwendete man die Plasmide pMTL1003 und pMTL1013, die Teil einer Serie von Expressionsvektoren sind, die vor kurzem in diesem Labor konstruiert wurden. Von pMTL4 (Chambers et al., 1988) abgeleitet, repliziert sich pMTL1003 von einem mutanten ColE1-Replicon (600 Kopien pro Zelle, Minton et al., 1988), codiert die von pUC8 abgeleiteten Gene bla und lacZ' (Messing und Vieria, 1982) und inkorporiert die pSC101-Verteilungsfunktion (par; Miller et al., 1983), den E. coli rrnB-Doppelterminator (Brosius et al., 1981) und den pMTL20- Polylinkerclonierungsbereich (Chambers et al., 1988). Die Transcription von lacZ' steht unter Kontrolle eines synthetischen trp-Promotors. pMTL1013 unterscheidet sich von pMTL1003 nur darin, daß das bla-Gen (ApR) durch das tet (TcR)-Gen ersetzt wurde. Diese Expressionsvektoren wurden auffolgende Weise abgeleitet (siehe Fig. 4 zu Einzelheiten).
Das 5'-Ende des bla-Gens (ApR) wurde zusammen mit den Doppeltranscriptionsterminationssignalen (T1 und T2) des rrnB-Operons aus dem Plasmid pKK223-3 als 831 bp ScaI/SmaI-Fragment isoliert und zwischen die EcoRV- und ScaI-Stellen von pMTL4 zum Erhalt von pMTL7 eingefügt. Ein 385 bp TaqI-Fragment, das die pSC101 par Stabilitätsdeterminante (Miller et al., 1983) trägt, wurde anschließend zwischen den EcoRVI- und ScaI-Stellen insertiert, um pMTL8 zu erhalten. Die verb]eibenden Manipulationen hatten den Zweck, sowohl die Größe zu reduzieren als auch unerwünschte Restriktionsstellen aus dem fertigen Vektor zu entfernen. pMTL8 wurde mit Sah und Eco47 gespalten, blunt- Ends mit S1-Nuclease erzeugt und einer Selbstligation unterzogen, um pMTL9 zu ergeben. Diese 58 bp-Deletion entfernte die einzigen SalI, Eco47 und BamHI-Schnittstellen und eine Anzahl von TaqI und HaeII-Stellen. Dann wurde ein 322 bp HaeII-Fragment aus pMTL9 deletiert, wodurch die Anzahl von HaeII- und TaqI-Stellen im fertigen Vektor pMTL10 um eins verringert und die einzigen PstI- und HindIII-Stellen entfernt wurden. Obwohl durch diese Deletion ein Teil des pSC101 par-Fragments entfernt wurde, zeigt sich im Experiment, daß pMTL10 in Zellen, die ohne Antibiotika-Selektion gezüchtet worden waren, eine Segregationsstabilität von 100 % aufwies. Die letzte Modifizierung, die an der Vektorbasis vorgenommen wurde, bestand darin, eine ortsspezifische Mutagenese (site directed mutagenesis) vorzunehmen, um eine EcoRV-Stelle zwischen par und dem ColE1-Replikationsursprung einzuführen.
Dies wurde erreicht, indem man zunächst das diesen Bereich enthaltene, 530 kb TaqI- Fragment von pMTL10 in die AccI-Stelle von M13mp8 donierte. Anschließend wurde ein mutagenes Oligonucleotid eingesetzt, um unter Verwendung der ortsspezifischen Mutagenese die gewünschte EcoRV-Restriktionsstelle einzuführen. Das mutierte TaqI-Fragment wurde wiederum isoliert und mit den 1,44 kB und 430 kB TaqI-Fragmenten von pMTL10 ligiert. Der erhaltene, modifizierte Vektor wurde pMTL100 genannt.
Um die Expression eines heterologen Gens unter die Kontrolle eines externen Promoters zu stellen, ist es erforderlich, das Strukturgen in der Nähe der geeigneten Transcriptionssignale in der richtigen Orientierung zu insertieren. Derartige Manipulationen werden durch die Möglichkeit der gerichteten Clonierung sowie die Existenz von Hilfsmitteln zum Nachweis der Insertion von Fremd-DNA verstärkt.
Eines der einfachsten Systeme, das sich durch die Vektorserien pUC und M13 veranschaulichen läßt (Vieira und Messing, 1982), ist jenes, das die Inaktivierung des β- Galactosidase-a-Peptid, von lacZ' codiert, umfaßt. Ein funktionierendes lacZ' tragende Vektoren verleihen Kolonien oder Plaques geeigneter E. coli-Wirte in Anwesenheit des chromogenen Substrats XGal eine blaue Färbung. Die Inaktivierung des Gens (z.B. durch Insertion heterologer DNA) führt zu farblosen (weißen) Kolonien bzw. Plaques. In den pUC- bzw. M13-Vektoren ist dem lacZ'-Gen sein natürlicher lac po-Promoterbereich vorangestellt.
Bei den Vektoren pMTL1003 und pMTL1013 wollten wir die Nützlichkeit des lacZ'- Selektionssystems erhalten, aber den lac-Promoter durch den trp-Promoter ersetzen. Um dies zu erreichen, wurde die ortsspezifische Mutagenese an M13mt120-DNA angewandt, um eine PuvII-Stelle im 3'-Ende von lacZ' zu entfernen (wodurch die PuvII-Stelle 5' von lac po als einzige verblieb) sowie um eine einzelne HpaI-Stelle 3' vom +1 des lac po zu erzeugen. Gleichzeitig wurde am Start des lacZ'-Gens eine NdeI-Stelle so erzeugt, daß das ATG der Ndei-Erkennungssequenz (CATATG) dem AUG-Translationsinitiationscodon von lacZ' entsprach.
Obwohl für die Expression der SOD nicht relevant, wird dessen Existenz die zukünftige Expression anderer Gene unterstützen. Beispielsweise kann eine Ndei-Stelle an entsprechenden Positionen in einem beliebigen heterologen Gen, das exprimiert werden soll, erzeugt und anschließend verwendet werden, um das Gen an der Ndei-Stelle des modifizierten lacZ'-Gens zu insertieren. Dieses plaziert das AUG-Startcodon des zu exprimierenden Gens in optimaler Distanz zur Shine-Dalgarno-Sequenz des lacZ'-Gens, was die folgende Translation der RNA-Transcripte maximiert. Ein 830 bp HindIII-PstI-Restriktionsfragment, das einen synthetischen E. coli trp-Promoter trägt, wurde aus dem Plasmid pDR720 (Russel und Bennett 1982) isoliert, durch Behandlung mit Polik mit blunt-Ends versehen und zwischen der PvuII- und der HpaI-Stelle des modifizierten M13mt120- Vektors insertiert. Durch diese Manipulation ließ sich der natürliche lac-Promoter effektiv durch den trp-Promoter ersetzen (Es sei angemerkt, daß dieselbe Strategie angewendet werden kann, um lac po durch jedes andere Promoterelement zu ersetzen). Der trp- Promoter/lacZ'/Polylinker-Bereich wurde anschließend als 388 bp HaeII-Fragment aus dem M13-Vektor entfernt und in der angegebenen Richtung (Fig.5) in eine der beiden HaeII-Stellen von pMTL100 doniert, um pMTL1003 zu erhalten.
Der Vektor pMTL1013 ist pMTL1003 analog mit der Ausnahme, daß das bla-Gen durch das tet-Gen aus pBR322 ersetzt wurde. Das tet-Gen wurde aus pBR322 als 1,43 kb EcoRI-AvaI-Fragment (Balbas et al., 1986) isoliert, mit Polik mit blunt-Ends versehen und in die SmaI-Stelle von M13mp10 insertiert. Anschließend wurde zur Entfernung der Restriktionsorte von ClaI, HindIII, EcoRV, BamHI, SphI und SalI die ortspezifische Mutagenese angewandt. Die jeweiligen Nucleotidsubstitutionen waren wie folgt: A in T, nt 27; T in A, nt 28; T in C, nt 187; C in T, nt 379; T in C, nt 565 und C in T, nt 656 (die Nucleotidpositionen entsprechen der pBR322-Sequenz, Balbas et al., 1986). Das modifizierte tet-Gen wurde anschließend in Form eines etwa 1,43 kb EcoRI-BamHI- Fragments ausgeschnitten, in die HpaI-Stelle von pMTL28 (vgl. Fig.6) insertiert, reisoliert als BamHI-BclI-Fragment und mit einem 1,85 kb Fragment von pMTL1003 ligiert, das durch Spaltung von pMTL1003 mit SspI und DraI erzeugt worden war. Das schließlich erhaltene Plasmid wurde als pMTL1013 bezeichnet (Fig.7).
Das sod-Gen wurde als ein 1,3 kb NruI-HindIII-Fragment (Fig.3) aus pBCM2 isoliert, zwischen die SmaI- und HindIII-Stelle von pUC9 doniert und anschließend als EcoRI- HindIII-Fragment vergleichbarer Größe wieder ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde dann in die SmaI-Stelle von pMTL1003 insertiert, nach einer Behandlung zum Erzeugen von blunt-Ends mit PolIk. Für die weiteren Untersuchungen wurden zwei rekombinante Plasmide (pBCM3 und pBCM4) gewählt, die die zwei möglichen Orientierungen der Insertion des donierten Fragments repräsentieren. Bei pBCM3 (Fig.8) war sod so orientiert, daß sich seine Expression durch Durchlesen während der Transcription vom vektoriellen trp-Promoter aus verstärken ließ. Zwei analoge Plasmide, pBCM5 (entsprechend pBCM3) und pBCM6 (entsprechend pBCM4), wurden unter Verwendung von pMTL1013 anstelle von pMTL1003 erzeugt.
pBCM3 und pBCM4 enthaltende Zellen wurden in komplexen Medien (2XYT), die mit 100 M MnSO&sub4; ergänzt waren, gezogen und durch Zugabe von Indolacrylsäure (20 lg/ml) die Transcritpion des vektoriellen trp-Promoters in der späten exponentiellen Phase induziert. Die Zellen wurden in stündlichen Intervallen aus der Kultur entnommen, durch Ultraschall aufgebrochen und die SOD-Aktivität des Extrakts nach der Entfernung der Zelibruchstücke mittels Zentrifugation bestimmt.
Die Höchstmenge an MnSOD, die von den pBCM3 tragenden Zellen erzeugt wurde, 62.275 Einheiten pro ml Kultur (entsprechend 12.210 u/mg lösliches Protein), wurde nach 10 Std. erreicht (Fig.9). Unter Bezugnahme auf die spezifische Aktivität der reinen MnSOD (25.000 u/mg) entsprach dies 47 % des löslichen Proteins der Zelle. Diese Mengen wurden bestätigt durch Dichtescans von mit Coomassie blue getärbten Gelen nach SDS-PAGE des Gesamtzellextrakts (Fig. 10).
Daß die hohe Expression auf dem vektoriellen trp-Promoter beruhte, wurde durch die geringen Mengen an SOD (10,9 Einheiten pro ml Kultur) indiziert, die von den pBCM4 tragenden Zellen erzeugt wurden. Die überraschende Fähigkeit von E. coli, eine hohe Expression des B. stearothennophilus-sod-Gens zu stutzen, ist mit der Beobachtung konsistent, daß dessen codierender Bereich wenig Gebrauch von modulierenden Codons macht (ein einziges CGG- bzw. GGA-Codon werden verwendet), eine Codonverzerrung (codon bias) aufweist, die für hochexprimierte E. coli-Gene charakteristisch ist und ihm eine Ribosomenbindungstelle vorangeht, die nahezu dem Konsens entspricht.
Das Maß der von pBCM3 dirigierten sod-Expression wurde in einer Reihe von E. coli- Wirten mit unterschiedlichem Maß an natürlicher SOD-Aktivität untersucht (Tabelle 3). In diesem Fall wurde die Transcription vom trp-Promoter in der späten exponentiellen Phase nach Verarmung des in den Beispielen beschriebenen Minimal-Salz-Mediums an Tryptophan induziert. Unerklärlicherweise produzierten Wirte, die einen mutierten sodB-Lokus trugen, signifikant geringere Mengen an rekombinanter SOD als Wirte mit sodA oder mit wt.
Vorherige Studien haben gezeigt, daß sod-Mutanten verstärkte Empfindlichkeit gegenüber Methylviologen zeigen (Carlioz und Touati, 1986), einem im Handel erhältlichen Herbizid, von dem bekannt ist, daß es freie Superoxidradikale in E. coli erzeugt. Es war daher interessant zu sehen, ob das B. stearothermophilus-Enzym in der Lage wäre, die verstärkte Empfindlichkeit des E. coli-Stamms QC781 gegenüber Methylviologen zu komplementieren. Der Stamm QC781 wurde daher mit und ohne pBCM3 in Anwesenheit von 10&supmin;&sup5; M Methylviologen angezogen und die Wirkung auf die Wachstumsrate quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 dargestellt. Es war zu sehen, daß die Express ion der rekombinanten SOD die wachstumsinhibierende Wirkung des Wirkstoffes verminderte, jedoch die Wachstumsgeschwindigkeiten, die von QC781 in Abwesenheit von Methylviologen erreicht werden, nicht vollständig wieder herstellte. Dies steht im Gegensatz zu vergleichbaren Experimenten, die mit einer donierten Hefe-MnSOD ausgeführt wurden (Schrank et al., 1988).
Die Herstellung des MnSOD-Gens von B. stearothermophilus und B. caldotenax soll in den folgenden Beispielen genauer beschrieben werden. Die verwendeten Bakterienstämme und rekombinanten Vektoren sind in Tabelle 1 aufgezählt.

BEISPIEL 1

(a) Medien und Kulturbedingungen

B. stearothermophilus wurde bei 58 ºC und einem pH von 7,0 mit einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 1 vvm im folgenden Medium gezogen: Saccharose (4 %), Hefeextrakt (5 %), KH&sub2;PO&sub4; (1 %), MgSO&sub4; 7 H&sub2;O (0,054 %), MnCl&sub2; 4 H&sub2;O (0,003 %), FeCl&sub3; H&sub2;O (0,0014 %), Zitronensäuremonohydrat (0,064 %) und Polypropylenglykol P-2000 (0,01 %). E. coli wurde routinemäßig in L-Brühe kultiviert (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl). Ein verfestigtes Medium (L-Agar) bestand aus L-Brühe, der 2 % (Gew./Vol.) Agar (Bacto-Difco) zugesetzt waren. Die zur Erhaltung und Selektion der Transformanten verwendeten Antibiotika-Konzentrationen betrugen 50 lg/ml Ampicillin, 15 lg/ml Tetracyclin, 30 lg/ml Kanamycin und 5 lg/ml Chloramphenicol. Die Repression des trp-Promoters wurde, falls erforderlich, durch Anwesenheit eines Tryptophanüberschusses im Medium erzielt (100 lg/ml). Das bei der Erzeugung der rekombinanten SOD in E. coli im Versuchsanlagenmaßstab verwendete Medium enthielt Glucose (1,4 %), NH&sub4;SO&sub4; (0,25 %), KH&sub2;PO&sub4; (0,2 %), Na-Citrat (0,005 %), Hefeextrakt - Difco (0,5 %), MgSO&sub4; (1 %) und Spurenelemente (1,0 %). Die Stammlösung der Spurenelemente enthielt EDTA-Na&sub2; (0,5 %), FeCl&sub3; 6 H&sub2;O (0,05 %), ZnO (0,005 %), CuCl&sub2; H&sub2;O (0,001 %), CoNO&sub3; 6 H&sub2;O (0,001 %) und NR&sub4; Mo&sub7;O&sub2;&sub4; (0,001 %). Die Kultur wurde bei 37 ºC und einem pH von 7 0 ± 0,1 mit einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 1 vvm gezogen. Unter diesen Bedingungen hörte das exponentielle Wachstum nach etwa 8 Stunden auf und die Kultur wurde zu diesem Zeitpunkt geerntet.

(b) Aufreinigung der DNA

Die Plasmide wurde aus geklärten Lysaten, die unter Anwendung eines Brij-Lysis- Verfahrens (Clewell et al., 1969) hergestellt worden waren, mittels anschließender Caesiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation (Col man et al., 1978) aufgereinigt. Zu Testzwecken wurde außerdem ein schnelles Plasmidreinigungsverfahren im kleinen Maßstab angewandt (Holmes und Quigley, 1981). Die chromosomale DNA des Donors B. stearothennophilus wurde im wesentlichen wie von Marmur (1961) beschrieben hergestellt.

(c) Restriktions-, Ligations- und Transformationsverfahren

Restriktionsendonucleasen und DNA-Ligase wurden von den Bethesda Research Laboratories (BRL) bezogen und in bzw. unter den vorn Hersteller empfohlenen Puffern und Bedingungen eingesetzt. Die Transformation von E. coli erfolgte im wesentlichen wie von Cohen et al. (1972) beschrieben.

(d) Agarose-Gelelektrophorese

Abgedautes Material wurde in 1 %-Agarosestabgelen mit einem horizontalen Standardsystem (BRL Modell 4) der Elektrophorese unterworfen, wobei ein Tris-Borat-EDTA- Puffer verwendet wurde. Die Elektrophorese der nicht abgedauten DNA erfolgte für 3 Stunden mit 125 V, 50 mA, während die abgedaute DNA 16 Stunden lang mit 15 V und 10 mA elektrophoretisiert wurde. Die Fragrnentgrößen wurden über den Vergleich mit Fragmenten der DNA des Phagen k, der sowohl mit Hindih als auch mit EcoRI zerschnitten wurde, abgeschätzt. Die Fragmente wurden unter Einsatz der Elektroelution (McDonell et al., 1977) aus den Gelen isoliert.

(e) Nucleotidseguenzierung

M13-Bakteriophagenclone wurden mit Hilfe des Didesoxynucleotidverfahrens von Sänger et al. (1977) sequenziert, wobei eine modifizierte Version der Bakteriophagen-T7- DNA-Polyrnerase, die "sequenaseR" verwendet wurde (Tabor und Richardson, 1987). Die angewandten experimentellen Bedingungen entsprachen den vom Hersteller angegebenen (USB Corp.). Die Sequenzierung doppelsträngiger Plasmid-DNA erfolgte durch Modifikation des von Chen und Seeburg (1985) entwickelten Klenow-Polymerase/Didesoxynucleotid-Verfahrens. Die angewandten experimentellen Bedingungen entsprachen den vom Hersteller angegebenen (BCL).

(f) Southern-Transfer der DNA

DNA-Restriktionsfragmente wurden von den Agarosegelen auf " -Proben"-Nylonmembranen nach dem Verfahren von Reed und Mann (1985) transferiert. Vor dem Transfer in einer 0,4 M NaOH-Transferlösung wurden die Gele mit 0,25 M HCl depuriniert (15 min). Der Transfer erfolgte vor der Hybridisierung über 4 bis 16 Stunden mittels Kapillarelution.

(g) In-situ-Koloniehybridisierung

Die Bakterienkolonien wurden mittels in-situ-Koloniehybridisierung, wie sie von Grunstein und Hogness (1977) beschrieben wurde, auf die gewünschten rekombinanten Plasmide gescreent, wobei Nitrocellulosefilterscheiben (Schleicher und Schüll, 0,22 lm) verwendet wurden.

(h) Radioaktive Markierung der Oligonucleotide

Durch Anhängen von [c-32P]-dATP an das 5'-Hydroxyende mit T4-Polynucleotidkinase (Maxam und Gilbert, 1977) wurden Oligonucleotidsonden endständig markiert. Nicht eingebaute Nudeotide wurden durch Chromatographie auf Sephadex G-25-Einmalsäulen, wie vom Hersteller (Pharmacia) angegeben, entfernt.

(i) Hybridisierungsbedingungen

Die Hybridisierungen unter Verwendung der am 5'-Ende markierten Oligonucleotidsonden (50-mer) wurden, wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben, bei einer Temperatur von 55 ºC über 2 Stunden oder länger durchgeführt. Die Filterwaschungen erfolgten mehrmals für je 5 Minuten Dauer bei 45 ºC.

(j) ortsspezifische Mutagenese (site-directed mutagenesis)

Eine gekoppelte von einem Oligonucleotid als Primer dirigierte Mutagenese (priming oligonucleotid directed mutagenesis) erfolgte unter Anwendung des Suppressorselektionsprotokolls von Carter et al. (1985). Mutanten wurden nach dem von Carter et al. (1984) beschriebenen Differentialtemperatur-Hybridisierungsverfahren identifiziert, wobei ein radioaktiv markiertes Oligonucleotid als Sonde verwendet wurde.

(k) Segregationsstabilität

Die Segregationsstabilität der Plasmidvektoren wurde unter Anwendung einer kontinuierlichen Kultur analysiert. Zellen wurden in Fermentern der LH500-Serie gezogen und Kontrollen in einem kontinuierlichen 1 L-Kulturkessel mit einem Arbeitsvolumen von 600 ml. Das verwendete Wachstumsmediurn war das einfache Salzrnediurn von Tempest (1969). Die Kulturen wurden bei 37 ºC, pH 7,0 und unter einer Belüftungsrate von 1 vvm gehalten. Nach der Inokulation, ließ man die Kulturen chargenweise für 4 bis 5 Stunden wachsen, bevor der Zustrom von frischem Medium einsetzte. Es wurden periodisch Proben entnommen, Verdünnungsreihen auf Isosensitest-Agar angesetzt und Kolonien auf die plasmidcodierte β-Lactamaseproduktion hin getestet.

(l) Bestimmung der Superoxiddismutaseaktivität

Bakterien wurden in einer 1 L-Chargenkultur gezogen und 100 ml Proben an verschiedenen Stufen der Wachstumsphase entnommen. Die Proben wurden auf Eis gekühlt, 120 Minuten mit 13.000 g zentrifugiert und in 5 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,8) resuspendiert und eingefroren. Die Zellen wurden unter Verwendung eines MSE Ultrasonic Disintegrators (150 W) bei mittlerer Frequenz, Amplitude 2, für 3 Intervalle a 30 Sekunden auf Eis aufgebrochen. Die Zelltrümmer wurden durch 5 minütige Zentrifugation mit 10.000 g entfernt. Die SOD-Aktivität wurde bestimmt, indem man die Inhibition der Reduktion von Fe(III)-Cytochrom C überwachte, wie von McCord und Fridovich (1979) beschrieben. Die Proteinkonzentration wurde nach dem Verfahren von Bradford (1976) bestimmt. Die SOD-Aktivität wurde außerdem nach der PAGE sichtbar gemacht, wofür das Gel vor der Zugabe von Riboflavin mit einer Lösung eines Nitroblau-Tetrazol-Reagenz getränkt wurde. Dieses Verfahren wurde von Beauchamp und Fridovich (1971) vollständig beschrieben.

(m) Fermentation in kleinem Maßstab von pBCM3 enthaltenden E. coli TG1- Zellen

Obwohl der Expressionsgrad der rekombinanten SOD, wie er in der chargenweisen Kultur erzielt wurde, in einer hohen Größenordnung lag, war von Interesse, ob sich diese hohe Produktionsraten würden auf Bedingungen übertragen lassen, die denjenigen der kommerziellen Produktion von rekombinanten Proteinen stärker ähneln. Dementsprechend wurde ein 8 L-Versuchskultur unter Verwendung des hier beschriebenen minimalen Salzmediums angesetzt. Das Inokulum für die Beimpfung wurde durch frisch transformierte Zellen bereitgestellt, die auf zur Promoterrepression- bzw. -selektion mit Tryptophan (100 lg/ml) und Ampicillin (100 lg/ml) ergänztem L-Agar ausplatiert waren. Das Impfmaterial wurde durch eine 500 ml 2xLB-Kultur bereitgestellt, die mit MnSO&sub4;, Ampicillin und Tryptophan ergänzt war. Das Impfmaterial wurde bei 37 ºC und 200 rpm 7 Stunden lang gezogen. Einmal beimpft, ließ man die Kultur vor dem Ernten einen vollen Zyklus durchlaufen, unter Vertrauen auf den Tryptophanmangel, der den trp-Promoter spät in der exponentiellen Wachstumsphase der Kultur anstellen sollte, wenn die Zelldichten am höchsten sind. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation geerntet und die Zellpaste in Tüten verpackt, blitzgefroren und bis zur Extraktion bei -80 ºC gelagert. Das Maß der in den Versuchsmaßstabskulturen erhaltenen SOD-Expression war mit dem in den Rollflaschenexperimenten erhaltenen konsistent. Nach der Reinigung zeigte sich bei der Charakterisierung, daß die gereinigte rekombinante SOD ein Dimer ist, wobei jede Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 21.000 Dalton und einen isoelektrischen Punkt von 5,5 hatte.
Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, daß das die Mn-Superoxiddisrnutase von Bacillus stearothemzophilus codierende Gen (sod) in Escherichia coli doniert wurde und seine gesamte Nucleotidsequenz bestimmt wurde. Mit Ausnahme des post-translational abgespaltenen N-terminalen Methioninrests, stirnmt die vorhergesagte Aminosäuresequenz zu 100 % mit der zuvor bestimmten Aminosäuresequenz überein. Es konnte gezeigt werden, daß die rekombinante MnSOD in E. coli funktional aktiv ist, sowohl in-vivo als auch in-vitro; sie wurde zu 47 % des löslichen Proteins der Zelle exprimiert, indem man seine Transcription an den trp-Promoter aus E. coli koppelte.

BEISPIEL 2

(a} Molekulare Clonierung des B. caldotenax sod-Gens

Die zur Clonierung des B. caldotenar Gens verwendete Oligonucleotidsonde wurde radioaktiv markiert und in DNA/DNA-Hybridisierungsreaktionen gegen genomische DNA von B. caldotenax YT1 eingesetzt, die mit verschiedenen Restriktionsenzyrnen geschnitten worden war. Unter den angewandten Bedingungen (siehe unten) hybridisierte die Sonde stark mit verschiedenen diskreten Fragmenten, einschließlich eines 4,1 kb HindIII-Fragments. Dementsprechend isolierte man eine mit HindIII gespaltene genomische DNA etwa dieser Größe aus Agarosegelen und ligierte sie mit mit Hindih geschnittener pUC19- Plasmid-DNA. Die erhaltenen Ligationsgemische wurden in E. coli TG1 transformiert und die Transformanten auf einem Ampicillin und XGal enthaltenden L-Agar selektiert. Eine Gesamtzahl von 1100 Rekombinanten (weiße Kolonien) wurden einzeln mittels in-situ- Koloniehybridisierung unter Verwendung von radiornarkierten Oligonueleotiden als Sonden gescreent. Die Sonde hybridisierte stark mit 4 verschiedenen rekombinanten Clonen. Die Plasmid-DNA eines dieser Clone wurde isoliert und mit pBCM7 bezeichnet.

(b) Bestimmung der B. caldotenar sod-Nucleotidsequenz

Um die Position des sod-Strukturgens in der in pBCM7 vorliegenden donierten DNA zu bestimmen, wurde die Plasmid-DNA mit verschiedenen Endonudeasen gespalten und die erhaltenen Fragmente der Southern-blot-Analyse unterzogen. Eines der kleinsten Fragmente, das mit der Oligosonde hybridisierte, erwies sich als ein 1,9 kb AccI-Fragment. Dieses Fragment wurde aus mittels Selbstligation zyklisierter pBCM7-DNA gelgereinigt, über Ultraschall fragmentiert, die erzeugten sticky-Ends durch Behandlung mit T4-Polymerase in blunt-Ends überführt und die gelgereinigten Fragmente von 500 bis 1000 bp in die SmaI-Stelle von M13mp8 insertiert. Aus 100 der erhaltenen rekombinanten Clone wurden DNA-Templates hergestellt. Die erhaltenen Nucleotidsequenzdaten wurden zu einer lückenlosen Sequenz zusammengesetzt unter Verwendung der Computersoftware von DNASTARInc.. Die in Fig. 12 dargestellte Sequenz repräsentiert ein Teilstück von 780 bp der erhaltenen Sequenz, das das sod-Strukturgen umfaßt; sie wurde anhand beider DNA-Stränge bestimmt.
Die Translation der in Fig. 12 dargestellten Nucleotidsequenz ergab das Vorhandensein eines ORF von 615 bp, der mit einem AUG-Codon (nt 30) beginnt und mit einem UAA- Codon (nt 643) endet. Über den in Fig. 12 dargestellten Bereich hinweg bestanden 35 Unterschiede hinsichtlich der Nukleotide gegenüber dem äquivalenten Bereich des B. stearothermophilus-Genoms. Von diesen befanden sich 21 im codierenden Bereich des Gens, was zu zwei Unterschieden hinsichtlich der Aminosäuren zwischen den zwei codierten Polypeptiden führte. Daher enthält die BC-MnSOD die Aminosäurereste Glu und Ile in den Positionen 103 bzw. 188, wogegen die BS-MnSOD die Aminosäuren Asp und Val an den jeweils äquivalenten Positionen enthält. Wie beim B. stearothermophilus-Gen geht dem Translationsinitiationscodon eine Sequenz (5'-CAAAAGGAGGAGA-3') voran, die eine starke Komplimentarität zum 3'-Ende der Bacillus subtilis 165 rRNA (3'-UCUUUCCUCCACU-5') zeigt. Gleichermaßen befindet sich unmittelbar 3' vom Transiationsstopcodon eine Dyandensyrnmetrie aufweisende Sequenz (nt 654 - 677); diese stellt wahrscheinlich einen Rho-unabhängigen Transcriptionsterminator dar. In diesem Fall hätte die vermutlich gebildete Stem-loop-RNA-Struktur einen höheren DG (-26,4 kcal) als die äquivalente, downstream des B. stearothermophilus-Gen gefundene Struktur (DG - 22,2 kcal), aufgrund eines einzigen Unterschiedes in der Nucleotidsequenz, d.h. einer Substitution T durch C. Das sod-Strukturgen verfügt über einen G+C-Gehalt von 52,8 % und die Codonnutzung (Codon usage) ist in Tabelle 2 gegeben.

(c) Superexpression der BC-MnSOD

Um eine hohe Expression des BC-MnSOD-Gens hervorzurufen, wurden zu den oben beschriebenen äquivalente Plasmide konstruiert. In diesem Fall wurde das 1,9 kb AccI- Fragment in die AccI-Stelle von pMTL1003 zum Erhalt der rekombinanten Plasmide pBCM8 (vgl. Fig. 13) und pBCM9 insertiert. Bei pBCM8 (Fig. 13) war sod so orientiert, daß seine Expression durch Durchlesen bei der Transcription vom vektoriellen trp-Promoter aus verstärkt werden konnte. Unter Verwendung von pMTL1013 wurden zwei analoge Plasmide pBCM10 (entsprechend pBCM8) und pBCM11 (entsprechend pBCM9) erzeugt.
pBCM8 und pBCM9 tragende Zellen wurden in einem komplexen Medium (2XYT) gezogen, das mit 100 µM MnSO&sub4; ergänzt war, und die Transcription des vektoriellen trp- Promoters durch Zugabe von Indolacrylsäure (20 lg/ml) in der späten exponentiellen Phase induziert. In stündlichen Intervallen wurden Zellen aus den Kulturen entnommen, mittels Ultraschall aufgebrochen und die SOD-Aktivität des Extrakts nach Entfernung der Zelltrümmer durch Zentrifugation bestimmt. Die erzielten Expressionsmaße spiegelten die mit den rekombinanten Clonen von B. stearothermophilus erzielten wieder. So wurde der Maximalwert der von pBCM8 tragenden Zellen produzierten MnSOD, 90.710 Einheiten pro ml Kultur (entsprechend 9.913 u/mg lösliches Protein), nach 10 Stunden erreicht (Fig.9). Unter Bezugnahme auf die spezifische Aktivität der gereinigten MnSOD (25.000 u/mg) entsprach dies 40 % des löslichen Proteins der Zelle. Dieses Ausmaß ließ sich durch Dichtescans von Coomassie blue-gefärbten Gelen nach SDS-PAGE von Gesamtzellextrakten bestätigen (vgl. Fig. 10). Daß die hohe Expression auf dem vektoriellen trp- Promoter beruhte, wurde durch die geringen Mengen an SOD indiziert, die von pBCM9 tragenden Zellen erzeugt wurden (8,9 u/ ml Kultur). Die Fähigkeit von E. coli, hohe Expressionsraten des B. caldotenax sod-Gens zu stützen, war mit der Beobachtung konsistent, daß dessen codierender Bereich nur geringen Gebrauch von modulierenden Codons macht (ein CGG- und ein GGG-Codon werden verwendet), eine Codonverzerrung aufweist, die für hoch exprimierte E. coli-Gene charakteristisch ist (Grosjean und Friers, 1982) und ihm eine Ribosomenbindungsstelle vorangeht, die nahezu dem Konsens entspricht.

BEISPIEL 3

Nach dem folgenden Verfahren wurde eine gereinigte, pyrogenfreie BS-MnSOD aus einer BS-Kultur hergestellt.
Nach der Ernte wurden die BS-Zellen mittels Hochdruckhomogenisation aufgebrochen und der Rohextrakt chargenweise durch fraktionierte Elution auf DE-23-Cellulose gereinigt. Die die MnSOD enthaltenden 0,4 m-Fraktionen wurden nacheinander wie folgt chromatographiert:
(i) auf DEAE-Sepharose mit Ionenaustauschgradientenchromatographie bei pH 8,0
(ii) über Hydroxylappatitchromatographie unter Verwendung eines Phosphatgradienten bei pH 6,8
Das 30 % reine Enzym wurde von Pyrogenen befreit und zur Homogenität gereinigt, und zwar mittels Ionenaustauschgradientenchromatographie auf Q-Sepharose bei pH 7,5 und mittels Gelfiltration auf Sephaenyl S-200.

PHARMAKOLOGISCHE TESTS

(a) Serumhalbwertszeit

Die Halbwertszeit der BS-MnSOD wurde unter Einsatz eines Meerschweinchen-Modells bestimmt. Störungen durch Wechselwirkungen mit endogenen Cu/ZnSOD's wurden durch Zugabe von 5 mM Cyanid zum Testsystem ausgeschaltet.
Es wurde eine Halbwertszeit von ungefähr 6 Stunden beobachtet.

(b) Antigenität

In Gruppen von Meerschweinchen (n = 12), die auf dem intra-peritonealen Weg 1, 2 bzw. 10 mg pro kg Körpergewicht/6 Stunden erhielten (4 Tiere pro Gruppe), wurde keine nachteilige Antigenität beobachtet. Post-mortem-Untersuchungen an nach 48 bzw. 96 Stunden getöteten Tieren (2 Tiere/Dosis/Zeit) zeigten keine zerstörerischen Auswirkungen auf innere Organe und die Gesamtpathologie war normal.

(c) Schützende Wirkungen während der Herzperfusion

Eine Standardlösung für die Herzperfus ion (Ringerlösung) wurde mit 0,1 mg/l an BS- MnSOD ergänzt, die in Behältnissen, die 5 mg Enzym, 10 mg Lactose und 5 µMol Tris- HCl enthielten, bereitgestellt worden war.
Sechs Minischweine wurde in Gruppen zu je drei Tieren pro Gruppe aufgeteilt und einer Prozedur unterzogen, die eine Operation am offenen Herzen beim Menschen nachstellte. Genauer wurden die Tiere für 2 Stunden mit abgeklammerten Aorten gehalten, während sie mit den Testlösungen infundiert wurden.
Am Ende des Testzeitraumes wurden die Aortenklammern entfernt, die normale Blutversorgung wieder hergestellt und Standardverfahren zur Wiederherstellung des normalen Sinusrhythmus' angewandt.
Die Tiere wurden während der post-operativen Periode beobachtet; die Testtiere (diejenigen, denen die BS-MnSOD-enthaltenden Lösungen infundiert worden waren) zeigten eine nahezu normale flerzfunktion und überlebten einen Monat lang, bis zu dem Zeitpunkt, an dem sie zur pathologischen Untersuchung geschlachtet wurden. Es zeigten sich keine Anzeichen für Myocardinfarkte oder andere anormale Herzgewebepathologien.
Die Tiere in der Kontrollgruppe zeigten Herzdysfunktionen und waren nach einer Woche alle tot.

Anhang Abkürzungen:

aa, Aminosäure(n); Ap, Ampicillin; BC-MnSOD, Bacillus caldotenax MnSOD; bp, Basenpaar(e); BS-MnSOD, Bacillus stearothermophilus MnSOD; CuS OD, Kupfer enthaltende SOD; dal, Daltons; FESOD, Eisen enthaltende SOD; kb, Kilobase(n) oder 1000 bp; kcal, Kilocalorien; lacZ', das für das β-Galactosidase a-Peptid codierende Gen; MnSOD, Mangan enthaltende SOD; nt, Nukleotid(e); Oligo(s), Oligodesoxynucleotid(e); ORF, offener Leserahmen (open reading frame); ORI, Replikationsursprung (origin of replication); O&sub2;&supmin;, Superoxidradikal; PAGE, Polyacrylamidgelelektrophorese; par, Verteilungsfunktion des Plasmids psclol; po, Promoter-Operator-Bereich; Polik, (großes) Klenow- Fragment der E. coli DNA-Polymerase I; R, Resistenz; S, empfindlich (sensitive); SDS, Natriumdodecylsulfat; SOD, Superoxiddismutase; sod, für die SOD codierendes Gen; Tc, Tetracyclin; vvm, volumetrisches Volumen pro Minute; wt, Wildtyp; Xgal, 5-Brom-4- chlor-3-indolyl-βD-galactosid; ZnSOD, Zink enthaltende SOD.

Legenden der Figuren

Fig.1: Zum Nachweis des B.stearothennphilus sod-Gens verwendete Oligonucleotidsonde

Die angegebenen Aminosäuren (Ein-Buchstabnen-Code, obere Zeile) sind die Reste 17 bis 34 der von Brock und Walker (1980) bestimmten Sequenz. Das synthetisierte Oligonucleotid (50-mer) ist als "Sonde" markiert und wurde konstruiert, um den die als Ziel gewünschte Aminosäuresequenz codierenden DNA-Strang zu komplementieren. Die tatsächliche Sequenz der DNA, die die Aminosäure 17 bis 34 codiert, ist über der Oligonucleotidsequenz angegeben (mit" nt-Sequenz" bezeichnet). Die Komplementarität zwischen der tatsächlichen Sequenz und der Sonde wird durch angezeigt, während eine neutrale Basenpaarung durch ein Komma angedeutet ist.

Fig.2: Restriktionskarte von pBCM1 und pBCM2

Die Schnittstellen der Restriktionsenzyme befinden sich an den angegeben Stellen. Die von pAT153 abgeleitete DNA wird durch die dicke Linie dargestellt, wogegen die dünne Linie das von B. stearothennophilus abgeleitete DNA-Insert repräsentiert. Position und Orientierung der Transcription des sod- (SOD) und des bla-Gens (APR) sowie der ColE1- Replikationsursprung (ORI) sind durch die geeigneten Pfeile markiert. Das eingezeichnete HindIII-Fragment von 3,0 kb und das 1,6 kb EcoRI-SstI-Fragment wurden zum Zweck der Sequenzierung wie im Text angegeben isoliert. Schnittstellen der Restriktionsenzyme sind: C, ClaI; H, HindIII; N, Nrui; P, PvuI; R1, EcoRI; Sa, SalI; S1, SstI; S2, SstII; X, XhoI.

Fig.3: Nucleotidsequenz des die MnSOD codierenden B. stearothermophilus Gens

Der dargestellte Bereich ist ein HindIII-Nrui-Restriktionsfragment mit 1294 bp, das von pBCM2 abgeleitet ist (vgl. Fig.2). Von den zwei ORF's entspricht der ORF A dem sod- Gen und der ORF B einem potentiellen, bislang nicht identifizierten Gen. Beiden ORF's vorangehende mögliche Ribosomenbindungsstellen sind unterstrichen und mit S.D. gekennzeichnet. Der Bereich mit Dyadensymmetrie, der dem Transcriptionsterminator von sod entsprechen könnte, ist mit gegenläufigen Pfeilen über der Sequenz gekennzeichnet.

Fig.4: Konstruktion von pMTL10

Details der einzelnen, bei der Konstruktion von pMTL4 umfaßten Schritte, sind im Text gegeben. Die Schnittstellen der Restriktionsenzyme sind: Sc, ScaI; Hd, HindIII, P, PstI; S, SalI; B, BamHI; Sm, SmaI; RV, EcoRV; E7, Eco47; R1, EcoRI; T, TaqI, Ha, HaeII. Andere Plasmidelemente sind: die ColE1-Replikations-spezifischen Transcripte, RNAI und RNAII; die pSC101-Verteilungsfunktion, par; der E. coli trp-Promoter; das fl- Galactosidase a-Peptid, lacZ'; die E. coli rrnB-Operon Transcriptionsterminationssignale, T1 und T2; die bla- und tet-Gene, Ap und Tc.

Fig.5: Restriktionskarte von pMTL1003

Das Plasmid pMTL1003 wurde von pMTL10 abgeleitet (vgl. Fig.4), und zwar über die Insertion eines 388 bp HaeII-Fragments mit einem trp/lacZ'/Polylinker-Bereich in die HaeII-Stelle von pMTL10, die dem pSC101 par-Element unmittelbar benachbart ist (siehe Text bezüglich der Details). Markierte Elemente sind: der Colel-Replikationsursprung; die pSC101-Verteilungsfunktion, par; der E. coli tip-Promoter, trp; das β-Galactosidase a- Peptid, lacZ'; das Ampicillinresistenz-Gen (bla), ApR; die E. coli rrnB-Operon Transcriptionsterminationssignale, T1 und T2

Fig.6: Nucleotidsequenz der Polylinkerclonierungsregion von pMTL28

Die angegebenen Polylinkerbereiche entsprechen den in der Clonierungsvektorserie von pMTL20 verfügbaren (Chambers et al., 1988). pMTL28 wurde mittels chemischer Synthese geeigneter Oligo's
Annealen und Insertion derselben zwischen die XhoI- und die EcoRI-Stelle von pMTL23 abgeleitet.

Fig.7: Restriktionskarte von pMTL1013

Das Plasmid pMTL1013 wurde aus pMTL1003 durch Ersetzen des bla-Gens durch das tet-Gen (siehe Text bezüglich der Details) abgeleitet. Markierte Elemente sind: der ColE1- Replikationsursprung; die pSC101-Verteilungsfunktion, par; der E. coli trp-Promoter, trp; das β-Galactosidase a-Peptid, lacZ'; das Tetracyclinresistenz-Gen (tet), TcR; die E. coli rrnB-Operon Transcriptionsterminationssignale, T1 und T2

Fig.8: Restriktionskarte von pBCM3

Das Plasmid pBCM3 wurde durch Isolieren des sod-Gens pBCM2 als 1,3 kb NruI- HindIII-Fragment (Fig.3), Clonieren desselben zwischen die SmaI- und die HindIII- Restriktionsorte von pUC9 und anschließendes wiederaussch neiden als EcoRI-HindIII- Fragment vergleichbarer Größe aufgebaut. Dieses Fragment wurde dann, nachdem es durch Behandlung mit PolIk mit blunt-Ends versehen worden war, in die SmaI-Stelle von pMTL1003 so insertiert, das ein Durchlesen des sod-Gens während der Transcription vom trp-Promoter aus erfolgen konnte. Das von B. stearothermophilus abgeleitete DNA-Insert ist durch die dicke Linie dargestellt. Andere Merkmale: der ColE1-Replikationsursprung, ORI; die pSC101-Verteilungsfunktion, par; der tip-Promoter, tip; rrnB-Operon Transcritionsterminationssignale, T1 und T2; ein Ampicillinresistenzmarker und das B. stearothermophilus MnSOD-Gen, sod.

Fig.9: Herstellung der rekombinanten MnSOD in Escherichia Coli, die pBCM3 tragen

pBCM3 tragende Zellen wurden in einem Komplexmedium gezogen (2XYT), das mit 100 lM MnSO4 ergänzt war, und die Transcritpion des vektoriellen trp-Promoters in der späten exponentiellen Phase (angezeigt durch einen Pfeil) durch Zugabe von Indolacrylsäure (20 lg/ml) induziert. Die Zellen wurden in stündlichen Intervallen aus der Kultur entnommen, mittels Ultraschall aufgebrochen und die SOD-Aktivität nach Entfernen der Zelltrümmer mittels Zentrifugation bestimmt.

Fig.10: SDS-PAGE des Gesamtzellextrakts von pBCM3 tragenden TG1-Zellen

Gesamtzellextrakte wurden von der 10-Stunden-Probe des in Fig.9 dargestellten Experiments abgeleitet und der SDS-PAGE unterworfen. Spur 1: gereinigte B. stearothennophilus MnSOD; Spur 2: Molekulargewichtsmarker; Spur 3: lösliches Zell-Lysat von pBCM3 tragenden TG 1-Zellen.

Fig.11: Befähigung von pBCM3, eine E. coli soda-Mutante zu komplementieren

Der Stamm QC781 wurde in Anwesenheit von 10&supmin;&sup5; M Methylviologen angezogen, entweder mit ( ) oder ohne ( ) das Plasmid pBCM3. Eine Wachstumskurve des plasmidfreien QC781 ( ) ist zu Vergleichszwecken ebenfalls dargestellt.

Fig.12: Nucleotidsequenz des die BC-MnSOD codierenden B. caldotenax-Genes

Bei dem dargestellten Bereich handelt es sich um ein Teilstück von 780 bp des in pBCM8 enthaltenen 1,9 kb AccI-Fragments. Die Unterschiede der Nucleotidsequenz die bei der B. stearothennophilus-Sequenz auftreten sind oberhalb der Sequenz in Kleinbuchstaben angegeben (ein - zeigt das Fehlen eines Nucleotids in der B. stearothermophilus- DNA an). Die zwei Unterschiede hinsichtlich der Aminosäuren zwischen BS-MnSOD und BC-MnSod sind durch Aufnahme der BS-MnSOD-Aminosäuren unter der BC-MnSOD- Sequenz an den passenden Stellen (103, Asp anstelle von Glu; 188, Val anstelle von Ile) dargestellt. Die vor dem sod-Gen liegende Ribosomenbindungsstelle ist unterstrichen und mit S.D. gekennzeichnet. Der Bereich mit Dyadensymmetrie, der dem Transcriptionsterminationslement von sod entsprechen könnte, ist durch gegenläufige Pfeile oberhalb der Sequenz angegeben.

Fig. 13: Restriktionskarte von pBCM8

Das Plasmid pBCM8 wurde durch Isolieren des B. catdotenax sod-Gens als 1,9 kb AccI-Fragment aus pBCM7 und Clonieren desselben in die Acci-Schnittstelle von pMTL1003 derart, daß ein Durchlesen durch sod während der Transcription vom vektoriellen trp-Promoter aus auftreten kann, konstruiert. Das von B. caldotenax abgeleitete Insert ist durch eine dicke Linie angedeutet. Andere Merkmale: ColE1-Replikationsursprung; die psclol-Verteilungsfunktion, par; der trp-Promoter, tip; rrnB-Operon Transcriptionsterminationssignale, T1 und T2; ein Ampicillinresistenzmarker und das B. caldotencix MnSOD-Gen, sod. Tabelle I Bakterienstämme und Plasmid-/Phagenvektoren Tabelle I (Fortsetzung) Tabelle 2 Codonverwendung der BS-MnSOD- und BC-MnSOD-Gene
Ter - entspricht einem Translationsterminationscodon
BC - entspricht dem B. caldotenax-Gen
BS - entspricht dem B. stearothermophilus-Gen
fettgedruckte Codons entsprechen denjenigen Codons, die als Transiationsmodulatoren in E. coli bekannt sind Tabelle 3 Expressionslevel der nativen und rekombinanten SOD in E. coli
a - Die Phänotypen A und B beziehen sich auf das soda- bzw. das sodB-Gen + oder - zeigen an, ob das Gen funktional (+) oder defekt (-) ist
b - Die Ausmaße der sod-Expression, die von pBCM3/8 in einer Reihe von Wirten mit unterschiedlichem Maß nativer SOD-Aktivität gesteuert wird, wurde abgeschätzt durch Bestimmung der SOD-Mengen in Zellextrakten (Tabelle 3). In diesen Fällen wurde die Transcrition vom trp-Promoter aus spät in der exponentiellen Phase nach der Verarmung der Medien (2XYT) an Tryptophan induziert.

Claims

1. Pharmazeutische Zubereitung zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung pathologischer Zustände aufgrund der Anwesenheit von Superoxidradikalen, welche ein MnSOD-Enzym und einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das MnSOD-Enzym (i) in nativer Form vorliegt, (ii) die Dismutation von Superoxidradikalen katalysiert und (iii) (a) entweder die Aminosäuresequenz von Badilus stearothermophilus (BS) oder Bacillus caldotenax (BC) MnSOD oder (b) eine abweichende Sequenz aufweist, die sich von den Sequenzen in (a) durch 1 bis 20 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen unterscheidet.

2. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1, bei der das MnSOD-Enzym in nativer Form im Vergleich zum in einer Kultur eines MNSQD-erzeugenden BS- oder BC-Mikroorganismus vorhandenen MOD-SOD-Enzym im wesentlichen chemisch unmodifiziert ist.

3. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, die im wesentlichen frei von aus B. stearothermophilus oder B. caldotenax von Natur aus eigenen makromolekularen Substanzen bestehenden Pyrogenen ist.

4. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, in der das MNSQD-Enzym durch Kultivieren eines transformierten Mikroorganismus aus einer anderen Spezies als B. stearothermophilus oder B. caldctenax hergestellt wird.

5. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche, in der das MnSOD-Enzym eine aus

( i) der in Fig. 12 für BC MnSOD gezeigten Aminosäuresequenz,

( ii) der in Fig. 3 für BS MnSOD gezeigten Aminosäuresequenz und

(iii) Aminosäuresequenzen, die sich durch 1 bis 10 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen von den Sequenzen (i) und (ii) unterscheiden

ausgewählte Aminosäuresequenz aufweist.

6. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 5, in der sich die Aminosäuresequenzen (iii) durch 1 bis 5 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen von den Sequenzen (i) und (ii) unterscheiden.

7. Pharmazeutische Zubereitung nach einem der vorstehenden Ansprüche in Form (a) einer injizierbaren Lösung oder (b) einer Lösung, die sich zur Perfusion von Geweben während chirurgischer Eingriffe oder Transplantationen eignet.

8. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 7, die 0,001 bis 1,0 mg/l des MnSOD-Enzyms enthält.

9. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 8, die 0,05 bis 0,5 mg/l des MnSOD-Enzyms enthält.

10. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung mit folgenden Schritten:

(a) Kultivieren eines MnSOD-Enzym erzeugenden Mikroorganismus, um eine MnSOD-Enzym enthaltende Kultur herzustellen;

(b) Isolieren des MnSOD-Enzyms aus der Kultur;

(c) Reinigen des isolierten MnSOD-Enzyms zur Herstellung von gereinigtem Enzym, das im Vergleich zu dem in der in Schritt (a) hergestellten MnSOD enthaltenden Kultur vorhandenen MnSOD-Enzym chemisch im wesentlichen unmodifiziert ist, und

(d) Vermischen des chemisch unmodifizierten MnSOD-Enzyms mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff,

dadurch gekennzeichnet, daß das MnSOD-Enzym

( i) in nativer Form vorliegt,

( ii) die Dismutation von Superoxidradikalen katalysiert und

(iii) (a) entweder die Aminosäuresequenz von Badilus stearothermophilus (BS) oder Badilus caldotenax (BC) MnSOD oder (b) eine abweichende Sequenz aufweist, die sich von den Sequenzen in (a) durch 1 bis 20 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen unterscheidet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der Mikroorganismus ein transformierter Mikroorganismus einer anderen Spezies als B. stearothermophilus oder B. caldotenax ist.

12. Verwendung eines MnSOD-Enzyms bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung für die Prophylaxe und/oder Behandlung pathologischer Zustände aufgrund der Anwesenheit von Superoxidradikalen, dadurch gekennzeichnet, daß das MnSOD-Enzym (i) in nativer Form vorliegt, (ii) die Dismutation von Superoxidradikalen katalysiert und (iii) (a) entweder die Aminosäuresequenz von Badilus stearothermophilus (BS) oder Badilus caldotenax (BC) MnSOD oder (b) eine abweichende Sequenz aufweist, die sich von den Sequenzen in (a) durch 1 bis 20 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen unterscheidet.

13. Verwendung eines MnSOD-Enzyms bei der Herstellung einer Infusionslösung für Organe, die operiert oder transplantiert werden, besonders solcher Organe, die von der normalen Blutzufuhr abgeschnitten sind, dadurch gekennzeichnet, daß das MnSOD-Enzym (i) in nativer Form vorliegt, (ii) die Dismutation von Superoxidradikalen katalysiert und (iii) (a) entweder die Aminosäuresequenz von Bachlus stearothermophilus (BS) oder Badilus caldotenax (BC) MnSOD oder (b) eine abweichende Sequenz aufweist, die sich von den Sequenzen in (a) durch 1 bis 20 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen unterscheidet.

14. MnSOD-Enzym, das im wesentlichen in reiner Form vorliegt und die Aminosäuresequenz oder im wesentlichen die Aminosäuresequenz von B. caldotenax aufweist, wobei diese Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus

( i) der in Fig. 12 gezeigten Aminosäuresequenz,

(ii) Aminosäuresequenzen, die sich von der Sequenz (i) durch 1 bis 30 Aminosäureinsertionen, -deletionen und/oder -substitutionen unterscheiden mit der Maßgabe, daß die Aminosäuresequenzen (ii) Glu an der mit 103 bezeichneten Stelle und/oder Ile an der mit 188 bezeichneten Stelle aufweisen.

15. Rekombinantes DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz aufweist, die ein wie in Anspruch 14 definiertes MnSOD-Enzym codiert, wobei das rekombinante DNA- Molekül vorzugsweise aus (a) der in Fig. 12 gezeigten DNA-Codierungssequenz und (b) DNA-Sequenzen ausgewählt ist, die nach dem genetischen Code dieser Sequenz degeneriert sind.

16. Verfahren zur Herstellung eines MNSQD-Enzyms, bei dem man einen transformierten Stamm E. coli mit einem rekombinanten Plasmid, das mindestens ein Strukturgen aufweist, das für ein operativ mit einem Promotor verknüpftes MnSOD-Enzym codiert, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der native trp-Promotor von E. coli ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der Promotor eine Basensequenz hat, die die Sequenz TTGACA am 5'-Ende und die Sequenz TTAACT am 3'-Ende aufweist.

18. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der Promotor eine Easensequenz hat, die die Sequenz TCAATT am 5'-Ende und die Sequenz ACAGTT am 3'-Ende aufweist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 18, bei dem der Prqmotor die folgende intervenierende, zwischen der 3'- und 5'-Sequenzen befindliche Sequenz aufweist:

20. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der Promotor die folgende Basensequenz aufweist: