DE3688710T2

DE3688710T2 - Isolierung und pharmazeutische Verwendung von Hyaluronidase und diese enthaltende pharmazeutische und tierärztliche Präparate.

Info

Publication number: DE3688710T2
Application number: DE86301092T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Edwards; Roy Thomas Sawyer
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1985-02-16
Filing date: 1986-02-17
Publication date: 1993-11-18
Anticipated expiration: 2006-02-18
Also published as: EP0193330A3; DE3688710D1; GB8504025D0; EP0193330A2; EP0193330B1; US4820516A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hyaluronidasen.
Die Bezeichnung Hyaluronidase wird für eine wichtige Gruppe von Enzymen verwendet, die gewisse Gewebepolysaccharide (Glycosaminoglycane abbauen. Prinzipiell existieren zwei Arten von Hyaluronidasen: (a) solche, die relativ unspezifisch sind und Hyaluronsäure, Chondroitin und verwandte Polysaccharide spalten, und (b) solche, die spezifisch Hyaluronsäure spalten.
Hyaluronsäure ist ein Polysaccharid, das im extrazellulären Bindegewebe von Tieren weit verbreitet ist. Als "Kittsubstanz", die die Zellen zusammenhält, als Hauptbestandteil des Glaskörpers des Auges und von funktioneller Wichtigkeit in Gelenken usw., kommt der Hyaluronsäure eine beachtliche physiologische Bedeutung zu. Ein Enzym, das spezifisch Hyaluronsäure spaltet, müßte für verschiedenste medizinische und wissenschaftliche Anwendungszwecke geeignet sein.
Hyaluronidasen sind in der Natur weit verbreitet, z. B. in Hoden, Leber und Milz von Säugetieren sowie in gewissen Mikroorganismen. Säugetierhyaluronidasen gehören zur erstgenannten Art, d. h. sie spalten (unspezifisch) Hyaluronsäure, Chondroitin und andere Polysaccharide.
Andere Hyaluronidasen der zweitgenannten Art (d. h. hyaluronsäurespezifische Hyaluronidasen) werden nach der von Linker et al., 1960 J. Biol. Chem. 235, Seiten 924-7 beschriebenen Methode aus Mikroorganismen wie z. B. Streptomyces-Bakterien oder aus dem Egel Hirudo medicinalis gewonnen. Der Hyaluronsäure-Spaltungsmechanismus der aus Hirudo medicinalis gewonnenen Hyaluronidase unterscheidet sich von dem der aus Mikroorganismen gewonnenen Hyaluronidase, wie es aus Abbildung 1 der beigelegten Zeichnungen ersichtlich ist.
Genauer gesagt handelt es sich bei der aus Hirudo medicinalis erhältlichen Hyaluronidase um eine Endo-β- Glucuronidase (siehe die obengenannte Veröffentlichung von Linker et al.). Unseres Wissens nach ist dies der einzige beschriebene Fall einer hyaluronsäurespezifischen Endo-β-Glucuronidase.
Die von Linker et al. identifizierte β-Glucuronidase wurde von Yuki und Fishman (1963 J. Biol. Chem 238, Seiten 1877-9) genauer beschrieben, wobei ihr Aktivitätsoptimum mit pH 6,0 angegeben wurde. Seitdem wurde nur wenig über die aus Hirudo medicinalis gewonnene Hyaluronidase publiziert.
Es gelang nun, eine neue hyaluronsäurespezifische Endo-β-Glucuronidase aus Büffelegeln zu isolieren (bei dem Ausdruck "Büffelegel" handelt es sich um einen weiten Begriff, der die Unterfamilie Hirudinariinae umfaßt, d. h. die Gattungen Hirudinaria, Illebdella und Poecilodbella wie in "Leech Biology and Behaviour" von Dr. R.T. Sawyer, Oxford University Press, 1986, definiert).
Erfindungsgemäß wird daher eine aus Egeln der Unterfamilie Hirudinariinae erhältliche Endo-β-Glucuronidase zur Verfügung gestellt.
Die erfindungsgemäße Endo-β-Glucuronidase ist hyaluronsäurespezifisch (d. h. kann Hyaluronsäure, jedoch nicht Chondroitin, Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6- sulfat oder Heparin spalten). Es wurde weiterhin gefunden, daß das Enzym nicht die Fähigkeit hat, Fibronectin zu spalten, weshalb angenommen wird, daß es im wesentlichen über keine Protease-Aktivität verfügt. Die bekannte, aus Hirudo medicinalis gewonnene Endo-β- Glucuronidase ist ebenfalls hyaluronsäurespezifisch, aber die erfindungsgemäße Endo-β-Glucuronidase unterscheidet sich von der bekannten Endo-β-Glucuronidase darin, daß es sich bei ihr um ein Molekül handelt, das nachweislich unter Bedingungen wie hohen Temperaturen und pH-Extremen wesentlich stabiler und daher wertvoll ist.
Die aus Büffelegeln gewonnene Endo-β- Glucuronidase ist durch eine im Vergleich zu der aus Hirudo medicinalis gewonnenen Endo-β-Glucuronidase verbesserte Hitzestabilität gekennzeichnet; und zwar bleibt bei aus Büffelegeln gewonnener Endo-β- Glucuronidase mindestens 70% der Aktivität (Testtemperatur 37ºC) nach 30-minütiger Inkubation bei 50ºC erhalten (Abbildung 2). Im Vergleich dazu verliert aus Hirudo medicinalis gewonnene Endo-β-Glucuronidase nach Inkubation unter den gleichen Bedingungen mehr als 90% ihrer Aktivität. Dies wird in Abbildung 2 der beigelegten Zeichnungen dargestellt. Weiterhin bleibt nach 12-stündiger Aufbewahrung bei 50ºC beim Büffelegelenzym mindestens 30% der Aktivität erhalten, während das aus Hirudo medicinalis gewonnene Enzym nach 40 Minuten vollständig inaktiviert ist.
Die aus Büffelegeln gewonnene Endo-β- Glucuronidase ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie im Vergleich mit der aus Hirudo medicinalis gewonnenen Endo-β-Glucuronidase unter extremen pH- Bedingungen über eine verbesserte Aktivität verfügt. Dies wird in Abbildung 3 der beigelegten Zeichnungen dargestellt, wobei sich um eine gegen den pH auf getragene Aktivitätskurve einer erfindungsgemäßen Endo-β- Glucuronidase im Vergleich mit einer aus Hirudo medicinalis gewonnenen Endo-β-Glucuronidase handelt. Insbesondere bleiben bei pH 3,5 mindestens 50% der Aktivität bei aus Büffelegeln gewonnener Endo-β- Glucuronidase erhalten, während bei der aus Hirudo medicinalis gewonnenen Endo-β-Glucuronidase weniger als 10% der Aktivität erhalten bleiben. Auf ähnliche Weise bleiben bei pH 9,0 bei dem aus Büffelegeln gewonnenen Enzym 5% der Aktivität erhalten, während das aus Hirudo medicinalis gewonnene Enzym vollständig inaktiviert wird. Weiterhin wird das Hirudo-Enzym bei pH 9,0 irreversibel inaktiviert, während das aus Büffelegeln gewonnene Enzym im anschließenden Test bei optimalem pH noch eine Aktivität aufweist.
Die aus Büffelegeln gewonnene Endo-β-Glucuronidase wird weiterhin durch ihr Verhalten in der Gegenwart von HgCl&sub2; gekennzeichnet. Bei niedrigen Konzentrationen (10 uM HgCl&sub2;) wurde die aus Büffelegeln gewonnene Endo-β- Glucuronidase weitestgehend inaktiviert, während unter den gleichen Bedingungen 50% der Aktivität der aus Hirudo medicinalis gewonnenen Endo-β-Glucuronidase erhalten blieben.
Weder die aus Büffelegeln gewonnene Endo-β- Glucuronidase (z. B. aus den Arten Hirudinaria manillensis oder Poecilobdella granulosa) noch die bekannte, aus Hirudo medicinalis gewonnene Endo-β-Glucuronidase wurde im unterschied zu bekannten β-Glucuronidasen (siehe Seiten 361-409, Band 16, Advances in Enzymology, Betaglucuronidases, Interscience, London, herausgegeben von W.H. Fishman) durch Saccharo-1,4-lacton in millimolaren Konzentrationen gehemmt.
Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Endoβ-Glucuronidase ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 28.500 ± 3.000 (in unreduzierter Form) enthält, was durch Messungen mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Elektrophorese unter Verwendung eines Polyacrylamidgels mit einem Gradienten von 3 bis 15% gemessen wurde. Im Vergleich zu den Molekulargewichten anderer Hyaluronidasen handelt es sich hierbei um ein niedriges Molekulargewicht. Solch ein Molekulargewicht entspricht ungefähr 285 Aminosäureeinheiten, was die Endo-β-Glucuronidase besonders geeignet für Synthesen, Manipulierung oder Modifizierung mittels Protein- oder Gentechnik macht. Die vorliegende Erfindung umfaßt daher weiterhin die der aus Büffelegeln isolierten Endo-β-Glucuronidase entsprechenden Enzyme, die im wesentlichen die gleichen Merkmale und Aktivität haben, insbesondere bezüglich der Hyaluronsäurespezifität. (Wird hier von einer aus Büffelegeln gewonnenen Endo-β-Glucuronidase gesprochen, so ist dies selbstverständlich so zu verstehen, daß dies das genetisch manipulierte Material umfaßt, das zwangsläufig aus den Egeln "gewonnen wird", insofern als zuerst ein aus den Egeln isoliertes Enzymausgangsmaterial vorhanden sein muß, bevor weiteres Enzym entweder direkt aus Egel-DNA oder -RNA oder indirekt mittels eines synthetischen Gens, das die ursprüngliche DNA-Sequenz ganz oder teilweise enthält, gentechnisch bearbeitet werden kann.)
Durch die vorliegende Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer wie oben beschriebenen Endo-Beta-Glucuronidase zur Verfügung gestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, daß man Gewebe von Egeln der Unterfamilie Hirudinariinae mit einem Extraktionsmittel extrahiert und aus dem so entstandenen Extrakt eine Endo- Beta-Glucuronidase isoliert.
Das Extraktionsmittel besteht vorzugsweise aus einer Ammoniumsulfatlösung. Das Extrakt wird weiterhin vorzugsweise mittels Gelchromatographie gereinigt, worauf es konzentriert wird oder ihm das Wasser entzogen wird.
Die aus Büffelegeln gewonnene Endo-Beta-Glucuronidase unterscheidet sich weiterhin von der aus Hirudo medicinalis gewonnenen hinsichtlich ihres Aktivitätsgrades.
Die Aktivität einer Endo-Beta-Glucuronidase kann in Standardeinheiten ausgedrückt werden; eine Einheit entspricht der Reduktionswirkung, die Glucuronsäure (Glucoseäquivalent in Mikrogramm) stündlich aus Hyaluronsäure bei einem optimalen pH freisetzt. Die erfindungsgemäße Endo-Beta-Glucuronidase hat eine Aktivität von ungefähr 3.500 Einheiten pro Egel (im Vergleich zu ungefähr 233 Einheiten pro Egel, wie für die aus Hirudo medicinalis isolierte Hyaluronidase beschrieben).
Wie bereits erwähnt, ist die erfindungsgemäße Endo-Beta-Glucuronidase hochspezifisch für, und hochaktiv gegen, Hyaluronsäure. Solch ein wirksames und stabiles Enzym kann für eine Reihe von Anwendungszwecken, wie unten beschrieben, verwendet werden:
(a) Zur Identifizierung und Quantifizierung von Hyaluronsäure, entweder alleine oder an ein Marker- Molekül gebunden (Immunofluoreszenzmolekül, kolloidales Gold usw.) oder mittels eines enzymatischen (oder anderen) Amplifizierungssystems. Bei sorgfältiger Quantifizierung könnte die erfindungsgemäße Endo-Beta-Glucuronidase den Wirkstoff in einem diagnostischen Nachweis für Hyaluronsäure darstellen. Solche Nachweise könnten zum Beispiel für die in-vivo- oder in-vitro-Prüfung oder Diagnose von
(1) Bakterien wie z. B. Streptococcus, die in Hyaluronsäure eingekapselt vorliegen; und
(2) rheumatoider Arthritis, Leberkrankheiten, Blasenkrebs, Wilms-Tumor und anderen Krankheiten, die durch erhöhte Hyaluronsäuregehalte gekennzeichnet sind, verwendet werden. Die Bestimmung von Hyaluronsäure in Körperflüssigkeiten mittels der erfindungsgemäßen Endo-Beta-Glucuronidase wird in Beispiel 2 dargestellt.
(b) Wegen ihrer einzigartigen Spaltungswirkung könnte die erfindungsgemäße Endo-Beta-Glucuronidase für Synthesezwecke verwendet werden, um neue Abbauprodukte der Hyaluronsäure zu erhalten, die für Synthesezwecke für die Herstellung von hochreiner Hyaluronsäure verwendet werden könnten.
(c) Als Standardnachweis für die Prüfung von kommerziell hergestellter Hyaluronsäure, was für Behörden sowie für Hyaluronsäurehersteller von Interesse wäre.
(d) Zur Entfernung von Hyaluronsäure von kommerziell beschichteten Artikeln wie z. B. Prothesen und zur Förderung der Entfernung von auf Glycosamin beruhenden Rückständen (zum Beispiel auf Zähnen oder Kontaktlinsen, oder als Wirkstoff in biologischen Reinigungsmitteln).
(e) Zur Untersuchung der Funktion und zum Arbeiten mit Glycosaminoglycanen in Zelle/Zelle- und Zelle/Substrat-Wechselwirkungen und sowie für andere Aspekte beim Arbeiten mit Zellkulturen (wo die Fähigkeit, Hyaluronsäure selektiv abzubauen, von beachtlichem Vorteil ist). Dies würde sich auch auf Anwendung im industriellen Maßstab erstrecken, wie z. B. industriemäßige Kultur von Säugetier- und anderen Zellen, aus denen Produkte gewonnen werden.
(f) Zur Verstärkung der Wirkung von Formulierungen, die bei pflanzlichem, tierischem oder mikrobiellem Material angewandt werden (wie z. B. antibakterielle Formulierungen, z. B. in vivo und in vitro verwendete Formulierungen gegen Streptococcus-Bakterien).
(g) Zur Verbesserung der in-vivo- oder in-vitro- Befruchtung (z. B. wenn bei künstlicher Besamung Endo-β- Glucuronidase vor dem Sperma injiziert wird), zur invitro-Befruchtung oder für die Trennung von Fischlaich.
(h) Für die Behandlung von Fleisch, von Pelz oder von Tierhäuten, wie z. B. bei der Herstellung von Leder.
(i) Zur Isolierung, Extraktion oder Reinigung von Hyaluronsäure (wie z. B. als Teilschritt eines Affinitätschromatographiesystems).
(j) In der pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Therapie.
Bei therapeutischer Verwendung wirkt die erfindungsgemäße Endo-β-Glucuronidase im allgemeinen als Dispergiermittel (oder Spreitungsfaktor) oder unterstützt das Durchdringen der Haut (ein perkutaner Faktor). Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische oder veterinärmedizinische Formulierung, die eine hyaluronsäurespezifische Endo-β-Glucuronidase und ein verträgliches Verdünnungsmittel oder Vehikel oder einen verträglichen Träger enthält. Beispiele solcher pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Verwendungszwecke sind zum Beispiel die unten angegebenen; die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Verwendungszwecke beschränkt:
1. Als Injektionshilfsstoff für andere Substanzen (wie z. B. Lokalanästhetika), oder jedesmal wenn eine intramuskuläre oder subdermale Injektion angezeigt ist (z. B. für Patienten mit subdermaler intramuskulärer Infusion, um die Verbreitung von Flüssigkeiten von der Injektionsstelle weg zu unterstützen).
2. Zur Behandlung von Blutunterversorgung des Herzens, um eine akute Myocardischämie oder einen akuten Myocardinfarkt einzuschränken.
3. Zur Behandlung von Haut- und Gewebeverpflanzungen, oder von Haut- und Gewebelappen, wie sie häufig in der plastischen Chirurgie und Mikrochirurgie auftreten, zum Abbau von Blutstauungen und zur Verbesserung der Durchblutung.
4. Zur Behandlung von Glaukomen und anderen Augenkrankheiten, bei denen eine gewisse Auflösung des Glaskörpers oder eine verbesserte Zirkulation physiologischer Flüssigkeiten in oder um das Auge nützlich wären; zum Beispiel als Hilfsmittel bei der unblutigen Entfernung verschiedener Verschlüsse, zur Linderung des Augendrucks und von Thrombosen im Auge, und zur Behandlung von Netzhautablösungen oder drohenden Netzhautablösungen. Soweit uns bekannt ist, ist der letztgenannte therapeutische Verwendungszweck (d. h. die Behandlung von Glaukomen und anderen Augenkrankheiten) bisher noch nie für eine Endo-β-Glucuronidase vorgeschlagen worden.
5. Als neuartiges Drogenvermittlungssystem durch die Haut, durch Schleimhäute oder ähnliche Wege, auf denen Drogen von außen in die Körpermatrix eindringen können; zum Beispiel als topisches oder perkutanes Mittel, das auf die Haut entweder alleine oder als Hilfsmittel aufgetragen wird, als Aerosolinhalation, wobei die Nasenmembranen durchdrungen werden, als Hilfsmittel, das auf die Hornhaut oder auf andere Teile des Auges appliziert wird. Soweit uns bekannt ist, ist dieser therapeutische Verwendungszweck (als Drogenvermittlungssystem) niemals zuvor vorgeschlagen worden.
6. Als Antibiotikum, um die Hyaluronsäurekapsel, die gewisse pathogene Mikroorganismen umgibt, zu entfernen oder zu schwächen, wie z. B. mit Streptococcus in Verbindung gebrachte periodontale Krankheiten sowie Streptocokken auch Pneumonie, und in diesem Zusammenhang als Hilfsmittel gemeinsam mit anderen Antibiotika gegen den gleichen Mikroorganismus.
7. Als Mittel, zur Entfernung oder Schwächung der Hyaluronsäurekapsel, die gewisse Tumoren und krebsartige Gewächse umgibt, und in diesem Zusammenhang, auch als Hilfsmittel zur Chemotherapie, die sich gegen die gleichen Tumore richtet.
8. Als Angiogeneseinhibitor; dieser ließe sich z. B. als Krebsmittel verwenden.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Beispiele ausschließlich zu Erläuterungszwecken angegeben.

Beispiel 1

Die Kopfregion eines Büffelegels der Gattung Hirudinaria manillensis wurde abgetrennt und in destilliertem Wasser homogenisiert. Der Überstand wurde aufbewahrt, während der Niederschlag nochmals suspendiert und zentrifugiert wurde. Die vereinigten Überstände ergaben das Enzym der Stufe I.
Die Stufe II wurde dadurch hergestellt, daß man den Überstand der Stufe I mit einer 40% gesättigten Ammoniumsulfatlösung versetzte, die Suspension bei 800 g 20 Minuten lang bei 4ºC zentrifugierte und dann den entstehenden Überstand mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 80% versetzte. Die Suspension wurde bei 800 g 20 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert; das Pellet wurde wiederum in einer 50% gesättigten Ammoniumsulfatlösung suspendiert, und die Suspension wurde bei 800 g 20 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend drei Mal gegen destilliertes Wasser bei 4ºC dialysiert, und das Dialysat wurde bei 2.600 g 20 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert, um Niederschläge zu entfernen, was das Enzym der Stufe 11 ergab. Die Ausbeute an Stufe 11 aus Stufe I betrug 20%.
Bei der so gewonnenen Hyaluronidase handelte es sich um ein ausnehmend stabiles Enzym, dessen Aktivität nach einer Reihe verschiedener Lagerbedingungen erhalten blieb: Reinheit Lagerbedingungen Lagerzeit % der Ausgangsaktivität Stufe (lyophilisiert)
Nach einem Jahr im Tiefkühlschrank bleiben bei der Preparation der Stufe II 50% der Aktivität erhalten.
Die Erhöhung der Aktivität nach dem Gefrieren wird dahingehend interpretiert, daß Enzym aus kapselbildenden Körnchen physisch freigesetzt wird, oder daß ein ähnlicher Vorgang stattfindet. Die Hyaluronidase hat ein Aktivitätsoptimum im pH-Bereich von 4,5 bis 5,5 (Apfelsäure) mit einer Ionenstärke im Bereich von 0,1- 0,2 molar und war hyaluronsäurespezifisch.
Die Wirkungsweise der Hyaluronidase wurde in einem Versuch überprüft, in dem die Gesamtheit der reduzierenden Zucker mittels des 3,5-Dinitrosalicylsäuretests nachgewiesen wurde. Bei dem durch die Enzymreaktion erhaltenen reduzierenden Zucker handelte es sich nicht um N-Acetylhexosamin (Nachweis nach der Methode von Reising et al.). Anders ausgedrückt, der aus Büffelegeln gewonnenen Hyaluronidase fehlte die Endo-β-N-Acetylhexosaminidasewirkung, die typisch für Säugetierhyaluronidase ist. Diese Versuche zeigen deutlich, daß die Hyaluronidase sich von Säugetier- und Streptomyces- Hyaluronidase unterscheidet und daß sie die internen Glucuronsäurebindungen der Hyaluronsäure hydrolysiert, daß es sich also um eine Endo-β-Glucuronidase handelte.

Beispiel 2 - Analyse von Hyaluronsäure in Körperflüssigkeiten

Endo-β-Glucuronidase und Harn wurden 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, und der Hyaluronsäuregehalt wurde dadurch gemessen, daß mit den während der Inkubation freigesetzten glucosereduzierenden Äquivalenten ein Test durchgeführt wurde. Routinemäßig wurden Meßwerte zwischen 40 und 80 g Hyaluronsäure pro ml Harn erhalten. Vor der Inkubation wurde der Harn 24 Stunden lang bei 4ºC gegen destilliertes Wasser dialysiert, um alle reduzierenden Zucker zu entfernen.
Die Stabilität des Enzyms in dialysiertem oder nichtdialysiertem Harn betrug mindestens 4 Stunden, und die Gegenwart einer Puffersubstanz war nicht erforderlich, um beinahe maximale Aktivität zu erhalten.
Die erfindungsgemäße Endo-β-Glucuronidase kann zur Prüfung des Hyaluronsäurespiegels in einer Reihe von Körperflüssigkeiten, wie Harn, Plasma, Speichel, Synovia und wäßrige Flüssigkeiten, verwendet werden.

Beispiel 3

Das Molekulargewicht der Hyaluronidase wurde durch Behandlung mit Natriumdodecylsulfat (SDS) mit anschließender Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt.
Proben (5.000 Einheiten pro ml) von aus Poecilobdella granulosa gewonnener Hyaluronidase wurden 3 Minuten lang in der Gegenwart von SDS auf 100ºC erhitzt. Anschließend ließ man jeweils 5-50 ul dieser Mischung auf einem 3-15%-igen Polyacrylamidgel laufen (Abbildung 4). Gleichzeitig ließ man geeignete Marker Molekulargewicht in benachbarten Bahnen im Gel laufen, um das Molekulargewicht der Hyaluronidase genau bestimmen zu können.
Die Messung ergab 28.500 ± 3.000 Dalton für das Protein in der Probe, wobei es sich um 80% des Gesamtproteins handelte. Um sicherzustellen, daß es sich bei diesem Protein um die Hyaluronidase handelte, ließ man eine Hyaluronidaseprobe, die nicht auf 100ºC in SDS erhitzt worden war, auf einem mit 0,5 mg Hyaluronsäure pro ml überschichteten 7%-igen Trenngel laufen. Anschließend an den Hyaluronsäureabbau erfolgte eine Behandlung mit Alcianblau, einem Färbemittel, das Hyaluronsäure als blauen Fleck sichtbar macht.
Das für den Hyaluronsäureabbau im Gel verantwortliche Protein (nachgewiesen durch die Abwesenheit eines blauen Flecks) wurde aus dem Gel herausgeschnitten, zerkleinert und mit SDS auf 1000ºC erhitzt. Es wurde dann neben einer Kontroll-Probe von SDS Hyaluronidase laufen lassen.
Es wurde gefunden, daß das für den Hyaluronsäureabbau verantwortliche Protein mit dem bei 28.500 ± 3.000 Dalton gefundenen Protein übereinstimmte.

Beispiel 4

(a) Temperaturstabilität

Hyaluronidaseproben, die entweder aus Büffelegeln oder Hirudo medicinalis gewonnen worden waren und jeweils 2.000 Einheiten enthielten, wurden bei 50ºC oder bei 60ºC inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden aliquote Teile entnommen und anschließend durch 1-stündige Inkubation bei 37ºC und pH 5,0 (20 mM Natriumcitrat, 0,1 M NaCl, 1 mg pro ml Hyaluronsäure) auf Hyaluronidaseaktivität untersucht. Die Aktivität wurde dadurch untersucht, daß die durch den Hyaluronsäureabbau freigesetzten glucosereduzierenden Äquivalente gemessen wurden. Die Ergebnisse (Abbildung 2) zeigten, daß das aus Büffelegeln gewonnene Enzym wesentlich hitzestabiler war als das aus Hirudo medicinalis gewonnene.
Nach 30-minütiger Vorinkubation bei 50ºC blieben bei der Büffelegel-Hyaluronidase mindestens 70% der Aktivität erhalten, während bei der aus Hirudo medicinalis gewonnenen über 90% verloren gingen.
Auf ähnliche Weise wurden bei der aus Büffelegeln gewonnenen Hyaluronidase nach 10-minütiger Vorinkubation bei 60ºC mindestens 25% der Aktivität beibehalten, während die Aktivität der aus Hirudo medicinalis gewonnenen vollständig verloren ging.

(b) pH-Abhängigkeit

Hyaluronidaseproben, die entweder aus Büffelegeln oder Hirudo medicinalis gewonnen worden waren und jeweils 500 Einheiten enthielten, wurden 1 Stunde lang bei 47ºC bei verschiedenen pH-Werten von 2,0 bis 10,0 (20 mM Natriumcitrat für pH 2 bis 7, 20 mM Tris-HCl zur pH 7-10) inkubiert. Alle Inkubationsmischungen enthielten 0,1 M NaCl und 1 mg Hyaluronsäure pro ml.
Sowohl im stark sauren sowie im stark basischen pH-Bereich wurde eine Wirkungshemmung bei beiden Hyaluronidasen beobachtet. Bezüglich des Ausmaßes der Hemmung und ihrer Umkehrbarkeit unterschieden sich die beiden Enzyme jedoch beachtlich.
Bei pH 3,5 blieben bei der aus Büffelegeln gewonnenen Hyaluronidase mindestens 50% ihrer Maximalaktivität erhalten, während bei der aus Hirudo medicinalis gewonnenen unter 10% erhalten blieben. Ähnlich blieben bei pH 9,0 bei dem aus Büffelegeln gewonnenen Enzym 5% der Aktivität erhalten, während das aus Hirudo medicinalis gewonnene vollständig inaktiviert wurde.
Um festzustellen, ob die Enzymhemmung bei pH 9,0 eine irreversible Inaktivierung bedeutete, wurden die auf pH 9,0 eingestellten Ansätze anschließend auf pH 5,0 gebracht und bei 37ºC nochmals 1 Stunde inkubiert. Als sie anschließend auf die entstandenen glucosereduzierenden Äquivalente untersucht wurden, fand man, daß die aus Büffelegeln gewonnene Hyaluronidase noch aktiv war, während die aus Hirudo medicinalis gewonnene irreversibel zerstört war.

Beispiel 5

Die Kopfregion von 40 Büffelegeln der Art Poecilobdella granulosa wurde entfernt und gewogen (32,8 g Frischgewicht). Dies wurde anschließend in destilliertem Wasser 10 Minuten lang bei 4ºC homogenisiert. Die Mischung wurde dann bei 800 g 20 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und das Pellet noch zweimal mit destilliertem Wasser extrahiert. Die Überstände wurden zusammengegeben und ergaben Stufe I.
Stufe II wurde dadurch hergestellt, daß man 40% gesättigte Ammoniumsulfatlösung zum Überstand der Stufe I zugab, die Suspension 20 Minuten lang bei 4ºC und 800 g zentrifugierte und dann zum entstandenen Überstand Ammonsulfat zugab, so daß die Mischung 80% gesättigt war.
Die Suspension wurde 20 Minuten lang bei 4ºC und 800 g zentrifugiert, das Pellet wurde wieder in einer 50% gesättigten Ammoniumsulfatlösung suspendiert, und die Suspension wurde 20 Minuten lang bei 4ºC und 800 g zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend dreimal bei 40ºC gegen destilliertes Wasser dialysiert, und das Dialysat wurde 20 Minuten lang bei 4ºC und 2.600 g zentrifugiert, um Niederschläge zu entfernen, was das Enzym der Stufe II ergab. Die Ausbeute von Stufe I zu Stufe II betrug 20%.
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn das Enzym aus anderen Geweben als aus dem Gehirn extrahiert wurde.
Die bei jedem Schritt gemessene Aktivität und die Ausbeute in Prozent der Aktivität bei Stufe I sind unten angegeben. Reinheit Gesamtaktivität (Einheiten) % der Ausgangsaktivität Stufe
Die Aktivität der Hyaluronidase wurde durch 1-stündige Inkubation bei 37ºC in 20 mM Natriumcitrat, 0,1 M NaCl und 1 mg Hyaluronsäure pro ml gemessen. Eine Einheit ist definiert als diejenige Menge an Enzymaktivität, die in 1 Stunde bei 37ºC aus Hyaluronsäure 1 ug glucosereduzierende Äquivalente produziert wird.
Um das Enzym der Stufe II weiter zu reinigen, wurden Proben mit 15.000 bis 20.000 Einheiten auf eine Sephadex G100-Säule (Höhe 93 cm, Volumen 187 cm³) aufgetragen. Die Säule wurde bei einem Arbeitsdruck von 108 cm H&sub2;O mit 50 mM Tris-HCl pH 7,0 und 20 mM NaCl bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,6 ml pro Minute eluiert. Die Hyaluronidase wurde zwischen 65 Minuten und 105 Minuten eluiert, wobei ein Peak mit maximaler Aktivität bei 85 Minuten erhalten wurde.
Die Säulenausbeuten betrugen zwischen 90% und 110%. Die erhaltene Fraktion stellte Stufe III dar.
Charakteristische Beispiele der spezifischen Aktivität des Enzyms pro mg Protein sind unten angegeben.
Spezifische Aktivität (Einheiten pro mg Protein)
Stufe I 200
Stufe II 530
Stufe III 1.200

Beispiel 6

Die Glaskörperflüssigkeiten wurden aus Kuhaugen entfernt und einzeln in 20 mM MES und 0,1 M NaCl bei pH 5,0 bei einem Endvolumen von 10 ml suspendiert. Anfänglich ergab die Messung der glucosereduzierenden Äquivalente einen Meßwert von 0. Das durchschnittliche Frischgewicht pro Flüssigkeit betrug 2,75 g.
5.000 Einheiten Büffelegel-Hyaluronidase wurden einer dieser Flüssigkeiten zugegeben. Einer weiteren wurden 5.000 Hyaluronidaseeinheiten sowie 2 mg Hyaluronsäure zugegeben. Der letztgenannte Ansatz wurde als Kontrolle verwendet, um zu ermitteln, ob ein Hyaluronsäureabbau unter den in-vivo-Bedingungen der Inkubation stattfinden kann.
Nach einstündiger Inkubation bei 37ºC enthielt die Flüssigkeitsmischung, die nur mit Hyaluronidase inkubiert worden war, insgesamt 3,38 mg Glucoseäquivalente, während die andere, zu der Hyaluronsäure zugegeben worden war, 4,68 mg enthielt.
Diese Ergebnisse bestätigen die Anwesenheit von beträchtlichen Mengen Hyaluronsäure in der Glaskörperflüssigkeit, die mit einer Hyaluronidase vom Endo-β-Glucuronidase-Typ abgebaut werden kann. Dies stimmt mit der Verwendung des Enzyms als Therapeutikum für die Behandlung von hyaluronsäurebedingten Augenkrankheiten überein.

Claims

1. Aus Egeln der Unterfamilie Hirudinariinae erhältliche hyaluronsäurespezifische Endo-Beta- Glucuronidase, welche zur Spaltung von Hyaluronsäure, jedoch nicht von Chondroitin, Chondroitin-4-sulfat oder Chondroitin-6-sulfat, befähigt ist und in unreduzierter Form gemäß Messung mittels Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid Electrophorese ein Molekulargewicht von 28.500 ± 3.000 hat, wobei bei besagter Endo-Beta- Glucuronidase nach 30-minütiger Inkubation bei 50ºC mindestens 70% ihrer Aktivität bei 37ºC erhalten bleiben und mindestens 55% ihrer Aktivität in einem wäßrigen Medium bei pH 3,5 bei einer Temperatur von 37ºC.

2. Endo-Beta-Glucuronidase gemäß Anspruch 1, die Fibronectin nicht zu spalten vermag und die im wesentlichen über keine Protease-Aktivität verfügt.

3. Endo-Beta-Glucuronidase nach Anspruch 1 oder 2, wobei besagte Egel den Arten Hirudinaria manillensis oder Poecilobdella granulosa angehören.

4. Verfahren zur Herstellung einer Endo-Beta- Glucuronidase, dadurch gekennzeichnet, daß man Gewebe von Egeln der Unterfamilie Hirudinariinae mit einem Extraktionsmittel extrahiert und aus dem so gewonnenen Extrakt eine Endo-Beta-Glucuronidase isoliert.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Extraktionsmittel eine Ammoniumsulfatlösung enthält.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man besagtes Extrakt mittels Gelchromatographie reinigt und es anschließend konzentriert oder ihm das Wasser entzieht.

7. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Formulierung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein pharmakologisch wirksames Material und eine hyaluronsäurespezifische Endo-Beta-Glucuronidase gemäß Ansprüchen 1 bis 3 enthält.

8. Pharmazeutische oder veterinärmedizinische Formulierung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Endo-Beta-Glucuronidase gemäß Ansprüchen 1 bis 3 sowie ein pharmazeutisch unbedenkliches Verdünnungsmittel, Vehikel oder einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthält.

9. Verwendung einer hyaluronsäurespezifischen, aus Egeln der Unterfamilie Hirudinariinae erhältlichen Endo-Beta-Glucuronidase zur Herstellung eines Arzneimittels, das den Fluß von physiologischen Flüssigkeiten bei der Behandlung von Glaucomen oder anderen Augenkrankheiten anregt.