DE69738581T2

DE69738581T2 - Menschliche dnase i hyperaktive varianten

Info

Publication number: DE69738581T2
Application number: DE69738581T
Authority: DE
Inventors: Robert A. Millbrae LAZARUS; Clark Qun San Francisco PAN
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2017-06-10
Also published as: CA2257133A1; AU3368497A; JP2000512496A; ES2301180T3; CA2257133C; US7407785B2; DK0910647T3; EP0910647A1; PT910647E; EP0910647B1; US20020173025A1; US20050170365A1; AU737618B2; JP3468778B2; WO1997047751A1; US6391607B1; NZ333128A; DE69738581D1; US20080293121A1; ATE389724T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Forschungsergebnisse über humane Desoxyribonuclease I (DNase I), eine Phosphodiesterase, die zur Hydrolyse von Polydesoxyribonucleinsäure befähigt ist. Allgemein betrifft die Erfindung modifizierte (variante) Formen von humaner DNase I mit erhöhter DNA-Hydrolyseaktivität und deren Herstellung durch rekombinante DNA-Verfahren, pharmazeutische Zusammensetzungen, mit denen die DNase I-Varianten klinisch ausgenützt werden können, sowie Verfahren zur Verwendung dieser DNase I-Varianten und von deren Zusammensetzungen.
Hintergrund der Erfindung
DNase I ist eine Phosphodiesterase, die zur Hydrolyse von Polydesoxyribonucleinsäure befähigt ist. DNase I wurde aus verschiedenen Spezies in unterschiedlichen Graden gereinigt.
Rinder-DNase I wurde gründlich biochemisch untersucht; vergl. z. B. Moore (Hrsg. P. D. Boyer), Academic Press, New York (1981), S. 281–296. Die vollständige Aminosäuresequenz für Rinder-DNase I ist bekannt (Liao et al., J. Biol. Chem., Bd. 248 (1973), S. 1489–1495; Oefner et al., J. Mol. Biol., Bd. 192 (1986), S. 605–632; Lahm et al., J. Mol. Biol., Bd. 221 (1991), S. 645–667) und für bovine DNase I kodierende DNA wurde kloniert und exprimiert (Worrall et al., J. Biol. Chem., Bd. 265 (1990), S. 21889–21895). Die Struktur von Rinder-DNase I wurde durch Röntgenkristallographie ermittelt; Suck et al., EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 2423–2430; Suck et al., Nature, Bd. 321 (1986), S. 620–625; Oefner et al., J. Mol. Biol., Bd. 192 (1986), S. 605–632; Weston et al., J. Mol. Biol., Bd. 226 (1992), S. 1237–1256.
Für humane DNase I kodierende DNA wurde isoliert und sequenziert und diese DNA wurde in rekombinanten Wirtszellen exprimiert, was die Herstellung von humaner DNase I in für gewerbliche Zwecke geeigneten Mengen ermöglichte; Shak et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 87 (1990), S. 9188–9192.
Für DNase I gibt es eine Anzahl von bekannten Anwendungsmöglichkeiten. Sie wurde für therapeutische Zwecke eingesetzt. Ihre hauptsächliche therapeutische Anwendung besteht in der Verringerung der Viskoelastizität von pulmonalen Sekreten (Schleim) bei Krankheiten, wie Pneumonie und zystischer Fibrose (CF), wobei sie die Luftwege freihalten; vergl. z. B. Lourenco et al., Arch. Intern. Med., Bd. 142 (1982), S. 2299–2308; Shak et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 87 (1990), S. 9188–9192; Hubbard et al., New Engl. J. Med., Bd. 326 (1992), S. 812–815; Fuchs et al., New Engl. J. Med., Bd. 331 (1994), S. 637–642; Bryson et al., Drugs, Bd. 48 (1994), S. 894–906. Schleim trägt auch zur Morbidität bei chronischer Bronchitis, asthmatischer Bronchitis, Bronchiektasie, Emphysem, akuter und chronischer Sinusitis und auch bei üblichen Erkältungen bei.
Die Lungensekrete von Personen mit derartigen Krankheiten stellen komplexe Materialien dar, die Mucoglycoproteine, Mucopolysaccharide, Proteasen, Actin und DNA enthalten. Einige der Materialien in Lungensekreten werden von Leukozyten (Neutrophilen) freigesetzt, die das Lungengewebe in Reaktion auf die Anwesenheit von Mikroorganismen (z. B. Stämmen von Pseudomonas-, Pneumococcus- oder Staphylococcus-Bakterien) oder anderen Reizstoffen (z. B. Tabakrauch, Pollen) infiltrieren. Im Verlauf der Reaktion mit derartigen Mikroorganismen oder Reizmitteln kann es dazu kommen, dass die Leukozyten degenerieren und ihren Inhalt freisetzen, der zur Viskoelastizität der Lungensekrete beiträgt.
Die Fähigkeit von DNase I zur Verringerung der Viskoelastizität von Lungensekreten wird ihrem enzymatischen Abbau großer Mengen an von Neutrophilen freigesetzter DNA zugeschrieben; Shak et al., Proc. Nat. Acad. Sci., Bd. 87 (1990), S. 9188–9192; Aitken et al., J. Am. Med. Assoc., Bd. 267 (1992), S. 1947–1951.
Suck et al., J. Mol. Recognit., Bd. 7(2) (Juni 1994), S. 65–70 beschreiben die Struktur des DNA-DNase I-Komplexes und identifizieren eine Anzahl von Resten des Enzyms, die an der Komplexbildung beteiligt sind.
DNase I-Varianten mit verstärkter enzymatischer Aktivität werden beispielsweise in WO-90/07572 A (Veröffentlichungstag 12. Juli 1990) und in WO-96/26279 A (Veröffentlichungstag 29. August 1996) beschrieben.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, humane DNase I-Varianten bereitzustellen, die eine stärkere DNA-hydrolytische Aktivität als die native humane DNase I aufweisen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Nucleinsäuren, die für derartige hyperaktive Varianten von humaner DNase I kodieren, sowie in der Bereitstellung von rekombinanten Vektoren, die derartige Nucleinsäuren umfassen, von rekombinanten Wirtszellen, die mit diesen Nucleinsäuren oder Vektoren transformiert sind, und von Verfahren zur Herstellung der humanen DNase I-Varianten mittels rekombinanter DNA-Technik. Die Erfindung umfasst die Verwendung derartiger Nucleinsäuren und Vektoren für die in vivo- oder ex vivo-Gentherapie.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die hyperaktiven Varianten von humaner DNase I gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipiens umfassen.
Erfindungsgemäß werden humane DNase I-Varianten mit mindestens 90% Identität mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz von nativer humaner DNase I bereitgestellt, die ferner eine oder mehrere der folgenden Aminosäuresubstitutionen umfassen: Q9R, E13K, T14K, T14R, H44K, H44R, N74K, N74R, S75K, T205K und T205R; wobei die Variante eine größere DNA-hydrolytische Aktivität als native humane DNase I aufweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Variante eine Aminosäuresequenz, die mindestens 95% Identität und insbesondere 98% Identität mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz von nativer humaner DNase I hat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Variante mindestens eine der folgenden Aminosäurerest-Substitutionen: E13R:N74K, Q9R:E13R:N74K, E13R:N74K:T205K und Q9R:E13R:N74K:T205K.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Variante eine Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf isolierte Nucleinsäuren abgestellt, die für diese humanen DNase I-Varianten kodieren.
Außerdem ist die vorliegende Erfindung auf die Verwendung dieser humanen DNase I-Varianten bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Lungenkrankheit oder -störung abgestellt. Dies umfasst die Verwendung zur Verringerung oder Verhinderung der Viskoeleastizität oder der viskosen Konsistenz eines DNA enthaltenden Materials in einem Patienten und zur Verringerung oder Verhinderung der Bildung von DNA enthaltenden Immunkomplexen in einem Patienten. Die Erfindung ist speziell auf die Behandlung von Krankheiten, wie zystischer Fibrose, chronischer Bronchitis, Lungenentzündung, Bronchiektasie, Emphysem, Asthma oder systemischer Lupus erythematosus abgestellt.
Ferner ist die vorliegende Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung abgestellt, die eine humane DNase I-Variante gemäß der vorstehenden Definition und gegebenenfalls ein pharmazeutisch verträgliches Exzipiens umfasst.
Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf Forschungsarbeiten der Erfinder zur Untersuchung der enzymatischen Aktivität von humaner DNase I. Diese Forschungsarbeiten befassten sich mit der Konstruktion und der Synthese von verschiedenen humanen DNase I-Varianten und mit dem Testen dieser Varianten, um ihre Fähigkeit zur in vitro-Hydrolyse von DNA zu ermitteln. Die Erfinder haben erstmals eine Klasse von humanen DNase I-Varianten mit der Bezeichnung "hyperaktive Varianten" identifiziert, die eine erhöhte DNA-hydrolytische Aktivität aufweisen und die gegenüber einer Hemmung durch Natriumchlorid weniger empfindlich sind als native humane DNase I.
Aufgrund ihrer erhöhten DNA-hydrolytischen Aktivität weisen die hyperaktiven Varianten auch eine erhöhte mucolytische Aktivität auf und erweisen sich beim Abbau (Verdau) von DNA allgemein wirksamer als native humane DNase I. Aufgrund der Tatsache, dass sie gegenüber einer Hemmung durch Natriumchlorid weniger empfindlich sind, erweisen sich die hyperaktiven Varianten unter physiologischen Salzbedingungen, die in Lungensekreten und anderen biologischen Flüssigkeiten auftreten, wirksamer als native humane DNase I. Demgemäß sind hyperaktive Varianten von humaner DNase I besonders wertvoll bei der Behandlung von Patienten mit Lungensekreten, die relativ große Mengen an DNA umfassen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Aminosäuresequenz von humaner reifer DNase I (SEQ ID NO: 1). Die Zahlen geben die Sequenzposition von Aminosäureresten innerhalb der Sequenz an.
2–4 zeigen Daten für die folgenden Varianten:
Q9R (SEQ ID NO: 2), E13K (SEQ ID NO: 3), E13R (SEQ ID NO: 4), T14K (SEQ ID NO: 5), T14R (SEQ ID NO: 6), H44K (SEQ ID NO: 7), H44R (SEQ ID NO: 8), N74K (SEQ ID NO: 9), N74R (SEQ ID NO: 10), S75K (SEQ ID NO: 11), T205K (SEQ. 1D. NO: 12), T205R (SEQ ID NO: 13), E13R:N74K (SEQ ID NO. 14), Q9R:E13R:N74K (SEQ ID NO: 15), E13R:N74K:T205K (SEQ ID NO: 16), Q9R:E13R:N74K:T205K (SEQ ID NO: 17).
2 zeigt die Aktivität von hyperaktiven Varianten von humaner DNase I bei Bestimmung in einem Superspiralen-DNA-Verdauungstest und einem linearen DNA-Verdauungstest gemäß der Beschreibung in Beispiel 3.
3 zeigt die Aktivität von hyperaktiven Varianten von humaner DNase I bei Bestimmung in einem DNA-Hyperchromizitätstest gemäß der Beschreibung in Beispiel 3.
4 zeigt die prozentuale Aktivität von nativer humaner DNase I und von hyperaktiven Varianten von humaner DNase I bei Bestimmung in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Natriumchlorid in einem linearen DNA-Verdauungstest gemäß der Beschreibung in Beispiel 3. Die Werte für die prozentuale Aktivität sind als Werte relativ zur Aktivität der einzelnen DNase I-Produkte (natives oder Variante) in Abwesenheit von zugesetztem Natriumchlorid angegeben.
Ausführliche Beschreibung
Die hier verwendeten Ausdrücke "humane DNase I", "native humane DNase I" und "Wildtyp-DNase I" beziehen sich auf das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von humaner reifer DNase I gemäß den Angaben in 1.
Bei einer "Variante" oder "Aminosäuresequenzvariante" von humaner DNase I handelt es sich um ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die sich von der von nativer humaner DNase I unterscheidet. Im Allgemeinen weist eine Variante eine mindestens 80% Sequenzidentität, vorzugsweise eine mindestens 90% Sequenzidentität, insbesondere eine mindestens 95% Sequenzidentität und ganz besonders eine mindestens 98% Sequenzidentität mit nativer humaner DNase I auf. Die prozentuale Sequenzidentität wird beispielsweise gemäß Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 1382–1386, Version des Algorithmus von Needleman et al., J. Mol. Biol., Bd. 48 (1970), S. 443–453, nach Ausrichtung der Sequenzen zur Erzielung einer maximalen Homologie bestimmt.
Die Ausdrücke "hyperaktive Variante", "humane hyperaktive DNase I-Variante" und "hyperaktive Variante von humaner DNase I" beziehen sich auf eine Variante von nativer humaner DNase I, die im Vergleich zu nativer humaner DNase I eine erhöhte DNA-hydrolytische Aktivität besitzt.
Der Ausdruck "DNA-hydrolytische Aktivität" bezieht sich auf die enzymatische Aktivität von nativer humaner DNase I oder einer Variante von humaner DNase I bei der Hydrolyse von Substrat-DNA unter Bildung von 5'-phosphorylierten Oligonucleotid-Endprodukten. Die DNA-hydrolytische Aktivität wird leicht durch eines von mehreren verschiedenen Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, bestimmt, wozu die analytische Polyacrylamid- und Agarose-Gelelektrophorese, der Hyperchromizitätstest (Kunitz, J. Gen. Physiol., Bd. 33 (1950), S. 349–362; Kunitz, J. Gen. Physiol., Bd. 33 (1950), S. 363–377) oder der Methylgrün-Test (Kurnick, Arch. Biochem., Bd. 29 (1950), S. 41–53; Sinicropi, et al., Anal. Biochem., Bd. 222 (1994), S. 351–358) gehören.
Bei einer humanen DNase I-Variante mit "erhöhter DNA-hydrolytischer Aktivität" handelt es sich um eine DNase, die DNA in stärkerem Umfang als native humane DNase I hydrolysiert, und zwar bei Bestimmung unter vergleichbaren Bedingungen. Wenn beispielsweise der in Beispiel 3 beschriebene lineare DNA- Verdauungstest zur Bestimmung der DNA-hydrolytischen Aktivität herangezogen wird, handelt es sich bei einer humanen DNase I-Variante mit erhöhter DNA-hydrolytischer Aktivität um eine DNase, deren Aktivität beim Test unter vergleichbaren Bedingungen höher als die von nativer humaner nativer DNase I ist. Bei diesem Test weist eine hyperaktive Variante von humaner DNase I typischerweise eine um mindestens 50% höhere DNA-hydrolytische Aktivität als die native humane DNase auf, wobei sich aber hyperaktive Varianten mit einer bis zu 10-fach höheren DNA-hydrolytischen Aktivität im Vergleich zu nativer humaner DNase I leicht herstellen lassen, insbesondere indem man mehrere Aminosäurereste der Aminosäuresequenz der nativen humanen DNase I abändert (vergl. 2).
Der Ausdruck "mucolytische Aktivität" bezieht sich auf die Verringerung der Viskoelastizität (Viskosität) von Sputum oder anderen biologischen Materialien, die beispielsweise bei Behandlung des Materials mit nativer humaner DNase I oder mit einer hyperaktiven Variante von humaner DNase I beobachtet wird. Die mucolytische Aktivität lässt sich leicht nach einem von mehreren verschiedenen Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, bestimmen, einschließlich des Sputum-Verdichtungstests (PCT-Patentanmeldung WO-94/10567 , Veröffentlichungstag 11. Mai 1994), Tests unter Verwendung eines Torsionspendels (Janmey, J. Biochem. Biophys. Methods, Bd. 22 (1991), S. 41–53) oder anderer rheologischer Verfahren.
Der Ausdruck "Polymerase-Kettenreaktion" oder "PCR" bezieht sich allgemein auf ein in vitro-Verfahren zur Amplifikation einer erwünschten Nucleotidsequenz, wie es beispielsweise im US-Patent 4 683 195 beschrieben ist. Im Allgemeinen beinhaltet das PCR-Verfahren wiederholte Zyklen einer Primer-Erweiterungssynthese unter Verwendung von Oligonucleotidprimern, die zur bevorzugten Hybridisierung mit einer Matrizen-Nucleinsäure befähigt sind.
Die Ausdrücke "Zelle", "Wirtszelle" "Zelllinie" und "Zellkultur", die hier in austauschbarer Weise verwendet werden, sind alle so zu verstehen, dass sie Nachkommen umfassen, die sich aus dem Wachstum oder der Züchtung einer Zelle ergeben. Die Ausdrücke "Transformation" und "Transfektion" werden in austauschbarer Weise verwendet und beziehen sich auf ein Verfahren zur Einführung von DNA in eine Zelle.
Der Ausdruck "funktionell verknüpft" bezieht sich auf die kovalente Verbindung von zwei oder mehr DNA-Sequenzen mittels einer enzymatischen Ligation oder auf andere Weise, und zwar in einer solchen relativen Konfiguration zueinander, dass die normale Funktion der Sequenzen ausgeübt werden kann. Beispielsweise ist eine DNA für eine Vorsequenz oder ein sekretorischer Leader funktionell mit einer DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist funktionell mit einer Kodierungssequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist funktionell mit einer Kodierungssequenz verknüpft, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet der Ausdruck "funktionell verknüpft", dass die zu verknüpfenden DNA-Sequenzen benachbart sind und sich im Fall eines Sekretionsleaders in Nachbarschaft und in Lesephase befinden. Die Verknüpfung wird durch Ligation an zweckmäßigen Restriktionsstellen erreicht. Wenn derartige Stellen nicht vorliegen, so werden synthetische Oligonucleotid-Adapter oder -Linker zusammen mit üblichen rekombinanten DNA-Verfahren herangezogen.
Aminosäuren werden hier durch Dreibuchstaben- oder Einbuchstaben-Bezeichnungen folgendermaßen identifiziert:
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Studie von Struktur, DNA-hydrolytischer Aktivität und mucolytischer Aktivität von Aminosäuresequenzvarianten von humaner DNase I. Die hyperaktiven Varianten der vorliegenden Erfindung weisen im Vergleich zu nativer humaner DNase I eine erhöhte DNA-hydrolytische Aktivität auf. Die erhöhte DNA-hydrolytische Aktivität wird vorzugsweise durch Herstellen von Mutationen an und/oder um solche Aminosäurereste innerhalb von nativer humaner DNase I erreicht, die offensichtlich die Bindung von DNA beeinflussen. Speziell geeignet sind Mutationen, die einen basischen Aminosäurerest (z. B. Lysin, Arginin oder Histidin) an einer oder mehreren Positionen innerhalb der DNase I einführen, wo die Aminosäureseitenketten sich in enger Nachbarschaft zum negativ geladenen Phosphatgerüst des gebundenen DNA-Substrats befinden, unter Einschluss beispielsweise der Positionen der Aminosäurereste Gln9, Glu13, Thr14, His44, Asn74, Ser75 und Thr205 von nativer humaner DNase I (die Ziffer im Anschluss an die Dreibuchstaben-Aminosäurebezeichnung bedeutet die spezielle Position des Aminosäurerestes innerhalb der Sequenz von 1).
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, gemäß denen man hyperaktive Varianten von humaner DNase I herstellen kann. Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird eine hyperaktive Variante hergestellt, indem man entweder eine einzelne oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen an oder neben (d. h. innerhalb von 5 Aminosäureresten) den Aminosäureresten von nativer humaner DNase I, die die DNA-Bindung beeinflussen, einführt. Einige erläuternde Beispiele für derartige Mutationen sind nachstehend aufgeführt: Q9R, E13K, E13R, T14K, T14R, H44K, H44R, N74K, N74R, S75K, T205K, T205R, E13R:N74K, Q9R:E13R:N74K, E13R:N74K:T205K, Q9R:E13R:N74K:T205K (vergl. 2 und 3).
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine positionsgerichtete Mutagenese zur Einführung eines Aminosäurerestes an oder neben (d. h. innerhalb von 5 Aminosäureresten) den Aminosäureresten von nativer humaner DNase I, die an der DNA-Bindung beteiligt sind, einführt, wobei sich der eingeführte Rest für eine posttranslationale Modifikation entweder auf biologischem oder chemischem Wege eignet (vergl. die nachstehenden Ausführungen); Means et al., Chemical Modification of Proteins (Holden-Day, 1971); Glazer et al., Chemical Modification of Proteins: Selected Methods and Analytical Procedures (Elsevier, 1975); Creighton, Proteins, S. 70–87 (W. H. Freeman, 1984); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press, 1991). Beispielsweise lässt sich eine hyperaktive Variante von humaner DNase I herstellen, indem man posttranslationale Modifikationen vornimmt, die die positive Nettoladung an oder neben (d. h. innerhalb von 5 Aminosäureresten) den Aminosäureresten von nativer humaner DNase I erhöht, die an der DNA-Bindung beteiligt sind. Beispielsweise kann ein Cysteinrest an oder neben einem Rest von nativer humaner DNase I, der an der DNA-Bindung beteiligt ist, eingeführt werden. Die freie Thiolgruppe des Cysteinrestes kann sodann modifiziert werden, beispielsweise mit einem thiolspezifischen Alkylierungsmittel, wie Ethylenimin, was zur Bildung von S-Aminoethylcystein führt, das bei einem neutralen pH-Wert eine positive Ladung trägt. Ein erläuterndes Beispiel für derartige Mutationen ist H44C.
Zweckmäßigerweise werden Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen in der Aminosäuresequenz von nativer humaner DNase I üblicherweise durch Einführung von Mutationen in die entsprechende Nucleotidsequenz der DNA, die für native humane DNase I kodiert, vorgenommen, beispielsweise durch positionsgerichtete Mutagenese. Die Expression der mutierten DNA führt sodann zur Bildung der varianten humanen DNase I mit der erwünschten (nicht-nativen) Aminosäuresequenz.
Obgleich beliebige, aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur Durchführung der positionsgerichteten Mutagenese, wie sie beispielsweise bei Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflg. (Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1989)) beschrieben sind, herangezogen werden können, stellt eine Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen humanen DNase I-Varianten dar. Dieses Verfahren, das aus dem Stand der Technik bekannt ist (Zoller et al., Meth. Enz., Bd. 100 (1983), S. 4668–500; Zoller et al., Meth. Enz., Bd. 154 (1987), S. 329–350; Carter, Meth. Enz., Bd. 154 (1987), S. 382–403; Kunkel et al., Meth. Enzymol., Bd. 154 (1987), S. 367–382; Horwitz et al., Meth. Enz., Bd. 185 (1990), S. 599–611), eignet sich in besonderer Weise zur Herstellung von Substitutionsvarianten, obgleich es auch in zweckmäßiger Weise zur Herstellung von Deletions- und Insertionsvarianten herangezogen werden kann.
Bei der positionsgerichteten Mutagenese verwendet man typischerweise einen Phagenvektor, der sowohl in einzelsträngiger als auch in doppelsträngiger Form vorliegt. Zu typischen Vektoren, die sich zur positionsgerichteten Mutagenese eignen, gehören Vektoren, wie der M13-Phage und Plasmidvektoren, die eine einzelsträngige Phagen-Replikationsursprungsstelle enthalten (Messing et al., Meth. Enzymol., Bd. 101 (1983), S. 20–78; Veira et al., Meth. Enzymol., Bd. 153 (1987), S. 3–11; Short et al., Nuc. Acids. Res., Bd. 16 (1988), S. 7583–7600). Eine Replikation dieser Vektoren in geeigneten Wirtszellen führt zur Synthese von einzelsträngiger DNA, die für die positionsgerichtete Mutagenese verwendet werden kann.
Kurz zusammengefasst, bei der Durchführung der positionsgerichteten Mutagenese von DNA, die für native humane DNase I (oder eine Variante davon) kodiert, wird die DNA verändert, indem man zunächst ein Oligonucleotid, das für die erwünschte Mutation kodiert, mit einer einzelsträngigen DNA hybridisiert. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase zur Synthese eines vollständigen zweiten Strangs herangezogen, wobei man das hybridisierte Oligonucleotid als Primer verwendet, und der zweite Strang der DNA wird als Matrize eingesetzt. Somit wird das Oligonucleotid, das für die erwünschte Mutation kodiert, in die erhaltene doppelsträngige DNA eingebaut.
Oligonucleotide zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer lassen sich nach einem beliebigen geeigneten Verfahren herstellen, z. B. durch Reinigung einer natürlich vorkommenden DNA oder durch in vitro-Synthese. Beispielsweise werden Oligonucleotide leicht unter Anwendung verschiedener Techniken der organischen Chemie synthetisiert, z. B. gemäß den Angaben von Narang et al., Meth. Enzymol., Bd. 68 (1979), S. 90–98; Brown et al., Meth. Enzymol., Bd. 68 (1979), S. 109–151; Caruthers et al., Meth. Enzymol., Bd. 154 (1985), S. 287–313). Der allgemeine Weg zur Auswahl einer geeigneten Hybridisierungssonde oder eines Primers ist bekannt; Keller et al., DNA Probes, S. 11–18 (Stockton Press, 1989). Typischerweise enthalten die Hybridisierungssonde oder der Primer 10–25 oder mehr Nucleotide und umfassen mindestens 5 Nucleotide auf jeder Seite der Sequenz, die für die erwünschte Mutation kodiert, um zu gewährleisten, dass das Oligonucleotid bevorzugt an der gewünschten Position mit dem einzelsträngigen DNA-Matrizenmolekül hybridisiert.
Selbstverständlich kann die positionsgerichtete Mutagenese zur Einführung mehrerer Substitutions-, Insertions- oder Deletionsmutationen in eine Ausgangs-DNA verwendet werden. Wenn die zu mutierenden Stellen sich nahe beieinander befinden, können die Mutationen gleichzeitig eingeführt werden, indem man ein einzelnes Oligonucleotid verwendet, das für sämtliche erwünschten Mutationen kodiert. Wenn jedoch die zu mutierenden Stellen einen gewissen Abstand voneinander aufweisen (durch mehr als etwa 10 Nucleotide getrennt), ist es schwieriger, ein einzelnes Oligonucleotid zu erzeugen, das für sämtliche erwünschten Veränderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei alternativen Verfahren herangezogen werden.
Beim ersten Verfahren wird ein getrenntes Oligonucleotid für jede erwünschte Mutation erzeugt. Die Oligonucleotide werden sodann gleichzeitig an die einzelsträngige Matrizen-DNA angelagert und der zweite Strang von DNA, die aus der Matrize synthetisiert wird, kodiert für sämtliche erwünschten Aminosäuresubstitutionen.
Das alternative Verfahren beinhaltet zwei oder mehr Runden einer Mutagenese zur Erzeugung der erwünschten Variante. Die erste Runde entspricht den Angaben zur Einführung einer einzelnen Mutation. Die zweite Mutageneserunde verwendet die in der ersten Mutageneserunde erzeugte mutierte DNA als Matrize. Somit enthält diese Matrize bereits eine oder mehrere Mutationen. Das Oligonucleotid, das für eine oder mehrere zusätzliche erwünschte Aminosäuresubstitutionen kodiert, wird sodann an diese Matrize angelagert und der erhaltene DNA-Strang kodiert nunmehr für Mutationen sowohl der ersten als auch der zweiten Mutageneserunde. Diese erhaltene DNA kann als eine Matrize in einer dritten Mutageneserunde verwendet werden usw.
Die PCR-Mutagenese (Higuchi, in PCR Protocols, S. 177–183 (Academic Press, 1990); Vallette et al., Nuc. Acids Res., Bd. 17 (1989), S. 723–733 eignet sich ebenfalls zur Herstellung der Varianten von humaner DNase I. Kurz zusammengefasst, wenn geringe Mengen an Matrizen-DNA als Ausgangsmaterial bei einer PCR verwendet werden, können Primer, die sich in der Sequenz geringfügig von der entsprechenden Region in der Matrizen-DNA unterscheiden, zur Erzeugung relativ großer Mengen eines spezifischen DNA-Fragments verwendet werden, das sich von der Matrizensequenz nur an den Positionen unterscheidet, wo sich die Primer von der Matrize unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA umfasst beispielsweise die Sequenz von einem der Primer die erwünschte Mutation und wird konstruiert, um einen Strang der Plasmid-DNA an der Mutationsposition zu hybridisieren. Die Sequenz des anderen Primers muss mit einer Nucleotidsequenz innerhalb des entgegengesetzten Strangs der Plasmid-DNA identisch sein, jedoch kann diese Sequenz sich an einer beliebigen Stelle entlang der Plasmid-DNA befinden. Es ist jedoch bevorzugt, dass die Sequenz des zweiten Primers sich in einem Abstand innerhalb von 200 Nucleotiden vom ersten Primer befindet, so dass am Ende die gesamte amplifizierte Region von DNAs, die durch die Primer gebunden wird, leicht sequenziert werden kann. Eine PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaars, das dem gerade beschriebenen Paar entspricht, führt zu einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der durch den Primer spezifizierten Mutationsposition und möglicherweise an anderen Positionen unterscheiden, da der Matrizen-Kopiervorgang in gewissem Maße fehleranfällig ist; Wagner et al., in PCR Topics, S. 69–71 (Springer-Verlag, 1991).
Wenn das Verhältnis von Matrize zur amplifizierten Produkt-DNA äußerst gering ist, beinhaltet der Großteil der Produkt-DNA-Fragmente die erwünschte(n) Mutation(en). Diese Produkt-DNA wird zum Ersetzen der entsprechenden Region im Plasmid, das als PCR-Matrize diente, verwendet, wobei man übliche rekombinante DNA-Verfahren heranzieht. Mutationen an getrennten Positionen können gleichzeitig eingeführt werden, indem man entweder einen zweiten mutanten Primer verwendet oder eine zweite PCR mit verschiedenen mutanten Primern durchführt und die beiden erhaltenen PCR-Fragmente gleichzeitig mit dem Plasmidfragment in einer dreiteiligen (oder mehrteiligen) Ligation verknüpft.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Varianten, die Kassettenmutagenese, beruht auf der Technik von Wells et al., Gene, Bd. 34 (1985), S. 315–323. Beim Ausgangsmaterial handelt es sich um das Plasmid (oder einen anderen Vektor), das die zu mutierende DNA-Sequenz umfasst. Das oder die Codons in der zu mutierenden Ausgangs-DNA werden identifiziert. Auf jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle oder Mutationsstellen muss eine einzige Restriktionsendonucleasenstelle vorliegen. Wenn keine derartigen Restriktionsstellen vorliegen, können sie unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Oligonucleotid-vermittelten Mutageneseverfahrens erzeugt werden, um sie an entsprechenden Positionen in der DNA einzuführen. Die Plasmid-DNA wird an diesen Stellen geschnitten, um sie zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, das aber nicht die erwünschte Mutation oder Mutationen enthält, wird unter Anwendung üblicher Verfahren synthetisiert, wobei die beiden Stränge des Oligonucleotids getrennt synthetisiert und anschließend unter Anwendung üblicher Techniken hybridisiert werden. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so konstruiert, dass sie 5'- und 3'-Enden aufweist, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, so dass sie direkt mit dem Plasmid verknüpft werden kann. Das erhaltene Plasmid enthält die mutierte DNA-Sequenz.
Das Vorliegen einer oder mehrerer Mutationen in einer DNA wird durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren bestimmt, wozu die Restriktionskartierung und/oder DNA-Sequenzierung gehören. Ein bevorzugtes Verfahren für die DNA-Sequenzierung ist das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren von Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Bd. 72 (1979), S. 3918–3921.
DNA, die für eine humane DNase I-Variante kodiert, wird in einen replizierbaren Vektor inseriert, um eine weitere Klonierung oder Expression vorzunehmen. Bei "Vektoren" handelt es sich um Plasmide und andere DNAs, die innerhalb einer Wirtszelle zur Replikation befähigt sind und sich somit zur Ausführung von zwei Funktionen in Verbindung mit kompatiblen Wirtszellen eignen (ein Vektor-Wirt-System). Eine Funktion besteht in der Erleichterung der Klonierung der Nucleinsäure, die für eine humane DNase I-Variante kodiert, d. h. zur Herstellung von verwertbaren Mengen der Nucleinsäure. Die andere Funktion besteht darin, die Expression einer humanen DNase I-Variante zu dirigieren. Eine oder alle beide Funktionen werden vom Vektor in der speziellen Wirtszelle, der für die Klonierung oder Expression verwendet wird, ausgeübt. Die Vektoren enthalten verschiedene Komponenten, und zwar je nach der Funktion, die sie ausüben.
Zur Herstellung einer humanen DNase I-Variante umfasst ein Expressionsvektor DNA, die für die Variante gemäß den vorstehenden Ausführungen kodiert, und zwar in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor und einer Ribosomenbindungsstelle. Die Variante wird sodann direkt in rekombinanter Zellkultur oder als ein Fusionsprodukt mit einem heterologen Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid, das eine spezifische Spaltungsstelle an der Verbindung zwischen dem heterologen Polypeptid und der humanen DNase I-Variante aufweist, exprimiert.
Prokaryonten (z. B. E. coli und andere Bakterien) stellen die bevorzugten Wirtszellen für die anfänglichen Klonierungsstufen der Erfindung dar. Sie eignen sich insbesondere für eine rasche Erzeugung von großen DNA-Mengen, zur Erzeugung einzelsträngiger DNA-Matrizen zur Verwendung für die positionsgerichtete Mutagenese und für die DNA-Sequenzierung der erzeugten Varianten. Prokaryontische Zellen können auch zur Expression von DNA, die für eine humane DNase I-Variante kodiert, verwendet werden. Polypeptide, die in prokaryontischen Zellen erzeugt werden, sind typischerweise nicht glycosyliert.
Ferner können die erfindungsgemäßen humanen DNase I-Varianten in eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden, unter Einschluss von eukaryontischen Mikroorganismen (z. B. Hefe) oder Zellen, die sich von einem Tier oder einem anderen vielzelligen Organismus (z. B. Ovarialzellen des chinesischen Hamsters oder andere Säugetierzellen) ableiten, oder in lebenden Tieren (z. B. Rindern, Ziegen und Schafen).
Verfahren zur Klonierung und Expression sind aus dem Stand der Technik bekannt. Zu Beispielen für prokaryontische und eukaryontische Wirtsellen und für Expressionsvektoren, die sich zur Verwendung bei der Herstellung der erfindungsgemäßen humanen DNase I-Varianten eignen, gehören beispielsweise die in der PCT-Patentveröffentlichung WO-90/07572 (Shak, Veröffentlichungstag 12. Juli 1990) beschriebenen Produkte.
Wenn prokaryontische Zellen oder Zellen, die erhebliche Zellwandkonstruktionen enthalten, als Wirte verwendet werden, handelt es sich bei den bevorzugten Verfahren zur Transfektion der Zellen mit DNA um das von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 69 (1972), S. 2110–2114, beschriebene Verfahren unter Behandlung mit Calcium oder um das Polyethylenglykol-Verfahren von Chung et al., Nuc. Acids. Res., Bd. 16 (1988), S. 3580. Wenn Hefe als Wirt verwendet wird, wird die Transfektion im Allgemeinen unter Verwendung von Polyethylenglykol gemäß Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Bd. 75 (1978), S. 1929–1933, durchgeführt. Wenn Säugetierzellen als Wirtszellen verwendet werden, wird die Transfektion im Allgemeinen mit dem Calciumphosphat-Fällungsverfahren durchgeführt; Graham, et al., Virology, Bd. 52 (1978), S. 546; Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech., Bd. 2 (1990), S. 3–10. Jedoch eignen sich auch andere bekannte Verfahren zur Einführung von DNA in prokaryontische und eukaryontische Zellen, z. B. die nukleare Injektion, die Elektroporation oder die Protoplastenfusion, zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Erfindungsgemäß besonders geeignet sind Expressionsvektoren, die in Säugetierzellen für eine vorübergehende Expression von DNA, die für humane DNase I-Varianten kodiert, sorgen. Im Allgemeinen beinhaltet eine vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der zur wirksamen Replikation in einer Wirtszelle befähigt ist, so dass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors ansammeln kann und wiederum hohe Konzentrationen eines erwünschten Polypeptids, das durch den Expressionsvektor kodiert wird, synthetisiert. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen eine zweckmäßige positive Identifikation von Polypeptiden, die durch die klonierten DNAs kodiert werden, sowie ein rasches Screening von derartigen Polypeptiden auf erwünschte biologische oder physiologische Eigenschaften; Wong et al., Science, Bd. 228 (1985), S. 810–815; Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 4360–4364; Yang et al., Cell, Bd. 47 (1986), S. 3–10. Somit werden vorübergehende Expressionssysteme in zweckmäßiger Weise zur Expression von DNA, die für Aminosäuresequenz-Varianten von nativer humaner DNase I kodieren, in Verbindung mit Tests zur Identifikation von solchen Varianten, die eine erhöhte DNA-hydrolytische Aktivität aufweisen, verwendet.
Eine humane DNase I-Variante wird vorzugsweise aus der Wirtszelle, in der sie exprimiert wird, sezerniert, wobei in diesem Fall die Variante aus dem Kulturmedium, in dem die Wirtszellen gezüchtet werden, gewonnen wird. In diesem Fall kann es erstrebenswert sein, die Zellen in einem serumfreien Kulturmedium zu züchten, da die Abwesenheit von Serumproteinen und anderen Serumkomponenten im Medium die Reinigung der Variante erleichtern kann. Wenn keine Sekretion erfolgt, so wird die humane DNase I-Variante aus Lysaten der Wirtszellen gewonnen. Wenn die Variante in einer Wirtszelle exprimiert wird, bei der es sich nicht um eine Zelle humanen Ursprungs handelt, ist die Variante vollständig frei von Proteinen humanen Ursprungs. Auf jeden Fall ist es erforderlich, die Variante von rekombinanten Zellproteinen zu reinigen, um im Wesentlichen homogene Präparate der humanen DNase I-Variante zu erhalten. Für therapeutische Zwecke weist die gereinigte Variante vorzugsweise eine Reinheit von mehr als 99% auf (d. h. etwaige andere Proteine machen in der gereinigten Zusammensetzung weniger als 1% des gesamten Proteins aus).
Im Allgemeinen wird die Reinigung einer huamen DNase I-Variante erreicht, indem man die unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften der Variante im Vergleich zu den Verunreinigungen, mit denen sie assoziiert sein kann, ausnützt. Beispielsweise wird als erste Stufe das Kulturmedium oder das Wirtszelllysat zentrifugiert, um teilchenförmige Zellbruchstücke zu entfernen. Anschließend wird die humane DNase I-Variante von verunreinigenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, Gelfiltration (molekulare Ausschlusschromatographie), Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Immunoaffinitätschromatographie (z. B. unter Verwendung einer Säule, die an Sepharose gekuppelte, anti-humane DNase I-Antikörper umfasst), Tentakel-Kationenaustauschchromatographie (Frenz et al., PCT-Patentveröffentlichung WO-93/25670 (Veröffentlichungstag 23. Dezember 1993), Umkehrphasen-HPLC und/oder Gelelektrophorese.
Selbstverständlich ist es für einen Fachmann ersichtlich, dass die Reinigungsverfahren, die für native humane DNase I eingesetzt werden, möglicherweise eine gewisse Modifikation erfordern, damit sie bei der Reinigung einer humanen DNase I-Variante geeignet sind, um den strukturellen und anderen Unterschieden zwischen den nativen und varianten Proteinen Rechnung zu tragen. Beispielsweise wird in einigen Wirtszellen (insbesondere in bakteriellen Wirtszellen) die humane DNase I-Variante möglicherweise zu Beginn in einer unlöslichen, aggregierten Form (im Stand der Technik als "refraktile Körper" oder "Einschlusskörper" bezeichnet) exprimiert, wobei es in diesem Fall erforderlich ist, die humane DNase I-Variante im Verlauf ihrer Reinigung in Lösung zu bringen und zu renaturieren. Verfahren zur Solubilisierung und Renaturierung von rekombinanten refraktilen Proteinkörpern sind aus dem Stand der Technik bekannt (vergl. z. B. Builder et al., US-Patent 4 511 502 ).
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden kovalente Modifikationen an einem nativen oder varianten humanen DNase I-Protein vorgenommen, um die DNA-hydrolytische Aktivität des Proteins zu erhöhen oder um andere Eigenschaften des Proteins (z. B. die Stabilität, die biologische Halbwertszeit und die Immunogenizität) zu beeinflussen. Derartige kovalente Modifikationen können anstelle oder zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Substitutions-, Insertions- und Deletionsmutationen der Aminosäuresequenz vorgenommen werden.
Kovalente Modifikationen können eingeführt werden, indem man Zielaminosäurereste der nativen oder varianten humanen DNase I mit einem organischen Derivatisierungsmittel umsetzt, das zur Umsetzung mit ausgewählten Aminosäureseitenketten oder N- oder C-terminalen Resten befähigt ist. Geeignete Derivatisierungsmittel und Derivatisierungsverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Beispielsweise werden Cysteinylreste sehr häufig mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen), wie Chloressigsäure oder Chloracetamid, zu Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivaten umgesetzt. Cysteinylreste werden auch durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)- propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol, derivatisiert.
Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonat beim pH-Wert 5,5–7,0 umgesetzt, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. p-Bromphenacylbromid ist ebenfalls geeignet. Die Umsetzung wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumkakodylat beim pH-Wert 6,0 durchgeführt.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäureanhydrid oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Eine Derivatisierung mit diesen Mitteln bewirkt die Umkehr der Ladung der Lysinylreste. Zu weiteren geeigneten Reagenzien zur Derivatisierung von α-Aminogruppen enthaltenden Resten gehören Imidoester, wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und eine durch Transaminasen katalysierte Umsetzung mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, wozu Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin gehören. Eine Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Umsetzung unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird, und zwar aufgrund des hohen pK_a-Werts der funktionellen Guanidingruppe. Ferner können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie mit der ε-Aminogruppe von Arginin reagieren.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') umgesetzt, wobei R und R' verschiedene Alkylgruppen bedeuten, z. B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)-carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)-carbodiimid. Ferner werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Umsetzung mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgewandelt.
Eine kovalente Kupplung von Glycosiden an Aminosäurereste eines nativen oder varianten humanen DNase I-Proteins kann dazu herangezogen werden, die Anzahl oder das Profil von Kohlenhydratsubstituenten zu modifizieren oder zu erhöhen, insbesondere an Resten, die an der DNA-Bindung beteiligt sind, oder in Nachbarschaft hierzu. Je nach dem eingesetzten Kupplungsverfahren können der oder die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, z. B. die von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen, z. B. die von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, z. B. die von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Geeignete Verfahren sind beispielsweise in der PCT- Patentveröffentlichung WO-87/05330 (Veröffentlichungstag 11. September 1987) und bei Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., (1981), S. 259–306, beschrieben.
Die kovalente Bindung von Mitteln, wie Polyethylenglykol (PEG) oder humanem Serumalbumin, an humane DNase I-Varianten kann die Immunogenizität und/oder Toxizität der Variante verringern und/oder ihre Halbwertszeit verlängern, wie es bei anderen Proteinen beobachtet worden ist; Abuchowski et al., J. Biol. Chem., Bd. 252 (1977), S. 3582–3586; Poznansky et al., FERS Letters, Bd. 239 (1988), S. 18–22; Goodson et al., Biotechnology, Bd. 8 (1990), S. 343–346; Katre, J. Immunol., Bd. 144 (1990), S. 209–213; Harris, Polyethylene Glycol Chemistry (Plenum Press, 1992).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst eine hyperaktive Variante von humaner DNase I eine oder mehrere zusätzliche Aminosäure-Sequenzmutationen oder andere kovalente Modifikationen, die bewirken, dass die Variante eine verringerte Bindungsaffinität für Actin aufweist. Beispiele für derartige Mutationen und kovalente Modifikationen, die die Actin-Bindung verringern, sind in der PCT-Patentveröffentlichung WO-96/26279 beschrieben. Eine hyperaktive Variante kann auch eine Aminosäuresequenzmutation oder eine andere kovalente Modifikation umfassen, die die Empfindlichkeit der Variante gegenüber einem Abbau durch Proteasen (z. B. Neutrophilen-Elastase), die im Sputum und anderen biologischen Materialien vorhanden sein können, verringert.
Die DNA-hydrolytische Aktivität der humanen DNase I-Varianten, die gemäß den vorstehenden Ausführungen hergestellt worden sind, lässt sich leicht unter Anwendung von Tests und Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind und hier beschrieben werden, bestimmen. Beliebige derartige Varianten mit einer erhöhten DNA-hydrolytischen Aktivität (gemäß der hier gegebenen Definition) stellen hyperaktive Varianten im Rahmen des Umfangs der vorliegenden Erfindung dar.
Antikörper gegen hyperaktive Varianten von humaner DNase I werden durch Immunisierung eines Tiers mit einer hyperaktiven Variante oder einem Fragment davon, gegebenenfalls in Verbindung mit einem immunogenen Polypeptid, und durch anschließende Gewinnung der Antikörper aus dem Serum der immunisierten Tiere erzeugt. Alternativ werden monoklonale Antikörper aus Zellen des immunisierten Tiers auf herkömmliche Weise hergestellt. Die Antikörper können auch in Form von chimären (z. B. humanisierten) oder einzelkettigen Antikörpern oder Fab-Fragmenten hergestellt werden, wobei man sich herkömmlicher Verfahren bedient. Vorzugsweise binden die Antikörper an die hyperaktive Variante, binden jedoch nicht im wesentlichen Umfang an andere DNase-Proteine (z. B. native humane oder bovine DNase I) (d. h. sie gehen keine Kreuzreaktion ein). Die Antikörper können in Verfahren eingesetzt werden, die sich mit der Lokalisierung und Aktivität der hyperaktiven Variante befassen, z. B. mit dem Nachweis und der Messung ihrer Konzentration in Geweben oder klinischen Proben. Immobilisierte Antikörper eignen sich in besonderer Weise zum Nachweis der hyperaktiven Variante in klinischen Proben für diagnostische Zwecke und bei der Reinigung der hyperaktiven Variante, z. B. aus rekombinanten Zellkulturen.
Die hyperaktiven Varianten von humaner DNase I, die erfindungsgemäß bereitgestellt werden, werden zur Verringerung der Viskoelastizität von DNA enthaltendem Material, einschließlich Sputum, Schleim oder andere Lungensekrete, verwendet. Derartige Varianten eignen sich in besonderer Weise zur Behandlung von Patienten mit Lungenkrankheiten, bei denen abnormale viskose oder eingedickte Sekrete und Zustände vorliegen, z. B. bei akuter oder chronischer bronchialer Lungenkrankheit, einschließlich infektiöse Pneumonie, Bronchitis oder Tracheobronchitis, Bronchiektasie, zystische Fibrose, Asthma, Tuberkulose und Pilzinfektionen. Für derartige Therapien werden eine Lösung oder ein fein verteiltes trockenes Präparat der hyperaktiven Variante auf herkömmliche Weise in die Luftwege (z. B. Bronchien) oder Lungen eines Patienten eingeträufelt, z. B. durch Aerosolisierung.
Die hyperaktiven Varianten eignen sich auch zur begleitenden Behandlung von Abszessen oder schweren, abgeschlossenen Infektionen bei Zuständen, wie Empyem, Meningitis, Abszessen, Peritonitis, Sinusitis, Otitis, Periodontitis, Perikarditis, Pankreatitis, Cholelithiasis, Endokarditis und septischer Arthritis, sowie bei topischen Behandlungen bei einer Vielzahl von entzündlichen und infizierten Läsionen, z. B. infizierten Läsionen der Haut und/oder von Schleimhautmembranen, chirurgischen Wunden, ulzerativen Läsionen und Verbrennungen. Die hyperaktive Variante kann die Wirksamkeit von Antibiotika, die bei der Behandlung von derartigen Infektionen eingesetzt werden, verbessern (z. B. wird die Aktivität von Gentamicin durch reversible Bindung an intakte DNA erheblich verringert).
Hyperaktive Varianten von humaner DNase I eignen sich zur Behandlung von systemischem Lupus erythematosus (SLE), einer lebensbedrohenden Autoimmunkrankheit, die durch die Erzeugung verschiedener Autoantikörper gekennzeichnet ist. DNA stellt eine wichtige antigene Komponente der Immunkomplexe dar. In diesem Fall kann die hyperaktive humane DNase I (nativ oder variant) systemisch verabreicht werden, z. B. durch intravenöse, subkutane, intrathekale oder intramuskuläre Verabreichung an den betroffenen Patienten.
Hyperaktive Varianten von humaner DNase I eignen sich auch dazu, die Neuentwicklung und/oder Verschlimmerung von Atemwegsinfektionen zu verhindern, wie sie beispielsweise bei Patienten mit zystischer Fibrose, chronischer Bronchitis, Asthma, Lungenentzündung oder anderen Lungenkrankheiten oder bei Patienten, deren Atmung durch einen Ventilator oder eine andere mechanische Vorrichtung unterstützt wird, oder bei anderen Patienten, bei denen das Risiko von Atemwegsinfektionen besteht, z. B. bei Patienten nach einer Operation, auftreten.
Die erfindungsgemäßen hyperaktiven Varianten können nach bekannten Verfahren zur Herstellung von therapeutisch wertvollen Zusammensetzungen zubereitet werden. Eine bevorzugte therapeutische Zusammensetzung ist eine Lösung einer hyperaktiven Variante in einer gepufferten oder ungepufferten wässrigen Lösung. Vorzugsweise handelt es sich um eine isotone Salzlösung, wie 150 mM Natriumchlorid mit einem Gehalt an 1,0 mM Calciumchlorid mit einem pH-Wert von 7. Diese Lösungen eignen sich in besonderer Weise zur Verwendung in handelsüblichen Zerstäubungsgeräten, einschließlich Strahlzerstäubungsgeräten und Ultraschallzerstäubungsgeräten, die sich für die direkte Verabreichung in die Luftwege oder Lungen eines betroffenen Patienten eignen.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die therapeutische Zusammensetzung ein trockenes Pulver der hyperaktiven Variante, das vorzugsweise durch Sprühtrocknung einer Lösung der Variante hergestellt worden ist, und zwar im Wesentlichen gemäß der PCT-Patentveröffentlichung WO-95/23613 .
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die therapeutische Zusammensetzung Zellen, die in aktiver Weise eine hyperaktive Variante von humaner DNase I erzeugen. Derartige Zellen können direkt in das Gewebe eines Patienten eingeführt werden oder sie können in poröse Membranen eingekapselt werden, die dann den Patienten implantiert werden, wobei in beiden Fällen die Abgabe der hyperaktiven Variante in Körperbereichen des Patienten, die einer erhöhten DNA-hydrolytischen Aktivität bedürfen, erfolgt. Beispielsweise können die eigenen Zellen des Patienten entweder in vivo oder ex vivo mit DNA, die für eine hyperaktive Variante von humaner DNase I kodiert, transformiert und anschließend zur direkten Erzeugung der varianten DNase I im Patienten verwendet werden. Das letztgenannte Verfahren wird allgemein als Gentherapie bezeichnet.
Die therapeutisch wirksame Menge einer hyperaktiven Variante von humaner DNase I hängt beispielsweise von der Menge an DNA im zu behandelnden Material, den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten ab. Demzufolge ist es für den Therapeuten erforderlich, die Dosierung so einzustellen und den Verabreichungsweg so zu modifizieren, wie es zur Erzielung einer optimalen therapeutischen Wirkung erforderlich ist. Im Hinblick auf die erhöhte DNA-hydrolytische Aktivität kann die Menge der zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung erforderlichen hyperaktiven Variante geringer sein als die Menge an nativer humaner DNase I, die zur Erzielung der gleichen Wirkung unter den gleichen Umständen erforderlich ist. Im allgemeinen handelt es sich bei der therapeutisch wirksamen Menge der hyperaktiven Variante um eine Dosierung von 0,1 μg bis etwa 5 mg der Variante pro kg Körpergewicht des Patienten bei Verabreichung in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hier beschrieben werden.
Eine hyperaktive humane DNase I-Variante wird gegebenenfalls mit einem oder mehreren pharmakologischen Mitteln, die zur Behandlung der vorstehend aufgeführten Zustände verwendet werden, kombiniert oder zusammen damit verabreicht, z. B. mit Antibiotika, Bronchodilatatoren, entzündungshemmenden Mitteln, Mucolytika (z. B. n-Acetylcystein), Actin bindenden oder lösenden Proteinen (z. B. Gelsolin; Matsudaira et al., Cell, Bd. 54 (1988), S. 139–140; Stossel et al., PCT-Patentveröffentlichung WO-94/22465 (Veröffentlichungstag 13. Oktober 1994)), Protease-Inhibitoren, Gentherapieprodukten (die beispielsweise das zystische Fibrose-Transmembrankonduktanz-Regulator-(CFTR)-Gen umfassen; Riordan et al., Science, Bd. 245 (1989), S. 1066–1073), Glucocorticoiden oder zytotoxischen Mitteln.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sollen den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise beschränken.
Beispiel 1
Mutagenese von humaner DNase I
Der E. coli-Stamm CJ236 (BioRad Laborstories, Richmond, Kalifornien, USA) wurde mit dem Plasmid pRK.DNase.3 unter Anwendung des Verfahrens von Chung et al. (Nuc. Acids. Res., Bd. 16 (1988), S. 3580) transformiert. Das bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendete Plasmid pRK.DNase.3 entspricht den Angaben in der PCT-Patentveröffentlichung WO-90/07572 (Veröffentlichungstag 12. Juli 1990), mit der Ausnahme, dass die für die reife humane DNase I kodierende Nucleotidsequenz der Darstellung in 1A von Shak et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 87 (1999), S. 9188–9192, entspricht. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agarplatten mit einem Gehalt an 50 μg/ml Carbenicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C gezüchtet. 2YT-Brühe (5 ml) mit einem Gehalt an 50 μg/ml Carbenicillin und 10 μl VCSM 13-Helferphage (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) wurden mit einer individuellen Kolonie aus der Agarplatte inokuliert und über Nacht bei 37°C unter Bewegen gezüchtet. Einzelsträngige DNA wurde aus dieser Kultur isoliert und als Matrize für die anschließende Mutagenese verwendet.
Eine positionsgerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden gemäß dem Verfahren von Kunkel et al. (Meth. Enzymol., Bd. 154 (1987), S. 367–382) durchgeführt. Bei den mutagenen Oligonucleotiden handelte es sich um 27-mere mit 12 genauen Basenübereinstimmungen in 5'-Stellung zum unpassenden Codon und 12 genauen Basenübereinstimmungen in 3'-Stellung zum unpassenden Codon. Nach der Mutagenese wurde einzelsträngige DNA aus individuellen Klonen der Didesoxy-Sequenzierung (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463–5467) unterworfen. DNA mit varianten Nucleotidsequenzen wurde sodann gemäß den vorstehenden Angaben in den E. coli-Stamm XLI Blue MRF' (Stratagene) transformiert. Nach Ausstreichen und Isolieren einer einzelnen Kolonie gemäß den vorstehenden Angaben wurden individuelle Kolonien zur Inokulation von 0,5 Liter LB-Brühe mit einem Gehalt an 50 μg/ml Carbenicillin verwendet. Nach Züchtung über Nacht unter Bewegen bei 37°C wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und die variante DNA (im Expressionsvektor) wurde unter Verwendung von Qiagen tip-500-Säulen (Qiagen Inc., Chatsworth, Kalifornien, USA) gereinigt.
Die 2 und 3 identifizieren die verschiedenen humanen DNase I-Varianten, die hergestellt wurden. In den Figuren und in der gesamten Beschreibung wird die Bezeichnung der in einer DNase I-Variante vorhandenen Aminosäure-Substitutionsmutation(en) mit einem ersten Buchstaben, einer Ziffer und einem zweiten Buchstaben abgekürzt. Beim ersten Buchstaben handelt es sich um die Einbuchstaben-Abkürzung des Aminosäurerestes in nativer (Wildtyp) humaner reifer DNase I, die Zahl gibt die Position des Restes in nativer humaner reifer DNase I an (Nummerierung gemäß 1) und der zweite Buchstabe stellt die Einbuchstaben-Abkürzung für den Aminosäurerest dar, der sich an dieser Position in der varianten DNase I befindet. Beispielsweise wurde in der DNase (-Variante mit einer E13R-Mutation der Glutaminsäurerest (E) in Position 13 in nativer humaner reifer DNase I durch einen Argininrest (R) ersetzt. Mehrfache Mutationen in einer einzelnen Variante werden auf ähnliche Weise bezeichnet, wobei ein Doppelpunkt (:) jeweils die verschiedenen Mutationen, die in der Variante vorliegen, trennt. Beispielsweise bedeutet die Bezeichnung E13R:N74K, dass die Variante eine E13R-Mutation und eine N74K-Mutation aufweist.
Beispiel 2
Expression von humanen DNase I-Varianten
Humane embryonale 293-Nierenzellen (ATCC CRL 1573, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA) wurden in Serum mit einem Gehalt an Medium in 150 mm-Petri-Kunststoffschalen gezüchtet. Zellen in der logarithmischen Phase wurden vorübergehend mit 22,5 μg gereinigter varianter DNA (auf die vorstehend angegebene Weise hergestellt) und 17 μg Adenovirus-DNA unter Anwendung des Calciumphosphat-Fällungsverfahrens (Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech., Bd. 2 (1990), S. 3–10) kotransfiziert. Etwa 16 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und das Medium wurde gegen serumfreies Medium ausgetauscht. Zellkulturmedium wurde von jeder Platte etwa 96 Stunden nach dem Austausch gegen serumfreies Medium geerntet. Insgesamt etwa 25 ml Zellkulturüberstand mit einem Gehalt an der DNase I-Variante wurden auf diese Weise erhalten. Der Pool von Kulturüberständen der einzelnen Platten wurde unter Verwendung von Centriprep 10-Konzentrationsvorrichtungen auf das etwa 10-fache konzentriert. Die Konzentration an DNase I-Protein in den Konzentraten wurde unter Anwendung eines DNase I-Protein-ELISA-Tests gemäß der PCT-Patentveröffentlichung WO-96/26279 bestimmt.
Kulturüberstand mit einem Gehalt an nativer humaner DNase I wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt, mit der Ausnahme, dass die 293-Zellen vorübergehend mit dem Plasmid pRK.DNase.3 transfiziert wurden.
Beispiel 3
Biochemische Aktivitäten von humanen DNase I-Varianten
I. Plasmid-DNA-Verdauungstest
Zur Bestimmung der DNA-hydrolytischen Aktivität von humanen DNase I-Varianten wurden zwei verschiedene Plasmid-Verdauungstests herangezogen. Der erste Test ("Superspiralen-DNA-Verdauungstest") maß die Umwandlung von doppelsträngiger Superspiralen-pBR322-Plasmid-DNA in entspannte ("nicked"), lineare und abgebaute Formen. Der zweite Test ("linearer DNA-Verdauungstest") maß die Umwandlung von linearer, doppelsträngiger pBR322-DNA in abgebaute Formen.
Speziell wurden Kulturüberstände (hergestellt auf die vorstehend beschriebene Weise und vor der Verwendung etwa 1:1 000 verdünnt) zu 160 μl Lösung mit einem Gehalt an 25 μg/ml entweder an Superspiralen-pBR322-DNA oder EcoRI-verdauter, linearisierter pBR322-DNA in 25 mM HEPES, pH-Wert 7,1, 100 μg/ml Rinderserumalbumin, 1 mM MgCl₂, 2,5 mM CaCl₂, 150 mM NaCl gegeben und die Proben wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquotmengen der Reaktionsgemische entfernt und durch Zugabe von 25 mM EDTA zusammen mit Xylolcyanol, Bromphenolblau und Glycerin gestoppt. Die Unversehrtheit der pBR322-DNA in den gestoppten Proben wurde durch Elektrophorese der Proben in 0,8% (Gew.-/Vol.) Agarosegelen analysiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit einer Lösung von Ethidiumbromid gefärbt und die DNA in den Gelen wurde durch UV-Licht sichtbar gemacht. Die relativen Mengen an pBR322-DNA in Superspiralform, relaxierter Form und linearer Form wurden durch Scanning der Gele mit einem Molecular Dynamics Modell 575 Fluorlmager-Gerät bestimmt und die DNA-Mengen in den Banden des Gels, die diesen verschiedenen Formen entsprachen, wurden quantitativ ermittelt.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in 2 dargestellt. Beim Superspiralen-DNA-Verdauungstest wurde die gesamte Aktivität der humanen DNase I-Varianten als die Anfangsgeschwindigkeit des Verschwindens von Superspiralen-DNA (als Ergebnis zur Umwandlung in relaxierte (nicked), lineare oder abgebaute DNA) unter Normierung relativ zu der Geschwindigkeit, die bei nativer humaner DNase I beobachtet wurde ("relative Nicking-Aktivität") gemessen. Das Verhältnis von linearisierten zu entspannten Formen von pBR322-DNA wurde auch relativ zum Verhältnis bei nativer humaner DNase I bestimmt ("L/R-Verhältnis"). Beim linearen DNA-Verdauungstest wurde die Aktivität der humanen DNase I-Varianten als Anfangsgeschwindigkeit des Verschwindens von linearer DNA (als Folge der Umwandlung in abgebaute Formen) unter Normierung relativ zu der Geschwindigkeit, die bei nativer humaner DNase I beobachtet wurde ("relative lineare DNA-Verdauungsaktivität") gemessen. Beim Superspiralen-DNA-Verdauungstest wies native humane DNase I eine Superspiralen-DNA-Nicking-Aktivität von 1 200 ± 43 mg DNA min^–1 mg^–1 DNase I (n = 2) auf und ergab ein Verhältnis von linearem zu entspanntem Produkt von 0,010. Beim linearen DNA-Verdauungstest wies native humane DNase I eine lineare DNA-Verdauungsaktivität von 23 ± 3 mg DNA min^–1 mg^–1 DNase I (n = 6) auf.
II. Hyperchromizitätstest
Die DNA-hydrolytische Aktivität von humanen DNase I-Varianten wurde auch unter Anwendung eines Hyperchromizitätstests bestimmt, der auf der Zunahme der Absorption bei 260 nm bei Denaturierung und Depolymerisation von DNA beruhte (Kunitz, J. Gen. Physiol., Bd. 33 (1950), S. 349–362; Kunitz, J. Gen. Physiol., Bd. 33 (1950), S. 363–377).
Beim Hyperchromizitätstest wurden Kulturüberstände (hergestellt auf die vorstehend beschriebene Weise und vor der Verwendung etwa 1:2 bis 1:50 verdünnt) zu 150 μl Lösung mit einem Gehalt an 10 μg/ml bis 600 μg/ml Kälberthymus-DNA in 25 mM HEPES, pH-Wert 7,1, 1 mM MgCl₂, 2,5 mM CaCl₂, 150 mM NaCl gegeben und die Zunahme der Absorption bei 260 nm wurde mit einem Spektrophotometer (Molecular Devices Spectra Max 250) 6 Minuten überwacht. Diagramme der Aktivität gegen die DNA-Konzentration waren hyperbolisch und die Daten wurden an die Michaelis-Menton-Gleichung angepasst, um die kinetischen K_m- und V_max-Werte zu erhalten. 3 zeigt die 1/K_m, V_max- und V_max/K_m-Werte, die für die humanen DNase I-Varianten berechnet wurden, bei Normierung relativ zu den Werten von nativer humaner DNase I. Bei diesen Test wies native humane DNase I einen K_m-Wert von 229 ± 33 μg/ml DNA (n = 6) und einen V_max-Wert von 168 ± 18 A₂₆₀-Einheiten min^–1 mg^–1 DNase I (n – 6) auf.
III. Einfluss von Natriumchlorid auf die DNA-hydrolytische Aktivität
Der Einfluss von Natriumchlorid auf die DNA-hydrolytische Aktivität verschiedener humaner DNase I-Varianten wurde unter Anwendung des linearen DNA-Verdauungstests im Wesentlichen gemäß den vorstehenden Angaben bestimmt, mit der Ausnahme, dass Natriumchlorid zum Reaktionsgemisch bis zu einer Endkonzentration von 20 mM bis 400 mM gegeben wurde. 4 zeigt die prozentuale Aktivität von hyperaktiven Varianten und von nativer humaner DNase I bei verschiedenen Konzentrationen an Natriumchlorid, relativ zu den entsprechenden Aktivitäten bei fehlender Zugabe von Natriumchlorid. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Humane DNase I-Variante mit mindestens 90% Identität mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz von nativer humaner DNase I, ferner umfassend eine oder mehrere der folgenden Aminosäure-Substitutionen: Q9R, E13K, T14K, T14R, H44K, H44R, N74K, N74R, S75K, T205K und T205R; wobei die Variante eine größere hydrolytische DNA-Aktivität als native humane DNase I aufweist.
Variante nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 95% Identität mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz von nativer humaner DNase I hat.
Variante nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 98% Identität mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz von nativer humaner DNase I hat.
Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend mindestens eine der folgenden Aminosäurerest-Substitutionen: E13R:N74K, Q9R:E13R:N74K, E13R:N74K:T205K, Q9R:E13R:N74K:T205K.
Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17.
Isolierte Nucleinsäure, die für eine humane DNase I-Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert.
Verwendung einer humanen DNase I-Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Lungenkrankheit oder -störung.
Verwendung nach Anspruch 7, worin die Krankheit oder Störung zystische Fibrose ist.
Verwendung einer humanen DNase I-Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von systemischem Lupus erythematosus.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine humane DNase I-Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten.