BR112013027547B1 - polipeptídeo, dímero, composição, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira microbiana, método para preparar o polipeptídeo e composição contendo nucleasse - Google Patents

polipeptídeo, dímero, composição, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira microbiana, método para preparar o polipeptídeo e composição contendo nucleasse Download PDF

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Abstract

POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEI CO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA, MÉTODO PARA PREPARAR O POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO CONTENDO NUCLEASSE PARA USO EM UM MÉTODO PARA TRATAR SLE E DÍMERO Moléculas de nuclease híbrida e métodos para tratamento de uma doença ou distúrbio imuno-relacionada em um mamífero, e uma composição farmacêutica para tratamento de uma doença imuno-relacionada em um mamífero.

Description

Antecedentes da invenção
[0001] A liberação excessiva de partículas de (ribo)nucleoproteínas a partir de células mortas ou células morrendo podem causar a patologia lúpus através de dois mecanismo: (i) deposição ou formação in situ de cromatina/complexos anti-cromatina que causam nefrite e conduzem a perda da função renal; e (ii) as nucleoproteínas ativam a imunidade inata através do receptor do tipo Toll (TLR) 7, 8, e 9, bem como as rotas independente de TLR. A liberação das nucleoproteínas pode servir como um antígeno potente para os auto-anticorpos no SLE, provendo amplificação da célula B e a ativação de DC através do co-engrenamento dos receptores do antígeno e TLRs. Assim, existe uma necessidade para um meio de remoção dos antígenos incitantes e/ou de atenuação do estímulo imune, amplificação imune, e da doença mediada pelo complexo imune nos indivíduos necessitando do mesmo.
Sumário da invenção
[0002] É descrito aqui uma molécula de nuclease híbrida compreendendo um primeiro domínio de nuclease e um domínio Fc modificado, onde o primeiro domínio de nuclease é, operativamente, ligado ao domínio Fc. O domínio Fc é modificado de modo que a molécula tenha toxicidade reduzida em relação a uma molécula de nuclease híbrida tendo um domínio Fc não modificado. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida tem um domínio Fc que foi modificado para diminuir a ligação aos receptores FcY, proteínas do complemento, ou a ambos. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida tem citotoxicidade reduzida, pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 vezes comparada a uma molécula controle, por exemplo, a uma molécula de nuclease híbrida sem um domínio Fc modificado.
[0003] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida inclui adicionalmente, um primeiro domínio ligante, e o primeiro domínio de nuclease é operativamente acoplado para modificar o domínio Fc pelo primeiro domínio ligante.
[0004] Em alguns aspectos, a molécula de nuclease híbrida inclui um domínio Fc modificado que é um mutante, domínio IgG1 Fc. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende um ou mais mutações na articulação, nos domínios CH2 e/ou CH3. Em alguns aspectos, o domínio Fc compreende uma sequência de aminoácido tendo uma ou mais das mutações P238S, P331S, SCC, SSS (resíduos 220, 226, e 229), G236R, L328R, L234A, e L235A. Em alguns aspectos, o domínio Fc mutante inclui uma mutação P238s. Em alguns aspectos, o domínio Fc mutante inclui uma mutação P331s. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e pode incluir mutações em uma ou mais das três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e/ou uma ou mais mutações nas três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e/ou mutações em uma das três articulações de cisteínas (localizada no resíduo 220 pela numeração EU) para SCC (onde CCC refere-se as três cisteínas presentes no domínio de articulação alelo- selvagem). Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S, e/ou P331S, e/ou mutações nas três articulações de cisteínas (localizadas nos resíduos 220, 226 e 229 pela numeração EU) para SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e P331S e mutações nas três articulações de cisteína. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e P331 e SCC.
[0005] Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e P331S e SSS. Em alguns aspectos, um domínio mutante Fc inclui P238S e SCC. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui P238S e SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui P331S e SCC. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui P331S e SS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui mutações em uma ou mais das três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui uma mutação nas três articulações de cisteína. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui uma mutação nas três articulações de cisteínas para SCC. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui uma mutação nas três articulações de cisteínas e SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui SCC. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui SSS.
[0006] Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:59. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:60. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:71. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:72. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:73. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:74. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:75. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:76. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:87. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:88. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:89. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é como mostrado na SEQ ID NO:90.
[0007] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um alelo selvagem, um domínio RNase 1 humano ligado a um mutante, um domínio IgG1 Fc humano compreendendo SCC, P238S, e P331S, ou a um mutante, o domínio IgG1 Fc humano compreendendo SSS, P238S, e P331S. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é como mostrado nas SEQ ID NOs:61, 77, ou 91. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é como mostrada nas SEQ ID NOs:209, 62, 79, 92 ou 94.
[0008] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um alelo selvagem, um domínio RNase 1 humano ligado via um domínio ligante (Gli4Ser)4 a um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SCC, P238S, e P331S, ou a um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SSS, P238S, e P331S. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é como mostrado nas SEQ ID NOs:63, ou 79. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é como mostrada nas SEQ ID NOs:64 ou 79.
[0009] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio A114F DNase 1 G105R humano ligado via um domínio ligante (Gli4Ser)4 a um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SCC, P238S, e P331S, ligado via um domínio ligante NLG a um domínio RNAse humano alelo selvagem. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio DNase 1 G105R A114F ligado via um domínio ligante a um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SSS, P238, e P31, ligado via um domínio ligante NLG a um domínio RNase 1 humano alelo selvagem. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é como mostrada nas SEQ ID NOs:65 ou 81. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é como mostrada na SEQ ID NO: 66, ou 82.
[0010] Em outras concretizações, uma molécula de nuclease híbrida compreende uma sequência de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 62, 64, 78, 80, 92, ou 96, ou uma molécula de nuclease híbrida compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 62, 64, 78, 80, 92, ou 96. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96. Em outros aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende uma sequência de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 66, 68, 70, 82, 84, 86, 94, ou 98, ou uma molécula de nuclease híbrida compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a sequência de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 66, 68, 70, 82, 84, 86, 94, ou 98. Em outro aspecto, uma molécula de nuclease híbrida compreende uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:98.
[0011] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio RNase 1 humano alelo selvagem ligado via um domínio ligante (Gli4Ser)4 a um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SCC, P238S, e P331S, ligado via um domínio ligante NLG a um domínio DNase 1 G105R A114F humano. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio RNase 1 humano alelo selvagem, ligado via um domínio ligante (Gli4Ser)4 a um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SSS, P238S, e P331S, ligado via um domínio ligante NLG a um domínio DNase 1 G105R A114F humano. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é como mostrado nas SEQ ID NOs:67, ou 83. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é como mostrada nas SEQ ID NOs: 68 ou 84.
[0012] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio RNase 1 humano alelo-selvagem ligado a um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SCC, P238S, e P331S ligado via um domínio ligante NLG a um domínio Dnase 1 G105R A114F humano. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio RNase 1 humano alelo selvagem ligado a um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SSS, P238S, e P331S ligado via um domínio ligante NLG a um domínio DNase 1 G105R A114F humano. Em alguns aspectos, um ácido nucléico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é mostrado nas SEQ ID NOs: 69, 85, ou 93. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NOs: 70, 86, 94, ou 98.
[0013] Em alguns aspectos, a citotoxicidade induzida por uma molécula de nuclease híbrida é reduzida quando comparada a uma molécula controle. Em alguns aspectos, a citotoxicidade induzida por uma molécula de nuclease híbrida é reduzida em cerca de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% quando comparada a uma molécula controle. Em alguns aspectos, a molécula de nuclease híbrida tem cerca de 3-5 vezes ou pelo menos 3 vezes a citotoxicidade reduzida quando comparada a uma molécula de nuclease híbrida tendo um domínio Fc não modificado (por exemplo, um domínio Fc alelo-selvagem).
[0014] Em alguns aspectos, a atividade de uma molécula de nuclease híbrida tendo um DNase não é menos que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou > 30 vezes menor que a atividade de uma molécula DNase controle. Em alguns aspectos, a atividade de uma molécula de nuclease híbrida tendo uma DNase é cerca de igual a atividade de uma molécula DNase controle. Em alguns aspectos, a atividade de uma molécula de nuclease híbrida tendo uma RNase não menor que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou >30 vezes menos que a atividade de uma molécula RNase controle. Em alguns aspectos, a atividade de uma molécula de nuclease híbrida tendo uma RNase é cerca de igual a atividade de uma molécula RNase controle.
[0015] Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida é um polipeptídio, onde a sequência de aminoácidos do primeiro domínio de nuclease compreende uma sequência de aminoácidos RNase alelo-selvagem humano, onde o primeiro domínio ligante é (GliSer)n, onde n é 0, 1, 2, 3, 4, ou 5, onde a sequência de aminoácidos do domínio Fc compreende uma sequência de aminoácido do domínio IgG1 Fc mutante humano, e sendo que o primeiro domínio ligante é acoplado ao terminal C do primeiro domínio nuclease e o N-terminal do domínio Fc. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida é um polipeptídio compreendendo ou consistindo de uma sequência mostrada na Tabela 1.
[0016] Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida compreende uma DNase 1 humana alelo-selvagem ligada a um mutante, um domínio IgG1 Fc humano. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida compreende uma DNase 1 G105 R A114F humana ligada a um mutante, um domínio IgG1 Fc humano por um domínio ligante (Gli4Ser)n onde n=0, 1, 2, 3, 4 ou 5. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida compreende a RNase humana alelo-selvagem ligada a um mutante, um domínio IgG1 Fc humano mutante ligado a uma DNase 1 humana alelo-selvagem. Em algumas concretizações a molécula de nuclease híbrida compreende uma RNase humana alelo selvagem ligada a um domínio IgG1 Fc humano mutante ligado a uma DNase 1 humana G105R A114F. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida é um polipeptídio, onde a sequência de aminoácido do primeiro domínio de nuclease compreende uma sequência de aminoácido RNase, onde o primeiro domínio ligante está entre 5 e 32 aminoácidos de comprimento, onde a sequência de aminoácidos do domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos do domínio Fc humano, e onde o primeiro domínio ligante é acoplado ao C-terminal do primeiro domínio de nuclease e o terminal-N do domínio Fc. Em algumas concretizações, o domínio ligante inclui (Gli4Ser)5 e sítios de restrição Bg1II, AgeI, e XhoI. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida é um polipeptídio, onde a sequência de aminoácidos do primeiro domínio de nuclease compreende uma sequência de aminoácido RNase humana, onde o primeiro domínio ligante é um peptídio NLG entre 5 e 32 aminoácidos de comprimento, onde a sequência de aminoácidos do domínio Fc compreende uma sequência de aminoácidos do domínio Fc mutante humano, e onde o primeiro domínio ligante é acoplado ao terminal-C do primeiro domínio de nuclease e ao terminal N do domínio Fc.
[0017] Em algumas concretizações, o domínio Fc não se liga substancialmente a um receptor Fc sobre uma célula humana. Em algumas concretizações, o domínio Fc é modificado p ara diminuir a ligação aos receptores FY, proteínas do complemento, ou ambos. Em alguns aspectos , a ligação ao receptor Fc é reduzida em cerca de 1 , 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% quando comparada a uma molécula controle. Em alguns aspectos, a molécula de nuclease híbrida tem cerca de 3-5 vezes ou pelo menos 3 vezes a citotoxicidade reduzida quando comparada a uma molécula de nuclease híbrida tendo um domínio Fc não modificado (por exemplo, um domínio Fc alelo- selvagem).
[0018] Em algumas concretizações, o soro de meia-vida da molécula é significativamente maior que a meia-vida do primeiro domínio de nuclease sozinho. Em algumas concretizações, a atividade da nuclease do primeiro domínio de nuclease da molécula é o mesmo ou maior que o domínio de nuclease sozinho. Em algumas concretizações, a administração da molécula a um camundongo aumenta a taxa de sobrevivência do camundongo como medido por uma análise de modelo de Lupus animal. Em outros aspectos, a molécula de nuclease híbrida degrada o RNA, DNA ou ambos nos complexos imune. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida inibe a produção do interferon-α. Em alguns aspectos a produção interferon-α é reduzida em cerca 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% quando comparado a uma molécula controle.
[0019] Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease hibrida inclui uma sequência líder. Em algumas concretizações, a sequência líder é um peptídeo VK3LP humano a partir de uma família de cadeia leve kappa humana, e a sequência líder são acopladas ao terminal-N do primeiro domínio de nuclease. Nas concretizações, o VK3LP tem a sequência representada na SEQ ID NO:100.
[0020] Em algumas concretizações, a molécula é um polipeptídio. Em algumas concretizações, a molécula é um polinucleotídio.
[0021] Em algumas concretizações, o primeiro domínio de nuclease compreende uma RNase. Em algumas concretizações, a RNase é uma RNase humana. Em algumas concretizações, a RNase é um polipeptídio compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácido RNase representada na Tabela 1. Em algumas concretizações, a Rnase é um membro da família da RNase A humana. Em algumas concretizações, a RNase é uma RNase 1 pancreática humana.
[0022] Em algumas concretizações, o primeiro domínio de nuclease compreende uma DNase. Em algumas concretizações, a DNase é uma DNase humana. Em algumas concretizações, a DNase é um polipeptídio compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos DNase representada na Tabela 1. Em algumas concretizações, a DNase é selecionada a partir do grupo consistindo de DNase I humana, TREX1, e DNase 1L3 humana.
[0023] Em algumas concretizações, o domínio Fc é um domínio Fc humano. Em algumas concretizações, o domínio Fc é um domínio Fc mutante compreende SSS, P238S, e/ou P331S. Em algumas concretizações, o domínio Fc é um domínio IgG1 Fc humano. Em algumas concretizações, o domínio Fc é um polipeptídio compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos do domínio Fc representada na tabela 1.
[0024] Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante tem um comprimento de cerca de 1 a cerca de 50 aminoácidos. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante tem um comprimento de cerca de 5 a cerca de 31 aminoácidos. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante tem comprimento de cerca de 15 a cerca de 25 aminoácidos. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante tem comprimento de cerca de 20 a cerca de 32 aminoácidos. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante tem comprimento de cerca de 20 aminoácidos. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante tem comprimento de cerca de 25 aminoácidos. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante tem comprimento de cerca de 18 aminoácidos. Em algumas concretizações, o primeiro domí nio ligante compreende um peptídeo gli/ ser. Em algumas concretizações, o peptídeo gli/ser é da fórmula (Gli4Ser)n, onde n é um número inteiro positivo selecionado a partir do grupo consistindo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, e 10. Em algumas concretizações, o peptídeo gli/ser inclui (Gli4Ser)3. Em algumas concretizações, o peptídeo gli/ser inclui (Gli4Ser)4. Em algumas concretizações, o peptídeo gli/ser inclui (Gli4Ser)5. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante inclui pelo menos um sítio de restrição. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante inclui cerca de 12 ou maior nucleotídeo incluindo pelo menos um sítio de restrição. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante inclui dois ou mais sítios de restrição. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante inclui uma pluralidade de sítios de restrição. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante compreende um peptídeo NLG. Os peptídeos NLG contém uma sequência consensus de glicosilação ligado ao N. Em uma concretização, o peptídeo NLG tem uma sequência representada n a SEQ ID NO:99. Em algumas concretizações, o primeiro domínio ligante compreende um sítio de glicosilação ligado ao N.
[0025] Em algumas concretizações, o primeiro domínio nuclease é ligado ao terminal N do domínio Fc. Em algumas concretizações, o primeiro domínio de nuclease é ligado ao terminal C do domínio Fc.
[0026] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida inclui ainda um segundo domínio nuclease. Em algumas concretizações, o primeiro e o segundo domínio de nuclease são distintos dos domínios de nuclease. Em algumas concretizações, o primeiro e o segundo domínio de nuclease são os mesmos domínios de nuclease. Em algumas concretizações, o segundo domínio de nuclease é ligado ao terminal-N do domínio Fc. Em algumas concretizações, o segundo domínio de nuclease é ligado ao terminal-C do primeiro domínio de nuclease. Em algumas concretizações, o segundo domínio de nuclease é ligado ao terminal-N do primeiro domínio de nuclease.
[0027] Também descrito aqui é um polipeptídio dimérico compreendendo um primeiro polipeptídio e um segundo polipeptídio, onde o primeiro polipeptídio compreende um primeiro domínio de nuclease, e um domínio Fc, onde o primeiro domínio de nuclease é operativamente acoplado ao domínio Fc. Em algumas concretizações, o segundo polipeptídio é uma segunda molécula de nuclease híbrida compreendendo um segundo domínio de nuclease, e um segundo domínio Fc, onde o segundo domínio de nuclease é operativamente acoplado ao segundo domínio Fc.
[0028] Também descrito aqui é uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma molécula de nuclease híbrida e/ou pelo menos um polipeptídio dimérico como descrito aqui, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0029] Também descrito aqui é uma molécula de ácido nucléico codificante de uma molécula de nuclease híbrida. É também descrito aqui um vetor de expressão recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico. Também descrito aqui é uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão recombinante descrito aqui.
[0030] Também descrito aqui é um método para fazer uma nuclease híbrida descrita aqui, compreendendo a provisão de uma célula hospedeira contendo uma sequência de ácido nucléico que codifica a molécula de nuclease híbrida; e a manutenção da célula hospedeira sob condições nas quais a molécula de nuclease híbrida é expressa.
[0031] Também descrito aqui é um método para tratar ou prevenir uma condição associada com uma resposta imune anormal, compreendendo a administração a um paciente necessitando do mesmo de uma quantidade efetiva de uma molécula de nuclease híbrida isolada aqui. Em algumas concretizações, a condição é uma doença autoimune. Em algumas concretizações, a doença autoimune é selecionada a partir do grupo consistindo de diabete mielitus dependente de insulina, esclerose múltipla, encefalomielites autoimune experimental, artrite reumatoide, artrite autoimune experimental, miastenia grave, tiroidite, uma forma experimental de uveoretinite, tireoidite de Hashimoto, mixoedema primário, tirotoxicose, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, doença de Addison, menopausa prematura, infertilidade masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, Pemphigus vulgaris, penfigoide, oftalmia simpatética, uveite facogênica, anemia hemolítica autoimune, leucopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite crônica ativa Hbs-ve, cirrose criptogênica, colite ulcerativa, síndrome de Sjogren, escleroderma, granulomatose de Wegener, polimiosite, dermatomiosite, LE discoide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), e doença de tecido conectivo. Em algumas concretizações, a doença autoimune é SLE.
[0032] Também é descrito é um método para tratar SLE compreendendo a administração para um indivíduo de uma composição contendo nuclease em uma quantidade eficaz para degradar os complexos imunes contendo RNA, DNA ou ambos, RNA e DNA. Em alguns aspectos, a composição inclui um veículo farmaceuticamente aceitável e uma molécula de nuclease híbrida como descrito aqui. Em outros aspectos, a composição inclui uma molécula de nuclease híbrida compreendendo uma sequência de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 62, 64, 66, 68, 70, 78, 80, 82, 84, 86, 92, 94, 96, ou 98.
Breve descrição das várias vistas dos desenhos
[0033] Estas e outras figuras, aspectos, e vantagens da presente invenção se tornará melhor entendida com relação à descrição a seguir, e acompanhar os desenhos, onde:
[0034] A figura 1 ilustra uma estrutura protótipo para criar diferentes configurações da molécula de nuclease hibrida;
[0035] A figura 2 ilustra a concentração de RSLV-124 recuperada a partir do soro do camundongo após uma injeção intravenosa única;
[0036] A figura 3 ilustra o resultado de uma análise da atividade enzimática RNase sobre o RLSV-12 recuperada do soro de um camundongo como medido em unidade de fluorescência relativa (RFU’s) durante o tempo;
[0037] A figura 4 ilustra a concentração de RSLV-124 no soro de camundongo como extrapolado a partir da atividade de enzimática RNase da molécula;
[0038] A figura 5 ilustra a análise da difusão da enzima radial única (SRED) do soro a partir de dois camundongos transgênico RNase (Tg) comparado a um camundongo B6 normal;
[0039] A figura 6 ilustra a concentração de RNase A em Tg e duplo Tg (DTg) em camundongos medido por ELISA. Cada ponto representa a concentração medida em um camundongo individual;
[0040] A figura 7 ilustra a sobrevivência de TLR7.1 Tg versus TLR7.1xRNase A DTg em camundongos;
[0041] A figura 8 ilustra a quantidade de PCR de IRGs no baço de TG versus DTg em camundongos;
[0042] A figura 9 ilustra o Western Blot sobre sobrenadantes da transfecção de COS a partir do constructo RSLV 125-129 (SEQ ID NOs: 208-217);
[0043] A figura 10 ilustra a análise SRED comparando as alíquotas das proteínas purificadas de proteína a partir dos sobrenadantes Cos transfectados RSLV;
[0044] A figura 11a-c ilustra os resultados de uma análise de atividade de nuclease DNase realizada na proteína da proteína purificada a partir dos sobrenadantes COS7 transfectados com plasmídeos de fusão RSLV;
[0045] A figura 12 ilustra o RFU (unidades de fluorescência relativa) como uma função do tempo para cada proteína;
[0046] A figura 13 ilustra um ponto Lineweaver Burk de moléculas diferentes testadas;
[0047] A figura 14 ilustra os dados do gráfico de citotoxicidade em porcentagem de células mortas como uma função de concentração da proteína de fusão para moléculas RNaseIg com um alelo-selvagem ou o domínio Fc mutante;
[0048] A figura 15 ilustra o histograma do revestimento de THP-1 das células coradas após 72 horas;
[0049] A figura 16 ilustra a capacidade de RSLV-132 para inibir a produção de interferon-α induzida pelos complexos imunes de pacientes SLE;
[0050] A figura 17 ilustra a capacidade in vivo de RSLV- 132 para inibir a produção de interferon-α induzida pelo RNA;
[0051] A figura 18 ilustra uma avaliação da atividade enzimática RNAse de dois pontos de produções de RSLV-132 tendo sido armazenado por até 8 semanas a 4°C, comparado ao da RNase alelo-selvagem e RSLV-124;
[0052] A figura 19 ilustra uma avaliação da atividade enzimática RNase de RSLV-133, RSLV-123 e RSLV-124 em relação ao da RNase A como medida em RFUs durante o tempo;
[0053] A figura 20 ilustra uma avaliação da atividade enzimática da DNase de RSLV-133, e RSLV-123 em relação ao da DNase 1 como medida em RFUs durante o tempo;
[0054] A figura 21 ilustra o resultados de um experimento de digestão em gel comparando com a capacidade de RSLV-133 para digerir o DNA em relação RSLV-123 e o DNase 1 alelo- selvagem; e
[0055] A figura 22 ilustra a ligação de RSLV-124 e RSLV- 132 ao receptor Fc influenciando as células THP1 através da análise FACS da medida da intensidade de fluorescência média.
Descrição detalhada
[0056] O lupus sistêmico eritematoso (SLE) é uma doença autoimune multi-sistêmica caracterizada pela presença de alta titulação de auto-anticorpos dirigidos contra as auto- nucleoproteínas. Existe uma forte evidência de que a liberação defeituosa ou o processamento de células mortas ou células morrendo em SLE conduz a doença, predominantemente através do acúmulo de ribonucleoproteínas ribo- e deoxi- (abreviado nucleoproteínas). As nucleoproteínas causam danos através de três mecanismos: (i) ativação do sistema imune inato para produzir citocinas inflamatórias; (ii) serve como ant'gieno para gerar os complexos imunes circulatórios; e (iii) serve como antígenos para produzir a formação do complexo in situ nos sítios locais tais como o rim. A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, sobre a descoberta que a digestão dos ácidos nucléicos extracelulares tem um efeito terapêutico in vivo.
[0057] Consequentemente, a presente invenção provê métodos para tratamento das doenças caracterizadas pela liberação defeituosa ou processamento de células apoptóticas e resíduos celulares, tal como SLE, através da administração de uma quantidade efetiva de uma atividade nuclease para degradar o RNA e DNA extracelular contendo complexos. Os referidos tratamentos pode inibir aprodução de interferon Tipo I (IFNs) que são citocinas predominante em SLE e são fortemente correlacionados com a atividade da doença e nefrite.
[0058] Em uma concretização, um indivíduo é tratado através da administração de uma atividade de nuclease que é uma atividade de DNase ou uma RNase, preferivelmente, na forma de uma molécula de nuclease híbrida. Em um aspecto, a atividade de nuclease é um primeiro domínio de nuclease. Em um outro aspecto, o domínio de nuclease é acoplado a um domínio Fc modificado tal que a molécula tem citotoxicidade reduzida. Em um aspecto, uma molécula de nuclease híbrida inclui um segundo domínio de nuclease.
[0059] Em um outro aspecto, um método de tratamento de SLE é provido no qual uma quantidade efetiva de uma composição contendo nuclease é administrada a um indivíduo. Em um aspecto, o tratamento resulta na degradação de complexos imunes contendo RNA, DNA ou ambos RNA e DNA. Em um outro aspecto, o tratamento resulta na inibição de interferon tipo I, tal como interferon-α em um indivíduo. Em um aspecto, um método para tratamento de um indivíduo compreendendo a administração de uma quantidade efetiva de uma composição de uma molécula de nuclease híbrida compreendendo uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NOs: 62, 64, 66, 68, 70, 78, 80, 82, 84, 86, 92, 94, 96 ou 98. Em um outro aspecto, a composição é uma molécula de nuclease híbrida compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO:96 ou 98.
[0060] Os termos utilizado nas reivindicações e especificações são definidas como representado abaixo a menos que de outro modo especificado. No caso, o conflito dirigido com um termo utilizado em um pedido de patente provisório, o termo utilizado nos exemplos do relatório de ser controlado.
[0061] “Aminoácidos” se referem aos aminoácidos de ocorrência natural e aminoácidos sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de uma maneira similar a dos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, e O-fosfoserina. Os análogos de aminoácidos se referem aos compostos que tem a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, ou seja, um carbono α que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, sulfônio de metil metionina. Os referidos análogos têm o grupo R modificado (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais de peptídeo modificado, mas retém a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. Os miméticos de aminoácidos se referem aos compostos químicos que tem uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural.
[0062] Os aminoácidos podem ser referidos aqui tanto por suas três letras símbolos comumente conhecidas quanto por uma letra símbolo recomendada pela IUPAC-IUB da Comissão de Nomenclatura Bioquímica (“IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commision”). Os nucleotídeos, igualmente, podem ser referidos por seus códigos de única letra comumente aceitos.
[0063] Uma “substituição de aminoácido” se refere à substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido existente em uma sequência de aminoácido predeterminada (uma sequência de aminoácidos de um polipeptídio inicial) com um segundo, resíduo de aminoácido de “substituição” diferente. Uma “inserção de aminoácido” se refere à incorporação de pelo menos um aminoácido adicional dentro de uma sequência de aminoácidos predeterminada. Embora a inserção consista usualmente na inserção de um ou dois resíduos de aminoácidos, as atuais “inserções de peptídeo” maiores, podem ser feitas, por exemplo, de inserção de cerca de três a cerca de cinco ou mesmo até cerca de dez, quinze, ou vinte resíduos de aminoácidos. Os resíduos inseridos podem ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural como descrito acima. Uma “deleção de aminoácido” se refere à remoção de pelo menos um resíduo de aminoácido a partir de uma sequência de aminoácidos predeterminados.
[0064] “Polipeptídio”, “peptídeo”, e “proteína” são utilizados intercaladamente aqui para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicados aos polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais dos resíduos de aminoácidos é um mimético químico artificial de um aminoácido de um correspondente de ocorrência natural, bem como polímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímero de aminoácido de ocorrência não-natural.
[0065] O “ácido nucleico” se refere à desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos tanto na forma de fita simples quanto fita dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que tem propriedades de ligação similares as do ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que de outro modo indicado, uma sequência de ácido nucleico particular também implicitamente abrange as variantes conservativamente modificadas dos mesmos (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências de complementação e bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições do códon de degeneração podem ser conseguidas pelas sequências geradoras nas quais a terceira posição de um ou mais dos códons selecionados (ou todos) é substituídas com resíduos de desoxinosina ou de base mista (Batzer et al., “Nucleic Acid Res.”, 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608, 1985); e Cassol et al., 1992; Rossolini et al., “Mol. Cell. Probes”, 8:91-98, 1994). Para arginina e leucina, modificações na segunda base pode também ser conservativa. O termo ácido nucleico é utilizado intercaladamente com o gene, cDNA, e mRNa codificado por um gene.
[0066] Os polinucleotídios da presente invenção podem ser compostos de qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, os quais podem ser RNA ou DNA não modificados ou RNA ou DNA modificados. Por exemplo, os polinucleotídios podem ser compostos de DNA de fitas únicas ou de fitas duplas que é uma mistura de regiões de fitas simples e fitas duplas, RNA de fitas simples e fitas duplas, e RNA que é uma mistura de regiões de fita simples e fita dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser simples ou duplos ou, mais tipicamente, fita dupla ou uma mistura de regiões de fitas simples e fitas duplas. Adicionalmente, o polinucleotídio pode ser composto de regiões de fitas triplas compreendendo RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. Um polinucleotídio pode também conter um ou mais bases modificadas ou cadeias principais de DNA ou RNA modificadas para estabilidade ou por outras razões. As bases “modificadas” incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases não usuais tais como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita para DNA e RNA; assim, “polinucleotídio” abrange as formas modificadas quimicamente, enzimaticamente, ou metabolicamente.
[0067] Como utilizado aqui, o termo “molécula de nuclease híbrida” se refere aos polinucleotídios ou polipeptídios que compreendem pelo menos um domínio de nuclease e pelo menos um domínio Fc. As moléculas de nuclease híbrida são também referidas como proteínas de fusão e genes de fusão. Por exemplo, em uma concretização, uma molécula de nuclease híbrida pode ser um polipeptídio compreendendo pelo menos um domínio Fc ligado a um domínio de nuclease tal como DNase e/ou RNase. Como um outro exemplo, uma molécula de nuclease híbrida pode incluir um domínio de nuclease de RNase, um domínio de ligação, e um domínio Fc. Exemplos de moléculas de nuclease híbridas incluem SEQ ID NO: 62, 64, 66, 68, 70, 78, 80, 82, 84, 86, 92, 96 e 98. Outros exemplos são descritos em maiores detalhes a seguir. Em uma concretização, uma molécula de nuclease híbrida da invenção pode incluir modificações adicionais. Em uma outra concretização, uma molécula de nuclease híbrida pode ser modificada por adição de uma porção funcional (por exemplo, PEG, um fármaco, ou um marcador).
[0068] Como utilizado aqui, uma “molécula de nuclease biespecífica híbrida”, ou “molécula de binuclease” se refere a uma molécula de nuclease híbrida com 2 ou mais domínios de nuclease, por exemplo, um domínio DNase e um domínio RNase.
[0069] Em determinados aspectos, as moléculas de nuclease híbrida da invenção podem empregar um ou mais “domínios de ligação”, tais como ligantes de peptídeos. Como utilizado aqui, o termo “domínio de ligação” se refere a uma sequência que conecta dois ou mais domínios em uma sequência linear. Como utilizado aqui, o termo “ligante de polipeptídio” se refere a uma sequência de peptídeo ou polipeptídio (por exemplo, uma sequência de peptídeo ou de polipeptídio sintética) que se conecta a dois ou mais domínios em uma sequência de aminoácidos linear de uma cadeia de polipeptídio. Por exemplo, os ligantes de polipeptídio podem ser utilizados a conectar um domínio de nuclease a um domínio Fc. Preferivelmente, tal ligante de polipeptídio pode prover flexibilidade à molécula de polipeptídio. Em determinadas concretizações o ligante de polipeptídio é utilizado para conectar (por exemplo, fundir geneticamente) um ou mais domínios Fc e/ou um ou mais domínios de nuclease. Uma molécula de nuclease híbrida da invenção pode compreender mais do que um domínio de ligação ou um ligante de peptídeo.
[0070] Como utilizado aqui, o termo “ligante de polipeptídio gli-ser” se refere a um peptídeo que consiste de glicina e resíduos de serina. Um ligante de polipeptídio gli/ser exemplificativo compreende a sequência de aminoácidos Ser(Gli4Ser)n. Em uma concretização, n=1. Em uma concretização, n=2. Em uma outra concretização, n=3, ou seja, Ser(Gli4Ser)3). Em uma outra concretização, n=4, ou seja, Ser(Gli4Ser)4. Ainda em uma outra concretização, n=5. Ainda em uma outra concretização, n=6. Em uma outra concretização, n=7. Ainda em uma outra concretização, n=8. Em uma outra concretização, n=9. Ainda uma outra concretização, n=10. Um outro exemplo de ligante de polipeptídio gli/ser compreende a sequência de aminoácido Ser(Gli4Ser)n. Em uma concretização, n=1. Em uma outra concretização, n=2. Em uma concretização preferida, n=3. Em uma outra concretização, n=4. Em uma outra concretização, n=5. Ainda em uma outra concretização, n=6.
[0071] Como utilizado aqui, os termos “ligados”, “fundidos”, ou “fusão”, são utilizados intercaladamente. Estes termos se referem a ligação junta de dois ou mais elementos ou componentes ou domínios, através de qualquer meio incluindo conjugação química ou meios recombinantes. Métodos de conjugação química (por exemplo, usando agentes de reticulação hetero-bifuncionais) são conhecidos no estado da técnica.
[0072] Como utilizado aqui, o termo “região Fc” deve ser definido como a porção de uma imunoglobulina nativa formada pelos respectivos domínios Fc (ou porções Fc) de suas duas cadeias pesadas.
[0073] Como utilizado aqui, o termo “domínio Fc” se refere a uma porção de uma cadeia pesada de imunoglobulina simples (Ig), onde o domínio Fc não compreende um domínio Fv. Como tal, o domínio Fc pode também ser referido como “Ig” ou “IgG”. Em algumas concretizações, um domínio Fc começando na região de articulação logo a montante do sítio de clivagem da papaína e terminando no C-terminal do anticorpo. Consequentemente, um domínio Fc completo compreende pelo menos um domínio de articulação, um domínio CH2, e um domínio CH3. Em determinadas concretizações, um domínio Fc compreende pelo menos um de: um domínio de articulação (por exemplo, região superior, região mediana, e/ou região de articulação inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, um domínio CH4, ou uma porção variante, ou fragmento do mesmo. Em outras concretizações, um domínio Fc compreende um domínio Fc completo (ou seja, um domínio de articulação, um domínio CH2, e um domínio CH3). Em uma concretização, um domínio Fc compreende um domínio de articulação (ou porção do mesmo) fundida a um domínio CH3 (ou porção do mesmo). Em uma concretização, um domínio Fc compreende um domínio CH2 (ou porção do mesmo) fundido a um domínio CH3 (ou porção do mesmo). Em uma outra concretização, um domínio Fc consiste de um domínio CH3 ou porção do mesmo. Em uma outra concretização, um domínio Fc consiste de um domínio de articulação (ou porção do mesmo) e um domínio CH3 (ou porção do mesmo). Em uma outra concretização, um domínio Fc consiste de um domínio CH2 (ou porção do mesmo) e um domínio CH3. Em uma outra concretização, um domínio Fc consiste de um domínio de articulação (ou porção do mesmo) e um domínio CH2 (ou porção do mesmo). Em uma concretização, um domínio Fc perde pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Em uma concretização, um domínio Fc da invenção compreende pelo menos a porção de uma molécula Fc conhecida da técnica a ser requerida para a ligação FcRn. Em uma outra concretização, um domínio Fc da presente invenção compreende pelo menos a porção de uma molécula Fc conhecida do estado da técnica a ser requerida para a ligação FcYR. Em uma concretização, um domínio Fc da invenção compreende pelo menos a porção de uma molécula Fc conhecida do estado da técnica a ser requerida para a ligação da proteína A. Em uma concretização, um domínio Fc da invenção compreende pelo menos a porção de uma molécula Fc conhecida do estado da técnica que será requerida para a ligação da proteína G. Um domínio Fc aqui se refere, geralmente, a um polipeptídio compreendendo todo ou parte do domínio Fc de uma cadeia pesada da imunoglobulina. Isto inclui, mas não está limitada a polipeptídios compreendendo o CH1 inteiro, articulação, CH2, e/ou domínios, bem como fragmentos dos referidos peptídeos compreendendo apenas, por exemplo, a articulação, domínios CH2, e CH3. O domínio Fc pode ser derivado a partir de uma imunoglobulina de qualquer espécie e/ou qualquer subtipo, incluindo, mas não limitado a, um anticorpo de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM humana. O domínio Fc abrange as moléculas variantes Fc e Fc nativas. Quando com as variantes Fc e Fc nativas, o termo domínio Fc inclui as moléculas na forma monomérica ou multimérica, se digerida a partir de todo o anticorpo ou produzida por outros meios. A cessão de números de resíduos de aminoácidos para um domínio Fc está de acordo com as definições de Kabat. Ver, por exemplo, “Sequences of Proteíns of Immunological Interest” (Tabela de conteúdo, introdução e seções de sequências de região constante), 5a Edição, Bethesda, MD:NIH volume 1:647723 (1991); Kabat et al., “Introduction”, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Dept. of Health and Human Services, NIH, 5a edição, Bethesda, MD volume 1; xiii- xcvi (1991); Chothia & Lesk, “J. Mol. Biol.”, 196:901-917 (1987); Chothia et al., “Nature” 342:878-883 (1989), cada um dos quais é aqui incorporado por referência pra todos os propósitos.
[0074] Como representado aqui, deve ser entendido por um técnico no assunto que qualquer domínio Fc pode ser modificado de modo que varie na sequência de aminoácido a partir do domínio Fc nativo de uma molécula de imunoglobulina de ocorrência natural. Em determinadas concretizações exemplificativas, o domínio Fc retém uma função efetora (por exemplo, ligação FcYR) .
[0075] Os domínios Fc de um polipeptídio da invenção podem ser derivados de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, um domínio Fc de um polipeptídio pode compreender um domínio CH2 e/ou CH3 derivado de uma molécula IgG1 e uma região de articulação derivada de uma molécula IgG3. Em um outro exemplo, um domínio Fc pode compreender uma região de articulação quimérica derivada, em parte, a partir de uma molécula IgG1 e, em parte, de uma molécula IgG3. Em um outro exemplo, um domínio Fc pode compreender um derivado articulado quimérico, em parte, a partir de uma molécula IgG1 e, em parte, a partir de uma molécula IgG4.
[0076] Uma sequência de polipeptídio ou de aminoácido “derivado de” um polipeptídio designado ou proteína se refere a origem do polipeptídio. Preferivelmente, o polipeptídio ou sequência de aminoácidos que é derivado de uma sequência particular tem uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntico àquela sequência ou uma porção do mesmo, sendo que a porção consiste de pelo menos 10-20 aminoácidos, preferivelmente, pelo menos 20-30 aminoácidos, mais preferivelmente, pelo menos 30-50 aminoácidos, ou que é de outro modo identificável para um técnico no assunto como tendo sua origem na sequência.
[0077] Os polipeptídios derivados de um outro peptídeo pode ter um ou mais mutações relativas ao polipeptídio inicial, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos que foram substituídos com um outro resíduo de aminoácidos ou que tem uma ou mais inserções ou deleções de resíduos de aminoácidos.
[0078] Um polipeptídio pode compreender uma sequência de aminoácidos que não é de ocorrência natural. As referidas variantes têm necessariamente, menos que 100% de identidade de sequência ou similaridade com as moléculas de nuclease híbridas iniciais. Em uma concretização preferida, a variante terá uma sequência de aminoácido de cerca de 75% a menos que 100% de identidade da sequência de aminoácidos ou similaridade com a sequência de aminoácidos do polipeptídio inicial, mais preferivelmente, de cerca de 80% a menos que 100%, mais preferivelmente, de cerca de 85% a menos que 100%, mais preferivelmente, de cerca de 90% a menos que 100% (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) e mais preferivelmente de cerca de 95% a menos que 100%, por exemplo, sobre o comprimento da molécula variante.
[0079] Em uma concretização, existe uma diferença de aminoácidos entre uma sequência de polipeptídio inicial e a sequência derivada do mesmo. A identidade ou similaridade com relação a esta sequência é definida aqui como a porcentagem dos resíduos de aminoácidos nas sequências candidatas que são idênticas (ou seja, o mesmo resíduo) com os resíduos de aminoácidos iniciais, após o alinhamento das sequências e a introdução de intervalos, se necessário, para conseguir a porcentagem máxima de identidade de sequência.
[0080] Em uma concretização, um polipeptídio da invenção consiste de, consiste essencialmente de, ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada da tabela 1 e variantes funcionalmente ativas da mesma. Em uma concretização, um polipeptídio inclui uma sequência de aminoácido pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas a uma sequência de aminoácidos representada na Tabela 1. Em uma concretização, um polipeptídio inclui uma sequência de aminoácido contínua pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade a uma sequência de aminoácidos contínuos representada na Tabela 1. Em uma concretização, um polipeptídio inclui uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, ou 500 (ou qualquer número inteiro dentro destes números) aminoácidos contínuos de uma sequência de aminoácido representado na Tabela 1.
[0081] Em uma concretização, os peptídeos da invenção são codificados por uma sequência de nucleotídeos. As sequências de nucleotídeos da invenção podem ser úteis para um número de aplicações, incluindo, clonagem, terapia gênica, expressão de proteína e purificação, introdução de mutação, vacinação de DNA de um hospedeiro necessitando da mesma, geração de anticorpo por, por exemplo, imunização passiva, PCR, primer e geração sonda, desenho de siRNA e geração (ver, por exemplo, website de Dharmacon siDesign), e do gênero. Em uma concretização, a sequência de nucleotídeo da invenção compreende, consiste de, ou consiste essencialmente de, uma sequência de nucleotídeo selecionado da Tabela 1. Em uma concretização, uma sequência de nucleotídeos inclui uma sequência de nucleotídeos pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade para uma sequência de nucleotídeo representada na Tabela 1. Em uma concretização, uma sequência de nucleotídeos inclui uma sequência de nucleotídeos contínuos pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeo representada na Tabela 1. Em uma concretização, uma sequência de nucleotídeos inclui uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, ou 500 (ou qualquer número inteiro dentro destes números) aminoácidos contínuos de uma sequência de aminoácido representado na Tabela 1.
[0082] As moléculas de nuclease híbridas preferidas da invenção compreende uma sequência (por exemplo, pelo menos um domínio Fc) derivada de uma sequência de imunoglobulina humana. Entretanto, as sequências pode compreender um ou mais sequências de uma outra espécie de mamíferos. Por exemplo, um domínio Fc de primata ou domínio de nuclease pode ser incluído na sequência objeto. Alternativamente, um ou mais aminoácidos murino podem estar presentes em um polipeptídio. Em algumas concretizações, as sequências de polipeptídios da invenção não são imunogênicas e/ou tem imunogenicidade reduzida.
[0083] Deve ser também entendido por um técnico no assunto que as moléculas de nuclease híbridas da invenção podem ser alteradas de modo que elas variem na sequência de sequências de ocorrência natural ou sequências nativas das quais eles foram derivadas, embora retenham a atividade desejada das sequências nativas. Por exemplo, as substituições de nucleotídeos ou aminoácidos conduzindo as substituições conservativas ou mudanças em resíduos de aminoácidos “não essenciais” podem ser feitas. Uma molécula de ácido nucleico isolada codificante de uma variante não-natural de uma molécula de nuclease híbrida derivada de uma imunoglobulina (por exemplo, um domínio Fc) pode ser criada pela introdução de um ou mais substituições de nucleotídeos, adições ou deleções dentro da sequência de nucleotídeos de imunoglobulinas de modo que um ou mais substituições aminoácidos, adições ou deleções são introduzidas dentro das proteínas codificadas. As mutações podem ser introduzidas por técnicas padrões, tais como mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR.
[0084] As moléculas de nuclease híbridas de peptídeos da invenção podem compreender substituições de aminoácidos conservativos em um ou mais resíduos de aminoácidos, por exemplo, em resíduos de aminoácidos essenciais e não- essenciais. Uma “substituição de aminoácido conservativo” é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas no estado da técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histadina).
[0085] Assim, um resíduo de aminoácido não essencial em um polipeptídio de ligação é preferivelmente, substituída com um outro resíduo de aminoácidos a partir da mesma família da cadeia lateral. Em uma outra concretização, uma série de aminoácidos pode ser substituído com uma série estruturalmente similar que difere de modo a e/ou a composição dos membros da família da cadeia lateral. Alternativamente, em uma outra concretização, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma sequência codificante, tal como, saturação por mutagênese, e os mutantes resultantes podem ser incorporados dentro de ligantes de polipeptídios da invenção e classificados por suas habilidades de ligação ao alvo desejado.
[0086] O termo “melhora” se refere a qualquer resultado terapeuticamente benéfico no tratamento de um estado de doença, por exemplo, um estado de doença autoimune (por exemplo, SLE), incluindo profilaxia, redução na severidade ou progressão, remissão, ou cura da mesma.
[0087] O termo “in situ” se refere aos processos que ocorrem em uma célula viva crescendo separada de um organismo vivo, por exemplo, crescendo em cultura de tecido.
[0088] O termo “in vivo” se refere aos processos que ocorrem em um organismo vivo.
[0089] O termo “mamífero” ou “indivíduo” ou “paciente” como utilizado aqui inclui ambos, humanos e não-humanos e inclui, mas não está limitado a humanos, primatas não- humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos, e suínos (“porcines”).
[0090] O termo porcentagem de “identidade”, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídios, se refere a dois ou mais sequências ou subsequências que tem uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são os mesmos, quando comparados e alinhados para correspondência máxima, quando medido usando um dos algoritmos de comparação da sequência descritos abaixo (por exemplo, BLASTP e BLASTN ou outros algoritmos disponíveis aos técnicos no assunto) ou por inspeção visual. Dependendo da aplicação, a porcentagem de “identidade” pode existir sobre uma região da sequência sendo comparada, por exemplo, sobre o domínio funcional, ou alternativamente, existe sobre o comprimento completo das duas sequências a ser comparada.
[0091] Para comparação da sequência, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência a qual a sequência de teste é comparada. Quando do uso de um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são introduzidas em um computador, as coordenadas das subsequências são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa algoritmo da sequência são designados. O algoritmo de comparação da sequência então calcula a porcentagem de identidade de sequência para a sequência de teste relativa à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designado.
[0092] O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, através do algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, “Adv. Appl. Math.”, 2, 482(1981), através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch., “J. Mol. Biol.”, 48: 443 (1970), através da busca por métodos de similaridade de Pearson & Lipman, “Proc. Nat’l. Acad. Sci.”, USA 85: 2444 (1988), através da implementação computadorizada destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no pacote “Wisconsin Genetics Software”, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, Wis), ou através de inspeção visual (ver geralmente, Ausubel et al., infra).
[0093] Um exemplo de um algoritmo que é apropriado para determinação da porcentagem da identidade de sequência e similaridade da sequência é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et al., “J. Mol. Biol.”, 215:403-410 (1990). O Software para desempenho da análise BLAST está publicamente disponível através do website da “National Center for Biotechnology Information”.
[0094] O termo “quantidade suficiente” significa uma quantidade suficiente para produzir um efeito desejado, por exemplo, uma quantidade suficiente para modular a agregação da proteína em uma célula.
[0095] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade que é eficaz para melhorar um sintoma de uma doença. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma “quantidade profilaticamente eficaz” quando a profilaxia pode ser considerada terapia.
[0096] Deve ser observado que, como utilizado no pedido de patente e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o(a)” incluem referência em plural a menos que o contexto dite claramente o contrário.
Composições: Moléculas de nuclease híbridas:
[0097] Em algumas concretizações, uma composição da presente invenção inclui uma molécula de nuclease híbrida. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida inclui um domínio de nuclease operativamente ligado a um domínio Fc. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida inclui um domínio de nuclease ligado a um domínio Fc. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida é uma proteína de nuclease. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida é um polinucleotídio de nuclease.
[0098] Em algumas concretizações, o domínio de nuclease está ligado ao domínio Fc via um domínio de ligação. Em algumas concretizações, o domínio de ligação é um peptídeo ligante. Em algumas concretizações, o domínio de ligação é um nucleotídeo ligante. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida inclui uma molécula líder, por exemplo, um peptídeo líder. Em algumas concretizações, a molécula líder é um peptídeo líder posicionado no N-terminal do domínio de nuclease. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida da invenção compreende um peptídeo líder no terminal- N da molécula, onde o peptídeo líder é mais tarde clivado a partir da molécula de nuclease híbrida.
[0099] Os métodos para produção de sequências de nucleotídeos codificante de um peptídeo líder fundida a uma proteína recombinante são bem conhecidos do estado da técnica. Em uma concretização, qualquer uma das moléculas de nuclease híbrida da presente invenção pode ser expressa tanto com quanto sem um líder fundido ao seu terminal-N. A sequência da proteína de uma molécula de nuclease híbrida da presente invenção segue a clivagem de um peptídeo líder fundida pode ser previsível e/ou deduzida por um técnico no assunto. Exemplos de moléculas de nuclease híbridas da presente invenção incluem, adicionalmente, um peptídeo líder VK3 (VK3LP), onde o peptídeo líder é fundido ao terminal N da molécula de nuclease híbrida, são representados na SEQ ID NOs: 93 (RSLV-132) e 94 (RSLV-133). As sequências de nucleotídeos correspondentes são representadas nas SEQ ID NOs: 91 e 93, respectivamente. Em concretizações, após a clivagem do VK3 líder, estas moléculas de nuclease híbrida têm as sequências como representadas nas SEQ ID NOS: 96 (RSLV-132) e 98 (RSLV-133), respectivamente. As sequências de nucleotídeos correspondentes são representadas nas SEQ ID NOS: 95 e 97, respectivamente. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida, da presente invenção, é expressa sem um peptídeo líder fundido ao seu terminal-N, e a molécula de nuclease híbrida resultante tem uma metionina no terminal-N.
[0100] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida irá incluir um códon de parada. Em algumas concretizações, o códon de parada será no terminal-C do domínio Fc.
[0101] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida inclui ainda um segundo domínio de nuclease. Em algumas concretizações, o segundo domínio de nuclease é ligado ao domínio Fc via um segundo domínio de ligação. Em algumas concretizações, o segundo domínio ligante será no terminal-C do domínio Fc. A figura 1 ilustra pelo menos uma concretização de uma molécula de nuclease híbrida. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida inclui uma sequência ilustrada na Tabela 1.
[0102] Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida é uma molécula de RNase ou uma molécula de DNase ou uma molécula de múltiplas enzimas (por exemplo, ambos RNase e Dnase ou duas nucleases RNA ou DNA com diferentes especificidades para substrato) ligada a um domínio Fc que se liga especificamente aos complexos imune extracelulares. Em algumas concretizações, o domínio Fc não se liga, efetivamente, aos receptores FcY. Em um aspecto, a molécula de nuclease híbrida não se liga efetivamente ao C1q. Em outros aspectos, a molécula de nuclease híbrida compreende uma na estrutura do domínio Fc a partir da IgG1. Em outro aspecto, a molécula de nuclease híbrida compreende ainda as mutações na articulação, nos domínios CH2, e/ou CH3. Em outro aspecto, as mutações são P238S, P331S, ou N297S, e pode incluir mutações em um ou mais das três articulações de cisteínas. Em algumas dos respectivos aspectos, as mutações em um ou mais das três articulações de cisteínas pode ser SCC ou SSS. Em outro aspecto, as moléculas contém a articulação SCC, mas são de outro modo alelo-selvagem para os domínios IgG1 Fc CH2 e CH3, e se liga efetivamente aos receptores Fc, facilitando o entendimento da molécula de nuclease híbrida em compartimento endocíticos de células para a qual eles são ligados. Em outro aspecto, a molécula tem atividade contra substratos de RNA de fita dupla e/ou fita simples.
[0103] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida inclui um domínio Fc mutante. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida inclui um domínio IgG1 Fc mutante. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende um ou mais mutações na articulação dos domínios CH2 e/ou CH3. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui uma mutação P238S. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui uma mutação P331S. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui uma mutação P238S e uma mutação P331S. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e pode incluir mutações em um ou mais das três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e/ou uma ou mais mutações nas três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e/ou mutações nas três articulações de cisteínas para SSS ou em uma articulação de cisteína para SCC. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e P331S e mutações nas três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e P331S e tanto SCC ou SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e P331S e SCC. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui P238S e SSS. Em alguns aspectos, um domínio FC mutante inclui P331S e tanto SCC ou SSS. Em alguns aspectos, um domínio FC mutante inclui mutações em um ou mais das três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui mutações nas três articulações de cisteína. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui mutações nas três articulações de cisteínas para SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc inclui mutações em uma das três articulações de cisteína para SCC. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui SCC ou SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante é como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 59, 60, 7176, ou 87-90. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 62, 64, 66, 68, 70, 78, 80, 82, 84, 86, 92, 94, 96 ou 98. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio RNase 1 humana alelo-selvagem ligado a um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SCC, P238S, e P331S, ou um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SSS, P238S e P331S. Em alguns aspectos, uma sequência de ácido nucleico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é como mostrado na SEQ ID NO: 61,77, ou 91. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é mostrada na SEQ ID NO: 62, 78, 92, ou 96.
[0104] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio RNase 1 humana alelo-selvagem ligado via um domínio ligante (Gli4Ser)4 para um mutante, domínio IgG1 Fc humano compreendendo SCC, P238S, e P331 ou um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SSS, P238S, e P331S. Em alguns aspectos, uma sequência de ácido nucleico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NOs:63 OU 79. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NOS: 64, ou 80.
[0105] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio DNase G105R A114F humano ligado via um domínio ligante (Gli4Ser)4 para um mutante, domínio IgG1 Fc humano compreendendo SCC, P238S, e P331S ligado via um domínio ligante NLG para um domínio RNAse 1 humano alelo- selvagem. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio DNase 1 G105R A114F humano ligado via um domínio ligante (Gli4Ser)4 para um mutante, domínio IgG1 Fc humano compreendendo SSS, P238S, e P331S ligado via um domínio ligante NLG a um domínio RNase 1 humano alelo-selvagem. Em alguns aspectos, uma sequência de ácido nucleico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NOS: 65, ou 81. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NO: 66, ou 82.
[0106] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio RNase 1 humano alelo-selvagem ligado via um domínio ligante (Gli4Ser)4 a um mutante, domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SCC, P238S, e P331S ligado via um domínio ligante NLG para um domínio DNAse 1 G105R A114F humano. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio RNase 1 alelo-selvagem humano ligado via um domínio ligante (Gli4Ser)4 para um mutante, o domínio IgG1 Fc humano compreendendo SSS, P238S, e P331S ligado via um domínio ligante NLG para um domínio DNase 1 G105R A114F humano. Em alguns aspectos, uma sequência de ácido nucléico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NOS: 67, ou 83. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NOS: 68 ou 84.
[0107] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio RNAse 1 humano alelo-selvagem ligado para um mutante, domínio IgG1 Fc humano compreendendo SCc, P238S, e P331S ligado via um domínio NLG ligante para um domínio DMNase 1 G105R A114F humano. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida compreende um domínio RNAse 1 humano alelo-selvagem ligado a um domínio IgG1 Fc humano mutante compreendendo SSS, P238S, e P331S ligado via um domínio NLG ligante para um domínio DNAse 1 G105R A114F humano. Em alguns aspectos, uma sequência de ácido nucleico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NOS: 69, 85 ou 93. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NOS: 70, 86, 94 ou 98.
[0108] Em alguns aspectos, a atividade da molécula de nuclease híbrida é detectável in vitro e/ou in vivo. Em alguns aspectos, a molécula de nuclease híbrida se liga a uma célula, uma célula maligna, ou a uma célula de câncer e interfere com sua atividade biológica.
[0109] Em um outro aspecto, uma molécula RNase multifuncional é provida de modo que é ligada a uma outra enzima ou a um anticorpo tendo especificidade de ligação, tal como um scFv alvo para RNA ou um segundo domínio de nuclease com as mesmas especificidades ou com especificidades diferentes como o primeiro domínio.
[0110] Em um outro aspecto, uma molécula DNase multifuncional é provida de modo que seja ligado a uma outra enzima ou anticorpo tendo especificidade de ligação, tal como um scFv alvo para o DNA ou para um segundo domínio de nuclease com a mesma especificidade ou uma especificidade diferente como a do primeiro domínio.
[0111] Em um outro aspecto, uma molécula de nuclease híbrida é adaptada para prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio em um mamífero através da administração de uma molécula de nuclease híbrida ligada a uma região Fc, em uma quantidade terapeuticamente efetiva para o mamífero necessitando do mesmo, onde a doença é prevenida ou tratada. Em outro aspecto, a doença ou distúrbio é uma doença autoimune ou câncer. Em alguns dos referidos aspectos, a doença autoimune é diabetes mielitus dependente de insulina, esclerose múltipla, encefalomielites autoimune experimental, artrite reumatoide, artrite autoimune experimental, miastenia grave, tiroidite, uma forma experimental de uveoretinite, tireoidite de Hashimoto, mixoedema primário, tirotoxicose, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, doença de Addison, menopausa prematura, infertilidade masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, Pemphigus vulgaris, penfigoide, oftalmia simpatética, uveite facogênica, anemia hemolítica autoimune, leucopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite crônica ativa Hbs-ve, cirrose criptogênica, colite ulcerativa, síndrome de Sjogren, escleroderma, granulomatose de Wegener, polimiosite, dermatomiosite, LE discoide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), e doença de tecido conectivo.
[0112] Em algumas concretizações, os alvos para a atividade enzimática RNase das moléculas de nuclease híbrida RNase são primariamente extracelulares, consistindo de, por exemplo, RNA contido nos complexos imunes com auto-anticorpo anti-RNAP e RNA expresso nas superfícies das células passando por apoptose. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida RNAse é ativa no meio ácido das vesículas endocítica. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease RNase híbrida inclui um domínio Fc (wt) alelo- selvagem de modo a, por exemplo, permitir a molécula para se ligar FcR e entrar no compartimento endocítico através da entrada na rota utilizada pelos complexos imunes. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida RNase incluindo um domínio Fc wt é adaptada para ser ativa em ambos, extracelularmente e no meio endocítico (onde TLR7 pode ser expresso). Em alguns aspectos, isto permite uma molécula de nuclease RNase híbrida incluindo um domínio Fc wt para interromper TLR7 a sinalização através, previamente, engolfada pelo complexo imune ou pelo RNAs que ativa TLR7 após a infecção viral. Em algumas concretizações, o RNase wt de uma molécula de nuclease híbrida RNase não é resistente para inibição de um inibidor de RNAse citoplásmico RNAse. Em algumas concretizações, o RNAse wt de uma molécula de nuclease híbrida RNase não é ativa no citoplasma de uma célula.
[0113] Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida incluindo um domínio Fc wt é utilizada para a terapia de uma doença autoimune, por exemplo, SLE.
[0114] Em algumas concretizações, o domínio Fc de igação ao receptor Fc (FcR) é aumentado, por exemplo, via alterações de glicosilação e/ou mudanças na sequência de aminoácido. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida tem um ou mais alterações Fc que aumentam a ligação FcR.
[0115] Os caminhos alternativos para construir uma molécula de nuclease híbrida ligada a um domínio Fc são previstas. Em algumas concretizações, a orientação do domínio pode ser alterada para construir uma molécula Ig-RNase ou uma molécula Ig-DNase ou uma molécula Rnase-Ig ou uma molécula RNase-Ig que retém a ligação FcR e tem domínios de nuclease ativa.
[0116] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida DNase inclui um domínio Fc wt que pode permitir, por exemplo, as moléculas para transmitir endocitose após a ligação FcR. Em algumas concretizações, as moléculas de nuclease híbrida DNase pode ser ativa em relação aos complexos imunes extracelulares contendo DNA, por exemplo, tanto na forma solúvel quanto depositada como complexos insolúveis.
[0117] Em algumas concretizações, as moléculas de nucleases híbridas incluem ambos, DNase e RNase. Em algumas concretizações, estas moléculas de nuclease híbrida podem melhorar a terapia de SLE por eles poderem ser, por exemplo, complexos imune digestivos contendo RNa, DNas, ou uma combinação de ambos RNA e DNAs; e quando eles incluem ainda um domínio wt Fc, eles são ativos em ambos extracelularmente e no compartimento endocítico onde TLR7 e TLR9 pode ser localizado.
[0118] Em algumas concretizações, os domínios ligantes incuem (gli4ser) 3, 4, ou 5 variantes que alteram o comprimento do ligante através de 5 progressões de aminoácidos. Em outras concretizações, um domínio ligante é aproximadamente 18 aminoácidos no comprimento e incluem um sítio de glicosilação ligado ao N, que podem ser sensíveis para protease clivar in vivo. Em algumas concretizações, um sítio de glicosilação ligado ao N pode proteger as moléculas de nuclease híbrida a partir da clivagem no domínio ligante. Em algumas concretizações, um sítio de glicosilação ligado ao N pode assistir na separação das dobras dos domínios funcionais independentes separados através do domínio ligante.
[0119] Em algumas concretizações, as moléculas de nuclease híbrida pode incluir ambos os domínios IgG1 Fc mutante e/ou alelo-selvagem humano. Em algumas concretizações, as moléculas de nuclease híbrida podem ser expressas em ambas, nas transfecções estáveis CHO e COS transitórias. Em algumas concretizações, ambas a ligação CD80/86 e a atividade RNase são conservadas em uma molécula de nuclease híbrida. Em algumas concretizações, as moléculas de nuclease híbrida incluem os constructos DNase 1 L3-Ig-ligante-RNase. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida inclui um constructo DNAse 1-Ig-ligante-RNase ou um constructo RNase-Ig-ligante-DNase. Em algumas concretizações, as junções de fusão entre os domínios de enzima e os outros domínios da molécula de nuclease híbrida é otimizado.
[0120] Em algumas concretizações, as moléculas e nuclease híbrida incluem as moléculas de nuclease híbrida DNase-Ig e/ou as moléculas de nuclease híbrida DNase-RNase.
[0121] Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida inclui TREX1. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida TREX1 pode digerir cromatina. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida TREX1 é expressa por uma célula. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida expressa inclui TREX-1 de rato (“murine”) e um domínio Fc (wt ou mutante) de rato. Em algumas concretizações, um domínio ligante de aminoácido 2025 (aa) entre TREX1 e a articulação igG pode ser requerida para permitir a atividade DNase. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida com um domínio ligante 15 aa não é ativo. Em algumas concretizações, o uso dos domínios ligantes de aminoácidos 20 e 25 (mais 2 ou mais aminoácidos para incorporar os sítios de restrição) resultam na atividade funcional como medido por digestão de cromatina. Em algumas concretizações, uma região hidrofóbica de aproximadamente 72 aa pode ser removida a partir de COOH final e TREX-1 antes da fusão para o domínio Fc via o domínio ligante. Em algumas concretizações, um domínio ligante de 20 aminoácidos versão da molécula de nuclease híbrida apresentam altos níveis de expressão comparada aos controles e/ou outras moléculas de nuclease híbrida. Em algumas concretizações, a análise de enzima cinética é utilizada para comparar a atividade enzimática de moléculas de nuclease híbrida e controla de uma maneira quantitativa.
[0122] Em algumas concretizações, a otimização adicional da junção da fusão escolhida para truncado de uma enzima TREX1 pode ser utilizado para melhorar a expressão das moléculas de nuclease híbrida.
[0123] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida inclui uma molécula de nuclease híbrida do domínio TREX-1-ligante-Ig Fc com domínio ligante de 20 e/ou 25 aa. Em algumas concretizações, os domínios ligantes são variantes de um cassete (gli4ser) ou (gli4ser)5 com um ou mais sítios restrição ligado para incorporação dentro do constructo de moléculas de nuclease híbrida. Em algumas concretizações, devido à dimerização de cabeça a calda útil para a atividade enzimática TREX1; um domínio ligante maior flexível pode ser utilizado para facilitar a dobra adequada.
[0124] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida é uma molécula de nuclease híbrida TREX1-tandem. Em algumas concretizações, um método alternativo para facilitar a dobra cabeça-para-cauda de TREX1 é para gerar uma molécula de nuclease híbrida TREX1-TREX1-Ig que incorpora dois domínios TREX1 em tandem, seguido por um domínio ligante e um domínio Ig Fc. Em algumas concretizações, o posicionamento de cassetes TREX1 de uma maneira cabeça-para-cauda pode ser corrigida para dobra da cabeça-cauda tanto sobre o braço da imunoenzima e introduzir um domínio funcional TREX1 único dentro de cada braço da molécula. Em algumas concretizações, cada imunoenzima de uma molécula de nuclease híbrida tem duas enzimas TREX1 funcional ligada a um domínio IgG Fc único.
[0125] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida inclui TREXl-ligante 1-Ig-ligante 2-RNAse.
[0126] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida inclui RNase-Ig-ligante-TREX1. Em algumas concretizações, cassetes são derivados para ambos o amino e fusão carboxila de cada enzima para incorporação dentro das moléculas de nuclease híbrida onde a configuração da enzima é revertida. Em algumas concretizações, a enzima RNase apresenta comparável da atividade funcional com relação de sua posição nas moléculas de nuclease híbrida. Em algumas concretizações, a moléculas de nuclease híbrida alternativa pode ser designada para testar se uma configuração particular demonstra expressão melhorada e/ou função dos componentes da molécula de nuclease híbrida.
[0127] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida inclui 1L3-Ig. Em algumas concretizações, a 1L3 DNase é construída a partir de uma sequência de rato e expressa. Em algumas concretizações, a enzima é ativa. Em algumas concretizações, uma nuclease híbrida de 1L3 DNase-Ig-RNase de rato é construído e expresso. Em algumas concretizações, a molécula inclui 1L3-Ig humana, 1L3-Ig-RNase humana, e/ou RNAse-Ig-1L3 humano.
[0128] Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida inclui DNAse-1-Ig. Em algumas concretizações, um alelo variante de ocorrência natural, A114F, que permite a sensibilidade reduzida para actina é incluída em uma molécula de nuclease DNase 1-Ig híbrida. Em algumas concretizações, esta mutação é introduzida dentro de uma molécula de nuclease híbrida para gerar um derivado mais estável da DNase 1 humana. Em algumas concretizações, um DNase 1-ligante-Ig contendo um domínio ligante de 20 ou 25 aa é feito. Em algumas concretizações, umas moléculas de nuclease híbrida incluem RNase-Ig-ligante-DNase 1 onde o domínio DNase 1 é localizado no lado COOH do domínio Ig Fc. Em algumas concretizações, as moléculas de nuclease híbrida são feitas de modo que incorporem DNase 1 e incluam: DNase 1-ligante-Ig- ligante 2-RNase, e/ou RNase-Ig-ligante-DNase 1.
[0129] Um outro aspecto da presente invenção é para usar os métodos de terapia gênica para tratamento ou prevenção de distúrbios, doenças, e condições com uma ou m ais moléculas de nuclease híbrida. Os métodos de terapia do gene se referem à introdução das sequências de ácido nucleico da molécula de nuclease híbrida (DNA, RNA e DNA ou RNA anti-sentido) dentro de um animal para conseguir a expressão do polipeptídio ou polipeptídios da presente invenção. Este método pode incluir a introdução de um ou mais polinucleotídios codificante de um polipeptídio da molécula de nuclease híbrida da presente invenção ligado, operativamente, a um promotor e quaisquer outros elementos genéticos necessários para a expressão do polipeptídio pelo tecido alvo.
[0130] Nas aplicações da terapia de gene, os genes de molécula de nuclease híbrida são introduzidos dentro das células de modo a conseguir na síntese in vivo de um produto genético terapeuticamente efetivo. “A terapia de gene” inclui ambas as terapias de gene convencionais onde um efeito de duração é conseguido por um tratamento único, e a administração de agentes terapêutico de gene, que envolvem um tempo ou administração repetida de um DNA ou mRNA terapeuticamente efetiva. Os oligonucleotídeos podem ser modificados para aumentar sua absorção, por exemplo, por substituição de seus grupos fosfodiésteres carregados negativamente por grupos não carregados.
Domínios Fc:
[0131] Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida inclui um domínio Fc. Os domínios Fc não contém uma região variável que se liga a um antígeno. Nas concretizações, o domínio Fc não contém uma região variável. Os domínios Fc úteis para produção das moléculas de nuclease híbridas da presente invenção podem ser obtidos a partir de um número de fontes diferentes. Em uma concretização preferida, um domínio Fc da molécula de nuclease híbrida é derivado a partir de uma imunoglobulina humana. É entendido, entretanto, que o domínio Fc pode ser derivado a partir de uma imunoglobulina de uma outra espécie de mamíferos, incluindo, por exemplo, um roedor (por exemplo, um camundongo, rato, coelho, porquinho da índia) ou espécies de primata não-humano (por exemplo, chimpanzé, macacos). Além disso, o domínio Fc da molécula de nuclease híbrida ou porção do mesmo pode ser derivado a partir de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA, e IgE, e qualquer isotipo de imunoglobulina, incluindo IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Em uma concretização preferida, a IgG1 do isotipo humano é utilizada.
[0132] Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida inclui um domínio Fc mutante. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida inclui um domínio IgG1 Fc mutante. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende uma ou mais mutações na articulação, domínios CH2 e/ou CH3. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui uma mutação P238S. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui uma mutação P331S. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui uma mutação P238S e uma mutação P331S. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e pode incluir mutações em uma ou mais das três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e/ou um a ou mais mutações nas três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e/ou mutações em uma articulação de cisteína para SCC ou nas três articulações de cisteínas SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui P238S e P331S e mutações em pelo menos uma das três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante compreende P238s e P331S e SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui P238S e SCC ou SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui P331S e SCC ou SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui P331S e SCC ou SSS. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui mutações em uma ou mais das três articulações de cisteínas. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui mutações em uma das três articulações de cisteínas para SCC. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui SCC. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante inclui mutações nas três articulações de cisteínas para SSS. Em alguns aspectos, um domínio c mutante inclui SSS. Em alguns aspectos, uma sequência de ácido nucléico codificante de um domínio Fc mutante é mostrada nas SEQ ID NOS: 59, 71, 73, 75, 87, ou 89. Em alguns aspectos, um domínio Fc mutante é mostrado nas SEQ ID NOS: 60, 72,74, 76, 88, ou 90. Em alguns aspectos, uma sequência de ácido nucléico codificante de uma molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NOS: 61, 63, 65, 67,69, 77, 79, 81, 83, 85, 91, 93, 95 ou 97. Em alguns aspectos, uma molécula de nuclease híbrida é como mostrado nas SEQ ID NOS: 62, 64, 66, 68, 70, 78, 80, 82, 84, 86, 92, 96, ou 98.
[0133] Uma variedade das sequências de gene do domínio Fc (por exemplo, as sequências de gene da região constante humana) está disponível na forma de depósitos publicamente acessíveis. Os domínios da região constante compreendendo uma sequência do domínio Fc podem ser selecionados tendo uma função efetora particular (ou perda de uma função efetora particular) ou com uma modificação particular para reduzir a imunogenicidade. Muitas sequências de anticorpos e genes codificantes do anticorpo foram publicados e sequências do domínio Fc apropriadas (por exemplo, articulação, nas sequências CH2, e/ou CH3, ou porções dos mesmos) pode ser derivada destas sequências usando técnicas reconhecidas da técnica. O material genético obtido usando qualquer um dos métodos acima mencionados pode então ser alterado ou sintetizado para obter polipeptídios da presente invenção. Seria ainda apreciado que o escopo desta invenção abrange alelos, variantes e mutações das sequências de DNA da região constante.
[0134] As sequências do domínio Fc podem ser clonadas, por exemplo, usando a reação em cadeia de polimerase e primers que são selecionados para amplificar o domínio de interesse. Para clonar uma sequência de domínio Fc a partir de um anticorpo, o mRNa pode ser isolado a partir do hibridoma, baço, ou células linfáticas, transcrição reversa dentro do DNA, e genes do anticorpo amplificado por PCR. Os métodos de amplificação por PCR são descritos em detalhes nas patentes norte-americanas Nos.: US 4,683,195; US 4,683,202; US 4,800,159; US 4,965,188; e em, por exemplo, “Protocolos de PCR: Um Guia para Métodos e Aplicações” (“PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”), Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, Califórnia (1999); Ho et al., 1989. “Gene” 77:51; Horton et al., 1993. (“Methods Enzymol”, 217:270). O PCR pode ser iniciado pelos primers da região constante em consenso ou por primers mais específicos com base no DNA e nas sequências de aminoácidos de cadeia leve e de cadeia pesada publicada. Como discutidos acima, O PCR pode também ser utilizado para isolar os clones de DNA codificantes das cadeias leves e peadas do anticorpo. Neste caso, as bibliotecas podem ser classificadas pelos primers consenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas da região constante de camundongo. Os numerosos conjuntos de primers adequados para a amplificação dos genes do anticorpo são conhecidos do estado da técnica (por exemplo, primers 5’ baseados na sequência N-terminal dos anticorpos purificados (Benhar e Pastan. 1994. “Proteín Engineering”, 7:1509); amplificação rápida das extremidades do cDNA (Ruiberti, F. et al., 1994; “J. Immunol. Methods”, 173:33); sequências líderes do anticorpo (Larrick et al., 1989, “Biochem. Biophys. Res. Commun.”, 160: 1250). A clonagem das sequências do anticorpo é ainda descrita em Newman et al., patente norte-americana US 5,658,570, depositado em Janeiro 25, 1995, a qual é incorporada por referência aqui.
[0135] As moléculas de nuclease híbridas da invenção podem compreender um ou mais domínios Fc (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais domínios Fc). Em uma concretização, os domínios Fc podem ser de tipos diferentes. Em uma concretização, pelo menos um domínio Fc presente na molécula de nuclease híbrida compreende um domínio de articulação ou porção do mesmo. Em uma outra concretização, a molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc que compreende pelo menos um domínio CH2 ou porção do mesmo. Em uma outra concretização, a molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc que compreende pelo menos um domínio CH3 ou porção do mesmo. Em uma outra concretização, a molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc que compreende pelo menos um domínio CH4 ou porção do mesmo. Em uma outra concretização, a molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc que compreende pelo menos um domínio de articulação ou porção do mesmo e pelo menos um domínio CH2 ou porção do mesmo (por exemplo, na orientação articulação-CH2). Em uma outra concretização, a molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc que compreende pelo menos um domínio CH2 ou porção do mesmo e pelo menos um domínio CH3 ou porção do mesmo (por exemplo, na orientação CH2-CH3). Em uma outra concretização, a molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc compreendendo pelo menos um domínio de articulação ou porção do mesmo, pelo menos um domínio CH2 ou porção do mesmo, e pelo menos um domínio CH3 ou porção do mesmo, por exemplo, na orientação articulação-CH2-CH3, articulação-CH3-CH2, ou CH2-CH3-articulação.
[0136] Em determinadas concretizações, a molécula de nuclease híbrida compreende pelo menos uma região Fc completa derivada de um ou mais imunoglobulinas de cadeias pesadas (por exemplo, um domínio Fc incluindo, articulação, domínios CH2, e CH3, apesar destes necessitaram ser derivados do mesmo anticorpo). Em outra concretização, a molécula de nuclease híbrida compreende pelo menos dois domínios Fc completos derivados de um ou mais imunoglobulina de cadeias pesadas. Nas concretizações preferidas, o domínio Fc completo é derivado de um cadeia pesada de imunoglobulina de IgG humana (por exemplo, IgG1 humano).
[0137] Em uma outra concretização, uma molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc compreendendo um domínio CH3 completo. Em uma outra concretização, uma molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc compreendendo um domínio CH2 completo. Em uma outra concretização, uma molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc compreendendo pelo menos um domínio CH3, e pelo menos um domínio de uma região de articulação, e um domínio CH2. Em uma outra concretização, uma molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc compreendendo uma articulação e um domínio CH3. Em uma outra concretização, uma molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc compreendendo uma articulação, um domínio CH2, e um domínio CH3. Em uma concretização preferida, o domínio Fc é derivado de uma cadeia pesada de imunoglobulina de IgG humana (por exemplo, IgG1 humana).
[0138] Os domínios da região constante ou porções da mesma constituindo um domínio Fc de uma molécula de nuclease híbrida da invenção podem ser derivados de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, um polipeptídio da invenção pode compreender um domínio CH2 ou porção do mesmo derivada de uma molécula de IgG1 e uma região CH3 ou porção da mesma derivada de uma molécula de IgG3. Em um outro exemplo, uma molécula de nuclease híbrida pode compreender um domínio Fc compreendendo um domínio de articulação, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG3. Como representado aqui, deverá ser entendido por um técnico no assunto que um domínio Fc pode ser alterado de modo que variem na sequência de aminoácido de uma molécula de anticorpo de ocorrência natural.
[0139] Em uma outra concretização, uma molécula de nuclease híbrida da invenção compreende um ou mais domínios Fc truncados que são apesar de tudo suficientes para conferir as propriedades de ligação do receptor Fc (FcR) para a região Fc. Assim, um domínio Fc de uma molécula de nuclease híbrida da invenção pode compreender ou consistir de uma porção de ligação FcRn. As porções de ligação FcRn podem ser derivadas de cadeias pesadas de qualquer isotipo, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em uma concretização, uma porção de ligação FcRn de um anticorpo da IgG1 isotipo humano é utilizada. Em uma outra concretização, uma porção de ligação FcRn de um anticorpo da IgG4 isotipo humana é utilizada.
[0140] Em uma concretização, uma molécula de nuclease híbrida da invenção perde um ou mais domínios da região constante de uma região Fc completa, ou seja, elas são parcialmente ou inteiramente deletadas. Em uma certa concretização, as moléculas de nuclease híbridas da invenção irão perder um domínio CH2 inteiro (constructos ΔCH2). Os técnicos no assunto irão apreciar que tais constructos podem ser preferidos devido às propriedades regulatórias do domínio CH2 sobre a taxa catabólica do anticorpo. Em determinadas concretizações, as moléculas de nuclease híbridas da invenção compreendem regiões Fc deletadas do domínio CH2 derivado de um vetor (por exemplo, da IDEC Pharmaceuticals, San Diego) codificante de um domínio da região constante humana IgG1 (ver, por exemplo, WO 02/060955 A2 e WO 02/096948 A2). Este exemplo de vetor é construído para excluir o domínio CH2 e prover um vetor sintético expressando uma região constante da IgG1 deletada do domínio. Deverá ser observado que estes exemplos de constructos são preferivelmente construídos para fundir a ligação do domínio CH3 diretamente em uma região de articulação do respectivo domínio Fc.
[0141] Em outros constructos, pode ser desejável prover um peptídeo espaçador entre um ou mais constituintes do domínio Fc. Por exemplo, o peptídeo espaçador pode ser colocado entre uma região de articulação e um domínio CH2 e/ou entre um domínio CH2 e um domínio CH3. Por exemplo, constructos compatíveis podem ser expressos onde o domínio CH2 foi deletado e o domínio CH3 remanescente (sintético ou não sintético) é ligado à região de articulação com 1-20, 1-10 ou 1-5 peptídeos de aminoácidos espaçadores. O referido peptídeo espaçador pode ser adicionado, por exemplo, para garantir que os elementos regulatórios do domínio da região constante permaneçam livres e acessíveis ou que a região de articulação permaneça flexível. Preferivelmente, qualquer peptídeo de ligação compatível com a presente invenção será relativamente não imunogênico e não previne apropriadamente a dobra do Fc.
Mudanças para os aminoácidos Fc:
[0142] Em determinadas concretizações, um domínio Fc empregado em uma molécula de nuclease híbrida da invenção é alterado ou modificado, por exemplo, por mutação no aminoácido (por exemplo, adição, deleção, ou substituição). Como utilizado aqui, o termo “variante do domínio Fc” se refere a um domínio Fc tendo pelo menos uma modificação de aminoácido, tal como uma substituição de aminoácido, quando comparado ao Fc alelo-selvagem do qual o domínio Fc é derivado. Por exemplo, onde o domínio Fc é derivado de um anticorpo IgG1 humano, uma variante compreende pelo menos uma mutação de aminoácido (por exemplo, substituição) quando comparado a um aminoácido alelo-selvagem na posição correspondente da região Fc da IgG1 humana.
[0143] A substituição do aminoácido de uma variante Fc pode ser localizada em uma posição dentro do domínio Fc referido como correspondente ao número da porção daquele resíduo que seria dado em uma região Fc em um anticorpo.
[0144] Em uma concretização, a variante Fc compreende uma substituição em uma posição do aminoácido localizada em um domínio de articulação ou porção da mesma. Em uma outra concretização, a variante Fc compreende uma substituição em uma posição de aminoácido localizada em um domínio CH2 ou porção do mesmo. Em uma outra concretização, a variante Fc compreende uma substituição em uma posição do aminoácido localizada em um domínio CH3 ou porção do mesmo. Em uma outra concretização, a variante Fc compreende uma substituição em uma posição do aminoácido localizada em um domínio CH4 ou porção do mesmo.
[0145] Em uma determinada concretização, as moléculas de nuclease híbrida da invenção compreende uma variante Fc compreende mais do que uma substituição de aminoácido. As moléculas de nuclease híbridas da invenção podem compreender, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições dos aminoácidos. Preferivelmente, as substituições dos aminoácidos são espacialmente posicionadas uma das outras por um intervalo de pelo menos 1 posição de aminoácido ou mais, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 posições de aminoácidos ou mais. Mais preferivelmente, os aminoácidos construídos são espacialmente posicionados afastados uns dos outros por um intervalo de pelo menos 5, 10, 15, 20 ou 25 posições de aminoácidos ou mais.
[0146] Em determinadas concretizações, a variante Fc confere um aperfeiçoamento em pelo menos uma função efetora transmitida por um domínio Fc compreendendo dito domínio Fc alelo-selvagem (por exemplo, um aperfeiçoamento na capacidade do domínio Fc para se ligar aos receptores Fc (por exemplo, FcYRI, FcyRII, ou FcylII) ou proteínas complementares (por exemplo, C1q), ou para disparar a citotoxicidade dependente do anticorpo (ADCC), fagocitose, ou citotoxicidade dependente do complemento (CDCC). Em uma outra concretização, a variante Fc provê um resíduo de cisteína construído.
[0147] Em alguns aspectos, um domínio Fc inclui mudanças nas regiões entre os aminoácidos 234-238, incluindo a sequência LLGGP no início do domínio CH2. Em alguns aspectos, uma variante Fc altera a função efetora mediada por Fc, particularmente, ADCC, e/ou diminui a avidez de ligação aos receptores Fc. Em alguns aspectos, a sequência altera próxima a junção CH2-CH3, nas posições tais como K322 ou P331 pode eliminar a citotoxicidade mediada pelo complemento e/ou alterar a avidez de ligação FcR. Em alguns aspectos, um domínio Fc incorpora mudanças nos resíduos de P238 e P331, por exemplo, mudança das prolinas de alelo-selvagem nestas posições para a serina. Em algunas aspectos, as alterações na região de articulação em uma ou mais das três articulações de cisteínas, para codificar CCC, SCC, SSC, SCS, ou SSS nestes resíduos pode também afetar a ligação FcR e homogeneidade molecular, por exemplo, através da eliminação de cisteínas não pareadas que podem desestabilizar o proteína dobrada.
[0148] As moléculas de nuclease híbridas da invenção podem empregar variantes de Fc reconhecidas na técnica que são conhecidos por transmitem um aperfeiçoamento na função efetora e/ou na ligação FcR. Especificamente, uma molécula de nuclease híbrida da invenção pode incluir, por exemplo, uma mudança (por exemplo, uma substituição) em um ou mais das posições de aminoácidos descritos nas publicações internacionais do PCT Nos: WO 88/07089 A1, WO 96/14339 A1, WO 98/05787 A1, WO 98/23289 A1, WO 99/51642 A1, WO 99/58572A1, WO 00/09560 A2, WO 00/32767 A1, WO 00/42072 A2, WO 02/44215 A2, WO 02/060919 A2, WO 03/074569 A2, WO 04/016750 A2, WO 04/029207 A2, WO 04/035752 A2, WO 04/063351 A2, WO 04/074455 A2, WO 04/099249 A2; WO 05/040217 A2; WO 04/044859, WO 05/070963 A1, WO 05/077981 A2; WO 05/092925 A2; WO 05/123780 A2; WO 06/019447 A1; WO 06/047350 A2 e WO 06/085967 A2; publicações de patentes norte-americanas Nos: US 2007/0231329, US 2007/0231329, US 2007/0237765, US 2007/0237766, US 2007/0237767, US 2007/0243188, US 2007/0248603, US 2007/02868559, US 2008/0057056; ou as patentes norte-americanas Nos.: US 5,648,260; US 5,739,277; US 5,834,250; US 5,869,046; US 6,096,871; US 6,121,022; US 6,194,551; US 6,242,195; US 6,277,375; US 6,528,624; US 6,538,124; US 6,737,056; US 6,821,505; US 6,998,253; US 7,083,784; e US 7,317,091, cada uma das quais incorporadas aqui por referência. Em uma concretização, a mudança específica (por exemplo, a substituição específica de um ou mais aminoácidos descritos na técnica) pode ser feita em um ou mais das posições de aminoácidos descritas. Em uma outra concretização, uma mudança diferente em um ou mais das posições de aminoácidos descritos (por exemplo, a substituição diferente de um ou mais posições de aminoácidos descritos na técnica) pode ser feita.
[0149] Outras mutações de aminoácidos no domínio Fc são contempladas para reduzir a ligação ao receptor Fc gama e subtipos receptores Fc gama. Por exemplo, mutações nas posições 238, 239, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 322, 324, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 356, 360, 373, 376, 378, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, ou 439 da região Fc pode alterar a ligação como descrita na patente norte-americana US No. 6,737,056, concedida em 18 de maio de 2004, incorporada aqui por referência em sua íntegra. Esta patente reportou que a mudança Pro331 em IgG3 para Ser resultou em seis vezes menos afinidade quando comparada ao IgG3 não alterada, indicando o envolvimento de Pro331 na ligação R1 do Fc gama. Em adição, as modificações dos aminoácidos nas posições 234, 235, 236, e 237, 297, 318, 320 e 322 são descritos como potencialmente alterando o receptor de afinidade de ligação na patente norte-americana US 5,624,821, concedida em 29 de abril de 1997, e incorporada aqui por referência em sua íntegra.
[0150] As mutações adicionais contempladas para uso incluem, por exemplo, aquelas descritas na publicação de patente No. 2006/0235208, publicado em 19 de outubro de 2006 e incorporada aqui por referência em sua íntegra. Esta publicação descreve variantes Fc que apresentam ligação reduzida para os receptores Fc gama, citotoxicidade media pela célula dependente do anticorpo reduzida, ou citotoxicidade dependente do complemento reduzida, que compreende pelo menos uma modificação do aminoácido na região Fc, incluindo 232G , 234G, 234H, 235D, 235G, 235H, 236I, 236N, 236P, 236R, 237K, 237L, 237N, 237P, 238K, 239R, 265G, 267R, 269R, 270H, 297S, 299A, 299I, 299V, 325A, 325L, 327R, 328R, 329K, 330I, 330L, 330N, 330P, 330R, e 331L (numeração é de acordo com o índice EU), bem como mutantes duplos 236R/237K, 236R/325L, 236R/328R, 237K/325L, 237K/328R, 325L/328R, 235G/236R, 267R/269R, 234G/235G, 236R/237K/325L, 236R/325L/328R, 235G/236R/237K, e 237K/325L/328r. Outras mutações contempladas par auso como descrito nesta publicação inclui 227G, 234D, 234E, 234G, 234I, 234Y, 235D, 235I, 235S, 236S, 239D, 246H, 255Y, 258H, 260H, 264I, 267D, 267E, 268D, 268E, 272H, 272I, 272R, 281D, 282G, 283H, 284E, 293R, 295E, 304T, 324G, 324I, 327D, 327A, 328A, 328D, 328E, 328F, 328I, 328M, 328N, 328Q, 328T, 328V, 328Y, 330I, 330L, 330Y, 332D, 332E, 335D, uma inserção de G entre as posições 235 e 236, uma inserção de A entre as posições 235 e 236, uma inserção de S entre posições 235 e 236, uma inserção e T entre posições 235 e 236, uma inserção de N entre as posições 235 e 236, uma inserção de D entre as posições 235 e 236, uma inserção de V entre as posições 235 e 236, uma inserção de L entre as posições 235 e 236, uma inserção de G entre as posições 235 e 236, uma inserção de A entre as posições 235 e 236,uma inserção de S entre as posições 235 e 236, uma inserção de T entre as posições 235 e 236, uma inserção de N entre as posições 235 e 236, uma inserção de D entre as posições 235 e 236, uma inserção de V entre as posições 235 e 236, uma inserção de L entre as posições 235 e 236, uma inserção de G entre as posições 297 e 298, uma inserção de A entre as posições 297 e 298, uma inserção de S entre as posições 297 e 298, uma inserção de D entre as posições 297 e 298, uma inserção de G entre as posições 326 e 327, uma inserção de A entre as posições 326 e 327, uma inserção de T entre as posições 326 e 327, uma inserção de D entre as posições 326 e 327, e uma inserção de E entre as posições 326 e 327 (a numeração é de acordo com o índice EU). Adicionalmente, as mutações descritas na publicação do pedido de patente norte-americano No. US 2006/0235208 incluem 227G/332E, 234D/332E, 234E/332E, 234Y/332E, 234I/332E, 234G/332E, 235I/332E, 235S/332E, 235D/332E, 235E/332E, 236S/332E, 236A/332E, 236S/332D, 236A/332D, 239D/268E, 246H/332E, 255Y/332E, 258H/332E, 260H/332E, 264I/332E, 267E/332E, 267D/332E, 268D/332D, 268E/332D, 268E/332E, 268D/332E, 268E/330Y, 268D/330Y, 272R/332E, 272H/332E, 283H/332E, 284E/332E, 293R/332E, 295E/332E, 304T/332E, 324I/332E, 324G/332E, 324I/332D, 324G/332D, 327D/332E, 328A/332E, 328T/332E, 328V/332E, 328I/332E, 328F/332E, 328Y/332E, 328M/332E, 328D/332E, 328E/332E, 328N/332E, 328Q/332E, 328A/332D, 328T/332D, 328V/332D, 328I/332D, 328F/332D, 328Y/332D, 328M/332D, 328D/332D, 328E/332D, 328N/332D, 328Q/332D, 330L/332E, 330Y/332E, 330I/332E, 332D/330Y, 335D/332E, 239D/332E, 239D/332E/330Y, 239D/332E/330L, 239D/332E/330I, 239D/332E/268E, 239D/332E/268D, 239D/332E/327D, 239D/332E/284E, 239D/268E/330Y, 239D/332E/268E/330Y, 239D/332E/327A, 239D/332E/268E/327A, 239D/332E/330Y/327A, 332E/330Y/268 E/327A, 239D/332E/268E/330Y/327A, Inserção G>297-298/332E, Inserção A>297-298/332E, Inserção S>297-298/332E, Inserção D>297-298/332E, Inserção G>326-327/332E, Inserção A>326- 327/332E, Inserção T>326-327/332E, Inserção D>326-327/332E, Inserção E>326-327/332E, Inserção G>235-236/332E, Inserção A>235-236/332E, Inserção S>235-236/332E, Inserção T>235- 236/332E, Inserção N>235-236/332E, Inserção D>235-236/332E, Inserção V>235-236/332E, Inserção L>235-236/332E, Inserção G>235-236/332D, Inserção A>235-236/332D, Inserção S>235- 236/332D, Inserção T>235-236/332D, Inserção N>235-236/332D, Inserção D>235-236/332D, Inserção V>235-236/332D, e Inserção L>235-236/332D (a numeração de acordo com o índice EU) são contempladas para uso. O mutante L234A/L235A é descrito, por exemplo, na paublicação de pedido de patente norte-americano No. 2003/0108548, publicado em Junho 12, 2003 e incorporado aqui por referência em sua íntegra. Nas concretizações, as modificações estão incluídas tanto individualmente quanto em combinação.
[0151] Em determinadas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida da invenção compreende uma substituição de aminoácido para um domínio Fc que altera as funções efetoras independente do antígeno do anticorpo, em particular, a circulação de meia-vida do anticorpo. As referidas moléculas de nuclease híbrida apresenta tanto ligação aumentada quanto dimínuída para o FcRn quandocomparado às moléculas de nuclease híbrida perdendo estas substituições e, portanto, tendo uma meia vida aumentada ou diminuída no soro, respectivamente. As variantes Fc com afindiade melhorada para RcRn são antecipadas por ter meia-vidas maiores no soro, e as referida smoléculas tem aplicações úteis nos métodos de tratamento de mamíferos quando a meia vida maior do polipeptídio administrado é desejada, por exemplo, para tratar uma doença ou distúrbio crônico. Em contraste, as variantes Fc com afinidade de ligação FcRn diminuída sãoe speradas para ter meia-vidas mais curtas, e tais moléculas são também úteis, por exemplo, para administração a um mamífero, onde um tempo de circulação mais curto pode ser vantajoso, por exemplo, para uma imagem de diagnóstico in vivo ou em situações onde o polipeptídio de partida tem efeitos colateriais tóxicos quando presente na circulação por períodos prolongados. As variantes Fc com afinidade de ligação FcRn diminuída são também menos desejadas por cruzar a placenta e, assim, são também úteis no tratamento de doenças ou distúrbios em molheres grávidas. Em adição, outras aplicações nas quais a afinidade de ligação FcRn reduzida pode ser desejada por incluir aquelas aplicações nas quais a localização do cérebro, rim, e/ou fígado é deseja. Em uma concretização exemplificativa, as moléculas de nuclease híbrida da invenção apresentam o transporte reduzido através do epitélio do glomerulo do rim a partir da vasculatura. Em outra concretização, as moléculas de nucelase híbridas da invenção apresentam transporte reduzido através da barreira do sangue no cérebro (BBB) a partir do cérebro, dentro do espaço vascular. Em uma concretização, uma molécula de nuclease híbrida com ligação FcRn alterada compreende pelo menos um domínio Fc (por exemplo, um ou dois domínios Fc) tendo uma ou mais substituições de aminoácidos dentro “da alça de ligação FcRn“ de um domínio Fc. Exemplos de substituições de aminoácidos, os quais tem atividade de ligação FcRn alteradas estão descritos na publicação internacional do PCT No. WO 2005/047327, a qual é incorporada aqui por referência.
[0152] Em outras concretizações, uma molécula de nuclease híbrida da invenção compreende uma variante Fc compreendendo uma substituição de aminoácido que altera a as funções efetores dependente do antígeno do polipeptídio, em particular, ADCC ou a ativação do complemento, por exemplo, quandocomparado com a região Fc do alelo-selvagem. Em uma concretização exemplificativa, as referidas moléculas de nuclease apresentam a ligação alterada para um receptor gama Fc (por exemplo, CD16). As referidas moléculas de nuclease híbridas apresentam tanto ligação aumentada quanto diminuída para o gama FcR quando comparado aos polipeptídios alelo- selvagem e, portanto, mediam a função efetora melhorada ou reduzida, respectivamente. As variantes Fc com afinidade melhoradas para FcYRs são antecipadas para melhorar a função efetora, e referidas moléculas tem aplicações úteis em métodos para tratamento de mamíferos onde a destruição da molécula alvo é desejada. Em contraste, as variantes Fc com afinidade de ligação FcyR diminuida são esperadas para reduzir a função efetora, e tais moléculas sãot ambém úteis, por exemplo, para tratamento de condições nas quais a destruição da célula alvo é indesejada, por exemplo, onde as céluals normais podem expressar moléculas alvo, ou onde a administraçãocrônica do polipeptídeo pode resultar na ativação do ssitema imune não desejado. Em uma concretização, o polipeptídio compreendendo um Fc apresenta pelo menos uma função efetora dependente do antígeno alterado selecioando a partir do grupo consistindo de opsonização, fagocitose, citotoxicidade dependente do complemento, citotoxicidade celular dependente do antígeno (ADCC), ou modulação da célula efetora quando comparado a um polipeptídio compreendendo uma região Fc alelo-selvagem.
[0153] Em uma concretização, a molécula de nucelase híbrida apresenta a ligação alterada para uma ativação FcyR (por exemplo, FcyI, FcyIIa, ou FcyRIIIa.) . Em uma outra concretização, a molécula de nuclease híbrida apresenta afinidade de ligação alterada para um inibidor FCYR (por exemplo, FcyRIIb). Substituições de aminoácidos exemplificativas cujas FcR alteradas ou atividade de ligação do complemento estão descritas na publicação do pedido internacional WO 2005/063815, que é incorporada aqui por referência em sua íntegra.
[0154] A molécula de nuclease híbrida da invenção pode compreender uma substituição de aminoácido que altera a glicosilação da molécula de nuclease híbrida. Por exemplo, o domínio Fc da molécula de nuclease híbrida pode compreender umd omínio Fc tendo uma mutação conduzindo a glicosilação reduzida (por exemplo, glicosilação ligada ao N- ou O-) ou pode compreender uma glicoforma alterada do domínio Fc alelo- selvagem (por exemplo, uma fucose inferior ou um glicano livre de fucose). Em uma outra concretização, a molécula de nuclease híbrida tem uma substituição de aminoácido próxima ou dentro da porção (“motif“) de glicosilação, por exemplo, uma porção de glicosilação ligada ao N que contém a sequência de aminoácido NXT ou NXS. Substituições de aminoácidos exemplifictivas que reduzem ou alteram a glicosilação estão descritas na publicação de pedido internacional WO 2005/018572 e na publicação da patente US 2007/0111281, as quais são incorporadas aqui por referência.
[0155] Em uma outra concretização, uma molécula de nuclease híbrida da invenção compreende pelo menos um domínio Fc tendo um resíduo de cisteína construído ou análogo do mesmo que está localizado na superfície exposta ao solvente. Preferivelmente, o resíduo de cisteína construído ou análogo do mesmo não interfere com uma função efetora conferida por Fc. Mais preferivelmente, a alteração não interfere com a capacidade de Fc se ligar aos receptores Fc (por exemplo, FcYRI, FcYRII, ou FcYRIII) ou proteínas do complemento (por exemplo, CIq), ou em disparar a função efetora imune (por exemplo, citotoxicidade dependente do anticorpo (ADCC), fagocitose, ou citotoxicidade dependente do complemento (CDCC)). Em uma concretização preferida, as moléculas de nuclease híbridas da invenção compreendem um domínio Fc compreendendo pelo menos um resíduo de cisteína livre construído ou análogo do mesmo que é substancialmente livre da ligação bissulfeto com um segundo resíduo de cisteína. Qualquer um dos resíduos de cisteína construídos ou análogos dos mesmos, acima mencionados, pode subsequentemente ser conjugado a um domínio funcional usando técnicas reconhecidas no estado da técnica (por exemplo, conjugado com um ligante hetero-bifuncional reativo ao tiol).
[0156] Em uma concretização, a molécula de nuclease híbrida da invenção pode compreender um domínio Fc fundido geneticamente tendo dois ou mais de seus domínios Fc constituintes independentemente selecionados a partir dos domínios Fc descritos aqui. Em uma concretização, os domínios Fc são os mesmos. Em uma outra concretização, pelo menos dois dos domínios Fc são diferentes. Por exemplo, os domínios Fc das moléculas de nuclease híbrida da invenção compreendem o mesmo número de resíduos de aminoácidos ou eles podem diferir no comprimento por um ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, em cerca de 5 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos), cerca de 10 resíduos, cerca de 15 resíduos, cerca de 20 resíduos, cerca de 30 resíduos, cerca de 40 resíduos, ou cerca de 50 resíduos). Ainda em uma outra concretização, os domínios Fc das moléculas de nuclease híbridas da presente invenção podem diferir na sequência de um ou mais posições de aminoácidos. Por exemplo, pelo menos dois dos domínios Fc podem diferir em cerca de 5 posições de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5 posições de aminoácidos), cerca de 10 posições, cerca de 15 posições, cerca de 20 posições, cerca de 30 posições, cerca de 40 posições, ou cerca de 50 posições).
Domínios ligantes:
[0157] Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida inclui um domínio ligante. Em algumas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida inclui uma pluralidade dos domínios ligantes. Em algumas concretizações, o domínio ligante é um polipeptídio ligante. Em determinados aspectos, é desejável empregar um polipeptídio ligante para fundir um ou mais domínios Fc para um ou mais domínios de nuclease para formar uma molécula de nuclease híbrida.
[0158] Em uma concretização, o polipeptídio de ligação é sintético. Como usado aqui, o termo “sintético” com relação a um polipeptídio de ligação inclui peptídeos (ou polipeptídios) que compreende uma sequência de aminoácido (que pode ou não pode ser de ocorrência natural) que é ligado em uma sequência linear de aminoácidos para uma sequência (que pode ou não pode ser de ocorrência natural) (por exemplo, uma sequência do domínio Fc) ao qual não é naturalmente ligado na natureza. Por exemplo, o polipeptídio de ligação pode compreender polipeptídios de ocorrência não natural que são formas modificadas de polipeptídios de ocorrência natural (por exemplo, compreendendo uma mutação, tal como, adição, substituição ou deleção) ou que compreende uma primeira sequência de aminoácidos (que pode ou não pode ser de ocorrência natural). Os ligantes de polipeptídios da invenção podem ser empregados, por exemplo, para garantir que os domínios Fc sejam justapostos para garantir a dobra apropriada e a formação de um domínio Fc funcional. Preferivelmente, um polipeptídio de ligação compatível com a presente invenção será relativamente não imunogênico e não inibirá e não inibe qualquer associação não-covalente entre subunidades de monômeros de uma proteína de ligação.
[0159] Em determinadas concretizações, as moléculas de nuclease híbrida da invenção emprega um polipeptídio de ligação para ligar quaisquer dois ou mais domínios na estrutura de uma cadeia de polipeptídio única. Em uma concretização, os dois ou mais domínios podem ser independentemente selecionados a partir de quaisquer domínios Fc ou domínios de nuclease discutidos aqui. Por exemplo, em determinadas concretizações, um polipeptídio de ligação pode ser utilizado para fundir domínios Fc idênticos, formando, desse modo uma região Fc homomérica. Em outras concretizações, um polipeptídio de ligação pode ser utilizado para fundir diferentes domínios Fc (por exemplo, um domínio Fc alelo-selvagem e uma variante do domínio Fc), formando, desse modo uma região Fc heteromérica. Em uma outra concretização, um polipeptídio de ligação da invenção pode ser utilizado para fundir o C-terminal de um primeiro domínio Fc (por exemplo, um domínio de articulação ou porção do mesmo, um domínio CH2 ou porção do mesmo, um domínio CH3 completo ou porção do mesmo, uma porção de ligação FcRn, uma porção de ligação FcYR, uma porção de ligação do complemento , ou porção do mesmo) para o N-terminal de um segundo domínio Fc (por exemplo, um domínio Fc completo).
[0160] Em uma concretização, um polipeptídio de ligação compreende uma porção de um domínio Fc. Por exemplo, em uma concretização, um polipeptídio de ligação pode compreender um domínio de articulação da imunoglobulina de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, e/ou IgG4. Em uma outra concretização, um polipeptídio de ligação pode compreender um domínio CH2 de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, e/ou um anticorpo IgG4. Em outras concretizações, um polipeptídio de ligação pode compreender um domínio CH3 de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, e/ou IgG4. Outras porções de uma imunoglobulina (por exemplo, imunoglobulina humana) podem ser utilizadas bem como. Por exemplo, um polipeptídio de ligação pode compreender um domínio CH1 ou porção do mesmo, um domínio CL ou porção do mesmo, um domínio VH ou porção do mesmo, ou um domínio VL ou porção do mesmo. Ditas porções podem ser derivadas a partir de qualquer imunoglobulina, incluindo, por exemplo, um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, e/ou anticorpo IgG4.
[0161] Em exemplos de concretizações, um polipeptídio de ligação pode compreender pelo menos uma porção de uma região de articulação de imunoglobulina. Em uma concretização, um polipeptídio de ligação compreende um domínio de articulação superior (por exemplo, um domínio de articulação superior de IgG1, IgG2, IgG3, ou um domínio de articulação superior IgG4). Em uma outra concretização, um polipeptídio de ligação compreende um domínio de ligação mediano (por exemplo, um domínio de articulação mediano de IgG2, um IgG3, ou um IgG4). Em uma outra concretização, um polipeptídio de ligação compreende um domínio de articulação inferior (por exemplo, um domínio de articulação inferior de IgG1, um IgG2, um IgG3, ou um IgG4).
[0162] Em uma outra concretização, os ligantes de polipeptídios podem ser construídos para combinar elementos de articulação derivados do mesmo ou de isotipos diferentes de anticorpos. Em uma concretização, o polipeptídio de ligação compreende uma articulação quimérica compreendendo pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG1 e pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG2. Em uma concretização, o polipeptídio de ligação compreende uma articulação quimérica compreendendo pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG1 e pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG3. Em uma outra concretização, um polipeptídio de ligação compreende uma articulação quimérica compreendendo pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG1 e pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG4. Em uma concretização, o polipeptídio de ligação compreende uma articulação quimérica compreendendo pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG2 e pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG3. Em uma concretização, o polipeptídio ligante compreende uma articulação quimérica compreendendo pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG2 e pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG4. Em uma concretização, o polipeptídio de ligação compreende uma articulação quimérica compreendendo pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG1, pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG2, e pelo menos uma porção de uma região de articulação IgG4. Em uma outra concretização, um polipeptídio de ligação pode compreender uma IgG1 superior e uma articulação intermediária e uma porção de repetição da articulação mediana de IgG3 única. Em uma outra concretização, um polipeptídio de ligação pode compreender um uma articulação superior IgG4, uma articulação mediana IgG1 e uma articulação inferior IgG2.
[0163] Em uma concretização, um polipeptídio de ligação compreende ou consiste de um ligante gli-ser. Como utilizado aqui, o termo “ligante de gli-ser” refere-se a um peptídeo que consiste de resíduos de glicina e de serina. Um exemplo de ligante de gli/ser compreende uma sequência de aminoácidos da fórmula (Gli4Ser)n, onde n é um número inteiro positivo (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5). Um ligante preferido de gli/ser é (Gli4Ser)4. Um outro ligante gli/ser preferido é (Gli4Ser)3. Um outro ligante gli/ser preferido é (Gli4Ser)5. Em determinadas concretizações, o ligante gli-ser pode ser inserido entre duas outras sequências dos ligantes de polipeptídios (por exemplo, qualquer uma das sequências de polipeptídio de ligação descritas aqui). Em uma outra concretização, um ligante gli-ser é ligado a um ou mais extremidades de uma outra sequência do ligante de peptídeo (por exemplo, qualquer uma das sequências ligantes de polipeptídio descritas aqui. Ainda em uma outra concretização dois ou mais ligantes gli-ser são incorporados em série em um polipeptídio de ligação. Em uma concretização, um polipeptídio de ligação da invenção compreende pelo menos uma porção de uma região de articulação superior (por exemplo, derivado de uma molécula de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4), pelo menos uma porção de uma região de articulação mediana (por exemplo, derivada de uma molécula IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4) e uma série de resíduos de aminoácidos gli/ser (por exemplo, um ligante gli/ser tal como (Gli4Ser)n).
[0164] Em uma outra concretização, um polipeptídio de ligação da presente invenção compreende um domínio da região de articulação da imunoglobulina de ocorrência não natural, por exemplo, o domínio da região de articulação que não é encontrado naturalmente no polipeptídio compreendendo o domínio da região de articulação e/ou um domínio da região de articulação que foi alterado de modo que ele difere na sequência de aminoácidos a partir de um domínio da região de articulação da imunoglobulina de ocorrência natural. Em uma concretização, as mutações podem ser feitas para os domínios da região de articulação para fazer um polipeptídio de ligação da invenção. Em uma concretização, um polipeptídio de articulação da invenção compreende um domínio de articulação que não compreende um número de ocorrência natural de cisteínas, ou seja, o polipeptídio ligante compreende tanto poucas cisteínas quanto um número maior de cisteínas do que um a molécula de articulação de ocorrência natural.
[0165] Em uma outra concretização, um polipeptídio de ligação da invenção compreende uma sequência de peptídeo biologicamente relevante ou uma porção de sequência do mesmo. Por exemplo, uma sequência de peptídeo biologicamente relevante pode incluir, mas não estar limitada a, sequências derivadas de um peptídeo anti-rejeição ou peptídeo anti- inflamatório. Os referidos peptídeos anti-rejeição ou anti- inflamatórios podem ser selecionados a partir do grupo consistindo de um peptídeo inibitório de citocina, um peptídeo inibitório da adesão celular, um peptídeo inibitório da trombina, e um peptídeo inibitório de plaquetas. Em uma concretização preferida, um polipeptídio de ligação compreende uma sequência de peptídeo selecionado a partir do grupo consistindo de um inibitório IL-1 ou sequência de peptídeo antagonista, uma sequência de peptídeo eritropoietina (EPO)-mimética, uma sequência de peptídeo trombopoietina (TPO)-mimético, uma sequência de peptídeo G- CSF mimético, uma sequência de peptídeo TNF-antagonista, uma sequência peptídeo de ligação a integrina, uma sequência de peptídeo antagonista da selectina, uma sequência de peptídeo anti-patogênica, uma sequência de peptídeo intestinal vasoativo (VIP), uma sequência de peptídeo antagonista calmodulina, um antagonista de célula mamária, uma sequência de peptídeo antagonista SH3, uma sequência de peptídeo antagonista receptor uroquinase (UKR), uma sequência de peptídeo mimético de somatostatina ou cortistatina, e uma sequência de peptídeo inibitório de célula macrófago e/ou célula T. Exemplos de sequências de peptídeos, qualquer um dos quais podem ser empregados como um polipeptídio de ligação são descritas na patente norte-americana No. US 6,660,843, a qual é incorporada aqui por referência.
[0166] Será entendido que as formas variantes destes ligantes de polipeptídios exemplificativos podem ser criadas através da introdução de uma ou mais substituições, adições ou deleções dentro da sequência de nucleotídeo codificante de um polipeptídio de ligação tal que um ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos são introduzidas dentro do polipeptídio de ligação. Por exemplo, as mutações podem ser introduzidas por técnicas padrões, tais como mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediado por PCR.
[0167] Os ligantes de polipeptídios da presente invenção são pelo menos um aminoácido de comprimento e pode ter comprimento variado. Em uma concretização, um ligante de polipeptídio da invenção é de cerca de 1 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento. Como utilizado nesse contexto, o termo “cerca de” indica +/- dois resíduos de aminoácidos. Uma vez que comprimento do ligante deve ser um número inteiro positivo, o comprimento de cerca de 1 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento, significa um comprimento de cerca de 1 a 48-52 aminoácidos de comprimento. Em uma outra concretização, um ligante de polipeptídio da invenção é de cerca de 10-20 aminoácidos de comprimento. Em uma outra concretização, um ligante de polipeptídio da invenção é de cerca de 15 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento.
[0168] Em uma outra concretização, um ligante de polipeptídio da presente invenção é de cerca de 20 a cerca de 45 aminoácidos de comprimento. Em uma outra concretização, um ligante de polipeptídio da presente invenção é de cerca de 15 a cerca de 25 aminoácidos de comprimento. Em uma outra concretização, um ligante de polipeptídio da invenção é de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, ou mais aminoácidos de comprimento.
[0169] Os ligantes de polipeptídios podem ser introduzidos dentro das sequências de polipeptídio usando técnicas conhecidas do estado da técnica. Modificações podem ser confirmadas através da analise de sequência de DNA. O DNA plasmidial pode ser utilizado para transformar células hospedeiras para produção estável dos polipeptídios produzidos.
Domínios de nuclease:
[0170] Em determinados aspectos, uma molécula de nuclease híbrida inclui um domínio de nuclease. Consequentemente, as moléculas de nuclease híbridas da invenção compreendem, tipicamente, pelo menos um domínio de nuclease e pelo menos um domínio Fc de ligação. Em determinados aspectos, uma molécula de nuclease híbrida inclui uma pluralidade de domínios de nuclease.
[0171] Em algumas concretizações, um domínio de nuclease é substancialmente todo ou pelo menos um fragmento enzimaticamente ativo de uma DNase. Em algumas concretizações, a DNase é uma DNase secretada do tipo 1, preferivelmente, uma DNase humana tal como uma DNase 1. Exemplos de domínios de DNase 1 são representados nas SEQ ID NOs: 48-53 e 102. Um exemplo de DNase 1 humana está descrito em UniProtKB, entrada P24855 (SEQ ID NOs:49 e 102). Em algumas concretizações, a DNase é uma DNase 1 e/ou uma enzima (DNase L) tipo DNase 1, 1-3. Um exemplo de eenzima tipo Dnase 1 humana 1-3 está descrito em UniProtKB, entrada Q13609 (SEQ ID NOs: 57 e 103). Em algumas concretizações, a DNase é TREX1 (três primers de reparo da exonuclease 1). Um exemplo de TREX1 humana está descrito em UniProtKB, entrada Q9NSU2 (SEQ ID NO:104). Preferivelmente, o TREX1 humano é uma TREX1 humana de C-terminal truncado que perdeu as sequências alvos nucleares intracelulares, por exemplo, uma TREX1 humana sem os aminoácidos C-terminal 72, como representado na SEQ ID NO;105.
[0172] Em algumas concretizações, um domínio de nuclease é substancialmente todo ou pelo menos um fragmento enzimaticamente ativo de uma RNase. Em uma concretização, a RNase é um RNase extracelular ou uma RNase secretora da superfamília de RNase A, por exemplo, RNase A, preferivelmente, uma RNAse pancreática humana. Um exemplo de RNase humana está descrito em UniProtKB, entrada P07998 (SEQ ID NOs:58 e 101).
[0173] Em uma concretização, o domínio de nuclease está operativamente ligado (por exemplo, quimicamente conjugado ou geneticamente fundido (por exemplo, tanto diretamente quanto via um ligante de polipeptídeo)) a um terminal-N de um domínio Fc. Em uma outra concretização, o domínio de nuclease está operativamente ligado (por exemplo, quimicamente conjugado ou geneticamente fundido (por exemplo, tanto diretamente quanto via um ligante de polipeptídeo)) a um terminal-C de um domínio Fc. Em outras concretizações, um domínio de nuclease está operativamente ligado (por exemplo, quimicamente conjugado ou geneticamente fundido (por exemplo, tanto diretamente quanto via um ligante de peptídeo)) via uma cadeia lateral de aminoácido de um domínio Fc. Em determinada concretização exemplificativa, o domínio de nuclease está fundido a um domínio Fc via um domínio de articulação de imunoglobulina humana ou porção do mesmo.
[0174] Em determinadas concretizações, as moléculas de nuclease híbridas da presente invenção compreendem dois ou mais domínios de nuclease e, pelo menos um domínio Fc. Por exemplo, os domínios de nuclease podem ser operativamente ligados a ambos, ao terminal-N e ao terminal-C de um domínio Fc. Em outra concretização exemplificativa, os domínios de nuclease podem ser operativamente ligados a ambas as extremidades C- e N- terminal de múltiplos domínios Fc (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, ou mais domínios Fc) que estão ligados juntos em série na forma de um arranjo sequencial (“tandem”) dos domínios Fc.
[0175] Em outras concretizações, dois ou mais domínios de nuclease estão ligados uns aos outros (por exemplo, via um ligante de polipeptídeo) em série, e o arranjo sequencial dos domínios de nuclease está operativamente ligado (por exemplo, quimicamente conjugado ou geneticamente fundido (por exemplo, tanto diretamente quanto via um ligante de polipeptídeo)) tanto para o C-terminal quanto para o N-terminal de um domínio Fc ou um arranjo sequencial dos domínios Fc. Em outras concretizações, o arranjo sequencial dos domínios de nuclease está operativamente ligado a ambos, o C-terminal e o N-terminal de um domínio Fc ou um arranjo sequencial de domínios Fc.
[0176] Em outras concretizações, um ou mais domínios de nuclease podem ser inseridos entre dois domínios Fc. Por exemplo, um ou mais domínios de nuclease podem formar todo ou parte de um ligante de peptídeo de uma molécula de nuclease híbrida da invenção.
[0177] As moléculas de nuclease híbridas preferidas da presente invenção compreendem, pelo menos, um domínio de nuclease (por exemplo, RNase ou DNase), pelo menos um domínio de ligação, e pelo menos um domínio Fc.
[0178] Em determinadas concretizações, as moléculas de nuclease híbridas da invenção têm, pelo menos, um domínio de nuclease específico para uma molécula alvo que media um efeito biológico. Em outra concretização, a ligação das moléculas de nuclease híbridas da invenção a uma molécula alvo (por exemplo, DNA ou RNA) resulta na redução ou na eliminação da molécula alvo, por exemplo, de uma célula, um tecido, ou da circulação.
[0179] Em determinadas concretizações, as moléculas de nuclease híbridas da presente invenção podem compreender dois ou mais domínios de nuclease. Em uma concretização, os domínios de nuclease são idênticos, por exemplo, RNase e RNase, ou TREX1 e TREX1. Em uma outra concretização, os domínios de nuclease são diferentes, por exemplo, DNase e RNase.
[0180] Em outras concretizações, as moléculas de nuclease híbridas da presente invenção podem ser arranjadas juntas ou com outros polipeptídios para formar proteínas de ligação tendo dois ou mais polipeptídios (“multímeros”), onde pelo menos um polipeptídeo do multímero é uma molécula de nuclease híbrida da invenção. As formas multimérica exemplificativas incluem dimérica, trimérica, tetramérica, e proteínas de ligação de forma hexamérica alterada e do gênero. Em uma concretização, os polipeptídios do multímero são os mesmos (ou seja, proteínas de ligação homoméricas alteradas, por exemplo, homodímeros, homotetrâmeros). Em uma outra concretização, os polipeptídios do multímero são diferentes (por exemplo, heteroméricas).
Métodos para preparar moléculas de nucleases híbridas
[0181] As moléculas de nucleases híbridas desta invenção podem ser feitas predominantemente em células hospedeiras transformadas usando técnicas de DNA recombinante. Para tanto, uma molécula de DNA recombinante codificante para o peptídeo é preparado. Os métodos para preparação das referidas moléculas DNA são bem conhecidos da técnica. Por exemplo, sequências codificantes para os peptídeos poderiam ser cortadas do DNA usando enzimas de restrição apropriadas. Alternativamente, a molécula de DNA poderia ser sintetizada usando técnicas de síntese química, tais como método de fosforamidação (“phosphoramidate”). Pode também ser utilizada uma combinação destas técnicas.
[0182] A invenção também inclui um vetor capaz de expressar os peptídeos em um hospedeiro apropriado. O vetor compreende a molécula de DNA que codifica para os peptídeos operativamente ligados para expressão apropriada das sequências controle. Os métodos para afetar esta ligação operativa, tanto antes quanto após a molécula de DNA ter sido inserida dentro do vetor, são bem conhecidos. As sequências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, melhoradores, operadores, domínios de nuclease ribossomal, sinais de inicialização, sinais de finalização, sinais de cobertura, sinais de poliadenilação, e outros sinais envolvidos com o controle da transcrição ou da tradução.
[0183] O vetor resultante tendo a molécula de DNA no mesmo é utilizado para transformar um hospedeiro adequado. Esta transformação pode ser realizada usando métodos bem conhecidos da técnica.
[0184] Qualquer um de um grande número de células hospedeiras disponíveis e bem conhecidas que podem ser utilizadas na prática desta invenção. A seleção de um hospedeiro particular é dependente de um número de fatores reconhecidos pela técnica. Estes incluem, por exemplo, compatibilidade, com a escolha do vetor de expressão, toxicidade dos peptídeos codificados pela molécula de DNA, taxa de transformação, facilidade de recuperação dos peptídeos, características de expressão, biossegurança e custos. Um balanço destes fatores deve ser encontrado com o entendimento de que nem todos os hospedeiros podem ser igualmente eficazes para a expressão de uma sequência de DNA específica. Dentro desse guia geral, hospedeiros microbianos úteis incluem bactérias (tais como E. coli sp.), levedura (tais como Saccharomyces sp.), e outros fungos, insetos, plantas, células de mamíferos (incluindo humanos) em cultura, ou outros hospedeiros conhecidos do estado da técnica.
[0185] Em seguida, o hospedeiro transformado é cultivado e purificado. As células hospedarias podem ser cultivadas sob condições de fermentação convencionais de modo que os compostos desejados são expressos. As referidas condições de fermentação são bem conhecidas da técnica. Finalmente, os peptídeos são purificados a partir da cultura através de métodos bem conhecidos da técnica.
[0186] Os compostos podem também ser feitos através de métodos sintéticos. Por exemplo, técnicas de síntese de fase sólida podem ser utilizadas. As técnicas apropriadas são bem conhecidas do estado da técnica e, incluem aquelas descritas em Merrifield (1973), “Chem. Polypeptides”, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), “J. Am. Chem. Soc.”, 85: 2149; Davis et al. (1985), “Biochem. Intl.”, 10: 394-414; Stewart and Young (1969), “Solid Phase Peptide Synthesis”; U.S. Pat. No.: 3,941,763; Finn et al. (1976), “The Proteins (3rd ed.)”, 2: 105-253; and Erickson et al. (1976), “The Proteins (3rd ed.)”, 2: 257-527. A síntese de fase sólida é a técnica preferida para preparar peptídeos individuais uma vez que este é um método de custo efetivo para preparo de peptídeos pequenos. Os compostos que contém peptídeos derivados ou que contém grupos não peptídeos podem ser sintetizados por técnicas de química orgânica bem conhecida.
[0187] Outros métodos para expressão/síntese de moléculas são geralmente conhecidos no estado da técnica pelos técnicos no assunto.
Composições farmacêuticas e métodos terapêuticos de uso
[0188] Em determinadas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida é administrada sozinha. Em determinada concretização, uma molécula de nuclease híbrida é administrada antes da administração de pelo menos um outro agente terapêutico. Em determinadas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida é administrada concomitantemente com a administração de pelo menos um outro agente terapêutico. Em determinadas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida é administrada subsequentemente a administração de pelo menos um outro agente terapêutico. Em outras concretizações, uma molécula de nuclease é administrada antes da administração de pelo menos um outro agente terapêutico. Como será apreciado por um técnico no assunto, em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida é combinada com o outro agente/composto. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida e outro agente são administrados concomitantemente. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida e outro agente não são administrados simultaneamente, com a molécula de nuclease híbrida sendo administrada antes ou após o agente ser administrado. Em algumas concretizações, o indivíduo recebe ambos, a molécula de nuclease híbrida e ou outro agente durante um mesmo período de prevenção, a ocorrência de um distúrbio, e/ou um período de tratamento.
[0189] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em terapias combinadas, ou seja, combinada com outros agentes. Em determinadas concretizações, uma terapia combinada compreende a molécula de nuclease, em combinação com pelo menos um outro agente. Agentes incluem, mas não estão limitados a, composições químicas preparadas sinteticamente in vitro, anticorpos, regiões de ligação ao antígeno, e combinações e conjugados dos mesmos. Em determinadas concretizações, um agente pode agir como um agonista, antagonista, modulador alotérico, ou toxina.
[0190] Em determinadas concretizações, a invenção provê composições farmacêuticas compreendendo uma molécula de nuclease híbrida junto com um diluente farmaceuticamente aceitável, um veículo, solubilizante, emulsificante, conservante e/ou adjuvante.
[0191] Em determinadas concretizações, a invenção provê composições farmacêuticas compreendendo uma molécula de nuclease híbrida e uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um agente terapêutico adicional, junto com um diluente farmaceuticamente aceitável, veículo, solubilizante, emulsificante, conservante e/ou adjuvante.
[0192] Em determinadas concretizações, os materiais de formulação apropriados são preferivelmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas. Em algumas concretizações, o(s) material(ais) da formulação é(são) para administração s.c. e/ou I.V.. Em determinadas concretizações, a composição farmacêutica pode conter os materiais de formulação para modificação, manutenção ou conservação, por exemplo, do pH, osmolaridade, viscosidade, claridade, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição. Em determinadas concretizações, os materiais de formulação apropriados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como, glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tais como, ácido ascórbico, sulfito de sódio ou sulfito hidrogênio de sódio); tampões (tais como, borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de intumescimento, (tais como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais como ácido tetraacético de etilenodiamina (EDTA)); agentes de complexação (tais como cafeína, poli(vinil pirrolidonas), beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); material de enchimento, monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (tais como, glicose, manose ou dextrinas); proteínas (tais como, albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas); agentes colorante, de sabor e agentes diluentes, agentes emulsificantes; polímeros hidrofílicos (tais como poli(vinil pirrolidonas)); polipeptídeo de baixo peso molecular; contra- íons formadores de sal (tais como sódio), conservantes (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetila, metilparabeno, propilparabeno, clorohexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (tais como glicerina, propileno glicol ou polietileno glicol); álcoois de açúcar (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão, surfactantes ou agentes umidificantes (tais como plurônico, PEG, ésteres de sorbitan, polissorbato, tais como polissorbato 20, polissorbato 80, tripton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes melhoradores de estabilidade (tais como sacarose e sorbitol); agentes melhoradores de tonicidade (tais como haletos de metal alcalino, preferivelmente, cloreto de sódio ou cloreto de potássio, sorbitol manitol); veículos de liberação, diluentes, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. (“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 18th Edition, A. R. German, ed., Mack Publishing Company (1995)). Em algumas concretizações, a formulação compreende PBS; 20 mM de NaOAC, pH 5,2, 50 mM de NaCl; e/ou 10 mM de NAOAC, pH 5,2; 9% de sacarose.
[0193] Em determinadas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida e/ou uma molécula terapêutica é ligada a um veículo extensor da meia-vida conhecido do estado da técnica. Os referidos veículos incluem, mas não estão limitados a, polietileno glicol, glicogênio (por exemplo, glicosilação da molécula de nuclease híbrida), e dextrana. Os referidos veículos são descritos, por exemplo, no pedido de patente norte-americano No.: US 09/428,082, atualmente patente US 6,660,843 e o pedido de patente internacional PCT No.: WO 99/25044, os quais foram incorporados aqui por referência para qualquer propósito.
[0194] Em determinadas concretizações, a composição farmacêutica ótima será determinada por um técnico no assunto dependendo de, por exemplo, da rota pretendida de administração, formato de liberação e dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra. Em determinadas concretizações, as referidas composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo, e taxa de liberação in vivo dos anticorpos da invenção.
[0195] Em determinadas concretizações, o veículo primário ou transportador em uma composição farmacêutica pode ser tanto de natureza aquosa quanto não aquosa. Por exemplo, em determinadas concretizações, um veículo ou transportador apropriado pode ser água para injeção, solução salina fisiológica ou um fluido cerebroespinal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns nas composições para administração parenteral. Em algumas concretizações, a salina compreende salina tamponada com fosfato isotônico. Em determinadas concretizações, a salina tamponada neutra ou salina misturada com albumina do soro são veículos exemplificativos adicionais. Em determinadas concretizações, as composições farmacêuticas compreendem tampão Tris com um pH de cerca de 7,0-8,5, ou tampão acetato com pH de cerca de 4,0-5,5, que podem incluir ainda sorbitol ou ainda um substituto adequado. Em determinadas concretizações, uma composição compreendendo uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser preparada para armazenamento através da mistura da composição selecionada tendo o grau desejado de pureza com agentes de formulação opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra), na forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Adicionalmente, em determinadas concretizações, uma composição compreendendo uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser formulada como um liofilizado usando excipientes apropriados tais como sacarose.
[0196] Em determinadas concretizações, a composição farmacêutica pode ser selecionada para liberação parenteral. Em certas concretizações, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para liberação através do trato digestivo, tal como oralmente. A preparação das referidas composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da capacidade de um técnico no assunto.
[0197] Em determinadas concretizações, os componentes da formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis aos sítios de administração. Em determinadas concretizações, tampões são utilizados para manter a composição em um pH fisiológico ou em um pH levemente inferior, tipicamente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.
[0198] Em determinadas concretizações, quando a administração parenteral é contemplada, uma composição terapêutica pode ser na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável livre de pirogênio, compreendendo uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem agentes terapêuticos adicionais, em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em determinadas concretizações, um veículo para injeção parenteral é água destilada estéril na qual uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, é formulada como uma solução estéril, isotônica, adequadamente conservada. Em determinadas concretizações, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tal como microesferas injetáveis, partículas bioerodíveis, compostos poliméricos (tais como ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), contas ou lipossomos, que podem prover a liberação sustentada controlada do produto que pode então ser liberado via uma injeção com depósito. Em determinadas concretizações, o ácido hialurônico pode também ser utilizado, e pode ter o efeito de promover duração sustentada na circulação. Em determinadas concretizações, dispositivos de liberação de fármaco implantáveis podem ser utilizados para introduzir a molécula desejada.
[0199] Em determinadas concretizações, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Em determinadas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser formulada como um pó seco para inalação. Em determinadas concretizações, uma solução de inalação compreendendo uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, pode ser formulada com um propelente para liberação aerossol. Em determinadas concretizações, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é ainda descrita no pedido de patente PCT No. PCT/US 94/001875, o qual descreve a liberação pulmonar das proteínas modificadas quimicamente.
[0200] Em determinadas concretizações, é contemplado que formulações podem ser administradas oralmente. Em determinadas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, que é administrado nesta forma pode ser formulado com ou sem aqueles veículos convencionalmente utilizados na composição das formas de dosagem sólidas, tais como tabletes e cápsulas. Em determinadas concretizações, uma cápsula pode ser designada para liberar a porção ativa da formulação no ponto do trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade for maximizada e a degradação pré-sistêmica for minimizada. Em determinadas concretizações, pelo menos um agente adicional pode ser incluído para facilitar a absorção de uma molécula de nuclease híbrida e/ou qualquer agente terapêutico adicional. Em determinadas concretizações, diluentes, aromatizantes, ceras com baixos pontos de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes desintegrantes de tabletes, e ligantes podem também ser empregados.
[0201] Em determinadas concretizações, uma composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, em uma mistura com excipientes não tóxicos que são apropriados para a fabricação de tabletes. Em determinadas concretizações, através da dissolução dos tabletes em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose única. Em certas concretizações, excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, tais como, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, ou bicarbonato, lactose, ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tais como, amido, gelatina, ou acácia; ou agentes lubrificantes, tais como, estearato de magnésio, ácido esteárico, ou talco.
[0202] As composições farmacêuticas adicionais serão evidentes aos técnicos no assunto, incluindo formulações envolvendo uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, em formulações de liberação sustentada ou formulações de liberação controlada. Em determinadas concretizações, as técnicas para formulação de uma variedade de outros meios de liberação sustentada ou controlada, tais como, veículos de lipossomo, micropartículas bioerodíveis, ou contas porosas e injeções com depósitos, também são conhecidas dos técnicos no assunto. Ver, por exemplo, o pedido de patente internacional No. PCT/US93/00829, que descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a liberação de composições farmacêuticas. Em determinadas concretizações, preparações de liberação sustentada podem incluir matrizes de polímero semipermeáveis na forma de artigos formados, por exemplo, películas, ou microcápsulas. As matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (patente norte-americana No.: US 3,773,919 e patente EP 058,481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al., “Biopolymers”, 22:547-556 (1983)), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., “J. Biomed. Mater. Res.”, 15:167-277 (1981) e Langer, “Chem. Tech.”, 12:98-105 (1982)), acetate de vinil etileno (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). Em determinadas concretizações, as composições de liberação sustentada podem também incluir lipossomos, que podem ser preparados por qualquer um de vários métodos conhecidos do estado da técnica. Ver, por exemplo, Eppstein et al., “Proc. Natl. Acad. Sci.”, USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 e EP 143,949.
[0203] A composição farmacêutica a ser utilizadas para administração in vivo étipicamente estéril. Em determinadas concretizações, isto pode ser acompanhado por filtragem através de membranas de filtragem estéreis. Em certas concretizações, onde a composição é liofilizada, a esterilização usando este método pode ser conduzida tanto antes para ou na sequência da liofilização e reconstituição. Em determinadas concretizações, a composição para administração parenteral pode ser armazenada na forma liofilizada ou em uma solução. Em determinadas concretizações, as composições parenterais geralmente são colocadas dentro de um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa tendo uma interrupção perfurável através de uma agulha de injeção hipodérmica.
[0204] Em determinadas concretizações, uma vez que a composição farmacêutica foi formulada, ela pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólida, ou como um pó desidratado ou liofilizado. Em determinadas concretizações, tais formulações podem ser armazenadas tanto em uma forma pronta para uso quanto em uma forma (por exemplo, liofilizada) que é reconstituída antes da administração.
[0205] Em determinadas concretizações, kits são providos para produzir uma unidade de administração em dose única. Em determinadas concretizações, o kit pode conter ambos, um primeiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Em certas concretizações, um kit contendo seringas únicas e seringas de múltiplas câmaras pré-carregadas (por exemplo, seringas líquidas e lioseringas) são incluídas.
[0206] Em determinadas concretizações, a quantidade efetiva de uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, a ser empregada terapeuticamente irá depender, por exemplo, do contexto terapêutico e dos objetivos. Um técnico no assunto irá apreciar que os níveis de dosagens apropriados para tratamento, de acordo com determinadas concretizações, irão assim, variar dependendo, em parte, da molécula liberada, da indicação para a qual uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, está sendo utilizados, a rota de administração, e o tamanho (o peso do corpo, da superfície do corpo ou do tamanho do órgão) e/ou condição (a idade e a saúde geral) do paciente. Em determinadas concretizações, o médico pode titular a dosagem e modificar a rota da administração para obter o efeito terapêutico ótimo. Em determinadas concretizações, uma dosagem típica pode variar de cerca de 0,1 μ g/kg a até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em determinadas concretizações, a dosagem pode variar de 0,1 μ g/kg até cerca de 100 mg/kg; ou 1 μ g/kg a cerca de 100 mg/kg; ou 5 μ g/kg até cerca de 100 mg/kg.
[0207] Em certas concretizações, a frequência da dosagem será tomada de acordo com os parâmetros farmacocinéticos de uma molécula de nuclease híbrida e/ou quaisquer agentes terapêuticos adicionais na formulação utilizada. Em determinadas concretizações, um médio irá administrar a composição até uma dosagem ser conseguida que alcance o efeito desejado. Em determinadas concretizações, a composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única, ou como dois ou mais doses (que podem ou não podem conter a mesma quantidade da molécula desejada) durante um tempo, ou como uma infusão contínua via um dispositivo de implantação ou cateter. Adicionalmente, o refinamento da dosagem apropriada é rotineiramente feito pelos técnicos no assunto e está dentro do âmbito das tarefas rotineiramente realizadas por eles. Em certas concretizações, as dosagens apropriadas podem ser acertadas através do uso de dados de resposta de dose adequadas.
[0208] Em determinadas concretizações, a rota de administração da composição farmacêutica está de acordo com os métodos conhecidos, por exemplo, oralmente, através de injeção intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra- parenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, subcutaneamente, intraocular, intraarterial, intraportal, ou rotas intralesional; através de sistemas de liberação sustentada, ou por dispositivos de implantação. Em determinadas concretizações, as composições podem ser administradas por injeção de bolus ou continuamente por infusão, ou através de dispositivo de implantação.
[0209] Em determinadas concretizações, a composição pode ser administrada localmente via implantação de uma membrana, esponja ou um outro material apropriado sobre o qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Em determinadas concretizações, onde um dispositivo de implantação é utilizado, o dispositivo pode ser implantado dentro de qualquer tecido ou órgão apropriado, e a liberação da molécula desejada pode ser via difusão, bolus de liberação determinada, ou administração contínua.
[0210] Em determinadas concretizações, pode ser desejável utilizar uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, de uma maneira ex vivo. Nos referidos exemplos, as células, tecidos e/ou órgãos que tenham sido removidos do paciente são expostos a uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de nuclease híbrida, com ou sem pelo menos um agente terapêutico adicional, após o que as células, tecidos e/ou órgãos são subsequentemente implantados de volta dentro do paciente.
[0211] Em determinadas concretizações, uma molécula de nuclease híbrida e/ou quaisquer agentes terapêuticos adicionais podem ser liberados por implantação de determinadas células que foram geneticamente construídos, usando métodos tais como, aqueles descritos aqui, para expressar e secretar os polipeptídios. Em determinadas concretizações, as referidas células podem ser células de animais ou células humanas, e podem ser autólogas, heterólogas, ou xenogênicas. Em determinadas concretizações, as células podem ser imortalizadas. Em determinadas concretizações, de modo a diminuir a chance de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar a infiltração dos tecidos ao redor. Em determinadas concretizações, os materiais de encapsulação são tipicamente bio-compatíveis, envoltórios poliméricos semipermeáveis ou membranas que permitem a liberação do produto de proteína, mas previnem a destruição das células através do sistema imune do paciente ou através de outros fatores prejudiciais a partir dos tecidos ao redor.
[0212] As moléculas de nuclease híbridas da presente invenção são particularmente eficazes no tratamento de distúrbios autoimunes ou respostas imunes anormais. Neste sentido, deverá ser apreciado que as moléculas de nuclease híbridas da presente invenção podem ser utilizadas para controlar, suprimir, modular, tratar, ou eliminar as respostas imunes não desejadas para ambos, externa e auto- antígenos. Ainda em uma outra concretização, os polipeptídios da presente invenção podem ser utilizadas para tratar distúrbios imunes que incluem, mas não estão limitados a, diabetes mielitus dependente de insulina, esclerose múltiplas, encefalomielite autoimune experimental, artrite reumatoide, artrite autoimune experimental, miastenia grave, tiroidite, uma forma experimental de uveoretinite, tiroidite de Hashimoto, mixoedema primário, tirotoxicose, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, doença de Addison, menopausa prematura, infertilidade masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, Pemphigus vulgaris, pênfigo, oftalmia simpática, uveíte fagogênica, anemia hemolítica autoimune, leucopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite crônica ativa Hbs-ve, cirrose criptogênica, colite ulcerativa, síndrome de Sjogren, esclerodermia, granulomatose de Wegener, polimiosite, dermatomiosite, LE discoide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), e doença de tecido conectivo. KIT
[0213] Um kit pode incluir uma molécula de nuclease híbrida descrita aqui e as instruções para uso. Os kits podem compreender, em um recipiente apropriado, uma molécula de nuclease híbrida descrita aqui, um ou mais controles, e vários tampões, reagentes, enzimas e outros ingredientes padrões bem conhecidos da técnica.
[0214] O recipiente pode incluir pelo menos um frasco, poço, tubo de teste, frasco, garrafa, seringa, ou outros meios recipientes, dentro do qual uma molécula de nuclease híbrida pode ser colocada, e em alguns exemplos, aliquotada adequadamente. Quando um componente adicional é provido, o kit pode conter recipientes adicionais dentro do qual este componente pode ser colocado. Os kits podem também incluir um meio para conter a molécula de nuclease híbrida e qualquer outro recipiente para reagente em confinamento próximo para venda comercial. Os referidos recipientes podem incluir injeção ou recipientes plásticos moldados por sopro dentro dos quais os frascos desejados são retidos. Os recipientes e/ou kits podem incluir rótulo com instruções para uso e/ou observações.
EXEMPLOS
[0215] Abaixo são apresentados exemplos das concretizações específicas para realização da presente invenção. Os exemplos são oferecidos com o propósito ilustrativo apenas, e não pretendem ser limitativos ao escopo da presente invenção em qualquer sentido. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão com relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem é claro, ser levados em conta.
[0216] A prática da presente invenção empregará, a menos que de outro modo indicado, métodos convencionais da química da proteína, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia, dentro do campo técnica. As referidas técnicas são explicadas completamente na literatura. Ver, por exemplo, “T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rdEd. (Plenum Press) Vols A and B(1992)”.
Exemplo 1: Abordagem geral para produção das moléculas de nuclease híbrida.
[0217] As moléculas de nuclease híbrida foram desenhadas para incorporar as estruturas desejadas e a atividade funcional de estruturas de enzima única ou de múltiplas enzimas como cassetes modulares com sítios de enzima de restrição compatíveis para transferir e trocar os domínios. A estrutura esquemática das diferentes concretizações das moléculas de nuclease híbrida é ilustrada na Figura 1. O nucleotídeo e as sequências de aminoácidos de moléculas de nuclease híbrida representativa são mostrados na tabela 1.
[0218] Os cDNAs humanos foram isolados a partir do RNA de pâncreas humano (Ambion) ou de RNA PBMC humano obtido de linfócitos do sangue periférico de humanos normais (aproximadamente 5x10e6) usando kits QIAgen RNAeasy (Valencia, CA) e Kits QIAshredder para homogeneizar os lisados celulares (QIAgen, Valencia, CA). Os PBMCs humanos foram isolados a partir de sangue humano heparinizado diluído 1:1 em D-PBS e distribuído em camadas sobre o meio de separação de linfócitos LSM (MP Biomedicals, Irvine, CA), gradientes Ficcol.
[0219] O RNA do baço de camundongo foi isolado usando kits QIAgen RNAeasy (Valencia, CA), de aproximadamente 5x10e6 esplenócitos. As células foram pelotizadas por centrifugação a partir do meio de cultura, e 5x10e6 células foram utilizadas para preparar o RNA. O RNA foi isolado a partir das células usando o kit QIAGEN RNAeasy (Valencia, Calif.) kit de isolamento do RNA total e QIAGEN QIAshredder de acordo com as instruções do fabricante acompanhando o kit. Um a dois microgramas (1-2 μ g) do RNA total foi utilizado como modelo para preparar o cDNA através da transcrição reversa. O RNA, 300 ng de primers aleatórios, e 500 ng de Oligo dT (12-18), e 1 μ l de dNTPs 25 mM foram combinados e desnaturados a 80°C durante 5 minutos antes da adição da enzima. A transcriptase reversa Superscript III (Invitrogen, Life Technologies) foi adicionada ao RNA mais a mistura de primer em um volume total de 25 μ l na presença de 5 vezes o segundo tampão de fita e 0,1 M de DTT provido com a enzima. A reação de transcrição reversa foi deixada prosseguir a 50°C por uma hora.
[0220] Entre 10-100ng do cDNA foram utilizados nas reações de amplificação do PCR usando primers específicos para o gene de nuclease de interesse (RNaseA, RNase1, DNase1, TREX1, DNase1L3, etc.) Para as reações de clonagem iniciais, os primers foram designados para isolar a extensão completa do cDNA ou produtos de truncagem codificantes do gene de interesse. A extensão completa ou os fragmentos de PCR reduzidos foram isoladas por eletroforese em gel de agarose, e purificados usando colunas da Qiagen QIAquick para remover nucleotídeos, primers, e produtos amplificados não desejados. Os fragmentos purificados foram clonados dentro de vetores de clonagem pCR2.1 TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transformados dentro de bactérias competentes TOP10. As colônias isoladas foram transferidas para o meio de caldo Luria contendo 50 ug/ml de carbenicilina, e crescidos durante a noite para isolar os plasmídeos. Os clones TOPO foram classificados em insertos para o tamanho correto por digestão com enzima de restrição EcoRI (NEB, Ipswich, MA) e eletroforese em gel de agarose dos fragmentos digeridos. A análise da sequência do DNA dos clones positivos foi realizada com a mistura de reação ABI Ready v3.1 e analisada usando um sequenciador ABI 3730 XL DNA. Uma vez que os clones corretos foram obtidos, modificações adicionais nas sequências foram designadas e as reações de PCR realizadas para produzir os alelos desejados ou os cassetes de expressão desejados. Os produtos da truncagem e os alelos foram gerados pela mutagênese em PCR usando primers de sobreposição para introdução das mutações em posições específicas nos genes. Os ligantes foram sintetizados por PCR de sobreposição usando primers de sobreposição interna e rodadas sucessivas de PCR para ligar a sequencia adicional a cada terminal. As moléculas de nuclease híbridas foram arranjadas como uma tira de vários cassetes intercalados. As moléculas da concretização preferida contém um peptídeo líder fixado, um cassete de nuclease, um cassete opcional codificante de uma escolha de vários ligantes de polipeptídios diferentes, um cassete do domínio -Ig Fc tanto com um códon de parada (STOP) quanto com um ligante na extremidade carboxila do domínio CH3, e para as moléculas do tipo resolvICase, um segundo cassete de ligação, seguido por um segundo cassete de nuclease. A figura 1 ilustra a estrutura do tipo cassete destas moléculas de nuclease híbrida e exemplos de sequências potenciais inseridas em cada posição. Uma vez que as moléculas de nuclease híbridas foram arranjadas, elas foram transferidas a um plasmídeo de expressão de mamífero pDG apropriado para expressão transitória em COS7 ou outras células e expressão estável em células CHO DG44 usando seleção para DHFR com metotrexato.
Expressão transitória de moléculas de nuclease híbridas
[0221] As células COS-7 foram transfectadas transitoriamente com vetor de expressão pDG contendo os insertos dos genes da molécula de nuclease híbrida. O dia antes da transfecção, as células foram semeadas em um disco de 60 mm a 4x10e5 células em 4 ml de DMEM (ThermoFisher/Mediatech cell gro) + 10% FBS do meio de cultura de tecido. O meio basal DMEM foi suplementado com 4,5 g/L de glicose, piruvato de sódio, L-glutamina 4 mM, e aminoácidos não essenciais. O soro bovino fetal (Hyclone, Logan, UT ThermoFisher Scientific) foi adicionado ao meio em 10% do volume final. As células foram incubadas a 37°C, 5% de CO2, durante a noite e foram aproximadamente 40-80% confluente no dia de transfecção. O DNA plasmidial foi preparado usando Kits miniprep Qiagen QIAprep (Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante, e eluído em 50 ul de tampão EB. As concentrações do DNA foram medidas usando um espectrofotômetro Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington DE). O DNA plasmidial foi transfectado usando o reagente de transfecção Polyfect (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante, usando 2,5 μ g do DNA plasmidial por disco de 60 mm e 15 ul do reagente Polyfect em 150ul de soro livre do coquetel de transfecção DMEM. Após formação do complexo, as reações foram diluídas dentro de 1ml do meio de crescimento de célula contendo soro e todos os suplementos, e adicionado gota-a-gota em placas contendo 3ml de meio de cultura completo fresco DMEM. As transfecções transitórias foram incubadas durante 48-72 horas antes da coleta dos sobrenadantes da cultura para análise adicional.
Produção dos transfectantes CHO DG44 estável expressando as moléculas de nuclease híbrida de interesse.
[0222] Produção estável das moléculas de nuclease híbridas foi conseguida por eletroporação de um plasmídeo selecionável, amplificável, pDG, contendo o cDNA nuclease-Ig sob o controle do promotor CMV, dentro das células de ovários de Hamster Chinês (CHO). O vetor pDG é uma versão modificada de pcDNA3 codificante do marcador selecionável DHFR com um promotor atenuado para aumentar a seleção da pressão para o plasmídeo. O DNA plasmidial foi preparado usando kits Qiagen maxipreparado, e plasmídeo purificado foi linearizado em um sítio AscI único antes da extração com fenol e precipitação com etanol. O DNA do esperma de Salmão (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) foi adicionado como veículo de DNA, e 100 mg de cada um dos plasmídeos e veículo de DNA foi utilizado para transfectar 107células CHO DG44 por eletroporação. As células foram crescidas na fase logarítmica em meio Excell 302 (JRH Biosciences) contendo glutamina (4 mM), piruvato, insulina recombinante, penicilina-estreptomicina, e 2xDMEM de aminoácidos não-essencial (todos da Life Technologies, Gaithersburg, Md.), daqui em diante referido como meio “Excell 302 completo”. O meio para células não transfectadas também contendo HT (Diluído de uma solução 100x de hipoxantina e timidina) (Invitrogen/Life Technologies). O meio para transfecções sob seleção contendo níveis variados de metotrexato (Sigma-Aldrich) como agente seletivo, variando de 50 nM para 1μ M. As eletroporações foram realizadas em 280 volts, 950 microFarads. As células transfectadas foram deixadas para recuperar durante a noite em meio não seletivo antes do plaqueamento seletivo em placas de 96 poços de fundo plano (Costar) em diluições seriais variando de 125 células/poço a 2000 células/poço. O meio de cultura para clonagem celular foi Excell 302 completo, contendo 50 nM de metotrexato. Uma vez que o crescimento clonal foi suficiente, as diluições seriais dos sobrenadantes de cultura a partir dos poços principais foram classificados para expressão das moléculas de nuclease híbridas pelo uso de um sanduiche de ELISA -IgG. Resumidamente, as placas NUNC Immulon II foram revestidas durante a noite a 4°C com 7,5 micrograma/ml de IgG anti-camundongo de cabra F(ab’2) (KPL Labs, Gaithersburg, MD) ou 2 ug/ml de IgG anti-camundongo ou anti-humano de cabra (Jackson Immunoresearch, West Grove PA) em PBS. As placas foram bloqueadas em PBS/2-3% de BASA, e diluições seriais dos sobrenadantes da cultura incubados em temperatura ambiente para 2-3 horas. As placas foram lavadas três vezes em PBS/0,05% de Tween 20, e incubadas com conjugado de peroxidase de rábano silvestre e IgG2 a anti-camundongo de cabra F(ab’2) (Southern Biotechnologies) e IgG anti- camundongo de cabra (KPL) misturados juntos, cada a 1:3500 em PBS/1,0% de BSA, ou peroxidase de rábano silvestre conjugado com IgG1 anti-humano de cabra F(ab’2) (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) em 1:2500 durante 1-2 horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas quatro vezes em PBS/0,05% de Tween 20, e ligação detectada com SureBlue Reserve, substrato TMB (KPL Labs, Gaithersburg, MD). As reações foram interrompidas por adição de volume igual de 1N HCl, e placas lidas a 450nM em um leitor de placa Spectramax Pro (Microdevices, Sunnyvale CA). Os clones com a produção superior da molécula de nuclease híbrida foram expandidos em frascos T25 e então T75 para prover números adequados de células para congelamento e para produção progressiva da proteína de fusão. Os níveis de produção foram ainda aumentados em culturas de quatro melhores clones por amplificação progressiva no meio de cultura contendo metotrexato. Em cada passagem sucessiva de células, o meio completo Excell 302 contendo uma concentração aumentada de metotrexato, de modo que apenas as células que amplificaram o plasmídeo DHFR poderiam sobreviver.
[0223] Os sobrenadantes foram colhidos a partir das células CHO expressando a molécula de nuclease híbrida, filtrada através de 0,2 μ m de filtros de expressão PES (Nalgene, Rochester, N.Y.) e foram passadas sobre uma coluna de Proteina A-agarose (IPA 300 agarose reticulada) (Repligen, Needham, Mass.). A coluna foi lavada com tampão de lavagem de coluna (90mM de Tris-Base, 150mM de NaCl, 0,05% de azida de sódio, pH 8,7), e a proteína de ligação foi eluída usando 0,1 M de tampão citrato, pH 3,0. As frações foram colhidas e a concentração da proteína foi determinada em 280nM usando um espectrofotômetro de micro-amostra Nanodrop (Wilmington DE), e a determinação do branco usando 0,1 M do tampão citrato, pH 3,0. As frações contendo as moléculas de nuclease híbrida foram fundidas, e a troca de tampão realizada por fusos seriais em PBS usando concentradores Centricon seguido por filtragem através de dispositivos de filtros de 0,2 μ m, para reduzir a possibilidade de contaminação por endotoxina.
Exemplo 2: Construção de genes de fusão RNase-Ig
[0224] A RNase 1 de murino foi amplificada como um cDNA de extensão total a partir de um banco EST (do Dr. C. Raine, Albert Einstein School of Medicine”, Bronx, NY) que enviou o clone para nosso laboratório sem um MTA. A sequência específica dos primers 5’ e 3’ utilizadas foram das sequências publicadas. A sequência do clone foi verificada através da análise de sequenciamento. O número de acesso no Genebank é NCB1 geneID 19752. A RNase 1 humana de comprimento total foi isolada a partir de preparados aleatórios e cDNA preparado de oligo-dT derivado de RNA total de pâncreas humano (Ambion/Applied BIosystems, Austin, TX).
[0225] Uma vez que o clone de extensão total foi isolado, os primers foram designados para criar um gene de fusão com os domínios Fc da IgG2a de camundongo ou IgG1 humana (SEQ ID NO:40). Dois primers diferentes foram designados para a sequência 5’ fundidos no terminal amino da cauda Fc; o primeiro incorporado ao peptídeo líder nativo a partir da RNase de camundongo (ou humano), enquanto o segundo ligado a um sítio AgeI para o terminal amino de RNase no sítio de clivagem do peptídeo sinal previsível de modo a fundir a RNase para um peptídeo líder VKIII humano que já tinha sido clonado e utilizado para outros estudos de expressão. Para a RNase de murino, a sequência do primeiro primer é: mribNL5’ 30mer (RNase 5’ com líder nativo e HindIII+Kozak) gTT AAg CTT gCC ACC ATg ggT CTg gAg AAg TCC CTC ATT CTg-3’ (SEQ ID NO:1)
[0226] O segundo primer cria uma junção de fusão do gene entre uma sequência líder existente e a sequência madura na extremidade 5’ da RNase, em ou nas proximidades do sítio de clivagem do peptídeo líder previsto. 27mer (RNase 5’ sequência madura (sem lider, com sítio AgeI) 5’-gAT ACC ACC ggT Agg gAA TCT gCA gCA CAg AAg TTT CAg-3’ (SEQ ID NO:2)
[0227] A sequência do primer 3’ para fusão à IgG2a de murino na extremidade carboxi de RNase e o terminal amino da cauda Fc é como a seguir: mrib3NH2 28mer (RNase na extremidade 3’ com sítio XhoI para fusão ao mIgG2a). 5’-ggC TCg AgC ACA gTA gCA TCA AAg tGG ACT ggT ACg TAg g-3’ (SEQ ID NO:3)
[0228] Mais dois oligos foram designados para criar um gene de fusão -Ig-RNase, onde a cauda -Ig é um terminal amino para o domínio da enzima RNase. mrib5X 36mer RNase na extremidade 5’ com o líder aa e o sítio XbaI para fusão à extremidade carboxi do domínio Fc. 5’-AAA TCT AgA CCT CAA CCA ggT Agg gAA TCT gCA gCA CAg AAg TTT CAg-3’ (SEQ ID NO:4) mrib3X 31mer RNase na extremidade 3’ com dois códons de parada e sítio XbaI para fusão à extremidade carboxi do domínio Fc. 5’-TCT AgA CTA TCA CAC AgT AgC ATC AAA gTg gAC Tgg TAC gTA g- 3’ (SEQ ID NO:5)
Exemplo 3: Isolamento dos domínios Fc de camundongo e humano e introdução de mutações na sequência codificante
[0229] Para isolamento dos domínios Fc de camundongo e humano(SEQ ID NO:40), o RNA foi derivado de tecidos humanos ou de tecidos de camundongo como a seguir. Uma suspensão de célula única foi gerada a partir do baço de camundongo em meio de cultura RPMI. Alternativamente, os PBMCs humanos foram isolados do meio fresco, todo o sangue usando meio de separação de linfócito (LSM), Organon Teknika (Durham, NC), camada de células brancas colhidas de acordo com as indicações do fabricante, e células lavadas três vezes em PBS antes do uso. As células foram pelotizadas por centrifugação do meio de cultura, e 2x107células foram utilizadas para preparar o RNA. O RNA foi isolado a partir das células usando o kit QIAGEN RNAeasy (Valencia, Calif.) do kit de isolamento do RNA total e colunas de QIAGEN QIAshredder, de acordo com as instruções do fabricante acompanhando os kits. Um micrograma (4 μ g) do RNA total foi utilizado como modelo para preparar o cDNA através de transcrição reversa. O RNA, 300 ng dos primers aleatórios, e 500 ng do Oligo dT (12-18), e 1 μ l de dNTPs 25 mM foram combinados e desnaturados a 80°C para 5 minutos antes da adição da enzima. A transcriptase reversa Superscript III (Invitrogen, Life Technologies) foi adicionada ao RNA mais a mistura do primer em um volume total de 25 μ l na presença do segundo tampão de fita e 0,1 M DTT provido com a enzima. A reação de transcrição reversa foi deixada a prosseguir a 50°C por uma hora. O cDNA foi purificado usando colunas de purificação em PCR QIAquick (QIAGEN) de acordo com as indicações do fabricante, e eluídas em 40 microlitros do tampão EB antes do uso nas reações de PCR.
[0230] Os domínios Fc alelo-selvagem de camundongos e humanos foram isolados por amplificação por PCR usando o cDNA descrito acima como modelo. Os primers a seguir foram utilizados para amplificação inicial das sequências alelo- selvagem, mas incorporados nas mudanças mutacionais desejadas no domínio de articulação: mahIgG1CH2M: 47 mer 5’-tgtccaccgtgtccagcacctgaactcctgggtggatcgtcagtcttcc-3’ (SEQ ID NO:6) hIgG1-5scc: 49 mer 5’-agatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgtccaccgtgt-3’ (SEQ ID NO:7) mahIgG1S: 51 mer 5’-tctagattatcatttacccggagacagagagaggctcttctgcgtgtagtg-3’ (SEQ ID NO:8) muIgG2aCH2: 58mer 5’- cctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggatcatccgtcttcatcttcc-3’ (SEQ ID NO:9) mIgG2a-5scc: 47mer 5’-gaagatctcgagcccagaggtcccacaatcaagccctctcctcca-3’ (SEQ ID NO:10) mIgG2a3S: 48mer 5’-gtttctagattatcatttacccggagtccgagagaagctcttagtcgt-3’ (SEQ ID NO:11)
[0231] As reações de PCR foram realizadas usando um ciclador térmico C1000 (BioRad, Hercules CA) ou um ciclador térmico Eppendorf (ThermoFisher Scientific, Houston TX). As reações incluem uma etapa de desnaturação inicial a 95°C durante 2 minutos, seguido por 34 ciclos com 94°C, 30 segundos de desnaturação, 50°C, 30 segundos de anelamento, e 72°C, 1 minuto da etapa de extensão, seguido por uma extensão final de 4 minutos a 72°C. Uma vez que as caudas alelo- selvagem foram isoladas, os fragmentos foram TOPO clonados dentro de vetores pCR2.1, o DNA preparado usando os kits minipreparados do plasmídeo QIAGEN spin de acordo com as instruções do fabricante e clonados sequencialmente usando as reações de sequenciamento ABI Dye Terminator v3.1 de acordo com as instruções do fabricante.
[0232] O DNA a partir dos clones corretos foram utilizados como modelo na extensão de sobreposição dos PCRs para introduzir as mutações nas posições desejadas na sequencia codificante para a IgG2a de camundongo ou IgG1 humana. As reações de PCR foram arranjadas usando a extensão total dos clones de alelo-selvagem como modelo (1 microlitro), 50 pmol dos primers 5’ e 3’ do PCR em cada porção do domínio -Fc até o e incluindo o sítio de mutação desejada a partir de cada direção, e o PCR de alta fidelidade Supermix (Invitrogen, Carlsbad CA), na reação com 50 microlitros de volume usando um ciclo de amplificação curta. Como um exemplo da mutagênese de sobreposição em PCR, a combinação do primer utilizada para introduzir a mutação P331S dentro da -IgG1 humana, foi como a seguir:
[0233] Um subfragmento 5’ foi amplificada usando a extensão total do clone alelo-selvagem como modelo, e o primer 5’ foi hIgG1-5scc: 5’- agatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgtccaccgtgt-3’ (SEQ ID NO:12), embora o primer 3’ foi P331AS:5’- gttttctcgatggaggctgggagggctttgttggagacc-3’ (SEQ ID NO:13). Um subfragmento 3’ foi amplificado usando a extensão total do clone alelo-selvagem como modelo e o primer 5’ foi P331S: 5’aaggtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaacaatctcc-3’ (SEQ ID NO:14), enquanto o primer 3’ foi mahIgG1S: 5’- tctagattatcatttacccggagacagagagaggctcttctgcgtgtagtg-3’ (SEQ ID NO:15).
[0234] Uma vez que os subfragmentos foram amplificados e isolados por eletroforese em gel de agarose, eles foram purificados por colunas de purificação em gel QIAquick e eluídas em 30 microlitros do tampão EB de acordo com as instruções do fabricante. Duas rodadas do PCR foram então realizadas com dois subfragmentos como modelos de sobreposição em novas reações. O ciclador foi pausado e os primers dos flancos 5’(hIgG1-5scc, ver acima) e 3’ (mahIgG1S, ver acima) foram adicionados às reações (50 pmol cada). As amplificações de PCR foram então realizadas em 34 ciclos nas condições descritas para a molécula alelo-selvagem acima. Os fragmentos de extensão completa foram isolados por eletroforese em gel, e TOPO clonados nos vetores pCR2.1 para a análise da sequência. Os fragmentos dos clones com a sequência correta foram então subclonados dentro dos vetores de expressão para criação das moléculas de nuclease híbridas diferentes descritas acima.
Exemplo 4:
[0235] Quantificação da proteína RSLV-124 e atividade da enzima RNase no soro do camundongo:
[0236] Análise da estabilidade in vivo em camundongos do constructo RSLV-124 (SEQ ID NO;106)
[0237] Quatro camundongos (C220, C221, C222, C223) foram injetados intravenosamente com uma injeção única de RSLV-124 no tempo zero. Vem vários períodos após a injeção, amostras de sangue foram colhidas e analisadas quanto á presença da proteína RSLV-124 (uma RNase alelo-selvagem humana ligada a um domínio Fc IgG1 humano alelo-selvagem (SEQ ID NO:106) e a atividade enzimática RNase. Para detectar o composto RSLV-124 no soro do camundongo, um ELISA foi desenvolvido para captura do Fc humana a partir do soro de camundongo seguido pela detecção da RNase humana. Quando o ELISA foi realizado nas amostras de sangue do quarto camundongo, a presença de RSLV- 124 foi detectada nos cinco minutos após a injeção intravenosa única de 150 ug, entre 38 μ g/ml a 55 μ g/ml (Figura 2). Um dia após a injeção, a concentração de RSLV-124 caiu rapidamente para entre 8 μ g/ml a 12 μ g/ml. A concentração no sangue do fármaco permaneceu relativamente estável durante a análise até sete dias quando os níveis de sangue do fármaco foram de aproximadamente 5 μ g/ml. As mesmas amostras de sangue utilizadas para medir a proteína RSLV-124 por ELISA foram utilizadas para quantificar a atividade enzimática de RNase do fármaco. O Sistema RNaseAlert QC da Ambion (CA # AM 1966) foi utilizado para medir a cinética da enzima da proteína RSLV-124 nas amostras de sangue do camundongo com algumas modificações. O composto do fármaco foi capturado a partir do soro do camundongo sobre a placa de avaliação RNaseAlert usando um anticorpo monoclonal anti-Fc e quantificado através da medida da fluorescência por meio das instruções do kit Ambion. A análise das unidades fluorescentes relativas (RFU’s) da molécula RSLV-124 demonstrou entre 80,000 - 140,000 RFUs em cinco minutos após a injeção (Figura 3). A RFU’s declinou rapidamente em paralelo com a concentração daproteína, permanecendo relativamente estável entre 18,000 - 40,000 RFU’s para o dia sete. O sistema RnaseAlert QC foi utilizado para desenvolver uma curva padrão usando quantidades conhecidas da proteína, a partir desta curva padrão, o RFU’s de RSLV-124 na amostra de sangue foram utilizadas para extrapolar a concentração da proteína de RSLV-124. A partir desta análise foi determinado que a concentração da proteína presente no sangue de camundongo em relação aos sete dias de experimento, como calculado usando a avaliação da atividade enzimática da RNase foram muito similares aos valores que foram medidos usando o ELISA (Figura 4). A partir destes experimentos foi concluído que o composto RSLV-124 é estável in vivo na circulação do camundongo em relação aos sete dias e retém sua atividade enzimática, sugerindo que o composto não é suscetível à degradação in vivo no camundongo uma vez que 100% da atividade enzimática são retidas durante os sete dias na circulação no camundongo. Uma vez que as proteínas de fusão Fc são frequentemente suscetíveis à degradação na circulação, esta descoberta confirma ainda o uso das proteínas de Fusão Rnase-Fc como fármacos valiosos.
Exemplo 5: Fenótipo de camundongo transgênico duplo TLR7.1xRNaseA
[0238] Foram criados camundongos que super-expressam a RNaseA (RNase Tg). Esta nuclease foi expressa em níveis elevados em RNase Tg de camundongo. Foi desenvolvido ambos, um método de difusão radial único (SRED) (Figura 5 e uma quantidade muito maior de ELISA para quantificar a RNase no soro (figura 6)). Ambas as análises mostraram um aumento significante na atividade RNase na RNase Tg. Q quantificação do nível de RNase na Figura 6 comparada com o camundongo B6 alelo-selvagem demonstrou existir um aumento de aproximadamente 10 vezes da RNase na RNase Tg. Foi cruzada a RNase Tg com TLR7.1 Tg de camundongo para criar o Tg duplo (DTg). O TLR7.1 de camundongo teve 8-16 cópias de TLR7 e desenvolveu uma doença muito agressiva, uma doença do tipo lúpus rapidamente progressivo, e iniciou a morte em 3 mo de idade com uma sobrevivência média de 6 mo. Em uma análise preliminar, os inventores sangraram DTg e os controles da cria (“littermate”) com 3 m.o de idade para ver se os camundongos DTg apresentavam sinais de melhora. Como mostrado na figura 5, os camundongos DTg tiveram níveis muito altos de RNAse em seu soro (equivalente a >13 U/ml de RNase com base em nosso padrão com a atividade específica de 993 U/mg). A concentração de RNaseA em Tg e DTg de camundongo foi também medida pela análise ELISA como mostrado na Figura 6. A RNaseA Tg e TLR7.1XRNase A Dtg de camundongo teve concentrações de soro RNase entre 1-2 ng/ml. Método detalhado para RNase A ELISA 1. placa revestidas com anti-RNase A Abcam Ab(ab6610): 2,5-10 μ g/ml O/N em 4C 2. Lavagem da placa 3 vezes com 0,05% de Tween/1XPBS 3. Bloqueio com 1% de BSA em PBS por pelo menos 1 hora 4. Lavar aplaca 3 vezes com 0,05 de Tween/1XPBS 5. Carregar as amostras. Diluições das amostras a 1:50 6. Incubar a temperatura ambiente durante 2 horas 7. Lavar as placas 3 vezes com 0,05% de Tween/1XPBS. 8. Preparar a diluição de anti-RNase marcada com biotina Ab em diluição de 1:4500 (2,2 μ g/ml). 9. Lavar a placa 3 vezes 10. Diluir StrepAV HRP (Biolegedn 405210) 1:2500. Cobrir com lâmina metálica e folha em temperatura ambiente (RT) durante 25-30 minutos 11. Lavar 6 vezes, deixar o líquido assentar nos poços por pelo menos 30 segundos entre as lavagens 12. Adicionar o substrato BD OptEIA A+B 1:1. Esperar até alterar a cor 5-10 minutos no máximo. Não deixar o padrão do poço ser superior a 1,0. Adicionar 80 μ L. (CatNos.: 51- 2606KC, Reagente A, 51-2607KC; Reagente B) 13. Adicionar 40μ l de ácido sulfúrico 1M para interromper a reação. Informação Produto/Reagente: RNaseA Ab: ab6610 (90 mg/ml) Tampão ELISA: 1%BSA em PBS Tampão de lavagem ELISA: 0,05% de Tween/1XPBS Conjugado de biotina anti-RNaseA Ab: Rockland: 200-4688 (10 mg/ml) Strep AV HRP: Biolegend 405210 Reagente BD OptEIA A e B: 51-2606KC e 51-2607KC
Exemplo 6: Curvas de sobrevivência para cepas de camundongos transgênicos TLR7.1
[0239] Existe uma diferença significativamente maior do DTg e dos controles TLR7.1 na sobrevivência. Como mostrado na Figura 7, em 10 meses, 61% de TLR7.1 do camundongo foi morto, enquanto 31% de camundongos DTg morreram. Este dado demonstra que a super-expressão de RNaseA exerceu um forte efeito terapêutico. As razões pelas quais os camundongos TLR7.1 morreram prematuramente não foram completamente claras, apesar da anemia severa, trombocitopenia, e glomerulonefrite poder participar de uma parte. Para determinar se a célula vermelha e a contagem de plaquetas foram positivamente impactadas pela expressão da RNaseA em camundongos DTg, nós realizamos uma contagem do sangue, mas não observamos diferenças entre os camundongos TLR7.1 e DTg. Em contraste, existe uma melhora significativa na histopatologia do rim em camundongos DTg. Foi observada a diminuição da deposição de IgG e C3 em camundongos DTg. A coloração PAS, que reflete a inflamação nos mesangios também foi reduzida em camundongos DTg comparado aos controles TLR7.1 na cria (“littermate”). Quando os inventores compararam a infiltração dos macrófagos dos rins usando o anticorpo anti-MAC-2 (galectina 3) (Lyoda et al., “Nephrol Dial Transplat.”, 22:3451, 2007), existiam muito poucas células Mac-2 positivas nos glomérulos dos camundongos DTg. Os resultados da contagem de 20 glomérulos por camundongo em 5 camundongos em cada grupo revelou uma média +/- SE de 3,8+/-1,1 e 1,4+/-0,2 para um único versus DTg respectivamente, p = .05. Em adição, foi quantificado o tamanho dos tufos glomerulares (“glomerular tuft”) e observado uma redução significante no tamanho dos tufos glomerulares nos camundongos DTg (179+/-41 versus 128+/-16,8 um2 em um sozinho versus DTg respectivamente, p = 0,037). Em resumo, TLR7.1XRNaseA DTg camundongo sobrevive mais do que suas crias TgTLR7.1 sozinhas e tem menos inflamação e danos em seus rins.
Exemplo 7: Análise de IRGs em baço de camundongos TLR Tg.
[0240] Análise dos genes de resposta de interferon (IRgs) nos baços de camundongos TLR7.1 Tg e camundongos TLR7.1XRNase DTg mostrou que a expressão do gene IRF7 foi significativamente menor nos camundongos DTg (p=0,03). Alguns outros IRGs incluindo MX1 (Proteína de ligação ao GTP induzida pelo interferon Mx1 (UniProtKB P09922)) e V1G1 (Domínio de metionina S-adenosila radical contendo a proteína 2 (UniProtKB Q8CBB9)) foram menores em camundongos DTg comparado ao camundongo Tg, mas as diferenças não foram significantes (figura 8). O PCR quantitativo foi realizado como a seguir: RNA total foi isolado do baço de camundongos usando o kit mini RNeasy (QIagen, Valencia, CA, USA), DNase tratada usando Turbo DNA-free (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e o cDNA da primeira fita foi produzido com o kit RNA-para-cDNA (Applied Biosystems) usando primers aleatórios. O 260/280 estava entre 1,7 e 2,0 para o RNA isolado medido com um NanoDrop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). O cDNA foi diluído em um equivalente de 1 ng/ul do RNA total e 8ul foram utilizados por reação. Os primers para o gene de referência (18s) e os genes de interesse (GOI) foram sintetizados (IDT, Coralville, Iowa, USA) e diluídos em concentrações apropriadas para qPCR usando água em grau molecular. Os resultados de BLAST dos primers demonstrou homologia de sequência específica apenas para o gene de referência ou GOI. As reações em duplicata (20ul) foram corridas em um sistema ABI Fast 7500 usando uma mistura 1:1 do modelo e primer para a mistura principal SensiMix SYBR Low-ROX (Bioline, London, UK). A quantificação relativa foi calculada usando o método 2-ddCTcom idade aproximada de camundongos B5 alelo-selvagem como linha de base para determinar as mudanças na dobra para cada GOI. As curvas de dissociação para as reações demonstraram um pico de fusão único para cada gene. A curva padrão demonstrou similar eficiência de amplificação para cada gene e que as concentrações do modelo estavam dentro da variação dinâmica linear para cada um do conjunto de primer.
Exemplo 8: Construção e expressão de DNase1-Ig único e duas moléculas de nuclease híbridas da enzima.
[0241] Os alelos de ocorrência natural da DNase1 humana ou moléculas do tipo DNase1 foram reportados. A mutação A114F foi previamente relatada por ocorrer em variantes naturais das enzimas tipo DNase1 humano, e por resultar em resistência à actina das enzimas contendo esta mudança de sequência. Ver Pan, CQ, Dodge TH, Baker DL, Prince WE, Sinicropi DV, and Lazarus RA. “J. Biol. Chem.”, 273: 18374-18381, (1998); Zhen A, Parmelee D, Hyaw H, Coleman TA, Su K, Zhang J, Gentz R, Ruben S, Rosen C, and Li Y. “Biochem. and Biophys. Res. Comm.”, 231: 499-504 (1997); and Rodriguez AM, Rodin D, Nomura H, Morton CC, Weremowicz S, and Schneider MC. Genomics 42: 507-513 (1997), todos os quais foram aqui incorporados por Referência.
[0242] Similarmente, a mutação G105R foi reportado recentemente como um polimorfismo único de nucleotídeo no gene codificante da DNase1 humana que foi polimórfico em algumas ou todas as populações, e que é relevante para a autoimunidade. (Ver Yasuda t., Ueki M., Takeshita H., Fujihara J, Kimura-Kataoka K, Lida R, Tsubota E, Soejima M, Koda Y, Dato H, Panduro A. “Int. J. Biochem. Cell. Biol” 42(7): 1216-1225 (2010), incorporado aqui por referência). As variantes alélicas nesta posição resultaram em alta atividade das isoformas de DNase1 abrigadas em relação ao alelo selvagem. Uma outra mutação polimórfica de ocorrência natural (R21S) também foi reportada por conferir atividade maior (Ver Yasuda, supra).
[0243] Os pacientes SLE foram reportados por ter níveis significativamente diminuídos da atividade DNase1 (Ver, Martinez-Valle F, Balada E., Ordi-Ros J, Bujan-Rivas S., Sellas-Fernandez A., Vilardell-Tarres M., Lupus 18(5): 418423 (2009), incorporado aqui por referência).
[0244] As variantes da enzima de ocorrência natural podem, assim, serem menos imunogênicas quando administradas aos pacientes, uma vez que estas isoformas de ocorrência na população humana. Concordamos que a combinação das propriedades resistentes a actina dos alelos similares ao A114F com a atividade enzimática aumentada dos alelos tipo G105R poderia produzir variantes alélicas novos da DNase1 humana que pode demonstrar atividade clínica melhorada in vitro e in vivo. Para nosso conhecimento, o nosso é o primeiro relato desta nova forma mutante de NDase1 gerada a partir da combinação de duas variantes de ocorrência natural G105R e A114F.
[0245] A DNase1 humana foi isolada como descrito previamente a partir do RNA do pâncreas humano (Ambion), por cDNA preparados aleatoriamente e o PCR usando o conjunto de primers a seguir: 5’hDNase1-age: GTT ACC GGT CTG AAG ATC GCA GCC TTC AAC ATC CAG (SEQ ID NO:16). 5’hDNase1-bx: GTT CTC GAG ATC TTT CAG CAT CAC CTC CAC TGG ATA GTG (SEQ ID NO:17).
[0246] Alternativamente, os cassetes 3’ DNase foram amplificados por PCR usando o par de primers a seguir: 3’hDNase1-RV: GTT GAT ATC CTG AAG ATC GCA GCC TTC AAC ATC CAG (SEQ ID NO:18). 3’hDNase1-stop: GTT TCT AGA TTA TCA CTT CAG CAT CAC CTC CAC TGG ATA GTG (SEQ ID NO:19).
[0247] As reações de PCR foram realizadas usando 50 pmol em cada primer, 2ul de cDNA, em um volume total de 50 ul usando um PCR Supermix Platinum, como previamente descrito. O perfil de amplificação foi de 94C, 30 segundos; 55C, 30 segundos; 68C, 90 segundos, durante 35 ciclos.
[0248] Uma vez que o gene do alelo selvagem foi amplificado por PCR, os fragmentos foram submetidos à eletroforese em gel e fragmentos de 850 bp purificados por purificação em coluna QIAquick. Os fragmentos foram clonados dentro do pCR2.1, transformados por clone TOPO de acordo com as instruções do fabricante como descrito para os outros constructos. Uma vez que a sequência foi verificada, os primers de PCR foram utilizados para produzir os subfragmentos contendo alelos de ocorrência natural para DNase 1 que foram reportados por melhorar a atividade específica e aperfeiçoar a resistência à atividade inibitória da actina. Estes subfragmentos contidos na sequência de sobreposição, permitindo a amplificação dos subclones de DNAse1 completos contendo as variações dos alélicos desejados. As células COS7 foram transfectadas transitoriamente em discos de 60 mm usando o reagente de transfecção Polyfect (Qiagen, Valencia, CA). O DNA plasmidial foi preparado usando os kits de minipreparo Qiagen QIAPrep de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmídeos foram eluídos em 50 ul de tampão EB. A concentração do DNA foi medida usando Nanodrop e uma alíquota equivalente a 2,5 μ g do DNA plasmidial usado para cada reação de transfecção. Cada cassete de expressão DNaseIg ou RNase-Ig-DNAse foi inserido dentro do vetor de expressão de mamífero pDG, um derivado de pcDNA3.1. As células transfectadas foram incubadas durante 72 horas a 37°C, 5% de CO2 antes de serem colhidas dos sobrenadantes da cultura para análise adicional. Os sobrenadantes da cultura foram colhidos, as células residuais centrifugadas a partir da solução, e o líquido transferido para novos tubos.
[0249] As células COS7 foram transfectadas transitoriamente com plasmídeos contendo DNase 1 humana alelo selvagem ou alelos mutantes de DNase1 de ocorrência natural (G105R e/ou A114F) fundidas ao domínio Fc de IgG1 humana alelo-selvagem. Este cassete CH2-CH3 de articulação contém uma mutação única C^S na região de articulação para eliminar a primeira cisteína neste domínio uma vez que ele não emparelha devido à ausência de seu parceiro de emparelhamento presente na cadeia leve do anticorpo. Em adição, mais complexos de proteína de fusão de múltiplas nucleases foram também expressos a partir das transfecções transitórias da célula COS.
Exemplo 9: Isolamento de caudas Ig humanas, introdução de mutações dentro da sequência codificante, e construção de moléculas de nuclease mutante
[0250] Para isolamento dos domínios Fc Ig humanos mutantes, o RNA foi derivado de PBMCs humanos isolados a partir de todo sangue fresco, usando meio de separação de linfócitos (LSM), Organon Teknika (Durham, NC), camada de células brancas colhidas de acordo com as indicações do fabricante, e as células foram lavadas três vezes em PBS antes do uso. As células foram pelotizadas através da centrifugação a partir do meio de cultura, e 2x107células foram utilizadas para preparar o RNA. O RNA foi isolado a partir das células usando o kit QIAGEN RNAeasy (Valencia, Calif.) o kit de isolamento do RNA total e as colunas de QIAGEN QIAshredder, de acordo com as instruções do fabricante acompanhando os kits. Um micrograma (1 μ g) do RNA total foi utilizado como modelo para preparar o cDNA através de transcrição reversa. O RNA, 300 ng dos primers aleatórios, e 500 ng do Oligo dT (12-18), e 1 μ l de dNTPs 25 mM foram combinados e desnaturados a 80°C para 5 minutos antes da adição da enzima. A transcriptase reversa Superscript III (Invitrogen, Life Technologies) foi adicionada ao RNA mais a mistura do primer em um volume total de 25 μ l na presença do segundo tampão de fita e 0,1 M DTT provido com a enzima. A reação de transcrição reversa foi deixada a prosseguir a 50°C por uma hora. O cDNA foi purificado usando colunas de purificação em PCR QIAquick (QIAGEN) de acordo com as indicações do fabricante, e eluídas em 40 microlitros do tampão EB antes do uso nas reações de PCR.
[0251] Os domínios Fc Ig alelo-selvagem humanos foram isolados por amplificação por PCR usando o cDNA descrito acima como modelo. Os fragmentos Ig- mutantes foram isolados por mutagêneses dirigida por PCR, usando os primers de PCR contendo as mutações desejadas e o cassete de alelo-selvagem como molde. As reações de PCR foram realizadas usando um ciclador térmico C1000 (BioRad, Hercules CA). As reações incluíram uma etapa de denaturação inicial a 95°C durante 2 minutos, seguido por 34 ciclos com uma denaturação a 94°C, durante 30 segundos, 55°C, 30 segundos de anelamento, e 72°C, 1 minuto em uma esta de extensão, seguido por uma extensão final de 4 minutos a 72°. Uma vez que caudas mutantes de comprimento total forma isoladas, os fragmentos foram TOPO clonados em vetores pCR2.1, o DNA preparado usando o kit miniprep de plasmídeo QIAGEN spin, de acordo com as instruções do fabricante e os clones sequenciados usando reações de sequenciamento em Terminais ABI DYE v3.1, de acordo com as instruções do fabricante.
[0252] As moléculas recombinantes foram geradas por mutagênese de PCR usando PCR de sobreposição de extensão com oligonucleotídeos alterados.
[0253] Os oligonucleotídeos a seguir foram usados para derivar estas moléculas. CS-P238S 5-1: TCT CCA CCG AGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGA GGA TCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC C (58mer) (SEQ ID NO: 20) SSSH-5-2: AGA TCT CGA GCC CAA ATC TTC TGA CAA AAC TCA CAC ATC TCC ACC GAG CCC AGC ACC T (58 mer) (SEQ ID NO: 21) P331S-S: GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC A (46mer) (SEQ ID NO: 22) P331S-AS: TGG AGA TGG TTT TCT CGA TGG GGG CTG GGA GGG CTT TGT TGG AGA CC (47mer) (SEQ ID NO: 23) hIgG1-3’WTnogt: TCT AGA TTA TCA TTT TCC CGG AGA GAG AGA GAG GCT CTT CTG CGT GTA GTG (51mer) (SEQ ID NO: 24)
[0254] A mutação P238S e substituições SSS para SCC foram introduzidas por mutagenese por PCR usando duas 5’ oligos de sobreposição nas reações sequenciais de PCR. A primeira reação de PCR incluiu o primer 5’ a seguir que incorpora a mutação P238S dentro de sua sequência: CS-P238S 5-1: TCT CCA CCG AGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGA GGA TCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC C (58mer). (SEQ ID NO: 25).
[0255] A segunda reação de PCR incluiu o primer 5’ a seguir que sobrepos o primeiro primer e adiciou sobre os resíduos de articulação aterados no mutante P238S: SSSH-5-2: AGA TCT CGA GCC CAA ATC TTC TGA CAA AAC TCA CAC ATC TCC ACC GAG CCC AGC ACC T (58 mer). (SEQ ID NO: 26).
[0256] O DNA dos clones corretos foi utilizado como modelo na extensão de sobreposição dos PCRs para introduzir as mutações nas posições internas desejadas na sequencia codificante para a -IgG1 humana. As reações de PCR foram arranjadas usando a extensão total dos clones como modelo (1 microlitro), 50 pmol dos primers 5’ e 3’ para o PCR em cada porção da cauda -Ig até o e incluindo o sítio de mutação desejada a partir de cada direção, e o PCR de alta fidelidade Supermix hi (Invitrogen, Carlsbad CA), em volumes de reação de 50 microlitros usando um ciclo de amplificação curta. Como um exemplo da mutagênese de sobreposição em PCR, a combinação do primer utilizada para introduzir a mutação P331S dentro da -IgG1 humana, com a mutação P238s já introduzida como a seguir:
[0257] Um subfragmento 5’ foi amplificado usando a extensão total do clone alelo-selvagem como modelo, e o primer 5’ foi SSSH-5-2: AGA TCT CGA GCC CAA ATC TTC TGA CAA AAC TCA CAC ATC TCC ACC GAG CCC AGC ACC T (58 mer), while the 3’ primer was P331S-AS: TGG AGA TGG TTT TCT CGA TGG GGG CTG GGA GGG CTT TGT TGG AGA CC (47mer). (SEQ ID NO: 27).
[0258] Um subfragmento 3’ foi amplificado usando a estensão total do clone alelo-selvagem como modelo e o primer 5’: P331S-S: GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC A (46mer), while the 3’ primer was hIgG1- 3’WTnogt: TCT AGA TTA TCA TTT TCC CGG AGA GAG AGA GAG GCT CTT CTG CGT GTA GTG (51mer). (SEQ ID NO: 28).
[0259] Uma vez que os subfragmentos foram amplificados e isolados por eletroforese em gel de agarose, eles foram purificados em colunas de purifiação QIAquick gel e eluídas em 30 microlitros de tampão EP de acordo com as instruções do fabricante. Duas corridas de PCR foram então realizadas com dois subfragmentos como modelos de sobreposiçãoem novas reações. O ciclador foi pausado e os primers dos flancos 5’ e 3’ foram adicioandos às reações (50 pmol cada). As amplificações de PCR foram então realizadas durante 34 ciclos nas condições descritas para as moléculas de alelo-selvagem acima. Os fragmentos de extensão total foram isolados por eletroforese em gel, e o TOPO clonados em vetores pCR2.1 para análise da sequência. Os fragmentos a partir dos clones com a sequência correta foram então subclonados dentro dos vetores de expressão para criação das moléculas de nuclease diferentes desritas aqui.
[0260] Para as moléculas de nuclease multiespecífcias, as reações de PCR foram realizadas usando primers alternativas para a extremidade 3’ do domínio Fc, removendo o codon STOP e adicionando o ligante NLG e o sítio de restrição EcoRV para as moléculas para facilitar a fusão do resto do cassete. A sequência do primer foi listada abaixo: 5' GAT ATC CTG CAC GCT AGG GCT GCT CAC ATT 3'. (SEQ ID NO: 29).
[0261] Os mutantes de nuclease RSLV foram construídos através da fusão das caudas Ig- alteradas para o domínio da RNAse do alelo-selvagem com o sem um ligante separando os dois domínios. RSLV 125 e RSLV126 funde-se a RNase humana para a articulação mutante e o domínio IgG1 Fc. RSLV125 não contém ligante, enquanto o RSLV 126 contém o fragment (gli4ser) ligante como um fragment inserido (BgIII-XhoI) entre o domínio de nuclease e as regiões de articulação. RSLV-125 incorpora um cassete alelo-selvagem Rnase fundido diretamente ao SSS (além do CCC ou alelo-selvagem) versão da articulação IgG1 humaan, e um domínio IgG1 Fc humano, mutantes P238S, P331S (SEQ ID NO:61-62).
[0262] O RSLV 126 incorpora um cassete RNase alelo- selvagem fundido a um domínio ligante (gli4ser), seguido pela articulação do mutante SSS, e um domínio Fc mutante duplo P238s-P331S (SEQ ID NO:63-64).
[0263] RSLV-127 é um constructo de fusão multinuclease que incorpora uma Dnase humana amino terminal (G105R/A114F) fundida a um dominio ligante (gli4ser)4, seguido por uma articulação mutante SSS e domínio FC duplomutante P238S-P331S fundido a um domínio ligante NLG e sguido por um C-terminal do domínio RNAse alelo-selvagem (SEQ ID NO:65-66).
[0264] RSLV-128 é um constructo de fusão de multiplas nucleases que incorpora um terminal amino do dominio RNase humano alelo-selvagem, fundido a um domínio ligante (gli4ser)4, seguido por uma articulação mutante SSS e um domínio FC de dupla mutação P238S-P331S fundido a um domínio ligante NLG e seguido por um C-terminal do domínio de DNase mutante (G105R/A114F) (SEQ ID NO:67-68).
[0265] RSLV-129 é um constructo de fusão multiespecífico que incorpora um domínio RNase humano alelo-selvagem amino terminal, fundido a uma articulação mutante SSS e a um domínio Fc duplo mutante P238S-P331S fundido ao domínio ligante NLG e seguido por um domínio de DNase mutante C- terminal (G105R/A114F)(SEQ ID NO:69-70).
[0266] RSLV-132 incorpora um cassete RNase alelo-selvagem fundido diretamente a uma versão SCC da articulação IgG1 humana, e um domínio IgG1 Fc humanao mutante P238S, P331S (SEQ ID NOs: 91-92 E 95-96).
[0267] RSLV-133 é um constructo de fusão multiespecífico que incorpora um domínio RNase humano alelo-selvagem amino terminal, fundido a uma articulação mutante SCC e a um domínio Fc duplo mutante P238S-P331S fundido ao domínio ligante NLG e seguido por um domínio DNase mutante C-terminal (G105R/A114F)(SEQ ID NO:93-94 E 97-98).
[0268] Versões adicionais de RSLV-125-RSLV-129 com uma articulação SCC estão mostradas na Tabela 1 como RSLV-125-2 (SEQ ID NO:77-78), RSLV-126-2 (SEQ ID NO:79-80), RSLV-127-2 (SEQ ID NO:81-82), RSLV-128-2 (SEQ ID NO:83-84), and RSLV- 129-2 (SEQ ID NO:85-86).
0: Western Blot sobre as proteínas de fusão RSLV 125-129 expressas a partir das transfecções COS7
[0269] A figura 9 mostra um Western Blot sobre os sobrenadantes de transfecção COS a partir de constructos RSLV 125-129. Os plasmídeos de expressão contendo RSLV 125, 126, 127, 128, ou 129 foram transfectados em células COS7 usando reagente de transfecção Polyfect e os sobrenadantes colhidos após 48 horas. Em adição as moléculas de nuclease simples contidos em RSLV 125 e 126, mais complexos de proteínas de fusão de multi-nuclease foram também expressos a partir das transfecções transitórias de células COS, codificadas por RSLV 127, 128, e 129. A análise de Western blot foi realizada nos sobrenadantes a partir dos transfectantes transitórios. As moléculas mostradas na figura 9 contém o RNase 1 humana fundida à articulação SSS IgG1 humana, e domínio IgG G1 P238S-P331S Fc ou inclui a RNase humana (alelo-selvagem) fundida ao Domínio Fc CH2-CH3 articulação SSS-(P238S-331S) da IgG1 humana, seguido por um ligante novo contendo um sítio de glicosilação ligado ao N para proteger o domínio ligante da clivagem da protease, e o alelo mutante G105R-A114F formado da DNase1 humana no temrinal carboxi da molécula. Em adição, o RSLV 127 codifica o mutante DNase 1 humano acima no terminal amino e o RNase 1 WT no terminal carboxi da cauda mutante -Ig. Os sobrenadantes COS foram colhidos após 72 horas e amostras de 0,5 ml foram imunoprecipitadas durante a noite a 4°C com 100 ul de contas de proteína A-agarose. As contas de proteína A foram centrifugadas e lavadas duas vezes em PBS antes da ressuspensão em tampão carregado com SDS- PAGE, para redução de gel NuPAGE ou não redução do tampão da mostra LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA). As amostras foram aquecidas de acordo com as instruções do fabricante, as contas de proteína A foram centrifugadas para pelotizar, e o tampão da amostra carregado sobre gel em gradiente NuPAGE DE 5-12%. As amostras foram eletroforesadas a 150 volts durante 1,5-2 horas, e os géis blotados em membranas de nitrocelulose a 30 mamp durante 1 hora. O Western blot foi bloqueado em TBS/5% de leite não integral durante a noite. Os blots foram incubados com 1:2500 HRP (peroxidase de rabano silvestre) conjugada com IgG anti-humana de cabra (Fc específico, Jackson Immunoresearch) durante 1,5 hora em temperatura ambiente, lavada em PBS/0,5% de Tween 20 cinco ou mais, e os blots desenvolvidos usando reagente ECL. Os resultados demonstram que a construção das proteínas de fusão Fc nuclease foi um sucesso e as proteínas são facilmente expressas em células COS. Além disso, a análise da redução e do perfil de não redução para estas proteínas de fusão Fc nuclease confirma que os constructos de DNA codificam proteínas de peso molecular apropriado. O padrão de SDS-PAGE de não redução confirma que as propriedades de ligação do bissulfeto das proteínas são consistentes com o comportamento esperado dos constructos.
1: Análise SRED da afinidade de proteínas purificadas a partir de transfectantes COS7
[0270] A figura 10 mostra a análise SRED comparando as alíquotas de proteínas purificadas de proteínas A, a partir de sobrenadantes COS transfectados com RSLV do 0. Um gel de agarose a 2% foi preparado com água destilada. Poly-IC (Sigma) foi dissolvido em água destilada a 3 mg/ml. A placa de gel foi preparada como a seguir: 1,5 ml de tampão de reação (0,2M Tris-HCl, pH 7.0, 40mM de EDTA e 0,1 mg/ml de brometo de etídio), 1 ml de Poly-IC e 0,5 ml de água foram colocados em um tubo e mantidos a 50°C durante 5 minutos. 3 ml de agarose (mantida a 50°C) foi adicionado ao tubo. A mistura foi imediatamente derramada sobre uma placa de vidro. Os poços de amostra foram perfurados no gel. 2μ l de cada controle, amostra de soro, ou proteínas RSLV purificadas afins, foi carregado nos poços e o gel foi incubado a 37°C durante 4 horas e câmara úmida. Então, o gel foi incubado em um tampão (20 mM de acetato de sódio, pH 5.2, 20 mg/m de brometo de etídio) em gelo durante 30 minutos, e lido sob UV. Os géis foram fotografados em um transiluminador UV usando um sistema de câmara digital Kodak DC290, equipado com filtros de brometo de etídio e analisados usando um software de análise de imagem “Kodak Molecular Imaging”. Os resultados da análise da atividade enzimática da RNase indica que todos os constructos contém porções RNase cataliticamente ativa.
2: Atividade em gel da DNase das moléculas de nuclease RSLV.
[0271] A figura 11 ilustra os resultados a partir da análise da atividade da DNase nuclease realizada sobre a proteína purificada da proteína A dos sobrenadantes COS7 transfectados com os plasmídeos de fusão RSLV no 0. A figura 11 cinco painéis (11a, 11b, 11c), com cada gel do painel mostrado o padrão de digestão com diminuição das quantidades da proteína de fusão indicada e 1 micrograma do DNA plasmídial. Cada proteína foi serialmente diluída em dois incrementos ne nucleases livres de água a partir de 500 ng a 4 ng da enzima. Para cada amostra, foi adicionado 1 ug de DNA plasmídial PDG, incubada durante 30 minutos a 37 graus. Metade de cada amostra foi submetida à eletroforese em gel de agarose durante 30 minutos a 10 volts usando 1.2% de gel de agarose TAE. A figura 11c ilustra os resultados de uma análise da atividade da enzima DNAse em gel usando o DNAse 1 disponível comercialmente (Biolabs, Inc.). A coluna mais distante a direita é um controle negativo com o DNA sozinho e nenhuma enzima, a coluna da esquerda daquela é um outro controle negativo, isto é uma molécula RNase-Ig que tem a atividade RNase, mas nenhuma atividade de DNase, como esperado no DNA plasmídial remanescente intacto e não é digerido em ambos os casos. Os resultados demonstram que a enzima DNase 1 comercialmente disponível é altamente ativa e digere todos os DNA na maioria das concentrações testadas. Os resultados nas figuras 11a e 11b ilustra a atividade da DNAase de quatro diferentes constructos de fusão Fc de nuclease. O painel superior na figura 11a mostra a capacidade de uma proteína de fusão DNase-Ig para digerir o DNA plasmídial, como é aparente a partir do gel, esta enzima digere todo o DNA em todas as concentrações testadas é como ativo, ou mais ativos do que a DNase 1 comercialmente disponível. No painel inferior da figura 11 a é uma proteína Fc de nuclease de fusão biespecífica com a DNase no terminal amino do Fc (SEQ ID NOs: 65-66) e ela também têm a atividade enzimática DNAse, mas um pouco menor do que DNase-Ig no painel superior da Figura 11a. O painel superior da figura 11b mostra a atividade enzimática da DNase de uma outra nuclease biespecífica, esta proteína de fusão Fc tem a DNase sobre o terminal C do Fc conectado ao Fc via um ligante NLG especialmente engenheirado (SEQ ID NOs: 67-68). Como é aparentemente pelos dados desta enzima também tem uma atividade enzimática DNase robusta e parece ser mais ativa do que as outras nucleases biespecíficas examinadas aqui. O painel inferior da figura 11b mostra a atividade enzimática DNase de uma outra molécula de nuclease biespecífica que é perdida (G4S)4 ligante conectando o módulo RNase com o Fc (SEQ ID NO:69-70). Esta nuclease biespecífica também tem boa atividade DNase mas parece ser um tanto menor que as outras proteínas de Fusão de nuclease Fc biespecífica mostradas neste experimento. Estes dados sugerem que todas as nucleases biespecíficas têm boa atividade DNase, o que é um dado inesperado dos esforços passados de outros experimentos neste sentido (Dwyer et al., “JBC”, volume 271, No. 14; pp 97389743). Além disso, a posição da DNase no constructo, bem como o comprimento do ligante e composição conectando a DNase ao Fc são críticos na criação de uma enzima DNase altamente ativa no contexto de uma proteína de Fusão Fc de nuclease biespecífica.
3: análise da cinética da enzima
[0272] As figuras 12-13 mostram os resultados a partir da análise da atividade enzimática fluorescente cinética comparada à atividade da enzima RNase da RNase A recombinante (Ambion), RSLV 125, RSLV 126, nRNase WT-SCCH-WThIGG1, e hRNaseG88D-SCCH-(P238S/K322S/P331S)hIgG1. Para definir, adicionalmente, as características funcionais da proteína de fusão mRNase-Ig bivalente, nos estudamos a cinética da enzima de diferentes proteínas de fusão nuclease usando o substrato Rnase Alert (Ambion/IDT) e fluorescência foi quantificada com um leitor de microplaca Biotek Synergy2. Os dados analisados usando um software Gen5 (Biotek Instruments, Inc., Winooski, Vermont). As unidades de fluorescência relativa como uma função do tempo foram avaliadas a cada minuto durante o curso de um experimento de 45 minutos, incubados a 37°C de acordo com as instruções do fabricante, usando a diminuição do início das concentrações da enzima a partir de 10 pg/ul e diluição serial para 0,1 pg/ul em 0,67x incrementos. Cada amostra incluiu uma concentração fixada do substrato Rnase Alert (200nM) em um tampão de reação 1X Rnase Alert.
[0273] A figura 12 mostra a RFU (unidades fluorescência relativa) versus o tempo para cada proteína em concentrações equimolares, com as proteínas de teste a 4,5 pg/ul ou 4,5ng/ml, e o controle RNAse A recombinante a 1,3 pg/ul na presença de 200 nM do substrato RNase Alert.
[0274] A figura 13 mostra um plot Lineweaver Burk das moléculas diferentes. De modo a estimar o Vmax e Km, a análise de fluorescências cinética RNase Alert foram representadas usando 105pM da enzima, e concentração do substrato foi diminuída a partir de 200 nM para 50 pM em quatro vezes o incremento. Assim, a concentração da enzima foi fixada e a concentração do substrato titulada nesta série de experimento. Os dados mostraram que os plots Lineweaver Burk para as proteínas de fusão diferentes sob estas condições. Tomados juntos, os dados nas figuras 12 e 13 demonstram que as porções RNase são altamente ativa nas três proteínas de fusão RNAse Fc construídas e testadas aqui.
4: Avaliação da citotoxicidade in vitrocontra a linha celular THP-1 humana.
[0275] As figuras 14-15 mostram os resultados dos estudos da análise in vitro dos efeitos das proteínas de fusão RNaseIg com alelo selvagem ou mutante (incluindo SCC, P238S, P331S) domínios -IgG Fc sobre os sobreviventes de uma linha celular monocítica humana, THP1. As células THP1 foram mantidas em crescimento logarítmicos em RPMI/10% de FBS antes da coleta para análise. As células foram maiores que 98% viáveis antes do uso na avaliação citotoxicidade. As células THP1 forma plaqueadas em placas de 96 poços em uma densidade celular de 1x10e6 c/ml, ou 100,000 células por poço. As proteínas de nuclease híbrida foram adicionadas aos poços sucessivos usando uma diluição serial em duas séries iniciado em 5 microgramas/ml e finalizando com 0,01 micrograma/ml da proteína de fusão por reação. Neste experimento, uma proteína de fusão RNase-Fc com uma IgG1 Fc alelo-selvagem (wtRNasewtIgG) foi comparada com uma RNase-Fc com um mutante Fc (P238s, P331S) que teve um receptor Fc significativamente reduzido na ligaçãoe interalização (mtRNasemgIgG), com relação a sua capacidade de induzir a citotoxicidade nas células THP1 cultivada. As reações foram incubadas nas placas de 96 poços por três dias a 37°C, 5% de CO2 antes da coleta de célula e análise. Após três dias, as células foram colhidas por centrifugação a 1000 rpm, lavadas em PBS/2% de FBS, e incubadas com os reagentes do kit de detecção e apoptose FITC Annexin V (#556547, Becton Dickinson/Pharmingen), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram lavadas com 100 microlitros de tampão de ligação frio fornecido com o kit, e o iodeto de Annexin V-FITC/Propidio (PI) adicionado em 1:100 em 100 ul do tampão de ligação. As amostras foram incubadas em gelo por 20 minutos, após o que 400 μ l de tampão de ligação adicional foram adicionados em cada amostra. As amostras coradas foram analisadas por citometria de fluxo usando um FACS Canto (Becton Dickinson) e os dados analisados usando o software Flowjo (Treestar, Ashland, OR).
[0276] A figura 14 mostrou o efeito das proteínas RNase Fc de fusão com o alelo-selvagem ou o domínio Fc mutante sobre as células mortas como medida por dois métodos, Annexin V de ligação (painel superior) e iodeto de propídio de ligação (painel inferior), ambos são medidas sensíveis das células mortas. Este experimento demonstra que a ligação da proteína de fusão RNase com Fc mutante (P238S, P331S) tem ligação reduzida aos receptores Fc sobre a superfície das células THP1, e internalização subsequente da proteína. Os resultados demonstram uma diminuição significante na morte celular pelo mutante RNase-Fc comparado às proteínas de fusão Fc RNase alelo-selvagem (por exemplo, uma diminuição de aproximadamente 3 vezes em 1,25 μ g/ml da proteína). A figura 15 apresenta os resultados dos experimentos de classificação celular de fluorescência ativada (FACS)para examinar a citotoxicidade dos constructos de fusão RNase Fc com um alelo-selvagem ou o domínio Fc mutante (RNAse-wtIgG ou RNase- mtIgG, respectivamente). Os dados demonstram uma diminuição significante no número de células mortas quando as células THP1 são incubadas com o constructo RNase Fc com um Fc mutante (pico de tamanho menor para a direita do gráfico para o mutante RNase Fc comparado ao RNase-wtIgG). Estes dados mostram uma diminuição de aproximadamente 3- a 5- vezes na morte celular pelo mutante RNase Fc comparado ao alelo- selvagem. Estes e outros experimentos examinando a ligação do receptor Fc claramente mostraram que na presença de células sustentando os receptores Fc ao constructo RNase Fc com uma região Fc alterado tem ligação reduzida para receptores Fc e menos internalização pela célula, resultando em menos morte celular devido a atividade RNase do constructo. Os referidos constructos são particularmente úteis no tratamento de doenças autoimunes como ele pode ser indesejável para utilizar uma proteína terapêutica que é citotóxica para as células de sustentação do receptor Fc.
5: produção IFN-alfa por PBMCs humano é inibida pela adição de RSLV-132 para culturas in vivo.
[0277] A adição de RSLV132 aboliu a indução do interferon- alfa a partir das células mononucleares do sangue periférico humano estimulado, usando complexos imunes fomrados com soro a partir de três pacientes SLE mais extrato celular necrótico (NCE) (Figura 16). Para medir a capacidade de RSLV-132 para ligar a e degradar o RNA contido nos complexos imunes dos pacientes com lupus, e uma bioanálise in vitro foi desenvolvida. O experimento envolve a formação dos complexos imunes in vitro usando os auto-anticorpos a partir dos pacientes com lupus e NCE a partir de células humanas cultivadas (U937). A combinação do soro de pacientes com lupus com o NCE resulta na formação de complexos imunes (IC) que são indutores muito potentes de interferon, soro humano normal não estimula a produção de interferon. O IC é incubado com células mononucleares de sangue periférico humano normal (PBMC’s) como células repórter. A produção do interferon pela célula repórter sis medido usando um ELISA do interferon- alfa. As células repórter foram obtidas a partir de voluntários normais pela centrifugação em gradiente de densidade Ficoll. O paciente de lupus ou soro de voluntario normal saudável foi obtido da “University of Washington Institutional Review Board” #HSD No. 3971, o soro foi diluído 1/1000 e adicioando a 10% (v/v) de extrato celular necrótico (NCE) derivado das células U937 cultivadas como acima. O soro do paciente de lupus e do voluntário normal foi incubado com o NCE para 15 minutos em temperatura ambiente, os ICs resultantes foram incubados com ou sem várias doses de RSLV- 132, RSLV-124, ou RNase alelo-selvagem durante 15 minutos então incubadas com PBCMs normais durante 20 horas na presença de 500 U/mL Universal IFN seguido pela medida da quantidade de IFN secretada a partir da cultura de PBMC. O soro foi obtido a partir de três (3) diferentes pacientes com lupus com vários graus da atividade da doença variando de médio para ativo. O NCE foi incubado tanto com o soro do paciente de lupus quanto com o soro de voluntários normais saudáveis na temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido por 20 horas de incubação com PBMCs. A IFN-α foi quantificada pro ELISA onde IFN-α é capturada usando um MAb de camundongo contra a IFN alfa humana (MMHA-11) [PBL Biomedical Laboratories, product #2112-1] e foi detectado usando um anticorpo policlonal de coelho contra IFN alfa [PBL Biomedical Laboratories, product # 31101-1], seguido pelo desenvolvimento usando HRP anti-coelho {Jackson Immuno Research, product # 711-035-152] e substrato TMB. Em alguns casos antes da adição do NCE para PBMCs, o artigo de teste (RSLV-124 ou RSLV-132) foi adicionado em concentrações de 0,16, 0,5; 1,6 e 5,0 ug/mL ou RNase foi adicionada em concentrações de 0,05; 0,16; 0,5 e 1,6 ug/mL (equimolar) para o NCE. A capacidade do soro do paciente com lupus para estimular a produção e IFN a partir de PBMCs foi reduzida em aproximadamente 50% com a adição de 5,0 ug/mL RSLV-124. Esta inibição reflete a quantidade equimolar de RNase. A adição da mesma concentração de huRSLV-132 foi como ou mais eficiente na inibição de IFN do que RSLV-124, com a produção de IFN quase completamente abolida com a adição de 5,0 ug/mL de hURSLV-132. Quando combinada com NCE, os anticorpos anti- RNA/DNA do paciente com lupus são indutores pontes da IFN a partir de PBMCs isolados frescos. O soro a partir de voluntários normais não tem esta mesma capacidade para estimular a produção de IFN a partir das células repórteres. Este dado indica que os auto-anticorpos circulando no soro do paciente com lupus são capazes de formar complexos imunes que presumivelmente despertam o TLR7 e a subsequente produção e IFN. O tipo exato e subtipos de IFN não foram analisados. Este dado indica que RSLV-132 ligam-se aos seus alvos moleculares, o RNA associado com o ICs do paciente com lupus e, degradam potencialmente, prevenindo assim, o estímulo de IFN a partir de PBMCs (Figura 16). RSLV-132 parece ser mais ativo do que RSLV-124 nesta avaliação.
6: RSLV-132 é um inibidor in vivo potente da ativação do Interferon indutor do RNA.
[0278] Para avaliar a capacidade do RSLV-132 em se ligar a e degradar o RNA na circulação do camundongo, um modelo farmacodinâmico foi desenvolvido usando um poliinosinico mimético:ácido policitidílico (poli I:C) que é um ativador robusto da rota do interferon. O poli(I:C) é um RN de fita dupla não combinado com uma fita sendo um polímero de ácido inosínico, o outro é um polímero de ácido citidílico. É conhecida a interação com o receptor do tipo 3 Toll (TLR3) que é expresso na membrana das células B, macrófagos e células dendríticas. O poli(I:C) está disponível na Invitrogen. Os efeitos de poli I:C podem ser quantificados através da medida dos níveis de expressão do genes estimulados pelo interferon no baço de camundongos seguindo a administração. No dia zero 10 camundongos B6, três meses de idade, foram tratados tanto com RSLV-132 (250 ug por camundongo) ou imunoglobulina intravenosa (IVIG) (Privigen, Behring) (250ug por camundongo) como um controle, ambos via injeção intraperitoneal. Vinte horas após a injeção de RSLV- 132 ou IVIG, o poli(I:C) foi injetado nos camundongos a 200ug por camundongo, intraperitonealmente. Duas horas mais tarde, os animais foram sacrificados por exposição ao CO2, os baços foram coletados em RNAlater (Qiagen) e armazenados a -80°C para estudo posterior da expressão dos genes estimulados pelo interferon (ISGs). As amostras de baço foram submetidas ao estudo da expressão de ISGs, incluindo Ifit1 (proteína induzida pelo interferon com tetratricopeptídeo repetidos 1 (UniProt Q64282)), Irf7 (fator regulador do interferon 7 (UniProt P70434)) e o gene Mx1 por qPCR. Os resultados destes experimentos demonstram que a injeção intraperitoneal de RSLV-132 resulta em concentrações no soro de RSLV-132 que são capazes de ligar ao poli (I:C) circulante e efetivamente degradar o RNA mimético, efetivamente assim, prevenindo o estímulo da rota do interferon e os três ISGs monitorados (Figura 17).
7: Análise da cinética da enzima para RSLV-132 e RSLV-133.
[0279] RSLV-132 e RSLV-133 foram transitoriamente expressos em células CHO e purificados usando proteína-A. A atividade RNAse destas proteínas de fusão RNase Fc foi quantificada usando o kit RNaseAlert QC (Cat # AM1966). Várias quantidades da proteína de fusão RNase Fc foram utilizadas e os resultados estão mostrados na figura 18 em relação as unidades de fluorescência relativa (RFUs) durante o tempo. Os resultados demonstram que o RSLV-132 é uma enzima RNase altamente ativa, e tem atividade RNase aumentada em relação a outros constructos de fusão RNase Fc tal como RSLV- 124 e o alelo selvagem de RNas, por exemplo, usando quantidades iguais (400 pM) de RSLV-132 e RSLV-124 resultando em mais do que duas vezes o RFUs (80.000 versus 35,000) para o RSLV-132 vs. RSLV-124. Em adição, duas lotes das produções foram testados quanto a sua estabilidade a 4C. O RSLV-132.1 foi armazenado a 4°C durante 8 semanas antes deste experimento e RSLV-132.2 foi armazenado a -80°C e descongelado apenas antes do teste, demonstrando que a proteína é estável a 4°C por até 2 meses. A estabilidade do fármaco e a atividade catalítica aumentada pode prover eficácia aumentada em um arranjo terapêutico.
[0280] A figura 19 mostra a atividade enzimática de RNAse em RFUs em relação ao tempo, comparando a quantidade da atividade de RNAse da molécula RSLV-133 biespecífica com o RSLV-132 mono-específico, e a RNAse alelo-selvagem. Como demonstrado na figura 19 a molécula RSLV-133 tem atividade RNAse significativamente aumentada em relação à molécula RSLV-124 mono-específica ou, uma nuclease Fc biespecífica precoce, RSLV-123, ou RNase alelo-selvagem, resultando em mais do que 2 vezes o RFUs com uma quantidade igual da proteína. A figura 20 mostra o resultado de uma avaliação da atividade enzimática do DNase da molécula RLSV-133 em comparação com o RSLV-123, um constructo de nuclease biespecífico prévio, e a DNase alelo-selvagem. Neste experimento a atividade enzimática de DNase foi quantificada usando o kit DNaseAlert a partir das tecnologias DNA integradas, clivagem do substrato do DNA resultando em uma emissão de fluorescência que foi quantificada usando um leitor de microplacas de múltipla forma Synergy2 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT). A figura 20 mostra os RFUs da atividade enzimática de DNase durante um tempo para RSLV- 133, RSLV-123, ou DNase alelo-selvagem. Os resultados do experimento demonstra que o RSLV-133 tem atividade DNase aumentada em relação DNase alelo-selvagem e o RSLV-123, a molécula de nuclease biespecífica anterior, resultando em mais do que 3 vezes a atividade da DNase na faixa linear do experimento. A figura 21 demonstra a capacidade da molécula RSLV-133 em digerir o DNA em um experimento de digestão em gel. Os resultados mostram que o RSLV-133 é capaz de digerir o DNA nesta análise tão efetivamente quanto o DNase alelo- selvagem (comparar colunas 5 & 7). Dados os pesos moleculares relativos de RSLV-133 e da DNase alelo-selvagem parece que o RSLV-133 é mais efetivo na digestão do DNA nesta análise bem como.
8: RSLV-132 demonstra a ligação do receptor Fc diminuído.
[0281] Para examinar a capacidade das proteínas de fusão RNAse Fc em ligar os receptores Fc in vitro, RSLV124 (Fc domínio alelo-selvagem) e RSLV-132 (domínio Fc mutante, P238S/P331S) foram incubados com uma linha celular mielóide humana de suporte Fc, o THP1 e a ligação especifica para as células foi quantificada pela análise do estoque de célula ativada por fluorescência (FACS). RLSV-124 e RSLV-132 foram marcados fluorescentemente usando corante Alexa fluor AF-647 a partir da Invitrogen (Cat # A20006). Após diálise das proteínas de fusão RNase Fc para remover o corante não ligado, variando as quantidades das proteínas marcadas foram incubadas com as células THP1 por uma hora, as células foram lavadas estringentemente para remover a proteína de fusão RNase Fc não ligada, e a proteína especificamente ligada foi quantificada pela medida da intensidade da fluorescência FACS. Os resultados na figura 22 demonstram que a proteína RSLV-132 que tem um domínio Fc mutante tem significativamente menos ligação do receptor Fc do que o RSLV-124 que tem um domínio Fc alelo-selvagem, apresentando mais do que 4 vezes de redução na ligação do receptor Fc. Esta descoberta é consistente com nossas descobertas prévias de que as proteínas de fusão RNase Fc com um domínio Fc mutante (P238S/P331S) tem citotoxicidade significativamente diminuída.
9: Análise in vitro da atividade biológica da molécula de nuclease híbrida.
[0282] Uma ou mais moléculas de nuclease híbridas são purificadas, por exemplo, por afinidade ou cromatografia de troca iônica como previamente descrito nos exemplos acima. Em alguns exemplos, a molécula de nuclease híbrida é um polipeptídeo. Em alguns exemplos, a molécula de nuclease híbrida inclui uma ou mais das sequências da Tabela 1. Em alguns exemplos, a molécula de nuclease híbrida inclui um domínio de nuclease ligado a um domínio Fc mutante. Em alguns exemplos, a molécula de nuclease híbrida inclui um domínio Fc mutante. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante compreende mutações na articulação, CH2, e/ou domínios CH3. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e pode incluir mutações em um ou mais das três articulações de cisteínas. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e/ou mutações nas três articulações de cisteínas para SSS. Em alguns exemplos o domínio Fc mutante compreende P238S e P331S e mutações nas três articulações para cisteína. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante compreende P238S e P331S e SSS. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante é mostrado nas SEQ ID NOs: 59, 60, 61. Em algumas concretizações, a molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID. Vários domínios ligantes (por exemplo, aqueles descritos aqui), podem ser utilizados para ligar os domínios Fc aos domínios de nuclease. Por exemplo, os domínios ligantes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ou mais aminoácidos de comprimento podem ser usados. As moléculas são analisadas quanto à atividade nuclease específica in vitro usando análises qualitativas para verificar se elas possuem a função de nuclease desejada. As atividades específicas são geralmente então determinadas através da florescência com base na análise cinética utilizando substratos, tais como, do kit de reagente RNase ou DNase Alert, e um leitor de placa fluorescente arranjado para tomar as leituras em função do tempo. Em adição, as soluções de proteínas são geralmente checadas quanto a contaminação de endotoxina usando um kit comercialmente disponível, tal como, o kit “Pyrotell Limulus amebocyte Lysate (LAL)”, 0,06 EU/ml do limite de detecção da Cape Cod, Inc., (E. Palmouth, MA0. As moléculas são então avaliadas usando uma variedade da análise in vitro para a atividade biológica.
[0283] Uma série de análises in vitroirão medir os efeitos das moléculas sobre a produção de citocina pelo PBMC humano em resposta a vários estímulos, na presença ou na ausência das moléculas na cultura. O paciente humano ou normal PBMC (aproximadamente 1x10e6 células) foi cultivado por 24, 48, ou 96 horas dependendo da análise. Os PBMC são cultivados na presença de estímulo tal como TLR ligantes, anticorpos co-estimultórios, complexos imunes, e soro normal ou autoimune. Os efeitos das moléculas sobre a produção de citocina é medido usando reagentes comercialmente disponíveis, tal como o kit do par de anticorpos da Biolegend (San Diego, CA) para IL-6, IL-8, IL-10, IL-4, IFN-gama, TNF- alfa. Os sobrenadantes da cultura obtidos de culturas in vitrosão colhidos em 24, 48 horas ou em períodos de tempo posteriores, para determinar os efeitos das moléculas sobre a produção de citocina. A produção de IFN-alfa é medida usando, por exemplo, anticorpos anti-humanos IFN-alfa e reagentes de curva padrão disponíveis na fonte de interferon PBL (Piscataway, NJ). Um conjunto similar de análise é realizado usando a subpopulação de linfócitos humanos (isolados de monócitos, células B, pDCs, células T, etc.); purificados usando, por exemplo, contas magnéticas comercialmente disponíveis com base nos kits de isolamento da Miltenyi Biotech (Auburn, CA).
[0284] Em adição, o efeito das moléculas sobre a expressão dos receptores de ativação de linfócito tais como CD5, CD23, CD69, CD80, CD86 e CD25 são analisadas em vários períodos de tempo após o estímulo. O PBMC ou a subpopulação de célula isolada são submetidos à citometria de fluxo multicolorida para determinar como estas moléculas afetam a expressão de diferentes receptores associados com a ativação celular imune.
[0285] Um outro conjunto de exames irá medir os efeitos destas moléculas sobre a proliferação de diferentes subpopulações de linfócitos in vitro. Estas análises irão utilizar, por exemplo, coloração CFDA-SE (Invitrogen, Carlsbad, CA) de PBMC’s humanos antes do estímulo. CFSE em 5 mM é diluído 1:3000 em PBS/0,5% de BSA com 10e7-10e8 PBMCS ou subconjuntos de células purificadas e reações de marcação incubadas durante 3-4 minutos a 37°C antes de vários períodos de lavagem em RPMI/10% de FBS para remover o CFSE remanescente. As células CFSE marcadas são então incubadas em reações de co-cultura com vários estímulos (ligantes TLR, anticorpos de co-estímulo, etc.) e as moléculas para 4 dias antes da análise da proliferação celular por citometria de fluxo usando anticorpos específicos da subpopulação celular conjugada com corante.
[0286] Uma outra análise irá medir a citotoxicidade de uma ou mais moléculas. Esta análise irá mediar a toxicidade usando a coloração Annexin 5 (por exemplo, Annexin 5-FITC). As células de interesse (por exemplo, monócitos ou uma linha celular monocítica) são contatadas com um a molécula de nuclease híbrida de interesse (por exemplo, uma molécula de nuclease híbrida tendo um domínio Fc mutante) ou um ou mais controles. Em vários períodos de tempo após o contato, as células são separadas da cultura e coradas com Annexin 5. O número de células apoptóticas ou mortas é então contado, por exemplo, usando citometria de fluxo ou uma microscopia fluorescente. As células contatadas com uma molécula de nuclease híbrida de interesse mostra números menores de células coradas positivas para Annexin 5 comparado aos controles positivos.
[0287] Os efeitos destas moléculas sobre a maturação in vitro dos monócitos em DCs e macrófagos também é avaliado usando ambas, as amostras normais e as amostras de pacientes PBMC.
[0288] A eficácia de uma molécula de nuclease híbrida é demonstrada através da comparação dos resultados de uma análise das células tratadas com uma molécula de nuclease híbrida descrita aqui com os resultados da análise de células tratadas com formulações de controle. Após o tratamento, os níveis de vários marcadores (por exemplo, citocinas, receptores de superfície celular, proliferação) descritos acima são geralmente melhorados em um grupo efetivo de moléculas tratadas em relação aos níveis de marcadores existentes antes do tratamento, ou em relação aos níveis medidos em um grupo controle.
Exemplo 20: Administração de uma molécula de nuclease híbrida a um mamífero necessitando da mesma.
[0289] Mamíferos (por exemplo, camundongos, ratos, roedores, humanos, porquinhos da índia) são utilizados no estudo. Os mamíferos são administrados (por exemplo, intravenosamente) um ou mais moléculas de nuclease híbrida compreendendo um ou mais sequências da Tabela 1 ou um controle. Em alguns exemplos, a molécula de nuclease híbrida é um polipeptídeo. Em alguns exemplos, a molécula de nuclease híbrida inclui um ou mais sequências da Tabela 1. Em alguns exemplos, a molécula de nuclease híbrida inclui um domínio nuclease ligado a um domínio Fc mutante. Em alguns exemplos, a molécula de nuclease híbrida inclui um domínio Fc mutante. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante compreende mutações na articulação, domínios CH2, e/ou CH3. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante compreende P238S e/ou P331S, e pode incluir mutações em um ou mais das três articulações de cisteína. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante compreende P238s e/ou P331S, e/ou mutações nas três articulações de cisteínas. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante compreende P238s e/ou P331S, e/ou mutações nas três articulações de cisteínas para SSS. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante compreende P238s e P331S e mutações nas três articulações de cisteína. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante compreende P238S e P231S e SSS. Em alguns exemplos, o domínio Fc mutante é mostrado nas SEQ ID NOS: 59, 60, 61. Em alguns exemplos, a molécula de nuclease híbrida é mostrada nas SEQ ID NOS. Vários domínios ligantes (por exemplo, aqueles descritos aqui) podem ser utilizados para ligar os domínios Fc aos domínios de nuclease. Por exemplo, os domínios de ligação: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ou mais aminoácidos de comprimento podem ser utilizados, Em alguns exemplos, a molécula de nuclease híbrida é formulada como um veículo farmaceuticamente aceitável. Em alguns exemplos, a molécula é formulada como descrito nas composições farmacêuticas na seção acima. A molécula de nuclease híbrida visa RNase e/ou DNase.
[0290] As múltiplas rodadas de doses são utilizadas quando consideradas úteis. Os efeitos sobre os níveis de IFN-alfa, níveis de gene de resposta IFN-alfa, titulação de auto- anticorpo, função renal e patologia, e/ou níveis do complexo imune circulatório são monitoradas nos mamíferos. Os estudos similares são realizados com protocolos de tratamento diferentes e rotas de administração (por exemplo, administração intramuscular, etc.). A eficácia de uma molécula de nuclease híbrida é demonstrada através da comparação dos níveis de IFN-alfa, níveis de gene de resposta da IFN-alfa, titulação do auto-anticorpo, função renal e patologia, e/ou níveis do complexo imune circulante em mamíferos tratados com uma molécula de nuclease híbrida descrita aqui para tratamento de mamíferos com formulações de controle.
[0291] Em um exemplo, um indivíduo humano necessitando do tratamento foi selecionado ou identificado. O indivíduo pode ser necessitando de, por exemplo, redução da causa ou do sintoma de SLE. A identificação do indivíduo pode ocorrer em uma direção clínica, ou de outra forma, por exemplo, na casa do indivíduo através do uso pelo próprio indivíduo do kit de auto-teste.
[0292] No tempo zero, uma primeira dose apropriada de uma molécula de nuclease híbrida é administrada ao indivíduo. A molécula de nuclease híbrida é formulada como descrito aqui. Após o período de tempo, após a primeira dose, por exemplo, 7 dias, 14 dias, e 21 dias, a condição do indivíduo é avaliada, por exemplo, através da medida dos níveis de IFN-alfa, dos níveis do gene de resposta de IFN-alfa, da titulação de auto- anticorpo, da função renal e da patologia, e/ou dos níveis do complexo imune circulante. Outros critérios relevantes podem também ser medidos. O número e a extensão das doses são ajustados de acordo com a necessidade do indivíduo.
[0293] Após o tratamento, os níveis de IFN-alfa do indivíduo, os níveis do gene de resposta de IFN-alfa, a titulação do auto-anticorpo, a função e a patologia renal, e/ou os níveis do complexo imune circulante são diminuídos e/ou melhorados em relação aos níveis existentes antes do tratamento, ou em relação aos níveis medidos em um indivíduo afligido similarmente, mas não tratado/indivíduo controle.
[0294] Em um outro exemplo, um indivíduo roedor necessitando do tratamento é selecionado ou identificado. A identificação do indivíduo pode ocorrer em um arranjo de laboratório ou de outro modo.
[0295] No tempo zero, uma primeira dose apropriada de uma molécula de nuclease híbrida é administrada ao indivíduo. A molécula de nuclease híbrida é formulada como descrito aqui. Após um período de tempo, em seguida a primeira dose, por exemplo, 7 dias, 14 dias, e 21 dias, a condição do indivíduo foi avaliada, por exemplo, através da medida dos níveis de IFN-alfa, dos níveis do gene de resposta da IFN-alfa, da titulação do auto-anticorpo, da função e da patologia renal, e/ou dos níveis do complexo imune circulante. Outros critérios relevantes também podem ser medidos. O número e a extensão das doses são ajustados de acordo com as necessidades do indivíduo.
[0296] Após o tratamento, os níveis de IFN-alfa do indivíduo, os níveis do gene de resposta de IFN-alfa, a titulação do auto-anticorpo, a função e a patologia renal, e/ou os níveis do complexo imune circulante são diminuídos e/ou melhorados em relação aos níveis existentes antes do tratamento, ou em relação aos níveis medidos em um indivíduo similarmente afligido, mas um indivíduo não tratado/indivíduo controle.
[0297] Apesar de a invenção ter sido particularmente ilustrada e descrita com referência a uma concretização preferida e várias concretizações alternativas, deverá ser entendidos pelos técnicos no assunto que várias mudanças na forma e nos detalhes podem ser feitos aqui, sem fugir do espírito e do escopo de proteção da invenção.
[0298] Todas as referências, patentes concedidas e os pedidos de patentes citados, dentro do corpo do presente relatório descritivo são aqui incorporados para referência em sua íntegra, e para todos os propósitos.
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Claims (31)

1. Polipeptídeo, caracterizadopelo fato de compreender uma RNAse humana e um domínio Fc IgG1 humano mutante, a RNAse human sendo operativamente ligado ao domínio Fc e sendo que o domínio Fc inclui uma mutação P238S e uma mutação P331S, e sendo que o polipeptídeo compreende: uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID Nos: 96, 92, 62 ou 78; ou uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 98 ou 94.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de compreender o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:96.
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de o peptídeo compreender uma sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:98.
4. Dímero, caracterizadopelo fato de compreender um polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, opcionalmente um homodímero.
5. Composição, caracterizadapelo fato de compreender o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, ou o dímero da reivindicação 4, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
6. Molécula de ácido nucleico, caracterizadapelo fato de a molécula de ácido nucléico codificar o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3.
7. Vetor de expressão recombinante, caracterizadopelo fato de o vetor compreender uma molécula de ácido nucléico, conforme definida na reivindicação 6.
8. Célula hospedeira microbiana, caracterizadapelo fato de ser transformada pelo vetor de expressão recombinante, conforme definido na reivindicação 7.
9. Método para preparar o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizadopelo fato de compreender: prover uma célula hospedeira contendo uma sequência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo; e manter a célula hospedeira em condições nas quais o polipeptídeo seja expresso.
10. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadospelo fato de ser voltado à fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma condição associada com a liberação excessiva de (ribo)nucleproteína.
11. Dímero, de acordo com reivindicação 4, caracterizadopelo fato de ser voltado à fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma condição associada com a liberação excessiva de (ribo)nucleoproteína.
12. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de ser voltado à fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma condição associada com a liberação excessiva de (ribo)nucleoproteína.
13. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadospelo fato de a condição ser uma doença autoimune, associada com a liberação excessiva de (ribo)nucleoproteína.
14. Dímero, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a condição ser uma doença autoimune associada com a liberação excessiva de (ribo)nucleoproteína.
15. Uso da composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de a condição ser uma doença autoimune associada com a liberação excessiva de (ribo)nucleoproteína.
16. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizados pelo fato de a doença autoimune ser SLE.
17. Dímero, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a doença autoimune ser SLE.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de a doença autoimune ser SLE.
19. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizados pelo fato de a doença autoimune ser a síndrome de Sjogren.
20. Dímero, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a doença autoimune ser a síndrome de Sjogren.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de a doença autoimune ser a síndrome de Sjogren.
22. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizados pelo fato de a doença autoimune ser lúpus nefrite.
23. Dímero, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a doença autoimune ser lúpus nefrite.
24. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de a doença autoimune ser lúpus nefrite.
25. Composição contendo nucleasse, caracterizada pelo fato de ser voltada à fabricação de um medicamento efetivo para degradar os complexos imunes contendo RNA, DNA ou ambos, RNA e DNA, a composição compreendendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e o polipeptídeo, da reivindicação 1, compreendendo uma sequência de aminoácidos representada nas SEQ ID NOs: 96, 98, 92, 94, 62, ou 78, e para uso no tratamento de SLE.
26. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser dirigido à fabricação de um medicamento para tratamento de SLE.
27. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser dirigido à fabricação de um medicamento para tratamento de SLE.
28. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de o polipeptídeo ser formulado para administração intravenosa.
29. Dímero, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o dímero ser formulado para administração intravenosa.
30. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de ser formulada para administração intravenosa.
31. Composição contendo nuclease, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de ser formulada para administração intravenosa.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102378465B1 (ko) 2009-11-02 2022-03-28 유니버시티 오브 워싱톤 스루 이츠 센터 포 커머셜리제이션 치료학적 뉴클레아제 조성물 및 방법
KR102161657B1 (ko) 2011-04-29 2020-10-06 유니버시티 오브 워싱톤 스루 이츠 센터 포 커머셜리제이션 치료적 뉴클레아제 조성물 및 방법
WO2013114374A1 (en) * 2012-02-01 2013-08-08 Protalix Ltd. Dnase i polypeptides, polynucleotides encoding same, methods of producing dnase i and uses thereof in therapy
EP2946015B1 (en) 2013-01-16 2021-05-26 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
ES2759252T3 (es) 2013-10-31 2020-05-08 Resolve Therapeutics Llc Fusiones y métodos terapéuticos de nucleasa-albúmina
MY178774A (en) * 2014-02-24 2020-10-20 Takeda Pharmaceuticals Co Uti fusion proteins
US9599606B2 (en) * 2014-06-10 2017-03-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System ADP-ribose detection reagents
WO2016069889A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Resolve Therapeutics, Llc Therapeutic nuclease-transferrin fusions and methods
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
DK3328881T3 (da) 2015-09-08 2019-10-07 Theripion Inc Apoa-1 fusionspolypeptider og relaterede sammensætninger og fremgangsmåder
EP3464367B1 (en) 2016-05-27 2020-09-09 AbbVie Biotherapeutics Inc. Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
CA3029627A1 (en) * 2016-07-01 2018-01-04 Resolve Therapeutics, Llc Optimized binuclease fusions and methods
WO2018136163A2 (en) 2016-12-09 2018-07-26 Theripion, Inc. Tandem apoa-1 fusion polypeptides
US10988746B2 (en) * 2018-10-08 2021-04-27 Neutrolis, Inc. Manufacturing and engineering of DNASE enzymes for therapy
MX2021008081A (es) 2019-01-04 2021-08-05 Resolve Therapeutics Llc Tratamiento de la enfermedad de sjogren con proteinas de fusion de nucleasa.
JP2020136505A (ja) 2019-02-20 2020-08-31 株式会社Ｊｏｌｅｄ 半導体装置および表示装置
CA3166299A1 (en) * 2020-01-11 2021-07-15 Paul STABACH Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing diseases or disorders caused by or associated with dnase1 and/or dnase1l3 deficiency
AU2021288567A1 (en) * 2020-06-08 2023-02-09 Yale University Compositions and methods for treating and/or preventing coagulopathy and/or sepsis in patients suffering from bacterial and/or viral infections
CN112088903A (zh) * 2020-09-28 2020-12-18 武汉愔紫生物科技有限公司 一种大分子蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用
JP2024507220A (ja) * 2021-02-19 2024-02-16 セリピオン， インコーポレイテッド パラオキソナーゼ融合ポリペプチドならびに関連する組成物および方法
CN115595315A (zh) * 2021-06-28 2023-01-13 四川大学华西医院（Cn） 核糖核酸酶i在抑制疼痛的药物中的新用途

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5453269A (en) 1986-04-14 1995-09-26 The General Hospital Corporation Heterobifunctional antibodies having dual specificity for fibrin and thrombolylic agents and methods of use
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5559212A (en) 1988-04-06 1996-09-24 Alfacell Corporation Frog embryo and egg-derived tumor cell anti-proliferation protein
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5840840A (en) 1990-04-17 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selective RNase cytotoxic reagents
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
IE922437A1 (en) 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
GB9300686D0 (en) 1993-01-15 1993-03-03 Imp Cancer Res Tech Compounds for targeting
US20030108548A1 (en) 1993-06-01 2003-06-12 Bluestone Jeffrey A. Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6348343B2 (en) 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
CN1173878A (zh) 1995-10-16 1998-02-18 尤尼利弗公司 双功能或双价抗体片段类似物
US6482626B2 (en) 1996-02-05 2002-11-19 Genentech, Inc. Human DNase
US6716974B1 (en) 1996-05-31 2004-04-06 Maine Medical Center Research Institute Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on jagged/notch proteins and nucleic acids
US6391607B1 (en) 1996-06-14 2002-05-21 Genentech, Inc. Human DNase I hyperactive variants
AU3968897A (en) 1996-08-02 1998-02-25 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US7247302B1 (en) 1996-08-02 2007-07-24 Bristol-Myers Squibb Company Method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
DK0932417T3 (da) 1996-10-17 2003-04-14 Immunomedics Inc Non-antigent toxinkonjugat og fusionsprotein af internaliserende receptorsystem
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US20030069403A1 (en) 1997-06-16 2003-04-10 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020192659A1 (en) 1997-09-17 2002-12-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6280991B1 (en) 1997-10-15 2001-08-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Engineered cytotoxic ribonclease
US5840296A (en) 1997-10-15 1998-11-24 Raines; Ronald T. Engineered cytotoxic ribonuclease A
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU770555B2 (en) 1998-08-17 2004-02-26 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6239257B1 (en) 1998-12-30 2001-05-29 Alfacell Corporation Family of proteins belonging to the pancreatic ribonuclease a superfamily
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
EP1194451A1 (en) 1999-07-02 2002-04-10 Genentech, Inc. Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
US6175003B1 (en) 1999-09-10 2001-01-16 Alfacell Corporation Nucleic acids encoding ribonucleases and methods of making them
US7118751B1 (en) 1999-10-14 2006-10-10 Trubion Pharmaceuticals, Inc. DNA vaccines encoding antigen linked to a domain that binds CD40
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
EP1355919B1 (en) 2000-12-12 2010-11-24 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7319139B2 (en) 2001-01-29 2008-01-15 Biogen Idec, Inc. TAG-72 specific CH2 domain deleted antibodies
CN1494553A (zh) 2001-01-29 2004-05-05 IDECҩ�﹫˾ 改变的抗体及其使用方法
ES2393733T3 (es) 2001-03-07 2012-12-27 Merck Patent Gmbh Tecnología de expresión para proteínas que contienen una fracción de anticuerpo de isotipo híbrido
JP4586310B2 (ja) 2001-07-04 2010-11-24 株式会社Ｉｈｉ セラミックス複合部材の製造方法
US20060040262A1 (en) 2002-12-27 2006-02-23 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP1487879B1 (en) 2002-03-01 2012-12-26 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
CA2489446A1 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Ribonuclease zymogen design
US7425620B2 (en) 2002-08-14 2008-09-16 Scott Koenig FcγRIIB-specific antibodies and methods of use thereof
US20060235208A1 (en) * 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
CN101987871A (zh) 2002-09-27 2011-03-23 赞科股份有限公司 优化的Fc变体及其产生方法
DE60334141D1 (de) 2002-10-15 2010-10-21 Facet Biotech Corp VERÄNDERUNG VON FcRn-BINDUNGSAFFINITÄTEN ODER VON SERUMHALBWERTSZEITEN VON ANTIKÖRPERN MITTELS MUTAGENESE
WO2004041170A2 (en) 2002-11-01 2004-05-21 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
WO2004063351A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US7067298B2 (en) 2003-03-31 2006-06-27 Ambion, Inc. Compositions and methods of using a synthetic Dnase I
US7666417B2 (en) 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
JP2007503206A (ja) 2003-08-22 2007-02-22 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 変更されたエフェクター機能を有する改良された抗体およびその抗体を産生する方法
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
CA2545603A1 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
EP1697520A2 (en) 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
CA2551916C (en) 2003-12-31 2014-04-29 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
DK1706424T3 (da) 2004-01-12 2009-11-02 Applied Molecular Evolution FC-region varianter
CA2555661C (en) 2004-02-13 2017-11-21 Immunomedics, Inc. Fusion proteins containing recombinant cytotoxic rnases
CA2561264A1 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
JP2008505853A (ja) 2004-04-13 2008-02-28 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド 細胞傷害性薬剤としての非天然のリボヌクレアーゼ複合体
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
AU2005272993B2 (en) 2004-07-15 2010-02-11 Xencor, Inc Optimized Fc variants
WO2007011363A2 (en) 2004-08-11 2007-01-25 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain fusion proteins
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
DE102005009219A1 (de) 2005-02-25 2006-08-31 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Ribonuclease-Tandemenzyme und Verfahren zu ihrer Herstellung
US20110123440A1 (en) 2005-03-29 2011-05-26 Genevieve Hansen Altered Antibody FC Regions and Uses Thereof
RU2007145509A (ru) 2005-05-09 2009-06-20 Гликарт Биотехнологи Аг (Ch) Антигенсвязывающие молекулы, имеющие модифицированные fc-участки и измененное связывание с fc-рецепторами
EP1896579A2 (en) 2005-06-16 2008-03-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Cytotoxic ribonuclease variants
ES2354280T3 (es) 2005-06-16 2011-03-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Variantes de ribonucleasa citotóxica.
US20080279850A1 (en) 2005-07-25 2008-11-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. B-Cell Reduction Using CD37-Specific and CD20-Specific Binding Molecules
PT2298815E (pt) 2005-07-25 2015-07-16 Emergent Product Dev Seattle Moléculas de ligaçao especificas para cd37 e especificas para cd20
CN101292036B (zh) 2005-10-21 2016-04-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于重组表达多肽的方法
WO2007121354A2 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Trubion Pharmaceuticals Inc. Binding proteins comprising immunoglobulin hinge and fc regions having altered fc effector functions
EP2010221B1 (en) * 2006-04-21 2012-02-29 mAB-Factory GmbH Antibody-rnase-conjugate
GB0611444D0 (en) 2006-06-09 2006-07-19 Medical Res Council Technology Rnase H2 complex and genes therefor
CA3149553C (en) 2006-06-12 2023-11-21 Aptevo Research And Development Llc Single-chain multivalent binding proteins with effector function
EP1905841A1 (en) 2006-09-25 2008-04-02 Max Delbrück Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch; Trex1 as a marker for lupus erythematosus
US20080260738A1 (en) 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment
WO2008150485A2 (en) 2007-05-29 2008-12-11 Wyeth Erbb2 binding proteins and use thereof
BRPI0812562A2 (pt) 2007-06-12 2019-09-24 Trubion Pharmaceuticals Inc composições terapêuticas anti-cd20 e métodos
EP2167130A2 (en) * 2007-07-06 2010-03-31 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding peptides having a c-terminally disposed specific binding domain
WO2009015345A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins
CA2720628A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region
CA2705542A1 (en) 2007-11-13 2009-05-22 Sapphire Energy, Inc. Production of fc-fusion polypeptides in eukaryotic algae
CA2719924C (en) 2008-04-11 2017-10-03 Philip Tan Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
JP2012503985A (ja) * 2008-09-26 2012-02-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド ループスの治療、診断、モニタリング方法
WO2010039985A1 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Quintessence Biosciences, Inc. Therapeutic Ribonucleases
KR102378465B1 (ko) * 2009-11-02 2022-03-28 유니버시티 오브 워싱톤 스루 이츠 센터 포 커머셜리제이션 치료학적 뉴클레아제 조성물 및 방법
TWI529163B (zh) 2011-01-25 2016-04-11 陶氏農業科學公司 用於製備４－胺基－５－氟－３－鹵素－６－（經取代之）吡啶甲酸酯的方法
KR20130129438A (ko) 2011-02-23 2013-11-28 암젠 인크 Uvc 노출을 위한 세포 배양 배지 및 이와 관련된 방법
BR112013021785A8 (pt) 2011-02-25 2018-07-03 Recombinetics Inc animais geneticamente modificados e métodos para fazer os mesmos
KR102055331B1 (ko) 2011-04-21 2019-12-12 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 B형 간염 바이러스(hbv) 발현 조절
KR102161657B1 (ko) 2011-04-29 2020-10-06 유니버시티 오브 워싱톤 스루 이츠 센터 포 커머셜리제이션 치료적 뉴클레아제 조성물 및 방법
US20140178479A1 (en) 2011-08-12 2014-06-26 Perosphere, Inc. Concentrated Felbamate Formulations for Parenteral Administration
WO2013180295A1 (ja) 2012-06-01 2013-12-05 日本電信電話株式会社 パケット転送処理方法およびパケット転送処理装置
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof

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