DE102005009219A1

DE102005009219A1 - Ribonuclease-Tandemenzyme und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE102005009219A1
Application number: DE200510009219
Authority: DE
Inventors: Jens Dr. Köditz; Franziska Leich; Ulrich Dr. Arnold; Renate Prof. Dr. Ulbrich-Hofmann
Original assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Current assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2006-08-31

Abstract

Der Erfindung liegt das Problem zu Grunde, definierte, zytotoxische Ribonucleasen, die auch unter physiologischen Bedingungen stabil sind, für den Einsatz in der Tumortherapie herzustellen. DOLLAR A Ribonuclease-Tandemenzyme, die aus kovalent durch einen Peptid-linker miteinander verbundenen RNase-Einheiten bestehen, besitzen eine stabile Struktur. Die enzymatische Aktivität dieser Konstrukte führt in der Zelle zur zytotoxischen Wirkung. Die RNase-Tandemenzyme werden durch rekombinante Proteinexpression gewonnen. DOLLAR A Einsatz als Tumortherapeutikum.

Description

Seit den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts ist die zytotoxische Wirkung von Ribonucleasen (RNasen) bekannt (Ledoux 1955a; b), welche auf dem enzymatischen Abbau von Ribonucleinsäure (RNA) im Zytosol der Zelle beruht (Saxena et al. 1991) und den Einsatz in der Tumortherapie ermöglichen könnte. Bisher befindet sich jedoch nur eine RNase – die Onconase aus dem Nördlichen Leopardfrosch (Rana pipiens) (Ardelt et al. 1991) – in Phase III der klinischen Tests (Mikulski et al. 2002).

Onconase wirkt jedoch reversibel nephrotoxisch (Vasandani et al. 1999) und ist immunogen (Matousek et al. 2003b), was einen Einsatz als Therapeutikum problematisch erscheinen lässt. Im Gegensatz dazu könnten Säuger-RNasen neue Ansatzpunkte für potentielle Krebstherapeutika liefern (Saxena et al. 1991).

Monomere Säuger-RNasen werden jedoch durch die Bindung an den klassenspezifischen zytosolischen RNase-Inhibitor in ihrer Wirkung gehindert (Lee et al. 1989) bzw. gelangen nur schlecht in die Zellen (Wu et al. 1995; Monti and D'Alessio 2004), wodurch ihr Einsatz in der Krebstherapie sehr uneffektiv ist. Durch gentechnische Modifizierung ist es gelungen, Varianten der RNase aus Rinderpankreas (RNase A) und aus humanem Pankreas (RNase 1) mit verminderter Affinität zum RNase-Inhibitor und/oder verbesserter Zellaffinität bzw. verbessertem intrazellulären Transport herzustellen (Leland et al. 1998; Bretscher et al. 2000; Futami et al. 2001; Gaur et al. 2001; Leland et al. 2001; Haigis et al. 2002; Dickson et al. 2003; Bosch et al. 2004).

Eine andere Möglichkeit stellt die RNase aus Rindersamen (BS-RNase) dar, welche die einzige natürlich vorkommende dimere RNase ist. Das Dimer existiert in zwei Konformationen: eine M=M Form, die ausschließlich durch zwei intermolekulare Disulfidbrücken zusammengehalten wird und eine swapped M × M Form, bei der zusätzlich zu den Disulfidbrücken die N-terminalen Helices der beiden Untereinheiten ausgetauscht sind (Piccoli et al. 1992). Durch die dimere Struktur wird die Bindung des RNase-Inhibitors sterisch unterbunden (Murthy and Sirdeshmukh 1992) und wahrscheinlich die Zellaffinität durch Erhöhung der positiven Nettoladung verbessert (Monti and D'Alessio 2004), wodurch BS-RNase zytotoxisch wirkt (Kim et al. 1995a, b). Durch Austausch der zur BS-RNase-Sequenz korrespondierenden Reste in RNase A und RNase 1 konnten auch diese in dimere Formen mit vergleichbaren Eigenschaften überführt werden (Di Donato et al. 1994; Piccoli et al. 1999). Ähnliche Eigenschaften wurden für artifizielle nicht-kovalent verbundene swapped RNase A-Multimere (Matousek et al. 2003a), die bei der Lyophilisierung aus Essigsäure entstehen, oder für chemisch verknüpfte RNase A-Dimere (Bartholeyns and Baudhuin 1976) beobachtet. Nachteilig ist neben den verschiedenen existierenden Zuständen (M=M, M × M bzw. Dimere, Trimere, Tetramere) vor allem, dass sowohl die über Disulfidbrücken verknüpften Dimere unter reduzierenden Bedingungen, wie sie im Zytosol bestehen, als auch die swapped RNasen in ihre Monomere zerfallen, die dann durch den RNase-Inhibitor gebunden werden können (Murthy et al. 1996).

Der Erfindung liegt das Problem zu Grunde, die o. g. Nachteile zu beseitigen und definierte, auch unter physiologischen, d. h. reduzierenden Bedingungen stabile, zytotoxische RNase Dimere/Multimere in hohen Ausbeuten herzustellen.

Erfindungsgemäß wird das Problem nach Anspruch 1 dadurch gelöst, dass auf gentechnischem Weg Ribonuclease(RNase)-Tandemenzyme, bestehend aus zwei oder mehreren durch einen Peptid-linker kovalent miteinander verbundenen RNase-Einheiten, erzeugt werden (1), die zytotoxische Wirkung besitzen und somit potentielle Tumortherapeutika darstellen.

Auf Grund sterischer Abschirmung ist die Bindung des zytosolischen RNase-Inhibitorproteins nicht mehr an beide RNase-Einheiten möglich bzw. stark eingeschränkt. Der daraus resultierende Erhalt der enzymatischen Aktivität in der Zelle führt somit zu ihrer zytotoxischen Wirkung. Durch die Verknüpfung zweier kationischer RNase-Einheiten und das Einführen von basischen Aminosäureresten in die linker-Sequenz wird zusätzlich die positive Nettoladung erhöht, was die Aufnahme in die Zelle verbessert. Die beschriebene Verfahrensweise ermöglicht die Herstellung definierter RNase-Konstrukte in hohen Ausbeuten durch rekombinante Proteinexpression.

Die Vorteile der RNase-Tandemenzyme lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1. Durch die dimere Struktur wird die Bindung zum RNase-Inhibitor gestört und die positive Nettoladung erhöht, was zu einer verbesserten Aufnahme in die Zellen führt. Beides ist mit einer gesteigerten proliferationshemmenden Wirkung verbunden.
2. Im Gegensatz zu anderen RNase-Dimeren besitzen die RNase-Tandemenzyme auch unter physiologischen, d.h. reduzierenden Bedingungen, wie sie im Zytosol zu finden sind, eine homogene, stabile Struktur und stehen nicht mit verschiedenen strukturellen Formen im Gleichgewicht oder zerfallen in ihre monomeren Einheiten.
3. Durch die Variation der linker-Sequenz können die Eigenschaften der Tandemenzyme hinsichtlich ihrer proliferationshemmenden Wirkung moduliert werden, ohne die eigentliche katalytisch aktive Struktur wesentlich zu beeinflussen.
4. Die RNase-Tandemenzyme lassen sich leicht und schnell durch rekombinante Proteinexpression gewinnen, ohne dass weitere Verfahrensschritte oder chemische Modifizierungen zur Herstellung dimerer Varianten notwendig sind.

Konstruktion der Expressionsvektoren
Die Herstellung der Plasmide mit dem rnase A-tandem-Gen erfolgte durch eine zweistufige Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Berücksichtigung der codon usage des Empfängerorganismus (E. coli). Im 1. Schritt wurden in zwei separaten PCRs ausgehend von der Nucleotidsequenz des rnase A-Gens im pET26b(+)-Vektor durch Verwendung der entsprechenden forward-Primer und des T7-Terminator-Primers bzw. der reverse-Primer und des T7-Promotor-Primers die linker-Sequenzen am 5'-Ende bzw. am 3'-Ende des rnase-Gens eingeführt. Nach Isolation der PCR-Produkte, die im Bereich der linker-Sequenz zueinander komplementär sind, bildeten diese das Ausgangsmaterial für den 2. PCR-Schritt. In dieser Reaktion wurde das tandem-Gen vervollständigt und unter Verwendung des T7-Terminator- und T7-Promotor-Primers amplifiziert. Nach Isolation des gewünschten PCR-Produkts aus dem Agarosegel wurde die DNA mit Hind III und Nde I verdaut und in einem gleichermaßen geschnittenen pET26b(+)-Vektor ligiert. Die linker-Sequenz im rnase A-tandem-Gen konnte anschließend mittels ortsgerichteter Mutagenese (Stratagene) modifiziert werden.
Gewinnung der Enzyme in der Schüttelkultur
Die Expression der Enzyme erfolgte im E. coli-Stamm BL21 (DE3) (Stratagene) in Form von inclusion bodies. Eine Vorkultur wurde in 50 ml Terrific broth (TB)-Medium, das 50 μg ml^–1 Kanamycin und 0,4 % (w/v) Glucose enthielt, bei 30°C über Nacht angezogen. 10 ml Vorkultur wurden in 1 1 TB Medium (mit 0,4 % (w/v) Glucose und 50 μg ml^–1 Kanamycin) überführt und bei 37°C bei 200 rpm geschüttelt. Bei Erreichen einer OD₆₀₀ von 1,8–2 wurden die Zellen mit 0,7 mM Isopropyl-β-D-galaktosid (IPTG) induziert. 3–4 Stunden nach Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation für 15 min bei 6000 × g geerntet und bis zur Weiterverarbeitung bei –20°C gelagert.
Zur Isolierung der inclusion bodies wurden die Zellen in 25 ml Zellaufschlusspuffer (0,1 M Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0) mit Hilfe eines Ultraturrax (Janke und Kunkel) resuspendiert und für 30 min bei 4°C mit 1,5 mg ml^–1 Lysozym (Serva) behandelt. Anschließend erfolgte eine zweimalige Hochdruckhomogenisation mittels Gaulin-Homogenisator bei 1200 bar und eine Inkubation mit 10 μg ml^–1 DNase (La Roche) und 3 mM MgCl₂ bei 25°C für 30 min. Danach wurden 0,5 Volumeneinheiten einer Triton-Waschlösung (60 mM EDTA, 6 % (v/v) Triton X-100, 1,5 M NaCl, pH 7,0) zugegeben und der Reaktionsansatz für 30 min auf Eis gelagert. Durch Zentrifugation bei 20000 × g für 20 min bei 4°C wurden die inclusion bodies isoliert und zweimal mit 50 ml 0,1 M Tris/HCl, 20 mM EDTA, pH 7,0, gewaschen (mit jeweils anschließender Zentrifugation bei 20000 × g für 20 min bei 4°C). Die Lagerung der isolierten inclusion bodies erfolgte bei –20°C.
Zur Gewinnung der aktiven Enzyme wurden die inclusion bodies in 10 ml Solubilisierungspuffer (6 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Dithiothreitol, pH 8,3) gelöst. Nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde der pH-Wert der Lösung mit 1 M HCl auf pH 5,0 eingestellt und die Lösung zur Entfernung von Aggregaten 20 min bei 10000 × g zentrifugiert. Das Solubilisat wurde anschließend gegen 10120 mM Essigsäure über Nacht dialysiert.
Zur Renaturierung wurde die Proteinlösung unter Rühren in den Renaturierungspuffer (0,1 M Tris/HCl, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,3, 1 mM Glutathion (reduzierte Form), 0,2 mM Glutathion (oxidierte Form)) eingetropft und 48 h dort belassen. Die Proteinkonzentration im Renaturierungsansatz betrug 50 μg ml^–1. Danach erfolgte eine Konzentrierung der Proteinlösung und Pufferaustausch (50 mM Tris/HCl, pH 7,5) in einer Ultrafiltrationszelle (Pall Filtron, 3 K Omega Membran).
Eine Reinigung der Enzyme bis zur Homogenität in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese erfolgte durch Kationenaustauschchromatographie an einer MonoS-Säule (Pharmacia) unter Einsatz eines Elutionsgradienten, der durch die Pufferlösungen 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 und 50 mM Tris/HCl, 0,5 M NaCl, pH 7,5, erhalten wurde.
Charakterisierung der RNase-Tandemenzyme
Im Ergebnis wurden 10 Tandemvarianten erhalten, die sich hinsichtlich ihrer linker-Sequenz unterscheiden. Alle Varianten waren gegenüber Hefe-RNA aktiv, wobei die Aktivität im Vergleich zu RNase A geringer war (Tabelle 1), und besaßen eine zu RNase A vergleichbare thermodynamische Stabilität (Tabelle 1). Der Einfluss der Varianten auf die Zellproliferation wurde durch den Einbau von radioaktiv markiertem Thymidin in neu synthetisierte DNA von K-562 Zellen untersucht (Dickson et al. 2003). Alle Varianten wiesen eine im Vergleich zu RNase A deutlich stärkere Inhibierung des Zellwachstums auf, wobei die Variante mit der größten positiven Ladung in der linker-Sequenz den größten Effekt aufwies (2, Tabelle 1). Dies zeigt, dass durch die Verknüpfung zweier RNase-Einheiten durch einen proteinogenen linker eine Erhöhung der proliferationshemmenden Wirkung erzielt wird.
Erläuterung Bezugszeichen
1: Modell eines RNase A-Tandemenzyms.
2: Hemmung der Proliferation von K562-Zellen durch ausgewählte RNase-Tandemenzyme.
Die Hemmung der Proliferation von K562-Zellen durch die Tandemvarianten mit den linker-Sequenzen GP₆G
GP₄G
GP₃G
SGRSGRSG (∎), SGRSG
und SGSGSG (♦) wurde durch den Einbau von radioaktiv markiertem Thymidin in die DNA bestimmt.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Ribonuclease-Tandemenzyme bestehend aus zwei oder mehreren durch einen Peptidlinker kovalent miteinander verbundenen Ribonuclease(RNase)-Einheiten.
Verfahren zur Herstellung von RNase-Tandemenzymen gekennzeichnet dadurch, dass in einer zweistufigen Polymerasekettenreaktion ausgehend von der Nucleotidsequenz des rnase A-Gens unter Verwendung entsprechender Primer die linker-Sequenzen am 5'-Ende bzw. 3'-Ende des rnase-Gens eingeführt und das tandem-Gen vervollständigt wird.
Verfahren nach Anspruch 2 gekennzeichnet dadurch, dass die linker-Sequenz mittels ortsgerichteter Mutagenese modifiziert werden kann.
Verfahren nach Anspruch 2 gekennzeichnet dadurch, dass zur Verbesserung der Aufnahme in die Zelle zwei kationische RNase-Einheiten durch einen Peptid-linker, in den basische Aminosäurereste eingefügt wurden, verknüpft werden.
Verfahren nach Anspruch 2 gekennzeichnet dadurch, dass mittels Variation der linker-Sequenz die proliferationshemmende Wirkung moduliert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dass die Enzyme mittels Proteinexpression in E.coli hergestellt und nach erfolgter Isolierung aus den Aggregaten renaturiert werden.