WO2007010989A1 - 神経分化誘導ペプチド及びその利用 - Google Patents

神経分化誘導ペプチド及びその利用 Download PDF

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WO2007010989A1
WO2007010989A1 PCT/JP2006/314399 JP2006314399W WO2007010989A1 WO 2007010989 A1 WO2007010989 A1 WO 2007010989A1 JP 2006314399 W JP2006314399 W JP 2006314399W WO 2007010989 A1 WO2007010989 A1 WO 2007010989A1
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amino acid
peptide
seq
acid sequence
sequence
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PCT/JP2006/314399
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Kanno
Tetsuhiko Yoshida
Nahoko Kobayashi
Original Assignee
Toagosei Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Neuronal differentiation-inducing peptide and use thereof
  • the present invention relates to a peptide having neuronal differentiation-inducing properties and use thereof.
  • the present invention relates to a neuronal differentiation inducing agent containing the peptide as an active ingredient.
  • neural stem cells or embryos are expected to regenerate nerve cells using embryonic stem cells (ES cells) (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-357543).
  • ES cells embryonic stem cells
  • these stem cells are transplanted to the affected area as they are, they are hardly differentiated into nerve cells and are difficult to engraft. Even if they are engrafted, most of them are separated into glial cells.
  • somatic stem cells such as skin stem cells and adipose stem cells are stem cells that are relatively easily available, and have high utility value in the medical industry if nerve cells can be differentiated from these stem cells.
  • a method for inducing differentiation of neural cells from these somatic stem cells in a short time and with high efficiency has not yet been established, and the establishment of such a method, specifically, neuronal differentiation suitable for such purpose.
  • Development of inducers is desired.
  • JP-A-9323928 discloses a neuronal differentiation-inducing agent containing a pyrrolidone derivative as an active ingredient, but does not describe the effect of inducing differentiation of somatic stem cells from neural cells. . Disclosure of the invention
  • the present invention was created by an approach completely different from the development approach of a neuronal differentiation inducer containing a chemical substance as an active ingredient as described in JP-A-9 323928.
  • One object of the present invention is a peptide having neuronal differentiation-inducing properties Is an offer.
  • Another object is to provide a neuronal differentiation inducer (pharmaceutical composition) containing such a peptide as an active ingredient.
  • Another purpose is to design such peptides.
  • Another object is to provide a method for producing nerve cells or a method for generating nerve cells using such peptides.
  • the neuronal differentiation-inducing peptide provided by the present invention is an artificially designed neuronal differentiation-inducing peptide that does not exist in nature alone as a neuronal differentiation-inducing peptide.
  • the present inventor is known to form a complex with Elondin A (ElonginA) and act as a transcriptional regulator, and can bind to the Elondin BC complex (specifically, a part of ElonginC).
  • ElonginA Elondin A
  • ElonginC Elondin BC complex
  • SOCS-bottoms amino acid sequences
  • the neuronal differentiation-inducing peptide disclosed here is a peptide that can induce differentiation of at least one cell into a neuron (hereinafter also referred to as “neural differentiation-inducing peptide”).
  • the present invention relates to any one of the SOCS proteins as such a peptide.
  • BC-box-derived amino acid sequence consisting of at least 10 contiguous amino acid residues selected from the amino acid sequence constituting the BC-box of the protein of the species, or an amino acid sequence that has been partially modified Providing artificially synthesized peptides
  • an amino acid sequence constituting a cell membrane translocation domain is included on the N-terminal side or C-terminal side of the BC-box-derived sequence or its modified sequence.
  • Preferred examples of the amino acid sequence constituting the transmembrane domain include those shown in any of SEQ ID NOs: 16, 17, and 18.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide is 50 or less.
  • the BC-box-derived sequence is selected from the amino acid sequences shown in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 15 (that is, a total of 15 sequences).
  • Peptides containing the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 15 or an amino acid sequence obtained by partially modifying the sequence are preferred examples.
  • the BC-box-derived sequence is represented by any one of SEQ ID NO: 41 to 101 (that is, 61 sequences in total). It includes an amino acid sequence consisting of at least 10 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequence, or an amino acid sequence obtained by partially modifying the sequence.
  • SEQ ID NOs: 41 to 101 preferred examples include the amino acid sequence shown in any one of the above, or a peptide comprising an amino acid sequence obtained by partially modifying the sequence.
  • the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 102, and SEQ ID NO: 103 (that is, 24 sequences in total) or It includes an amino acid sequence in which the sequence is partially modified. Peptides composed of these amino acid sequences are preferred examples.
  • the present invention also includes a nucleotide sequence that encodes any of the neuronal differentiation-inducing peptides disclosed herein, and a nucleotide sequence that is complementary to Z or a nucleotide sequence thereof. Artificially designed polynucleotides that do not exist (eg, polynucleotides substantially composed of these sequences) are provided.
  • SEQ ID NOs: 1 to 103 that is, a total of 103 sequences! A nucleotide sequence that encodes the amino acid sequence shown (or a modified sequence obtained by subjecting the sequence to partial modification) and a polynucleotide comprising Z or a nucleotide sequence complementary to the sequence ( For example, a polynucleotide substantially composed of these sequences).
  • the present invention also provides a neuronal differentiation-inducing agent containing at least one neuronal differentiation-inducing peptide disclosed herein.
  • the neuronal differentiation-inducing agent disclosed here is a BC— consisting of at least 10 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequences constituting the BC-box of any one protein belonging to SOCS proteins. It includes an artificially synthesized peptide containing an amino acid sequence derived from a box or an amino acid sequence obtained by partially modifying the sequence.
  • the peptide includes an amino acid sequence constituting a cell membrane translocation domain on the N-terminal side or C-terminal side of the BC-box-derived sequence or a modified sequence thereof.
  • a nerve differentiation-inducing agent comprising the peptide having a total number of amino acid residues of 50 or less as an active ingredient is preferable.
  • At least 10 amino acid sequence powers selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 15 or any of SEQ ID NO: 41 to SEQ ID NO: 101 are selected.
  • a neuronal differentiation-inducing agent containing an amino acid sequence consisting of consecutive amino acid residues or a peptide containing an amino acid sequence in which the sequence is partially modified as an active ingredient is preferable.
  • a neuronal differentiation inducer containing a peptide containing the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 102 and SEQ ID NO: 103 as an active ingredient is preferable.
  • the neuronal differentiation inducer disclosed herein typically comprises one or more neuronal differentiation-inducing peptides and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention produces the neuronal differentiation-inducing peptide disclosed herein.
  • a method That is, in this method, an amino acid sequence derived from a BC-box consisting of at least 10 consecutive amino acid residues, which is also selected for the amino acid sequence constituting the BC-box of any one of the proteins belonging to the SOCS protein, or Designing a peptide chain that includes an amino acid sequence that has been partially modified in the sequence and that is inductive to at least one type of cell, and synthesizes the designed peptide chain It is included.
  • a peptide chain comprising an amino acid sequence constituting a cell membrane translocation domain is designed on the N-terminal side or C-terminal side of the BC-box-derived amino acid sequence or its modified amino acid sequence.
  • the peptide chain is designed so that the total number of amino acid residues constituting the peptide chain is 50 or less.
  • the present invention provides various methods using the neuronal differentiation-inducing peptide disclosed herein.
  • the present invention provides a method for producing nerve cells from at least one kind of cell material.
  • the method for producing nerve cells according to the present invention comprises a BC-box comprising at least 10 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequences constituting the BC-box of any one protein belonging to SOCS proteins. Preparing an artificially synthesized peptide containing a derived amino acid sequence or an amino acid sequence obtained by partially modifying the sequence, and supplying the peptide to the cell material.
  • the peptide includes an amino acid sequence constituting a cell membrane translocation domain on the N-terminal side or C-terminal side of the BC-box-derived sequence or a modified sequence thereof.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide is 50 or less.
  • the peptide is an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 41 to SEQ ID NO: 101 as the BC-box-derived sequence. At least 10 consecutive amino acids selected from It includes an amino acid sequence consisting of acid residues or an amino acid sequence in which the sequence is partially modified.
  • the peptide comprises the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 102, and SEQ ID NO: 103.
  • the present invention also provides a method for generating nerve cells in a living body or living tissue as a method using the neuronal differentiation-inducing peptide disclosed herein.
  • the neural cell generation method according to the present invention is a BC-box comprising at least 10 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequences constituting the BC-box of any one protein belonging to SOCS proteins.
  • the peptide includes an amino acid sequence constituting a cell membrane translocation domain on the N-terminal side or C-terminal side of the BC-box-derived sequence or a modified sequence thereof.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide is 50 or less.
  • the peptide is an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 41 to SEQ ID NO: 101 as the BC-box-derived sequence.
  • An amino acid sequence consisting of at least 10 consecutive amino acid residues selected from: or an amino acid sequence that has been partially modified.
  • the peptide comprises the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 102, and SEQ ID NO: 103.
  • the peptide as the active ingredient contained in the neuronal differentiation inducer of the present invention is, as described above, a synthetic peptide comprising the BC-box-derived amino acid sequence or an amino acid sequence obtained by partially modifying the sequence. Therefore, it can be easily manufactured. For this reason, a desired amount of peptide (and thus a neuronal differentiation inducer) can be easily prepared. Further, according to the present invention, by using such a neuronal differentiation-inducing agent (neural differentiation-inducing peptide), non-neuronal cells (typically fat stem cells, skin stem cells, etc.) that have been difficult in the past are used. Sex stem cells or embryonic stem cells) can be easily induced to differentiate into neurons.
  • a neuronal differentiation-inducing agent typically fat stem cells, skin stem cells, etc.
  • Sex stem cells or embryonic stem cells can be easily induced to differentiate into neurons.
  • cell materials such as adipose stem cells
  • a desired amount of nerve cells depending on the application (for example, treatment of a neurological disease requiring nerve regeneration).
  • the generation of nerve cells can be realized by administering an appropriate amount to an affected area where nerve regeneration is required or a temporary or permanent living tissue (including a culture such as a cell mass) removed from the body. it can.
  • FIG. 1 shows the result of examining the state of nerve separation after culturing mouse neural stem cells with the peptide of sample 1 at a concentration of lOngZmL using the immuno-antibody method using markers: MAPs. It is a fluorescence micrograph shown.
  • Fig. 2 shows the result of examining the state of nerve separation after culturing mouse neural stem cells with the peptide of sample 1 at a concentration of lOngZmL using the immuno-antibody method using NeuN as a marker. It is a fluorescence micrograph shown.
  • FIG. 3 shows the result of examining the state of nerve separation after culturing mouse neural stem cells with the peptide of sample 6 at a concentration of lOngZmL using the immuno-antibody method using MAPs. It is a fluorescence micrograph shown.
  • FIG. 4 shows the result of examining the state of nerve separation after culturing mouse neural stem cells with the peptide of sample 6 at a concentration of lOngZmL using an immuno-antibody method using NeuN as a marker. It is a fluorescence micrograph shown.
  • FIG. 5 shows the results of examination of the state of nerve division after culturing mouse neural stem cells with the peptide of sample 1 at a concentration of lOOngZmL as a marker: an immunoantibody method using MAPs.
  • Fig. 6 shows the state of neuronal differentiation after adding the peptide of sample 1 to mouse neural stem cells at a concentration of lOOngZmL and culturing it with the immuno-antibody method using marker: NeuN. It is a fluorescence micrograph which shows the result.
  • FIG. 7 shows the results of examination of the state of nerve distribution after adding the peptide of sample 6 to mouse neural stem cells at a concentration of lOOngZmL and immunization using a marker: MAPs.
  • FIG. 8 shows the results of examining the state of neuronal differentiation after adding the peptide of sample 6 to mouse neural stem cells at a concentration of lOOngZmL and cultivating using the marker: NeuN immunoimmunoassay. It is a fluorescence micrograph.
  • FIG. 9 is a fluorescence micrograph showing the result of examining the state of the neuronal differentiation after culturing with mouse neural stem cells without adding a peptide, using the marker: MAPs. is there.
  • FIG. 10 is a fluorescence micrograph showing the result of examining the state of the nerve distribution after culturing without adding peptide to mouse neural stem cells by the immunoantibody method using the marker: NeuN.
  • FIG. 11 shows the result of examining the state of nerve division after culturing human adipose stem cells with the peptide of sample 1 at a concentration of lOngZmL, using the immuno-antibody method using markers: MAPs. It is a fluorescence micrograph shown.
  • FIG. 12 shows the result of examining the state of nerve separation after culturing the human adipose stem cell with the peptide of sample 1 at a concentration of lOngZmL by the immuno-antibody method using the marker: NeuN. It is a fluorescence micrograph shown.
  • FIG. 13 shows the result of examining the state of nerve division after culturing the human adipose stem cell with the peptide of sample 6 added at a concentration of lOngZmL by an immuno-antibody method using a marker: MAPs. It is a fluorescence micrograph shown.
  • FIG. 14 shows the result of examining the state of nerve separation after culturing human adipose stem cells with the peptide of sample 6 added at a concentration of lOngZmL by the immuno-antibody method using NeuN as a marker. It is a fluorescence micrograph shown.
  • FIG. 15 shows the results of examination of the state of nerve division after adding the peptide of sample 1 to human adipose stem cells at a concentration of lOOngZmL and immunization using markers: MAPs.
  • FIG. 16 shows the results obtained by examining the state of neuronal differentiation after adding the peptide of sample 1 to human adipose stem cells at a concentration of lOOngZmL and culturing using the marker: NeuN. It is a fluorescence micrograph.
  • FIG. 17 shows the results of examination of the state of nerve division after culturing the human adipose stem cells with the peptide of sample 6 at a concentration of lOOngZmL as a marker: immunoassay using MAPs.
  • FIG. 18 shows the results of investigating the state of neuronal differentiation after adding the peptide of sample 6 to human adipose stem cells at a concentration of lOOngZmL and cultivating using the marker: NeuN. It is a fluorescence micrograph.
  • FIG. 19 is a fluorescence micrograph showing the result of examining the state of nerve mitosis after culturing without adding peptide to human adipose stem cells by the immunoantibody method using a marker: MAPs.
  • FIG. 20 is a fluorescence micrograph showing the result of examining the state of the neuronal differentiation after culturing without adding peptide to human adipose stem cells, using the marker: NeuN immunoimmunoassay. is there.
  • amino acids are represented in one-letter code (in the sequence listing, three-letter code) in accordance with the nomenclature related to amino acids shown in the IUPAC-IUB guidelines.
  • an artificially synthesized neuroleptide-inducing peptide is an artificial chemistry that does not have its peptide chain independently and stably present in nature.
  • peptide refers to an amino acid polymer having a plurality of peptide bonds, and is not limited by the number of amino acid residues contained in the peptide chain. Accordingly, oligopeptides having up to about 10 amino acid residues or polypeptides having more amino acid residues are also included in the neuronal differentiation-inducing peptides in this specification.
  • amino acid residue is a term including the N-terminal amino acid and the C-terminal amino acid of the peptide chain, unless otherwise specified.
  • a partially modified amino acid sequence (modified amino acid sequence) J with respect to a predetermined amino acid sequence means that the predetermined amino acid sequence does not impair the neural differentiation-inducing property 1
  • amino acid residues are conservatively replaced by 7 so-called conservative amino acid replacement sequences (eg, A sequence in which a basic amino acid residue is replaced with another basic amino acid residue), or one or several (typically 2 or 3) amino acid residues are added for a given amino acid sequence (Inserted) or deleted sequences are described in this specification. It is a typical example encompassed by the U "partial reforming strange was subjected sequence (modified amino acid sequence)."
  • polynucleotide is a term indicating a polymer (nucleic acid) in which a plurality of nucleotides are linked by a phosphate diester bond, and is not limited by the number of nucleotides.
  • Various lengths of DNA and RNA fragments are encompassed by the polynucleotides herein.
  • artificially designed polynucleotides are artificially synthesized by chemical synthesis or biosynthesis (ie, production based on genetic engineering) in which the nucleotide chain (full length) alone does not exist in nature. Polynucleotides that are made.
  • the present inventor is an artificial amino acid sequence present in a BC box, which is a region (domain or motif) that binds to the Elondin BC complex (specifically, a part of the amino acid sequence portion of Elondin C).
  • An amino acid sequence capable of exerting neuronal differentiation-inducing property even with a relatively short peptide chain that can be synthesized, and a peptide comprising the sequence were identified.
  • SEQ ID NOs: 1 to 15 are amino acid sequences contained in BC boxes of various proteins identified as SOCS proteins (see the above four documents).
  • mSOCS— 1 (SEQ ID NO: 1), mSOCS— 2 (SEQ ID NO: 2), mSOCS— 3 (SEQ ID NO: 3), mSOCS— 4 (SEQ ID NO: 4), mSOCS— 5 (SEQ ID NO: 5), hSOCS 6 (SEQ ID NO: 6), hSOCS— 7 (SEQ ID NO: 7), hRAR— 1 (SEQ ID NO: 8), hRAR-like (SEQ ID NO: 9), mWSB 1 (SEQ ID NO: 10), mWSB 2 (SEQ ID NO: 11) ), mASB 1 (SEQ ID NO: 12), mASB—2 (SEQ ID NO: 13), hASB—3 (SEQ ID NO: 14), LRR—1 (SEQ ID NO: 15) 14 or 15 from the N-terminus of the BC box An amino acid sequence consisting of consecutive amino acid residues and a peptide consisting of the amino acid sequence are shown! (See the above four
  • SEQ ID NO: 41-: L01 is an amino acid contained in BC-box of various SOCS proteins identified from viruses (HIV, AdV, SIV, etc.) and mammals
  • the sequence and the peptide consisting of the sequence are shown.
  • SEQ ID NO: 96 and SEQ ID NO: 100 are amino acid sequences contained in the BC-box of a SOCS protein (MUF1) identified from human.
  • SEQ ID NO: 101 is an amino acid sequence contained in the BC box of a SOCS protein mCIS (cytokine-inducible SH2-containing protein) identified from a mouse.
  • these SEQ ID NOs are given and at least 10 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequences shown in the sequence listing attached to the present specification (for example, amino acid sequences shown in the sequence listing) Peptide consisting of 10 amino acid residues on the N-terminal side) It can be suitably used as a tide.
  • an appropriate one based on an amino acid sequence consisting of at least 10 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequences shown in these sequence listings (preferably an amino acid sequence consisting of 10 to 15 consecutive amino acid residues).
  • Such a modified sequence can be used as a neuronal differentiation-inducing peptide.
  • amino acid sequences consisting of 14 or 15 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box shown in each SEQ ID NO. An amino acid sequence in which several amino acid residues are deleted, for example, each sequence The amino acid sequence consisting of 8, 9, 10, 11, 12 or 13 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box shown in the number (ie, the BC-box C shown in each SEQ ID NO.
  • a modified amino acid sequence obtained by deleting several amino acid residues on the terminal side) and having a neuronal differentiation-inducing property is preferred.
  • an amino acid sequence consisting of 14 or 15 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box shown in each SEQ ID No. and further having several amino acid residues added to the C-terminal side is also suitable. It can be a modified amino acid sequence.
  • the neuronal differentiation-inducing peptide may be a peptide that only has the above-mentioned BC-box-derived amino acid sequence or a modified amino acid sequence thereof (hereinafter also collectively referred to as “BC-box-related sequence”).
  • BC-box-related sequence a modified amino acid sequence thereof
  • a peptide having such a domain can be rapidly introduced into a cell when supplied to a predetermined cell material (target cell), and can improve the activity of inducing nerve differentiation. it can.
  • SEQ ID NOs: 16, 17, and 18 show the amino acid sequence of the protein transduction domain contained in HIV TAT and the peptide comprising the sequence.
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of the protein transduction domain (PTD4) obtained by modifying the TAT and a peptide having the sequence ability.
  • SEQ ID NO: 18 shows the related amino acid sequence of ANT of Drosophila mutant Antennapedia and a peptide comprising the sequence.
  • the above-mentioned cell membrane translocation domains shown in the sequence listing are merely examples, and usable domains are not limited to these.
  • Various cell membrane transduction domains that can be used in the practice of the present invention have been published at the time of filing the present application and are described in numerous documents. The amino acid sequence of these cell membrane translocation domains can be easily known by general search means.
  • the neuronal differentiation-inducing peptide provided by the present invention is preferably one in which at least one amino acid residue is amidated.
  • the structural stability (for example, protease resistance) of the neuronal differentiation-inducing peptide can be improved by the amido of the carboxyl group of the amino acid residue (typically the C-terminal amino acid residue of the peptide chain).
  • Nerve irritation-inducing peptides are desirable in which the total number of amino acid residues constituting the peptide chain is 100 or less (preferably 50 or less, particularly preferably 30 or less).
  • Such a peptide having a short chain length is easy to chemically synthesize, and can easily provide a neuronal differentiation-inducing peptide.
  • the peptide conformation (three-dimensional structure) is not particularly limited as long as it exhibits neuronal differentiation inducibility in the environment in which it is used, but it is linear from the viewpoint that it is difficult to become an immunogen (antigen). A shape or a helix shape is preferred. Such a peptide is unlikely to constitute an epitope.
  • the neuronal differentiation-inducing peptide applied to the neuronal differentiation-inducing agent is preferably a linear and relatively low molecular weight (typically 50 or less (particularly 30 or less) amino acid residues). is there.
  • the ratio of BC-box-related sequences to the entire amino acid sequence is:
  • the ratio is not particularly limited as long as the nerve differentiation-inducing activity is not lost, but the ratio is preferably 50% or more.
  • the peptide for inducing neuronal differentiation according to the present invention all amino acid residue-type amino acids are preferred, but as long as the neuronal differentiation-inducing activity is not lost, one amino acid residue is used. Some or all of them may be substituted with D-type amino acids.
  • the neuronal differentiation-inducing peptide of the present invention may partially contain a sequence that cannot be included in the neural differentiation-inducing sequence, as long as the neuronal differentiation-inducing property is not lost.
  • such partial sequences include BC-box-related sequence portions in peptide chains.
  • a sequence that can maintain a three-dimensional shape is preferred.
  • a peptide having a relatively short peptide chain can be easily produced according to a general chemical synthesis method. For example, it is possible to adopt the! / Or deviation of the conventionally known solid phase synthesis method or liquid phase synthesis method.
  • a protecting group for the amino group Boc (t-butyloxycarbonyl) or Fi Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) is applied, and a 7-core solid synthesis method is suitable.
  • neuroleptide-inducing peptides disclosed herein are commercially available peptide synthesizers (eg, PerSe ptive
  • a neuronal differentiation-inducing peptide may be biosynthesized based on genetic engineering techniques! This approach is preferred when producing polypeptides with relatively long peptide chains. That is, DNA of a nucleotide sequence (including the ATG start codon) encoding the amino acid sequence of a desired neuronal differentiation-inducing peptide is synthesized. Then, various regulatory elements (including a promoter, a ribosome binding site, a terminator, an enhancer, and various cis elements that control the expression level) for expressing the DNA and the amino acid sequence in a host cell are included. A recombinant vector having a gene construct for expression consisting of is constructed according to the host cell.
  • This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (for example, yeast, insect cell, plant cell, animal (mammalian) cell) by a general technique, and the host cell or a tissue containing the cell under a predetermined condition. And cultivate individuals. As a result, the desired polypeptide can be expressed and produced in the cell.
  • the target neuronal differentiation-inducing peptide can be obtained by isolating and purifying the host cell (in the medium if secreted) force polypeptide.
  • This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (for example, yeast, insect cell, plant cell, mammalian cell) by a general technique, and the host cell or a tissue or an individual containing the cell is cultured under a predetermined condition. To do. As a result, the desired polypeptide can be expressed and produced in the cell. And host cells (if secreted The desired neuronal differentiation-inducing peptide can be obtained by isolating and purifying the polypeptide from the medium).
  • a predetermined host cell for example, yeast, insect cell, plant cell, mammalian cell
  • a fusion protein expression system can be used for efficient mass production in a host cell. That is, a gene (DNA) encoding the amino acid sequence of the target neuronal differentiation-inducing peptide is chemically synthesized, and the synthesized gene is converted into an appropriate fusion protein expression vector (for example, the pET series and Amashi provided by Novagen). It is introduced into a suitable site for GST (Glutathione S-transferase) fusion protein expression vectors such as the pGEX series provided by Jam Bioscience.
  • a host cell typically E. coli
  • the obtained transformant is cultured to prepare the desired fusion protein.
  • the protein is then extracted and purified.
  • the obtained purified fusion protein is cleaved with a predetermined enzyme (protease), and the released peptide fragment (designed neuronal differentiation-inducing peptide) is recovered by a method such as affinity chromatography.
  • a predetermined enzyme protease
  • affinity chromatography a method such as affinity chromatography
  • construct a cage DNA for cell-free protein synthesis system that is, a synthetic gene fragment containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a neuronal differentiation-inducing peptide
  • construct various compounds necessary for peptide synthesis ATP, RNA polymerase, amino acids, etc.
  • the cell-free protein synthesis system performs the target neuron.
  • Differentiation-inducing peptides can be easily synthesized and produced.
  • the neuroleptidase-inducing peptide of the present invention can be easily produced based on the Pure System (registered trademark) of Post Genome Research Institute, Inc., Japan.
  • a single-stranded or double-stranded polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the neuronal derivation peptide disclosed herein and a nucleotide sequence complementary to Z or the sequence can be easily produced by a conventionally known method ( Synthesis). That is, by selecting a codon corresponding to each amino acid residue constituting the designed amino acid sequence, a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the neuronal differentiation-inducing peptide can be easily determined and provided. Once the nucleotide sequence is determined, a polynucleotide (single strand) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like. Further, the obtained double-stranded DNA can be obtained by employing various enzymatic synthesis means (typically PCR) using the obtained single-stranded DNA as a cage.
  • Synthesis Synthesis
  • the polynucleotide provided by the present invention may be in the form of DNA or RNA (such as mRNA).
  • DNA can be provided in double-stranded or single-stranded form. When provided as a single strand, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) of a complementary sequence.
  • the polynucleotide provided by the present invention constructs a recombinant gene (expression cassette) for the production of a neuroleptidase-inducing peptide in various host cells or in a cell-free protein synthesis system. It can be used as a material for
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a neuronal differentiation-inducing peptide having a novel amino acid sequence and a nucleotide sequence complementary to Z or the sequence.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide chain is 50 or less (particularly preferred 30 or less)
  • a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 103 or an amino acid sequence containing a modified sequence (neurogenesis differentiation-related sequence) of the sequence
  • Z or the sequence Artificially designed polynucleotides are provided that comprise (or consist essentially of) complementary nucleotide sequences.
  • a preferred neuronal differentiation-inducing peptide of the present invention has a high nerve differentiation-inducing activity against at least one kind of cell. For this reason, it can be suitably used as an active ingredient of a neuronal differentiation inducer.
  • the neuronal differentiation-inducing peptide contained in the neuronal differentiation-inducing agent may be in the form of a salt as long as the neuronal differentiation-inducing activity is not impaired.
  • an acid addition salt of the peptide that can be obtained by addition reaction of an inorganic acid or an organic acid usually used according to a conventional method can be used.
  • other salts for example, metal salts
  • the neuronal differentiation-inducing agent can contain various pharmaceutically (pharmaceutical) acceptable carriers depending on the form of use. Carriers generally used in peptide medicine are preferred as diluents, excipients and the like. Depending on the use and form of the neuronal differentiation-inducing agent, it may vary as appropriate, but typically water, physiological buffer, and various organic solvents can be mentioned. It may be a non-drying oil such as an aqueous solution of an appropriate concentration of alcohol (such as ethanol), glycerol or olive oil. Alternatively, it may be a ribosome. Examples of secondary components that can be contained in the nerve differentiation-inducing agent include various fillers, extenders, binders, moisturizers, surfactants, pigments, and fragrances.
  • neuronal differentiation inducer there is no particular limitation regarding the form of the neuronal differentiation inducer.
  • typical forms include solutions, suspensions, emulsions, aerosols, foams, granules, powders, tablets, capsules, ointments.
  • physiological saline or an appropriate buffer solution for example, PBS
  • compositions using a neuronal differentiation-inducing peptide (main component) and various carriers (subcomponents) as materials may be in accordance with a conventionally known method. Since the profitable preparation method itself does not characterize the present invention, a detailed description is omitted. For more information on prescriptions, for example Comprehensive Medicinal Chemistr y, supervised by Corwin Hansch, published by Pergamon Press (1990). The entire contents of this book are incorporated herein by reference.
  • the neuronal differentiation-inducing agent provided by the present invention can be used in a method or dosage depending on its form and purpose.
  • a neuronal differentiation-inducing peptide comprising a BC-box-related sequence disclosed herein that is, a neuronal differentiation-inducing agent comprising the peptide is injected as a liquid, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally or intraperitoneally.
  • a patient ie, a living body
  • a solid form such as a tablet can be administered orally so that it can be administered in vivo, typically in or around the affected area.
  • Nerve cells can be generated (produced) from existing somatic stem cells, which makes it possible to effectively treat various neurological diseases for which nerve regeneration is an effective treatment.
  • Regenerative medical approach for neurological diseases such as Parkinson's disease, cerebral infarction, Alzheimer's disease, body paralysis due to spinal cord injury, brain contusion, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, brain tumor, retinal degeneration It is possible to treat with.
  • an appropriate amount of a neuronal differentiation-inducing agent may be added to cellular material temporarily or permanently removed from a living body, ie, raw silk and woven cell mass (eg, culture of somatic stem cells).
  • a differentiation-inducing peptide By applying a differentiation-inducing peptide, neurons can be efficiently generated in vitro (in vitro). This means that the desired nerve cells can be produced in large quantities in the cell material.
  • the present invention also provides cells that have been induced to differentiate into nerve cells, which are useful for the treatment of neurological diseases, by utilizing any of the neuronal differentiation-inducing peptides disclosed herein.
  • a cell mass or living tissue can be provided.
  • the polynucleotide encoding the neuronal differentiation-inducing peptide of the present invention can be used as a material used for so-called gene therapy.
  • encoding neuronal differentiation-inducing peptide The gene (typically a DNA segment, or RNA segment) is inserted into an appropriate vector and introduced into the target site, so that the present invention is always in the living body (cell) in the present invention.
  • Such neuronal differentiation-inducing peptides can be expressed. Therefore, the polynucleotide (DNA segment, RNA segment, etc.) encoding the neuronal differentiation-inducing peptide of the present invention is useful as a drug for treating or preventing neurological diseases for the above-mentioned patients.
  • Example 1 A total of 24 types of peptides (samples 1 to 24) were produced using the peptide synthesizer described below. Table 1 lists the amino acid sequences of these synthetic peptides.
  • hSOCS—6 (SEQ ID NO: 6) for sample 1, m WSB-1 (SEQ ID NO: 10) for sample 2, mASB—1 (SEQ ID NO: 12) for sample 3, hSOCS—7 (SEQ ID NO: 7) for sample 4 ), MWSB-2 (SEQ ID NO: 11) for sample 5, LRR-1 (SEQ ID NO: 15) for sample 6, mASB-2 (SEQ ID NO: 13) for sample 7, hASB-3 (SEQ ID NO: 14) for sample 8, Sample 9 has mSOCS-5 (SEQ ID NO: 5), sample 10 has hRAR-1 (SEQ ID NO: 8), sample 11 has mSOCS-1 (SEQ ID NO: 1), sample 12 has mSOCS-2 (SEQ ID NO: 2), In sample 13, mSOCS-3 (SEQ ID NO: 3), and in sample 14, an amino acid consisting of 14 or 15 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box contained in mSOCS-4 (SEQ ID NO:
  • Sample 15 has an amino acid sequence consisting of 10 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box contained in hSOCS-6 (SEQ ID NO: 6).
  • Sample 16 has an amino acid sequence consisting of 10 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box contained in mASB-1 (SEQ ID NO: 12).
  • Sample 17 also has an amino acid sequence consisting of 10 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box contained in mWSB-1 (SEQ ID NO: 10).
  • VIF A (SEQ ID NO: 80) has an amino acid sequence consisting of 15 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box.
  • Sample 20 has an amino acid sequence consisting of 15 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box contained in M-SSB1 (SEQ ID NO: 92).
  • Sample 21 is SIV
  • VIF CPZ has an amino acid sequence consisting of 15 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box contained in GAB (SEQ ID NO: 89).
  • Sample 22 is the 7th amino acid residue R from the N-terminal in the amino acid sequence consisting of 10 consecutive amino acid residues from the N-terminal of the BC-box contained in hSOCS-6 (SEQ ID NO: 6). Modified amino substituted with It has an acid sequence.
  • Sample 23 has an amino acid sequence consisting of 10 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box contained in MUF1 (SEQ ID NO: 96).
  • Sample 24 has an amino acid sequence consisting of 15 consecutive amino acid residues from the N-terminus of the BC-box contained in mCI S (SEQ ID NO: 101).
  • Each peptide described above is a commercially available peptide synthesizer (Applied Biosystems product).
  • the Fmoc-amino acid force that binds to the resin by repeating the deprotection group reaction and the condensation reaction also extends the peptide chain, and the synthetic peptide of the desired chain length Got.
  • 20% piperidine Z dimethylformamide (DMF) grade for peptide synthesis, product of Kanto Chemical Co., Ltd.
  • Fmoc Fmoc-amino acid
  • —OH Fmoc-amino acid
  • the synthesized peptide chain is transferred to a centrifuge tube together with greaves, and ethanediol 1.8 mL, m-taresol 0.6 mL, thioanol 3.6 mL and trifluoroacetic acid 24 mL are added at room temperature. Stir for 2 hours. Thereafter, the rosin bound to the peptide chain was removed by filtration.
  • the molecular weight of each eluted peptide is measured using MALD ⁇ TOF / MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry) using Voyager DE RP (trademark) manufactured by PerSeptive Biosystems. Based on the above. As a result, it was confirmed that the target peptide was synthesized and purified.
  • Example 1 the neuronal differentiation-inducing activity was examined for two peptides of sample 1 (YARAAARQA RA-SLQYLCRFVIRQYTR) and sample 6 (YARAAARQARA—TLLESSARTILHN RI).
  • these sample peptides were added and incubated in the culture solution of neural stem cells collected from mouse force and the culture solution of adipose stem cells collected from humans, respectively.
  • the addition concentration was lOngZmL and lOOngZmL for all peptides.
  • evaluation was carried out by the conventional immuno-antibody method.
  • neuron markers MAPs (Microfilament Associated Proteins) and NeuN (Neuronal neuron markers.
  • MAPs are markers that can be stained (detected) broadly to relatively immature-Euron force mature-Euron NeuN is a marker that can specifically stain (detect) mature-euron.
  • Fig. 1 to Fig. 20 which are micrographs, the above two types of stem cells showed significant nerve separation in the above two types of sample peptides (concentration 10 ng / mL). . When the concentration was lOOngZmL, more remarkable nerve division was observed. Such neuronal differentiation was not observed in the control (control) incubated with the sample peptide.
  • Sample 2 (YARAAARQARA—SLQHICRMSIRRVMS), Sample 3 (YARAAA RQARA-TLLSLCRVAVRRALG), Sample 4 (YARAAARQARA—SLQHLCRFRIR QLVR), Sample 5 (YARAAARQARA—SLKHLCRKALRSFLT), Sample 7 (YARA AARQARA-PLAHLCRLRVRIG) SLTHLCRLEI RSSIK), Sample 9 (YARAAARQARA—SLQYICRAVICRCTT), Sample 10 (YARA AARQARA-SLQDLCCRAWSCTP), Sample 11 (YARAAARQARA—PLQELCR QRIVAAVG), Sample 12 (YARAAARQARA—TLQHFCRLAINKCT), Sample 13 (YARAAARQARA-TLY — SL QHICRTVICNCTT), Sample 15 (YARAAARQARA— SLQYLCRFVI), Sample 16 (YARAAARQARA -TLLSLCRVAV), Sample 17 (YARAAARQARA—SL
  • nerve differentiation-inducing peptide nerve differentiation-inducing agent
  • nerve differentiation-inducing agent nerve differentiation-inducing agent
  • the neuronal differentiation-inducing peptide of the present invention has a high activity of inducing neural differentiation, and therefore can be used as a pharmaceutical peptide component.

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Abstract

　本発明によって提供される神経分化誘導剤は、少なくとも一種の細胞を神経細胞に分化誘導し得る少なくとも一種のペプチドを含有する神経分化誘導剤であって、前記ペプチドとして： 　ＳＯＣＳ系タンパク質に属する何れか一種のタンパク質のＢＣ－ボックスを構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基から成るＢＣ－ボックス由来アミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む人為的に合成されたペプチド； 　を含有する。

Description

神経分化誘導ペプチド及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、神経分化誘導性を有するペプチドとその利用に関する。特にそのぺプ チドを有効成分とする神経分化誘導剤に関する。
本願は 2005年 7月 20日に出願された日本国特許出願第 2005— 210674号、 20 05年 8月 11曰〖こ出願された曰本国特許出願第 2005— 233782号および 2005年 9 月 22日に出願された日本国特許出願第 2005— 276795号に基づく優先権を主張 しており、これら出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
背景技術
[0002] 再生医療分野における一つの課題として神経細胞の再生が挙げられる。例えば、 種々の中枢神経系疾患の治療として、神経幹細胞或!ゝは胚性幹細胞 (ES細胞）を 利用して神経細胞を再生することが期待されている（特開 2004— 357543号公報） 。しかし、神経幹細胞等は入手 (採取）が困難である。また、これら幹細胞は患部にそ のまま移植されても神経細胞にほとんど分ィ匕せず生着も困難である。仮に生着した 場合でもグリア細胞に分ィ匕してしまうものがほとんどである。
[0003] また、皮膚幹細胞や脂肪幹細胞等の体性 (成体)幹細胞は、比較的入手が容易な 幹細胞であり、これら幹細胞より神経細胞を分化することができれば医療産業上の利 用価値は高い。しかし、従来、短時間に且つ高効率にこれら体性幹細胞から神経細 胞を分化誘導する方法は未だ確立されておらず、かかる方法の確立、具体的には、 そのような目的に適する神経分化誘導剤の開発が望まれている。例えば特開平 9 323928号公報には、ピロリドン誘導体を有効成分とする神経分化誘導剤が記載さ れて ヽるが、体性幹細胞から神経細胞を分化誘導する効果にっ ヽては記載がな ヽ。 発明の開示
[0004] 本発明は、上記の特開平 9 323928号公報に記載されるような従前の化学物質 を有効成分とする神経分化誘導剤の開発アプローチとは全く異なるアプローチにより 創出されたものである。本発明の一つの目的は、神経分化誘導性を有するペプチド の提供である。また、そのようなペプチドを有効成分とする神経分化誘導剤 (薬学的 組成物）の提供を他の目的とする。また、そのようなペプチドを設計することを他の目 的とする。また、そのようなペプチドを使用して神経細胞を生産する方法または神経 細胞を発生させる方法を提供することを他の目的とする。
本発明によって提供される神経分ィ匕誘導ペプチドは、それ単独で自然界にお!/、て 神経分化誘導ペプチドとして存在するものではない人為的に設計された神経分化誘 導ペプチドである。本発明者は、ェロンジン A(ElonginA)と複合体を形成して転写 調節因子として働くことが知られて 、るェロンジン BC (ElonginBC)コンプレックス ( 具体的には ElonginCの一部）に結合し得る領域 (アミノ酸配列）である SOCS—ボッ タスを有する種々の SOCSタンパク質 (サイト力イン情報伝達のサブレッサー）に着目 した。例えば、以下の文献：
(1) .PNAS、 95卷、 1998年、 pp. 114—119 ;
(2) .ジーン 'アンド'ディべロップメント (GENES & DEVELOPMENT), 12卷、 1998年、 pp. 3872- 3881 ;
(3) .ジーン 'アンド'ディべロップメント (GENES & DEVELOPMENT), 18卷、 2004年、 pp. 2867— 2872 ;および
(4) .ジーン 'アンド'ディべロップメント (GENES & DEVELOPMENT), 18卷、 2004年、 pp. 3055- 3065 ;
を参照された 、（これら文献の全内容は本明細書中に参照として援用されて 、る。）。 そして、鋭意検討の結果、 SOCSタンパク質及びそれらのファミリータンパク質 (以 下総称して「socs系タンパク質」と 、う。）を構成するペプチド鎖 (アミノ酸配列）の一 部であって、 ElonginBCコンプレックスに結合すると考えられている特定領域「BC— ボックス」の全部又は一部を構成するアミノ酸配列力も成るペプチドが、体性幹細胞 に対する高い神経分化誘導活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った ここで開示される神経分化誘導ペプチドは、少なくとも一種の細胞を神経細胞に分 化誘導し得るペプチド（以下「神経分化誘導ペプチド」とも 、う。）である。
即ち、本発明は、そのようなペプチドとして、 SOCS系タンパク質に属する何れか一 種のタンパク質の BC -ボックスを構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも 10 個の連続するアミノ酸残基から成る BC—ボックス由来アミノ酸配列又は該配列に部 分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む人為的に合成されたペプチドを提供する
[0007] ここで開示されるペプチドの好ましい一態様では、前記 BC—ボックス由来配列又 はその改変配列の N末端側又は C末端側に、細胞膜通過ドメインを構成するアミノ酸 配列を含む。カゝかる細胞膜通過ドメインを構成するアミノ酸配列の好まし 、例として配 列番号 16、 17及び 18のいずれかに示すものが挙げられる。
また、ここで開示されるペプチドの好ましい他の一態様では、ペプチドを構成する全 アミノ酸残基数が 50以下である。
また、ここで開示されるペプチドの好ましい他の一態様では、前記 BC—ボックス由 来配列として配列番号 1〜配列番号 15 (即ち計 15通りの配列）のうちのいずれかに 示すアミノ酸配列から選択される少なくとも 10個の連続するアミノ酸残基から成るアミ ノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む。配列番号 1〜 配列番号 15のうちのいずれかに示すアミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施 されたアミノ酸配列を含むペプチドは好ましい例である。
[0008] また、ここで開示されるペプチドの好ましい他の一態様では、前記 BC—ボックス由 来配列として、配列番号 41〜配列番号 101 (即ち計 61通りの配列）のうちのいずれ かに示すアミノ酸配列から選択される少なくとも 10個の連続するアミノ酸残基から成 るアミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む。配列番 号 41〜配列番号 101のうちの 、ずれかに示すアミノ酸配列又は該配列に部分的な 改変が施されたアミノ酸配列を含むペプチドは好ましい例である。
また、ここで開示されるペプチドの好ましい他の一態様では、配列番号 19〜配列番 号 40、配列番号 102及び配列番号 103 (即ち計 24通りの配列）のうちのいずれかに 示すアミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む。これら アミノ酸配列から構成されるペプチドは好ましい例である。
[0009] また、本発明は、ここで開示されるいずれかの神経分化誘導ペプチドをコードする ヌクレオチド配列及び Z又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、天然に存 在しない人為的に設計されたポリヌクレオチド (例えばそれら配列により実質的に構 成されるポリヌクレオチド)を提供する。
好ましいポリヌクレオチドとして、配列番号 1〜103 (即ち計 103通りの配列）のうち の！、ずれかに示されるアミノ酸配列（または該配列にぉ 、て部分的な改変が施され て成る改変配列）をコードするヌクレオチド配列及び Z又は該配列と相補的なヌクレ ォチド配列を含むポリヌクレオチド (例えばそれら配列により実質的に構成されるポリ ヌクレオチド）が挙げられる。
[0010] また本発明は、ここで開示される少なくとも一種の神経分化誘導ペプチドを含有す る神経分化誘導剤を提供する。
即ち、ここで開示される神経分化誘導剤は、 SOCS系タンパク質に属する何れか一 種のタンパク質の BC—ボックスを構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも 10 個の連続するアミノ酸残基から成る BC—ボックス由来アミノ酸配列又は該配列に部 分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む人為的に合成されたペプチドを含む。
[0011] 好ましくは、前記ペプチドは前記 BC—ボックス由来配列又はその改変配列の N末 端側又は C末端側に細胞膜通過ドメインを構成するアミノ酸配列を含む。
また、全アミノ酸残基数が 50以下である前記ペプチドを有効成分とする神経分ィ匕 誘導剤が好ましい。
また、前記 BC—ボックス由来配列として配列番号 1〜配列番号 15のうちの!/、ずれ か或いは配列番号 41〜配列番号 101のうちのいずれかに示すアミノ酸配列力も選 択される少なくとも 10個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列又は該配列に 部分的な改変が施されたアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分とする神経分化誘 導剤が好ましい。
また、配列番号 19〜配列番号 40、配列番号 102及び配列番号 103のうちのいず れかに示すアミノ酸配列を含むペプチドを有効成分とする神経分化誘導剤が好まし い。
ここで開示される神経分化誘導剤は、典型的には、一種又は二種以上の神経分ィ匕 誘導ペプチドと薬学的に許容され得る担体とを含む。
[0012] また、本発明は他の側面として、ここで開示される神経分化誘導ペプチドを製造す る方法を提供する。即ち、この方法は、 SOCS系タンパク質に属する何れか一種のタ ンパク質の BC—ボックスを構成するアミノ酸配列力も選択される少なくとも 10個の連 続するアミノ酸残基から成る BC—ボックス由来アミノ酸配列又は該配列に部分的な 改変が施されたアミノ酸配列を含み、且つ、少なくとも一種の細胞に対して神経分ィ匕 誘導性を有するペプチド鎖を設計すること、および、前記設計したペプチド鎖を合成 すること、を包含する。
[0013] 好ましくは、前記 BC—ボックス由来アミノ酸配列又はその改変アミノ酸配列の N末 端側又は C末端側に細胞膜通過ドメインを構成するアミノ酸配列を含むペプチド鎖を 設計する。
また、好ましくは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 50以下となるように該 ペプチド鎖を設計する。
[0014] また、本発明は他の側面として、ここで開示される神経分化誘導ペプチドを利用す る種々の方法を提供する。
その一つとして本発明は、少なくとも一種の細胞材料から神経細胞を生産する方法 を提供する。
即ち、本発明に係る神経細胞生産方法は、 SOCS系タンパク質に属する何れか一 種のタンパク質の BC—ボックスを構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも 10 個の連続するアミノ酸残基から成る BC—ボックス由来アミノ酸配列又は該配列に部 分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む人為的に合成されたペプチドを用意する こと、および、該ペプチドを前記細胞材料に供給すること、を包含する。
[0015] 本生産方法の好ま 、一態様では、前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列 又はその改変配列の N末端側又は C末端側に、細胞膜通過ドメインを構成するァミノ 酸配列を含む。
また、好ましい他の一態様では、前記ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が 50以 下である。
また、好ましい他の一態様では、前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列とし て配列番号 1〜配列番号 15のうちのいずれか或いは配列番号 41〜配列番号 101 のうちのいずれかに示すアミノ酸配列から選択される少なくとも 10個の連続するァミノ 酸残基から成るアミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を 含む。
また、好ましい他の一態様では、前記ペプチドは、配列番号 19〜配列番号 40、配 列番号 102及び配列番号 103のうちのいずれかに示すアミノ酸配列を含む。
[0016] また、本発明は、ここで開示される神経分化誘導ペプチドを利用する方法として、 生体又は生組織中に神経細胞を発生させる方法を提供する。
即ち、本発明に係る神経細胞発生方法は、 SOCS系タンパク質に属する何れか一 種のタンパク質の BC—ボックスを構成するアミノ酸配列から選択される少なくとも 10 個の連続するアミノ酸残基から成る BC—ボックス由来アミノ酸配列又は該配列に部 分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む人為的に合成されたペプチドを用意する こと、および、生体又は生体外に一時的又は永久的に摘出された生糸且織に前記ぺプ チドを付与すること、を包含する。
[0017] 本発生方法の好ま 、一態様では、前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列 又はその改変配列の N末端側又は C末端側に、細胞膜通過ドメインを構成するァミノ 酸配列を含む。
また、好ましい他の一態様では、前記ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が 50以 下である。
また、好ましい他の一態様では、前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列とし て配列番号 1〜配列番号 15のうちのいずれか或いは配列番号 41〜配列番号 101 のうちのいずれかに示すアミノ酸配列から選択される少なくとも 10個の連続するァミノ 酸残基から成るアミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を 含む。
また、好ましい他の一態様では、前記ペプチドは、配列番号 19〜配列番号 40、配 列番号 102及び配列番号 103のうちのいずれかに示すアミノ酸配列を含む。
[0018] 本発明の神経分化誘導剤に含まれる有効成分たるペプチドは、上述のとおり、前 記 BC—ボックス由来アミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配 列を含む合成ペプチドであるため容易に製造することができる。このため、所望する 量のペプチド (延 、ては神経分化誘導剤)を容易に調製することができる。 また、本発明によると、そのような神経分化誘導剤 (神経分化誘導ペプチド)を利用 することにより、従来は困難であった非神経細胞 (典型的には脂肪幹細胞、皮膚幹細 胞等の体性幹細胞、或いは胚性幹細胞)を神経細胞に分化誘導することが容易に 実現される。このため、比較的大量に調達し得る細胞材料 (脂肪幹細胞等)を使用し て、用途 (例えば、神経の再生が要求されるような神経疾患の治療）に応じて所望さ れる量の神経細胞を供給することができる。或いはまた、神経再生が必要な患部や 体外に摘出した一時的又は永久的な生組織 (細胞塊等の培養物を含む）に適当量 を投与することにより、神経細胞の発生を実現することができる。
<配列表フリーテキスト >
配列番号 1〜配列番号 103 合成ペプチド
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、マウス神経幹細胞にサンプル 1のペプチドを lOngZmLの濃度で添カロ して培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： MAPsを使用した免疫抗体法で調べ た結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 2]図 2は、マウス神経幹細胞にサンプル 1のペプチドを lOngZmLの濃度で添カロ して培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： NeuNを使用した免疫抗体法で調べ た結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 3]図 3は、マウス神経幹細胞にサンプル 6のペプチドを lOngZmLの濃度で添カロ して培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： MAPsを使用した免疫抗体法で調べ た結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 4]図 4は、マウス神経幹細胞にサンプル 6のペプチドを lOngZmLの濃度で添カロ して培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： NeuNを使用した免疫抗体法で調べ た結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 5]図 5は、マウス神経幹細胞にサンプル 1のペプチドを lOOngZmLの濃度で添 カロして培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： MAPsを使用した免疫抗体法で調 ベた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 6]図 6は、マウス神経幹細胞にサンプル 1のペプチドを lOOngZmLの濃度で添 加して培養した後の神経分化の状態をマーカー： NeuNを使用した免疫抗体法で調 ベた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 7]図 7は、マウス神経幹細胞にサンプル 6のペプチドを lOOngZmLの濃度で添 加して培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： MAPsを使用した免疫抗体法で調 ベた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 8]図 8は、マウス神経幹細胞にサンプル 6のペプチドを lOOngZmLの濃度で添 加して培養した後の神経分化の状態をマーカー： NeuNを使用した免疫抗体法で調 ベた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 9]図 9は、マウス神経幹細胞にペプチドを添加しな 、で培養した後の神経分ィ匕の 状態をマーカー: MAPsを使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光顕微鏡写 真である。
[図 10]図 10は、マウス神経幹細胞にペプチドを添加しないで培養した後の神経分ィ匕 の状態をマーカー： NeuNを使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光顕微鏡 写真である。
[図 11]図 11は、ヒト脂肪幹細胞にサンプル 1のペプチドを lOngZmLの濃度で添カロ して培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： MAPsを使用した免疫抗体法で調べ た結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 12]図 12は、ヒト脂肪幹細胞にサンプル 1のペプチドを lOngZmLの濃度で添カロ して培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： NeuNを使用した免疫抗体法で調べ た結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 13]図 13は、ヒト脂肪幹細胞にサンプル 6のペプチドを lOngZmLの濃度で添カロ して培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： MAPsを使用した免疫抗体法で調べ た結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 14]図 14は、ヒト脂肪幹細胞にサンプル 6のペプチドを lOngZmLの濃度で添カロ して培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： NeuNを使用した免疫抗体法で調べ た結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 15]図 15は、ヒト脂肪幹細胞にサンプル 1のペプチドを lOOngZmLの濃度で添 加して培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： MAPsを使用した免疫抗体法で調 ベた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 [図 16]図 16は、ヒト脂肪幹細胞にサンプル 1のペプチドを lOOngZmLの濃度で添 加して培養した後の神経分化の状態をマーカー： NeuNを使用した免疫抗体法で調 ベた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 17]図 17は、ヒト脂肪幹細胞にサンプル 6のペプチドを lOOngZmLの濃度で添 カロして培養した後の神経分ィ匕の状態をマーカー： MAPsを使用した免疫抗体法で調 ベた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 18]図 18は、ヒト脂肪幹細胞にサンプル 6のペプチドを lOOngZmLの濃度で添 加して培養した後の神経分化の状態をマーカー： NeuNを使用した免疫抗体法で調 ベた結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
[図 19]図 19は、ヒト脂肪幹細胞にペプチドを添加しないで培養した後の神経分ィ匕の 状態をマーカー: MAPsを使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光顕微鏡写 真である。
[図 20]図 20は、ヒト脂肪幹細胞にペプチドを添加しな 、で培養した後の神経分ィ匕の 状態をマーカー: NeuNを使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光顕微鏡写 真である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及し て 、る事項 (例えば神経分化誘導ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって 本発明の実施に必要な事柄 (例えばペプチド合成、ポリヌクレオチド合成、ペプチド を成分とする神経分化誘導剤 (薬剤組成物)の調製に関するような一般的事項)は、 医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、衛生 学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発 明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実 施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸を IUPAC-IUBガイ ドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した 1文字表記 (但し配列表では 3 文字表記)で表す。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照 として組み入れられて 、る。 [0021] 本明細書において「人為的に合成された神経分ィ匕誘導ペプチド」とは、そのべプチ ド鎖がそれのみで独立して自然界に安定的に存在するものではなぐ人為的な化学 合成或いは生合成 (即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の系（例 えば神経分化誘導剤を構成する組成物）の中で安定して存在し得るペプチド断片を いう。
本明細書にぉ 、て「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマー を指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されない。 従ってアミノ酸残基数が 10程度までのオリゴペプチド或いはそれ以上のアミノ酸残基 力 成るポリペプチドも本明細書における神経分ィ匕誘導ペプチドに包含される。 本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖の N末端アミノ酸及び C末端アミノ酸を包含する用語である。
[0022] 本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「部分的な改変が施されたアミノ酸 配列（改変アミノ酸配列） Jとは、当該所定のアミノ酸配列が有する神経分化誘導性を 損なうことなぐ 1個または数個（例えば 9個以下、好ましくは 5個以下、特に好ましくは 2, 3個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び Z又は付加 (挿入)されて形成されたァミノ 酸配列をいう。例えば、 1個又は数個（典型的には 2個又は 3個）のアミノ酸残基が保 守的に 換し 7こいわゆる I司 ¾置換 (conservative amino acid replacement)によって生 じた配列 (例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列）、 或いは、所定のアミノ酸配列について 1個又は数個（典型的には 2個又は 3個）のアミ ノ酸残基が付加 (挿入)した若しくは欠失した配列等は、本明細書で ヽぅ「部分的な改 変が施された配列（改変アミノ酸配列）」に包含される典型例である。
また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエス テル結合で結ばれたポリマー (核酸)を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限 定されない。種々の長さの DNAフラグメント及び RNAフラグメントが本明細書におけ るポリヌクレオチドに包含される。また、「人為的に設計されたポリヌクレオチド」とは、 そのヌクレオチド鎖 (全長）がそれ単独で自然界に存在するものではなぐ化学合成 或いは生合成 (即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成されたポリヌク レオチドをいう。 [0023] 本発明者は、ェロンジン BCコンプレックス（具体的にはェロンジン Cのアミノ酸配列 部分の一部）に結合する領域 (ドメイン又はモチーフ）である BC ボックスに存在す るアミノ酸配列であって、人為的に合成可能な比較的短 、ペプチド鎖であっても神 経分化誘導性を発揮し得るアミノ酸配列及び該配列から成るペプチドを特定した。 その典型例である配列番号 1〜15は、 SOCS系タンパク質として同定された各種タ ンパク質の BC ボックスに含まれるアミノ酸配列である（上記 4つの文献参照)。 具体的には、 mSOCS— 1 (配列番号 1) , mSOCS— 2 (配列番号 2) , mSOCS— 3 (配列番号 3) , mSOCS— 4 (配列番号 4) , mSOCS— 5 (配列番号 5) , hSOCS 6 (配列番号 6) , hSOCS— 7 (配列番号 7) , hRAR— 1 (配列番号 8) , hRAR-li ke (配列番号 9) , mWSB 1 (配列番号 10) , mWSB 2 (配列番号 11) , mASB 1 (配列番号 12) , mASB— 2 (配列番号 13) , hASB— 3 (配列番号 14) , LRR— 1 (配列番号 15)に含まれる BC ボックスの N末端から 14個又は 15個の連続するァ ミノ酸残基から成るアミノ酸配列及び該配列から成るペプチドを示して!/ゝる（上記 4つ の文献参照)。
[0024] また、特に詳細な説明は省略する力 配列番号 41〜： L01は、ウィルス（HIV、 AdV 、 SIV等）や哺乳動物から同定された種々の SOCS系タンパク質の BC—ボックスに 含まれるアミノ酸配列及び該配列から成るペプチドを示している。例えば、配列番号 96および配列番号 100は、ヒトから同定された SOCS系タンパク質（MUF1)の BC —ボックスに含まれるアミノ酸配列である。また、配列番号 101は、マウスから同定さ れた SOCS系タンパク質 mCIS (cytokine- inducible SH2- containing protein)の BC —ボックスに含まれるアミノ酸配列である。
これらは例示であり、本発明に関する BC ボックスの構成アミノ酸配列をこれらに 限定することを意図したものではない。ここに例示するまでもなぐ様々な BC—ボック スの構成アミノ酸配列が本願出願当時に出版されて 、る数々の文献に記載されて ヽ る。それらアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
[0025] 本発明では、これら配列番号を付与し、本明細書に添付の配列表に示したアミノ酸 配列から選択される少なくとも 10個の連続するアミノ酸残基 (例えば配列表に示すァ ミノ酸配列の N末端側の 10個のアミノ酸残基)から成るペプチドを神経分化誘導ぺプ チドとして好適に利用することができる。
また、これら配列表に示したアミノ酸配列から選択される少なくとも 10個の連続する アミノ酸残基から成るアミノ酸配列 (好ましくは 10個〜 15個の連続するアミノ酸残基か ら成るアミノ酸配列）に基づく適当な改変配列を神経分化誘導ペプチドとして利用す ることがでさる。
例えば、各配列番号に示す BC—ボックスの N末端から 14個又は 15個の連続する アミノ酸残基力 成るアミノ酸配列のうち、数個のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配 列、例えば各配列番号に示す BC—ボックスの N末端から 8個、 9個、 10個、 11個、 1 2個又は 13個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列（即ち各配列番号に示す BC—ボックスの C末端側の数個のアミノ酸残基を欠失させて成る改変アミノ酸配列） であって、神経分化誘導性を有するペプチドが好ま ヽ。
或いは、各配列番号に示す BC—ボックスの N末端から 14個又は 15個の連続する アミノ酸残基カゝら成るアミノ酸配列のさらに C末端側に数個のアミノ酸残基を付加した ものも好適な改変アミノ酸配列となり得る。
また、神経分ィ匕誘導ペプチドは、前記 BC—ボックス由来アミノ酸配列又はその改 変アミノ酸配列 (以下、総称して「BC—ボックス関連配列」ともいう。）のみ力 成るぺ プチドであってもよいが、神経分化誘導性の向上の観点からは、いわゆる細胞膜通 過ドメイン (タンパク質導入ドメイン： Protein Transduction Domain)を構成するアミノ酸 配列の導入が好ましい。このようなドメイン (モチーフ)を備えるペプチドであれば、所 定の細胞材料 (ターゲットである細胞)に供給した際、細胞内に速やかに導入され得、 神経分ィ匕誘導活性を向上させることができる。
多くの好適な細胞膜通過ドメイン (ペプチド断片)が知られている力 それらのうちの 好適な幾つかの例を配列番号 16, 17及び 18に示した。配列番号 16は、 HIVの TA Tに含まれるタンパク質導入ドメインのアミノ酸配列と該配列から成るペプチドを示し ている。配列番号 17は、前記 TATを改変したタンパク質導入ドメイン (PTD4)のアミ ノ酸配列と該配列力も成るペプチドを示している。配列番号 18は、ショウジヨウバエ（ Drosophila)の変異体 Antennapediaの ANTの関連アミノ酸配列と該配列から成るぺ プチドを示している。 なお、配列表に示した上述の細胞膜通過ドメインはあくまでも例示であり、使用可 能なドメインはこれらに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な細胞膜通 過ドメインが本願出願当時に出版されて 、る数々の文献に記載されて 、る。それら細 胞膜通過ドメインのアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができ る。
[0027] 本発明によって提供される神経分化誘導ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残 基がアミドィ匕されて 、るものが好ま U、。アミノ酸残基 (典型的にはペプチド鎖の C末 端アミノ酸残基)のカルボキシル基のアミドィ匕により、神経分化誘導ペプチドの構造安 定性 (例えばプロテアーゼ耐性)を向上させ得る。
神経分ィ匕誘導ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 100以下 (好 適には 50以下、特に好ましくは 30以下）であるものが望ましい。このような鎖長の短 いペプチドは、化学合成が容易であり、容易に神経分化誘導ペプチドを提供すること ができる。なお、ペプチドのコンホメーシヨン（立体構造）については、使用する環境 下で神経分化誘導性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免 疫原 (抗原）になり難いという観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましい。この ような形状のペプチドはェピトープを構成し難い。かかる観点から、神経分化誘導剤 に適用する神経分化誘導ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量 (典型的 には 50以下 (特に 30以下）のアミノ酸残基数)のものが好適である。
[0028] 全体のアミノ酸配列に対する BC—ボックス関連配列の占める割合 (即ちペプチド鎖 を構成する全アミノ酸残基数に占める BC—ボックス関連配列部分を構成するァミノ 酸残基数の個数％)は、神経分化誘導活性を失わない限り特に限定されないが、当 該割合は 50%以上が好ましい。なお、本発明の神経分ィ匕誘導ペプチドとしては、全 てのアミノ酸残基力 型アミノ酸であるものが好ま 、が、神経分化誘導活性を失わ な 、限りにお 、て、アミノ酸残基の一部又は全部が D型アミノ酸に置換されて 、るも のであってもよい。
[0029] 本発明の神経分ィ匕誘導ペプチドは、神経分化誘導性を失わない限りにお 、て、神 経分化誘導関連配列に含まれ得ない配列を部分的に含み得る。特に限定するもの ではないが、かかる部分配列としてはペプチド鎖における BC—ボックス関連配列部 分の 3次元形状 (典型的には直鎖形状)を維持し得る配列が好ましい。
[0030] ここで開示される神経分ィ匕誘導ペプチドのうちペプチド鎖の比較的短いものは、一 般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相 合成法又は液相合成法の!/、ずれを採用してもよ ヽ。ァミノ基の保護基として Boc (t-b utyloxycarbonyl)或 ヽ i Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl)を適用し 7こ固ネ目合成法 が好適である。
ここで開示される神経分ィ匕誘導ペプチドは、市販のペプチド合成機 (例えば、 PerSe ptive
Biosystems社、 Applied Biosystems社等から入手可能である。）を用いた固相合成法 により、所望するアミノ酸配列、修飾 (C末端アミド化等)部分を有するペプチド鎖を合 成することができる。
[0031] 或 ヽは、遺伝子工学的手法に基づ!/ヽて神経分化誘導ペプチドを生合成してもよ ヽ 。このアプローチは、ペプチド鎖の比較的長いポリペプチドを製造する場合に好適で ある。すなわち、所望する神経分化誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオ チド配列 (ATG開始コドンを含む。）の DNAを合成する。そして、この DNAと該ァミノ 酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボ ゾーム結合部位、ターミネータ一、ェンハンサー、発現レベルを制御する種々のシス エレメントを包含する。 )とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、 宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞 (例えばイースト、昆 虫細胞、植物細胞、動物（哺乳類)細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又 は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細 胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞 (分泌された場合は培地中） 力 ポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の神経分化誘導ペプチドを 得ることができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞 (例 えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主 細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリぺプ チドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞 (分泌された場合は 培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、 目的の神経分化誘導ぺプ チドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導 入方法等は、当該分野で従来力 行われている方法をそのまま採用すればよぐ 力る方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する 例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システ ムを利用することができる。すなわち、 目的の神経分ィ匕誘導ペプチドのアミノ酸配列 をコードする遺伝子 (DNA)を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質 発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されて 、る pETシリーズおよびアマシ ャムバイオサイエンス社から提供されている pGEXシリーズのような GST(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該 ベクターにより宿主細胞 (典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体 を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製 する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ)で切断し、 遊離した目的のペプチド断片 (設計した神経分化誘導ペプチド)をァフィ-テイクロマ トグラフィ一等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現シ ステム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供される GSTZHisシステムを 利用し得る。）を用いることによって、本発明の神経分化誘導ペプチドを製造すること ができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の铸型 DNA (即ち神経分ィ匕誘導べプチ ドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ぺ プチド合成に必要な種々の化合物 (ATP、 RNAポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用 し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビト 口合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えば Shimizu らの餘文 (Shimizu et al., Nature Biotechnology,
19, 751-755(2001》、 Madinらの論文 (Madin et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術 に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行 つており、また、無細胞タンパク質合成用キット (例えば、 日本の東洋紡績 (株)から入 手可能な PROTEIOS (商標） Wheat germ cell-free protein
synthesis kit)が市販されている。
従って、上述のようにして、利用するアミノ酸配列（BC—ボックス関連配列）をひとた び決定し、ペプチド鎖を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパ ク質合成システムによって目的の神経分化誘導ペプチドを容易に合成'生産すること ができる。例えば、 日本の (株)ポストゲノム研究所のピュアシステム (登録商標）に基 づいて本発明の神経分ィ匕誘導ペプチドを容易に生産することができる。
ここで開示される神経分ィヒ誘導ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び Z又は 該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、 従来公知の方法によって容易に製造 (合成)することができる。すなわち、設計したァ ミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、神経 分化誘導ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提 供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、 DNA合成機等を利用 して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得るこ とができる。さらに得られた一本鎖 DNAを铸型として用い、種々の酵素的合成手段（ 典型的には PCR)を採用して目的の二本鎖 DNAを得ることができる。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、 DNAの形態であってもよぐ RNA( mRNA等）の形態であってもよい。 DNAは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一 本鎖で提供される場合は、コード鎖 (センス鎖)であってもよぐそれと相補的な配列 の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよ 、。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で 又は無細胞タンパク質合成システムにて、神経分ィ匕誘導ペプチド生産のための組換 え遺伝子 (発現カセット)を構築するための材料として使用することができる。
本発明によると、新規なアミノ酸配列の神経分化誘導ペプチドをコードするヌクレオ チド配列及び Z又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提 供される。例えば、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 50以下 (特に好ましく は 30以下）であって、配列番号 1〜103のいずれかで示されるアミノ酸配列或いは該 配列の改変配列 (神経分化誘導関連配列）を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオ チド配列及び Z又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む (又はそれら配列から 実質的に構成された)人為的に設計されたポリヌクレオチドが提供される。
[0034] 好適な本発明の神経分化誘導ペプチドは少なくとも一種の細胞に対して高!ヽ神経 分化誘導活性を有する。このため、神経分化誘導剤の有効成分として好適に使用し 得る。なお、神経分化誘導剤に含有される神経分化誘導ペプチドは、神経分化誘導 活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通 常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ぺプ チドの酸付加塩を使用することができる。或いは、神経分化誘導活性を有する限り、 他の塩 (例えば金属塩)であってもよ!/、。
[0035] 神経分化誘導剤は、有効成分である神経分化誘導ペプチドの他、使用形態に応じ て医薬 (薬学)上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてぺプ チド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。神経分化誘導剤の用途や 形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶 媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール (エタノール等)水溶液、グリセロール、ォ リーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリボソームであってもよい。また、神経分 化誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付 湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
神経分化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、 液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏 が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝 液 (例えば PBS)等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすること ちでさる。
なお、神経分化誘導ペプチド（主成分)及び種々の担体 (副成分)を材料にして種 々の形態の薬剤 (組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよ く、カゝかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもな ヽため詳細な説明は省略 する。処方に関する詳細な情報源として、例えば Comprehensive Medicinal Chemistr y, Corwin Hansch監修， Pergamon Press刊 (1990)が挙げられる。この書籍の全内容は 本明細書中に参照として援用されて 、る。
[0036] 本発明によって提供される神経分化誘導剤は、その形態及び目的に応じた方法や 用量で使用することができる。
例えば、ここで開示される BC—ボックス関連配列を含む神経分化誘導ペプチド (即 ち該ペプチドを含む神経分化誘導剤は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内 若しくは腹腔内への注射によって患者 (即ち生体)に所望する量だけ投与することが できる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。これにより、 生体内で、典型的には患部又はその周辺に存在する体性幹細胞から、神経細胞を 発生 (生産)させることができる。このため、神経再生が有力な治療法となる種々の神 経疾患を効果的に治療することが可能となる。例えば、パーキンソン病、脳梗塞、ァ ルツハイマー病、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋萎縮性側索硬化症、ハン チントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患を再生医療的アプローチによって治 療することが実現される。
[0037] 或 、はまた、生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料、即ち生糸且織ゃ細 胞塊 (例えば体性幹細胞の培養物)に、適当量の神経分化誘導剤 (神経分化誘導べ プチド)を付与することによって、体外 (インビトロ)で神経細胞を効率よく発生させるこ とができる。このことは当該細胞材料中に所望する神経細胞を大量に生産し得ること を意味する。
而して、大量に生産された神経細胞、或いは該生産された神経細胞を含む細胞材 料 (生組織や細胞塊)を再び生体内 (典型的には神経再生が要求されている患部）に 戻すことによつても、生体に直接神経分化誘導剤 (神経分化誘導ペプチド)を投与す る場合と同様の治療効果が得られ得る。
以上の説明から明らかなように、本発明はまた、ここで開示される神経分化誘導べ プチドのいずれかを利用することによって、神経疾患治療に有用な、神経細胞に分 化誘導された細胞、細胞塊又は生組織を提供することができる。
[0038] また、本発明の神経分ィ匕誘導ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遺 伝子治療に使用する素材として用い得る。例えば、神経分化誘導ペプチドをコード する遺伝子（典型的には DNAセグメント、或!ヽは RN Aセグメント）を適当なベクター に組み込み、 目的とする部位に導入することにより、常時、生体 (細胞）内で本発明に ンンンンンンンンンンンンンンンンンンンンンンンン
係る神経分化誘導ペプチドを発現させることが可能である。従って、本発明の神経分 化誘導ペプチドをコードするポリヌクレオチド (DNAセグメント、 RNAセグメント等）は 、上述した患者等に対し、神経疾患を治療し又は予防する薬剤として有用である。
[0039] 以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に 示すものに限定することを意図したものではない。
[0040] <実施例 1：ペプチド合成 >
計 24種類のペプチド (サンプル 1〜24)を後述するペプチド合成機を用いて製造し た。表 1には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列を列挙している。
[0041] [表 1]
T a b 1
ァ: '酸配列 総アミノ酸残茶数
7 レ丄 YARAAARQARA- SLQYLCRFVIRQYTR (配列番号丄 9 ) 2 6 7 2 YARAAARQARA- SLQHICRMSIRRVMS (配列番号 2 0 ) 2 6 7 3 YARAAARQARA- -TLLSLCRVAVRRALG (配列番号 2 丄 ) 2 6 7 4 YARAAARQARA- SLQHLCRFRIRQLVR (配列番号 2 2 ) 2 6 7 o YARAAARQARA- SLKHLCRKALRSFLT (配列番号 2 3 ) 2 6 プ 6 YARAAARQARA- TLLESSARTILHNRI (配列番号 2 4 ) 2 6 プ 7 YARAAARQARA- PLAHLCRLRVR AIG (配列番号 2 5 ) 2 6 プ 8 YARAAARQARA- SLTHLCRLEIRSSIK (配列番号 2 6 ) 2 6 プ 9 YARAAARQARA- SLQYICRAVICRCTT (配列番号 2 7 ) 2 6 プ 1 0 YARAAARQARA- -SLQDLCCRAVVSCTP (配列番号 2 8 ) 2 6 プ 1 1 YARAAARQARA- - PLQELCRQRIVAAVG (配列番号 2 9 ) 2 6 プ 1 2 YARAAARQARA- -TLQHFCRLAINKCT (配列番号 3 0 ) 2 5 プ 1 3 YARAAARQARA- -TLQHLCR TVNGHLD (配列番号 3 1 ) 2 6 プ 1 4 YARAAARQARA- -SLQHに RTVに NC丌 (配列番号 3 2 ) 2 6 プ 1 5 YARAAARQARA- SLQYLCRFVI (配列 «号 3 3 ) 2 1 プ 1 6 YARAAARQARA- -TLLSLCRVAV (配列番号 3 4 ) 2 1 プ 1 7 YARAAARQARA- -SLQHICRMSI (配列 «号 3 5 ) 2 1 フ レ 1 8 YARAAARQARA- -SLQYLCRFVIRQYT (!¾列番号 3 6 ) 2 6 フ レ 1 9 YARAAARQARA- -SLQYLALKALVTP 列番号 3 7 ) 2 6 フ レ 2 0 YARAAARQARA- - PLMDLCRRSVRLALG 列番号 3 8 ) 2 6 フ レ 2 1 YARAAARQARA- -SLQFLAL ALISERR 列番号 3 9 ) 2 6 フ レ 2 2 YARAAARQARA- -SLQYLC FVI (1%！列番^ 4 0 ) 2 1 フ レ 2 3 YARAAARQARA- -ALFELCGRAV 列番号 1 0 2 ) 2 1 フ レ 2 4 YARAAARQARA- -SLQHLCRLVINRLVA (¾列番号 1 0 3 ) 2 6 表 1に示すように、サンプル 1〜24は、 、ずれも N末端側に細胞膜通過ドメインであ る PTD4 (配列番号 17)を有し、その C末端側に隣接して BC—ボックス関連配列を 有している。すなわち、サンプル 1では hSOCS— 6 (配列番号 6)、サンプル 2では m WSB- 1 (配列番号 10)、サンプル 3では mASB— 1 (配列番号 12)、サンプル 4で は hSOCS— 7 (配列番号 7)、サンプル 5では mWSB— 2 (配列番号 11)、サンプル 6 では LRR—1 (配列番号 15)、サンプル 7では mASB— 2 (配列番号 13)、サンプル 8 では hASB— 3 (配列番号 14)、サンプル 9では mSOCS— 5 (配列番号 5)、サンプ ル 10では hRAR— 1 (配列番号 8)、サンプル 11では mSOCS— 1 (配列番号 1)、サ ンプル 12では mSOCS— 2 (配列番号 2)、サンプル 13では， mSOCS— 3 (配列番 号 3)、そしてサンプル 14では mSOCS— 4 (配列番号 4)に含まれる BC—ボックスの N末端から 14個又は 15個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を有する。 また、サンプル 15は hSOCS— 6 (配列番号 6)に含まれる BC—ボックスの N末端か ら 10個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を有する。また、サンプル 16は mASB— 1 (配列番号 12)に含まれる BC—ボックスの N末端から 10個の連続するァ ミノ酸残基から成るアミノ酸配列を有する。また、サンプル 17は mWSB— 1 (配列番 号 10)に含まれる BC—ボックスの N末端から 10個の連続するアミノ酸残基力も成る アミノ酸配列を有する。
また、サンプル 18は hSOCS— 6 (配列番号 6)に含まれる BC—ボックスの N末端か ら 15個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列のうち、 C末端アミノ酸残基 Rを Kに置換した改変アミノ酸配列を有する。また、サンプル 19は HIV— 1
VIF A (配列番号 80)に含まれる BC—ボックスの N末端から 15個の連続するァミノ 酸残基から成るアミノ酸配列を有する。また、サンプル 20は M— SSB1 (配列番号 92 )に含まれる BC—ボックスの N末端から 15個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ 酸配列を有する。また、サンプル 21は SIV
VIF CPZ— GAB (配列番号 89)に含まれる BC—ボックスの N末端から 15個の連続 するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を有する。また、サンプル 22は hSOCS— 6 ( 配列番号 6)に含まれる BC—ボックスの N末端から 10個の連続するアミノ酸残基から 成るアミノ酸配列のうち、 N末端から 7番目のアミノ酸残基 Rを Kに置換した改変アミノ 酸配列を有する。
また、サンプル 23は MUF1 (配列番号 96)に含まれる BC—ボックスの N末端から 1 0個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を有する。また、サンプル 24は mCI S (配列番号 101)に含まれる BC—ボックスの N末端から 15個の連続するアミノ酸残 基から成るアミノ酸配列を有する。
なお、いずれのサンプルも、 C末端アミノ酸のカルボキシル基（一 COOH)はアミド ィ匕（一CONH )されている。
2
[0043] 上述した各ペプチドは、市販のペプチド合成機 (アプライドバイオシステム社製品
433A)を用いて固相合成法 (Fmoc法）により合成した。なお、縮合剤として HATU ( Applied Biosystems社製品）を使用し、固相合成法に用いた榭脂及びアミノ酸は NOV A biochem社から購入した。アミノ酸配列の C末端をアミド化する場合には、固相担体 として「Rink Amide resin (100〜200 mesh)」を使用した。
而して、上記ペプチド合成機の合成プログラムに準じて脱保護基反応及び縮合反 応を反復して榭脂に結合する Fmoc—アミノ酸力もペプチド鎖を伸長していき、 目的の 鎖長の合成ペプチドを得た。具体的には、 20%ピぺリジン Zジメチルホルムアミド (D MF) (ペプチド合成用グレード、関東ィ匕学 (株)製品）によって、アミノ酸のァミノ保護基 である Fmocを切断除去し、 DMFで洗浄し、 Fmoc—アミノ酸 (-OH)各 4eqを反応させ 、 DMFで洗浄する操作を反復した。そして、ペプチド鎖の伸長反応が全て終了した 後、 20%ピぺリジン ZDMFにより Fmoc基を切断し、 DMF、メタノールの順で上記反 応物を洗浄した。
[0044] 固相合成後、合成したペプチド鎖を榭脂と共に遠沈管に移し、エタンジオール 1. 8 mL、 m -タレゾール 0. 6mL、チオア-ノール 3. 6mL及びトリフルォロ酢酸 24mLを 加え、室温で 2時間撹拌した。その後、ペプチド鎖に結合していた榭脂を濾過して除 去した。
次いで、濾液に冷却エタノールをカ卩え、氷冷水で冷却してペプチド沈澱物を得た。 その後、遠心分離 (2500rpmで 5分間）によって上澄みを廃棄した。沈殿物に冷ジェ チルエーテルを新たに加えて十分に撹拌した後、上記と同じ条件で遠心分離を行つ た。この撹拌と遠心分離の処理を計 3回反復して行った。 [0045] 得られたペプチド沈殿物を真空乾燥し、高速液体クロマトグラフ (Waters 600： Wate rs社製品）を用いて精製を行った。
具体的には、プレカラム（日本ウォーターズ (株)製品、 Guard-Pak
Delta-pak C18 A300)及び C18逆相カラム（日本ウォーターズ (株）製品、 XTerra (登 録商標）カラム、 MS C18、 5 m、 4.6 X 150mm)を使用し、 0. 1%トリフルォロ酢酸水 溶液と 0. 1%トリフルォロ酢酸ァセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。即ち 、溶離液に含まれる上記トリフルォロ酢酸ァセトニトリル溶液の分量を経時的に増大 させつつ (容積比で 10%から 80%への濃度勾配を設ける）、 1. 5mLZ分の流速で 上記カラムを用いて 30〜40分間の分離精製を行った。なお、逆相カラム力も溶離し たペプチドは紫外線検出器 (490E Detector： Waters社製品）を用いて波長： 220nm で検出され、記録チャート上にピークとして示される。
また、溶離した各ペプチドの分子量を PerSeptive Biosystems社製の Voyager DE RP (商標）を用いて MALD卜 TOF/MS (Matrix- Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry：マトリックス支援レーザーイオン化 飛行時間型 質量分析)に 基づいて決定した。その結果、 目的のペプチドが合成'精製されていることが確認さ れた。
[0046] <実施例 2：合成ペプチドの神経分化誘導活性評価 >
上記実施例 1で得られた神経分ィ匕誘導ペプチドのうち、サンプル 1 (YARAAARQA RA-SLQYLCRFVIRQYTR)及びサンプル 6 (YARAAARQARA— TLLESSARTILHN RI)の二つのペプチドについて、神経分化誘導活性を調べた。
即ち、これらサンプルペプチドを、マウス力 採取した神経幹細胞の培養液中およ びヒトから採取した脂肪幹細胞の培養液中にそれぞれ添加し、インキュベーションし た。添加濃度は、何れのペプチドについても lOngZmL及び lOOngZmLとした。 そして、ペプチドを添加して 24時間経過後、常法である免疫抗体法により評価した 。具体的には、ニューロンマーカーとして MAPs (Microfilament Associated Proteins) 及び NeuN (Neuronal
nuclei)を加え、共焦点レーザー顕微鏡で神経分化の程度を評価した。 MAPsは、比 較的未熟な-ユーロン力 成熟した-ユーロンまで幅広く染色 (検出)し得るマーカー であり、 NeuNは、成熟-ユーロンを特異的に染色 (検出)し得るマーカーである。 その結果、顕微鏡写真である図 1〜図 20に示すように、上記二種類の幹細胞は何 れも上記二種類のサンプルペプチド (濃度 10ng/mL)で顕著な神経分ィ匕が認めら れた。濃度 lOOngZmLの場合、さらに顕著な神経分ィ匕が認められた。かかる神経 分化は、サンプルペプチドを添カ卩しな 、でインキュベーションした対照 (コントロール） では認められなかった。
また、サンプル 2 (YARAAARQARA— SLQHICRMSIRRVMS)、サンプル 3 (YARAAA RQARA-TLLSLCRVAVRRALG)、サンプル 4 (YARAAARQARA— SLQHLCRFRIR QLVR)、サンプル 5 (YARAAARQARA— SLKHLCRKALRSFLT)、サンプル 7 (YARA AARQARA - PLAHLCRLRVRKAIG)、サンプル 8 (YARAAARQARA -SLTHLCRLEI RSSIK)、サンプル 9 (YARAAARQARA— SLQYICRAVICRCTT)、サンプル 10 (YARA AARQARA - SLQDLCCRAWSCTP)、サンプル 11 (YARAAARQARA— PLQELCR QRIVAAVG)、サンプル 12 (YARAAARQARA— TLQHFCRLAINKCT)、サンプル 13 (YARAAARQARA -TLQHLCRKTVNGHLD)、サンプル 14 (YARAAARQARA— SL QHICRTVICNCTT)、サンプル 15 (YARAAARQARA— SLQYLCRFVI)、サンプル 16 (YARAAARQARA -TLLSLCRVAV)、サンプル 17 (YARAAARQARA— SLQHICRM SI)、サンプル 18 (YARAAARQARA - SLQYLCRFVIRQYTK)、サンプル 19 (YARAA ARQARA- SLQYLALKALVTPKK)、サンプル 20 (YARAAARQARA— PLMDLCRRS VRLALG)、サンプル 21 (YARAAARQARA -SLQFLALKALISERR)、サンプル 22 (Y ARAAARQARA-SLQYLCKFVI)、サンプル 23 (YARAAARQARA - ALFELCGRAV )及びサンプル 24 (YARAAARQARA - SLQHLCRLVINRLVA)につ!/、て上記と同様 の試験を行ったところ、何れのサンプルについても、上記二種類の幹細胞で顕著な 神経分化が認められた。
このことから、本発明に係る神経分化誘導ペプチド (神経分化誘導剤）は、効果的 に幹細胞等の細胞を神経細胞 (ニューロン)に分ィ匕させ得ることが確かめられた。 <実施例 3 :顆粒剤の調製 >
サンプル 1のペプチド 50mgと結晶化セルロース 50mg及び乳糖 400mgとを混合し た後、エタノールと水の混合液 lmLを加え混練した。この混練物を常法に従って造 粒し、神経分化誘導ペプチドを主成分とする顆粒剤 (顆粒状神経分化誘導剤)を得 た。
[0048] 以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の 範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した 具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
産業上の利用可能性
[0049] 上述のように本発明の神経分化誘導ペプチドは高!ヽ神経分化誘導活性を有して ヽ るため、医薬用のペプチド成分として利用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 少なくとも一種の細胞を神経細胞に分ィ匕誘導し得る少なくとも一種のペプチドを含 有する神経分化誘導剤であって、前記ペプチドとして：
SOCS系タンパク質に属する何れか一種のタンパク質の BC—ボックスを構成する アミノ酸配列から選択される少なくとも 10個の連続するアミノ酸残基力も成る BC -ボ ックス由来アミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む 人為的に合成されたペプチド；
を含有する神経分化誘導剤。
[2] 前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列又はその改変配列の N末端側又は C 末端側に、細胞膜通過ドメインを構成するアミノ酸配列を含む、
請求項 1に記載の神経分化誘導剤。
[3] 前記ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が 50以下である、請求項 1又は 2に記載 の神経分化誘導剤。
[4] 前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列として配列番号 1〜配列番号 15及び 配列番号 41〜配列番号 101のうちの!/、ずれかに示すアミノ酸配列から選択される少 なくとも 10個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列又は該配列に部分的な改 変が施されたアミノ酸配列を含む、請求項 3に記載の神経分化誘導剤。
[5] 前記ペプチドは、配列番号 19〜配列番号 40、配列番号 102及び配列番号 103の うちのいずれかに示すアミノ酸配列を含む、請求項 3に記載の神経分化誘導剤。
[6] 少なくとも一種の細胞を神経細胞に分化誘導し得る少なくとも一種の人為的に合成 されたペプチドであって、
SOCS系タンパク質に属する何れか一種のタンパク質の BC—ボックスを構成する アミノ酸配列から選択される少なくとも 10個の連続するアミノ酸残基力も成る BC -ボ ックス由来アミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列と、 前記 BC—ボックス由来アミノ酸配列又はその改変アミノ酸配列の N末端側又は C 末端側に、細胞膜通過ドメインを構成するアミノ酸配列と、
を含む合成ペプチド。
[7] 前記ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が 50以下である、請求項 6に記載の合 成ペプチド。
[8] 前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列として配列番号 1〜配列番号 15及び 配列番号 41〜配列番号 101のうちの!/、ずれかに示すアミノ酸配列から選択される少 なくとも 10個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列又は該配列に部分的な改 変が施されたアミノ酸配列を含む、請求項 7に記載の合成ペプチド。
[9] 配列番号 19〜配列番号 40、配列番号 102及び配列番号 103のうちのいずれかに 示すアミノ酸配列を含む、請求項 7に記載の合成ペプチド。
[10] 少なくとも一種の細胞を神経細胞に分化誘導し得るペプチドを製造する方法であつ て、
SOCS系タンパク質に属する何れか一種のタンパク質の BC—ボックスを構成する アミノ酸配列から選択される少なくとも 10個の連続するアミノ酸残基力も成る BC -ボ ックス由来アミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を含み、 且つ、少なくとも一種の細胞に対して神経分化誘導性を有するペプチド鎖を設計す ること、
および
前記設計したペプチド鎖を合成すること、
を包含する方法。
[11] 前記 BC—ボックス由来アミノ酸配列又はその改変アミノ酸配列の N末端側又は C 末端側に、細胞膜通過ドメインを構成するアミノ酸配列を含むペプチド鎖を設計する
、請求項 10に記載の方法。
[12] ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が 50以下となるように該ペプチド鎖を設計 する、請求項 10又は 11に記載の方法。
[13] 少なくとも一種の細胞材料から神経細胞を生産する方法であって、
SOCS系タンパク質に属する何れか一種のタンパク質の BC—ボックスを構成する アミノ酸配列から選択される少なくとも 10個の連続するアミノ酸残基力も成る BC -ボ ックス由来アミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む 人為的に合成されたペプチドを用意すること、
および、 該ペプチドを前記細胞材料に供給すること、
を包含する方法。
[14] 前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列又はその改変配列の N末端側又は C 末端側に、細胞膜通過ドメインを構成するアミノ酸配列を含む、請求項 13に記載の 方法。
[15] 前記ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が 50以下である、請求項 13又は 14に 記載の方法。
[16] 前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列として配列番号 1〜配列番号 15及び 配列番号 41〜配列番号 101のうちの!/、ずれかに示すアミノ酸配列から選択される少 なくとも 10個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列又は該配列に部分的な改 変が施されたアミノ酸配列を含む、請求項 15に記載の方法。
[17] 前記ペプチドは、配列番号 19〜配列番号 40、配列番号 102及び配列番号 103の うちのいずれかに示すアミノ酸配列を含む、請求項 15に記載の方法。
[18] 生体又は生組織中に神経細胞を発生させる方法であって、
SOCS系タンパク質に属する何れか一種のタンパク質の BC—ボックスを構成する アミノ酸配列から選択される少なくとも 10個の連続するアミノ酸残基力も成る BC -ボ ックス由来アミノ酸配列又は該配列に部分的な改変が施されたアミノ酸配列を含む 人為的に合成されたペプチドを用意すること、
および、
生体又は生体外に一時的又は永久的に摘出された生組織に、前記ペプチドを付 与すること、
を包含する方法。
[19] 前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列又はその改変配列の N末端側又は C 末端側に、細胞膜通過ドメインを構成するアミノ酸配列を含む、
請求項 18に記載の方法。
[20] 前記ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が 50以下である、請求項 18又は 19に 記載の方法。
[21] 前記ペプチドは、前記 BC—ボックス由来配列として配列番号 1〜配列番号 15及び 配列番号 41〜配列番号 101のうちの!/、ずれかに示すアミノ酸配列から選択される少 なくとも 10個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列又は該配列に部分的な改 変が施されたアミノ酸配列を含む、請求項 20に記載の方法。
前記ペプチドは、配列番号 19〜配列番号 40、配列番号 102及び配列番号 103の うちのいずれかに示すアミノ酸配列を含む、請求項 20に記載の方法。
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