JP6501122B2 - ネスチン誘導合成ペプチド及びその利用 - Google Patents

ネスチン誘導合成ペプチド及びその利用 Download PDF

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Description

本発明は、アストロサイト中のネスチン発現を誘導し得る或いはネスチン発現量を増大し得る合成ペプチドとその利用に関する。特に、該ペプチドを有効成分とするネスチン発現誘導剤（組成物）ならびに該ペプチドを使用してアストロサイト由来のネスチン高発現細胞を生産する方法に関する。
なお、本出願は２０１３年１０月１１日に出願された日本国特許出願２０１３−２１３９４３号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
再生医療分野における一つの課題として、種々の神経系疾患や外傷等により失われた神経機能の再生および回復が挙げられる。
例えば、生体外（インビトロ）培養系で生産した神経細胞を患部に移入することで、脱落した神経細胞を補う方法が模索されている。しかし、すでに神経軸索を伸長した神経細胞を患部（例えば脳などの中枢神経系組織）に移入したとしても、損傷以前の神経ネットワークを再構築することは困難である。また、特に中枢神経系組織は、神経細胞とそれ以外の種々の細胞（例えばアストロサイト等）が影響し合う生理学的環境を構成することにより神経機能を発揮、維持しているため、神経細胞のみの補充で失われた神経機能を回復させることは難しい。
そこで、神経幹細胞を利用した神経機能の再生技術および回復技術の確立が期待されている。例えば、患部（例えば脳などの中枢神経系組織）に神経幹細胞を移入すること若しくは内在性の神経幹細胞の再生能力を利用することにより、生体内（典型的には患部）において必要な細胞（例えば神経細胞やアストロサイト等）に分化させ、それにより脱落した細胞を補充し、神経ネットワークおよび生理学的環境を再構築することで、神経機能回復を実現する治療法が期待されている。
近年、成体脳内にも神経幹細胞が存在しており、脳が損傷を受けた際には該神経幹細胞から分化した神経細胞が患部（損傷部）に向けて移動し、該神経細胞が患部において成熟神経細胞へ成長し、神経細胞の補充と神経ネットワークの再構築に寄与し得ることが示された（非特許文献１）。しかし、成体脳内における神経幹細胞から神経細胞への分化は、側脳室の脳室下帯（subventricular zone、ＳＶＺ）領域や海馬歯状回の顆粒細胞下帯（subgranular zone、ＳＧＺ）領域等の限られた領域でしか確認されていない。また、成体脳内の神経幹細胞は細胞数が少なく、神経幹細胞から分化し患部へ移動した神経細胞の患部における生存数が極めて低いことが指摘されている。そのため、前述した成体脳内の神経幹細胞による神経細胞の自発的供給のみでは、失われた神経機能の再生および回復には不十分である。現状においては、成体脳内に存在する神経幹細胞を生体内において必要な細胞へ分化させ、患部へ移行し、さらに患部に生着させることを促進する有効な手段は確立されていない。
一方、患部に移入可能な神経幹細胞の入手方法としては、胎生期脳内あるいは生後初期脳内の神経幹細胞若しくは成体脳内の神経幹細胞を利用する方法、または、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、embryonic stem cell）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、induced pluripotent stem cell）等から分化誘導する方法が挙げられる。しかし、脳内の神経幹細胞を利用する方法やＥＳ細胞から分化誘導する方法は、倫理的課題や拒絶反応の課題から困難である。また、誘導多能性幹細胞から分化誘導する方法についても、安全性や効率、コストの観点から、実用化への課題が残る。
国際公開第ＷＯ２００９／０９３６９２号
臨床神経学、４９巻（１１号）、２００９年、ｐｐ．８３０−８３３ ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（The Journal of Neuroscience ）、２６巻（５号）、２００６年、ｐｐ．１５５１−１５６１ ニューロン（Neuron）、４１巻（５号）、２００４年、ｐｐ．６８３−６８６ トレンド・イン・ニューロサイエンス（TRENDS in Neurosciences）、２７巻（８号）、２００４年、ｐｐ．４４７−４５２ ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（The Journal of Neuroscience ）、２１巻（１８号）、２００１年、ｐｐ．７１５３−７１６０ ＰＮＡＳ、９７巻（２５号）、２０００年、１３８８３−１３８８８ フロンティア・イン・セルラー・ニューロサイエンス（Frontiers in Cellular Neuroscience）、６巻、２０１２年、ｐｐ．１−６
最近、ＳＶＺ領域やＳＧＺ領域では、神経幹細胞のマーカータンパク質であるネスチンを発現し且つアストロサイトの特徴を有する細胞集団が多分化能を有しており、神経細胞の産生を行っている即ち当該細胞が成体脳内において神経幹細胞集団を構成していることが示された（非特許文献２〜６）。また、当該神経幹細胞は、ネスチンとアストロサイトのマーカータンパク質であるＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質、glial fibrillary acidic protein）を共発現することが示された。このことから、アストロサイト中のネスチンの発現を誘導する或いはネスチン発現量を増大することで、当該アストロサイトから神経幹細胞を生産（産生）する（または、アストロサイトを脱分化する或いは脱分化誘導するともいえる）技術の確立が期待される。
アストロサイトは中枢神経系に広範囲に存在し、細胞数も多いため、生体内（インビボ、in vivo）若しくは生体外（インビトロ、in vitro）において、アストロサイト由来の神経幹細胞を生産する（または、アストロサイト中のネスチン発現量を増大させる或いはアストロサイト由来のネスチン高発現細胞を生産するともいえる）ことができれば、医療産業上の利用価値は高い。しかし、短時間かつ高効率にアストロサイト由来のネスチン高発現細胞を生産する方法は従来確立されておらず、かかる方法の確立、並びに、そのような目的に供するネスチン発現誘導剤の開発が望まれる。また、同様の理由から、アストロサイト中のネスチン発現量を増大させることで神経幹細胞を生産する方法の確立が望まれる。例えば、非特許文献７には、アストロサイトにおいて特定遺伝子を強制的に発現させることによって、当該アストロサイトを特定の神経細胞に誘導する（分化転換、transdifferentiation）方法が記載されている。しかし、アストロサイトからネスチン高発現細胞を生産する方法、並びに、アストロサイトから神経幹細胞を生産する方法については記載が無い。
そこで本発明は、人為的に合成可能な比較的短い鎖長のペプチドであって、アストロサイト中のネスチン発現量を増大させるネスチン誘導合成ペプチドの提供を目的とする。また、そのようなペプチドを使用してアストロサイト由来のネスチン高発現細胞を生産する方法の提供を目的とする。また、そのようなペプチドを有効成分とするネスチン発現誘導剤（薬学的組成物）の提供を他の目的とする。
本発明者は、細胞内において何らかの機能を有するペプチドとしてアミノ酸配列がすでに同定されているペプチド若しくはペプチドの一部（即ち機能が特定されているモチーフ）を構成するアミノ酸配列の研究を鋭意推進し、ＳＯＣＳ（サイトカインシグナル抑制因子、suppressor of cytokine signaling）系タンパク質として同定された各種タンパク質のＢＣ−ボックスを構成するアミノ酸配列からなるペプチドに着目した。ここでＳＯＣＳ系タンパク質とは、エロンジンＡ（ＥｌｏｎｇｉｎＡ）と複合体を形成して転写調節因子として働くことが知られているエロンジンＢＣ（ＥｌｏｎｇｉｎＢＣ）コンプレックス（具体的にはエロンジンＣ（ＥｌｏｎｇｉｎＣ）の一部）に結合し得る領域（アミノ酸配列）であるＳＯＣＳ−ボックスを有する種々のＳＯＣＳタンパク質及びそれらのファミリータンパク質の総称である。また、ここでＢＣ−ボックスとは、ＥｌｏｎｇｉｎＢＣコンプレックスに結合すると考えられている特定領域をいう。
そして、鋭意検討の結果、ＳＯＣＳ６タンパク質のＢＣ−ボックスの全部又は一部を構成するアミノ酸配列を使用して構築した合成ペプチドが、アストロサイトにおいてネスチンの発現を誘導する（アストロサイト中のネスチン発現量を増大させるともいう）優れたネスチン発現誘導能（ネスチン発現誘導活性）を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
前記目的を実現すべく、本発明によると、アストロサイト中のネスチン発現量を増大させるために用いられるネスチン発現誘導剤であって、少なくとも１種のアストロサイト培養物中（典型的には培地中）に供給された際、該細胞のネスチン発現を誘導し得る或いはネスチン発現の誘導を促進し得る（ネスチン発現を増大し得る或いはネスチン発現の増大を促進しうるともいう）能力を有するペプチド（以下、「ネスチン誘導合成ペプチド」という）の少なくとも1種を有効成分（即ちアストロサイト中のネスチン発現量を増大させることに関与する物質）として含むことで特徴づけられるネスチン発現誘導剤を提供する。
即ち、前記ネスチン発現誘導剤の有効成分として使用し得る本発明に係るネスチン誘導合成ペプチドは、そのペプチド鎖中に以下のアミノ酸配列：
ＳＬＱＹＬＣＲＦＶＩＲＱＹＴＲ（配列番号１）；
若しくは該アミノ酸配列において１個、２個、又は３個のアミノ酸残基が同類置換されて形成されたアミノ酸配列の何れかからなるネスチン誘導性ペプチド配列を含む合成ペプチドである。
また、典型的には、前記ネスチン発現誘導剤は、薬学上許容され得る少なくとも１種の担体（例えば前記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも１種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体）を含む。
ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造することができる。また、物質自体が単純な構造（直鎖状のペプチド鎖）であるため、取扱いが容易であり、例えば、アストロサイトの培養物中（典型的には培地中）に該合成ペプチドを供給するという簡易な処理を行うことによって、該アストロサイト中のネスチン発現の誘導ないしネスチン発現量の増加を実現することができる。
また、ここで開示される好ましい一態様のネスチン発現誘導剤では、前記ネスチン誘導合成ペプチドは、前記ネスチン誘導性ペプチド配列のアミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する。
このような膜透過性ペプチド配列を有する前記ネスチン誘導合成ペプチドを対象とするアストロサイトに添加することによって、ネスチン誘導性ペプチド配列を該アストロサイトの外部(典型的には細胞膜の外側)から細胞内に高効率に移送することができる。
また、ここで開示される好ましい一態様のネスチン発現誘導剤では、前記ネスチン誘導合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号２）；
を有する。
配列番号２としてここで開示されているアミノ酸配列は、膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例であり、本発明の実施に好適に採用することができる。
また、ここで開示される好ましい他の一態様のネスチン発現誘導剤では、前記ネスチン誘導合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が２８以下である。このような短いペプチド鎖のペプチドは化学合成が容易であり、且つ、安価で取扱性に優れるため、ネスチン発現誘導剤の成分として好ましい。
また、ここで開示される好ましい他の一態様のネスチン発現誘導剤では、前記ネスチン誘導合成ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＳＬＱＹＬＣＲＦＶＩＲＱＹＴＲＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号７）；
を有する。
このようなネスチン誘導合成ペプチドを含むネスチン発現誘導剤は、特にヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来のアストロサイトにおいてネスチン発現量を増大させる用途に好適である。
また、本発明は、他の側面として、アストロサイト由来のネスチン高発現細胞を生産する或いはネスチン高発現細胞の生産性を向上する方法であって、アストロサイトの培養物を準備すること、および、該アストロサイト培養物中にここで開示されるいずれかのネスチン誘導合成ペプチド（換言すればここで開示されるいずれかのネスチン誘導合成ペプチドを含むネスチン発現誘導剤）を少なくとも一回供給することを特徴とする生産方法を提供する。
かかる生産方法によると、前述の通り単純な構成の合成ペプチドをネスチン発現誘導因子として使用するという簡易な手法によって、アストロサイト由来のネスチン高発現細胞を効率的に生産することができる。また、かかる生産方法は、特にヒト若しくはヒト以外の哺乳動物由来のアストロサイトにおいて好適に実施することができる。
ここで開示されるネスチン高発現細胞の生産方法の他の好ましい一態様は、前記ネスチン誘導合成ペプチドを少なくとも１回供給された後のアストロサイト培養物中からネスチン高発現細胞を選別することをさらに包含する。
かかる生産方法によると、高純度のネスチン高発現細胞集団を生産することができる。
また、ここで開示されるネスチン高発現細胞の生産方法の他の好ましい一態様は、細胞選別機（セルソータ）を使用して前記ネスチン高発現細胞の選別を行う。
かかる生産方法によると、ネスチン高発現細胞の選別を高効率に行うことができる。このような生産方法は、多量且つ高純度のネスチン高発現細胞の生産に特に好適である。
また、アストロサイト由来の神経幹細胞を生産する目的に、ここで開示されるアストロサイト由来のネスチン高発現細胞の生産方法を好適に実施することができる。即ち、アストロサイト中のネスチン発現量を増大させることにより、ネスチンを発現する神経幹細胞（ネスチン発現神経幹細胞）を生産することができる。なお、ネスチンを発現し且つアストロサイトの特徴を有する細胞が成体脳内で神経幹細胞として機能していることは非特許文献１〜６に示されている。
また、ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、アストロサイト中のネスチン発現量を増大させることにより、該アストロサイトをネスチン発現神経幹細胞に脱分化し得る或いは脱分化を促進し得る、アストロサイト脱分化能を有する合成ペプチド（アストロサイト脱分化合成ペプチドともいう）として好適に実施することができる。また、ネスチン誘導合成ペプチドを有効成分として含むネスチン発現誘導剤も同様に、アストロサイト脱分化剤として好適に実施することができる。
図１は、一実施形態に係るサンプルペプチド（サンプル１）を添加して培養した海馬由来のアストロサイトにおけるネスチン遺伝子の発現を定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Quantitative Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction、ｑＲＴ−ＰＣＲともいう）の結果で示すグラフである。 図２は、一実施形態に係るサンプルペプチド（サンプル１）を添加して培養した海馬由来のアストロサイトにおけるネスチンの発現をウエスタンブロット解析の結果で示す画像である。 図３は、一実施形態に係るサンプルペプチド（サンプル１）を添加して培養した大脳皮質由来のアストロサイトにおけるネスチン遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲの結果で示すグラフである。 図４は、一実施形態に係るサンプルペプチド（サンプル１）または比較対象のサンプルペプチド（サンプル２〜３）のいずれかを添加して培養した大脳皮質由来のアストロサイトにおけるネスチンの発現をウエスタンブロット解析の結果で示す画像である。
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
また、本明細書において「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物（例えばネスチン発現誘導剤）中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは６０以下、例えば５０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（例えば前記ネスチン誘導合成ペプチドが有するネスチン発現誘導能）を損なうことなく、１個又は数個（例えば２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドには、各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換（例えば前記同類置換）、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列であって、同様にネスチン発現誘導能を示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを包含する。
また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー（核酸）を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのＤＮＡフラグメント及びＲＮＡフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。また、「人為的に設計されたポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド鎖（全長）がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成されたポリヌクレオチドをいう。
本明細書において「ネスチン」とは、神経幹細胞のマーカータンパク質として把握されるタンパク質である。即ち、アストロサイト由来のネスチン高発現細胞は神経幹細胞として機能し得る。通常生体内のアストロサイトにおいてネスチンの発現は認められないが、培養細胞においては、無刺激状態であってもネスチンの弱い発現を認めることがある。
また、本明細書において「神経幹細胞」とは、自己複製能を有し、１以上、好ましくは２以上の神経系細胞（典型的には神経細胞若しくはグリア細胞）、またはそれらの細胞から構成される組織等に分化し得る細胞をいう。本明細書において、神経幹細胞はネスチンを発現することで特徴づけられる細胞であり得るが、前記の能力を有している限り、それに限定されない。
また、本明細書において「脱分化」とは、既に分化した細胞（分化細胞）が該細胞の有する特徴や機能を失って分化前の細胞状態に変化することをいう。例えば、神経細胞が神経前駆細胞、神経幹細胞または多能性幹細胞に変化することをいい、分化細胞の「初期化」も含む概念である。ここで、特に「アストロサイト脱分化」とは、アストロサイトにおいてネスチンの発現を誘導することにより、当該アストロサイトを神経幹細胞としての機能を有する細胞状態へ即ち当該アストロサイトを神経幹細胞へと変化させることをいう。
ここで開示されるアストロサイト由来のネスチン高発現細胞を生産する方法は、対象となるアストロサイトの培養物を準備することと、アストロサイトに供給することによって当該アストロサイトにおいてネスチンの発現量を増大し得る（ネスチン発現を誘導し得るともいう）作用が本発明者によって見出されたネスチン誘導性ペプチド配列（配列番号１）を有する合成ペプチド（即ち、ネスチン誘導合成ペプチド）を当該アストロサイト培養物中（典型的には培地中）に少なくとも一回供給することと、を特徴とする生産方法である。
ここで前記アストロサイトの好適例としては、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には哺乳動物）由来のアストロサイトである。ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、特にヒト由来のアストロサイト中のネスチン発現量を増大し得る、或いは発現量の増大を促進し得る。
上述の通り、ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、前記ネスチン誘導性ペプチド配列（配列番号１）若しくはその改変アミノ酸配列を含む合成ペプチドである。配列番号１に記載される具体的なアミノ酸配列は、ヒト由来のＳＯＣＳ６のＢＣ−ボックスを構成するペプチド鎖（アミノ酸配列）の一部であって、ＢＣ−ボックスのＮ末端から１５個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であることに加え、少なくとも一種のアストロサイトにおけるネスチン発現を誘導する或いはネスチン発現量を増大させることが本発明者によって新たに見出された配列である。昨今、シグナルペプチドの機能に関する研究が進められているが、当該ＳＯＣＳ６シグナル配列の利用によって少なくとも一種のアストロサイト中のネスチンの発現を誘導することを示唆する文献はない。
或いはまた、ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、配列番号１に示すネスチン誘導性ペプチド配列（改変アミノ酸配列を含む）のみから成る合成ペプチドであってもよいが、ネスチン発現誘導能向上の観点からは、当該ネスチン誘導性ペプチド配列のＮ末端側もしくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する合成ペプチドが好ましい。膜透過性ペプチド配列を有する合成ペプチドであれば、目的のアストロサイトに供給した際、細胞内に速やかに導入され得ることによりネスチン発現誘導能を向上させることができる。
前記膜透過性ペプチド酸配列は、細胞膜及び／又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。多くの好適な膜透過性ペプチド配列が知られているが、例えばＮｏＬＳ（核小体局在シグナル、Nucleolar localization signal）に関連するアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）がネスチン誘導合成ペプチドの膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列として好ましい。例えば、配列番号２に示すＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）に含まれるＮｏＬＳ並びに配列番号３に示すＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれるＮｏＬＳのアミノ酸配列と該配列から成るペプチドが挙げられる。また、他の膜透過性ペプチド配列の例として、配列番号４〜６に示すアミノ酸配列およびそれらの改変アミノ酸配列（膜透過性を保持しているものに限られる）が挙げられる。配列番号４は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれる膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列と該配列から成るペプチドを示している。配列番号５は、前記ＴＡＴを改変した膜透過性ペプチド配列（ＰＴＤ４）のアミノ酸配列と該配列から成るペプチドを示している。配列番号６は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ関連アミノ酸配列と該配列から成るペプチドを示している。
なお、配列表に示した上述の膜透過性ペプチド配列はあくまでも例示であり、使用可能なペプチド配列はこれに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な膜透過性ペプチド配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
特に、膜透過性ペプチド配列として以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号２）；
が好ましい。
かかる配列番号２に示すアミノ酸配列又はその改変アミノ酸配列と前記ネスチン誘導性ペプチド配列（配列番号１）又はその改変アミノ酸配列とを組み合わせることにより、高いネスチン発現誘導能を示す合成ペプチドを得ることができる。
ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＳＬＱＹＬＣＲＦＶＩＲＱＹＴＲＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号７）；
またはその改変アミノ酸配列を特に好ましく含有する。配列番号７に示すアミノ酸配列は、前記配列番号１に示すヒト由来のＳＯＣＳ６シグナル配列を構成するアミノ酸配列と、前記配列番号２に示すＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列と、を組み合わせることにより構築された合計２８アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）のうちの幾つかは、上述したようなネスチン誘導性ペプチド配列と、膜透過性ペプチド配列とを適宜組み合わせることにより構築することができる。ネスチン誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の何れが相対的にＣ末端側（Ｎ末端側）に配置されてもよい。また、ネスチン誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とは隣接して配置されるのが好ましい。即ち、ネスチン誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間には、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないか或いは存在していても該残基数が１〜３個程度が好ましい。例えば、ネスチン誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間にリンカーとして機能する１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基（例えば１個又は数個のグリシン（G）残基）を含むものであり得る。
ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。
ネスチン誘導合成ペプチドは、前記ネスチン発現誘導能を失わない限りにおいて、ネスチン誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。特に限定するものではないが、かかる部分配列としてはネスチン誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列部分の３次元形状（典型的には直鎖形状）を維持し得る配列が好ましい。該ネスチン誘導合成ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が適当であり、６０以下が望ましく、５０以下が好ましい。例えば３０以下、典型的には２８以下の合成ペプチドが特に好ましい。
このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易にネスチン誘導合成ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下（生体外若しくは生体内）でアストロサイトにおけるネスチン発現誘導能を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、本発明に適用するネスチン誘導合成ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には６０以下、例えば５０以下、特に３０以下、具体的には２８以下のアミノ酸残基数）のものが好適である。
全体のアミノ酸配列に対するネスチン誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の占める割合（即ちペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に占めるネスチン誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸残基数の個数％）は、アストロサイトにおけるネスチン発現誘導能を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね６０％以上が望ましく、８０％以上が好ましい。９０％以上が特に好ましい。ネスチン誘導性ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とから成る（即ち、これらの配列が全アミノ酸配列の１００％を占める）ペプチドは好適な一形態である。
なお、本発明のネスチン誘導合成ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、アストロサイトにおけるネスチン発現誘導能を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
或いは、遺伝子工学的手法に基づいてネスチン誘導合成ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望するネスチン誘導合成ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のネスチン誘導合成ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のネスチン誘導合成ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズ及びアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出し、精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計したネスチン誘導合成ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。また、必要に応じて適当な方法によってリフォールディングする。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ちネスチン誘導合成ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、ネスチン誘導合成ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、ネスチン誘導合成ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、前記アストロサイトにおけるネスチン発現誘導能を損なわない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、前記アストロサイトにおけるネスチン発現誘導能を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドはネスチン発現誘導能を有する合成ペプチドであるため、アストロサイト由来のネスチン高発現細胞を生産する目的並びに対象とするアストロサイト中のネスチン発現量を増大させる目的に好適に使用し得る。
ここで開示されるネスチン発現誘導剤は、有効成分であるネスチン誘導合成ペプチドのネスチン発現誘導能が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。ネスチン発現誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、ネスチン発現誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
ネスチン発現誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ、即ちリン酸緩衝生理食塩水）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、ネスチン誘導合成ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴づけるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
ここで開示されるネスチン発現誘導剤（ネスチン誘導合成ペプチド）の適用対象アストロサイトは特に制限されず、種々の動物由来のアストロサイトにおいてネスチン発現を誘導する(若しくはネスチン発現誘導を促進する)ことが可能である。例えば、ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来のアストロサイトが挙げられる。ここで開示されるネスチン発現誘導剤は、特にヒト由来のアストロサイトが適用対象として好ましい。
なお、ネスチン発現誘導剤（ネスチン誘導合成ペプチド）の適用対象アストロサイトは、生体外で維持される培養細胞に限定されず、生体内のアストロサイトにも適用可能である。
ここで開示されるネスチン発現誘導剤（ネスチン誘導合成ペプチド）は、アストロサイトをネスチン発現神経幹細胞に脱分化させるために用いられるアストロサイト脱分化剤（アストロサイト脱分化合成ペプチド）として利用することができる。即ち、ネスチン発現誘導剤（ネスチン誘導合成ペプチド）はアストロサイト脱分化能を有する。
ここで前記アストロサイトの好適例としては、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には哺乳動物）由来のアストロサイトである。ここで開示されるアストロサイト脱分化剤（アストロサイト脱分化合成ペプチド）は、特にヒト由来のアストロサイトをネスチン発現神経幹細胞に脱分化し得る、或いは脱分化を促進し得る。
なお、アストロサイト脱分化剤（アストロサイト脱分化合成ペプチド）の適用対象アストロサイトは、インビトロ培養系の培養細胞に限定されず、生体内のアストロサイトにも適用可能である。
ここに開示されるアストロサイト培養物中のアストロサイトは、アストロサイトの性質を維持する限り、特に限定されない。例えば、ヒト又はヒト以外の動物（典型的には哺乳動物）由来のアストロサイトであり得、初代培養細胞、継代細胞、細胞株（セルライン）等の各種培養細胞であり得る。また、例えば、グリオーマ（神経膠腫瘍）由来、海馬由来、大脳辺縁部由来、脊髄由来、末梢神経系の膠細胞由来等、生体内の種々の組織由来のアストロサイトであり得る。幹細胞（例えば多能性幹細胞や体性幹細胞等）や神経系以外の組織（例えば、脂肪組織や皮膚組織等）由来の細胞から分化誘導して得られたアストロサイトであってもよい。ヒトの中枢神経系由来の各種培養細胞、幹細胞や神経系以外の組織由来の細胞から分化誘導されたアストロサイトは、医療産業上の観点から好ましい。
また、ここに開示されるアストロサイト培養物中のアストロサイトは、その性質を維持する限り、分子生物学的操作をされてもよい。例えば、培養株樹立のためのテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）遺伝子の導入や、ネスチン発現を標識するマーカー遺伝子やマーカータンパク質をコードする遺伝子の導入等が挙げられる。
ここに開示されるネスチン高発現細胞の選別方法は特に限定されず、種々の細胞選別方法を利用してネスチン高発現細胞を選別可能である。例えば、蛍光標識式細胞分取器（ＦＡＣＳ、fluorescence-activated cell sorter）を用いた細胞選別、磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ（登録商標））を用いた細胞分別、顕微鏡下での細胞選別、光ピンセットを利用した細胞選別、各種カラムを用いた細胞選別、抗原抗体反応を応用した細胞選別、細胞染色を応用した細胞選別、特定遺伝子導入による標識を利用した細胞選別、細胞の生理的性質（増殖性、接着性、遊走性、細胞分裂の特徴、栄養要求性等）を利用した細胞選別などが挙げられる。
また、ここに開示されるネスチン高発現細胞の選別に用いられる細胞選別機は特に限定されず、種々の細胞選別機を利用することができる。例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ（登録商標）、光ピンセットを応用した細胞選別装置、各種カラムを応用した細胞選別装置が挙げられる。ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ並びに光ピンセットを応用した細胞選別装置は、自動化により高効率にネスチン高発現細胞を分取可能なため、本発明の実施に好適に用いることができる。特にＦＡＣＳおよびＭＡＣＳは高精度な分取が可能なため、好ましい。
ネスチン高発現細胞の選別に利用可能なネスチン高発現細胞の特徴としては、例えば、ネスチン、ネスチンＲＮＡ、ネスチン発現と相関性の高いタンパク質若しくは該タンパク質をコードするＲＮＡ、又は分子生物学的手法によりアストロサイトに導入したタンパク質若しくは導入遺伝子の転写産物および翻訳産物、又はネスチン高発現細胞の生理的性質（増殖性、接着性、遊走性、細胞分裂の特徴、栄養要求性等）等が挙げられるが、ネスチン高発現細胞を選別可能な特徴であれば特に限定されない。特にネスチン、ネスチンＲＮＡ、ネスチン発現と相関性の高いタンパク質または該タンパク質をコードするＲＮＡは比較的簡易な方法でネスチンの発現を識別可能であるため本発明の実施に好適に用いることができる。特にネスチン及び/又はネスチン発現と相関性の高いタンパク質は抗原抗体反応による識別が可能なため好ましい。例えば、蛍光標識された抗ネスチン抗体を用いてネスチンタンパク質を標識し、該標識を目印としてネスチン高発現細胞を選別可能である。
ここで開示されるアストロサイト由来のネスチン高発現細胞の生産方法は、アストロサイト由来のネスチン発現神経幹細胞を生産（産生）する目的に好適に実施することができる。即ち、アストロサイト中のネスチン発現量を増大させることにより、ネスチンを高発現する神経幹細胞を生産することができる。
なお、前記ネスチン発現神経幹細胞の生産方法は、インビトロ培養系における神経幹細胞の生産に限定されず、生体内における神経幹細胞の産生或いは神経幹細胞の産生促進にも適応可能である。
ここで開示されるネスチン発現誘導剤（ネスチン誘導合成ペプチド）即ちアストロサイト脱分化剤（アストロサイト脱分化合成ペプチド）は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、インビトロで培養（継代）しているアストロサイト中のネスチン発現量を増大させる場合においては、ここで開示されるネスチン発現誘導剤（ネスチン誘導合成ペプチド）即ちアストロサイト脱分化剤（アストロサイト脱分化合成ペプチド）の適当量を、対象のアストロサイトに対し、培養過程のいずれかの段階（好ましくは培養開始後初期の段階）で培地に添加するとよい。添加量及び添加回数は、培養細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。典型的には、培地中のペプチド濃度が概ね０．１μＭ〜１００μＭの範囲内、好ましくは０．５μＭ〜２０μＭ（例えば１μＭ〜１０μＭ）の範囲内となるように、１〜複数回添加する（例えば培養開始時並びに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加添加する）ことが好ましい。
また、ここで開示されるネスチン発現誘導剤（ネスチン誘導合成ペプチド）即ちアストロサイト脱分化剤（アストロサイト脱分化合成ペプチド）は、他のネスチン発現誘導剤並びにアストロサイト脱分化剤と併用することも可能であり、或いは他のネスチン発現誘導方法並びにアストロサイト脱分化方法と併用することも可能である。
或いはまた、ここに開示されるネスチン発現誘導剤（ネスチン誘導合成ペプチド）即ちアストロサイト脱分化剤（アストロサイト脱分化合成ペプチド）を、例えば液剤として、或いは、錠剤等の個体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを患者（即ち生体）に所望量供給することもできる。投与方法としては、例えば静脈内や脳内等への注射あるいは経口投与等が挙げられる。これにより、生体内で、典型的には患部またはその周辺に存在するアストロサイト若しくは患部へ遊走可能なアストロサイトから、ネスチン高発現細胞（即ちネスチン発現神経幹細胞）を産生（生産）することができる。このため、該神経幹細胞を利用することで、種々の神経疾患や外傷により失われた神経機能を効果的に回復させることが可能となる。例えば、パーキンソン病、脳梗塞、アルツハイマー病、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患および外傷を再生医療的アプローチによって治療することが実現できる。或いはまた、前記神経疾患および外傷の再生医療的治療に資する薬剤組成物として使用できる。
或いはまた、ここに開示されるネスチン発現誘導剤（ネスチン誘導合成ペプチド）即ちアストロサイト脱分化剤（アストロサイト脱分化合成ペプチド）を使用することで、アストロサイト培養物からネスチン高発現細胞（ネスチン発現神経幹細胞）を効率よく生産することができる。即ち、ここで開示されるネスチン高発現細胞の生産方法（ネスチン発現神経幹細胞の生産方法）を採用することによって生体外で効率よく生産したネスチン高発現細胞（ネスチン発現神経幹細胞）を患部（即ち患者の生体内）に移入することにより、例えば、パーキンソン病、脳梗塞、アルツハイマー病、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患および外傷を再生医療的アプローチによって治療することが可能となる。また、ここで開示されるネスチン高発現細胞の生産方法即ちネスチン発現神経幹細胞の生産方法の実施によって生体外で生産された神経幹細胞は、再生医療的治療に資する医療用資材として使用できる。
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
＜実施例１：ペプチド合成＞
配列番号７〜９のアミノ酸配列から成る合成ペプチドを後述のペプチド合成機を用いて製造した。なお、以下の説明では、当該合成ペプチドを配列番号に対応してサンプル１〜３と呼称する。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列等の情報を列挙している。
表１に示すように、各サンプルに係るペプチドは、いずれもペプチド鎖のＣ末端側に膜透過性アミノ酸配列であるＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号２）を有している。
サンプル１のペプチド（配列番号７）は、前記Ｃ末端側のアミノ酸配列に隣接してそのＮ末端側にヒト由来のＳＯＣＳ６に含まれるＢＣ−ボックスのＮ末端から１５個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号１）、即ちネスチン誘導性ペプチド配列を有するペプチドである。
サンプル２のペプチド（配列番号８）は、前記Ｃ末端側のアミノ酸配列に隣接してそのＮ末端側にヒト由来のＡＳＢ７に含まれるＢＣ−ボックスのＮ末端から１５個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドである。
サンプル３のペプチド（配列番号９）は、前記Ｃ末端側のアミノ酸配列に隣接してそのＮ末端側にヒト由来のエロンジンＡに含まれるＢＣ−ボックスのＮ末端から１５個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するペプチドである。
なお、いずれのペプチドもＣ末端アミノ酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）はアミド化（−ＣＯＮＨ２）されており、全体が２８のアミノ酸残基からなる直鎖状のペプチドである。いずれのペプチドも、市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
合成した各サンプルは、ＰＢＳ（-）に溶かし、ペプチド濃度が１ｍＭのストック液を調製した。
＜実施例２：海馬由来のアストロサイトにおける合成ペプチドのネスチン発現誘導活性の評価試験−１＞
前記実施例１で得られた合成ペプチドのうち、サンプル１（即ち本発明におけるネスチン誘導合成ペプチド）について、ネスチン発現誘導活性をネスチン遺伝子の発現量を定量することで評価した。供試細胞としてラット脳海馬由来アストロサイトの培養細胞（Ｒ−ＨｉＡｓ−５２１：Lonza社製）を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
前記ラット脳海馬由来アストロサイトを、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度に細胞培養用６穴（ウェル）プレートに播種した。培地はアストロサイト増殖培地（Astrocyte Growth Medium Bulletkit：Lonza社製。以下、ＡＧ培地という。）を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下のＣＯ２インキュベータ内で一晩培養した。
その一晩培養後、培地を５μＭとなる量のサンプル１に係るペプチドを含有するＡＧ培地に交換し、同条件で２日間培養を継続した。また、比較例としてペプチド無添加を設けた。
前記培養終了後、各試験区の培養細胞をＣｏｌｄ ＰＢＳ（−）で洗浄し、市販のＲＮＡ抽出・精製キット（NucleoSpin（商標）RNA/Protein kit：Macherey Nagel社製）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、精製した。操作はすべてＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）非存在下で行い、キットに添付のマニュアルどおりに行った。精製したＲＮＡはAgilent 2100 Bioanalyzer（アジレントテクノロジー社製）を用いて定量した。
精製したＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲに供し、ネスチン遺伝子の発現量を調べた。また、ハウスキーピング遺伝子としてＡｃｔｉｎβを利用した。ＲＴ−ＰＣＲとしてツーステップＲＴ−ＰＣＲ法を採用し、定量ＰＣＲとしてＴａｑＭａｎ（登録商標）法を採用した。
具体的には、各ｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ（complementary DNA、相補的ＤＮＡ）を合成した。ＲＴ−ＰＣＲには、プライマーとしてランダムプライマー（ｄＮ６）およびオリゴ（ｄＴ）２０プライマーを用い、逆転写酵素としてSuper Script（登録商標）III（Life Technologies社製）を用いた。
次に、ＲＴ−ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼとしてFastStart TaqMan（登録商標）Probe Master (ROX)（Roche Applied Science社製）を用い、プローブとしてUniversal ProbeLibrary（Roche Applied Science社製）のProbe #67（ネスチン用プローブ、製品番号4688660）及びProbe #63（Ａｃｔｉｎβ用プローブ、製品番号4688627）の各プローブを終濃度200ｎＭに調整して用いた。サーマルサイクラーはABI PRISM7700（Life Technologies社製）を用いた。定量ＰＣＲ反応は、９５℃で１０秒インキュベーションし、続いて９５℃１５秒、６２℃２０秒、７２℃２０秒のサイクルを４５サイクルする条件で行った。定量ＰＣＲに用いたプライマーの配列は次の通りである。
ネスチン遺伝子
センス：ＧＴＣＣＴＴＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＡ（配列番号１０）
アンチセンス：ＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＧＡＧＡＧＴＴＣ（配列番号１１）
Ａｃｔｉｎβ遺伝子
センス：ＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧ（配列番号１２）
アンチセンス：ＧＡＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＣＡＣＡＧ（配列番号１３）
各試験区におけるネスチン遺伝子の発現量は各試験区におけるＡｃｔｉｎβの発現量で補正した。ネスチン遺伝子の発現量の定量結果を図１に示す。なお、各遺伝子の発現量は、ペプチド無添加区における各遺伝子の発現量を１とした相対値で示している。
図１に示すように、サンプル１を添加した培養区では、ペプチド無添加区と比べて顕著なネスチン遺伝子の発現増加が認められた。このことは、ここに開示されるネスチン誘導合成ペプチド（即ち、該ペプチドを有効成分として含むネスチン発現誘導剤）がアストロサイトにおいてネスチンの発現を誘導し得る或いは発現量を増大し得るペプチド（組成物）であることを示している。さらに、当該ペプチド（組成物）がアストロサイト脱分化活性を有し得ることも示している。
＜実施例３：海馬由来のアストロサイトにおける合成ペプチドのネスチン発現誘導活性の評価試験−２＞
前記実施例１で得られた合成ペプチドのうち、サンプル１（即ち本発明におけるネスチン誘導合成ペプチド）について、ネスチン発現誘導活性を抗ネスチン抗体を用いたウエスタンブロット解析を行うことで評価した。供試細胞としてラット脳海馬由来アストロサイトの培養細胞（Ｒ−ＨｉＡｓ−５２１：Lonza社製）を用いた。また、比較例としてペプチド無添加区を設けた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
実施例２と同様にして、ラット脳海馬由来アストロサイトをペプチド濃度５μＭのペプチド存在下で３日間培養した。培養終了後、各試験区の培養細胞をＣｏｌｄ ＰＢＳ （−）で洗浄し、市販のタンパク質抽出・精製キット（NucleoSpin（商標）RNA/Protein kit：Macherey Nagel社製）を用いてトータルタンパク質を抽出した。操作はすべてタンパク質分解酵素（プロテアーゼ、Protease）非存在下で行い、キットに添付のマニュアルどおりに行った。抽出したタンパク質の濃度は、RC DC Protein assay（BIO RAD社製）を用いて定量した。
以下のＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット解析により、各試験区におけるネスチンおよびＧＦＡＰの発現状態を調べた。また、一連の操作における内部標準としてＧＡＰＤＨタンパク質を採用した。
具体的には、各試験区から得られたタンパク質及び分子量マーカー（MagicMark（商標） XP Western Protein Standard：Life Technologies社製）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（電気泳動用プレキャストゲル：オリエンタルインスツルメンツ社製）の各ウェルに注入し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ネスチンの電気泳動には７．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用い、ＧＦＡＰおよびＧＡＰＤＨタンパク質の電気泳動には５〜２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた。
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離したタンパク質をＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride）膜へ転写（ブロッティング）し、その後、Tween20（商標）を含むＰＢＳ（−）（以下ＰＢＳＴ（−）という）で５％に希釈したPerfect-Block（MoBiTec社製）を用いて該ＰＶＤＦ膜をブロッキング処理した。
ネスチン、ＧＦＡＰおよびＧＡＰＤＨタンパク質の各タンパク質の検出には、一次抗体として、抗ネスチン抗体（マウス由来、Merck Millipore社製）、抗ＧＦＡＰ抗体（マウス由来、Progen Biotechnik社製）および抗ＧＡＰＤＨ抗体（マウス由来、Merck Millipore社製）をＰＢＳＴ（−）にてそれぞれ５００倍希釈、５０００倍希釈、１００００倍希釈して用い、室温で１時間反応させた。そして、二次抗体として、ＨＲＰ（Horseradish Peroxidase）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ由来、Dako Cytomation社製）を、ＰＢＳＴ（−）にて５０００倍希釈〜１００００倍希釈して用い、室温で１時間反応させた。
そして、ECL prime Western blotting detection reagent（GE Healthcare社製）を反応させ、Luminescent image analyzer LAS-3000（富士フィルム社製）を用いて目的のタンパク質を検出した。結果を図２に示す。レーン１がサンプル１添加区並びにレーン２がペプチド無添加区の結果である。いずれの試験区においても、内部標準として採用したＧＡＰＤＨタンパク質の発現は一定であった。
図２に示すように、サンプル１を添加した培養区では、ペプチド無添加区と比べて顕著なネスチンの発現亢進が認められた。サンプル１添加区では、ペプチド無添加区と比べてネスチンを２倍以上発現していることが確認できた。これらは、ここに開示されるネスチン誘導合成ペプチド（即ち、該ペプチドを有効成分として含むネスチン発現誘導剤）がアストロサイト中のネスチン発現を誘導し得る或いはネスチン発現量を増大し得るペプチド（組成物）であることを示している。さらに、当該ペプチド（組成物）がアストロサイト脱分化活性を有し得ることも示している。
一方、ＧＦＡＰの発現は、サンプル１を添加した培養区とペプチド無添加区とを比較しても変化は認められなかった。また、サンプル１添加区では、発現維持されたＧＦＡＰと、サンプル１に係るペプチドにより発現誘導されたネスチンとが共発現することを確認できた。ネスチンとＧＦＡＰの共発現は、非特許文献４で示された神経幹細胞における当該タンパク質の発現パターンに一致する。これらも、ここに開示されるネスチン誘導合成ペプチド（即ち、該ペプチドを有効成分として含むネスチン発現誘導剤）がアストロサイト脱分化活性を有することを示している。
なお、詳細なデータは示していないが、生体から採取したアストロサイトではネスチンの発現は確認されないが、一般的な培養条件下で培養、継代した種々のアストロサイト培養細胞ではネスチンの発現が確認された。このことは、ペプチド無添加区において確認されるネスチンの発現が培養細胞特有のタンパク質発現パターンであることを示している。
＜実施例４：大脳皮質由来のアストロサイトにおける合成ペプチドのネスチン発現誘導活性の評価試験−１＞
前記実施例１で得られた合成ペプチドのうち、サンプル１（即ち本発明におけるネスチン誘導合成ペプチド）について、ネスチン発現誘導活性をネスチン遺伝子の発現量を定量することで評価した。供試細胞としてラット脳大脳皮質由来アストロサイトの培養細胞（Ｒ−ＣｘＡｓ−５２０：Lonza社製）を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
前記ラット大脳皮質由来アストロサイトを、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度に細胞培養用６穴（ウェル）プレートに播種した。ＡＧ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下のＣＯ２インキュベータ内で一晩培養した。
その一晩培養後、培地を１０μＭとなる量のサンプル１に係るペプチドを含有するＡＧ培地に交換し、同条件で２日間培養を継続した。また、比較例としてペプチド無添加を設けた。
前記培養終了後、実施例２と同様にして各試験区の培養細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、精製した。
精製したＲＮＡを、実施例２と同様にして、ｑＲＴ−ＰＣＲに供し、ネスチン遺伝子の発現量を調べた。また、ハウスキーピング遺伝子としてＡｃｔｉｎβを利用した。
各試験区におけるネスチン遺伝子の発現量は各試験区におけるＡｃｔｉｎβの発現量で補正した。ネスチン遺伝子の発現量の定量結果を図３に示す。なお、各遺伝子の発現量は、ペプチド無添加区における各遺伝子の発現量を１とした相対値で示している。
図３に示すように、サンプル１を添加した培養区では、実施例２と同様にペプチド無添加区と比べて顕著なネスチン遺伝子の発現増加が認められた。このことは、ここに開示されるネスチン誘導合成ペプチド（即ち、該ペプチドを有効成分として含むネスチン発現誘導剤）が種々のアストロサイトにおいてネスチンの発現を誘導し得るペプチド（組成物）であることを示している。さらに、当該ペプチド（組成物）が種々のアストロサイトに対するアストロサイト脱分化活性を有し得ることを示している。
＜実施例５：大脳皮質由来のアストロサイトにおける合成ペプチドのネスチン発現誘導活性の評価試験−２＞
前記実施例１で得られた合成ペプチドのうち、サンプル１〜３について、ネスチン発現誘導活性を抗ネスチン抗体を用いたウエスタンブロット解析することで評価した。供試細胞としてラット大脳皮質由来アストロサイトの培養細胞（Ｒ−ＣｘＡｓ−５２０：Lonza社製）を用いた。また、比較例としてペプチド無添加区を設けた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
実施例４と同様にして、ラット大脳皮質由来アストロサイトをペプチド濃度５μＭのペプチド存在下で２日間培養した。前記培養終了後、実施例３と同様にして各試験区の培養細胞からトータルタンパク質を抽出した。
次に、実施例３と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析を行い、各試験区におけるネスチンおよびＧＦＡＰの発現状態を調べた。また、一連の操作における内部標準としてＧＡＰＤＨタンパク質を採用した。結果を図４に示す。
レーン１はペプチド無添加区、レーン２はサンプル２添加区、レーン３はサンプル３添加区、レーン４はサンプル１添加区の結果である。
図４に示すように、サンプル１を添加した培養区（即ちレーン４）では、ペプチド無添加区と比べて顕著なネスチンの発現増加が認められた。サンプル１添加区では、ペプチド無添加区と比べてネスチンを２倍以上発現していることが確認できた。また、サンプル１添加区のＧＦＡＰの発現量は、ペプチド無添加区と比べて変化を認めなかった。さらに、サンプル１添加区では、サンプル１に係るペプチドにより発現誘導されたネスチンと発現維持されたＧＦＡＰとの共発現も確認できた。これらのことは、ここに開示されるネスチン誘導合成ペプチド（即ち、該ペプチドを有効成分として含むネスチン発現誘導剤）が種々のアストロサイトにおいてネスチンの発現を誘導し得るペプチド（組成物）であることを示している。さらに、当該ペプチド（組成物）が種々のアストロサイトに対するアストロサイト脱分化活性を有し得ることを示している。
一方、サンプル２または３を添加した培養区では、ペプチド無添加区と比べてネスチンおよびＧＦＡＰの発現に変化は認められなかった。このことは、ネスチン発現誘導能はＳＯＣＳ系タンパク質のＢＣ−ボックス関連ペプチド（ＢＣ−ボックス由来のアミノ酸配列又はその改変配列からなるペプチド）が一般的に有する機能ではなく、本発明が開示するネスチン誘導合成ペプチド（即ち、当該ペプチドを有効成分として含むネスチン発現誘導剤）に特異的な機能であることを示している。
なお、ペプチド無添加区およびサンプル２、３添加区において確認されるネスチンの発現は、実施例３と同様に培養細胞特有のタンパク質の発現である。
実施例２、３において海馬由来のアストロサイトを供試細胞としたサンプル１に係るペプチドのネスチン発現誘導活性が示され、さらに、実施例４、５において大脳皮質由来のアストロサイトを供試細胞としたサンプル１に係るペプチドのネスチン発現誘導活性が示された。このことは、ネスチン誘導合成ペプチド（即ち当該ペプチドを含むネスチン発現誘導剤）が種々のアストロサイトにおけるネスチン発現誘導能を有しており、さらに種々のアストロサイトに対するアストロサイト脱分化能を有し得ることを示している。従来、神経幹細胞はＳＶＺやＳＧＺといった限られた領域でしか確認されていない（非特許文献１〜６）。神経幹細胞の産生において、ＳＶＺやＳＧＺ以外の領域由来のアストロサイトが利用可能であることは、医療産業上の価値が極めて高い。
＜実施例６：顆粒剤の調製＞
前記サンプル１に係る合成ペプチド（ネスチン誘導合成ペプチド）５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドを主成分とする顆粒剤（顆粒状組成物）を得た。
上述のように、ここで開示されるネスチン誘導合成ペプチドは、アストロサイト中のネスチン発現を誘導する（あるいは発現量を増大させる）ネスチン発現誘導能を有しているため、アストロサイト由来のネスチン高発現細胞を生産する目的並びに対象とするアストロサイト中のネスチン発現量を増大させる目的に好適に使用し得る。アストロサイト由来のネスチン高発現細胞は、神経幹細胞として機能し得る。したがって、ここで開示されるネスチン高発現細胞の生産方法は、例えば再生医療用途の医療用資材の生産方法として利用することが可能であり、また、ネスチン誘導合成ペプチドを有効成分として含むネスチン発現誘導剤は、例えば再生医療用途の組成物として好適に利用することができる。
配列番号１〜９ 合成ペプチド
配列番号１０〜１３ プライマー

Claims (8)

  1. アストロサイト中のネスチン発現量を増大させるために用いられるネスチン発現誘導剤であって、以下のアミノ酸配列：
    ＳＬＱＹＬＣＲＦＶＩＲＱＹＴＲ（配列番号１）；
    からなるネスチン誘導性ペプチド配列を含む合成ペプチドを有効成分とする、ネスチン発現誘導剤。
  2. 前記合成ペプチドは、前記ネスチン誘導性ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項１に記載のネスチン発現誘導剤。
  3. 前記合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
    ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号２）；
    を有する、請求項２に記載のネスチン発現誘導剤。
  4. 前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が２８以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のネスチン発現誘導剤。
  5. 前記合成ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
    ＳＬＱＹＬＣＲＦＶＩＲＱＹＴＲＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号７）；
    を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のネスチン発現誘導剤。
  6. アストロサイト由来のネスチン高発現細胞を生産する方法であって、
    アストロサイトの培養物を準備すること、および
    前記アストロサイト培養物中に請求項１〜５のいずれか一項に記載のネスチン発現誘導剤を少なくとも１回供給すること、
    を包含する、生産方法。
  7. 前記ネスチン発現誘導剤を少なくとも１回供給された後のアストロサイト培養物中からネスチン高発現細胞を選別すること、
    をさらに包含する、請求項６に記載の生産方法。
  8. 細胞選別機（セルソータ）を使用して前記ネスチン高発現細胞の選別を行う、請求項７に記載の生産方法。
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