ES2354280T3 - Variantes de ribonucleasa citotóxica. - Google Patents

Abstract

Una ribonucleasa diseñada por ingeniería de la superfamilia RNasa A que tiene al menos dos cambios de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa de la ribonucleasa, siendo el primer cambio una sustitución de aminoácido en la región correspondiente a los restos de aminoácidos 85 a 94 de RNasa A pancreática bovina, y siendo el segundo cambio una alteración, sustitución o intercambio de aminoácido en un lugar seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos que corresponden a los restos 38, 39 y 67 de RNasa A pancreática bovina, teniendo la ribonucleasa diseñada por ingeniería una actividad citotóxica intensificada en comparación con una correspondiente ribonucleasa diseñada por ingeniería que tiene una modificación sólo en la región que corresponde a restos de los aminoácidos 85 a 94.

Description

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional nº. de serie 60/690.970 presentada el 16 de junio de 2005. 5

DECLARACIÓN EN CUANTO A INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADO FEDERALMENTE

Esta invención se hizo con apoyo económico del gobierno de los Estados Unidos concedida por la siguiente agencia: NIH CA073808. Estados Unidos tiene ciertos 10 derechos en esta invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las ribonucleasas son enzimas que catalizan la degradación de ARN. Una ribonucleasa bien estudiada es la ribonucleasa A bovina (RNasa A), cuya función biológica 15 putativa es descomponer la gran cantidad de ARN que se acumula en el intestino del rumiante. La superfamilia de RNasa A es un grupo de enzimas ribonucleasa clasificadas como homólogos a RNasa A. Algunos miembros de la superfamilia poseen varias propiedades biológicas de 20 interés que incluyen actividades antiproliferativas, citotóxicas, embriotóxicas, espermatogénicas y anti-tumorales. Un miembro de esta familia es un homólogo de RNasa A aislada originalmente de oocitos y embriones precoces de la rana leopardo Rana pipiens, que ahora se 25 conoce como Onconase (ONC), un nombre usado para la molécula que exhibe propiedades antitumorales in vitro e in vivo. Actualmente, la ONC se está evaluando como un agente terapéutico del cáncer en ensayos clínicos.

Una limitación significativa sobre la aptitud de la 30 ONC como agente quimioterapéutico es la toxicidad renal limitativa de la dosis. La ONC es retenida en el riñón a una concentración mucho mayor que la de los miembros

mamíferos de la superfamilia RNasa. Puede haber también manifestaciones alergénicas con la ONC, puesto que los ratones producen anticuerpos contra ONC pero no contra RNasa A, con la que ONC comparte aproximadamente 30% de sus aminoácidos. Esto sugiere que otros miembros de la familia 5 de RNasa pueden ser también candidatos para evaluación como agentes terapéuticos clínicos si se les pueden impartir las propiedades citotóxicas similares a las de ONC.

En el cuerpo, los niveles de actividad de RNasa son controlados por un inhibidor de la ribonucleasa (RI), que 10 es una proteína de 50-kDA encontrada en el citosol de todas las células mamíferas. RI es un miembro de una familia de proteínas rica en leucina y está compuesto por 15 repeticiones alternantes dispuestas simétricamente en una molécula con forma de herradura de caballo. RI tiene un 15 gran número de restos de cisteína (32 en IR humano), lo que significa que puede mantener su forma y función sólo en un medio reductor como el citosol. El IR actúa uniéndose a la superfamilia de RNasa, un IR a una molécula de RNasa, y, cuando está así unido, el IR inhibe completamente la 20 actividad catalítica de la ribonucleasa por bloqueo estérico del sitio activo de la enzima. La unión de IR a la RNasa es muy íntima, teniendo una afinidad de unión muy alta.

Algunos miembros de la familia RNasa, notoriamente 25 ONC y la ribonucleasa seminal bovina, poseen la capacidad nativa de evadir IR. El hecho de la evasión de IR es principalmente responsable de la citotoxicidad de ONC y la ribonucleasa seminal bovina. También se ha encontrado que miembros de la superfamilia de RNasa que no son nativamente 30 citotóxicos pueden hacerse citotóxicos por modificación de sus constituyentes aminoácidos de manera que inhiban la unión a IR y, en particular, haciendo sustituciones de

aminoácidos pequeños por grandes en uno de los puntos de más estrecha interacción entre IR y RNasa. Este procedimiento se describe en la patente U.S. nº. 5.840.296, que describe una variante citotóxica, G88R RNasa A, que tiene una afinidad aminorada para IR en comparación con la 5 RNasa A, pero que todavía, es 10 veces menos citotóxica que la ONC. La nomenclatura G88R significa que la molécula de RNasa A se alteró sustituyendo el resto de glicina (G) en la posición del aminoácido 88 por un resto de arginina (R).

Los procedimientos y las herramientas para modelar la 10 estructura tridimensional de las proteínas continúan evolucionando. Al analizar la interacción entre dos moléculas, por ejemplo entre RNasa A e IR, sólo está siendo ahora susceptible de solución el problema de definir los sitios de interacción entre las dos moléculas. A medida que 15 se están desarrollando las herramientas de modelación, puede aumentar la sofisticación del análisis de esa interacción.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una ribonucleasa 20 diseñada por ingeniería de la familia de la RNasa A que tiene al menos dos cambios de aminoácidos de la secuencia nativa de aminoácidos de la ribonucleasa, siendo el primer cambio una sustitución de aminoácido en la región correspondiente a los restos 85 a 94 de la RNasa A 25 pancreática bovina y siendo el segundo cambio una alteración, sustitución o un cambio de aminoácidos en un sitio seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos que corresponden a los restos 38, 39 y 67 de la RNasa AS pancreárica bovina, una ribonucleasa diseñada por 30 ingeniería que tiene una actividad citotóxica intensificada en comparación con una ribonucleasa correspondiente diseñada por ingeniería que tiene una modificación sólo en

la región correspondiente a los restos de aminoácido 85 a 94.

En particular, la invención proporciona las ribonucleasas bovinas diseñadas por ingeniería ribonucleasa A D38R/R39D/G88R y ribonucleasa A D38R/R39D/N67R/G88R. 5

La invención proporciona también una construcción de ADN que codifica la ribonucleasa diseñada por ingeniería de la invención y un alojante de células tal como un ADN.

La invención proporciona además:

un método in vitro para impartir actividad citotóxica 10 a células, que comprende la etapa de suministrar a las células in vitro una ribonucleasa diseñada por ingeniería de la invención;

una ribonucleasa de la invención diseñada por ingeniería para uso en un método de terapia en un cuerpo 15 humano o animal, en particular para uso en la impartición de actividad citotóxica a células.

Es un objetivo de la presente invención definir una ribonucleasa A diseñada por ingeniería que tenga propiedades citotóxicas mejoradas en comparación con 20 anteriores ribonucleasas diseñadas por ingeniería.

Otros objetivos, ventajas y características de la presente invención serán evidentes considerando la memoria siguiente junto con los dibujos que se acompañan.

25

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIFERENTES VISTAS DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 es una representación de la estructura tridimensional de la ribonucleasa A y del inhibidor de ribonucleasa.

La Fig. 2 es una representación de la interacción 30 entre la estructura tridimensional de la ribonucleasa A y el inhibidor de ribonucleasa, que muestra los sitios

seleccionados como diana para modificaciones de la ribonucleasa A.

La Fig. 3 representa datos gráficos de los ejemplos siguientes que muestran el efecto de las ribonucleasas sobre la proliferación de células K-532. Los puntos de los 5 datos son la media de al menos tres experimentos, realizado cada uno por triplicado. Cada una de las curvas está marcada con la correspondiente variante de RNasa A.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 10

La presente invención está dirigida a ribonucleasas alteradas de la superfamilia de RNasa A que han sido diseñadas por ingeniería para tener un nuevo nivel de citotoxicidad. Esto se consiguió usando una nueva herramienta de modelado de interacción molecular, el 15 algoritmo de Evaluación Rápida de la Densidad Atómica (FADE). Este algoritmo se usó para modelar las posiciones de contacto molecular entre la RNasa A y el inhibidor de ribonucleasa. Sobre la base de este modelo se diseñaron variantes de la secuencia de aminoácidos de RNasa A con el 20 fin de crear nuevas variantes de RNasa A que, mediante impedimento estérico, son capaces de evadir el IR. Se identifican aquí variantes que son más citotóxicas que las variantes de RNasa A antes conocidas.

El análisis empezó con un estudio de la interacción 25 entre la RNasa A y la moléculas de IR. Hay muchas propiedades de una interfaz de proteína-proteína que pueden dotar al complejo de estabilidad, incluidas superficie total, superficie no polar, densidad de empaquetamiento e interacciones polares. La superficie de 2.550 Å2 accesible 30 para el disolvente sepultada después de la formación del complejo IRp-RNasa es relativamente grande para un complejo de enzima-inhibidor, y es considerablemente mayor que 1600

Å2, que es típica para complejos de proteasa-inhibidor. En general, las interfaces de proteínas se asemejan al carácter químico de superficies de proteínas expuestas a disolventes, que comprenden aproximadamente 57% de restos no polares, 24% de polares neutros y 19% de restos de 5 aminoácido cargados. Sin embargo, las interfaces de proteína-proteína contienen menos restos cargados y más restos polares neutros que los de superficies de proteínas expuestas a disolvente. Desviándose de esta tendencia, la interfaz de IRp-RNasa A está significativamente más 10 cargada, con 49% de restos no polares, 27% de polares neutros y 24% de restos cargados. Ciertamente, parece que los factores electroestáticos desempeñan un papel importante en el complejo formado entre la RNasa A (pI9,3) y la proteína de IR ácida (pI4,7) a pH citosólico. 15

A diferencia con las interacciones de carga-carga de mayor papel dentro de complejo de IRp-Nasa A, el grado de complementariedad de forma entre las dos superficies es inferior al medio. La estadística de correlación de forma, Sc, describe el grado en que se ajustan las dos 20 superficies, describiendo un valor de 1,0 un casamiento perfecto y un valor de 0,0 dos superficies no afines. La interfaz IRp-RNasa A tiene un valor de Sc relativamente bajo, 0,58, en comparación con valores de 0,70-0,76 para complejos típicos de proteasa-inhibidor y de 0,64-0,68 para 25 complejos típicos de anticuerpo-antígeno. El empaquetamiento de átomos en la interfaz IRp-RNasa A es también menos denso que en una típica proteína interior o una interfaz proteína-proteína. La gran cantidad de superficie sepultada podría compensar el relativamente bajo 30 grado de complementariedad de forma para que resultara una interacción muy estable entre IR y RNasa A.

Antes del trabajo que se describe aquí, K7A/K41R/G88R RNasa A era la más evasiva de las variantes previamente producidas. De nuevo, con la nomenclatura usada en este documento, G88R significa que la molécula de RNasa A se alteró sustituyendo el resto de glicina (G) en la posición 5 del aminoácido 88 por un resto de arginina (R), y la acumulación de K47A/K41R/G88R significa que se hicieron las tres sustituciones a la misma variante RNasa A. Esta variante formó un complejo con IRp que tenía un valor Kd de 47 nM, casi 102 veces mayor que el de G88R RNasa A. Aún 10 así, K7A/K41R/G88R RNasa A no es una citotoxina potente debido en gran parte a la disminución en 102 veces de la actividad ribonucleolítica causada por el reemplazo de su resto de lisina en el sitio activo con arginina. Así, para ser eficaz como agente citotóxico, la variante debe 15 combinar una afinidad reducida a IR con el mantenimiento de una actividad catalítica eficaz como una RNasa.

El algoritmo FADE reveló nuevos “bultos” y “agujeros” en el complejo de IRp-RNasa A para desbaratamiento por mutagénesis dirigida al sitio como se ilustra en las 20 Figuras 1 y 2 y se muestra en la Tabla 1. En las variantes de RNasa A creadas en este trabajo, el cambio de D38R/R39D y la sustitución de N67R produjeron la mayor disminución de la afinidad a IR. Sola, cada una de estas sustituciones efectuó una desestabilización del complejo IRp-RNasa A casi 25 igual a la de la sustitución de G88R. La combinación de las sustituciones más desbaratadoras inspiradas por FADE dio por resultado ribonucleasas que no sólo eran 30 veces más evasivas que la K7A/K41R/G88R RNasa A, sino que también retenían casi la actividad catalítica del tipo silvestre 30 (véase más adelante en la Tabla 2). Además, las variantes D38R/R39D/G88R, D38R/R39D/N67R/G88R y K31A/D38R/R39D/N67R/

G88R eran más citotóxicas para las células K-562 que la ONC (véase Fig. 3).

La aplicación del algoritmo FADE a la interacción de RNasa A e IR condujo así a modelos de la interacción entre estructuras de las dos moléculas, como se muestra en las 5 Figuras 1 y 2. Este análisis se realizó con RNasa A bovina e inhibidor de ribonucleasa porcina (IRp). En estas figuras se presentan los marcadores de complementariedad geométrica de FADE como esferas llenas. Estas esferas no representan átomos. En realidad, las esferas representan puntos de la 10 interfaz molecular cerca de los cuales la complementariedad local es muy significativa… Se sumaron los marcadores de complementariedad a 2 Å o menos de cualquier átomo dentro de un resto particular para determinar los tamaños de cúmulos mostrados en la Tabla 1. Los restos de RNasa A que 15 eran proximales al número mayor de marcadores de complementariedad y distales del sitio activo enzimático de RNasa A se seleccionaron como dianas para desbaratamiento.

Un hallazgo interesante es la diferencia de afinidad de los homólogos porcino y humano de IR observada para 20 algunas variantes de RNasa A. En general, las variantes de RNasa A se unieron más estrechamente por IRp que por IRh (datos presentados en la Tabla 2 más adelante). Esta mayor afinidad de IRp a favor de RNasa A no se observó cuando se midieron originalmente las constantes de equilibrio de 25 disociación para complejos de RNasa A de tipo silvestre con IRp (Kd = 6,7 x 10-14M) e IRh (Kd = 4,4 x 1014M). De los 28 restos en IRp que tienen contacto con RNasa A, 25 son idénticos en IRh. Las tres diferencias entre los restos de unión de RNasa A son los reemplazos de His6 en IRp con un 30 resto de glutamina en IRp, Asp228 con alanina y Val405 con leucina. Estos tres restos de IRp tienen contacto átomo-átomo exclusivamente con restos de RNasa A identificados

por FADE. His6 tiene tres contactos con Lys31 de RNasa A, Asp228 tiene dos contactos con Ser89 y Val405 tiene tres contactos con Asn67. Probablemente, estos tres cambios contribuyen a la diferente afinidad de IRp e IRh para las variantes de RNasa. 5

Tabla 1. Restos de complementariedad de forma más alta en el complejo de IRp-RNasa según identificación por el algoritmo FADE.

10

Cadena

Resto Tamaño del cúmulo*

RNasa A

Lys7 Asn24 Glu28 Lys31 Arg39 Asn67 Gly88 Ser89 Lys91 Tyr430 Asp431 Tyr433 2 5 3 2 31 6 5 14 9 22 10 38

* Número de marcadores de complementariedad de FADE a 2 Å o menos de un átomo del resto indicado.

Así, estos tres restos fueron las dianas para una 15 potencial modificación. Nótese que las variantes en la posición Gly88 habían sido exploradas previamente, como se describe en la patente U.S. nº. 5.840.296, por lo se consideraron otras alteraciones, solas o en combinación con G88R. Se pensó que el desbaratamiento del complejo IR-Enasa 20

A podría lograrse de la mejor forma, en general, reemplazando con arginina restos pequeños neutros o aniónicos de RNasa A. Se sospechó que la arginina, como el aminoácido más polar y el segundo en tamaño, podría generar repulsión electrostática y fuerza estérica mientras que 5 aumentaría la carga neta positiva, lo que se sabe que intensifica la internalización celular. Además, los autores de la invención reemplazaron restos de lisina en la RNasa A con alanina para crear cadenas laterales neutras truncadas, eliminando así interacciones favorables dentro del 10 complejo.

De esta manera se identificaron las sustituciones siguientes como prometedoras para estudio:

Cambio D38R/R39D (Figura 2C). Se identificó por el algoritmo FADE Arg 39 como proximal al número mayor de 15 marcadores de complementariedad de cualquier resto en la RNasa (Tabla 1). Con 14 contactos átomo-átomo con IRp, Arg39 tiene también más contactos con IR que cualquier resto de RNasa A con excepción de Glu111, que también tiene 14 contactos. Juntos, Asp38 y Arg39 de RNasa A forman tres 20 uniones de hidrógeno con Arg453 y Glu397 de IRp, respectivamente, interaccionando Arg39 con Glu397 de manera bidentada. Además, estos dos restos de RNasa A tienen contactos de van der Waals con Gln426, Val428, Tyr430 e Ile455 de IR. Aunque no se identificó Asp38 explícitamente 25 por el análisis de FADE, se pensó que intercambiando este residuo con Arg39 se podrían desbaratar simultáneamente tres interacciones favorables en la interfaz IRp-RNasa A. Además, el cambio D38R/R39D era conservador en cuanto a que conservaba el contenido local de aminoácido. 30

Lazo B4-5 (Figura 2D). Cuatro lazos superficiales aportan 16 de los 24 restos que tienen contacto con IR. El lazo 4-5 de RNasa A, que contiene los restos 87-96, se

empaqueta frente a una región especialmente hidrófoba de IRp definida por tres restos de triptófano: Trp257, Trp259 y Trp314. Tres restos de RNasa A dentro de este lazo, Gly88, Ser 89 y Lys91, se identificaron por FADE como importantes para mediar la complementariedad de forma con 5 IR. Intentos anteriores para crear un IR de RNasa A evasiva demostraron que el reemplazo de Gly88 (tamaño de cúmulo FADE 5) con un resto de arginina es extremadamente eficaz al introducir fuerza estérica y electrostática, aumentando el valor de Kd del complejo IRp-RNasa A en casi 4 órdenes 10 de magnitud. Por tanto, aunque los restos Ser89 y Lys91 se identificaron por el algoritmo FADE como cúmulos de complementariedad casi grandes, se supuso que esta región del complejo se desbarataría al máximo con la sustitución de G88R y por tanto no se alteró más este lazo. 15

Sustitución de N67R (Figura 2A). Asn67 era proxinal al tercer mayor cúmulo de marcadores de complementariedad siguiendo Arg39 y restos del lazo 4-5 de RNasa A. Asn67 tiene seis contactos con los restos de IRp Cys404, Val405, Gly406 y Tyr433, incluido una unión de hidrógeno con el 20 oxígeno de la cadena principal de Val405. Es digno de mención que Tyr 433 de IRp, que tiene contactos con Asn67 de RNasa A, se identificó que era proximal al número mayor de marcadores de complementariedad de cualquier resto en cualquier proteína. De conformidad con ello, otros han 25 identificado que Tyr433 de IR y Asn67 de RNasa A como “restos de anclaje” del complejo IRp-RNasa A.

Otros restos identificados por FADE. Lys7 (Fig. 2B) tuvo la puntuación más baja de los restos de RNasa A con un tamaño del cúmulo de complementariedad de 2. No obstante, Lys7 tiene 7 30 contactos átomo-átomo con Ser456 de IRp, incluidas varias uniones de hidrógeno. Estudios previos habían revelado que este resto contribuye significativamente a la estabilidad del

complejo. Los presentes inventores examinaron también Asn24 y Lys31, respectivamente. Asn24 tiene 7 contactos de van der Waals y dos uniones de hidrógeno con Asp89 y Asp117 de IR; Lys 31 tiene tres contactos átomo-átomo con His6 de IRp y un contacto con Asp31. 5

Si bien estas localizaciones particulares de aminoácidos se identifican por referencia a la secuencia específica de ribonucleasa A pancreática bovina, ha de tenerse en cuenta que hay muchos miembros de la superfamilia de RNasa A de enzimas a los que se puede aplicar esta información. Los expertos en la 10 técnica saben cómo realizar el alineamiento de secuencias y determinar los miembros de esta superfamilia para identificar la localización de los correspondientes aminoácidos en otros miembros de esta familia íntimamente conectada.

Para tener éxito a los fines previstos, los presentes 15 inventores previeron que las variantes de RNasa A tenían que tener una afinidad reducida para IR y retener sin embargo una actividad catalítica significativa. Era de esperar que la combinación de una afinidad reducida para IR y una actividad catalítica haría citotóxicas las variantes 20 y acaso más citotóxicas que las anteriores variantes de G88R RNasa A. Por ello se ensayaron modificaciones de la enzima en cada una de las localizaciones identificadas antes y los resultados se presentan en los Ejemplos siguientes. Este trabajo estableció que varias de estas 25 variantes presentaban una citotoxicidad acrecentada. En particular, las variantes D38R/R39D/G88R y D38R/R39D/N67R/ G88R presentaron una afinidad reducida para IR y un alto nivel de actividad catalítica y se encontró que ambas tenían una citotoxicidad acrecentada, como lo ejemplifican 30 los datos presentados en las siguientes Tablas 2 y 3.

Se usó el algoritmo FADE para identificar rápida y objetivamente los restos de RNasa A en el complejo de IRp_RNasa A que presentan un grado alto de

complementariedad de forma. Previamente varios de los restos identificados por el algoritmo FADE habían revelado experimentalmente que aportan una cantidad significativa de energía de unión al complejo IRp-RNasa A o que son dianas excelentes para desbaratamiento por mutagénesis. El éxito 5 del algoritmo FADE para predecir la importancia de estas regiones dio crédito a su utilidad y justificó el posterior análisis de restos adicionales de RNasa identificados por FADE. Aunque hubiera podido identificarse una lista similar de restos por examen cuidadoso de la estructura 10 tridimensional, la ventaja evidente de FADE es la extremada velocidad a la que identifican regiones de alta complementariedad. Además, el algoritmo computacional es objetivo, eliminándose así posibles errores o sesgos humanos. 15

Una característica importante de cualquier fármaco es su índice terapéutico, que es la relación de su dosis tóxica a su dosis eficaz. En los seres humanos, la ONC exhibe un índice terapéutico muy favorable como agente quimioterapéutico del cáncer, lo que permite su progresión 20 a ensayos clínicos de Fase III. Las ribonucleasas mamíferas podrían exhibir un índice terapéutico incluso mayor que ONC. Por ejemplo, la línea de células Hep-3B de carcinoma de hígado es la más vulnerable a todas las ribonucleasas ensayadas en esta trabajo. (Tabla 3). ONC tiene un índice 25 terapéutico (IT), definido aquí como CI50NmuMG/CI50Hep-3B, de 31. A diferencia, las variantes D38R/R39D/N67R/G88R, D38R/R39D/G88R y G88R de RNasa A tienen valores de IT de >323, >500 y >118, respectivamente. Una explicación bioquímica del índice terapéutico de las ribonucleasas 30 (anfibias o mamíferas) requiere más experimentación.

EJEMPLOS Protocolo y resultados experimentales

Para explorar cuáles de las potenciales variantes de RNasa A tendrían éxito, los autores de la invención hicieron vectores de expresión y produjeron cada una de las 5 variantes de RNasa A para cada una de las alteraciones propuestas sugeridas antes. Luego se ensayaron esas variantes en cuanto a sus propiedades catalíticas, su afinidad para IR, su estabilidad y su citotoxicidad.

Actividad catalítica. 10

Para ser citotóxica, una ribonucleasa debe retener su actividad catalítica. Consecuentemente, se ensayó la actividad catalítica de cada ribonucleasa para determinar cuál de las sustituciones de aminoácidos, si es que hubiera alguna, comprometía la citotoxicidad por reducir la 15 capacidad de la enzima para degradar ARN. Los valores de kcat/KM para RNasa de tipo silvestre, sus variantes y ONC eran 5,2 x 107, 7,4 x 107, 5,3 x 106 y 2,2 x 105 M-1s-1, respectivamente, que estaban de acuerdo con valores dados a conocer antes. Los restos de intercambio 38 y 39 de RNasa A 20 tenían un efecto menor sobre la catálisis por la enzima. El valor de kcat/KM para D38R/R39D RNasa A era 1,8 x 107, que representa una pérdida de sólo 3 veces de la actividad ribonucleolítica. Se vio un efecto menor similar en la variante D38R/R39D/G88R; su valor kcat/KM de 3,1 x 107 M-1s-1 25 era 2,5 veces inferior que el de G88R RNasa A. Es interesante que, cuando la sustitución individual de R39D se hizo en el contexto de la sustitución de G88R, el efecto sobre la actividad ribonucleolítica fue más pronunciado, reduciendo el valor de kcat/KM de G88R RNasa en 17 veces a 30 4,3 x 106 M-1s-1. Esta disminución podría resultar de la carga negativa intensificada en esta región, reduciendo

posiblemente el número de colisiones productivas entre la enzima y su sustrato aniónico.

El sitio de unión del sustrato P2 de la RNasa A, que contiene Lys7, juega un papel importante en la catálisis por RNasa A. Consistentemente con resultados anteriores, 5 K7A/G88R/RNasa A presentó una disminución de casi 10 veces en la actividad nucleolítica, teniendo un valor de kcat/KM de 5,3 x 10-6 M-1s-1. Esta contribución perjudicial a la catálisis fue aditiva cuando se combinó con otras sustituciones que disminuían la actividad; el intercambio 10 D38R/R39D (disminución de 3 veces de kcat/KM), cuando se combinó con la sustitución de K7A (disminución de 10 veces en kcat/KM) dio por resultado una variante K7A/D38R/R39D con una actividad de 1,6 x 106 M-1s-1, que es 30 veces menor que la de la RNasa A de tipo silvestre. Adicionalmente, la 15 sustitución de K7A fue responsable de una reducción de 15 veces en la actividad de D38R/R39D/G88R RNasa A, reduciendo la actividad de la cuádruple variante K7A/D38R/R39D/G88R RNasa A a 1,6 x 106 M-1s-1.

La mayoría de las sustituciones inspiradas por FADE no 20 tuvieron efecto significativo sobre la actividad ribonucleolítica. Las sustituciones de N67R, K31A y N24R, cuando se combinaron individualmente con la sustitución de G88R, produjeron enzimas con una actividad catalítica aproximadamente comparable con la de la propia G88R RNasa 25 A. Los valores de kcat/KM para estas tres variantes eran 9,2 x 107, 5,2 x 107 y 7,8 x 107 M-1s-1 respectivamente. Por tanto, las variantes de RNasa A que combinan muchas de estas sustituciones (tales como K31A/D38R/R39D/N67R/G88R RNasa A y D38R/R39D/N67R/G88R RNasa A) tenían casi el valor 30 de kcat/KM de la enzima de tipo silvestre (4,8 x 107 y 3,8 x 107 M-s-1 respectivamente). En síntesis, la actividad

enzimática no parecía que fuera el parámetro limitante para estas variantes.

Tabla 2. Parámetros bioquímicos y actividades citotóxicas de RNasa A, sus variantes y ONC

5

ND, no determinado

a Los valores de Tm (+ 2ºC) para RNasa A y sus variantes se determinaron en PBS por espectroscopía de UV. 10

b Los valores de Kcat/KM (+DE)para RNasa A y sus variantes son para la catálisis de la escisión de 6-FAM-dArU(dA)2-6 TAMRA a (23+2)ºC en tampón MES-NaOH 0,10 M (exento de OVS) a pH 6,0, que contiene NaCl (0,10 M). El valor de kcat/KM (+ DE) para ONC es para la catálisis de la escisión de 6-FAM-dArUdGdA-6-TAMRA a (23 + 2)ºC en tampón MES-NaOH 15 0,020 M (exento de OVS) a pH 6,0, que contiene NaCl (0,010 M).

c Los valores de Kd (+ DE) son para el complejo con IRp a (23 + 2)ºC. El valor de Kd para ONC se estima de WU y otros, (1993) J. Biol. Chem. 268, 10686-10693.

d Los valores de G se calcularon con la ecuación: 20

G=-RTln(Kdtipo silvestre/Kdvariante).

e Los valores de Kd(+DE) son para el complejo con IRp a (23+2)ºC.

f Los valores de (kcat/KM)cito se calcularon con 1 eq y los valores de Kd para el complejo con IRh.

g Los valores de CI50 (+DE) son para incorporación de [metil-3H]timidina 25 en el ADN de células K-562 expuestas a una ribonucleasa y se calcularon con 3 eq.

h De Vicentini y otros, (1990) Biochemistry 29, 8827-8834.

i De Leland y otros, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10407-10412.

j De Abel y otros, (2002) Anal. Biochem. 306, 100-107. 30

k Para G88R RNasa A marcada con fluoresceína.

l De Haigis y otros, (2002) J. Biol. Chem. 277, 11576-11581.

m De Leland y otros, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10407-10412 y determinada por espectroscopía de dicroísmo circular.

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Afinidad para inhibidor de ribonucleasa

Las secuencias de aminoácidos de IRp e IRh son bastante similares (identidad de 77%). Además, de los 28 restos en IRp que tienen contacto con RNasa A, sólo dos están reemplazados por restos no similares en IRh. A pesar del supuesto de que dos proteínas de inhibidor tendrían 5 afinidades similares para las variantes de RNasa A, se determinaron los valores de Kd de complejos con IRp e IRh. Estos valores de Kd figuran en la anterior Tabla 2.

Como ensayo riguroso de la utilidad del algoritmo FADE para identificar restos importantes para interacciones de 10 proteína-proteína, se identificaron los valores de Kd para variantes inspiradas por FADE en complejos con IRp. Los valores de Kd de 0,57 y 17 nM obtenidos para G88R RNasa A y K7A/G88R RNasa A en complejos con IRp estaban en buen acuerdo con los determinados previamente. La sustitución de 15 N24R fue el único cambio que no disminuyó la afinidad de IRp para RNasa A. En efecto, con un valor de Kd de 0,27, pareció realmente que N24R/G88R RNasa A forma un complejo ligeramente más fuerte con IRp que la G88R/RNasa A. Se observaron los aumentos más significativos de los valores 20 de Kd para el intercambio D38R/R39D y la sustitución de N67R, cuyos complejos presentaban valores de Kd de 0,30 y 0,36 nM, respectivamente. Estos cambios de aminoácidos eran responsables de los aumentos de 4.500 y 5.400 veces del valor de Kd, respectivamente. Las variantes K7A/D38R/R39D, 25 N67R/G88R y D38R/T39D/G88R formaron complejos con IRp que tienen valores de Kd de 3,5, 45 y 8,0 nM, respectivamente.

La combinación de múltiples sustituciones produjo las variantes más evasivas de IR de RNasa A. Son notables las variantes K7A/D38R/R39D/G88R y D38R/R39D/N67R/G88R que 30 formaban complejos con IRp con valores de IRp de 0,12 y 1,4 m, respectivamente. Es notable que D38R/R39D/N67R/G88R RNasa A es la primera variante de RNasa A que se ha

observado que forma un complejo con IRp que tiene un valor micromolar de Kd. Cambiando sólo 4 de los 124 restos de RNasa A, el valor de Kd del complejo IRp-RNasa A se incrementó en 20 millones de veces con la variante D38R/R39D/N67R/G88R. 5

Los valores de Kd para los complejos de IRp con variantes de RNasa A son ideales para estimar la capacidad del algoritmo FADE para identificar marcadores de complementariedad de forma. Como agente quimioterapéutico, sin embargo, las ribonucleasas deben ser capaces de eludir 10 el IR humano. Por esta razón, se determinaron también los valores de Kd para los complejos de IRh con variantes de RNasa A. Con la excepción de N67R/G88R RNasa A (Kd = 44 nM), los valores de Kd para complejos de IRh eran mayores que los obtenidos para IRp, variando la magnitud de las 15 diferencias de 2 a 230 veces. El valor de Kd más alto observado para un complejo con IRh era el de K7a/D38R/R39D/G88R RNasa A a 27 M, que representa una disminución de 400 millones de veces de la afinidad para IRh. 20

Es importante que los efectos desestabilizadores de estas sustituciones sobre el complejo no eran enteramente aditivos, lo que indica que la interfaz de IRp-RNasa A es plástica. La naturaleza de la acomodación de la interfaz de unión se puede ver por comparación de los valores de G 25 (Tabla 2). Por ejemplo, las sustituciones de G88R y N67R desestabilizaron el complejo en aproximadamente 5 kcal/mol cada una. Además, la variante doble N67R/G88R presentó una pérdida de 8 kcal/mol de la energía libre de unión, a pesar de la separación espacial de estas dos sustituciones. 30

Estabilidad

La estabilidad de conformación de una ribonucleasa es necesaria para la función biológica, incluida la

citotoxicidad. Por ello se determinó el valor de Tm cada variante de RNasa A y se recoge en la Tabla 2. La sustitución de N67R era la más desestabilizadora, disminuyendo el valor de Tm de la RNasa A de tipo silvestre en 7ºC a un valor de 57ºC. Esta pérdida de la estabilidad 5 de conformación no se recuperó por sustituciones adicionales, habiendo sido observada en todas las variantes que contenían la sustitución de N67R. Las variantes N67R/G88R y D38R/R39D/N67R/G88R tenían valores de Tm de 58 y 56ºC, respectivamente. K31A/D38R/R39D/N67R/G88R RNasa A 10 tenía el valor de Tm más bajo, de 54ºC, que es casi 10ºC inferior al de la enzima de tipo silvestre. Este valor de Tm es significativamente mayor que la temperatura fisiológica. Ninguna de las sustituciones de otros aminoácidos redujo el valor de Tm en más de unos pocos 15 grados centígrados.

Citotoxicidad

Se midió la toxicidad de cada ribonucleasa con la línea de células de leucemia humana K-562. En la Tabla 2 se muestran las ribonucleasas en el orden de la citotoxicidad, 20 usando los valores de CI50 derivados por aplicación de la ecuación 3 (véase más adelante) a los datos de la Figura 3 (h=1,43+0,02 para las 12 ribonucleasas citotóxicas). ONC, G88R RNasa A y K7A/G88R RNasa A presentaron valores de CI50 similares a los dados a conocer antes. D38R/R39D RNasa A 25 (Figura 3A) y N67R RNasa A (Figura 3C) no presentaron actividad citotóxica, incluso a concentraciones de 25 M. La carencia de citotoxicidad para las dos últimas variantes es interesante considerando el alto aumento de la citotoxicidad que presentaron en el contexto de la 30 sustitución de G88R.

Después de la incorporación de la sustitución de K7A en la variante D38R/R39D/G88R, su afinidad para IRh

disminuyó 40 veces, lo que es consistente con la pérdida de interacciones favorables entre la cadena lateral de lisina y el resto de serina C-terminal de IRh. Este valor mas alto de Kd estaba acompañado por una pérdida de actividad catalítica, que condujo a un valor de CI50 de casi dos 5 veces el de D38R/R39D/G88R RNasa A. Aunque no se identificó Asp38 explícitamente por el análisis FADE, su importancia en el cambio D38R/R39D es manifiesta cuando se compara el valor de R39D/G88R RNasa A (CI50 = 0,69 M) con el de D38R/R39D/G88R RNasa A (CI50 = 0,22 M). 10

Se exploraron en cuanto a la actividad citotóxica frente a 10 diferentes líneas de células dos de las variantes más citotóxicas de RNasa A descubiertas en este trabajo, D38R/R39D/G88R y D38R/R39D/N67R/G88R, así como ONC, RNasa A de tipo silvestre y G88R RNasa A. Los valores 15 de CI50 resultantes de estas ribonucleasas figuran en la Tabla 3. Todas las líneas de células son de origen humano excepto la NmuMG, que es una línea de células epiteliales mamíferas normales de ratón. Con excepción de la línea de células Hep3B, todas las líneas de células cancerosas 20 humanas, como la línea K-562 de leucemia humana, están entre las 60 líneas de células exploradas por el National Cancer Institute en la búsqueda de nuevos agentes quimioterapéuticos del cáncer.

Las líneas de células se muestran en la Tabla 3 25 ordenadas de acuerdo con tiempos de duplicación crecientes. No parece que haya correlación directa alguna entre el tiempo de duplicación y la sensibilidad a las ribonucleasas como se ha señalado anteriormente. En general, la tendencia de citotoxicidad entre las variantes de RNasa A reflejó la 30 vista en la línea de células K-562, esto es, D38R/R39D/N67R/G88R>S38R/R39D/G88R>G88R>RNasa A de tipo silvestre, teniendo la variante D38R/R39D/N67R/G88R

consistentemente el valor de CI50 más bajo. Las líneas de células HCT-116, A549 y SF268 eran excepciones a esta tendencia general, ya que eran más sensibles a la RNasa A de tipo silvestre que la G88R RNasa A. Otros investigadores han dado cuenta de que la ribonucleasa pancreática humana 5 de tipo silvestre (RNasa 1) es tóxica en algunas líneas celulares, justamente como los presentes investigadores encontraron diversas líneas de células susceptibles a la RNasa A de tipo silvestre. Estas tres líneas derivan de tres tipos de tejido diferentes: colon, pulmón y SNC, 10 respectivamente.

Un objetivo de este trabajo era identificar variantes de RNasa A que tuvieran una citotoxicidad igual o mayor que la de ONC. Este objetivo se alcanzó con la variante D38R/R39D/G88R en las líneas de células K-562, Du145, Hep-15 3B y SF268. En las seis restantes líneas de células, ONC presentó una citotoxicidad de 3 a 30 veces mayor que la presentada por las variantes de RNasa A. Es interesante que ninguna de las variantes derivadas de RNasa A ensayadas en esta exploración era tóxica para la línea normal de células 20 NmuMG a las concentraciones máximas ensayadas. La discriminación no se observó con ONC, que tenía un valor de CI50 de 1,62 M para la línea normal de células de ratón.

Tabla 3. Valores de CI50 de RNasa A, sus variantes y ONC para diez líneas de células 25

a Los valores de CI50 son para la conversión de calceína AM en calceína expuesta a una ribonucleasa y se calcularon con la ecuación 4.

b DRNG y DRG se refieren a las variantes de RNasa A D38R/R39D/N67R/G88R y 5 D38R/R39D/G88R, respectivamente.

PROCEDIMIENTOS Y MATERIALES

Materiales

Las células Escherichia coli BL21(DE3) y los plásmidos 10 pET22b(+) y pET27b(+) eran de Novagen (Madison, WI). Las células K-562 se derivaron de una línea continua de leucemia mielogenosa crónica humana obtenida de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). El medio de cultivo y los suplementos eran de Invitrogen (Carlsbad, CA). La 15 [metil-3H]timidina (6,7 Ci/mmol) era de Perkin Elmer (Boston, MA). Las enzimas se obtuvieron de Promega (Madison, WI) o New England Biolabs (Beverly, MA). Los sustratos de ribonucleasa 6-FAM-dArUdAdA-6-TAMRA y 6-FAM-dArUdGdA-6-TAMRA eran de Integrated DNA Technologies 20 (Coralville, IA). Todos los otros productos químicos usados eran de calidad reactivo o mejor y se usaron sin posterior purificación.

El Caldo Terrific (TB) contenía (en 1,00 l) triptona (12 g), extracto de levadura (24 g), glicerol (4 ml), 25 KH2PO4 (2,31 g) y K2HPO4 (12,54 g). La solución salina tamponada con fosfato contenía (en 1,00 l) NaCl (8,0 g),

KCl (2,0 g), Na2HPO47H2O (1,15 g), KH2PO4 (2,0 g) y NaN3 (0,10 g) y tenía un pH de 7,4.

Instrumentos

La incorporación de [metil-3H]timidina en ADN genómico de K-562 se cuantificó mediante recuento por centelleo 5 usando un contador de centelleo y lumininiscencia de líquidos Microbeta TriLux (Perkin Elmer, Wellesley, MA). La masa de cada una de las variantes de proteína se confirmó por espectrometría de masas MALDITOF usando una Voyager-DE-PRO Biospectrometry Workstation (Applied BioSystems, Foster 10 City, CA). Las mediciones de fluorescencia se hicieron con un fluorímetro de recuento de fotones QuantaMaster 1 equipado con agitación de la muestra (Photon Technology International, South Brunswick, NJ). Los datos de desnaturalización térmica se obtuvieron usando un 15 espectrofotómetro de doble haz Cary 3 equipado con control de la temperatura (Varian, Palo Alto, CA).

Diseño de variantes de Ribonucleasa A

El programa Fast Atomic Density Evaluator (FADE) calcula marcadores de complementariedad de forma de 20 proteínas e interfaces complejas. La densidad atómica se mide usando algoritmos de transformada de Fourier rápida basados en métodos descritos previamente. Usando la estructura del complejo cristalino IRp-RNasa A (IDFJ de entrada PDB), se identificaron restos críticos de RNasa A 25 en estrecha proximidad de grandes cúmulos de marcadores complementarios de forma, que se recogen en la anterior Tabla 1. Se seleccionaron sustituciones de aminoácidos para crear un conflicto electrostático o estérico máximo así como para eliminar cualesquiera acciones favorables 30 culómbicas o de corto intervalo.

Al comienzo de esta investigación, la variante más citotóxica de RNasa A era K7A/G88R RNasa A. Inicialmente se

hicieron posteriores sustituciones de aminoácidos inspiradas por el análisis FADE en el fondo de estos cambios establecidos esperando que cualesquiera contribuciones adicionales a la capacidad de evasión serían aditivas. Como se discute en esta memoria, los inventores 5 encontraron que la pérdida de actividad enzimática que acompaña a la sustitución de K7A comprometía la citotoxicidad y, por ello, se hicieron posteriores sustituciones en el fondo de la sustitución de G88R sola. El fondo de G88R proporcionó una referencia bien 10 caracterizada de citotoxicidad y evasión de IR de la que se pudieron identificar mejoras usando los ensayos propios establecidos. También se hicieron solas sustituciones que resultaron satisfactorias en el fondo de G88R para estimar su contribución inicial a la evasión de IR y la 15 citotoxicidad.

Producción de ribonucleasas

Se crearon moléculas de ADNc que codifican variantes de RNasa A por mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleótidos usando un plásmido pET22b(+) o pET27b(+) 20 que contenía ADNc que codifica RNasa A de tipo silvestre o su variante G88R, respectivamente. Se produjeron ONC, RNasa A de tipo silvestre y variantes de RNasa A como han descrito antes Haigis y otros, (2002) J. Biol. Chem 277, 11576-11581, con las excepciones siguientes. Se agitaron 25 cuerpos de inclusión de E. coli en tampón Tris-HCl 20 mM a pH 8,0, que contenía guanidina-HCl (7M), DTT (0,1 M) y EDTA (10 mM) hasta disolución completa. Las ribonucleasas se replegaron durante la noche a temperatura ambiente y seguidamente se diluyeron en tampón Tris-HCl 0,10 M a pH 30 8,0 que contenía NaCl (0,1 M), glutationa reducida (1,0 mM) y glutationa oxidada (0,2 mM). Después de la purificación, las proteínas se dializaron frente a PBS y se

filtraron con jeringa de 0,2 m antes de usarlas en ensayos bioquímicos. La concentración de proteína se determinó por espectroscopia de UV y usando un coeficiente de extinción de 278 = 0,72 mg.ml-1cm-1 para RNasa A y sus variantes y 280 = 0,87 mg.ml-1cm-1 para ONC. 5

Producción de inhibidor de ribonucleasa

Se preparó inhibidor de ribonucleasa porcina (IRp) de acuerdo con lo descrito por Klink y otros (2001) Protein Expr. Purif. 22, 174-179. Se confirmó que IRp recientemente preparado era 100% activo por su capacidad para titular la 10 actividad ribonucleolítica de RNasa A de tipo silvestre.

Se produjo inhibidor de ribonucleasa humana (IRh) en células BL21(DE3) de E. coli transformadas con un plásmido pET22b(+) que contenía ADNc que codifica IRh entre sus sitios NdeI y SalI. Se inocularon cultivos (1,0 l) de TB a 15 un OD de 0,005 a 600 nm desde un cultivo nocturno. El cultivo se hizo crecer a 37ºC a un OD de 1,8-2,0 a 600 nm. Se añadió IPTG a una concentración final de 0,5 mM y la inducción se realizó durante la noche a 18ºC. La posterior purificación de proteína soluble y la determinación de IRh 20 se hicieron de la misma manera que para IRp. La pureza y el tamaño de ambos IR se confirmaron por electroforesis y espectroscopia de masas.

Ensayos de unión del inhibidor de ribonucleasa

La afinidad de las variantes de RNasa a IRp y a IRh se 25 determinó usando una ligera modificación de un ensayo de competición del que anteriormente dieron cuenta Abel y otros, (2002) Anal. Biochem. 306, 100-107. En resumen, se añadieron a 2,0 ml de PBS que contenían DTT (5 mM) G88R RNasa A marcada con fluoresceína (concentración final 50 30 nM) y concentraciones variables de ribonucleasa no marcada. Después de 15 minutos de incubación a (23 + 2)ºC, protegida frente a la luz, se controló durante 3 min (excitación: 493

nm; emisión: 515 nm) la intensidad inicial de fluorescencia en la G88R RNasa A marcada con fluoresceína no marcada. Se añadió luego IRp (concentración final 50 nM, que es suficiente para unir 90% de G88R RNasa A marcada con fluoresceína en ausencia de competidor no marcado) y se 5 midió la intensidad final de fluoresceína. El ensayo de competición se hizo idénticamente igual que para IRh, excepto que fue necesario más IRh (concentración final de 115 nM) para alcanzar 90% de unión de G88R RNasa A marcada con fluoresceína a causa de menor afinidad de IRh. Se 10 determinó la afinidad de IRh a G88R RNasa A marcada con fluoresceína por titulación de G88R RNasa A 50 nM marcada con fluoresceína con cantidades variables de IRh (0,5-1000 nM) y registrando la disminución de la fluorescencia después de unión. Se encontró que el valor de Kd era de 7,8 15 nM.

Ensayos de actividad catalítica

Se determinó la actividad catalítica de RNasa A y sus variantes mediante ensayo de su capacidad de escindir el sustrato fluorogénico hipersensible 6-FAM-dArUdAdA-6-TAMRA 20 (50 nM), que presenta un aumento de 180 veces de la fluorescencia (excitación: 493 nm; emisión: 515 nm) después de escisión). Los ensayos se realizaron a (23 + 2)ºC en 2 ml de tampón de MES-NaOH 0,10 M a pH 6,0, que contenía NaCl (0,10 M). El MES usado para preparar el tampón de ensayo se 25 purificó por cromatografía de intercambio aniónico para eliminar trazas de ácido vinilsulfónico oligómero, que es un subproducto de la síntesis del tampón comercial y que se ha visto que es un potente inhibidor de RNasa A. Los valores de kcat/KM se obtuvieron con la ecuación: 30

(1)

en la que I/t representa la velocidad de reacción inicial generada por escisión del sustrato 6-FAM-dArUdAda-6-TAMRA después de la adición de ribonucleasa a la cubeta, I0 e Imax 5 son, respectivamente, las intensidades de fluorescencia antes de la adición de enzima y después de la escisión completa del sustrato por exceso de RNasa A de tipo silvestre. Los valores de la actividad para ONC se determinaron a (23 + 2)ºC en 2,0 ml de tampón MES-NaOH 20 10 mM exento de OVS a pH 6,0, que contenía NaCl (0,010 M) usando el sustrato 6-FAM-dArUdGdA-6-TAMRA (50 nM).

Ensayos de citotoxicidad

Los valores de CI50 para RNasa A, sus variantes y ONC se determinaron midiendo la incorporación de [metil-15 3H]timidina en el ADN celular de células K-562 en presencia de ribonucleasas. Todos los ensayos de citotoxicidad se repitieron al menos tres veces por triplicado. Cada punto de ensayo representa la media de tres o más valores experimentales (+ DE). Los valores de CI50 se calcularon 20 ajustando las curvas usando regresión no lineal a una curva sigmoidal de dosis-respuesta con la ecuación:

100%

y =  (2)

1 + 10(log (CI50)-log[ribonucleasa)h 25

En la ecuación 2, y es la síntesis total de ADN después del pulso de 4-h[metil-3H]timidina, y h es la pendiente de la curva.

Se realizaron otros ensayos de citotoxicidad que no eran los realizados usando células K-562, en el dispositivo 30

Keck-UWCCC Small Molécule Screening Facility. En estos ensayos se usaron 120 líneas de células de un amplio espectro de tejidos. Después de incubación con ribonucleasas durante 72 horas, se determinaron los valores de CI50 midiendo la conversión enzimática de la 5 profluoroforocalceína AM (Molecular Probes, Eugene, OR) en calceína en células vivas. Para cada célula viva se determinó el coeficiente de variación y las puntaciones de Z usando doxorrubicina como control interno. Todos los ensayos de citotoxicidad se realizaron por triplicado tres 10 veces. Los valores de CI50 se calcularon con la ecuación:

en la que % bajo y % alto se refieren a la inhibición por 15 las dos concentraciones de [ribonucleasa]baja y [ribonucleasa ]alta que ponen entre paréntesis la inhibición del 50%.

Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo a los fines de 20 claridad de comprensión, se entiende que ciertas adaptaciones de la invención son cuestión de optimización rutinaria para los expertos en la técnica y se pueden implementar sin desviarse del alcance de las reivindicaciones anexas. 25

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería de la superfamilia RNasa A que tiene al menos dos cambios de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa de la ribonucleasa, siendo el primer cambio una sustitución de 5 aminoácido en la región correspondiente a los restos de aminoácidos 85 a 94 de RNasa A pancreática bovina, y siendo el segundo cambio una alteración, sustitución o intercambio de aminoácido en un lugar seleccionado entre el grupo constituido por aminoácidos que corresponden a los restos 10 38, 39 y 67 de RNasa A pancreática bovina, teniendo la ribonucleasa diseñada por ingeniería una actividad citotóxica intensificada en comparación con una correspondiente ribonucleasa diseñada por ingeniería que tiene una modificación sólo en la región que corresponde a 15 restos de los aminoácidos 85 a 94.
2. 2. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería según la reivindicación 1, en la que el segundo cambio es un intercambio de arginina en el resto 39 con un ácido aspártico en el resto 38. 20
3. 3. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería según la reivindicación 1, en la que el segundo cambio es una sustitución de una asparagina en el resto 67 por una arginina.
4. 4. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería según la 25 reivindicación 1, en la que el primer cambio es la sustitución de una glicina en el resto 88 por arginina.
5. 5. La ribonucleasa A pancreática bovina D38R/R39D/G88R diseñada por ingeniería.
6. 6. La ribonucleasa A pancreática bovina D38R/R39D/N67R/ 30 G88R diseñada por ingeniería.
7. 7. Una construcción de ADN que codifica la ribonucleasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. 8. Una células que aloja la construcción de ADN de la reivindicación 7.
9. 9. Un procedimiento in vitro para impartir actividad citotóxica en células, que comprende la etapa de suministrar a las células in vitro una ribonucleasa 5 diseñada por ingeniería según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
10. 10. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso en un procedimiento de terapia en un cuerpo humano o animal. 10
11. 11. Una ribonucleasa diseñada por ingeniería según la reivindicación 10 para uso en la impartición de actividad citotóxica a células.