KR20130129438A - Uvc 노출을 위한 세포 배양 배지 및 이와 관련된 방법 - Google Patents

Uvc 노출을 위한 세포 배양 배지 및 이와 관련된 방법 Download PDF

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로저 하트
알. 마이클 보이킨
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암젠 인크
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Abstract

본 발명은 자외선 C (UVC) 광 노출에 대한 노출을 위해 최적화된 세포 배양 배지, 그리고 관련된 방법에 관계한다.

Description

UVC 노출을 위한 세포 배양 배지 및 이와 관련된 방법{CELL CULTURE MEDIA FOR UVC EXPOSURE AND METHODS RELATED THERETO}
관련된 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2011년 2월 23일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/445,988에 우선권을 주장하고, 이것은 본원에 참고문헌으로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 자외선 C (UVC) 광 노출에 대한 노출을 위해 최적화된 세포 배양 배지 및 이와 관련된 방법에 관계한다.
발명의 배경
제약학적 산물의 제조에 이용되는 세포 배양 배지의 멸균은 생물부하 (bioburden)를 예방하기 위한 높은 품질 제약학적 산물을 생산하는 공정의 일부로서 중요한 단계이다. 이것은 전형적으로, 멸균 등급 여과 (0.2 또는 0.1 마이크론 절대 정격 필터)에 의해 달성된다. 세포 배지와 상층액의 마이코플라스마와 바이러스 오염 역시 전세계의 생물약제 제조업체에 중대한 과제를 제기한다. 용액으로부터 크거나 작은, 외피보유 또는 비-외피보유 (또는 "나신") DNA 또는 RNA 바이러스 입자를 비활성화시키고 및/또는 제거하기 위해 여러 방법이 이용되고 있다. 이들 접근법의 실례에는 여과(나노, 바이러스 또는 0.1 마이크론), 크로마토그래피, 배치 열 처리, 관류 고온 순간 살균 (HTST), 감마선 조사, 낮은 pH와 화학적 비활성화 (용매, 세정제), 그리고 배치 또는 관류 자외선 C (UVC)가 포함된다. HTST는 바이러스의 제어를 위한 증명된 방법이지만, 이것은 단백질성 성분, 예를 들면, 혈청을 내포하는 세포 배양 배지에 대한 부작용을 갖는다. 부가적으로, 비록 이들 화학약물의 빈번한 독성이 제약학적 제조에서 그들의 이용을 제한하긴 하지만, 바이러스 입자를 비활성화시키기 위해 화학적 처리가 이용되고 있다. 게다가, HTST는 플랜트에서 통합된 전용 기반시설을 필요로 하고, 이것은 제약학적 작용제와 치료 작용제의 제조를 계획할 때 고려사항이 될 수 있다.
상기 기술에 더하여, 세포 상층액으로부터 단백질의 정제에 앞서 대규모 단백질 제조물을 처리하기 위해 UVC 기술이 이용되고 있다. 예로써, U.S. 특허 출원 공개 번호 20100203610A1을 참조한다. UVC 기술은 원치 않는 생물체의 DNA/RNA를 파괴하기 위해 스펙트럼의 자외선 파장 범위 내에 광의 성질에 의존한다. UVC 선량인 것으로 간주되는, UVC 처리의 강도는 광속의 강도 및 액체가 UVC 광 공급원에 노출되는 시간에 의해 지배된다. 제공된 UVC 선량은 원하는 생물체의 효과적인 비활성화에 충분해야 하지만, 목표 단백질 생산과 품질을 비롯한 견고한 공정을 위해 필요한 용액의 성분을 파괴할 만큼 높지 않아야 한다. 비록 배지의 UVC 처리가 바이러스 비활성화를 위한 효과적인 수단이긴 하지만, 본 발명자들은 성장에 앞서 UVC 광에 노출된 배지에서 성장된 세포가 UVC 광에 노출되지 않은 배지와 비교하여, 감소된 단백질 역가를 산출한다는 것을 발견하였다.
따라서 UVC 처리가능 세포 배양 배지, 그리고 제약학적 제조에서 이용을 위해 세포 배양 배지를 UVC로 처리하기 위한 방법이 당분야에 요구된다. 이런 방법은 귀중한 세포주를 바이러스 오염으로부터 보호하고, 오염되고 불용한 배지의 결과로서 손실되는 비용을 절감하고, 그리고 이런 세포주에 의한 단백질 생산의 효율을 증가시키는데 특히 유용할 수 있다. 따라서 이런 방법의 개발은 생물약제의 제조에서 폭넓은 적용을 가질 수 있다.
발명의 요약
본원에서는 (a) UVC 광에 노출되는 기초 배지; 그리고 (b) UVC 노출 후 상기 기초 배지에 첨가되는 UV 민감성 배지 성분을 포함하는 추가의 포장을 포함하는 세포 배양 배지가 제시된다. 한 구체예에서, 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함한다. 추가의 구체예에서, 기초 배지는 분말 또는 액상 형태 이고, 그리고 추가의 포장은 분말 또는 액상 형태이다. 또 다른 구체예에서, 배지는 포유동물 세포의 배양에 적합하고, 또 다른 구체예에서, 배지는 곤충 세포의 배양에 적합하다.
또한, 본원에서는 UVC 노출된 세포 배양 배지 제제를 제조하기 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 (a) 기초 배지를 UVC 광에 노출하는 단계; 그리고 (b) UV 민감성 성분을 포함하는 추가의 포장을 상기 UVC 노출된 기초 배지에 첨가하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함하지 않는다. 추가의 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함한다. 다른 구체예에서, UVC 광은 약 254nm의 파장에 있다. 추가의 구체예에서, 기초 배지는 약 25 내지 약 350 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 기초 배지는 약 125 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출되고, 추가의 구체예에서, 기초 배지는 약 175 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 기초 배지를 UVC 광에 노출하는 단계는 기초 배지 내에 임의의 비-외피보유 바이러스의 핵산을 손상시키는데 충분하다. 다른 구체예에서, UVC 광은 박막 UVC 반응장치를 이용하여 전달되고, 추가의 구체예에서, UVC 광은 나선 UVC 반응장치를 이용하여 전달된다.
또한, 본원에서는 단백질을 생산하기 위한 방법이 제시되고, 상기 방법은 (a) 기초 배지를 UVC 광에 노출하는 단계; (b) UV 민감성 배지 성분을 포함하는 추가의 포장을 상기 UVC 노출된 기초 배지에 첨가하는 단계; 그리고 (c) 원하는 단백질이 생산되도록, 세포를 UVC 처리된 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함하지 않는다. 추가의 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함한다. 다른 구체예에서, UVC 광은 약 254nm의 파장에 있다. 추가의 구체예에서, 기초 배지는 약 25 내지 약 350 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 기초 배지는 약 125 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출되고, 추가의 구체예에서, 기초 배지는 약 175 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 기초 배지를 UVC 광에 노출하는 단계는 기초 배지 내에 임의의 비-외피보유 바이러스의 핵산을 손상시키는데 충분하다. 다른 구체예에서, UVC 광은 박막 UVC 반응장치를 이용하여 전달되고, 추가의 구체예에서, UVC 광은 나선 UVC 반응장치를 이용하여 전달된다. 한 구체예에서, 세포는 CHO 세포이다. 추가의 구체예에서, 단백질은 재조합 인간 에리트로포이에틴이다.
도면의 간단한 설명
도 1. 도 1에서는 실시예 1로부터 HPLC 역가 결과를 기술한다. 대조 처리되지 않은 배지 및 다양한 UVC 처리된 배지 군에 대한 결과가 도시된다. Y-축은 mg/L의 재조합 인간 에리트로포이에틴을 나타내고, 그리고 X-축은 3가지 상이한 수확 주기 및 총 수율을 나타낸다.
도 2. 도 2에서는 실시예 1로부터 Bradford 검정 결과를 기술한다. 대조 처리되지 않은 배지 및 다양한 UVC 처리된 배지 군에 대한 결과가 도시된다. Y-축은 mg/L의 재조합 단백질을 나타내고, 그리고 X-축은 3가지 상이한 수확 주기 및 총 수율을 나타낸다.
도 3. 도 3에서는 실시예 2로부터 HPLC 역가 결과를 기술한다. 대조 처리되지 않은 배지 및 다양한 UVC 처리된 배지 군에 대한 결과가 도시된다. Y-축은 mg/L의 재조합 인간 에리트로포이에틴을 나타내고, 그리고 X-축은 3가지 상이한 수확 주기를 나타낸다.
도 4. 도 4에서는 실시예 2로부터 Bradford 검정 결과를 기술한다. 대조 처리되지 않은 배지 및 다양한 UVC 처리된 배지 군에 대한 결과가 도시된다. Y-축은 mg/L의 재조합 단백질을 나타내고, 그리고 X-축은 3가지 상이한 수확 주기를 나타낸다.
도 5. 도 5에서는 실시예 3으로부터 HPLC 역가 결과를 기술한다. 대조 처리되지 않은 배지 및 다양한 UVC 처리된 배지 군에 대한 결과가 도시된다. Y-축은 mg/RB의 재조합 인간 에리트로포이에틴을 나타내고, 그리고 X-축은 3가지 상이한 수확 주기 및 이들 수확 주기의 총합을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본원에서 이용된 섹션 표제는 단지 조직화를 목적으로 하고, 그리고 거기에 기술된 요부 (subject matter)를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 본 출원에서 인용된 모든 참고문헌은 본원에 명백히 참고문헌으로 편입된다. 본원에서 달리 정의되지 않으면, 본 발명과 관련하여 이용된 과학 용어와 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 게다가, 문맥에 의해 달리 요구되지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함하고, 그리고 복수 용어는 단수를 포함한다.
본 발명은 UVC 처리가능 세포 배양 배지에 대한 당분야의 요구를 해소한다. 본 발명의 신규한 제제와 방법을 개발하는데 있어서 여러 장애물이 극복되어야 했다. 최초 배지로 시작하여, 안정된, 새로운 기초 배지의 제제가 UV 민감성 성분을 최초 배지로부터 제거함으로써 시도되었다. 하지만, 전혀 예상치 않게, UV 민감성 성분을 최초 배지로부터 제거하는 것은 UV 민감성 성분을 포함하지 않는 새로운 기초 배지, 그리고 UV 민감성 성분을 포함하는 추가의 포장 둘 모두에서 일정한 불안정성과 용해성 문제를 유발하는 것으로 밝혀졌다.
분리된 혼합물의 행태를 예언할 수 없음은 혼합물 내에서 다수의 구성물 사이에 화학적 상호작용에서 유래한다. 더욱 구체적으로, 추가의 포장에서 용해성 문제는 자가 완충 시스템 내에서 양성자의 상호작용으로부터 유래되는 것으로 생각된다. 게다가, 새로운 기초 배지 및 추가의 포장에서 불안정성 문제는 또한, 기타 상호작용, 예를 들면, UVC 조사에 노출에 의해 생산될 수 있는 반응성 산소 종 (reactive oxygen species)으로부터 유래되었을지도 모른다.
예상치 않게, 추가의 포장은 안정하지 않은 것으로 밝혀졌다. 추가의 포장은 최초 기초 배지로부터 이전될 때, 최초 용해성이거나 열적으로 안정하지 않았다. 최초 배지에서와 유사한 안정성을 회복하기 위하여, 혼합물이 용해성과 안정성을 갖도록 하는 적정제 (titrant)를 첨가함으로써 혼합물의 pH를 조정하는 것이 필요하였다.
추가의 예상치 못한 관찰은 기초 배지의 핵심 성분에 손상을 유발하는 UV로 처리될 때, UV 민감성 성분을 포함하지 않는 새로운 기초 배지에서 상호작용에 관련되었다. 이러한 손상은 예측될 수 없었는데, 그 이유는 추가의 포장 내에 성분이 최초 배지 내에 반응성 종을 통상적으로 소멸시키고, 따라서 이를 UV로부터 보호하기 때문이다. 추가의 포장 내에 배치되기 때문에 새로운 기초 배지 내에 존재하지 않는 잠재적 소멸제 (quencher)의 무제한적 실례에는 피리독살과 피리독살이 포함된다. 추가의 소멸제의 부재로 인하여 손상되었을 지도 모르는 새로운 기초 배지 내에 남아있는 소멸제의 무제한적 실례에는 피루브산염이 포함된다. 추가의 소멸제의 부재로 인하여 손상되었을 지도 모르는 새로운 기초 배지 내에 남아있는 핵심 성분의 무제한적 실례에는 우태 혈청 단백질이 포함된다.
하지만, 놀랍게도, 추가의 포장은 복합 혼합물 (가령, 최초 기초 배지)과 같은 일정한 양상에서 자가-안정성이다. 추가의 포장의 자연 pH는 대략 6.7이고, 이것은 기초 배지에서와 대략 동일하다.
추가의 예상치 못한 효과는 UVC 반응장치의 유형 및 관련된 선량 분포에 관련된다. 몇몇 공정 UVC 반응장치, 예를 들면, 층류 또는 박막 반응장치는 전형적으로 높은 선량 꼬리를 갖는 넓은 선량 분포를 산출한다. 새로운 배지는 이러한 넓은 분포 (및 과다노출)을 수용하지만, 이것은 역가 교정에 의해 입증되는 바와 같이, 놀랍게도 현저하게 손상되지 않는다. 기존 연구는 박막 반응장치와 비교하여 타이트한 선량 분포를 산출하는 나선 UVC 반응장치를 이용하였다. 이들 연구는 UVC 처리가 감소된 역가 (산물 농도)를 유발한다는 것을 증명하였다. 최초 배지가 박막 UVC 처리될 때, 결과는 전체 공정 실패, 다시 말하면, 회전병에 세포 부착의 완전한 결여 및 세포 성장의 결여이다.
따라서 한 양상에서, 본 발명은 UVC 노출에 적합한 세포 배양 배지를 제시하고, 여기서 상기 배지는 기초 배지, 그리고 UVC 노출 후 기초 배지에 첨가되는 UV 민감성 배지 성분을 포함하는 추가의 포장을 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 UVC 노출된 세포 배양 배지 제제를 만들기 위한 방법을 더욱 제시하고, 상기 방법은 기초 배지를 조제하는 단계, 기초 배지를 UVC 광에 노출하는 단계, 그리고 UV 민감성 성분을 포함하는 추가의 포장을 UVC 노출된 기초 배지에 첨가하는 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 단백질을 생산하기 위한 방법을 더욱 제시하고, 상기 방법은 기초 배지를 UVC 광에 노출하는 단계, UV 민감성 배지 성분을 포함하는 추가의 포장을 UVC 노출된 기초 배지에 첨가하는 단계, 그리고 원하는 단백질이 생산되도록, 세포를 UVC 처리된 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
UV-민감성 배지 성분
하기에 더욱 논의된 바와 같이, 세포 배양 배지는 시험관내 환경에서 세포 증식을 뒷받침하는 많은 상이한 성분을 포함한다. 일정한 배지 성분은 UVC 광에 민감하고 UVC 광에 노출될 때 분해되는 것으로 밝혀졌다. 이것은 차례로, 세포 배양으로부터 감소된 단백질 생산으로 이어진다. 세포 배양 배지의 UVC 처리에서 관찰된, 단백질 산물 역가에 대한 이러한 유해한 영향을 극복하기 위하여, UVC 노출에 적합한 새로운 기초 배지가 요구된다. 따라서 본 발명의 목적은 UV 민감성 성분을 포함하지 않는 기초 배지, 그리고 UV 민감성 성분을 포함하는 추가의 포장을 제공하는 것이다. 본원에서 이용된 바와 같이, "기초 배지"는 일정한 UV 민감성 성분을 포함하지 않는 액체, 분말, 또는 다른 형태의 세포 배양 배지를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "추가의 포장"은 기초 배지가 UVC 광에 노출된 이후, 기초 배지에 첨가되는 액체, 분말, 또는 다른 형태의 UV 민감성 성분(들)을 지칭한다.
한 구체예에서, 기초 배지는 분말 형태이고, 그리고 추가의 포장은 분말 형태이다. 다른 구체예에서, 기초 배지는 분말 형태이고, 그리고 추가의 포장은 액상 형태이다. 또 다른 구체예에서, 기초 배지는 액상 형태이고, 그리고 추가의 포장은 분말 형태이다. 다른 구체예에서, 기초 배지는 액상 형태이고, 그리고 추가의 포장은 액상 형태이다.
한 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12 (cyanacobalamin)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 다른 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 한 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 3가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 4가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 다른 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 5가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 더욱 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 6가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 한 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 7가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 또 다른 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 8가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 9가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 더욱 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 10가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 또 다른 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 11가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 한 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 12가지 성분을 포함하지 않는 액체 배지이다. 또 다른 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12를 포함하지 않는 액체 배지이다.
한 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 다른 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 또 다른 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 3가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 또 다른 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 4가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 5가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 다른 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 6가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 더욱 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 7가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 또 다른 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 8가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 또 다른 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 9가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 다른 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 10가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 11가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 다른 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 12가지 성분을 포함하지 않는 분말 배지이다. 더욱 추가의 구체예에서, UVC 노출에 적합한 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12를 포함하지 않는 분말 배지이다.
한 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 액체이다. 다른 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2가지 성분을 포함하는 액체이다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 3가지 성분을 포함하는 액체이다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 4가지 성분을 포함하는 액체이다. 더욱 추가의 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 5가지 성분을 포함하는 액체이다. 추가의 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 6가지 성분을 포함하는 액체이다. 더욱 추가의 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 7가지 성분을 포함하는 액체이다. 한 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 8가지 성분을 포함하는 액체이다. 다른 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 9가지 성분을 포함하는 액체이다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 10가지 성분을 포함하는 액체이다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 11가지 성분을 포함하는 액체이다. 다른 추가의 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 12가지 성분을 포함하는 액체이다. 다른 구체예에서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12를 포함하는 액체이다.
한 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2가지 성분을 포함한다. 한 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 3가지 성분을 포함한다. 더욱 추가의 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 4가지 성분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 5가지 성분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 6가지 성분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 7가지 성분을 포함한다. 추가의 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 8가지 성분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 9가지 성분을 포함한다. 더욱 추가의 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 10가지 성분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 11가지 성분을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 12가지 성분을 포함한다. 다른 구체예에서, 추가의 포장은 분말이고, 그리고 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12를 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 UVC 노출에 적합한 기초 배지 및 추가의 포장을 포함하는 키트에 관계한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 2가지 성분을 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 4가지 성분을 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 5가지 성분을 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 6가지 성분을 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 7가지 성분을 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 8가지 성분을 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 9가지 성분을 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 10가지 성분을 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 11가지 성분을 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 12가지 성분을 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12를 더욱 포함하고, 이들은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다.
UV 민감성 성분에 대한 농도의 하기 설명에서, 특정한 농도 및 농도 범위는 1X 배지에 대한 최종 농도이다. 당업자는 2X 배지 용액 (즉, 소정의 농도와 범위의 2배), 3X 배지 용액 (즉, 소정의 농도의 3배) 등에 대한 필요 농도를 쉽게 구상할 것이다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 엽산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.1 내지 약 10.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 엽산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.5 내지 약 5.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 엽산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.0 내지 약 3.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 엽산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.0 내지 약 3.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 엽산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.0 mg/L의 농도를 산출한다. 추가의 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 엽산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.5 mg/L의 농도를 산출하다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 엽산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 3.0 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.0 내지 약 100.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 10.0 내지 약 90.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 10.0 내지 약 80.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 10.0 내지 약 70.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 15.0 내지 약 55.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 20.0 내지 약 50.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 25.0 내지 약 40.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 25.0 내지 약 35.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 30.0 내지 약 35.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 30.0 내지 약 33.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 31.0 내지 약 32.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 31.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 32.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 히스티딘을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 31.5 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.0 내지 약 100.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 10.0 내지 약 90.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 10.0 내지 약 80.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 10.0 내지 약 70.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 15.0 내지 약 55.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 20.0 내지 약 50.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 25.0 내지 약 40.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 30.0 내지 약 40.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 32.0 내지 약 38.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 34.0 내지 약 36.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 35.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 36.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 페닐알라닌을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 35.5 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 트립토판을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.1 내지 약 50.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 트립토판을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.0 내지 약 20.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 트립토판을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 5.0 내지 약 15.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 트립토판을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 8.0 내지 약 12.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 트립토판을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 8.0 내지 약 10.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 트립토판을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 8.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 트립토판을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 8.5 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 트립토판을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 9.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 트립토판을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 9.5 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.0 내지 약 100.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 10.0 내지 약 90.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 20.0 내지 약 80.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 30.0 내지 약 70.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 40.0 내지 약 60.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 50.0 내지 약 60.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 53.0 내지 약 57.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 54.0 내지 약 56.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 55.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 55.5 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티로신을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 60.0 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.01 내지 약 10.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.05 내지 약 5.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 .08 내지 약 0.12 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산을 더욱 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.100 내지 약 0.110 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.101 내지 약 0.107 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.102 내지 약 0.104 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.102 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.103 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리포산을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.104 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 니아신아미드를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.1 내지 약 10.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 니아신아미드를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.5 내지 약 5.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 니아신아미드를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.0 내지 약 3.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 니아신아미드를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.5 내지 약 2.5 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 니아신아미드를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.5 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 니아신아미드를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 니아신아미드를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.5 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독살을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.1 내지 약 10.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독살을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.5 내지 약 5.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독살을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.0 내지 약 3.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독살을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.5 내지 약 2.5 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독살을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.5 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독살을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독살을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.5 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독신을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.0001 내지 약 1 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독신을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.001 내지 약 0.1 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독신을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.010 내지 약 0.050 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독신을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.020 내지 약 0.040 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독신을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.025 내지 약 0.035 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독신을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.030 내지 약 0.035 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독신을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.030 내지 약 0.032 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독신을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.030 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독신을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.031 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 피리독신을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.032 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.01 내지 약 10.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.05 내지 약 5.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.1 내지 약 1.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.1 내지 약 0.5 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.1 내지 약 0.3 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.15 내지 약 0.25 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.20 내지 약 0.23 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.21 내지 약 0.22 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.210 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.213 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.216 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 리보플라빈을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.219 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티아민을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.1 내지 약 10.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티아민을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.5 내지 약 5.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티아민을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.0 내지 약 3.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티아민을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 1.5 내지 약 2.5 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티아민을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.0 내지 약 2.3 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티아민을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.1 내지 약 2.2 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티아민을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티아민을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.1 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 티아민을 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 2.2 mg/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 메토트렉사트를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.0000001 내지 약 0.001 g/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 메토트렉사트를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.000001 내지 약 0.0001 g/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 메토트렉사트를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.00001 내지 약 0.0001 g/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 메토트렉사트를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.00001 내지 약 0.00005 g/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 메토트렉사트를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.00002 내지 약 0.00004 g/L의 농도를 산출한다.
다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 메토트렉사트를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.00003 g/L의 농도를 산출한다.
한 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.01 내지 약 10.0 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.05 내지 약 5.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.1 내지 약 1.0 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.3 내지 약 0.8 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.5 내지 약 0.75 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.6 내지 약 0.7 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.65 내지 약 0.70 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.67 내지 약 0.69 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.67 mg/L의 농도를 산출한다. 또 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.68 mg/L의 농도를 산출한다. 다른 구체예에서, UVC 광에 노출된 기초 배지는 비타민 B12를 포함하고, 이것은 UVC 노출된 기초 배지에 첨가되어 약 0.69 mg/L의 농도를 산출한다.
세포, 단백질 및 세포 배양
일반적으로, 세포 배양 배지는 본원에서 "기초 배지"로서 교체 가능하게 지칭되는 기초 용액 또는 "기초 배지"를 내포하고, 그 내로 모든 원하는 성분이 첨가된다. 본 발명의 배경에서, "기초 배지"는 일정한 UV 민감성 성분을 포함하지 않는 세포 배양 배지를 지칭한다. 하기에 기술된 기초 배지는 UV 민감성 성분을 일반적으로 포함하지만, 일정한 UV 민감성 성분을 포함하지 않도록 선택적으로 조제될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 가령, RPMI 1640이 본원에서 기초 배지로서 개시되면, 이것은 만약 그렇지 않으면 RPMI 1640에서 전형적으로 관찰되는 일정한 UV 민감성 성분을 선택적으로 포함하지 않을 수 있는 것으로 이해될 것이다.
전형적으로, "세포 배양 배지" (일명 "배양 배지", "세포 배양 배지", 또는 "조직 배양 배지")는 당업자에 의해 충분히 이해되는 용어이고, 그리고 세포, 예를 들면, 동물 또는 포유동물 세포가 성장되고 하기로부터 적어도 하나 또는 그 이상의 성분을 일반적으로 제공하는 영양소 용액을 지칭하는 것으로 알려져 있다: 에너지 공급원 (통상적으로, 탄수화물, 예를 들면, 글루코오스의 형태에서); 모든 필수 아미노산, 그리고 일반적으로, 20개의 기초 아미노산 플러스 시스테인; 비타민 및/또는 전형적으로 낮은 농도로 요구되는 기타 유기 화합물; 지질 또는 유리 지방산, 예를 들면, 리놀레산; 그리고 미량 원소, 예를 들면, 전형적으로 매우 낮은 농도로, 통상적으로 마이크로몰 범위에서 요구되는 무기 화합물 또는 자연 발생 원소. 세포 배양 배지는 또한, 다양한 선택적 성분, 예를 들면, 호르몬 및 기타 성장 인자, 예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 혈청 등; 염, 예를 들면, 칼슘, 마그네슘과 인산염, 그리고 완충액, 예를 들면, HEPES; 뉴클레오시드와 염기, 예를 들면, 아데노신, 티미딘, 히포크산틴; 그리고 단백질과 조직 가수분해물, 예를 들면, 가수분해된 동물 단백질 (펩톤 또는 펩톤 혼합물, 이것은 동물 부산물, 정제된 젤라틴 또는 식물 물질로부터 획득될 수 있다); 항생제, 예를 들면, 젠타마이신; 그리고 세포 보호제, 예를 들면, Pluronic 폴리올 (Pluronic F68)을 내포하도록 보충될 수 있다. 세포 배양 배지는 일정한 구체예에서, 혈청이 없고, 그리고 동물 기원의 산물 또는 소재가 없다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 동물 또는 포유동물 세포는 배양되는 특정 세포에 적합한 배지에서 배양되고, 이것은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상업적으로 가용한 배지가 이용될 수 있는데, 여기에는 Iscove의 변형된 Dulbecco의 배지, RPMI 1640, 최소 필수 배지-알파. (MEM-알파), Eagle의 배지의 Dulbecco의 변형 (DMEM), DME/F12, 알파 MEM, Earle의 BSS를 포함하는 기초 배지 Eagle, 글루타민을 포함하는 DMEM 높은 글루코오스, 글루타민을 포함하지 않는 DMEM 높은 글루코오스, 글루타민을 포함하지 않는 DMEM 낮은 글루코오스, 글루타민을 포함하는 DMEM:F12 1:1, GMEM (Glasgow의 MEM), 글루타민을 포함하는 GMEM, Grace의 완전 곤충 배지, FBS를 포함하지 않는 Grace의 곤충 배지, 글루타민을 포함하는 Ham의 F-10, 글루타민을 포함하는 Ham의 F-12, HEPES와 글루타민을 포함하는 IMDM, HEPES를 포함하고 글루타민을 포함하지 않는 IMDM, IP41 곤충 배지, 글루타민 또는 Phenol Red를 포함하지 않는 15 (Leibovitz)(2X), 글루타민을 포함하지 않는 15 (Leibovitz), McCoy의 5A 변형된 배지, 배지 199, 글루타민 또는 Phenol Red (2X)를 포함하지 않는 MEM Eagle, 글루타민을 포함하는 MEM Eagle-Earle의 BSS, 글루타민을 포함하지 않는 MEM Eagle-Earle의 BSS, 글루타민을 포함하지 않는 MEM Eagle-Hanks BSS, 글루타민을 포함하는 NCTC-109, 글루타민을 포함하는 Richter의 CM 배지, HEPES, 글루타민 및/또는 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640, 글루타민을 포함하는 RPMI 1640, 글루타민을 포함하지 않는 RPMI 1640, Schneider의 곤충 배지, 또는 특정 세포 유형에 대해 조제되는 당업자에게 공지된 임의의 다른 배지가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 전술한 예시적인 배지에 필요하거나 원하는 바에 따라, 그리고 알려져 있거나 일과적인 기술을 이용하여 당업자에 의해 실시되는 바와 같이, 적절한 농도 또는 양에서, 선택적 성분을 비롯한 보충 성분 또는 소재가 첨가될 수 있다.
이에 더하여, 본 발명의 방법에 적합한 세포 배양 조건은 세포의 배치 배양, 유가 배양, 또는 연속 배양에 전형적으로 이용되고 알려진 것들인데, pH, 용존 산소 (O2), 그리고 이산화탄소 (CO2), 환기와 습도, 그리고 온도에 유의한다.
본 발명의 조성물은 다양한 세포를 배양하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 배지는 진핵 세포, 예를 들면, 식물 및/또는 동물 세포를 배양하는데 이용된다. 세포는 포유동물 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 양서류 세포 또는 조류 세포일 수 있다. 배지는 MK2.7 세포, PER-C6 세포, CHO 세포, HEK 293 세포, COS 세포와 Sp2/0 세포, 5L8 하이브리도마 세포, Daudi 세포, EL4 세포, HeLa 세포, HL-60 세포, K562 세포, Jurkat 세포, THP-1 세포, Sp2/0 세포, 일차 상피 세포 (가령, 각질형성세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포) 및 확립된 세포주와 이들의 계통 (가령, 293 배아 신장 세포, BHK 세포, HeLa 자궁경부 상피 세포와 PER-C6 망막 세포, MDBK (NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, BeWo 세포, Chang 세포, Detroit 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS 180 세포, LS 174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, Clone M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK1 세포, PK(15) 세포, GH1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 그리고 TH-I, B1 세포, 또는 이들의 유도체), 임의의 조직 또는 장기 (심장, 간, 신장, 결장, 장, 식도, 위, 신경 조직 (뇌, 척수), 폐, 혈관 조직 (동맥, 정맥, 모세관), 림프양 조직 (임파선, 아데노이드, 편도선, 골수, 그리고 혈액), 비장, 그리고 섬유아세포와 섬유아세포-유사 세포주 (가령, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, Dempsey 세포, Detroit 551 세포, Detroit 510 세포, Detroit 525 세포, Detroit 529 세포, Detroit 532 세포, Detroit 539 세포, Detroit 548 세포, Detroit 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl1 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, Vero 세포, DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDM1C3 세포, KLN205 세포, McCoy 세포, 생쥐 L 세포, Strain 2071 (생쥐 L) 세포, L-M 계통 (생쥐 L) 세포, L-MTK (생쥐 L) 세포, NCTC 클론 2472와 2555, SCC-PSA1 세포, Swiss/3T3 세포, Indian muntac 세포, SIRC 세포, CII 세포, 그리고 Jensen 세포, 또는 이들의 유도체)가 포함되지만 이들에 국한되지 않음)로부터 섬유아세포 세포, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 세포 유형이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 세포를 배양하는데 이용될 수 있다.
본원에서 개시된 배지는 현탁 중인 세포 또는 부착 세포를 배양하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 세포의 부착성 단층 또는 현탁 배양, 형질감염, 그리고 육성, 그리고 단층 또는 현탁 배양 중인 세포에서 단백질 또는 항체의 발현에 적합하다.
본 발명의 배지에 의해 뒷받침되는 세포는 임의의 동물, 예를 들면, 생쥐 또는 햄스터 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 배지에서 육성된 세포는 정상 세포 또는 비정상 세포 (즉, 형질전환된 세포, 확립된 세포, 또는 병든 조직 시료로부터 유래된 세포)일 수 있다.
동물 세포, 포유동물 세포, 배양된 세포, 동물 또는 포유동물 숙주 세포, 숙주 세포, 재조합 세포, 재조합 숙주 세포 등은 모두 본 발명의 공정에 따라 배양될 수 있는 세포에 대한 용어이다. 이런 세포는 전형적으로, 포유동물로부터 획득되거나 유래된 세포주이고, 그리고 적절한 영양소 및/또는 성장 인자를 내포하는 배지에서 단층 배양 또는 현탁 배양에 배치될 때, 성장하고 생존할 수 있다. 특정 세포 배양의 성장과 유지에 필요한 성장 인자와 영양소는 예로써, Barnes and Sato, (1980, Cell, 22:649); Mammalian Cell Culture, Ed. J. P. Mather, Plenum Press, NY, 1984; 그리고 U.S. 특허 번호 5,721,121에서 기술된 바와 같이, 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 경험적으로 쉽게 결정될 수 있다.
다양한 유형의 세포가 본 발명의 방법에 따라 배양될 수 있다. 세포는 전형적으로, 다량의 특정 단백질, 더욱 구체적으로, 관심되는 당단백질을 배양 배지 내로 발현하고 분비할 수 있거나, 또는 발현하고 분비하도록 분자 조작될 수 있는 동물 또는 포유동물 세포이다. 숙주 세포에 의해 생산된 당단백질은 숙주 세포에 내인성 또는 상동성일 수 있는 것으로 이해될 것이다. 대안으로, 당단백질은 숙주 세포에 이질성, 다시 말하면, 외래성이다, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 숙주 세포에 의해 생산되고 분비된 인간 당단백질이다. 부가적으로, 포유동물 당단백질, 다시 말하면, 포유동물 생물체로부터 최초 획득되거나 유래된 것들이 본 발명의 방법에 의해 달성되고 세포에 의해 배양 배지 내로 분비될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 유리하게 생산될 수 있는 포유동물 당단백질의 무제한적 실례에는 융합 또는 키메라 단백질을 비롯하여, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 성장 인자 (가령, EGF, HER-2, FGF-α, FGF-β, TGF-α, TGF-β, PDGF. IGF-1, IGF-2, NGF, NGF-β); 성장 인자 수용체가 포함된다. 다른 무제한적 실례에는 성장 호르몬 (가령, 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬); 인슐린 (가령, 인슐린 A 사슬과 인슐린 B 사슬), 프로인슐린; 에리트로포이에틴 (EPO); 다베포에틴, 집락 자극 인자 (가령, G-CSF, GM-CSF, M-CSF); 인터류킨 (가령, IL-1 내지 IL-12); 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 이의 수용체 (VEGF-R); 인터페론 (가령, IFN-α, β, 또는 γ); 종양 괴사 인자 (가령, TNF-α와 TNF-β) 및 이들의 수용체, TNFR-1과 TNFR-2; 트롬보포이에틴 (TPO); 트롬빈; 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP); 응고 인자 (가령, 인자 VIII, 인자 IX, 폰빌레브란트 인자 등); 항-응고 인자; 조직 플라스미노겐 활성화인자 (TPA), 예를 들면, 우로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직 유형 TPA; 여포 자극 호르몬 (FSH); 황체 형성 호르몬 (LH); 칼시토닌; CD 단백질 (가령, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19 등); CTLA 단백질 (가령, CTLA4); T-세포와 B-세포 수용체 단백질; 골격 형태발생 단백질 (BNPs, 예를 들면, BMP-1, BMP-2, BMP-3 등); 신경영양성 인자, 예를 들면, 골 유래된 신경영양성 인자 (BDNF); 뉴로트로핀, 예를 들면, 3-6; 레닌; 류머티스성 인자; RANTES; 알부민; 렐락신; 대식세포 저해 단백질 (가령, MIP-1, MIP-2); 바이러스 단백질 또는 항원; 표면 막 단백질; 이온 채널 단백질; 효소; 조절 단백질; 항체; 면역조절성 단백질 (가령, HLA, MHC, B7 패밀리); 호밍 수용체; 수송 단백질; 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 (SOD); G-단백질 커플링된 수용체 단백질 (GPCRs); 신경조절성 단백질; 알츠하이머병 연관된 단백질과 펩티드 (가령, A-베타), 그리고 당분야에 공지된 다른 것들이 포함된다. 임의의 전술한 단백질과 폴리펩티드의 융합 단백질과 폴리펩티드, 키메라 단백질과 폴리펩티드뿐만 아니라 단편 또는 일부분, 또는 돌연변이체, 변이체, 또는 유사체 역시 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있는 적절한 단백질, 폴리펩티드와 펩티드에 포함된다.
차후 단리 및/또는 정제를 위한 단백질을 품고, 발현하고, 그리고 생산하는데 적합한 동물 또는 포유동물 숙주 세포의 무제한적 실례에는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 예를 들면, CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909; 그리고 WO 01/92337 A2), 디히드로엽산 환원효소 음성 CHO 세포 (CHO/-DHFR, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), 그리고 dp12.CHO 세포 (U.S. 특허 번호 5,721,121); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포 (COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); 인간 배아 신장 세포 (가령, 293 세포, 또는 현탁 배양 동안 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL-10); 원숭이 신장 세포 (CV1, ATCC CCL-70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); 생쥐 버팀 세포 (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL-75); 인간 간암 세포 (HEP-G2, HB 8065); 생쥐 유방 종양 세포 (MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포 (Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68); MCR 5 세포; FS4 세포가 포함된다.
본 발명의 방법과 공정을 이용한 배양에 적합한 세포는 예로써, 형질전환, 형질감염, 감염, 또는 주입을 거쳐 도입된 발현 벡터 (구조체), 예를 들면, 코딩 서열, 또는 이들의 일부분을 품고, 배양 공정에서 발현과 생산을 위한 단백질을 인코딩하는 플라스미드 등을 내포할 수 있다. 이런 발현 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사와 번역을 위한 필수 요소를 내포한다. 생산되는 단백질과 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 내포하는 발현 벡터뿐만 아니라 적절한 전사와 번역 제어 요소를 작제하기 위해, 당업자에게 충분히 알려져 있고 이들에 의해 실시되는 방법이 이용될 수 있다. 이들 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 그리고 생체내 유전자 재조합이 포함된다. 이런 기술은 J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 그리고 F. M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y에서 기술되고, 이들 모두 본원에 참고문헌으로 편입된다.
현탁 중인 또는 단층 배양 중인 포유동물 세포의 육성에 더하여, 본 발명의 배지와 방법은 바이러스를 포유동물 세포로부터 생산하기 위한 방법에 이용될 수도 있다. 본 발명의 이러한 양상에 따른 방법은 (a) 바이러스로 감염되는 포유동물 세포를 획득하는 단계; (b) 바이러스에 의한 세포의 감염을 촉진하는데 적합한 조건 하에, 세포를 바이러스와 접촉시키는 단계; 그리고 (c) 세포에 의한 바이러스의 생산을 촉진하는데 적합한 조건 하에, 세포를 본 발명의 배양 배지에서 육성하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라서, 세포는 본 발명의 배양 배지에서 세포의 육성에 앞서, 육성 동안 또는 육성 이후에, 바이러스와 접촉될 수 있다; 포유동물 세포를 바이러스로 감염시키기 위한 최적 방법은 당분야에 널리 알려져 있고 당업자에게 익숙할 것이다. 본 발명의 배지에서 현탁 육성된 바이러스-감염된 포유동물 세포는 본 발명의 배지에서 현탁 육성되지 않은 세포보다 높은 바이러스 역가 (가령, 2-, 3-, 5-, 10-, 20-, 25-, 50-, 100-, 250-, 500-, 또는 1000-배 높은 역가)를 산출할 것으로 기대된다. 이들 방법은 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 그리고 백신 제조 등을 위한 기타 바이러스가 포함되지만 이들에 국한되지 않은 다양한 포유동물 바이러스와 바이러스 벡터를 생산하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 배지에서 감염된 세포의 육성 이후에, 바이러스, 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 이들의 성분 (단백질 및/또는 핵산 (DNA 및/또는 RNA))을 포함하는 이용된 배양 배지는 백신 생산, 세포 형질감염 또는 유전자 요법에서 이용을 위한 바이러스 벡터의 생산, 동물 또는 세포 배양액의 감염, 바이러스 단백질 및/또는 핵산의 연구 등을 비롯한 다양한 목적에 이용될 수 있다. 대안으로, 바이러스, 바이러스 벡터, 바이러스 입자 또는 이들의 성분은 당업자에게 익숙한 단백질 및/또는 핵산 단리를 위한 기술에 따라, 이용된 배양 배지로부터 선택적으로 단리될 수 있다.
세포 배양의 유형
이해의 목적으로, 하지만 제한 없이, 단백질 생산을 위한 세포 배양액과 배양 작업은 3가지 일반적인 유형; 다시 말하면, 연속 배양, 배치 배양 및 유가 배양을 포함할 수 있는 것으로 당업자에 의해 인지될 것이다. 연속 배양에서, 예로써, 새로운 배양 배지 보충물 (즉, 사양 배지)이 배양 기간 동안 세포에 제공되는 반면, 오래된 배양 배지가 매일 제거되고, 그리고 산물이 예로써, 매일 또는 연속적으로 수확된다. 연속 배양에서, 사양 배지는 매일 첨가될 수 있고 연속적으로, 다시 말하면, 방울 또는 주입으로서 첨가될 수 있다. 연속 배양의 경우에, 세포는 이들 세포가 생존하여 남아있고 환경 조건과 배양 조건이 유지되기만 하면, 원하는 만큼 길게 배양 상태로 있을 수 있다.
배치 배양에서, 세포는 배지에서 초기에 배양되고, 그리고 상기 배지는 제거되거나, 대체되거나, 또는 보충되지 않는다, 다시 말하면, 세포는 배양 작업 동안 또는 배양 작업의 종결 이전에, 새로운 배지가 "사양"되지 않는다. 원하는 산물은 배양 작업의 종결 시점에서 수확된다.
유가 배양의 경우에, 배양 작업 시간이 배양 배지를 작업 동안 새로운 배지로 매일 (또는 연속적으로) 1회 또는 그 이상 보충함으로써 증가한다, 다시 말하면, 세포는 배양 기간 동안 새로운 배지 ("사양 배지")가 "사양"된다. 유가 배양은 앞서 기술된 바와 같은 다양한 사양 섭생과 시간, 예를 들면, 매일, 격일, 2일 마다, 기타 등등, 하루 1회 이상, 또는 하루 1회 이하 등을 포함할 수 있다. 게다가, 유가 배양은 사양 배지로 연속적으로 사양될 수 있다. 원하는 산물은 이후, 배양/생산 작업의 종결 시점에서 수확된다.
본 발명에 따라서, 세포 배양이 수행될 수 있고, 그리고 당단백질이 단백질의 대규모 또는 소규모 생산을 위한 조건 하에, 동물 또는 포유동물 세포 배양을 위해 전통적으로 이용되는 배양 용기 및/또는 배양 기구를 이용하여, 세포에 의해 생산될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 조직 배양 접시, T-플라스크 및 스피너 플라스크가 전형적으로, 실험실 규모에서 이용된다. 더욱 큰 규모 (가령, 500 L, 1000L, 2000L, 5000 L, 10000 L 등)에서 배양의 경우에, 발효기 타입 탱크 배양 장치, 에어 리프트 타입 배양 장치, 유동층 생물반응장치, 중공 섬유 생물반응장치, 회전병 배양, 교반된 탱크 생물반응장치 시스템, 충전층 타입 배양 장치, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적절한 장치가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 절차가 이용될 수 있다. 마이크로캐리어가 회전병 또는 교반된 탱크 생물반응장치 시스템과 함께 이용되거나 이용되지 않을 수 있다. 이들 시스템은 배치, 연속, 또는 유가 양식으로 작동될 수 있다. 이에 더하여, 이러한 배양 기구 또는 시스템은 필터, 중력, 원심력 등을 이용한 세포 분리기가 구비되거나 구비되지 않을 수 있다.
한 구체예에서, 세포 배양 기초 배지는 UVC 광에 노출되고, 이후 필요할 때까지 보관되고, 이 시점에서 추가의 포장이 세포 배양에서 이용에 앞서 UVC 노출된 기초 배지에 첨가될 것이다. 다른 구체예에서, 세포 배양 기초 배지는 자동화 공정의 일부로서 처리되고, 여기서 추가의 포장이 보관을 위한 중단 시간 없이 단계별 공정의 일부로서 UVC 노출된 기초 배지에 첨가된다. 당업자는 이러한 UVC 노출 공정이 일어날 수 있는 다양한 방식을 쉽게 계획할 것인데, 필수적인 단계는 기초 배지의 UVC 노출, 그 이후에 일정한 시점에서 추가의 포장의 첨가이다.
UV 광
용어 "자외선"은 x-선 영역 (100 nm)에서부터 가시 영역 (400 nm)까지 걸쳐있는 광의 전자기 스펙트럼의 섹션을 지칭한다. 특히, 자외선은 일반적으로, 4가지 세분으로 나눠진다: (1) 진공 자외선 -- 100 내지 200 nm의 파장을 가짐, (2) 자외선 C (UVC) -- 200 내지 280 nm의 파장을 가짐, (3) 자외선 B (UVB) -- 280 내지 315 nm의 파장을 가짐, 그리고 (4) 자외선 A (UVA) -- 315 내지 400 nm의 파장을 가짐. 한 구체예에서, 세포 배양 기초 배지는 세포 배양 배지를 배양 기구 (가령, 생물반응장치) 내로 도입하기에 앞서, UVC 광에 노출된다.
본 발명의 한 구체예에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지를 생물반응장치 내로 도입하기에 앞서, 200 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 275 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 270 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 265 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 더욱 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 260 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 255 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 250 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 245 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 240 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 235 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 한 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 230 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 225 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 220 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 215 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 210 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 200 nm 내지 205 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 205 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 더욱 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 210 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 215 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 더욱 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 220 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 225 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 230 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 235 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 240 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 245 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 250 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 255 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 더욱 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 260 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 한 구체예에서, 세포 배양 배지는 265 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 270 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 275 nm 내지 280 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 205 nm 내지 275 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 210 nm 내지 270 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 더욱 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 215 nm 내지 265 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 220 nm 내지 260 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 225 nm 내지 255 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 230 nm 내지 250 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 235 nm 내지 245 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 245 nm 내지 265 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 248 nm 내지 260 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 249 nm 내지 259 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 250 nm 내지 258 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 더욱 추가의 구체예에서, 세포 배양 배지는 251 nm 내지 257 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 252 nm 내지 256 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 253 nm 내지 255 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지를 생물반응장치 내로 도입하기에 앞서, 254 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 254 nm+/-1 nm의 파장, 또는 254 nm+/-2 nm의 파장, 또는 254 nm+/-3 nm의 파장, 또는 254 nm+/--4 nm의 파장, 또는 254 nm+/-5 nm의 파장, 또는 254 nm+/-6 nm의 파장, 또는 254 nm+/-7 nm의 파장, 또는 254 nm+/-8 nm의 파장, 또는 254 nm+/-9 nm의 파장, 또는 254 nm+/-10 nm의 파장, 또는 254 nm+/-15 nm의 파장, 또는 254 nm+/-20 nm의 파장, 또는 254 nm+/-25 nm의 파장을 갖는 UVC 광에 노출된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "에너지"는 처리된 세포 배양 배지가 노출되는 자외선 조사의 양 (밀리줄/cm2 또는 줄/미터2)을 지칭한다. 본 발명의 한 구체예에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지를 생물반응장치 내로 도입하기에 앞서, 25-350 mJ/cm2의 에너지 밀도에서, 더욱 바람직하게는 60-250 mJ/cm2의 에너지 밀도에서, 그리고 가장 바람직하게는 100-150 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출된다. 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지를 생물반응장치 내로 도입하기에 앞서, 125 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 125 mJ/cm2 +/-1 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-2 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-3 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-4 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-5 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-10 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-15 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-20 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-25 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-30 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-40 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-50 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-60 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-70 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-80 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-90 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-100 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-110 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-120 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 175 mJ/cm2 +/-1 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-2 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-3 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-4 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-5 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-10 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-15 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-20 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-25 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-30 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-40 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-50 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-60 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-70 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-80 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-90 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-100 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-110 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-120 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-130 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-140 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-150 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-160 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-170 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출된다.
에너지 밀도의 특정 실례가 제공될 때, 본원에서 개시된 방법에 이용될 수 있는 UVC 공급원은 목표 에너지 밀도 인근에서 일정한 범위의 에너지 밀도를 전달하는 것으로 명기된다; 이러한 범위의 에너지 밀도는 또한, "선량 분포 (dose distribution)"로서 지칭된다. 에너지 밀도 분포의 한 가지 특질은 에너지 밀도의 전개의 비대칭인데, 이것은 "높은 선량 꼬리"를 갖는다. 분포는 P10, P50, P90의 확률 측정 (probability measure), 그리고 평균을 이용하여 도출될 수 있다. P# 값은 #%의 유체 (가령, 배지)가 처리되는 선량 값을 설명한다. 따라서 60 mJ/cm2의 P10 값은 10%의 유체가 60 mJ/cm2 이하의 에너지 밀도를 수용했다는 것을 의미한다. 이러한 접근법은 UVC 노출 장치, 예를 들면, 본원에서 기술된 나선 UVC 반응장치에 적합하다.
개시된 방법의 다른 구체예에서, UVC 광을 전달하기 위해 층류 UVC 노출 장치 (가령, 박막 UVC 반응장치)가 이용될 수 있다. 층류 또는 박막 UVC 노출 장치가 이용될 때, 분포는 P10=1/2*평균, P90=2*평균으로 근사될 수 있다. 따라서 층류 또는 박막 UVC 노출 장치가 본원에서 기술된 조건 하에 이용되면, 분포는 P10~60, 평균=125 mJ/cm2 및 P90~250 mJ/cm2일 것이다.
상기 논의와 일관하게, UVC 광의 목표 에너지 밀도가 본 발명에서 제공될 때, 목표 에너지 밀도는 암묵적으로, 앞서 제공된 선량 분포 규칙에 의해 설명되는 선량의 범위를 구체화하는 것으로 명기된다. 더욱 구체적으로, 한 구체예에서, 목표 UVC 에너지 밀도는 에너지 밀도의 P10-P60 분포 내에 모든 에너지 밀도를 포함한다; 다른 구체예에서, 목표 UVC 에너지 밀도는 에너지 밀도의 P65 분포 내에 모든 에너지 밀도를 포함한다; 다른 구체예에서, 목표 UVC 에너지 밀도는 에너지 밀도의 P70 분포 내에 모든 에너지 밀도를 포함한다; 다른 구체예에서, 목표 UVC 에너지 밀도는 선량의 P75 분포 내에 모든 에너지 밀도를 포함한다; 다른 구체예에서, 목표 UVC 에너지 밀도는 에너지 밀도의 P80 분포 내에 모든 에너지 밀도를 포함한다; 다른 구체예에서, 목표 UVC 선량은 에너지 밀도의 P85 분포 내에 모든 에너지 밀도를 포함한다; 다른 구체예에서, 목표 UVC 에너지 밀도는 에너지 밀도의 P90 분포 내에 모든 에너지 밀도를 포함한다; 다른 구체예에서, 목표 UVC 에너지 밀도는 에너지 밀도의 P95 분포 내에 모든 에너지 밀도를 포함한다.
본 발명의 배경에서, UVC 에너지 밀도는 제공된 스칼라 범위 (scalar range) (가령, 125 mJ/cm2 +/-1 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-2 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-3 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-4 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-5 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-10 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-15 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-20 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-25 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-30 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-40 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-50 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-60 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-70 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-80 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-90 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-100 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-110 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 125 mJ/cm2 +/-120 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 본 발명의 다른 구체예에서, 175 mJ/cm2 +/-1 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-2 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-3 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-4 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-5 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-10 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-15 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-20 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-25 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-30 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-40 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-50 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-60 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-70 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-80 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-90 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-100 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-110 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-120 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-130 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-140 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-150 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-160 mJ/cm2의 에너지 밀도, 또는 175 mJ/cm2 +/-170 mJ/cm2의 에너지 밀도)를 이용하여 기술되거나, 또는 전술한 선량 분포 함수 (가령, 목표 에너지 밀도의 P10-60, P65, P70, P75, P80, P85, P90 및 P95의 범위 내에 에너지 밀도)를 이용하여 기술될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
UVC 노출 장치
본 발명의 세포 배양 배지와 방법은 세포 배양 기초 배지를 UVC에 노출하기 위한 임의의 장치, 시스템, 기구 또는 방법과 함께 이용될 수 있다. 장치의 무제한적 실례는 U.S. 특허 번호 7,651,660, U.S. 특허 번호 6,773,608, U.S. 특허 번호 6,596,230, U.S. 특허 번호 5,725,757, U.S. 특허 번호 5,707,594 및 U.S. 특허 출원 공개 번호 20040245164A1에서 찾아볼 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 세포 배양 배지와 방법은 나선 UV 반응장치와 함께 이용된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 세포 배양 배지와 방법은 층류 흐름 (또는 박막) UV 반응장치와 함께 이용된다.
기타 배지 처리
본원에서 제시된 세포 배양 배지와 방법은 세포 배양에 앞서, 배지를 멸균하거나 소독하기 위한 UVC 노출 이외의 처리 방법 또는 장치와 함께 이용될 수 있는 것으로 예기된다. 한 구체예에서, HTST가 본 발명의 배지와 방법과 공동으로 이용된다 (예로써, U.S. 특허 번호 7,420,183을 참조한다). 다른 구체예에서, pH의 조정 (가령, 4 미만으로)이 본 발명의 배지와 방법과 공동으로 이용된다.
한 구체예에서, 세포 배양 배지는 UVC 광에 노출된 이후, 여과 단계에 종속된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "무균 여과" 및 "무균 필터"는 표준 생물학적 무균 필터의 이용을 통해, 세포 배양 배지로부터 마이크로 플라스마 (micro plasma) 및 기타 잠재적 오염물질의 제거를 지칭한다. 본 발명의 한 구체예에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지를 생물반응장치 내로 도입하기에 앞서, 200 nm의 최대 크기의 구멍을 갖는 무균 필터에 통과된다.
다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 UVC 광에 노출 이전에 또는 노출 이후에, 심층 필터에 통과된다. 용어 "심층 필터"는 복수 여과 층을 갖는 필터를 지칭하고, 각 층은 상이한 크기와 밀도의 미립자 물질의 여과를 담당한다. 이러한 유형의 여과 공정은 크기 배제와 유사하다. 광 물질은 필터 베드의 상부에서 단리된다. 배지는 아래쪽 층에서 점진적으로 정제되고 짙어진다. 큰 현탁된 입자는 위쪽 층에서 제거되는 반면, 작은 입자는 아래쪽 층에 의해 제거된다.
다른 구체예에서, 세포 배양 배지는 바이러스를 비활성화시키는 화학물질, 예를 들면, 용매, 세정제, 프소랄렌, 또는 베타-프로피오락톤으로 처리된다.
추가 구체예
한 구체예에서, 본 발명은 UVC 광으로 처리 시에 배지의 부분적인 파괴를 보상하기 위해, UVC 광에 민감한 것으로 알려져 있거나 의심되는 과량의 배지 성분, 예를 들면, 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12 (cyanacobalamin)로 배지를 보충함으로써 바이러스-비활성화된 배지를 제공하는 방법을 제시한다.
본원에서 기술된 바와 같이, 다양한 통상의 배지 성분은 UVC 광에 노출 이후에, 분해되거나 생물학적으로 비활성화된다. 이러한 분해를 보상하기 위하여, UVC-매개된 분해에 민감한 배지 성분은 UVC 광에 노출 이후에, 이들 화합물의 적량을 제공하는 과잉의 양으로 배지 레시피에 첨가될 수 있다. 다시 말하면, UVC 노출에 의해 비활성화되는 소정의 배지 성분의 양은 배지가 상기 성분의 필요한 양을 갖도록, 일정한 양의 비활성화된 성분의 첨가에 의해 보충될 수 있다. 한 구체예에서, 성분은 UVC 노출에 앞서, 배지에 보충물로서 첨가될 수 있고, 다른 구체예에서, 성분은 UVC 노출 이후에, 배지에 보충물로서 첨가될 수 있다.
특정한 실례에서, UVC 광에 비활성화되는 것으로 알려져 있거나 의심되는 배지 성분이 확인된다. 이후, 배지 내에서 상기 성분의 최초 양이 확인된다. 별개로, 의도된 UVC 선량에 기초하여 분해되는 성분의 양에 관한 경험적 결정이 이루어진다. 대안으로, 이러한 결정은 상기 성분의 공지된 성질 (가령, 흡광도, 농도, UVC 선량 등)을 가이드로서 이용한 계산에 의해 이루어질 수 있다. 이후, 분해되는 것으로 예측되는 성분의 양이 무균 첨가 (가령, 상기 성분을 적절한 농도로 포함하는 무균 용액) 동안 배지에 첨가된다. 차후에, 보충된 배지는 UVC 광에 노출된다.
다른 특정한 실례에서, UVC 광에 의해 비활성화되는 것으로 알려져 있거나 의심되는 배지 성분이 확인된다. 이후, 배지 내에서 상기 성분의 최초 양이 확인된다. 별개로, 의도된 UVC 선량에 기초하여 분해되는 성분의 양에 관한 경험적 결정이 이루어진다. 대안으로, 이러한 결정은 상기 성분의 공지된 성질 (가령, 흡광도, 농도, UVC 선량 등)을 가이드로서 이용한 계산에 의해 이루어질 수 있다. 보충된 배지는 이후, UVC 광에 노출된다. 차후에, 분해되는 것으로 예측되는 성분의 양이 무균 첨가 (가령, 상기 성분을 적절한 농도로 포함하는 무균 용액) 동안 배지에 첨가된다.
본 발명을 기술함에 있어서, 하기 실시예는 예시로서 제공되고 본 발명을 한정하지 않는다.
실시예
모든 실시예에 대한 재료와 방법
재조합 인간 에리트로포이에틴은 UV 민감성 성분 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 그리고 비타민 B12, 그리고 메토트렉사트를 포함하는 DMEM/F12 기초 배지에서 배양된 CHO 세포주로부터 생산되었다.
이들 실험을 위한 UVC 처리된 배지와 대조 배지는 무균 등급 필터를 통해 이동되었다. 세포는 바이알로부터 해동되고 확대된 부피 회전병에서 정률 증가되고, 그 이후에 공정의 생산 국면을 위해 일련의 생물반응장치 내로 접종되었다.
이들 실험은 하기의 간격에서 3회 수확을 통해 수행되었다: 수확 1, 8일; 수확 2, 7일; 수확 3, 7일. 공정의 회전병 정률 증가 부분은 37.0℃의 설정값에서 작업되었다. 공정의 회전병 접종과 생산 부분은 36.0℃의 설정값에서 작업되었다.
UVC 처리는 60W/m2의 레이저 강도, 5 내지 20 시간당 리터 (LPH)의 유속을 갖는 나선 흐름 UVC 반응장치 (254 nm에서)를 이용하여 완결되었다. 배지는 원하는 조건에 대한 정확한 UVC 선량으로 처리되었다.
실시예 1
실험적 조건 - 실시예 1
조건 UVC 선량
( mJ / cm 2 ) 		UVC 처리 시기 설명
대조 N/A N/A
UVC 125 125 정률 증가,
접종, 생산		 모든 시기에서 1X 배지의 UVC 처리
UVC [2.5X] 125 125 정률 증가,
접종, 생산		 모든 시기에서 2.5X 배지의 UVC 처리
UVC 175 175 정률 증가,
접종, 생산		 모든 시기에서 1X 배지의 UVC 처리
UVC 125 (2.5X, 1X, 2.5X) 125 정률 증가,
접종, 생산		 정률 증가 동안 2.5X 배지, 접종에서 1X 배지, 그리고 생산 동안 2.5X 배지의 UVC 처리
UVC 125 (1X, 1X, 2.5X) 125 정률 증가,
접종, 생산		 정률 증가 동안 1X 배지, 접종에서 1X 배지, 그리고 생산 동안 2.5X 배지의 UVC 처리
특정한 공정 요구를 사정하고 UVC 배지 처리에 대한 공정의 견고함을 조사하기 위해 몇몇 다른 조건이 추가되었다. 제조 시설은 정률 증가 배지 및 농축된 생산 배지를 농축된 상태에서 제조하고, 그리고 공급 탱크 내로 운반 동안 인-라인 여과를 수행한다. 배지는 인-라인 필터를 통해 WFI 플러시를 이용하여 최종 1X 부피가 된다. 농축된 배지 및 1X UVC 처리된 배지의 다양한 조합이 본 실험에서 조사되었다.
결과
정률 증가 공정의 임의의 시기에서 세포 성장 또는 집단 배가에 대한 UVC 처리된 조건 및 대조 사이에 차이가 없었다. UVC 조건의 물질대사 데이터는 생산의 모든 수확에 걸쳐서 대조와 유사하였다. 수확 3에서 세포 부착은 모든 UVC 조건에 대해 대조와 유사하였다. 2.5X UVC 125mJ/cm2 조건은 다른 조건과 비교하여 약간 감소된 부착을 나타냈지만, 이것은 전면적인 생산에서 관찰되면 문제가 되지 않을 것으로 예상된다.
모든 UVC 배지 처리된 조건은 역가 감소를 나타냈다. 175mJ/cm2 조건은 수확의 전역에서 시종일관하게 더욱 낮은 역가를 나타냈다. 농축되면서 처리된 배지는 수확 3에서 역가에 대한 더욱 큰 효과를 갖는 것으로 보이긴 하지만, 이를 확증하기 위하여 더욱 많은 연구가 필요할 것이다.
대조 단독 및 UVC 처리된 2.5X 농축된 정률 증가 배지의 반복은 바이알 해동으로부터 가공 처리되었다. 다른 UVC 조건은 접종에서 처리를 시작하고, 생산 내내 지속한다. 이 시점에서 처리 시작은 바이알 해동으로부터 처리의 전형이다. 생산 역가 데이터는 도 1과 2에서 요약된다.
실시예 2
실험적 조건 - 실시예 2
조건 UVC 선량 (mJ/cm 2 ) UVC 처리 시기 설명
대조 N/A N/A
UVC 2.5X 125 125 정률 증가 성장 비교를 위해 정률 증가에서만
2.5X 농도에서 UVC 처리된 배지
UVC 50 [1X] 50 접종, 생산
UVC 75 [1X] 75 접종, 생산
본 실험은 2.5X 농축된 UVC 처리된 배지를 이용한 공정의 정률 증가 부분을 반복하고, 그리고 공정의 접종과 생산 부분 동안 더욱 낮은 UVC 선량을 사정하기 위해 수행되었다. 기존 실험은 산물 역가가 UVC 선량과 상관된다는 것을 암시하였고, 따라서 75mJ/cm2와 50mJ/cm2의 더욱 낮은 선량이 조사되었다.
결과
모든 UVC 처리된 조건에 대한 생산의 전환 및 각 수확에서 물질대사 데이터는 대조와 필적하였다. 산물 역가는 이들 2가지 UVC 처리로 용량 의존성 감소를 증명하였다. 산물 역가 데이터는 도 3과 4에서 요약된다.
실시예 3
다양한 세포 배양 배지 처리 조건이 본 에포에틴 알파 배지 처리 실험에서 연구되었다. 연구된 배지 처리 기술에는 고온 순간 살균 (HTST), 자외선-C (UVC) 및 바이러스 여과 (VF)가 포함되었다. 이들 처리는 회전병 (RB) 접종에서 시작하여 생산 내내 적용되었다. 각 조건은 수확되고 정제되었다. 모든 새로운 UVC 처리 조건은 현재의 배지의 UVC 처리 (조건 2)로 관찰된 감소된 역가를 교정하였다. 모든 처리된 조건은 또한, 대조 조건 (조건 1과 10)과 비교하여 전환에서 유사한 세포 성장과 생존능을 보였다. 일부 산물 품질 차이, 예를 들면, 대조에 비하여 더욱 낮은 SE-HPLC % 단위체가 관찰되었다.
배지 처리 조건
표 3에서는 생산 동안 이용된 다양한 용액에 적용된 배지 처리 조건을 제시한다. 상기 표의 처리 칼럼 하에 합병된 셀은 처리 기술이 조제된 양쪽 성분에 함께 적용된다는 것을 지시한다; 상기 표의 처리 칼럼 하에 별개의 셀은 처리 기술이 각 성분에 별개로 적용된다는 것을 지시한다.
Figure pct00001
DMEM = 현재의 배지
DMEM_S = UVC 민감성 성분을 갖는 추가의 포장
DMEM_B = UVC 민감성 성분이 없는 새로운 기초 배지
UVC = 자외선 - C
HTST = 고온 순간 살균
VF = 바이러스 여과
FBS = 소 태아 혈청
조건 6-9는 UVC 처리되고, 그 이후에 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12를 포함하는 추가의 포장이 첨가된 새로운 기초 배지를 이용한다.
125 mJ/cm2의 각 조건에 대한 목표 평균 UVC 선량은 정밀하게 달성되지 않았다. 이것은 최초 평균 선량 모델에서 형광 강도의 가변성에 기인하였다. 더욱 정밀한 선량 분포 모델이 차후에 개발되고 평균과 백분율 (10, 50과 90) 선량을 보고하는데 이용되었다. 나선 UVC 반응장치 단위에 의해 전달된 평균 선량은 목표보다 낮았다. 현재의 배지 (조건 2)의 정량 이하 (under-dosing)는 감소된 역가를 여전히 유발하였는데, 이것은 낮게는 50 내지 75 mJ/cm2의 선량에 대해 역가 충격 (titer impact)을 입증하는 기존 연구 결과와 일치한다.
생산성 결과는 도 5에 제공된다. 처리 조건 3, 4 및 6 내지 9는 작용 한계 내에서 유사한 생산성을 갖고, 따라서 현재의 배지의 UVC 처리 (조건 2)로 관찰된 역가 감소를 교정하는데, 이것은 수확 2와 3에 대한 모든 다른 조건보다 대략 15-20% 낮고, 그리고 기존 연구 결과와 일치한다. 새로운 배지 대조, 조건 5에 대한 결과는 현재의 배지 대조 1과 10과 일치하였다.

Claims (28)

  1. 하기를 포함하는 세포 배양 배지:
    a. UVC 광에 노출되는 기초 배지; 그리고
    b. UVC 노출 후 상기 기초 배지에 첨가되는 UV 민감성 배지 성분을 포함하는 추가의 포장.
  2. 청구항 1에 있어서, 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함하지 않는 것인 세포 배양 배지.
  3. 청구항 1에 있어서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함하는 것인 세포 배양 배지.
  4. 청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 있어서, 기초 배지는 분말 또는 액상 형태이고, 그리고 상기 추가의 포장은 분말 또는 액상 형태인 것인 세포 배양 배지.
  5. 청구항 1에 있어서, 배지는 포유동물 세포의 배양에 적합한 것인 세포 배양 배지.
  6. 청구항 1에 있어서, 배지는 곤충 세포의 배양에 적합한 것인 세포 배양 배지.
  7. UVC 노출된 세포 배양 배지 제제를 제조하기 위한 방법에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    a. 기초 배지를 UVC 광에 노출하는 단계;
    b. UV 민감성 성분을 포함하는 추가의 포장을 상기 UVC 노출된 기초 배지에 첨가하는 단계.
  8. 청구항 7에 있어서, 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함하지 않는 것인 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 추가의 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 7 내지 9중 어느 한 항에 있어서, UVC 광은 약 254nm의 파장에 있는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 기초 배지는 약 25 내지 약 350 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출되는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 기초 배지는 약 125 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출되는 것인 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 기초 배지는 약 175 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출되는 것인 방법.
  14. 청구항 7에 있어서, 기초 배지를 UVC 광에 노출하는 단계는 기초 배지 내에 임의의 비-외피보유 바이러스의 핵산을 손상시키는데 충분한 것인 방법.
  15. 청구항 7에 있어서, UVC 광은 박막 UVC 반응장치를 이용하여 전달되는 것인 방법.
  16. 청구항 7에 있어서, UVC 광은 나선 UVC 반응장치를 이용하여 전달되는 것인 방법.
  17. 단백질을 생산하기 위한 방법에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    a. 기초 배지를 UVC 광에 노출하는 단계;
    b. UV 민감성 배지 성분을 포함하는 추가의 포장을 상기 UVC 노출된 기초 배지에 첨가하는 단계; 그리고
    c. 원하는 단백질이 생산되도록, 세포를 UVC 처리된 배지에서 배양하는 단계.
  18. 청구항 17에 있어서, 기초 배지는 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함하지 않는 것인 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 포장은 리포산, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 엽산, 니아신아미드, 피리독살, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 메토트렉사트, 그리고 비타민 B12로 구성된 군에서 선택되는 적어도 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 또는 13가지 성분을 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 17 내지 19중 어느 한 항에 있어서, UVC 광은 약 254nm의 파장에 있는 것인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 배지는 약 25 내지 약 350 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출되는 것인 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 기초 배지는 약 125 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출되는 것인 방법.
  23. 청구항 21에 있어서, 기초 배지는 약 175 mJ/cm2의 에너지 밀도에서 UVC 광에 노출되는 것인 방법.
  24. 청구항 17에 있어서, 기초 배지를 UVC 광에 노출하는 단계는 기초 배지 내에 임의의 비-외피보유 바이러스의 핵산을 손상시키는데 충분한 것인 방법.
  25. 청구항 17에 있어서, 세포는 CHO 세포인 것인 방법.
  26. 청구항 17에 있어서, 단백질은 재조합 인간 에리트로포이에틴인 것인 방법.
  27. 청구항 17에 있어서, UVC 광은 박막 UVC 반응장치를 이용하여 전달되는 것인 방법.
  28. 청구항 17에 있어서, UVC 광은 나선 UVC 반응장치를 이용하여 전달되는 것인 방법.
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