JP2014506482A - Uvc露光のための細胞培養培地およびそれに関連した方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、紫外線C(UVC)光露光への露光に最適化された細胞培養培地および関連した方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本願は、2011年2月23日に出願された米国仮出願第61/445,988号の利益を主張し、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
本願は、2011年2月23日に出願された米国仮出願第61/445,988号の利益を主張し、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、紫外線C(UVC)光露光への露光に最適化された細胞培養培地およびそれに関連した方法に関する。
薬学的製品の製造に用いられる細胞培養培地の滅菌は、バイオバーデンを防ぐために、高品質の薬学的製品を生成するプロセスの一部として重要なステップである。これは、一般的に、滅菌等級濾過(0.2または0.1ミクロンの絶対定格濾過)により達成される。細胞培地および上清のマイコプラズマ属およびウイルスの汚染もまた、世界中の生物薬剤の製薬業者に大きな課題をもたらす。大きなもしくは小さなエンベロープもしくは非エンベロープ(または「裸」)DNAまたはRNAウイルス粒子を不活性化し、および/または該ウイルス粒子を溶液から除去するために、幾つかの方法が用いられている。これらのアプローチの例には、濾過(ナノ、ウイルス、または0.1ミクロン)、クロマトグラフィー、バッチ熱処理、流水式高温短時間(HTST)、ガンマ線照射、低pHおよび化学的不活性化(溶媒、洗浄剤)、ならびにバッチまたは流水式紫外線光C(UVC)が含まれる。HTSTは、ウイルスの制御において実績のある方法であるが、血清等のタンパク質成分を含有する細胞培養培地へ悪影響を与える。さらに、ウイルス粒子を不活性化するための化学的処理が、しばしばこれらの化学物質の毒性性質が、薬剤製造におけるそれらの使用を制限しはするが、用いられている。さらに、HTSTは、工場設備において専用かつ統合された基礎設備を必要とし、これは薬学的および治療的薬剤の製造を企図する場合に考慮すべき事項であり得る。
上記技術に加えて、細胞上清からこれらのタンパク質を精製する前に大きなタンパク質調製物を処理するためにUVC技術が用いられている。例えば、米国特許出願公開第20100203610A1号を参照のこと。UVC技術は、望ましくない生物のDNA/RNAを攪乱するために、紫外線波長範囲のスペクトルにおける光の特性に依存する。UVC線量であると見なされるUVC処理の強度は、光束の強度および液体がUVC光源に露光される時間によって決定される。提供されるUVC線量は、所望の生物の有効な不活性化に十分である必要があるが、線量が高すぎて、標的タンパク質の生成および品質を含むロバストなプロセスに必要とされる溶液の成分を攪乱するべきではない。培地のUVC処理はウイルス不活性化に有効な手段であるが、本発明者は、増殖する前にUVC光に露光された培地で増殖した細胞が、UVC光に露光されていない培地と比較して減少したタンパク質力価を生成することを見出した。
それ故に、薬剤製造で用いる、UVCを処理することができる細胞培養培地、およびUVCにより細胞培養培地を処理するための方法が当該技術分野において必要である。そのような方法は、貴重な細胞系をウイルス汚染から防ぎ、汚染された使用不可能な培地の結果として失われる経費を節約し、そのような細胞系によるタンパク質生成の効率を高めるのに特に有用であり得る。したがって、そのような方法の開発は、生物薬剤の製造において広い用途を有し得る。
(a)UVC光に露光される基本培地と、(b)UVC露光後、該基本培地に添加されるUV感受性培地成分を含む添加剤パッケージと、を含む、細胞培養培地が本明細書に提供される。一実施形態では、基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含まない。別の実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含む。更なる実施形態では、基本培地は、粉末または液体形態であり、添加剤パッケージは、粉末または液体形態である。なお別の実施形態では、培地は、哺乳動物細胞の培養に適しているが、一方、さらに別の実施形態では、培地は、昆虫細胞の培養に適している。
また、UVCに露光された細胞培養培地製剤を作製するための方法も、本明細書に提供され、該方法は、(a)基本培地をUVC光に露光するステップと、(b)UV感受性成分を含む添加剤パッケージを該UVCに露光された基本培地に添加するステップと、を含む。一実施形態では、基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含まない。更なる実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含む。別の実施形態では、UVC光は、約254nmの波長である。更なる実施形態では、基本培地は、約25〜約350mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される。なお別の実施形態では、基本培地は、約125mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光され、一方、更なる実施形態では、基本培地は、約175mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される。さらに別の実施形態では、基本培地をUVC光に露光する該ステップは、基本培地中のいずれかの非エンベロープウイルスの核酸を損傷するのに十分である。別の実施形態では、UVC光は、薄膜UVC反応器を用いて送達され、一方、更なる実施形態では、UVC光は、螺旋UVC反応器を用いて送達される。
また、タンパク質を生成するための方法が、本明細書に提供され、該方法は、(a)基本培地をUVC光に露光するステップと、(b)UV感受性培地成分を含む添加剤パッケージを該UVCに露光された基本培地に添加するステップと、(c)所望のタンパク質が生成されるように該UVCで処理された培地中で細胞を培養するステップと、を含む。一実施形態では、基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含まない。更なる実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含む。別の実施形態では、UVC光は、約254nmの波長である。更なる実施形態では、基本培地は、約25〜約350mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される。なお別の実施形態では、基本培地は、約125mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光され、一方、更なる実施形態では、基本培地は、約175mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される。さらに別の実施形態では、基本培地をUVC光に露光するステップは、基本培地中のいずれかの非エンベロープウイルスの核酸を損傷するのに十分である。別の実施形態では、UVC光は、薄膜UVC反応器を用いて送達され、一方、更なる実施形態では、UVC光は、螺旋UVC反応器を用いて送達される。一実施形態では、細胞は、CHO細胞である。更なる実施形態では、タンパク質は、組換えヒトエリスロポエチンである。
本明細書で使用される項の見出しは、構成目的のためのみであり、そこに記載される主題を限定するように解釈されるべきではない。本出願において言及されるすべての参照は、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。本明細書に特に規定されない限り、本発明に関連して使用される科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により特に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
本発明は、UVCで処理することができる細胞培養培地の当該技術分野における必要性に取り組む。本発明の新規製剤および方法を開発する場合に、幾つかの障害を克服しなければならなかった。元の培地から開始して、UV感受性成分を元の培地から除去することによって、安定した新しい基本培地の製剤化を試みた。しかしながら、全く予想しなかったが、UV感受性成分を元の培地から除去することにより、UV感受性成分を含まない新しい基本培地と、UV感受性成分を含む添加剤パッケージとの両方において、ある特定の不安定かつ溶解性の問題をもたらすことが見出された。
別々の混合物の挙動を予測できないことは、混合物内の多くの構成物質の中およびその間の化学的相互作用に由来する。より具体的には、添加剤パッケージを用いた溶解性の問題は、自己緩衝系におけるプロトンの相互作用に由来すると考えられている。さらに、新しい基本培地および添加剤パッケージを用いる不安定性の問題はまた、UVC放射線への露光によって生成され得る、活性酸素種等を通じて他の相互作用に由来し得る。
予想外に、添加剤パッケージが安定していなかったことを見出した。添加剤パッケージは、元来、元の基本培地から除去された場合に、可溶性でも、熱的に安定していなかった。元の培地と同様の安定性を回復するために、滴定剤を添加することによって、混合物のpHを調節して、可溶性で安定にすることが必要であった。
更に予想外の順守が、UVで処理した場合にUV感受性成分を含まない新しい基本培地における相互作用に関与し、基本培地の主な成分への損傷をもたらした。添加剤パッケージ内の成分が、通常、元の培地中の反応種を反応停止させ、それによって、UVからそれを防ぐため、この損傷は、予測可能でない。可能性のある反応停止剤が添加剤パッケージ内に入れられるため、新しい基本培地内に存在しない可能性のある反応停止剤の非限定例には、ピリドキサルおよびピリドキサルが含まれる。更なる反応停止剤の不在により損傷され得る新しい基本培地内に残留する反応停止剤の非限定例には、ピルビン酸塩が含まれる。更なる反応停止剤の不在により損傷され得る新しい基本培地内に残留する主な成分の非限定例には、ウシ胎仔血清タンパク質が含まれる。
しかしながら、驚いたことには、添加剤パッケージは、複合混合物(例えば、元の基本培地)のようなある特定の態様において自己安定化される。添加剤パッケージの天然pHは、約6.7であり、これは基本培地とほぼ同一である。
更なる予想外の効果は、UVC反応器の種類および関連した線量分布に関与する。幾つかのプロセスのUVC反応器、例えば、層流および薄膜反応器は、広範な線量分布をもたらし、一般的には、高線量テールを有する。新しい培地は、この広範な分布(および露光過度)を受けるが、驚くべきことに、力価改善によって証明されるように著しく損傷しない。先行研究は、薄膜反応器と比較して、蜜な線量分布を生じる螺旋UVC反応器を使用した。これらの研究は、UVC処理が、力価(産物濃度)の減少をもたらすことを示した。元の培地が薄膜UVCで処理された場合、結果は、全プロセスの失敗、すなわち、ローラーボトルへの細胞付着の完全な欠如および細胞増殖の欠如であった。
したがって、一態様では、本発明は、UVC露光に適している細胞培養培地を提供し、該培地は、基本培地と、UVC露光後、基本培地に添加されるUV感受性培地成分を含む添加剤パッケージと、を含む。更なる態様では、本発明は、UVCに露光された細胞培養培地製剤を作製するための方法を更に提供し、該方法は、基本培地を製剤化するステップと、基本培地をUVC光に露光するステップと、UV感受性成分を含む添加剤パッケージをUVCに露光された基本培地に添加するステップと、を含む。別の態様では、本発明は、タンパク質を生成するための方法を更に提供し、該方法は、基本培地をUVC光に露光するステップと、UV感受性培地成分を含む添加剤パッケージをUVCに露光された基本培地に添加するステップと、所望のタンパク質が生成されるようにUVCで処理された培地中で細胞を培養するステップと、を含む。
UV感受性培地成分
以下の本明細書でさらに論じられるように、細胞培養培地は、インビトロ設定における細胞増殖を支持する多くの異なる成分を含む。ある特定の培地成分は、UVC光に感受性があり、UVC光に露光される場合に分解されることが見出されている。これは、同様に、細胞培養物からのタンパク質生成の低下をもたらす。細胞培養培地のUVC処理で観察されるタンパク質産物力価へのこの有害な影響を克服するために、UVC露光に適している新しい基本培地が必要とされる。したがって、本発明の目的は、UV感受性成分を含まない基本培地と、UV感受性成分を含む添加剤パッケージとを提供することである。本明細書で使用されるとき、「基本培地」とは、ある特定のUV感受性成分を含まない、液体、粉末、または他の形態の細胞培養培地を指す。本明細書で使用されるとき、「添加剤パッケージ」とは、基本培地がUVC光に露光された後に、基本培地に添加されるべき、液体、粉末、または他の形態のUV感受性成分(複数可)を指す。
以下の本明細書でさらに論じられるように、細胞培養培地は、インビトロ設定における細胞増殖を支持する多くの異なる成分を含む。ある特定の培地成分は、UVC光に感受性があり、UVC光に露光される場合に分解されることが見出されている。これは、同様に、細胞培養物からのタンパク質生成の低下をもたらす。細胞培養培地のUVC処理で観察されるタンパク質産物力価へのこの有害な影響を克服するために、UVC露光に適している新しい基本培地が必要とされる。したがって、本発明の目的は、UV感受性成分を含まない基本培地と、UV感受性成分を含む添加剤パッケージとを提供することである。本明細書で使用されるとき、「基本培地」とは、ある特定のUV感受性成分を含まない、液体、粉末、または他の形態の細胞培養培地を指す。本明細書で使用されるとき、「添加剤パッケージ」とは、基本培地がUVC光に露光された後に、基本培地に添加されるべき、液体、粉末、または他の形態のUV感受性成分(複数可)を指す。
一実施形態では、基本培地は、粉末形態であり、添加剤パッケージは、粉末形態である。別の実施形態では、基本培地は、粉末形態であり、添加剤パッケージは、液体形態である。なお別の実施形態では、基本培地は、液体形態であり、添加剤パッケージは、粉末形態である。別の実施形態では、基本培地は、液体形態であり、添加剤パッケージは、液体形態である。
一実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12(シアノコバラミン)からなる群から選択される少なくとも1個の成分を含まない液体培地である。別の実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも2個の成分を含まない液体培地である。一実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも3個の成分を含まない液体培地である。更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも4個の成分を含まない液体培地である。なお更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも5個の成分を含まない液体培地である。また更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも6個の成分を含まない液体培地である。一実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも7個の成分を含まない液体培地である。なお別の実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも8個の成分を含まない液体培地である。更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも9個の成分を含まない液体培地である。また更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも10個の成分を含まない液体培地である。なお別の実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも11個の成分を含まない液体培地である。一実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも12個の成分を含まない液体培地である。さらに別の実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12を含まない液体培地である。
一実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個の成分を含まない粉末培地である。別の実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも2個の成分を含まない粉末培地である。なお別の実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも3個の成分を含まない粉末培地である。さらに別の実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも4個の成分を含まない粉末培地である。更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも5個の成分を含まない粉末培地である。なお更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも6個の成分を含まない粉末培地である。また更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも7個の成分を含まない粉末培地である。なお別の実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも8個の成分を含まない粉末培地である。さらに別の実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも9個の成分を含まない粉末培地である。別の実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも10個の成分を含まない粉末培地である。更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも11個の成分を含まない粉末培地である。なお更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも12個の成分を含まない粉末培地である。また更なる実施形態では、UVC露光に適している基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12を含まない粉末培地である。
一実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個の成分を含む液体である。別の実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも2個の成分を含む液体である。さらに別の実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも3個の成分を含む液体である。なお別の実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも4個の成分を含む液体である。また更なる実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも5個の成分を含む液体である。更なる実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも6個の成分を含む液体である。また更なる実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも7個の成分を含む液体である。一実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも8個の成分を含む液体である。別の実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも9個の成分を含む液体である。なお別の実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも10個の成分を含む液体である。さらに別の実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも11個の成分を含む液体である。なお更なる実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも12個の成分を含む液体である。別の実施形態では、添加剤パッケージは、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12を含む液体である。
一実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個の成分を含む。さらに別の実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも2個の成分を含む。一実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも3個の成分を含む。また更なる実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも4個の成分を含む。なお別の実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも5個の成分を含む。さらに別の実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも6個の成分を含む。なお別の実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも7個の成分を含む。更なる実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも8個の成分を含む。なお別の実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも9個の成分を含む。また更なる実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも10個の成分を含む。なお別の実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも11個の成分を含む。さらに別の実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも12個の成分を含む。別の実施形態では、添加剤パッケージは、粉末であり、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12を含む。
更なる実施形態では、本発明は、UVC露光に適している基本培地と、添加剤パッケージと、を含むキットに関する。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個の成分を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加する。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも2個の成分を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも4個の成分を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも5個の成分を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも6個の成分を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも7個の成分を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも8個の成分を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも9個の成分を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも10個の成分を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも11個の成分を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも12個の成分を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12を更に含み、これらをUVCに露光された基本培地に添加する。
UV感受性成分の濃度の以下の説明において、特定の濃度および濃度の範囲は、1倍培地の最終濃度である。当業者は、2倍培地溶液(すなわち、所定の濃度および範囲の2倍)、3倍培地溶液(すなわち、所定の濃度の3倍)等の必要な濃度を容易に想定し得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、葉酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.1〜約10.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、葉酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.5〜約5.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、葉酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.0〜約3.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、葉酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.0〜約3.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、葉酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.0mg/Lの濃度を得る。更なる実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、葉酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.5mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、葉酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約3.0mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.0〜約100.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約10.0〜約90.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約10.0〜約80.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約10.0〜約70.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約15.0〜約55.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約20.0〜約50.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約25.0〜約40.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約25.0〜約35.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約30.0〜約35.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約30.0〜約33.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約31.0〜約32.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約31.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約32.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ヒスチジンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約31.5mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.0〜約100.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約10.0〜約90.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約10.0〜約80.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約10.0〜約70.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約15.0〜約55.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約20.0〜約50.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約25.0〜約40.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約30.0〜約40.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約32.0〜約38.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約34.0〜約36.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約35.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約36.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、フェニルアラニンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約35.5mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、トリプトファンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.1〜約50.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、トリプトファンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.0〜約20.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、トリプトファンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約5.0〜約15.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、トリプトファンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約8.0〜約12.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、トリプトファンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約8.0〜約10.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、トリプトファンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約8.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、トリプトファンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約8.5mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、トリプトファンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約9.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、トリプトファンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約9.5mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.0〜約100.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約10.0〜約90.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約20.0〜約80.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約30.0〜約70.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約40.0〜約60.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約50.0〜約60.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約53.0〜約57.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約54.0〜約56.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約55.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約55.5mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チロシンを更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約60.0mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.01〜約10.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.05〜約5.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.08〜約0.12mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸を更に含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.100〜約0.110mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.101〜約0.107mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.102〜約0.104mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.102mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.103mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リポ酸を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.104mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ナイアシンアミドを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.1〜約10.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ナイアシンアミドを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.5〜約5.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ナイアシンアミドを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.0〜約3.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ナイアシンアミドを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.5〜約2.5mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ナイアシンアミドを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.5mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ナイアシンアミドを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ナイアシンアミドを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.5mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキサルを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.1〜約10.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキサルを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.5〜約5.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキサルを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.0〜約3.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキサルを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.5〜約2.5mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキサルを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.5mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキサルを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキサルを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.5mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキシンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.0001〜約1mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキシンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.001〜約0.1mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキシンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.010〜約0.050mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキシンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.020〜約0.040mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキシンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.025〜約0.035mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキシンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.030〜約0.035mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキシンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.030〜約0.032mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキシンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.030mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキシンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.031mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ピリドキシンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.032mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.01〜約10.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.05〜約5.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.1〜約1.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.1〜約0.5mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.1〜約0.3mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.15〜約0.25mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.20〜約0.23mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.21〜約0.22mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.210mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.213mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.216mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、リボフラビンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.219mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チアミンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.1〜約10.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チアミンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.5〜約5.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チアミンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.0〜約3.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チアミンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約1.5〜約2.5mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チアミンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.0〜約2.3mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チアミンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.1〜約2.2mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チアミンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チアミンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.1mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、チアミンを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約2.2mg/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、メトトレキサートを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.0000001〜約0.001g/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、メトトレキサートを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.000001〜約0.0001g/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、メトトレキサートを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.00001〜約0.0001g/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、メトトレキサートを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.00001〜約0.00005g/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、メトトレキサートを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.00002〜約0.00004g/Lの濃度を得る。
別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、メトトレキサートを含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.00003g/Lの濃度を得る。
一実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.01〜約10.0mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.05〜約5.0mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.1〜約1.0mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.3〜約0.8mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.5〜約0.75mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.6〜約0.7mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.65〜約0.70mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.67〜約0.69mg/Lの濃度を得る。なお別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.67mg/Lの濃度を得る。さらに別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.68mg/Lの濃度を得る。別の実施形態では、UVC光に露光された基本培地は、ビタミンB12を含み、これをUVCに露光された基本培地に添加して、約0.69mg/Lの濃度を得る。
細胞、タンパク質、および細胞培養
一般に、細胞培養培地は、「基本培地」として本明細書で相互交換可能に称される、基本溶液または「基礎培地」を含有し、これに所望の成分のすべてが添加される。本発明の文脈において、「基本培地」は、ある特定のUV感受性成分を含まない細胞培養培地を指す。以下に記載される基本培地は、概して、UV感受性成分を含むが、任意に、ある特定のUV感受性成分を含まないように製剤化され得ることが理解されよう。例えば、RPMI1640が、本明細書で基本培地として開示される場合、それが、他の場合では一般に、RPMI1640中に見出されるある特定のUV感受性成分を、任意に含まない場合があることが理解されよう。
一般に、細胞培養培地は、「基本培地」として本明細書で相互交換可能に称される、基本溶液または「基礎培地」を含有し、これに所望の成分のすべてが添加される。本発明の文脈において、「基本培地」は、ある特定のUV感受性成分を含まない細胞培養培地を指す。以下に記載される基本培地は、概して、UV感受性成分を含むが、任意に、ある特定のUV感受性成分を含まないように製剤化され得ることが理解されよう。例えば、RPMI1640が、本明細書で基本培地として開示される場合、それが、他の場合では一般に、RPMI1640中に見出されるある特定のUV感受性成分を、任意に含まない場合があることが理解されよう。
一般に、「細胞を培養する培地」(「培養培地」、「細胞培養培地」、または「組織培養培地」とも称される)は、細胞、例えば、動物または哺乳動物細胞が増殖し、概して、以下の少なくとも1個以上の成分を提供する栄養溶液を指すことが当業者によって理解され、知られている用語である:エネルギー源(通常、グルコース等の炭水化物の形態で);すべての必須アミノ酸、および概して、20種の塩基性アミノ酸+システイン;ビタミンおよび/もしくは一般的には低濃度で必要とされる他の有機化合物;脂質もしくは遊離脂肪酸、例えばリノール酸;ならびに、微量元素、例えば、一般的に、非常に低濃度で、通常、ミクロモル範囲で必要とされる無機化合物または天然元素。細胞培養培地はまた、様々な任意の成分、例えば、ホルモンおよび他の成長因子、例えば、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、血清等;塩、例えばカルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩、ならびに緩衝液、例えばHEPES;ヌクレオシドおよび塩基、例えばアデノシン、チミジン、ヒポキサンチン;ならびにタンパク質および組織加水分解物、例えば加水分解動物タンパク質(動物副産物、精製ゼラチン、または植物材料から得ることができるペプトンまたはペプトン混合物);抗生物質、例えばゲンタマイシン;ならびに細胞保護剤、例えばPluronicポリオール(Pluronic F68)を含むように添加することもできる。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、無血清であり、動物起源の産物または成分を含まない。
当業者により理解されるように、動物または哺乳動物細胞は、培養される特定の細胞に適しており、過度な実験を行うことなく当業者によって決定され得る培地中で培養される。市販の培地を利用することができ、Iscove改変ダルベッコ培地、RPMI1640、最小必須培地α(MEM-α)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、DME/F12、αMEM、基礎培地イーグル+イーグルの緩衝生理食塩溶液、DMEM高グルコース(グルタミン含有)、DMEM高グルコース(グルタミン不含)、DMEM低グルコース(グルタミン不含)、DMEM:F12 1:1(グルタミン含有)、GMEM(グラスゴーMEM)、GMEM(グルタミン含有)、グレース完全昆虫培地、グレース昆虫培地(FBS不含)、ハムF−10(グルタミン含有)、ハムF−12(グルタミン含有)、IMDM(HEPEおよびグルタミン含有)、IMDM(HEPES含有するが、グルタミン不含)、IP41昆虫培地、15(Leibovitz)(2X)(グルタミンまたはフェノールレッド不含)、15(Leibovitz)(グルタミン不含)、マッコイ5A改変培地、培地199、MEMイーグル(グルタミンまたはフェノールレッド(2X)不含)、MEMイーグル−イーグルの緩衝生理食塩溶液(グルタミン含有)、MEMイーグル−イーグルの緩衝生理食塩溶液(グルタミン不含)、MEMイーグル−ハンクス緩衝生理食塩溶液(グルタミン不含)、NCTC−109(グルタミン含有)、RichterのCM培地(グルタミン含有)、RPMI1640(HEPES、グルタミン、および/もしくはペニシリン−ストレプトマイシン含有)、RPMI1640(グルタミン含有)、RPMI1640(グルタミン不含)、Schneiderの昆虫培地、あるいは当業者に知られている任意の他の培地が挙げられるが、これらに限定されず、これらは特定細胞種について製剤化される。必要または所望に応じて、および当業者によって知られており、日常的な技術を用いて実施されるように、前述の例示的な培地に、適切な濃度または量の任意の成分を含む、追加成分または構成要素を添加することができる。
さらに、本発明の方法に適している細胞培養条件は、細胞のバッチ、供給バッチ、または連続培養に一般的に使用され、知られているものであり、pH、溶解酸素(O2)および二酸化炭素(CO2)、撹拌および湿度、ならびに温度に注意を払う。
本発明の組成物は、様々な細胞を培養するために使用することができる。一実施形態では、この培地を用いて、植物および/または動物細胞等の真核細胞を培養する。これらの細胞は、哺乳動物細胞、魚細胞、昆虫細胞、両生類細胞、または鳥類細胞であり得る。この培地を用いて、MK2.7細胞、PER−C6細胞、CHO細胞、HEK293細胞、COS細胞およびSp2/0細胞、5L8ハイブリドーマ細胞、Daudi細胞、EL4細胞、HeLa細胞、HL−60細胞、K562細胞、Jurkat細胞、THP−1細胞、Sp2/0細胞、一次上皮細胞(例えば、ケラチン生成、頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、および網膜上皮細胞)、樹立した細胞株およびそれらの菌株(例えば、293胚腎臓細胞、BHK細胞、HeLa頸部上皮細胞、およびPER−C6網膜細胞、MDBK(NBL−1)細胞、911細胞、CRFK細胞、MDCK細胞、BeWo細胞、Chang細胞、Detroit562細胞、HeLa229細胞、HeLa S3細胞、Hep−2細胞、KB細胞、LS180細胞、LS174T細胞、NCI−H−548細胞、RPMI2650細胞、SW−13細胞、T24細胞、WI−28 VA13、2RA細胞、WISH細胞、BS−C−I細胞、LLC−MK2細胞、クローンM−3細胞、1−10細胞、RAG細胞、TCMK−1細胞、Y−1細胞、LLC−PK1細胞、PK(15)細胞、GH1細胞、GH3細胞、L2細胞、LLC−RC256細胞、MH1C1細胞、XC細胞、MDOK細胞、VSW細胞、およびTH−I、B1細胞、またはそれらの誘導体)、任意の組織もしくは器官(例えば、限定されないが、心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織(脳、脊髄)、肺、血管組織(動脈、静脈、毛細血管)、リンパ系組織(リンパ腺、アデノイド、扁桃、骨髄、および血管)、膵臓由来の線維芽細胞、ならびに線維芽細胞株および線維芽様細胞株(例えば、TRG−2細胞、IMR−33細胞、Don細胞、GHK−21細胞、シトルリン血症細胞、Dempsey細胞、Detroit551細胞、Detroit510細胞、Detroit525細胞、Detroit529細胞、Detroit532細胞、Detroit539細胞、Detroit548細胞、Detroit573細胞、HEL299細胞、IMR−90細胞、MRC−5細胞、WI−38細胞、WI−26細胞、MiCl1細胞、CV−1細胞、COS−1細胞、COS−3細胞、COS−7細胞、Vero細胞、DBS−FrhL−2細胞、BALB/3T3細胞、F9細胞、SV−T2細胞、M−MSV−BALB/3T3細胞、K−BALB細胞、BLO−11細胞、NOR−10細胞、C3H/IOTI/2細胞、HSDM1C3細胞、KLN205細胞、McCoy細胞、マウスL細胞、2071系統(マウスL)細胞、L−M系統(マウスL)細胞、L−MTK(マウスL)細胞、NCTCクローン2472および2555、SCC−PSA1細胞、Swiss/3T3細胞、Indian muntac細胞、SIRC細胞、CII細胞、ならびにJensen細胞、またはそれらの誘導体)、あるいは当業者に知られている任意の他の細胞型が挙げられるが、これらに限定されない、細胞を培養することができる。
本明細書に開示される培地を用いて、懸濁液中の細胞または付着細胞を培養することができる。本発明の組成物は、細胞の、付着、単層、または懸濁培養、トランスフェクション、および栽培のいずれか、ならびに単層または懸濁培養における細胞中のタンパク質または抗体の発現に適している。
本発明の培地によって支持される細胞は、マウスまたはハムスターまたはヒト等の任意の動物に由来し得る。本発明の培地中で培養された細胞は、正常細胞または異常細胞(すなわち、形質転換細胞、樹立細胞、または罹患組織サンプル由来の細胞)であり得る。
動物細胞、哺乳動物細胞、培養細胞、動物または哺乳動物宿主細胞、宿主細胞、組換え細胞、組換え宿主細胞等は、本発明のプロセスに従って培養することができる細胞に対するすべての用語である。そのような細胞は、一般的に、哺乳動物から得られるまたはそれに由来する細胞株であり、適切な栄養および/または成長因子を含む培地中の単層培養または懸濁培養のいずれかに入れる場合に増殖および生存することができる。特定の細胞培養の成長および維持に必要な成長因子および栄養は、例えば、Barnes and Sato、(1980,Cell,22:649)、Mammalian Cell Culture,Ed.J.P.Mather,Plenum Press,NY,1984、および米国特許第5,721,121号に記載されるように、関連技術分野において当業者により容易に実験的に決定することができる。
多くの細胞種を本発明の方法に従って培養することができる。細胞は、一般的に、培養培地中に大量の特定のタンパク質、より具体的には、所望の糖タンパク質を発現および分泌することができるか、または発現および分泌するために分子的に操作することができる動物または哺乳動物細胞である。宿主細胞によって生成される糖タンパク質は、宿主細胞に内因性または同種であり得る。あるいは、糖タンパク質は、宿主細胞に異種、すなわち、外来性、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)宿主細胞によって生成および分泌されるヒト糖タンパク質である。さらに、哺乳動物糖タンパク質、すなわち、本来、哺乳動物生物から得られるか、またはそれに由来するものが本発明の方法によって得られ、細胞によって培養培地内に分泌され得る。
本発明の方法によって好都合に生成することができる哺乳動物糖タンパク質の非限定例には、融合またはキメラタンパク質を含む、サイトカイン、サイトカイン受容体、成長因子(例えば、EGF、HER−2、FGF−α、FGF−β、TGF−α、TGF−β、PDGF、IGF−1、IGF−2、NGF、NGF−β)、成長因子受容体が含まれる。他の非限定例には、成長ホルモン(例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン);インスリン(例えば、インスリンA鎖およびインスリンB鎖)、プロインスリン;エリスロポエチン(EPO);ダーベポエチン、コロニー刺激因子(例えば、G−CSF、GM−CSF、M−CSF);インターロイキン(例えば、IL−1〜IL−12);血管上皮成長因子(VEGF)およびその受容体(VEGF−R);インターフェロン(例えば、IFN−α、β、もしくはγ);腫瘍壊死因子(例えば、TNF−αおよびTNF−β)およびそれらの受容体、TNFR−1およびTNFR−2;トロンボポエチン(TPO);トロンビン;脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP);凝固因子(例えば、因子VIII、因子IX、フォンウィルブランド因子等);抗凝固因子;組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型TPA;卵胞刺激ホルモン(FSH);黄体形成ホルモン(LH);カルシトニン;CDタンパク質(例えば、CD3、CD4、CD8、CD28、CD19等);CTLAタンパク質(例えば、CTLA4);T細胞およびB細胞受容体タンパク質;骨形成タンパク質(BNP、例えば、BMP−1、BMP−2、BMP−3等);神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子(BDNF);ニューロトロフィン、例えば、3−6;レニン;リウマチ因子;RANTES;アルブミン;レラキシン;マクロファージ阻害タンパク質(例えば、MIP−1、MIP−2);ウイルスタンパク質または抗原;表面膜タンパク質;イオンチャネルタンパク質;酵素;調節タンパク質;抗体;免疫調節タンパク質、(例えば、HLA、MHC、B7ファミリー);ホーミング受容体;輸送タンパク質;スーパーオキシドジスムターゼ(SOD);G−タンパク質結合受容体タンパク質(GPCR);神経調節タンパク質;アルツハイマー病関連タンパク質およびペプチド、(例えばA−ベータ)、および当該技術分野で知られている他のものが含まれる。融合タンパク質およびポリペプチド、キメラタンパク質およびポリペプチド、ならびに前述のタンパク質およびポリペプチドのうちのいずれかの断片もしくは部分、または突然変異体、変異体、または類似体もまた、本発明の方法によって生成することができる好適なタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドに含まれる。
次の単離および/または精製のためにタンパク質を保持、発現、および生成するのに適した動物または哺乳動物宿主細胞の非限定例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、例えば、CHO−K1(ATCC CCL−61)、DG44(Chasin et al.,1986,Som.Cell Molec.Genet.,12:555−556、Kolkekar et al.,1997,Biochemistry,36:10901−10909、および第WO01/92337 A2号)、ジヒドロ葉酸還元酵素陰性CHO細胞(CHO/−DHFR,Urlaub and Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216)、およびdp12.CHO細胞(米国特許第5,721,121号);SV40によって形質転換されたサル腎CV1細胞(COS細胞、COS−7,ATCC CRL−1651);ヒト胚腎細胞(例えば、293細胞、または懸濁培養中での増殖のためにサブクローンした293細胞、Graham et al.,1977,J.Gen.Virol.,36:59);新生仔ハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL−10);サル腎細胞(CV1、ATCC CCL−70);アフリカミドリザル腎細胞(VERO−76、ATCC CRL−1587;VERO、ATCC CCL−81);マウスセルトリ細胞(TM4,Mather,1980,Biol.Reprod.,23:243−251);ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL−2);イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL−34);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL−75);ヒト肝臓細胞(HEP−G2、HB8065);マウス乳腺腫瘍細胞(MMT060562、ATCC CCL−51);バッファローラット肝細胞(BRL3A、ATCC CRL−1442);TRI細胞(Mather,1982,Annals NY Acad.Sci.,383:44−68);MCR5細胞;FS4細胞が含まれる。
本発明の方法およびプロセスを用いて培養するのに適している細胞は、培養プロセスにおいて発現および生成するためのタンパク質をコードするコード配列またはその部分を保持する、導入(例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、または注入による)、発現ベクター(構築物)、プラスミド等を含むことができる。そのような発現ベクターは、挿入されるコード配列の転写および翻訳のための必要な要素を含む。当業者によく知られ、実施されている方法を用いて、生成されたタンパク質およびポリペプチドをコードする配列、ならびに適切な転写および翻訳制御要素を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。そのような技術は、J.Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.、およびF.M.Ausubel et al.,1989,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Yに記載されており、これらのすべては、いかなる目的のために、本明細書に組み込まれる。
懸濁液中または単層培養物中の哺乳動物細胞の培養に加えて、本培地および方法は、哺乳動物細胞からウイルスを生成するための方法に使用され得る。本発明の本態様に従ってそのような方法は、(a)ウイルスに感染する哺乳動物細胞を得ることと、(b)ウイルスによる細胞の感染を促進するのに適している条件下で、細胞をウイルスと接触させることと、(c)細胞によるウイルスの生成を促進するのに適している条件下で、本発明の培養培地中で細胞を培養することと、を含む。本発明に従って、細胞は、本発明の培養培地中で、細胞の培養前、培養中、または培養後のいずれかでウイルスと接触し得、哺乳動物細胞をウイルスに感染させるための最適方法は、当該技術分野で公知であり、当業者にはよく知られている。本発明の培地中の懸濁液中で培養されたウイルス感染した哺乳動物細胞は、本発明の培地中の懸濁液中で培養されない細胞よりも高いウイルス力価(例えば、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、250倍、500倍、または1000倍高い力価)を生成することが期待され得る。これらの方法を用いて、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、およびワクチン製造のための他のウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない、様々な哺乳動物ウイルスおよびウイルスベクターを生成することができる。本培地中で感染した細胞を培養した後、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス粒子、またはそれらの成分(タンパク質および/または核酸(DNAおよび/もしくはRNA))を含む使用された培養培地は、ワクチン生産、細胞トランスフェクションまたは遺伝子治療に用いるウイルスベクターの生産、動物または細胞培養の感染、ウイルスタンパク質および/または核酸の研究等を含む、様々な目的のために使用することができる。あるいは、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス粒子、またはそれらの成分は、任意に、当業者によく知られているであろうタンパク質および/または核酸の単離に関する技術に従って使用された培養培地から単離することができる。
細胞培養の種類
限定されるものではないが理解のために、当業者は、タンパク質生成のための細胞培養および培養実行には3つの一般的種類、すなわち、連続培養、バッチ培養、および供給バッチ培養を含むことができることが理解されよう。連続培養において、例えば、新鮮な培養培地の補充(すなわち供給培地)が培養期間中細胞に提供され、一方、古い培養培地は毎日除去され、産物が、例えば毎日または連続的に収穫される。連続培養において、供給培地を毎日加えることができ、また連続的に、すなわち点滴または注入で加えることができる。連続培養では、細胞は生存したままであり、環境および培養条件が維持されるかぎり、この細胞は所望の長さで培養中にとどまることができる。
限定されるものではないが理解のために、当業者は、タンパク質生成のための細胞培養および培養実行には3つの一般的種類、すなわち、連続培養、バッチ培養、および供給バッチ培養を含むことができることが理解されよう。連続培養において、例えば、新鮮な培養培地の補充(すなわち供給培地)が培養期間中細胞に提供され、一方、古い培養培地は毎日除去され、産物が、例えば毎日または連続的に収穫される。連続培養において、供給培地を毎日加えることができ、また連続的に、すなわち点滴または注入で加えることができる。連続培養では、細胞は生存したままであり、環境および培養条件が維持されるかぎり、この細胞は所望の長さで培養中にとどまることができる。
バッチ培養において、細胞は最初に、培地中で培養され、この培地は除去も、交換も、添加もされない。すなわち、培養実行中またはその終了前に、細胞に新しい培地は「供給(fed)」されない。所望の産物は、培養行程の終了時に収穫される。
供給バッチ培養では、培養実行時間は、その実行中に新しい培地を毎日1回以上(または連続的に)添加することにより増加させる。すなわち、培養期間中、細胞に新しい培地(「供給培地」)が供給される。供給バッチ培養は、上記の様々な供給計画および時間、例えば、毎日、1日おき、2日おき等、1日に1回より多く、または1日に1回未満等を含むことができる。さらに、供給バッチ培養に、供給培地を連続的に供給することができる。次いで、所望の産物は、培養/生産実行の終了時に収穫される。
本発明によれば、動物または哺乳動物細胞培養のために従来使用される培養容器および/または培養装置を用いて、大規模または小規模のタンパク質の生産のための条件下で、細胞培養を実行することができ、糖タンパク質を細胞によって生産することができる。当業者によって理解されるように、組織培養皿、Tフラスコ、およびスピナーフラスコは、一般に、実験室規模で使用される。より大規模(例えば、500L、1000L、2000L、5000L、10000L等)に培養するために、発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、流動層型バイオリアクター、中空糸型バイオリアクター、ローラーボトル培養、撹拌タンクバイオリアクターシステム、充填槽型培養装置、または当業者に知られている任意の他の適切な装置が挙げられるが、これらに限定されない、手順を使用することができる。ローラーボトルまたは撹拌タンクバイオリアクターシステムとともにマイクロキャリアを用いても用いなくてもよい。該システムは、バッチ、連続、または供給バッチ様式で操作することができる。さらに、培養装置またはシステムは、フィルター、重力、遠心力等を用いる細胞分離器を装備してもしていなくてもよい。
一実施形態では、細胞培養基本培地を、UVC光に露光し、次いで、必要になるまで保存し、この時点で、添加剤パッケージを、細胞培養中で使用する前に、UVCに露光された基本培地に添加する。別の実施形態では、細胞培養基本培地は、保存に間に合うように中断することなく、段階的プロセスの一部として添加剤パッケージをUVCに露光された基本培地に添加する、自動プロセスの一部として処理される。当業者は、基本培地をUVC露光し、続いて、ある時点で、添加剤パッケージを添加する必要なステップを用いる、このUVC露光プロセスが生じ得る方法をいくらでも容易に想定するであろう。
UV光
「紫外線光」という用語は、X線領域(100nm)から可視領域(400nm)に及ぶ、光の電磁スペクトルの部分を指す。特に、紫外線光は、一般に、4つの部分に分けられる。(1)100〜200nmの波長を有する真空紫外線光、(2)200〜280nmの波長を有する紫外線C(UVC)、(3)280〜315nmの波長を有する紫外線B(UVB)、および(4)315〜400nmの波長を有する紫外線A(UVA)。一実施形態では、細胞培養培地を培養装置(例えばバイオリアクター)内に導入する前に、細胞培養基本培地は、UVC光に露光される。
「紫外線光」という用語は、X線領域(100nm)から可視領域(400nm)に及ぶ、光の電磁スペクトルの部分を指す。特に、紫外線光は、一般に、4つの部分に分けられる。(1)100〜200nmの波長を有する真空紫外線光、(2)200〜280nmの波長を有する紫外線C(UVC)、(3)280〜315nmの波長を有する紫外線B(UVB)、および(4)315〜400nmの波長を有する紫外線A(UVA)。一実施形態では、細胞培養培地を培養装置(例えばバイオリアクター)内に導入する前に、細胞培養基本培地は、UVC光に露光される。
本発明の一実施形態では、細胞培養培地をバイオリアクター内に導入する前に、細胞培養培地は、200nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜275nmの波長を有するUVC光に露光される。更なる実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜270nmの波長を有するUVC光に露光される。なお別の実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜265nmの波長を有するUVC光に露光される。また更なる実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜260nmの波長を有するUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜255nmの波長を有するUVC光に露光される。更なる実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜250nmの波長を有するUVC光に露光される。なお別の実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜245nmの波長を有するUVC光に露光される。さらに別の実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜240nmの波長を有するUVC光に露光される。更なる実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜235nmの波長を有するUVC光に露光される。一実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜230nmの波長を有するUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜225nmの波長を有するUVC光に露光される。なお別の実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜220nmの波長を有するUVC光に露光される。さらに別の実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜215nmの波長を有するUVC光に露光される。なお別の実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜210nmの波長を有するUVC光に露光される。更なる実施形態では、細胞培養培地は、200nm〜205nmの波長を有するUVC光に露光される。なお更なる実施形態では、細胞培養培地は、205nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。また更なる実施形態では、細胞培養培地は、210nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。なお更なる実施形態では、細胞培養培地は、215nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。また更なる実施形態では、細胞培養培地は、220nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地は、225nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。更なる実施形態では、細胞培養培地は、230nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。さらに別の実施形態では、細胞培養培地は、235nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地は、240nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。なお更なる実施形態では、細胞培養培地は、245nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地は、250nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。更なる実施形態では、細胞培養培地は、255nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。また更なる実施形態では、細胞培養培地は、260nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。一実施形態では、細胞培養培地は、265nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。なお別の実施形態では、細胞培養培地は、270nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。さらに別の実施形態では、細胞培養培地は、275nm〜280nmの波長を有するUVC光に露光される。なお別の実施形態では、細胞培養培地は、205nm〜275nmの波長を有するUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地は、210nm〜270nmの波長を有するUVC光に露光される。また更なる実施形態では、細胞培養培地は、215nm〜265nmの波長を有するUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地は、220nm〜260nmの波長を有するUVC光に露光される。さらに別の実施形態では、細胞培養培地は、225nm〜255nmの波長を有するUVC光に露光される。なお別の実施形態では、細胞培養培地は、230nm〜250nmの波長を有するUVC光に露光される。更なる実施形態では、細胞培養培地は、235nm〜245nmの波長を有するUVC光に露光される。なお別の実施形態では、細胞培養培地は、245nm〜265nmの波長を有するUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地は、248nm〜260nmの波長を有するUVC光に露光される。なお更なる実施形態では、細胞培養培地は、249nm〜259nmの波長を有するUVC光に露光される。更なる実施形態では、細胞培養培地は、250nm〜258nmの波長を有するUVC光に露光される。また更なる実施形態では、細胞培養培地は、251nm〜257nmの波長を有するUVC光に露光される。なお別の実施形態では、細胞培養培地は、252nm〜256nmの波長を有するUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地は、253nm〜255nmの波長を有するUVC光に露光される。
本発明の別の実施形態では、細胞培養培地をバイオリアクター内に導入する前に、細胞培養培地は、254nmの波長を有するUVC光に露光される。本発明の他の実施形態では、細胞培養培地は、254nm+/−1nmの波長、または254nm+/−2nmの波長、または254nm+/−3nmの波長、または254nm+/−4nmの波長、または254nm+/−5nmの波長、または254nm+/−6nmの波長、または254nm+/−7nmの波長、または254nm+/−8nmの波長、または254nm+/−9nmの波長、または254nm+/−10nmの波長、または254nm+/−15nmの波長、または254nm+/−20nmの波長、または254nm+/−25nmの波長を有するUVC光に露光される。
本明細書で使用される、「エネルギー」という用語は、処理される細胞培養培地が露光されるミリジュール/cm2またはジュール/メートル2単位の紫外線放射線量を指す。本発明の一実施形態では、細胞培養培地をバイオリアクター内に導入する前に、細胞培養培地は、25〜350mJ/cm2のエネルギー密度、より好ましくは、60〜250mJ/cm2のエネルギー密度、最も好ましくは、100〜150mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される。別の実施形態では、細胞培養培地をバイオリアクター内に導入する前に、細胞培養培地は、125mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される。本発明の他の実施形態では、細胞培養培地は、125mJ/cm2+/−1mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−2mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−3mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−4mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−5mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−10mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−15mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−20mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−25mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−30mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−40mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−50mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−60mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−70mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−80mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−90mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−100mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−110mJ/cm2のエネルギー密度、または125mJ/cm2+/−120mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される。本発明のなお他の実施形態では、細胞培養培地は、175mJ/cm2+/−1mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−2mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−3mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−4mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−5mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−10mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−15mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−20mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−25mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−30mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−40mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−50mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−60mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−70mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−80mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−90mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−100mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−110mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−120mJ/cm2のエネルギー密度、175mJ/cm2+/−130mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−140mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−150mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−160mJ/cm2のエネルギー密度、または175mJ/cm2+/−170mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される。
エネルギー密度の具体例が提供されているが、本明細書に開示される方法において使用され得るUVC源が、標的エネルギー密度の前後の一連のエネルギー密度を送達することが留意され、この一連のエネルギー密度は「線量分布」としても称される。エネルギー密度分布の1つの特徴は、「高線量テール」を有する、エネルギー密度の広がりの非対称性である。P10、P50、P90、および平均の確率測度を用いて、この分布を抽象化することができる。P#値は、流動体(例えば培地)の#%が処理される線量値を示す。したがって、60mJ/cm2のP10値は、流動体の10%が60mJ/cm2未満のエネルギー密度を受けたことを意味する。このアプローチは、本明細書に記載される螺旋UVC反応器等のUVC露光装置に適している。
開示される方法の別の実施形態では、層流UVC露光装置(例えば、薄膜UVC反応器)を使用して、UVC光を送達することができる。層流または薄膜UVC露光装置を使用するとき、この分布は、P10=1/2*平均、P90=2*平均で近似され得る。したがって、層流または薄膜UVC露光装置が、本明細書に記載される条件下で使用された場合、この分布は、P10〜60、平均=125mJ/cm2、およびP90〜250mJ/cm2であり得る。
上の考察と一致して、UVC光の標的エネルギー密度が本開示に提供されるとき、標的エネルギー密度が、上に提供される線量分布規定によって説明される一連の被爆量を具体化することは暗黙であることに留意する。より具体的には、一実施形態では、標的UVCエネルギー密度は、エネルギー密度のP10〜P60分布内のすべてのエネルギー密度を含み、別の実施形態では、標的UVCエネルギー密度は、エネルギー密度のP65分布内のすべてのエネルギー密度を含み、別の実施形態では、標的UVCエネルギー密度は、エネルギー密度のP70分布内のすべてのエネルギー密度を含み、別の実施形態では、標的UVCエネルギー密度は、線量のP75分布内のすべてのエネルギー密度を含み、別の実施形態では、標的UVCエネルギー密度は、エネルギー密度のP80分布内のすべてのエネルギー密度を含み、別の実施形態では、標的UVC線量は、エネルギー密度のP85分布内のすべてのエネルギー密度を含み、別の実施形態では、標的UVCエネルギー密度は、エネルギー密度のP90分布内のすべてのエネルギー密度を含み、別の実施形態では、標的UVCエネルギー密度は、エネルギー密度のP95分布内のすべてのエネルギー密度を含む。
本開示の文脈において、UVCエネルギー密度は、提供されたスカラー範囲(例えば、125mJ/cm2+/−1mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−2mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−3mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−4mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−5mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−10mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−15mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−20mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−25mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−30mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−40mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−50mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−60mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−70mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−80mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−90mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−100mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−110mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは125mJ/cm2+/−120mJ/cm2、または本発明のなお他の実施形態では、175mJ/cm2+/−1mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−2mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−3mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−4mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−5mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−10mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−15mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−20mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−25mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−30mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−40mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−50mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−60mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−70mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−80mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−90mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−100mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−110mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−120mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−130mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−140mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−150mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−160mJ/cm2のエネルギー密度、もしくは175mJ/cm2+/−170mJ/cm2)を用いて記載され得るか、または、記載される線量分布関数(例えば、標的エネルギー密度のP10〜60、P65、P70、P75、P80、P85、P90、およびP95の範囲内のエネルギー密度)を用いて記載され得ることが理解されよう。
UVC露光装置
本発明の細胞培養培地および方法は、細胞培養基本培地をUVCに露光するために、いかなる装置(device)、システム、装置(apparatus)、または方法と共に使用することができる。装置の非限定例は、米国特許第7,651,660号、米国特許第6,773,608号、米国特許第6,596,230号、米国特許第5,725,757号、米国特許第5,707,594号、および米国出願公開第20040245164A1号に見出され得る。一実施形態では、本発明の細胞培養培地および方法は、螺旋UV反応器と共に使用される。別の実施形態では、本発明の細胞培養培地および方法は、層流(または薄膜)UV反応器と共に使用される。
他の培地処理
本発明の細胞培養培地および方法は、細胞培養基本培地をUVCに露光するために、いかなる装置(device)、システム、装置(apparatus)、または方法と共に使用することができる。装置の非限定例は、米国特許第7,651,660号、米国特許第6,773,608号、米国特許第6,596,230号、米国特許第5,725,757号、米国特許第5,707,594号、および米国出願公開第20040245164A1号に見出され得る。一実施形態では、本発明の細胞培養培地および方法は、螺旋UV反応器と共に使用される。別の実施形態では、本発明の細胞培養培地および方法は、層流(または薄膜)UV反応器と共に使用される。
他の培地処理
本明細書に提供される細胞培養培地および方法は、細胞培養前に培地を滅菌または消毒するために、UVC露光以外の処理方法または装置と共に使用することができる。一実施形態では、HTSTは、本発明の培地および方法と組み合わせて使用される(例えば、米国特許第7,420,183号を参照)。別の実施形態では、pHの調節(例えば、4を下回るまで)は、本発明の培地および方法と組み合わせて使用される。
一実施形態では、細胞培養培地を、UVC光に露光された後に、濾過ステップに付す。本明細書で使用されるとき、「滅菌濾過」および「滅菌フィルター」という用語は、標準的な生物学的滅菌フィルターの使用により細胞培養培地からマイクロプラズマおよび他の潜在的汚染物を除去することを指す。本発明の一実施形態では、細胞培養培地をバイオリアクター内に導入する前に、最大200nmのサイズの細孔を有する滅菌フィルターに細胞培養培地を通過させる。
別の実施形態では、細胞培養培地は、UVC光に露光される前または露光された後に、デプスフィルター(depth filter)を通す。「デプスフィルター」という用語は、それぞれの層が、異なるサイズおよび密度の微粒子物質の濾過を担う、複数の濾過層を有するフィルターを指す。このタイプの濾過プロセスは、サイズ排除に類似している。軽い物質は、濾過床の最上部で単離される。下層になるほど、培地は次第に、より細かく、そしてより高密度になる。より大きな懸濁粒子はより上部の層で除去され、一方、より小さな粒子はより下部の層により除去される。
別の実施形態では、細胞培養培地は、溶媒、洗浄剤、ソラレン、またはβ−プロピオラクトン等のウイルスを不活性化する化学物質で処理される。
更なる実施形態
一実施形態では、本開示は、培地を、UVC光の影響を受けやすいことが知られている、または受けやすいと考えられる、過剰量の培地成分、例えば、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12(シアノコバラミン)で補充し、UVC光による処置時のそれらの部分的破壊を補うことによって、ウイルスを不活性化する培地を提供する方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、培地を、UVC光の影響を受けやすいことが知られている、または受けやすいと考えられる、過剰量の培地成分、例えば、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12(シアノコバラミン)で補充し、UVC光による処置時のそれらの部分的破壊を補うことによって、ウイルスを不活性化する培地を提供する方法を提供する。
本明細書に記載されるように、様々な一般的な培地成分は、UVC光への露光後、分解されるか、または生物学的に不活性になる。この分解を補うために、UVC媒介の分解に影響を受けやすい培地成分を、UVC光への露光後に適切な量のこれらの化合物を提供する余剰量で、培地処方物に添加することができる。換言すれば、UVC露光によって不活性化される所与の培地成分量が、培地が必要量の成分を有することができるように、不活性化される成分量を添加することによって補充され得る。一実施形態では、成分は、UVC露光前、培地への補助剤として添加することができ、一方、別の実施形態では、成分は、UVC露光後、培地への補助剤として添加することができる。
特定の例では、UVC光によって不活性化されることが知られている、または不活性化されると考えられる培地成分が特定される。次いで、初期量の培地中の成分が特定される。別々に、所望のUVC線量に基づいて、分解される成分量から経験的決定がなされる。あるいは、指針として成分の既知の特性(例えば、吸光度、濃度、UVC線量等)を用いて、計算によって、この決定がなされる。次いで、分解されることが予測される成分量を、滅菌添加剤(例えば、適切な濃度で成分を含む滅菌溶液)中で培地に添加する。続いて、補充した培地が、UVC光に露光される。
別の特定の例では、UVC光によって不活性化されることが知られている、または不活性化されると考えられる培地成分が特定される。次いで、初期量の培地中の成分が特定される。別々に、所望のUVC線量に基づいて、分解される成分量から経験的決定がなされる。あるいは、指針として成分の既知の特性(例えば、吸光度、濃度、UVC線量等)を用いて、計算によって、この決定がなされる。次いで、補充された培地が、UVC光に露光される。次いで、分解されることが予測される成分量を、滅菌添加剤(例えば、適切な濃度の成分を含む滅菌溶液)中で培地に添加する。
本発明が説明されたが、以下の実施例は、説明する目的のために提供されるものであって、限定するためのものではない。
すべての実施例の材料および方法
組換えヒトエリスロポエチンは、UV感受性成分のリポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、およびビタミンB12、ならびにメトトレキサートを含むDMEM/F12基本培地中で培養されたCHO細胞株から生成された。
組換えヒトエリスロポエチンは、UV感受性成分のリポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、およびビタミンB12、ならびにメトトレキサートを含むDMEM/F12基本培地中で培養されたCHO細胞株から生成された。
これらの実験のためにUVCで処理された対照培地を、滅菌等級フィルターに通過させた。細胞をバイアルから解凍し、拡大した体積のローラーボトル中でスケールアップを図り、プロセスの生産段階のために一連のバイオリアクターに接種した。
これらの実験は、収穫1、8日間、収穫2、7日間、収穫3、7日間の間隔の3つの収穫を通して行われた。このプロセスのローラーボトルのスケールアップ部分は、37.0℃の設定点で実行された。このプロセスのローラーボトルの接種および生産部分は、36.0℃の設定点で実行された。
UVC処理は、螺旋流UVC反応器(254nmで)を用いて、60W/m2の照射強度で、時速5〜20リットル(LPH)の流速で完了した。培地は、所望の条件に対して正確なUVC吸収量で処理された。
実施例1
幾つかの他の条件を加えて、特定のプロセスの必要性を評価し、UVCで処理した培地へのプロセスのロバスト性を試験した。製造設備は、濃縮状態でスケールアップ培地および富化生産培地を調製し、供給タンクへの移動中、インライン濾過を行う。培地は、WFI洗浄機を用い、インラインフィルターを通して、最終的にそれの1倍の体積にする。濃縮し、1倍のUVCで処理した培地の様々な組み合わせを、この実験では試験した。
結果
スケールアッププロセスのいかなる段階でも、細胞増殖または集団倍加に関しては、UVCで処理した条件と対照との差はなかった。UVC条件の代謝データは、生産のすべての収穫を通じて対照と同様であった。収穫3での細胞付着は、UVC条件のすべてに関して、対照と同様であった。2.5倍のUVCの125mJ/cm2条件は、他の条件と比較してわずかに付着の減少を示したが、これは、大規模な生産において観察される場合、問題を示さないことが予測される。
スケールアッププロセスのいかなる段階でも、細胞増殖または集団倍加に関しては、UVCで処理した条件と対照との差はなかった。UVC条件の代謝データは、生産のすべての収穫を通じて対照と同様であった。収穫3での細胞付着は、UVC条件のすべてに関して、対照と同様であった。2.5倍のUVCの125mJ/cm2条件は、他の条件と比較してわずかに付着の減少を示したが、これは、大規模な生産において観察される場合、問題を示さないことが予測される。
すべてのUVCで処理した培地条件は、力価減少を示した。175mJ/cm2条件は、収穫を通じて一貫して低い力価を示した。処理され、濃縮された培地が、収穫3で力価においてより大きな効果を有するように思われるが、更なる研究がこれを確認するには必要である。
対照およびUVCで処理した2.5倍濃縮したスケールアップ培地の複写のみが、ウイルス解凍から処理された。他のUVC条件は、接種での処理を開始し、生産まで継続した。この時点での開始は、ウイルス解凍からの処理を示す。産物力価データを図1および2に要約する。
実施例2
2.5倍に濃縮したUVCで処理した培地を用いてプロセスのスケールアップ部分を繰り返し、接種中およびプロセスの生産部分でより低いUVC被爆量を評価するために、この実験が実行された。前述の実験は、産物力価がUVC被爆量と相関があるため、75mJ/cm2および50mJ/cm2のより低い被爆量が試験されたことを示唆した。
結果
すべてのUVCで処理した条件に関して産物の変化および産物のそれぞれの収穫における代謝データを対照と比較した。産物力価は、2つのUVC処理による用量依存的な減少を示した。産物力価データを図3および4に要約する。
すべてのUVCで処理した条件に関して産物の変化および産物のそれぞれの収穫における代謝データを対照と比較した。産物力価は、2つのUVC処理による用量依存的な減少を示した。産物力価データを図3および4に要約する。
実施例3
様々な細胞培養培地の処理条件は、このエポエチンアルファ培地処理実験において研究された。研究された培地処理技術は、高温短時間(HTST)、紫外線光C(UVC)、およびウイルス濾過(VF)を含んだ。ローラーボトル(RB)接種から開始し、生産まで、これらの処理を適用した。それぞれの条件が、収穫され、精製された。すべての新しいUVC処理条件は、現行培地のUVC処理で観察された力価の減少を改善した(条件2)。すべての処理条件はまた、対照条件と比較した場合の変化で同様の細胞増殖および生存能力を示した(条件1および10)。対照と比較して低いSE−HPLCのモノマー率のような幾つかの製品品質の差が観察された。
様々な細胞培養培地の処理条件は、このエポエチンアルファ培地処理実験において研究された。研究された培地処理技術は、高温短時間(HTST)、紫外線光C(UVC)、およびウイルス濾過(VF)を含んだ。ローラーボトル(RB)接種から開始し、生産まで、これらの処理を適用した。それぞれの条件が、収穫され、精製された。すべての新しいUVC処理条件は、現行培地のUVC処理で観察された力価の減少を改善した(条件2)。すべての処理条件はまた、対照条件と比較した場合の変化で同様の細胞増殖および生存能力を示した(条件1および10)。対照と比較して低いSE−HPLCのモノマー率のような幾つかの製品品質の差が観察された。
培地処理条件
表3は、生産中に使用される様々な溶液に適用される培地処理条件を示す。表の処理欄下の結合したセルは、処理技術を製剤化した両方の成分に一緒に適用することを示し、表の処理欄下にある別々のセルは、処理技術をそれぞれの成分に別々に適用することを示す。
表3は、生産中に使用される様々な溶液に適用される培地処理条件を示す。表の処理欄下の結合したセルは、処理技術を製剤化した両方の成分に一緒に適用することを示し、表の処理欄下にある別々のセルは、処理技術をそれぞれの成分に別々に適用することを示す。
条件6〜9は、UVCで処理し、続いて、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12を含む添加剤パッケージを添加した新しい基本培地を用いる。
125mJ/cm2のそれぞれの条件に関する標的平均UVC線量は、正確に得られなかった。これは、元の平均線量モデルにおける蛍光強度の変動によるためであった。その後、より正確な線量分布モデルが、開発され、平均およびパーセンテージ(10、50、および90)線量を報告するために利用されている。螺旋UVC反応器ユニットによって送達された平均線量は、標的よりも低かった。現行の培地(条件2)の過少線量はなお、力価の減少をもたらし、これは、限りなく低い50〜75mJ/cm2の線量に対する力価の影響を示したことが先行研究と一致している。
生産性の結果を図5に提供する。処理条件3、4、および6〜9は、処理限界内で同様の生産性を有し、それ故に、UVC処理の現行の培地(条件2)で観察された力価の減少を改善し、これは収穫2および3に関しては、すべての他の条件よりも約15〜20%低く、先行研究と一致した。新しい培地の対照、条件5の結果は、既存の培地対照1および10と一致した。
Claims (28)
- 細胞培養培地であって、
a.UVC光に露光される基本培地と、
b.UVC露光後、前記基本培地に添加されるUV感受性培地成分を含む添加剤パッケージと、を含む、細胞培養培地。 - 前記基本培地が、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含まない、請求項1に記載の細胞培養培地。
- 前記添加剤パッケージが、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含む、請求項1に記載の細胞培養培地。
- 前記基本培地が、粉末または液体形態であり、前記添加剤パッケージが、粉末または液体形態である、請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 前記培地が、哺乳動物細胞の培養に適している、請求項1に記載の細胞培養培地。
- 前記培地が、昆虫細胞の培養に適している、請求項1に記載の細胞培養培地。
- UVCに露光された細胞培養培地製剤を作製するための方法であって、
a.基本培地をUVC光に露光するステップと、
b.UV感受性成分を含む添加剤パッケージを前記UVCに露光された基本培地に添加するステップと、を含む、方法。 - 前記基本培地が、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含まない、請求項7に記載の方法。
- 前記添加剤パッケージが、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記UVC光が、約254nmの波長である、請求項7〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記基本培地が、約25〜約350mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される、請求項10に記載の方法。
- 前記基本培地が、約125mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される、請求項11に記載の方法。
- 前記基本培地が、約175mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される、請求項11に記載の方法。
- 前記基本培地をUVC光に露光する前記ステップが、前記基本培地中のいずれかの非エンベロープウイルスの核酸を損傷するのに十分である、請求項7に記載の方法。
- 前記UVC光が、薄膜UVC反応器を用いて送達される、請求項7に記載の方法。
- 前記UVC光が、螺旋UVC反応器を用いて送達される、請求項7に記載の方法。
- タンパク質を生成するための方法であって、
a.基本培地をUVC光に露光するステップと、
b.UV感受性培地成分を含む添加剤パッケージを前記UVCに露光された基本培地に添加するステップと、
c.所望のタンパク質が生成されるように前記UVCで処理された培地中で細胞を培養するステップと、を含む、方法。 - 前記基本培地が、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含まない、請求項17に記載の方法。
- 前記パッケージが、リポ酸、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキサル、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、メトトレキサート、およびビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、または13個の成分を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記UVC光が、約254nmの波長である、請求項17〜19のいずれかに記載の方法。
- 前記培地が、約25〜約350mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される、請求項20に記載の方法。
- 前記基本培地が、約125mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される、請求項21に記載の方法。
- 前記基本培地が、約175mJ/cm2のエネルギー密度のUVC光に露光される、請求項21に記載の方法。
- 前記基本培地をUVC光に露光する前記ステップが、前記基本培地中のいずれかの非エンベロープウイルスの核酸を損傷するのに十分である、請求項17に記載の方法。
- 前記細胞がCHO細胞である、請求項17に記載の方法。
- 前記タンパク質が、組換えヒトエリスロポエチンである、請求項17に記載の方法。
- 前記UVC光が、薄膜UVC反応器を用いて送達される、請求項17に記載の方法。
- 前記UVC光が、螺旋UVC反応器を用いて送達される、請求項17に記載の方法。
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