CN103930127B - 治疗性核酸酶组合物和方法 - Google Patents

治疗性核酸酶组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103930127B
CN103930127B CN201280032451.2A CN201280032451A CN103930127B CN 103930127 B CN103930127 B CN 103930127B CN 201280032451 A CN201280032451 A CN 201280032451A CN 103930127 B CN103930127 B CN 103930127B
Authority
CN
China
Prior art keywords
domains
nucleic acid
polypeptide
mutation
hybrid nucleic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201280032451.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103930127A (zh
Inventor
J·A·莱德贝特
M·海登-莱德贝特
K·艾肯
孙锡章
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Washington
Original Assignee
University of Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Washington filed Critical University of Washington
Priority to CN201711217220.XA priority Critical patent/CN107964539B/zh
Publication of CN103930127A publication Critical patent/CN103930127A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103930127B publication Critical patent/CN103930127B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/12—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for climacteric disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/27—Endoribonucleases producing 3'-phosphomonoesters (3.1.27)
    • C12Y301/27005—Pancreatic ribonuclease (3.1.27.5)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

用于在哺乳动物中治疗免疫相关疾病或病症的杂交核酸酶分子和方法，以及用于在哺乳动物中治疗免疫相关疾病的药物组合物。

Description

治疗性核酸酶组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年4月29日提交的第61/480,961号美国临时申请和2012年3月29日提交的第61/617,241号美国临时申请的优先权。本申请还涉及：2010年11月2日提交的第PCT/US2010/055131号国际专利申请；2009年11月2日提交的第61/257,458号美国临时申请；和2010年8月4日提交的第61/370,752号美国临时申请。前述申请所公开的全部内容为了所有目的均通过引用整体并入本申请。
关于联邦资助研究的声明
本发明在美国国立卫生研究院(基金号AI44257、NS065933和AR048796)、红斑狼疮研究联盟和华盛顿州生命科学发现基金(2087750)的资助下进行。政府享有本发明的某些权益。
发明背景
在死亡和濒死细胞中，(核糖)核蛋白的过度释放可能通过两种机制导致狼疮病理学：(i)染色质/抗-染色质复合物沉积或在原位形成，导致肾炎并一步引起肾功能丧失；和(ii)通过Toll样受体(TLR)7、8和9以及不依赖于TLR的途径，核蛋白活化先天免疫。核蛋白的释放可以作为系统性红斑狼疮自身抗体的有效抗原，通过抗原受体与TLRs的互相接触，使得B细胞扩增和DC细胞激活。需要在所需主体中除去刺激性抗原和/或减轻免疫刺激、免疫放大和免疫复合物介导的疾病的方法。
发明概述
本申请公开了一种杂交核酸酶分子，所述杂交核酸酶分子包括第一核酸酶结构域和经修饰的Fc结构域，其中所述第一核酸酶结构域有效地与所述Fc结构域偶联。所述Fc结构域被修饰以使得所述分子与具有未经修饰的Fc结构域的杂交核酸酶分子相比，具有降低的细胞毒性。在某些实施方式中，所述杂交核酸酶分子具有Fc结构域，所述Fc结构域被修饰以降低其与Fcγ受体、补体蛋白或这两者的结合。在某些实施方式中，与对照分子例如不具有经修饰的Fc结构域的杂交核酸酶分子相比，所述杂交核酸酶分子的细胞毒性至少降低1、2、3、4或5倍。
在某些实施方式中，所述杂交核酸酶分子进一步包括第一接头结构域，并且所述第一核酸酶结构域通过第一接头结构域有效地与所述经修饰的Fc结构域偶联。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括经修饰的Fc结构域，所述Fc结构域是一个突变的、IgG1Fc结构域。在某些方面，突变的Fc结构域在铰链、CH2和/或CH3结构域包括一个或多个突变。在某些方面，所述Fc结构域包括具有一个或多个下述突变的氨基酸序列：P238S、P331S、SCC、SSS(残基220、226和229)、G236R、L328R、L234A和L235A。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P331S突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S突变和P331S突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，并且可以包括在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或在三个铰链半胱氨酸中的一个(根据EU编号位于残基220)变成SCC的突变(其中CCC指在野生型铰链结构域中存在的三个半胱氨酸)。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或三个铰链半胱氨酸(根据EU变化位于残基220、226和229)变成SSS的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和P331S以及在三个铰链半胱氨酸中的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和P331S和SCC。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和P331S和SSS。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和SCC。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和SSS。在某些方面，突变的Fc结构域包括P331S和SCC。在某些方面，突变的Fc结构域包括P331S和SSS。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中变成SCC的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中变成SSS的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括SCC。在某些方面，突变的Fc结构域包括SSS。
在某些方面，编码突变的Fc结构域的核酸如SEQ ID NO:59所示。在某些方面，突变的Fc结构域如SEQ ID NO:60所示。在某些方面，编码突变的Fc结构域的核酸如SEQ ID NO:71所示。在某些方面，突变的Fc结构域如SEQ ID NO:72所示。在某些方面，编码突变的Fc结构域的核酸如SEQ ID NO:73所示。在某些方面，突变的Fc结构域如SEQ ID NO:74所示。在某些方面，编码突变的Fc结构域的核酸如SEQ ID NO:75所示。在某些方面，突变的Fc结构域如SEQ ID NO:76所示。在某些方面，编码突变的Fc结构域的核酸如SEQ ID NO:87所示。在某些方面，突变的Fc结构域如SEQ ID NO:88所示。在某些方面，编码突变的Fc结构域的核酸如SEQ ID NO:89所示。在某些方面，突变的Fc结构域如SEQ ID NO:90所示。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1结构域，其与包括SCC、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，或者与包括SSS、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接。在某些方面，编码杂交核酸酶分子的核酸如SEQ ID NO:61、77或91所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO:209、62、78、92或94所示。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域与包括SCC、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，或者与包括SSS、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接。在某些方面，编码杂交核酸酶分子的核酸如SEQ IDNO:63或79所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO:64或79所示。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括人DNase1G105R A114F结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域与包括SCC、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，并且所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与野生型人RNase1结构域连接。在某些方面，杂交核酸酶分子包括人DNase1G105R A114F结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域与包括SSS、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，并且所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与野生型人RNase1结构域连接。在某些方面，编码杂交核酸酶分子的核酸如SEQID NO:65或81所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO:66或82所示。
在其它实施方式中，杂交核酸酶分子包括如SEQ ID NO:62、64、78、80、92或96所示的氨基酸序列，或者杂交核酸酶分子包括与如SEQ ID NO:62、64、78、80、92或96所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些方面，杂交核酸酶分子包括如SEQ IDNO:96所示的氨基酸序列。在其它方面，杂交核酸酶分子包括如SEQ ID NO:66、68、70、82、84、86、94或98所示的氨基酸序列，或者杂交核酸酶分子包括与如SEQ ID NO:66、68、70、82、84、86、94或98所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在其它方面，杂交核酸酶分子包括如SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域与包括SCC、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与人DNase1G105R A114F结构域连接。在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域与包括SSS、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与人DNase1G105R A114F结构域连接。在某些方面，编码杂交核酸酶的核酸如SEQ ID NO:67或83所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO:68或84所示。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1结构域，其与包括SCC、P238S和P331的突变的人IgG1Fc结构域连接，所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与人DNase1G105R A114F结构域连接。在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1结构域，其与包括SSS、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与人DNase1G105R A114F结构域连接。在某些方面，编码杂交核酸酶分子的核酸如SEQ ID NO:69、85或93所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO:70、86、94或98所示。
在某些方面，当与对照分子比较时，杂交核酸酶分子诱导的细胞毒性降低。在某些方面，当与对照分子比较时，杂交核酸酶分子诱导的细胞毒性降低约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。在某些方面，与具有未经修饰的Fc结构域(例如，野生型Fc结构域)的杂交核酸酶分子相比，所述杂交核酸酶分子的细胞毒性减少约3-5倍或至少约3倍。
在某些方面，具有DNase的杂交核酸酶分子的活性不低于对照DNase分子活性的约1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19、1/20、1/21、1/22、1/23、1/24、1/25、1/26、1/27、1/28、1/29、1/30或<1/30倍。在某些方面，具有DNase的杂交核酸酶分子的活性约等于对照DNase分子的活性。在某些方面，具有RNase的杂交核酸酶分子的活性不低于对照RNase分子活性的约1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19、1/20、1/21、1/22、1/23、1/24、1/25、1/26、1/27、1/28、1/29、1/30或<1/30倍。在某些方面，具有RNase的杂交核酸酶分子的活性约等于对照RNase分子的活性。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是多肽，其中第一核酸酶结构域的氨基酸序列包括人野生型RNase氨基酸序列，其中第一接头结构域是(Gly4Ser)n，其中n为0、1、2、3、4或5，其中Fc结构域的氨基酸序列包括人突变的IgG1Fc结构域的氨基酸序列，且其中第一接头结构域与第一核酸酶结构域的C-末端和Fc结构域的N-末端连接。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是包含表1所示序列的多肽，或由表1中所示的序列组成的多肽。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括与突变的人IgG1Fc结构域连接的野生型人DNase 1。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括与突变的人IgG1Fc结构域连接的人DNase1G105R A114F，所述连接通过(gly4ser)n接头结构域，其中n＝0、1、2、3、4或5。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括与突变的人IgG1Fc结构域连接的野生型人RNase1，所述人IgG1Fc结构域与野生型人DNase1连接。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括与突变的人IgG1Fc结构域连接的野生型人RNase 1，所述人IgG 1Fc结构域与人DNase1G105RA114F连接。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是多肽，其中第一核酸酶结构域的氨基酸序列包含RNase氨基酸序列，其中第一接头结构域的长度在5至32个氨基酸之间，其中Fc结构域的氨基酸序列包含人Fc结构域氨基酸序列，且其中第一接头结构域与第一核酸酶结构域的C-末端和Fc结构域的N-末端偶联。在某些实施方式中，接头结构域包括(Gly4Ser)5和限制性位点BglII、AgeI和XhoI。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是多肽，其中第一核酸酶结构域的氨基酸序列包括人RNase氨基酸序列，其中第一接头结构域是长度为5至32个氨基酸的NLG肽，其中Fc结构域的氨基酸序列包括人突变的Fc结构域氨基酸序列，且其中第一接头结构域与第一核酸酶结构域的C-末端和Fc结构域的N-末端偶联。
在某些实施方式中，所述的Fc结构域基本上不与人细胞上的Fc受体结合。在某些实施方式中，所述Fc结构域被修饰以降低其与Fcγ受体、补体蛋白或这两者的结合。在某些方面，当与对照分子相比时，Fc受体的结合降低约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。在某些方面，与具有未经修饰的Fc结构域(例如，野生型Fc结构域)的杂交核酸酶分子相比，所述杂交核酸酶分子的Fc受体结合减少约3-5倍或至少约3倍。
在某些实施方式中，Fc结构域与人细胞上的Fc受体结合。在某些实施方式中，分子的血清半衰期显著长于单独的第一核酸酶结构域的血清半衰期。在某些实施方式中，分子的第一核酸酶结构域的核酸酶活性与单独的核酸酶结构域相同或更高。在某些实施方式中，小鼠狼疮模型检测的结果显示给予小鼠分子可以增加小鼠的存活率。在某些方面，所述杂交核酸酶分子降解循环系统中的RNA、DNA或者这两者。在其它方面，所述杂交核酸酶分子降解免疫复合物中的RNA、DNA或者这两者。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子抑制干扰素-α的产生。在某些方面，当与对照分子比较时，干扰素-α的产生减少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括前导序列。在某些实施方式中，前导序列是来自人κ轻链家族的人VK3LP肽，且前导序列与第一核酸酶结构域的N-末端偶联。在某些实施方式中，所述VK3LP的序列如SEQ ID NO:100所示。
在某些实施方式中，所述分子是多肽。在某些实施方式中，所述分子是多核苷酸。
在某些实施方式中，所述第一核酸酶结构域包括RNase。在某些实施方式中，RNase是人RNase。在某些实施方式中，所述RNase是多肽，所述多肽包含与表1中所示的RNase氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述RNase是人RNase A家族成员。在某些实施方式中，所述RNase是人胰RNase1。
在某些实施方式中，所述第一核酸酶结构域包括DNase。在某些实施方式中，DNase是人DNase。在某些实施方式中，所述DNase是多肽，所述多肽包含与表1中所示的DNase氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述DNase选自下组：人DNase I、TREX1和人DNase 1L3。
在某些实施方式中，所述Fc结构域是人Fc结构域。在某些实施方式中，所述Fc结构域是突变的Fc结构域。在某些实施方式中，所述Fc结构域是包括SSS、P238S和/或P331S的突变的Fc结构域。在某些实施方式中，所述Fc结构域是人IgG1Fc结构域。在某些实施方式中，所述Fc结构域是多肽，所述多肽包含与表1中所示的Fc结构域氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约1至约50个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约5至约31个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约15至约25个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约20至约32个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约20个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约25个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域的长度为约18个氨基酸。在某些实施方式中，第一接头结构域包含gly/ser肽。在某些实施方式中，gly/ser肽为通式(Gly4Ser)n所示，其中n为选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的正整数。在某些实施方式中，gly/ser肽包括(Gly4Ser)3。在某些实施方式中，gly/ser肽包括(Gly4Ser)4。在某些实施方式中，gly/ser肽包括(Gly4Ser)5。在某些实施方式中，第一接头结构域包括至少一个限制性位点。在某些实施方式中，第一接头结构域包括约12个或更多个核苷酸，所述核苷酸包含至少一个限制性位点。在某些实施方式中，第一接头结构域包括两个或多个限制性位点。在某些实施方式中，第一接头结构域包括多个限制性位点。在某些实施方式中，第一接头结构域包括NLG肽。NLG肽含有N-连接糖基化共有序列。在实施方式中，所述NLG肽具有如SEQ ID NO:99所示的序列。在某些实施方式中，所述第一接头结构域包括N-连接糖基化位点。
在某些实施方式中，第一核酸酶结构域与Fc结构域的N-末端连接。在某些实施方式中，第一核酸酶结构域与Fc结构域的C-末端连接。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子进一步包括第二核酸酶结构域。在某些实施方式中，第一和第二核酸酶结构域是不同的核酸酶结构域。在某些实施方式中，第一和第二核酸酶结构域是相同的核酸酶结构域。在某些实施方式中，第二核酸酶结构域与Fc结构域的C-末端连接。在某些实施方式中，第二核酸酶结构域与Fc结构域的N-末端连接。在某些实施方式中，第二核酸酶结构域与第一核酸酶结构域的C-末端连接。在某些实施方式中，第二核酸酶结构域与第一核酸酶结构域的N-末端连接。
本申请还公开了包含第一多肽和第二多肽的二聚体多肽，其中第一多肽包含第一核酸酶结构域和Fc结构域，其中第一核酸酶结构域与Fc结构域有效偶联。在某些实施方式中，第二多肽是包含第二核酸酶结构域的第二杂交核酸酶和第二Fc结构域，其中第二核酸酶结构域与第二Fc结构域有效偶联。
本申请还公开了药物组合物，所述药物组合物包含如本申请所述的至少一个杂交核酸酶分子和/或至少一个二聚体多肽，以及药学上可接受的赋形剂。
本申请还公开了编码本申请所公开的杂交核酸酶分子的核酸分子。本申请还公开了包含本申请所公开的核酸分子的重组表达载体。本申请还公开了用本申请所公开的重组表达载体转染的宿主细胞。
本申请还公开了一种制备本申请所公开的杂交核酸酶的方法，所述方法包括：提供包含编码杂交核酸酶分子核酸序列的宿主细胞；以及在表达杂交核酸酶分子的条件下维持宿主细胞。
本申请还公开了一种治疗或预防与免疫应答异常相关状况的方法，所述方法包括给予所需患者有效量的本申请所公开的分离杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，所述状况是自身免疫病。在某些实施方式中，自身免疫病选自胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎、类风湿性关节炎、实验性自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、实验性葡萄膜炎、桥本氏甲状腺炎、原发性粘液性水肿、甲状腺毒症、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、爱迪生氏病、过早绝经、男性不育、青少年糖尿病、肺出血肾炎综合征、寻常型天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体炎性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎Hbs-ve、隐源性肝硬化、溃疡性结肠炎、舍格伦综合征、硬皮病、韦格纳肉芽肿、多肌炎、皮肌炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)和结缔组织病。在某些实施方式中，自身免疫病是系统性红斑狼疮(SLE)。
本申请还公开了一种治疗SLE的方法，所述方法包括给予个体有效量的含有核酸酶的组合物以降解含有RNA、DNA或者RNA和DNA两者的免疫复合物。在某些方面，所述组合物包括药学上可接受的载体和如本申请所述的杂交核酸酶分子。在其它方面，所述组合物包括杂交核酸酶分子，所述杂交核酸酶分子包括如SEQ ID NO:62、64、66、68、70、78、80、82、84、86、92、94、96或98所示的氨基酸序列。
附图说明
通过下面的描述及相应附图，使本发明的这些和其它特征、方面和益处更加便于理解，其中：
图1显示了用于制备杂交核酸酶分子的不同实施方式的示意结构。
图2显示了单次静脉注射后从小鼠血清中回收的RSLV-124的浓度。
图3显示了通过检测各时间的相对荧光单位(RFU)，获得的从小鼠血清中回收的RLSV-124的RNase酶活性检测结果。
图4显示了由分子的RNase酶活性外推得到的小鼠血清中RSLV-124的浓度。
图5显示了两只RNase转基因(Tg)小鼠与正常B6小鼠比较的血清单相酶扩散(SRED)分析结果。
图6显示了在Tg和双Tg(DTg)小鼠中利用ELISA检测得到的RNaseA浓度。各点表示在各只小鼠中检测得到的浓度。
图7显示了TLR7.1Tg与TLR7.1xRNaseA DTg小鼠比较的存活情况。
图8显示了在Tg与DTg小鼠比较的脾脏中IRG的定量PCR结果。
图9显示了RSLV 125-129构建体(SEQ ID NO：208-217)的COS转染上清液的Western印迹。
图10显示了用SRED分析，对在经RSLV转染的COS上清液中由蛋白A纯化得到的蛋白等分物进行比较的结果。
图11a-c显示了在经RSLV融合质粒转染的COS7上清液中由蛋白A纯化后的蛋白进行DNase核酸酶活性检测的结果。
图12显示了针对各蛋白的作为时间的函数的RFU(相对荧光单位)。
图13显示了所检测的不同分子的Lineweaver Burk曲线。
图14显示了细胞毒性数据图，显示了死亡细胞百分率是具有野生型或突变的Fc结构域的RNaseIg分子的融合蛋白浓度的函数。
图15显示了72小时后THP-1染色细胞的直方图叠加。
图16显示了RSLV-132抑制SLE患者的免疫复合物诱导产生干扰素-α的能力。
图17显示了RSLV-132在体内抑制RNA诱导的干扰素-α产生的能力。
图18显示了与野生型RNase和RSLV-124相比，在4℃下贮存8周的两个产品批次的RSLV-132的RNase酶活性检测结果。
图19显示了通过检测各时间的RFU，获得的RSLV-133、RSLV-123和RSLV-124相对于RNase A的RNase酶活性检测结果。
图20显示了通过检测各时间的RFU，获得的RSLV-133和RSLV-123相对于DNase 1的DNase酶活性检测结果。
图21显示了对RSLV-133消化DNA的能力与RSLV-123和野生型DNase 1进行比较的胶内消化实验结果。
图22显示了利用FACS分析检测平均荧光强度，测定的RSLV-124和RSLV-132与THP1细胞携带的Fc-受体的结合。
发明详述
系统性红斑狼疮(SLE)是一种多系统自身免疫性疾病，其特征为存在较高滴度的直接针对自身核蛋白的自身抗体。有确凿的证据表明，在SLE中对死亡和濒死细胞的清除或处理缺陷导致该疾病的发生，该疾病主要由核糖-和脱氧-核糖核蛋白(简称为核蛋白)的聚集导致。核蛋白主要通过三种机制导致损伤：i)激活先天免疫系统从而产生炎性细胞因子；ii)作为抗原以产生循环系统中的免疫复合物；和iii)作为抗原以产生在局部如肾脏形成的原位复合物。本发明至少部分基于细胞外核酸的消化在体内具有治疗效果的这一发现。
相应地，本发明提供了通过给予有效量的核酸酶活性以降解含有细胞外RNA和DNA的复合物来治疗疾病的方法，所述疾病的特征在于对凋亡细胞和细胞碎片的清除和处理存在缺陷，如SLE。这种治疗能够抑制I型干扰素(IFN)的产生，其为SLE中主要的细胞因子并且与疾病的活动度和肾炎密切相关。
在一个实施方式中，通过给予核酸酶活性治疗个体，所述核酸酶活性是DNase或RNase活性，优选以杂交核酸酶分子形式。在一个方面，所述核酸酶活性是第一核酸酶结构域。在另一个方面，所述核酸酶结构域与经修饰的Fc结构域偶联以使得所述分子具有降低的细胞毒性。在一个方面，杂交核酸酶分子包括第二核酸酶结构域。
在另一个方面，本申请提供了一种治疗SLE的方法，其中给予个体有效量的包括核酸酶的组合物。在一个方面，治疗使得含有RNA、DNA或者RNA和DNA两者的免疫复合物降解。在另一个方面，治疗使得在个体中抑制I型干扰素，如干扰素-α。在一个方面，一种治疗个体的方法包括给予有效量的杂交核酸酶分子组合物，所述杂交核酸酶分子包括如SEQ ID NO：62、64、66、68、70、78、80、82、84、86、92、94、96或98所示的氨基酸序列。在另一个方面，所述组合物包括如SEQ ID NO：96或98所示的氨基酸序列的杂交核酸酶分子。
除非另有说明，对权利要求书和说明书中术语的定义如下文所示。如果与原临时专利申请中的术语发生直接冲突，则以本申请说明书中使用的术语为准。
“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸具有类似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸指经遗传编码的氨基酸以及随后经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团连接，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指结构与氨基酸的一般化学结构不同，但是功能与天然存在的氨基酸类似的化合物。
本发明中氨基酸既可以以通常已知的三个字母的形式表示，也可以以IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一个字母的形式表示。同样地，核苷酸可以以常规的单一字母代码表示。
“氨基酸取代”指预设氨基酸序列(初始多肽的氨基酸序列)中的至少一个存在的氨基酸残基被另一个不同的“替代”氨基酸残基所替代。“氨基酸插入”指将至少一个额外的氨基酸加入预设的氨基酸序列。插入通常由一个或两个氨基酸残基的插入组成，但可以进行更长的“肽插入”，例如插入约三个至约五个或甚至约十个、十五个或二十个氨基酸残基。插入的残基可以是上文所述的天然存在的或非天然存在的残基。“氨基酸删除”指从预设的氨基酸序列中除去至少一个氨基酸残基。
“多肽”、“肽”、和“蛋白”在本发明中可以互换使用，均是指氨基酸残基的聚合物。这些术语用于描述天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，也可以描述这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是与天然存在的氨基酸相对应的人工化学模拟物。
“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。除特别限定，该术语包括含有天然核苷酸已知类似物的核酸，所述核酸与标准核酸具有类似的结合性质，且通过与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除另有说明，特定核酸序列还隐含了其适当的修饰变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及其明确表示的序列。特别地，通过将序列中的一个或多个选定(或全部)密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Cassol et al.,1992；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)，可以在获得的序列中实现简并密码子取代。对于精氨酸和亮氨酸，在第二个碱基的修饰也可以是保守的。术语核酸可以与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。
本发明的多核苷酸可以由任意多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未经修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由下列分子组成：单链和双链DNA、单链和双链区域混合物DNA、单链和双链RNA、以及单链和双链区域混合物RNA，以及杂交分子，所述杂交分子包含单链DNA和RNA，或更典型地双链DNA和RNA，或单链和双链区混合的DNA和RNA。此外，多核苷酸可以由三链区域组成，其包含RNA、或DNA、或RNA和DNA二者都有。多核苷酸还可以包含一个或多个修饰的碱基，或出于稳定或其它原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯基碱基和罕见碱基如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括经化学、酶或代谢而修饰的形式。
在本申请中，术语“杂交核酸酶分子”指包含至少一个核酸酶结构域和至少一个Fc结构域的多核苷酸或多肽。杂交核酸酶分子也指融合蛋白和融合基因。例如，在某个实施方式中，杂交核酸酶分子可以是多肽，其包含与核酸酶结构域，如DNase和/或RNase，相连接的至少一个Fc结构域。作为另一个例子，杂交核酸酶分子可以包含RNase核酸酶结构域、接头结构域和Fc结构域。杂交核酸酶分子的例子包括SE ID NO：62、64、66、68、70、78、80、82、84、86、92、94、96和98。其它例子将在下文中更详细的描述。在某个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子可以包括附加的修饰。在另一个实施方式中，可以修饰杂交核酸酶分子来加入功能性基团(例如，PEG、药物或标记)。
如申请所使用的，“杂交双特异性核酸酶分子”或“双核酸酶分子”指具有两个或多个核酸酶结构域例如DNase结构域和RNase结构域的杂交核酸酶分子。
在某些方面，本发明的杂交核酸酶分子可以引入一个或多个“接头结构域”，如多肽接头。本申请使用的术语“接头结构域”指在线性序列中连接两个或多个结构域的序列。本申请使用的术语“多肽接头”指在多肽链的线性氨基酸序列中连接两个或多个结构域的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)。例如，多肽接头可以将核酸酶结构域与Fc结构域连接。优选地，此类多肽接头可以为多肽分子提供柔韧性。在某些实施方式中，多肽接头用于连接(例如，基因融合)一个或多个Fc结构域和/或一个或多个核酸酶结构域。本发明的杂交核酸酶分子可以包含多于一个的接头结构域或肽接头。
本申请所使用的术语“gly-ser多肽接头”指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性的gly/ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在某个实施方式中，n＝1。在某个实施方式中，n＝2。在另一个实施方式中，n＝3，即Ser(Gly4Ser)3。在另一个实施方式中，n＝4，即Ser(Gly4Ser)4。在另一个实施方式中，n＝5。在又一个实施方式中，n＝6。在另一个实施方式中，n＝7。在又一个实施方式中，n＝8。在另一个实施方式中，n＝9。在又一个实施方式中，n＝10。另一个示例性gly/ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在某个实施方式中，n＝1。在某个实施方式中，n＝2。在一个优选实施方式中，n＝3。在另一个实施方式中，n＝4。在另一个实施方式中，n＝5。在又一个实施方式中，n＝6。
本申请使用的术语“连接的”、“融合的”、或“融合”可以互换使用。这些术语指两个以上元件或部分或结构域通过任意方式连接在一起，包括化学偶联或重组的方式。化学偶联的方法(例如，使用异双功能交联剂)是本领域已知的。
本申请使用的术语“Fc区域”的定义为，由两条重链各自的Fc结构域(或Fc部分)形成的天然免疫球蛋白的一部分。
本申请使用的术语“Fc结构域”指单个免疫球蛋白(Ig)重链的一部分，其中所述Fc结构域不包括Fv结构域。因此，也可以将Fc结构域称作“Ig”或“IgG”。在某些实施方式中，Fc结构域刚好起始于铰链区的木瓜蛋白酶裂解位点的上游，且终止于抗体的C-末端。相应地，完整的Fc结构域包含至少一个铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方式中，Fc结构域包含以下区域中的至少一个：铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域，或者其变体、部分或片段。在其它实施方式中，Fc结构域包含完整的Fc结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在某个实施方式中，Fc结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)。在另一个实施方式中，Fc结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)。在另一个实施方式中，Fc结构域由CH3结构域或其部分组成。在另一个实施方式中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在另一个实施方式中，Fc结构域由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在另一个实施方式中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在某个实施方式中，Fc结构域缺少CH2结构域的至少一部分(例如，全部或部分CH2结构域)。在某个实施方式中，本发明的Fc结构域至少包含本领域已知的FcRn结合所需的那部分Fc分子。在另一个实施方式中，本发明的Fc结构域至少包含本领域已知的FcγR结合所需的那部分Fc分子。在某个实施方式中，本发明的Fc结构域至少包含本领域已知的蛋白A结合所需的那部分Fc分子。在某个实施方式中，本发明的Fc结构域至少包含本领域已知的蛋白G结合所需的那部分Fc分子。本发明中的Fc结构域通常指包含免疫球蛋白重链的全部或部分Fc结构域的多肽。即包括，但不限于，包含整个CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域的多肽，以及仅包含例如铰链、CH2和/或CH3结构域的此类肽的片段。Fc结构域可以来自任意种属和/或任意亚型的免疫球蛋白，包括但不限于，人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。Fc结构域包含天然Fc和Fc变体分子。对于Fc变体和天然Fc，术语Fc结构域包括单体或多聚体形式，无论是从完整的抗体上酶切得到还是通过其它方式产生。根据Kabat的定义对Fc结构域中的氨基酸残基序号进行分配。参见例如Sequences of Proteins ofImmunological Interest(目录、前言和恒定区序列章节)，第五版，Bethesda,MD:NIHvol.1:647-723(1991)；Kabat等,"Introduction"Sequences of Proteins ofImmunological Interest,US Dept of Health and Human Services,NIH，第五版，Bethesda,MD vol.1:xiii-xcvi(1991)；Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia et al.,Nature 342:878-883(1989)，其均通过引用为各种目的并入本申请。
如本申请所述，本领域的普通技术人员知晓，对任意Fc结构域进行修饰后的氨基酸序列将不同于天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fc结构域的氨基酸序列。在某些示例性实施方式中，Fc结构域保留了效应器功能(例如，FcγR结合)。
本发明多肽的Fc结构域可以来自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fc结构域可以包括来自IgG1分子的CH2和/或CH3结构域和来自IgG3分子的铰链区。在另一个例子中，Fc结构域可以包括嵌合铰链区，所述嵌合铰链区部分来自IgG1分子以及部分来自IgG3分子。在另一个例子中，Fc结构域可以包括嵌合铰链区，所述嵌合铰链区部分来自IgG1分子以及部分来自IgG4分子。
“来自”指定多肽或蛋白的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。优选地，来自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与所述序列或其部分基本上相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少10-20个氨基酸组成，优选地至少20-30个氨基酸，更优选地至少30-50个氨基酸，或其它的能被本领域技术人员鉴定为在序列中具有该来源的部分。
来自另一个肽的多肽可以具有相对于初始多肽的一个或多个突变，例如一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸残基所取代，或具有一个或多个氨基酸残基插入或删除。
多肽可以包含非天然存在的氨基酸序列。此类变体必然与初始杂交核酸酶分子具有低于100％的序列相同性或相似性。在一个优选实施方式中，变体的氨基酸序列例如，在覆盖变体分子全长的范围内，与初始多肽的氨基酸序列具有约75％至低于100％的氨基酸序列相同性或相似性，更优选地约80％至低于100％、更优选地约85％至低于100％、更优选地约90％至低于100％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)以及最优选地约95％至低于100％。
在一个实施方式中，在初始多肽序列与来自所述初始多肽的序列之间有一个氨基酸的不同。与所述序列的相同性或相似性在本申请中定义为，在对序列进行比对并根据需要引入空位以使得序列的相同性达到最高百分比后，在参比序列中与起始氨基酸残基相同(即，相同残基)的氨基酸残基的百分比。
在一个实施方式中，本发明的多肽包含、由、或基本上由选自表1的氨基酸序列及其功能上有活性的变体组成。在一个实施方式中，多肽包括与表1所示的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方式中，多肽包括与表1所示的连续的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的连续的氨基酸序列。在一个实施方式中，多肽包括具有表1所示的氨基酸序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400或500个(或这些数字之间的任意整数)连续氨基酸的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明的多肽由核苷酸序列编码。本发明的核苷酸序列可以用于多种用途，包括：克隆、基因治疗、蛋白表达和纯化、引入突变、对所需宿主进行DNA免疫、生成抗体用于例如被动免疫、PCR、生成引物和探针、siRNA的设计和生成(参见，例如Dharmacon siDesign网站)，等等。在一个实施方式中，本发明的核苷酸序列包含、由或基本上由选自表1的核苷酸序列组成。在一个实施方式中，核苷酸序列包括与表1所示的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在一个实施方式中，核苷酸序列包括与表1所示的连续的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的连续的核苷酸序列。在一个实施方式中，核苷酸序列包括具有表1所示的核苷酸序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400或500个(或这些数字中的任意整数)连续核苷酸的核苷酸序列。
本申请优选的杂交核酸酶分子包含来自人免疫球蛋白序列的序列(例如，至少一个Fc结构域)。但是，序列可以包含来自其它哺乳动物种属的一个或多个序列。例如，在所述序列中可以包括灵长类的Fc结构域或核酸酶结构域。或者，在多肽中可以存在一个或多个鼠源性的氨基酸。在某些实施方式中，本发明的多肽序列无免疫原性和/或具有降低的免疫原性。
本领域的普通技术人员还知晓，可以改变本发明的杂交核酸酶分子，使其与天然存在的序列或其来自的天然序列相比，序列发生改变，但仍保留天然序列的所需活性。例如，可以进行核苷酸或氨基酸取代，使“非必需”氨基酸残基处发生保守取代或改变。可以在免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸的取代、加入或删除，使得在编码的蛋白中引入一个或多个核苷酸的取代、加入或删除，由此构建得到分离的核酸分子，其编码来自免疫球蛋白(例如，Fc结构域)的杂交核酸酶分子的非天然变体，可以通过标准技术引入突变，如位点直接突变和PCR介导的突变。
本发明的肽杂交核酸酶分子可以在一个或多个氨基酸残基处包含保守性氨基酸取代，例如在必需或非必需氨基酸残基处。“保守性氨基酸取代”指氨基酸残基被与之有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域对具有相似侧链的氨基酸残基家族进行了定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选地，结合多肽的非必需氨基酸残基被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基所替代。在另一个实施方式中，一串氨基酸可以被结构上类似但序列和/或侧链家族成员的组成不同的一串氨基酸替代。或者，在另一个实施方式中，可以将突变随机引入全部或部分编码序列，如利用饱和突变，再将产生的变异体加入本发明的结合多肽中，并筛选其与所需靶点的结合能力。
术语“改善”指对疾病状态，例如自身免疫病状态(例如，系统性红斑狼疮)进行治疗后的任意有益的治疗结果，包括状态的预防、严重性减轻或进展延缓、消除、或治愈。
术语“原位”指活细胞在活的有机体外的生长过程，例如，在组织培养物中生长。
术语“体内”指发生在活的有机体内的过程。
本申请中使用的术语“哺乳动物”或“主体”或“患者”包括人类和非人类，并且包括但不限于人类、非人灵长类、犬、猫、鼠、牛、马和猪。
当术语“相同”百分率用于两个或多个核酸或多肽序列时，是指当对两个或多个序列或子序列，采用下文所述的序列比较算法之一(例如，本领域技术人员可采用的BLASTP和BLASTN或其它算法)或目测检测进行比较或比对，以实现最大一致性时，相同的核苷酸或氨基酸残基的特定百分率。根据其应用不同，“相同”百分率可以存在于被比较的序列区域，例如功能性机构域，或者存在于被比较的两个序列的全长。
对于序列比较而言，一般地将一条序列作为对照序列与待测序列进行比较。当使用序列比较算法时，将待测和对照序列输入计算机，如有必要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。随后采用该序列比较算法根据指定的程序参数计算待测序列相对于对照序列的序列相同百分率。
可以通过以下方法对序列进行最优比对以进行比较，例如Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性研究方法，可以使用这些算法的计算机执行形式(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)，或通过目测(通常参见上文所述的Ausubel et al.)。
适于确定序列相同性和序列相似性百分率算法的一个例子为BLAST算法，已在Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中对其进行了描述。公众可在国家生物技术信息中心的网站获得进行BLAST分析的软件。
术语“足量”指足以产生所需结果的量，例如足以调节细胞内蛋白聚集的量。
术语“治疗有效量”是指有效改善疾病症状的量。当将预防认为是治疗时，治疗有效量可以是“预防有效量”。
必须注意的是，除非文中明确表示为其它含义，否则在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式的“一个”、“一个”和“这种”包括复数含义。
组合物
杂交核酸酶分子
在某些实施方式中，本发明的组合物包括杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括与Fc结构域有效连接的核酸酶结构域。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括与Fc结构域连接的核酸酶结构域。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是核酸酶蛋白。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是核酸酶多核苷酸。
在某些实施方式中，核酸酶结构域通过接头结构域与Fc结构域连接。在某些实施方式中，接头结构域是接头肽。在某些实施方式中，接头结构域是接头核苷酸。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括前导分子，例如前导肽。在某些实施方式中，前导分子是位于核酸酶结构域N-末端的前导肽。在实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包括在所述分子N-末端的前导肽，其中所述前导肽随后从所述核酸酶分子上裂解。制备编码与重组蛋白融合的前导肽的核酸序列的方法是本领域所公知的。在实施方式中，本发明的任意杂交核酸酶分子可以在具有或不具有与其N-末端融合的前导肽的条件下表达。本领域技术人员能够预测和/或推断所融合的前导肽裂解后本发明的杂交核酸酶分子的蛋白序列。本发明的杂交核酸酶分子的例子还包括VK3前导肽(VK3LP)，其中所述前导肽融合至所述杂交核酸酶分子的N-末端，如SEQ ID NOS：92(RSLV-132)和94(RSLV-133)所示。相应的核苷酸序列分别如SEQ ID NOS：91和93所示。在实施方式中，VK3前导肽裂解后，这些杂交核酸酶分子的序列分别如SEQ ID NOS:96(RSLV-132)和98(RSLV-133)所示。相应的核苷酸序列分别如SEQ IDNOS：95和97所示。在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子在不具有与其N-末端融合的前导肽的条件下表达，并且所得到的杂交核酸酶分子具有N-末端甲硫氨酸。
在某些实施方式中，所述杂交核酸酶分子将包括终止密码子。在某些实施方式中，所述终止密码子将在所述Fc结构域的C-末端。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子进一步包括第二核酸酶结构域。在某些实施方式中，第二核酸酶结构域通过第二接头结构域与Fc结构域连接。在某些实施方式中，第二接头结构域位于Fc结构域的C-末端。图1显示了杂交核酸酶分子的至少一个实施方式。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括表1所示的序列。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是与Fc结构域连接的RNase分子或DNase分子或多酶分子(例如，RNase和DNase二者都有，或具有不同底物特异性的两个RNA或DNA核酸酶)，所述Fc结构域与细胞外免疫复合物特异性结合。在某些实施方式中，Fc结构域不能有效地与Fcγ受体结合。在一个方面，杂交核酸酶分子不能有效地与C1q结合。在其它方面，杂交核酸酶分子包含来自IgG1的框内Fc结构域。在其它方面，杂交核酸酶分子进一步包含在铰链、CH2、和/或CH3结构域的突变。在其它方面，突变是P238S、P331S或N297S，且可以在三个铰链半胱氨酸中包含一个或多个的突变。在某些此类方面，在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个的突变可以是SCC或SSS。在其它方面，分子包含SCC铰链，但除此之外具有野生型的人IgG1Fc CH2和CH3结构域，且与Fc受体有效地结合，促进杂交核酸酶分子被摄取进入与之结合的细胞的内吞小泡。在其它方面，分子具有针对单链和/或双链RNA底物的活性。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括突变的Fc结构域。在某些方面，杂交核酸酶分子包括突变的IgG1Fc结构域。在某些方面，突变的Fc结构域在铰链、CH2和/或CH3结构域包括一个或多个突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P331S突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S突变和P331S突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，并且可以在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个包括突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或在三个铰链半胱氨酸中变成SSS或在一个铰链半胱氨酸中变成SCC的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和P331S和在三个铰链半胱氨酸中的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和P331S，以及SCC或SSS。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和P331S和SCC。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S SSS。在某些方面，突变的Fc结构域包括P331S，以及SCC或SSS。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中变成SSS的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中的一个变成SCC的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括SCC或SSS。在某些方面，突变的Fc结构域是如下述任意SEQ ID NO：59、60、71-76或87-90所示。在某些方面，杂交核酸酶分子是如下述任意SEQ ID NO：62、64、66、68、70、78、80、82、84、86、92、94、96或98所示。在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1结构域，其与包括SCC、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域或包括SSS、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接。在某些方面，编码杂交核酸酶分子的核酸序列如SEQ ID NO：61、77或91所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO：62、78、92或96所示。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域与包括SCC、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域或包括SSS、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接。在某些方面，编码杂交核酸酶分子的核酸序列如SEQ ID NO：63或79所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO：64或80所示。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括人DNase1G105R A114F结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域与包括SCC、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，并且所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与野生型人RNase1结构域连接。在某些方面，杂交核酸酶分子包括人DNase1G105R A114F结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域与包括SSS、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，并且所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与野生型人RNase1结构域连接。在某些方面，编码杂交核酸酶分子的核酸序列如SEQ ID NO：65或81所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO：66或82所示。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域与包括SCC、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，并且所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与人DNase1G105R A114F结构域连接。在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1结构域，其通过(Gly4Ser)4接头结构域与包括SSS、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，并且所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与人DNase1G105R A114F结构域连接。在某些方面，编码杂交核酸酶分子的核酸序列如SEQ ID NO：67和83所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO：68或84所示。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1，其与包括SCC、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，并且所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与人DNase1G105R A114F结构域连接。在某些方面，杂交核酸酶分子包括野生型人RNase1，其与包括SSS、P238S和P331S的突变的人IgG1Fc结构域连接，并且所述突变的人IgG1Fc结构域通过NLG接头结构域与人DNase1G105R A114F结构域连接。在某些方面，编码杂交核酸酶分子的核酸序列如SEQ ID NO：69、85或93所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO：70、86、94或98所示。
在某些方面，杂交核酸酶分子的活性可以在体外和/或体内检测。在某些方面，杂交核酸酶分子与细胞、恶性细胞或癌细胞结合，并且干扰所述细胞的生物活性。
在其它方面，提供了多功能RNase分子，其连接于另一个具有结合特异性的酶或抗体，如靶向于RNA的scFv，或与第一结构域具有相同或不同特异性的第二核酸酶结构域。
在另一方面，提供了多功能的DNase分子，其连接于另一个具有结合特异性的酶或抗体，如scFv，所述scFv靶向于DNA，或以与第一结构域相同或不同的特异性靶向于第二核酸酶结构域。
在另一方面，杂交核酸酶分子适于在哺乳动物中预防或治疗疾病或状况，通过对有需要的哺乳动物给药治疗有效量的连接至Fc区域的杂交核酸酶分子，以预防或治疗疾病。在其它方面，疾病或状况是自身免疫病或癌症。在某些此类方面，自身免疫病是胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎、类风湿性关节炎、实验性自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、实验性葡萄膜炎、桥本氏甲状腺炎、原发性粘液性水肿、甲状腺毒症、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、爱迪生氏病、过早绝经、男性不育、青少年糖尿病、肺出血肾炎综合征、寻常型天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体炎性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎Hbs-ve、隐源性肝硬化、溃疡性结肠炎、舍格伦综合征、硬皮病、韦格纳肉芽肿、多肌炎、皮肌炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮或结缔组织病。
在某些实施方式中，RNase杂交核酸酶分子的RNase酶活性靶点主要在细胞外，由例如抗-RNP自身抗体免疫复合物中的RNA和凋亡中的细胞表面表达的RNA组成。在某些实施方式中，RNase核酸酶分子在内吞小泡的酸性环境中有活性。在某些实施方式中，RNase杂交核酸酶分子包括野生型(wt)的Fc结构域，从而例如允许分子与FcR结合，并且通过免疫复合物利用的进入途径进入内吞小泡。在某些实施方式中，包括野生型Fc结构域的RNase杂交核酸酶分子被改造成在细胞外和内吞环境(此处可以表达TLR7)中均具有活性。在某些方面，这使得包含野生型Fc结构域的RNase核酸酶分子通过之前吞入的免疫复合物或病毒感染后活化TLR7的RNA来终止TLR7信号转导。在某些实施方式中，RNase杂交核酸酶分子的野生型RNase对RNase胞质抑制剂的抑制作用没有抗性。在某些实施方式中，RNase杂交核酸酶分子的野生型RNase在细胞的胞质中无活性。
在某些实施方式中，包含野生型Fc结构域的杂交核酸酶分子用于治疗自身免疫病，例如系统性红斑狼疮。
在某些实施方式中，Fc结构域与Fc受体(FcR)的结合增加，例如通过糖基化的改变和/或氨基酸序列的变化。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子具有一个或多个Fc改变，使FcR结合增加。
设想了构建杂交核酸酶分子与Fc结构域连接的替代方式。在某些实施方式中，可以改变结构域的方向以构建Ig-RNase分子或Ig-DNase分子或RNase-Ig分子或RNase-Ig分子，其仍能与FcR结合且具有活化的核酸酶结构域。
在某些实施方式中，DNase杂交核酸酶分子包括野生型Fc结构域，所述结构域能够允许例如分子在与FcR结合后被胞吞。在某些实施方式中，DNase杂交核酸酶分子可作用于包含DNA的细胞外免疫复合物，其可以是可溶性形式或不可溶的复合物沉淀。
在某些实施方式中，杂交核酸酶包括DNase和RNase。在某些实施方式中，这些杂交核酸酶分子可以改善系统性红斑狼疮的治疗，因为其可以例如消化包含RNA、DNA，或RNA和DNA组合的免疫复合物；并且当其进一步包含野生型Fc结构域时，其在细胞外以及在TLR7和TLR9可以定位的内吞小泡中均具有活性。
在某些实施方式中，包括(gly4ser)3、4或5变体的接头结构域以5个氨基酸为级数改变接头结构域的长度。在另一个实施方式中，接头结构域的长度约18个氨基酸，且包括一个N-连接糖基化位点，其在体内对蛋白酶裂解敏感。在某些实施方式中，N-连接糖基化位点可以保护杂交核酸酶分子的接头结构域不被裂解。在某些实施方式中，N-连接糖基化位点可以协助将独立的功能性结构域的折叠分隔开来，所述独立的功能性结构域被接头结构域分隔。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子可以包括突变和/或野生型人IgG1Fc结构域。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子可以由COS瞬时和CHO稳定转染表达。在某些实施方式中，在杂交核酸酶分子中均保持了CD80/86结合能力和RNase活性。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括DNase1L3-Ig-接头-RNase构建体。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括DNase1-Ig-接头-RNase构建体或RNase-Ig-接头-DNase构建体。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子的酶结构域和其它结构域之间的融合连接点是经优化的。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括DNase-Ig杂交核酸酶分子和/或杂交DNase-RNase杂交核酸酶分子。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括TREX1。在某些实施方式中，TREX1杂交核酸酶分子可以酶切染色质。在某些实施方式中，TREX1杂交核酸酶分子由细胞表达。在某些实施方式中，表达的杂交核酸酶分子包括鼠源性的TREX-1和鼠源性的(野生或突变)Fc结构域。在某些实施方式中，TREX1和IgG铰链之间的20-25个氨基酸(aa)的接头结构域为DNase活性所需。在某些实施方式中，带有15个氨基酸的接头结构域的杂交核酸酶分子无活性。在某些实施方式中，染色质酶切检测结果显示，使用20和25个氨基酸的接头结构域(加上2个或多个氨基酸以引入限制性位点)可以获得功能性活性。在某些实施方式中，可以从TREX-1的COOH末端除去约72个氨基酸的疏水性区域，然后再通过接头结构域与Fc结构域融合。在某些实施方式中，与对照和/或其它杂交核酸酶分子相比，具有20个氨基酸的接头结构域的杂交核酸酶分子显示出较高的表达水平。在某些实施方式中，使用动态酶实验对杂交核酸酶分子的酶活性同对照进行定量比较。
在某些实施方式中，可以选择用于TREX1酶截短的融合连接点进行进一步优化，以改善杂交核酸酶分子的表达。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括带有20和/或25个氨基酸接头结构域的人TREX1-接头-Ig Fc结构域杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，接头结构域是(gly4ser)4或(gly4ser)5表达盒的变体，其连有一个或多个限制性位点以引入到杂交核酸酶分子构建体中。在某些实施方式中，由于头部至尾部的二聚化对TREX1的酶活性有用；因此可以使用一个柔性的、更长的接头结构域以促进适当的折叠。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子是TREX1-串联杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，另一种促使TREX1从头部至尾部折叠的方法是，产生一个TREX1-TREX1-Ig杂交的杂交核酸酶分子，其中加入两个串联的TREX1结构域，然后是一个接头结构域和一个Ig Fc结构域。在某些实施方式中，TREX1表达盒头尾连接的定位方式可以修正为在免疫酶的各臂上头尾折叠的方式，并且在该分子的各臂上均引入了一个单一的TREX1功能性结构域。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子的每个免疫酶均具有两个功能性TREX1酶，其与一个单一的IgG Fc结构域连接。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括TREX1-接头1-Ig-接头2-RNase。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括RNase-Ig-接头-TREX1。在某些实施方式中，当酶是反向构型时，对各个酶生成其氨基融合和羧基融合的表达盒，用于引入杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，无论RNase在杂交核酸酶分子中处于什么位置，其均表现出相当的功能性活性。在某些实施方式中，可以设计替代的杂交核酸酶分子以检测是否存在特定构型，使改进杂交核酸酶分子成分的表达和/或功能。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括1L3-Ig。在某些实施方式中，1L3DNase由鼠源性序列构建和表达。在某些实施方式中，酶是有活性的。在某些实施方式中，构建和表达鼠源性的1L3DNase-Ig-RNase杂交核酸酶。在某些实施方式中，分子包括人1L3-Ig、人1L3-Ig-RNase和/或人RNase-Ig-1L3。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括DNase1-Ig。在某些实施方式中，在DNase1-Ig杂交核酸酶分子中包括天然存在的变体等位基因A114F，所述A114F对肌动蛋白的敏感性降低。在某些实施方式中，将该突变引入杂交核酸酶分子以产生更加稳定的人DNase1衍生物。在某些实施方式中，制备包含20或25个氨基酸的接头结构域的DNase1-接头-Ig。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括RNase-Ig-接头-DNase1，其中DNase1结构域位于Ig Fc结构域的COOH一侧。在某些实施方式中，制备加入DNase1的杂交核酸酶分子，所述分子包括：DNase1-接头-Ig-接头2-RNase和/或RNase-Ig-接头-DNase1。
本发明的另一方面为利用一种或多种杂交核酸酶分子，采用基因治疗的方法治疗或预防状况、疾病和状态。基因治疗的方法涉及将杂交核酸酶分子的核酸(DNA、RNA和反义DNA或RNA)序列引入动物，以表达一种或多种本发明的多肽。该方法可以包括，引入一种或多种与启动子和遗传元件有效连接的编码本发明杂交核酸酶分子多肽的多核苷酸，所述遗传元件为靶组织中表达多肽所必需。
在基因治疗应用中，将杂交核酸酶分子基因引入细胞，以实现在体内合成治疗有效的基因产物。“基因治疗”包括全部两种常规的基因治疗，即一次治疗长期有效，以及给药基因治疗剂，其包括一次或多次给药治疗有效的DNA或mRNA。可以对寡核苷酸进行修饰以增强其摄取，例如使用不带电的基团取代带负电的磷酸二酯基团。
Fc结构域
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括Fc结构域。所述Fc结构域不包含与抗原结合的可变区。在实施方式中，Fc结构域不包含可变区。可以从多种不同来源获得用于产生本发明杂交核酸酶分子的Fc结构域。在优选实施方式中，杂交核酸酶分子的Fc结构域来自人免疫球蛋白。但是，可以理解，Fc结构域可以来自其它哺乳动物种属的免疫球蛋白，包括例如，啮齿类(例如小鼠、大鼠、家兔、豚鼠)或非人灵长类(例如，黑猩猩、短尾猴)种属。而且，杂交核酸酶分子的Fc结构域或其部分可以来自于任意免疫球蛋白种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任意免疫球蛋白亚型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个优选实施方式中，使用人IgG1亚型。
在某些方面，杂交核酸酶分子包括突变的Fc结构域。在某些方面，杂交核酸酶分子包括突变的IgG1Fc结构域。在某些方面，突变的Fc结构域包括在铰链、CH2和/或CH3结构域中的一个或多个突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P331S突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S突变和P331S突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，并且可以包括在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或在铰链半胱氨酸中变成SCC或在三个铰链半胱氨酸中变成SSS的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和P331S以及在三个铰链半胱氨酸中至少一个的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和P331S和SCC。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S和P331S和SSS。在某些方面，突变的Fc结构域包括P238S，以及SCC或SSS。在某些方面，突变的Fc结构域包括P331S，以及SCC或SSS。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸的一个或多个中的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中的一个变成SCC的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括SCC。在某些方面，突变的Fc结构域包括在三个铰链半胱氨酸中变成SSS的突变。在某些方面，突变的Fc结构域包括SSS。在某些方面，编码突变的Fc结构域的核酸序列如SEQ ID NO：59、71、73、75、87或89所示。在某些方面，突变的Fc结构域如SEQ ID NO：60、72、74、76、88或90所示。在某些方面，编码杂交核酸酶分子的核酸序列如SEQ ID NO：61、63、65、67、69、77、79、81、83、85、91、93、95或97所示。在某些方面，杂交核酸酶分子如SEQ IDNO：62、64、66、68、70、78、80、82、84、86、92、94、96或98所示。
各种Fc结构域基因序列(例如，人恒定区序列)均可以通过公众易于取得的形式获得。恒定区结构域包含Fc结构域序列，可以选择具有特定效应器功能(或缺乏特定效应器功能)或带有特定修饰的恒定区结构域，以降低免疫原性。很多抗体和抗体编码基因的序列已被公开，使用本领域已知的技术可以从这些序列中选取合适的Fc结构域序列(例如，铰链、CH2和/或CH3序列，或其部分)。随后，可以对使用任意前述方法获得的遗传材料进行改造或合成，以获得本发明的多肽。本发明的范围将进一步理解为包括恒定区DNA序列的等位基因、变体和突变。
可以将Fc结构域序列克隆，例如采用聚合酶链式反应和引物，选择的所述引物可用于扩增目标结构域。为了克隆来自抗体的Fc结构域序列，可以从杂交瘤、脾脏或淋巴细胞中分离mRNA，将其逆转录为DNA，并且利用PCR扩增抗体基因。对PCR扩增方法的详细描述，参见美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188；以及例如"PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications"Innis et al.eds.,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)；Ho et al.1989.Gene 77:51；Horton et al.1993.Methods Enzymol.217:270。PCR的启动可以通过通用的恒定区引物，或基于公开发表的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更为特异的引物。如上文所讨论的，PCR还可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在此情况下，可以利用通用引物或更大的同源探针如小鼠恒定区探针来筛选文库。许多适于抗体基因扩增的引物集合是本领域所公知的(例如，基于纯化抗体的N-末端序列的5'引物(Benhar and Pastan.1994.Protein Engineering 7:1509)；cDNA末端的快速扩增(Ruberti,F.et al.1994.J.Immunol.Methods 173:33)；抗体前导序列(Larrick etal.1989Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250))。对抗体序列克隆的进一步描述，参见Newman et al.,美国专利号5,658,570，申请日1995年1月25日，其通过引用并入本申请。
本发明的杂交核酸酶分子可以包含一个或多个Fc结构域(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多Fc结构域)。在一个实施方式中，Fc结构域可以是不同类型。在一个实施方式中，杂交核酸酶分子中的至少一个Fc结构域包含铰链结构域或其部分。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括至少一个CH2结构域或其部分。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括至少一个CH3结构域或其部分。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括至少一个CH4结构域或其部分。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括至少一个铰链结构域或其部分和至少一个CH2结构域或其部分(例如，在铰链-CH2方向)。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括至少一个CH2结构域或其部分和至少一个CH3结构域或其部分(例如，在CH2-CH3方向)。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括至少一个铰链结构域或其部分、至少一个CH2结构域或其部分以及至少一个CH3结构域或其部分，例如按以下方向：铰链-CH2-CH3、铰链-CH3-CH2或CH2-CH3-铰链。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包含至少一个来自一个或多个免疫球蛋白重链的完整Fc区域(例如，Fc结构域包括铰链、CH2和CH3结构域，但不需要其都来自相同的抗体)。在其它实施方式中，杂交核酸酶分子包含至少两个来自一个或多个免疫球蛋白重链的完整Fc区域。在优选实施方式中，完整Fc结构域来自人IgG免疫球蛋白重链(例如，人IgG1)。
在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括完整的CH3结构域。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括完整的CH2结构域。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包括至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括至少一个CH3结构域、至少一个铰链区域和一个CH2结构域。在一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括铰链和CH3结构域。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域包括铰链、CH2和CH3结构域。在优选实施方式中，Fc结构域来自人IgG免疫球蛋白重链(例如，人IgG1)。
组成本发明的杂交核酸酶分子Fc结构域的恒定区结构域或其部分可以来自不同免疫球蛋白分子。例如，本发明的多肽可以包含来自IgG1分子的CH2结构域或其部分和来自IgG3分子的CH3区域或其部分。在另一个实施例中，杂交核酸酶分子可以包含Fc结构域，所述Fc结构域包括一个铰链结构域，其部分来自IgG1分子和部分来自IgG3分子。如本申请所述，本领域的普通技术人员能够理解，可以对Fc结构域进行改变，使得其不同于天然存在的抗体分子中的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含一个或多个截短的Fc结构域，但仍足以赋予Fc区域与Fc受体(FcR)结合的性质。因此，本发明杂交核酸酶分子的Fc结构域可以包含FcRn结合部分，或由FcRn结合部分组成。FcRn结合部分可以来自任意同种型的重链，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方式中，使用人同种型IgG1抗体的FcRn结合部分。在另一个实施方式中，使用人同种型IgG4抗体的FcRn结合部分。
在一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子缺乏完整Fc区域的一个或多个恒定区结构域，即其部分或全部被删除。在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子将缺乏整个CH2结构域(ΔCH2构建体)。本领域技术人员会理解，可以优选此类构建体，因为CH2结构域可以调控抗体的分解代谢速率。在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含删除了CH2结构域的Fc区域，所述Fc结构域来自编码IgG1人恒定区结构域(参见，例如WO 02/060955A2和WO02/096948A2)的载体(例如，来自IDEC Pharmaceuticals,San Diego)。该示例性载体被改造为删除CH2结构域，并提供合成载体，所述合成载体表达结构域删除的IgG1恒定区。值得注意的是，这些示例性构建体优选被改造为将结合的CH3结构域直接与各自Fc结构域的铰链区融合。
在其它构建体中，可能需要在一个或多个Fc结构域组分之间提供一个肽间隔区。例如，肽间隔区可以位于铰链区和CH2结构域之间，和/或CH2和CH3结构域之间。例如，可以表达得到相容的构建体，其中CH2结构域被删除，并且将其余的CH3结构域(合成的或非合成的)与铰链区连接，所述铰链区带有1-20、1-10或1-5个氨基酸肽间隔区。引入此类肽间隔区可以，例如，确保恒定区结构域的调控元件保持游离且可接近，或确保铰链区仍保持柔韧性。优选地，与本发明相容的任意接头肽将具有相对的非免疫原性，且不会阻碍Fc的适当折叠。
Fc氨基酸的改变
在某些实施方式中，在本发明的杂交核酸酶分子中使用的Fc结构域被改变或修饰，例如通过氨基酸突变(例如，加入、删除或取代)。如本申请所使用，术语“Fc结构域变体”指与作为Fc结构域来源的野生型Fc相比，具有至少一个氨基酸修饰如氨基酸取代的Fc结构域。例如，变体中Fc结构域来自人IgG1抗体，与人IgG1Fc区域相应位置的野生型氨基酸相比，变体包含至少一个氨基酸突变(例如，取代)。
Fc变体的氨基酸取代可以定位于Fc结构域内的某个位点，该位点的指代编号对应于该残基在抗体的Fc区域中被指定的编号。
在一个实施方式中，Fc变体包含位于铰链结构域或其部分的氨基酸位点的取代。在另一个实施方式中，Fc变体包含位于CH2结构域或其部分的氨基酸位点的取代。在另一个实施方式中，Fc变体包含位于CH3结构域或其部分的氨基酸位点的取代。在另一个实施方式中，Fc变体包含位于CH4结构域或其部分的氨基酸位点的取代。
在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含Fc变体，所述Fc变体包括一个以上氨基酸取代。本发明的杂交核酸酶分子可以包含，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代。优选地，各氨基酸取代之间在空间定位上间隔至少1个氨基酸位点或更多，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸位点或更多。更优选地，经改造的各氨基酸之间在空间定位上间隔至少5、10、15、20或25个氨基酸位点或更多。
在某些实施方式中，由于具有包含所述野生型Fc结构域的Fc结构域，Fc变体可改进至少一个效应器功能(例如，Fc结构域与Fc受体(例如，FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或补体蛋白(例如，C1q)的结合能力提高，或触发抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒作用(CDCC))。在其它实施方式中，Fc变体提供经改造的半胱氨酸残基。
在某些方面，Fc结构域包括在氨基酸234-238之间区域的改变，其包括在CH2结构域起始的序列LLGGP。在某些方面，Fc变体改变Fc介导的效应器功能特别是ADCC，和/或降低结合Fc受体的亲合力。在某些方面，在CH2-CH3的交界处附近(在位置如K322或P331)发生的序列改变能够消除补体介导的细胞毒性和/或改变与FcR结合的亲合力。在某些方面，Fc结构域在残基P238和P331处引入改变，例如将这些位置的野生型脯氨酸变成丝氨酸。在某些方面，改变铰链区的三个铰链半胱氨酸中的一个或多个以便在这些残基处编码CCC、SCC、SSC、SCS或SSS，其也能够影响与FcR的结合和分子的均一性，例如通过消除未配对的可能使折叠蛋白不稳定的半胱氨酸。
本发明的杂交核酸酶分子可以引入本领域认可的Fc变体，所述Fc变体已知能够改进效应器功能和/或FcR结合。特别地，本发明的杂交核酸酶分子可以包括，例如，在一个或多个氨基酸位点的改变(例如，取代)，参见国际PCT公布号WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2,WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2和WO06/085967A2；美国专利公开号US2007/0231329、US2007/0231329、US2007/0237765、US2007/0237766、US2007/0237767、US2007/0243188、US20070248603、US20070286859、US20080057056；或美国专利号5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；和7,317,091，其均通过引用并入本申请。在一个实施方式中，可以在一个或多个公开的氨基酸位点进行特定改变(例如，本领域公开的一个或多个氨基酸位点的特定取代)。在另一个实施方式中，可以在一个或多个公开的氨基酸位点进行不同改变(例如，本领域公开的一个或多个氨基酸位点的不同取代)。
预计Fc结构域中的其它氨基酸突变也能够减少其与Fcγ受体和Fcγ受体亚型的结合。例如，在Fc区域位置238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、322、324、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、356、360、373、376、378、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439的突变能够改变结合，如2004年5月18日颁布的美国专利号6,737,056中所描述的，其通过引用整体并入本申请。该专利报道了在IgG3中将Pro331变为Ser使得与未突变的IgG3相比亲和性降低6倍，这表明Pro331参与了FcγRI结合。此外，在1997年4月29日颁布的美国5,624,821中也披露了在位置234、235、236和237、297、318、320和322的氨基酸修饰可能会改变受体结合亲和性，其全部内容通过引用并入本申请。
考虑使用的其它突变包括例如在2006年10月19日公开的2006/0235208号美国专利中所描述的那些并且其通过引用整体并入本申请。该公开描述的Fc变体表现出与Fcγ受体结合减少、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性减少或补体依赖性细胞毒性减少，其包括在Fc区域的至少一个氨基酸修饰，包括232G、234G、234H、235D、235G、235H、236I、236N、236P、236R、237K、237L、237N、237P、238K、239R、265G、267R、269R、270H、297S、299A、299I、299V、325A、325L、327R、328R、329K、330I、330L、330N、330P、330R和331L(根据EU索引编号)，以及双突变236R/237K、236R/325L、236R/328R、237K/325L、237K/328R、325L/328R、235G/236R、267R/269R、234G/235G、236R/237K/325L、236R/325L/328R、235G/236R/237K和237K/325L/328R。其它考虑使用的在此公开中描述的突变包括227G、234D、234E、234G、234I、234Y、235D、235I、235S、236S、239D、246H、255Y、258H、260H、2641、267D、267E、268D、268E、272H、272I、272R、281D、282G、283H、284E、293R、295E、304T、324G、324I、327D、327A、328A、328D、328E、328F、328I、328M、328N、328Q、328T、328V、328Y、330I、330L、330Y、332D、332E、335D、在位置235和236之间插入G、在位置235和236之间插入A、在位置235和236之间插入S、在位置235和236之间插入T、在位置235和236之间插入N、在位置235和236之间插入D、在位置235和236之间插入V、在位置235和236之间插入L、在位置235和236之间插入G、在位置235和236之间插入A、在位置235和236之间插入S、在位置235和236之间插入T、在位置235和236之间插入N、在位置235和236之间插入D、在位置235和236之间插入V、在位置235和236之间插入L、在位置297和298之间插入G、在位置297和298之间插入A、在位置297和298之间插入S、在位置297和298之间插入D、在位置326和327之间插入G、在位置326和327之间插入A、在位置326和327之间插入T、在位置326和327之间插入D和在位置326和327之间插入E(根据EU索引编号)。此外，考虑使用公开号为2006/0235208的美国专利申请中描述的突变，包括227G/332E、234D/332E、234E/332E、234Y/332E、234I/332E、234G/332E、235I/332E、235S/332E、235D/332E、235E/332E、236S/332E、236A/332E、236S/332D、236A/332D、239D/268E、246H/332E、255Y/332E、258H/332E、260H/332E、264I/332E、267E/332E、267D/332E、268D/332D、268E/332D、268E/332E、268D/332E、268E/330Y、268D/330Y、272R/332E、272H/332E、283H/332E、284E/332E、293R/332E、295E/332E、304T/332E、324I/332E、324G/332E、324I/332D、324G/332D、327D/332E、328A/332E、328T/332E、328V/332E、328I/332E、328F/332E、328Y/332E、328M/332E、328D/332E、328E/332E、328N/332E、328Q/332E、328A/332D、328T/332D、328V/332D、328I/332D、328F/332D、328Y/332D、328M/332D、328D/332D、328E/332D、328N/332D、328Q/332D、330L/332E、330Y/332E、330I/332E、332D/330Y、335D/332E、239D/332E、239D/332E/330Y、239D/332E/330L、239D/332E/330I、239D/332E/268E、239D/332E/268D、239D/332E/327D、239D/332E/284E、239D/268E/330Y、239D/332E/268E/330Y、239D/332E/327A、239D/332E/268E/327A、239D/332E/330Y/327A、332E/330Y/268E/327A、239D/332E/268E/330Y/327A、插入G>297-298/332E、插入A>297-298/332E、插入S>297-298/332E、插入D>297-298/332E、插入G>326-327/332E、插入A>326-327/332E、插入T>326-327/332E、插入D>326-327/332E、插入E>326-327/332E、插入G>235-236/332E、插入A>235-236/332E、插入S>235-236/332E、插入T>235-236/332E、插入N>235-236/332E、插入D>235-236/332E、插入V>235-236/332E、插入L>235-236/332E、插入G>235-236/332D、插入A>235-236/332D、插入S>235-236/332D、插入T>235-236/332D、插入N>235-236/332D、插入D>235-236/332D、插入V>235-236/332D和插入L>235-236/332D(根据EU索引编号)。在例如2003年6月12日公开的公开号为2003/0108548的美国专利中描述了突变L234A/L235A，其通过引用整体并入本申请。在实施方式中，单独地或组合引入所描述的修饰。
在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含对Fc结构域的氨基酸取代，所述取代改变了不依赖于抗原的抗体效应器功能，特别是抗体的循环半衰期。与缺乏所述取代的杂交核酸酶分子相比，本发明的杂交核酸酶分子显示出了与FcRn结合的升高或降低，并因此分别具有延长或缩短的血清半衰期。对FcRn的亲和力改进的Fc变体有望具有更长的血清半衰期，并且此类分子可用于哺乳动物的治疗中，所述哺乳动物需要给予具有较长半衰期的多肽，例如治疗慢性疾病或状况。相反的，FcRn结合亲和性降低的Fc变体可能具有更短的半衰期，此类分子同样有用，例如，给予哺乳动物，缩短循环时间可能对所述哺乳动物有益，例如用于体内诊断成像，或用于当初始多肽在循环系统中长时间存在时具有毒副作用的情况。FcRn结合亲和性降低的Fc变体穿过胎盘的可能性也较低，因此，所述Fc变体还可以用于治疗妊娠妇女所患的疾病或状况。此外，需要FcRn结合亲和性降低的其它应用包括需要定位于脑、肾和/或肝中的应用。在一个示例性实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子表现为从血管向肾小球上皮细胞转运的量降低。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子表现为从脑转运透过血脑屏障(BBB)进入血管间隙的量降低。在一个实施方式中，具有FcRn结合改变的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域(例如，一个或两个Fc结构域)，所述杂交核酸酶分子在Fc结构域的“FcRn结合环”内具有一个或多个氨基酸取代。能改变FcRn结合活性的示例性氨基酸取代已在国际PCT公开号WO05/047327中公开，所述公开参考并入本申请。
在其它实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含Fc变体，所述Fc变体含有的氨基酸取代改变了多肽抗原依赖性效应器功能，特别是抗原依赖细胞介导的细胞毒作用或补体活化，例如与野生型Fc区域比较。在一个示例性实施方式中，所述杂交核酸酶分子显示出与Fcγ受体(例如CD16)结合的改变。此类杂交核酸酶分子与野生型多肽相比，表现为与FcRγ的结合增加或减少，因而分别介导效应器功能增强或减弱。与FcγR亲和性改进的Fc变体预计能增强效应器功能，且此类分子可用于需要破坏哺乳动物靶分子的治疗方法中。而相反的，与FcRγ结合亲和性降低的Fc变体预计能降低效应器的功能，此类分子也是有用的，例如，用于治疗不希望靶细胞破坏的疾病，例如在正常细胞可能表达靶分子的情形，或长期给予多肽结果可能导致有害的免疫系统活化的情形。在一个实施方式中，与包含野生型Fc区域的多肽相比，包含Fc的多肽显示至少一种抗原依赖性效应器功能的改变，所述改变选自调理作用、吞噬作用、补体依赖性细胞毒作用、抗原依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或效应细胞调节。
在一个实施方式中，杂交核酸酶分子表现为与活化的FcγR(例如，FcγI、FcγIIa或FcγRIIIa)结合的改变。在另一个实施方式中，杂交核酸酶分子表现为与抑制性FcγR(例如，FcγRIIb)结合亲和性的改变。能改变FcR或补体结合活性的示例性氨基酸取代已在国际PCT公开号WO05/063815中公开，所述公开通过引用并入本申请。
本发明的杂交核酸酶分子还可以包含氨基酸取代，所述取代改变杂交核酸酶分子的糖基化。例如，杂交核酸酶分子的Fc结构域可以包含具有突变的Fc结构域，所述Fc结构域的突变导致糖基化(例如，N-或O-连接的糖基化)降低；或可以包含糖型改变的野生型Fc结构域(例如，低海藻糖或无海藻糖的聚糖)。在另一个实施方式中，杂交核酸酶分子在接近或位于糖基化的基序内具有氨基酸取代，例如，含有氨基酸序列NXT或NXS的N-连接糖基化基序。使糖基化降低或改变的示例性氨基酸取代已在国际PCT公开号WO05/018572和US专利公开号2007/0111281中公开，所述公开通过引用并入本申请。
在其它实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含至少一个Fc结构域，所述Fc结构域具有位于溶剂接触表面的经改造的半胱氨酸残基或其类似物。优选地，经改造的半胱氨酸残基或其类似物不干扰Fc所赋予的效应器功能。更优选地，所述改变不干扰Fc与Fc受体(例如，FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或补体蛋白(例如，C1q)的结合能力，也不干扰Fc触发免疫效应器的功能(例如，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒作用(CDCC))。在优选的实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含Fc结构域，所述Fc结构域含有至少一个经改造的游离半胱氨酸残基或其类似物，其基本上不与第二个半胱氨酸残基通过二硫键结合。可以再使用本领域认可的技术，将上文所述的任意经改造的半胱氨酸残基或其类似物与功能性结构域(例如，与硫醇-反应性异双功能性连接偶联)偶联。
在一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子可以包含基因融合的Fc结构域，所述基因融合的Fc结构域具有两个或多个独立选自本发明所述Fc结构域的Fc结构域成分。在一个实施方式中，Fc结构域是相同的。在另一个实施方式中，至少两个Fc结构域是不同的。例如，本发明的杂交核酸酶分子的Fc结构域包含相同数量的氨基酸残基或在长度上相差一个或多个不同数量的氨基酸残基(例如，约5个氨基酸残基(例如，1、2、3、4或5个氨基酸残基)、约10个残基、约15个残基、约20个残基、约30个残基、约40个残基或约50个残基)。在又一个实施方式中，本发明杂交核酸酶分子的Fc结构域在一个或多个氨基酸位点的序列可以不同。例如，至少两个Fc结构域可以在约5个氨基酸位点(例如，1、2、3、4或5个氨基酸位点)、约10个位点、约15个位点、约20个位点、约30个位点、约40个位点或约50个位点不同。
接头结构域
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括一个接头结构域。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子包括多个接头结构域。在某些实施方式中，接头结构域是多肽接头。在某些方面，优选使用多肽接头，将一个或多个Fc结构域与一个或多个核酸酶结构域融合，以形成杂交核酸酶分子。
在一个实施方式中，多肽接头是合成的。如本申请所使用，术语“合成的”多肽接头包括含有氨基酸序列(其可以是或不是天然存在的序列)的肽(或多肽)，所述氨基酸序列的线性氨基酸序列连接于一个在自然界中不与之天然连接的序列(其可以是或不是天然存在的序列)(例如，一个Fc结构域序列)。例如，多肽接头可以包含非天然存在的多肽，所述多肽为天然存在多肽的修饰形式(例如，包含一个突变，如加入、取代或删除)，或包含一个第一氨基酸序列(其可以是或不是天然存在的序列)。可以使用本发明的多肽接头，例如，以确保Fc结构域是并列的，以及保证适当的折叠和功能性Fc结构域的形成。优选地，与本发明具有相容性的多肽接头将具有相对的非免疫原性，且在结合蛋白的单体亚基中不会抑制任何非共价结合。
在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子使用多肽接头，以在单个多肽链的框内连接任意两个或多个结构域。在一个实施方式中，两个或多个结构域可以独立选自本发明讨论的任意Fc结构域或核酸酶结构域。例如，在某些实施方式中，多肽接头可以用于融合相同的Fc结构域，以形成同质型Fc区域。在其它实施方式中，多肽接头可以用于融合不同的Fc结构域(例如，野生型Fc结构域和Fc结构域变体)，以形成异质型Fc区域。在其它实施方式中，本发明的多肽接头可以用于将第一Fc结构域(例如，铰链结构域或其部分、CH2结构域或其部分、完整的CH3结构域或其部分、FcRn结合部分、FcγR结合部分、补体结合部分或其部分)的C-末端与第二Fc结构域(例如，完整地Fc结构域)的N-末端基因融合。
在一个实施方式中，多肽接头包含Fc结构域的一部分。例如，在一个实施方式中，多肽接头可以包含IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4抗体的免疫球蛋白铰链结构域。在另一个实施方式中，多肽接头可以包含IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4抗体的CH2结构域。在其它实施方式中，多肽接头可以包含IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4抗体的CH3结构域。也可以使用免疫球蛋白(例如，人免疫球蛋白)的其它部分。例如，多肽接头可以包含CH1结构域或其部分、CL结构域或其部分、VH结构域或其部分或VL结构域或其部分。所述部分可以来自任意免疫球蛋白，包括例如IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4抗体。
在示例性实施方式中，多肽接头可以包含免疫球蛋白铰链区的至少一部分。在一个实施方式中，多肽接头包含上游铰链结构域(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上游铰链结构域)。在另一个实施方式中，多肽接头包含一个中游铰链结构域(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中游铰链结构域)。在另一个实施方式中，多肽接头包含一个下游铰链结构域(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4下流铰链结构域)。
在其它实施方式中，可以通过组合来自相同或不同抗体亚型的铰链元件，构建多肽接头。在一个实施方式中，多肽接头包含嵌合铰链，所述嵌合铰链包含IgG1铰链区的至少一部分和IgG2铰链区的至少一部分。在一个实施方式中，多肽接头包含嵌合铰链，所述嵌合铰链包含IgG1铰链区的至少一部分和IgG3铰链区的至少一部分。在另一个实施方式中，多肽接头包含嵌合铰链，所述嵌合铰链包含IgG1铰链区的至少一部分和IgG4铰链区的至少一部分。在一个实施方式中，多肽接头包含嵌合铰链，所述嵌合铰链包含IgG2铰链区的至少一部分和IgG3铰链区的至少一部分。在一个实施方式中，多肽接头包含嵌合铰链，所述嵌合铰链包含IgG2铰链区的至少一部分和IgG4铰链区的至少一部分。在一个实施方式中，多肽接头包含嵌合铰链，所述嵌合铰链包含IgG1铰链区的至少一部分、IgG2铰链区的至少一部分和IgG4铰链区的至少一部分。在另一个实施方式中，多肽接头可以包含一个IgG1上游铰链和中游铰链以及一个单一的IgG3中游铰链重复基序。在另一个实施方式中，多肽接头可以包含IgG4上游铰链、IgG1中游铰链和IgG2下游铰链。
在另一个实施方式中，多肽接头包含或由gly-ser接头组成。如本申请所使用的术语“gly-ser接头”指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。一个示例性的gly/ser接头包含式(Gly4Ser)n所示的氨基酸序列，其中n为正整数(例如，1、2、3、4或5)。一个优选的gly/ser接头为(Gly4Ser)4。另一个优选的gly/ser接头为(Gly4Ser)3。另一个优选的gly/ser接头为(Gly4Ser)5。在某些实施方式中，可以将gly-ser接头插入多肽接头(例如，本发明所述的任意多肽接头序列)的两个其它序列之间。在其它实施方式中，将gly-ser接头附加在另一个多肽接头序列(例如，本发明所述的任意多肽接头序列)的一个末端或两个末端。在其它实施方式中，将两个或多个gly-ser接头连续地插入多肽接头中。在一个实施方式中，本发明的一个多肽接头包含上游铰链区(例如，来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)的至少一部分、中游铰链区(例如，来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)的至少一部分和一系列gly/ser氨基酸残基(例如，gly/ser接头如(Gly4Ser)n)。
在一个实施方式中，本发明的多肽接头包含非天然存在的免疫球蛋白铰链区结构域，例如非天然存在于多肽中的铰链区结构域，所述多肽包含铰链区结构域和/或被改变的铰链区结构域，使得其氨基酸序列不同于天然存在的免疫球蛋白铰链区结构域。在一个实施方式中，可以在铰链区结构域发生突变，以制备本发明的多肽接头。在一个实施方式中，本发明的多肽接头包含铰链结构域，所述铰链结构域不包含天然存在的数目的半胱氨酸，即多肽接头包含的半胱氨酸数目少于或多于天然存在的铰链分子的半胱氨酸数目。
在其它实施方式中，本发明的多肽接头包含生物学相关的肽序列或其部分序列。例如，生物学相关的肽序列可以包括，但不限于，来自抗排斥或抗炎肽的序列。所述抗排斥或抗炎肽可以选自细胞因子抑制性肽、细胞粘附抑制性肽、凝血酶抑制性肽和血小板抑制性肽。在一个优选实施方式中，多肽接头包含的肽序列选自IL-1抑制或拮抗肽序列、促红细胞生成素(EPO)-模拟肽序列、促血小板生成素(TPO)-模拟肽序列、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)模拟肽序列、肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂肽序列、整合素结合肽序列、选择素拮抗肽序列、抗致病性肽序列、血管活性肠肽(VIP)模拟肽序列、钙调蛋白拮抗肽序列、肥大细胞拮抗剂、SH3拮抗肽序列、尿激酶受体(UKR)拮抗肽序列、生长激素抑制素或皮质醇稳定蛋白模拟肽序列和巨噬细胞和/或T-细胞抑制肽序列。示例性肽序列已被美国专利号6,660,843所公开，所述公开通过引用并入本申请，可以引入所述示例性肽序列中的任意一个作为多肽接头。
可以理解，通过在编码多肽接头的核苷酸序列中取代、加入或删除一个或多个核苷酸，使得在多肽接头中引入一个或多个氨基酸的取代、加入或删除，可以构建这些示例性多肽接头的变体形式。例如，可以通过标准技术引入突变，如定点突变和PCR介导的突变。
本发明的多肽接头在长度上为至少一个氨基酸且其长度可以改变。在一个实施方式中，本发明多肽接头的长度约1至约50个氨基酸。如在本申请中使用，术语“约”表示+/-两个氨基酸残基。因为接头长度必须是正整数，所以长度为约1至约50个氨基酸的长度指长度为1至48-52个氨基酸的长度。在另一个实施方式中，本发明多肽接头的长度为约10-20个氨基酸。在另一个实施方式中，本发明多肽接头的长度为约15至约50个氨基酸。
在另一个实施方式中，本发明多肽接头的长度为约20至约45个氨基酸。在另一个实施方式中，本发明多肽接头的长度为约15至约25个氨基酸。在另一个实施方式中，本发明多肽接头的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多的氨基酸。
可以采用本领域公知的技术将多肽接头引入多肽序列。可以通过DNA序列分析对修饰进行确证。质粒DNA可以用于转化宿主细胞，以稳定生产产生的多肽。
核酸酶结构域
在某些方面，杂交核酸酶分子包括核酸酶结构域。相应地，本发明的杂交核酸酶分子通常包含至少一个核酸酶结构域和至少一个连接的Fc结构域。在某些方面，杂交核酸酶分子包含多个核酸酶结构域。
在某些实施方式中，核酸酶结构域基本上是DNase的全部或至少是酶活性片段。在某些实施方式中，DNase是I型分泌DNase，优选是人DNase如DNase 1。示例性的DNase 1结构域如SEQ ID NO：48-53和102所示。示例性的人DNase 1如UniProtKB中的条目P24855(SEQID NO：49和102)所示。在某些实施方式中，DNase是DNase 1和/或DNase 1-样(DNaseL)酶1-3。示例性的人DNase 1-样酶1-3如UniProtKB中的条目Q13609(SEQ ID NO：57和103)所示。在某些实施方式中，DNase是TREX1(三引物修复核酸外切酶1)。示例性的人TREX1如UniProtKB中的条目Q9NSU2(SEQ ID NO：104)所示。优选的人TREX1是缺乏细胞内核靶向序列的C-末端截短的人TREX1，例如如SEQ ID NO：105所示的缺乏72个C-末端氨基酸的人TREX1。
在某些实施方式中，核酸酶结构域基本上是RNase的全部或至少是酶活性片段。在某些实施方式中，RNase是RNase A超家族的细胞外或分泌型RNase，例如RNase A，优选人胰脏RNase。示例性的人RNase如UniProtKB中的条目P07998(SEQ ID NO：58和101)所示。
在一个实施方式中，核酸酶结构域与Fc结构域的N-末端有效连接(例如，化学偶联或基因融合(例如，直接连接或通过多肽连接))。在另一个实施方式中，核酸酶结构域与Fc结构域的C-末端有效连接(例如，化学偶联或基因融合(例如，直接连接或通过多肽连接))。在其它实施方式中，核酸酶结构域通过氨基酸侧链与Fc结构域有效连接(例如，化学偶联或基因融合(例如，直接连接或通过多肽连接))。在某些示例性实施方式中，核酸酶结构域通过人免疫球蛋白铰链结构域或其部分与Fc结构域融合。
在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子包含两个或多个核酸酶结构域和至少一个Fc结构域。例如，核酸酶结构域可以与Fc结构域的N-末端和C-末端有效连接。在其它示例性实施方式中，核酸酶结构域可以与多个Fc结构域的N-末端和C-末端有效连接(例如，两个、三个、四个、五个或更多Fc结构域)，所述Fc结构域以一系列Fc结构域串联阵列的形式连接在一起。
在其它实施方式中，两个或多个核酸酶结构域彼此连接(例如，通过多肽连接)，以一系列核酸酶结构域串联阵列的形式，与Fc结构域或Fc结构域串联阵列的C-末端或N-末端有效连接(例如，化学偶联或基因融合(例如，直接连接或通过多肽连接))。在其它实施方式中，核酸酶结构域的串联阵列与Fc结构域或Fc结构域的串联阵列的C-末端和N-末端有效连接。
在其它实施方式中，可以在两个Fc结构域之间插入一个或多个核酸酶结构域。例如，一个或多个核酸酶结构域可以形成本发明的杂交核酸酶分子的全部或部分多肽接头。
本发明的优选杂交核酸酶分子包含至少一个核酸酶结构域(例如，RNase或DNase)、至少一个接头结构域和至少一个Fc结构域。
在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子具有至少一个核酸酶结构域，所述核酸酶结构域对介导生物学效应的靶分子具有特异性。在另一个实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子与靶分子(例如，DNA或RNA)结合的结果导致靶分子的减少或消除，所述靶分子例如来自细胞、组织或来自循环系统。
在某些实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子可以包含两个或多个核酸酶结构域。在一个实施方式中，核酸酶结构域是相同的，例如RNase和RNase，或TREX1和TREX1。在另一个实施方式中，核酸酶结构域是不同的，例如DNase和RNase。
在其它实施方式中，本发明的杂交核酸酶分子可以组装在一起或与其它多肽形成具有两个或多个多肽(“多聚体”)的结合蛋白，其中多聚体中的至少一个多肽是本发明的杂交核酸酶分子。示例性的多聚体形式包括二聚体、三聚体、四聚体和六聚体结合蛋白等等。在一个实施方式中，多聚体中的多肽是相同的(即，同质型结合蛋白，例如同型二聚体、同型四聚体)。在另一个实施方式中，多聚体中的多肽是不同的(例如，异质型)。
制备杂交核酸酶分子的方法
本发明的杂交核酸酶分子主要可以采用重组DNA技术在转化宿主细胞中制备。为此，制备编码肽的重组DNA分子。制备此类DNA分子的方法是本领域所公知的。例如，可以采用适当的限制性酶将编码肽的序列从DNA上切除。或者，使用化学合成技术如磷酰胺酯法，合成DNA分子。还可以使用这些技术的组合。
本发明还包括能够在适当宿主中表达肽的载体。所述载体包含DNA分子，所述DNA分子编码的肽与适当的表达控制序列有效连接。本领域公知在DNA分子插入载体之前或之后影响所述有效连接的方法。表达控制序列包括启动子、活化子、增强子、操纵子、核糖核酸酶结构域、启动信号、终止信号、加帽信号、聚腺苷酸化信号和转录或翻译控制涉及的其它信号。
得到的具有上述DNA分子的载体用于转化适宜的宿主。使用本领域公知的方法可以进行该转化。
在实施本发明时，可以使用大量的可获得的已知宿主细胞中的任意细胞。特定宿主的选择依赖于多个本领域公知的因素。这包括，例如，与选定表达载体的相容性、DNA分子编码多肽的毒性、转化率、肽回收的容易程度、表达特性、生物安全性和成本。可以理解，由于并非所有的宿主均可以等效的表达特定DNA序列，因而需要考虑这些因素的平衡。在这些一般原则中，有用的微生物宿主包括培养的细菌(如大肠杆菌)、酵母(如酿酒酵母)和其它真菌、昆虫、植物、哺乳动物(包括人)细胞，或其它本领域已知的宿主。
接下来，培养和纯化转化宿主。可以在常规发酵条件下培养宿主细胞，以表达所需化合物。此类发酵条件是本领域公知的。最后，利用本领域公知的方法从培养基中纯化肽。
还可以利用合成方法制备化合物。例如，可以使用固相合成技术。本领域公知的适当技术包括以下描述的技术：Merrifield(1973),Chem.Polypeptides,pp.335-61(Katsoyannis and Panayotis eds.)；Merrifield(1963),J.Am.Chem.Soc.85:2149；Daviset al.(1985),Biochem.Intl.10:394-414；Stewart and Young(1969),Solid PhasePeptide Synthesis；美国专利号3,941,763；Finn et al.(1976),The Proteins(3rd ed.)2:105-253；以及Erickson et al.(1976),The Proteins(3rd ed.)2:257-527。固相合成是制备单个肽的优选技术，因为其是制备小肽的性价比最高的方法。可以采用有机化学技术公知的方法合成含有衍生的肽或含有非肽基团的化合物。
分子表达/合成的其它方法通常是本领域的普通技术人员所知晓的。
药物组合物和治疗方法的用途
在某些实施方式中，单独给药杂交核酸酶分子。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子在给药至少一种其它治疗剂前给药。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子与至少一种其它治疗剂伴随给药。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子在给药至少一种其它治疗剂后给药。在其它实施方式中，杂交核酸酶分子在给药至少一种其它治疗剂前给药。本领域技术人员可以意识到，在某些实施方式中，杂交核酸酶分子与其它试剂/化合物组合。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子与其它试剂伴随给药。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子和其它试剂并非同时给药，杂交核酸酶分子在给药试剂之前或之后给药。在某些实施方式中，在预防阶段、疾病发生和/或治疗阶段，向主体给药杂交核酸酶分子和其它试剂。
本发明的药物组合物可以在联合治疗中给药，即与其它试剂联用。在某些实施方式中，联合治疗包括将核酸酶分子与至少一种其它试剂联用。试剂包括，但不限于，体外合成制备的化学组合物、抗体、抗原结合区域及其组合和偶联物。在某些实施方式中，试剂可以作为激动剂、拮抗剂、别构调节剂或毒素。
在某些实施方式中，本发明提供的药物组合物包含杂交核酸酶分子以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。
在某些实施方式中，本发明提供的药物组合物包含杂交核酸酶分子和治疗有效量的至少一种其它治疗剂以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。
在某些实施方式中，可接受的制剂材料优选在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒的。在某些实施方式中，制剂材料用于皮下和/或静脉给药。在某些实施方式中，药物组合物可以含有制剂材料，所述制剂材料用于修饰、维持或保持组合物的例如pH、渗透压、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶出或释放速率、吸收或渗透。在某些实施方式中，适宜的制剂材料包括，但不限于，氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；填充剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸钠(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；盐形成抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙烯丙二醇或聚乙烯乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；混悬剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克、PEG、山梨醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Triton、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醛)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物，优选氯化钠或钾、甘露醇、山梨醇)；递送介质；稀释剂；赋形剂和/或药用佐剂。(Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版，A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company(1995))在某些实施方式中，该制剂包含PBS；20mM NaOAC、pH 5.2，50mM NaCl；和/或10mM NAOAC、pH5.2，9％蔗糖。
在某些实施方式中，杂交核酸酶分子和/或治疗性分子与本领域已知的延长半衰期的介质连接。此类介质包括，但不限于，聚乙二醇、糖原(例如，糖基化杂交核酸酶分子)和葡聚糖。此类介质已在例如美国申请序列号09/428,082，现为美国专利号6,660,843和公开的PCT申请号WO 99/25044中描述，所述公开特此参考并入。
在某些实施方式中，最佳药物组合物将由本领域技术人员依据例如计划给药途径、递送形式和所需剂量确定。参见，例如上文所述的Remington's PharmaceuticalSciences。在某些实施方式中，此类组合物可以改变本发明中抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
在某些实施方式中，药物组合物中主要介质或载体的性质既可以是水性的也可以是非水性的。例如，在某些实施方式中，适宜的介质或载体可以是注射用水、生理盐溶液或人工脑脊液，还可能添加了供胃肠外给药的其它常见成份。在某些实施方式中，盐包括等张的磷酸缓冲盐。在某些实施方式中，进一步的示例性介质为中性缓冲盐或盐与血清白蛋白的混合物。在某些实施方式中，药物组合物包含pH约7.0-8.5的Tris缓冲盐，或pH约4.0-5.5的乙酸缓冲盐，其可以进一步包括山梨醇或适宜的替代品。在某些实施方式中，组合物包含杂交核酸酶分子，与或不与至少一种其它治疗剂，可以通过将具有所需纯度的选定组分与任选的制剂试剂(见上文所述的Remington's Pharmaceutical Sciences)混合制成供贮存的冻干饼或水性溶液形式。进一步地，在某些实施方式中，组合物包含杂交核酸酶分子，与或不与至少一种其它治疗剂，可以通过使用适当的赋型剂如蔗糖将其制成冻干制剂。
在某些实施方式中，药物组合物可供选择用于胃肠外递送。在某些实施方式中，组合物可供选择用于吸入或通过消化道递送，如口服。制备此类药学上可接受的组合物在本领域技术人员能力范围内。
在某些实施方式中，制剂成分的浓度是给药部位可接受的。在某些实施方式中，缓冲剂用于使组合物维持在生理pH或略低的pH条件下，典型的pH范围为约5至约8。
在某些实施方式中，当计划采用胃肠外给药时，治疗组合物可以是无热源的、胃肠外可接受的水性溶液，在药学上可接受介质中所述水性溶液包含所需杂交核酸酶分子，可以含有或不含有其它治疗剂。在某些实施方式中，胃肠外注射用介质是无菌蒸馏水，其中将杂交核酸酶分子，与或不与至少一种其它治疗剂，制成无菌、等张、适合保存的制剂。在某些实施方式中，制剂可包括带有某试剂的所需分子制剂，如可注射微球、生物溶蚀性粒子、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、小球或脂质体，所述制剂可以使产品控释或缓释，所述产品随后可以通过储库注射递送。在某些实施方式中，还可以使用透明质酸，其能延长在循环系统中的持续时间。在某些实施方式中，可以使用可植入的药物递送介质以引入所需分子。
在某些实施方式中，可以将药物组合物制成供吸入的制剂。在某些实施方式中，杂交核酸酶分子，与或不与至少一种其它治疗剂，可以被制成供吸入的干粉。在某些实施方式中，包含杂交核酸酶分子的吸入剂溶液，可含有或不含有至少一种其它治疗剂，可以与用于气雾剂递送的抛射剂一起制剂。在某些实施方式中，可以将溶液雾化。肺部给药在PCT申请号PCT/US94/001875中有进一步的描述，其描述了化学修饰的蛋白的肺部递送。
在某些实施方式中，制剂可以口服给药。在某些实施方式中，以所述方式给药的杂交核酸酶分子，可含有或不含有至少一种其它的治疗剂，可以使用或不使用载体来制备，所述载体通常用于制备固体剂型如片剂和胶囊剂的制备。在某些实施方式中，可以将胶囊设计为在胃肠道内当生物利用度达到最高、且前-全身降解(pre-systemic degradation)最低时，释放制剂的活性成分。在某些实施方式中，可以加入至少一种其它试剂以利于杂交核酸酶分子和/或任意其它治疗剂的吸收。在某些实施方式中，还可以加入稀释剂、矫味剂、低熔点蜂蜡、植物油、润滑剂、混悬剂、片剂崩解剂和粘合剂。
在某些实施方式中，药物组合物中可以包括有效量的杂交核酸酶分子，与或不与至少一种其它治疗剂，与无毒赋形剂混合，所述赋形剂适于生产片剂。在某些实施方式中，通过在无菌水，或其它适宜介质中溶解片剂，制成单位给药形式的溶液。在某些实施方式中，适当的赋形剂包括，但不限于，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。
其它药物组合物对本领域技术人员而言也是显而易见的，其包括缓释或控释制剂，所述缓释或控释制剂中包含杂交核酸酶分子，含有或不含有至少一种其它治疗剂。在某些实施方式中，多种其它缓释或控释制剂技术，如脂质体载体、生物溶蚀微粒或多孔小球和储库注射剂，也是本领域技术人员已知的。参见例如，PCT申请号PCT/US93/00829，其中描述了递送药物组合物的控释多孔聚合微粒。在某些实施方式中，缓释制剂可以包括成型粒子形式的半透性聚合材料，例如膜或微囊。缓释材料可以包括聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利号3,773,919和欧洲专利号058,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸共聚物(Sidman etal.,Biopolymers,22:547-556(1983))、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(见上文所述的Langer et al.)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。在某些实施方式中，缓释组合物还可以包括脂质体，所述脂质体可以采用本领域已知的若干方法中的任意一种制备。参见，例如，Eppstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；欧洲专利号036,676；088,046和143,949。
供体内给药使用的药物组合物一般是无菌的。在某些实施方式中，其可以通过无菌滤膜过滤实现。在某些实施方式中，当组合物是冻干时，采用该方法进行的无菌处理可以在冻干和复溶之前或之后进行。在某些实施方式中，供胃肠外给药的组合物可以以冻干形式或溶液形式保存。在某些实施方式中，通常将胃肠外组合物置于带有无菌端口的容器中，例如，具有塞子的静脉给药溶液袋或瓶，所述塞子能够被皮下注射针刺破。
在某些实施方式中，一旦将药物组合物制剂，可以将所述药物组合物以溶液、混悬剂、凝胶、乳剂、固体或以脱水或冻干粉末形式保存在无菌瓶中。在某些实施方式中，此类制剂可以以即开即用形式或给药前复溶(例如，冻干)的形式保存。
在某些实施方式中，提供单剂量给药单元的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒可以包含盛有干蛋白的第一容器和盛有水性制剂的第二容器。在某些实施方式中，包括了含有单室和多室预充式注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
在某些实施方式中，可依据例如治疗背景和目的，确定供治疗使用的药物组合物的有效量，所述药物组合物包含杂交核酸酶分子，含有或不含有至少一种其它治疗剂。本领域技术人员会理解，根据某些实施方式用于治疗的适宜剂量水平将部分地依据以下条件的不同而不同：所递送的分子、杂交核酸酶分子与或不与至少一种其它的治疗剂所用于的适应症、给药途径以及患者的体型(体重、体表面积或器官大小)和/或身体状况(年龄和总体健康情况)。在某些实施方式中，临床医师可以调整剂量和改变给药途径以获得最佳治疗效果。在某些实施方式中，剂量通常可以在约0.1μg/kg至最多约100mg/kg或以上范围内，视上述因素而定。在某些实施方式中，剂量可以在约0.1μg/kg至最多约100mg/kg范围内；或1μg/kg至约100mg/kg；或5μg/kg至最多约100mg/kg。
在某些实施方式中，给药频次将考虑所用制剂中的杂交核酸酶分子和/或任意其它治疗剂的药代动力学参数。在某些实施方式中，临床医师将给药所述组合物直至达到所需效果的一定剂量。在某些实施方式中，所述组合物可以因此在一段时间内以单次或两次或多次给药(含有或不含相同量的所需分子)，或通过植入设备或导管连续输注。更精确的适当给药剂量可以由本领域的普通技术人员通过常规方式确定且均在其常规作用范围内。在某些实施方式中，适宜的剂量可以通过使用适宜的剂量-效应数据确定。
在某些实施方式中，药物组合物的给药途径均为已知方法，例如口服，通过静脉、腹腔、脑内(实质内)、脑室内、肌内、皮下、眼内、动脉、门静脉或囊内途径注射；通过缓释系统或植入设备给药。在某些实施方式中，所述组合物可以通过推注或连续输注，或通过植入设备给药。
在某些实施方式中，所述组合物可以通过植入吸收或包封了所需分子的膜、海绵或其它适宜材料局部给药。在某些实施方式中，在使用植入设备时，可以将该设备植入任意适宜的组织或器官，可以通过扩散、定时释放推注、或持续给药的方式递送所需分子。
在某些实施方式中，需要以离体方式使用药物组合物，其包含杂交核酸酶分子，与或不与至少一种其它治疗剂。在此类例子中，将细胞、组织和/或器官从患者体内取出，将其与包含杂交核酸酶分子且含有或不含有至少一种其它治疗剂的药物组合物接触，随后再将细胞、组织和/或器官重新植入患者体内。
在某些实施方式中，可以通过植入某些细胞来递送杂交核酸酶分子和/或任意其它的治疗剂，所述细胞使用如本发明所述的方法，经遗传工程改造以表达和分泌多肽。在某些实施方式中，此类细胞可以是动物或人细胞，可以是同源的、异源的或异种的。在某些实施方式中，细胞可以是永生化的。在某些实施方式中，为降低产生免疫应答的几率，可以将细胞包封以避免周围组织浸润。在某些实施方式中，包封材料一般是生物相容性的、半透性的聚合壳或膜，其允许蛋白产品释放但阻止患者的免疫系统或周围组织的其它有害因素破坏细胞。
本发明的杂交核酸酶分子对自身免疫病或免疫异常应答的治疗特别有效。就这一点而言，可以理解本发明的杂交核酸酶分子可以用于控制、抑制、调节、治疗或消除由外部和自身抗原引起的有害免疫应答。在其它实施方式中，本发明的多肽可以用于治疗的免疫疾病包括，但不限于，胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎、类风湿性关节炎、实验性自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、实验性葡萄膜炎、桥本氏甲状腺炎、原发性粘液性水肿、甲状腺毒症、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、爱迪生氏病、过早绝经、男性不育、青少年糖尿病、肺出血肾炎综合征、寻常型天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体炎性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎Hbs-ve、隐源性肝硬化、溃疡性结肠炎、舍格伦综合征、硬皮病、韦格纳肉芽肿、多肌炎、皮肌炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮或结缔组织病。
试剂盒
试剂盒可以包括本申请所公开的杂交核酸酶分子和使用说明书。试剂盒可以包括在适宜容器中的本申请所公开的杂交核酸酶分子、一个或多个对照和多种缓冲液、试剂、酶和其它本领域公知的标准成分。
所述容器可以包括至少一个药瓶、孔、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器装置，可以将杂交核酸酶分子放入其中，并且在一些情况下，可以进行适当地分装。当其中提供附加的组分时，所述试剂盒可以包括附加的容器，该组分可以置于所述容器中。所述试剂盒还可以包括将含有杂交核酸酶分子和任意其它试剂的容器密封的装置，以供商业销售。此类容器可以包括注射器或将所需的药瓶保存在其中的吹塑成的容器。容器和/或试剂盒可以包括注明使用方法和/或警告的标签。
实施例
下文为用于实现本发明特定实施方式的实施例。这些实施例仅为说明性目的，其无意于以任何方式限制本发明的保护范围。虽已尽力确保所使用数字(例如，量、温度，等等)的准确度，但是仍应允许有某些实验误差和偏差。
除另有说明外，本发明的实施将采用本领域范围内常规的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。此类技术已在文献中有详细的解释。参见，例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,现行版本)；Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum Press)VolsAand B(1992)。
实施例1：产生杂交核酸酶分子的一般途径
杂交核酸酶分子被设计加入所需结构和功能活性，所述分子单酶或多酶结构作为模块盒与限制性酶位点具有相容性，所述限制性酶位点用于穿梭和结构域交换。杂交核酸酶分子不同实施方式的示意性结构见图1。代表性的杂交核酸酶分子的核苷酸和氨基酸序列见表1。
使用QIAgen RNAeasy试剂盒(Valencia,CA)从人胰脏RNA(Ambion)中分离人cDNA或从正常人外周血淋巴细胞(约5x10e6)中分离人PBMC RNA，使用QIAshredder试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)均质化细胞裂解产物。人PBMC分离自D-PBS1:1稀释的肝素化人血液，使用聚蔗糖梯度LSM淋巴细胞分离液(MP Biomedicals,Irvine,CA)分层。
利用QIAgen RNAeasy试剂盒(Valencia,CA)从约5x10e6个脾细胞中分离小鼠脾脏RNA。离心培养基收集细胞，使用5x10e6个细胞制备RNA。利用QIAGEN RNAeasy试剂盒(Valencia,Calif.)总RNA分离试剂盒和QIAGEN QIAshredder根据试剂盒和试剂盒所附带的生产厂商说明书从细胞中分离RNA。使用1至2微克(1-2μg)总RNA作为逆转录制备cDNA的模板。将RNA、300ng随机引物、500ng寡核苷酸dT(12-18)以及1μl 25mM dNTP混合并在加入酶之前在80℃条件下变性5分钟。将Superscript III逆转录酶(Invitrogen,LifeTechnologies)加入总体积25μl的RNA与引物的混合物中，其中还存在5倍量的第二链缓冲液以及与酶一并加入的0.1M DTT。在50℃条件下进行逆转录反应一小时。
10-100ng cDNA用于PCR扩增反应，所述PCR扩增反应使用对目标核酸酶基因(RNaseA、RNase1、DNase1、Trex1、DNase1L3，等等)具有特异性的引物。对于初始克隆反应而言，设计引物以分离全长cDNA或编码目标基因的截短产物。使用琼脂糖凝胶电泳分离全长或缩短的PCR片段，并采用Qiagen QIAquick柱进行纯化以除去核苷酸、引物和不需要的扩增产物。将经纯化的片段克隆至pCR2.1TOPO克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)，并转化至TOP10感受态细菌中。将分离的克隆挑出接种至含50μg/ml羧变青霉素的LuriaBroth培养基中，生长过夜以分离质粒。对TOPO克隆是否经EcoRI酶切至正确的尺寸进行筛选，所述筛选用限制性酶EcoRI(NEB,Ipswich,MA)进行酶切并对酶切得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳。使用ABI即用型反应混合物v 3.1和ABI 3730XL DNA测序仪对阳性克隆进行DNA序列分析。获得正确克隆后，进一步设计序列修饰并进行PCR反应，以产生所需的等位基因或表达盒。利用PCR诱变产生截短产物和等位基因，所述PCR诱变使用重叠引物以在基因的特定位点引入突变。通过重叠PCR，使用内部重叠引物合成接头，通过连续的PCR循环在两个末端均连上附加序列。将杂交核酸酶分子组装成一串若干可互换的盒。优选实施方式中的分子包含固定的前导肽、核酸酶盒、编码若干不同的备选多肽接头的可选盒、在CH3结构域羧基末端带有终止密码子或接头、且用于resolvICase型分子的-Ig Fc结构域盒、第二接头盒、后接第二核酸酶盒。图1显示了这些杂交核酸酶分子的盒型结构以及在各位点插入的可能序列的例子。一旦杂交核酸酶分子组装，就将其转移至哺乳动物表达质粒pDG中，所述质粒pDG适于在COS7或其它细胞中瞬时表达以及在使用甲氨蝶呤对DHFR进行选择的CHO DG44细胞中稳定表达。
杂交核酸酶分子的瞬时表达
使用含有杂交核酸酶分子插入基因的表达载体pDG，对COS-7细胞进行瞬时转染。转染前一天，将细胞接种，每60mm平皿接种4x10e5个细胞，加入4ml DMEM(ThermoFisher/Mediatech cell gro)+10％FBS的组织培养基。DMEM基础培养基中添加了4.5g/L葡萄糖、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺4mM和非必需氨基酸。在培养基中加入占终体积10％的胎牛血清(Hyclone,Logan,UT ThermoFisher Scientific)。将细胞在37℃，5％CO2的条件下孵育过夜，在转染当天细胞达到约40-80％融合。使用Qiagen(Valencia,CA)QIAprep微量制备试剂盒按照生产厂商的说明制备质粒DNA，将所述质粒DNA洗脱至50μl EB缓冲液中。使用Nanodrop 1000(Thermo Fisher Scientific,Wilmington DE)分光光度计检测DNA的浓度。使用Polyfect(Qiagen,Valencia,CA)转染试剂按照生产厂商的说明转染质粒DNA，每60mm平皿加入2.5μg质粒DNA和15μl溶于150μl无血清DMEM转染混合物中的polyfect试剂。混合后，将反应物稀释至1ml含血清和所有添加剂的细胞生长培养基中，并滴加至含3ml新鲜DMEM完全培养基的平皿中。在收集培养基上清以用于进一步分析前，瞬时转染孵育48-72小时。
表达目标杂交核酸酶分子的稳定CHO DG44转染子的传代
通过电穿孔在CMV启动子控制下将含有RNase-Ig cDNA的选择性、可扩增质粒pDG导入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以实现稳定生产杂交核酸酶分子。pDG载体是pcDNA3的改进版，所述pDG载体编码带有减弱启动子的DHFR选择性标记物，以增加质粒的选择性压力。使用Qiagen maxiprep试剂盒制备质粒DNA，在进行酚提取和乙醇沉淀前，在唯一的AscI位点将纯化质粒线性化。加入鲑鱼精子DNA(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)作为载体DNA，将质粒和载体DNA各100μg用于电穿孔转染107CHO DG44个细胞。细胞在Excell 302培养基(JRHBiosciences)(下文中将其称为“Excell 302完全”培养基)中生长至对数期，所述培养基中含有谷氨酰胺(4mM)、丙酮酸钠、重组胰岛素、青霉素-链霉素和2xDMEM非必需氨基酸(均来自Life Technologies,Gaithersburg,Md.)。非转染细胞使用的培养基中也含有HT(稀释自次黄嘌呤和胸腺嘧啶的100x溶液)(Invitrogen/Life Technologies)。供选择性转染使用的培养基中含有不同水平的甲氨蝶呤(Sigma-Aldrich)作为选择剂，范围为50nM至1μM。在280伏、950微法条件下进行电穿孔。使转染细胞在非选择性培养基中恢复过夜，随后以125个细胞/孔至2000个细胞/孔范围间的不同系列稀释度选择性接种至96孔平底培养板(Costar)中。细胞克隆使用的培养基为Excell 302完全培养基，其中含有50nM甲氨蝶呤。克隆充分向外生长后，对主孔培养基上清进行系列稀释后使用-IgG夹心ELISA筛选-Ig融合蛋白的表达情况。简言之，将NUNC immulon II培养板用7.5微克/ml F(ab’2)山羊抗小鼠IgGPBS溶液(KPL Labs,Gaithersburg,MD)或2μg/ml山羊抗人或抗小鼠IgG(JacksonImmunoresearch,West Grove PA)4℃包被过夜。PBS/2-3％BSA封闭培养板，并将培养基上清的系列稀释液室温孵育2-3小时。PBS/0.05％吐温20洗板3次，并使用辣根过氧化物酶偶联的F(ab’2)山羊抗小鼠IgG2a(Southern Biotechnologies)和山羊抗小鼠IgG(KPL)的混合物孵育，所述抗体均在PBS/1.0％BSA中按照1:3500的比例稀释，或使用辣根过氧化物酶偶联的F(ab’2)山羊抗人IgG1(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)按照1:2500的比例稀释，室温孵育1-2小时。PBS/0.05％吐温20洗板4次，使用SureBlue Reserve，TMB底物(KPLLabs,Gaithersburg,MD)进行结合检测。加入等体积的1N HCl终止反应，使用Spectramax Pro酶标仪(Microdevices,Sunnyvale CA)于450nm条件下读板。将融合蛋白产量最高的克隆先后扩增至T25和T75烧瓶中，以提供用于冻存和大规模生产融合蛋白的适宜数量的细胞。将来自四个最佳克隆的培养物在含甲氨蝶呤的培养基中逐渐扩增以进一步增加其生产水平。在细胞的各次连续传代过程中，增加Excell 302完全培养基中甲氨蝶呤的浓度，这样仅有扩增了DHFR质粒的细胞才能够存活。
收集表达杂交核酸酶分子的CHO细胞的上清液，使用0.2μm PES快速滤器(Nalgene,Rochester,N.Y.)过滤，并使其通过蛋白A-琼脂糖(IPA 300交联琼脂糖)柱(Repligen,Needham,Mass.)。使用柱洗涤缓冲液(90mM Tris-碱、150mM NaCl、0.05％叠氮钠，pH 8.7)对洗柱，用0.1M pH 3.0柠檬酸缓冲液洗脱结合蛋白。收集组分，用Nanodrop(Wilmington DE)微量样品分光光度计于280nm处测定蛋白浓度，用0.1M pH3.0柠檬酸缓冲液进行空白检测。将含有融合蛋白的部分混合，用centricon浓缩器在PBS中连续振摇以进行缓冲液交换，随后用0.2μm的过滤设备过滤，以降低内毒素污染的可能性。
实施例2：RNase-Ig融合基因的构建。
依照来自EST文库(来自Dr.C.Raine,Albert Einstein School of Medicine,Bronx,NY)的全长cDNA扩增鼠源性RNase 1，该克隆由Dr.C.Raine直接送达本实验室，没有附带MTA。使用的序列特异性的5’和3’引物来自公开序列。通过序列分析对克隆的序列进行验证。Genebank登录号为NCBI geneID 19752。全长人RNase 1分离自随机引物和oligo dT引物cDNA，所述cDNA来自于人胰脏总RNA(Ambion/Applied Biosystems,Austin,TX)。
将全长克隆分离后，设计引物以构建带有小鼠IgG2a或人IgG1(SEQ ID NO:40)Fc结构域的融合基因。设计了两种不同的引物，针对融合在Fc尾的氨基末端的5’序列；第一种加入了来自小鼠(或人)RNase的天然前导肽，而第二种在RNase氨基末端的预计的信号肽裂解位点处连接了一个AgeI位点，以便将RNase与已克隆的人VKIII先导肽融合，所述人VKIII先导肽已用于其它表达研究。对于鼠源性RNase而言，第一个引物的序列为：
mribNL5’
30mer(RNase 5’带有天然信号肽和HindIII+Kozak)
gTT AAg CTT gCC ACC ATg ggT CTg gAg AAg TCC CTC ATT CTg-3’(SEQ ID NO:1)
第二个引物在RNase 5’末端的现有前导序列和成熟序列之间构建基因融合连接，所述连接位于或接近预计的前导肽裂解位点。
27mer(RNase 5’成熟序列(无先导，带有AgeI位点))
5’-gAT ACC ACC ggT Agg gAA TCT gCA gCA CAg AAg TTT CAg-3’(SEQ ID NO:2)
融合于鼠源性IgG2a的RNase羧基末端和Fc尾氨基末端的3’引物序列如下文所示：
mrib3NH2
28mer(RNase 3’末端带有XhoI位点用于与mIgG2a融合)。
5’-ggC TCg AgC ACA gTA gCA TCA AAg tGG ACT ggT ACg TAg g-3’(SEQ IDNO:3)
另设计两个寡核苷酸，以构建–Ig-RNase融合基因，其中–Ig尾是RNase酶结构域的氨基末端。
mrib5X
带有连接氨基酸和XbaI位点的36mer RNase 5’末端，用于与Fc结构域的羧基末端融合。
5’-AAA TCT AgA CCT CAA CCA ggT Agg gAA TCT gCA gCA CAg AAg TTT CAg-3’(SEQ ID NO:4)
mrib3X
带有两个终止密码子和XbaI位点的31mer RNase 3’末端，用于与Fc结构域的羧基末端融合。
5’-TCT AgA CTA TCA CAC AgT AgC ATC AAA gTg gAC Tgg TAC gTA g-3’(SEQID NO:5)
实施例3：人和小鼠-Fc结构域的分离以及在编码序列中引入突变。
用于分离小鼠和人(SEQ ID NO:40)-Fc结构域的RNA来自下文所述的小鼠或人组织。单细胞悬液来自RPMI培养基中的小鼠脾脏。或者，使用淋巴细胞分离液(LSM)OrganonTeknika(Durham,NC)从新鲜全血中分离人PBMC，按照生产厂商的说明书收集血沉棕黄色层，使用前在PBS中将细胞洗涤三次。离心培养基收集细胞，用2x107个细胞制备RNA。利用QIAGEN RNAeasy试剂盒(Valencia,Calif.)，总RNA分离试剂盒和QIAGEN QIAshredder柱，根据试剂盒中附带的生产厂商说明书从细胞中分离RNA。使用4μg总RNA作为逆转录制备cDNA的模板。将RNA、300ng随机引物、500ng寡核苷酸dT(12-18)、以及1μl 25mM dNTPs混合并在加入酶之前在80℃条件下变性5分钟。将Superscript III逆转录酶(Invitrogen,LifeTechnologies)加入总体积25μl的RNA与引物的混合物中，还有与酶一并提供的第二链缓冲液以及0.1M DTT。在50℃条件下进行逆转录反应一小时。使用QIAquick(QIAGEN)PCR纯化柱，根据生产厂商的说明纯化cDNA，并且在用于PCR反应前将其洗脱至40μlEB缓冲液中。
使用上文所述的cDNA作为模板，通过PCR扩增，分离野生型小鼠和人-Fc结构域。下述引物用于野生型序列的初始扩增，但是已在铰链结构域加入了所需的突变性改变：
mahIgG1CH2M:47mer
5’-tgtccaccgtgtccagcacctgaactcctgggtggatcgtcagtcttcc-3’(SEQ ID NO:6)
hIgG1-5scc:49mer
5’-agatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgtccaccgtgt-3’(SEQ ID NO:7)
mahIgG1S:51mer
5’-tctagattatcatttacccggagacagagagaggctcttctgcgtgtagtg-3’(SEQ ID NO:8)
muIgG2aCH2:58mer
5’-cctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggatcatccgtcttcatcttcc-3’(SEQID NO:9)
mIgG2a-5scc:47mer
5’-gaagatctcgagcccagaggtcccacaatcaagccctctcctcca-3’(SEQ ID NO:10)
mIgG2a3S:48mer
5’-gtttctagattatcatttacccggagtccgagagaagctcttagtcgt-3’(SEQ ID NO:11)
使用C1000热循环仪(BioRad,Hercules CA)或Eppendorf热循环仪(ThermoFisherScientific,Houston TX)进行PCR反应。反应包括95℃下的初始变性步骤2分钟，随后进行34个循环：在94℃变性30秒，50℃退火30秒，以及72℃延伸1分钟，随后在72℃最后延伸4分钟。野生型尾分离后，将片段TOPO克隆至pCR2.1载体，根据生产厂商的说明，使用QIAGEN旋转质粒微量制备试剂盒制备DNA，以及根据生产厂商的说明使用ABI Dye Terminator v3.1测序反应物对克隆进行测序。
将来自正确克隆的DNA作为重叠延伸PCR中的模板，以便在小鼠IgG2a或人-IgG1编码序列的所需位置引入突变。在50μl反应体积中搭建PCR反应，使用全长野生型克隆作为模板(1μl)，50pmol的5’和3’引物，用于从每个方向PCR在-Fc结构域中达到且包括所需突变位点的各部分，以及PCR高保真超混合液(Invitrogen,Carlsbad CA)，使用短扩增循环。作为重叠PCR诱变的一个例子，用于下文所示的引物组合将P331S突变引入人-IgG1：
使用全长野生型克隆作为模板扩增5’亚片段，5’引物为hIgG1-5scc：
5’-agatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgtccaccgtgt-3’(SEQ ID NO:12)，3’引物为P331AS：5’-gttttctcgatggaggctgggagggctttgttggagacc-3’(SEQ ID NO:13)。使用全长野生型克隆作为模板扩增3’亚片段，5’引物为P331S：
5’aaggtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaacaatctcc-3’(SEQ ID NO:14)，3’引物为mahIgG1S：5’-tctagattatcatttacccggagacagagagaggctcttctgcgtgtagtg-3’(SEQ ID NO:15)。
将亚片段扩增并使用琼脂糖凝胶电泳分离后，根据生产厂商的说明，使用QIAquick凝胶纯化柱对扩增产物进行纯化，并洗脱至30μl EB缓冲液中。随后以两个亚片段作为新反应的重叠模板进行两轮PCR。暂停循环，在反应物中加入5’(hIgG1-5scc，见上文)和3’(mahIgG1S，见上文)侧翼引物(均为50pmol)。随后在上文所述的野生型分子采用的条件下进行34个循环的PCR扩增。通过凝胶电泳分离全长片段，并TOPO克隆至pCR2.1载体，用于序列分析。再将带有正确序列来自克隆的片段亚克隆进入表达载体，以构建本发明所述的不同杂交核酸酶分子。
实施例4：在小鼠血清中对RSLV-124蛋白和RNase酶活性的定量。
RSLV-124构建体(SEQ ID NO:106)在小鼠体内的稳定性分析。
在零时刻单次静脉注射给予四只小鼠(C220、C221、C222、C223)RSLV-124。在注射后的不同时间点收集血样并分析RSLV-124蛋白(与野生型人IgG1Fc结构域连接的人野生型RNase(SEQ ID NO:106))的存在和RNase酶活性。为检测小鼠血清中的RSLV-124化合物，开发了一种ELISA，其从小鼠血清中捕获人Fc，随后对人RNase进行检测。在单次静脉注射给药150ug五分钟后，ELISA检测到四只小鼠的血液样品中存在的RSLV-124蛋白为38μg/ml至55μg/ml(图2)。在注射一天后，RSLV-124的浓度迅速降至8μg/ml至12μg/ml。在持续7天的分析期间，该药物在血液中的浓度仍维持相对稳定，药物在血液中的水平为约5μg/ml。使用与用ELISA测定RSLV-124蛋白相同的血液样品对药物的RNase酶活性进行定量。使用来自Ambion的RNaseAlert QC系统(Cat#AM1966)测定小鼠血液样品中具有某些修饰的RSLV-124蛋白的酶动力学。使用人抗-Fc单克隆抗体将药物化合物从小鼠血清中捕获至RNaseAlert检测板上，并依据Ambion试剂盒的说明书通过检测荧光进行定量。在注射五分钟后，RSLV-124分子的相对荧光单位(RFU)分析结果为80,000–140,000RFU(图3)。RFU与蛋白浓度平行迅速下降，到第7天时，其在18,000–40,000RFU之间维持相对稳定。利用RNaseAlert QC系统使用已知量的蛋白建立标准曲线，使用血液样品中RSLV-124的REU通过该标准曲线外推RSLV-124的蛋白浓度。从这个分析中，利用RNase酶活性检测的结果计算，得到了在为期7天的实验中小鼠血液中存在的蛋白浓度，其与使用ELISA测定的值非常接近(图4)。从这些实验中可以得出结论，在7天中RSLV-124化合物在小鼠体内循环中能够保持稳定并且保持其酶活性，这表明该化合物在小鼠体内不易于降解，因为在小鼠的循环系统中7天，其几乎保持了100％的酶活性。由于Fc融合蛋白通常易于在循环系统中降解，因而该发现进一步证实了可以将RNase-Fc融合蛋白用作有价值的药物。
实施例5：TLR7.1xRNaseA双转基因小鼠的表型。
构建出一种过表达RNaseA(RNase Tg)的小鼠。这种核酸酶在RNase Tg小鼠中具有较高的表达水平。开发了单相酶扩散(SRED)法(图5)和定量ELISA，所述ELISA在血清中能够更加准确的对RNase进行定量(见图6)。这两项检测均显示在RNase Tg中RNase活性显著增加。将图6中RNase水平的定量结果与野生型B6小鼠进行比较，显示在RNase Ig中RNase增加了约10倍。我们将RNaseA Tg与TLR7.1Tg小鼠杂交获得具有8-16个TLR7拷贝的双Tg(DTg)。TLR7.1小鼠患有非常严重的、迅速进展的狼疮样疾病并在3月龄时开始死亡，其平均生存期为6个月。在一项初步分析中，收集3月龄DTg及其同窝对照的血样，以确定DTg小鼠是否出现改善迹象。如图5所示，DTg小鼠血清中的RNase水平非常高(等效量>13U/ml RNase，标准品的比活度为993U/mg)。采用ELISA试验测定了Tg和DTg小鼠中的RNaseA浓度，结果见图6。RNase A Tg和TLR7.1XRNaseA Dtg小鼠RNase A的血清浓度在1-2ng/ml之间。
RNase A ELISA的详细方法
1.用抗-RNaseA Abcam Ab(ab6610)包板：2.5-10μg/ml O/N，4℃。
2.用0.05％吐温/1XPBS洗板3次
3.用含1％BSA的PBS至少封闭1小时
4.用0.05％吐温/1XPBS洗板3次
5.上样，样品1:50稀释
6.室温条件下孵育2小时
7.用0.05％吐温/1XPBS洗板3次
8.制备1:4500稀释的生物素标记的抗RNase抗体(2.2ug/ml)。室温放置1小时(Rockland 200-4688：10mg/ml)。
9.洗板3次
10.按照1:2500的比例稀释StrepAV HRP(Biolegend 405210)。使用锡箔纸覆盖并在室温下放置25-30min。
11.洗板6次，在两次洗涤之间让液体在各孔中至少停留30s。
12.加入BD OptEIA底物A+B 1:1。放置直至颜色改变，最多5-10min。最上边孔中标准品的读数不能超过1.0。加入80μl。(目录号：51-2606KC；试剂A，51-2607KC；试剂B)
13.加入40μl 1M的硫酸终止反应
产品/试剂信息：
RNaseA Ab：ab6610(90mg/ml)
ELISA缓冲液：含1％BSA的PBS
ELISA洗涤缓冲液：0.05％吐温/1XPBS
抗RNaseA生物素偶联的Ab：Rockland：200-4688(10mg/ml)
Strep AV HRP：Biolegend 405210
BD OptEIA试剂A和B：51-2606KC和51-2607KC
实施例6：TLR7.1转基因小鼠品系的存活曲线。
DTg和TLR7.1同窝对照的存活率存在非常显著的差异。如图7所示，在10个月时，61％的TLR7.1小鼠死亡，而31％的DTg小鼠死亡。该数据显示RNaseA过表达产生强大的治疗作用。尽管严重的贫血、血小板减少和肾小球肾炎在这中间起了一部分作用，TLR7.1小鼠过早死亡的原因尚不完全明确。为确定DTg小鼠中红细胞和血小板计数是否确实受到了RNaseA表达的影响，我们进行了血液计数，但TLR7.1和DTg小鼠之间未发现存在差异。相反，DTg小鼠中肾脏组织病理学得到了显著改善。我们观察到DTg小鼠中IgG和C3的沉积减少。与TLR7.1同窝对照相比，DTg小鼠中的PAS染色也减少，所述PAS染色能反映肾小球膜炎症。当用抗-MAC-2(半乳凝素3)抗体(Lyoda et al.Nephrol Dial Transplat 22:3451,2007)比较肾脏中的巨噬细胞浸润时发现，DTg小鼠肾小球中的mac-2阳性细胞更少。各组取5只小鼠，每只小鼠取20个肾小球进行计数的结果显示，单一和DTg的平均值+/-SE分别为3.8+/-1.1和1.4+/-0.2，p＝.05。此外，还对肾小球丛的尺寸进行了定量检测，并观察到DTg小鼠中肾小球丛的尺寸显著降低(单一和DTg中分别为179+/-41和128+/-16.8μm2，p＝0.037)。总之，TLR7.1XRNaseA DTg小鼠的存活期显著长于其单一Tg TLR7.1同窝，且肾脏的炎症和损伤减轻。这一发现表明：在该小鼠模型中除去RNA免疫复合物显著改善了总体死亡率，并且减轻了与该狼疮样病理学相关的肾损伤和总体炎症状况。
实施例7：TLR Tg小鼠脾脏中的IRG分析。
对TLR7.1Tg和TLR7.1X RNaseA DTg小鼠脾脏中的干扰素应答基因(IRG)进行分析的结果显示，DTg小鼠中IRF7基因(干扰素调节因子7(UniProtKB P70434))的表达显著降低(p＝0.03)。与Tg小鼠相比，其它某些IRGs包括MX1(干扰素诱导的GTP结合蛋白Mx1(UniProtKB P09922))和VIG1(含有S-腺苷甲硫氨酸结构域的蛋白2(UniProtKB Q8CBB9))在DTg小鼠中降低，但是该差异不具有显著性。(图8)。如下文所示进行定量PCR：使用RNeasymini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)从小鼠脾脏中分离总RNA，使用Turbo-DNA-free(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)处理DNase，使用RNA-to-cDNA试剂盒(Applied Biosystems)利用随机引物制备第一链cDNA。使用NanoDrop(ThermoScientific,Waltham,MA,USA)检测分离RNA的260/280在1.7至2.0之间。将cDNA稀释至相当于1ng/μl总RNA，每次反应使用8μl。合成对照基因(18s)和目标基因(GOI)的引物(IDT,Coralville,Iowa,USA)，用分子级水将所述引物稀释至适于qPCR的浓度。引物的BLAST结果显示，其为仅与对照基因或GOI同源的特异性序列。反应设置双复管(20μl)，使用含模板和引物1:1混合物的SensiMix SYBR low-ROX主混合物(Bioline,London,UK)在ABI Fast7500系统中进行。通过2-ddCT法计算相对量，以年龄匹配的野生型B6小鼠作为基线确定各GOI的变化倍数。反应的解离曲线显示了各基因的单一熔化峰。标准曲线显示了各基因具有相似的扩增效率且模板浓度在各引物线性动力学范围内。
实施例8：DNase1-Ig单酶和双酶杂交核酸酶分子的构建和表达。
人DNase1或DNase1样分子天然存在的等位基因已被报道。此前已报道了在人DNAse1样酶的天然变体中出现的A114F突变，且其引起酶的肌动蛋白抗性，所述酶包含此序列改变。参见，Pan,CQ,Dodge TH,Baker DL,Prince WE,Sinicropi DV,and Lazarus RA.JBiol Chem 273:18374-18381,(1998)；Zhen A,Parmelee D,Hyaw H,Coleman TA,Su K,Zhang J,Gentz R,Ruben S,Rosen C,and Li Y.Biochem and Biophys Res Comm 231:499-504(1997)；以及Rodriguez AM,Rodin D,Nomura H,Morton CC,Weremowicz S,andSchneider MC.Genomics 42:507-513(1997)，其全部内容通过整体引用并入本申请。
类似地，最近有报道G105R突变作为编码人DNAse 1基因中的单核苷酸多态性，所述多态性在某些或所有种群中具有多态性，且与自身免疫性有关。(参见，Yasuda T,UekiM,Takeshita H,Fujihara J,Kimura-Kataoka K,Lida R,Tsubota E,Soejima M,Koda Y,Dato H,Panduro A.Int J Biochem Cell Biol 42(7):1216-1225(2010)，在此通过引用并入本申请)。与野生型相比，在所述位点的等位基因变体为高活性的DNase1同种型。另一种天然存在的、多态性突变(R21S)也已报道具有更高的活性(见上文所述的Yasuda)。
已有报道显示系统性红斑狼疮患者DNase1活性水平显著降低(参见，Martinez-Valle F,Balada E,Ordi-Ros J,Bujan-Rivas S,Sellas-Fernandez A,Vilardell-TarresM.Lupus 18(5):418-423(2009)，在此通过引用并入本申请)。
当对患者给药时，天然存在的酶变体可能具有较低的免疫原性，因为这些同种型存在于人群。我们已经详尽地论证了将类似于A114F具有肌动蛋白抗性性质的等位基因与像G105R一样能够增加酶活性的等位基因进行组合将产生新的人DNase1等位基因变体，所述变体可能显示出改善的体外和体内临床活性。据我们所知，我们首次报道了由两种天然存在的变体G105R和A114F组合产生出新突变形式的所述DNase1。
按照如前所述的方法从人胰脏RNA(Ambion)中分离人DNase1，通过随机引物获得cDNA并使用下述引物集进行PCR：
5’hDNase1-age：GTT ACC GGT CTG AAG ATC GCAGCC TTC AAC ATC CAG(SEQ IDNO:16)
5’hDNase1-bx：GTT CTC GAG ATC TTT CAG CAT CAC CTC CAC TGG ATA GTG(SEQID NO:17)
或者用下述引物对，通过PCR扩增3’DNase盒。
3’hDNase1-RV：GTT GAT ATC CTG AAG ATC GCA GCC TTC AAC ATC CAG(SEQ IDNO:18)
3’hDNase1-stop：GTT TCT AGA TTA TCA CTT CAG CAT CAC CTC CAC TGG ATAGTG(SEQ ID NO:19)
在各引物均为50pmol，2μl cDNA，总体积为50μl条件下，利用上文所述的PlatinumPCR Supermix进行PCR反应。在94℃30s；55℃30s；68℃90s扩增条件下进行35次扩增循环。
通过PCR扩增得到野生型基因后，对基因片段进行凝胶电泳，使用QIAquick柱纯化850bp片段。将片段克隆至pCR2.1，如对其它构建体的描述，根据生产厂商的说明通过TOPO克隆进行转化。对序列进行了验证后，使用PCR引物生产含有DNase1天然存在的等位基因的亚片段，所述片段已报道具有改善的特异性活性和对肌动蛋白抑制具有改进抗性。这些亚片段中含有折叠序列，允许含有上述所需等位基因变体的完全DNase1亚克隆扩增。用Polyfect(Qiagen,Valencia,CA)转染试剂在60mm平皿中将COS 7细胞瞬时转染。利用Qiagen QIAprep微量制备试剂盒根据生产厂商的说明制备质粒DNA。将质粒洗脱至50μl EB缓冲液中。使用Nanodrop检测DNA的浓度，每次转染反应使用2.5μg质粒DNA。将各DNaseIg或RNase-Ig-DNase表达盒插入表达载体pDG，所述pDG衍生自pcDNA3.1的哺乳动物。在收集培养基上清液用于进一步分析前，将转染细胞在37℃、5％CO2条件下孵育72小时。收集培养基上清液，离心除去溶液中的残留细胞，并将液体转移至新的试管中。
使用质粒瞬时转染COS-7细胞，所述质粒含有人DNase1野生型或与野生型人IgG1Fc结构域融合的天然存在的DNase 1突变等位基因(G105R和/或A114F)。该铰链-CH2-CH3盒含有铰链区C→S单突变以清除该结构域中的第一个半胱氨酸，因为在抗体的轻链中缺乏与其配对的配体导致其无法配对。此外，还可以通过COS细胞瞬时转染表达更多的复合多核酸酶融合蛋白。
实施例9：人-Ig尾端的分离、将突变引入编码序列和构建突变核苷酸分子
为了分离突变的人-Ig Fc结构域，从人PBMC中获得RNA，使用淋巴细胞分离液(LSM)Organon Teknika(Durham,NC)从新鲜的全血中分离人PBMC，按照生产厂商的说明收集血沉棕黄层，并且在使用前用PBS洗涤细胞三次。离心使细胞从培养基中成球，用2x107个细胞制备RNA。利用QIAGEN RNAeasy试剂盒(Valencia,Calif.)，总RNA分离试剂盒和QIAGENQIAshredder柱，根据试剂盒中附带的生产厂商说明书从细胞中分离RNA。使用1微克(4μg)总RNA作为逆转录制备cDNA的模板。将RNA、300ng随机引物、500ng寡核苷酸dT(12-18)、以及1μl 25mM dNTPs混合，并在加入酶之前在80℃条件下变性5分钟。在第二链缓冲液和与酶一并提供的0.1M DTT存在的条件下，将Superscript III逆转录酶(Invitrogen,LifeTechnologies)加入总体积25μl的RNA与引物的混合物中。在50℃条件下进行逆转录反应一小时。使用QIAquick(QIAGEN)PCR纯化柱，根据生产厂商的说明纯化cDNA，并且在用于PCR反应前将其在40μl EB缓冲液中洗脱。
使用上文所述的cDNA作为模板，利用PCR扩增分离野生型人-Ig Fc结构域。利用PCR定点诱变，使用包含所需突变和野生型表达盒的适宜PCR引物作为模板来分离突变-Ig片段。使用C1000热循环仪(BioRad,Hercules CA)进行PCR反应。反应包括95℃下2分钟的初始变性步骤，随后在94℃进行34个循环，变性30秒，55℃退火30秒，以及72℃延伸1分钟，随后在72℃最后延伸4分钟。一旦将全长突变尾端分离，就将片段TOPO克隆至pCR2.1载体，根据生产厂商的说明，使用QIAGEN旋转质粒微量制备试剂盒制备DNA，以及根据生产厂商的说明使用ABI Dye Terminator v3.1测序反应物对克隆进行测序。
通过PCR诱变，利用具有突变寡核苷酸的重叠延伸PCR制备重组分子。
使用下述寡核苷酸衍生这些分子。
CS-P238S 5-1：TCT CCA CCG AGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGA GGA TCG TCAGTC TTC CTC TTC CCC C(58mer)(SEQ ID NO:20)
SSSH-5-2：AGA TCT CGA GCC CAA ATC TTC TGA CAA AAC TCA CAC ATC TCC ACCGAG CCC AGC ACC T(58mer)(SEQ ID NO:21)
P331S-S：GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC A(46mer)(SEQ ID NO:22)
P331S-AS：TGG AGA TGG TTT TCT CGA TGG GGG CTG GGA GGG CTT TGT TGG AGACC(47mer)(SEQ ID NO:23)
hIgG1-3’WTnogt：TCT AGA TTA TCA TTT TCC CGG AGA GAG AGA GAG GCT CTTCTG CGT GTA GTG(51mer)(SEQ ID NO:24)
通过PCR诱变在连续的PCR反应中利用两个重叠的5’寡核苷酸引入P238S突变和用SSS替换SCC。第一个PCR反应包括下述5’引物，其在其序列中引入P238S突变：CS-P238S 5-1：TCT CCA CCG AGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGA GGA TCG TCA GTC TTC CTC TTC CCCC(58mer)。(SEQ ID NO:25)
第二个PCR反应包括下述5’引物，其与第一个引物重叠并且在P238S突变体上加入突变的铰链残基：SSSH-5-2：AGA TCT CGA GCC CAA ATC TTC TGA CAA AAC TCA CAC ATCTCC ACC GAG CCC AGC ACC T(58mer)。(SEQ ID NO:26)
使用来自正确克隆的DNA作为重叠延伸PCR的模板，以便在人-IgG1编码序列所需的内在位置引入突变。在50μl反应体积中使用短扩增循环搭建PCR反应，使用全长克隆作为模板(1微升)，50pmol的5’和3’引物以PCR-Ig尾部的每一部分直到从每个方向都包括所需突变位点，以及PCR高保真Supermix(Invitrogen,Carlsbad CA)。作为重叠PCR诱变的一个例子，用下文所示的引物组合将P331S突变引入到已引入P238S突变的人-IgG1：
使用全长野生型克隆作为模板来扩增5’亚片段，5’引物为SSSH-5-2：AGA TCT CGAGCC CAA ATC TTC TGA CAA AAC TCA CAC ATC TCC ACC GAG CCC AGC ACC T(58mer)，3’引物为P331S-AS：TGG AGA TGG TTT TCT CGA TGG GGG CTG GGA GGG CTT TGT TGG AGA CC(47mer)。(SEQ ID NO:27)
使用全长野生型克隆作为模板来扩增3’亚片段，5’引物为：P331S-S：GTC TCC AACAAA GCC CTC CCA GCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC A(46mer)，3’引物为hIgG1-3’WTnogt：TCT AGA TTA TCA TTT TCC CGG AGA GAG AGA GAG GCT CTT CTG CGT GTA GTG(51mer)。(SEQ ID NO:28)
一旦将亚片段扩增并使用琼脂糖凝胶电泳分离后，根据生产厂商的说明，使用QIAquick凝胶纯化柱对其进行纯化，并在30微升EB缓冲液中洗脱。随后在新反应中，以两个亚片段作为重叠模板进行两轮PCR。暂停循环，在反应物中加入5’和3’侧翼引物(均为50pmol)。随后如上文所述的野生型分子采用的条件下进行34个循环的PCR扩增。通过凝胶电泳分离全长片段，并TOPO克隆至pCR2.1载体中，以用于序列分析。随后将带有正确序列的来自克隆的片段亚克隆进入表达载体，以产生本申请所述的不同杂交核酸酶分子。
对于多特异性核酸酶分子而言，使用针对Fc结构域3’末端的替代引物进行PCR反应，除去终止密码子，并在分子中加入NLG接头和EcoRV限制性位点，以促进与其余表达盒的融合。该引物序列列于下文：5'GAT ATC CTG CAC GCT AGG GCT GCT CAC ATT 3'。(SEQ IDNO:29)
通过将突变的人-Ig尾端与野生型RNase结构域在具有或不具有将这两个结构域隔离的接头的情况下融合，从而构建RSLV突变核酸酶。RSLV 125和RSLV126将人RNase与突变的铰链和IgG1Fc结构域融合。RSLV125中不含有接头，而RSLV 126中含有(gly4ser)4接头，该接头作为插入核酸酶结构域和铰链区之间的(BglII-XhoI)片段。RSLV-125将野生型RNase表达盒直接与SSS(而非CCC或野生型)版的人IgG1铰链以及P238S、P331S突变的人IgG1Fc结构域融合(SEQ ID NO:61-62)。
RSLV 126将野生型RNase表达盒与(gly4ser)4接头结构域融合，后接SSS突变铰链和P238S-P331S双突变Fc结构域(SEQ ID NO:63-64)。
RSLV-127是多核酸酶融合构建体，其将氨基末端的人DNase(G105R/A114F)与(gly4ser)4接头结构域融合，接头后接SSS突变铰链和融合了NLG接头结构域的P238S-P331S双突变Fc结构域，后接C末端的野生型RNase结构域(SEQ ID NO:65-66)。
RSLV-128是多核酸酶融合构建体，其将氨基末端的野生型人RNase结构域与(gly4ser)4接头结构域融合，后接SSS突变铰链和融合了NLG接头结构域的P238S-P331S双突变Fc结构域，后接C末端的突变DNase(G105R/A114F)结构域(SEQ ID NO:67-68)。
RSLV-129是多特异性融合构建体，其将氨基末端的野生型人RNase结构域与SSS突变铰链和融合了NLG接头结构域的P238S-P331S双突变Fc结构域融合，后接C末端的突变DNase(G105R/A114F)结构域(SEQ ID NO:69-70)。
RSLV-132将野生型RNase表达盒直接与SCC版的人IgG1铰链以及P238S、P331S突变的人IgG1Fc结构域融合(SEQ ID NOS:91-92和95-96)。
RSLV-133是多特异性融合构建体，其将氨基末端的野生型人RNase结构域与SCC突变铰链和融合了NLG接头结构域的P238S-P331S双突变Fc结构域融合，后接C末端的突变DNase(G105R/A114F)结构域(SEQ ID NOS:93-94和97-98)。
具有SCC铰链的其它版本的RSLV-125-RSLV-129见表1，如RSLV-125-2(SEQ ID NO:77-78)、RSLV-126-2(SEQ ID NO:79-80)、RSLV-127-2(SEQ ID NO:81-82)、RSLV-128-2(SEQID NO:83-84)和RSLV-129-2(SEQ ID NO:85-86)。
实施例10：COS7转染表达的RSLV 125-129融合蛋白的Western印迹
图9显示了源于RSLV 125-129构建体的COS转染上清液的Western印迹。使用Polyfect转染试剂将含有RSLV 125、126、127、128或129的表达质粒转染至COS7细胞中，并于48小时后收集上清液。除了在RSLV 125和126中包含的单一核酸酶分子以外，还在COS细胞瞬时转染中表达了由RSLV 127、128和129编码的更复杂的多核酸酶融合蛋白。对瞬时转染体的上清液进行了Western印迹分析。图9中的分子含有人RNase1与人SSS IgG1铰链和IgG1P238S-P331S Fc结构域的融合，或包括人RNase1(野生型)与人IgG1的SSS铰链-(P238S-331S)CH2-CH3Fc结构域的融合，后接含有N-连接糖基化位点以保护接头结构域不被蛋白酶裂解的新型接头，以及在分子羧基末端的突变等位基因G105R-A114F形式的人DNase1。此外，RSLV 127编码在氨基末端上的上述人DNase1突变和在突变-Ig尾端的羧基末端上的RNase 1WT。72小时后收集COS上清液，在4℃条件下将0.5ml样品与100μl蛋白A-琼脂糖小球免疫沉淀。在使用SDS-PAGE上样缓冲液重悬前，将蛋白A小球离心并在PBS中洗涤两次，用NuPAGE凝胶——还原或非还原性LDS上样缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)。根据生产厂商的说明加热样品，离心后的蛋白A小球成团，并将上样缓冲液加入5-12％NuPAGE梯度凝胶中。在150伏条件下将样品电泳1.5-2小时，在30mAmp条件下处理1小时将凝胶转印至硝酸纤维素膜。使用TBS/5％脱脂奶粉将Western印迹封闭过夜。在室温条件下将印迹与1:2500的HRP(辣根过氧化物酶)偶联的山羊抗人IgG(Fc特异性，Jackson Immunoresearch)孵育1.5小时，PBS/0.5％吐温20中洗涤五次或以上，并使用ECL试剂对印迹显色。结果表明核酸酶Fc融合蛋白的构建是成功的，并且COS细胞容易地表达了所述蛋白。此外，对这些核酸酶Fc融合蛋白的还原和非还原谱图的分析证实了所述DNA构建体编码了具有适宜分子量的蛋白。非还原SDS-PAGE谱图确证了所述蛋白二硫键的性质与构建体的预期性质一致。
实施例11：源自COS7转染子的经亲和纯化的蛋白的SRED分析
图10显示了SRED分析，比较了对实施例10的源自经RSLV转染的COS上清液的，并经蛋白A纯化后的蛋白等分物。使用蒸馏水制备2％的琼脂糖凝胶。将Poly-IC(Sigma)溶于蒸馏水中使其浓度为3mg/ml。按照如下方法制备胶板：将1.5ml反应缓冲液(0.2M Tris-HClpH7.0、40mM EDTA和0.1mg/ml溴乙锭)、1ml Poly-IC和0.5ml水加入试管中，并在50℃保持5分钟。将3ml琼脂糖(保持50℃)加入试管。将混合物立即倾倒在玻璃板上。在凝胶上打上样孔。对照、血清样品或经亲和纯化的RSLV蛋白均取2μl上样，并将凝胶置于湿盒中37℃孵育4小时。然后将凝胶在置于缓冲液(20mM乙酸钠pH 5.2，20mg/ml溴乙锭)中，在冰上孵育30min，并在UV下检测。在UV透照灯的照射下，用配有溴乙锭滤片的Kodak数字照相机DC290系统对凝胶拍照，并使用Kodak分子成像软件进行分析。来自RNase酶活性检测的结果表明所述构建体均含有具有催化活性的RNase部分。
实施例12：RSLV核酸酶分子的胶内DNase活性
图11显示了对实施例10中的源自经RSLV融合质粒转染的COS7上清液的，并经蛋白A纯化后的蛋白进行DNase核酸酶活性检测。图11中有五幅图(11a、11b、11c)，其中各凝胶图均表示量逐渐减少的指示融合蛋白和1微克质粒DNA的消化图。使用无核酸酶的水将各蛋白倍比稀释，使其含有500ng至4ng酶。在各样品中加入1μg PDG质粒DNA，在37度下孵育30分钟。将各样品的一半使用1.2％的TAE琼脂糖在100伏下进行30分钟的琼脂糖凝胶电泳。图11c显示了使用商品化的DNase 1(Biolabs,Inc.)的胶内DNase酶活性检测结果。最右侧的泳道为仅含有DNA而无酶的阴性对照，其左侧的泳道为另一个阴性对照，其为RNase-Ig分子，其具有RNase活性但不具有DNase活性，与预期的一致，这两种情况下质粒DNA仍是完整的并且未被消化。结果表明商品化的DNase1具有较高的活性，并且其在大部分检测浓度下消化了所有的DNA分子。图11a和11b的结果显示了四种不同核酸酶Fc融合构建体的DNase活性。图11a的上图显示了DNase-Ig融合蛋白消化质粒DNA的能力，从凝胶中明显的看出，该酶在所有检测浓度下消化了全部的DNA，其具有比商品化的DNase 1相同或者更高的活性。图11a中的下图是在Fc的氨基末端具有DNase的双特异性核酸酶Fc融合蛋白(SED ID 65-66)，其也具有较强的DNase酶活性，但是其活性略低于图11a的上图中的DNase-Ig。图11b的上图显示了另一种双特异性核酸酶的DNase酶活性，该Fc融合蛋白在Fc的C-末端具有DNase，其通过特别设计的NLG接头与Fc连接(SEQ ID 67-68)。从数据中可以明显的看出，该酶也具有较强的DNase酶活性，并且其似乎比这里检测的其它双特异性核酸酶具有更高的活性。图11b中的下图显示了另一种双特异性核酸酶分子的DNase酶活性，其缺乏连接RNase模块和Fc的(G4S)4接头(SEQ ID 69-70)。该双特异性核酸酶也具有良好的DNase活性，但是其活性似乎略低于本实验中的另两种双特异性核酸酶Fc融合蛋白。该数据表明所有的双特异性核酸酶均具有良好的DNase活性，考虑到过去别人在这方面的努力(Dwyer等，JBC；Vol 271,No.14；pp 9738-9743)，本申请的上述数据是意料不到的。而且，在构建体中DNase的位置以及连接DNase与Fc的接头的长度和组分，对在双特异性核酸酶Fc融合蛋白中形成具有较高活性的DNase酶均是至关重要的。
实施例13：酶动力学分析
图12-13显示了对重组RNase A(Ambion)、RSLV 125、RSLV 126、hRNase WT-SCCH-WThIgG1和hRNaseG88D-SCCH-(P238S/K322S/P331S)hIgG1的RNase酶活性进行比较的动态荧光酶活性检测。为进一步确定二价mRNase-Ig融合蛋白的功能特征，我们使用RNaseAlert底物(Ambion/IDT)研究了不同核酸酶融合蛋白的酶动力学，并使用Biotek Synergy2酶标仪对荧光进行定量。使用Gen5软件(Biotek Instruments,Inc.,Winooski,Vermont)进行数据分析。根据生产厂商的说明书，将相对荧光单位作为时间的函数，在37℃下孵育45分钟的实验过程中的每分钟进行检测，检测中使用逐渐降低的酶浓度，其从初始10pg/μl按照0.67x倍比稀释降至0.1pg/μl。各样品均包括在1X RNase Alert反应缓冲液中的固定浓度的RNase Alert底物(200nM)。
图12显示了在存在200nM RNase Alert底物的条件下以摩尔浓度计的各蛋白相对于时间的RFU(相对荧光单位)，待测蛋白为4.5pg/ul或4.5ng/ml，并且重组RNaseA对照为1.3pg/ul。
图13显示了不同分子的Lineweaver Burk曲线。为估计Vmax和Km，将RNase Alert动态荧光检测设定为使用105pM的酶，并且将底物浓度每次稀释4倍，由200nM降至50pM。这样，在这一系列实验中，固定酶的浓度并测定底物浓度。数据显示了在这些条件下不同融合蛋白产生的Lineweaver Burk曲线。图12和13中的数据结合在一起表明：在这里所构建和检测的三个RNase Fc融合蛋白中的RNase部分均具有较高的活性。
实施例14：体外评估对人THP-1细胞系的细胞毒性
图14-15显示了对具有野生型或突变(包括SCC、P238S、P331S)-IgG Fc结构域的RNaseIg融合蛋白对人单核细胞系THP1存活情况的影响进行分析的体外研究。在收集用于检测前，在RPMI/10％FBS培养基中保持THP1细胞处于对数生长。在用于细胞毒性检测前，细胞的存活率应大于98％。以1x10e6c/ml或100,000个细胞每孔的细胞密度将THP1细胞接种于96孔板。将融合蛋白2倍系列稀释，每个反应中融合蛋白开始为5微克/ml至结束为0.01微克/ml，以此方式将杂交核酸酶蛋白加入连续的孔中。在这项实验中，具有野生型IgG1Fc的RNase-Fc融合蛋白(wtRNasewtIgG)与具有突变Fc(P238S，P331S)的RNase-Fc(mtRNasemgIgG)相比，后者具有显著降低的Fc受体结合和内化，这与其在培养的THP1细胞中诱导细胞毒性的能力相关。在收集细胞并进行分析前，将反应物在37℃、5％CO2下在96孔板中孵育3天。三天后，1000rpm离心收集细胞，在PBS/2％FBS中洗涤，并按照生产厂商的说明使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(#556547,Becton Dickinson/Pharmingen)中的试剂孵育。使用100微升试剂盒中提供的冰冷的结合缓冲液洗涤细胞，并按照在100ul结合缓冲液中1:100的比例加入annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)。将样品在冰上孵育20分钟，随后在各样品中均再加入400μl补充的结合缓冲液。通过使用FACS Canto(Becton Dickinson)的流式细胞仪对染色样品进行分析，并使用Flowjo软件(Treestar,Ashland,OR)对数据进行分析。
图14显示了采用两种对细胞死亡敏感的检测方法Annexin V结合(上图)和碘化丙啶结合(下图)检测的具有野生型或突变的Fc结构域的RNase Fc融合蛋白对细胞死亡的影响。这项实验表明RNase融合蛋白与突变Fc(P238S，P331S)的结合降低了其与THP1细胞表面的Fc受体的结合，以及随后该蛋白的内化。该结果显示与野生型Fc融合蛋白相比，RNase-Fc突变体导致的细胞死亡显著降低(例如，蛋白为1.25μg/ml时降低约3倍)。图15是检测具有野生型或突变的Fc结构域(分别为RNase-wtIgG或RNase-mtIgG)的RNase Fc融合构建体的细胞毒性的荧光活化细胞分选(FACS)实验。数据表明当THP1细胞与具有突变Fc的RNase Fc构建体共同孵育时，死亡细胞数显著减少(与RNase–wtIgG相比，表示RNase Fc突变体的右图中峰尺寸更小)。这些数据显示RNase Fc突变体导致的细胞死亡比野生型低约3-5倍。这些和其它检测Fc受体结合的实验均清楚地表明：在存在携带Fc受体的细胞时，具有突变Fc结构域的RNase Fc构建体与Fc受体的结合减少并且较少被细胞内化，结果使得由构建体的RNase活性导致的细胞死亡减少。这种构建体在治疗自身免疫性疾病中特别有用，因为可能不希望所使用的蛋白治疗剂对携带Fc受体的细胞产生细胞毒性。
实施例15：在体外将RSLV-132加入培养物中抑制人PMNC产生IFN-α。
RSLV132能够阻止用免疫复合物刺激的人外周血单核细胞对干扰素-α的诱导，所述免疫复合物由三名SLE患者的血清和坏死细胞提取物(NCE)形成(图16)。为测定RSLV-132结合并降解狼疮患者的免疫复合物中所含的RNA的能力，开发了一项体外生物检测。此项实验涉及使用来自狼疮患者的自身抗体和来自培养的人细胞(U937)的NCE在体外形成免疫复合物。将狼疮患者的血清与NCE组合形成免疫复合物(IC)，其是干扰素的高效诱导剂，而正常人的血清不会刺激产生干扰素。将与IC孵育的正常人外周血单核细胞(PBMC)作为报告细胞。使用干扰素-αELISA检测报告细胞产生的干扰素。利用菲柯尔密度梯度离心从正常志愿者中获得报告细胞。在华盛顿大学机构审查委员会#HSD No.3971的监督下获得狼疮患者或健康正常志愿者的血清，将血清按照1/1000的比例稀释并加入10％(v/v)如上文所述来自培养的U937细胞的坏死细胞提取物(NCE)。将经过稀释的狼疮患者或正常志愿者的血清在室温下与NCE孵育15分钟，将所得到的IC与或者不与不同剂量的RSLV-132、RSLV-124或野生型RNase孵育15分钟，然后在存在500U/mL通用IFN的条件下与正常PBMC孵育20小时，随后测定PBMC培养物所分泌的IFN的量。血清来自于三名不同的狼疮患者，其患有疾病的活动度不同，在轻度至活跃范围内变化。将NCE与狼疮患者或健康正常志愿者的血清在室温下孵育15分钟，随后与PBMC孵育20小时。利用ELISA对IFN-α进行定量，其中使用针对人IFN-α的小鼠MAb(MMHA-11)[PBL Biomedical Laboratories，产品#2112-1]捕获IFN-α，并使用针对IFN-α的兔多克隆抗体[PBL Biomedical Laboratories，产品#31101-1]进行检测，随后使用抗-兔HRP[Jackson Immuno Research，产品#711-035-152]和TMB底物显色。在一些情况下，在将NCE加入PBMC之前，将浓度为0.16、0.5、1.6和5.0ug/mL的待测物(RSLV-124或RSLV-132)或者浓度为0.05、0.16、0.5和1.6ug/mL(等摩尔)的RNase加入NCE中。加入5.0ug/mL RSLV-124后，狼疮患者的血清刺激PBMC产生IFN的能力降低约50％。这种抑制反映等摩尔量RNase的抑制能力。与RSLV-124相比，加入相同浓度的huRSLV-132同样或更有效地抑制IFN，加入5.0ug/mL的huRSLV-132几乎完全消除了IFN的产生。当与NCE组合时，狼疮患者的抗-RNA/DNA抗体能够有效诱导新分离的PBMC产生IFN。正常志愿者的血清不具有这种相同的刺激报告细胞产生IFN的能力。该数据表明在狼疮患者血清中循环的自身抗体能够形成免疫复合物，其可能触发了TLR7并且随后产生IFN。未对IFN确切的类型和亚型进行分析。该数据表明RSLV-132能够结合其分子靶点，即狼疮患者IC中结合的RNA，并且有效地将其降解，以阻止其刺激PBMC产生IFN(图16)。在这项检测中，RSLV-132似乎比RSLV-124具有更高的活性。
实施例16：RSLV-132是RNA诱导的干扰素活化的高效体内抑制剂。
为了评估RSLV-132在小鼠循环系统中结合和降解RNA的能力，开发了一种使用RNA模拟聚肌苷酸:聚胞苷酸(poly I:C)的药效学模型，所述RNA模拟物为干扰素通路的强效激动剂。Poly(I:C)是一种错配的双链RNA，其一条链是肌苷酸的聚合物，另一条链是胞苷酸的聚合物。已知其与在B细胞、巨噬细胞和树突状细胞膜上表达的toll-样受体3(TLR3)相互作用。Poly(I:C)来自Invitrogen。可以通过测定给药后小鼠脾脏中干扰素刺激基因的表达水平对poly I:C的作用进行定量。在第0天，通过腹腔注射给予10只三月龄的B16小鼠RSLV-132(每只小鼠250ug)或作为对照的静脉免疫球蛋白(IVIG)(Privigen,Behring)(每只小鼠250ug)。RSLV-132或IVIG注射二十小时后，给小鼠腹腔内注射poly(I:C)，每只小鼠200ug。2小时后，通过暴露于CO2中处死动物，收集脾脏至RNAlater(Qiagen)，并在-80℃下保存以便用于后续干扰素刺激基因(ISG)的表达的研究。利用qPCR，将脾脏样品用于研究ISG的表达，ISG包括Ifit1(具有三十四肽重复1的干扰素诱导蛋白(UniProt Q64282))、Irf7(干扰素调节因子7(UniProt P70434))和Mx1基因。这些实验的结果表明：腹腔注射RSLV-132获得了能够与循环系统中的poly(I:C)结合并有效降解RNA模拟物的RSLV-132血清浓度，从而有效阻止了干扰素通路以及所监测的三个ISG的激活(图17)。
实施例17：RSLV-132和RSLV-133的酶动力学分析
在CHO细胞中瞬时表达RSLV-132和RSLV-133，并使用蛋白-A纯化。使用Ambion的RNaseAlert QC试剂盒(Cat#AM1966)对这些RNase Fc融合蛋白的RNase活性进行定量。使用了不同量的RNase Fc融合蛋白，并且如图18所示的结果以相对荧光单位(RFU)随时间变化表示。结果显示RSLV-132是较高活性的RNase，并且其与其它RNase Fc融合构建体如RSLV-124和野生型RNase相比具有增加的RNase活性。例如，当使用等量的(400pM)RSLV132和RSLV-124时，RSLV-132产生的RFU比RSLV-124高两倍(80,000vs.35,000)。此外，检测了两个生产批次在4℃下的稳定性。在这项实验前RSLV-132.1在4℃下保存8周，而RSLV-132.2在-80℃下保存并刚好在检测前解冻，结果表明该蛋白在4℃可以稳定存在达2个月。该药物的稳定性和增强的催化活性可以在治疗环境中提供增强的疗效。
图19显示了以RFU随时间变化表示的RNase酶活性，其对双特异性RSLV-133分子RNase活性的量与单特异性RSLV-132和野生型RNase进行了比较。如图19所示，与单特异性RSLV-124分子或者早期的双特异性核酸酶Fc RSLV-123或野生型RNase相比，RSLV-133分子具有显著增加的RNase活性，在蛋白量相等时，其产生高于两倍的RFU。图20显示了对RLSV-133分子与此前的双特异性核酸酶构建体RSLV-123和野生型DNase进行比较的DNase酶活性检测结果。在这项实验中，使用来自Integrated DNA Technologies的DNaseAlert试剂盒对DNase酶的活性进行定量，DNA底物的裂解产生荧光发射，使用Synergy2多模式酶标仪(BioTek Instruments,Inc.,Winooski,VT)对荧光进行定量。图20显示了RSLV-133、RSLV-123或野生型DNase的DNase酶活性的RFU随时间的变化情况。实验结果表明：与野生型DNase和早期的双特异性核酸酶分子RSLV-123相比，RSLV-133具有增加的DNase活性，在实验的线性范围内其产生高于3倍的DNase活性。图21显示了在胶内消化实验中，RSLV-133分子消化DNA的能力。结果显示在该项检测中RSLV-133能够与野生型DNase同样有效地消化DNA(比较泳道5&7)。考虑到RSLV-133和野生型DNase的相对分子量，似乎还是RSLV-133在该项检测中更加有效地消化了DNA。
实施例18：RSLV-132显示出降低的Fc受体结合。
为检测RNase Fc融合蛋白在体外结合Fc受体的能力，将RSLV124(野生型Fc结构域)和RSLV-132(突变的Fc结构域；P238S/P331S)与携带Fc的人骨髓细胞系共同孵育，并通过荧光活化细胞分选(FACS)分析对THP1和与细胞的特异性结合进行定量。使用来自Invitrogen的alexa fluor染料AF-647(Cat#A20006)对RLSV-124和RSLV-132进行荧光标记。对RNase Fc融合蛋白进行透析以除去未结合的染料后，将不同量的标记蛋白与THP1细胞孵育1小时，仔细洗涤细胞以除去未结合的RNase Fc融合蛋白，并使用FACS测定平均荧光强度来对特异性结合的蛋白进行定量。图22中的结果表明与具有野生型Fc结构域的RSLV-124相比，具有突变的Fc结构域的RSLV-132蛋白与Fc受体的结合显著减少，其与Fc受体的结合减少4倍以上。这一发现与我们此前的发现一致，即具有突变的Fc结构域(P238S/P331S)的RNase Fc融合蛋白具有显著降低的细胞毒性。
实施例19:杂交核酸酶分子生物学活性的体外评估。
如上述实施例中描述的方法，对一种或多种杂交核酸酶分子通过例如亲和或离子交换色谱进行纯化。在某些例子中，杂交核酸酶分子是多肽。在某些例子中，杂交核酸酶分子包括表1中的一个或多个序列。在某些例子中，杂交核酸酶分子包括与突变的Fc结构域连接的核酸酶结构域。在某些例子中，杂交核酸酶分子包括突变的Fc结构域。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括在铰链、CH2和/或CH3结构域的突变。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，以及可以包括在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个的突变。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或在三个铰链半胱氨酸中的突变。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或在三个铰链半胱氨酸变成SSS的突变。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括P238S和P331S以及在三个铰链半胱氨酸的突变。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括P238S和P331S和SSS。在某些例子中，所述突变的Fc结构域如SEQ ID NO：59、60、61所示。在某些例子中，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO所示。多种接头结构域(例如，本申请所描述的那些)可以用于连接Fc结构域和核酸酶结构域。例如，可以使用氨基酸长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多的接头结构域。采用定性试验在体外检测分子的特定核酸酶活性，以验证其是否具有所需的核酸酶功能。通常通过基于荧光的动力学检测和将读数设定为时间的函数的荧光酶标仪对特定活性进行确定，所述检测使用底物如RNase或DNase Alert试剂盒试剂。此外，一般采用市售试剂盒，如Pyrotell鲎变形细胞溶解物(LAL)试剂盒，以检测蛋白溶液的内毒素污染，所述试剂盒购于Cape Cod,Inc.(E.Palmouth,MA)且产品的检测限为0.06EU/ml。然后，采用多种体外试验对分子的生物学活性进行检测。
一系列体外试验将通过在培养基中存在或不存在分子的情况下，人PBMC对不同刺激的应答情况测定分子对细胞因子产物的作用。根据试验需要将正常或患者的人PBMC(约1x10e6个细胞)培养24、48或96小时。在存在刺激物如TLR配体、共刺激抗体、免疫复合物和正常或自身免疫性血清的情况下培养PBMC。采用市售试剂如Biolegend(San Diego,CA)的IL-6、IL-8、IL-10、IL-4、IFN-γ、TNF-α抗体配对试剂盒检测分子对细胞因子产物的作用。在24、48小时或更长的时间点收集体外培养物的培养基上清液，以确定分子对细胞因子产物的作用。采用例如来自PBL interferon source(Piscataway,NJ)的抗-人IFN-α抗体和标准曲线试剂检测IFN-α的产生情况。采用人淋巴细胞亚群(分离的单核细胞、B细胞、pDC、T细胞，等等)进行类似的系列试验；使用磁珠进行纯化，所述磁珠例如市售的来自MiltenyiBiotech(Auburn,CA)的分离试剂盒的磁珠。
此外，在刺激后的不同时间点评价分子对淋巴细胞活化受体如CD5、CD23、CD69、CD80、CD86和CD25表达的影响。对PBMC或分离细胞亚群进行多色流式细胞术检测以确定这些分子是如何影响与免疫细胞活化相关的不同受体的表达。
通过另外一系列检测测定这些分子在体外对不同淋巴细胞亚群增殖的影响。刺激前，利用例如CFDA-SE染色(Invitrogen,Carlsbad,CA)对人PBMC进行这些检测。用PBS/0.5％BSA将5mM的CFSE按1:3000比例稀释，加入10e7-10e8个PBMCS或已纯化的细胞亚类，将标记反应物在37℃条件下孵育3-4分钟，随后在RPMI/10％FBS中洗涤若干次以除去残留的CFSE。随后将CFSE标记细胞与多种刺激物(TLR配体、共刺激抗体，等等)和分子在共培养反应物中孵育4天，再利用染料偶联的细胞亚群特异性抗体通过流式细胞术对细胞增殖情况进行分析。
将采用另一项检测测定一个或多个分子的细胞毒性。这项检测将使用Annexin 5染色(例如，Annexin 5-FITC)测定毒性。将所关注的细胞(例如，单核细胞或单核细胞系)与所关注的杂交核酸酶分子(例如，具有突变的Fc结构域的杂交核酸酶分子)或一个或多个对照接触。在接触后的不同时间点，将细胞从培养基中分离并使用Annexin 5染色。然后计数凋亡或死亡的细胞数，例如使用流式细胞仪或荧光显微镜。与阳性对照相比，与所关注的杂交核酸酶分子接触的细胞显示出较少的Annexin 5染色阳性细胞数。
使用正常和患者的PBMC样品，在体外评价这些分子对单核分子向DC和巨噬细胞成熟的影响。
杂交核酸酶分子的有效性通过下述比较来确证：比较经本发明所述杂交核酸酶分子处理细胞的检测结果和来自经对照制剂处理细胞的检测结果。相对于处理前存在的标记物水平，或相对于对照组检测得到的水平，在有效分子处理组中，上文所述的多种标记物(例如，细胞因子、细胞表面受体、增殖)的水平普遍得到改善。
实施例20：对所需哺乳动物给药杂交核酸酶分子。
在本研究中使用了哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、啮齿类、人、豚鼠)。向哺乳动物给药(例如，静脉给药)一种或多种杂交核酸酶分子或对照，所述分子包含表1中一个或多个序列。在某些例子中，杂交核酸酶分子是多肽。在某些例子中，杂交核酸酶分子包括表1中的一个或多个序列。在某些例子中，杂交核酸酶分子包括与突变的Fc结构域连接的核酸酶结构域。在某些例子中，杂交核酸酶分子包括突变的Fc结构域。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括在铰链、CH2和/或CH3结构域的突变。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，以及可以包括在三个铰链半胱氨酸中的一个或多个的突变。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或在三个铰链半胱氨酸中的突变。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括P238S和/或P331S，和/或在三个铰链半胱氨酸变成SSS的突变。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括P238S和P331S以及在三个铰链半胱氨酸的突变。在某些例子中，所述突变的Fc结构域包括P238S和P331S和SSS。在某些例子中，所述突变的Fc结构域如SEQ ID NO：59、60、61所示。在某些例子中，杂交核酸酶分子如SEQ ID NO所示。多种接头结构域(例如，本发明所描述的那些)可以用于连接Fc结构域和核酸酶结构域。例如，可以使用氨基酸长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多的接头结构域。在某些例子中，将杂交核酸酶分子制成药学上可接受的载体。在某些例子中，将分子制成上述章节中描述的药物组合物。杂交核酸酶分子是RNase和/或DNase靶向的。
将采用多次给药的方法视为是有益的。在动物中监测对以下水平的影响：IFN-α水平、IFN-α应答基因水平、自身抗体滴度、肾功能和病理学和/或循环系统中免疫复合物水平。采用不同治疗方案和给药途径(例如，肌内给药，等等)进行类似的研究。杂交核酸酶分子的有效性通过以下比较得到了确证：比较使用本发明公开的杂交核酸酶分子治疗的哺乳动物和使用对照制剂治疗的哺乳动物以下水平：IFN-α水平、IFN-α应答基因水平、自身抗体滴度、肾功能和病理学和/或循环系统中免疫复合物水平。
在一个例子中，对需要治疗的人类主体进行选择或鉴别。主体可能需要例如降低系统性红斑狼疮的诱因或症状。主体的鉴别可以在临床或其它地方进行，例如在主体家中通过主体自己使用自检试剂盒进行。
在零时刻，向主体给药适宜的首剂量杂交核酸酶分子。如本发明所述将杂交核酸酶分子制剂。首次给药一段时间后，例如7天、14天和21天时，评估主体的身体状况，例如测定IFN-α水平、IFN-α应答基因水平、自身抗体滴度、肾功能和病理学和/或循环系统中免疫复合物水平。还可以检测其它的相关标准。根据主体的需要调整给药次数和强度。
相对于治疗前存在的水平，或相对于在类似状况但未经治疗主体或对照主体中的检测水平，所述给药后主体中以下水平得到降低和/或改善：IFN-α水平、IFN-α应答基因水平、自身抗体滴度、肾功能和病理学和/或循环系统中免疫复合物水平。
在另一个例子中，对所需治疗的啮齿类主体进行选择或鉴别。主体的鉴别可以在实验室或其它地方。
在零时刻，向主体给药适宜的首剂量杂交核酸酶分子。如本发明所述将杂交核酸酶分子制剂。首次给药一段时间后，例如7天、14天、和21天，评估主体的身体状况，例如测定IFN-α水平、IFN-α应答基因水平、自身抗体滴度、肾功能和病理学和/或循环系统中免疫复合物水平。还可以检测其它的相关标准。根据主体的需要调整给药次数和强度。
相对于治疗前的水平，或相对于在类似状况但未经治疗的主体或对照主体中的检测水平，所述给药后主体中的下列水平得到降低和/或改善：IFN-α水平、IFN-α应答基因水平、自身抗体滴度、肾功能和病理学和/或循环系统中免疫复合物水平。
虽然本发明通过引用优选实施方式和多种替代实施方式对发明进行了特别展现和描述，但是本领域技术人员都应该能够理解，在不脱离本发明公开的主旨和保护范围的情况下，上述内容还可以进行各种形式和细节上的变化。
出于任意目的，本说明书中引用的所有参考文献、已授权的专利和专利申请均通过整体引用并入本申请。
表

Claims (27)

1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：62、64、78、80、92或96所示。
2.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：96所示。
3.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：66、68、70、82、84、86、94或98所示。
4.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：98所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的多肽，其中所述多肽含有Fc结构域，且其中所述Fc结构域被修饰以降低其与Fcγ受体、补体蛋白或者这两者的结合。
6.根据权利要求1-4任一项所述的多肽，其细胞毒性与含有野生型Fc结构域的多肽相比至少降低1、2、3、4或5倍。
7.根据权利要求1-4任一项所述的多肽，其中所述多肽含有Fc结构域，且其中所述Fc结构域进一步包括选自下组的附加突变：
C220S；
C220S、C226S、C229S；
G236R；
L328R；
L234A；和
L235A。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述Fc结构域包括C220S突变。
9.根据权利要求1-4任一项所述的多肽，其与单独的第一核酸酶结构域或单独的第二核酸酶结构域相比，具有增加的血清半衰期。
10.根据权利要求1-4任一项所述的多肽，其降解循环系统中的RNA和免疫复合物中的RNA，或抑制干扰素-α的产生，或者这两者。
11.根据权利要求1-4任一项所述的多肽，其中RNase的活性不低于对照RNase分子活性的约1/9。
12.根据权利要求1-4任一项所述的多肽，其中RNase的活性约等于对照RNase分子的活性。
13.根据权利要求3或4所述的多肽，其中DNase的活性不低于对照DNase分子活性的约1/9。
14.根据权利要求3或4所述的多肽，其中DNase的活性约等于对照DNase分子的活性。
15.一种组合物，所述组合物包括前述任意一项权利要求所述的多肽和药学上可接受的载体。
16.一种编码根据权利要求1-4任一项所述的多肽的核酸分子。
17.一种包括根据权利要求16所述的核酸分子的重组表达载体。
18.一种根据权利要求17所述的重组表达载体转化的宿主细胞。
19.一种权利要求1-4任一项所述的多肽的制备方法，所述方法包括：提供包括编码所述多肽的核酸序列的宿主细胞；并且将所述宿主细胞维持在表达所述多肽的条件下。
20.根据权利要求1-4任一项所述的多肽在制备用于治疗或预防与异常免疫应答相关的状况的药物中的用途，其中所述与异常免疫应答相关的状况是SLE。
21.含有多肽的组合物在制备用于治疗SLE的药物中的用途，所述药物包括有效量的含有多肽的组合物以降解含有RNA、DNA或者RNA和DNA两者的免疫复合物，其中所述组合物包括药学上可接受的载体和多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：62、64、66、68、70、78、80、82、84、86、92、94、96或98所示。
22.一种二聚体，所述二聚体包括根据权利要求1-14任一项所述的多肽。
23.一种组合物，所述组合物包括根据权利要求22所述的二聚体以及一种药学上可接受的载体。
24.根据权利要求1所述的多肽在制备用于治疗SLE的药物中的用途。
25.根据权利要求2所述的多肽在制备用于治疗SLE的药物中的用途。
26.根据权利要求3所述的多肽在制备用于治疗SLE的药物中的用途。
27.根据权利要求4所述的多肽在制备用于治疗SLE的药物中的用途。
CN201280032451.2A 2011-04-29 2012-04-27 治疗性核酸酶组合物和方法 Active CN103930127B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711217220.XA CN107964539B (zh) 2011-04-29 2012-04-27 治疗性核酸酶组合物和方法

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161480961P 2011-04-29 2011-04-29
US61/480,961 2011-04-29
US201261617241P 2012-03-29 2012-03-29
US61/617,241 2012-03-29
PCT/US2012/035614 WO2012149440A2 (en) 2011-04-29 2012-04-27 Therapeutic nuclease compositions and methods

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711217220.XA Division CN107964539B (zh) 2011-04-29 2012-04-27 治疗性核酸酶组合物和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103930127A CN103930127A (zh) 2014-07-16
CN103930127B true CN103930127B (zh) 2018-01-09

Family

ID=47073103

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280032451.2A Active CN103930127B (zh) 2011-04-29 2012-04-27 治疗性核酸酶组合物和方法
CN201711217220.XA Active CN107964539B (zh) 2011-04-29 2012-04-27 治疗性核酸酶组合物和方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711217220.XA Active CN107964539B (zh) 2011-04-29 2012-04-27 治疗性核酸酶组合物和方法

Country Status (27)

Country Link
US (5) US10202588B2 (zh)
EP (2) EP2704737B1 (zh)
JP (5) JP6063450B2 (zh)
KR (5) KR102161657B1 (zh)
CN (2) CN103930127B (zh)
AU (5) AU2012249360B2 (zh)
BR (1) BR112013027547B1 (zh)
CA (1) CA2834626A1 (zh)
CL (1) CL2013003123A1 (zh)
CO (1) CO6811815A2 (zh)
CR (1) CR20130598A (zh)
DK (1) DK2704737T3 (zh)
DO (1) DOP2013000250A (zh)
EA (1) EA201391585A1 (zh)
EC (1) ECSP13013060A (zh)
ES (1) ES2666303T3 (zh)
HR (1) HRP20180564T1 (zh)
HU (1) HUE038759T2 (zh)
IL (4) IL300276A (zh)
LT (1) LT2704737T (zh)
MX (2) MX351953B (zh)
NZ (1) NZ616989A (zh)
PE (1) PE20141172A1 (zh)
PL (1) PL2704737T3 (zh)
SG (2) SG10201913930UA (zh)
SI (1) SI2704737T1 (zh)
WO (1) WO2012149440A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107964539A (zh) * 2011-04-29 2018-04-27 华盛顿大学 治疗性核酸酶组合物和方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528485A (zh) 2009-11-02 2021-10-22 华盛顿大学 治疗性核酸酶组合物和方法
US9603907B2 (en) 2012-02-01 2017-03-28 Protalix Ltd. Dry powder formulations of dNase I
CN104995302B (zh) 2013-01-16 2021-08-31 爱默蕾大学 Cas9-核酸复合物及其相关用途
SI3063275T1 (sl) 2013-10-31 2020-02-28 Resolve Therapeutics, Llc Terapevtske fuzije nukleaza-albumin in postopki
AU2015218704B2 (en) * 2014-02-24 2019-05-02 Takeda Gmbh UTI fusion proteins
US9599606B2 (en) * 2014-06-10 2017-03-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System ADP-ribose detection reagents
WO2016069889A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Resolve Therapeutics, Llc Therapeutic nuclease-transferrin fusions and methods
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
WO2017044424A1 (en) * 2015-09-08 2017-03-16 Theripion, Inc. Apoa-1 fusion polypeptides and related compositions and methods
TW201806972A (zh) 2016-05-27 2018-03-01 美商艾伯維生物醫療股份有限公司 雙特異性結合蛋白
DK3478830T3 (da) * 2016-07-01 2024-05-21 Resolve Therapeutics Llc Optimerede binucleasefusioner og metoder
WO2018136163A2 (en) 2016-12-09 2018-07-26 Theripion, Inc. Tandem apoa-1 fusion polypeptides
US10988746B2 (en) * 2018-10-08 2021-04-27 Neutrolis, Inc. Manufacturing and engineering of DNASE enzymes for therapy
EP3906062A1 (en) * 2019-01-04 2021-11-10 Resolve Therapeutics, LLC Treatment of sjogren's disease with nuclease fusion proteins
JP2020136505A (ja) 2019-02-20 2020-08-31 株式会社Ｊｏｌｅｄ 半導体装置および表示装置
AU2021205976A1 (en) * 2020-01-11 2022-07-07 Yale University Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing diseases or disorders caused by or associated with DNAse1 and/or DNAse1L3 deficiency
AU2021288567A1 (en) * 2020-06-08 2023-02-09 Yale University Compositions and methods for treating and/or preventing coagulopathy and/or sepsis in patients suffering from bacterial and/or viral infections
CN112088903A (zh) * 2020-09-28 2020-12-18 武汉愔紫生物科技有限公司 一种大分子蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用
EP4294916A2 (en) * 2021-02-19 2023-12-27 Theripion, Inc. Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods
CN115595315A (zh) * 2021-06-28 2023-01-13 四川大学华西医院（Cn） 核糖核酸酶i在抑制疼痛的药物中的新用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1852976A (zh) * 2003-07-26 2006-10-25 特鲁比昂药品公司 结合构建体及其使用方法
CN101990439A (zh) * 2007-07-06 2011-03-23 特鲁比昂药品公司 具有置于c末端的特异性结合结构域的结合肽

Family Cites Families (130)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5453269A (en) 1986-04-14 1995-09-26 The General Hospital Corporation Heterobifunctional antibodies having dual specificity for fibrin and thrombolylic agents and methods of use
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5559212A (en) 1988-04-06 1996-09-24 Alfacell Corporation Frog embryo and egg-derived tumor cell anti-proliferation protein
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5840840A (en) 1990-04-17 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selective RNase cytotoxic reagents
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
WO1993015722A1 (en) 1992-02-07 1993-08-19 Syntex (Usa) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles
GB9300686D0 (en) 1993-01-15 1993-03-03 Imp Cancer Res Tech Compounds for targeting
US20030108548A1 (en) 1993-06-01 2003-06-12 Bluestone Jeffrey A. Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6348343B2 (en) 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
US5989830A (en) 1995-10-16 1999-11-23 Unilever Patent Holdings Bv Bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6482626B2 (en) 1996-02-05 2002-11-19 Genentech, Inc. Human DNase
US6716974B1 (en) 1996-05-31 2004-04-06 Maine Medical Center Research Institute Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on jagged/notch proteins and nucleic acids
US6391607B1 (en) 1996-06-14 2002-05-21 Genentech, Inc. Human DNase I hyperactive variants
JP2001506967A (ja) 1996-08-02 2001-05-29 ブリストル―マイヤーズ・スクイブ・カンパニー 治療およびインビボ診断における免疫グロブリンの使用の結果としての免疫グロブリン誘発毒性の抑制方法
US7247302B1 (en) 1996-08-02 2007-07-24 Bristol-Myers Squibb Company Method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
EP0932417B1 (en) 1996-10-17 2003-03-05 Immunomedics, Inc. Non-antigenic toxin-conjugate and fusion protein of internalizing receptor system
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US20020198149A1 (en) 1997-06-16 2002-12-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020192659A1 (en) 1997-09-17 2002-12-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6280991B1 (en) 1997-10-15 2001-08-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Engineered cytotoxic ribonclease
US5840296A (en) 1997-10-15 1998-11-24 Raines; Ronald T. Engineered cytotoxic ribonuclease A
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
EP1068241B1 (en) 1998-04-02 2007-10-10 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6239257B1 (en) 1998-12-30 2001-05-29 Alfacell Corporation Family of proteins belonging to the pancreatic ribonuclease a superfamily
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU6064400A (en) 1999-07-02 2001-01-22 Genentech Inc. Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
US6175003B1 (en) 1999-09-10 2001-01-16 Alfacell Corporation Nucleic acids encoding ribonucleases and methods of making them
EP1246643A4 (en) 1999-10-14 2005-05-11 Jeffery A Ledbetter DNA VACCINES ENCODING ANTIGEN ASSOCIATED WITH CD40-BINDING DOMAIN
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
EP2357187A1 (en) 2000-12-12 2011-08-17 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
MXPA03006771A (es) 2001-01-29 2004-05-05 Idec Pharma Corp Anticuerpos modificados y metodos de uso.
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
DK1366067T3 (da) 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
JP4586310B2 (ja) 2001-07-04 2010-11-24 株式会社Ｉｈｉ セラミックス複合部材の製造方法
US20060040262A1 (en) * 2002-12-27 2006-02-23 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040018557A1 (en) 2002-03-01 2004-01-29 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2003276711A1 (en) 2002-06-14 2003-12-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Ribonuclease zymogen design
EP1534335B9 (en) 2002-08-14 2016-01-13 Macrogenics, Inc. Fcgammariib-specific antibodies and methods of use thereof
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
BRPI0314814C1 (pt) 2002-09-27 2021-07-27 Xencor Inc anticorpo compreendendo uma variante de fc
PT1562972E (pt) 2002-10-15 2010-11-10 Facet Biotech Corp Alteração de afinidades de ligação ao fcrn ou semi-vidas séricas de anticorpos por mutagénese
US20060263774A1 (en) 2002-11-01 2006-11-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
US7355008B2 (en) 2003-01-09 2008-04-08 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US7067298B2 (en) 2003-03-31 2006-06-27 Ambion, Inc. Compositions and methods of using a synthetic Dnase I
US7666417B2 (en) 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
US7754209B2 (en) * 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
JP2007503206A (ja) 2003-08-22 2007-02-22 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 変更されたエフェクター機能を有する改良された抗体およびその抗体を産生する方法
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
WO2005063815A2 (en) * 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
KR20060124656A (ko) 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
EP2154157A3 (en) 2004-01-12 2010-04-28 Applied Molecular Evolution Inc. FC region variants
EP1720996A4 (en) 2004-02-13 2007-03-21 Immunomedics Inc RECOMBINANT CYTOTOXIC RASES CONTAINING FUSION PROTEINS
EP2053062A1 (en) 2004-03-24 2009-04-29 Xencor, Inc. Immunoglobin variants outside the Fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
JP2008505853A (ja) 2004-04-13 2008-02-28 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド 細胞傷害性薬剤としての非天然のリボヌクレアーゼ複合体
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
KR100863776B1 (ko) 2004-07-15 2008-10-16 젠코어 인코포레이티드 최적화된 Ｆｃ 변이체
US20080181892A1 (en) 2004-08-11 2008-07-31 Trubion Pharmaceuticals Binding Domain Fusion Protein
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
DE102005009219A1 (de) 2005-02-25 2006-08-31 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Ribonuclease-Tandemenzyme und Verfahren zu ihrer Herstellung
US20110123440A1 (en) * 2005-03-29 2011-05-26 Genevieve Hansen Altered Antibody FC Regions and Uses Thereof
EP1888649A2 (en) 2005-05-09 2008-02-20 GlycArt Biotechnology AG Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors
ES2354280T3 (es) 2005-06-16 2011-03-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Variantes de ribonucleasa citotóxica.
EP1896579A2 (en) 2005-06-16 2008-03-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Cytotoxic ribonuclease variants
US20080279850A1 (en) 2005-07-25 2008-11-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. B-Cell Reduction Using CD37-Specific and CD20-Specific Binding Molecules
EP2298815B1 (en) 2005-07-25 2015-03-11 Emergent Product Development Seattle, LLC B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules
TW200732472A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Hoffmann La Roche Method for the recombinant expression of a polypeptide
WO2007121354A2 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Trubion Pharmaceuticals Inc. Binding proteins comprising immunoglobulin hinge and fc regions having altered fc effector functions
EP2010221B1 (en) 2006-04-21 2012-02-29 mAB-Factory GmbH Antibody-rnase-conjugate
GB0611444D0 (en) 2006-06-09 2006-07-19 Medical Res Council Technology Rnase H2 complex and genes therefor
WO2007146968A2 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
EP1905841A1 (en) 2006-09-25 2008-04-02 Max Delbrück Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch; Trex1 as a marker for lupus erythematosus
US20080260738A1 (en) 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment
US20090258005A1 (en) 2007-05-29 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals Inc. Therapeutic compositions and methods
BRPI0812562A2 (pt) 2007-06-12 2019-09-24 Trubion Pharmaceuticals Inc composições terapêuticas anti-cd20 e métodos
WO2009015345A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins
WO2009012600A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins
WO2009064777A2 (en) 2007-11-13 2009-05-22 Sapphire Energy, Inc. Production of fc-fusion polypeptides in eukaryotic algae
NZ603059A (en) 2008-04-11 2014-07-25 Emergent Product Dev Seattle Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
WO2010036960A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Genentech, Inc. Methods for treating, diagnosing, and monitoring lupus
JP2012504423A (ja) 2008-10-01 2012-02-23 クインテッセンス バイオサイエンシズ，インコーポレーテッド 治療用リボヌクレアーゼ
CN113528485A (zh) 2009-11-02 2021-10-22 华盛顿大学 治疗性核酸酶组合物和方法
TWI529163B (zh) 2011-01-25 2016-04-11 陶氏農業科學公司 用於製備４－胺基－５－氟－３－鹵素－６－（經取代之）吡啶甲酸酯的方法
MX2013009741A (es) 2011-02-23 2014-01-17 Amgen Inc Medio de cultivo celular para exposicion a uvc y metodos relacionados al mismo.
CN106417184A (zh) 2011-02-25 2017-02-22 重组股份有限公司 经遗传修饰的动物及其生成方法
CR20190207A (es) 2011-04-21 2019-06-26 Ionis Pharmaceuticals Inc MODULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB) (Divisional 2013-0551)
SG10201913930UA (en) 2011-04-29 2020-03-30 Univ Washington Therapeutic nuclease compositions and methods
US20140178479A1 (en) 2011-08-12 2014-06-26 Perosphere, Inc. Concentrated Felbamate Formulations for Parenteral Administration
US9401875B2 (en) 2012-06-01 2016-07-26 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Packet transfer processing method and packet transfer processing device
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1852976A (zh) * 2003-07-26 2006-10-25 特鲁比昂药品公司 结合构建体及其使用方法
CN101990439A (zh) * 2007-07-06 2011-03-23 特鲁比昂药品公司 具有置于c末端的特异性结合结构域的结合肽

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107964539A (zh) * 2011-04-29 2018-04-27 华盛顿大学 治疗性核酸酶组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012149440A2 (en) 2012-11-01
IL285985B1 (en) 2023-03-01
JP6063450B2 (ja) 2017-01-18
JP2020203926A (ja) 2020-12-24
KR102596953B1 (ko) 2023-11-02
CA2834626A1 (en) 2012-11-01
KR102006393B1 (ko) 2019-08-02
US11034944B2 (en) 2021-06-15
JP2014519809A (ja) 2014-08-21
JP7212016B2 (ja) 2023-01-24
JP6762345B2 (ja) 2020-09-30
EP2704737B1 (en) 2018-01-10
IL269020B (en) 2021-09-30
KR20190090884A (ko) 2019-08-02
WO2012149440A3 (en) 2014-05-15
SG10201913930UA (en) 2020-03-30
US20190119660A1 (en) 2019-04-25
US20140178379A1 (en) 2014-06-26
AU2016201790B2 (en) 2017-11-30
AU2012249360A1 (en) 2013-04-11
EA201391585A1 (ru) 2014-04-30
EP2704737A4 (en) 2015-07-01
KR20220112861A (ko) 2022-08-11
KR102161657B1 (ko) 2020-10-06
CN103930127A (zh) 2014-07-16
IL285985B2 (en) 2023-07-01
JP2023036998A (ja) 2023-03-14
IL229074A0 (en) 2013-12-31
ES2666303T3 (es) 2018-05-03
IL269020A (en) 2019-10-31
CN107964539A (zh) 2018-04-27
US20210395711A1 (en) 2021-12-23
AU2016201790A1 (en) 2016-04-14
CN107964539B (zh) 2022-06-28
NZ616989A (en) 2016-03-31
JP2019022505A (ja) 2019-02-14
LT2704737T (lt) 2018-06-11
ECSP13013060A (es) 2015-03-31
PL2704737T3 (pl) 2018-07-31
MX351953B (es) 2017-11-06
US10000745B2 (en) 2018-06-19
KR20200113028A (ko) 2020-10-05
CO6811815A2 (es) 2013-12-16
JP2017114854A (ja) 2017-06-29
US20150152399A1 (en) 2015-06-04
IL229074B (en) 2020-04-30
BR112013027547B1 (pt) 2021-01-19
CL2013003123A1 (es) 2014-08-22
BR112013027547A2 (pt) 2016-11-29
IL285985A (en) 2021-10-31
AU2018201073A1 (en) 2018-03-08
AU2018201073B2 (en) 2019-12-05
EP2704737A2 (en) 2014-03-12
AU2022203877A1 (en) 2022-06-23
SG194680A1 (en) 2013-12-30
KR102428875B1 (ko) 2022-08-05
AU2020201619B2 (en) 2022-03-10
US8937157B2 (en) 2015-01-20
MX2021015735A (es) 2022-06-09
US10202588B2 (en) 2019-02-12
PE20141172A1 (es) 2014-09-22
CR20130598A (es) 2014-03-19
HUE038759T2 (hu) 2018-11-28
EP3449933A1 (en) 2019-03-06
IL300276A (en) 2023-04-01
DK2704737T3 (en) 2018-04-23
US20140044711A1 (en) 2014-02-13
AU2020201619A1 (en) 2020-03-19
KR20230156151A (ko) 2023-11-13
SI2704737T1 (en) 2018-06-29
DOP2013000250A (es) 2014-01-31
AU2020201619C1 (en) 2022-10-06
AU2012249360B2 (en) 2015-12-24
AU2018201073C1 (en) 2020-06-04
MX2013012612A (es) 2014-01-24
HRP20180564T1 (hr) 2018-06-01
KR20140043353A (ko) 2014-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103930127B (zh) 治疗性核酸酶组合物和方法
CN102770533B (zh) 治疗性核酸酶组合物和方法
CN109790526A (zh) 优化的二核酸酶融合体和方法
KR20200039778A (ko) 가용성 인터페론 수용체 및 그의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant