MX2013012612A - Composiciones de nucleasa terapeuticas y metodos. - Google Patents

Composiciones de nucleasa terapeuticas y metodos.

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Abstract

Moléculas de nucleasa híbridas y métodos para tratar en un mamífero una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema inmunológico, y una composición farmacéutica para tratar en un mamífero una enfermedad relacionada con el sistema inmunológico.

Description

COMPOSICIONES DE NUCLEASA TERAPÉUTICAS Y MÉTODOS.
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de EE.UU. N° 61/480.961, presentada el 29 de abril de 2011 y la solicitud provisional de EE.UU. N° 61/617.241, presentada el 29 de marzo de 2012. Esta solicitud también está relacionada con: La Solicitud Internacional de Patente No. PCT/US2010/055131, presentada el 02 de noviembre 2010; la Solicitud Internacional de Patente No. 61/257,458, presentada el 02 de noviembre de 2009; y la Solicitud Provisional U.S. N° 61/370.752, presentada el 4 de agosto de 2010. Todas las revelaciones de las solicitudes arriba mencionadas son incorporadas mediante esta por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADO POR EL GOBIERNO FEDERAL Esta invención se realizó con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (subvenciones AI44257, NS065933 y AR048796) , la Alianza para la Investigación de Lupus, y el Fondo para Descubrimientos en las Ciencias de la Vida del Estado de Washington (2.087.750). El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
ANTECEDENTES La liberación excesiva de partículas de (ribo) ucleoproteína a partir de células muertas y moribundas puede causar la patología del lupus mediante dos mecanismos: (i) la deposición o formación in situ de complejos de cromatina / anticromatina causa nefritis y conduce a la pérdida de la función renal, y (ii) nucleoproteínas activan la inmunidad innata a través de los receptores tipo Toll (TLR) 7, 8 y 9, como asi también mediante rutas TLR-independientes . La liberación de nucleoproteinas puede servir como un antigeno potente para autoanticuerpos en lupus eritematoso sistémico (SLE), proporcionando amplificación de las células B y activación de las células dentríticas (DC) mediante la interconexión de los receptores de antigeno y los receptores de tipo Toll (TLRs) . Por lo tanto, existe una necesidad de un medio para eliminar antigenos que incitan y/o atenúan la estimulación inmune, la amplificación inmune y enfermedades mediadas por un complejo inmune en sujetos que lo necesitan.
Este documento describe una molécula de nucleasa híbrida que comprende un primer dominio de nucleasa y un dominio Fe modificado, donde el primer dominio de nucleasa está acoplado operativamente al dominio Fe. El dominio Fe se modifica de modo que la molécula tiene una citotoxicidad reducida con relación a una molécula de nucleasa híbrida que tiene un dominio Fe sin modificar. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida tiene un dominio Fe que ha sido modificado para disminuir la ligadura con los receptores Fcy, las proteínas del complemento, o ambos. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida tiene una citotoxicidad reducida al menos 1, 2, 3, 4, o 5 veces en comparación con una molécula de control, por ejemplo, una molécula de nucleasa híbrida sin un dominio Fe modificado.
En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye además un primer dominio de enlace, y el primer dominio de nucleasa está acoplado operativamente al dominio Fe modificado mediante el primer dominio de enlace.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio Fe modificado que es un dominio Fe de la IgGl mutante. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende una o más mutaciones en los dominios bisagra, CH2 y/o CH3. En algunos aspectos, el dominio Fe comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una o más de las mutaciones P238S, P331S, SCC, SSS (residuos 220, 226, y 229), G236R, L328R, L234A y L235A. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación P238S. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación P331S. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación P238S y una mutación P331S. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S y puede incluir mutaciones en una o más de las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o una o más mutaciones en las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o mutaciones en una de las tres cisteinas bisagra (ubicadas en el residuo 220 según la numeración EU) a SCC (donde CCC se refiere a las tres cisteinas presentes en el dominio bisagra natural) . En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o mutaciones en las tres cisteinas bisagra (ubicadas en los residuos 220, 226 y 229 según la numeración EU) a SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y mutaciones en las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye P238S y SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye P238S y SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye P331S y SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye P331S y SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en una o más de las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación en las tres cisteinas bisagra a SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en las tres cisteinas bisagra a SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye SSS.
En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 59. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 60. En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 71. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 72. En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 73. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 74. En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 75. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 76. En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 87. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 88. En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 89. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante es el mostrado en la SEQ ID NO: 90.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio RNasal humano natural ligado a un dominio Fe de IgGl humano mutante que comprende SCC, P238S y P331S, o a un dominio Fe de IgGl humano mutante que comprende SSS, P238S y P331S . En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica una molécula de nucleasa híbrida es como el mostrado en las SEQ ID NO: 61, 77 o 91. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es como la mostrada en las SEQ ID NO: 209, 62, 78, 92, o 94.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a través de un dominio de enlace (Gly4Ser)4 a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SCC, P238S y P331S, o a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SSS, P238S y P331S. En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica una molécula de nucleasa híbrida es como el mostrado en las SEQ ID NO: 63 o 79. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es como la mostrada en las SEQ ID NO: 64 o 79.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio RNasal humana natural ligado a través de un dominio de enlace (Gly Ser)4 a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SCC, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio de RNasal humana natural. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a través de un dominio de enlace (Gly4Ser)4 a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SSS, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio de RNasal humana natural. En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica una molécula de nucleasa híbrida es como el mostrado en las SEQ ID NO: 65 o 81. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es como la mostrada en las SEQ ID NO: 66 o 82.
En otras realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 62, 64, 78, 80, 92, o 96, o una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 62, 64, 78, 80, 92 ó 96. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 96. En otros aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 66, 68, 70, 82, 84, 86, 94, ó 98, o una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 66, 68, 70, 82, 84, 86, 94, o 98. En otros aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 98.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a través de un dominio de enlace (Gly4Ser)4 a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SCC, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio DNasal G105R A114F humano. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a través de un dominio de enlace (Gly4Ser)4 a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SSS, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio DNasal G105R A114F humano. En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica una molécula de nucleasa híbrida es como el mostrado en las SEQ ID NO: 67 o 83. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es como las mostradas en las SEQ ID NO: 68 o 84.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SCC, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio DNasal G105R A114F humano. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SSS, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio DNasal G105R A114F humano. En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica una molécula de nucleasa híbrida se muestra en las SEQ ID NO: 69, 85 o 93. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es como las mostradas en las SEQ ID NO: 70, 86, 94 ó 98.
En algunos aspectos, la citotoxicidad inducida por una molécula de nucleasa híbrida es reducida en comparación con una molécula de control. En algunos aspectos, la citotoxicidad inducida por una molécula de nucleasa híbrida es reducida en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100% en comparación con una molécula de control. En algunos aspectos, la molécula de nucleasa híbrida tiene una citotoxicidad aproximadamente 3-5 veces, o al menos aproximadamente 3 veces reducida en comparación con una molécula de nucleasa híbrida que tiene un dominio Fe no modificado (por ejemplo, un dominio Fe natural) .
En algunos aspectos, la actividad de una molécula de nucleasa híbrida que tiene una DNasa no es menos de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó más de 30 veces menor que la actividad de una molécula de DNasa de control. En algunos aspectos, la actividad de una molécula de nucleasa híbrida que tiene una DNasa es aproximadamente igual a la actividad de una molécula de DNasa de control. En algunos aspectos, la actividad de una molécula de nucleasa híbrida que tiene una RNasa no es menos de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó más de 30 veces menor que la actividad de una molécula de RNasa de control. En algunos aspectos, la actividad de una molécula de nucleasa híbrida que tiene una RNasa es aproximadamente igual a la actividad de una molécula de RNasa de control.
En algunas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida es un polipéptido, en el que la secuencia de aminoácidos del primer dominio de nucleasa comprende una secuencia de aminoácidos de RNasa natural humana, donde el primer dominio de enlace es (Gly4Ser)n, donde n es 0, 1, 2, 3, 4 ó 5, donde la secuencia de aminoácidos del dominio Fe comprende una secuencia de aminoácidos del dominio Fe de IgGl mutante humana y donde el primer dominio de enlace está acoplado al extremo C-terminal del primer dominio de nucleasa y al extremo el N-terminal del dominio Fe. En algunas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia que se muestra en la Tabla 1.
En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida comprende DNasal humana natural ligada a un dominio Fe de IgGl humana mutante. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida comprende DNasal G105R A114F humana ligada a un dominio Fe de IgGl humana mutante mediante un dominio de enlace (Gly4Ser)n donde n = 0, 1, 2, 3, 4 ó 5. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida comprende RNasal humana natural ligada a un dominio Fe de IgGl humana mutante ligado a DNasal humana natural. En algunas realizaciones, · una molécula de nucleasa híbrida comprende RNasal humana natural ligada a un dominio Fe de IgGl humana mutante ligado a DNasal G105R A114F. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida es un polipéptido, en el que la secuencia de aminoácidos del primer dominio de nucleasa comprende una secuencia de aminoácidos de RNasa, donde el primer dominio de enlace tiene una longitud entre 5 y 32 aminoácidos, donde la secuencia de aminoácidos del dominio Fe comprende una secuencia de aminoácidos del dominio Fe humano, y donde el primer dominio de enlace está acoplado al extremo C-terminal del primer dominio de nucleasa y al extremo el N-terminal del dominio Fe. En algunas realizaciones, el dominio de enlace incluye (Gly4Ser)5 y sitios de restricción BglII, Agel y Xhol. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida es un polipéptido, en el que la secuencia de aminoácidos del primer dominio de nucleasa comprende una secuencia de aminoácidos de RNasa humana, donde el primer dominio de enlace es un péptido NLG que tiene una longitud entre 5 y 32 aminoácidos, donde la secuencia de aminoácidos del dominio Fe comprende una secuencia de aminoácidos del dominio Fe humano mutante, y donde el primer dominio de enlace está acoplado al extremo C-terminal del primer dominio de nucleasa y al extremo N-terminal del dominio Fe.
En algunas realizaciones, el dominio Fe no se liga sustancialmente a un receptor de Fe sobre una célula humana. En algunas realizaciones, el dominio Fe ha sido modificado para disminuir la ligadura con los receptores Fcy, las proteínas del complemento, o ambos. En algunos aspectos, la ligadura al receptor Fe es reducida en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100% en comparación con una molécula de control. En algunos aspectos, la molécula de nucleasa híbrida tiene una ligadura al receptor Fe disminuida 3-5 veces, o al menos aproximadamente 3 veces en comparación con una molécula de nucleasa híbrida que tiene un dominio Fe no modificado (por ejemplo, un dominio Fe natural) .
En algunas realizaciones, la vida media en suero de la molécula es significativamente mayor que la vida media en suero del primer dominio de nucleasa solo. En algunas realizaciones, la actividad de nucleasa del primer dominio de nucleasa de la molécula es igual o mayor que aquella del dominio de nucleasa solo. En algunas realizaciones, la administración de la molécula a un ratón aumenta la tasa de supervivencia del ratón, medida mediante un ensayo con un modelo de lupus en ratón. En algunos aspectos, la molécula de nucleasa híbrida degrada ARN, ADN circulantes o ambos. En otros aspectos, la molécula de nucleasa híbrida degrada ARN, ADN o ambos en complejos inmunes. En algunas formas de realización, la molécula de nucleasa híbrida inhibe la producción de interferón-a . En algunos aspectos, la producción de interferón alfa es reducida en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100% en comparación con una molécula de control .
En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye una secuencia leader. En algunas formas de realización, la secuencia leader es un péptido VK3LP humano de la familia de cadenas livianas kappa humanas, y la secuencia leader está acoplada al extremo N-terminal del primer dominio de nucleasa. En realizaciones, el VK3LP tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 100.
En algunas realizaciones, la molécula es un polipéptido. En algunas realizaciones, la molécula es un polinucleótido .
En algunas realizaciones, el primer dominio de nucleasa comprende una RNasa. En algunas realizaciones, la RNasa es una RNasa humana. En algunas realizaciones, la RNasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de RNasa indicada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, la RNasa es un miembro de la familia de RNasa A humana. En algunas realizaciones, la RNasa es una RNasal pancreática humana.
En algunas realizaciones, el primer dominio de nucleasa comprende una DNasa. En algunas realizaciones, la DNasa es una DNasa humana. En algunas realizaciones, la DNasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de DNasa indicada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, la DNasa se selecciona del grupo formado por DNasa 1 humana, TREX1 y DNasa 11.3 humana .
En algunas realizaciones, el dominio Fe es un dominio Fe humano. En algunas realizaciones, el dominio Fe es un dominio Fe mutante. En algunas realizaciones, el dominio Fe es un dominio Fe mutante que comprende SSS, P238S y/o P331S. En algunas realizaciones, el dominio Fe es un dominio Fe IgGl humano. En algunas realizaciones, el dominio Fe es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de un dominio Fe indicado en la Tabla 1.
En algunas formas de realización, el primer dominio de enlace tiene una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 aminoácidos. En algunas formas de realización, el primer dominio de enlace tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 31 aminoácidos. En algunas formas de realización, el primer dominio de enlace tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos. En algunas formas de realización, el primer dominio de enlace tiene una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 32 aminoácidos. En algunas realizaciones, el primer dominio de enlace tiene una longitud de aproximadamente 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el primer dominio de enlace tiene una longitud de aproximadamente 25 aminoácidos. En algunas realizaciones, el primer dominio de enlace tiene una longitud de aproximadamente 18 aminoácidos. En algunas realizaciones, el primer dominio de enlace comprende un péptido gly/ser. En algunas formas de realización, el péptido gly/ser tiene la fórmula (Gly4Ser)n donde n es un número entero positivo seleccionado del grupo formado por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 . En algunas realizaciones, el péptido gly/ser incluye (Gly4Ser) 3. En algunas realizaciones, el péptido gly/ser incluye (Gly4Ser)4. En algunas realizaciones, el péptido gly/ser incluye (Gly4Ser)5. En algunas realizaciones, el primer dominio de enlace incluye al menos un sitio de restricción. En algunas realizaciones, el primer dominio de enlace incluye aproximadamente 12 o más nucleótidos incluyendo al menos un sitio de restricción. En algunas realizaciones, el primer dominio de enlace incluye dos o más sitios de restricción. En algunas realizaciones, el primer dominio de enlace incluye una pluralidad de sitios de restricción. En algunas realizaciones, el primer dominio de enlace comprende un péptido NLG. Péptidos NLG contienen una secuencia de consenso de glicosilacion ligada a N. En realizaciones, el péptido NLG tiene una secuencia indicada en la SEQ ID NO: 99. En algunas realizaciones, el primer dominio de enlace comprende un sitio de glicosilacion N-enlazado .
En algunas realizaciones, el primer dominio de nucleasa está enlazado al extremo N-terminal del dominio Fe. En algunas realizaciones, el primer dominio de nucleasa está enlazado al extremo C-terminal del dominio Fe.
En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye además un segundo dominio de enlace. En algunas realizaciones, los dominios de nucleasa primero y segundo son dominios de nucleasa distintos. En algunas realizaciones, los dominios de nucleasa primero y segundo son los mismos dominios de nucleasa. En algunas realizaciones, el segundo dominio de nucleasa está enlazado al extremo C-terminal del dominio Fe. En algunas realizaciones, el segundo dominio de nucleasa está enlazado al extremo N-terminal del dominio Fe. En algunas realizaciones, el segundo dominio de nucleasa está enlazado al extremo C-terminal del primer dominio de nucleasa. En algunas realizaciones, el segundo dominio de nucleasa está enlazado al extremo N-terminal del primer dominio de nucleasa.
También se describe en este documento un polipéptido dimérico que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, donde el primer polipéptido comprende un primer dominio de nucleasa y un dominio Fe, donde el primer dominio de nucleasa está acoplado operativamente al dominio Fe. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es una segunda molécula de nucleasa híbrida que comprende un segundo dominio de nucleasa y un segundo dominio Fe, donde el segundo dominio de nucleasa está acoplado operativamente al segundo dominio Fe.
También se describe en este documento una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de nucleasa híbrida y/o al menos un polipéptido dimérico como descrito en ésta, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se describe en ésta una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de nucleasa híbrida revelada en ésta. También se describe en ésta un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico revelada en ésta. También se describe en ésta una célula hospedante transformada con un vector de expresión recombinante revelado en ésta.
También se describe en este documento un método de fabricación de una nucleasa híbrida revelada en ésta, método que comprende: proporcionar una célula hospedante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la molécula de nucleasa híbrida; y mantener la célula hospedante bajo condiciones en las que se expresa la molécula de nucleasa híbrida .
También se describe en ésta un método para tratar o prevenir una condición asociada con una respuesta inmune anormal, método que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad efectiva de una molécula de nucleasa híbrida aislada revelada en ésta. En algunas realizaciones, la condición es una enfermedad autoinmune. En algunas formas de realización, la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo formado por diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune experimental, artritis reumatoide, artritis autoinmune experimental, miastenia grave, tiroiditis, una forma experimental de uveorretinitis, tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, tirotoxicosis, anemia perniciosa, gastritis autoinmune atrófica, enfermedad de Addison, menopausia precoz, infertilidad masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, pénfigo, oftalmía simpática, uveitis facogénica, anemia hemolítica autoinmune, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa Hbs-ve, cirrosis criptogénica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjógren, esclerodermia, granulomatosis de egener, polimiositis, dermatomiositis, lupus eritematoso discoide (LED) , lupus eritematoso sistémico (LES) , y enfermedad del tejido conectivo. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmune es SLE.
También se describe en ésta un método para tratar SLE que comprende administrar a un sujeto una composición que contiene nucleasa en una cantidad efectiva para degradar complejos inmunes que contienen ARN, ADN o ambos, ARN y AD . En algunos aspectos, la composición incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable y una molécula de nucleasa híbrida según lo descrito en ésta. En otros aspectos, la composición incluye una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 62, 64, 66, 68, 70, 78, 80, 82, 84, 86, 92, 94, 96, ó 98.
BREVE DESCRIPCIÓN DE VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con ayuda de la descripción siguiente y los dibujos que la acompañan, donde: La Figura 1 muestra una estructura prototipo para la creación de diferentes formas de realización de moléculas de nucleasa híbridas.
La Figura 2 muestra la concentración · de RSLV-124 recuperada de suero de ratón después de una única inyección intravenosa .
La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de actividad enzimática de RNasa en RLSV-124 recuperada de suero de ratón, actividad medida en unidades de fluorescencia relativa (RFU's) en función del tiempo.
La Figura 4 muestra la concentración de RSLV-124 en suero de ratón, obtenida por extrapolación de la actividad enzimática de RNasa de la molécula.
La Figura 5 muestra el análisis por difusión enzimática simple radial (SRED) del suero de dos ratones de RNasa transgénicos (Tg) en comparación con un ratón B6 normal.
La Figura 6 muestra la concentración de RNasa en ratones transgénicos (Tg) y doblemente transgénicos (DTg) medida mediante ELISA. Cada punto representa la concentración medida en un ratón individual.
La Figura 7 muestra la supervivencia de ratones TLR7.1 Tg versus ratones TLR7. IxRNasaA DTg La Figura 8 muestra el análisis cuantitativo por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de genes de respuesta a interferón (IRGs) en bazos de ratones Tg versus ratones DTg.
La' Figura 9 muestra una transferencia de Western (Western Blot) en sobrenadantes de transfección de células COS de constructos RSLV 125-129 (SEQ ID NOS: 208-217) .
La Figura 10 muestra un análisis SRED que compara alícuotas de proteínas purificadas con proteína A de sobrenadantes COS transíectados con RSLV.
Las Figuras lla-c muestran los resultados de un ensayo de actividad de la nucleasa DNasa realizado con proteína purificada con proteina A de sobrenadantes de C0S7 transfectados con plásmidos de fusión RSLV.
La Figura 12 muestra las unidades de fluorescencia relativa (RFU) en función del tiempo para cada proteina.
La Figura 13 muestra un diagrama Lineweaver Burk de las diferentes moléculas ensayadas.
La Figura 14 muestra datos de citotoxicidad que representan gráficamente el porcentaje de células muertas en función de la concentración de proteina de fusión para moléculas RNasalg con un dominio Fe natural o mutante.
La Figura 15 muestra superposiciones de histogramas de células teñidas con THP-1 después de 72 horas.
La Figura 16 muestra la capacidad de RSLV-132 para inhibir la producción de interferón-a inducida por complejos inmunes de pacientes con LES.
La Figura 17 muestra la capacidad in vivo de RSLV-132 para inhibir la producción de interferón-a inducida por ARN.
La Figura 18 muestra un ensayo de actividad enzimática de RNasa de dos lotes de producción de RSLV-132 que han sido almacenados durante un máximo de 8 semanas a 4 ° C, en comparación con RNasa natural y RSLV-124.
La Figura 19 muestra un ensayo de actividad enzimática de RNasa de RSLV-133, RSLV-123 y RSLV-124 en relación con RNasa A, actividad medida en RFUs en función del tiempo.
La Figura 20 muestra un ensayo de actividad enzimática de DNasa de RSLV-133 y RSLV-123 en relación con DNasa 1, actividad medida en RFUs en función del tiempo.
La Figura 21 muestra los resultados de un experimento de digestión en gel que compara la capacidad de RSLV-133 para digerir el ADN con relación a RSLV-123 y DNasa 1 natural.
La Figura 22 muestra la unión de RSLV-124 y RSLV-132 a células THP1 que contienen el receptor Fe mediante análisis FACS que mide la intensidad de fluorescencia promedio.
DESCRIPCIÓN DETALLADA El lupus eritematoso sistémico (LES o SLE) es una enfermedad autoinmune multisistémica caracterizada por la presencia de auto-anticuerpos de alto titulo dirigidos contra las mismas nucleoproteinas del enfermo. Existe una fuerte evidencia de que defectos en la eliminación o el procesamiento de células muertas o moribundas en LES conduce a la enfermedad, predominantemente a través de la acumulación de ribo- y desoxi-ribonucleoproteinas (abreviadamente nucleoproteinas) . Las nucleoproteinas causan daños a través de tres mecanismos: i) la activación del sistema inmune innato produce citoquinas inflamatorias; ii) las nucleoproteinas sirven como antigenos para generar complejos inmunes circulantes, y iii) sirven como antigenos para generar in situ complejos en sitios específicos tales como el riñon. La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la digestión de los ácidos nucleicos extracelulares tiene un efecto terapéutico in vivo .
En consecuencia, la presente invención proporciona métodos para tratar enfermedades caracterizadas por la eliminación o el procesamiento defectuosos de las células apoptóticas y restos de células, tal como la enfermedad lupus eritematoso sistémico (SLE) , métodos que consisten en administrar una cantidad efectiva de una composición con actividad de nucleasa para degradar los complejos extracelulares que contienen RNA y ADN. Este tratamiento puede inhibir la producción de interferones de tipo I (IFNs), que son citoquinas prominentes en el LES y están fuertemente correlacionados con la actividad de esta enfermedad y con la nefritis.
En una forma de realización, un sujeto es tratado mediante la administración de un compuesto con actividad de nucleasa, que es una actividad de DNasa o RNasa, preferentemente en la forma de una molécula de nucleasa híbrida. En un aspecto, la actividad de nucleasa se encuentra en un primer dominio de nucleasa. En otro aspecto, el dominio de nucleasa se acopla a un dominio Fe modificado de modo que la molécula tiene una citotoxicidad reducida. En un aspecto, una molécula de nucleasa híbrida incluye un segundo dominio de nucleasa.
En otro aspecto, se proporciona un método para tratar lupus eritematoso sistémico (SLE) en el que una cantidad efectiva de una composición que contiene nucleasa se administra a un sujeto. En un aspecto, el tratamiento resulta en la degradación de complejos inmunes que contienen ARN, ADN, o ambos, ARN y ADN. En otro aspecto, el tratamiento resulta en la inhibición de interferones de tipo I, tales como el interferón-a, en un sujeto. En un aspecto, un método para tratar un sujeto comprende administrar una cantidad efectiva de una composición de una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 62, 64, 66, 68, 70, 78, 80, 82, 84, 86, 92, 94, 96, o 98. En otro aspecto, la composición es una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 96 ó 98.
Los términos utilizados en las reivindicaciones y la memoria descriptiva se definen como se indica a continuación, siempre que no se especifique de otro modo. En el caso de conflicto directo con un término usado en una solicitud de patente provisional madre, el término utilizado en la presente memoria descriptiva tiene preferencia.
"Aminoácido" se refiere a los aminoácidos de origen natural y sintéticos, como asi también a aminoácidos análogos y aminoácidos miméticos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, como asi también aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato y O-fosfoserina. «Análogos de aminoácidos» se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono a que está ligado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. «Aminoácido mimético» se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido; pero que funciona de una manera similar a un aminoácido de origen natural.
En ésta se puede hacer referencia a aminoácidos ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Similarmente, puede hacerse referencia a nucleótidos mediante sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
Una "sustitución de aminoácido" se refiere al reemplazo de al menos un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada (una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de partida) con un segundo residuo de aminoácido «de reemplazo» diferente. Una "inserción de aminoácido" se refiere a la incorporación de al menos un aminoácido adicional en una secuencia de aminoácidos predeterminada. Mientras que la inserción consistirá usualmente en la inserción de uno o dos residuos de aminoácidos, las «inserciones de péptidos» más grandes de la presente pueden hacerse, por ejemplo, mediante la inserción de aproximadamente tres a aproximadamente cinco, o incluso hasta aproximadamente diez, quince o veinte residuos de aminoácidos . El residuo (los residuos) insertado (s) puede (n) ser de origen natural o de origen no natural, como se describe anteriormente. Una «eliminación de aminoácido" se refiere a la separación de al menos un residuo aminoácido de una secuencia de aminoácidos predeterminada.
"Polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural , así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. "Ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos, ya sea en forma de hebra simple o doble. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de ligadura similares al ácido nucleico de referencia y que son metabolizados de una manera similar a nucleótidos de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular abarca también implícitamente variantes modificadas de manera conservativa de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, tan bien como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, sustituciones de codones degenerados pueden lograrse mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más (o todos) codones seleccionados es sustituida con residuos de base mixta y / o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res.. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol . Chem. 260:2605-2608, 1985); y Cassol et al., 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994). Para arginina y leucina, las modificaciones en la segunda base también pueden ser conservativas. El término ácido nucleico se usa de manera intercambiable con gen, ADNc y ARNm codificado por un gen.
Los polinucleotidos de la presente invención pueden estar compuestos de cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser un ARN o ADN no modificado o un ARN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleotidos pueden estar compuestos de ADN de una sola y de doble hebra, ADN que es una mezcla de regiones mono-y bicatenarias, ARN de una sola y de doble hebra y ARN que es una mezcla de regiones de una sola y de doble hebra, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de cadena simple o, más típicamente, de cadena doble o una mezcla de regiones mono- y bicatenarias. Además, el polinucleótido puede estar compuesto de regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o ambos, ARN y ADN. Un polinucleótido también puede contener una o más bases modificadas o cadenas principales de ADN o ARN modificadas para mejor estabilidad o por otras razones. Bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Puede hacerse una variedad de modificaciones al ADN y ARN; por lo tanto, "polinucleótido" abarca formas químicamente, enzimáticamente o métabólicamente modificadas.
Tal como se utiliza aquí, el término "molécula de nucleasa híbrida" se refiere a polinucleótidos o polipéptidos que comprenden al menos un dominio de nucleasa y al menos un dominio Fe. Moléculas de nucleasa híbridas también se conocen como proteína (s) de fusión y gen (es) de fusión. Por ejemplo, en una realización, una molécula de nucleasa híbrida puede ser un polipéptido que comprende al menos un dominio Fe ligado a un dominio de nucleasa, tales como DNasa y/o RNasa. Como otro ejemplo, una molécula de nucleasa híbrida puede incluir un dominio de nucleasa RNasa, un dominio de enlace y un dominio Fe. Ejemplos de moléculas de nucleasa híbrida incluyen SEQ ID NO:62, 64, 66, 68, 70, 78, 80, 82, 84, 86, 92, 94, 96 y 98. Otros ejemplos serán descritos con mayor detalle más abajo. En una realización, una molécula de nucleasa híbrida de la invención puede incluir modificaciones adicionales. En otra forma de realización, una molécula de nucleasa híbrida puede ser modificada para añadir un resto funcional (por ejemplo, PEG, un fármaco o un marcador) .
Según lo usado en ésta, una «molécula de nucleasa biespecífica híbrida» o una «molécula de binucleasa» se refiere a una molécula de nucleasa híbrida con 2 o más dominios nucleasa, por ejemplo, un dominio DNasa y un dominio de RNasa.
En ciertos aspectos, las moléculas de nucleasa híbrida de la invención pueden emplear uno o más «dominios de enlace», tales como enlaces polipeptídicos . Tal como se utiliza aquí, el término "dominio de enlace" se refiere a una secuencia que conecta dos o más dominios en una secuencia lineal. Tal como se utiliza aquí, el término «enlace polipeptídico» se refiere a una secuencia peptídica o polipeptídica (por ejemplo, una secuencia peptídica o polipeptídica sintética) que conecta dos o más dominios en una secuencia de aminoácidos lineal de una cadena polipeptídica. Por ejemplo, grupos de enlace polipeptídicos se pueden utilizar para conectar un dominio nucleasa a un dominio Fe. Preferiblemente, dichos enlaces polipeptídicos pueden proporcionar flexibilidad a la molécula de polipéptido. En ciertas realizaciones, el grupo de enlace de polipéptido se utiliza para conectar (por ejemplo, fusionar genéticamente) uno o más dominios Fe y/o uno o más dominios nucleasa. Una molécula de nucleasa híbrida de la invención puede comprender más de un dominio de enlace o enlazador peptídico .
Tal como se utiliza aquí, el término «grupo de enlace polipeptídico «gly-ser» se refiere a un péptido que consiste de residuos de glicina y serina. Un grupo de enlace polipeptídico gly/ser típico comprende la secuencia de aminoácidos Ser (Gly4Ser ) n . En una realización, n=l . En una realización, n=2. En otra realización, n=3, es decir, Ser (Gly4Ser ) 3. En otras realización, n=4, es decir, Ser (Gly4Ser ) 4. En otra realización, n=5. En aún otra realización, n=6. En otra realización, n=7. En aún otra realización, n=8. En otra realización, n=9. En aún otra realización, n=10. Otro grupo de enlace polipeptídico gly/ser típico comprende la secuencia de aminoácidos Ser (Gly4Ser ) n . En una realización, n=l. En una realización, n=2. En una realización preferida, n=3. En otra realización, n=4. En otra realización, n=5. En aún otra realización, n=6.
Según lo usado en ésta, los términos "enlazado", "fusionado" o "fusión" se usan en forma intercambiable. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes o dominios mediante cualquier medio, incluyendo conjugación química o medios recombinantes . Métodos de conjugación química (por ejemplo, el uso de agentes de reticulación heterobifuncionales ) son conocidos por el arte.
Como se usa en ésta, el término "región Fe" se define como la porción de una inmunoglobulina nativa, formada por los respectivos dominios Fe (o restos Fe) de sus dos cadenas pesadas .
Tal como se utiliza aquí, el término "dominio Fe" se refiere a una porción de una inmunoglobulina (Ig) simple de cadena pesada en la que el dominio Fe no comprende un dominio Fv. Como tal, también puede hacerse referencia al dominio Fe como "Ig" o "IgG." En algunas formas de realización, un dominio Fe comienza en la región bisagra, justo aguas arriba del sitio de escisión de la papaína, y termina en el extremo C-terminal del anticuerpo. En consecuencia, un dominio Fe completo comprende al menos un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En ciertas realizaciones, un dominio Fe comprende al menos uno de: un dominio de bisagra (por ejemplo, una región de bisagra superior, media, y/o inferior) , un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4, o una variante, porción o fragmento de los mismos. En otras realizaciones, un dominio Fe comprende un dominio Fe completo (es decir, un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3) . En una realización, un dominio Fe comprende un dominio de bisagra (o una porción del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o una porción del mismo) . En otra realización, un dominio Fe comprende un dominio CH2 (o una porción del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o una porción del mismo) . En otra realización, un dominio Fe consiste de un dominio CH3 o una porción del mismo. En otra realización, un dominio Fe consiste de un dominio de bisagra (o una porción del mismo) y un dominio CH3 (o una porción del mismo) . En otra realización, un dominio Fe consiste de un dominio CH2 (o una porción del mismo) y un dominio CH3. En otra realización, un dominio Fe consiste de un dominio de bisagra (o una porción del mismo) y un dominio CH2 (o una porción del mismo) . En una realización, un dominio Fe carece de al menos una parte de un dominio CH2 (por ejemplo, todo o parte de un dominio CH2) . En una forma de realización, un dominio Fe de la invención comprende al menos la porción de una molécula de Fe conocida en el arte que se requiere para la unión FcRn. En otra realización, un dominio Fe de la invención comprende al menos la porción de una molécula de Fe conocida en arte que se requiere para la unión FcDR. En una forma de realización, un dominio Fe de la invención comprende al menos la porción de una molécula de Fe conocida en arte que se requiere para la unión con Proteina A. En una forma de realización, un dominio Fe de la invención comprende al menos la porción de una molécula de Fe conocida en arte que se requiere para la unión con Proteina G. Un dominio Fe en este documento generalmente se refiere a un polipéptido que comprende todo o parte del dominio Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina . Esto incluye, pero no se limita a, polipéptidos que comprenden los dominios enteros CH1, bisagra, CH2 y / o CH3, como asi también fragmentos de tales péptidos que comprenden sólo, por ejemplo, el dominio bisagra, CH2 y CH3. El dominio Fe puede ser derivada de una inmunoglobulina de cualquier especie y / o cualquier subtipo, incluyendo, pero no estando limitado a, un anticuerpo humano IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE o IgM. El dominio Fe abarca moléculas de Fe nativo y Fe variante. Al igual que con las variantes de Fe y Fes nativos, el término dominio Fe incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sean obtenidas por digestión a partir del anticuerpo entero o producidas por otros medios. La asignación de los números de residuos aminoácidos de un dominio Fe está de acuerdo con las definiciones de Kabat. Véase, por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Table of Contents, Introduction and Constant Región Sequences sections) ,5th edition, Bethseda, MD: NIH vol.1:647-723 (1991) ; Kabat et al . , "Introduction"Sequences of Proteins of Inmunological Interest , US Dept of Health and Human Services, NIH, 5th edition, Bethseda, MD vol .1 : xiii-xcvi (1991); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989), cada uno de los cuales es incorporado en ésta por referencia para todos los propósitos.
Como se indica en este documento, será entendido por un experto con experiencia ordinaria en el arte que cualquier dominio Fe puede ser modificado de modo que varía en la secuencia de aminoácidos del dominio Fe nativo de una molécula de inmunoglobulina de origen natural. En ciertas formas de realización típicas, el dominio Fe conserva una función efectora (por ejemplo, ligadura al FcD R) .
Los dominios Fe de un polipéptido de la invención pueden derivarse a partir de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fe de un polipéptido puede comprender un dominio CH2 y / o CH3 derivado de una molécula IgGl y una región bisagra derivada de una molécula IgG3. En otro ejemplo, un dominio Fe puede comprender una región bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula IgGl y, en parte, de una molécula IgG3. En otro ejemplo, un dominio Fe puede comprender una región bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula IgGl y, en parte, de una molécula IgG4.
Un polipéptido o una secuencia de aminoácidos "derivado de" un polipéptido o una proteína designada se refiere al origen del polipéptido. Preferentemente, el polipéptido o la secuencia de aminoácidos derivado de una secuencia particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a aquella secuencia o una porción de la misma, donde la porción consiste de al menos de 10-20 aminoácidos, preferiblemente al menos 20 - 30 aminoácidos, más preferiblemente al menos 30-50 aminoácidos, o puede ser identificado por un entendido en el arte con experiencia ordinaria como un polipéptido o secuencia de aminoácidos que tiene su origen en dicha secuencia.
Los polipéptidos derivados de otro péptido pueden tener una o más mutaciones en relación con el polipéptido de partida, por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos que han sido sustituidos por otro residuo aminoácido o que tiene una o más inserciones o eliminaciones de residuos de aminoácidos.
Un polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que no es de origen natural. Dichas variantes tienen necesariamente una identidad o similitud de secuencia menor de 100% con las moléculas de nucleasa híbrida de partida. En una realización preferida, la variante tendrá una secuencia de aminoácidos desde aproximadamente 75% hasta menos del 100% de identidad o similitud con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de partida, más preferiblemente desde aproximadamente 80% hasta menos del 100%, más preferiblemente desde aproximadamente 85% a menos del 100%, más preferiblemente desde aproximadamente 90% a menos del 100% (por ejemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) y más preferiblemente desde aproximadamente 95% a menos del 100%, por ejemplo, a lo largo de la molécula variante.
En una forma de realización, hay una diferencia de un aminoácido entre una secuencia polipeptidica de partida y la secuencia - derivada de la misma. Identidad o similitud con respecto a esta secuencia se define en ésta como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos (es decir, que tienen el mismo residuo) con respecto a los residuos de aminoácidos de partida, después de alinear las secuencias e introducir intervalos artificiales (gaps), si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia .
En una forma de realización, un polipéptido de la invención consiste de, consiste esencialmente de o comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la Tabla 1 y variantes funcionalmente activas del mismo. En una realización, un polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica con respecto a una secuencia de aminoácidos indicada en la Tabla 1. En una realización, un polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos contigua al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica con respecto a una secuencia de aminoácidos contigua indicada en la Tabla 1. En una realización, un polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, ó 500 (o cualquier número entero dentro del rango indicado) aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos indicada en la Tabla 1.
En una realización, los péptidos de la invención son codificados por una secuencia de nucleotidos. Las secuencias de nucleotidos de la invención pueden ser útiles para un número de aplicaciones, incluyendo: clonación, terapia génica, expresión y purificación de proteínas, introducción de mutaciones, vacunación con ADN de un hospedante que lo necesita, generación de anticuerpos para, por ejemplo, inmunización pasiva, PCR, generación de cebadores y sondas, diseño y generación de siRNA (véase, por ejemplo, el sitio web Dharmacon siDesign) y similares. En una forma de realización, la secuencia de nucleotidos de la invención comprende, consiste en o consiste esencialmente en una secuencia de nucleotidos seleccionada de la Tabla 1. En una realización, una secuencia nucleotidica incluye una secuencia nucleotidica al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica con respecto a una secuencia nucleotidica indicada en la Tabla 1. En una realización, una secuencia nucleotidica incluye una secuencia nucleotidica contigua al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica con respecto a una secuencia nucleotidica contigua indicada en la Tabla 1. En una realización, una secuencia nucleotidica incluye un nucleótido que tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, ó 500 (o cualquier número entero dentro del rango indicado) nucleotidos contiguos de una secuencia nucleotidica indicada en la Tabla 1.
Moléculas de nucleasa híbridas preferidas de la invención comprenden una secuencia (por ejemplo, al menos un dominio Fe) derivada de una secuencia de inmunoglobulina humana. Sin embargo, las secuencias pueden comprender una o más secuencias de otras especies de mamíferos. Por ejemplo, un dominio Fe de primate o un dominio de nucleasa pueden incluirse en la secuencia sujeto. Alternativamente, uno o más aminoácidos murinos pueden estar presentes en un polipéptido. En algunas formas de realización, las secuencias de polipéptidos de la invención no son inmunogénicas y/o tienen una inmunogenicidad reducida .
También será entendido por un experto en el arte con experiencia ordinaria que las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden ser alteradas de modo que sus secuencias varían con respecto a las secuencias de origen natural o nativas de las cuales se derivaron, mientras que conservan la actividad deseable de las secuencias nativas. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos o aminoácidos que conducen a sustituciones conservativas o cambios en los residuos de aminoácidos "no esenciales". Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una variante no natural de una molécula de nucleasa híbrida derivada de una inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio Fe) puede crearse mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia nucleotídica de la inmunoglobulina, de modo que se introducen en la proteína codificada una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR.
Las moléculas de de nucleasa híbrida peptídicas de la invención pueden comprender sustituciones de aminoácidos conservativas en uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo, en residuos aminoácidos esenciales o no esenciales. Una "substitución de aminoácidos conservativa" es una substitución en la cual el residuo de aminoácidos es reemplazado por un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el arte, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales ramificadas en el carbono beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial en un polipéptido de enlace es reemplazado preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. En otra realización, una cadena de aminoácidos puede ser reemplazada con una cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y / o la composición de los miembros de la familia de cadenas laterales. Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación, tal como mediante mutagenesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden ser incorporados en los polipéptidos de enlace de la invención y seleccionados por su capacidad para unirse al objetivo deseado .
El término "mejorar" se refiere a cualquier resultado terapéuticamente beneficiosos en el tratamiento de un estado de enfermedad, por ejemplo, un estado de enfermedad autoinmune (por ejemplo, SLE) , incluyendo la profilaxis, la disminución en la severidad o progresión, la remisión, o la cura del mismo.
El término "in situ" se refiere a procesos que se producen en una célula viva que crece en forma separada de un organismo vivo, por ejemplo, que crece en un cultivo de tejidos.
El término "in vivo" se refiere a procesos que se producen en un organismo vivo.
El término "mamífero" o "sujeto" o "paciente", según lo usado en ésta, incluye ambos, los seres humanos y no-humanos, e incluye, pero no está limitado a, seres humanos, primates no humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos y porcinos .
El término «identidad» porcentual, en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos idéntico, cuando las secuencias se comparan y se alinean para la máxima correspondencia, midiéndose el porcentaje usando uno de los algoritmos de comparación de secuencias descritos más abajo (por ejemplo, BLASTP y BLASTN u otros algoritmos disponibles para las personas de experiencia) o mediante inspección visual. Dependiendo de la aplicación, la "identidad" porcentual puede existir a lo largo de una región de la secuencia que se compara, por ejemplo, a lo largo de un dominio funcional, o, alternativamente, existe a lo largo de toda la longitud de las dos secuencias a ser comparadas.
Para comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en una computadora, si es necesario se designan las coordenadas de las subsecuencias, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de comparación de secuencias. Luego, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia (s) de prueba con relación a la secuencia de referencia, en base a los parámetros designados del programa.
La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) , mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual ( véase en general Ausubel et al., infra) .
Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la identidad porcentual de una secuencia y similitud de una secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) . El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del sitio Web National Center for Biotechnology Information.
El término "cantidad suficiente" significa una cantidad suficiente para producir un efecto deseado, por ejemplo, una cantidad suficiente para modular la agregación de proteínas en una célula.
El término "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad efectiva para mejorar un síntoma de una enfermedad. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser una "cantidad profilácticamente efectiva" debido a que la profilaxis puede ser considerada como terapia.
Debe observarse que, según lo utilizado en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "uno", "una", "el" y "ella" incluyen referencias al plural, siempre que el contexto no dicte claramente lo contrario .
COMPOSICIONES Moléculas de nucleasa. híbridas En algunas realizaciones, una composición de la invención incluye una molécula de nucleasa híbrida. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio de nucleasa enlazado operativamente a un dominio Fe. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio de nucleasa enlazado a un dominio Fe. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida es una proteína de nucleasa. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida es un polinucleótido de nucleasa.
En algunas realizaciones, el dominio de nucleasa está ligado al dominio Fe vía un dominio de enlace. En algunas realizaciones, el dominio de enlace es un péptido de enlace. En algunas realizaciones, el dominio de enlace es un nucleótido de enlace. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye una molécula leader, por ejemplo, un péptido leader. En algunas realizaciones, la molécula leader es un péptido leader posicionado en el extremo N-terminal del dominio de nucleasa. En formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende un péptido leader en el extremo N-terminal de la molécula, donde más tarde el péptido líder es escindido de la molécula de nucleasa híbrida. Los métodos para generar secuencias de ácidos nucleicos que codifican un péptido leader fusionado a una proteína recombinante son bien conocidos por el arte. En formas de realización, cualquiera de las moléculas de nucleasa híbridas de la presente invención puede ser expresada,- ya sea con o sin un leader fusionado a su extremo N-terminal. La secuencia de la proteina de una molécula de nucleasa híbrida de la presente invención después de la escisión de un péptido leader fusionado puede predecirse y / o deducirse por un experto en el arte. Ejemplos de moléculas de nucleasa híbrida de la presente invención que incluyen adicionalmente un péptido leader VK3 (VK3LP) , donde el péptido leader está fusionado al extremo N-terminal de la molécula de nucleasa híbrida , se indican en las SEQ ID NOS: 92 (RSLV-132) y 94 (RSLV-133) . Tales secuencias nucleotídicas correspondientes se indican en SEQ ID NOS: 91 y 93, respectivamente. En formas de realización, después de la escisión del líder VK3, estas moléculas de nucleasa híbrida tienen las secuencias indicadas en SEQ ID NOS: 96 (RSLV-132) y 98 (RSLV-133), respectivamente. Tales secuencias nucleotídicas correspondientes se indican en SEQ ID NOS: 95 y 97, respectivamente. En algunas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida de la presente invención se expresa sin un péptido leader fusionado a su extremo N-terminal, y la molécula de nucleasa híbrida resultante tiene una metionina N-terminal.
En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluirá un codón de parada. En algunas realizaciones, el codón de parada se encontrará en el extremo C-terminal del dominio Fe.
En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye además un segundo dominio de enlace. En algunas realizaciones, el segundo dominio de nucleasa está ligado al dominio Fe vía un segundo dominio de enlace. En algunas realizaciones, el segundo dominio de enlace se encontrará en el extremo C-terminal del dominio Fe. La Figura 1 muestra al menos una realización de una molécula de nucleasa híbrida. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye una secuencia mostrada en la Tabla 1.
En algunas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida es una molécula de RNasa o DNasa o una molécula multi-enzimática (que contiene, por ejemplo, ambas, RNasa y DNasa o dos nucleasas de ARN o ADN con diferente especificidad para el sustrato) unida a un dominio Fe que se liga específicamente a complejos inmunes extracelulares . En algunas realizaciones, el dominio Fe no se liga efectivamente a receptores de Fcy. En un aspecto, la molécula de nucleasa híbrida no se liga efectivamente a Clq. En otros aspectos, la molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio Fe enmarcado de IgGl. En otros aspectos, la molécula de nucleasa híbrida comprende, además, las mutaciones en los dominios de bisagra, CH2 y/o CH3. En otros aspectos, las mutaciones son P283S, P331S ó N297S y pueden incluir mutaciones en una o más de las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos tales, las mutaciones en una o más de las tres cisteinas bisagra pueden ser SCC o SSS. En otros aspectos, las moléculas contienen la bisagra SCC, pero por lo demás son de tipo natural para dominios Fe de IgGl, CH2 y CH3 humanos, y se ligan eficientemente a los receptores Fe, lo que facilita la absorción de la molécula de nucleasa híbrida en el compartimiento endocítico de las células a las cuales están ligados. En otros aspectos, la molécula tiene actividad contra sustratos de ARN de hebra simple y/o doble.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio Fe mutante. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio Fe IgGl mutante. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende una o más mutaciones en los dominios bisagra, CH2 y/o CH3. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación P238S. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación P331S. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación P238S y una mutación P331S. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S y ¦ puede incluir mutaciones en una o más de las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o una o más mutaciones en las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o mutaciones en las tres cisteinas bisagra a SSS o en una cisteina bisagra a SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y mutaciones en las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y cualquiera de SCC o SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye P238S SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye P238S y cualquiera de SCC o SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en una o más de las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en las tres cisteinas bisagra a SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en una de las tres cisteinas bisagra a SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye SCC o SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante es el mostrado en cualquiera de las SEQ ID NOs:59, 60, 71-76, ó 87-90. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es la mostrada en cualquiera de las SEQ ID NOs:62, 64, 66, 68, 70, 78, 80, 82, 84, 86, 92, 94, 96 ó 98. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrido comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a un dominio Fe de IgGI humana mutante que comprende SCC, P238S y P331S, o un dominio Fe de IgGI humana mutante que comprende SSS, P238S y P331S. En algunos aspectos, una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de nucleasa híbrida es como las mostradas en las SEQ ID NO: 61, 77 o 91. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es como las mostradas en las SEQ ID NO: 62, 78, 92 ó 96.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a través de un dominio de enlace (Gly4Ser) 4 a un dominio Fe de IgGI humana mutante que comprende SCC, P238S y P331S, o un dominio Fe de IgGI humana mutante que comprende SSS, P238S y P331S. En algunos aspectos, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de nucleasa híbrida se muestra en las SEQ ID NO: 63 o 79. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es como las mostradas en las SEQ ID NO: 64 o 80.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a través de un dominio de enlace (Gly4Ser)4 a un dominio Fe de IgGI humana mutante que comprende SCC, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio de RNasal humana natural. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a través de un dominio de enlace (Gly4Ser) 4 a un dominio Fe de IgGI humana mutante que comprende SSS, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio RNasal humana natural. En algunos aspectos, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de nucleasa híbrida se muestra en las SEQ ID NO: 65 o 81. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es como las mostradas en las SEQ ID NO: 66 o 82.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a través de un dominio de enlace (Gly4Ser)4 a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SCC, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio DNasal G105R A114F humano natural. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a través de un dominio de enlace (Gly4Ser)4 a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SSS, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio de DNasal G105R A114F humana natural. En algunos aspectos, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de nucleasa híbrida se muestra en las SEQ ID NO: 67 o 83. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es como las mostradas en las SEQ ID NO: 68 o 84.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SCC, P238S y • P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio de DNasal G105R A114F humana. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de RNasal humana natural ligado a un dominio Fe de IgGl humana mutante que comprende SSS, P238S y P331S ligado a través de un dominio de enlace NLG a un dominio de DNasal G105R A114F humana. En algunos aspectos, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de nucleasa híbrida se muestra en las SEQ ID NO: 69, 85 o 93. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida es como las mostradas en las SEQ ID NO: 70, 86, 94 ó 98.
En algunos aspectos, la actividad de la molécula de nucleasa híbrida es detectable in vitro y/o in vivo. En algunos aspectos, la molécula de nucleasa híbrida se liga a una célula, una célula maligna o una célula de cáncer e interfiere con su actividad biológica.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de RNasa multifuncional que está ligada a otra enzima o anticuerpo que tiene especificidad de ligadura, tal como un scFv dirigido a ARN o un segundo dominio de nucleasa con especificaciones iguales o diferentes al primer dominio.
En otro aspecto, se proporciona una molécula de DNasa multifuncional que está ligada a otra enzima o anticuerpo que tiene especificidad de ligadura, tal como un scFv dirigido a ADN o un segundo dominio de nucleasa con especificaciones iguales o diferentes al primer dominio.
En otro aspecto, una molécula de nucleasa híbrida está adaptada para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero mediante la administración de una molécula de nucleasa híbrida unida a una región Fe, en una cantidad terapéuticamente efectiva para el mamífero que necesita tal tratamiento para prevenir o tratar la enfermedad. En otros aspectos, la enfermedad o trastorno es una enfermedad autoinmune o cáncer. En algunas aspectos tales, la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo formado por diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune experimental, artritis reumatoide, artritis autoinmune experimental, miastenia grave, tiroiditis, una forma experimental de uveorretinitis, tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, tirotoxicosis , anemia perniciosa, gastritis autoinmune atrófica, enfermedad de Addison, menopausia precoz, infertilidad masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, pénfigo, oftalmía simpática, uveitis facogénica, anemia hemolítica autoinmune, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa Hbs-ve, cirrosis criptogénica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjógren, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, polimiositis, dermatomiositis, lupus eritematoso discoide (LED) , lupus eritematoso sistémico (LES) , o enfermedad del tejido conectivo.
En algunas formas de realización, los objetivos de la actividad enzimática Rnasa de moléculas de nucleasa híbridas RNasa son principalmente extracelulares , consistiendo en, por ejemplo, el ARN contenido en complejos inmunes con autoanticuerpo anti-RNP y el ARN expresado en la superficie de células sometidas a apoptosis. En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida RNasa es activa en el ambiente ácido de los vesículos endociticos. En algunas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida RNasa que incluye un dominio Fe natural es adaptada para ser activa tanto extracelularmente como así también en un ambiente endocítico (donde TLR7 puede ser expresado) . En algunos aspectos, esto permite que una molécula de nucleasa híbrida RNasa que incluye un dominio Fe natural pare la señalización de TLR7 a través de complejos inmunes previamente envueltos o mediante ARN que activan TLR7 después de infección viral. En algunas realizaciones, la RNasa natural de una molécula de nucleasa híbrida RNasa no es activa en el citoplasma de una célula.
En algunas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida que incluye un dominio de Fe natural se utiliza para la terapia de una enfermedad autoinmune, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico.
En algunas formas de realización, se incrementa la ligadura del dominio Fe a un receptor de Fe (FcR),por ejemplo, vía alteraciones de la glicosilación y / o cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida tiene una o más alteraciones del Fe que aumentan la ligadura al FcR.
Se prevén rutas alternativas para construir una molécula de nucleasa híbrida unida a un dominio Fe. En algunas formas de realización, puede alterarse la orientación del dominio para construir una molécula de Ig-RNasa o una molécula de Ig-DNasa o una molécula de RNasa-Ig o una molécula de DNasa-Ig que retiene la ligadura al FcR y tiene dominios de nucleasa activos.
En algunas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas incluyen un dominio Fe natural que puede permitir, por ejemplo, que las moléculas sufran endocitosis después de ligarse al FcR. En algunas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas DNasa pueden ser activas contra complejos inmunes extracelulares que contienen ADN, por ejemplo, ya sea en forma soluble o depositados como complejos insolubles .
En algunas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas incluyen ambas, DNasa y RNasa. En algunas formas de realización, estas moléculas de nucleasa híbridas pueden mejorar la terapia del LES porque pueden, por ejemplo, digerir los complejos inmunes que contienen ARN, ADN o una combinación de ambos, ARN y ADN, y cuando incluyen, además, un dominio Fe natural son activas tanto extracelularmente como así también en el compartimiento endocítico donde pueden estar ubicados los receptores TLR7 y TLR9.
En algunas formas de realización, los dominios de enlace incluyen variantes de (Gly4Ser) 3, 4 ó 5 que alteran la longitud del grupo de enlace mediante 5 progresiones de aminoácidos. En otra forma de realización, un dominio de enlace tiene una longitud de aproximadamente 18 aminoácidos e incluye un sitio de glicosilación ligado a N, que puede ser sensible a la escisión de proteasa in vivo. En algunas formas de realización, un sitio de glicosilación ligada a N puede proteger las moléculas de nucleasa híbridas de la escisión en el dominio del grupo de enlace. En algunas formas de realización, un sitio de glicosilación ligado a N puede ayudar en separar el plegamiento de dominios funcionales independientes separados por el dominio del grupo de enlace.
En algunas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas pueden incluir ambos, dominios IgGl Fe mutantes y/o de tipo humano natural. En algunas realizaciones, las moléculas de nucleasa híbridas pueden expresarse mediante ambas, transfecciones transiente de COS y estable de CHO. En algunas formas de realización, tanto la unión a CD80/86 como así también la actividad de RNasa se preservan en una molécula de nucleasa híbrida. En algunas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas incluyen constructos de DNasalL3-Ig-enlace-RNasa . En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye un constructo DNasal-Ig-enlace-RNasa o un constructo RNasal-Ig-enlace-DNasa . En algunas realizaciones, se optimizan los empalmes por fusión entre los dominios enzimáticos y los otros dominios de la molécula de nucleasa híbrida.
En algunas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas incluyen moléculas de nucleasa híbridas DNasa-Ig y/o moléculas de nucleasa híbridas DNasa-RNasa.
En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye TREX1. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida TREX1 puede digerir cromatina. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida TREX1 es expresada por una célula. En algunas formas de realización, la molécula de nucleasa híbrida expresada incluye TREX-1 murino y un dominio Fe (natural o mutante) murino. En algunas realizaciones, puede requerirse un dominio de enlace de 20-25 aminoácidos (aa) entre TREXl y la bisagra de IgG para permitir la actividad de DNasa. En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida con un dominio de enlace de 25 aa no es activa. En algunas formas de realización, el uso de dominios de enlace de 20 y 25 aminoácidos (plus 2 o más aminoácidos para incorporar sitios de restricción) resulta en una actividad funcional medida por la digestión de cromatina. En algunas formas de realización, puede separarse una región hidrófoba de aproximadamente 72 aa del extremo COOH de TREX-1 previo a la fusión al dominio Fe vía el dominio de enlace. En algunas formas de realización, una versión de dominio de enlace de 20 aminoácidos de la molécula de nucleasa híbrida exhibe altos niveles de expresión en comparación con controles y / u otras moléculas de nucleasa híbridas. En algunas formas de realización, los ensayos enzimáticos cinéticos se utilizan para comparar la actividad enzimática de moléculas de nucleasa híbridas y de control de un modo cuantitativo.
En algunas formas de realización, puede usarse una optimización adicional del empalme de fusión elegido para el truncamiento de una enzima TREXl, con el fin de mejorar la expresión de las moléculas de nucleasa híbridas.
En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye una molécula de nucleasa híbrida TREXl-enlace-dominio Fclg humana con dominios de enlace de 20 y/o 25 aa. En algunas formas de realización, el (los) dominio (s) de enlace es (son) (una) variante (s) de un cásete (gly4ser) o (gly4ser) 5 con uno o más sitios de restricción ligados para la incorporación en el constructo de las moléculas de nucleasa híbridas. En algunas formas de realización, debido a la dimerización cabeza-a-cola útil para la actividad de la enzima TREX1; puede utilizarse un dominio de enlace flexible y más largo para facilitar un plegado correcto.
En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida es una molécula de nucleasa híbrida TREX-1 tándem. En algunas formas de realización, un método alternativo para facilitar el plegado cabeza-a-cola de TREX1 consiste en generar una molécula de nucleasa híbrida TREX1-TREX1-Ig que incorpora dos dominios TREX1 en tándem, seguidos por un dominio de enlace y un dominio Fe de Ig. En algunas formas de realización, cada inmunoenzima de una molécula de nucleasa híbrida tiene dos enzimas TREX1 funcionales ligadas a un solo dominio Fe de la IgG.
En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye TREXl-enlacel-Ig-enlace2-RNasa .
En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye RNasa-lg-enlace-TREXl . En algunas formas de realización, los casetes se derivan para ambas, la fusión amino y la fusión carboxilo para cada enzima, para su incorporación en las moléculas de nucleasa híbridas donde se invierte la configuración de las enzimas. En algunas realizaciones, la enzima RNasa exhibe una actividad funcional comparable, sin tomar en cuenta su posición en las moléculas de nucleasa híbrida. En algunas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas pueden diseñarse para ensayar si una configuración particular muestra una expresión y/o función mejorada de los componentes de la molécula de nucleasa híbrida.
En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye 1L3-Ig. En algunas formas de realización, la DNasa 1L3 se construye a partir de una secuencia murina y es expresada.
En algunas realizaciones, la enzima es activa. En algunas realizaciones, una nucleasa híbrida DNasa-Ig-RNasa 1L3 murina es construida y expresada. En algunas formas de realización, la molécula incluye 1L3-Ig humana, lL3-Ig-RNasa humana y / o RNasa-Ig-lL3 humana.
En algunas realizaciones, la molécula de nucleasa híbrida incluye DNasal-Ig. En algunas formas de realización, se incluye un alelo variante natural, A114F, que muestra una sensibilidad reducida a la actina, en una molécula de nucleasa híbrida DNasal-Ig. En algunas formas de realización, esta mutación se introduce en una molécula de nucleasa híbrida para generar un derivado más estable de DNasal humana. En algunas realizaciones, se prepara una DNasal-enlace-Ig que contiene un dominio de enlace de 20 ó 25 aa . En algunas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas incluyen RNasa-Ig-enlace-DNasal , donde el dominio DNasal está ubicado del lado COOH del dominio IgFc. En algunas formas de realización, se preparan moléculas de nucleasa híbridas que incorporan DNasal e incluyen: DNasal-enlace-Ig-enlace2-RNasa y/o RNasa-Ig-enlace-DNasal.
Otro aspecto de la presente invención es el uso de métodos de terapia génica para tratar o prevenir trastornos, enfermedades y condiciones con una o más moléculas de nucleasa híbrida. Los métodos de terapia génica se refieren a la introducción de secuencias de ácidos nucleicos de una molécula de nucleasa híbrida (ADN, ARN y ADN o ARN antisentido) en un animal, para lograr la expresión del polipéptido o de los polipéptidos de la presente invención. Este método puede incluir la introducción de uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido de la molécula de nucleasa híbrida de la presente invención, ligado operativamente a un promotor y otros elementos genéticos cualesquiera necesarios para la expresión del polipéptido por el tejido objetivo.
En aplicaciones de terapia génica, se introducen genes de una molécula de nucleasa híbrida en células con el fin de lograr la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz. El término «terapia génica» incluye ambas, las terapias génicas convencionales que logran un efecto duradero mediante un solo tratamiento, y la administración de agentes génicos terapéuticos, lo que implica la administración única o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente eficaz. Los oligonucleótidos pueden ser modificados para mejorar su absorción, por ejemplo, mediante la sustitución de sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.
Dominios Fe En algunas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio Fe. El dominio Fe no contiene ninguna región variable que se liga a antígeno. En formas de realización, el dominio Fe no contiene ninguna región variable. Dominios Fe útiles para producir las moléculas de nucleasa híbridas de la presente invención pueden obtenerse a partir de un número de fuentes diferentes. En realizaciones preferidas, un dominio Fe de la molécula de nucleasa híbrida se deriva de una inmunoglobulina humana. Queda entendido, sin embargo, que el dominio Fe puede derivarse de una inmunoglobulina de otra especie de mamífero, incluyendo, por ejemplo, un roedor (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cobayo) o una especie de primate no humano (por ejemplo, chimpancé, macaco) . Además, el dominio Fe de la molécula de nucleasa híbrida o una porción del mismo puede derivarse de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA, e IgE, y cualquier isotipo de inmunoglobulina, incluyendo IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. En una realización preferida, se usa el isotipo IgGl humano.
En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio Fe mutante. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio Fe IgGl mutante. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende una o más mutaciones en los dominios bisagra, CH2 y/o CH3. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación P238S. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación P331S. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación P238S y una mutación P331S. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S y puede incluir mutaciones en una o más de las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o una o más mutaciones en las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o mutaciones en una cisteína bisagra a SCC o en las tres cisteinas bisagra a SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y mutaciones en al menos una de las tres histeínas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye P238S y SCC o SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye P331S y SCC o SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en una o más de las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en las tres cisteinas bisagra. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en una de las tres cisteinas bisagra a SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye SCC. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye mutaciones en las tres cisteinas bisagra a SSS. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante incluye una mutación P331S. En algunos aspectos, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un dominio Fe mutante se muestra en SEQ ID NOs:59, 71, 73, 75, 87 ó 89. En algunos aspectos, un dominio Fe mutante se muestra en SEQ ID NOs:60, 72, 74, 76, 88, ó 90. En algunos aspectos, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una molécula de nucleasa híbrida se muestra en las SEQ ID NOs:61, 63, 65, 67, 69, 77, 79, 81, 83, 85, 91, 93, 95 ó 97. En algunos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida se muestra en las SEQ ID NOs:62, 64, 66, 68, 70, 78, 80, 82, 84,86, 92, 94, 96, ó 98.
Una variedad de secuencias génicas del dominio Fe (por ejemplo, secuencias génicas de la región constante humana) está disponible en la forma de depósitos accesibles al público. Pueden seleccionarse dominios de región constante que comprenden una secuencia del dominio Fe que tienen una función efectora particular (o carecen de una función efectora en particular) o con una modificación particular para reducir la inmunogenicidad. Muchas secuencias de anticuerpos y genes que codifican anticuerpos han sido publicados, y secuencias del dominio Fe adecuadas (por ejemplo, bisagra, CH2 y/o CH3 o porciones de las mismas) pueden ser derivadas de estas secuencias utilizando técnicas conocidas por el arte. Luego, el material genético obtenido usando cualquiera de los métodos precedentes puede ser alterado o sintetizado para obtener polipéptidos de la presente invención. Será apreciado además que el alcance de esta invención abarca alelos, variantes y mutaciones de las secuencias de ADN de la región constante.
Secuencias del dominio Fe pueden clonarse, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa y los cebadores que se seleccionan para amplificar el dominio de interés. Para clonar una secuencia del dominio Fe de un anticuerpo, puede aislarse mRNA de células de hibridoma, bazo o células linfáticas, efectuar la transcripción inversa en ADN, y amplificar los genes del anticuerpo mediante PCR. Métodos de amplificación con PCR se describen en detalle en las patentes U.S. Nos. 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188, y en, por ejemplo, "PCR Protocols: A Guide to Methods y Applications" Innis et al. eds . , Academic Press, San Diego, Calif. (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270) . La PCR puede iniciarse mediante cebadores de la región constante de consenso o mediante cebadores más específicos en base a las secuencias de ADN de cadena pesada y liviana y las secuencias de aminoácidos publicadas. Como se discutió anteriormente, la PCR también puede usarse para aislar clones de ADN que codifican las cadenas liviana y pesada del anticuerpo. En este caso, las bibliotecas pueden rastrearse mediante cebadores de consenso o sondas homólogas más grandes, tales como sondas de la región constante de ratón. Numerosos conjuntos de cebadores adecuados para la amplificación de genes de anticuerpos son conocidos por el arte (por ejemplo, cebadores 5' basados en la secuencia N-terminal de anticuerpos purificados (Benhar y Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); amplificación rápida de extremos de ADNc (Ruberti, F. et al. 1994. (1996) J. Immunol. Methods 173:33); secuencias leader de anticuerpos (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys . Res. Commun. 160:1250) . La clonación de secuencias de anticuerpos se describe además en Newman et al., patente U.S. No. 5.658.570, presentada el 25 de enero de 1995, que se incorpora en ésta por referencia.
Las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden comprender uno o más dominios de Fe (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más dominios Fe) . En una forma de realización, los dominios Fe pueden ser de diferentes tipos. En una realización, al menos un dominio Fe presente en la molécula de nucleasa híbrida comprende un dominio de bisagra o una porción del mismo. En otra realización, la molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende al menos un dominio CH2 o una porción del mismo. En otra realización, la molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende al menos un dominio CH3 o una porción del mismo. En otra realización, la molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende al menos un dominio CH4 o una porción del mismo. En otra realización, la molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende al menos un dominio de bisagra o una porción del mismo y al menos un dominio CH2 o una porción del mismo (por ejemplo, en la orientación bisagra-CH2 ) . En otra realización, la molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende al menos un dominio CH2 o una porción del mismo y al menos un dominio CH3 o una porción del mismo (por ejemplo, en la orientación CH2-CH3) . En otra realización, la molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende al menos un dominio de bisagra o una porción del mismo, al menos un dominio CH2 o una porción del mismo y al menos un dominio CH3 o una porción del mismo, por ejemplo, en la orientación bisagra-CH2-CH3, bisagra-CH3-CH2 o CH2-CH3-bisagra .
En ciertas formas de realización, la molécula de nucleasa híbrida comprende al menos una región Fe completa derivada de una o más cadenas pesadas de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio Fe que incluye dominios bisagra, CH2 y CH3, aunque éstos no necesitan ser derivados del mismo anticuerpo) . En otras formas de realización, la molécula de nucleasa híbrida comprende al menos dos dominios Fe completos derivadas de una o más cadenas pesadas de inmunoglobulina. En realizaciones preferidas, el dominio completo Fe se deriva de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG humana (por ejemplo, IgGl humana) .
En otra realización, una molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende un dominio CH3 completo . En otra realización, una molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende un dominio CH2 completo . En otra realización, una molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende al menos un dominio CH3, y al menos uno de una región bisagra, y un dominio CH2. En otra realización, una molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende una región bisagra y un dominio CH3. En otra realización, una molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio Fe que comprende una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En realizaciones preferidas, el dominio Fe se deriva de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG humana (por ejemplo, IgGl humana) .
Los dominios de región constante o porciones de los mismos que componen un dominio Fe de una molécula de nucleasa híbrida de la invención pueden derivarse a partir de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede comprender un dominio CH2 o una porción del mismo derivado de una molécula IgGl y una región CH3 o una porción de la misma derivada de una molécula IgG3. En otro ejemplo, una molécula de nucleasa híbrida puede comprender un dominio Fe que comprende un dominio bisagra derivado, en parte, de una molécula IgGl y, en parte, de una molécula IgG3. Como se indica en este documento, será entendido por un experto con experiencia ordinaria en el arte que un dominio Fe puede ser alterado de modo que varía en la secuencia de aminoácidos de una molécula de anticuerpo de origen natural.
En otra realización, una molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende uno o más dominios Fe truncados que son sin embargo suficientes para conferir a la región Fe propiedades de ligadura al receptor Fe (FcR) . Por lo tanto, un dominio Fe de una molécula de nucleasa híbrida de la invención puede comprender o consistir de una porción de enlace a FcRn. Porciones de enlace a FcRn pueden derivarse de cadenas pesadas de cualquier isotipo, incluyendo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG . En una forma de realización, se utiliza una porción de enlace a FcRn de un anticuerpo del isotipo IgGl humano. En otra forma de realización, se utiliza una porción de enlace a FcRn de un anticuerpo del isotipo IgG4 humano.
En una realización, una molécula de nucleasa híbrida de la invención carece de uno o más dominios de región constante de una región Fe completa, es decir, son parcialmente o totalmente eliminados. En ciertas formas de realización, moléculas de nucleasa híbridas de la invención carecerán de un dominio CH2 entero (constructos DCH2) . Los entendidos en el arte apreciarán que tales constructos pueden ser preferidos debido a las propiedades reguladoras del dominio CH2 sobre la velocidad catabólica del anticuerpo. En ciertas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención comprenden regiones Fe con dominio CH2 eliminado derivadas de un vector (por ejemplo, de IDEC Pharmaceuticals, San Diego) que codifica un dominio de la región constante de la IgGl humana (véase, por ejemplo, los documentos WO 02/060955A2 y WO02/096948A2 ) . Este vector típico está diseñado para eliminar el dominio CH2 y proporciona un vector sintético que expresa una región constante de IgGl con dominio eliminado. Se observará que estos constructos típicos están diseñados preferentemente para fusionar un dominio CH3 directamente a una región de bisagra del dominio Fe respectivo.
En otros constructos puede ser deseable proporcionar un espaciador peptídico entre uno o más dominios Fe constituyentes. Por ejemplo, puede colocarse un espaciador peptídico entre una región de bisagra y un dominio CH2 y/o entre un dominio CH2 y un dominio CH3. Por ejemplo, pueden expresarse constructos compatibles en los cuales el dominio CH2 ha sido eliminado y el dominio CH3 remanente (sintético o no sintético) se une a la región bisagra con un espaciador peptídico de 1-20, 1-10 ó 1-5 aminoácidos. Tal espaciador peptídico puede añadirse, por ejemplo, para asegurar que los elementos reguladores del dominio de región constante permanezcan libres y accesibles o que la región bisagra permanezca flexible. Preferentemente, cualquier péptido de enlace compatible con la presente invención será relativamente no inmunogénico y no impedirá el plegamiento apropiado de la Fe.
Cambios en los aminoácidos de la Fe En ciertas realizaciones, un dominio Fe empleado en una molécula de nucleasa híbrida de la invención es alterado o modificado, por ejemplo, mediante mutación de aminoácidos (por ejemplo, adición, eliminación o sustitución) . Según lo usado en ésta, el término "variante de dominio Fe" se refiere a un dominio Fe que tiene al menos una modificación de aminoácidos, tal como una sustitución de aminoácidos, en comparación con la Fe natural del cual se deriva el dominio Fe. Por ejemplo, cuando el dominio Fe se deriva de un anticuerpo IgGl humano, una variante comprende al menos una mutación de aminoácido (por ejemplo, sustitución) en comparación con un aminoácido natural en la posición correspondiente de la región Fe de la IgGl humana .
La(s) sustitución (sustituciones) de (un) aminoácido ( s ) de una variante de Fe puede (n) estar ubicada (s) en una posición dentro del dominio Fe designada mediante el número de porción correspondiente que se daría al residuo en una región Fe en un anticuerpo .
En una forma de realización, la variante de Fe comprende una sustitución en una posición de aminoácido ubicada en un dominio de bisagra o una porción del mismo. En otra forma de realización, la variante de Fe comprende una sustitución en una posición de aminoácido ubicada en un dominio CH2 o una porción del mismo. En otra forma de realización, la variante de Fe comprende una sustitución en una posición de aminoácido ubicada en un dominio CH3 o una porción del mismo. En otra forma de realización, la variante de Fe comprende una sustitución en una posición de aminoácido ubicada en un dominio CH4 o una porción del mismo.
En ciertas realizaciones, las molécula de nucleasa híbridas de la invención comprenden una variante de Fe que comprende más de una sustitución de aminoácidos. Las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden comprender, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos están posicionadas espaciadamente entre si con intervalo de al menos una o más posiciones de aminoácido, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 o más posiciones de aminoácidos. Más preferentemente, los aminoácidos construidos están posicionados espaciadamente entre si con un intervalo de al menos 5, 10, 15, 20, 25 o más posiciones de aminoácidos.
En ciertas realizaciones, la variante de Fe confiere una mejora en al menos una función efectora impartida por un dominio Fe que comprende dicho dominio de Fe natural (por ejemplo, una mejora en la capacidad del dominio Fe para ligarse a receptores Fe (por ejemplo FcD RI, FcD RII o FcDRIII ) o proteínas de complemento (por ejemplo, Clq) , o para activar la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) , la fagocitosis, o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDCC) ) . En otras realizaciones, la variante de Fe proporciona un residuo de cisteína construido.
En algunos aspectos, un dominio Fe incluye cambios en la región entre los aminoácidos 234-238, incluyendo la secuencia LLGGP al comienzo del dominio CH2. En algunos aspectos, una variante de Fe altera la función efectora mediada por Fe, particularmente ADCC, y/o disminuye la avidez de ligadura por receptores de Fe. En algunos aspectos, cambios de secuencia más cercanos al empalme CH2-CH3, en posiciones tales como K322 y P331, pueden eliminar la citotoxicidad mediada por complemento y/o alterar avidez por la ligadura al FcR. En algunos aspectos, un dominio Fe incorpora cambios en los residuos P238 y P331, por ejemplo, cambiando las prolinas naturales en estas posiciones a serina. En algunos aspectos, las alteraciones en la región bisagra en una o más de las tres cisteínas bisagra, para codificar CCC, SCC, SSC, SCS o SSS en estos residuos, también pueden afectar la ligadura al FcR y la homogeneidad molecular, por ejemplo, mediante la eliminación de cisteínas no apareadas que pueden desestabilizar la proteina plegada .
Las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden emplear variantes de Fe reconocidas por el arte que son conocidas por impartir una mejora en la función efectora y/o la ligadura al FcR. Específicamente, una molécula de nucleasa híbrida de la invención puede incluir, por ejemplo, un cambio (por ejemplo, una sustitución) en una o más de las posiciones de aminoácidos descritas en las Publicaciones PCT Internacionales WO88/07089A1, W096/14339A1, WO98/05787A1, W098 / 23289A1, W099/51642A1, W099/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2 , WO02/44215A2 , O02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351 A2, WO04/074455A2, WO0 /0992 9A2 , WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 y O06/085967A2, las publicaciones de patente US Nos. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, ' US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056, o patentes U.S. Nos. 5.648.260, 5.739.277, 5.834.250, 5.869.046, 6.096.871, 6.121.022, 6.194.551, 6.242.195, 6.277.375, 6.528.624, 6.538.124, 6.737.056, 6.821.505, 6.998.253, 7.083.784, y 7.317.091, cada una de las cuales se incorpora en ésta por referencia. En una forma de realización, el cambio específico (por ejemplo, la sustitución específica de uno o más aminoácidos descritos en el arte) se puede hacer en una o más de las posiciones de aminoácidos descritas. En otra forma de realización, puede realizarse un cambio diferente en una o más posiciones de aminoácidos (por ejemplo, la sustitución diferente en una o más posiciones de aminoácidos descritas por el arte) .
Se contemplan otras mutaciones de aminoácidos en el dominio Fe para reducir la unión al receptor Fe gamma y a los subtipos del receptor Fe gamma. Por ejemplo, mutaciones en las posiciones 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 322, 324, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 356, 360, 373, 376, 378, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ó 439 de la región Fe puede alterar la ligadura según lo descrito en la patente U.S. No. 6.737.056, publicada el 18 de mayo de 2004, incorporada en ésta por referencia en su totalidad. Esta patente informa gue cambiando Pro331 en IgG3 a Ser resultó en una afinidad seis veces menor en comparación con IgG3 no mutado, lo que indica la implicación de Pro331 en la ligadura Fe RI gamma. Además, se informa que modificaciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235, 236, y 237, 297, 318, 320 y 322 alteran potencialmente la afinidad de ligadura del receptor según lo revelado en la patente U.S. 5.624.821, publicada el 29 de abril de 1997, incorporada en ésta por referencia en su totalidad.
Mutaciones adicionales contempladas para su uso incluyen, por ejemplo, aquellas descritas en la publicación de solicitud de patente U.S. No. 2006/0235208, publicada el 19 de octubre de 2006, incorporada en ésta por referencia en su totalidad. Estas publicaciones describen variantes de Fe que exhiben una unión reducida a receptores Fe gamma, una citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos reducida, o una citotoxicidad dependiente de complemento reducida, variantes que comprenden al menos una modificación de aminoácidos en la región Fe, incluyendo 232g, 234g, 234H, 235D, 235g, 235H, 2361, 236N, 236P, 236R, 237K, 237L, 237N, 237P, 238K, 239R, 265 g, 267R, 269R, 270H, 297S, 299A, 2991, 299V, 325A, 325L, 327R, 328R, 329K, 3301, 330L, 330N, 330P, 330R y 331L (la numeración está de acuerdo con el índice de la UE) , como asi también mutantes dobles 236R/237K, 236R/325L, 236R/328R, 237K/325L, 237K/328R, 325L/328R , 235G/236R, 267R/269R, 234G/235G, 236R/237K/325L, 236R/325L/328R, 235G/236R/237K y 237K/325L/328R. Otras mutaciones contempladas para el uso descrito en esta publicación incluyen 227G, 234D, 234E, 234g, 2341, 234Y, 235D, 2351, 235S, 236S, 239D, 246H, 255Y, 258H, 260H, 2641, 267D, 267E, 268D, 268E , 272H, 2721, 272R, 281D, 282g, 283H, 284E, 293R, 295E, 304T, 324g, 324i, 327D, 327A, 328A, 328D, 328E, 328F, 3281, 328M, 328N, 328Q, 328T, 328V, 328Y , 3301, 330L, 330Y, 332D, 332E, 335D, una inserción de G entre las posiciones 235 y 236, una inserción de A entre las posiciones 235 y 236, una inserción de S entre las posiciones 235 y 236, una inserción de T entre las posiciones 235 y 236, una inserción de N entre las posiciones 235 y 236, una inserción de D entre las posiciones 235 y 236, una inserción de V entre las posiciones 235 y 236, una inserción de L entre las posiciones 235 y 236, una inserción de G entre las posiciones 235 y 236, una inserción de A entre las posiciones 235 y 236, una inserción de S entre las posiciones 235 y 236, una inserción de T entre las posiciones 235 y 236, una inserción de N entre las posiciones 235 y 236, una inserción de D entre las posiciones 235 y 236, una inserción de V entre las posiciones 235 y 236, una inserción de L entre las posiciones 235 y 236, una inserción de G entre posiciones 235 y 236, una inserción de A entre posiciones 235 y 236, una inserción de S entre posiciones235 y 236, una inserción de T entre posiciones 235 y 236, una inserción de N entre posiciones 235 y 236, una inserción de D entre posiciones 235 y236, una inserción de una inserción de V entre posiciones 235 y 236, una inserción de L entre posiciones 235 y 236, una inserción de G entre posiciones 297 y 298, una inserción de A entre posiciones 297 y 298, una inserción de S entre posiciones297 y 298, una inserción de D entre posiciones 297 y 298, una inserción de G entre posiciones 326 y 327, una inserción de A entre posiciones 326 y 327, una inserción de T entre posiciones 326 y 327, una inserción de D entre posiciones 326 y 327, y una inserción de E entre posiciones 326 y 327 (la numeración está de acuerdo con el índice EU) . Adicionalmente, las mutaciones descritas en la publicación de solicitud de patente U.S. No. 2006/0235208 que incluyen 227G/332E, 234D/332E, 234E/332E, 234Y/332E, 234I/332E, 234G/332E, 235I/332E, 235S/332E, 235D/332E, 235E/332E, 236S/332E, 236A/332E, 236S/332D, 236A/332D, 239D/268E, 246H/332E, 255Y/332E, 258H/332E, 260H/332E, 264I/332E, 267E/332E, 267D/332E, 268D/332D, 268E/332D, 268E/332E, 268D/332E, 268E/330Y, 268D/330Y, 272R/332E, 272H/332E, 283H/332E, 284E/332E, 293R/332E, 295E/332E, 304T/332E, 324I/332E, 324G/332E, 324I/332D, 324G/332D, 327D/332E, 328A/332E, 328T/332E, 328V/332E, 328I/332E, 328F/332E, 328Y/332E, 328M/332E, 328D/332E, 328E/332E, 328N/332E, 328Q/332E, 328A/332D, 328T/332D, 328V/332D, 328I/332D, 328F/332D, 328Y/332D, 328M/332D, 328D/332D, 328E/332D, 328N/332D, 328Q/332D, 330L/332E, 330Y/332E, 330I/332E, 332D/330Y, 335D/332E, 239D/332E, 239D/332E/330Y, 239D/332E/330L, 239D/332E/330I , 239D/332E/268E, 239D/332E/268D, 239D/332E/327D, 239D/332E/284E, 239D/268E/330Y, 239D/332E/268E/330Y, 239D/332E/327A, 239D/332E/268E/327A, 239D/332E/330Y/327A, 332E/330Y/268 E/327A, 239D/332E/268E/330Y/327A, Inserto G>297-298/332E, Inserto A>297-298/332E, Inserto ooS>297-298/332E, Inserto D>297- 298/332E, Inserto G>326-327/332E, Inserto A>326-327/332E, Inserto T>326-327/332E, Inserto D>326-327/332E, Inserto E>326-327/332E, Inserto G>235-236/332E, Inserto A>235-236/332E, Inserto S>235-236/332E, Inserto T>235-236/332E, Inserto N>235-236/332E, Inserto D>235-236/332E, Inserto V>235-236/332E, Inserto L>235-236/332E, Inserto G>235-236/332D, Inserto A>235-236/332D, Inserto S>235-236/332D, Inserto T>235-236/332D, Inserto N>235-236/332D, Inserto D>235-236/332D, Inserto V>235-236/332D, e Inserto L>235-236/332D (numeración de acuerdo con el índice EU) están contemplados para el uso. La mutante L234A/L235A se describe, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente U.S. No. 2003/0108548, publicada el 12 de junio de 2003, incorporada en ésta por referencia en su totalidad. En formas de realización, las modificaciones descritas se incluyen ya sea individualmente o en combinación.
En ciertas realizaciones, una molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende una sustitución de aminoácidos en un dominio de Fe que altera las funciones efectores antígeno-independientes del anticuerpo, en particular la vida media de circulación del anticuerpo. Tales moléculas de nucleasa híbridas exhiben una ligadura aumentada o disminuida a FcRn en comparación con las moléculas de nucleasa híbridas que carecen de estas sustituciones y, por lo tanto, tienen una vida media en el suero aumentada o disminuida, respectivamente. Se anticipa que las variantes de Fe con afinidad mejorada para FcRn tienen vidas medias en suero más largas, y tales moléculas tienen aplicaciones útiles en métodos de tratamiento de mamíferos en los cuales es deseable una larga vida media del polipéptido administrado, por ejemplo, para tratar una enfermedad o trastorno crónico. En contraste, se espera que las variantes de Fe con afinidad de ligadura a FcRn disminuida tienen vidas medias más cortas, y tales moléculas también son útiles, por ejemplo, para la administración a un mamífero en el cual un tiempo de circulación acortado puede ser ventajoso, por ejemplo, para la formación de imágenes de diagnóstico in vivo o en situaciones en las que el polipéptido de partida tiene efectos secundarios tóxicos al estar presente en la circulación durante periodos prolongados. Variantes de Fe con afinidad de ligadura a FcRn disminuida también tienen menos probabilidades de atravesar la placenta y, por lo tanto, también son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas. Además, otras aplicaciones en las cuales una afinidad de unión a FcRn reducida puede ser deseable incluyen aquellas aplicaciones en las que se desea la localización en el cerebro, riñon y/o hígado. En una forma de realización típica, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención exhiben un transporte reducido a través del epitelio de los glomérulos del riñon desde la vasculatura. En otra forma de realización, las moléculas de nucleasa híbrida de la invención exhiben un transporte reducido a través de la barrera de sangre cerebral (BBB) del cerebro hacia el espacio vascular. En una forma de realización, una molécula de nucleasa híbrida con ligadura a FcRn alterada comprende al menos un dominio Fe (por ejemplo, uno o dos dominios Fe) que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro del "bucle de unión a FcRn" de un dominio Fe. Sustituciones de aminoácidos típicas que alteran la actividad de ligadura a FcRn se describen en la Publicación Internacional PCT No. WO05/047327, que se incorpora en ésta por referencia .
En otras realizaciones, una molécula de nucleasa híbridas de la invención comprende una variante de Fe que comprende una sustitución de aminoácidos que altera las funciones efectores antigeno-dependientes del polipéptido, en particular ADDC o la activación del complemento, por ejemplo, en comparación con una región Fe natural. En una realización típica, dichas moléculas de nucleasa híbrida exhiben ligadura alterada a un receptor de Fe gamma (por ejemplo, CD16) . Tales moléculas de nucleasa híbridas exhiben una ligadura a FcR gamma aumentada o disminuida en comparación con polipéptidos naturales y, por lo tanto, sirven de intermediario para una función efectora aumentada o reducida, respectivamente. Se anticipa que variantes de Fe con afinidad mejorada para FcDRs aumentan la función efectora, y tales moléculas tienen aplicaciones útiles en métodos para tratar mamíferos en los cuales es deseable la destrucción de la molécula objetivo. En contraste, se espera que variantes de Fe con afinidad de ligadura a FcDR disminuida reducen la función efectora, y tales moléculas también son útiles, por ejemplo, para el tratamiento de condiciones en las cuales la destrucción de células objetivo no es deseable, por ejemplo, cuando células normales pueden expresar moléculas objetivo, o cuando la administración crónica del polipéptido podría resultar en la activación no deseada del sistema inmunológico . En una forma de realización, el polipéptido que comprende un Fe exhibe al menos una función efectora antígeno-dependiente alterada seleccionada del grupo formado por opsonización, fagocitosis, citotoxicidad complemento-dependiente, citotoxicidad celular antígeno-dependiente (ADCC) , o modulación de células efectoras en comparación con una polipéptido que comprende una región Fe natural.
En una realización, la molécula de nucleasa híbrida exhibe ligadura alterada a un Fe DR activante (por ejemplo, Fe ? I, Fe ? lia, o Fe ? RlIIa) . En otra realización, la molécula de nucleasa híbrida exhibe afinidad de ligadura alterada a un FcD R inhibitorio (por ejemplo, Fe ? Rllb) . Sustituciones de aminoácidos típicas que alteran la actividad de ligadura a FcR o al complemento se describen en la Publicación Internacional PCT No. O05/063815 que se incorpora en ésta por referencia.
Una molécula de nucleasa híbrida de la invención también puede comprender una sustitución de aminoácidos que altera la glicolización de la molécula de nucleasa híbrida. Por ejemplo, el dominio Fe de la molécula de nucleasa híbrida puede comprender un dominio Fe que tiene una mutación que conduce a glicosilación reducida (por ejemplo, glicosilación N- u Coligada) o puede comprender una glicoforma alterada del dominio Fe natural (por ejemplo, un glicano de bajo contenido de fucosa o libre de fucosa) . En otra forma de realización, la molécula de nucleasa híbrida tiene una sustitución de aminoácidos cerca de o dentro de un motivo de glicosilación, por ejemplo, un motivo de glicosilación ligado a N que contiene la secuencia de aminoácidos NXT o NXS . Sustituciones de aminoácidos típicas que reducen o alteran glicolisación se describen en la Publicación Internacional PCT No. O05/018572 y la publicación de patente U.S. No. 2007/0111281, incorporada en ésta por referencia .
En otras realizaciones una molécula de nucleasa híbrida de la invención comprende al menos un dominio de Fe que tiene un residuo de cisteina construido mediante ingeniería genética o un análogo del mismo que está ubicado en la superficie expuesta a solvente. Preferentemente el residuo de cisteina construido mediante ingeniería genética o el análogo del mismo no interfiere con una función efectora conferida por el Fe. Más preferentemente, la alteración no interfiere con la capacidad del dominio Fe para ligarse a receptores Fe (por ejemplo Fe ?RI, Fe ? RII o Fe ? RUI) o proteínas del complemento (por ejemplo, Clq) , o para activar la función efectora inmune (por ejemplo, citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) , fagocitosis, o citotoxicidad dependiente del complemento (CDCC)) .En realizaciones preferidas, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención comprenden un dominio Fe que comprende al menos un residuo construido de cisteína libre o un análogo del mismo que está sustancialmente libre de enlaces de disulfuro con un segundo residuo de cisteína. Cualquiera de los residuos de cisteína construidos precedentes o los análogos de los mismos pueden ser conjugados subsecuentemente con un dominio funcional utilizando técnicas conocidas por el arte (por ejemplo, conjugadas con un grupo de enlace heterobifuncional reactivo con tiol) .
En una forma de realización, la molécula de nucleasa híbrida de la invención puede comprender un dominio Fe fusionado genéticamente que tiene dos o más de sus dominios Fe constituyentes seleccionados independientemente de los dominios Fe descritos en ésta. En una forma de realización, los dominios Fe son los mismos. En otra forma de realización, al menos dos de los dominios Fe son diferentes. Por ejemplo, los dominios Fe de las moléculas de nucleasa híbridas de la invención comprenden el mismo número de residuos de aminoácidos o pueden diferir en longitud en uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, en aproximadamente 5 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2 , 3, 4, ó 5 residuos de aminoácidos), aproximadamente 10 residuos, aproximadamente 15 residuos, aproximadamente 20 residuos, aproximadamente 30 residuos, aproximadamente 40 residuos, o aproximadamente 50 residuos) . En aún otras formas de realización, los dominios Fe de las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden diferir en la secuencia en una o más posiciones de aminoácidos. Por ejemplo, al menos dos de los dominios Fe pueden diferir en aproximadamente 5 posiciones de aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 posiciones de aminoácidos), aproximadamente 10 posiciones, aproximadamente 15 posiciones, aproximadamente 20 posiciones, aproximadamente 30 posiciones, aproximadamente 40 posiciones o aproximadamente 50 posiciones) .
Dominios de conector.
En algunas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio de conector. En algunas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida incluye una pluralidad de dominios de conector. En algunas formas de realización, el dominio de conector es un conector de polipéptido. En ciertos aspectos, es conveniente emplear un conector de polipéptido a fin de fusionar uno o más dominios Fe a uno o más dominios de nucleasa a fin de formar una molécula de nucleasa híbrida.
En una forma de realización, el conector de polipéptido es sintético. De acuerdo con la presente solicitud, el término "sintético" con respecto a un conector de polipéptido incluye péptidos (o polipéptidos ) que comprenden una secuencia de aminoácidos (que puede ser natural o no natural) que está ligada en una secuencia lineal de aminoácidos, a una secuencia (que puede ser natural o no natural) (por ejemplo, una secuencia de dominio Fe) a la cual no está naturalmente ligada en la naturaleza. Por ejemplo, el conector de polipéptido puede comprender polipéptidos no naturales que son formas modificadas de polipéptidos naturales (por ejemplo, que comprenden una mutación tal como una adición, una sustitución o eliminación) o que comprenden una primera secuencia de aminoácidos (que puede ser natural o no natural) . Los conectores de polipéptido de la invención pueden emplearse, por ejemplo, para garantizar la yuxtaposición de los dominios Fe de modo de asegurar el apropiado pliegue y la formación de un dominio Fe funcional. Preferentemente, un conector de polipéptido compatible con la presente invención será relativamente no inmunógeno, y no ¦ inhibirá ninguna asociación no covalente entre subunidades de monómero de una proteina de unión.
En ciertas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención emplean un conector de polipéptido a fin de unir cualesquiera dos o más dominios en marco en una sola cadena de polipéptido. En una forma de realización, los dos o más dominios pueden seleccionarse de manera independiente de cualquiera de los dominios Fe o dominios de nucleasa descriptos en la presente solicitud. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, un conector de polipéptido puede usarse para fusionar dominios Fe idénticos, a fin de formar una región Fe homómera. En otras formas de realización, puede usarse un conector de polipéptido a fin de fusionar diferentes dominios Fe (por ejemplo, un dominio Fe de tipo silvestre y una variante de dominio Fe) , de modo de formar una región Fe heterómera. En otras formas de realización, un conector de polipéptido de la invención puede usarse para fusionar genéticamente el término C de un primer dominio Fe (por ejemplo, un dominio bisagra o una de sus porciones, un dominio CH2 o una de sus porciones, un dominio completo CH3 o una de sus porciones, una porción de unión de FcRn, una porción de unión de FcDR, una porción de unión de complemento, o una de sus porciones), al término N de un segundo dominio Fe (por ejemplo, un dominio completo Fe) .
En una forma de realización, un conector de polipéptido comprende una porción de un dominio Fe. Por ejemplo, en una forma de realización, un conector de polipéptido puede comprender un dominio bisagra de inmunoglobulina de un anticuerpo IgGl, IgG2, IgG3, y/o IgG4. En otra forma de realización, un conector de polipéptido puede comprender un dominio CH2 de un anticuerpo IgGl, IgG2, IgG3, y/o IgG4. En otras formas de realización, un conector de polipeptido puede comprender un dominio CH3 de un anticuerpo IgGl, IgG2, IgG3, y/o IgG4. También pueden usarse otras porciones de una inmunoglobulina (por ejemplo, una inmunoglobulina humana) . Por ejemplo, un conector de polipéptido puede comprender un dominio CH1 o una de sus porciones, un dominio CL o una de sus porciones, un dominio VH (variable pesada, conforme a su sigla en inglés) o una de sus porciones, o un dominio VL (variable liviana, conforme a su sigla en inglés) o una de sus porciones. Dichas porciones pueden derivar de cualquier inmunoglobulina, que incluye, por ejemplo, un anticuerpo IgGl, IgG2, IgG3, y/o IgG4.
En formas de realización ejemplares, un conector de polipéptido puede comprender por lo menos una porción de una región bisagra de inmunoglobulina. En una forma de realización, un conector de polipéptido comprende un dominio bisagra superior (por ejemplo, un dominio bisagra superior IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4) . En otra forma de realización, un conector de polipéptido comprende un dominio bisagra medio (por ejemplo, un dominio bisagra medio IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4) . En otra forma de realización, un conector de polipéptido comprende un dominio bisagra inferior (por ejemplo, un dominio bisagra inferior IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4) .
En otras formas de realización, pueden construirse conectores de polipéptido que combinan elementos de bisagra derivados de los mismos o diferentes isotipos de anticuerpo. En una forma de realización, el conector de polipéptido comprende una bisagra quimérica que comprende por lo menos una porción de una región bisagra IgGl y por lo menos una porción de una región bisagra IgG2. En una forma de realización, el conector de polipéptido comprende una bisagra quimérica que comprende por lo menos una porción de una región bisagra IgGl y por lo menos una porción de una región bisagra IgG3. En otra forma de realización, un conector de polipéptido una bisagra quimérica que comprende por lo menos una porción de una región bisagra IgGl y por lo menos una porción de una región bisagra IgG4. En una forma de realización, el conector de polipéptido comprende una bisagra quimérica que comprende por lo menos una porción de una región bisagra IgG2 y por lo menos una porción de una región bisagra IgG3. En una forma de realización, el conector de polipéptido comprende una bisagra quimérica que comprende por lo menos una porción de una región bisagra IgG2 y por lo menos una porción de una región bisagra IgG4. En una forma de realización, el conector de polipéptido comprende una bisagra quimérica que comprende por lo menos una porción de una región bisagra IgGl, por lo menos una porción de una región bisagra IgG2 y por lo menos una porción de una región bisagra IgG . En otra forma de realización, un conector de polipéptido puede comprender una bisagra superior y media IgGl y un solo motivo de repetición de bisagra media IgG3. En otra forma de realización, un conector de polipéptido puede comprender una bisagra superior IgG4, una bisagra media IgGl y una bisagra inferior IgG2.
En otra forma de realización, un conector de polipéptido comprende o consiste en un conector de gly-ser. De acuerdo con la presente solicitud, el término "conector de gly-ser" se refiere a un péptido que consiste en residuos glicina y serina. Un ejemplo de conector de gly/ser comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula (Gly4Ser)n, donde n es un número entero positivo (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5) . Un conector preferido de gly/ser es (Gly4Ser)4. Otro conector preferido de gly/ser es (Gly4Ser)3. Otro conector preferido de gly/ser es (Gly4Ser)5. En ciertas formas de realización, el conector de gly-ser puede insertarse entre dos secuencias adicionales del conector de polipéptido (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de conector de polipéptido que se describen en esta solicitud) . En otras formas de realización, un conector de gly-ser está unido en uno o ambos extremos de otra secuencia del conector de polipéptido (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de conector de polipéptido que se describen en esta solicitud) . Aun en otras formas de realización, dos o más conectores de gly-ser están incorporados en serie en un conector de polipéptido. En una forma de realización, un conector de polipéptido de la invención comprende por lo menos una porción de una región de bisagra superior (por ejemplo, derivada de una molécula de IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4), por lo menos una porción de una región de bisagra media (por ejemplo, derivada de una molécula de IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4) y una serie de residuos de aminoácidos gly/ser (por ejemplo, un conector gly/ser tal como (Gly4Ser)n) .
En una forma de realización, un conector de polipéptido de la invención comprende un dominio de región bisagra de inmunoglobulina no natural, por ejemplo, un dominio de región bisagra que no se encuentra naturalmente en el polipéptido que comprende el dominio de región bisagra, y/o un dominio de región bisagra que ha sido alterado de manera tal que difiere en la secuencia de aminoácidos respecto de un dominio de región bisagra de inmunoglobulina natural. En una forma de realización, pueden efectuarse mutaciones a los dominios de región bisagra a fin de preparar un conector de polipéptido de la invención. En una forma de realización, un conector de polipéptido de la invención comprende un dominio bisagra que no comprende un número natural de cisteinas, es decir, el conector de polipéptido comprende menos cisteinas o una cantidad mayor de cisteinas en comparación con una molécula bisagra natural.
En otras formas de realización, un conector de polipéptido de la invención comprende una secuencia de péptido biológicamente relevante o una porción de secuencia de esta. Por ejemplo, una secuencia de péptido biológicamente relevante puede incluir, sin limitación, secuencias derivadas de un péptido antiinflamatorio o antirrechazo . Dichos péptidos antiinflamatorios o antirrechazo pueden seleccionarse del grupo que consiste en un péptido inhibidor de citoquina, un péptido inhibidor de la adhesión celular, un péptido inhibidor de la trombina, y un péptido inhibidor de plaquetas. En una forma de realización preferida, un conector de polipéptido comprende una secuencia de péptido seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de péptido antagonista o inhibidora de IL-1 ( interleuquina-1 ) , una secuencia de péptido mimética de eritropoyetina (EPO) , una secuencia de péptido mimética de trombopoyetina (TPO) , secuencia de péptido mimética de G-CSF (factor estimulante de colonia de granulocitos, conforme a sus siglas en inglés), una secuencia de péptido antagonista de TNF (factor de necrosis tumoral, conforme a sus siglas en inglés), una secuencia de péptido de unión de integrina, una secuencia de péptido antagonista de selectina, una secuencia de péptido antipatógena, una secuencia de péptido mimética del péptido intestinal vasoactivo (VIP, conforme a sus siglas en inglés) , una secuencia de péptido antagonista de calmodulina, un antagonista de mastocitos, una secuencia de péptido antagonista de SH3, una secuencia de péptido antagonista del receptor de uroquinasa (UKR, conforme a sus siglas en inglés) , una secuencia de péptido mimética de somatostatina o cortistatina y una secuencia de péptido de inhibición de células T y/o macrófagos. Ejemplos de secuencias de péptidos, cualquiera de las cuales puede emplearse como un conector de polipéptido, se revelan en la Patente Norteamericana Nro. 6.660.843, incorporada por referencia en la presente solicitud.
Se entenderá que las formas variantes de estos cónectores de polipéptido ejemplares pueden crearse mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótido que codifica un conector de polipéptido, de modo tal que se introducen una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en el conector de polipéptido. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones mediante técnicas convencionales, tales como la mutagénesis de sitio dirigido, y la mutagénesis mediada por PCR (reacción en cadena de la polimerasa, conforme a sus siglas en inglés) .
Los cónectores de polipéptido de la invención tienen por lo menos un aminoácido de longitud, y pueden tener diversas longitudes. En una forma de realización, un conector de polipéptido de la invención tiene de alrededor de 1 a alrededor de 50 aminoácidos de longitud. Como se usa en este contexto, el término "alrededor de" indica +/- dos residuos de aminoácidos. Debido a que la longitud del conector debe ser un número entero positivo, la longitud de alrededor de 1 a alrededor de 50 aminoácidos de longitud significa una longitud de 1 a 48-52 aminoácidos de longitud. En otra forma de realización, un conector de polipéptido de la invención tiene de alrededor de 10-20 aminoácidos de longitud. En otra forma de realización, un conector de polipéptido de la invención tiene de alrededor de 15 a alrededor de 50 aminoácidos de longitud.
En otra forma de realización, un conector de polipéptido de la invención tiene de alrededor de 20 a alrededor de 45 aminoácidos de longitud. En otra forma de realización, un conector de polipéptido de la invención tiene de alrededor de 15 a alrededor de 25 aminoácidos de longitud. En otra forma de realización, un conector de polipéptido de la invención tiene de alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 , 57, 58, 59, 60, o más aminoácidos de longitud.
Los conectores de polipéptidos pueden introducirse en las secuencias de polipéptidos empleando técnicas conocidas en el arte. Las modificaciones pueden ser confirmadas por medio del análisis de secuencia de ADN. Puede usarse ADN plásmido para transformar células huéspedes para la producción estable de los polipéptidos producidos.
Dominios de nucleasa.
En ciertos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio de nucleasa. En consecuencia, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención habitualmente comprenden por lo menos un dominio de nucleasa y por lo menos un dominio Fe ligado. En ciertos aspectos, una molécula de nucleasa híbrida incluye una pluralidad de dominios de nucleasa.
En algunas formas de realización, un dominio de nucleasa es sustancialmente la totalidad de una DNasa o por lo menos un fragmento enzimáticamente activo de una DNasa. En algunas formas de realización, la DNasa es una DNasa secretada tipo I, preferentemente, una DNasa humana tal como DNasa 1. Ejemplos de dominios de DNasa 1 se exponen en SEC. ID. NROS. 48-53 y 102. Una DNasa 1 humana ejemplar se describe en UniProtKB entrada P24855 (SEC. ID. NROS.: 49 y 102). En algunas formas de realización, la DNasa es DNasa 1 y/o una enzima de tipo DNasa 1 (DNasaL) , 1-3. Un ejemplo de enzima de tipo DNasa 1 humana, 1-3, se describe en UniProtKB entrada Q13609 (SEC. ID. NROS . : 57 y 103) . En algunas formas de realización, la DNasa es TREX1 (exonucleasa 1 de reparación de cebado tres, conforme a su sigla en inglés) . Un ejemplo de TREX1 humana se describe en UniProtKB entrada Q9NSU2 (SEC. ID. NRO. : 104) . Preferentemente, la TREX1 humana es una TREX1 humana truncada C-terminal que carece de secuencias de direccionamiento nuclear intracelular, por ejemplo, una TREXl humana que carece de 72 aminoácidos C-terminales como se expone en SEC. ID. NRO.: 105.
En algunas formas de realización, un dominio de nucleasa es sustancialmente la totalidad de una RNasa, o por lo menos un fragmento enzimáticamente activo de una RNasa. En algunas formas de realización, la RNasa es una RNasa extracelular o secretora de la superfamilia de RNasa A, por ejemplo, RNasa A, preferentemente, una RNasa pancreática humana. Un ejemplo de RNasa humana se describe en UniProtKB entrada P07998 (SEC. ID. NROS. : 58 y 101) .
En una forma de realización, el dominio de nucleasa está funcionalmente ligado (por ejemplo, químicamente conjugado o genéticamente fusionado (por ejemplo, directamente o por medio de un conector de polipéptido) ) al término N de un dominio Fe. En otra forma de realización, el dominio de nucleasa está funcionalmente ligado (por ejemplo, químicamente conjugado o genéticamente fusionado (por ejemplo, directamente o por medio de un conector de polipéptido)) al término C de un dominio Fe. En otras formas de realización, un dominio de nucleasa está funcionalmente ligado (por ejemplo, químicamente conjugado o genéticamente fusionado (por ejemplo, directamente o por medio de un conector de polipéptido) ) mediante una cadena lateral de aminoácido de un dominio Fe. En ciertas formas de realización ejemplares, el dominio de nucleasa está fusionado a un dominio Fe por medio de un dominio bisagra de inmunoglobulina humana o una de sus porciones.
En ciertas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención comprenden dos o más dominios de nucleasa y por lo menos un dominio Fe. Por ejemplo, los dominios de nucleasa pueden estar funcionalmente ligados tanto al término N como al término C de un dominio Fe. En otras formas de realización ejemplares, los dominios de nucleasa pueden estar funcionalmente ligados tanto a los extremos N como C terminales de múltiples dominios Fe (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más dominios Fe) que están ligados entre sí en serie para formar una disposición en tándem de dominios Fe.
En otras formas de realización, dos o más dominios de nucleasa están ligados entre sí (por ejemplo, por medio de un conector de polipéptido) en serie, y la disposición en tándem de dominios de nucleasa está funcionalmente ligada (por ejemplo, químicamente conjugada o genéticamente fusionada (por ejemplo, directamente o por medio de un conector de polipéptido) ) al término C o al término N de un dominio Fe o una disposición en tándem de dominios Fe. En otras formas de realización, la disposición en tándem de dominios de nucleasa está funcionalmente ligada tanto al término C como al término N de un dominio Fe o una disposición en tándem de dominios Fe.
En otras formas de realización, uno o más dominios de nucleasa pueden ser insertados entre dos dominios Fe. Por ejemplo, uno o más dominios de nucleasa pueden formar la totalidad o parte de un conector de polipéptido de una molécula de nucleasa híbrida de la invención.
Las moléculas de nucleasa híbridas preferidas de la invención comprenden por lo menos un dominio de nucleasa (por ejemplo, RNasa o DNasa) , por lo menos un dominio de conector, y por lo menos un dominio Fe.
En ciertas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención tienen por lo menos un dominio de nucleasa específico para una molécula blanco que media un efecto biológico. En otra forma de realización, la unión de las moléculas de nucleasa híbridas de la invención a una molécula blanco (por ejemplo, ADN o ARN) logra la reducción o eliminación de la molécula blanco, por ejemplo, de una célula, un tejido o de la circulación.
En ciertas formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden comprender dos o más dominios de nucleasa. En una forma de realización, los dominios de nucleasa son idénticos, por ejemplo, RNasa y RNasa, o TREX1 y TREX1. En otra forma de realización, los dominios de nucleasa son diferentes, por ejemplo, DNasa y RNasa.
En otras formas de realización, las moléculas de nucleasa híbridas de la invención pueden ensamblarse entre sí o con otros polipéptidos, a fin de formar proteínas de unión que tienen dos o más polipéptidos ( "multímeros" ) , donde por lo menos un polipéptido del multímero es una molécula de nucleasa híbrida de la invención. Ejemplos de formas multimeras incluyen proteínas de unión alteradas dímeras, trímeras, tetrámeras y hexámeras, y similares. En una forma de realización, los polipéptidos del multímero son iguales (es decir, proteínas de unión alteradas homómeras, por ejemplo, homodímeros, homotetrámeros ) . En otra forma de realización, los polipéptidos del multímero son diferentes (por ejemplo, heterómeros) .
Métodos de preparación de moléculas de nucleasa híbridas .
Las moléculas de nucleasa híbridas de esta invención pueden prepararse, en gran parte, en células huéspedes transformadas usando técnicas de ADN recombinado. Para este fin, se prepara una molécula de ADN recombinado que codifica para el péptido. Los métodos de preparación de dichas moléculas de ADN son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, podrían extraerse del ADN las secuencias codificadoras para los péptidos, usando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de ADN podría sintetizarse empleando técnicas de síntesis química, tales como el método de fosforamidato . Además, podría utilizarse una combinación de estas técnicas.
La invención además incluye un vector capaz de expresar los péptidos en un huésped apropiado. El vector comprende la molécula de ADN que codifica para los péptidos funcionalmente ligada a secuencias de control de expresión apropiadas. Los métodos para llevar a cabo esta unión operativa o funcional, antes o después de la inserción de la molécula de ADN en el vector, son muy conocidos. Las secuencias de control de expresión incluyen promotores, activadores, mejoradores, operadores, dominios de nucleasa ribosómicos, señales de inicio, señales de detención, señales de casquete, señales de poliadenilación y otras señales involucradas en el control de la transcripción o traducción.
El vector resultante que tiene la molécula de ADN dentro se usa para la transformación de un huésped apropiado. Esta transformación puede llevarse a cabo empleando métodos bien conocidos en la técnica.
Puede usarse cualquiera de una gran cantidad de células huéspedes disponibles y bien conocidas, en la puesta en práctica de esta invención. La selección de un huésped particular depende de una cantidad de factores reconocidos en la técnica. Estos factores incluyen, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión seleccionado, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, el índice de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la bioseguridad y los costos. Un balance de estos factores debe contraponerse con el entendimiento de que no todos los huéspedes pueden ser igualmente eficaces para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estas pautas generales, los huéspedes microbianos útiles incluyen bacterias (tales como del género E. coli) , levaduras (tales como del género Saccharomyces) y otros hongos, insectos, plantas, células mamíferas (que incluyen humanas) en cultivo, u otros huéspedes conocidos en la técnica.
A continuación, el huésped transformado es cultivado y purificado. Las células huéspedes pueden cultivarse en condiciones de fermentación convencionales, de manera tal que sean expresados los compuestos deseados. Dichas condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Finalmente, los péptidos son purificados del cultivo por métodos bien conocidos en la técnica.
Los compuestos además pueden ser preparados por métodos de síntesis. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de síntesis de fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en el arte, e incluyen aquellas descriptas en las referencias de errifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds . ) ; Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. , 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl., 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; Patente Norteamericana Nro. 3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; y Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527. La síntesis de fase sólida es la técnica preferida de preparación de péptidos individuales, ya que es el método más eficaz desde el punto de vista de costo-beneficio, para la preparación de péptidos pequeños. Los compuestos que contienen péptidos derivados o que contienen grupos no péptidos pueden sintetizarse por medio de técnicas de química orgánica bien conocidas .
Otros métodos son aquellos de la síntesis y expresión de moléculas, que son generalmente conocidos en la técnica, para el experto en el arte.
Composiciones farmacéuticas y métodos de uso terapéuticos .
En ciertas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida se administra sola. En ciertas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida se administra antes de la administración de por lo menos un agente terapéutico adicional. En ciertas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida se administra de manera concurrente con la administración de por lo menos un agente terapéutico adicional. En ciertas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida se administra después de la administración de por lo menos un agente terapéutico adicional. En otras formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida se administra antes de la administración de por lo menos un agente terapéutico adicional. Como apreciará el experto en la técnica, en algunas formas de realización, la molécula de nucleasa híbrida se combina con el otro agente o compuesto. En algunas formas de realización, la molécula de nucleasa híbrida y otro agente se administran en forma concurrente. En algunas formas de realización, la molécula de nucleasa híbrida y otro agente no se administran en forma simultánea, donde la molécula de nucleasa híbrida se administra antes o después de la administración del agente. En algunas formas de realización, el sujeto recibe tanto la molécula de nucleasa híbrida como el otro agente durante un mismo período de prevención, aparición de un trastorno y/o período de tratamiento.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse en una terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. En ciertas formas de realización, la terapia de combinación comprenden molécula de nucleasa, en combinación con por lo menos un agente adicional. Los agentes incluyen, sin limitación, composiciones químicas preparadas en forma sintética in vitro, anticuerpos, regiones de unión de antígeno, y sus combinaciones y conjugados. En ciertas formas de realización, un agente puede actuar como un agonista, antagonista, modulador alostérico o una toxina.
En ciertas formas de realización, la invención provee composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de nucleasa híbrida junto con un diluyente, portador, solubilizador , emulsionante, conservante y/o coadyuvante farmacéuticamente aceptable.
En ciertas formas de realización, la invención provee composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de nucleasa híbrida y una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional, junto con un diluyente, portador, solubilizador, emulsionante, conservante y/o coadyuvante farmacéuticamente aceptable.
En ciertas formas de realización, los materiales de formulación aceptables son preferentemente no tóxicos para los receptores, en las dosificaciones y las concentraciones empleadas. En algunas formas de realización, los materiales de la formulación son para la administración subcutánea (s. c.) y/o intravenosa (I. V.). En ciertas formas de realización, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para la modificación, el mantenimiento o la conservación, por ejemplo, del pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, el índice de disolución o liberación, la adsorción o penetración de la composición. En ciertas formas de realización, los materiales de formulación adecuados incluyen, sin limitación, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina) ; antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio, o hidrógeno-sulfito de sodio) ; reguladores del pH (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos) ; agentes de volumen (tales como manitol o glicina) ; agentes quelantes (tales como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) ) ; agentes formadores de complejos (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina) ; rellenos; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, ma osa o dextrinas) ; proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ) ; colorantes, agentes saborizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona) ; polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (tales como sodio) ; conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, fenetil alcohol, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido de hidrógeno) ; solventes (tales como glicerol, propilenglicol o polietilenglicol) ; alcoholes de azúcares (tales como manitol o sorbitol) ; agentes de suspensión; surfactantes o agentes humectantes (tales como Pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, Tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal) ; agentes mejoradores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol) ; agentes mejoradores de la tonicidad (tales como haluros metálicos alcalinos, preferentemente, cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol) ; vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o coadyuvantes farmacéuticos (Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995). En algunas formas de realización, la formulación comprende PBS; NaOAC, 20 mM, pH 5,2; NaCl, 50 mM; y/o NAOAC, 10 mM, pH 5,2, 9% sacarosa .
En ciertas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida y/o una molécula terapéutica está ligada a un vehículo de extensión de la semivida conocido en la técnica. Dichos vehículos incluyen, sin limitación, polietilenglicol, glicógeno (por ejemplo, la glicosilación de la molécula de nucleasa híbrida) y dextrano. Dichos vehículos se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Norteamericana Nro. 09/428.082, ahora, Pat. Norteam. Nro. 6.660.843, y la Solicitud PCT publicada Nro. WO 99/25044, que se incorporan por referencia para cualquier propósito.
En ciertas formas de realización, la composición farmacéutica óptima será determinada por el experto en la técnica de acuerdo con, por ejemplo, la vía propuesta de administración, el formato de liberación y la dosificación deseada. Ver, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, supra. En ciertas formas de realización, dichas composiciones pueden afectar el estado físico, la estabilidad, el índice de liberación in vivo y el índice de aclaramiento in vivo de los anticuerpos de la invención.
En ciertas formas de realización, el portador o vehículo primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, un portador o vehículo adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cerebroespinal artificial, posiblemente, suplementado con otros materiales comunes en composiciones para la administración parenteral. En algunas formas de realización, la solución salina comprende solución salina regulada con fosfato isotónica. En ciertas formas de realización, otros vehículos ejemplares son la solución salina regulada neutra o la solución salina mixta con albúmina sérica. En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas comprenden regulador Tris de un pH de aproximadamente 7,0-8,5, o regulador de acetato de un pH de aproximadamente 4,0-5,5, que además pueden incluir sorbitol o un sustituto adecuado. En ciertas formas de realización, una composición que comprende una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, puede prepararse para el almacenamiento mediante la mezcla de la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza, con agentes de formulación opcionales [Remington ' s Pharmaceutical Sciences, supra) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Asimismo, en ciertas formas de realización, una composición que comprende una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.
En ciertas formas de realización, la composición farmacéutica puede ser seleccionada para el suministro parenteral. En ciertas formas de realización, las composiciones pueden seleccionarse para la inhalación o para el suministro a través del aparato digestivo, tal como la via oral. La preparación de dichas composiciones farmacéuticamente aceptables se encuentra dentro de la capacidad del experto en la técnica.
En ciertas formas de realización, los componentes de la formulación se presentan en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En ciertas formas de realización, se usan reguladores a fin de mantener la composición a un pH fisiológico o a un pH levemente inferior, habitualmente, dentro de un rango de pH de alrededor de 5 a alrededor de 8.
En ciertas formas de realización, cuando se contempla la administración parenteral, una composición terapéutica puede presentarse en la forma de una solución acuosa libre de pirógeno, parenteralmente aceptable, que comprende una molécula de nucleasa híbrida deseada, con agentes terapéuticos adicionales o sin ellos, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas formas de realización, un vehículo para la inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, se formula como una solución isotónica estéril apropiadamente conservada. En ciertas formas de realización, la preparación puede involucrar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico, o ácido poliglicólico) , cuentas o liposomas, que pueden proporcionar la liberación controlada o sostenida del producto, que luego puede liberarse por medio de una inyección de liberación prolongada. En ciertas formas de realización, puede usarse además ácido hialurónico, que puede tener el efecto de favorecer la duración sostenida en la circulación. En ciertas formas de realización, pueden usarse dispositivos de liberación de fármacos implantables a fin de introducir la molécula deseada.
En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica puede formularse para la inhalación. En ciertas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, puede formularse como un polvo seco para la inhalación. En ciertas formas de realización, una solución para inhalación que comprende una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, puede formularse con un propulsor para el suministro en aerosol. En ciertas formas de realización, las soluciones pueden ser nebulizadas. La administración pulmonar se describe adicionalmente en la Solicitud PCT Nro. PCT/US94/001875, que describe la administración pulmonar de proteínas químicamente modificadas.
En ciertas formas de realización, se contempla la administración de las formulaciones por vía oral. En ciertas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, que se administra de esta forma puede formularse con aquellos portadores utilizados rutinariamente en la composición de formas farmacéuticas sólidas, tales como comprimidos y cápsulas, o sin dichos portadores. En ciertas formas de realización, puede diseñarse una cápsula a fin de liberar la porción activa de la formulación en el punto del tubo digestivo donde se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica . En ciertas formas de realización, puede incluirse por lo menos un agente adicional a fin de facilitar la absorción de una molécula de nucleasa híbrida y/o de cualquier agente terapéutico adicional. En ciertas formas de realización, pueden empleares además diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegradores de comprimidos y aglutinantes .
En ciertas formas de realización, una composición farmacéutica puede comprender una cantidad eficaz de una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la elaboración de comprimidos. En ciertas formas de realización, mediante la disolución de los comprimidos en agua estéril u otro vehículo apropiado, pueden prepararse soluciones en forma de dosis unitarias. En ciertas formas de realización, los excipientes adecuados incluyen, sin limitación, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa, o fosfato de calcio; agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina, o goma de acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
Composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para el experto en la técnica, e incluyen formulaciones que comprenden una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, en formulaciones de liberación sostenida o controlada. En ciertas formas de realización, los expertos en la técnica conocen además las técnicas para la formulación de una diversidad de otros medios de liberación sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, micropartículas bioerosionables, o cuentas porosas e inyecciones de liberación prolongada. Ver, por ejemplo, la Solicitud PCT Nro. PCT/US93/00829, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. En ciertas formas de realización, las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (Patente Norteamericana Nro. 3.773.919 y Patente EP 058.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Water. Res., 15: 167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), etilenvinil acetato (Langer et al., supra) o ácido poli-D (-) -3-hidroxibutirico (EP 133.988). En ciertas formas de realización, las composiciones de liberación sostenida además pueden incluir liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las referencias de Eppstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.
La composición farmacéutica por utilizar en la administración in vivo típicamente es estéril. En ciertas formas de realización, este tipo de composición puede lograrse mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. En ciertas formas de realización, cuando la composición es liofilizada, la esterilización usando este método puede conducirse antes o después de la liofilización y la reconstitución. En ciertas formas de realización, la composición para la administración parenteral puede ser almacenada en forma liofilizada o en una solución. En ciertas formas de realización, las composiciones parenterales, en general, se colocan en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede ser agujereado por una aguja de inyección hipodérmica.
En ciertas formas de realización, una vez que la composición farmacéutica ha sido formulada, puede ser almacenada en viales estériles como una solución, una suspensión, un gel, una emulsión, un sólido, o como un polvo deshidratado o liofilizado. En ciertas formas de realización, dichas formulaciones pueden almacenarse o bien en una forma lista para el uso, o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que es reconstituida antes de la administración.
En ciertas formas de realización, se proveen equipos para la producción de una unidad de administración de dosis única. En ciertas formas de realización, el equipo puede contener tanto un primer recipiente que tiene una proteina desecada, como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. En ciertas formas de realización, se incluyen equipos que contienen jeringuillas previamente llenadas de cámara única y múltiple, (por ejemplo, jeringuillas de liquido y liojeringuillas) .
En ciertas formas de realización, la cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, por emplear en forma terapéutica dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y de los objetivos. El experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento, de acuerdo con ciertas formas de realización, en consecuencia, variarán de acuerdo, en parte, con la molécula administrada, la indicación para la cual se usa una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este; la vía de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de órgano) y/o la condición física (la edad y salud general) del paciente. En ciertas formas de realización, el médico podrá valorar la dosificación, y modificar la vía de administración a fin de obtener el efecto terapéutico óptimo. En ciertas formas de realización, una dosificación típica puede variar de alrededor de 0,1 Dg/kg a alrededor de 100 mg/kg o más, de acuerdo con los factores mencionados anteriormente. En ciertas formas de realización, la dosificación puede variar de 0,1 Dg/kg a alrededor de 100 mg/kg; o 1 Dg/kg a alrededor de 100 mg/kg; o 5 Dg/kg a alrededor de 100 mg/kg.
En ciertas formas de realización, la frecuencia de la dosificación considerará los parámetros farmacocinéticos de una molécula de nucleasa híbrida ylo de cualquier agente terapéutico adicional utilizado en la formulación. En ciertas formas de realización, el médico administrará la composición hasta llegar a una dosificación que logre el efecto deseado. En ciertas formas de realización, la composición, por lo tanto, puede administrarse como una sola dosis, o como dos o más dosis (que pueden contener o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) en función del tiempo, o como una infusión continua mediante un catéter o un dispositivo de implantación. El refinamiento adicional de la dosificación apropiada es realizada rutinariamente por los expertos en la técnica, y se encuentra dentro del ámbito de las tareas realizadas en forma habitual por dichos expertos. En ciertas formas de realización, las dosificaciones apropiadas pueden ser evaluadas a través del uso de los datos apropiados de dosis y respuesta.
En ciertas formas de realización, la via de administración de la composición farmacéutica es aquella de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, la via oral, la inyección por las vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal) , intracerebroventricular, intramuscular, subcutánea, intraocular, intraarterial, intraportal, o intralesional; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. En ciertas formas de realización, las composiciones pueden administrarse mediante la inyección de bolo, o en forma continua mediante la infusión, o por medio de un dispositivo de implantación.
En ciertas formas de realización, la composición puede ser administrada localmente mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado que ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. En ciertas formas de realización, cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede ser implantado en cualquier órgano o tejido adecuado, y la liberación de la molécula deseada puede ser mediante la difusión, el bolo de liberación controlada o la administración continua.
En ciertas formas de realización, puede ser conveniente usar una composición farmacéutica que comprende una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, de una manera ex vivo. En dichos casos, las células, los tejidos y/u órganos que se han extraído del paciente se exponen a una composición farmacéutica que comprende una molécula de nucleasa híbrida, con por lo menos un agente terapéutico adicional o sin este, después de lo cual las células, los tejidos y/u órganos son posteriormente implantados nuevamente en el paciente.
En ciertas formas de realización, una molécula de nucleasa híbrida y/o cualquier agente terapéutico adicional puede administrarse mediante la implantación de ciertas células que han sido genéticamente diseñadas, usando métodos tales como aquellos que se describen en esta solicitud, de manera de expresar y secretar los polipéptidos . En ciertas formas de realización, dichas células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterologas o xenogeneicas . En ciertas formas de realización, las células pueden ser inmortalizadas. En ciertas formas de realización, a fin de disminuir la posibilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden ser encapsuladas de modo de evitar la infiltración de tejidos circundantes. En ciertas formas de realización, los materiales de encapsulación son típicamente membranas o receptáculos poliméricos biocompatibles , semipermeables, que permiten la liberación de los productos de proteína, si bien evitan la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente, o por otros factores nocivos, de los tejidos circundantes.
Las moléculas de nucleasa híbridas de la presente invención son particularmente eficaces en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios o respuestas inmunitarias anormales. En este sentido, se apreciará que las moléculas de nucleasa híbridas de la presente invención pueden usarse para el control, la supresión, la modulación, el tratamiento o la eliminación de respuestas inmunitarias indeseadas, tanto a antígenos externos como a autoantígenos . Aun en otras formas de realización, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para tratar trastornos inmunitarios que incluyen, sin limitación, diabetes sacarina insulinodependiente , esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmunitaria experimental, artritis reumatoide, artritis autoinmunitaria experimental, miastenia grave, tiroiditis, una forma experimental de uveorretinitis, tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, tirotoxicosis , anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmunitaria, enfermedad de Addison, menopausia prematura, infertilidad masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, penfigoide, oftalmía simpática, uveítis facogénica, anemia hemolítica autoinmunitaria, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa Hbs-ve, cirrosis criptógena, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, esclerodermia, ganulomatosis de Wegener, polimiositis, dermatomiositis , lupus eritematoso discoide, lupus eritematoso sistémico, o enfermedad del tejido conectivo.
Equipos .
Un equipo puede incluir una molécula de nucleasa híbrida revelada en la presente solicitud e instrucciones para el uso. Los equipos pueden comprender, en un recipiente adecuado, una molécula de nucleasa híbrida revelada en la presente solicitud, uno o más controles, y diversos reguladores, reactivos, enzimas y otros ingredientes convencionales bien conocidos en la técnica .
El recipiente puede incluir por lo menos un vial, un receptáculo, tubo de ensayo, un matraz, una botella, jeringuilla u otro medio de recipiente, en el cual puede colocarse una molécula de nucleasa híbrida, y en algunos casos, puede ser adecuadamente dividida en alícuotas. Cuando se provee un componente adicional, el equipo puede contener recipientes adicionales en los cuales puede colocarse este componente. Los equipos además pueden incluir un medio para la contención de la molécula de nucleasa híbrida y cualquier otro recipiente de reactivo bien cerrado para la venta comercial. Dichos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección o soplo, en los cuales se retienen los viales deseados. Los recipientes y/o equipos pueden incluir etiquetas con instrucciones para el uso y/o advertencias.
EJEMPLOS .
A continuación, se presentan ejemplos de formas de realización específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solo con propósitos ilustrativos, y no tienen la intención de limitar el alcance de la presente invención de manera alguna. Se han hecho esfuerzos por garantizar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), si bien, naturalmente, deben permitirse cierto error experimental y desviación.
La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de la química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinado y farmacología, dentro de la capacidad del arte. Dichas técnicas se explican por completo en la literatura. Ver, por ejemplo, las referencias de T. E. Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993) ; A. L. Lehninger, Biochemistry ( orth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da. Edición, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds . , Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición (Easton, Pennsylvania : ack Publishing Company, 1990) ; Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vol. A y B(1992).
Ejemplo 1. Enfoque general para generar moléculas de nucleasa híbridas Las moléculas de nucleasa híbridas fueron diseñadas para incorporar estructuras deseadas y actividad funcional de enzimas simples o estructuras multi-enzimas como cassettes modulares con sitios enzimáticos de restricción compatibles lanzadera e intercambio de dominios. La estructura esquemática de diferentes realizaciones de moléculas de nucleasa híbridas se ilustra en la Figura 1. Las secuencias de nucleótido y aminoácido de las moléculas de nucleasa híbridas representativas se muestran en la Tabla 1.
Se aislaron cADNs humanos a partir de ARN de páncreas humano (Ambion) o PBMC ARN humano de linfocitos de sangre periférica humana normal (aproximadamente 5xl0e6) usando los kits QIAgen RNAeasy (Valencia, CA) y QIAshredder para homogeneizar los lisatos celulares (Qiagen, Valencia, CA) . Se aislaron PB Cs humanos a partir de sangre humana heparinizada diluida en 1:1 en D-PBS y puesta en capas sobre gradientes de Ficoll con LSM Lymphocyte Separation Médium (Medio para Separación de Linfocitos) (MP Biomedicals, Irvine, CA) .
Se aisló ARN de bazo de ratón usando los kits QIAgen RNAeasy (Valencia, CA) de aproximadamente 5xl0e6 esplenocitos . Mediante centrifugación se formaron pellets con las células a partir del medio de cultivo, y se utilizaron 5xl0e6 células para preparar el ARN. Se aisló el ARN a partir de las células usando el kit QIAGEN RNAeasy (Valencia, Calif . ) kit de aislamiento ARN total y QIAGEN QIAshredder de acuerdo con las instrucciones del fabricante que acompañan al kit. Se utilizaron de uno a dos microgramos (1-2 µg) de ARN total como patrón para preparar el cADN mediante transcripción inversa. El ARN, 300 ng cebadores aleatorios y 500 ng Oligo dT (12-18) y 1 µ? 25 mM dNTPs se combinaron y desnaturalizaron a 80°C durante 5 minutos antes del agregado de la enzima. Se agregó la transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen, Life Technologies) al ARN más la mezcla de cebador en un volumen total de 25 µ? en presencia de un búfer de segunda hebra y se proporcionaron 0.1 M DTT con la enzima. Se dejó proseguir la reacción de transcripción inversa a 50°C durante una hora.
Se utilizaron entre 10-100ng cADN en reacciones de amplificación PCR usando cebadores específicos para el gen de nucleasa de interés (RNasaA, RNasal, DNasal, Trexl, DNasalL3, etc.) Para las reacciones iniciales de clonación, se diseñaron cebadores para aislar la longitud completa del cADN o productos de truncamiento que codifican el gen de interés. Se aislaron los fragmentos PCR de longitud completa o acortados mediante electroforesis en gel de agarosa, y se purificó usando columnas Qiagen QIAquick para remover los nucleótidos, cebadores y productos amplificados no deseados. Los fragmentos purificados se clonaron en vectores de clonación pCR2.1 TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformaron en bacterias competentes TOP10. Se tomaron las colonias aisladas en un medio de cultivo Luria que contenía 50 ug/ml carbenicilina, y se desarrollaron durante la noche para producir plásmidos aislados. Los clones TOPO se seleccionaron para insertos del tamaño correcto mediante digestión con la enzima de restricción EcoRI (NEB, Ipswich, MA) y electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos digeridos. El análisis de secuencia ADN de los clones positivos se realizó con la Mezcla de Reacción v 3.1 y se analizó usando un secuenciador ABI 3730 XL ADN. Una vez obtenidos los clones correctos, se diseñaron otras modificaciones de secuencia y se realizaron reacciones PCR para generar los alelos y cassettes de expresión deseados. Los productos de truncamiento y alelos fueron generados por mutagénesis PCR usando cebadores superpuestos para la introducción de mutaciones en posiciones específicas en los genes. Se sintetizaron enlazadores PCR de solapamiento usando cebadores de superposición interna y rondas sucesiva de PCR para anexar secuencias adicionales a cada término. Se agruparon las moléculas de nucleasa híbridas como una cadena de varios cassettes intercambiables. Las moléculas de la realización preferida contienen un péptido líder fijo, un cassette de nucleasa, un cassette opcional que codifica una elección de varios enlazadores diferentes de polipéptido, un cassette de dominio Fe de -Ig con un codón STOP o un enlazador en el extremo carboxilo del dominio CH3, y para las moléculas tipo resolvICase, un segundo cassette enlazador seguido por un segundo cassette de nucleasa. La Figura 1 ilustra la estructura del tipo de cassette de estas moléculas de nucleasa híbridas y los ejemplos de secuencias potenciales insertadas en cada posición. Una vez que se reunieron las moléculas de nucleasa híbridas, se transfirieron a un plásmido de expresión mamífero pDG adecuado para la expresión transitoria en COS7 u otras células y la expresión estable en células CHO DG44 usando la selección de DHFR con metotrexato.
Expresión transitoria de moléculas de nucleasa híbridas Se transfectaron transitoriamente células COS-7 con un vector de expresión pDG que contiene insertos del gen de la molécula de nucleasa híbrida. El día anterior a la transfección, se sembraron células a 4xl0e5 células por placa de 60 mm en 4 mi de DMEM (ThermoFisher/Mediatech cell gro) + 10% FBS medio de cultivo para tejido. Se suplemento el medio basal DMEM con 4,5 g/L glucosa, piruvato de sodio, L-glutamina 4 mM, y aminoácidos no esenciales. Se agregó suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT ThermoFisher Scientific) al medio hasta un 10% del volumen final. Se incubaron las células a 37°C, 5% C02 durante la noche y eran aproximadamente 40-80% confluentes el día de la transíección . El ADN plásmido se preparó usando los kits miniprep Qiagen (Valencia, CA) QIAprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyó en 50 ul EB de búfer. Las concentraciones de ADN se midieron usando un espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington DE) . Se transfectó el ADN plásmido usando un reactivo para transfección Polyfect (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando 2,5 ug ADN plásmido por placa de 60 mm y 15 ul del reactivo Polyfect en 150 ul de cócteles de transfección DMEM libres de suero. Después de la formación del complejo, se diluyeron las reacciones en 1 mi de un medio para crecimiento celular que contiene suero y todos los suplementos, y se agregó en forma de gotas a las placas que contienen 3 mi del medio de cultivo completo DMEM fresco. Las transíecciones transitorias se incubaron durante 48-72 horas antes de cosechar los sobrenadantes de cultivo para el análisis posterior.
Generación de transfectantes estables CHO DG44 que expresan las moléculas de nucleasa híbridas de interés La producción estable de moléculas de nucleasa híbridas se logró mediante la electroporación de una plásmido seleccionable, amplificable, pDG, que contiene cADN nucleasa-Ig bajo el control del promotor CMV, en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) . El vector pDG es una versión modificada de pcADN3 que codifica el marcador seleccionable DHFR con un promotor atenuado para mejorar la presión de selección para el plásmido. Se preparó el ADN plásmido usando los kits Qiagen maxiprep y el plásmido purificado se linearizó en un sitio AscI único antes de la extracción de fenol y precipitación de etanol. Se agregó ADN de esperma de salmón (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) como ADN transportador, y 100 µg cada uno de plásmido y ADN transportador se utilizaron para transfectar 107 CHO DG44 células mediante electroporación . Se desarrollaron las células hasta la fase logarítmica en un medio Excell 302 (JRH Biosciences) que contiene glutamina (4 mM) , piruvato, insulina recombinante, penicilina-estreptomicina, y aminoácidos no esenciales 2xDME (todos de Life Technologies, Gaithersburg, Md.), de aquí en más referidos como medio "Excell 302 completo". El medio para las células transfectadas también contenía HT (diluido de una solución lOOx de hipoxantina y timidina) ( Invitrogen/Life Technologies). Los medios para transfecciones bajo selección contenía variados niveles de metotrexato (Sigma-Aldrich) como agente selectivo, comprendidos entre un rango de 50 nM a 1 µ?. Las electroporaciones se realizaron a 280 voltios, 950 microFarads. Se dejaron recuperar las células transfectadas durante la noche en un medio no selectivo antes de la colocación selectiva en placas de 96 pocilios de base plana (Costar) en diluciones seriadas variadas comprendidas en un rango entre 125 células/pocilio a 2000 células/pocilio. El medio de cultivo para la clonación celular era Excell 302 completo, que contenía 50 nM de metotrexato. Una vez que el crecimiento clonal fue suficiente, se tamizaron diluciones seriadas de sobrenadantes de cultivo de los pocilios Master para la expresión de moléculas de nucleasa híbridas mediante el uso de un -IgG sandwich ELISA. Brevemente, se recubrieron placas NUNC immulon II durante la noche a 4°C con 7,5 microgramos/ml de IgG cabra-anti-ratón F(ab'2) (KPL Labs, Gaithersburg, MD) o 2 ug/ml IgG anti-humano o cabra-anti-ratón (Jackson Immunoresearch, West Grove PA) en PBS . Se bloquearon las placas en PBS/2-3% BSA, y se incubaron diluciones seriadas de sobrenadantes de cultivo a temperatura ambiente durante 2-3 horas. Se lavaron las placas tres veces en PBS/0,05 % Tween 20, y se incubó con peroxidasa de rábano picante conjugada EgG2a anti-ratón F(ab'2)cabra (Southern Biotechnologies ) y cabra- IgG anti-ratón (KPL) mezclados juntos, cada uno a 1:3500 en PBS/1,0% BSA, o en peroxidasa de rábano picante conjugado con F(ab')2 cabra- IgGl anti-humano (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) a 1:2500 durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas cuatro veces en PBS/0.05% Tween 20, y se detectó enlace con SureBlue Reserve, sustrato TMB (KPL Labs, Gaithersburg, MD) . Se detuvieron las reacciones mediante el agregado de igual volumen de 1N HC1, y se leyeron las placas a 450nM en una lectora de placa Spectramax Pro (Microdevices, Sunnyvale CA) . Los clones con la producción mayor de moléculas de nucleasa híbrida se expandieron en recipientes T25 y T75 para proporcionar las cantidades adecuadas de células para congelar la proteína de fusión y producirla a gran escala. Luego se aumentaron los niveles de producción. Los niveles de producción luego fueron aumentados en cultivos de los cuatro mejores clones mediante amplificación progresiva en un medio de cultivo que contiene metotrexato. En cada pasaje sucesivo de células, el medio Excell 302 completo contenía una concentración aumentada de metotrexato, de manera que sobrevivan sólo las células que amplificaron el plásmido DHFR.
Se recolectaron los sobrenadantes de las células CHO que expresan la molécula de nucleasa híbrida, se filtraron a través de filtros 0,2 µta PES express (Nalgene, Rochester, N.Y.) y se pasaron por una columna Proteína A-agarosa (IPA 300 agarosa reticulada) (Repligen, Needham, Mass.) . La columna se lavó con un búfer de lavado para columna (90m Tris-Base, 150mM NaCl, 0,05% azida de sodio, pH 8.7) , y se eluyó la proteina ligada usando un búfer de citrato 0.1 M, pH 3.0. Se recolectaron las fracciones y se determinó la concentración de proteina a 280nM usando un espectrofotómetro de micromuestra Nanodrop (Wilmington DE) , y la determinación del blanco usando un búfer de citrato 0.1 M, pH 3.0. Las fracciones que contenían las moléculas de nucleasa híbridas se agruparon y se realizó el intercambio de búfer mediante giros seriados en PBS usando concentradores Centricon seguido por la filtración a través de dispositivos de filtrado 0,2 µ?? para reducir la posibilidad de contaminación por endotoxina.
Ejemplo 2: Construcción de genes de fusión RNasa-Ig.
Se amplificó RNasa 1 murina como cADN de longitud completa a partir de una biblioteca EST (de Dr. C. Raine, Albert Einstein School of Medicine, Bronx, NY) quien envió el clon a nuestro laboratorio sin un MTA. Los cebadores específicos de secuencia 5' y 3' utilizados eran de las secuencias publicadas. La secuencia del clon fue verificada mediante el análisis de secuenciación . El número de acceso Genebank es NCBI geneID 19752. Se aisló RNasa 1 humana de longitud completa cADN cebado con oligo dT derivado de ARN total de páncreas humano (Ambion/Applied Biosystems, Austin, TX) .
Una vez aislado el clon de longitud completa, se designaron los cebadores para crear un gen de fusión con los dominios Fe de IgG2a ratón o IgGl humano (NR ID DE SEC: 40) . Se designaron dos cebadores diferentes para la secuencia 5' fusionada en el término amino de la cola Fe; el primero incorporó el péptido líder nativo de RNasa de ratón (o humano) , mientras que el segundo anexó un sitio Agel al término amino de RNasa en el sitio de clivaje del péptido de señal predicho para poder fusionar la RNasa al péptido líder VKIII que ya habíamos clonado y utilizado para otros estudios de expresión. Para la RNasa murina, la secuencia del primer cebador es: mribNL5' 30mer (RNasa 5' con líder nativo y HindIII+Kozak) gTT AAg CTT gCC ACC ATg ggT CTg gAg AAg TCC CTC ATT CTg-3' (NR ID DE SEC: 1) El segundo cebador crea una unión por fusión génica entre la secuencia líder existente y la secuencia madura en el extremo 5' de la RNasa, en o cerca del sitio de clivaje del péptido líder predicho. 27mer (RNasa 5' secuencia madura (sin líder, con sitio Agel) 5'-gAT ACC ACC ggT Agg gAA TCT gCA gCA CAg AAg TTT CAg-3' (SEC ID NR: 2) La secuencia del cebador 3' para la fusión con IgG2a murino en el extremo carboxi de RNasa y el término amino de la cola Fe es la siguiente: mrib3NH2 28mer (RNasa extremo 3' con sitio Xhol para fusión con mIgG2a) . 5'-ggC TCg AgC ACA gTA gCA TCA AAg tGG ACT ggT ACg TAg g-3' (NR ID DE SEC: 3) Se designaron dos oligos más para crear un gen de fusión - Ig-RNasa, donde la cola -IG es un amino terminal con respecto al dominio enzimático RNasa. mrib5X 36mer RNasa extremo 5' con enlazador aa y sitio Xbal para la fusión con extremo carboxi del dominio Fe. 5' -AAA TCT AgA CCT CAA CCA ggT Agg gAA TCT gCA gCA CAg AAg TTT CAg-3' (NR ID DE SEC:4) mrib3X 31mer RNasa extremo 3' con dos codones stop y sitio Xbal para la fusión con el extremo carboxi del dominio Fe. 5' -TCT AgA CTA TCA CAC AgT AgC ATC AAA gTg gAC Tgg TAC gTA g-3' (NR ID DE SEC: 5) Ejemplo 3: Aislamiento de dominios Fe- humanos y ratón e introducción de mutaciones dentro de la secuencia codifican e .
Para el aislamiento de los dominios Fe - ratones y humanos (SEC ID NR:40), se derivó ARN de tejido de ratón o humano de la siguiente manera. Se generó una sola suspensión celular de bazo de ratón en un medio de cultivo RPMI . Alternativamente, se aislaron PBMCs humano de sangre completa fresca usando el Medio de Separación de Linfocitos (LSM) Organon Teknika (Durham, NC) , se cosecharon las capas leucocitarias de acuerdo con las indicaciones del fabricante y se lavaron tres veces las células en PBS antes de utilizarlas. Se formaron pellets con las células mediante centrifugación a partir del medio de cultivo y se utilizaron células 2xl07 para preparar el ARN. Se asiló el ARN de las células usando el kit para aislamiento ARN total QIAGEN RNAeasy (Valencia, Calif . ) y las columnas QIAGEN QIAshredder de acuerdo con las instrucciones del fabricante incluidas en los kits. Se utilizó un microgramo (4 g) de ARN total como patrón para preparar cADN mediante transcripción inversa. El ARN, 300 ng de cebadores aleatorios y, 500 ng Oligo dT (12-18), y 1 µ? 25 mM dNTPs fueron combinados y desnaturalizados a 80°C durante 5 minutos antes del agregado de la enzima. Se agregó la transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen, Life Technologies) al ARN más la mezcla de cebador en un volumen total de 25 µ? en presencia de un búfer de segunda hebra y se proveyó 0,1 M DTT con la enzima. Se dejó proseguir la reacción de transcripción inversa a 50°C durante una hora. Se purificó el cADN usando columnas de purificación PCR QIAquick (QIAGEN) de acuerdo con las indicaciones del fabricante, y se eluyó en 40 microlitros del búfer EB antes de utilizar en las reacciones PCR.
Se aislaron los dominios Fe - ratón y humano tipo silvestre mediante amplificación PCR usando como patrón el cADN descripto anteriormente. Se utilizaron los siguientes cebadores para la amplificación inicial de las secuencias del tipo silvestre, pero se incorporaron los cambios de mutación deseados en el dominio bisagra (hinge) : mahIgGlCH2 : 47 mer 5 ' -tgtccaccgtgtccagcacctgaactcctgggtggatcgtcagtcttcc-3 ' (SEC ID NR: 6) hIgGl-5scc: 49 mer 5' -agatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgtccaccgtgt-3' (SEC ID NR:7) mahIgGIS: 51 mer 5' -tctagattatcatttacccggagacagagagaggctcttctgcgtgtagtg-3' (SEC ID NR:8) muIgG2aCH2: 58mer 5' -cctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggatcatccgtcttcatcttcc-3' (SEC ID NR: 9) mIgG2a-5scc: 47mer 5' -gaagatctcgagcccagaggtcccacaatcaagccctctcctcca-3' (SEC ID NR: 10) mIgG2a3S: 48mer 5' -gtttctagattatcatttacccggagtccgagagaagctcttagtcgt-3' (SEC ID NR:11) Se realizaron las reacciones PCR usando un termociclador C1000 (BioRad, Hercules CA) o un termociclador Eppendorf (ThermoFisher Scientific, Houston TX) . Las reacciones incluyeron un paso de desnaturalización inicial a 95°C durante 2 minutos, seguido por 34 ciclos con una desnaturalización a 94°C, 30 segundos, hibridación 50°C, 30 segundos, y 72°C, paso de extensión de 1 minuto, seguido por una extensión final de 4 minutos a 72°C. Una vez aisladas las colas, se clonaron los fragmentos utilizado TOP en vectores pCR2.1, se preparó el ADN usando los kits QIAGEN Spin Plasmid miniprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenciaron los clones usando las reacciones de secuenciación ABI Dye Terminator v3.1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
Se utilizó el ADN de los clones correctos como patrones en PCRs por extensión de superposición para introducir mutaciones en las posiciones deseadas en la secuencia de codificación para ratón IgG2a o humano -IgGl. Se configuraron las reacciones PCR usando clones del tipo silvestre de longitud completa como patrón (1 microlitro) , 50 pmol cebadores 5' y 3' para cada porción PCR del dominio -FC hasta e incluyendo el sitio de mutación deseada para cada dirección, y PCR hi fidelity Supermix (Invitrogen, Carlsbad CA) , en volúmenes de reacción de 50 microlitros usando un ciclo corto de amplificación. Como ejemplo de la mutagénesis de PCR de solapamiento, la combinación del cebador utilizada para introducir la mutación P331S en humano -IgGl, fue la siguiente: Un subfragmento 5' se amplificó usando el clon del tipo silvestre de longitud completa como patrón, y el cebador 5' era hIgGl-5scc: 5'- agatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgtccaccgtgt-3 ' (SEC ID NR: 12), mientras que el cebador 3' era P331AS: 5'-gttttctcgatggaggctgggagggctttgttggagacc-3' (SEC ID NR:1 3) . Subfragmentos 3' se amplificaron usando el clon del tipo silvestre de longitud completa como patrón y el cebador 5' era P331S : 5' aaggtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaacaatctcc-3 ' (SEC ID NR: 14), mientras que el cebador 3' era mahIgGIS: 5'-tctagattatcatttacccggagacagagagaggctcttctgcgtgtagtg-3' (SEC ID NR: 15) .
Una vez amplificados los subfragmentos y aislados mediante electroforesis en gel de agarosa, fueron purificados mediante columnas de purificación Qiaquick gel y eluídos en 30 microlitros del búfer EB de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se realizaron dos rondas de PCR con los dos subfragmentos como patrones en superposición en reacciones nuevas. Se pausó el ciclador y se agregaron los cebadores flanqueadores 5' (hIgGl-5scc, véase arriba) and 3' (mahIgGIS, véase arriba) a las reacciones (50 pmol cada una) . Luego se llevaron a cabo las amplificaciones PCR durante 34 ciclos en las condiciones descriptas para las moléculas del tipo silvestre anteriormente. Los fragmentos de longitud completa se aislaron mediante electroforesis en gel, y se clonaron con TOPO en vectores pCR2.1 para el análisis de secuencia. Los fragmentos de los clones con la secuencia correcta luego se subclonaron en vectores de expresión para la creación de diferentes moléculas de nucleasa híbridas descriptas aquí.
Ejemplo 4: Plantif cación de la proteina RSLV-124 y actividad de la enzima RNasa en sueros de ratón.
Análisis de estabilidad en ratón In vivo del constructo RSLV-124 (SEC ID NR: 106) Se inyectaron cuatro ratones (C220, C221, C222, C223) por la vía intravenosa con una inyección única de RSLV-124 en el tiempo cero. Varias veces luego de la inyección, se recolectaron muestras de sangre y se analizaron según la presencia de la proteina RSLV-124 (una RNasa humana del tipo silvestre ligada a un dominio Fe de IgGl humano tipo silvestre (SEC ID NR: 106) ) y la actividad enzimática de la RNasa. Para detectar el compuesto RSLV-124 en suero de ratón, se desarrolló ELISA con capturas de Fe humano del suero de ratón seguido por la detección de la RNasa humana. Cuando se corrió el ELISA en las muestras de sangre de los cuatro ratones se detectó la presencia de la proteina RSLV-124 a los cinco minutos luego de una inyección intravenosa única de 150 ug, a entre 38pg/ml y ·55µg/ml (Figura 2) . Un día después de la inyección, la concentración de RSLV-124 cayó rápidamente a entre 8pg/ml y 12pg/ml. La concentración en sangre del fármaco permaneció relativamente estable durante la duración del análisis hasta los siete dias cuando los niveles en sangre del fármaco eran de aproximadamente 5pg/ml. Las mismas muestras de sangre utilizadas para medir la proteína RSLV-124 mediante ELISA se utilizaron para cuantificar la actividad enzimática de RNasa del fármaco. Se utilizó el sistema RNasaAlert QC de Ambion (Cat # AM1966) para medir la cinética enzimática de la proteína RSLV-124 en muestras de sangre de ratón con algunas modificaciones. El compuesto del fármaco fue capturado de suero de ratón en una placa para ensayo RNasaAlert usando un anticuerpo monoclonal anti-Fc humano y se cuantificó mediante la medición de fluorescencia mediante las instrucciones del kit Ambion. El análisis de las unidades fluorescentes relativas (RFU) de la molécula RSLV-124 mostraron entre 80.000 - 140.000 RFUs cinco minutos después de la inyección (Figura 3) . Las RFUs declinaron rápidamente en paralelo con la concentración de proteína, permaneciendo relativamente estables a entre 18.000 -40.000 RFUs hasta el séptimo día. Se utilizó el sistema RNasaAlert QC para desarrollar una curva estándar usando las cantidades conocidas de proteina, esta curva estándar de RFUs de RSLV-124 en las muestras de sangre se utilizó para extrapolar la concentración de proteina de RSLV-124. De este análisis se determinó que la concentración de proteina presente en la muestra de sangre durante el experimento de siete dias calculado usando el ensayo de actividad enzimática RNasa era muy similar a los valores medidos usando ELISA (Figura 4). De estos experimentos, se concluyó que el compuesto RSLV-124 es estable en la circulación en ratón in vivo durante los siete dias y retiene su actividad enzimática, sugiriendo que el compuesto no es susceptible a degradación in vivo en el ratón ya que casi el 100% de la actividad enzimática fue retenida durante los siete dias en la circulación del ratón: Como las proteínas de fusión Fe a menudo son susceptibles a la degradación en la circulación, este hallazgo además confirma el uso de las proteínas de fusión RNasa-Fc como fármacos valiosos.
E emplo 5 : Fenotipo de TLR7. lxRNasaA en ratones doble transgénicos Se crearon ratones que sobreexpresan RNasaA (RNasa Tg) . Esta nucleasa se expresa en niveles elevados en RNasa Tg en ratones. Hemos desarrollado ambos: un método de difusión radial simple (SRED) (Figura 5 y un ELISA mucho más cuantitativo para cuantificar RNasa en el suero (Figura 6) . Ambos ensayos muestran un aumento significativo en la actividad de RNasa en RNasa Tg. La cuantificación del nivel de RNasa en la Figura 6 comparada con ratones tipo B6 del tipo Silvestre demostró que existe un aumento de aproximadamente diez veces en RNasa en RNasa Tg. Cruzamos RNasaA Tg con TLR7.1 Tg en ratones para crear ratones doble Tg (DTg) . TLR7.1 con 8-16 copias de TLR7 .y que desarrollen una enfermedad tipo lupus muy agresiva, que progresa rápidamente y comienzan a morir a los 3 meses de edad con una supervivencia media de 6 meses. En un análisis preliminar, desangramos los ratones DTg y se realizaron controles de las crias normales a los 3 meses de edad para ver si los ratones DTg exhibían signos de mejora. Como se muestra en la Fig. 5, los ratones DTg tenían niveles muy elevados de RNasa en su suero (equivalente a >13 U/ml RNasa en base a nuestro estándar con actividad específica de 993 U/mg) . La concentración RNasaA en ratones Tg y DTg también se midió mediante ELISA como se muestra en la Fig. 6. Los ratones RNasa A Tg y TLR7. lXRNasaA Dtg tenían concentraciones en suero de RNasa A entre 1-2 ng/ml.
Método detallado para ELISA RNasa A 1. Recubrir la placa con anti-RNasaA Abcam Ab(ab6610) : 2.5- 10ug/ml O/N en 4C. 2. Lavar la placa tres veces con 0,05% Tween/lXPBS 3. Bloquear con 1%BSA en PBS durante al menos una hora 4. Lavar la placa 3 veces con 0,05% Tween/lXPBS 5. Cargar las muestras. Diluciones de muestra a 1:50 6. Incubar temp. amb. durante 2 horas 7. Lavar la placa 3 veces con 0,05% Tween/lXPBS 8. Preparar dilución de Anti RNasa Ab marcada con biotina a una dilución de 1:4500 (2.2ug/ml) . Dejar a temp. amb. durante 1 hora (Rockland 200-4688: 10mg/ml) . 9. Lavar la placa 3 veces 10. Diluir StrepAV HRP (Biolegend 405210) 1:2500. Cubrir con papel de aluminio y dejar a temp. amb. durante 25-30 min . 11. Lavar 6 veces, dejar asentar el liquido en pocilios durante al menos 30 segundos entre los lavados. 12. Agregar el sustrato BD OptEIA A+B 1:1. Esperar hasta los cambios de color, 5-10 min máx. No dejar que el estándar de pocilio superior sobrepase 1.0. Agregar 80 ul . (CatNos: 51-2606KC;ReagentA, 51-2607KC; ReagentB) 13. Agregar 40ul de ácido sulfúrico 1M para detener la reacción .
Información del Producto/Reactivo: RNasaA Ab: ab6610 (90 mg/ml) Búfer ELISA: 1%BSA en PBS Búfer para lavado ELISA: 0,05% Tween/IXPBS Ab conjugado con biotina Anti RNasaA: Rockland: 200-4688 (10mg/ml) Strep AV HRP: Biolegend 405210 Reactivo BD OptEIA A y B: 51-2606KC y 51-2607KC Ejemplo 6. Curvas de superviviencia para cepas de ratones transgénicos TLR7.1.
Existió una diferencia altamente significativa entre DTg y los controles de crías normales TLR7.1. Como se muestra en la Figura 7, a los 10 meses, había muerto el 61% de los ratones TLR7.1, mientras que había muerto el 31% de los ratones DTg. Estos datos muestran la sobreexpresion de RNasaA ejercida como un fuerte efecto terapéutico. Las razones por las que los ratones TLR7.1 murieron prematuramente no están completamente claras, aunque tuvieron injerencia la anemia severa, trombocitopenia y glomerulonefritis . Para determinar si los conteos de glóbulos rojos y plaquetas se vieron positivamente impactados por la expresión de la RNasaA en los ratones DTg, realizamos conteos de sangre pero no hallamos diferencias entre los ratones TLR7.1 y DTg. En contraste, había una mejora significativa en la histopatologia de riñon de los ratones DTg. Observamos una deposición disminuida de IgG y C3 en los ratones DTg. La tinción con PAS, que refleja la inflamación en mesangio también fue reducida en los ratones DTg comparados con los controles de las crías normales TLR7.1. Cuando comparamos la infiltración de macrófagos en los ríñones utilizando el anticuerpo anti-MAC-2 (galectin3) (Lyoda y colab. Nephrol Dial Transplat 22: 3451, 2007), existían muchas menos células mac-2 positivas en los glomérulos del ratón DTg. Los resultados del conteo de glomérulos por ratón en 5 ratones de cada grupo revelaron una media +/- SE de 3.8+/-1.1 y 1.4+/-0.2 para normales versus DTg, respectivamente, p=.05. Además, cuantificamos el tamaño de la trama glomerular y observamos una reducción significativa en el tamaño de la trama glomerular en ratones DTg (179+/- 41 versus 128+/- 16.8 um2 en normales versus DTg, respectivamente, p=0.037). En síntesis, los ratones TLR7. lXRNasaA DTg sobreviven más que sus crías normales Tg TLR7.1 y tenían menos inflamación y daño en sus ríñones. Este hallazgo indica que, remover los complejos ARN inmunes en este modelo de ratón, mejora la mortalidad total y disminuye el daño en el riñon y la inflamación general asociada con esta patología tipo lupus.
Ejemplo 7. Análisis de IRGs en bazos de ratón TLR Tg.
El análisis de genes de respuesta al interferón (IRGs) en los bazos de ratones TLR7.1 Tg y TLR7.1 X RNasaA DTg mostraron que la expresión del gen IRF7 (factor regulatorio del interferón 7 (UniProtKB P70434)) fue significativamente inferior en los ratones DTg (p=0.03) . Algunos otros RGs incluyendo MX1 (proteina de enlace a GTP inducida por interferón Mxl (UniProtKB P09922)) y VIG1 (la proteina 2 que contiene al dominio del Radical S-adenosil metionina (UniProtKB Q8CBB9) ) era menor en ratones DTg comparada con ratones Tg, sin embargo, las diferencias no era significativas. (Figura 8) . El PCR cuantitativo se realizó de la siguiente manera: se aisló el ARN total de los bazos de ratones usando el mini kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA) , se trató con ADNsa usando Turbo libre de ADN (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) y se produjo el cADN con el kit RNA-para-cADN (Applied Biosystems) usando cebadores aleatorios. El 260/280 era entre 1,7 y 2,0 para ARN medido con un NanoDrop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) . Se diluyó el cADN hasta un equivalente de lng/ul ARN total y se utilizaron 8ul por reacción. Los cebadores para el de referencia (18s) y los genes de interés (GOI) se sintetizaron (IDT, Coralville, Iowa, USA) y diluyeron hasta concentraciones adecuadas para qPCR usando agua grado molecular. Los resultados BLAST de los cebadores muestran una homología de secuencia específica sólo con el gen de referencia o GOI. Las reacciones en duplicado (20 ul) se corrieron en un sistema ABI Fast 7500 usando una mezcla 1:1 de patrón y cebador para la mezcla SensiMix SYBR low-ROX master (Bioline, London, UK) . La cuantificación relativa se calculó usando el método 2~ ddCT con ratones B6 del tipo silvestre de la misma edad como línea de base para determinar cambios de para cada GOI. Las curvas de disociación para las reacciones muestran un pico de fusión único para cada gen. La curva estándar mostró eficacias similares de amplificación para cada gen y estas concentraciones¦ patrón están incluidas dentro del rango dinámico lineal para cada grupo de cebadores.
Ejemplo 8: Construcción y expresión de DNasal-Ig simple y moléculas de nucleasa híbridas duales.
Se ha informado sobre alelos naturales de DNasal o DNasal humana tipo moléculas. Se ha informado previamente que la mutación A114F ha ocurrido en variantes naturales de DNasal humana como enzimas y que resultó en resistencia a la actina de las enzimas que contienen este cambio de secuencia. Véase, CQ, Dodge TH, Baker DL, Prince WE, Sinicropi DV, and Lazarus RA. J Biol Chem 273: 18374-18381, (1998); Zhen A, Parmelee D, Hyaw H, Coleman TA, Su K, Zhang J, Gentz R, Rubén S, Rosen C, and Li Y. Biochem and Biophys Res Comm 231: 499-504 (1997); y Rodriguez AM, Rodin D, Nomura H, Morton CC, Weremowicz S, and Schneider MC. Genomics 42: 507-513 (1997), todas estas citas se incorporan aquí como referencia.
De manera similar, se ha informado recientemente la mutación G105R como polimorfismo de nucleotido simple en el gen que codifica la ADNsa 1 que es polimórfica en algunas o todas las poblaciones y es relevante para la autoinmunidad. (Véase, Yasuda T, Ueki M, Takeshita H, Fujihara J, Kimura-Kataoka K, Lida R, Tsubota E, Soejima M, Koda Y, Dato H, Panduro A. Int J Biochem Cell Biol 42(7): 1216-1225 (2010), incorporada aquí como referencia) . Las variantes alélicas en esta posición resultaron en una elevada actividad alojando las isoformas DNasa 1 con respecto al tipo silvestre. También se ha informado que otra mutación polimórfica (R21S) natural confiere mayor actividad. (Véase, Yasuda, supra) Se ha informado que los pacientes SLE tienen niveles significativamente disminuidos de la actividad DNasal (Véase, Martinez-Valle F, Balada E, Ordi-Ros J, Bujan-Rivas S, Sellas-Fernandez A, Vilardell-Tarres . Lupus 18(5) : 418-423 (2009), incorporada aquí como referencia) .
Por lo tanto, las variantes enzimáticas naturales pueden ser menos inmunogénicas cuando se administran a pacientes ya que estas isoformas ocurren en la población humana. Hemos razonado que la combinación de las propiedades resistentes a la actina de los alelos similar a A14F con actividad enzimática aumentada de alelos como G105R, podrían generar nuevas variantes alélicas de DNasal humana que podrían demostrar una actividad clínica mejorada in vitro e in vivo. Según nuestro conocimiento, el nuestro es el primer informe de esta nueva forma mutante de DNasal generada a partir de una combinación de dos variantes naturales G105R y A114F.
Se aisló la DNasa 1 humana como describimos previamente a partir de ARN (Ambion) de páncreas humano mediante cAD y PCR cebado aleatoriamente usando los siguientes grupos de cebadores : 5'hDNasal-age: GTT ACC GGT CTG AAG ATC GCA GCC TTC AAC ATC CAG (SEC ID NR:16) 5'hDNasal-bx: GTT CTC GAG ATC TTT CAG CAT CAC CTC CAC TGG ATA GTG (SEC ID NR:17) Alternativamente, los cassettes 3' DNasa fueron amplificados mediante PCR usando el siguiente par de cebadores. 3'hDNasal-RV: GTT GAT ATC CTG AAG ATC GCA GCC TTC AAC ATC CAG (SEC ID NR: 18) 3'hDNasal-stop: GTT TCT AGA TTA TCA CTT CAG CAT CAC CTC CAC TGG ATA GTG (SEC ID NR: 19) Se realizaron las reacciones PCR usando 50 pmol cada cebador, 2 ul cADN en un volumen total de 50 ul usando la mezcla Platinum PCR Supermix como describimos previamente. El perfil de amplificación fue de 94C 30 seg; 55C 30 seg; 68C 90 seg para 35 ciclos.
Una vez amplificado el gen silvestre mediante PCR, se sometieron los fragmentos a la electroforesis en gel y se purificaron fragmentos de 850 bp mediante la purificación con columna QIAquick. Se clonaron los fragmentos en pCR2.1, transformados mediante clonación TOPO de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se describió para los otros constructos. Una vez verificada la secuencia, se utilizaron los cebadores PCR para generar subfragmentos que contienen alelos naturales para DNasal de los que se ha informado mejoran la actividad especifica y la resistencia a la actividad inhibitoria de la actina. Estos subfragmentos contenían secuencias superpuestas, permitiendo la amplificación de subclones DNasal completos que contienen las variaciones alélicas deseadas. Las células COS7 se transíectaron transitoriamente en placas de 60 MI usando el reactivo de transfección Polyfect (Qiagen, Valencia, CA) . El ADN plásmido se preparó usando los kits miniprep Qiagen QIAprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se eluyeron los plásmidos en 50 ul de regulador EB. Se midió la concentración ADN usando el Nanodrop y un alícuota equivalente a 2,5 ug de ADN plásmido para cada reacción de transfección. Cada cassette de expresión DNasalg ) o RNasa-Ig-DNasa ) se insertó dentro del vector de expresión pDG, un derivado de pcADN3.1. Se incubaron las células transfectadas durante 72 horas a 37°C, 5% C02 antes de cosechar los sobrenadantes del cultivo para posterior análisis. Se cosecharon los sobrenadantes del cultivo, se centrifugaron las células residuales de la solución y se transfirió el líquido a nuevos tubos.
Se transfectaron transitoriamente células COS-7 con plásmidos que contienen DNasal humana tipo silvestre o alelos mutantes DNasa 1 naturales (G105R y/o A114F) ) fusionados al dominio Fe del IgGl humano silvestre. Este cassette bisagra-CH2-CH3 contiene una mutación simple C->S en la región bisagra para eliminar la primera cisteina en este dominio ya que no está apareada debido a la ausencia de su par de apareamiento presente en la cadena liviana del anticuerpo. Además, también se expresaron las proteínas de fusión multi-nucleasa más complejas de las transfecciones transitorias de células COS.
Ejemplo 9: Aislamiento de colas Ig hmanas , introducción a las mutaciones en la secuencia de codificación y construcción de moléculas de nucleasa mutantes .
Para aislar los dominios Fe de -Ig humanos mutantes, se derivó ARN de PBMCs humanos aislados en fresco, sangre completa usando el Medio de Separación de Linfocitos (LSM) Organon Teknika (Durham, NC) , capas leucocitarias cosechadas de acuerdo con las indicaciones del fabricante, y células lavadas tres veces en PBS antes de usar. Se formaron pellets con las células mediante centrifugado del medio de cultivo, y se utilizaron 2x107 células para preparar el ARN. Se aisló el ARN de las células usando el kit para aislamiento de ARN total QIAGEN RNAeasy kit (Valencia, Calif.) y las columnas QIAGEN QIAshredder de acuerdo con las instrucciones del fabricante que acompañan los kits. Se utilizó un microgramo (4 xg) de ARN total como patrón para preparar cADN mediante transcripción inversa. Se combinaron el ARN, 300 ng de cebadores aleatorios y 500 ng de Oligo dT (12-18), y 1 µ? 25 mM dNTPs y se desnaturalizaron a 80 °C. durante 5 minutos antes del agregado de la enzima. Se agregó la transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogen, Life Technologies) al ARN más la mezcla de cebador en un volumen total de 25 µ? en presencia de un segundo búfer y 0,1 DDT provisto con la enzima. Se dejó proseguir la reacción de transcripción inversa a 50°C durante una hora. Se purificó el cADN usando las columnas de purificación PCR QIAquick (QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se eluyó en 40 microlitros del búfer EB antes de usar en las reacciones PCR.
Se aislaron los dominios Fe del -Ig humano tipo silvestre mediante amplificaicón PCR usando el cADN descripto anteriormente como patrón. Los fragmentos -Ig mutantes se aislaron mediante mutagénesis dirigida por PCR, usando los cebadores PCR adecuados que contienen las mutaciones deseadas y los cassettes tipo silvestre como patrón. Se realizaron las reacciones PCR usando un termociclador C1000 (BioRad, Hercules CA) . Las reacciones incluían un paso de desnaturalización inicial a 95°C durante 2 minutos, seguido por 34 ciclos con una segunda desnaturalización a 94°C, 30 segundos, hibridación 55°C, 30 segundos, paso de extensión de 1 minuto, seguido por una extensión final de 4 minutos a 72°C. Una vez aisladas las colas mutantes de longitud completa, se clonaron con TOPO los fragmentos en los vectores pCR2.1, se preparó el ADN usando los kits QIAGEN Spin Plasmid iniprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenciaron los clones usando las reacciones de secuenciación ABI Dye Terminator v3.1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se generaron las moléculas recombinantes mediante mutagénesis PCR usando PCR de extensión de superposición con oligonucleótidos mutados.
Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para derivar estas moléculas.
CS-P238S 5-1: TCT CCA CCG AGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGA GGA TCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC C (58mer) (SEC ID NR: 20) SSSH-5-2: AGA TCT CGA GCC CAA ATC TTC TGA CAA AAC TCA CAC ATC TCC ACC GAG CCC AGC ACC T (58 mer) (SEC ID NR: 21) P331S-S: GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC A (46mer) (SEC ID NR: 22) P331S-AS: TGG AGA TGG TTT TCT CGA TGG GGG CTG GGA GGG CTT TGT TGG AGA CC (47mer) (SEC ID NR: 23) hIgGl-3' Tnogt : TCT AGA TTA TCA TTT TCC CGG AGA GAG AGA GAG GCT CTT CTG CGT GTA GTG (51mer) (SEC ID NR: 24) La mutación P238S y sustituciones SSS para SCC se introdujeron mediante mutagénsis PCR usando dos 5' oligos superpuestos en reacciones PCR secuenciales . La primera reacción PCR incluía el siguiente cebador 5' que incorpora la mutación P238S dentro de su secuencia: CS-P238S 5-1: TCT CCA CCG AGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGA GGA TCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC C (58mer) . (SEC ID NR: 25) La segunda reacción PCR incluía el siguiente cebador 5' que solapó al primer cebador y agregó residuos bisagra mutados al mutante P238S: SSSH-5-2: AGA TCT CGA GCC CAA ATC TTC TGA CAA AAC TCA CAC ATC TCC ACC GAG CCC AGC ACC T (58 mer) . (SEC ID NR: 26) Se utilizó el ADN de los clones correctos como patrón en las PCRs por extensión de superposición para introducir mutaciones en las posiciones internas deseadas en la secuencia de codificación para -IgGl humano. Las reacciones PCR se configuraron usando los clones de longitud completa como patrón (1 microlitro) , 50 pmol cebadores 5' y 3' para PCR cada porción de la cola -Ig hasta e incluyendo el sitio de mutación deseado de cada direción, y PCR hi fidelity Supermix (Invitrogen, Carlsbad CA) , en volúmenes de reacción de 50 microlitros usando un ciclo corto de amplificación. Como ejemplo de la mutagénesis por PCR de solapamiento, la combinación utilizada del cebador para introducir la mutación P331S dentro de -IgGl humano con la mutación P238S introducida, fue la siguiente: Se amplificó un subfragmento de 5' usando el clon del tipo silvestre de longitud completa como patrón, y el cebador 5' era SSSH-5-2: AGA TCT CGA GCC CAA ATC TTC TGA CAA AAC TCA CAC ATC TCC ACC GAG CCC AGC ACC T (58 mer) , mientras que el cebador 3' era P331S-AS: TGG AGA TGG TTT TCT CGA TGG GGG CTG GGA GGG CTT TGT TGG AGA CC (47mer). (SEC ID NR: 27) Se amplificaron subfragmentos 3' usando el clon del tipo silvestre de longitud completa como patrón y el cebador 5' : P331S-S: GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC A (46mer) , mientras que el cebador 3' era hlgGl-3'WTnogt: TCT AGA TTA TCA TTT TCC CGG AGA GAG AGA GAG GCT CTT CTG CGT GTA GTG (51mer) . (SEC ID NR: 28) Una vez amplificados los subfragmentos y aislados mediante electroforesis en gel de agarosa, fueron purificados mediante columnas de purificación Qiaquick gel y eluidos en 30 microlitros del búfer EB de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se realizaron dos rondas de PCR con los dos subfragmentos como patrones en superposición en reacciones nuevas. Se pausó el ciclador y los cebadores flanqueadores 5' y 3' se agregaron las reacciones (50 pmol cada una) . Luego se llevaron a cabo las amplificaciones PCR durante 34 ciclos en las condiciones descriptas para las moléculas del tipo silvestre anteriormente. los fragmentos de longitud completa se aislaron mediante electroforesis en gel, y se clonaron con TOPO en vectores pCR2.1 para el análisis de secuencia. Los fragmentos de los clones con la secuencia correcta luego se subclonaron en vectores de expresión para la creación de las diferentes moléculas de nucleasa descriptas aquí.
Para las moléculas de nucleasa multiespecificas , las reacciones PCR se realizaron usando un cebador alternativo para el extremo 3' del dominio Fe, removiendo el codón STOP y agregándolo al enlazador NLG y sitio de restricción EcoRV a las moléculas para facilitar la fusión al resto de los cassettes. La secuencia cebadora se da a continuación: 5' GAT ATC CTG CAC GCT AGG GCT GCT CAC ATT 3'. (SEC ID NR: 29) Se construyeron las nucleasas mutantes RSLV fusionando las colas -Ig humanas mutadas con el dominio RNasa tipo silvestre con o sin un enlazador separando los dos dominios. RSLV 125 y RSLV126 fusionan la RNasa humana con la bisagra mutante y el dominio Fe de IgGl. RSLV125 no contiene enlazador, mientras que RSLV 126 contiene al enlazador (gly4ser)4 como un fragmento (BglII-Xhol) insertado entre el dominio de nucleasa y las regiones bisagra. RSLV-125 incorpora un cassette RNasa tipo silvestre fusionado directamente a una versión SSS (en lugar de CCC o tipo silvestre) de la bisagra IgGl humana y un dominio Fe de IgGl humano mutante P238S, P331S (SEC ID NR: 61-62).
RSLV 126 incorpora un cassette RNasa tipo silvestre fusionado al domino enlazador (gly4ser)4, seguido por un dominio bisagra mutante SSS y un domino Fe mutante doble P238S-P331S (SEC ID NR: 63-64).
RSLV-127 es un constructo de fusión de multinucleasa que incorpora una DNasa humana amino terminal (G105R/A114F) fusionada a un dominio enlazador (gly4ser)4, seguido por un dominio bisagra mutante SSS y un dominio Fe mutante doble P238S-P331S fusionado al dominio enlazador NLG y seguido por un dominio RNasa del tipo silvestre C terminal (SEC ID NR: 65-66).
RSLV-128 es un constructo de fusión multinucleasa que incorpora un dominio RNasa humano tipo silvestre amino terminal, fusionado a un dominio enlazador (gly4ser)4, seguido por un dominio bisagra mutante SSS y dominio Fe mutante doble P238S-P331S fusionado a un dominio enlazador NLG y seguido por un dominio DNasa mutante C terminal (G105R/A114F) (SEC ID NR: 67-68) .
RSLV-129 es un constructo de fusión multiespecífica que incorpora un dominio RNasa humano tipo silvestre amino terminal, fusionado a un dominio bisagra mutante SSS y dominio Fe mutante doble P238S-P331S fusionado a un dominio enlazador NLG y seguido por un dominio DNasa mutante C terminal (G105R/A114F) (SEC ID NR: 69-70) .
RSLV-132 incorpora un cassette RNasa tipo silvestre fusionado directamente a una versión SCC del dominio bisagra de IgGl humano, y un dominio Fe de IgGl humano mutante P238S, P331S (SEC ID NRS : 91-92 y 95-96) .
RSLV-133 es un constructo de fusión multiespecifica que incorpora un dominio RNasa humano tipo silvestre amino terminal, fusionado a un dominio bisagra mutante SCC y un dominio Fe mutante doble P238S-P331S fusionado a un dominio enlazador NLG y seguido por un dominio DNasa mutante C terminal (G105R/A114F) (SEC ID NRS: 93-94 y 97-98) .
Versiones adicionales de RSLV-125-RSLV-129 con una bisagra SCC se muestran en la Tabla 1 RSLV-125-2 (SEC ID NR: 77-78), RSLV-126-2 (SEC ID NR: 79-80), RSLV-127-2 (SEC ID NR: 81-82), RSLV-128-2 (SEC ID NR: 83-84), y RSLV-129-2 (SEC ID NR: 85-86) .
Ejemplo 10: Western Blot en proteínas de fusión RSLV 125- 129 expresadas a partir de transfeccionea COS7 La Figura 9 muestra un Western Blot sobre sobrenadantes de transfección COS a partir de constructos RSLV 125-129. Los plásmidos de expresión que contienen RSLV 125, 126, 127, 128, o 129 fueron transfectados en células COS7 usando el reactivo para transfección Polyfect y sobrenadantes cosechados después de 48 horas. Además de las moléculas de nucleasa simples contenidas en RSLV 125 y 126, las proteínas de fusión multi-nucleasa complejas también se expresaron a partir de transfecciones transitorias de célula COS, codificadas por RSLV 127, 128, y 129. Se realizó el análisis Western blot en sobrenadantes de los transfectantes transitorios. Las moléculas ilustradas en la Figura 9 contienen RNasal humano fusionado al dominio bisagra de IgGl SSS humano, y al dominio Fe de Ig Gl P238S-P331S o incluyen RNasal humana (tipo silvestre) fusionada al dominio SSS bisagra- (P238S-331S) CH2-CH3 Fe de IgGl humano, seguido por un enlazador nuevo que contiene un sitio de glicosilación ligado con N para proteger el dominio enlazador del clivaje de proteasa, y la forma de alelo mutante G105R-A114F de DNasal humano en el extremo carboxilo terminal de la molécula. Además, RSLV 127 codifica DNasal humano mutante arriba en el extremo amino terminal y RNasa 1 WT en el extremo carboxilo terminal de la cola -Ig mutante. Los sobrenadantes COS se cosecharon después de 72 horas y se inmunoprecipitaron muestras de 0,5 mi durante la noche a 4°C con 100 ul de perlas de proteina A-agarosa. Las perlas de Proteína A fueron centrifugadas y lavadas dos veces en PBS antes de resuspender en un búfer de carga SDS-PAGE, de geles NuPAGE - Se centrifugaron las perlas e Proteína A y se lavaron dos veces en PBS antes de resuspender en un búfer de carga SDS- PAGE, para geles NuPAGE — LDS búfer para muestra reductor o no reductor (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Se calentaron las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante, las perlas de proteína A fueron centrifugadas hasta formar un pellet y se cargó el búfer para muestra en geles con gradiente 5-12% NuPAGE. Se aplicó electroforesis a las muestras a 150 voltios durante 1,5-2 horas, y se secó sobre membranas de nitrocelulosa a 30 mAmp durante 1 hora. Se bloquearon los Western blots en TBS/5% leche desgrasada durante la noche. Se incubaron con 1:2500 IgG anti-humano en cabra conjugado con HRP (peroxidasa de rábano) (Fe específico, Jackson Immunoresearch) durante 1,5 horas a temperatura ambiente, se lavó en PBS/0,5% Tween20 cinco o más veces y se desarrollaron los blots usando el reactivo ECL. Los resultados demuestran que la construcción de las proteínas de fusión Fe nucleasa fue exitosa y las proteínas son rápidamente expresadas a partir de las células COS. Un análisis ulterior de los perfiles reductores y no reductores de estas proteínas de fusión Fe nucleasa confirma que los constructos ADN codifican proteínas del peso molecular apropiado. El patrón en SDS-PAGE no reductor confirma las propiedades del enlace disulfuro de las proteínas como coherentes con el comportamiento esperado de los constructos.
Ejemplo 11 : Análisis SRED de proteínas purificadas por afinidad a partir de transfectantes COS7 La Figura 10 muestra el análisis SRED que compara alícuotas de proteínas purificadas con proteína A de sobrenadantes COS transíectados con RSLV del Ejemplo 10. Se preparó gel de agarosa al 2% con agua destilada. Se disolvió Poly-IC (Sigma) en agua destilada a 3 mg/ml. Se preparó la placa de gel de la siguiente manera: se colocaron 1,5 mi de búfer de reacción (0,2 Tris-HCl pH 7.0, 40m EDTA y 0,1 mg/ml bromuro de etidio) , 1 mi Poly-IC y 0,5 mi de agua en el tubo y se mantuvo a 50°C durante 5 min. Se agregaron 3 mi de agarosa (mantenido a 50°C) al tubo. La mezcla se vertió inmediatamente sobre una placa de vidrio. Se perforaron los pocilios para muestreo en el gel. Se cargaron 2 µ? de cada control, muestra de suero o proteínas RSLV purificadas por afinidad dentro de los pocilios y se incubó el gel a 37oC durante 4 horas en la cámara de humedad. Luego se incubó el gel en un búfer (acetato de sodio 20 mM, pH 5.2, 20mg/ml bromuro de etidio) sobre hielo durante 30 min. y se leyó bajo UV. Se fotografiaron los geles en un transiluminador UV usando una cámara digital Kodak DC290 equipada con filtros de bromuro de etidio y se analizaron usando el software Kodak Molecular Imaging. Los resultados del ensayo de actividad enzimática RNasa indican que los contructos todos contienen porciones de RNasa catalíticamente activas.
Ejemplo 12 : Actividad DNasa en gel de las moléculas de nucleasa RSLV La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo de actividad de nucleasa DNasa realizados en una proteína purificada con proteína A a partir de sobrenadantes COS7 transfectados con los plásmidos de fusión RSLV en el Ejemplo 10. La Figura 11 muestra cinco paneles (lia, 11b, 11c), cada panel de gel muestra el patrón de digestión con cantidades decrecientes de la proteína de fusión indicada y 1 microgramo del ADN plásmido. Cada proteína se diluyó serialmente en incrementos dobles en agua libre de nucleasa entre 500ng y 4ng de la enzima. A cada muestra, se agregó 1 ug ADN plásmido PDG, se incubó durante 30 minutos a 37 grados. La mitad de cada muestra se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa durante 30 minutos a 100 voltios usando 1,2% TAE geles de agarosa. La Figura 11c muestra los resultados de un ensayo de actividad de la enzima DNasa en gel que utiliza DNasa 1 comercializada (Biolabs, Inc.). La zona a la extrema derecha es un control negativo con ADN solo y sin enzima, la zona a la izquierda es otro control negativo, esta es una molécula RNasa-Ig que tiene actividad RNasa pero no tiene actividad DNasa, como se espera el ADN del plásmido permanece intacto y no es digerido en ambos casos. Los resultados demuestran que la enzima DNasal comercializada es altamente active y digiere todo el ADN a la mayoría de las concentraciones probadas. Los resultados de las Figuras lia y 11b muestran la actividad de la DNasa de cuatro constructos de fusión Fe nucleasa diferentes. El panel superior de la Figura lia muestra la capacidad de una proteína de fusión DNasa-Ig de digerir el ADN del plásmido, como es obvio en el gel, esta enzima digiere todo el ADN en todas las concentraciones probadas, es tan active o más que la DNasa 1 comercializada. En el panel inferior de la Figura lia hay una proteína de fusión Fe nucleasa biespecífica con DNasa en el extremo amino terminal de Fe (SED ID 65-66) y también tiene una actividad enzimática DNasa fuerte, pero un poco menor que la DNasa-Ig en el panel superior de la Figura lia. El panel superior de la Figura 11b muestra la actividad enzimática de la DNasa de otra nucleasa biespecífica, esta proteína de fusión Fe tiene la DNasa en el extremo C terminal del Fe conectado con el FC mediante un enlazador NLG especialmente diseñado (SEQ ID 67-68) . Como es obvio considerando los datos, esta enzima también tiene una fuerte actividad enzimática DNasa y parece ser más activa que las otras nucleasas biespecíficas examinadas aquí. El panel inferior de la Figura 11b muestra la actividad enzimática de DNasa de otra molécula de nucleasa biespecífica que carece del enlazador (G4S.) 4 que conecta el modulo RNasa con el Fe (SEQ ID 69-70) . Esta nucleasa biespecífica también tiene una buena actividad DNasa pero parece ser algo inferior que las otras dos proteínas de fusión Fe nucleasa biespecíficas mostradas en este experimento. Estos datos sugieren que todas las nucleasas biespecíficas tienen buena actividad DNasa, hecho inesperado teniendo en cuenta los esfuerzos anteriores realizados por otros a este respecto (Dwyer y colab. JBC; Vol 271, No. 14; páginas 9738-9743) . Además, la posición de la DNasa en el constructo así como también la longitud del enlazador y la composición que conecta la DNasa con Fe son críticas para crear una enzima DNasa altamente active en el contexto de una proteína de fusión Fe nucleasa biespecífica.
Ejemplo 13 : Análisis de la. cinética e zimatica Las Figuras 12-13 muestran resultados de un ensayo de actividad enzimática fluorescente cinético que compara la actividad de la enzima RNasa de RNasa A recombinante (Ambion) , RSLV 125, RSLV 126, hRNasa WT-SCCH-WThlgGl , and hRNasaG88D-SCCH- (P238S/K322S/P331S) hlgGl. Para definir más las características funcionales de la proteína de fusión mRNasa-Ig bivalente, estudiamos la cinética enzimática de diferentes proteínas de fusión a nucleasa usando el sustrato RNasa Alert y se cuantificó la fluorescencia con una lectora de microplaca Biotek Synergy2. Los datos se analizaron usando el software Gen5 (Biotek Instruments, Inc., Winooski, Vermont). Las unidades de fluorescencia relativa como función del tiempo se ensayaron cada minuto durante el transcurso de un experimento de 45 minutos incubada a 37C de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando concentraciones decreciente de la enzima partiendo de 10 pg/ul y diluyendo serialmente 0,1 pg/ul en incrementos 0,67x. Cada muestra incluía una concentración fija del sustrato RNasa Alert (200 nM) en un Regulador de reacción IX RNasa Alert.
La Figure 12 muestra las RFU (unidades de fluorescencia relativa) versus el tiempo para cada proteína a concentraciones equimolares, con las proteínas de prueba a 4,5 pg/ul o 4,5 ng/ml, y el control RNasaA recombinante a 1,3 pg/ul en presencia del sustrato 200 nM RNasa Alert.
La Figure 13 muestra un ploteo Lineweaver Burk de las diferentes moléculas. Para poder estimar la Vmax y Km, se determinaron ensayos de fluorescencia cinética RNasa Alert usando 105pM de enzima, y la concentración del sustrato se hizo decrecer desde 200n a 50 pM en incrementos de 4 veces. Así, se fijó la concentración enzimática y se tituló la concentración del sustrato en esta serie de experimentos. Los datos muestran los ploteos de Lineweaver Burk plots generados con diferentes proteínas de fusión bajo estas condiciones. Tomados juntos los datos de las Figuras 12 y 13, demuestran que las porciones RNasa son altamente activas en las tres proteínas de fusión Fe RNasa construidas y probadas aquí.
Ejemplo 14: Evaluación de la citotoxicidad in vitro contra la linea celular THP-1 humana Las Figuras 14-15 muestran resultados de los estudios in vitro que analizan los efectos de las proteínas de fusión RNasalg con dominios (incluyendo SCC, P238S, P331S) -IgG Fe del tipo silvestre o mutantes sobre la supervivencia de una línea celular monocítica humana, THP1. Las células THP1 se mantuvieron en crecimiento logarítmico en RP I/10% FBS antes de cosechar para los ensayos. Las células eran más del 98% viables antes de usar para el ensayo de citotoxicidad. Las células HP1 se colocaron en placas de 96 pocilios a una densidad celular de Ixl0e6 c/ml, o 100,000 células por pocilio. Se agregaron proteínas de nucleasa híbridas a pocilios sucesivos usando una dilución serial de dos veces partiendo de 5 microgramos/ml y terminando con 0,01 microgramo/ml de proteína de fusión por reacción. En este experimento, una proteína de fusión RNasa-Fc con un IgGl Fe tipo silvestre (wtRNasawtlgG) se comparó con una RNasa-Fc con un Fe mutante (P238S, P331S) que había reducido significativamente el enlace e internalización del receptor Fe (mtRNasamglgG) , con respecto a su capacidad para inducir citotoxicidad en las células THP1 cultivadas. Se incubaron las reacciones en placas de 96 pocilios durante 3 días a 37oC, 5% C02 antes de la cosecha de células y el análisis. Después de tres días, se cosecharon las células por centrifugación a 1.000 rpm, se lavaron en PBS/2%FBS, y se incubaron con reactivos del kit de detección de apoptosis FITC Annexin V (#556547, Becton Dickinson/Pharmingen) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se lavaron las células con 100 microlitros de un búfer de enlace en frío provisto con el kit, y se agregó anexina V-FITC/Yoduro de Propidio (PI) al: 100 en un búfer de enlace de 100 ul. Las muestras se incubaron sobre hielo durante 20 minutos, después de dicho período se agregó a cada muestra 400 µ? de un búfer de enlace adicional. Las muestras teñidas se analizaron mediante citometría de flujo usando FACS Canto (Becton Dickinson) y se analizaron los datos usando el software Flowjo (Treestar, Ashland, OR) .
La Figura 14 muestra el efecto de las proteínas de fusión RNasa Fe con un dominio Fe tipo silvestre o mutante sobre células muertas medidas mediante dos métodos enlace Annexin V (panel superior) y enlace de yoduro de propidio (panel inferior) , ambas son medidas sensibles de muerte celular. Este experimento demuestra que el enlace de la proteína de fusión RNasa con Fe mutante (P238S, P331S) tiene un enlace reducido a los receptores Fe sobre la superficie de las células THPl, y la subsiguiente internalización de la proteina. Los resultados muestran una disminución significativa en la muerte celular mediante RNasa-Fc mutante comparada con las proteínas de fusión Fe RNasa-tipo silvestre (por ejemplo, una disminución aproximadamente de tres veces a 1,25 \iq/ml de proteína) . La Figura 15 presenta los resultados de los experimentos de clasificación celular activadas por fluorescencia (FACS) para examinar la citotoxicidad de los construcciones de fusiones RNasa Fe con un dominio Fe del tipo silvestre o mutante (RNasa-wtlgG o RNasa-mtlgG, respectivamente) . Los datos demuestran una disminución en la cantidad de células muertas cuando las células THPl se incuban con el constructo RNasa Fe con un mutante Fe (tamaño de pico menor a la derecha del gráfico para el mutante RNasa Fe comparado con RNasa -wtlgG) . Estos datos muestran una disminución de 3 a 5 veces aproximadamente en la muerte celular mediante el RNasa Fe mutante comparado con el tipo silvestre. Estos y otros experimentos que examinan el enlace del receptor claramente muestran que, en presencia de células que portan receptores Fe, el constructo RNasa Fe con una región Fe mutada ha reducido el enlace con los receptores Fe y tiene una menor internalización mediante las células, resultando en una menor muerte celular debido a la actividad RNasa del constructo. Dichos constructos son particularmente útiles para tratar enfermedades autoinmunes ya que puede ser inconveniente utilizar una terapéutica con proteínas que es citotóxica para las células que portan el receptor Fe.
Ejemplo 15 : Producción de IFN-alfa mediante PBMCs humanos es inhibida por el agregado de RSLV-132 a los cultivos in vitro .
El agregado de RSLV132 eliminó la inducción de interferón- de las células mononucleares de sangre periférica humana estimuladas usando los complejos inmunes formados con suero de tres pacientes SLE más extracto celular necrótico (NCE) (Figura 16) . Para medir la capacidad de RSLV-132 para ligarse a y degradar el ARN contenido en los complejos inmunes de los pacientes con lupus, se desarrollaron bioensayos in vitro. El experimento incluye la formación de complejos inmunes in vitro usando los autoanticuerpos de pacientes con lupus y NCE de células humanas cultivadas (U937) . Si se combina suero de paciente con lupus con los resultados NCE en la formación de complejos inmunes (IC) que son inductores muy potentes de interferón, el suero humano normal no estimula la producción de interferón. El IC se incuba con células mononucleares de sangre periférica humana normal (PBMC's) como células reporteras. La producción de interferón por parte de la célula reportera se mide usando interferón-a ELISA. Las células reporteras se obtuvieron de voluntarios normales mediante centrifugación de gradiente de densidad Ficoll. Se obtuvo suero pacientes con lupus o voluntarios sanos normales conforme a la University of Washington Institutional Review Board #HSD No. 3971, el suero se diluyó 1/1000 y se agregó al extracto de células necróticas (NCE) 10% (vol/vol) derivado de las células U937 cultivadas como se indicó anteriormente. Se incubó el suero de pacientes con lupus o voluntarios normales diluido con NCE durante 15 minutos a temperatura ambiente, se incubaron los ICs resultantes con o sin varias dosis de RSLV-132, RSLV-124, RNasa tipo silvestre durante 15 minutos, luego se incubó con PBMCs normales durante 02 horas en presencia de 500 U/mL Universal IFN seguido por la medición de la cantidad de IFN secretado por el cultivo PBMC. Se obtuvo el suero de tres (2) pacientes con lupus diferentes, con varios grados de actividad de la enfermedad comprendidos entre leve y activo. Se incubó NCE con suero de paciente con lupus o suero de voluntario sano normal a temperatura ambiente durante 15 minutos seguido por 20 horas de incubación con PBMC. Se cuantificó el IFN-a mediante ELISA donde se capturó el IFN-a usando un MAb de ratón contra IFN alfa humano (MMHA-11) [PBL Biomedical Laboratories, product # 2112-1] y se detectó usando un anticuerpo monoclonal de conejo contra IFN alfa [PBL Biomedical Laboratories, producto # 31101-1], seguido por el desarrollo usando HRP anti-conejo [Jackson Immuno Research, producto # 711-035-152] y sustrato TMB . En algunos casos, antes del agregado del NCE al PBMC, el articulo de prueba (RSLV-124 o RSLV-132) se agregó a concentraciones de 0,16, 0,5, 1,6 y 5,0 ug/mL o se agregó RNasa a concentraciones de 0,05, 0,16, 0,5 y 1,6 ug/mL (equimolar) con respecto a NCE. La capacidad que tiene el suero de paciente con lupus de estimular la producción de IFN a partir del PBMC, fue reducida en aproximadamente el 50% con el agregado de 5,0 ug/mL RSLV-124. Esta inhibición reflejó la de una cantidad equimolar de RNasa. El agregado de la misma concentración de huRSLV-132 era como o más eficaz para inhibir IFN que RSLV-124, con la producción de IFN casi completamente eliminada con el agrego de 5,0 ug/mL de huRSLV-132. Cuando se combinó con NCE, los anticuerpos anti-ARN/ADN de pacientes con lupus son potentes inductores de IFN a partir de PBMC aislado fresco. El suero de voluntarios normales no tiene esta misma capacidad para estimular la producción de IFN a partir de las células reporteras. Estos datos indican que los auto-anticuerpos que circulan en el suero de pacientes con lupus son capaces de formar complejos inmunes que, presumiblemente, disparan TLR7 y la subsiguiente producción de IFN. El tipo y subtipo exacto de IFN no fueron analizados. Este dato indica que RSLV-132 se liga a su blanco molecular, el ARN asociado con IC del paciente con lupus y lo degrada potentemente, impidiendo asi la estimulación del IFN del PBMC (Figura 16) . RSLV-132 parece ser más activo que RSLV-124 en este ensayo.
E emplo 16 : RSLV-132 es un potente inhibidor in vivo de la activación de interferon inducida por ARN Para evaluar la capacidad de RSLV-132 para ligar y degradar el ARN en la circulación del ratón, se desarrolló un modelo farmacodinámico usando un mimético de ARN ácido poliinosinico : olicitidilico (poli I:C) que es un activador potente de la vía de interferon. El Poly(I:C) es un ARN doble hebra incorrectamente apareado, siendo una hebra un polímero de ácido inosínico y la otra un polímero de ácido citidílico. Se sabe que interactúa con el receptor 3 tipo Toll (TLR3) que se expresa en la membrana de las células B; macrófagos y células dendríticas. Poly(I:C) es comercializado por Invitrogen. Los efectos de poly I:C pueden cuantificarse midiendo los niveles de expresión genes estimulados con interferon en el bazo de los ratones luego de la administración. El día cero, 10 ratones B6, de tres meses de edad, fueron tratado con RSLV-132 (250ug por ratón) o inmunoglobulina intravenosa (IVIG) (Privigen, Behring) (250ug por ratón) como control, ambos con inyección intraperitoneal . Veinte horas después de la inyección de RSLV-132 or IVIG, se inyectó poly(I:C) a los ratones a 200 ug por ratón por la vía intraperitoneal. Dos horas más tarde, se sacrificaron los animales por exposición a C02, se recolectaron los bazos en ARN tardío (Qiagen) y se almacenó a -80C para el estudio posterior de la expresión de los genes estimulados por Interferón (ISGs) . Las muestras del bazo se sometieron a un estudio de la expresión de ISGs, incluyendo Ifitl (proteina inducida por Interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 (UniProt Q64282)), Irf7 (factor regulador de INterferón 7 (UniProt P70434)) y gen Mxl mediante qPCR. Los resultados de estos experimentos demuestran que la inyección intraperitoneal de RSLV-132 resulta en concentraciones en suero de RSLV-132 que son capaces de ligarse al poly (I:C) circulante y degradar eficazmente el mimético de ARN, impidiendo asi eficazmente la estimulación de la vía de Interferón y los tres ISGs monitoreados (Figura 17) .
E emplo 17. Análisis de la cinética enzimatica para RSLV- 132 y RSLV-133 Se expresaron RSLV-132 y RSLV-133 transitoriamente en céluals CHO y se purificó usando la proteina-A. Actividad de Rnasa de estas proteínas de fusión RNasa Fe se cuantificaron usando el kit RNasaAlert QC de Ambion (Cat # AM1966) . Se utilizaron varias cantidades de la proteína de fusión RNasa Fe y los resultados se muestran en la Figura 18 con respecto a las unidades de fluorescencia relativas (RFUs) en el tiempo. Los resultados demuestran que RSLV-132 es una enzima Rnasa altamente activa, y que ha aumentado la actividad de RNasa con respecto a los otros constructos de fusión to RNasa Fe como por ejemplo, RSLV-124 y RNasa del tipo Silvestre. Por ejemplo, usando cantidades iguales (400pM) de RSLV132 y RSLV-124 rinde más que dos veces la RFU (80, 000 vs . 35, 000) para RSLV-132 vs . RSLV-124. Además, se probaron dos lotes de producción según su estabilidad a 4C. Se almacenó RSLV-132.1 a 4C durante 8 semanas antes de este experimento y se almacenó RSLV-132.2 a -80C y se descongeló justo antes de la prueba, demostrando que la proteina es estable a 4C durante hasta dos meses. La estabilidad del fármaco y la actividad catalítica aumentada pueden proveer una eficacia mejorada en la configuración terapéutica.
La Figura 19 muestra la actividad enzimática de RNasa en RFUs en el tiempo, comparando la cantidad de actividad RNasa de la molécula RSLV-133 biespecífica con RSLV-132 monoespecífica y RNasa del tipo silvestre. Como se demostró en la Figura 19, la molécula RSLV-133 ha aumentado significativamente la actividad RNasa con respecto a la molécula RSLV-124 monoespecífica o, Fe nucleasa biespecífico temprano, RSLV-123 o RNasa del tipo silvestre, rindiendo más de dos veces que RFUs con una cantidad igual de proteína. La Figura 20 muestra los resultados del ensayo de actividad enzimática DNasa de la molécula RLSV-133 en comparación con RSLV-123, un constructo de nucleasa biespecífico previo, y DNasa del tipo silvestre. En este experimento, la actividad enzimática de DNasa se cuantificó usando el kit DNasaAlert Kit de Integrated ADN Technologies. El clivaje del sustrato de ADN dio una emisión fluorescente que fue cuantificada usando la Lectora de microplaca Synergy2 ulti-Mode (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT) . La Figure 20 muestra las RFUs de la actividad enzimática de DNasa en el tiempo para RSLV-133, RSLV-123, o DNasa del tipo silvestre. Los resultados del experimento demuestran que RSLV-133 aumentó la actividad DNasa con respecto a la DNasa del tipo silvestre y RSLV-123, la molécula de nucleasa biespecífica temprana, rindiendo más de 3 veces la actividad DNasa en el rango lineal del experimento. La Figura 21 demuestra la capacidad que tiene la molécula RSLV-133 de digerir ADN en un experimento de digestión en gel. Los resultados muestran que RSLV-133 es capaz de digerir ADN en este ensayo tan eficazmente como la DNasa del tipo silvestre (comparar las zonas 5&7) . Dados los pesos moleculares relativos de RSLV-133 y DNasa del tipo silvestre, parece que RSLV-133 también es más eficaz para digerir ADN en este ensayo.
Ejemplo 18 : RSLV-132 demuestra una unión disminuida al receptor Fe Para examinar la capacidad que tienen las proteínas de fusión Fe RNAsa para ligarse a receptores Fe in vitro, RSLV124 (dominio Fe tipo silvestre) y RSLV-132 (dominio Fe mutante; P238S/P331S) se incubaron con una linea celular mieloide humana que porta Fe, THP1 y el enlace específico a las células se cuantificó mediante un análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . Se marcaron con fluorescencia RLSV-124 y RSLV-132 usando una tintura Alexa Fluor AF-647 de Invitrogen (Cat # A20006) . Después de dializar las proteínas de fusión Fe RNAsa para remover la tintura no ligada, se incubaron varias proteínas marcadas con células THP1 durante una hora, las células se lavaron astringentemente para remover la proteína de fusión Fe RNasa y, se cuantificó la proteína específicamente ligada mediante FACS midiendo la intensidad de fluorescencia media. Los resultados en la Figura 22 demuestran que la proteína RSLV-132 que tienen un dominio Fe mutante presentan significativamente menos enlace con el receptor Fe que RSLV-124 que tiene un dominio Fe tipo silvestre, exhibiendo una reducción superior a 4 veces en el enlace del receptor Fe. Este hallazgo es coherente con los hallazgos previos que las proteínas de fusión Fe RNasa con un dominio Fe mutante ( P238S/P331S ) tienen una citotoxicidad significativamente disminuida.
Ejemplo 19: Evaluación In vitro de la actividad biolótica de la molécula de nucleasa híbrida.
Se purificaron una o más moléculas de nucleasa híbridas, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad o intercambio de iones como se describió previamente en los ejemplos anteriores. En algunas instancias, la molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio de nucleasa ligada al dominio Fe mutante. En algunos casos, la molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio Fe mutante. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende mutaciones en los dominios bisagra, CH2 y/o CH3. En algunas instancias, el dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y puede incluir mutaciones en una o más de las tres cisteínas bisagra. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o mutaciones en las tres cisteínas bisagra. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o mutaciones en las tres cisteínas bisagra con respecto a SSS. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y mutaciones en las tres cisteínas bisagra. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y SSS. En algunos casos el dominio Fe mutante se ilustra en los NRs ID DE SEC 59, 60, 61. En algunos casos, la molécula de nucleasa híbrida se ilustra en NRs ID DE SEC. Varios dominios enlazadores (por ejemplo, aquellos descriptos aquí) pueden utilizarse para ligar los dominios Fe con los dominios de nucleasa. Por ejemplo, pueden utilizarse los dominios enlazadores de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más aminoácidos de longitud. Se pueden probar las moléculas para la actividad específica de nucleasa in vitro usando ensayos cualitativos para verificar que poseen la función de nucleasa deseada. Las actividades especificas generalmente luego son determinadas mediante los ensayos cinéticos basados en fluorescencia utilizando sustratos como por ejemplo, los reactivos del Kit RNasa o DNasa Alert Kit, y una lectora de placa fluorescente determinada para tomar lecturas como función del tiempo. Además, se controlan en general soluciones de proteina para la contaminación por endotoxina usando los kits comercializados, como por ejemplo, el kit Pyrotell Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (lisado de amebocito de limus), limite de detección 0,06 EU/ml de Cape Cod, Inc. (E. Palmouth, MA) . Luego se prueban las moléculas usando una variedad de ensayos in vitro según la actividad biológica.
Una serie de ensayos in vitro medirán el efecto de las moléculas sobre la producción de citocinas mediante PBMC humano en respuesta a varios estímulos, en presencia o ausencia de las moléculas en los cultivos. Se cultivaron PBMC humanas normales o de pacientes (aproximadamente Ixl0e6 células) durante 24, 48, o 96 horas según el ensayo. Se cultivaron PBMC en presencia de estímulos como por ejemplo ligandos TLR, anticuerpos co-estimulatorios , complejos inmunes, y suero normal o autoinmune. Los efectos de las moléculas en la producción de citocina se midieron usando reactivos comercializados, como los kits de anticuerpo par de Biolegend (San Diego, CA) para IL-6, IL-8, IL-10, IL-4, IFN-gamma, TNF-alfa. Los sobrenadantes del cultivo de los cultivos in vitro se cosecharon a 24, 48 horas o puntos en el tiempo más tardíos para determinar los efectos de las moléculas sobre la producción de citocina. La producción IFN-alfa se midió usando, por ejemplo, anticuerpos IFN-alfa antihumanos y reactivos de curva estándar disponibilizados por PBL Inferieron Source (Piscataway, NJ) . Se realizó un grupo de ensayos usando subpoblaciones de linfocito humano (monocitos aislados, células B, pDCs, células T, etc.); purificados usando, por ejemplo, los kits de aislamiento por perlas magnéticas comercializados por Miltenyi Biotech (Auburn, CA) .
Además, el efecto de las moléculas sobre la expresión de los receptores de activación de linfocitos como por ejemplo, CD5, CD23, CD69, CD80, CD86, y CD25 se evaluó en varios puntos en el tiempo después de la estimulación. Se sometieron las PBMC o subpoblaciones de células aisladas a citometría de flujo multi-color para determinar cómo estas moléculas afectan la expresión de diferentes receptores con activación células inmunológicas .
Otro grupo de ensayos medirá los efectos de estas moléculas sobre la proliferación de diferentes subpoblaciones de linfocitos diferentes in vitro. Estos ensayos utilizarán, por ejemplo, la tinción con CFDA-SE (Invitrogen, Carlsbad, CA) de PBMCs humanas antes de la estimulación. Se diluyó CFSE 5 mM a 1:3000 en PBS/0,5% BSA con 10e7-10e8 PB CS o subgrupos de células purificadas y se marcaron las reacciones incubadas durante 3-4 minutos a 37C antes de lavar varias veces en RPMI/10% FBS para remover CFSE restante. Las células marcadas con CFSE luego se incubaron en reacciones en co-cultivo con varios estímulos (ligandos TLF, anticuerpos co-estimulatorios, etc.) y las moléculas durante 4 días antes de la proliferación celular mediante citometría de flujo usando anticuerpos específicos de subpoblación celular conjugada con tinción.
Otro ensayo medirá la citotoxicidad de una o más moléculas. Este ensayo medirá la toxicidad usando la tinción con Annexin 5 (por ejemplo, Annexin 5-FITC) . Las células de interés (por ejemplo, monocitos o línea celular de monocitos) se contactaron con una molécula de nucleasa híbrida de interés (por ejemplo, una molécula de nucleasa híbrida que tiene un dominio Fe mutante) o uno o más controles. En varios puntos en el tiempo luego del contacto, se separaron las células del cultivo y se tiñeron con Annexin 5. Luego se contó la cantidad de células apoptóticas o muertas, por ejemplo, usando citometria de flujo o un microscopio fluorescente. Las células contactadas con una molécula de nucleasa híbrida de interés mostraron cantidades inferiores de tinción positiva celular para Annexin 5 comparadas con los controles positivos.
El efecto de estas moléculas sobre la maduración in vitro de monocitos en DCs y macrófagos, también se evaluó usando ambas muestras PB C, normal y de Paciente.
La efectividad de la molécula de nucleasa híbrida se demostró comparando los resultados de un ensayo de células tratadas con la molécula de nucleasa híbrida descripta aquí con los resultados del ensayo con células tratadas con formulaciones de control. Después del tratamiento, los niveles de varios marcadores (por ejemplo, citocinas, receptores de superficie celular, proliferación) descriptos anteriormente, mejoraron en general en un grupo tratado con la molécula eficaz con respecto a los niveles de marcadores antes del tratamiento, o con respecto a los niveles medidos en un grupo de control.
Ejemplo 20: Administración de una molécula de nucleasa híbrida a un mamífero que necesita dicho tratamiento.
Se utilizaron mamíferos en el estudio (por ejemplo, ratones, ratas, roedores, humanos, cobayos) . Se les administró a los mamíferos (por ejemplo, por la vía intravenosa) una o más moléculas de nucleasa híbridas que comprenden una o más secuencias de la Tabla 1 o un control. En algunos casos la molécula de nucleasa híbrida es un polipéptido. En algunos casos, la molécula de nucleasa híbrida incluye una o más secuencias de la Tabla 1. En algunos casos, la molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio de nucleasa ligado a un dominio Fe mutante. En algunos casos, la molécula de nucleasa híbrida incluye un dominio Fe mutante. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende mutaciones en los dominios bisagra, CH2, y/o CH3. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y puede incluir mutaciones en una o más de las cisteinas bisagra. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o mutaciones en las tres cisteinas bisagra. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende P238S y/o P331S, y/o mutaciones en las tres cisteinas bisagra con respecto a SSS. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y mutaciones en las tres cisteinas bisagra. En algunos casos, el dominio Fe mutante comprende P238S y P331S y SSS. En algunos casos el dominio Fe mutante se ilustra en NRs ID DE SEC 59, 60, 61. En algunos casos, la molécula de nucleasa híbrida se ilustra en NRs ID DE SEC. Varios dominios enlazadores (por ejemplo, aquellos descriptos aquí) pueden utilizarse para ligar los dominios Fe con los dominios de nucleasa. Por ejemplo, se pueden utilizar los dominio enlazadores 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más aminoácidos en longitud. En algunos casos la molécula de nucleasa híbrida se formula en un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos la molécula se formula como se describió en la sección Composiciones Farmacéuticas anterior. La molécula de nucleasa híbrida se dirige a RNasa y/o DNasa.
Se utilizaron múltiples rondas de dosis cuando se consideró útil. Se monitorearon los efectos sobre los niveles IFN-alfa, los niveles del gen de respuesta al IFN-alfa, los títulos de autoanticuerpo, función renal y patología y/o niveles del complejo inmune circulante en mamíferos. Se realizaron estudios similares con diferentes protocolos de tratamiento y vías de administración (por ejemplo, administración intramuscular, etc.). La eficacia de una molécula de nucleasa híbrida se demostró comparando los niveles IFN-alfa, el gen de respuesta al IFN-alfa, niveles del gen de respuesta a IFN-alfa, títulos de anticuerpo, función renal y patología y/o niveles circulantes del complejo inmune en mamíferos tratados con una molécula de nucleasa híbrida descripta aquí, con mamíferos tratados con formulaciones de control .
En un ejemplo, se selecciona e identifica un humano que necesita tratamiento. El sujeto puede necesitar, por ejemplo, reducir una causa o síntoma de SLE. La identificación del sujeto puede suceder en el entorno de una clínica o en cualquier otra parte, por ejemplo, en el hogar del sujeto mediante el uso por mano propia del kit para auto-ensayo.
En el tiempo cero, se administra una primera dosis de una molécula de nucleasa híbrida al sujeto. La molécula de nucleasa híbrida se formula como se describió aquí. Después de un período de tiempo luego de la primera dosis, por ejemplo, 7 días, 14 días, y 21 días, se evalúa la condición del sujeto, por ejemplo, midiendo los niveles IFN-alfa, los niveles del gen de respuesta a IFN-alfa, los títulos del auto-anticuerpo, la función renal y patología y/o niveles del complejo inmune circulantes. También se midieron otros criterios relevantes. La cantidad y potencia de la dosis se ajustó de acuerdo con las necesidades del sujeto.
Después del tratamiento, los niveles de IFN-alfa, niveles del gen de respuesta al IFN-alfa, título auto-anticuerpo, función renal y patología y/o niveles del complejo inmune circulante del sujeto disminuyeron y/o mejoraron con respecto a los niveles existentes antes del tratamiento, o con respecto a los niveles medidos en un sujeto afectado de manera similar pero no tratado/de control.
En otro ejemplo, se selecciona o identifica un sujeto roedor que necesita dicho tratamiento. La identificación puede ocurrir en un entorno de laboratorio o cualquier otro lugar.
En el tiempo cero, se le administra una primera dosis adecuada de una molécula de nucleasa híbrida al sujeto. La molécula de nucleasa híbrida se formula como se describió aquí. Después de un período de tiempo luego de la primera dosis, por ejemplo, 7 días, 14 días, y 21 días, se evalúa la condición del sujeto, por ejemplo, midiendo los niveles IFN-alfa, los niveles del gen de respuesta a IFN-alfa, los títulos del auto-anticuerpo, la función renal y patología y/o niveles del complejo inmune circulantes. También se midieron otros criterios relevantes. La cantidad y potencia de la dosis se ajustó de acuerdo con las necesidades del sujeto.
Después del tratamiento, los niveles IFN-alfa, los niveles del gen de respuesta a IFN-alfa, los títulos del auto-anticuerpo, la función renal y patología y/o niveles del complejo inmune circulantes disminuyeron y/o mejoraron con respecto a los niveles existentes antes del tratamiento, o con respecto a los niveles medidos en un sujeto afectado de manera similar pero no tratado/de control.
Aunque la invención ha sido particularmente ilustrada y descripta con respecto a una realización preferida y varias realizaciones alternativas, el experto en el arte deberá comprender que pueden realizarse varios cambios en la forma y detalles sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.
Todas las referencias, patentes concedidas y Solicitudes de Patentes citadas dentro del cuerpo de la presente especificación, se incorporan aquí como referencia completas, para toda finalidad.
TABLAS

Claims (36)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de nucleasa híbrida que comprende un primer dominio de nucleasa y un dominio Fe modificado, donde el primer dominio de nucleasa está acoplado operativamente al dominio Fe y donde el dominio Fe está modificado de modo que la molécula tiene citotoxicidad reducida con relación a una molécula de nucleasa híbrida que tiene un dominio Fe no modificado ..
2. Una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ I D NO: 62, 64, 78, 80, 92, ó 96, o una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ I D NO: 62, 64, 78, 80, 92 ó 96.
3. Una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ I D NO: 96.
4. Una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ I D NO: 66, 68, 70, 82, 84, 86, 94, ó 98, o una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ I D NO: 66, 68, 70, 82, 84, 86, 94, o 98.
5. Una molécula de nucleasa híbrida comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ I D NO: 98.
6. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 1, donde el dominio Fe está modificado para disminuir la ligadura con los receptores Fcy, las proteínas del complemento, o ambos.
7. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 1 que tiene una citotoxicidad al menos 1, 2, 3, 4 ó 5 veces menor .
8. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 1, que comprende además un segundo dominio de nucleasa acoplado operativamente al dominio Fe.
9. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 1, donde el dominio Fe comprende un dominio Fe de inmunoglobulina humana, tal como un dominio Fe de la IgGl humana .
10. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 9, donde el dominio Fe comprende un dominio de bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.
11. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 9, donde el dominio Fe comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una o más de las mutaciones P238S, P331S, SCC, SSS (residuos 220, 226, y 229), G236R, L328R, L234A y L235A.
12. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 9, donde el dominio Fe modificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene las mutaciones SCC o SSS, P238S, y P331S.
13. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 1 que tiene una vida media en suero aumentada en relación con el primer dominio de nucleasa solo.
14. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 1, donde el primer dominio de nucleasa está acoplado operativamente al dominio Fe vía un primer dominio de enlace.
15. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 14, donde el primer dominio de enlace es un enlace polipeptidico, tal como un grupo de enlace gly-ser.
16. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 8, donde el segundo dominio de nucleasa está acoplado operativamente al dominio Fe vía un segundo dominio de enlace.
17. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 16, donde el segundo dominio de enlace es un enlace polipeptidico, tal como un péptido NLG.
18. La molécula de nucleasa híbrida de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el primer dominio de nucleasa comprende una RNasa o una DNasa.
19. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 18, donde la RNasa es una RNasa humana, tal como una RNasa A pancreática humana.
20. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 19 que degrada ARN y ARN circulante en complejos inmunes, o inhibe la producción de interferón-a, o ambos.
21. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 19, donde la actividad de la RNasa no es menor que aproximadamente 9 veces la actividad de una molécula de RNasa de control.
22. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 19, donde la actividad de la RNasa es aproximadamente igual a la actividad de una molécula de RNasa de control.
23. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 8, donde el segundo dominio de nucleasa comprende una DNasa o una RNasa.
24. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 23, donde la DNasa se selecciona del grupo formado por una DNasa humana de tipo 1, una DNasa humana 1L3 o TREX1 humana.
25. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 24, donde la actividad de la DNasa no es menor que aproximadamente 9 veces la actividad de una molécula de DNasa de control.
26. La molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 24, donde la actividad de la DNasa es aproximadamente igual a la actividad de una molécula de DNasa de control.
27. Una composición que comprende la molécula de nucleasa híbrida de cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
28. Una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de nucleasa híbrida de acuerdo con la reivindicación 1.
29. Un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28.
30. Una célula hospedante transformada con el vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 29.
31. Un método para preparar la molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 1, método que comprende: proporcionar una célula hospedante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica ' la molécula de nucleasa híbrida; y mantener la célula hospedante bajo condiciones en las que se expresa la molécula de nucleasa híbrida.
32. Un método para tratar o prevenir una condición asociada con una respuesta inmune anormal, método que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de una molécula de nucleasa híbrida de la reivindicación 1.
33. El método de la reivindicación 32, donde la condición es una enfermedad autoinmune.
34. El método de la reivindicación 33, donde la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo formado por diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, encéfalo mielitis autoinmune experimental, artritis reumatoide, artritis autoinmune experimental, miastenia grave, tiroiditis, una forma experimental de uveorretinitis, tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, tirotoxicosis , anemia perniciosa, gastritis autoinmune atrófica, enfermedad de Addison, menopausia precoz, infertilidad masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, pénfigo, oftalmía simpática, uveítis facogénica, anemia hemolítica autoinmune, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa Hbs-ve, cirrosis criptogénica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, esclerodermia, granulomatosis de egener, polimiositis , dermatomiositis, lupus eritematoso discoide (LED) , lupus eritematoso sistémico (LES) , y enfermedad del tejido conectivo.
35. El método de la reivindicación 34, donde la enfermedad autoinmune es lupus eritematoso sistémico.
36. Un método para tratar lupus eritematoso sistémico que comprende administrar a un sujeto una composición que contiene nucleasa en una cantidad efectiva para degradar complejos inmunes que contienen ARN, ADN o ambos, ARN y ADN, donde la composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una molécula de nucleasa híbrida que comprende una secuencia aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 62, 64, 66, 68, 70, 78, , 82, 84, 86, 92, 94, 96, o 98.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE032166T2 (en) 2009-11-02 2017-09-28 Univ Washington Therapeutic nuclease preparations and methods
KR102428875B1 (ko) 2011-04-29 2022-08-05 유니버시티 오브 워싱톤 스루 이츠 센터 포 커머셜리제이션 치료적 뉴클레아제 조성물 및 방법
US9603907B2 (en) 2012-02-01 2017-03-28 Protalix Ltd. Dry powder formulations of dNase I
AU2014207618A1 (en) 2013-01-16 2015-08-06 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
US10988745B2 (en) 2013-10-31 2021-04-27 Resolve Therapeutics, Llc Therapeutic nuclease-albumin fusions and methods
DK3110434T3 (en) * 2014-02-24 2019-01-14 Takeda Gmbh UTI FUSION PROTEINS
WO2015191546A2 (en) * 2014-06-10 2015-12-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Adp-ribose detection reagents
WO2016069889A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Resolve Therapeutics, Llc Therapeutic nuclease-transferrin fusions and methods
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
AU2016321146C1 (en) * 2015-09-08 2021-10-28 Theripion, Inc. ApoA-1 fusion polypeptides and related compositions and methods
AU2017271601A1 (en) 2016-05-27 2018-12-13 Abbvie Biotherapeutics Inc. Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
JP7308034B2 (ja) * 2016-07-01 2023-07-13 リゾルブ セラピューティクス， エルエルシー 最適化二重ヌクレアーゼ融合物および方法
WO2018136163A2 (en) 2016-12-09 2018-07-26 Theripion, Inc. Tandem apoa-1 fusion polypeptides
US10988746B2 (en) * 2018-10-08 2021-04-27 Neutrolis, Inc. Manufacturing and engineering of DNASE enzymes for therapy
JP2022516635A (ja) * 2019-01-04 2022-03-01 リゾルブ セラピューティクス， エルエルシー ヌクレアーゼ融合タンパク質によるシェーグレン病の処置
JP2020136505A (ja) 2019-02-20 2020-08-31 株式会社Ｊｏｌｅｄ 半導体装置および表示装置
KR20220152196A (ko) * 2020-01-11 2022-11-15 예일 유니버시티 DNAse1 및/또는 DNAse1L3 결핍에 의해 야기되거나 이와 관련된 질병 또는 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 조성물 및 방법
WO2021252470A2 (en) * 2020-06-08 2021-12-16 Yale University Compositions and methods for treating and/or preventing coagulopathy and/or sepsis in patients suffering from bacterial and/or viral infections
CN112088903A (zh) * 2020-09-28 2020-12-18 武汉愔紫生物科技有限公司 一种大分子蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用
JP2024507220A (ja) * 2021-02-19 2024-02-16 セリピオン， インコーポレイテッド パラオキソナーゼ融合ポリペプチドならびに関連する組成物および方法
CN115595315A (zh) * 2021-06-28 2023-01-13 四川大学华西医院（Cn） 核糖核酸酶i在抑制疼痛的药物中的新用途

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4615885A (en) 1983-11-01 1986-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing urokinase
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5453269A (en) 1986-04-14 1995-09-26 The General Hospital Corporation Heterobifunctional antibodies having dual specificity for fibrin and thrombolylic agents and methods of use
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5559212A (en) 1988-04-06 1996-09-24 Alfacell Corporation Frog embryo and egg-derived tumor cell anti-proliferation protein
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5840840A (en) 1990-04-17 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selective RNase cytotoxic reagents
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
GB9300686D0 (en) 1993-01-15 1993-03-03 Imp Cancer Res Tech Compounds for targeting
US20030108548A1 (en) 1993-06-01 2003-06-12 Bluestone Jeffrey A. Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6348343B2 (en) 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
WO1997014719A1 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6482626B2 (en) 1996-02-05 2002-11-19 Genentech, Inc. Human DNase
US6716974B1 (en) * 1996-05-31 2004-04-06 Maine Medical Center Research Institute Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on jagged/notch proteins and nucleic acids
US6391607B1 (en) 1996-06-14 2002-05-21 Genentech, Inc. Human DNase I hyperactive variants
AU3968897A (en) 1996-08-02 1998-02-25 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US7247302B1 (en) 1996-08-02 2007-07-24 Bristol-Myers Squibb Company Method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
AU729515B2 (en) 1996-10-17 2001-02-01 Immunomedics Inc. Non-antigenic toxin-conjugate and fusion protein of internalizing receptor system
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US20030083461A1 (en) 1997-06-16 2003-05-01 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020192659A1 (en) 1997-09-17 2002-12-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US5840296A (en) 1997-10-15 1998-11-24 Raines; Ronald T. Engineered cytotoxic ribonuclease A
US6280991B1 (en) 1997-10-15 2001-08-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Engineered cytotoxic ribonclease
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
CA2341029A1 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6239257B1 (en) 1998-12-30 2001-05-29 Alfacell Corporation Family of proteins belonging to the pancreatic ribonuclease a superfamily
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
IL147270A0 (en) 1999-07-02 2002-08-14 Genentech Inc Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
US6175003B1 (en) 1999-09-10 2001-01-16 Alfacell Corporation Nucleic acids encoding ribonucleases and methods of making them
AU1084901A (en) 1999-10-14 2001-04-23 Martha S. Hayden-Ledbetter Dna vaccines encoding antigen linked to a domain that binds cd40
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
ES2649037T3 (es) 2000-12-12 2018-01-09 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
CA2436092A1 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Modified antibodies and methods of use
DK1366067T3 (da) 2001-03-07 2012-10-22 Merck Patent Gmbh Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed
JP4586310B2 (ja) 2001-07-04 2010-11-24 株式会社Ｉｈｉ セラミックス複合部材の製造方法
US20060040262A1 (en) * 2002-12-27 2006-02-23 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040018557A1 (en) 2002-03-01 2004-01-29 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP1539940A4 (en) 2002-06-14 2006-02-22 Wisconsin Alumni Res Found Ribonuclease zymogen CONSTRUCTION
CA2495251C (en) 2002-08-14 2018-03-06 Macrogenics, Inc. Fc.gamma.riib-specific antibodies and methods of use thereof
DK2345671T3 (en) 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1578367A4 (en) 2002-11-01 2012-05-02 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF IMMUNE DISEASES
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US7067298B2 (en) 2003-03-31 2006-06-27 Ambion, Inc. Compositions and methods of using a synthetic Dnase I
US7666417B2 (en) * 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
US7754209B2 (en) * 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
EP1697415A1 (en) 2003-11-12 2006-09-06 Biogen Idec MA Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
WO2005063815A2 (en) * 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
EP1697520A2 (en) 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
ES2387028T3 (es) 2003-12-31 2012-09-12 Merck Patent Gmbh Proteína de fusión de Fc-eritropoyetina con farmacocinética mejorada
US20080089892A1 (en) 2004-01-12 2008-04-17 Eli Lilly And Co. Fc Region Variants
EP1720996A4 (en) 2004-02-13 2007-03-21 Immunomedics Inc RECOMBINANT CYTOTOXIC RASES CONTAINING FUSION PROTEINS
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
JP2008505853A (ja) 2004-04-13 2008-02-28 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド 細胞傷害性薬剤としての非天然のリボヌクレアーゼ複合体
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
EP1791866A2 (en) 2004-08-11 2007-06-06 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain fusion proteins
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
DE102005009219A1 (de) 2005-02-25 2006-08-31 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Ribonuclease-Tandemenzyme und Verfahren zu ihrer Herstellung
WO2006104989A2 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Verenium Corporation Altered antibody fc regions and uses thereof
BRPI0611445A2 (pt) 2005-05-09 2010-09-08 Glycart Biotechnology Ag molécula de ligação a antìgeno glicomanipulada, polinucleotìdeo, polipeptìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção, uso e composição farmacêutica
ES2354280T3 (es) 2005-06-16 2011-03-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Variantes de ribonucleasa citotóxica.
JP2008546391A (ja) 2005-06-16 2008-12-25 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 細胞傷害性リボヌクレアーゼ変異株
US20080279850A1 (en) 2005-07-25 2008-11-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. B-Cell Reduction Using CD37-Specific and CD20-Specific Binding Molecules
SI1912675T1 (sl) 2005-07-25 2014-07-31 Emergent Product Development Seattle, Llc zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20
BRPI0617688A2 (pt) 2005-10-21 2011-06-07 Hoffmann La Roche método para expressão recombinante de um polipeptìdeo
MX2008013057A (es) 2006-04-14 2009-04-07 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de enlace que comprenden regiones bisagra y regiones fc de inmunoglobulina que tienen funciones efectoras fc alteradas.
US20100015661A1 (en) * 2006-04-21 2010-01-21 Mab-Factory Gmbh Antibody-rnase-conjugate
GB0611444D0 (en) 2006-06-09 2006-07-19 Medical Res Council Technology Rnase H2 complex and genes therefor
MX363905B (es) 2006-06-12 2019-04-08 Aptevo Res & Development Llc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
EP1905841A1 (en) 2006-09-25 2008-04-02 Max Delbrück Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch; Trex1 as a marker for lupus erythematosus
EP2144930A1 (en) 2007-04-18 2010-01-20 ZymoGenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
US20090258005A1 (en) 2007-05-29 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals Inc. Therapeutic compositions and methods
US20100330089A1 (en) 2007-06-12 2010-12-30 Wyeth Anti-cd20 therapeutic compositions and methods
AU2008287195A1 (en) 2007-07-06 2009-02-19 Emergent Product Development Seattle, Llc Binding peptides having a C-terminally disposed specific binding domain
WO2009015345A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins
US8067548B2 (en) 2007-07-26 2011-11-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region
AU2008321074A1 (en) 2007-11-13 2009-05-22 Sapphire Energy, Inc. Production of Fc-fusion polypeptides in eukaryotic algae
EP2132228B1 (en) 2008-04-11 2011-06-22 Emergent Product Development Seattle, LLC Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
KR20110081161A (ko) 2008-09-26 2011-07-13 제넨테크, 인크. 루푸스의 치료, 진단 및 모니터링 방법
US8029782B2 (en) 2008-10-01 2011-10-04 Quintessence Biosciences, Inc. Therapeutic ribonucleases
HUE032166T2 (en) 2009-11-02 2017-09-28 Univ Washington Therapeutic nuclease preparations and methods
TWI529163B (zh) 2011-01-25 2016-04-11 陶氏農業科學公司 用於製備４－胺基－５－氟－３－鹵素－６－（經取代之）吡啶甲酸酯的方法
SG192905A1 (en) 2011-02-23 2013-09-30 Amgen Inc Cell culture media for uvc exposure and methods related thereto
MX363013B (es) 2011-02-25 2019-03-04 Recombinetics Inc Animales genéticamente modificados y métodos para su obtención.
RU2667524C2 (ru) 2011-04-21 2018-09-21 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Модулирование экспрессии вируса гепатита b (hbv)
KR102428875B1 (ko) 2011-04-29 2022-08-05 유니버시티 오브 워싱톤 스루 이츠 센터 포 커머셜리제이션 치료적 뉴클레아제 조성물 및 방법
US20140178479A1 (en) 2011-08-12 2014-06-26 Perosphere, Inc. Concentrated Felbamate Formulations for Parenteral Administration
US9401875B2 (en) 2012-06-01 2016-07-26 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Packet transfer processing method and packet transfer processing device
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof

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