CN112088903A - 一种大分子蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大分子蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用，所述大分子蛋白为生物界中细菌、真菌、动物或植物分泌的天然免疫多肽和蛋白中的一种或多种，所述消毒剂应用于体外环境、体表环境或口鼻腔环境中，所述大分子蛋白在体外环境中能稳定存在并具有持久杀毒灭菌活性，所述大分子蛋白为重组人源性RNases中的一种或多种。本发明将生物界中天然免疫物质应用于体外消毒产品中，实现对环境中病菌、病毒的灭活，改变天然免疫蛋白仅用于人体内药物的传统观念。

Description

一种大分子蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用

技术领域

本发明涉及消毒产品技术领域，特别涉及一种大分子蛋白在抗菌、抗病毒消毒剂中的应用，具体为将人体内天然免疫分子RNases用于体外灭菌消毒，预防病菌感染或减少环境中病菌载量，减轻感染。

背景技术

人类抗病毒、抗病菌依赖人体的免疫能力，有先天免疫和感染-疫苗后的获得免疫。先天免疫有细胞免疫和体液免疫。先天体液免疫由体内各种抗细菌、真菌、病毒感染的多肽、免疫因子和某些活性蛋白构成。其中有一些核糖核酸酶(RNases)，通过泪液，唾液，粘液和汗液等液体中分泌这些酶来抵御入侵的微生物。RNase A超家族是脊椎动物特异性的蛋白质家族，涵盖人类的八个功能成员。这些蛋白质由从骨髓细胞到上皮细胞的各种先天免疫细胞分泌，它们在我们体内的水平与感染和炎症过程有关，归因于分泌性RNase在身体细胞外间隙中的重要作用。

RNase A超家族由八个具有酶活性，且与RNase A的结构同源、“标准”的核糖核酸酶组成。它们都是具有二硫键结合的三级结构并能够降解RNA(核糖核酸)的分泌蛋白。在人类和小鼠中，所有基因都编码在14号染色体的紧密区域中，并被认为起源于基因复制。尽管该基因包含多个外显子，但编码区由单个外显子贡献。对它们的生理作用对于宿主防御，血管生成以及消化都很重要。第一个成员是RNase 1，它不仅是胰腺酶，还在包括血管内皮细胞在内的多种细胞中产生，在分泌后，它降解血管聚合RNA并具有抗HIV-1活性。RNase 2和3是嗜酸性粒细胞分泌蛋白，分别称为嗜酸性粒细胞衍生神经毒素(EDN)和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)，都具有抗RNA病毒的作用。RNase 4存在于多个组织中。RNase 5，也称为血管生成素，可诱导血管生长。RNase 7是皮肤中最丰富的RNase，而RNase 8在胎盘中表达。它们参与多种生理病理过程，具有对细菌和病毒破坏灭活作用，是生物界天然免疫防御的重要成员。

尽管RNases在人类天然免疫中起重要作用，重组RNases除了在生物医学研究方面的应用，在治疗和预防疾病的应用非常少，特别是在微生物感染和传染病的预防和消毒方面还没有任何应用。这种空缺，主要是由于现有技术中对这些RNases理化稳定性研究极少，缺乏足够的了解，加上人们对于蛋白质性质的常识观念，认为酶蛋白需要体温(37℃)来发挥酶的功能和活性，蛋白在自然环境中不稳定，容易变性、腐败和降解，而不能在体外持久、杀灭致病微生物，起到预防疾病的作用。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供了一种大分子多肽蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用，通过筛选生物界中分泌的天然免疫多肽和蛋白，寻找在体外环境能稳定存在并具有持久活性的大分子蛋白，并将该蛋白应用于消毒产品中，实现对环境中病菌、病毒的灭活，改变天然免疫蛋白仅用于人体内药物的传统观念。

本发明的采用技术方案具体如下：

一种大分子蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用，所述大分子蛋白为生物界中细菌、真菌、动物或植物分泌的天然免疫多肽和蛋白中的一种或多种。所述大分子蛋白在体外常温环境中结构稳定且具有一定的活性。

优选的，所述消毒剂作用于体外环境、体表环境或口鼻腔环境中。

优选的，所述大分子蛋白为RNaseA家族蛋白中的一种或多种。

更加优选的，所述大分子蛋白为RNase2、RNase3和RNase7中的一种或多种；所述大分子蛋白为人源性蛋白，人源性的免疫多肽-蛋白分子对人体伤害更小，避免引起人体的过敏反应。

所述大分子蛋白的制取方法为：从生物中直接提取、采用重组技术制取蛋白，或在体外通过物理、化学、生物技术合成蛋白；采用重组技术制取大分子蛋白的方法为：由原核细胞或真核细胞通过重组DNA表达、纯化的蛋白质，且纯度大于90％，浓度为1～20μM；所述真核细胞包括真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞或人细胞；具体的，所述原核细胞可采用大肠杆菌(E.coli)，所述真核细胞可采用人293细胞。

优选的，所述消毒剂为液体制剂，或消毒剂为干粉剂，且所述干粉剂与作用环境中的溶剂混合后发挥作用；更加优选的，所述消毒剂的溶剂为水。

优选的，所述消毒剂中大分子蛋白的浓度为0.01～5000nM。

优选的，所述消毒剂中还含有蛋白稳定剂、缓冲剂和防腐剂。

在上述技术方案中，所述蛋白稳定剂包括防腐和抗菌类蛋白质稳定剂、蛋白质和氨基酸类蛋白质稳定剂、抗氧化剂类蛋白质稳定剂和碳水化合物类蛋白质稳定剂中的一种或多种。具体的，所述防腐和抗菌类蛋白质稳定剂包括叠氮化钠、甘油、苯扎氯铵、苯扎溴铵和麝香草酚；所述蛋白质和氨基酸类蛋白质稳定剂包括β-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、L-异亮氨酸、牛磺酸、甘氨酸、白蛋白、L-精氨酸、肌氨酸、L-胱氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸和L-赖氨酸；所述抗氧化剂类蛋白质稳定剂包括三羟丙基膦、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、乙二胺四乙酸、DL-二硫苏糖醇和2-巯基乙醇；所述碳水化合物类蛋白质稳定剂包括α-乳糖一水合物、D-山梨醇和D-(+)-海藻糖二水合物。所述磷酸缓冲剂的pH为7～8，所述防腐剂为苯扎氯铵或/和山梨醇钾。

本发明的有益效果为：

(1)本发明将生物界中具有灭菌、杀毒的天然免疫大分子蛋白用作体外的抗菌抗病毒的消毒剂，该大分子蛋白在体外环境中能稳定存在且具有单独或与其他物质配合抑制病毒活性的作用；改变天然免疫蛋白仅用于人体内药物的行业偏见。

(2)本发明提供的消毒剂的有效成分是8个重组人源性RNases中的一个或几个，这些RNases是人体产生天然分泌蛋白，分泌后的蛋白分子量在130个氨基酸左右。现有研究已表明，它们在人体内具有抗病菌-病毒和调节机体免疫的作用；本发明通过实验证明，它们在体外环境中具有很强的稳定性和活性，能够用于杀灭环境中的病菌和病毒。

(3)重组人源性的RNases中，RNase2、RNase3和RNase7的稳定性和活性最好：RNase2、RNase3和RNase7在0℃至80℃都具有RNase的活性；RNase2和RNase3加热到100℃变性10～30分钟，在室温中复性后，活性与变性前没有显著差别；RNase2和RNase3保存3天～3个月，蛋白没有被降解，且活性没有显著差异；RNase2和RNase3暴露于自然环境中后，72h后回收仍检测数良好的RNase活性。

(4)含有重组人源性RNases的消毒剂适用于各种环境气候温度条件中，可用于身体表面、口鼻腔、伤口及环境的空气和固体物质表面，消除杀灭病菌和病毒90％以上；消毒剂的活性持久，短期内连续多次使用有累计增强酶分子的浓度和量效。

(5)这种消毒剂相对于现有的小分子消毒剂，具有作用时间长、效率高、对人体无刺激作用、环保、可循环发挥作用等优点；而且，它可以用于人群聚集的地方，比如运用中的餐馆、超市、影院、公交、办公室、门诊病房等，不会有气味、刺激、毒性和腐蚀等不良副作用。这种“外源性”RNase甚至可以在人体体表、口鼻腔、甚至气管、肺泡、食管肠道(RNase的天然环境)发挥作用。

(6)这种消毒剂特别适用于老年、有其他慢性疾患而先天免疫力低下的人群及其所在场所。

附图说明

图1为重组RNases在体外活性随温度变化图；

图2为消毒液中重组RNase2加热变性及复性后降解RNA的凝胶电泳图；

图3为不同保存状态下消毒液中重组RNase的SDS-PAGE图；

图4为保存3个月的消毒液中重组RNase降解RNA的凝胶电泳图；

图5为不同暴露时间下的消毒液中重组RNase2和重组RNase3降解RNA的凝胶电泳图；

图6重组RNase7对不同细菌和真菌的抑制作用对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本发明中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

实施例1

一种大分子蛋白的抗菌抗病毒消毒剂，该消毒剂包含重组人类RNase酶家族蛋白中的一个或多个。

Uniprot数据库中人源性RNases的记录条目见下表：

这些蛋白具有酶的作用，它们催化以下反应:

An(RNA)containing cytidine+H(2)O＝an(RNA)-3'-cytidine-3'-phosphate+a5'-hydroxy-ribonucleotide-3'-(RNA)An(RNA)containing uridine+H(2)O＝an(RNA)-3'-uridine-3'-phosphate+a 5'-hydroxy-ribonucleotide-3'-(RNA)

这些蛋白主要自然分布在全身各器官组织的细胞外，也通过泪液，唾液，粘液和汗液分泌到体表和口腔、肠道、尿道，作为天然免疫分子，在人体内抵抗致病性微生物。

本实施例中的RNases是采用重组技术制取的重组人源性RNases，其具体制备方法为：由E.coli(大肠杆菌)、Sf9昆虫细胞或人293细胞通过重组DNA表达、纯化的蛋白质，且蛋白质的纯度大于90％，浓度为1～200μM。重组RNases的制备为现有技术，在此不再做过多的赘述。

本实施例中的重组RNases具体为RNase2、RNase3和RNase7中的一种或多种。

本实施例的消毒剂为液体制剂，采用水作为溶剂，其中，大分子蛋白的浓度为0.01～5000nM。

为了保持长期的活性、提高消毒剂的使用效果，还可以在消毒剂中添加蛋白稳定剂、磷酸缓冲剂、防腐剂。蛋白稳定剂包括防腐和抗菌类蛋白质稳定剂、蛋白质和氨基酸类蛋白质稳定剂、抗氧化剂类蛋白质稳定剂和碳水化合物类蛋白质稳定剂中的一种或多种。磷酸缓冲剂的pH为7～8，具体的磷酸缓冲剂的成分可以为：137mM NaCl、2.7mM KCl、8mMNa₂HPO₄和2mM KH₂PO₄。防腐剂用以放置微生物的生长，同时也具有杀菌消毒作用，具体可为苯扎氯铵或/和山梨醇钾。

能被上述消毒液在体外或体表抑制的病毒包括但不限于以下病毒：预防呼吸道合胞病毒、全部流感病毒、副流感病毒，鼻病毒，脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，登革热病毒，轮状病毒，SARS病毒，MERS病毒，埃博拉病毒(Ebola virus)，马尔堡病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等呼吸道传染病毒，或艾滋病病毒(为逆转录病毒)，丙型肝炎病毒，乙型脑炎病毒。

由于有效成分为重组的RNases，调整防腐剂、稳定剂以及溶剂的种类和用量，可以使得消毒液应用于任何场景，如食品、日常用品、体表等，甚至可以雾化状态(气溶胶的形式)进入人的口、鼻、眼等部分来降低病毒。

需要说明的是，本发明使用的重组RNases既有申请人自己按照现有技术制备的，又有部分购于多家公司的，检测出来的RNase2和RNase3性质并非针对于某一家某一种产品，不具备偶然性。

实施例2消毒剂的稳定性

(1)重组RNases的热稳定性

多种温度条件下，测试三种RNases的活性变化。RNase活性检测过程具体为：催化反应将40mg酵母tRNA作为底物加入0.8mL反应液中(含40mM磷酸钠，pH 7.0和10mL的rhRNase2、或rhRNase3，或rhRNase7、或缓冲液对照)。终止反应是通过在冰冷的3％高氯酸中加入40nM硝酸镧，在给定的时间点停止反应。之后，离心，分光光度法以260nM定量分析残留在上清液中的酸溶性核糖核苷酸。所有时间点均一式三份进行测试。计算包括以下近似值：tRNA的平均分子量(Mr)为Mr＝28,100(75-90核糖核苷酸/tRNA分子1Mr 341/核糖核苷酸)，在260nm处的吸光度为1.0，相当于40mg RNA。以0℃所测RNase的活性为100％，后续各温度点所测RNase的活性相对与0℃所测活性，均转换成百分比。

检测结果如图1所示，从0℃～80℃，RNase2、RNase3和RNase7均具有良好的活性，而且活性随温度增高至50℃而提高，随后温度提高，活性下降。说明上述RNases在人类日常的生活环境温度中，都能具有良好的活性功能。

(2)重组RNases的复性

将含有RNase2的消毒液(RNase2浓度为2nM)，加热至100℃变性20min，在室温中复性后，降解真核细胞总RNA。检测结果如图2所示，其中，泳道1、2、3为未被RNase2消化的真核细胞总RNA放在室温10分钟，泳道4、5、6为真核细胞总RNA经RNase2在室温(25℃)消化10分钟，泳道7、8、9为总RNA经RNase2 100℃(变性后)消化10分钟，泳道10、11、12为总RNA经热变性-复性后的RNase2在室温(25℃)消化10分钟。由图可知，泳道1、2、3和泳道7、8、9中的RNA未被降解，说明加热至100℃的RNase2失去降解RNA的功能；泳道4、5、6和泳道10、11、12中的RNA已被降解，说明消毒液中的RNase2具备降解RNA的功能，且热变性后的RNase2可以自行恢复结构和功能。

(3)消毒液的保存稳定性

将含有RNase2或RNase3的消毒液，其中RNase2或RNase3的浓度为2-50nM，存放在不同温度下，保存一段时间后浓缩，进行检测，每条泳道加样量约为1μg。

如图3所示，泳道1-6为分别为RNase2存放于-80℃，-20℃，4℃，25℃，37℃，-80℃保存3个月；泳道7-11为分别为RNase3存放于-20℃，4℃，25℃，37℃，-80℃保存3个月。从图可知，RNase2和RNase3在上述温度中存放3个月后，其蛋白没有被降解，活性没有显著的差异。

将含有RNase2或RNase3的消毒液分别在不同温度存放3个月后，再消化真核细胞总RNA，反应条件为：37℃，30min，RNase用量约为0.5-1μg。

结果见图4，其中，泳道1-6中所用的重组RNase2依次为存放于-80℃，-20℃，4℃，25℃，37℃，-80℃中3个月的RNase2；泳道7-11所用的RNase3依次为存放于-20℃，4℃，25℃，37℃，-80℃保存3个月的RNase3。由图可知，重组RNase2和重组RNase3在上述温度下长期保存后，降解RNA的功能无明显差异。

上述检测结果说明消毒液中的重组RNase2和重组RNase3在常用温度下(-20～37℃)能长期保存，且保存期限大于3个月。

(4)消毒液暴露在自然环境中的活性

用移液器将5μL 5nM的重组RNase2或重组RNase3消毒液滴到组织学玻璃片表面，敞开放置在10人30平米大小的办公区，于0、0.5、2、8、24和72小时后回收RNases。在回收的管子里加入真核细胞总RNA，37℃反应1小时后，再进行凝胶电泳。

检测结果如图5所示，泳道R为未消化的真核细胞总RNA；泳道1、3、5、7、9和11分别为不同暴露时间的重组RNase2消化后的总RNA，且重组RNase2暴露放置时间依次为0、0.5、2、8、24和72小时；泳道2、4、6、8、10、12分别为不同暴露时间的重组RNase3消化后的总RNA，且重组RNase3暴露放置时间0、0.5、2、8、24、72小时；泳道C为暴露放置72小时的空白玻璃片用回收液清洗、消化的真核细胞总RNA。

重组人源性RNases能自然形成4个二硫键，稳定RNase的结构和功能。前面实验已证明RNase2和RNase3可以在37℃存放3个月以上，其蛋白的完整性和功能都保持良好。而本实验暴露放置24-72小时后有RNase的功能有所减弱。这种减弱，可能是由于暴露的水溶液蒸发后，RNases随气流飘散，也有可能小部分被环境中各种物理、化学、生物因素破坏降解，但飘散的和残留的可仍具有RNase的活性。因此，这些RNases能更长时间地、完整地保留在环境中，起到杀灭病毒的作用。

实施例3消毒液的抑菌作用

将临床常见的致病细菌和真菌，在100μl 10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)，其中含1％胰蛋白胨大豆肉汤培养基和以上不同浓度RNase7，37℃，孵育3小时后，转至培养皿过夜，第二天菌落计数(CFU)，再换算出CFU/mL。

检测结果如图6所示，依次为肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、疮疱丙酸杆菌(Prupionilacterium acnes)、屎肠球菌(Enterococcus Faecium)、白色念珠菌(candidaalbicans)的统计图；从图可知，RNase7对所有这些致病菌都有灭活作用，而各种致病菌对RNase的敏感性不同，以肠球菌的敏感性最高，白色念珠菌(真菌)的敏感性最低。值得注意的是，实验中所有的致病菌的数量都很高，远远高于平常致病载量。

实施例4消毒液对病毒的抑制

(1)RNase的抗病毒能力

有或无核糖核酸酶抑制剂(RI，200U/mL)对人嗜酸性粒细胞(0.4X 106/mL)降低呼吸道合胞病毒(RSV-A)和副流感病毒(PIV)1、2、3型感染性的反应情况见下表：

通过添加RNase抑制剂，证明了嗜酸性粒细胞的抗病毒作用是因为RNase的作用。

(2)RNase2对不同RNA病毒的灭活能力对比

用不同剂量的重组RNase2处理相同量的病毒1和病毒2，再用处理后的病毒感染培养细胞，检测活性病毒数量，结果如下表所示(所有试验重复3次，每次2份，结果为平均数，±标准差)：

从上表可知，活性病毒的数量随RNase2用量的增加而降低，证明RNase2对两中病毒都有抑制破坏作用，但病毒对RNase2的敏感性不同。其推测原因为：呼吸道合胞病毒和副流感病毒在双层脂质膜下方均有Matrix Proteins，是病毒结构组成的关键蛋白，在组装病毒、保护病毒外膜和基因组方面起重要的作用；呼吸道合胞病毒与副流感病毒有不同的Matrix protein，分别是195氨基酸和353氨基酸，可能导致了RNase2抗病毒效率不同。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种大分子蛋白在抗菌抗病毒消毒剂中的应用，其特征在于，所述大分子蛋白为生物界中细菌、真菌、动物或植物分泌的天然免疫多肽和蛋白中的一种或多种，所述消毒剂作用于体外环境、体表环境或口鼻腔环境中。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大分子蛋白为RNase酶家族蛋白中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述大分子蛋白为RNase2、RNase3和RNase7中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述大分子蛋白为人源性蛋白；所述大分子蛋白的制取方法为：从生物中直接提取、采用重组技术制取蛋白，或在体外通过物理、化学、生物技术合成蛋白。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重组制取大分子蛋白的方法具体为：由原核细胞或真核细胞通过重组DNA表达、纯化的蛋白质，且纯度大于90％；所述真核细胞包括真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞或人细胞。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述消毒剂为液体制剂，或消毒剂为干粉剂，且所述干粉剂与作用环境中的溶剂混合发挥作用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述消毒剂的溶剂为水。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述大分子蛋白的浓度为0.01～5000nM。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述消毒剂中还含有蛋白稳定剂、缓冲剂和防腐剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述蛋白稳定剂为叠氮化钠、甘油、苯扎氯铵、苯扎溴铵、麝香草酚、β-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、N,N-二甲基甘氨酸、L-异亮氨酸、牛磺酸、甘氨酸、白蛋白、L-精氨酸、肌氨酸、L-胱氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、三羟丙基膦、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、乙二胺四乙酸、DL-二硫苏糖醇、2-巯基乙醇、α-乳糖一水合物、D-山梨醇、D-(+)-海藻糖二水合物中的一种或多种。

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