CN1070423A

CN1070423A - 一种液体培养基除菌的方法

Info

Publication number: CN1070423A
Application number: CN 91108818
Authority: CN
Inventors: 刘树臣; 李淑兰
Original assignee: Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 1991-09-11
Filing date: 1991-09-11
Publication date: 1993-03-31

Abstract

本发明是一种液体培养基的除菌方法。通过把机械过滤除颗粒杂质，紫外线杀菌和高分子滤膜除菌的三种手段相结合来制备无菌液体培养基。在消除了培养基加热变质的基础上，既可大幅度地提高液体培养基的处理能力，又可较显著地延长膜的使用寿命。方法简单，经济、实施容易。

Description

本发明涉及一种用亲水性高分子滤膜对液体培养基除菌的方法。

在微生物培养和利用微生物发酵生产目的产物时，维持微生物生长、繁殖和代谢的培养基有固体培养基和液体培养基，而液体培养基最为常用，液体培养基被使用之前，都要进行灭菌，以确保微生物在最佳的环境中得以生长、繁殖和发酵。因为杂菌的存在不仅影响微生物的正常生长，而且还会影响目的产物的生成，严重时将导致微生物的培养或发酵失败。另外，杂菌的污染对产品的后处理带来困难，其结果是目的产物回收率下降。因此，培养基的灭菌是发酵工业中的关键技术之一。

最常用的灭菌方法是水蒸汽湿热灭菌。它的缺点是引起培养基中某些营养组份有较大的损失。为解决上述方法存在的问题，日本专利昭61-254183提出了利用高分子滤膜对培养基除菌的方法，这是现有灭菌技术中较为理想的方法，它是利用孔径为0.01-0.2μm的高分子滤膜直接对主要含有糖类、无机盐和硫胺素的培养基进行除菌。但其存在的问题是：培养基中的颗粒杂质和细菌对高分子滤膜的堵塞、污染程度和侵蚀、氧化程度会随处理时间的增加而越严重，造成过滤速率或处理能力下降、膜的使用寿命短。特别是处理含有酵母膏、玉米浆等的培养基时，上述问题更加严重。

本发明的目的在于通过采用机械过滤除颗粒杂质和紫外线杀菌的方法，解决由于培养基中颗粒杂质和细菌对高分子滤膜的堵塞污染和侵蚀氧化而造的过滤速率或处理能力下降、膜的使用寿命缩短的问题。

培养微生物和发酵用的培养基。

培养微生物和发酵用的培养基一般都含有碳源、氮源和无机盐以及微量元素。

常用的碳源主要有糖类、脂肪和某些有机酸及其盐等。葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、醋酸盐、乳酸、柠檬酸和石油等，都是常见的碳源，但本方法处理的培养基中不包含石油碳源。

氮源主要有玉米浆、酵毒膏、蛋白胨和尿素、氨水、磷酸氢二铵、硫酸铵等。

微量元素指的是钾、钠、镁、铁、硫、氯等。

维生素等也是常见的营养成分。

培养基的PH值对高分子滤膜性能有较大的影响。一般的高分子滤膜对处理液的PH值要求在2.0-12.0范围内。由于本发明的主要目的是除去液体培养基中的细菌。因此把液体培养基的PH值控制在4.5-6.5之间最好。这是由于细菌在酸性条件下，其繁殖缓慢或受到抑制，尽可能地把细菌数量控制在较低的范围内，同时又使高分子滤膜具有较好的操作条件，这有利于本发明的实施。因为在碱性条件下适宜细菌的生长和繁殖，加之有充足的营养源，使细菌得以迅速生长和繁殖，不利于灭菌，并消耗培养基。所以最好避免在碱性条件下操作。

本发明主要采用下面三种技术手段：

1、机械过滤除颗粒杂质

培养基中引入碳源、氮源、无机盐等的物质，不可避免含有颗粒杂质。实验室或小规模培养及发酵用的营养物质通常用化学纯以上的化学试剂，含的杂质量很少;而在工业微生物培养或发酵上，用于配制培养基的原料普遍是工业用料，含的颗粒杂质较多。特别是含有酵母膏、玉米浆等的培养基更是如此。如果不对培养基作预先除去杂质，直接用高分子滤膜除菌，必然导致高分子滤膜的严重堵塞和污染，甚至可能出现操作中途停止或失败。既使高分子膜堵塞、污染程度不严重，其过滤速率和处理能力也会显著下降。

本发明适用于大小规模的液体培养基的除菌。用本发明中的机械过滤除颗粒杂质的技术手段，可以有效地减轻高分子滤膜的堵塞和污染。

可用常见的机械过滤方法除去液体培养基中的机械杂质。如用丝网过滤、砂滤、离心过滤、滤布过滤、滤纸过滤等方法及它们相互组合的过滤方法。

用丝网过滤、滤布过滤和滤纸过滤方法比较好，其特点是液体损失很小，过滤速率快、成本低。特别是以它们组合方式的过滤，其效果更好。选用100目以上的丝网比较好，最好是选用不锈钢丝网。选用的滤布最好是除去25微米以上的杂质，滤布的形状可以是毡状、编织状等，材质可为化纤类、纯棉类、纯毛类等。滤纸最好是选用除去3微米以上杂质的滤纸，滤纸可以是定量滤纸、定性滤纸、工业用滤纸等。以丝网、滤布和滤纸三者组合方式的过滤效果最好，其次是滤布和滤纸组合的方式过滤。液体过滤顺序是先丝网过滤、再滤布过滤，最后滤纸过滤。也可单独使用滤纸或滤布过滤。培养基的流动方式可以是水平流动或垂直流动。最好是采用垂直向下流动方式。丝网和滤布可安装在一个过滤器内，也可分开单独使用。滤纸过滤最好单独使用。

一般使用上述滤布在常压下过滤液体培养基的处理能力在4-6m³/m²·h，滤纸则为2-5m³/m²·h。若用滤纸处理滤布过滤的滤液，其处理能力达到8-15m³/m²·h。使用滤布可增加滤纸的使用时间，减少更换次数，而滤布可进行反洗。应用丝网过滤可使滤布过滤速率提高0.2倍，而滤布过滤可使滤纸过滤速率提高0.5-2.0倍。

机械过滤的作用是减轻高分子滤膜的堵塞和污染程度，提高高分子滤膜的过滤速率或处理能力，有利于延长膜的使用寿命。

2、紫外线杀菌

在液体培养基配制、储存和通过高分子滤膜前的处理过程中，时时刻刻地都有细菌的污染和繁殖，既使培养基控制在酸性条件下，细菌的繁殖得到了一定程度的限制，但外界细菌的污染仍然会使培养基中的细菌数不断地增加，这是不容易避免的。如果直接用高分子滤膜除菌，其对滤膜的危害是十分严重的。细菌侵蚀和氧化高分子滤膜是造成膜使用寿命缩短的重要原因之一。

紫外线具有很好的杀菌作用，紫外线杀菌的照射方式可为直接照射、通过式照射，反向上层式照射、屏障式照射等。对于液体培养基杀菌，通常采用直接照射和通过式照射方式。考虑到紫外线穿透能力差，最好是采用通过式照射方式。

采用通过式照射时，培养基的流动方式可以是水平流动，也可以是垂直流动。但采用水平流动和垂直向下流动比较好。通过式照射的特点是紫外线利用率高，液体流层浅杀菌效果好，可连续操作。

紫外线的波长范围很宽，通常可选用200-300nm波长的紫外线，最好是250-270nm。紫外线照射强度可为10-500μw/cm²，最好是50-500μw/cm²，照射时间为0.5-5分钟比较好。

通常使用紫外线灯管杀菌。可以用一只或多只紫外线灯管组合起来使用。通过式紫外线杀菌器最好是选用园柱状的杀菌器，紫外线杀菌器可作并联杀菌或串联杀菌。

一般紫外线杀菌率在20%以上就有取得延长高分子滤膜使用寿命的效果;杀菌率在50%以上效果较好，杀菌率在85%以上效果最明显。

本发明还可采用其它物理杀菌方法，但应用紫外杀菌方法最为简单和经济，而且效果好。

紫外线杀菌作用是减轻细菌对高分子膜的侵蚀和氧化程度，延长膜的使用寿命，有利于培养基的灭菌。

3、高分子滤膜除菌

应用高分子滤膜除菌是一种较理想的方法。它是利用筛分原理，根据细菌尺寸的大小，选用相应较小孔径的滤膜，在常温常压下过滤流体、截留细菌，达到除去细菌的目的。

一般除菌用的高分子滤膜的孔径范围为：0.01-0.45μm。

对于液体培养基除菌所用膜的材质最好是众所周知的亲水性高分子材质。如：醋酸纤维素类、醋酸纤维酯类、聚砜类、聚丙烯腈类等。选好膜孔径也是十分重要的，膜孔径过大（如大于0.45μm）除菌不完全，膜孔径过小（如小于0.1μm）有些高分子营养物有可能被截留下来，营养物有所损失，影响微生物生长和繁殖以及发酵水平。因此，根据液体培养基中营养成份选择高分子滤膜孔径。对于含有无机盐和微量元素以及低分子营养物的液体培养基，可选用孔径为0.01-0.45μm的亲水性高分子滤膜。如含有：NaCl、MgSO₄、KH₂PO₄、Na₂HPO₄等无机盐以及含有尿素、葡萄糖、蔗糖、维生素等低分子有机物的液体培养基。

对于含有蛋白质、玉米浆、酵母膏等营养物质以及含有其他高分子有机物的液体培养基的除菌，最好选用0.1-0.45μm的亲水性材质的高分子滤膜。

亲水性高分子滤膜的形状可为：中空纤维状、平片状、螺旋卷式状、管状、褶裙状等。

高分子滤膜除菌手段在本发明中起的作用是制备无菌的液体培养基和克服营养组份加热变质、变褐的问题。

用下列操作步骤可完成本发明：

1、在操作前，根据高分子滤膜使用性能要求，可选用杀菌剂或高温水蒸汽等对高分子滤膜器与微生物培养罐或发酵罐相联接的管路进行消毒或灭菌。杀菌剂可以是（0.5-1）%的甲醛溶液或（3-5）%的双氧水溶液等，消毒时间应维持在1-3小时，水蒸汽灭菌条件为120℃，时间为10-30分钟，待消毒完成后，用水经过高分子滤膜过滤，冲洗上述杀菌剂。

2、按培养基的配方比例，在配料罐内配制液体培养基，无特殊要求，最好用无机酸把液体培养基PH值调至4.5-6.5之间。

3、以压缩空气或泵为动力，将液体培养基经机械过滤除颗粒杂质、紫外线预杀菌后，压入高分子滤膜过滤器，滤液可经储罐流入或直接流入微生物培养罐或发酵罐内。

与现有技术相比，本发明由于采用了机械过滤除杂质和紫外线杀菌的方法，较大地减轻了杂质和细菌对高分子滤膜的堵塞污染和侵蚀氧化程度，并仍可保持较高的透水能力，膜的使用寿命显著延长，培养基的处理能力可提高0.5-1.5倍，膜的使用寿命延长约0.2-0.5倍。

实施例1

以工业用的无机盐和低分子有机物为主要成分的培养基列入表1。每次在配料罐内用自来水配制30升培养基，并搅拌和充分溶解后，用0.30MPa的压缩空气加压液体培养基，培养基从配料罐底部流出，并用100目的不锈钢丝网和0.05m²的编织状的滤布和定性滤纸过滤，除去3微米以上的机械杂质，过滤时间13.5分钟。再经表2所示的紫外线杀菌器杀菌，培养基在杀菌器内停留时间为4.4分钟，即照射时间为4.4分钟。然后流入50升无菌储料罐内，并保持罐压为0.15MPa，最后培养基从储料罐底部流出经过表3的高分子滤膜除菌。高分子滤膜在使用前，用1%的甲醛溶液侵泡3小时，对膜和出口管线进行消毒后洗掉甲醛溶液。膜的除菌操作条件列入表4，总处理量为600升，每次处理30升，间歇操作10天，有效运行时间为50小时。膜不作清洗，表5为实施结果。

表1 培养基成分

成分	Na₂HPO₄·12H₂O	KH₂PO₄	MgSO₄·7H₂O	NaCl	蔗糖	尿素	维生素Bl
								％(W/W)	0.6	0.2	0.1	0.1	3	0.2	0.01

表2 紫外线杀菌器的性能参数

直径	有效长度	紫外线灯管	灯管功率	照射强度（254nm)/只
					mm	mm	只	W/只	μW/cm²
135	750	3	30	110

表3 高分子滤膜性能参数

材质	形状	孔径	膜有效面积	透水量（20℃，0.1MPa)
					聚砜	中空纤维	0.01μm	2m	40L/h

表4 高分子滤膜操作条件

膜入口压力	膜出口压力	PH	温度
				0.15MPa	0.04MPa	6	25℃

表5 实施例1结果

累计处理量,L 600

累计处理时间,h 50

每次平均处理时间,h 2.5

初始平均细菌数,个/mL 32

紫外线杀菌率,% 87.1

滤液出口细菌数,个/mL 0

清洗后透水量(20℃,0.1MPa),L/h 36(下降10%)

膜面状况：

膜的色泽稍有加深，污染物较少。

实施例2

方法同实施例1，在培养基中加入0.1%的酵母膏和玉米浆。改用表6的高分子滤膜除菌。机械过滤时间为14分钟，紫外线照射时间为4.6分钟。间歇操作5天，有效运行15小时。实施结果列入表7。

表6 高分子滤膜的性能参数

材质	形状	孔径	膜有效面积	透水量（20℃，0.1MPa)
					醋酸纤维素	平片	0.22μm	0.015m	50L/h

表7 实施例2结果

累计处理量,L 600

累计处理时间,h 15

每次平均处理时间,h 0.75

初始平均细菌数,个/mL 30

紫外线杀菌率,% 84.5

滤液出口细菌数,个/mL 0

清洗后透水量(25℃,0.1MPa),L/h 44.7(下降10.6%)

膜面状况：

膜面有较少污染物，略有粘液;膜的色泽略有加深。

实施例3

方法同实施例2，培养基PH为9.5，实施结果列表8。

表8 实施例3结果

累计处理量,L 600

累计处理时间,h 15.6

每次平均处理时间,h 0.78

初始平均细菌数,个/mL 41

紫外线杀菌率,% 85.2

滤液出口细菌数,个/mL 0

清洗后透水量,L/h 44.5(下降11%)

膜面状况：

粘液较多，有污染物，膜略有变硬，色泽稍有加深。

实施例4

方法同实施例2，只用滤布除去25微米的机械杂质，实施结果列入表9。

表9 实施例4结果

累计处理量,L 600

累计处理时间,h 19.4

每次平均处理时间,h 0.97

初始平均细菌数,个/mL 32

紫外线杀菌率,% 84.6

滤液出口细菌数,个/mL 0

清洗后透水量,L/h 41.7(下降16.6%)

膜面状况：

污染物较多，色泽加深略为明显。

实施例5

方法同实施例2，改用一只30W的紫外线灯管直接照射，照射高度为15cm，照射时间为15分钟。培养基液面面积为0.6×0.25m²，深度为0.2m，实施结果列入表10。

表10 实施例5结果

累计处理量,L 300

累计处理时间,h 7.6

每次平均处理时间,h 0.76

初始平均细菌数,个/mL 33

紫外线杀菌率,% 42

滤液出口细菌数,个/mL 0

清洗后透水量,L/h 44(下降12%)

膜面状况：

膜面有污染物，稍有粘液，色泽略有加深。

比较例1

方法同实施例2，无紫外线照射，实施结果列入表11。

表11 比较例1结果

累计处理量,L 300

累计处理时间,h 7.6

每次平均处理时间,h 0.76

初始平均细菌数,个/mL 37

滤液出口细菌数,个/mL 0

清洗后透水量,L/h 43.7(12.6%)

膜面状况：

有污染物，粘液稍多，膜色泽加深较明显，膜略有变硬。

比较例2

方法同实施例2，无机械过滤，每次操作完成后，清洗膜。实施结果见表12。

表12 比较例2结果

累计处理量,L 300

累计处理时间,h 15.8

每次平均处理时间,h 1.58

初始平均细菌数,个/mL 27

紫外线杀菌率,% 82

滤液出口细菌数,个/mL 0

最终透水量,L/h 32.2(下降35.6%)

膜面状况：

每次操作完成后，膜面上污染物较多，最终操作结束后，膜的色泽明显加深。

比较例3

方法同实施例2，无机械过滤和紫外线照射，每次操作完成后，清洗膜，实施结果列入表13。

表13 比较例3结果

累计处理量,L 420

累计处理时间,h 23.1

每次平均处理时间,h 1.65

初始平均细菌数,个/mL 30

滤液出口细菌数,个/mL 0

最终透水量,L/h 23.5(下降53%)

膜面状况：

每次操作完成后，膜面上污染物很多，最终操作结束后，膜的色泽明显加深，膜较明显变硬变脆。

比较例4

方法同实施例1，加入0.1%的酵母膏和玉米浆。无机械过滤和紫外线杀菌。每次操作完成后，清洗膜，实施结果列入表14。

表14 比较例4结果

累计处理量,L 150

累计处理时间,h 26

每次平均处理时间,h 5.2

初始平均细菌数,个/mL 28

滤液出口细菌数,个/mL 0

最终透水量,L/h 9.5(下降76%)

膜面状况：

Claims

1、一种用高分子滤膜对液体培养基除菌的方法。其特征在于采用机械过滤除颗粒杂质和紫外线杀菌作预处理方法与高分子滤膜除菌方法相结合，制备无菌液体培养基。

2、按照权利要求1的方法，其特征在于选用滤布和滤纸过滤除去机械杂质。最好是选用除去25微米以上杂质的滤布和除去3微米以上杂质的滤纸。

3、按照权利要求1的方法，其特征在于紫外线波长为200-300nm，最好是250-270nm。照射强度最好是50-500μw/cm²，照射时间最好是0.5-5.0分钟。

4、按照权利要求1的方法，其特征在于液体培养基的PH值范围为2.0-12.0，最好是4.5-6.5。

5、按照权利要求1的方法，其特征在于高分子滤膜为亲水性材质的滤膜。

6、按照权利要求的1，5的方法，其特征在于高分子滤膜孔径为0.01-0.45微米，最好是0.1-0.45微米。

7、按照权利要求6的方法，其特征在于高分子滤膜的形状可为平片状、中空纤维状、螺旋卷式状、褶裙状和管状等。