JPS58180499A - カテコ−ル２，３−オキシゲナ−ゼをコ−ドする遺伝子を含有する新規発現ベクタ−、得られた該酵素及びその適用 - Google Patents
カテコ−ル２，３−オキシゲナ−ゼをコ−ドする遺伝子を含有する新規発現ベクタ−、得られた該酵素及びその適用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は各種の微生物、特にバチルス スブチリス（３
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）等のグラム陽性
薗及びファージＭ１３中で、カテコール ２，３−オキ
シゲナーゼをコードする遺伝子の発現及びクローン化に
関する。 詳しくは、本発明は新規なりローン化及び発境ベクター
、特にプラスミドベクター及びその適用に関する。 最終的に、本発明は、得られる酵素即ちカテコール ２
．３−オキシゲナーゼの各種分野での利用に関している
。 ある種のシュードモナス菌がトルエン分解能を有するこ
とは既に知られている。 その理由は、該菌が下式に従い、１〜ルエンを細胞によ
り直接同化できる誘導体に徐々にトランスフオームする
連のｌＰｉ ＊ ｇｆをコードしているＴＯＬ又は＋
１ ＷＷＯ（１１７ｋｂ）と呼ばれるプラスミドを含ん
でいるためである。 ９− 〔式中ＸＯはキシレン オキシゲナーゼを、ＢＡＤＨは
ベンジルアルコール デバイドロゲナーゼを、ＢＺＤＨ
はベンズアルデヒド デバイドロゲナーゼを、Ｔｏはト
ルエート／ベンゾエートオキシゲナーゼを、Ｃ２，３−
０はカテコール２．３−オキシゲナーＵを、ＨＭ Ｓ
Ｄはハイドロキシムコンセミアルデヒド デバイドロゲ
ナーゼを、４−ＯＴは４−オキサクロトネート タート
メラーゼを、トＩ Ｍ Ｓ Ｈはハイドロキシムコンセ
ミアルデヒド ハイドロゲナーゼを、４−００は４−オ
キサクロトネート デカルボキシラーゼを夫々示す。） カテコール ２，３−オキシゲナーゼ （Ｃ２，３−０）は、これら酵素（ＥＣＮｏ、１゜１３
．１１．２）のひとつである。これは下記反応式に従い
カテコールをムコン酸セミアルデヒドに変換させる。 １０− Ｏｌｌ ＯＨ
上記酵素の活性は、カラーテストにより容易に示し得る
。なぜならカテコールは無色であるが、その分解生成物
、即ちムコンセミアルデヒドは黄色である。 カテコール ２，３−オキシゲナーゼを、以下ｒＣ２，
３−０，１と略称し、該酵素の合成をコードする遺伝子
を、「ｘｙｌＥＪ又は「遺伝子Ｃ２゜３−Ｏ」と略称す
ることがある。 上述したように、本酵素は無色のカテコールを分解し、
これを黄色のセミアルデヒドに変換させるものであると
いう事実より、多数の細菌］口二一を選別して、ＸＶＩ
Ｅ遺伝子を含む特定のプラスミドによってどの細菌が
形質転換されたか、又は反対にｘｙｌ Ｅ遺伝子が不活
性化されたかの決定を可能とするカラーテストの実施可
能性を包含している。 従来、ｘｙｌ Ｅ遺伝子を生ずるシュードモナスのよう
なダラム陰性菌である“ｒシエリヒア コリ（Ｅ ５ｃ
ｈａｒｌｃｈｌａ ｃｏｌ Ｉ ）内でｘｙｌ Ｆ遺
伝子の発現に成功した例が報告されている（文献６．９
．２７）。 Ｅ、００１１又はシュードモナス内でのｘｙｌ Ｅ遺伝
子の発現は、工業上大きな欠点を有している。なぜなら
２等菌種は病原性であり、人類に有害である。従って之
昏菌梳を用いてカテコール オキシゲナーゼを工業的規
模で製造することは困難である。 工業的規模で最も広範に利用できる細菌はバチルス ス
ブチリス（Ｂ 、 ５ｕｂｔｌｌｌｓ）である。これは
ダラム陽性菌であり、該細菌での異種特典的遺伝子の発
現は困難である。 現在工業的に相当に重要な細菌である、例えばバチルス
スブチリスに対するカラーテストは知られていないの
で、グラム陽性菌内で発現される、ｘｙｌＥＩ伝子を含
むプラスミドの研究は興味のあることである。 ファージ、殊にＤＮＡ配列手段としてのファージＭ １
３１１ｐ７ （３ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌ ａｂｏｒａ−ｔＯｒｉｅＳ及びＰＬ Ｌａｂｓ）
として近年用いられているファージＭ１３の場合、着色
剤Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド）を用いたカラーテストに代
えてカテコールを用いたカラーテストを行なうことは、
効率面及びコスト面において非常に有利である。事実カ
テコールは着色剤Ｘ−ｇａｌより約５０００倍も安価で
ある。 更に、得られる酵素即ちカテコール ２．３−オキシゲ
ナーゼは、カテコール自身及びその誘導体の両者に対す
る作用の面で工業上の価値がある。 本発明によれば、酵素カテコール ２，３−オキシゲナ
ーゼの適用は、以下の二つの主要な分野に区別される。 即ち第一の主要な分野は食品工業分野である。フルーツ
類は多量のカテコール類を含有しており、これは光及び
酸素の作用条件下に、ポリフェノールオキシダーゼ類に
より、着色され１３− た化合物に変換される。これがフルーツの褐色化に対応
する。 Ｃ２，３−０を、フルーツ内でのカテコールのアルデヒ
ドへの変換に用いれば、ポリフェノールオキシゲナーピ
の作用を封鎖でき、かくしてフルーツの褐色化を回避で
きる。 この適用のためには勿論精製された酵素を用いることが
できるが、該酵素を含む細菌、特に食品分野において興
味のある劃り例えばラクトバチルス（Ｌ ａｃｔｏｂａ
ｃ Ｉ ｌ ｌｕｓ ）ヤストレプトコツカス（Ｓ ｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ １ａｃｔｉｃ）の場合には
、これらを直接に用いることも可能である。 また酵素Ｃ２，３−０は、医薬品及び化粧品産業におい
ての使用にも適している。即ちカテコール及びそのある
種の誘導体は１１周知の通り強力なアレルゲンである。 最もよく知られ、下式で表わされる３−ペンタデシルカ
テコールは、トキシコデンドロン（Ｔｏｘｌｃｏｄｅｎ
ｄｒｏｎ）の多くの種、例えばツタウルシ類（ｐｏｉｓ
ｏｎ Ｉｖｙ 、 ｐｏｉｓｏｎ ｏａｋ ）に存
在しており、米国人の約５０％に対して接触１４− アレルギーを想起する。 ０ｎ Ｃ２，３−０が、関連する誘導体の芳香環を分解し、か
くしてそれらのアレルギー性を非常に顕著に低減させる
ことが判った。 Ｃ２，３−０はまた医薬品分野においても、カテコール
アミン類（アドレナリン、ノルアドレナリン、ＤＯＰＡ
、ＤＯＰＡＭＩＮＥ・・・）の構造を変化させるために
利用できる。 化粧品分野においても、Ｃ２，３−０は、ある種の化粧
品基材の分解によって発生するカテコール型化合物の存
在を抑制するために用いられる。 これらの二種の適用、即ち食品工業並びに化粧品及び医
薬品Ｔ業分野での適用において、バチルス スブチリス
からＣ２，３−０を製造し得ることは、特に大ぎな利点
となる。 宿主種としてのバチルス スブチリスが有利であるのは
、エシェリヒア ］コリとは異なり、これが人類及び動
物の病気に全く関連しない非病原性の微生物であるため
である。 このため、エシェリヒア コリーとは異なり、バチルス
スブチリス及びその代謝産物は、産業レベルでの使用
が許容されている。 加えて、バチルス スブチリスはダラム陽性菌のうらで
最もよく知られており、また最もよく研究されている。 最後に、バチルス スブチリスは、酵素、特にアミラー
Ｕ類及びプロテア−ぜ類の製造工業において広範に利用
される菌であり、その工業的培養条件はよく知られてい
る。 本発明は、少なくともカテコール ２．３−オキシゲナ
ーゼの合成をコードするｘｙｌ Ｅ遺伝子、及びグラム
陽性菌内で該ｘｙｌ Ｆ遺伝子を発現させるためのプロ
モーターを含有するプラスミドベクターに係る。 ｘｙｌ Ｅ遺伝子を発現させるためのプロモーターは、
好ましくは、ダラム陽性薗の染色体ＤＮＡ配列（Ｄ Ｎ
Ａ ５ｅｑｕθｎｃｅ ）から得られるが、該プロモ
ーターは他の物質例えばプラスミド類やバクテリオファ
ージ類から得られるものであってもよい。 バチルス スブチリス、バチルス リシエニフオルミス
（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｌｓ ） 、 ｔ＜ｆ
ルス７ミルス（８，ｐｕｍｌｌｕｓ ）等のバチルス類
細菌の各種の染色体ＤＮＡ起源とするプロモーター、エ
シェリヒア コリー等のダラム陰性菌の染色体ＤＮＡ由
来のプロモーター等も利用することができる。またプラ
スミド類特にダラム陽性閑のプラスミド類、例えばバチ
ルス スブチリスにおいて複製するｐＵＢｌｌｏ等に由
来するプロモーターを用いることも可能である。更に例
えばバクテリオファージ由来９等のダラム陽性菌のバク
テリオファージ等のバクテリオファージ由来のプロモー
ターもまた利用可能である。本発明に利用するに適した
プロモーターは、各種のものがあり、いずれもグラム陽
性菌株、例えばバチルス、ストレプトコッカス、ラクト
バチルス、スタフイロコツ力１７− ス及びコリネバクテリウムの夫々に採用できる。 既述の通り、これらプラスミドベクターの主な興味は、
バチルス スブチリスにおいて特異的遺伝子をクローン
化し、更にはバチルス スブチリスの培養により酵素Ｃ
２，３−０を得ることに存Ｊるので、本発明は、バチル
ス、より詳しくはバチルス スブヂリスの染色体ＤＮＡ
配列における遺伝子ｘｙｌ Ｅの機能的発現のプロモー
ターを提供せんとするものである。 本発明のプラスミドベクターをクローン化ベクターとし
て作用させようとする場合、該プラスミドベクターが、
少なくとも１つの特異的な（ｕｎｉｑｕθ）制限部位を
含み、該部位が、該部位へＤＮＡ配列が挿入（Ｉｎｓθ
ｒｔ）されると遺伝子ｘｙｌＥを不活性化させるような
位置に存するならば、特に有利である。従って、−Ｌ配
部位の位置は、遺伝子ｘｙｌ Ｅ内であってもよく、又
は上記プロモーターの下流側であって遺伝子ｘｙｌ Ｅ
の−Ｌ流側であってもよい。この種の不活性化は、コロ
ニーにカテコールを散布し、次いで形質転換されたにも
拘−１８＝ らず、遺伝子ｘｙｌ Ｅが発現されなかったことに基づ
き、黄色を呈しないコロニーを選別することにより、容
易に示すことができる。 また、上記特異的制限部位の中でも、容易に導入可能な
制限部位ＢａｍＨ１が好ましい。これについては、ｐ
ＴＧ４０２、例えば、ｐ ＴＧ４０３゜ｐＴＧ４０４．
Ｉ）ＴＧ４０５．ＥＩ ＴＧ４０６．１）ＴＧ４０７．
ｐ ＴＧ４０８．ｐ ＴＧ４０９及びｐＴＧ４１０から
誘導されたプラスミドに関する実施例にて後述する。 更に、本発明は、上記本発明のプラスミドで形質転換さ
れたダラム陽性菌、特にバチルス スブチリスに関する
。使用できるダラム陽性菌としては、ラクトバチルス、
ストレプトコッカス及びスタフィロコッカス又はコリネ
バクテリウムを挙げることができる。 また、本発明は、他のタイプのベクターにも関する。該
ベクターは、ファージＭ１３からｍｌ導されたファージ
であり、そのＤＮＡが、少なくともカテコール ２．３
−オキシゲナーゼの合成を］−ドする遺伝子ｘｙｌ Ｅ
を含有することを特徴とする。 このファージの［’Ｊ Ｎ Ａは、好ましくは、少なく
とも１つの特異的な（ｕｎｉｑｕｅ）制限部位を、該部
位においてＤＮＡ配列が挿入されると遺伝子ｘｙｌＥの
発現を不活性化させるような位置に含有している。上記
機能を有する数個の特異的制限部位（多重クローン化部
位、ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｔｏｎｉｎｇ″５ｉｔｅと
呼ばれる）を有するのが好ましい。 ファージＭ１３の利点は、この線状コリファージが、Ｄ
ＮＡのクローン化及び配列化に用いられることであり、
上記誘導されたファージは、ジエイ・メシング（Ｊ １
Ｍｅｓｓｉｎｇ）により開発され、及びＰＬ Ｌａｂ
ｓによりＤＮＡのクローン化及び配列化用のコンブリー
トキラ］・とじて販売されているファージＭ１３園ｐ７
である。 このファージは、多重クローン化部位を含んでおり、該
部位には、各種の制限断片（ｒｆｌＳｔｒｌ（ｉ−ｔｉ
ｏｎ ｒｒａｇｌｅｎｔ＆ ） 、例えばＥＣ０ＲＩ
、ＢａｍＨＩ、ＡＣＣＩ、Ｈｉｎｄ［、ｐｓｔｉ ａ
ｎｄ ｓａｌ Ｉ断片等を挿入することができる。 従って、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド及び５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トシドを、菌株およびファージＭ１３ｍｐ７用の培地に
添加すると、上記イソプロピルーβ−Ｄ−ガラクトシド
は、ファージＭ１３上に遺伝子１ａｃ Ｚの一部を誘発
し、これは、該細胞中においてファクターＦ′上に担持
されている遺伝子の最終部分が補足（ｃｏｇｉｐｌθｉ
＋ｅｎｔ）されると、陽性のβ−ガラクトシダーゼ表現
型となる。このため、指示薬５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（着色剤Ｘ−ｏ
ａｔ）が青色に変色する。 上記多重クローン化部位においてＤＮＡ断片が挿入され
ると、β−ガラクトシダーゼの相補性（ｃｏｓｐ＋ｅｉ
ｅｎｔａｔ＋ｏｎ ）が不活性化する。これら条件下で
は、着色指示薬は変色しない。しかしながら、上記指示
薬は極めて高価であり、ペトリ皿当り約３フラン程度も
することに注目すべきである。 また、各試験においては、多数のベトリ皿を用い２１− る必要があるので、経費は時として極めて高いものとな
る。 本発明の上記ファージを用いることにより、はるかにわ
ずられしくない指示薬であるカテコールを用いることが
でき、加えて、ファージＭ１３は、ファージＭ’１３ｉ
ｐ７の如く、各種菌株において、相補性に依存すること
なく、従って遺伝子１ａｃ ＺΔＭ１５を含有する特定
の菌株に依存することなく、使用することができる。 配列化に用いるには、約１５の相補性塩基を含むオリゴ
ヌクレオチドが、ファージのＤＮＡと、咳ＤＮＡ中の挿
入部位に非常に近接した領域において、交雑（ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚｅ ）されねばならない。 既述のベクターに加えて、本発明は更に該ベクターを用
いてバクテリア内で遺伝子をクローン化する方法、及び
これらプラスミドにより形質転換されたバクテリア、並
びに該バクテリアを用いてカテコール ２，３−オキシ
ゲナーゼを製造する方法に関する。 更に、本発明は、本発明により得られたバクテ２２− リアを用いて得られたカテコール ２，３−オキシゲナ
ーゼを、食品添加剤、より詳しくは食品工業における保
存剤として用いる用途、及び化粧品工業における保存剤
として用いる用途、並びに医療分野においてアレルギー
、特にカテコール及びその誘導体により惹起されたアレ
ルギーの治療及び防止用の活性成分として用いる用途に
も関（る。 また、酵素カテコール ２．３−オキシゲナーゼは、ウ
ルシオール又はその誘導体により汚染された材料表面の
汚染除去剤としても用いることができる。このような用
途にカテコール ２，３−オキシゲナーゼを用いること
により、ウルシオール又はその誘導体により汚染された
表面と皮膚との再接触の問題を解消し得る。該表面の処
理は、カテコール ２．３−オキシゲナーゼと洗剤とを
含有する溶液又は懸濁液中で行ない得る。後述するよう
に、カテコール ２．３−オキシゲナーゼは、実験空用
又は市販の洗剤の存在下で活性を保持する。 例えばＢ、スブチリスにより生産されるプロテアーゼ等
のバクテリアにより生産された蛋白質は、いくつかの洗
濯川石けん及び粉末において洗剤と共に使用されている
。フランス国特許第１５２０９４８月及び第２１１９４
８０Ｍによれば、洗濯川石けん及び粉末においてプロテ
アーゼ粒を用いることが記載されている。 本発明により、Ｂ、ズブチリス中でカテコール２．３−
オキシゲナーぜを生産することにより、カテコール ２
．３−オキシゲナーゼとプロテアーゼとの両方を生産す
るＢ、スブチリス菌株の製造が予想される。かかる！ｌ
ｉ株の出現により、現在通常の洗濯用洗剤で浄化されて
いるすべての表面からウルシオール及びそのＭ導体の汚
染除去が特に有利なものとなるであろう。 カテコール ２，３−オキシゲナーゼを汚染除去剤とし
て用いる場合、ローション又はバブルバス（ｂｕｂｂｌ
ｅ ｂａｔｈ）の形態でも用いることができるが、こ
れらに限定されるものではない。 カテコール ２．３−′Ａキシゲナーゼの特性を、無細
胞性バクテリア粗抽出物について調べた。該バクテリア
抽出物は、カテコールのみならず、４−メチルカテコー
ルをも酸化する能力があり、３２６及び３７８ｎｌの２
つの吸収ピークを有する黄色生成物を生じた。 得られた菌株の酵素活性を、分光光度計により測定した
結果、反応混合物中でのセミアルデヒドの蓄積に基づき
、３７５ｎｉの吸収が増大した。 １１； ０．１Ｍのりん酸塩緩衝液（ｐＨ６，８）２．９−、バ
クテリア抽出物０．１顧及び０．０２Ｍのカテコール溶
液１０μＱを、分光光度計のセルに入れ、３０℃にて１
分間測定する。 該機器（ＬＪｖｉｋｏｎ ８１０／８２０ ）には、計
算ユニットが備えられており、これによれば次の結果が
得られる。 ０各測定についてのＤＯ Ｏ各測定間の△Ｄ０ ０ＤＯ／分で表現されるスピード ０曲線の線型性（１ｉｎｅａｒｉｔｙ ）を検証するた
めの相関係数の計算 ２５− １つの測定は、６秒毎に１分間行なわれた（１０ポイン
１−）。 酵素活性は、ＩＩＵ／′Ｉｆ（ｌ蛋白で表わす。１＋ｉ
ＬＩは、−Ｆ配条件下３０℃で１分間に生じた生成物の
１ナノモルに相当づる。 ｔｍｃ圭仝賛遣辛−ｔ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）等のグラム陽性
薗及びファージＭ１３中で、カテコール ２，３−オキ
シゲナーゼをコードする遺伝子の発現及びクローン化に
関する。 詳しくは、本発明は新規なりローン化及び発境ベクター
、特にプラスミドベクター及びその適用に関する。 最終的に、本発明は、得られる酵素即ちカテコール ２
．３−オキシゲナーゼの各種分野での利用に関している
。 ある種のシュードモナス菌がトルエン分解能を有するこ
とは既に知られている。 その理由は、該菌が下式に従い、１〜ルエンを細胞によ
り直接同化できる誘導体に徐々にトランスフオームする
連のｌＰｉ ＊ ｇｆをコードしているＴＯＬ又は＋
１ ＷＷＯ（１１７ｋｂ）と呼ばれるプラスミドを含ん
でいるためである。 ９− 〔式中ＸＯはキシレン オキシゲナーゼを、ＢＡＤＨは
ベンジルアルコール デバイドロゲナーゼを、ＢＺＤＨ
はベンズアルデヒド デバイドロゲナーゼを、Ｔｏはト
ルエート／ベンゾエートオキシゲナーゼを、Ｃ２，３−
０はカテコール２．３−オキシゲナーＵを、ＨＭ Ｓ
Ｄはハイドロキシムコンセミアルデヒド デバイドロゲ
ナーゼを、４−ＯＴは４−オキサクロトネート タート
メラーゼを、トＩ Ｍ Ｓ Ｈはハイドロキシムコンセ
ミアルデヒド ハイドロゲナーゼを、４−００は４−オ
キサクロトネート デカルボキシラーゼを夫々示す。） カテコール ２，３−オキシゲナーゼ （Ｃ２，３−０）は、これら酵素（ＥＣＮｏ、１゜１３
．１１．２）のひとつである。これは下記反応式に従い
カテコールをムコン酸セミアルデヒドに変換させる。 １０− Ｏｌｌ ＯＨ
上記酵素の活性は、カラーテストにより容易に示し得る
。なぜならカテコールは無色であるが、その分解生成物
、即ちムコンセミアルデヒドは黄色である。 カテコール ２，３−オキシゲナーゼを、以下ｒＣ２，
３−０，１と略称し、該酵素の合成をコードする遺伝子
を、「ｘｙｌＥＪ又は「遺伝子Ｃ２゜３−Ｏ」と略称す
ることがある。 上述したように、本酵素は無色のカテコールを分解し、
これを黄色のセミアルデヒドに変換させるものであると
いう事実より、多数の細菌］口二一を選別して、ＸＶＩ
Ｅ遺伝子を含む特定のプラスミドによってどの細菌が
形質転換されたか、又は反対にｘｙｌ Ｅ遺伝子が不活
性化されたかの決定を可能とするカラーテストの実施可
能性を包含している。 従来、ｘｙｌ Ｅ遺伝子を生ずるシュードモナスのよう
なダラム陰性菌である“ｒシエリヒア コリ（Ｅ ５ｃ
ｈａｒｌｃｈｌａ ｃｏｌ Ｉ ）内でｘｙｌ Ｆ遺
伝子の発現に成功した例が報告されている（文献６．９
．２７）。 Ｅ、００１１又はシュードモナス内でのｘｙｌ Ｅ遺伝
子の発現は、工業上大きな欠点を有している。なぜなら
２等菌種は病原性であり、人類に有害である。従って之
昏菌梳を用いてカテコール オキシゲナーゼを工業的規
模で製造することは困難である。 工業的規模で最も広範に利用できる細菌はバチルス ス
ブチリス（Ｂ 、 ５ｕｂｔｌｌｌｓ）である。これは
ダラム陽性菌であり、該細菌での異種特典的遺伝子の発
現は困難である。 現在工業的に相当に重要な細菌である、例えばバチルス
スブチリスに対するカラーテストは知られていないの
で、グラム陽性菌内で発現される、ｘｙｌＥＩ伝子を含
むプラスミドの研究は興味のあることである。 ファージ、殊にＤＮＡ配列手段としてのファージＭ １
３１１ｐ７ （３ｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌ ａｂｏｒａ−ｔＯｒｉｅＳ及びＰＬ Ｌａｂｓ）
として近年用いられているファージＭ１３の場合、着色
剤Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド）を用いたカラーテストに代
えてカテコールを用いたカラーテストを行なうことは、
効率面及びコスト面において非常に有利である。事実カ
テコールは着色剤Ｘ−ｇａｌより約５０００倍も安価で
ある。 更に、得られる酵素即ちカテコール ２．３−オキシゲ
ナーゼは、カテコール自身及びその誘導体の両者に対す
る作用の面で工業上の価値がある。 本発明によれば、酵素カテコール ２，３−オキシゲナ
ーゼの適用は、以下の二つの主要な分野に区別される。 即ち第一の主要な分野は食品工業分野である。フルーツ
類は多量のカテコール類を含有しており、これは光及び
酸素の作用条件下に、ポリフェノールオキシダーゼ類に
より、着色され１３− た化合物に変換される。これがフルーツの褐色化に対応
する。 Ｃ２，３−０を、フルーツ内でのカテコールのアルデヒ
ドへの変換に用いれば、ポリフェノールオキシゲナーピ
の作用を封鎖でき、かくしてフルーツの褐色化を回避で
きる。 この適用のためには勿論精製された酵素を用いることが
できるが、該酵素を含む細菌、特に食品分野において興
味のある劃り例えばラクトバチルス（Ｌ ａｃｔｏｂａ
ｃ Ｉ ｌ ｌｕｓ ）ヤストレプトコツカス（Ｓ ｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ １ａｃｔｉｃ）の場合には
、これらを直接に用いることも可能である。 また酵素Ｃ２，３−０は、医薬品及び化粧品産業におい
ての使用にも適している。即ちカテコール及びそのある
種の誘導体は１１周知の通り強力なアレルゲンである。 最もよく知られ、下式で表わされる３−ペンタデシルカ
テコールは、トキシコデンドロン（Ｔｏｘｌｃｏｄｅｎ
ｄｒｏｎ）の多くの種、例えばツタウルシ類（ｐｏｉｓ
ｏｎ Ｉｖｙ 、 ｐｏｉｓｏｎ ｏａｋ ）に存
在しており、米国人の約５０％に対して接触１４− アレルギーを想起する。 ０ｎ Ｃ２，３−０が、関連する誘導体の芳香環を分解し、か
くしてそれらのアレルギー性を非常に顕著に低減させる
ことが判った。 Ｃ２，３−０はまた医薬品分野においても、カテコール
アミン類（アドレナリン、ノルアドレナリン、ＤＯＰＡ
、ＤＯＰＡＭＩＮＥ・・・）の構造を変化させるために
利用できる。 化粧品分野においても、Ｃ２，３−０は、ある種の化粧
品基材の分解によって発生するカテコール型化合物の存
在を抑制するために用いられる。 これらの二種の適用、即ち食品工業並びに化粧品及び医
薬品Ｔ業分野での適用において、バチルス スブチリス
からＣ２，３−０を製造し得ることは、特に大ぎな利点
となる。 宿主種としてのバチルス スブチリスが有利であるのは
、エシェリヒア ］コリとは異なり、これが人類及び動
物の病気に全く関連しない非病原性の微生物であるため
である。 このため、エシェリヒア コリーとは異なり、バチルス
スブチリス及びその代謝産物は、産業レベルでの使用
が許容されている。 加えて、バチルス スブチリスはダラム陽性菌のうらで
最もよく知られており、また最もよく研究されている。 最後に、バチルス スブチリスは、酵素、特にアミラー
Ｕ類及びプロテア−ぜ類の製造工業において広範に利用
される菌であり、その工業的培養条件はよく知られてい
る。 本発明は、少なくともカテコール ２．３−オキシゲナ
ーゼの合成をコードするｘｙｌ Ｅ遺伝子、及びグラム
陽性菌内で該ｘｙｌ Ｆ遺伝子を発現させるためのプロ
モーターを含有するプラスミドベクターに係る。 ｘｙｌ Ｅ遺伝子を発現させるためのプロモーターは、
好ましくは、ダラム陽性薗の染色体ＤＮＡ配列（Ｄ Ｎ
Ａ ５ｅｑｕθｎｃｅ ）から得られるが、該プロモ
ーターは他の物質例えばプラスミド類やバクテリオファ
ージ類から得られるものであってもよい。 バチルス スブチリス、バチルス リシエニフオルミス
（Ｂ、 Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｌｓ ） 、 ｔ＜ｆ
ルス７ミルス（８，ｐｕｍｌｌｕｓ ）等のバチルス類
細菌の各種の染色体ＤＮＡ起源とするプロモーター、エ
シェリヒア コリー等のダラム陰性菌の染色体ＤＮＡ由
来のプロモーター等も利用することができる。またプラ
スミド類特にダラム陽性閑のプラスミド類、例えばバチ
ルス スブチリスにおいて複製するｐＵＢｌｌｏ等に由
来するプロモーターを用いることも可能である。更に例
えばバクテリオファージ由来９等のダラム陽性菌のバク
テリオファージ等のバクテリオファージ由来のプロモー
ターもまた利用可能である。本発明に利用するに適した
プロモーターは、各種のものがあり、いずれもグラム陽
性菌株、例えばバチルス、ストレプトコッカス、ラクト
バチルス、スタフイロコツ力１７− ス及びコリネバクテリウムの夫々に採用できる。 既述の通り、これらプラスミドベクターの主な興味は、
バチルス スブチリスにおいて特異的遺伝子をクローン
化し、更にはバチルス スブチリスの培養により酵素Ｃ
２，３−０を得ることに存Ｊるので、本発明は、バチル
ス、より詳しくはバチルス スブヂリスの染色体ＤＮＡ
配列における遺伝子ｘｙｌ Ｅの機能的発現のプロモー
ターを提供せんとするものである。 本発明のプラスミドベクターをクローン化ベクターとし
て作用させようとする場合、該プラスミドベクターが、
少なくとも１つの特異的な（ｕｎｉｑｕθ）制限部位を
含み、該部位が、該部位へＤＮＡ配列が挿入（Ｉｎｓθ
ｒｔ）されると遺伝子ｘｙｌＥを不活性化させるような
位置に存するならば、特に有利である。従って、−Ｌ配
部位の位置は、遺伝子ｘｙｌ Ｅ内であってもよく、又
は上記プロモーターの下流側であって遺伝子ｘｙｌ Ｅ
の−Ｌ流側であってもよい。この種の不活性化は、コロ
ニーにカテコールを散布し、次いで形質転換されたにも
拘−１８＝ らず、遺伝子ｘｙｌ Ｅが発現されなかったことに基づ
き、黄色を呈しないコロニーを選別することにより、容
易に示すことができる。 また、上記特異的制限部位の中でも、容易に導入可能な
制限部位ＢａｍＨ１が好ましい。これについては、ｐ
ＴＧ４０２、例えば、ｐ ＴＧ４０３゜ｐＴＧ４０４．
Ｉ）ＴＧ４０５．ＥＩ ＴＧ４０６．１）ＴＧ４０７．
ｐ ＴＧ４０８．ｐ ＴＧ４０９及びｐＴＧ４１０から
誘導されたプラスミドに関する実施例にて後述する。 更に、本発明は、上記本発明のプラスミドで形質転換さ
れたダラム陽性菌、特にバチルス スブチリスに関する
。使用できるダラム陽性菌としては、ラクトバチルス、
ストレプトコッカス及びスタフィロコッカス又はコリネ
バクテリウムを挙げることができる。 また、本発明は、他のタイプのベクターにも関する。該
ベクターは、ファージＭ１３からｍｌ導されたファージ
であり、そのＤＮＡが、少なくともカテコール ２．３
−オキシゲナーゼの合成を］−ドする遺伝子ｘｙｌ Ｅ
を含有することを特徴とする。 このファージの［’Ｊ Ｎ Ａは、好ましくは、少なく
とも１つの特異的な（ｕｎｉｑｕｅ）制限部位を、該部
位においてＤＮＡ配列が挿入されると遺伝子ｘｙｌＥの
発現を不活性化させるような位置に含有している。上記
機能を有する数個の特異的制限部位（多重クローン化部
位、ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｔｏｎｉｎｇ″５ｉｔｅと
呼ばれる）を有するのが好ましい。 ファージＭ１３の利点は、この線状コリファージが、Ｄ
ＮＡのクローン化及び配列化に用いられることであり、
上記誘導されたファージは、ジエイ・メシング（Ｊ １
Ｍｅｓｓｉｎｇ）により開発され、及びＰＬ Ｌａｂ
ｓによりＤＮＡのクローン化及び配列化用のコンブリー
トキラ］・とじて販売されているファージＭ１３園ｐ７
である。 このファージは、多重クローン化部位を含んでおり、該
部位には、各種の制限断片（ｒｆｌＳｔｒｌ（ｉ−ｔｉ
ｏｎ ｒｒａｇｌｅｎｔ＆ ） 、例えばＥＣ０ＲＩ
、ＢａｍＨＩ、ＡＣＣＩ、Ｈｉｎｄ［、ｐｓｔｉ ａ
ｎｄ ｓａｌ Ｉ断片等を挿入することができる。 従って、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド及び５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トシドを、菌株およびファージＭ１３ｍｐ７用の培地に
添加すると、上記イソプロピルーβ−Ｄ−ガラクトシド
は、ファージＭ１３上に遺伝子１ａｃ Ｚの一部を誘発
し、これは、該細胞中においてファクターＦ′上に担持
されている遺伝子の最終部分が補足（ｃｏｇｉｐｌθｉ
＋ｅｎｔ）されると、陽性のβ−ガラクトシダーゼ表現
型となる。このため、指示薬５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（着色剤Ｘ−ｏ
ａｔ）が青色に変色する。 上記多重クローン化部位においてＤＮＡ断片が挿入され
ると、β−ガラクトシダーゼの相補性（ｃｏｓｐ＋ｅｉ
ｅｎｔａｔ＋ｏｎ ）が不活性化する。これら条件下で
は、着色指示薬は変色しない。しかしながら、上記指示
薬は極めて高価であり、ペトリ皿当り約３フラン程度も
することに注目すべきである。 また、各試験においては、多数のベトリ皿を用い２１− る必要があるので、経費は時として極めて高いものとな
る。 本発明の上記ファージを用いることにより、はるかにわ
ずられしくない指示薬であるカテコールを用いることが
でき、加えて、ファージＭ１３は、ファージＭ’１３ｉ
ｐ７の如く、各種菌株において、相補性に依存すること
なく、従って遺伝子１ａｃ ＺΔＭ１５を含有する特定
の菌株に依存することなく、使用することができる。 配列化に用いるには、約１５の相補性塩基を含むオリゴ
ヌクレオチドが、ファージのＤＮＡと、咳ＤＮＡ中の挿
入部位に非常に近接した領域において、交雑（ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚｅ ）されねばならない。 既述のベクターに加えて、本発明は更に該ベクターを用
いてバクテリア内で遺伝子をクローン化する方法、及び
これらプラスミドにより形質転換されたバクテリア、並
びに該バクテリアを用いてカテコール ２，３−オキシ
ゲナーゼを製造する方法に関する。 更に、本発明は、本発明により得られたバクテ２２− リアを用いて得られたカテコール ２，３−オキシゲナ
ーゼを、食品添加剤、より詳しくは食品工業における保
存剤として用いる用途、及び化粧品工業における保存剤
として用いる用途、並びに医療分野においてアレルギー
、特にカテコール及びその誘導体により惹起されたアレ
ルギーの治療及び防止用の活性成分として用いる用途に
も関（る。 また、酵素カテコール ２．３−オキシゲナーゼは、ウ
ルシオール又はその誘導体により汚染された材料表面の
汚染除去剤としても用いることができる。このような用
途にカテコール ２，３−オキシゲナーゼを用いること
により、ウルシオール又はその誘導体により汚染された
表面と皮膚との再接触の問題を解消し得る。該表面の処
理は、カテコール ２．３−オキシゲナーゼと洗剤とを
含有する溶液又は懸濁液中で行ない得る。後述するよう
に、カテコール ２．３−オキシゲナーゼは、実験空用
又は市販の洗剤の存在下で活性を保持する。 例えばＢ、スブチリスにより生産されるプロテアーゼ等
のバクテリアにより生産された蛋白質は、いくつかの洗
濯川石けん及び粉末において洗剤と共に使用されている
。フランス国特許第１５２０９４８月及び第２１１９４
８０Ｍによれば、洗濯川石けん及び粉末においてプロテ
アーゼ粒を用いることが記載されている。 本発明により、Ｂ、ズブチリス中でカテコール２．３−
オキシゲナーぜを生産することにより、カテコール ２
．３−オキシゲナーゼとプロテアーゼとの両方を生産す
るＢ、スブチリス菌株の製造が予想される。かかる！ｌ
ｉ株の出現により、現在通常の洗濯用洗剤で浄化されて
いるすべての表面からウルシオール及びそのＭ導体の汚
染除去が特に有利なものとなるであろう。 カテコール ２，３−オキシゲナーゼを汚染除去剤とし
て用いる場合、ローション又はバブルバス（ｂｕｂｂｌ
ｅ ｂａｔｈ）の形態でも用いることができるが、こ
れらに限定されるものではない。 カテコール ２．３−′Ａキシゲナーゼの特性を、無細
胞性バクテリア粗抽出物について調べた。該バクテリア
抽出物は、カテコールのみならず、４−メチルカテコー
ルをも酸化する能力があり、３２６及び３７８ｎｌの２
つの吸収ピークを有する黄色生成物を生じた。 得られた菌株の酵素活性を、分光光度計により測定した
結果、反応混合物中でのセミアルデヒドの蓄積に基づき
、３７５ｎｉの吸収が増大した。 １１； ０．１Ｍのりん酸塩緩衝液（ｐＨ６，８）２．９−、バ
クテリア抽出物０．１顧及び０．０２Ｍのカテコール溶
液１０μＱを、分光光度計のセルに入れ、３０℃にて１
分間測定する。 該機器（ＬＪｖｉｋｏｎ ８１０／８２０ ）には、計
算ユニットが備えられており、これによれば次の結果が
得られる。 ０各測定についてのＤＯ Ｏ各測定間の△Ｄ０ ０ＤＯ／分で表現されるスピード ０曲線の線型性（１ｉｎｅａｒｉｔｙ ）を検証するた
めの相関係数の計算 ２５− １つの測定は、６秒毎に１分間行なわれた（１０ポイン
１−）。 酵素活性は、ＩＩＵ／′Ｉｆ（ｌ蛋白で表わす。１＋ｉ
ＬＩは、−Ｆ配条件下３０℃で１分間に生じた生成物の
１ナノモルに相当づる。 ｔｍｃ圭仝賛遣辛−ｔ
【１
上記抽出物を種々の温度で１０分間処理し、その活性を
上記条骨下で測定する。 また、上記抽出物を５５℃にて異なる時間処理する。 ２６− 上記結果から判るように、該酵素は＾温耐牲を示す。次
の結果によっても、この＾い安定性が確認される。 上記抽出物を、各種緩衝液に蛋白濃度０．３２１１ｇ／
−まで希釈し、室温下で貯蔵した。 上記結果から、アセトンの安定化作用が判る。 アセトンは、抽出の目的で従来用いられていた（文献２
８．２９）。 Ｌ上玉農り乞盾１− ０．１Ｍりん酸塩中、種々のＥｌＨ値にて行なわれた酵
素の試験により、Ｉｎ−１６，７５において最＾の活性
が得られることが判った。 Ｌ！ＬＩＬ 加えて、４５℃において最＾の活性を示した。 ３０℃での活性レベルは、最＾の活性の半分であること
が示される。 本発明によるカテコール ２．３−オキシゲナーゼを含
有する組成物としては、特に化粧品及び医薬品分野での
局所的適用のための組成物を挙げることができる。この
タイプの組成物で使用するのに適当な基剤は当業者に公
知であり、それは本発明の特徴ではない。しかしながら
、本発明組成物の調整の際には、アセ１−ンヤ他の保Ｉ
Ｉ！溶媒が０２．３−０に対し安定化効果を有すること
、及び最高活性１１Ｈが６．５〜７．５の範囲に存する
ことを考慮するのが好ましい。 Ｃ２，３−０を食品工業において保存剤、特に果物の褐
色化防止のために、使用する場合、精製された酵素又は
細菌抽出物を使用することが可能である。ある場合、特
に果物を含む食品が醗酵製品である場合には、細菌自体
を使用することさえ可能である。 以下の実施例は、本発明の特徴及び利点を更に説明する
ものである。特にことわらない限り、参考文献は、明細
書の末尾に掲げられており、明細書中にはその番号のみ
が示しである。 添付図面は、本発明のある特定の態様を理解するのに役
立つであろう。 第１図は、ｐ ＴＧ２００の制限地図（ｒｅｓｔｒｌｃ
−Ｎｏｎ ｓａｐ ）である。 第２図は、１）ＴＧ２０６、ｐＨＶ３３及び＋１ＴＧ４
０２の制限地図である。 ２９− 第３図は、ｘｙｌ Ｅ遺伝子のヌクレオチド配列及びリ
ポソーム結合位藺な示す。 第４図は、ｘｙｌ Ｅ遺伝子配列のための手法（５ｔｒ
ａｔｅｌｌＶ）を示す。 第５図は、Ｃ２，３−０を含有する種々の抽出物の電気
泳動図である。 第１段階において、プラスミドｐ ＷＷＯのＸｈＯ■フ
ラグメントの１つに完全に含有されているｘｙｌ Ｅ遺
伝子が、小さいプラスミド群を使用してクローン化され
た。その結果非常に大きいプラスミドであるｐ ＷＷＯ
の制限フラグメントのすべてを選択することなく、試験
のための再びクローン化の容易なＸＶＩＥＤＮＡの諒が
刷製された。 加えて、これらの小さいプラスミドは、カテコール ２
，３−オキシゲナーゼの研究のために、この酵素を大量
に調製することを可能にした。 実施例１ −ａ Ｏ＝ ｌａ ） （ｊ７ｙｌＺ」ｔプラスミドル
ＷＷＯは、シュードモナス ビュチダ（Ｐ ｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ ｌｄａ ）の菌株から抽出さ
れ ｌこ 。 該プラスミドベクターは、カナマイシン及びストシブ１
−マイシンに対する耐性を］−卜するプラスミドｐ Ｋ
Ｔ２３０ （文献６）である。このプラスミドは、カナ
マイシン耐性遺伝子内に、独特な（ｕｎｉｑｕｅ）部位
ＸｈｏＩを有する。 プラスミドｐ ＢＲ３２２もクローン化ベクターとして
使用された。 宿主菌株は、すべてＥ、Ｃｏ１１Ｋ１２から派生したも
のである。５Ｋ１５９２は、ｇａｌ ｔｈｉｓｂｃ
８１５ ｅｎｄ Ａ ｈｓｄ Ｒ４ｈｓｄＭ
”（文献２５）である。ＢＺ１８は、ｒｌｒ ｉｋ”
ｇａｌ ｌａｃ ｙ ５ｕｌｌ［（文献１９）で
ある。Ｗ３１１０は、ｔｒｐ ＯＥ ｓｅｔ −（文
献２６）である。 Ｉｂ） 方 法 ｐ ＫＴ２３０におけるｘｙｌ Ｅ遺伝子のクローン化
のために、ｐ ＷＷＯのＩ） Ｎ Ａが制限酵素Ｘｈｏ
Ｉを用いて切断され、そしてアルカリンフォスファター
ゼで処理したベクターのＤＮＡのＸｈｏＩフラグメント
ど結合（＋ Ｉｇａｔｅ）された。 以前の研究により、このＸＶＩ Ｅ遺伝子がプラスミド
ｐ ｗｗｏの制限フラグメン１へＩ（Ｘｌ＋ｏＩ）中及
びそのフラグメントのＢａｌＭＨＴ−Ｘ ｈｏＩサブフ
ラグメント中に完全に位置していることが知られでいる
（文献６．９）。 菌株５Ｋ１５９２が、冑られたプラスミドにより形質転
換され、ストシブ［・マイシン耐性のコロニーがカテコ
ールの散荀によりｍ１定された。 この方法による同定が可能なのは、カテコール２．３−
オキシゲナーぜを含有する菌株がカテコールど接触した
ときに、２−ヒドロキシムコンセミアルデヒドを生成し
て色が黄色になるからである（文献′１４）。 完全なＸＶＩ ｉ：遺伝子を含んでいるが、プラスミド
ベクター〇ｒ） Ｎ Ａの一部を失った組み換え体を単
離する。プラスミドｌｌｌ’Ｇ２００の制限地図を、第
１図に示す。ｐ ｗｗｏのＤＮＡフラグメントは二重線
で示す。 このプラスミドｐ ＴＧ２００は、以下の試験において
、ｘｙｌ Ｅ遺伝子をコードするＤＮＡ源として使用さ
れる。 Ｄ ＴＧ２００のＢａ１ＨＩ−ＸｈＯＩ７ラク）＋１／
トは、プラスミドｐＢＲ３２２のＢａ１ｌＨＩ及びＳａ
ｌ■サイトでクローン化された。かくして得られたプラ
スミドを第１表に示す。 第 １ 表 ３３− ＡｐＲ：アンビシリン抵抗性。 ＴｃＳ：テトラサイクリン感受性。 得られた組み換えプラスミドを含む菌株それぞれについ
て、カテコール ２．３−オキシゲナーゼ発現のレベル
が比較された。 蛋白濃度は、ローリ−（Ｌ、 ｏｗｌｙ）法（文献１１
）により決定された。 得られた結果を、第２表に示す。 ３４− 第 ２ 表 異なった菌株における、指数的成長相でのカテコール
２，３−オキシゲナーゼの比活性（１１１０７１１１ｇ
） 第２表から判る様に、得られた菌株は、カテコール ２
，３−オキシゲナーゼの高いレベルを示し、該酵素を合
成するのに好適であると考えられる。 ｐ ＴＧ２０６の部分的制限地図が第２図のＡに示され
、制限部位に加えて、そこにはｘｙｌ Ｅ遺伝子及びＡ
ｐ’ 遺伝子も示されている。太線は、ｐＴＧ４０２
の合成に使用される部分を示している（＠記実施例参照
）。 かくして、Ｅ、Ｃ０１ｉ内でＸＶＩ Ｆ遺伝子を発現さ
せ得る小ざいプラスミド群を得ることが可能になった３
゜ 第２段階では、Ｂ、スブチリスにおいてｘｙｌ Ｅ遺伝
子を発現し得るプラスミドが、遺伝子ｘｙｌ Ｅのこれ
らの誼”から合成される。 この合成は次の二つの工程により達成される。 まず、Ｂ、スブチリスにおいて１１１ｋｌ可能なプラス
ミドを用いてｘｙｌ Ｅ遺伝子をクローン化し、つぎに
８．スブチリスにおいてｘｙｌ Ｅ遺伝子を発現するプ
ロモーターを選択覆る。 実施例２ この研究に用いたＢ、スブチリスの菌株は、マールブル
グ ストレイン（Ｎ４ ａｒｂｕｒｇ ５ｔｒａｉｎ
）１６８から派生したものである。菌株ＢＺ２ａｙｓ
８３ ｒｅｃ Ｅ、４は、ＢＤ２２４ ｔｈｒ５ｔ
ｒｐＣ２ｒｅｃＥ４の供与体ＤＮＡをＫＳ２７ｈｉｓ
Ａ １ ｃｙｓ Ｂ３に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍ ＞することにより得られた。 最終濃度０．１０μΩ／−のマイトマイシンＣ＜ＭＭＣ
）に感受性を有するｈｉＳ＋コロニーを選別した。低い
レベルのＭＭＣに対する感受性は、ｒθｃＥ４変異の存
在に関連する組み換え不能（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏ
ｎ ｄｌＨｉｃｉａｎｃｙ ）を示している（文献４
．５）。 菌株ＴＧＢＩ ｔｒｔ） Ｃ２ｒｅｃ Ｅ４ ｓｐ
。 ３３１は、ＢＤ２２４由来の供与体ＤＮＡをＲＵＢ３３
１ ｔｈｙ Ａ１ ｔｈＶ Ｂｌ ｔｒＤ Ｂ１
５ｐｏ ３３１の受容体細胞に形質転換して得られる。 菌株Ｍｌ １１２ （ｌｅｕ ８． ａｒｏ １５．
ｔｈｒ ５゜ｒｅｃ Ｅ４． ｒ−１−） （Ｔｕｎ
ａｋａ １９７９）Ｍ も使用された。 ＭＭＣ感受性のｔｈｙ＋細胞を選別した。 Ｅ、 Ｃｏ１ｔ ノ菌株は、Ｂ Ｚ １８ ｒｋ−ｍ
ｋ＋−３７＝ ｇａｌ ｌａｃ ｙ ｓｕｎ、Ｃ６００、ｍｋ−
ｍｋ＋に由来するもの及びＣ３Ｒ６０３である（文献１
９）。 プラスミドｐ ＴＧ２０６Ｇよ、実施例１で述べたもの
である。 制限地図が第２図の８に示されているプラスミド＋１
ＨＶ３３は文献１６及び１８に記述されている。このプ
ラスミドルよ、Ｅ、−」りで複製でき、宿主細胞をアン
ごシリン（５０μｇ／１ｌｌｌ）Ａｐｒ 、テトラサイ
クＩＪン（１５ｕｏ ／ｍＱ）Ｔｃ’ 及（ｊ’ｙロラ
ムフエニコール（２０μＧ／ｍ）Ｃｍ’に耐性を示すも
のとし、また、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｌｓにおいてもＩＩ
製する。しかｔノながら、後者の宿主においては、クロ
ラムフＪニコール（５μｏ／ｍｌ）に対する耐性のみが
発現される。 第２図のＦ３中、ｐＨＶ３３の太線部分は、ｐ ＴＧ４
０２の生成に使用される部分を示す（後記実施例会ｆｉ
ｌｌ）。 ２ｂ） １潰培 び培養条 すべてのＢ、スブチリス菌株は、０．３％（Ｗ／Ｖ）の
追加の寒天及び最終濃度がいずれも２０３８− μ０／−のチミンとウラシルを補給したトリプトース
ブラッド アガー ベース（ＴＢＡＢ ：Ｄｌｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）で維持した。プラスミ
ドを有する菌株の維持のために、ＴＢＡＢに５ｕＱ ／
ｌ１ｌｌｉのクロラムフェニコール（３ｉｇｍａＣｈｅ
ｉ＋１ｃａｌ Ｃｏ、）を添加した。 高い濃度の液体培地での培養細胞の生育は、２０μａ／
ｗＩＱのチミンを補給したペンアッセイブロース（ＰＡ
Ｂ；Ｐｉｔｉｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で行
なった。必要に応じて、クロラムフェニコールを添加し
た。 すべでのＥ、コリ菌株は、Ｌ−アガーで維持した。液体
培養はＬ−ブロースで行なった。必要に応じて、抗生物
質を添加した。 すべての培養物は、３７℃で生育された。液体培地のエ
アレーションは、撹拌により行なった。 確立されたＢ、スブチリス培養物は、空温（２０〜２２
℃）においてＴＢＡＢで維持された。Ｅ。 コリ培養物は、４℃においてＬ−アが−で維持された。 ２０ ） ＬＩＬ！ｌ！２１貢１０１プラスミドＤＮ
ＡをＥ、コリ受容体細胞に入れる形質転換は、レーダー
バーブ（Ｌ ｅｄｅｒｂｅｒｏ）とコーエン（Ｃｏｈｅ
ｎ）（１９７８）（文献１０）の方法により、モリソン
（Ｍｏｒｒｌｓｏｎ ） （１９７７）（文献１３）
の記１ところにより行なわれた。当該細胞は形質転換に
先立ち冷保存された。 バチルス スブヂリスの慣用的形質転換（スピッツエン
、５ｐｌｚｌｚｅｎ 、 １９５８ ） （文献２０
）に続いて、ボイランら（Ｂ ｏｙｌａｎ ａｔ
ａｔ、１９７２）〈文献２）の方法を行なった。別の方
法は、プロトプラストをプラスミドＤ Ｎ Ａで形質転
換するものであった（ヂ）シン（ＣｈａＨ）とコーエン
（Ｃｏｈｅｎ） １９７ ’Ｊ ） （文１３ ） 、
ｆｌｌ用的Ｊ［転換を行なう場合には、プラスミドを
含有する菌株の選別を、５μｇ／−のクロラムフェニコ
ールを補給したＴＢＡＢ培地で行ない、そしてプロスト
ラド形質転換の場合には、２０μｇ／−のクロラムフェ
ニコールを補給」）た０Ｍ３再生（ｒｅｇｅｎｅ −ｒ
ａｔｌｏｎ）培地（文Ｍ３）で行なった。 Ｃ２，３−０の発現は、実施例１と同様にして測定した
。 ２ｄ ） ＴＧ４０２の生成 プラスミドｐ ＨＶ３３を、Ｂａ１ＨＩ制限エンドメク
レアーゼで、６１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（Ｔｒｉｓ ） Ｉ） Ｈ７，９，６ｍＭＭＣｌ
Ｃｌ２２．１００１Ｍ Ｎａ ＯＱ、 １ｕＱＤＮ
Ａ及び６単位の酵素からなる溶液中で消化した。反応は
、１時間、３７℃で行なった後、１０分間６５℃で加熱
して停止させた。ａ＊＊条件を、１００１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ、ｐｉ−１７，４，５ｍＭＭｇＣＱ２及び５０１Ｍ
ＮａＣＴｉに調節し、次いで３単位のＥＯＯＲＩ制限
エンドヌクレアーゼを加えた。インキュベーションは、
３７℃で１時間行なった。 反応は、上記と同様に、加熱により停止した。 プラスミドｐ ＴＧ２０６は、Ｉｌｌ ＨＶ３３と正確
に同じ方法で、処理された。 プラスミドフラグメント（各々０．５μＱ）は、６６ｓ
Ｍ Ｔｒｌｓ ＨＣ（１、ｐ Ｈ７，９，６，６４
１− ＩＭ ＭＱ Ｃ（ｉｌｌ 、１０１Ｍジチオスレイト
ール（ＤＴＴ） 、０．５ｍ Ｍアデノシントリフオス
７Ｊ、−１−（ＡＴＰ）及び０．１単位のＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ（Ｂ ｏｏｂｒｉｒ＋ｏｅｎ Ｍ ａｎｎ
ｈｏ１ｇ＋ ）からなる緩衝液５０μＱ中で、結合され
た。結合は、１０〜１２℃でほぼ１８時間行なった。結
合反応は、溶液を１０分間６５℃に加熱して停止させた
。結合生成物は、４℃で保存し、そのまま形質転換に使
用した。 結合生成物を、Ｆ、」すＢ Ｚ １８に、形質転換によ
って導入した。受容体細胞のアンピシリン耐性、クロラ
ムフェニコール耐性、及びテトラサイクリン感受性によ
り選別を行なった。 上記手順により、プラスミドＤ Ｎ Ａ １μＱ当り、
７．６Ｘ１０’個の形質転換体を得た。 形質転換体に、カデ］−ル溶液を散布し、黄色になった
コロニーを新たなアンピシリン選別培地に移した。黄色
の呈色は、Ｃ２，３−０遺伝子が４２− 存在し、機能的に弁環されていることの証拠である。プ
ラスミドＤＮＡは、１４の代表的なコロニーの培養物１
ｗＪから調製され、アガロース ゲル上に分割（ｒｅｓ
ｏｌｖｅ ）された。 大多数のプラスミドはｐ ＴＧ２０６よりも大きく、ｐ
ＴＧ４０２よりも大きく、そして１つのＢａＩＩＩＨ■
と３つのＣＩａＩの制限酵素位置を持っていた。 これらのプラスミドの１つであって、ｐＴＧ４０２と名
付けられたものは、１Ｑの培養物から１１１ｔＪされ、
数種の制限酵素で分析された（下記参照）。新たに形成
されたｐ ＴＧ４０２は、Ｅ、コリ及びＢ、スブチリス
の双方の宿主において複製できるプラスミドベクター上
に０２．３−０遺伝子を有している。しかしながら、後
者の宿主においては、１１ ＴＧ４０２により」−ドさ
れたＣ２゜３−〇遺伝子は、機能的に発現しなかった。 即ち、Ｂ、スブチリスＴＧＢＩのクロラムフェニコール
耐性形質転換体のすべては、カテコールを散布しても白
色のままであった。このことは、Ｂ、ズブチリス宿主中
で０２．３−０遺伝子が転写又は翻訳されないか、ある
いは形質転換工程又は成長工程において再配列（ｒｅａ
ｒｒａｎｇｅ ）されたかであることを示唆する。 プラスミドはＢ、スブチリスから抽出され、Ｅ。 コリに再導入された。１べてのＥ、コリ宿主細胞は、カ
テコール散布により黄色になった。Ｃ２゜３−０遺伝子
番よ、発現が明瞭でないＢ、ズブチリス宿主中のプラス
ミドベクター上にそのまま残っていた。このことは、グ
ラム陽性宿主中の０２゜３−〇遺伝子のプロモーション
の欠如によるものと証明された。 ２ Ｃ３） Ｌ」ＬＧ ４０２の制ＪｕｌＬＬ、ｌ
Ｌ数種の制限酵素を用いてｐＴＧ４０２を消化させた。 部分的制限酵素地図を第２図のＣに示す。 太線部分はｘｙｌ Ｅ遺伝子を示し、矢印は転写方向を
示す。第３表はｐ ＴＧ４０２の制限酵素分析を示す。 ９．’Ｏｋｂのプラスミドは、ｐＢＲ３２２（ＢａｍＨ
Ｉと５ａｌＩとの間１７）小［１１引＜）、ｐＣ１９４
、及びＣ２，３−０遺伝子を含むｐ ｗｗｏのＢａ１ｌ
ＨＩからＸｈＯ■ノフラクメントカらなっている。ｐＢ
Ｒ３２２とｐｃ１９４はすでに配列されている（文献２
１及び３５）。Ｃ２゜３−０遺伝子を含むＤＴＧ４０２
の該領域は現在配列中である。これはＢａｍＨＩ−Ｘｈ
ｏＩ／５ａｌＩフラグメントとして挿入される。この領
域内に）−１ｐａＩ 、 Ａ ｖａＩ及びＣＩａＩに対
する１つの部位及び５ａｌＩに対する３つの部位が存在
する。同領域にはＢ（＋＋１１、ＥＯＯＲＩ、Ｈｉｎｄ
ｌ［Ｉ、ＫｐｎＩ、５ａｃＩ 、ＳｍａＩ 、 ５ｐｈ
Ｉ 、 ＸｂａＩ 、 ＸｈｏＩ又はＸｍａ■に対する
位置は存在しない。ＨｐａＩ及びＫｐｎＩ部位は全ｐ
ＴＧ４０２プラスミドにおいて特有のものである。Ｃ２
，３−０遺伝子内にＡｖａ■部位がある。というのは、
該ＡＶａＩでｐＴＧ４０２を切断し、得られるフラグメ
ントを元のものに反対方向に結合すると、遺伝子活性を
失わせるからである。 ４５− 第３表 Ｌ」ｌ土更□２ｆｆｉ−ＩＬＩＩＪＪ豆１酵素
全部位数 Ｂａ１ｌＨＩ−ＸｈｏＴ／５ａｌＩ＝Ｕ
鷹ｆｆ−匁Ｊ冒虹ｍ−−−−− ＡＶａＩ ２ １
ＢａｍＨＩ １ １
ＢΩ１■ ０ ０Ｃ１
ａＩ ４ １Ｅｃ
ｏＲＩ １ ０Ｈｌ
ｎｄｌｌ［２０ ＨｐａＩ １ １
ＫｐｎＩ １ １Ｐ
ｓｔＴ １ ０Ｓａ
ｃＩ ０ ０Ｓａ
ｌＩ ３ ３Ｓｍ
ａＩ ０ ０Ｓｐ
ｈＩ ０ ０Ｘｂａ
Ｉ Ｏ０ ＸｈｏＩ ＯＯ Ｘ翔ａＩ ＯＯ ４６− ２ｆ） Ｃ２３−０−をバチルス スブチバチルス
スブチリスＢＺ２から染色体ＤＮＡを分離し、６＋ａＭ
ｔｒｉｓ ＨＣＱ緩衝液（ＩＩＨ７，４）、６１
１１Ｍ ＭＣＩ Ｃ１１２，５０１ＭＮａ Ｃ１及び
２〜３単位の５ａｕ３Ａ／１μｕＡＤＮ中、３ａｕ３Ａ
ｒ消化させｒ、 ５’ ＧＡＴＣ３’ の単一の鎮状付着末端（ｓｌｎｏ
ｌｅＳｔｒａｎｄｆｉｄ ｃｏｈｅｓｌｖｏ ｔｅ
ｒａ＋ｎ＋ ）を有する数百のＤＮＡの小フラグメント
を得た。２等フラグメントを、予め３ａｍ）−ＩＩで線
状にされた。ｐＴＧ４０２と結合させた。Ｂａ１ｌＨＩ
は、５ａｕ３Ａと同一の単一鎖末端を作る。 結合された生成物を、形質転換によってバチルス スブ
チリスのプロトプラスト内に直接導入した。また、別法
として、上記生成物をまずエシェリヒア コリーＣ６Ｃ
６００ｒｋ−＋宿主に組み入れた。 エシェリヒア コリーの形質転換体を、５０μａ／ｍの
アムビシリンを含むＬ−ブロス内で一夜培養して選別し
た。混合された細胞集団を上清溶菌液Ｆｋ （ｃｌｅａ
ｒｅｄ １ｙｓａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ） （文献７
．１２）に従い処理し、プラスミドＤＮＡを単離した。 溶菌液上清（ｃｌｅａｒｅｄ １ｙｓａｔｅ）からのＤ
ＮＡの少量を、バチルス スブチリスＴＧＢ１またはＭ
１１１２受容細胞の慣用的形質転換のための供与ＤＮＡ
として用いた。プラスミド含有細胞のクロラムフェニコ
ール耐性により選別を行なった。 慣用的形質転換によるかプロ］−プラスト形質転換によ
るかに拘わらず、すべてのＴＧＢｌ又はＭ１１１２形質
転換体に、カテコール溶液を散布してＣ２，３−０遺伝
子の発現性を検査した。 Ｃ２，３−０遺伝子を転写させるプロモーターの選別の
ための指標として、」ロニーの黄色化を利用した。 プロトプラスト テコールを散布した助黄変する７種のコロニーを単離し
た。之等細胞内のプラスミドＤＮＡを、ｐＴＧ４１１、
４２３、４２４、４２５、４２６、４２７及び４２８と
命名した。 プラスミドを中間のエシェリヒア コリを経由して形質
転換させた場合では、カテコール散布により黄ｉする１
８以上のバチルス スブチリスコロニーが出現した。該
プラスミドをｐＴＧ４０３−４２１と呼ぶ。これはクロ
ラムフェニコール耐性の選択を続ける時Ｃ２．３−０遺
伝子活性を保持していた。上記各プラスミド類の起源を
下記第４表に示す。 ４９− 第４表 ハ天ダし一スノ天！２ス乍ａ匹二と≦４訳試 験
供与ＤＮＡ 形質転換法 プ
ラスミド−Ｎ虹 −−−−一□ Ｉ ＢＺ２＋ｐ ＴＧ４０２ Ｂ．ス１チリス
ＴＧＢＩ ｐ ＴＧ４１ １（３ ： １ ）結合
物 ブ【コトプうスト２ ＢＺ２＋ｐ ＴＧ
４０２ Ｅ．］すＢＺ１８（３ ： １ ）結合物 ３ 試験２の上Ｉ Ｂ．スブチリスＴＧ
Ｂ１ ｐＴＧ４０３（通常の°ｂの） ４ ＢＺ２＋ｐ ＴＧ４０２ ｉ＝．コリＢＺ
１Ｂ（４ ： １ ）結合物 ５ 試験４の１清 Ｂ．スブチリス１−Ｇ
［う１ ｐ ＴＧ４０４（通常のもの）
ｐＴＧ４１２１）ＴＧ４１３ ６ ＢＺ２＋１１ −ｒＧ４ｏ２ Ｅ．コリ（２
：１）結合物 Ｃ ６ ０ ０ ｒｋ− ｍｋ”
７ 試験６の−１ Ｂ．スブチリスＭ１
１１２ ｐＴＧ４０５（通常のもの）
ｐ ＴＧ４０６５０− 試 験 供与ＤＮＡ 形質転換法
プラスミドＮＯ。 ＴＧ４０７ ｐ ＴＧ４０８ ｐ ＴＧ４０９ ＴＧ４１０ ｐ ＴＧ４１４ １１ＴＧ４１５ ＴＧ４１６ ｐ ＴＧ４１７ ｐ ＴＧ４１８ ｐ ＴＧ４１９ ＴＧ４２０ ＴＧ４２１ ８ ＢＺ２＋ｐ ＴＧ４０２ Ｂ、スブチリス
Ｍ１１１２ １１１−Ｇ４２２（２：１）結合物
プロトプラスト ｐＴＧ４２３ＴＧ４２４ ＴＧ４２５ ＴＧ４２６ ＴＧ４２６ ＴＧ４２７ ２０＞ ７５２”Ｓ （７）
ＧＣＪ：冨栄ａＷｉ体媒地中で培養された１Ｑの澄明な
溶菌液（ｌｙｓａｔｅｓ ）から、プラスミドＤＮＡを
分離した。 プラスミドＤＮＡのｗｉ製は、塩化セシウム−臭化エチ
ジウムを使用する密度勾配遠心分離により行なった（文
献１７）。或いは、１ｍＧ培地からのアルカリ抽出法に
よりプラスミドＤＮＡを得た（文献１）。 精製されたｐＴＧ４０２は、数種の制限酵素を使用して
、酵素販売会社にコーイングランドバイオラブス：ベセ
スダ リサーチ ラボラトリース：ベーリンガーマンハ
イム）の推奨する条件下に消化された。０２．３−０遺
伝子の形質発現を促進づるｐＴＧ４０２誘導体は、プロ
モーターの下流側（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にあって且
つＣ２，３−０遺伝子の上流側（ｕｐｓｔｒθａ■）に
あるボテンシアル サイｌ−（ｐｏｔｅｎｔｌａｌ
５ｉｔｅｓ ）を決定する為に、Ｂａｅ＋ＨＴにより消
化された。 ＤＮＡ断片は、水平電気泳動装置中の０．８％（Ｗ／Ｖ
）又は１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル上で分離された。 トリスアセテートバッファー（Ｔｒｉｓ ４０ｉ Ｍ、
Ａｃ Ｎａ ２０１ Ｍ、ＥＤＴＡ２ａｉ Ｍ、ｐ Ｈ
７，８）を操作全般にわたって使用した。電気泳動は、
定電圧（３５Ｖ） 、室温（２０〜２２℃）で１４〜１
８時間行なった。 ＤＮＡは、臭化エチジウム（０，５μｇ／−）により３
０分間染色され、ゲルは蒸留水で充分に洗浄され、次い
でＤＮＡバンドが、ＵＶトランスイルミネーター（ウル
トラバイオレット プロダクツ インコーホレイテッド
社製）からの長波長紫外線により舶用化された。プラス
ミドＤＮＡ断片の寸法は、それぞれの移動度とＨＩｎｄ
ｌｌ［により消化されたλＣｌ８５７ｓＤＮＡの移動度
とを比較することにより、判定された。λＤ Ｎ Ａ断
片の寸法は、フィリップセンその他（Ｐ ｈｉｌｌｉｐ
ｓｅｎａｔ ａｔ）から得た（文献１５）。 テスｌ〜した全プラスミドは、ｐ ＴＧ４０２よりも大
であった。 一５３＝ テストの結果によれば、Ｃ２，３−０遺伝子プロダクト
は、バチルス スプチリス ポスト中に機能的に形質発
現されており、これは、Ｃ２，３−〇遺伝子の転写をプ
ロモートするバチルス スブチリス染色体ＤＮＡ配列が
導入されていることを示す。 定常期にある培地の抽出物から、バチルス スブチリス
ボス］・中での０２．３−０酵素の活性レベルを決定
した。活性は、前述の分光光度法により測定された。結
果は、第５表に示す通りである。 ５４− 第５表 バチルス スブチリスにおけるカテコール２．３−オキ
シゲナーゼの活性 菌株及びプラスミド 測定回数 全蛋白質（ａ ）
活 性（ｂ）（ｌｉ１ｇ／１ｌｉｌｌ） （
醗Ｕ／叩）ＴＧＢＩ／ｐ ＴＧ４０２ ２
１，５９ ０ＴＧＢＩ／ｐＴＧ４０３
２ １．５９ ２３８，０ＴＧＢ１／
ｐ ＴＧ４０４ ２ １．５９
２０．５Ｍ１１１２／ＤＴＧ４０５ ２ １．
８６ １７０２．５Ｍ１１１２／ＤＴＧ４０６
３ １．７４ １２４．０Ｍ１１
１２／Ｉ）ＴＧ４０７ ２ ２．２２
３７３．５Ｍ１１１２／ＤＴＧ４０８ ２
２，２１ １１７５．０Ｍ１１１２／ｐＴＧ
４０９ ２ ２．０３ １６９．５
Ｍ１１１２／ｐＴＧ４１０ ２ １，９３
９６１．５ＴＧＢＩ／ｐＴＧ４１１ ３
１．０２ ｓ８．０ＴＧＢ１／ｐＴＧ
４１２ ２ １．３０ ２４，０
ＴＧＢＩ／ｐＴＧ４１３ ２ １．６０
１４．０Ｍ１１１２／ｐＴＧ４１４ ２
１，５４ ２８８．０Ｍ１１１２／ｐＴ
Ｇ４１５ ２ １，９０ ６９６．０
Ｍ１１１２／ｐＴＧ４１６ ２ ２．３０
２０１１．０菌株及びプラスミド 測定回数
全蛋白質（ａ ） 活 性（ｂ）（ｌ１１ｇ／ｌｌ
ｌ２）（Ｉｌ（３７１１１ｇ）Ｍ Ｉ １１２／ｐ −
ｒＧ４１７ ２ １．９３ １８５３
，０Ｍ１１１２／ｐＴＧ４１８ ２ １，９２
２１７，０Ｍ１１１２／１ｌＴＧ’ｌ１９
２ ２．１５ ４８７，０Ｍ１１
１２／ｐｌ−Ｇ４２ｏ ３ １．９０
５５１．ＯＭ Ｉ １１２／ｐＴＧ４２１ ２
１．５４ ２４５，０Ｍ１１１２／
ＩＩＴＧ４２２ ２ ２．２３ １
９２．０Ｍ１１１２／ｐＴＧ４２３ ２ １．
７３ ２７８，０Ｍ１１１２／ｐＴＧ４２４
２ ２．４７ ６８．０Ｍ１１１
２／Ｉ）ＴＧ４２５ ２ １．９３
７９．０Ｍ１１１２／ｐＴＧ４２６ ２ １
．８０ ９３．０−Ｍ土ユニ２ｚＬ工Ｇ４２
７ ２ １．８９ １１３．０第５
表注：（ａ）０ウリ−法（Ｌ ｏｗｒｙ’ ｓｍｅｔｂ
ｏｄ）により測定した蛋白 質濃度。 （ｂ） １ミリユニツト（ａ＋Ｌｊ）は、３０℃で１分
間当り２−ヒド ロキシ ムコン酸セミアルデ ヒド１１１Ｍの生成に相当する。 尚、バチルス ズブチリス中のカテコール ２゜３−オ
キシゲナーゼの活性は、Ｆｅ２＋を含む緩衝液を使用す
る透析により、更に増大させることが出来る。 ５ａｕ３Ａにより得られたＤＮＡ断片とＢａ１ＨＩによ
り線状化されたプラスミド ベクター（例えばｐＴＧ４
０２）との結合は、１／４の確立で、５ａｕ３Ａ断片い
ずれかの端にＢａ１ＨＩのサイトを再生させる。バチル
ス スブチリス ホス］・中でＣ２，３−０遺伝子活性
を付与された（ａｓｓｏｃｌ −５７− ａｔａｄ ｗｉｔｈ）プラスミドは、Ｂａｍ１」Ｉに
より消化された。プラスミドｐ１°Ｇ ４０３．４０４
．４０５．４０６及び４０９．４１０．４１１．４２２
並びに４２５は、少なくとも１個のＢａ１ｔ−ＩＩサイ
１へを有していた。 生成されたプラスミドは、再ｑ−されたＦ３ａｉＨＩサ
イトが３ａｕ３Ａ断片−にのブＥ】モーターの−［流側
にあるのか及び（又は）“ト流側にあるのかを知る為に
、Ｈｉｎｄ［［ｌ及びＢ ａ叶ＩＩにより消化された。 ｍｒＧ４−１１．４２２．４２５上のプロモーターの上
流側に単一のＢａｍ１ｌＩザイ１〜が検出された。 ｐＴＧ４０３．４０４．４０５．４０６．４０７．４０
８．４０９及び４１０上には、プロモーターの下流側に
単一のｌ３ａｉ＋ｌｌＩリイ１〜が見出された。 バチルス スブチリスのプロモーターを含有する５ａｕ
３Ａ断片の大凡の大きさは、ｐ ＴＧ４０３の場合は５
００塩基対（以下ｂｐと略記する）、Ｄ ＴＧ４０４で
１４０ｂｌ）、 ｐＴＧ４０５で５７５ｂｐ、ＦＩＴＧ
４０６で９５０ｂρ、ｐＴＧ４０７で３３５ｂｌｌ、
＋１１”’Ｇ４０８で５００ｂｐ、ｐ ＴＧ４０９５８
− で９００ｂＦｌ、ｌ）丁Ｇ４１０で５００ｂｌ）である
。 プラスミドｐ ＴＧ４０３〜４１０は、以下の如き事項
に関連している： １） これ等のプラスミドは、Ｃ２，３−０遺伝子を発
現させる； ２） プラスミドを含むホスト細胞は、コロニーの黄色
春色及び分光光度分析から明らかな如く、カテコールを
２−ヒドロキシムコン セミアルデヒドに変換させる； ３） プロモーターの下流側で且つＣ２，３−０遺伝子
の上流側にある単一の１３ａａ＋ト１■リーイトは、各
プラスミド上に位置している。 これ等のプラスミドは、カテコールの変換にとって重要
であるだけでなく、バチルス スブチリス ホストにお
ける表現ベクターとしても使用され得る。 ｐ ＴＧ４０３〜４１０のいずれかの１３ａｍｌｌＩサ
イ１〜に遺伝子をクローニングさせると、多くの場合、
Ｃ２，３−０遺伝子の活性は、失われるであろう。 １３ａａ＋ト１ｒサイト・からＣ２，３−０遺伝子内の
任意のサイ１〜にわたるｍｒＧ４０２−ｐ２またはｐ
ＴＧ４０２−ｐ ９の領域に遺伝子をクローニングさせ
ると、Ｃ２，３−０遺伝子の活性は、確実に失われるで
あろう。 ゛発現″ベクターへの新しい遺伝子の挿入は、細胞コロ
ニーにカテコール溶液を単に散布することにより確認さ
れ得る。白色のコロニーは、Ｃ２゜３−０遺伝子が最早
機能しでおらず、新しい遺伝子が挿入されたことを示す
。黄色のコロニーは、新しい遺伝子が挿入されていない
ことを示す。 Ｂａｌ１ｌト１■リイトに挿入された新しい遺伝子が形
質発現される確立は、島い；何故ならば、活性なバチル
ス スブチリス プロモーターが、ＢａｍＨＩサイトの
（′ぐ上流側に位置しているからである。 バチルス スブチリス ホスト内での外来遺伝子の発現
が可能となった点で、本方法は、研究上及び産業上の目
的にとって、極めて有用なものである。 実施例３ ファージＭ１３は、線状］リファージの一種であり、遺
伝子の配列決定及びりＤ−ニング用のキラ］〜の形態で
、ベセスダ リサーチ ラボラトリーズとビーエル ラ
ボラトリーズにより販売されている。 ファージＭ１３のＢａｍＨＩ −５ａｌＩリ−イトにお
いて、ｐ ＴＧ２００のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片をり
［１−ン化した。 かくして得られたファージは、上述のエシェリヒア ］
り菌株中で遺伝子ｘｙｌ Ｅの形質発現を可能ならしめ
る。 実施例１において示した様に、この遺伝子のクローニン
グは、カテコールを散布し、カテコールの分解に起因す
る黄色化を示す溶菌斑を観察することにより、確認され
る。 ＢａｍＨＩ −ＸｈｏＩセグメントに含まれる２個の６
ｌ− ８ａｌＩ断片（第１図参照）は、ファージＭ１３中で２
つの方法でクローン化された： ０当初の方向及び順序を維持する、 ０当初の順序を維持するが、方向を逆にする。 第１の方法で形成した絹換えファージのみが、Ｃ２，３
−０の活性を発現することが出来た。 実施例４ （１）バチルス スブチリス以外のバクテリアの染色体
、（２）バクテリアのプラスミド又は〈３）バクテリオ
ファージのそれぞれに由来するＤＮＡ断片も、バチル
ス スブチリス内でのｘｙｌ Ｅの形質発現を促進する
か否かを判定する為に、種々の源からのＤＮＡを分離し
、精製した。 これ等の源は、バチルス リシエニフオルミス９９４５
Ａ、バチルス プミルスＢＰ１ 、エシェリヒア コリ
Ｃ６００ｒｋ”’ ｉｎｋ” 、プラスミドｐＬＩＢ１
１０（先ずスタフィロコッカス アウレウスから分離さ
れ、バチルス スブチリス内でも複製６２− することが明らかとなったもの。（文献３０）〕及びバ
チルス スブチリス バクテリオファージφ２９（とく
にφ２９ｓｕｓ １４ （１２４２）；（文献３１）〕
である。 バチルス リシエニフオルミス、バチルス プミルス及
びエシェリヒア コリからの染色体ＤＮＡ並びにφ２９
からのＤＮＡの場合には、精製ＤＮＡを５ａｕ３Ａによ
り完全に消化させた。 断片は、予めＢａｍＨＩにより消化されたｐＴＧ４０２
に結合され、挿入ＤＮＡとｐＴＧ４０２との重量比は、
２：１であった。 挿入ＤＮＡ源としてｐＵＢｌｌｏを使用する場合には、
Ｂａ１ｌＨＩ及びＢｇＩＩＩにより、ｐＵＢｌｌｏを完
全に消化させた。これにより２個のＤＮＡ断片が得られ
、その一方の大きさは約１．５５Ｋｂであり、他方の大
きさは約３．９５Ｋｂであった。結果は、ベセスダ リ
サーチ ラボラトリーズによりすでに公表されている制
限地図（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ １ａＤＳ）に合致
した。 ｐ ＵＢｌ １０ＤＮＡの断片をＢａ１ＨＩにより消化
されたｐＴＧ４０２ど等重量比で結合させた。 各実験から得られた結合生成物をプロトプラスト トラ
ンスフオーメイションにより別々にバチルスＭ１１２に
導入した。 １０μＱ ／ＩＱｃＩを補給されたＤＭ３再生培地上３
７℃で４８時間インキュベーションした後、Ｃｍ Ｆ’
形質転換体が選択された。 Ｃ１ｒ形貿転換体の］ロニ一群にカテコールを散布した
ところ、４べての場合に黄色のコロニ一群が観察された
。 このことは、バチルス スブヂリス内で、他のバチルス
類、ダラム陰性菌 エシェリヒア コリ、プラスミドｐ
ＵＢ１１０及びバクテリオファージφ２９から分離され
た［Ｉ Ｎ Ａのコントロール下に、ｐＴＧ４０２上に
ｘｙｌ Ｆ遺伝子が発現されることを示している。 バチルス リシエニフオルミスＤ Ｎ Ａが１１ＴＧ４
０２内に挿入された場合、全Ｃ１１ｒ形質転換体につぎ
、５．６８Ｘ１０−”の頻度で黄色コロニーが観察され
た。 エシェリヒア コリ供与体ＤＮＡは、１０’以上の全部
Ｃｌ１ｌｒ 形質転換体かられずか２個の黄色コロニ
ーが生じただけであった（頻度２×１０−’）。この結
果は、バチルス スブヂリス内での異種特異的遺伝子発
現に対する障害（文献３２）を考虜すれば、予期されな
かったことではないが、少なくとも２つのケースでは、
エシェリヒア コリに由来するＤＮＡのコントロールの
下に、ＸＶＩ Ｅなるシュードモナス遺伝子がバチルス
ズブチリス中で発現されることを明らかにしている。 上記実験で得られたＣ２，３−０の比活性及びＤＮＡ挿
入体（Ｄ Ｎ Ａ １ｎｓｅｒｔｓ ）の大体の寸法ハ
、第６表に示す通りである。Ｃ２，３−０の最高比活性
は、Ｍ１１１２／ｐＴＧ４４１により得られており、こ
の場合ＤＮＡ挿入体は、バチルス リシエニフオルミス
９９４５Ａから分離されたＤＮＡからなっていた。 φ２９ＤＮＡのコントロールの下にｘｖｌ Ｅを発現さ
せる２０種のプラスミドが分離されたが、その６５− 内の数種は同一であるかも知れない。これ等のプラスミ
ドについては、更に解明が必要である。 ６６− 第６表 プラスミド 挿入体源 挿入偉才ａ Ｃ
２，３−０比活性〈塩基対） −（１見２設Ｌ− ｐＴＧ４３１ ｐＵＢｌｌｏ １５５０
１４７３．Ｏｐ ＴＧ４３２ Ｅ、
］リ ６００ ４２，０１） Ｔ
Ｇ４３３ ５００
３４２．０ｐ ＴＧ４３５ Ｂ、プミルス
２００ １７９４．０ｐ ＴＧ４３６
５５ｏ ３２７．
０１） ＴＧ４３７ １８００
７２５．０Ｄ ＴＧ４３８ Ｂ、
ＩＪ？／エニ７００ ５５５，０フオルミ
ス ｐ ＴＧ４３９ ４００ ２２４
０．０１） ＴＧ４４０ ６００
１０１８，０ｐＴＧ４４１ ５００
２７２７．０ｐＴＧ４４２ φ２９
３００ １８５３，０ｐＴＧφ２９ｐ１
ｎ Ｎ、Ｔ、※ ２６２，７ｐＴＧφ２９＋
１２ ｌｌＮ、 Ｔ、 ２１５．４ｐＴＧ
φ２９ｐ ３ ＩＩＮ、 Ｔ、 ９２８．
９ｐＴＧφ２９ｐ４ ｎ Ｎ、 Ｔ、
１１３６，０ｐＴＧφ２９ｐ５ ｌＩＮ、Ｔ、
２９．２プラスミド 挿入体源
挿入体寸法 Ｃ２，３−Ｏｆｔ活性−（墨量対Σ −
１引すＺ■＞−− ｐＴＧφ２９＋１６ 〃Ｎ、 Ｔ、
１２９５．０ｐＴＧφ２９Ｄ ７ ＃
Ｎ、 −ｒ、 １１００，０ｐＴＧφ２９
ｐ９ 〃Ｎ、Ｔ、 ２７．３ｐＴＧ
φ２９＋１１１ ＃ Ｎ、−ｒ、
４６０．０ｐＴＧφ２９１） １２ 〃Ｎ
、 Ｔ、 、 ７６４．０ｐＴＧφ２９１
１１３ ｎ Ｎ、Ｔ、 ７
６９．０ｐＴＧφ２９ｐ１４ ／Ｊ Ｎ
、Ｔ、 ４５５，０ｐＴＧφ２９１）１５
〃Ｎ、Ｔ、 ２６１．０ｐＴＧφ２
９＋１１６ ’ Ｎ、Ｔ、
１０１７．０ｐＴＧφ２９ｐ１７ Ｎ
Ｎ、Ｔ、 ９９３，０ｐＴＧφ２９ｐ１８
〃 Ｎ、Ｔ、 部９．０ｐ
ＴＧφ２９ｐ １９ 〃Ｎ、 Ｔ、 １
１１１．０ｐＴＧφ２９ｐ ２０ 〃Ｎ、 Ｔ、
ｙ８９．。 ※ Ｎ、 Ｔ、−試験せず。 実施例５ ｘｙｌ Ｆ遺伝子の全ヌクレオチド配列及びその決定に
用いられた手法を第３図に詳細に示す。第３図は、ｘｙ
ｌ Ｅの完全ヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配
列を示している。 図示の配列は、左端のＨｐａ１１部位から１００塩基対
の３′に始まり、右端のｔ−＋ｐａｍ部位で終わってｕ
）ｐ （第４図）。推定されるリボゾーム結合部位にア
ンダーラインを付しである。暗号解読域は、組１に始ま
り、３個のアステリスクで示されるナンセンスコドンで
終わる（第３図）。バクテリオファー２Ｍ１３中でｘｙ
ｌ Ｅ遺伝子断片をサブクローニングし、その配列を定
めるに使用された方法は、第４図中の水平方向の矢印に
より示されている。ｘｙｌ Ｅの暗号解読域は、垂直方
向の矢印で示されている。翻訳開始部位の位置及び図示
のリーディングフレームは、精製Ｃ２，３−０から決定
された最初の９個のアミノ酸配列と完全に一致６９− している。該遺伝子は、３５０４７ダルトンのサブユニ
ツ１〜ポリペプチドを構成する３０６個のアミノ酸をコ
ードする。Ｃ２，３−０の活性形態は、分子量１４００
００ダルｌ−ンであるから（文献３３）、我々の得た結
果は、Ｃ２，３−０が４個の同一のサブユニツ１へから
なっているという報告（文献３４）を裏付けている。 バチルス スブチリス内での翻訳開始の為には、リボゾ
ーム結合部位と１６Ｓｒ ＲＮＡの３′領域との＾度の
相補性が必要であると考えられる。 ｘｙｌ Ｅ遺伝子について提案されているリボゾーム結
合部位からは、該部位とバチルス ズブチリス１６Ｓｒ
ＲＮＡ間の塩基対形成の為の自由エネルギーΔＧは、
−１５，６キロカロリー（ＫＣａｔ）であることが予測
される。更に、リボゾーム結合部位と開始コドンとの闇
の距離は、９塩基であると計算されている。これらの数
値は、バチルススブチリスの一連のりボゾーム結合部位
から最近計算されたΔＧとスペイサ−塩基の数値域（文
献３６）内に良好におさまるものである。 ７０− 配列に関するデータは、バチルス スブチリスにおける
ｘｙｌＥｍＲＮＡの翻訳が、シュードモナス及びエシェ
リヒア コリにより認められていると同じ開始コドンか
らはじまるという考え方を支持するものである。 実施例６ バチルス スブチリス内で産生された酵素が、シュード
モナス ビュチダＩｔ −２又はエシェリヒア コリＢ
Ｚ１８／ｐ ＴＧ２０６内で得られた酵素と同じである
ことを示す為に、これらの各細菌から得られた部分的に
精製され且つ細胞を含まない抽出物が、ポリアクリルア
マイドゲルを使用する電気泳動により分離された（第５
図）。Ｃ２゜３−〇のポリアクリルアマイドゲルによる
電気泳動は、以下の様にして行なう。部分的に精製した
Ｃ２．３−０の標品（ｐｒｅｐａｒａｔ ｔｏｎｓ ）
が、定常期培地から得られた（文献９）。細胞ペレット
を２０＋１１ＭＩＪン酸塩緩＊’ａ （ｐ Ｈ７，２）
により洗浄し、ＡＰＭ衝液（アセ８シ１０ １００ｉ Ｍ．ＦＩ Ｈ７．５）に懸濁し、次いで音波
処理して破壊した。 ベックマンＲ ６ ５ Ｔ ｉローターおよびＬ８−７
０超遠心機を使用し、３００００ｒｕ 、４℃の条件下
に゛１時間にわたり細胞＠壊物を遠心分離した。上澄み
液をアヒトンて”処理して、最終的に濃［ｆ５０容謹％
とし、１℃で２時間かけて蛋白質を析出させた。 次いで、ソルヴアルＨ Ｂ − ４ （ Ｓ ｏｒｖａ
ｌｌＨ Ｂ −４）ローター及びＲ Ｃ − ５ Ｂ遠
心機中１ ００００ｒｐＨで１０分間遠心分離した。上
澄み液をアセトンで処理して６６容蟲％とじ、４℃で２
時間放置して蛋白質を析出させた。 １１００００ｒｐで１０分間遠心分離した後、蛋白質ペ
レットを１−のＡＰｔｉ衝液（アセト２１０曵＋ＩＪン
ｗ１塩１ ００ｍ Ｍ，ｐ ｌ−１７．５）中に懸濁さ
せた。 酵素活性は、゛マテリアルズ アンド メソツズ（ Ｊ
ｙｌ ａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍ ｅｔｈｏｄ
ｓ）″に記載された方法に従って測定した。 電気泳動には、７．５％アクリルアマイド分離ゲル（ｓ
ｅｐａｒａｔｌｎａ （＋８１ ）及び３．０％スタ
ッキングゲル（ＳｔａＯｋ＋ｎＯ Ｑｅｌ）を使用し
た。蛋白質（２０〜２００μｇ）を各スロット（ ５ｌ
ｏｔ ）に加えたので、全０２，３−０活性（２６０ｍ
Ｕ）は等しかった。 ＴＧＢ １ ／ｐ ＴＧ４ ０ ２については、ＴＧＢ
１／ｐ ＴＧ４０３からの蛋白質量に等しい蛋白質量
を使用した。電気泳動は、一定電圧（２５ミリアンペア
）で、０．５Ｍカテ］−ルを散布したゲルを使用して５
時間行なった（第５図のパネルＡ）。 第５図のパネルＢは、蛋白質を固定し、クマシーブリリ
アントブルー Ｒ２５０（０．１５％Ｗ／Ｖ）ｒ％ｌｂ
、７．５％Ｖ／Ｖ酢酸及び５％Ｖ／Ｖメタノールの溶液
で脱色した。結果を第５図に示す。抽出物は、シュード
モナス ビュチダＩｔ−２からのものくレーン１）：エ
シェリヒア 」リ ＢＺ１８／１）ＴＧ２０６からのも
の（レーン７３− ２）：バチルス スブチリス ＴＧＢ１／ｐ ＴＧ４０
２からのものくレーン３）；及びバチルススブチリス
ＴＧＩ３１／１）ＴＧ４０３からのものくレーン４）で
あった。第５図中の矢印は、Ｃ２。 ３−０の位置を示′！ｌ。 ゲルシステムで非変性条件（ ｎｕｎ − ｄｅｎａｔ
ｕｒｌｎｇｃｏｎｄ ｌ ｔ ｌ ｏｎｓ ）を採用す
ることにより、電気泳動の終了後、ゲルにカテコールを
散布するだけで、Ｃ２．３−０＃素の速やかな同定が可
能であった。 機能性プロモーター（ ｆｕｎｃｔｌｏｎａｌ ｐｒ
ｏｍｏｔｅｒ）なしでｘｙｌ Ｅを含有するバチルス
スブチリス菌株（ＴＧＢ １ ／ｐ ＴＧ４ ０ ２
）の場合を除くすべての抽出物を含むゲルにおいて、黄
色バンドが同位置に出現した。前者については、黄色バ
ンドは認められなかった。Ｃ２．３−０の電気泳動移動
度が同 であることから、バチルス ズブチリス中の酵
素は、融合ポリペプチドとして生成されたのではなく、
シュードモナス及びエシェリヒア コリにおいて観察さ
れたものと同 の翻訳生成物（ｔｒａｎｓｌａｔｌｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔ ）としで生成されるこ７４− とを示唆している。 更に他の実験においては、■シエリヒア コリから分離
精製されたＣ２，３−０を注射されたラビットから得た
粗抗血清が得られた。オフテルロニーの二重拡散法によ
れば、抗血清は、シュードモナス ビュチダＩｔ −２
、■シエリヒア コリＢＺＩ ８／Ｉ）ＴＧ２０６及び
バチルス スブチリスＴＧＢＩ／ｐ ＴＧ４０３からの
部分Ｍ製油出物と反応したが、ＴＧＢ１／ｐＴＧ４０２
から得られたバチルス スブチリス抽出物とは交叉反応
しなかった。 実施例７ カテコール ２，３−オキシゲナーゼが、ウルシオール
で処理された表面の汚染除去剤として作用するか否かを
試験すべく、次の如く対照試験を行なった。 一仁上上−１ｊＬ Ｏウルシオール：０．１％又は１％のエタノール溶液 ○カテコール オキシゲナーゼ： Ｅ、コリ（菌株 ＢＺｌ ８／＋１ ＴＧ２０３）又は
Ｂ、スブチリス（菌株 Ｍ Ｉ １１２／ｐ ＴＧ４４
１）から精製された１ ０００ユニツト／ｄの該酵素を
約９０％の純撓で含有する組成物。（我々は、ホス１へ
菌株を問わず該酵素が同一物であることを示した１、） ０ 洗 剤 １）ＷＩＰＰ（商標名、Ｊス・ニー・ヘンケルベルギー
エヌ・ヴイ社製） ２）ＤＡＳＨ（商標名、ベネル
ックス、ブロクター・アンド・ギャンブル社＠） ＷＩＰＰは、水道水を用い最終濃度０．２５％の濃度で
用いた。これら濃度は、製造者により推奨されている濃
度である。ＷＩＰＰは、手洗い用洗剤であって、１１
Ｈ約６．８を有し、ＤＡＳＨは洗濯機用洗剤であってｐ
ｉ−１９である。 ３） 数種の洗剤溶液を実験室にて調整した。これらは
、ｐＨ６，８の１０−Ｍリン酸ナトリウムと０．０２５
％のＢｒ１０５８（ポリオキシエチレン２０−セチルエ
ーテル）又は０．０２％のＳＤＳ （ドデシル硫酸ナト
リウム）とを含有するものである。 ４） パームオリーブ バブル バス （Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ ｂｕｂｂｌｅ ｂａｔｈ）
、水晶は、推奨濃度であるバス（２００Ｑ）当り１カ
ツプ（２０ｍＧ）とほぼ同等の０．０１％の最終濃度で
用いた。 ０織物 次の５種の織物を用いた。 １） １００％綿 ２） ３５％綿、６５％ポリエステル ３） ウール ４）１００％アクリル ５） １００％ダクロン （２） カテコール ２．３−オキシゲナーゼ活性の測
定 酵素活性は、カテコール ２，３−オキシゲナーゼによ
るウルシオールのカテコール環の酵素的開裂により生じ
た黄色生成物の発生を観察することにより、或いは薄層
クロマトグラフィーにより測定した。後者の方法により
、残存するウルシオフ７− −ルの量を、相当するスポット・の大きさにより換算し
た。この方法は、検出最低限界１μΩを有するものであ
る。 洗剤溶液におけるカテコール ２，３−オキシゲナーゼ
の活性は、黄色生成物である２−ヒドロキシムコン酸セ
ミアルデヒドの生成により立証される。洗剤ＷＩＰＰを
用いた場合、徐々に黄色が発生してくるが、Ｄ Ａ Ｓ
Ｈの場合黄色化は一時的なものである。 カテコール ２．３−７１キシゲナーゼの洗剤溶液にお
ける活性を試験するために、ウルシオール、上記酵素及
び数種の洗剤を種々の組合せで混合し、最終容積１−で
３０℃にて３時間インキュベートし。結束を下表に示す
。 ７８− １号［〈１μｇ１は、インキュベーション後の残存ウル
シオールがＴＬＣ分析による検出レベル以下であること
を意味する。黄色の発生は、ウルシオールが市販洗剤に
より有効に溶解され、これが酵素カテコール ２，３−
オキシゲナーゼにより開裂されたことを示すものである
。 上記＊＊の存在下では、大量のウルシオールを用いた場
合でも、はとんどすべてのウルシオールが開裂される。 この試験にＪ：す、カテコール ２゜３−オキシゲナー
ゼが洗剤溶液中において安定であり、少量のｌｌｉ酊素
により大量のウルシオールが開裂され得ることが判る。 上記表の第１行から判るように、カテコール ２．３−
オキシゲナーゼが洗剤溶液中に含まれない場合、ウルシ
オールはほぼ定量的に残存する。従って、カテコール
２゜３−オキシゲナーゼを含有する洗剤溶液からウルシ
オールが消失したのは、該酵素のウルシオールに対する
作用に起因することが判る。 各種洗剤溶液中におけるカテコール ２．３−オキシゲ
ナーゼの活性の安定性を試験した結果、室温にて１２時
間経過後に残存する酵素活性量は、洗剤を含有すること
なく同一時間インキュベートした該酵素のそれよりも低
いものではなかった。 しかしながら、洗剤ＤＡＳＨを用いた場合は、上記の通
りではなかった。これはおそらくはその溶液のｐＨによ
るものであろう。 洗剤存在下に６０℃にて１５分間カテコール２．３−オ
キシゲナーゼをインキュベートした場合、活性は７５％
以上保持された。 酵素の安定性を増強するには、保護剤を添加するのがよ
い。最終濃度１０％のアセトンにより保護すれば非常に
効果的である。その他、グリセロール等の他の有機溶媒
も、上記保護剤として用いることができる。 次の実験を行なった。すなわち、ウルシオール８１− の０．１％エタノール溶″［１０μＱを、広さ１Ｃ１の
織物片に塗布する。この織物を、室温不乾燥した後、洗
剤１液（０，０２％ＳＤＳ。 ０．０２５％Ｂ ｒｌＪをＩＯＩＭのリン酸ナトリウム
ｐＨ６，８に添加したもの又はＷＩＰＰｏ、２５％）８
９０μＱ中にて、３０℃で３時間インキュベートする。 （予洗工程）。 次いで１０ユニツトのカテコール ２，３−オキシゲナ
ーゼを、アセトン（酵素安定化剤）１００μＱと共に添
加し、インキュベーションを３０℃にて３時間続ける。 その後、織物上及び洗剤溶液中に残存するウルシオール
を抽出し、定量する。即ち、織物を乾燥し、室温下５０
０μＱのエタノール中で撹拌することにより残存ウルシ
オールを抽出する。一方、洗剤溶液中のウルシオールは
５００μＱのブタノールで抽出する。上記ブタノール層
及びエタノール層に抽出されたウルシオールを凍結乾燥
さＭ１エタノール２５μＱに再懸濁させ、ＴＬＣプレー
トに適用する。石油エーテル／酢酸エチル（７：３Ｖ／
Ｖ）を溶媒として８２− クロマトグラフィーを行なう。ウルシオールは、デュビ
ュイス（ＤＵＰＵ Ｉｓ） （ＢｒｌｔｌｓｈＪｏｕ
ｒｎａｌ ｏｒ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １０
１．６１７゜１９７９）の方法に従って、ＴＬＣプレー
トをヨウ素処理後同定する。各ＴＬＣプレート上で、サ
ンプル中のウルシオール定最のため１．５μＱ及び１０
μｇのウルシオールをコクロマトグラフ処理する。対照
として、上記インキュベーションをカテコール ２．３
−オキシゲナーゼの不存在下に行なう。 以上の実験結果によれば、ウルシオールは、綿、綿−ポ
リエステル、ウール及びアクリルからは、洗剤溶液中で
単に洗浄するだけで有効に除去されるもの、カテコール
２，３−オキシゲナーゼを用いない限り破壊されない
。しかし、カテコール２．３−オキシゲナーゼの存在下
では、ウルシオールはＴＬＣ分析によっても検出されず
、ウルシオールのカテコール環の酵素的開裂を示す黄色
が洗浄液中に出現する。洗剤の不存在下では、ウルシオ
ールは織物に吸収されたまま残存し、カテコール ２，
３−オキシゲナーゼにより開裂されない。上記条件下で
は、１０ユニツトのカテコール ２．３−オキシゲナー
ぜは、ウルシオール１０μΩを容易に開裂せしめ、従っ
て使用酵素量及び／又はインキュベーション時聞を減少
させ得ることが判る。 工ｌニー」し」１ 得られた結果から、カテコール ２．３−オキシゲナー
ゼは、市販洗剤溶液中等の混合媒体（ｃｏｍｐｌｅｘ
ｍｅｄｉａ ）中において、広い温度範囲で活性を示
し、且つ安定であることが判明した。 更に、保護剤を添加することにより、好ましい結果が得
られる。カテコール ２．３−オキシゲナーゼは、汚染
された材料の通常の洗浄中にウルシオールを有効に除去
する。 下記菌株及びプラスミドは、アグリカルチュラル リサ
ーチ カルチＡ７− コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託
され、次の番号を付与された。 ０プラスミドｐＴＧ４４１を含有する菌株Ｍ１１１２・
・・・・・８１ ５２６５ ＱプラスミドｐＴＧ４０２を含有する菌株ＴＧＢ１・・
・・・・８１５２６４ 以下に、参照した文献名を記載する。 ８５− １、 ｌｌｉｒｎｂｏｉｍ １１．ｃ、 ｅｔ Ｊ、
Ｄｏｌｙ、 １９７９． Ａ ｒａｐｉｄａｌｋ
ａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒ
ｅ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ＋ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。 ７； １５１３−１５２０゜ ２、 Ｂｏｙｌａｎ Ｒ，Ｊ、、 Ｎ、＋１． Ｍｅ
ｎｄｅｌｓｏｎ、 Ｄ、 Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔＦ、
Ｅ、 Ｙｏｕｎｇ、 １９７２． Ｒｅ）；ｕｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｌ
ｗａｌｌ； ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ
ｍｕ仁ａｎｔ： ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｂｉｏ
ｓｙｒｒｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｅｉｃｈｏｉｃａ
ｃｉｄ、 Ｊ、 Ｂａｃｔ：ｅｒｉｏｌ、 １１
０ ； ２８１−２９０゜３、 Ｃｂａｎｇ Ｓ
、 ｅｔ Ｓ、Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ、 １９７９．
Ｈｌｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｅｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｌ）仁１
１１ｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｂｙ ｐｌａｓｍ
ｉｄ ＤＮＡ、 １４ｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇ
ｅｎｅ仁、 １６８ ：１１１−１１５゜ ４、 Ｄｕｌ）ｎａｕ Ｄ、 ｅｔ Ｃ：、 Ｃｌｒ
ｉｇ１１．ａｎｏ、 １９７４． Ｇｅｎｅｔｉｃｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｕｔａｎｌ＝８
ｃ迂 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ仁１１１ｓ、
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。 １１７ ＋ ４８８−４９３゜ ５、 １）ｕｂｎａｕ Ｄ、、Ｒ，Ｄａｖｉｄｕｆｆ−
Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｂ、５ｃｈｅｒ ｅｔＣ，Ｃｌｒｉｇ
ｌｉａｎｏ、 １９７３． Ｆａｔｅ ｏｆ ｔｒ
ｓｎｓｆｏｒｍｉｎｇｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉ
ｃ ａｃｉｄ ａｆｔｅｒ ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ｃｏ
ｍｐｅｔｅｎｔＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
ｐｈｅｎｏＬｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ ８６− ｏｆ ｒａｃｌｉａｔｉｏｎ ５ｅｎｓｉ仁ｉｖｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ：ｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｔｍｕｉｎｔｓ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１１４
＋ ２７３−２８６゜６、 Ｆｒａｎｌｃｌｉｎ
Ｆ、Ｃ，１１，、Ｈ，Ｈａｇｄａｓａｒｉａｎ、 １１
．Ｍ。 Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ＫＪＬ Ｔｉｍｍ１ｓ
、 １９８１． Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
ＴＯＬ ｐｌａｓｍｉｄｐＸＡＪＯｆｒｏｍ Ｐｓｅｕ
ｄｏｎ＋ｏｎａｓ 匹旦西ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏ
ｆｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｅｌｓｅ ｅｎｔｉｒｅ ｒｅ
ｇｕｌａｔｅｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｉｎｇｍｅｔａ
ｃｌｅａｖａｇｅ ｐａｔｈｗａｙ、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。 Ｌｌ、Ｓ、Ａ、 、川７４５８−７４６２ （８２）。 ７、 Ｇｕｅｒｒｙ Ｐ、、 Ｄ、Ｊ、 Ｌｅ Ｂｌ
ａｎｃ ａｔ Ｓ、 Ｆａｌｋｏｗ、 １９７３゜Ｇ
ｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｂｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ １ｓｏ
ｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｒｎｉｄｄｅｏｘｙｒｉ
ｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、 Ｊ、 Ｂａｃｌ：ｅ
ｒｉｏｌ、υ瓜；１０６４−１０６６゜ ８、 Ｈａｙｗａｒｄ Ｇ、Ｓ、 ｅｔ Ｍ
、Ｇ、 Ｓｍ１ｔｈ、 １９７２． Ｔｂｅ
ｃｈｒｏｍｏ−ｓｏｍｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐ
ｈａｇｅ Ｔ５．１． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔ
ｈｅｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｆｒａ
ｇｍｅｒ＋ｔｓ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌｅｌｅ
ｃｔ、ｒｏｐｂｏｒｅｓｉｓ、 Ｊ、 ＋４ｏ１．
Ｂｉｏｌ、 ６３； ３８３−３９５゜９、
Ｉｎｏｕｙｅ Ｓ＋、 Ａ、 Ｎａｋａｚａｗａ ｅ
ｔ Ｔ、 Ｎａｋａｚａｗａ、 １９８１゜Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＴＯＬ ｇｅｎｅｓ
ＩＢ ａｎｄ ＩＥｌｏ、 Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ
Ｅ、ト１． ｅｔ Ｓ、Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ、
１９７４． Ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｃｒ＋ａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＄ ｂｙ ｐｌａｓ
ｍｉｄｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ｌｌ’ｈ１０７２−１
０７４゜ １１、 Ｌｏｗｒｙ Ｏ，Ｊ、、 ｔＬｔｌ、 Ｒｏｓ
ｅｂｒｏｕＢｂ、 Ａ、Ｌ、 Ｆａｒｒ ｅｔＲ，Ｊ
、 Ｒａｎｄａｌｌ、 １９５１． Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎ仁 ｗｉｔｈ仁ｈｅ Ｆ
ｏｌｉｎ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎ仁、 Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 １９３：２６５−
２７５゜ １２、ＭｅｙｅｒｓＪ、Ａ、、Ｄ、５ａｎｃｈｅｚ、Ｌ
、Ｐ、ＥｌｗｅｌｌｅｔＳ、Ｆａｌｋｏｗ、 １９７
６、 Ｓｉｍｐｌｅ ａｇａｒｏｓｅ ｅｌｅｃｔｒ
ｏ−ｐｂｏｒｅｔｉｃ ｍｅｍｈｏｄ ｆｏｒ
ｔｌｌｅ １ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍ
ｉｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ、
Ｊ、 Ｂａｃ仁ｅｒｉｏ１． １２ｈ １５２９
−１５３７゜１３、Ｈｏｒｒｉｓｏｎ Ｉ）、Ａ、１
９７７、 Ｔｒａｎｓｆｏｒ＋ｎａｔｉｏｎ １ｎ
Ｅａｃｈｃｒｉｅｂｉａ ｃｏｉｌ； ｃｒｙｏｇｃｎ
ｉｃ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆｃｏｍｐｅｔｅ
ｎＬ ｃｅｌｌｓ、 Ｊ、 ＢａＣ仁ｅｒｉｏ１．
１３２＋ ３４９−３５１゜１４、 Ｎａｋａｚ
ａｗａ Ｔ、、 Ｓ、 Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ
Ａ、 Ｎａｌｃａｚａｗｓ、 １９８０゜Ｐｈｙ
ｓｉｃａｌ ａｎｄ ｆｕｎｅ仁１ｏｎａｌ ｍ
ａｐｐｉｎｇ ｏｆ ＲＰ−４ＴＯＬｐｌａｓｍｉ
ｄ ｒｅｃｏ＋ｎｂｉｎａｒ＋ｌ：ｓ＋ ａｎａｌｙｓ
ｉｓ ｏｆ １ｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄ ｄｅｌｅｔ
ｉｏｎ ｍｕｔａｎＬ：ｓ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
１４４：２２２−２３１゜ １５、 Ｐｈ１ｌｉｐｐｓｅｎ Ｐ、、 Ｒ，Ａ
、 Ｋｒａｒｎｅｒ ｅｔ Ｒ，ｔＪ、 Ｄａ
ｖｉｓ、 １９７８゜Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ヒｈ
ｅ ｙｅａｓＬ ｒｉｂ０８０ｔｎ８１ ＤＮＡ
ｒｅｐｅａｔ ｕｎｉｔｉｎ Ｓｓｔ Ｉ ａｎｄ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｌａｍｂｄａ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｕｓｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌｓｉ
ｚｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ、Ｊ、Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、１２３； ３７１−３８６゜１６、 Ｐ
ｒｉｍｒｏｓｅ Ｓ、Ｂ、 ｅｔ： Ｓ、Ｄ、
Ｅｈｒｌｉｃｂ、 １９８１． ｌ５ｏｌａ仁
１ｏｎｏｆ ｐｌａｓ＋ｎｉｄ ｄｅｌｅ仁ｉｏｎ
ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ５ｔｕｄｙ ｏｆ
ｔｈｅｉｒｉｎｓＩｌ：ａｂｉｌｉｔｙ、 Ｐｌ
ａｓｍｉｄ ６＋ １９３−２０１゜１７、 Ｒａ
ｄｌｏｆｆ ＲＪｌ、、 Ｗ、 Ｂａｕｅｒ ｅｔ Ｊ
、 Ｖｉｎｏｇｒａｄ、 １９６７゜Ａ ｄｙｅｂｕｏ
ｙａｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｕｅ＋＝１１０ｃｌ ｆ
ｏｒ ｔｉｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄ １ｓｏｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ
ｃｏｍｐｌｅｘ ＤＮＡ；ｔｈｅ ｃｌｏｓｅｄ
ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ ｉｎ ＨｅＬａ
ｃｅｌｌｓ、 Ｐｒｏｃ。 ［Ｊａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、５７：
１５１４−１５２１゜１８、 Ｒａｐｏｐｏｒｔ Ｇ
、、 Ａ、 Ｋ１１ｅｒ、 Ａ、 Ｂ１１１ａｕｌｔ、
Ｆ、 Ｆａｒｇｅｔｔｅａｔ Ｒ，Ｄｅｄｏｎｄｅｒ
、 １９７９． Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ａ ｃｏｌｏｎｙｂａｎｋ ｏｆ Ｅ、 ｃｏｌｉ ｃ
ｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ １６８ｇｅｎｏｍｅ、
Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １７６：
２３９−２４５゜１９、 ５ａｎｃａｒ Ａ、、
Ａ、Ｍ、 Ｈａｃｋ ｅｔ Ｗ、Ｄ、 Ｒｕｐ
ｐ、 １９７９゜５ｉｔｎｐｌｅ ｒｎｅｔｂｏｄ
ｆｏｒ １ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｌａｓｒｐｉｄ−ｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３７； ６９２−
６９３゜ ８９− ２０、５ｐｉｚｉｚｅｎ Ｊ、 １９５８． Ｔｒａ
ｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏ−ｃｈｅｒｎｉ
ｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎ仁 Ｓ仁ｒａｉｎｓ
ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ｂｙ
ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａＩｌ：ｅ、 Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａ仁１゜Δｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ
、ｌ＋４： １０７２−１０７８゜２１、５ｕｔｃｌ
ｉｆｆａ Ｊ、Ｇ、、 １９７９． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ旦ｐｌａｓｍｉｄｐ
ＢＲ３２２，Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｓｙｍｐ、 Ｑｕａｎｔ。 Ｂｉｏｌ、４３； ７７−９０ ２２、 Ｒｅｎａｕｔ： Ｅ、、 Ｐ、 ５Ｌ
ａｎｓｓｅｎｓ ｅ仁 Ｗ、 Ｆｉｅｒｓ、 １
９８１゜Ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅａｌ：ｏｒｓ ｆｏｒ
ｌｓｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＰＬ
ｐｒｏｍｏｍｏｒ ｏｆ ｃｏｌｉｐｈａｇｅｌ
ａｍｂｄａ、Ｇｅｎｅ １５＋ ８１−９３゜２３
、Ｌｉｅｂ 口、 １９６（１，Ｓしｕｄｉｅｓ
ｏｆ ｈｅａ仁 １ｎｄｕｃｉｂｌｅ ｌａｍｂ
ｄａｂａｅｔｅｒＬｏｂａｇｅ １． ｏｒｄｅｒ ｏ
ｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｉｔｅｓ ａｎｄｐｒｏｐｅｒ
Ｌ：ｉｅｓ ｏｆ ｍｕｅｄｎｔ： ｐｒｏｐｈ
ａｇｅｓ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ。 １６； １４９−１６３゜ ２４、 ｌｌａｌｌｅｗｅｉｌ Ｒ，Ａ、 ｅｔ Ｓ、
Ｅｍｔａｇｅ、 １９８０． Ｐｌａｓｍｉｄｖ
ｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎ仁ａｉｎｉｎｇ Ｌｈｅ ｔ
ｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｏｐｅｒｏｎｐｒｏｍｏｔｏｒ
５ｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒ
ｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒ
ｇｅｉｎ ｇｅｎｅｓ、Ｇｅｎｅ ９＋ ２７−４７゜
２５、 Ｋｕｓｈｎｅｒ Ｓ、Ｒ，１９７８，Ａｎ ｉ
ｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ９０− ｔｒａｎｓｆｏｒｒ、＋ａ仁ｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｂｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ Ｃｏ１Ｅ
１ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ、 ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。 Ｅｄｓ Ｂｏｙｅｒ、 Ｈ，Ｗ、 ａヒ Ｓ、
Ｎ１ｃｏｓｉａ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｈｏｒｔｈ−
１１ｏ１１ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｐｒｅｓｓ
、 １９７８゜２６、 Ｍｕｒｒａｙ ＩＣＥ、
ｅｔ Ｗ、Ｊ、 Ｂｒａｍｔｎｅｒ、 １９
７３゜Ｔｈｅ 衰１Ｅ ｇｅｎｅｏｆ Ｅｓｃｂｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌ↓Ｋ ｃｏｎｔａｉｎｓａ ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ Ｋ−ｒｅｓｅｒｉｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ、Ｊ
、１ｌｏ１．Ｂｉｏｌ、７７＋ ６１５−６２４゜２
７、 Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｆ、Ｃ，Ｈｏ、 ｌ−１，
Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ Ｋ、Ｎ、 ’ｒｉｒｍ
ｎｉｓ。 １９８１、１４ａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｇ
ｒｅｄａｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ５ｏｉｌＬ＋ａ
ｃｔｅｒｉａ、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＤｅｇｒｅｄａｔｉ
ｏｎｏｆＸｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓａｎｄ Ｒｅｃａｌ
ｃｉｔｒａｎｔ： Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、 Ｅｎｄ
ｓ Ｒ，Ｂｕｔｔ：ｅｒ ｅｔＴ、Ｌｅｉｓｉｎｇ
ｅｒ、Ａｃｄｄｅ＋！ｔｉｅ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏ
ｎ １９８１゜１０９−１３０゜ ２８、 Ｎｏｚａｋｉ Ｍ、、 Ｋａｇａｍｉｙ
ａｍａ Ｈ，１ｌａｙａｉｓｈｉ、 ｔｌｅｔａｐ
ｙｒｏ−ｃａｔｅｃｈａｓｅ、 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ、 Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎａｎｔｉ
ｓｏｍｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、１９６３．８ｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｃｈｅＺｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ３３８：
５８２−５９０゜２９、 ５ａｌａｔ−Ｔｒｅｐａｔ
： Ｊｏｓ６ Ｍ、、 Ｅｖａｎｓ Ｃ，Ｔｈ
ｅ ｍｅｔａ−ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｃａｔ
ｅｃｈｏｌ ｂｙ Ａｚｏ仁ｏｂａｃｔｅｒ ５
ｐｅｃｉｅｓ 。 １９７１、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０： ４
００−４１３゜３０、 ｈ：ｈｒｌ、ｉｃｈ Ｓ、
Ｄ、、 １９７７、 Ｒｅｐｌｉｃａ仁ｉｏｎ
ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ
ｓ ｆｒｏｍ Ｓｔａ １１１ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ １ｎＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｌ：１ｌｉｓ
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、、７４．１６８０−１６８２゜３１、Ｃａ
ｒｒａｓｃｏｓａＪ、Ｌ、、ＣａｍａｃｈｏＡ、、）ｉ
ｏｒｅｎｏＦ、。 Ｊｉｍｅｎｅｚ Ｆ、、 Ｍｅｌｌａｄｏ Ｒ，Ｐ、、
Ｖｉｎｕｅｌａ Ｅ、 ｅｔＳａｌａｓ Ｍ、、１
９７６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ８ｔｌｂｔｉｌｉｓ ｐ
ｂａｇｅ φ２９゜Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、６６
．２２９−２４１゜３２、 ＨｃＬａｕｇｈｌｉｎ
Ｊ、Ｒ，、Ｍｕｒｒａｙ Ｃ，Ｌ、 ｅｔ：
ＲａｂｉｎｏｗｉｔｚＪ、Ｃ，、１９８２，ｌ１ｅｔｅ
ｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ。 ｉｎ Ｈｌｃｒｏｌ）１ｏ１ｏｇｙ、 １９８２． Ｅ
（１，Ｄ、 Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ。 Ａ＋＋＋ｅｒｌｃａｎ Ｓｏｃ、ｉ、ｅｔｙ ｆｏｒ
＋４１ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 ＋Ｊａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ１）、Ｃ，、円）、２２−２７゜ ３３、Ｎｏｚａｋｉ １４．Ｏｎｏ Ｋ、、Ｎａｋａｚ
ａｗａ Ｔ、Ｋｏｔａｎｉ Ｓ、ｅｔｌｌａｙａｉｓｈ
ｉ Ｏ，、１９６８，Ｍｅｔａｐｙｒｏｃａｌ：ｅｃｈ
ａｓｅ Ｉｌ、 Ｔｈｅｒｏｌｅ ｏｆ １ｒｏｎ ａ
ｎｄ ５ｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐｓ、 Ｊ、
Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅ＋ａ、 ２１＋３． ２６８２−２６９０゜３
４、 Ｎａｚａｋｔ Ｍ、、 １９７９． Ｏ
ｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｅ仁 ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ
ｓ。 Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ、 Ｃｈｅｍ、、 ７８．１４
５−１８６゜３５、Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ、Ｓ、ａｎｄ
Ｂ、Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、１９８２゜Ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌ ｍａｐ ｏｆｐｃ１９４． ａ ｐｌａｓｍｉｄ
ｔｈａｔ ５ｐｅｃｉｆｉｅｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃ
ｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。 １５０、 ８１５−８２５゜ ３６、１ｌｏｒａｎ、 Ｃ，Ｉ’、 Ｊｒ、、 ｔｌ、
Ｌａｎｇ、 Ｓ、Ｆ、Ｊ、 Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ。 Ｇ、 Ｌｅｅ、 Ｉ゛１．５ｔｅｐｈｅｎｓ、 Ａ、Ｌ
、 ５ｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、 Ｊ、 Ｐｅｒｏ。 ａｎｄ Ｒ，Ｌｏｓｉｃｋ １９８２． １Ｊｕｃ
ｌｅｏ仁Ｌｄｅ ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ 仁ｈａｔｓ
ｉｇｎａｌ ｔｈｅ １ｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ９３−
上記条骨下で測定する。 また、上記抽出物を５５℃にて異なる時間処理する。 ２６− 上記結果から判るように、該酵素は＾温耐牲を示す。次
の結果によっても、この＾い安定性が確認される。 上記抽出物を、各種緩衝液に蛋白濃度０．３２１１ｇ／
−まで希釈し、室温下で貯蔵した。 上記結果から、アセトンの安定化作用が判る。 アセトンは、抽出の目的で従来用いられていた（文献２
８．２９）。 Ｌ上玉農り乞盾１− ０．１Ｍりん酸塩中、種々のＥｌＨ値にて行なわれた酵
素の試験により、Ｉｎ−１６，７５において最＾の活性
が得られることが判った。 Ｌ！ＬＩＬ 加えて、４５℃において最＾の活性を示した。 ３０℃での活性レベルは、最＾の活性の半分であること
が示される。 本発明によるカテコール ２．３−オキシゲナーゼを含
有する組成物としては、特に化粧品及び医薬品分野での
局所的適用のための組成物を挙げることができる。この
タイプの組成物で使用するのに適当な基剤は当業者に公
知であり、それは本発明の特徴ではない。しかしながら
、本発明組成物の調整の際には、アセ１−ンヤ他の保Ｉ
Ｉ！溶媒が０２．３−０に対し安定化効果を有すること
、及び最高活性１１Ｈが６．５〜７．５の範囲に存する
ことを考慮するのが好ましい。 Ｃ２，３−０を食品工業において保存剤、特に果物の褐
色化防止のために、使用する場合、精製された酵素又は
細菌抽出物を使用することが可能である。ある場合、特
に果物を含む食品が醗酵製品である場合には、細菌自体
を使用することさえ可能である。 以下の実施例は、本発明の特徴及び利点を更に説明する
ものである。特にことわらない限り、参考文献は、明細
書の末尾に掲げられており、明細書中にはその番号のみ
が示しである。 添付図面は、本発明のある特定の態様を理解するのに役
立つであろう。 第１図は、ｐ ＴＧ２００の制限地図（ｒｅｓｔｒｌｃ
−Ｎｏｎ ｓａｐ ）である。 第２図は、１）ＴＧ２０６、ｐＨＶ３３及び＋１ＴＧ４
０２の制限地図である。 ２９− 第３図は、ｘｙｌ Ｅ遺伝子のヌクレオチド配列及びリ
ポソーム結合位藺な示す。 第４図は、ｘｙｌ Ｅ遺伝子配列のための手法（５ｔｒ
ａｔｅｌｌＶ）を示す。 第５図は、Ｃ２，３−０を含有する種々の抽出物の電気
泳動図である。 第１段階において、プラスミドｐ ＷＷＯのＸｈＯ■フ
ラグメントの１つに完全に含有されているｘｙｌ Ｅ遺
伝子が、小さいプラスミド群を使用してクローン化され
た。その結果非常に大きいプラスミドであるｐ ＷＷＯ
の制限フラグメントのすべてを選択することなく、試験
のための再びクローン化の容易なＸＶＩＥＤＮＡの諒が
刷製された。 加えて、これらの小さいプラスミドは、カテコール ２
，３−オキシゲナーゼの研究のために、この酵素を大量
に調製することを可能にした。 実施例１ −ａ Ｏ＝ ｌａ ） （ｊ７ｙｌＺ」ｔプラスミドル
ＷＷＯは、シュードモナス ビュチダ（Ｐ ｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ ｌｄａ ）の菌株から抽出さ
れ ｌこ 。 該プラスミドベクターは、カナマイシン及びストシブ１
−マイシンに対する耐性を］−卜するプラスミドｐ Ｋ
Ｔ２３０ （文献６）である。このプラスミドは、カナ
マイシン耐性遺伝子内に、独特な（ｕｎｉｑｕｅ）部位
ＸｈｏＩを有する。 プラスミドｐ ＢＲ３２２もクローン化ベクターとして
使用された。 宿主菌株は、すべてＥ、Ｃｏ１１Ｋ１２から派生したも
のである。５Ｋ１５９２は、ｇａｌ ｔｈｉｓｂｃ
８１５ ｅｎｄ Ａ ｈｓｄ Ｒ４ｈｓｄＭ
”（文献２５）である。ＢＺ１８は、ｒｌｒ ｉｋ”
ｇａｌ ｌａｃ ｙ ５ｕｌｌ［（文献１９）で
ある。Ｗ３１１０は、ｔｒｐ ＯＥ ｓｅｔ −（文
献２６）である。 Ｉｂ） 方 法 ｐ ＫＴ２３０におけるｘｙｌ Ｅ遺伝子のクローン化
のために、ｐ ＷＷＯのＩ） Ｎ Ａが制限酵素Ｘｈｏ
Ｉを用いて切断され、そしてアルカリンフォスファター
ゼで処理したベクターのＤＮＡのＸｈｏＩフラグメント
ど結合（＋ Ｉｇａｔｅ）された。 以前の研究により、このＸＶＩ Ｅ遺伝子がプラスミド
ｐ ｗｗｏの制限フラグメン１へＩ（Ｘｌ＋ｏＩ）中及
びそのフラグメントのＢａｌＭＨＴ−Ｘ ｈｏＩサブフ
ラグメント中に完全に位置していることが知られでいる
（文献６．９）。 菌株５Ｋ１５９２が、冑られたプラスミドにより形質転
換され、ストシブ［・マイシン耐性のコロニーがカテコ
ールの散荀によりｍ１定された。 この方法による同定が可能なのは、カテコール２．３−
オキシゲナーぜを含有する菌株がカテコールど接触した
ときに、２−ヒドロキシムコンセミアルデヒドを生成し
て色が黄色になるからである（文献′１４）。 完全なＸＶＩ ｉ：遺伝子を含んでいるが、プラスミド
ベクター〇ｒ） Ｎ Ａの一部を失った組み換え体を単
離する。プラスミドｌｌｌ’Ｇ２００の制限地図を、第
１図に示す。ｐ ｗｗｏのＤＮＡフラグメントは二重線
で示す。 このプラスミドｐ ＴＧ２００は、以下の試験において
、ｘｙｌ Ｅ遺伝子をコードするＤＮＡ源として使用さ
れる。 Ｄ ＴＧ２００のＢａ１ＨＩ−ＸｈＯＩ７ラク）＋１／
トは、プラスミドｐＢＲ３２２のＢａ１ｌＨＩ及びＳａ
ｌ■サイトでクローン化された。かくして得られたプラ
スミドを第１表に示す。 第 １ 表 ３３− ＡｐＲ：アンビシリン抵抗性。 ＴｃＳ：テトラサイクリン感受性。 得られた組み換えプラスミドを含む菌株それぞれについ
て、カテコール ２．３−オキシゲナーゼ発現のレベル
が比較された。 蛋白濃度は、ローリ−（Ｌ、 ｏｗｌｙ）法（文献１１
）により決定された。 得られた結果を、第２表に示す。 ３４− 第 ２ 表 異なった菌株における、指数的成長相でのカテコール
２，３−オキシゲナーゼの比活性（１１１０７１１１ｇ
） 第２表から判る様に、得られた菌株は、カテコール ２
，３−オキシゲナーゼの高いレベルを示し、該酵素を合
成するのに好適であると考えられる。 ｐ ＴＧ２０６の部分的制限地図が第２図のＡに示され
、制限部位に加えて、そこにはｘｙｌ Ｅ遺伝子及びＡ
ｐ’ 遺伝子も示されている。太線は、ｐＴＧ４０２
の合成に使用される部分を示している（＠記実施例参照
）。 かくして、Ｅ、Ｃ０１ｉ内でＸＶＩ Ｆ遺伝子を発現さ
せ得る小ざいプラスミド群を得ることが可能になった３
゜ 第２段階では、Ｂ、スブチリスにおいてｘｙｌ Ｅ遺伝
子を発現し得るプラスミドが、遺伝子ｘｙｌ Ｅのこれ
らの誼”から合成される。 この合成は次の二つの工程により達成される。 まず、Ｂ、スブチリスにおいて１１１ｋｌ可能なプラス
ミドを用いてｘｙｌ Ｅ遺伝子をクローン化し、つぎに
８．スブチリスにおいてｘｙｌ Ｅ遺伝子を発現するプ
ロモーターを選択覆る。 実施例２ この研究に用いたＢ、スブチリスの菌株は、マールブル
グ ストレイン（Ｎ４ ａｒｂｕｒｇ ５ｔｒａｉｎ
）１６８から派生したものである。菌株ＢＺ２ａｙｓ
８３ ｒｅｃ Ｅ、４は、ＢＤ２２４ ｔｈｒ５ｔ
ｒｐＣ２ｒｅｃＥ４の供与体ＤＮＡをＫＳ２７ｈｉｓ
Ａ １ ｃｙｓ Ｂ３に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍ ＞することにより得られた。 最終濃度０．１０μΩ／−のマイトマイシンＣ＜ＭＭＣ
）に感受性を有するｈｉＳ＋コロニーを選別した。低い
レベルのＭＭＣに対する感受性は、ｒθｃＥ４変異の存
在に関連する組み換え不能（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏ
ｎ ｄｌＨｉｃｉａｎｃｙ ）を示している（文献４
．５）。 菌株ＴＧＢＩ ｔｒｔ） Ｃ２ｒｅｃ Ｅ４ ｓｐ
。 ３３１は、ＢＤ２２４由来の供与体ＤＮＡをＲＵＢ３３
１ ｔｈｙ Ａ１ ｔｈＶ Ｂｌ ｔｒＤ Ｂ１
５ｐｏ ３３１の受容体細胞に形質転換して得られる。 菌株Ｍｌ １１２ （ｌｅｕ ８． ａｒｏ １５．
ｔｈｒ ５゜ｒｅｃ Ｅ４． ｒ−１−） （Ｔｕｎ
ａｋａ １９７９）Ｍ も使用された。 ＭＭＣ感受性のｔｈｙ＋細胞を選別した。 Ｅ、 Ｃｏ１ｔ ノ菌株は、Ｂ Ｚ １８ ｒｋ−ｍ
ｋ＋−３７＝ ｇａｌ ｌａｃ ｙ ｓｕｎ、Ｃ６００、ｍｋ−
ｍｋ＋に由来するもの及びＣ３Ｒ６０３である（文献１
９）。 プラスミドｐ ＴＧ２０６Ｇよ、実施例１で述べたもの
である。 制限地図が第２図の８に示されているプラスミド＋１
ＨＶ３３は文献１６及び１８に記述されている。このプ
ラスミドルよ、Ｅ、−」りで複製でき、宿主細胞をアン
ごシリン（５０μｇ／１ｌｌｌ）Ａｐｒ 、テトラサイ
クＩＪン（１５ｕｏ ／ｍＱ）Ｔｃ’ 及（ｊ’ｙロラ
ムフエニコール（２０μＧ／ｍ）Ｃｍ’に耐性を示すも
のとし、また、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｌｓにおいてもＩＩ
製する。しかｔノながら、後者の宿主においては、クロ
ラムフＪニコール（５μｏ／ｍｌ）に対する耐性のみが
発現される。 第２図のＦ３中、ｐＨＶ３３の太線部分は、ｐ ＴＧ４
０２の生成に使用される部分を示す（後記実施例会ｆｉ
ｌｌ）。 ２ｂ） １潰培 び培養条 すべてのＢ、スブチリス菌株は、０．３％（Ｗ／Ｖ）の
追加の寒天及び最終濃度がいずれも２０３８− μ０／−のチミンとウラシルを補給したトリプトース
ブラッド アガー ベース（ＴＢＡＢ ：Ｄｌｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）で維持した。プラスミ
ドを有する菌株の維持のために、ＴＢＡＢに５ｕＱ ／
ｌ１ｌｌｉのクロラムフェニコール（３ｉｇｍａＣｈｅ
ｉ＋１ｃａｌ Ｃｏ、）を添加した。 高い濃度の液体培地での培養細胞の生育は、２０μａ／
ｗＩＱのチミンを補給したペンアッセイブロース（ＰＡ
Ｂ；Ｐｉｔｉｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で行
なった。必要に応じて、クロラムフェニコールを添加し
た。 すべでのＥ、コリ菌株は、Ｌ−アガーで維持した。液体
培養はＬ−ブロースで行なった。必要に応じて、抗生物
質を添加した。 すべての培養物は、３７℃で生育された。液体培地のエ
アレーションは、撹拌により行なった。 確立されたＢ、スブチリス培養物は、空温（２０〜２２
℃）においてＴＢＡＢで維持された。Ｅ。 コリ培養物は、４℃においてＬ−アが−で維持された。 ２０ ） ＬＩＬ！ｌ！２１貢１０１プラスミドＤＮ
ＡをＥ、コリ受容体細胞に入れる形質転換は、レーダー
バーブ（Ｌ ｅｄｅｒｂｅｒｏ）とコーエン（Ｃｏｈｅ
ｎ）（１９７８）（文献１０）の方法により、モリソン
（Ｍｏｒｒｌｓｏｎ ） （１９７７）（文献１３）
の記１ところにより行なわれた。当該細胞は形質転換に
先立ち冷保存された。 バチルス スブヂリスの慣用的形質転換（スピッツエン
、５ｐｌｚｌｚｅｎ 、 １９５８ ） （文献２０
）に続いて、ボイランら（Ｂ ｏｙｌａｎ ａｔ
ａｔ、１９７２）〈文献２）の方法を行なった。別の方
法は、プロトプラストをプラスミドＤ Ｎ Ａで形質転
換するものであった（ヂ）シン（ＣｈａＨ）とコーエン
（Ｃｏｈｅｎ） １９７ ’Ｊ ） （文１３ ） 、
ｆｌｌ用的Ｊ［転換を行なう場合には、プラスミドを
含有する菌株の選別を、５μｇ／−のクロラムフェニコ
ールを補給したＴＢＡＢ培地で行ない、そしてプロスト
ラド形質転換の場合には、２０μｇ／−のクロラムフェ
ニコールを補給」）た０Ｍ３再生（ｒｅｇｅｎｅ −ｒ
ａｔｌｏｎ）培地（文Ｍ３）で行なった。 Ｃ２，３−０の発現は、実施例１と同様にして測定した
。 ２ｄ ） ＴＧ４０２の生成 プラスミドｐ ＨＶ３３を、Ｂａ１ＨＩ制限エンドメク
レアーゼで、６１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（Ｔｒｉｓ ） Ｉ） Ｈ７，９，６ｍＭＭＣｌ
Ｃｌ２２．１００１Ｍ Ｎａ ＯＱ、 １ｕＱＤＮ
Ａ及び６単位の酵素からなる溶液中で消化した。反応は
、１時間、３７℃で行なった後、１０分間６５℃で加熱
して停止させた。ａ＊＊条件を、１００１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ、ｐｉ−１７，４，５ｍＭＭｇＣＱ２及び５０１Ｍ
ＮａＣＴｉに調節し、次いで３単位のＥＯＯＲＩ制限
エンドヌクレアーゼを加えた。インキュベーションは、
３７℃で１時間行なった。 反応は、上記と同様に、加熱により停止した。 プラスミドｐ ＴＧ２０６は、Ｉｌｌ ＨＶ３３と正確
に同じ方法で、処理された。 プラスミドフラグメント（各々０．５μＱ）は、６６ｓ
Ｍ Ｔｒｌｓ ＨＣ（１、ｐ Ｈ７，９，６，６４
１− ＩＭ ＭＱ Ｃ（ｉｌｌ 、１０１Ｍジチオスレイト
ール（ＤＴＴ） 、０．５ｍ Ｍアデノシントリフオス
７Ｊ、−１−（ＡＴＰ）及び０．１単位のＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ（Ｂ ｏｏｂｒｉｒ＋ｏｅｎ Ｍ ａｎｎ
ｈｏ１ｇ＋ ）からなる緩衝液５０μＱ中で、結合され
た。結合は、１０〜１２℃でほぼ１８時間行なった。結
合反応は、溶液を１０分間６５℃に加熱して停止させた
。結合生成物は、４℃で保存し、そのまま形質転換に使
用した。 結合生成物を、Ｆ、」すＢ Ｚ １８に、形質転換によ
って導入した。受容体細胞のアンピシリン耐性、クロラ
ムフェニコール耐性、及びテトラサイクリン感受性によ
り選別を行なった。 上記手順により、プラスミドＤ Ｎ Ａ １μＱ当り、
７．６Ｘ１０’個の形質転換体を得た。 形質転換体に、カデ］−ル溶液を散布し、黄色になった
コロニーを新たなアンピシリン選別培地に移した。黄色
の呈色は、Ｃ２，３−０遺伝子が４２− 存在し、機能的に弁環されていることの証拠である。プ
ラスミドＤＮＡは、１４の代表的なコロニーの培養物１
ｗＪから調製され、アガロース ゲル上に分割（ｒｅｓ
ｏｌｖｅ ）された。 大多数のプラスミドはｐ ＴＧ２０６よりも大きく、ｐ
ＴＧ４０２よりも大きく、そして１つのＢａＩＩＩＨ■
と３つのＣＩａＩの制限酵素位置を持っていた。 これらのプラスミドの１つであって、ｐＴＧ４０２と名
付けられたものは、１Ｑの培養物から１１１ｔＪされ、
数種の制限酵素で分析された（下記参照）。新たに形成
されたｐ ＴＧ４０２は、Ｅ、コリ及びＢ、スブチリス
の双方の宿主において複製できるプラスミドベクター上
に０２．３−０遺伝子を有している。しかしながら、後
者の宿主においては、１１ ＴＧ４０２により」−ドさ
れたＣ２゜３−〇遺伝子は、機能的に発現しなかった。 即ち、Ｂ、スブチリスＴＧＢＩのクロラムフェニコール
耐性形質転換体のすべては、カテコールを散布しても白
色のままであった。このことは、Ｂ、ズブチリス宿主中
で０２．３−０遺伝子が転写又は翻訳されないか、ある
いは形質転換工程又は成長工程において再配列（ｒｅａ
ｒｒａｎｇｅ ）されたかであることを示唆する。 プラスミドはＢ、スブチリスから抽出され、Ｅ。 コリに再導入された。１べてのＥ、コリ宿主細胞は、カ
テコール散布により黄色になった。Ｃ２゜３−０遺伝子
番よ、発現が明瞭でないＢ、ズブチリス宿主中のプラス
ミドベクター上にそのまま残っていた。このことは、グ
ラム陽性宿主中の０２゜３−〇遺伝子のプロモーション
の欠如によるものと証明された。 ２ Ｃ３） Ｌ」ＬＧ ４０２の制ＪｕｌＬＬ、ｌ
Ｌ数種の制限酵素を用いてｐＴＧ４０２を消化させた。 部分的制限酵素地図を第２図のＣに示す。 太線部分はｘｙｌ Ｅ遺伝子を示し、矢印は転写方向を
示す。第３表はｐ ＴＧ４０２の制限酵素分析を示す。 ９．’Ｏｋｂのプラスミドは、ｐＢＲ３２２（ＢａｍＨ
Ｉと５ａｌＩとの間１７）小［１１引＜）、ｐＣ１９４
、及びＣ２，３−０遺伝子を含むｐ ｗｗｏのＢａ１ｌ
ＨＩからＸｈＯ■ノフラクメントカらなっている。ｐＢ
Ｒ３２２とｐｃ１９４はすでに配列されている（文献２
１及び３５）。Ｃ２゜３−０遺伝子を含むＤＴＧ４０２
の該領域は現在配列中である。これはＢａｍＨＩ−Ｘｈ
ｏＩ／５ａｌＩフラグメントとして挿入される。この領
域内に）−１ｐａＩ 、 Ａ ｖａＩ及びＣＩａＩに対
する１つの部位及び５ａｌＩに対する３つの部位が存在
する。同領域にはＢ（＋＋１１、ＥＯＯＲＩ、Ｈｉｎｄ
ｌ［Ｉ、ＫｐｎＩ、５ａｃＩ 、ＳｍａＩ 、 ５ｐｈ
Ｉ 、 ＸｂａＩ 、 ＸｈｏＩ又はＸｍａ■に対する
位置は存在しない。ＨｐａＩ及びＫｐｎＩ部位は全ｐ
ＴＧ４０２プラスミドにおいて特有のものである。Ｃ２
，３−０遺伝子内にＡｖａ■部位がある。というのは、
該ＡＶａＩでｐＴＧ４０２を切断し、得られるフラグメ
ントを元のものに反対方向に結合すると、遺伝子活性を
失わせるからである。 ４５− 第３表 Ｌ」ｌ土更□２ｆｆｉ−ＩＬＩＩＪＪ豆１酵素
全部位数 Ｂａ１ｌＨＩ−ＸｈｏＴ／５ａｌＩ＝Ｕ
鷹ｆｆ−匁Ｊ冒虹ｍ−−−−− ＡＶａＩ ２ １
ＢａｍＨＩ １ １
ＢΩ１■ ０ ０Ｃ１
ａＩ ４ １Ｅｃ
ｏＲＩ １ ０Ｈｌ
ｎｄｌｌ［２０ ＨｐａＩ １ １
ＫｐｎＩ １ １Ｐ
ｓｔＴ １ ０Ｓａ
ｃＩ ０ ０Ｓａ
ｌＩ ３ ３Ｓｍ
ａＩ ０ ０Ｓｐ
ｈＩ ０ ０Ｘｂａ
Ｉ Ｏ０ ＸｈｏＩ ＯＯ Ｘ翔ａＩ ＯＯ ４６− ２ｆ） Ｃ２３−０−をバチルス スブチバチルス
スブチリスＢＺ２から染色体ＤＮＡを分離し、６＋ａＭ
ｔｒｉｓ ＨＣＱ緩衝液（ＩＩＨ７，４）、６１
１１Ｍ ＭＣＩ Ｃ１１２，５０１ＭＮａ Ｃ１及び
２〜３単位の５ａｕ３Ａ／１μｕＡＤＮ中、３ａｕ３Ａ
ｒ消化させｒ、 ５’ ＧＡＴＣ３’ の単一の鎮状付着末端（ｓｌｎｏ
ｌｅＳｔｒａｎｄｆｉｄ ｃｏｈｅｓｌｖｏ ｔｅ
ｒａ＋ｎ＋ ）を有する数百のＤＮＡの小フラグメント
を得た。２等フラグメントを、予め３ａｍ）−ＩＩで線
状にされた。ｐＴＧ４０２と結合させた。Ｂａ１ｌＨＩ
は、５ａｕ３Ａと同一の単一鎖末端を作る。 結合された生成物を、形質転換によってバチルス スブ
チリスのプロトプラスト内に直接導入した。また、別法
として、上記生成物をまずエシェリヒア コリーＣ６Ｃ
６００ｒｋ−＋宿主に組み入れた。 エシェリヒア コリーの形質転換体を、５０μａ／ｍの
アムビシリンを含むＬ−ブロス内で一夜培養して選別し
た。混合された細胞集団を上清溶菌液Ｆｋ （ｃｌｅａ
ｒｅｄ １ｙｓａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ） （文献７
．１２）に従い処理し、プラスミドＤＮＡを単離した。 溶菌液上清（ｃｌｅａｒｅｄ １ｙｓａｔｅ）からのＤ
ＮＡの少量を、バチルス スブチリスＴＧＢ１またはＭ
１１１２受容細胞の慣用的形質転換のための供与ＤＮＡ
として用いた。プラスミド含有細胞のクロラムフェニコ
ール耐性により選別を行なった。 慣用的形質転換によるかプロ］−プラスト形質転換によ
るかに拘わらず、すべてのＴＧＢｌ又はＭ１１１２形質
転換体に、カテコール溶液を散布してＣ２，３−０遺伝
子の発現性を検査した。 Ｃ２，３−０遺伝子を転写させるプロモーターの選別の
ための指標として、」ロニーの黄色化を利用した。 プロトプラスト テコールを散布した助黄変する７種のコロニーを単離し
た。之等細胞内のプラスミドＤＮＡを、ｐＴＧ４１１、
４２３、４２４、４２５、４２６、４２７及び４２８と
命名した。 プラスミドを中間のエシェリヒア コリを経由して形質
転換させた場合では、カテコール散布により黄ｉする１
８以上のバチルス スブチリスコロニーが出現した。該
プラスミドをｐＴＧ４０３−４２１と呼ぶ。これはクロ
ラムフェニコール耐性の選択を続ける時Ｃ２．３−０遺
伝子活性を保持していた。上記各プラスミド類の起源を
下記第４表に示す。 ４９− 第４表 ハ天ダし一スノ天！２ス乍ａ匹二と≦４訳試 験
供与ＤＮＡ 形質転換法 プ
ラスミド−Ｎ虹 −−−−一□ Ｉ ＢＺ２＋ｐ ＴＧ４０２ Ｂ．ス１チリス
ＴＧＢＩ ｐ ＴＧ４１ １（３ ： １ ）結合
物 ブ【コトプうスト２ ＢＺ２＋ｐ ＴＧ
４０２ Ｅ．］すＢＺ１８（３ ： １ ）結合物 ３ 試験２の上Ｉ Ｂ．スブチリスＴＧ
Ｂ１ ｐＴＧ４０３（通常の°ｂの） ４ ＢＺ２＋ｐ ＴＧ４０２ ｉ＝．コリＢＺ
１Ｂ（４ ： １ ）結合物 ５ 試験４の１清 Ｂ．スブチリス１−Ｇ
［う１ ｐ ＴＧ４０４（通常のもの）
ｐＴＧ４１２１）ＴＧ４１３ ６ ＢＺ２＋１１ −ｒＧ４ｏ２ Ｅ．コリ（２
：１）結合物 Ｃ ６ ０ ０ ｒｋ− ｍｋ”
７ 試験６の−１ Ｂ．スブチリスＭ１
１１２ ｐＴＧ４０５（通常のもの）
ｐ ＴＧ４０６５０− 試 験 供与ＤＮＡ 形質転換法
プラスミドＮＯ。 ＴＧ４０７ ｐ ＴＧ４０８ ｐ ＴＧ４０９ ＴＧ４１０ ｐ ＴＧ４１４ １１ＴＧ４１５ ＴＧ４１６ ｐ ＴＧ４１７ ｐ ＴＧ４１８ ｐ ＴＧ４１９ ＴＧ４２０ ＴＧ４２１ ８ ＢＺ２＋ｐ ＴＧ４０２ Ｂ、スブチリス
Ｍ１１１２ １１１−Ｇ４２２（２：１）結合物
プロトプラスト ｐＴＧ４２３ＴＧ４２４ ＴＧ４２５ ＴＧ４２６ ＴＧ４２６ ＴＧ４２７ ２０＞ ７５２”Ｓ （７）
ＧＣＪ：冨栄ａＷｉ体媒地中で培養された１Ｑの澄明な
溶菌液（ｌｙｓａｔｅｓ ）から、プラスミドＤＮＡを
分離した。 プラスミドＤＮＡのｗｉ製は、塩化セシウム−臭化エチ
ジウムを使用する密度勾配遠心分離により行なった（文
献１７）。或いは、１ｍＧ培地からのアルカリ抽出法に
よりプラスミドＤＮＡを得た（文献１）。 精製されたｐＴＧ４０２は、数種の制限酵素を使用して
、酵素販売会社にコーイングランドバイオラブス：ベセ
スダ リサーチ ラボラトリース：ベーリンガーマンハ
イム）の推奨する条件下に消化された。０２．３−０遺
伝子の形質発現を促進づるｐＴＧ４０２誘導体は、プロ
モーターの下流側（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にあって且
つＣ２，３−０遺伝子の上流側（ｕｐｓｔｒθａ■）に
あるボテンシアル サイｌ−（ｐｏｔｅｎｔｌａｌ
５ｉｔｅｓ ）を決定する為に、Ｂａｅ＋ＨＴにより消
化された。 ＤＮＡ断片は、水平電気泳動装置中の０．８％（Ｗ／Ｖ
）又は１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル上で分離された。 トリスアセテートバッファー（Ｔｒｉｓ ４０ｉ Ｍ、
Ａｃ Ｎａ ２０１ Ｍ、ＥＤＴＡ２ａｉ Ｍ、ｐ Ｈ
７，８）を操作全般にわたって使用した。電気泳動は、
定電圧（３５Ｖ） 、室温（２０〜２２℃）で１４〜１
８時間行なった。 ＤＮＡは、臭化エチジウム（０，５μｇ／−）により３
０分間染色され、ゲルは蒸留水で充分に洗浄され、次い
でＤＮＡバンドが、ＵＶトランスイルミネーター（ウル
トラバイオレット プロダクツ インコーホレイテッド
社製）からの長波長紫外線により舶用化された。プラス
ミドＤＮＡ断片の寸法は、それぞれの移動度とＨＩｎｄ
ｌｌ［により消化されたλＣｌ８５７ｓＤＮＡの移動度
とを比較することにより、判定された。λＤ Ｎ Ａ断
片の寸法は、フィリップセンその他（Ｐ ｈｉｌｌｉｐ
ｓｅｎａｔ ａｔ）から得た（文献１５）。 テスｌ〜した全プラスミドは、ｐ ＴＧ４０２よりも大
であった。 一５３＝ テストの結果によれば、Ｃ２，３−０遺伝子プロダクト
は、バチルス スプチリス ポスト中に機能的に形質発
現されており、これは、Ｃ２，３−〇遺伝子の転写をプ
ロモートするバチルス スブチリス染色体ＤＮＡ配列が
導入されていることを示す。 定常期にある培地の抽出物から、バチルス スブチリス
ボス］・中での０２．３−０酵素の活性レベルを決定
した。活性は、前述の分光光度法により測定された。結
果は、第５表に示す通りである。 ５４− 第５表 バチルス スブチリスにおけるカテコール２．３−オキ
シゲナーゼの活性 菌株及びプラスミド 測定回数 全蛋白質（ａ ）
活 性（ｂ）（ｌｉ１ｇ／１ｌｉｌｌ） （
醗Ｕ／叩）ＴＧＢＩ／ｐ ＴＧ４０２ ２
１，５９ ０ＴＧＢＩ／ｐＴＧ４０３
２ １．５９ ２３８，０ＴＧＢ１／
ｐ ＴＧ４０４ ２ １．５９
２０．５Ｍ１１１２／ＤＴＧ４０５ ２ １．
８６ １７０２．５Ｍ１１１２／ＤＴＧ４０６
３ １．７４ １２４．０Ｍ１１
１２／Ｉ）ＴＧ４０７ ２ ２．２２
３７３．５Ｍ１１１２／ＤＴＧ４０８ ２
２，２１ １１７５．０Ｍ１１１２／ｐＴＧ
４０９ ２ ２．０３ １６９．５
Ｍ１１１２／ｐＴＧ４１０ ２ １，９３
９６１．５ＴＧＢＩ／ｐＴＧ４１１ ３
１．０２ ｓ８．０ＴＧＢ１／ｐＴＧ
４１２ ２ １．３０ ２４，０
ＴＧＢＩ／ｐＴＧ４１３ ２ １．６０
１４．０Ｍ１１１２／ｐＴＧ４１４ ２
１，５４ ２８８．０Ｍ１１１２／ｐＴ
Ｇ４１５ ２ １，９０ ６９６．０
Ｍ１１１２／ｐＴＧ４１６ ２ ２．３０
２０１１．０菌株及びプラスミド 測定回数
全蛋白質（ａ ） 活 性（ｂ）（ｌ１１ｇ／ｌｌ
ｌ２）（Ｉｌ（３７１１１ｇ）Ｍ Ｉ １１２／ｐ −
ｒＧ４１７ ２ １．９３ １８５３
，０Ｍ１１１２／ｐＴＧ４１８ ２ １，９２
２１７，０Ｍ１１１２／１ｌＴＧ’ｌ１９
２ ２．１５ ４８７，０Ｍ１１
１２／ｐｌ−Ｇ４２ｏ ３ １．９０
５５１．ＯＭ Ｉ １１２／ｐＴＧ４２１ ２
１．５４ ２４５，０Ｍ１１１２／
ＩＩＴＧ４２２ ２ ２．２３ １
９２．０Ｍ１１１２／ｐＴＧ４２３ ２ １．
７３ ２７８，０Ｍ１１１２／ｐＴＧ４２４
２ ２．４７ ６８．０Ｍ１１１
２／Ｉ）ＴＧ４２５ ２ １．９３
７９．０Ｍ１１１２／ｐＴＧ４２６ ２ １
．８０ ９３．０−Ｍ土ユニ２ｚＬ工Ｇ４２
７ ２ １．８９ １１３．０第５
表注：（ａ）０ウリ−法（Ｌ ｏｗｒｙ’ ｓｍｅｔｂ
ｏｄ）により測定した蛋白 質濃度。 （ｂ） １ミリユニツト（ａ＋Ｌｊ）は、３０℃で１分
間当り２−ヒド ロキシ ムコン酸セミアルデ ヒド１１１Ｍの生成に相当する。 尚、バチルス ズブチリス中のカテコール ２゜３−オ
キシゲナーゼの活性は、Ｆｅ２＋を含む緩衝液を使用す
る透析により、更に増大させることが出来る。 ５ａｕ３Ａにより得られたＤＮＡ断片とＢａ１ＨＩによ
り線状化されたプラスミド ベクター（例えばｐＴＧ４
０２）との結合は、１／４の確立で、５ａｕ３Ａ断片い
ずれかの端にＢａ１ＨＩのサイトを再生させる。バチル
ス スブチリス ホス］・中でＣ２，３−０遺伝子活性
を付与された（ａｓｓｏｃｌ −５７− ａｔａｄ ｗｉｔｈ）プラスミドは、Ｂａｍ１」Ｉに
より消化された。プラスミドｐ１°Ｇ ４０３．４０４
．４０５．４０６及び４０９．４１０．４１１．４２２
並びに４２５は、少なくとも１個のＢａ１ｔ−ＩＩサイ
１へを有していた。 生成されたプラスミドは、再ｑ−されたＦ３ａｉＨＩサ
イトが３ａｕ３Ａ断片−にのブＥ】モーターの−［流側
にあるのか及び（又は）“ト流側にあるのかを知る為に
、Ｈｉｎｄ［［ｌ及びＢ ａ叶ＩＩにより消化された。 ｍｒＧ４−１１．４２２．４２５上のプロモーターの上
流側に単一のＢａｍ１ｌＩザイ１〜が検出された。 ｐＴＧ４０３．４０４．４０５．４０６．４０７．４０
８．４０９及び４１０上には、プロモーターの下流側に
単一のｌ３ａｉ＋ｌｌＩリイ１〜が見出された。 バチルス スブチリスのプロモーターを含有する５ａｕ
３Ａ断片の大凡の大きさは、ｐ ＴＧ４０３の場合は５
００塩基対（以下ｂｐと略記する）、Ｄ ＴＧ４０４で
１４０ｂｌ）、 ｐＴＧ４０５で５７５ｂｐ、ＦＩＴＧ
４０６で９５０ｂρ、ｐＴＧ４０７で３３５ｂｌｌ、
＋１１”’Ｇ４０８で５００ｂｐ、ｐ ＴＧ４０９５８
− で９００ｂＦｌ、ｌ）丁Ｇ４１０で５００ｂｌ）である
。 プラスミドｐ ＴＧ４０３〜４１０は、以下の如き事項
に関連している： １） これ等のプラスミドは、Ｃ２，３−０遺伝子を発
現させる； ２） プラスミドを含むホスト細胞は、コロニーの黄色
春色及び分光光度分析から明らかな如く、カテコールを
２−ヒドロキシムコン セミアルデヒドに変換させる； ３） プロモーターの下流側で且つＣ２，３−０遺伝子
の上流側にある単一の１３ａａ＋ト１■リーイトは、各
プラスミド上に位置している。 これ等のプラスミドは、カテコールの変換にとって重要
であるだけでなく、バチルス スブチリス ホストにお
ける表現ベクターとしても使用され得る。 ｐ ＴＧ４０３〜４１０のいずれかの１３ａｍｌｌＩサ
イ１〜に遺伝子をクローニングさせると、多くの場合、
Ｃ２，３−０遺伝子の活性は、失われるであろう。 １３ａａ＋ト１ｒサイト・からＣ２，３−０遺伝子内の
任意のサイ１〜にわたるｍｒＧ４０２−ｐ２またはｐ
ＴＧ４０２−ｐ ９の領域に遺伝子をクローニングさせ
ると、Ｃ２，３−０遺伝子の活性は、確実に失われるで
あろう。 ゛発現″ベクターへの新しい遺伝子の挿入は、細胞コロ
ニーにカテコール溶液を単に散布することにより確認さ
れ得る。白色のコロニーは、Ｃ２゜３−０遺伝子が最早
機能しでおらず、新しい遺伝子が挿入されたことを示す
。黄色のコロニーは、新しい遺伝子が挿入されていない
ことを示す。 Ｂａｌ１ｌト１■リイトに挿入された新しい遺伝子が形
質発現される確立は、島い；何故ならば、活性なバチル
ス スブチリス プロモーターが、ＢａｍＨＩサイトの
（′ぐ上流側に位置しているからである。 バチルス スブチリス ホスト内での外来遺伝子の発現
が可能となった点で、本方法は、研究上及び産業上の目
的にとって、極めて有用なものである。 実施例３ ファージＭ１３は、線状］リファージの一種であり、遺
伝子の配列決定及びりＤ−ニング用のキラ］〜の形態で
、ベセスダ リサーチ ラボラトリーズとビーエル ラ
ボラトリーズにより販売されている。 ファージＭ１３のＢａｍＨＩ −５ａｌＩリ−イトにお
いて、ｐ ＴＧ２００のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片をり
［１−ン化した。 かくして得られたファージは、上述のエシェリヒア ］
り菌株中で遺伝子ｘｙｌ Ｅの形質発現を可能ならしめ
る。 実施例１において示した様に、この遺伝子のクローニン
グは、カテコールを散布し、カテコールの分解に起因す
る黄色化を示す溶菌斑を観察することにより、確認され
る。 ＢａｍＨＩ −ＸｈｏＩセグメントに含まれる２個の６
ｌ− ８ａｌＩ断片（第１図参照）は、ファージＭ１３中で２
つの方法でクローン化された： ０当初の方向及び順序を維持する、 ０当初の順序を維持するが、方向を逆にする。 第１の方法で形成した絹換えファージのみが、Ｃ２，３
−０の活性を発現することが出来た。 実施例４ （１）バチルス スブチリス以外のバクテリアの染色体
、（２）バクテリアのプラスミド又は〈３）バクテリオ
ファージのそれぞれに由来するＤＮＡ断片も、バチル
ス スブチリス内でのｘｙｌ Ｅの形質発現を促進する
か否かを判定する為に、種々の源からのＤＮＡを分離し
、精製した。 これ等の源は、バチルス リシエニフオルミス９９４５
Ａ、バチルス プミルスＢＰ１ 、エシェリヒア コリ
Ｃ６００ｒｋ”’ ｉｎｋ” 、プラスミドｐＬＩＢ１
１０（先ずスタフィロコッカス アウレウスから分離さ
れ、バチルス スブチリス内でも複製６２− することが明らかとなったもの。（文献３０）〕及びバ
チルス スブチリス バクテリオファージφ２９（とく
にφ２９ｓｕｓ １４ （１２４２）；（文献３１）〕
である。 バチルス リシエニフオルミス、バチルス プミルス及
びエシェリヒア コリからの染色体ＤＮＡ並びにφ２９
からのＤＮＡの場合には、精製ＤＮＡを５ａｕ３Ａによ
り完全に消化させた。 断片は、予めＢａｍＨＩにより消化されたｐＴＧ４０２
に結合され、挿入ＤＮＡとｐＴＧ４０２との重量比は、
２：１であった。 挿入ＤＮＡ源としてｐＵＢｌｌｏを使用する場合には、
Ｂａ１ｌＨＩ及びＢｇＩＩＩにより、ｐＵＢｌｌｏを完
全に消化させた。これにより２個のＤＮＡ断片が得られ
、その一方の大きさは約１．５５Ｋｂであり、他方の大
きさは約３．９５Ｋｂであった。結果は、ベセスダ リ
サーチ ラボラトリーズによりすでに公表されている制
限地図（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ １ａＤＳ）に合致
した。 ｐ ＵＢｌ １０ＤＮＡの断片をＢａ１ＨＩにより消化
されたｐＴＧ４０２ど等重量比で結合させた。 各実験から得られた結合生成物をプロトプラスト トラ
ンスフオーメイションにより別々にバチルスＭ１１２に
導入した。 １０μＱ ／ＩＱｃＩを補給されたＤＭ３再生培地上３
７℃で４８時間インキュベーションした後、Ｃｍ Ｆ’
形質転換体が選択された。 Ｃ１ｒ形貿転換体の］ロニ一群にカテコールを散布した
ところ、４べての場合に黄色のコロニ一群が観察された
。 このことは、バチルス スブヂリス内で、他のバチルス
類、ダラム陰性菌 エシェリヒア コリ、プラスミドｐ
ＵＢ１１０及びバクテリオファージφ２９から分離され
た［Ｉ Ｎ Ａのコントロール下に、ｐＴＧ４０２上に
ｘｙｌ Ｆ遺伝子が発現されることを示している。 バチルス リシエニフオルミスＤ Ｎ Ａが１１ＴＧ４
０２内に挿入された場合、全Ｃ１１ｒ形質転換体につぎ
、５．６８Ｘ１０−”の頻度で黄色コロニーが観察され
た。 エシェリヒア コリ供与体ＤＮＡは、１０’以上の全部
Ｃｌ１ｌｒ 形質転換体かられずか２個の黄色コロニ
ーが生じただけであった（頻度２×１０−’）。この結
果は、バチルス スブヂリス内での異種特異的遺伝子発
現に対する障害（文献３２）を考虜すれば、予期されな
かったことではないが、少なくとも２つのケースでは、
エシェリヒア コリに由来するＤＮＡのコントロールの
下に、ＸＶＩ Ｅなるシュードモナス遺伝子がバチルス
ズブチリス中で発現されることを明らかにしている。 上記実験で得られたＣ２，３−０の比活性及びＤＮＡ挿
入体（Ｄ Ｎ Ａ １ｎｓｅｒｔｓ ）の大体の寸法ハ
、第６表に示す通りである。Ｃ２，３−０の最高比活性
は、Ｍ１１１２／ｐＴＧ４４１により得られており、こ
の場合ＤＮＡ挿入体は、バチルス リシエニフオルミス
９９４５Ａから分離されたＤＮＡからなっていた。 φ２９ＤＮＡのコントロールの下にｘｖｌ Ｅを発現さ
せる２０種のプラスミドが分離されたが、その６５− 内の数種は同一であるかも知れない。これ等のプラスミ
ドについては、更に解明が必要である。 ６６− 第６表 プラスミド 挿入体源 挿入偉才ａ Ｃ
２，３−０比活性〈塩基対） −（１見２設Ｌ− ｐＴＧ４３１ ｐＵＢｌｌｏ １５５０
１４７３．Ｏｐ ＴＧ４３２ Ｅ、
］リ ６００ ４２，０１） Ｔ
Ｇ４３３ ５００
３４２．０ｐ ＴＧ４３５ Ｂ、プミルス
２００ １７９４．０ｐ ＴＧ４３６
５５ｏ ３２７．
０１） ＴＧ４３７ １８００
７２５．０Ｄ ＴＧ４３８ Ｂ、
ＩＪ？／エニ７００ ５５５，０フオルミ
ス ｐ ＴＧ４３９ ４００ ２２４
０．０１） ＴＧ４４０ ６００
１０１８，０ｐＴＧ４４１ ５００
２７２７．０ｐＴＧ４４２ φ２９
３００ １８５３，０ｐＴＧφ２９ｐ１
ｎ Ｎ、Ｔ、※ ２６２，７ｐＴＧφ２９＋
１２ ｌｌＮ、 Ｔ、 ２１５．４ｐＴＧ
φ２９ｐ ３ ＩＩＮ、 Ｔ、 ９２８．
９ｐＴＧφ２９ｐ４ ｎ Ｎ、 Ｔ、
１１３６，０ｐＴＧφ２９ｐ５ ｌＩＮ、Ｔ、
２９．２プラスミド 挿入体源
挿入体寸法 Ｃ２，３−Ｏｆｔ活性−（墨量対Σ −
１引すＺ■＞−− ｐＴＧφ２９＋１６ 〃Ｎ、 Ｔ、
１２９５．０ｐＴＧφ２９Ｄ ７ ＃
Ｎ、 −ｒ、 １１００，０ｐＴＧφ２９
ｐ９ 〃Ｎ、Ｔ、 ２７．３ｐＴＧ
φ２９＋１１１ ＃ Ｎ、−ｒ、
４６０．０ｐＴＧφ２９１） １２ 〃Ｎ
、 Ｔ、 、 ７６４．０ｐＴＧφ２９１
１１３ ｎ Ｎ、Ｔ、 ７
６９．０ｐＴＧφ２９ｐ１４ ／Ｊ Ｎ
、Ｔ、 ４５５，０ｐＴＧφ２９１）１５
〃Ｎ、Ｔ、 ２６１．０ｐＴＧφ２
９＋１１６ ’ Ｎ、Ｔ、
１０１７．０ｐＴＧφ２９ｐ１７ Ｎ
Ｎ、Ｔ、 ９９３，０ｐＴＧφ２９ｐ１８
〃 Ｎ、Ｔ、 部９．０ｐ
ＴＧφ２９ｐ １９ 〃Ｎ、 Ｔ、 １
１１１．０ｐＴＧφ２９ｐ ２０ 〃Ｎ、 Ｔ、
ｙ８９．。 ※ Ｎ、 Ｔ、−試験せず。 実施例５ ｘｙｌ Ｆ遺伝子の全ヌクレオチド配列及びその決定に
用いられた手法を第３図に詳細に示す。第３図は、ｘｙ
ｌ Ｅの完全ヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配
列を示している。 図示の配列は、左端のＨｐａ１１部位から１００塩基対
の３′に始まり、右端のｔ−＋ｐａｍ部位で終わってｕ
）ｐ （第４図）。推定されるリボゾーム結合部位にア
ンダーラインを付しである。暗号解読域は、組１に始ま
り、３個のアステリスクで示されるナンセンスコドンで
終わる（第３図）。バクテリオファー２Ｍ１３中でｘｙ
ｌ Ｅ遺伝子断片をサブクローニングし、その配列を定
めるに使用された方法は、第４図中の水平方向の矢印に
より示されている。ｘｙｌ Ｅの暗号解読域は、垂直方
向の矢印で示されている。翻訳開始部位の位置及び図示
のリーディングフレームは、精製Ｃ２，３−０から決定
された最初の９個のアミノ酸配列と完全に一致６９− している。該遺伝子は、３５０４７ダルトンのサブユニ
ツ１〜ポリペプチドを構成する３０６個のアミノ酸をコ
ードする。Ｃ２，３−０の活性形態は、分子量１４００
００ダルｌ−ンであるから（文献３３）、我々の得た結
果は、Ｃ２，３−０が４個の同一のサブユニツ１へから
なっているという報告（文献３４）を裏付けている。 バチルス スブチリス内での翻訳開始の為には、リボゾ
ーム結合部位と１６Ｓｒ ＲＮＡの３′領域との＾度の
相補性が必要であると考えられる。 ｘｙｌ Ｅ遺伝子について提案されているリボゾーム結
合部位からは、該部位とバチルス ズブチリス１６Ｓｒ
ＲＮＡ間の塩基対形成の為の自由エネルギーΔＧは、
−１５，６キロカロリー（ＫＣａｔ）であることが予測
される。更に、リボゾーム結合部位と開始コドンとの闇
の距離は、９塩基であると計算されている。これらの数
値は、バチルススブチリスの一連のりボゾーム結合部位
から最近計算されたΔＧとスペイサ−塩基の数値域（文
献３６）内に良好におさまるものである。 ７０− 配列に関するデータは、バチルス スブチリスにおける
ｘｙｌＥｍＲＮＡの翻訳が、シュードモナス及びエシェ
リヒア コリにより認められていると同じ開始コドンか
らはじまるという考え方を支持するものである。 実施例６ バチルス スブチリス内で産生された酵素が、シュード
モナス ビュチダＩｔ −２又はエシェリヒア コリＢ
Ｚ１８／ｐ ＴＧ２０６内で得られた酵素と同じである
ことを示す為に、これらの各細菌から得られた部分的に
精製され且つ細胞を含まない抽出物が、ポリアクリルア
マイドゲルを使用する電気泳動により分離された（第５
図）。Ｃ２゜３−〇のポリアクリルアマイドゲルによる
電気泳動は、以下の様にして行なう。部分的に精製した
Ｃ２．３−０の標品（ｐｒｅｐａｒａｔ ｔｏｎｓ ）
が、定常期培地から得られた（文献９）。細胞ペレット
を２０＋１１ＭＩＪン酸塩緩＊’ａ （ｐ Ｈ７，２）
により洗浄し、ＡＰＭ衝液（アセ８シ１０ １００ｉ Ｍ．ＦＩ Ｈ７．５）に懸濁し、次いで音波
処理して破壊した。 ベックマンＲ ６ ５ Ｔ ｉローターおよびＬ８−７
０超遠心機を使用し、３００００ｒｕ 、４℃の条件下
に゛１時間にわたり細胞＠壊物を遠心分離した。上澄み
液をアヒトンて”処理して、最終的に濃［ｆ５０容謹％
とし、１℃で２時間かけて蛋白質を析出させた。 次いで、ソルヴアルＨ Ｂ − ４ （ Ｓ ｏｒｖａ
ｌｌＨ Ｂ −４）ローター及びＲ Ｃ − ５ Ｂ遠
心機中１ ００００ｒｐＨで１０分間遠心分離した。上
澄み液をアセトンで処理して６６容蟲％とじ、４℃で２
時間放置して蛋白質を析出させた。 １１００００ｒｐで１０分間遠心分離した後、蛋白質ペ
レットを１−のＡＰｔｉ衝液（アセト２１０曵＋ＩＪン
ｗ１塩１ ００ｍ Ｍ，ｐ ｌ−１７．５）中に懸濁さ
せた。 酵素活性は、゛マテリアルズ アンド メソツズ（ Ｊ
ｙｌ ａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍ ｅｔｈｏｄ
ｓ）″に記載された方法に従って測定した。 電気泳動には、７．５％アクリルアマイド分離ゲル（ｓ
ｅｐａｒａｔｌｎａ （＋８１ ）及び３．０％スタ
ッキングゲル（ＳｔａＯｋ＋ｎＯ Ｑｅｌ）を使用し
た。蛋白質（２０〜２００μｇ）を各スロット（ ５ｌ
ｏｔ ）に加えたので、全０２，３−０活性（２６０ｍ
Ｕ）は等しかった。 ＴＧＢ １ ／ｐ ＴＧ４ ０ ２については、ＴＧＢ
１／ｐ ＴＧ４０３からの蛋白質量に等しい蛋白質量
を使用した。電気泳動は、一定電圧（２５ミリアンペア
）で、０．５Ｍカテ］−ルを散布したゲルを使用して５
時間行なった（第５図のパネルＡ）。 第５図のパネルＢは、蛋白質を固定し、クマシーブリリ
アントブルー Ｒ２５０（０．１５％Ｗ／Ｖ）ｒ％ｌｂ
、７．５％Ｖ／Ｖ酢酸及び５％Ｖ／Ｖメタノールの溶液
で脱色した。結果を第５図に示す。抽出物は、シュード
モナス ビュチダＩｔ−２からのものくレーン１）：エ
シェリヒア 」リ ＢＺ１８／１）ＴＧ２０６からのも
の（レーン７３− ２）：バチルス スブチリス ＴＧＢ１／ｐ ＴＧ４０
２からのものくレーン３）；及びバチルススブチリス
ＴＧＩ３１／１）ＴＧ４０３からのものくレーン４）で
あった。第５図中の矢印は、Ｃ２。 ３−０の位置を示′！ｌ。 ゲルシステムで非変性条件（ ｎｕｎ − ｄｅｎａｔ
ｕｒｌｎｇｃｏｎｄ ｌ ｔ ｌ ｏｎｓ ）を採用す
ることにより、電気泳動の終了後、ゲルにカテコールを
散布するだけで、Ｃ２．３−０＃素の速やかな同定が可
能であった。 機能性プロモーター（ ｆｕｎｃｔｌｏｎａｌ ｐｒ
ｏｍｏｔｅｒ）なしでｘｙｌ Ｅを含有するバチルス
スブチリス菌株（ＴＧＢ １ ／ｐ ＴＧ４ ０ ２
）の場合を除くすべての抽出物を含むゲルにおいて、黄
色バンドが同位置に出現した。前者については、黄色バ
ンドは認められなかった。Ｃ２．３−０の電気泳動移動
度が同 であることから、バチルス ズブチリス中の酵
素は、融合ポリペプチドとして生成されたのではなく、
シュードモナス及びエシェリヒア コリにおいて観察さ
れたものと同 の翻訳生成物（ｔｒａｎｓｌａｔｌｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔ ）としで生成されるこ７４− とを示唆している。 更に他の実験においては、■シエリヒア コリから分離
精製されたＣ２，３−０を注射されたラビットから得た
粗抗血清が得られた。オフテルロニーの二重拡散法によ
れば、抗血清は、シュードモナス ビュチダＩｔ −２
、■シエリヒア コリＢＺＩ ８／Ｉ）ＴＧ２０６及び
バチルス スブチリスＴＧＢＩ／ｐ ＴＧ４０３からの
部分Ｍ製油出物と反応したが、ＴＧＢ１／ｐＴＧ４０２
から得られたバチルス スブチリス抽出物とは交叉反応
しなかった。 実施例７ カテコール ２，３−オキシゲナーゼが、ウルシオール
で処理された表面の汚染除去剤として作用するか否かを
試験すべく、次の如く対照試験を行なった。 一仁上上−１ｊＬ Ｏウルシオール：０．１％又は１％のエタノール溶液 ○カテコール オキシゲナーゼ： Ｅ、コリ（菌株 ＢＺｌ ８／＋１ ＴＧ２０３）又は
Ｂ、スブチリス（菌株 Ｍ Ｉ １１２／ｐ ＴＧ４４
１）から精製された１ ０００ユニツト／ｄの該酵素を
約９０％の純撓で含有する組成物。（我々は、ホス１へ
菌株を問わず該酵素が同一物であることを示した１、） ０ 洗 剤 １）ＷＩＰＰ（商標名、Ｊス・ニー・ヘンケルベルギー
エヌ・ヴイ社製） ２）ＤＡＳＨ（商標名、ベネル
ックス、ブロクター・アンド・ギャンブル社＠） ＷＩＰＰは、水道水を用い最終濃度０．２５％の濃度で
用いた。これら濃度は、製造者により推奨されている濃
度である。ＷＩＰＰは、手洗い用洗剤であって、１１
Ｈ約６．８を有し、ＤＡＳＨは洗濯機用洗剤であってｐ
ｉ−１９である。 ３） 数種の洗剤溶液を実験室にて調整した。これらは
、ｐＨ６，８の１０−Ｍリン酸ナトリウムと０．０２５
％のＢｒ１０５８（ポリオキシエチレン２０−セチルエ
ーテル）又は０．０２％のＳＤＳ （ドデシル硫酸ナト
リウム）とを含有するものである。 ４） パームオリーブ バブル バス （Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ ｂｕｂｂｌｅ ｂａｔｈ）
、水晶は、推奨濃度であるバス（２００Ｑ）当り１カ
ツプ（２０ｍＧ）とほぼ同等の０．０１％の最終濃度で
用いた。 ０織物 次の５種の織物を用いた。 １） １００％綿 ２） ３５％綿、６５％ポリエステル ３） ウール ４）１００％アクリル ５） １００％ダクロン （２） カテコール ２．３−オキシゲナーゼ活性の測
定 酵素活性は、カテコール ２，３−オキシゲナーゼによ
るウルシオールのカテコール環の酵素的開裂により生じ
た黄色生成物の発生を観察することにより、或いは薄層
クロマトグラフィーにより測定した。後者の方法により
、残存するウルシオフ７− −ルの量を、相当するスポット・の大きさにより換算し
た。この方法は、検出最低限界１μΩを有するものであ
る。 洗剤溶液におけるカテコール ２，３−オキシゲナーゼ
の活性は、黄色生成物である２−ヒドロキシムコン酸セ
ミアルデヒドの生成により立証される。洗剤ＷＩＰＰを
用いた場合、徐々に黄色が発生してくるが、Ｄ Ａ Ｓ
Ｈの場合黄色化は一時的なものである。 カテコール ２．３−７１キシゲナーゼの洗剤溶液にお
ける活性を試験するために、ウルシオール、上記酵素及
び数種の洗剤を種々の組合せで混合し、最終容積１−で
３０℃にて３時間インキュベートし。結束を下表に示す
。 ７８− １号［〈１μｇ１は、インキュベーション後の残存ウル
シオールがＴＬＣ分析による検出レベル以下であること
を意味する。黄色の発生は、ウルシオールが市販洗剤に
より有効に溶解され、これが酵素カテコール ２，３−
オキシゲナーゼにより開裂されたことを示すものである
。 上記＊＊の存在下では、大量のウルシオールを用いた場
合でも、はとんどすべてのウルシオールが開裂される。 この試験にＪ：す、カテコール ２゜３−オキシゲナー
ゼが洗剤溶液中において安定であり、少量のｌｌｉ酊素
により大量のウルシオールが開裂され得ることが判る。 上記表の第１行から判るように、カテコール ２．３−
オキシゲナーゼが洗剤溶液中に含まれない場合、ウルシ
オールはほぼ定量的に残存する。従って、カテコール
２゜３−オキシゲナーゼを含有する洗剤溶液からウルシ
オールが消失したのは、該酵素のウルシオールに対する
作用に起因することが判る。 各種洗剤溶液中におけるカテコール ２．３−オキシゲ
ナーゼの活性の安定性を試験した結果、室温にて１２時
間経過後に残存する酵素活性量は、洗剤を含有すること
なく同一時間インキュベートした該酵素のそれよりも低
いものではなかった。 しかしながら、洗剤ＤＡＳＨを用いた場合は、上記の通
りではなかった。これはおそらくはその溶液のｐＨによ
るものであろう。 洗剤存在下に６０℃にて１５分間カテコール２．３−オ
キシゲナーゼをインキュベートした場合、活性は７５％
以上保持された。 酵素の安定性を増強するには、保護剤を添加するのがよ
い。最終濃度１０％のアセトンにより保護すれば非常に
効果的である。その他、グリセロール等の他の有機溶媒
も、上記保護剤として用いることができる。 次の実験を行なった。すなわち、ウルシオール８１− の０．１％エタノール溶″［１０μＱを、広さ１Ｃ１の
織物片に塗布する。この織物を、室温不乾燥した後、洗
剤１液（０，０２％ＳＤＳ。 ０．０２５％Ｂ ｒｌＪをＩＯＩＭのリン酸ナトリウム
ｐＨ６，８に添加したもの又はＷＩＰＰｏ、２５％）８
９０μＱ中にて、３０℃で３時間インキュベートする。 （予洗工程）。 次いで１０ユニツトのカテコール ２，３−オキシゲナ
ーゼを、アセトン（酵素安定化剤）１００μＱと共に添
加し、インキュベーションを３０℃にて３時間続ける。 その後、織物上及び洗剤溶液中に残存するウルシオール
を抽出し、定量する。即ち、織物を乾燥し、室温下５０
０μＱのエタノール中で撹拌することにより残存ウルシ
オールを抽出する。一方、洗剤溶液中のウルシオールは
５００μＱのブタノールで抽出する。上記ブタノール層
及びエタノール層に抽出されたウルシオールを凍結乾燥
さＭ１エタノール２５μＱに再懸濁させ、ＴＬＣプレー
トに適用する。石油エーテル／酢酸エチル（７：３Ｖ／
Ｖ）を溶媒として８２− クロマトグラフィーを行なう。ウルシオールは、デュビ
ュイス（ＤＵＰＵ Ｉｓ） （ＢｒｌｔｌｓｈＪｏｕ
ｒｎａｌ ｏｒ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １０
１．６１７゜１９７９）の方法に従って、ＴＬＣプレー
トをヨウ素処理後同定する。各ＴＬＣプレート上で、サ
ンプル中のウルシオール定最のため１．５μＱ及び１０
μｇのウルシオールをコクロマトグラフ処理する。対照
として、上記インキュベーションをカテコール ２．３
−オキシゲナーゼの不存在下に行なう。 以上の実験結果によれば、ウルシオールは、綿、綿−ポ
リエステル、ウール及びアクリルからは、洗剤溶液中で
単に洗浄するだけで有効に除去されるもの、カテコール
２，３−オキシゲナーゼを用いない限り破壊されない
。しかし、カテコール２．３−オキシゲナーゼの存在下
では、ウルシオールはＴＬＣ分析によっても検出されず
、ウルシオールのカテコール環の酵素的開裂を示す黄色
が洗浄液中に出現する。洗剤の不存在下では、ウルシオ
ールは織物に吸収されたまま残存し、カテコール ２，
３−オキシゲナーゼにより開裂されない。上記条件下で
は、１０ユニツトのカテコール ２．３−オキシゲナー
ぜは、ウルシオール１０μΩを容易に開裂せしめ、従っ
て使用酵素量及び／又はインキュベーション時聞を減少
させ得ることが判る。 工ｌニー」し」１ 得られた結果から、カテコール ２．３−オキシゲナー
ゼは、市販洗剤溶液中等の混合媒体（ｃｏｍｐｌｅｘ
ｍｅｄｉａ ）中において、広い温度範囲で活性を示
し、且つ安定であることが判明した。 更に、保護剤を添加することにより、好ましい結果が得
られる。カテコール ２．３−オキシゲナーゼは、汚染
された材料の通常の洗浄中にウルシオールを有効に除去
する。 下記菌株及びプラスミドは、アグリカルチュラル リサ
ーチ カルチＡ７− コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託
され、次の番号を付与された。 ０プラスミドｐＴＧ４４１を含有する菌株Ｍ１１１２・
・・・・・８１ ５２６５ ＱプラスミドｐＴＧ４０２を含有する菌株ＴＧＢ１・・
・・・・８１５２６４ 以下に、参照した文献名を記載する。 ８５− １、 ｌｌｉｒｎｂｏｉｍ １１．ｃ、 ｅｔ Ｊ、
Ｄｏｌｙ、 １９７９． Ａ ｒａｐｉｄａｌｋ
ａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒ
ｅ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ＋ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。 ７； １５１３−１５２０゜ ２、 Ｂｏｙｌａｎ Ｒ，Ｊ、、 Ｎ、＋１． Ｍｅ
ｎｄｅｌｓｏｎ、 Ｄ、 Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔＦ、
Ｅ、 Ｙｏｕｎｇ、 １９７２． Ｒｅ）；ｕｌａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｌ
ｗａｌｌ； ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ
ｍｕ仁ａｎｔ： ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｂｉｏ
ｓｙｒｒｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｅｉｃｈｏｉｃａ
ｃｉｄ、 Ｊ、 Ｂａｃｔ：ｅｒｉｏｌ、 １１
０ ； ２８１−２９０゜３、 Ｃｂａｎｇ Ｓ
、 ｅｔ Ｓ、Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ、 １９７９．
Ｈｌｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｅｒａｎｓｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｌ）仁１
１１ｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｂｙ ｐｌａｓｍ
ｉｄ ＤＮＡ、 １４ｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇ
ｅｎｅ仁、 １６８ ：１１１−１１５゜ ４、 Ｄｕｌ）ｎａｕ Ｄ、 ｅｔ Ｃ：、 Ｃｌｒ
ｉｇ１１．ａｎｏ、 １９７４． Ｇｅｎｅｔｉｃｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｕｔａｎｌ＝８
ｃ迂 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ仁１１１ｓ、
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。 １１７ ＋ ４８８−４９３゜ ５、 １）ｕｂｎａｕ Ｄ、、Ｒ，Ｄａｖｉｄｕｆｆ−
Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｂ、５ｃｈｅｒ ｅｔＣ，Ｃｌｒｉｇ
ｌｉａｎｏ、 １９７３． Ｆａｔｅ ｏｆ ｔｒ
ｓｎｓｆｏｒｍｉｎｇｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉ
ｃ ａｃｉｄ ａｆｔｅｒ ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ｃｏ
ｍｐｅｔｅｎｔＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
ｐｈｅｎｏＬｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ ８６− ｏｆ ｒａｃｌｉａｔｉｏｎ ５ｅｎｓｉ仁ｉｖｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ：ｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｔｍｕｉｎｔｓ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１１４
＋ ２７３−２８６゜６、 Ｆｒａｎｌｃｌｉｎ
Ｆ、Ｃ，１１，、Ｈ，Ｈａｇｄａｓａｒｉａｎ、 １１
．Ｍ。 Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ＫＪＬ Ｔｉｍｍ１ｓ
、 １９８１． Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
ＴＯＬ ｐｌａｓｍｉｄｐＸＡＪＯｆｒｏｍ Ｐｓｅｕ
ｄｏｎ＋ｏｎａｓ 匹旦西ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏ
ｆｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｅｌｓｅ ｅｎｔｉｒｅ ｒｅ
ｇｕｌａｔｅｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｒｉｎｇｍｅｔａ
ｃｌｅａｖａｇｅ ｐａｔｈｗａｙ、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。 Ｌｌ、Ｓ、Ａ、 、川７４５８−７４６２ （８２）。 ７、 Ｇｕｅｒｒｙ Ｐ、、 Ｄ、Ｊ、 Ｌｅ Ｂｌ
ａｎｃ ａｔ Ｓ、 Ｆａｌｋｏｗ、 １９７３゜Ｇ
ｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｂｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ １ｓｏ
ｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｒｎｉｄｄｅｏｘｙｒｉ
ｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、 Ｊ、 Ｂａｃｌ：ｅ
ｒｉｏｌ、υ瓜；１０６４−１０６６゜ ８、 Ｈａｙｗａｒｄ Ｇ、Ｓ、 ｅｔ Ｍ
、Ｇ、 Ｓｍ１ｔｈ、 １９７２． Ｔｂｅ
ｃｈｒｏｍｏ−ｓｏｍｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐ
ｈａｇｅ Ｔ５．１． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔ
ｈｅｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｆｒａ
ｇｍｅｒ＋ｔｓ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌｅｌｅ
ｃｔ、ｒｏｐｂｏｒｅｓｉｓ、 Ｊ、 ＋４ｏ１．
Ｂｉｏｌ、 ６３； ３８３−３９５゜９、
Ｉｎｏｕｙｅ Ｓ＋、 Ａ、 Ｎａｋａｚａｗａ ｅ
ｔ Ｔ、 Ｎａｋａｚａｗａ、 １９８１゜Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＴＯＬ ｇｅｎｅｓ
ＩＢ ａｎｄ ＩＥｌｏ、 Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ
Ｅ、ト１． ｅｔ Ｓ、Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ、
１９７４． Ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｃｒ＋ａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＄ ｂｙ ｐｌａｓ
ｍｉｄｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ｌｌ’ｈ１０７２−１
０７４゜ １１、 Ｌｏｗｒｙ Ｏ，Ｊ、、 ｔＬｔｌ、 Ｒｏｓ
ｅｂｒｏｕＢｂ、 Ａ、Ｌ、 Ｆａｒｒ ｅｔＲ，Ｊ
、 Ｒａｎｄａｌｌ、 １９５１． Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎ仁 ｗｉｔｈ仁ｈｅ Ｆ
ｏｌｉｎ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎ仁、 Ｊ
、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 １９３：２６５−
２７５゜ １２、ＭｅｙｅｒｓＪ、Ａ、、Ｄ、５ａｎｃｈｅｚ、Ｌ
、Ｐ、ＥｌｗｅｌｌｅｔＳ、Ｆａｌｋｏｗ、 １９７
６、 Ｓｉｍｐｌｅ ａｇａｒｏｓｅ ｅｌｅｃｔｒ
ｏ−ｐｂｏｒｅｔｉｃ ｍｅｍｈｏｄ ｆｏｒ
ｔｌｌｅ １ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍ
ｉｄ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ、
Ｊ、 Ｂａｃ仁ｅｒｉｏ１． １２ｈ １５２９
−１５３７゜１３、Ｈｏｒｒｉｓｏｎ Ｉ）、Ａ、１
９７７、 Ｔｒａｎｓｆｏｒ＋ｎａｔｉｏｎ １ｎ
Ｅａｃｈｃｒｉｅｂｉａ ｃｏｉｌ； ｃｒｙｏｇｃｎ
ｉｃ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆｃｏｍｐｅｔｅ
ｎＬ ｃｅｌｌｓ、 Ｊ、 ＢａＣ仁ｅｒｉｏ１．
１３２＋ ３４９−３５１゜１４、 Ｎａｋａｚ
ａｗａ Ｔ、、 Ｓ、 Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ
Ａ、 Ｎａｌｃａｚａｗｓ、 １９８０゜Ｐｈｙ
ｓｉｃａｌ ａｎｄ ｆｕｎｅ仁１ｏｎａｌ ｍ
ａｐｐｉｎｇ ｏｆ ＲＰ−４ＴＯＬｐｌａｓｍｉ
ｄ ｒｅｃｏ＋ｎｂｉｎａｒ＋ｌ：ｓ＋ ａｎａｌｙｓ
ｉｓ ｏｆ １ｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄ ｄｅｌｅｔ
ｉｏｎ ｍｕｔａｎＬ：ｓ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
１４４：２２２−２３１゜ １５、 Ｐｈ１ｌｉｐｐｓｅｎ Ｐ、、 Ｒ，Ａ
、 Ｋｒａｒｎｅｒ ｅｔ Ｒ，ｔＪ、 Ｄａ
ｖｉｓ、 １９７８゜Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ヒｈ
ｅ ｙｅａｓＬ ｒｉｂ０８０ｔｎ８１ ＤＮＡ
ｒｅｐｅａｔ ｕｎｉｔｉｎ Ｓｓｔ Ｉ ａｎｄ
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｌａｍｂｄａ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｕｓｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌｓｉ
ｚｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ、Ｊ、Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、１２３； ３７１−３８６゜１６、 Ｐ
ｒｉｍｒｏｓｅ Ｓ、Ｂ、 ｅｔ： Ｓ、Ｄ、
Ｅｈｒｌｉｃｂ、 １９８１． ｌ５ｏｌａ仁
１ｏｎｏｆ ｐｌａｓ＋ｎｉｄ ｄｅｌｅ仁ｉｏｎ
ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ５ｔｕｄｙ ｏｆ
ｔｈｅｉｒｉｎｓＩｌ：ａｂｉｌｉｔｙ、 Ｐｌ
ａｓｍｉｄ ６＋ １９３−２０１゜１７、 Ｒａ
ｄｌｏｆｆ ＲＪｌ、、 Ｗ、 Ｂａｕｅｒ ｅｔ Ｊ
、 Ｖｉｎｏｇｒａｄ、 １９６７゜Ａ ｄｙｅｂｕｏ
ｙａｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｕｅ＋＝１１０ｃｌ ｆ
ｏｒ ｔｉｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄ １ｓｏｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ
ｃｏｍｐｌｅｘ ＤＮＡ；ｔｈｅ ｃｌｏｓｅｄ
ｃｉｒｃｕｌａｒ ＤＮＡ ｉｎ ＨｅＬａ
ｃｅｌｌｓ、 Ｐｒｏｃ。 ［Ｊａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、５７：
１５１４−１５２１゜１８、 Ｒａｐｏｐｏｒｔ Ｇ
、、 Ａ、 Ｋ１１ｅｒ、 Ａ、 Ｂ１１１ａｕｌｔ、
Ｆ、 Ｆａｒｇｅｔｔｅａｔ Ｒ，Ｄｅｄｏｎｄｅｒ
、 １９７９． Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ａ ｃｏｌｏｎｙｂａｎｋ ｏｆ Ｅ、 ｃｏｌｉ ｃ
ｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ １６８ｇｅｎｏｍｅ、
Ｍｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １７６：
２３９−２４５゜１９、 ５ａｎｃａｒ Ａ、、
Ａ、Ｍ、 Ｈａｃｋ ｅｔ Ｗ、Ｄ、 Ｒｕｐ
ｐ、 １９７９゜５ｉｔｎｐｌｅ ｒｎｅｔｂｏｄ
ｆｏｒ １ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｌａｓｒｐｉｄ−ｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １３７； ６９２−
６９３゜ ８９− ２０、５ｐｉｚｉｚｅｎ Ｊ、 １９５８． Ｔｒａ
ｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏ−ｃｈｅｒｎｉ
ｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎ仁 Ｓ仁ｒａｉｎｓ
ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ｂｙ
ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａＩｌ：ｅ、 Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａ仁１゜Δｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ
、ｌ＋４： １０７２−１０７８゜２１、５ｕｔｃｌ
ｉｆｆａ Ｊ、Ｇ、、 １９７９． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ旦ｐｌａｓｍｉｄｐ
ＢＲ３２２，Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｓｙｍｐ、 Ｑｕａｎｔ。 Ｂｉｏｌ、４３； ７７−９０ ２２、 Ｒｅｎａｕｔ： Ｅ、、 Ｐ、 ５Ｌ
ａｎｓｓｅｎｓ ｅ仁 Ｗ、 Ｆｉｅｒｓ、 １
９８１゜Ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅａｌ：ｏｒｓ ｆｏｒ
ｌｓｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＰＬ
ｐｒｏｍｏｍｏｒ ｏｆ ｃｏｌｉｐｈａｇｅｌ
ａｍｂｄａ、Ｇｅｎｅ １５＋ ８１−９３゜２３
、Ｌｉｅｂ 口、 １９６（１，Ｓしｕｄｉｅｓ
ｏｆ ｈｅａ仁 １ｎｄｕｃｉｂｌｅ ｌａｍｂ
ｄａｂａｅｔｅｒＬｏｂａｇｅ １． ｏｒｄｅｒ ｏ
ｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｉｔｅｓ ａｎｄｐｒｏｐｅｒ
Ｌ：ｉｅｓ ｏｆ ｍｕｅｄｎｔ： ｐｒｏｐｈ
ａｇｅｓ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ。 １６； １４９−１６３゜ ２４、 ｌｌａｌｌｅｗｅｉｌ Ｒ，Ａ、 ｅｔ Ｓ、
Ｅｍｔａｇｅ、 １９８０． Ｐｌａｓｍｉｄｖ
ｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎ仁ａｉｎｉｎｇ Ｌｈｅ ｔ
ｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｏｐｅｒｏｎｐｒｏｍｏｔｏｒ
５ｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒ
ｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒ
ｇｅｉｎ ｇｅｎｅｓ、Ｇｅｎｅ ９＋ ２７−４７゜
２５、 Ｋｕｓｈｎｅｒ Ｓ、Ｒ，１９７８，Ａｎ ｉ
ｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ９０− ｔｒａｎｓｆｏｒｒ、＋ａ仁ｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｂｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ Ｃｏ１Ｅ
１ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ、 ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。 Ｅｄｓ Ｂｏｙｅｒ、 Ｈ，Ｗ、 ａヒ Ｓ、
Ｎ１ｃｏｓｉａ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｈｏｒｔｈ−
１１ｏ１１ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｐｒｅｓｓ
、 １９７８゜２６、 Ｍｕｒｒａｙ ＩＣＥ、
ｅｔ Ｗ、Ｊ、 Ｂｒａｍｔｎｅｒ、 １９
７３゜Ｔｈｅ 衰１Ｅ ｇｅｎｅｏｆ Ｅｓｃｂｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌ↓Ｋ ｃｏｎｔａｉｎｓａ ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ Ｋ−ｒｅｓｅｒｉｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ、Ｊ
、１ｌｏ１．Ｂｉｏｌ、７７＋ ６１５−６２４゜２
７、 Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｆ、Ｃ，Ｈｏ、 ｌ−１，
Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ Ｋ、Ｎ、 ’ｒｉｒｍ
ｎｉｓ。 １９８１、１４ａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｇ
ｒｅｄａｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ５ｏｉｌＬ＋ａ
ｃｔｅｒｉａ、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＤｅｇｒｅｄａｔｉ
ｏｎｏｆＸｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓａｎｄ Ｒｅｃａｌ
ｃｉｔｒａｎｔ： Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、 Ｅｎｄ
ｓ Ｒ，Ｂｕｔｔ：ｅｒ ｅｔＴ、Ｌｅｉｓｉｎｇ
ｅｒ、Ａｃｄｄｅ＋！ｔｉｅ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏ
ｎ １９８１゜１０９−１３０゜ ２８、 Ｎｏｚａｋｉ Ｍ、、 Ｋａｇａｍｉｙ
ａｍａ Ｈ，１ｌａｙａｉｓｈｉ、 ｔｌｅｔａｐ
ｙｒｏ−ｃａｔｅｃｈａｓｅ、 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ、 Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎａｎｔｉ
ｓｏｍｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、１９６３．８ｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｃｈｅＺｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ ３３８：
５８２−５９０゜２９、 ５ａｌａｔ−Ｔｒｅｐａｔ
： Ｊｏｓ６ Ｍ、、 Ｅｖａｎｓ Ｃ，Ｔｈ
ｅ ｍｅｔａ−ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｃａｔ
ｅｃｈｏｌ ｂｙ Ａｚｏ仁ｏｂａｃｔｅｒ ５
ｐｅｃｉｅｓ 。 １９７１、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０： ４
００−４１３゜３０、 ｈ：ｈｒｌ、ｉｃｈ Ｓ、
Ｄ、、 １９７７、 Ｒｅｐｌｉｃａ仁ｉｏｎ
ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ
ｓ ｆｒｏｍ Ｓｔａ １１１ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ １ｎＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｌ：１ｌｉｓ
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、、７４．１６８０−１６８２゜３１、Ｃａ
ｒｒａｓｃｏｓａＪ、Ｌ、、ＣａｍａｃｈｏＡ、、）ｉ
ｏｒｅｎｏＦ、。 Ｊｉｍｅｎｅｚ Ｆ、、 Ｍｅｌｌａｄｏ Ｒ，Ｐ、、
Ｖｉｎｕｅｌａ Ｅ、 ｅｔＳａｌａｓ Ｍ、、１
９７６、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ８ｔｌｂｔｉｌｉｓ ｐ
ｂａｇｅ φ２９゜Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、６６
．２２９−２４１゜３２、 ＨｃＬａｕｇｈｌｉｎ
Ｊ、Ｒ，、Ｍｕｒｒａｙ Ｃ，Ｌ、 ｅｔ：
ＲａｂｉｎｏｗｉｔｚＪ、Ｃ，、１９８２，ｌ１ｅｔｅ
ｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ。 ｉｎ Ｈｌｃｒｏｌ）１ｏ１ｏｇｙ、 １９８２． Ｅ
（１，Ｄ、 Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ。 Ａ＋＋＋ｅｒｌｃａｎ Ｓｏｃ、ｉ、ｅｔｙ ｆｏｒ
＋４１ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 ＋Ｊａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ１）、Ｃ，、円）、２２−２７゜ ３３、Ｎｏｚａｋｉ １４．Ｏｎｏ Ｋ、、Ｎａｋａｚ
ａｗａ Ｔ、Ｋｏｔａｎｉ Ｓ、ｅｔｌｌａｙａｉｓｈ
ｉ Ｏ，、１９６８，Ｍｅｔａｐｙｒｏｃａｌ：ｅｃｈ
ａｓｅ Ｉｌ、 Ｔｈｅｒｏｌｅ ｏｆ １ｒｏｎ ａ
ｎｄ ５ｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐｓ、 Ｊ、
Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅ＋ａ、 ２１＋３． ２６８２−２６９０゜３
４、 Ｎａｚａｋｔ Ｍ、、 １９７９． Ｏ
ｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｅ仁 ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ
ｓ。 Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ、 Ｃｈｅｍ、、 ７８．１４
５−１８６゜３５、Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ、Ｓ、ａｎｄ
Ｂ、Ｗｅｉｓｂｌｕｍ、１９８２゜Ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌ ｍａｐ ｏｆｐｃ１９４． ａ ｐｌａｓｍｉｄ
ｔｈａｔ ５ｐｅｃｉｆｉｅｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃ
ｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
、 Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。 １５０、 ８１５−８２５゜ ３６、１ｌｏｒａｎ、 Ｃ，Ｉ’、 Ｊｒ、、 ｔｌ、
Ｌａｎｇ、 Ｓ、Ｆ、Ｊ、 Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ。 Ｇ、 Ｌｅｅ、 Ｉ゛１．５ｔｅｐｈｅｎｓ、 Ａ、Ｌ
、 ５ｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、 Ｊ、 Ｐｅｒｏ。 ａｎｄ Ｒ，Ｌｏｓｉｃｋ １９８２． １Ｊｕｃ
ｌｅｏ仁Ｌｄｅ ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ 仁ｈａｔｓ
ｉｇｎａｌ ｔｈｅ １ｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ９３−
【図面の簡単な説明】
第１図は、１）ＴＧ２００の制限地図である。第２図は
、ｐ ＴＧ２０６、ｐ ＨＶ３３およびｐ ＴＧ４０２
の制限地図である。第３図は、ｘｙｌ Ｅ遺伝子のヌク
レオチド配列及びリポソーム結合位置を示づ。第４図は
、ｘｙｌＥ′Ｍ伝了配列のための手法を示Ｊ０第５図は
、Ｃ２，３−０を含有する種々の抽出物の電気泳動図で
ある。 （以 上） ９４− ＧＡＣ＾＾ＣＡＴＧＡＡＣＴ＾τＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡ
ＣＧＴＣＡＴＧ＾＾Ｃ＾＾＾ＧＧＴＧＴ＾＾丁ＧＨ１＾
５ｌＩＬｙｓ Ｃ１ｙ Ｖａｌ Ｍ＠ＩＩＧ−３ 番 第１頁の続き Ｃｌ２Ｎ １５１００ ７２３５−４Ｂ
／／Ａ ２３ Ｌ １／２１２ ６９
０４−４８（Ｃ１２Ｎ １１００
−Ｃ１２Ｒ１／１２５） ６７６０−
４８（Ｃ１２Ｎ １５１００ −Ｃ
１２Ｒ１／１２５） ６７６０−４Ｂ＠
発 明 者 ダイレナ・ガフニー フランス国ストラスプルクロア００ ０リュ・ド・う・グランド・ブ ーシュツ−３ （ｌ 間者７’ニス・スペック フランス国エクボリスハイム６７ ２００リユ・ド・サベルネ１ ０発 明 者 ジャン−ビニール・ルコツクフランス国
うイヒシュテット６７ １１６リユ・デュ・シャン・デュ ・フオ６ 手続補正書（方式） ％式％ １ 事件の表示 昭和５８年特許願第１６０１３号 ２ 発明の名称 カテコール ２，３−オキシゲナーゼを］−ドする遺伝
子を含有する新規発現ベクター、得られた該酵素及びそ
の適用 トランスジーン ソシエテ アノニム ４代理人 昭和５８年４月６日（昭和５８年４月２６日発送）６
補正の対象 補正の内容 １ 明細書第８６頁１１４１行〜第９３頁第９行の記載
を次の通りに訂正−ｑる。 ［１，バーンボイム・エイチ・シー （３１ｒｎｂｏｌｉ ｌ−１、Ｇ 、 ）及びジエイ・
ドリー（、）、Ｄｏｌｙ ）。１９７９゜組換えプラス
ミドＤＮＡなスクリーニングするための急速アルカリ抽
出法。ニュークレイツク・アジツズ・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌｅｌｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｏｓ、 ） ７゜１５１
３〜１５２０頁。 ２、 ボイラン−７−ル・ジエイ（３ｏｙｌａｎ Ｒ。 Ｊ、）、エフ・エイチ・メンデルソン（Ｎ。 Ｈ，Ｍｅｎｄａｌｓｏｎ） 、ディー・ブルツクス（Ｄ
。 Ｂｒｏｏｋｓ）及びエフ・イー・ヤング（Ｆ、Ｅ。 Ｙ ｏｕｎａ ）。１９７２゜バクテリア細胞壁の調節
：ティコ酸の住合成欠損バチルス・スブチリスの変異体
の分析。ジャーナル争オブ・バクテリア細胞壁（Ｊ 、
Ｂ ａｃｔｅｒｌｏｌ、 ）、１１０．２８１〜２９
０１゜ ３、 チＡ７ンーＸス＜ｃｈａｎａ Ｓ、 ）及びニ
ス１− ・エフ・コーエン（Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ）。 １９７９゜プラスミドＤＮＡによるバチルス・スブチリ
スのプロトプラストの高頻度形質転換。モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス（Ｍ ｏｌｅｃ
、 Ｇ ［１，Ｇ ｅｎＮ、 ）１６８．１１１〜１１
５頁。 ４、 デュブナウ・ディー （Ｄｕｂｎａｕ Ｄ、 ）
及びシー・シリグリアノ（Ｃ，Ｃｌｒｌｇｌｉａｎｏ
）。 １９７４゜バチルス・スブチリスの組換え不能変異体の
遺伝的特徴づけ。ジャーナル・オブ・バクテリア細胞壁
（Ｊ 、 Ｂ ａｃｔｅｒｌｏｌ、 ）１１７．４８８
〜４９３頁。 ５、テュブナウ・ディー （Ｄｕｂｎａｕ Ｄ、 ）、
アール・デビドフーアベルソン（Ｒ。 Ｄａｖｌｄｏｆｆ −Ａｂｅｌｓｏｎ） 、ビー−シャ
ー （Ｂ。 ５ｃｈｅｒ）及びシー・シリグリアノ（Ｃ。 Ｃｌｒｉｇｌｌａｎｏ ） 。１９７３ 、受容能力の
あるバチルス・スブチリスにより受容された後の形質転
換デオキシリボ核酸の運命、放射線感受性の組換え不能
変異体の表現型内特徴づけ。 ＝２− ジャーナル・Ａブ・バクテリオロジーＬＪ。 Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、 ） １１４．２７３〜２８６頁
。 ６、 フランクリン・エフ・シー・エイチ（Ｆｒａｎｋ
ｌｉｎ Ｆ、 Ｃ，Ｈ，） 、エムφバグダザリア：／
（Ｍ、 Ｒａａｄａｓａｒｉａｎ） 、エム・エム・
バグダサリアン（Ｍ、 Ｍ、 Ｂａａｄａｓａｒｉａｎ
）及びケー・エフ・テイミイス（Ｋ、Ｎ。 ＴＩｕ＋ｌｓ ）、１９８１．シュードモナス・ビュチ
ダからのＴＯＬプラスミドｐ ＷＷｏの分子的及び機能
的分析及び全調節された芳香環メタ開裂経路のための遺
伝子のクローニング。 プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・オブφザ−１−−ニス−Ｕｉ
−（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ＋。 Ａｃａｄ、 Ｓａｌ、ＬＪ、Ｓ、Ａ、） 、７８゜７
４５８〜７４ｆ３２（８２）。 ７、 グリ−・ビー（Ｑｕｅｒｒｙ Ｐ、 ） 、ディ
ー・ジエイ・ル・プラン（Ｄ、 Ｊ、 Ｌｅ Ｂｌａｎ
ｃ）及びニス・ファル］つ（Ｓ、 Ｆａｌｋｏｗ ）。 ’＋ ９７３゜プラスミドデオキシリボ核酸の一般的単
離法。ジャーナル・オブ・バクテリオロジーＬｌ 、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ） 、１１６．１０６４〜１０
６６頁。 ８、 ヘイワード・ジー・ニス（ＨａｙｗａｒｄＧ、Ｓ
、）及びエム・ジー・スミス（Ｍ、Ｇ。 Ｓ ｗｉｔｈ）。１９７２゜バクテリオファージＴ５．
１．の染色体。アガロースゲル電気泳動法による単鎖Ｄ
ＮＡフラグメントの分析。 ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、
Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、） ６３．３８３〜３９５頁。 ９、 イノウニ・ニス、ニー・ナカザワ及びティー・ナ
カザワ。１９８トエシエリヒア・コリにおけるＴＯＬ遺
伝子ｘｙｌ Ｂ及びｘｙｌ Ｅの分子的クローニング。 ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ 、 Ｂ ａ
ｃｔｅｒｌｏｌ、 ）１４５．１１３７〜１１４３頁。 １０、 レーダーバーブ・イー・エム（Ｌｅｄｅｒｂ
ｅｒｇ Ｅ、 Ｍ、 ）及びニス・エフ・ローエン（
Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ） 、 １９７４．７ラスミド
デオキシリボ核酸によるサルモネラ・ティフィムリウム
（Ｓ ａｌｉｏｎｅｌ １ａｔｙｐｈｉｌｕｒｉｕｌ
）の形質転換。ジャーナル・オブ・バクテリオ［１ジー
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ＋ｏ＋、 ’）１１９．１０７２〜
１０７４頁。 １１、ローリー−Ｊ−−−エイチ（Ｌ ０ＷｒＶ Ｏ
。 Ｈｏ）、エフ・ジエイ・ローズブロウ（Ｎ。 Ｊ 、 ＲｏｓｅｂｒＯＬｌ（Ｉｔｔ ） 、ニーψエ
ル・ファー（Ａ、 Ｌ、 Ｆａｒｒ ）及ヒアール・シ
エイ・ラングＪＬ／（Ｒ，Ｊ、 Ｒａｎｄａｌｌ） 、
１９５１．フォリンフェノール試薬による蛋白測定。ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル会ケミストリー （
Ｊ 、Ｂ Ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） １９３，２６５〜
２７５員。 １２、 メーイヤーズ・ジ１イーＸイ（Ｍｅｙｅｒｓ
Ｊ 。 Ａ、）、ディー・サンチェツ（Ｄ。 ５ａｎＣ１ｌｅＺ） 、エル・ビー・エルウェル（Ｌ。 Ｐ、 Ｅｌｗｅｌｌ ）及びニス・ファルコウ（Ｓ。 Ｆａｌｋｏｗ）。１９７６゜プラスミドデオキシリボ核
酸の同品及び特徴づけのための単純な＝５− アガロース電気泳動法。ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジ−（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）１２７．１５
２９〜１５３７頁。 １３、 モリソン・ディ・ニー（Ｍ ｏｒｒｌｓｏｎ
Ｄ 。 Ａ、）。１９７７゜エシェリヒア・コリにおける形質転
換：受容能力のある細胞の低温保存。ジャーナル・オブ
φバクテリオロジーＬＪ 、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
） １３２．３４９〜３５１頁。 １４、 ナカザワ・ティー、ニス・イノウニ及びニー
・ナカザワ、１９８０゜ＲＰ−４ ７ＯＬプラスミド組換え体の物理的及び機能的マツピン
グ：挿入及び欠失変異体の分析。 ジャーナル・オブ・バクテリオロジーＬＪ。 Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、 ） １４４．２２２〜２３１頁
。 １５、 フイリブセン・ビー（Ｐ ｈｌ ｌ １ｐｐ
ｓｏｎＰ、）、アール・ニー・クレーマー（Ｒ，Ａ。 ）（ｒａ■ｅｒ ）及びアール・ダブリュー・ディビス
（Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ） 。１９７８．遺伝的及び物理
的サイズの選択を用いる、ｓｓｔ工及び６− Ｈｉｎｄｌｌｌラムダベクター中のイースト染色体ＤＮ
Ａの繰り返し単位のりＯ−ニング。ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ
ｌ、） 、１２３．３７１〜３８６頁。 １６、 プリムローズ・ニスφビー（Ｐ ｒｉｉａｒ
ｏｓｅＳ、Ｂ、）及びニス・ディー・エーリツヒ（Ｓ、
Ｄ、 Ｅｈｒｌｌｃｔｌ）、 １９８１．プラスミド
欠失変異体の単離及びその不安定性の研究。 プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ） 、６．１９３〜２０１
頁。 １７、 ラドロフ・アール・ダブリュー（Ｒａｄｌｏ
ＨＲ，Ｗ、） 、ダブリュー・バラエル（Ｗ、 Ｂａｕ
θ「）及びジエイ・ビッグラード（Ｊ、 Ｖｌｎｏｕｒ
ａｄ ） 。１９６７、閉鎖環状複合ＤＮＡの検知及び
単離のための色素浮遊密度法：Ｈｅ１−ａ細胞内の閉鎖
環状ＤＮＡ。 プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・オブ・ザ−１−−１’）、 −
］ニー （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、ＬＪ、Ｓ、Ａ、） 、５７．１
５１４〜１５２１頁。 １８、 ラボボート・ジー（Ｒａｐｏｐｏｒｔ Ｇ、
）、ニー・クライア（Ａ、 Ｋ１１ｅｒ） 、ニー・
ビロー （Ａ、 Ｂ１１１ａｕｌｔ ） 、エフー’７
フルゲツテ（Ｆ、 ＦａｒＯｅｔｔｅ ＞及Ｕ７−）Ｌ
ｔ・テト＞’ｊ（Ｒ，Ｄｅｄｏｎｄｅｒ ） 、 １９
７９．バチルス・ズブチリス１６８ゲノームを代表する
ハイブリッドプラスミドを含有するＥ、コリのコロニー
バンクの構築。モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジ
エネテイックス（Ｍ ｏｌｅｃ。 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ） １７６．２３９〜２４５
頁。 １９、 サンカー−Ｉ −（Ｓａｎｃａｒ Ａ、 ）
、ニー・エム・バック（Ａ、 Ｍ、 Ｈａｃｋ ）及
びダブリュー・ディー・ラブ（Ｗ、 Ｄ、 Ｒｕｐｐ
）。 １９７９゜プラスミドコード化蛋白質の単純な同品沫。 ジャーナル・オブ・バクテリオ０ジー（Ｊ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 ）、１３７．６９２〜６９３頁。 ２０、 スビツイツエン・ジエイ（Ｓ ｐｌｚｌｚｅ
ｎＪ、）。１９５８゜デオキシリボヌクレエートによる
バチルス・スブチリスの生化学的欠損株の形質転換。プ
ロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−
・オブ壷サイエンス・オプやザ・ニー・ニス・ニー （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｏａｄ、 Ｓｅｔ
、 Ｕ、 Ｓ。 Ａ、）、４４．１０７２〜１０７８頁。 ２１、サトクリフ・ジエイ・ジー（Ｓ ｕｔｃｌ １Ｈ
ｅＪ、Ｇ、 ）１９７９゜エシェリヒア・コリープラス
ミドｐＢＲ３２２の完全なヌクレオチド配列。コールド
・スプリング・ハーバ−・シンポジア・オン嗜りオンテ
イタテイブ・バイオロジー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ。 Ｑｕａｎｔ、 Ｂ ｌｏｔ、） 土」−１７７〜９０頁
。 ２２、 ルノー・イー（Ｒｅｎａｕｔ Ｅ 、 ）
、ビーゆスタンセンズ（ｐ 、 ｓ ｔａｎＳｓｅｎｓ
＞及びダブリ、：Ｌ−−７イヤーズ（Ｗ、 Ｆｌｅｒｓ
） 、 １９８１゜コリファージ ラｌ−ダのＰＬ
プロモータにより制御された高効率表現用のプラスミド
ベクター。ジーン（Ｇｏｎｅ ） １５．８１〜９３９
− 頁。 ２３、リーブ−エム（Ｌ−ｉｅｂ Ｍ、 ） 、 １９
６６゜熱誘導性ラムダバクテリオファージの研究。 遺伝子部位の順位及び変異体プロファージの特性。ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ 、
Ｍｏ１． Ｂ ｉｏｌ、） ｊ ６．１４９〜１６３頁
。 ２４、 ハレウエル・アール・ニー（Ｈａｌｌｅｗｅ
ｌｌＲ，Ａ、）及びニス・エムテージ（Ｓ。 Ｅ ｌｔａ口ｅ）。１９８０゜外部遺伝子の効率的に調
節された発現に適したｈリブトファン・オペロン・プロ
モーターを含有するプラスミドベクター。ジーン（Ｇ８
ｎｅ）艶、２７〜４７頁。 ２５、 クシュナー・ニス・アール（Ｋ ｕｓｈｎｅ
ｒＳ、Ｒ，）。１９７８゜ＣｏｌＥｌ派生のプラスミド
によるエシェリヒア・コリの改良された形質転換法。ジ
エネテイツク・エンジニアリング（Ｇ ｅｎｅｔｉｃ
Ｅ ｎｏｉｎｅｅｒｉｎｏ） 、ボイヤー・エイチ・
ダブリュー（Ｂｏｗｅｒ Ｈ，Ｗ、 ）１０− 及びニス・ニコシア・エルセピア（Ｓ。 Ｎ １ｃｏｓｌａ Ｅ １ｓｅｖｌｒ）編。モースー
ホランド・バイオメディカル・プレス（ＭＯｒｔｈ−Ｈ
ｏｌｌａｎｄ Ｂ １ｏｉｅｄｌｃａｌ ｐｒ
ｅｓｓ ） １ ９ ７ ８ 。 ２６、マレー−Ｘヌ・イー（Ｍｕｒｒａｙ Ｎ、 Ｅ、
）及びダブリュー・ジエイ・ブラマー（Ｗ、Ｊ。 Ｂ ｒａｗｗｅｒ） 、 １９７３゜Ｉく一制限システ
ムに対する感知配列を含有するエシェリヒア・コリ Ｋ
のｔ！ｉＪ！−Ｅ遺伝子。ジＡ７−ナル・オブ・モレキ
ユラー・バイオロジーＬＪ、Ｍｏｌ。 Ｂ ｉｏｌ、） ７７．６１５〜６２４頁。 ２７、 フランクリン・エフ・シー・エイチ（トｒａ
ｎｋｌｉｎ Ｆ、 Ｃ−Ｈ，） 、エム・バグダサリ７
ン（Ｍ 、 Ｂ ａｉ＋ｄａｓａｒｌａｎ）及びチー・
エフ・ティミス（Ｋ、 Ｎ、 Ｔ１ｍ５ｌｓ ）。 １９８１゜土壌バクテリアの減成的遺伝子操作。外生動
物質及び扱いにくい物質の微生物的分解。アール−７”
／ター（Ｒ，Ｈｕｔｔｅｒ ）及びチーｒ−・レイシン
ガー（Ｔ 、 Ｌ ｅｌｓｌｎａＯｒ）編。アカデミツ
ク・プレス。ロンドン。 １９８１゜１０９〜１３０頁。 ２８、 ノゾミ・エム、カガミＶマ・エイチ、ハヤイ
シ。メタピロ力テカーゼ、精製、結晶化及び特性。１９
６３゜ごオヘミシエ・ツアイトシュリフｈ （Ｂ １ｏ
ｃｈｅｉｉｓｃｈｅ ’：ｌ ｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ）
３３８．５８２〜５９０頁。 ２９、 サラトートレバト・ホセ・エム（Ｓ ａｌａ
ｔ−Ｔｒｅｐａｔ Ｊｏｓｅ Ｍ、 ） 、エバンス・
シー（Ｅ ｖａｎｓｃ 、 ）アゾトバクタ一種による
カテコールのメタ開裂。１９７１゜ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、 Ｊ、
３１ｏｃｈｅ（） ２０−１４００〜４１３頁。 ３０、■−リツヒーエス・ディー（Ｅ ｈｒｌｉｃｈＳ
、Ｄ、）１９７７゜バチルス・スブチリスにおけるスタ
フィロコッカス・オーレウス（Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からのプラスミドの複製及
び発現。プロシーデイングズ・オブ壷ザ・ナショナル・
アカデミ−φオブ・サイエンス・オブ・ザ・ニー・ニス
・ニー（ｐｒｏａ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃ１．ＬＪ、Ｓ。 Ａ、）−７先、１６８０〜１６８２頁。 ３１、 カラスコリ・ジ］ニイ・エル（Ｃａｒｒａｓ
ｃｏｓａ Ｊ 、 ｌ−、） 、カマチョ・ニー（Ｃａ
ｍａｃｈｏ Ａ、 ） 、モレノ・エフ（Ｍｏｒｅｎ
ｏ Ｆ、 ） 、ジメネツ・エフ（ＪｌｌθｎｅｚＦ、
）、メラド拳アール・ビー（ＭｅｌｌａｄｏＲ，Ｐ、
） 、ビヌエラ・イー（Ｖｉｎｕｅｌａ Ｅ、 ）及
びサラスΦエム（３ａｌａｓ Ｍ、 ）。バチルス・
スブチリス・ファージψ２９゜ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ。 ３ １ｏｃｈθ鵬、 ） ６６、 ２２９〜２４１
。 ３２、 マクロ−リン・ジエイ・アール（ＭｅＬ、ａ
ｕｏｈｌｌｎ Ｊ 、 Ｒ、） 、マレ−・シー◆エル
（Ｍｕｒｒａｙ Ｃ，ｌ 、 ）及びラビノビツツ・ジ
エイ・シー （Ｒａｂｌｎｏｗｌｔｚ Ｊ 、 Ｃ，）
。 １９８２゜異種特異的遺伝子発現。マイクロバイオロジ
ー。１９８２゜ディー・シュレシンジャー（Ｄ、Ｓｃ旧
ｏｓａｌｎｇｅｒ ）編。アメリ１３− カン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー。 ワシントンＤ、０．２２〜２７頁。 ３３、 ノザキ・エム、オノ・チー、ナカザワ・ティ
ー、］タニ・ニス及びハヤイシ・オー。 １９６８゜メタビロ力テカーゼ■、鉄及びスルフヒドリ
ル基の役割。ジャーナル・オプ・バクテリオロジ−（Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）２４３．２６８２〜２６
９０頁。 ３４、 ナザキ・エム、（Ｎａｚａｋｉ Ｍ、 ）。 １９７９゜オキシゲナーゼ及びディオキシゲナーゼ。ト
ピックス・イン・カレント・ケミストリー（Ｔｏｐｉｃ
ｓ、 Ｃｕｒｒ、 Ｃｈｅｉ＋、） ７８゜１４５
〜１８６頁。 ３５、 ホリノウチ・ニス及びビー・ワイシュラム（
Ｂ、 Ｗｅｉｓｈｌｕｍ ） 、 １９８２゜誘起性の
クロラムフェニコール耐性を特定するプラスミドである
Ｉ）Ｃ１９４のヌクレオチド配列及び機能的地図。ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジーＬＪ 、 Ｂａｃｔｅ
ｒｌｏｌ、 ） １５０．８１５〜８２５゜ １４− ３６、 七ラン・シー・ビー・ジュニア（Ｍ ｏｒａ
ｎＣ，Ｐ、Ｊｒ、） 、エフ・ラング（Ｎ。 Ｌａｎｏ）、ニス・エフ・ジエイ・ル・グリース（Ｓ、
Ｆ、 Ｊ、 Ｌｅ Ｇｒｌｃｅ） 、ジー・ジー（Ｇ
、Ｌｅｅ）、エム・ステフェンス（Ｍ。 Ｓ ｔｅｐｈｅｎｓ ） 、ニー・エル◆ソネンシエイ
ン（Ａ、 Ｌ、 ５ｏｎｅｎｓｈｅｌｎ ） 、シエイ
−ヘ口（Ｊ、Ｐθｒｏ ）及びアール・ロジック（Ｒ。 １−ｏｓｌｃｋ）。１９８２゜バチルス・スブチリスに
おける転写と翻訳の開始を指示するヌクレチオド配列。 モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス
（Ｍｏｌｅｃ、 Ｑθ０゜Ｇｅｎｅｔ、 ） １８６．
３３９〜３４６゜」（以 上） １５− −８２３＝
、ｐ ＴＧ２０６、ｐ ＨＶ３３およびｐ ＴＧ４０２
の制限地図である。第３図は、ｘｙｌ Ｅ遺伝子のヌク
レオチド配列及びリポソーム結合位置を示づ。第４図は
、ｘｙｌＥ′Ｍ伝了配列のための手法を示Ｊ０第５図は
、Ｃ２，３−０を含有する種々の抽出物の電気泳動図で
ある。 （以 上） ９４− ＧＡＣ＾＾ＣＡＴＧＡＡＣＴ＾τＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡ
ＣＧＴＣＡＴＧ＾＾Ｃ＾＾＾ＧＧＴＧＴ＾＾丁ＧＨ１＾
５ｌＩＬｙｓ Ｃ１ｙ Ｖａｌ Ｍ＠ＩＩＧ−３ 番 第１頁の続き Ｃｌ２Ｎ １５１００ ７２３５−４Ｂ
／／Ａ ２３ Ｌ １／２１２ ６９
０４−４８（Ｃ１２Ｎ １１００
−Ｃ１２Ｒ１／１２５） ６７６０−
４８（Ｃ１２Ｎ １５１００ −Ｃ
１２Ｒ１／１２５） ６７６０−４Ｂ＠
発 明 者 ダイレナ・ガフニー フランス国ストラスプルクロア００ ０リュ・ド・う・グランド・ブ ーシュツ−３ （ｌ 間者７’ニス・スペック フランス国エクボリスハイム６７ ２００リユ・ド・サベルネ１ ０発 明 者 ジャン−ビニール・ルコツクフランス国
うイヒシュテット６７ １１６リユ・デュ・シャン・デュ ・フオ６ 手続補正書（方式） ％式％ １ 事件の表示 昭和５８年特許願第１６０１３号 ２ 発明の名称 カテコール ２，３−オキシゲナーゼを］−ドする遺伝
子を含有する新規発現ベクター、得られた該酵素及びそ
の適用 トランスジーン ソシエテ アノニム ４代理人 昭和５８年４月６日（昭和５８年４月２６日発送）６
補正の対象 補正の内容 １ 明細書第８６頁１１４１行〜第９３頁第９行の記載
を次の通りに訂正−ｑる。 ［１，バーンボイム・エイチ・シー （３１ｒｎｂｏｌｉ ｌ−１、Ｇ 、 ）及びジエイ・
ドリー（、）、Ｄｏｌｙ ）。１９７９゜組換えプラス
ミドＤＮＡなスクリーニングするための急速アルカリ抽
出法。ニュークレイツク・アジツズ・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌｅｌｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｏｓ、 ） ７゜１５１
３〜１５２０頁。 ２、 ボイラン−７−ル・ジエイ（３ｏｙｌａｎ Ｒ。 Ｊ、）、エフ・エイチ・メンデルソン（Ｎ。 Ｈ，Ｍｅｎｄａｌｓｏｎ） 、ディー・ブルツクス（Ｄ
。 Ｂｒｏｏｋｓ）及びエフ・イー・ヤング（Ｆ、Ｅ。 Ｙ ｏｕｎａ ）。１９７２゜バクテリア細胞壁の調節
：ティコ酸の住合成欠損バチルス・スブチリスの変異体
の分析。ジャーナル争オブ・バクテリア細胞壁（Ｊ 、
Ｂ ａｃｔｅｒｌｏｌ、 ）、１１０．２８１〜２９
０１゜ ３、 チＡ７ンーＸス＜ｃｈａｎａ Ｓ、 ）及びニ
ス１− ・エフ・コーエン（Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ）。 １９７９゜プラスミドＤＮＡによるバチルス・スブチリ
スのプロトプラストの高頻度形質転換。モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス（Ｍ ｏｌｅｃ
、 Ｇ ［１，Ｇ ｅｎＮ、 ）１６８．１１１〜１１
５頁。 ４、 デュブナウ・ディー （Ｄｕｂｎａｕ Ｄ、 ）
及びシー・シリグリアノ（Ｃ，Ｃｌｒｌｇｌｉａｎｏ
）。 １９７４゜バチルス・スブチリスの組換え不能変異体の
遺伝的特徴づけ。ジャーナル・オブ・バクテリア細胞壁
（Ｊ 、 Ｂ ａｃｔｅｒｌｏｌ、 ）１１７．４８８
〜４９３頁。 ５、テュブナウ・ディー （Ｄｕｂｎａｕ Ｄ、 ）、
アール・デビドフーアベルソン（Ｒ。 Ｄａｖｌｄｏｆｆ −Ａｂｅｌｓｏｎ） 、ビー−シャ
ー （Ｂ。 ５ｃｈｅｒ）及びシー・シリグリアノ（Ｃ。 Ｃｌｒｉｇｌｌａｎｏ ） 。１９７３ 、受容能力の
あるバチルス・スブチリスにより受容された後の形質転
換デオキシリボ核酸の運命、放射線感受性の組換え不能
変異体の表現型内特徴づけ。 ＝２− ジャーナル・Ａブ・バクテリオロジーＬＪ。 Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、 ） １１４．２７３〜２８６頁
。 ６、 フランクリン・エフ・シー・エイチ（Ｆｒａｎｋ
ｌｉｎ Ｆ、 Ｃ，Ｈ，） 、エムφバグダザリア：／
（Ｍ、 Ｒａａｄａｓａｒｉａｎ） 、エム・エム・
バグダサリアン（Ｍ、 Ｍ、 Ｂａａｄａｓａｒｉａｎ
）及びケー・エフ・テイミイス（Ｋ、Ｎ。 ＴＩｕ＋ｌｓ ）、１９８１．シュードモナス・ビュチ
ダからのＴＯＬプラスミドｐ ＷＷｏの分子的及び機能
的分析及び全調節された芳香環メタ開裂経路のための遺
伝子のクローニング。 プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・オブφザ−１−−ニス−Ｕｉ
−（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ＋。 Ａｃａｄ、 Ｓａｌ、ＬＪ、Ｓ、Ａ、） 、７８゜７
４５８〜７４ｆ３２（８２）。 ７、 グリ−・ビー（Ｑｕｅｒｒｙ Ｐ、 ） 、ディ
ー・ジエイ・ル・プラン（Ｄ、 Ｊ、 Ｌｅ Ｂｌａｎ
ｃ）及びニス・ファル］つ（Ｓ、 Ｆａｌｋｏｗ ）。 ’＋ ９７３゜プラスミドデオキシリボ核酸の一般的単
離法。ジャーナル・オブ・バクテリオロジーＬｌ 、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ） 、１１６．１０６４〜１０
６６頁。 ８、 ヘイワード・ジー・ニス（ＨａｙｗａｒｄＧ、Ｓ
、）及びエム・ジー・スミス（Ｍ、Ｇ。 Ｓ ｗｉｔｈ）。１９７２゜バクテリオファージＴ５．
１．の染色体。アガロースゲル電気泳動法による単鎖Ｄ
ＮＡフラグメントの分析。 ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、
Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、） ６３．３８３〜３９５頁。 ９、 イノウニ・ニス、ニー・ナカザワ及びティー・ナ
カザワ。１９８トエシエリヒア・コリにおけるＴＯＬ遺
伝子ｘｙｌ Ｂ及びｘｙｌ Ｅの分子的クローニング。 ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ 、 Ｂ ａ
ｃｔｅｒｌｏｌ、 ）１４５．１１３７〜１１４３頁。 １０、 レーダーバーブ・イー・エム（Ｌｅｄｅｒｂ
ｅｒｇ Ｅ、 Ｍ、 ）及びニス・エフ・ローエン（
Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ） 、 １９７４．７ラスミド
デオキシリボ核酸によるサルモネラ・ティフィムリウム
（Ｓ ａｌｉｏｎｅｌ １ａｔｙｐｈｉｌｕｒｉｕｌ
）の形質転換。ジャーナル・オブ・バクテリオ［１ジー
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ＋ｏ＋、 ’）１１９．１０７２〜
１０７４頁。 １１、ローリー−Ｊ−−−エイチ（Ｌ ０ＷｒＶ Ｏ
。 Ｈｏ）、エフ・ジエイ・ローズブロウ（Ｎ。 Ｊ 、 ＲｏｓｅｂｒＯＬｌ（Ｉｔｔ ） 、ニーψエ
ル・ファー（Ａ、 Ｌ、 Ｆａｒｒ ）及ヒアール・シ
エイ・ラングＪＬ／（Ｒ，Ｊ、 Ｒａｎｄａｌｌ） 、
１９５１．フォリンフェノール試薬による蛋白測定。ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル会ケミストリー （
Ｊ 、Ｂ Ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） １９３，２６５〜
２７５員。 １２、 メーイヤーズ・ジ１イーＸイ（Ｍｅｙｅｒｓ
Ｊ 。 Ａ、）、ディー・サンチェツ（Ｄ。 ５ａｎＣ１ｌｅＺ） 、エル・ビー・エルウェル（Ｌ。 Ｐ、 Ｅｌｗｅｌｌ ）及びニス・ファルコウ（Ｓ。 Ｆａｌｋｏｗ）。１９７６゜プラスミドデオキシリボ核
酸の同品及び特徴づけのための単純な＝５− アガロース電気泳動法。ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジ−（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）１２７．１５
２９〜１５３７頁。 １３、 モリソン・ディ・ニー（Ｍ ｏｒｒｌｓｏｎ
Ｄ 。 Ａ、）。１９７７゜エシェリヒア・コリにおける形質転
換：受容能力のある細胞の低温保存。ジャーナル・オブ
φバクテリオロジーＬＪ 、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
） １３２．３４９〜３５１頁。 １４、 ナカザワ・ティー、ニス・イノウニ及びニー
・ナカザワ、１９８０゜ＲＰ−４ ７ＯＬプラスミド組換え体の物理的及び機能的マツピン
グ：挿入及び欠失変異体の分析。 ジャーナル・オブ・バクテリオロジーＬＪ。 Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、 ） １４４．２２２〜２３１頁
。 １５、 フイリブセン・ビー（Ｐ ｈｌ ｌ １ｐｐ
ｓｏｎＰ、）、アール・ニー・クレーマー（Ｒ，Ａ。 ）（ｒａ■ｅｒ ）及びアール・ダブリュー・ディビス
（Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ） 。１９７８．遺伝的及び物理
的サイズの選択を用いる、ｓｓｔ工及び６− Ｈｉｎｄｌｌｌラムダベクター中のイースト染色体ＤＮ
Ａの繰り返し単位のりＯ−ニング。ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ
ｌ、） 、１２３．３７１〜３８６頁。 １６、 プリムローズ・ニスφビー（Ｐ ｒｉｉａｒ
ｏｓｅＳ、Ｂ、）及びニス・ディー・エーリツヒ（Ｓ、
Ｄ、 Ｅｈｒｌｌｃｔｌ）、 １９８１．プラスミド
欠失変異体の単離及びその不安定性の研究。 プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ） 、６．１９３〜２０１
頁。 １７、 ラドロフ・アール・ダブリュー（Ｒａｄｌｏ
ＨＲ，Ｗ、） 、ダブリュー・バラエル（Ｗ、 Ｂａｕ
θ「）及びジエイ・ビッグラード（Ｊ、 Ｖｌｎｏｕｒ
ａｄ ） 。１９６７、閉鎖環状複合ＤＮＡの検知及び
単離のための色素浮遊密度法：Ｈｅ１−ａ細胞内の閉鎖
環状ＤＮＡ。 プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・オブ・ザ−１−−１’）、 −
］ニー （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、ＬＪ、Ｓ、Ａ、） 、５７．１
５１４〜１５２１頁。 １８、 ラボボート・ジー（Ｒａｐｏｐｏｒｔ Ｇ、
）、ニー・クライア（Ａ、 Ｋ１１ｅｒ） 、ニー・
ビロー （Ａ、 Ｂ１１１ａｕｌｔ ） 、エフー’７
フルゲツテ（Ｆ、 ＦａｒＯｅｔｔｅ ＞及Ｕ７−）Ｌ
ｔ・テト＞’ｊ（Ｒ，Ｄｅｄｏｎｄｅｒ ） 、 １９
７９．バチルス・ズブチリス１６８ゲノームを代表する
ハイブリッドプラスミドを含有するＥ、コリのコロニー
バンクの構築。モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジ
エネテイックス（Ｍ ｏｌｅｃ。 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 ） １７６．２３９〜２４５
頁。 １９、 サンカー−Ｉ −（Ｓａｎｃａｒ Ａ、 ）
、ニー・エム・バック（Ａ、 Ｍ、 Ｈａｃｋ ）及
びダブリュー・ディー・ラブ（Ｗ、 Ｄ、 Ｒｕｐｐ
）。 １９７９゜プラスミドコード化蛋白質の単純な同品沫。 ジャーナル・オブ・バクテリオ０ジー（Ｊ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、 ）、１３７．６９２〜６９３頁。 ２０、 スビツイツエン・ジエイ（Ｓ ｐｌｚｌｚｅ
ｎＪ、）。１９５８゜デオキシリボヌクレエートによる
バチルス・スブチリスの生化学的欠損株の形質転換。プ
ロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−
・オブ壷サイエンス・オプやザ・ニー・ニス・ニー （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｏａｄ、 Ｓｅｔ
、 Ｕ、 Ｓ。 Ａ、）、４４．１０７２〜１０７８頁。 ２１、サトクリフ・ジエイ・ジー（Ｓ ｕｔｃｌ １Ｈ
ｅＪ、Ｇ、 ）１９７９゜エシェリヒア・コリープラス
ミドｐＢＲ３２２の完全なヌクレオチド配列。コールド
・スプリング・ハーバ−・シンポジア・オン嗜りオンテ
イタテイブ・バイオロジー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ。 Ｑｕａｎｔ、 Ｂ ｌｏｔ、） 土」−１７７〜９０頁
。 ２２、 ルノー・イー（Ｒｅｎａｕｔ Ｅ 、 ）
、ビーゆスタンセンズ（ｐ 、 ｓ ｔａｎＳｓｅｎｓ
＞及びダブリ、：Ｌ−−７イヤーズ（Ｗ、 Ｆｌｅｒｓ
） 、 １９８１゜コリファージ ラｌ−ダのＰＬ
プロモータにより制御された高効率表現用のプラスミド
ベクター。ジーン（Ｇｏｎｅ ） １５．８１〜９３９
− 頁。 ２３、リーブ−エム（Ｌ−ｉｅｂ Ｍ、 ） 、 １９
６６゜熱誘導性ラムダバクテリオファージの研究。 遺伝子部位の順位及び変異体プロファージの特性。ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ 、
Ｍｏ１． Ｂ ｉｏｌ、） ｊ ６．１４９〜１６３頁
。 ２４、 ハレウエル・アール・ニー（Ｈａｌｌｅｗｅ
ｌｌＲ，Ａ、）及びニス・エムテージ（Ｓ。 Ｅ ｌｔａ口ｅ）。１９８０゜外部遺伝子の効率的に調
節された発現に適したｈリブトファン・オペロン・プロ
モーターを含有するプラスミドベクター。ジーン（Ｇ８
ｎｅ）艶、２７〜４７頁。 ２５、 クシュナー・ニス・アール（Ｋ ｕｓｈｎｅ
ｒＳ、Ｒ，）。１９７８゜ＣｏｌＥｌ派生のプラスミド
によるエシェリヒア・コリの改良された形質転換法。ジ
エネテイツク・エンジニアリング（Ｇ ｅｎｅｔｉｃ
Ｅ ｎｏｉｎｅｅｒｉｎｏ） 、ボイヤー・エイチ・
ダブリュー（Ｂｏｗｅｒ Ｈ，Ｗ、 ）１０− 及びニス・ニコシア・エルセピア（Ｓ。 Ｎ １ｃｏｓｌａ Ｅ １ｓｅｖｌｒ）編。モースー
ホランド・バイオメディカル・プレス（ＭＯｒｔｈ−Ｈ
ｏｌｌａｎｄ Ｂ １ｏｉｅｄｌｃａｌ ｐｒ
ｅｓｓ ） １ ９ ７ ８ 。 ２６、マレー−Ｘヌ・イー（Ｍｕｒｒａｙ Ｎ、 Ｅ、
）及びダブリュー・ジエイ・ブラマー（Ｗ、Ｊ。 Ｂ ｒａｗｗｅｒ） 、 １９７３゜Ｉく一制限システ
ムに対する感知配列を含有するエシェリヒア・コリ Ｋ
のｔ！ｉＪ！−Ｅ遺伝子。ジＡ７−ナル・オブ・モレキ
ユラー・バイオロジーＬＪ、Ｍｏｌ。 Ｂ ｉｏｌ、） ７７．６１５〜６２４頁。 ２７、 フランクリン・エフ・シー・エイチ（トｒａ
ｎｋｌｉｎ Ｆ、 Ｃ−Ｈ，） 、エム・バグダサリ７
ン（Ｍ 、 Ｂ ａｉ＋ｄａｓａｒｌａｎ）及びチー・
エフ・ティミス（Ｋ、 Ｎ、 Ｔ１ｍ５ｌｓ ）。 １９８１゜土壌バクテリアの減成的遺伝子操作。外生動
物質及び扱いにくい物質の微生物的分解。アール−７”
／ター（Ｒ，Ｈｕｔｔｅｒ ）及びチーｒ−・レイシン
ガー（Ｔ 、 Ｌ ｅｌｓｌｎａＯｒ）編。アカデミツ
ク・プレス。ロンドン。 １９８１゜１０９〜１３０頁。 ２８、 ノゾミ・エム、カガミＶマ・エイチ、ハヤイ
シ。メタピロ力テカーゼ、精製、結晶化及び特性。１９
６３゜ごオヘミシエ・ツアイトシュリフｈ （Ｂ １ｏ
ｃｈｅｉｉｓｃｈｅ ’：ｌ ｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ）
３３８．５８２〜５９０頁。 ２９、 サラトートレバト・ホセ・エム（Ｓ ａｌａ
ｔ−Ｔｒｅｐａｔ Ｊｏｓｅ Ｍ、 ） 、エバンス・
シー（Ｅ ｖａｎｓｃ 、 ）アゾトバクタ一種による
カテコールのメタ開裂。１９７１゜ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、 Ｊ、
３１ｏｃｈｅ（） ２０−１４００〜４１３頁。 ３０、■−リツヒーエス・ディー（Ｅ ｈｒｌｉｃｈＳ
、Ｄ、）１９７７゜バチルス・スブチリスにおけるスタ
フィロコッカス・オーレウス（Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からのプラスミドの複製及
び発現。プロシーデイングズ・オブ壷ザ・ナショナル・
アカデミ−φオブ・サイエンス・オブ・ザ・ニー・ニス
・ニー（ｐｒｏａ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃ１．ＬＪ、Ｓ。 Ａ、）−７先、１６８０〜１６８２頁。 ３１、 カラスコリ・ジ］ニイ・エル（Ｃａｒｒａｓ
ｃｏｓａ Ｊ 、 ｌ−、） 、カマチョ・ニー（Ｃａ
ｍａｃｈｏ Ａ、 ） 、モレノ・エフ（Ｍｏｒｅｎ
ｏ Ｆ、 ） 、ジメネツ・エフ（ＪｌｌθｎｅｚＦ、
）、メラド拳アール・ビー（ＭｅｌｌａｄｏＲ，Ｐ、
） 、ビヌエラ・イー（Ｖｉｎｕｅｌａ Ｅ、 ）及
びサラスΦエム（３ａｌａｓ Ｍ、 ）。バチルス・
スブチリス・ファージψ２９゜ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ。 ３ １ｏｃｈθ鵬、 ） ６６、 ２２９〜２４１
。 ３２、 マクロ−リン・ジエイ・アール（ＭｅＬ、ａ
ｕｏｈｌｌｎ Ｊ 、 Ｒ、） 、マレ−・シー◆エル
（Ｍｕｒｒａｙ Ｃ，ｌ 、 ）及びラビノビツツ・ジ
エイ・シー （Ｒａｂｌｎｏｗｌｔｚ Ｊ 、 Ｃ，）
。 １９８２゜異種特異的遺伝子発現。マイクロバイオロジ
ー。１９８２゜ディー・シュレシンジャー（Ｄ、Ｓｃ旧
ｏｓａｌｎｇｅｒ ）編。アメリ１３− カン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー。 ワシントンＤ、０．２２〜２７頁。 ３３、 ノザキ・エム、オノ・チー、ナカザワ・ティ
ー、］タニ・ニス及びハヤイシ・オー。 １９６８゜メタビロ力テカーゼ■、鉄及びスルフヒドリ
ル基の役割。ジャーナル・オプ・バクテリオロジ−（Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）２４３．２６８２〜２６
９０頁。 ３４、 ナザキ・エム、（Ｎａｚａｋｉ Ｍ、 ）。 １９７９゜オキシゲナーゼ及びディオキシゲナーゼ。ト
ピックス・イン・カレント・ケミストリー（Ｔｏｐｉｃ
ｓ、 Ｃｕｒｒ、 Ｃｈｅｉ＋、） ７８゜１４５
〜１８６頁。 ３５、 ホリノウチ・ニス及びビー・ワイシュラム（
Ｂ、 Ｗｅｉｓｈｌｕｍ ） 、 １９８２゜誘起性の
クロラムフェニコール耐性を特定するプラスミドである
Ｉ）Ｃ１９４のヌクレオチド配列及び機能的地図。ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジーＬＪ 、 Ｂａｃｔｅ
ｒｌｏｌ、 ） １５０．８１５〜８２５゜ １４− ３６、 七ラン・シー・ビー・ジュニア（Ｍ ｏｒａ
ｎＣ，Ｐ、Ｊｒ、） 、エフ・ラング（Ｎ。 Ｌａｎｏ）、ニス・エフ・ジエイ・ル・グリース（Ｓ、
Ｆ、 Ｊ、 Ｌｅ Ｇｒｌｃｅ） 、ジー・ジー（Ｇ
、Ｌｅｅ）、エム・ステフェンス（Ｍ。 Ｓ ｔｅｐｈｅｎｓ ） 、ニー・エル◆ソネンシエイ
ン（Ａ、 Ｌ、 ５ｏｎｅｎｓｈｅｌｎ ） 、シエイ
−ヘ口（Ｊ、Ｐθｒｏ ）及びアール・ロジック（Ｒ。 １−ｏｓｌｃｋ）。１９８２゜バチルス・スブチリスに
おける転写と翻訳の開始を指示するヌクレチオド配列。 モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス
（Ｍｏｌｅｃ、 Ｑθ０゜Ｇｅｎｅｔ、 ） １８６．
３３９〜３４６゜」（以 上） １５− −８２３＝
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 少なくとも（ａ ）カテコール ２，３−オキシ
ゲナーゼ合成をコードする遺伝子ｘｙｌ Ｅ及び（ｂ）
ダラム陽性菌において該遺伝子ｘｙｌ Ｅを発現させる
ためのプロモーターを含有することを特徴とするプラス
ミドベクター。 ２、 ダラム陽性菌が、バチルス、ラクトバチルス、ス
プレブトコツカス、スタフィロコッカス又はコリネバク
テリアである特許請求の範囲第１項記載のプラスミドベ
クター。 ３、 ダラム陽性菌が、バチルス スブチリスである特
許請求の範囲第２項記載のプラスミドベクター。 ４、 プロモーターが、ダラム陽性閑の染色体ＤＮＡ配
列である特許請求の範囲第１項記載のプラスミドベクタ
ー。 ５、 プロモーターが、バチルス スブチリスの染色体
ＤＮＡ配列である特許請求の範囲第４項記載のプラスミ
ドベクター。 ６、 プロモーターが、Ｂ、スブチリス、Ｂ、リヘニフ
オルミスまたはＢ、プミルスの染色体ＤＮＡ配列である
特許請求の範囲第５項記載のプラスミドベクター。 ７、 プロモーターが、ダラム陰性菌の染色体ＤＮＡ配
列である特許請求の範囲第１項記載のプラスミドベクタ
ー。 ８、 プロモーターが、Ｅ、コリの染色体ＤＮＡ配列で
ある特許請求の範囲第７項記載のプラスミドベクター。 ９、 プロモーターが、プラスミドのＤＮＡ配列である
特許請求の範囲第１ｒ１４記載のプラスミドベクター。 １０、 プロモーターが、ダラム陽性菌において複報
するプラスミドのＤＮＡ配列である特許請求の範囲第９
項記載のプラスミドベクター。 １１、 プロモーターが、プラスミドｐＵＢ１１０の
ＤＮＡ配列である特許請求の範囲第１０項記載のプラス
ミドベクター。 １２、 プロモーターが、バクテリオファージの［）
ＮＡ配列である特許請求の範囲第１項記載のプラスミド
ベクター。 １３、 プロモーターが、バクテリオファージφ２９
のＤＮＡ配列である特許請求の範囲第１項記載のプラス
ミドベクター。 ｉ４． ｐＴＧ４０２〜４２７、ｐ ＴＧ４３１〜４
４２及びｐＴＧφ２９ｐ１〜ｐＴＧφｐ２０から選ばれ
た特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 １５、 ｐＴＧ４０２の誘導体である特許請求の範囲
第１項記載のプラスミド。 １６、 プラスミドが、少なくとも１つの特異的制限
部位を有し、該部位は該部位におけるＤＮＡ配列の挿入
により、遺伝子ｘｙｌ Ｅの不活性化が生じるような位
置に存する特許請求の範囲第１項又は第２項記載のプラ
スミドベクター。 １７、 該特異的部位が、遺伝子ｘｙｌ Ｅ内又はそ
の上流側であって且つブＬ］モーターの下流側に存する
特許請求の範囲第１６項記載のプラスミドベクター。 １８、 特異的部位が、Ｂａ１８１部位である特許請
求の範囲第１６項又は第１７項記載のプラスミドベクタ
ー。 １９、 特許請求の範囲第１項乃至第１８項のいずれ
かに記載のプラスミドにより形質転換されたグラム陽ｌ
ｌｌ１ｍ株。 ２０、 特許請求の範囲第１９項に記載の菌株の醗酵
により得られたカテコール ２．３−オキシゲナーゼ。 ２１、 特許請求の範囲＃１１項乃至第１８項のいず
れかに記載のプラスミドを用いてグラム陽性菌内で遺伝
子をクローン化する方法。 ２２、 ＤＮＡが、カテコール ２．３−オキシゲナ
ーゼ合成をコードする遺伝子ｘｙｌ Ｅを少なくとも含
有することを特徴とするファージＭ１３゜２３、 少
なくとも１つの特異的制限部位を有し、該部位が、該部
位にＤＮＡ配列が挿入されることにより遺伝子ｘｙｌ
Ｅが不活性化されるような位置に存することを特徴とす
る特許請求の範囲第２２項記載のファージ。 ２４、 多重クローン化部位を有し、該部位が、該部
位にＤＮＡ配列が挿入されることにより遺伝子ｘｙｌ
Ｅの発現が不活性化されるような位置に存することを特
徴とする特許請求の範囲第２２項記載のファージ。 ２５、 ファージＭ１３の誘導体である特許請求の範
囲第２２項乃至第２４項のいずれかに記載のファージ。 ２６、 特許請求の範囲第２２項乃至第２４項のいず
れかに記載のファージを用いてＤＮＡをクローン化及び
配列する方法。 ２７、 カテコール ２．３−オキシゲナーゼを有効
成分とする局所投与用組成物。 ２８、 化粧品ベースを特徴とする特許請求の範囲第
２７項記載の組成物。 ２９、 アレルギーの治療及び防止用に用いられる５
− 特許請求の範囲第２７項に記載の組成物。 ３０、 カテコール ２．３−オキシゲナーゼを含有
する食品添加物。 ３１、 カテコール ２．３−オキシゲナーゼを薬理
分野において用いることによりカテコールアミンの構造
を修飾する方法。 ３２、 洗剤及び酵素カテコール ２，３−オキシゲナ
ーゼを含有する表面汚染除去用組成物。 ３３、 タンパク質分解酵素を特徴とする特許請求の
範囲第３２］１記載の組成物。 ３４、 カテコール ２，３−オキシゲナーゼが、非
病原性菌種から製造されたものである特許請求の範囲第
３２項記載の組成物。 ３５、 カテコール ２．３−オキシゲナーゼの製造
に用いられた非病原性菌種が、バチルス スブチリスで
ある特許請求の範囲第３４項記載の組成物。 ３６、 カテコール ２．３−オキシゲナーゼが、バ
チルス スブチリスの蛋白質産生菌株から製造されたも
のである特許請求の範囲第３３項記６− 載の組成物。 ３７． 酵素活性の安定化剤を含有する特許請求の範
囲第３２項に記載組成物。 ３８、 安定化剤が、アセトン、グリセロール又は他
の有機物質である特許請求の範囲第３７項記載の組成物
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8201574 | 1982-02-01 | ||
| FR8201574A FR2520753B1 (fr) | 1982-02-01 | 1982-02-01 | Nouveaux vecteurs d'expression de la catechol 2,3-oxygenase, enzymes obtenues et leurs applications |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58180499A true JPS58180499A (ja) | 1983-10-21 |
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Family Applications (1)
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| JP58016013A Pending JPS58180499A (ja) | 1982-02-01 | 1983-02-01 | カテコ−ル２，３−オキシゲナ−ゼをコ−ドする遺伝子を含有する新規発現ベクタ−、得られた該酵素及びその適用 |
Country Status (5)
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| JP (1) | JPS58180499A (ja) |
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Cited By (1)
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-
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-
1983
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- 1983-02-01 JP JP58016013A patent/JPS58180499A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6192569A (ja) * | 1984-07-27 | 1986-05-10 | ユニリ−バ− ナ−ムロ−ゼ ベンノ−トシヤ−プ | オキシドリダクタ−ゼの製造法 |
| JPH04252181A (ja) * | 1984-07-27 | 1992-09-08 | Unilever Nv | メタノールオキシダーゼの製造法 |
| JPH06292572A (ja) * | 1984-07-27 | 1994-10-21 | Unilever Nv | オキシドリダクターゼ |
| JP2575284B2 (ja) * | 1984-07-27 | 1997-01-22 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | オキシドリダクターゼをコードするｄｎａ |
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