JPS6192569A - オキシドリダクタ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発明はオキシドリダククーＬ’　ｃ、）微生物による
製造法、漂白剤および／又は洗剤組成物にこれらの酵素
全使用すること、ｔＪよびオキシドリダクタ−セおよび
任意にはジヒＩＳロキシアセトンシンターゼ酵素、およ
びハンセヌラ（Ｈｌ）・ポリモーフ了アルコールオキシ
ダーｆ”　５６よび／又はジヒＶロキシアセトンシンタ
ーゼａ面配列全コードする１）ＤＮＡ配列により形質転
換さＪまた微生物に関し、この微生物は本方法に通りに
使用できる。

面子受容体として酸素を使用するオキシドリダクタ−ぜ
は漂白組成物や洗剤組成物にｉ走用するのに適した酵紫
であり、洗（争又はｔλ白工・湿中、漂白剤例えばＨ２
ａ２　＠その枳で生成ゴるのに使用できる。９１Ｊえは
、 −ＱＢ　−ＰＳＳｉ２２２５，７１５号（コルゲート・
バルモリブ社〕、グルコースとグルコースオキシダーゼ
の混合物その他の成分Ｊｆ、乾燥扮末洗剤組成物に使用
することが記述されている。

−ＤＦｊ　−ＦＡ第２．５５７．６２３号（ヘンケル＆
シイ−社）、Ｃ１−Ｃ３アルカノールとアルカノールオ
ニＹシダーセ１、ヌはガラクトースとガラクトース・オ
キシタ゛−ゼ、又げ尿−とウラトキシダーゼお、ｒびそ
の他の成分をＰ白質を有する乾燥洗剤組成物と１て使用
することが言己述さ１ている。

−σＢ−ＦＡ第２，１０１，１６７号（ユニリーバ−社
）、Ｃ１〜Ｃ４了ルカノールとＣ１〜Ｃ，了ルカノール
オギシダーセ゛を液体ブリーチとし−て又は洗剤組＋１
．ｊとして（Ｑ・用することがＢ５述さ１ている。

上記アルカノールと酵素は、縮威物が水で稀釈するかｙ
は十分のＰ素と接触するまで、実質上の反応は呈１．伜
ｆ、ｒい。

奈まで、天然のオキシダーゼ／酵素は低コストで？４　
逆″″Ｆろことができないので、洗剤等の大規模の工芸
的用途に不向きであ・つた。更に、オキシダーゼ／酵素
は洗剤や徐白剤に使用した場合、非生理的弁件下で作用
させねばならないっさらには洗削用代物Ｖ：′使用する
のに使わとてきた天然のオキシタ゛−ゼは天然のカタラ
ーゼを伴ない、主成したパーオキサイドを殆んど直ぐに
分解するので、有効な漂白効果は得らねない。したがっ
て、製造条件下で使用１．かつ洗剤や漂白ｆ′、′１品
の使用（で一層適するオキシダーゼ／酵素の需（社）が
あろうこねらのオキシダーゼを経済的：で有利に製造す
るためＫ、細胞タン白質の２０ヂまで（ファン・ディケ
ン等、１９７６）のＨ−故りモーファのアルコールオタ
シタ゛−ゼの、ｉうｒＳ／；Ｆ、酵方法でこオ］らの酵
素の収率を−ヒげる必要があ乙。

高量の酵素産生新式役牛物を見つけろこと又は改良さね
た性質を有するＦ′ｒｍ、オキシダーゼ酵素を見出す方
法けあらゆる種類のｆ役牛物をチェックして適切なオキ
シダーゼ゛を１ｈ離すること、ついでそのパーオキサイ
ド牛成炒をチェック１．．３５造条件下および洗剤と漂
白製品の使用条件下のその安定性をチェックすることで
ある。し１つの日か適当な酵素が見つかるであろうとい
う望ノ、があ、つたが、成功は予見できず、多分非常（
て低いものてあろう。

別の方法は、これらのオキシダーゼを生成する天然の微
生物を古典峠迫伝技術により又雑する試行錯訓方法を連
用することであり、−府牛産的な微生物又は一層適切な
酵素を見出すこと全期待したが、成功はまた低かった。

高収率でおよび／又はカタラーゼの生成を伴なわずおよ
び／または貯蔵や使用中例えば漂白組成物や洗剤組成物
にて改良さねた性質を有するオキシダーゼ酵素の調製方
法の需要が明かに存在する。

試行錯・誤による問題は次の方法により克服することが
できる。すなわら、適当な条件下で微生物憂培養し、望
ましくは酵素をＯ縮し、濃縮した酵素を公知方法により
集取してオキシダーゼ酵素を製造する方法において、組
換えＤＮＡ技術により得そしてオキシダーゼ酵素を産生
じ得る微生物を使用することをコードする、方法である
。

オキシダーゼの製造法に使用するのに適する微生物は組
換えＤＮＡ技術により得ることができるが、特定の微生
物又は微生物群にて構造遺伝子の発現全調節する１梯以
上の他のＤＮＡ配列と共に、オキシダーゼをコードする
ＤＮＡ配列（所謂構造遺伝子）により微生物を形質転換
させ、当該配列を含むエピソームベクターを導入するか
あるいは微生物の染色体に組みこみ可能なりＮＡ配列を
備えた配列を含むベクターによる。

５′−および３′−制御側面頌域と共にＨ・ポリモーフ
ァ由来のアルコールオキシグーゼ（耽１゜１　、３．１
３　）をコードする構造遺伝子の決定は、本発明の範囲
を限定するものではないが、本発明の例として記述する
。本発明の精神は、グリセロールオキシダーゼ、グルコ
ースオよシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ等のその
他のオキシダーゼのＤＮＡ配列を単離すること、ＤＮＡ
配列又はその修飾を微生物のｒツムに又は微生物を形質
転換するのに使うエビソームベクターに加えることおよ
びこうして得ら第１た形質転換微生物の培養、ならびに
漂白組成にこの酵素を使用することにも適用可能である
。

使用する微生物はバチルスｂの如きバクテリアやカビも
可箭であるが、技術的かつ経済的理由から酵母を使うの
が望ましい。特に、カビ又は酵母はアスペルギルス属、
カンジダＦＡ、ゲオトリカム属、ハンセヌラバ、レンジ
ト属、ナドソニア属、ピチア属、ポリア属、ポリポラス
属、サツカロミセス属、スポロボロミセス属、トルロゾ
シス属、トリコスポロン屈およびゼンデラ属から選択で
き、特にアスペルギルス（Ａ）・ジャポニカス、Ａ・ニ
ガー、Ａ・オリゼー、カンジダ・ボイジニ、Ｈ・ポリモ
ーフ了、ピチア・パストリスおよびクロッケラ・θｐ、
　２２０１から選択することができる。

後者の名称は特にＣ・ボイジニの代りに使う。

多くの０１質化性醇母は過去１０年間単離されており、
ハンセヌラ・ポリモーフ了やカンジダ・ボ・イジニにつ
いては、メタノール代謝が広く研究されてきた（ビーン
ハイス等、１９８３）。

この代謝の′＃２１工程はメタノールがＭＯＸにより蝕
媒されて、ホルムアルデヒドとＨ２Ｏ２に酸化さねる。

ホルムアルデヒドは更にホルムアルデヒドデヒドロデナ
ーゼおよび蟻酸デヒドロゲナーゼの作用により酸化さね
る。Ｈ２Ｏ２はカタラーゼにより分解されて水と酸素に
なる。

別の形では、メタノールは細胞物質に同化さ４る。ホル
ムアルデヒドに転換後、この生成物はキシルロースモノ
リンｎｔ経路を介して炭水化物に固定さ第１る。ジヒド
ロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ　）はこの同化工
程上重要な後月をしている。

ＭＯＸ、蟻酸デヒドロケ９ナーゼ、ホルムアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼ、ＤＨＡＳおよびカタラーゼの出現は例
えば０．５チグルコースで、グルコース抑制を受ける。

しかし、ＭＯｘの合成は、これらの条件下でまだ十分に
抑制される（ロツケゞンキャンプ等、１９８４４）、Ｄ
ＨＡＳの合成とは反対に、低濃度グルコース（０，１％
）における生育により活性化される。

調節、すなわち当該ポリペプチドの遺伝子をスイッチオ
ン又はオフにする可能性が望ましい。と言うのは、必要
な時、糖蜜の如き適当な基質を選択して、バイオマスの
生産を可能にし、また必要に応じ、メタノール又はメタ
ノールと他の炭素の混合物を使って、目的のポリペプチ
ドを生産することができるからである。メタノールはや
′＞廉価な基質であるから、ポリペプチドの生産は非常
に経済的に行なうことができる。

メタノールで生育させてアルコールオキシダーセ゛（１
１１０Ｋ　）　’ｉコードする遺伝子の活性化後、太き
ｊ、Ｃミクロボディすなわらベルオキシソームが生成さ
れる。グルコース生育細胞はほんの僅かのベルオキシソ
ームを含むが、内部容量の８０係までの細胞が活性化状
態でベルオキシソームに［き換る。

メタノールがホルムアルデヒドとＨ２Ｏ２に転換しかつ
Ｈ２Ｏ２０分解はこれらのベルオキシンームにおいてお
きることが分ったが、更にホルムアルデヒドの酸化又は
同化は大概の場合、細肥質にて２きる。このプロセスは
有毒生成物の、いくつかの細胞プロセスの強力な同等活
性化の、およびこのプロセスに包含さねる少なくとも２
つの酵素の選択的トランスロケーションの区画分けの完
全な例である。

メタノール代謝に関与する殆んどの酵、索は精製かつ特
性化される（サーム、１９７７、ビストリック等、１９
８１）。竹に、メタノールオキシダーゼ（Ｅｃｌ、１，
３．１３）は詳細に研究された。

そねは約７４　ＫｃＬＯＭｒ値を有する同一モツプ−か
ら成るオクタマーでありかつｆＰ換基としてＦＡＤを含
む。今まで、分裂可能なトランスロケーションのシグナ
ル配列は検出さ十１ていない。生体内および試験管内合
成物による電気泳動研究（ロアおよびプローベル、１９
８３）又はミクロソーム膜の存在下の試験管内合成（ロ
ツケ゛ンキャンプ等、１９８４）から結論された。

活性化条件下で、２０％まての細胞タン白質がＭＯＸか
ら成る。

ハンセヌラ・ポリモーフ了ｃＢｓ　４７３２はジエイ・
ビー・ディケン博士（デルフト工業大学、オランタ′）
から入手した。細胞は３００　Ｖ；の最小培地を含有ス
る１１エルレンマイヤーフラスコにて３７°Ｃ生η゛さ
せ（ビーンノ・イス等、１９７８　）、指示通り、０．
５チ（ｖ／ｖ　）メタノール又は０．５チ（Ｖ／Ｖ　）
エタノールを補充した。ファージラムダＬ　４７．１お
よびＰ２溶原性大腸ωに１２株Ｑろ６４はビー・ファン
・デル・エルセン博士（アムステルダム大学、オランダ
）から入手し、上述通り増殖させた（ローネンおよびブ
ラマー、１９８０）。

大腸菌に１２株ＢＨＢ２６００、ＢＨＢ２６８８および
ＢＨＢ　２６９０　（ホーン、１９７９）はエム・ファ
ン・センタグ博士（ケ９ント犬学、ベルギー）から入手
したが、大ＩｌＩ！Ｉ菌に１２株、ＴＭ　１０１．７１
１８およびＭｌろ誘導Ｍ１３ｍｐ８，９．１８および１
９はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社（ケゞイサ
ーズバーグ、メリーランＦ１米国）から入手した。

ｂ）酵素 使用したすべての酵素はアマ−ジャム・インタナショナ
ル社、英国から入手したが、α−へりカーゼはファーム
・インダストリイ、フランスから入手した。酵素培養は
製造者の指示通りに行なった。　ＡＴＰ　：　ＲＮＡア
デニルトランスフェラーゼはイーブン等（１９８２）の
記述通りに精製した。

Ｃ）仙の材料 ［３５ｓｌメチオニン、〔α−３５８１ｄＡＴＰ　、　
Ｃα−３２Ｐ〕ｄＮＴＰ’　日、〔α−３２’Ｐ］ＡＴ
Ｉ’および〔γ−３２Ｐ″ｌ　ＡＴＰはアマ−シャツ・
・インタナショナル社、英国から入手した。

ニトロベンジルオキシ−メチル（ＮＢＩ・Ａ）Ｎｔｋ、
に’ｔシュラ・イア−およびジュールから入手１−１製
造者の指示通りジアゾ形（ＤＢＭ　）に転換した。

ニトロセルロースフィルター（ＨＡＴＦ型）はミリポア
から人手した。

ＲＮＡ単離、分画化および分析 ■、ポリモーフ了はメタノール又目、エタノールの存在
下中間対な段階まで生？７させに。この細胞は、１Ｑ　
ｒｎＭ　トリス−ａｃｚｐｌ（８，５ｍｈｉ　Ｍｇ　（
Ｊ２．１　’ｌｂ　Ｎａ　Ｃ１％　６多バラ−アミノサ
リチル酸、１％ドデシル硫酸すトリウム（Ｓｎ２　）お
よび５饅フエノール含有バツフアーにて、１６．０００
　ｐｓｉのフレンチプレスで１．・１つ返えし加圧して
破砕し１こ。ポリアデニール化ｂｎへ〇精製は上述通り
（イーブン等、１９８２）、続いて行なった。１７細胞
から４＝２の全ＲＮＡど０．１１ｆｆ７ポリアデニ一ル
什ｇｌＪＡを得た。

全ＲＮΔ又はポリアデニール化ＲＮＡの４μｐ試料は□
ＡＴＦ　：　ＲＮＡアデニルトランスフェラーゼおよび
〔α−”２Ｆ’）　ＡＴＰでそのダー末端をラベルし、
ついで７Ｍ尿鍬含有２．５係ポリアクリルアミドゲルで
分別した（イーブン等、１９８２）。特異的ｍＲｔｌＡ
フラクションの分御単１什については、４０μｇポリ７
デニール化ＲＮＡな・ラベルしｒ、−、ｉリアデニール
化ＲＮＡ４μｇと混合し、変性ポリアクリルアミドデル
で分別しＴ二。放射性２．Ａ　Ｋｂ　ＦｔＮＡクラスな
ゲルスライスから溶灯し、ついで２０℃８Ｗ６０ロータ
ーを使ってベックマン遠心分離機にて２４．０００　ｒ
ｅｖ　７分で１５時間、１　［１［１ｍＭ　ＮａＣＪ！
。

１　０　ｍＭ　　）　　リス−ＨＣＪ’、ＰＨ７，５、
ｌ　　ｍＭＥＤＴＡすｄよび０．１％ＳＤＳ　＆ζて５
−３０％グリ七ロ〜ル勾配で遠心分離して不純物を除い
た。放射性フラクションを集め、エタノールで沈澱させ
た。、ポリアデニール化ＲＮＡはプリカーサ−として［
３５Ｂ］メチオニンを使い、ペルハムとジャクソン（１
９７６）により、ウサギ網赤血゛球すセート中試験管内
にて翻訳させた。翻訳音物はバレリオ等（１９８３）に
記述さ幻たＵＯＸ抗血消で免疫沈降させた。

ｃＤＮＡｌに合成 ポリ°アクリルアミドゲルから抛ｌｌシたＲＮＡフラク
ション／３は逆転写酵素て放射性ｃＤＮＡを旬るために
使用した（イーブン等、１９８２）。高放射活性（３，
００ｎ　Ｃ１／ｉＭ以上）の〔α−３２Ｐ〕ｄＡＴＰお
よび〔α−”）　ｄｃ！ＴＴ　ｆ　便ッテ、６４分子介
ｃＤｔｌＡ　２００００　Ｃｐｍをヒト胎盤リボヌクレ
アーゼインヒーターの存在下４２℃で１時間生成−させ
た。

Ｄｋｒｋ単雅 １単離の１１．ホリモーファ細胞を１Ｍソルビトールで
洗い、１００＃１６１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭＫ
ＤＴＡ　、および１００　、、ｙ、クエン［ｐ）＋５．
８にて再＠濁させ、それ（で１００μｌＩ−メルカプト
エタノールを加えｒ二。細胞ｋ　５００　ｒｉｑα−ヘ
リカーゼで３０’Ｃ／１時間培ｉＬ７てスフェロプラス
ト化した。スフェロプラストはツルバール ーにて４，０　０　０　ｒｅｖ　７分で遠Ｉｕ分離して
集め、Ａ　Ｑ　７ｎｉ；　’ｌ　Ｏ　ｍＭ　）リス−Ｈ
ＣＪｐｌ（３、５　Ｑ　ｍＭ　ＥＤＴＡに再瞳ｅ８させ
、２．５≠ＳＤＳ　’ｆ加えて分解した。不完全に分解
した細胞はツルバール５ｓ３４０−ターにて２０．００
０　ｒｅｖ　７分で６０分間ペレット化し、そしてＤＮ
Ａは６０　Ｔｉローターを使ってペックマン遠心機中３
５，０００　ｒｅｖ／分で４８時間Ｃ３Ｃｉ−臭化エチ
ジウム密度勾配を使って遠心分閏Ｅして粘稠な上澄液か
ら単離した。２　ｍｙのＤＮＡは平均長さ３　Ｑ　Ｋｂ
で単離した。

ファージラムダＬ　４７．１　Ｋおけるクローンバンク
の、、ＩＩ、ｌ　？’： １５０μ９Ｈ，ポリモーフ了ＤＮＡを部分的に８ａｕ３
ＡＩで消化し、５ｗ２５０−ター中２３．０００ｒｅｖ
　７分で２２時間１Ｍ　Ｎａ　０４％　２０　ｍＭ）リ
ス−Ｈｃｔ、　＠４８および５　ｍＭ　ＥＤＴＡにて１
０−、ｌｌ［］％シヨ糖勾配で沈降させた。勾配物を分
画化し、フラクション試料はＴＢｌｆｌバッファー（８
９ｍＭトリス、８９ｍ１４ホウ酸、２．５　ｍＭ　ＫＤ
ＴＡ　）中０．６１７ガロースケ１ルで分別した。

５−２０　ＫｂのＤＮＡＪ−含むフラクションを集め、
ＤＮＡはエタノールで沈澱させた。ファージラムダＬ　
４７．１を生育し、そのＤＮＡはり−デ♂ア一等（１９
ＢＡ　）の記述により単離し１こ。そのＤＩＪ八をＢａ
ｍ）ＩＩで消イ〔シ、アームは−Ｅニアテイヌ４（１９
８２）の記述によりｊ３’ｔ’　；状カリウム勾自己で
遠心分離して厚ｆ、Ｉトシた。こうしてイ４ｔらｔまた
２μｙフアージラムダＤＮＡアームと０．５　ｌ１９　
Ｓａｕ　３　ＡＩ消化Ｈ，ｄ、リモーファＤＮＡ　ｆ連
結し、ホーン（１９７９）のフロトコールケ１史って試
験管同でパッケージした。ファージはｌ　４ａｎ”Ｔ　
）すＩ；！１当つ２０．０００　ｐ魚のプラーク密度ま
で大腸百扶Ｑ、　３６４にプレートした。プラークはニ
トロセルロースフィルター（ベントンとディビス、１９
７７）にプロットし、そのプロットは上記のように単［
・升した放射性ｃＤＮＡプローブとハイブリッドさせた
。ハイブリツー条件はリープボアー等（１９８４）ｉ−
こｄ己軌と１司じてあり、ハイブリッドするプラークは
オートラジメ′グラフィＶこより検出しプこ。

メメノールで生育させプこＨ．ポリモーフア細胞を超廿
波により分解し、細胞片は遠心分１１１Ｌにより除いた
。ＭＯＸ含有タン白質フラクションは（ＮＨ，）２８０
．沈澱により単離した（４０−６０％飽和）。沈θ物を
透析後、ＭＯＸはイオン変換クロマトグラフィ（ＤＦＪ
Ｅ−セフ了ロース）およびゲル濾過（セフアクリンＳ−
４００）によりカタラーゼその他のタン白質から分別し
た。ＭＯＸに対する抗体は完全および不完全フロインド
アジュバント（ディツユ、米国）を使う常法によりウサ
ギにて生成させた。過ｔＬｍで処理したアルコールオキ
シダーゼの配列分析はペックマンのシークエネーターで
行なった。残渣の同定は１（ＰＬＣ！で行なった。

アミノ酸組成は標準法を使い、ニンヒドリンで染色させ
工、クロマスペックアナライず−（ランク、ヒルガー、
英国）で測定した。カルボキシ末端アミノ酸はアンブラ
ー（１９７２）の記述により測定した。

デオキシオリゴヌクレオチドの化学合成デオキシオリゴ
ヌクレオチドはホスファイト技術（マツチュシとカルー
サブ、１９８１）を使って、バイオサーチＳＡＭエジー
ンマシーンで合成した。そ４をＴＢＥ中１６チ又は２０
％ポリアクリル了ミドデルで精製した。

デオキシオリゴヌクレオチＦプローブとのハイブリッド デオキシオリゴヌクレオチドをＴ、−＝リスクレオチド
キナーゼおよび〔γ−３２Ｐ″ｌ　ＡＴＰでラベルした
。得られたＭＯ！クローンのＤＮＡは各日制限酵素で消
化し、１チアガロースゲルで分別し、ＤＢＭ紙にプロッ
トした１、ハイブリッド化はウオレース＊（１９８１）
の記述により行なった。

ＤトＡ配列分析 完全Ｍｏｌ遺伝子を含むクローン４（例１参照）から、
い（つかのサブクローンを標９！−技術により、）了−
ジＭ　１３　ｍｐ　−３、−９又はＭ１３ｍｐ−１８、
−１９誘導物にて作った。２つのオリエンテーションで
クローンした小さいサブクローン（０，５Ｋｂ未満）は
両側から直接シーフェンスした。

２つのオリエンテーションでクローンした大キなサブク
ローンから、エクソヌクレアーゼＢａｌ　３　ｉ消化法
（第１図参が）により配列データを得た。

両クローン化オリエンテーションの各々について、ＲＦ
Ｍ　ｌ　３　ＤＮＡは、望ましくはインサートの中心で
のみｌＡ解する匍°限醇素で消化する。続いて、クロー
ンの両オリエンテーションをこのユニークな８位で切断
し、各種時間間隔でエクソヌクレアーゼＢａｌ　３１で
消イヒした。約１００−１５０ヌクレオチドが各間隔で
除かねるように、培養時間と条件を這んだ。ついで、配
列反応がＭ１３誘導物にてプライムする位置近＜（（あ
る制限部位を認識する制限酵素で各フラクションを消化
した。Ｔ４−ポリメラーゼおよびすベニのｄＮＴＰ’ｓ
で培養して平１−１７末端とし、全ミックス１に＃Ｊ釈
条件下で連結して、内部Ｒ７分子の形成させる。全連結
ミックスは大腸菌株、ＴＭｌｏｌ−７１１８に形質転換
させるのに使つプこ。各時間間隔から、いくつかのプラ
ークを捨い出し、サンガーのシーケンスプロトコール（
ビギン等、１９８３）の最近記述された変法を使って配
列決定しｔｏ 栄Ｖ要求変異体の中離 ＸＪｗＵ−１（ＯＢＳ　７１７１　）はβ−イソプロｔ
ルマレートデヒドロデナーゼ活性を欠りＨ．ポリモーフ
ア株ＮＣＹＣ４９５の栄養要求体でキ・る。この変異株
の単離はグリースン％　（１９８４）　Ｋより記ｊ依さ
第１た。

ＬＲ９（ａｓｓ　７１７２　）はオロチジン５′−デカ
ルボキシラーゼ活性を欠く、Ｈ，ポリモーフ了ＡＴｃｃ
　３４　ｄろ８の栄！要求林である７単離のために、こ
の酵母の最適主育温肢である３７°Ｃの代りに、３０”
Ｃで全操作を行なった２酵母細胞は３俤エチルメタンス
ルホネートで２時間突然変異させた（フィフク、１９７
０）。反応は６％チオ硫酸ナトリウム（最終り７１度）
で止め、溶成を更に１０分培養した。突然変異細胞を一
度Ｈ２０で洗い、分離のため妬ウラシルを補給したＹＥ
Ｉ’Ｄ又はＹＮβで２日培養し、ウラシル−栄養要求体
を増やし、ついで命素源のないＭＭで１５時間培養を行
なった。最後に、１０μｌ抗主物質／ｒｎ乙の濃度を含
むＭＭ　Ｋて１２時間ナイスクチン強化を行なった。処
理した細胞は２００μｇウラシル／ｍ／、および０．８
　ｍｔｉ　５−フロロオロチン酸を含むＹｔｌＢプレー
トで培養した（ボーク等、１９８４）。

通當１０６細胞ｆ：単一プレートで培養した。培養６日
後に酊じＦコロニーを取り出し、レプリカをＹｔ、ＩＢ
ｆレートで２７Ｓ！ｌ’培養して栄ｆ要求株を桐立させ
た。栄ｄ要求変異株から、１．１　ｒａ−細胞を単離し
たう別法と１−て、１．５Ｘ１０６酵母細胞は、２００
４ウラシルと０．８ｍり５−７０ロオロチン酩を補給し
たＹＮＢ計休培体１　ｍＡにて培養させた。２日間の培
善後、処理＃Ｊ’！　ｑｇ　ｉウラクル含有ＹｂＨ１３
で平板培養し、レプリカは２度ＹＮＢで平板培尼し１、
上記の通り分析シた。このような耐性変異株はサツカロ
ミセス・）・レビシエのＵＦｔＡ　５又はＵｒｌＡ　５
座に影０を与えたウラシル要求株であることが分った（
エフ・ラフルート、私信）。試験したＨ１迅１１モーフ
ァの約６００耐住コづニーの内、５２がウラシル表現型
を示した。Ｓ、セレビシェのＵＲＡ　３とＵＲＡ　５変
異はオｏ７−ジン５′−デカルボキシラーゼとオロチジ
ン５′−リン重塔ピロホスホリラーゼをそｆｌぞね欠く
（ジョーンズとフィフク、１９８２）から、Ｈ，ｆ、’
リモーフ了の生成ウラシル栄養要求株は両方の酵素活性
について調べた（リーベルマン等、１９５５）。２つの
酵素のいす灼かに影響を与えた変異株が見つかつ？−（
表１）１．そ七らをそねぞＦ１０ｄｃ］、とｏｌ）ｐｌ
−変異株と名付けた。Ｏ，ｄｃｌ変）′！株は低復帰領
嫂を示１．（表ｉ　）　、４ｆ３補により形質転換の目
的のために適している。

Ｈ，ポリモー７７由来の自律＋＋稈製配列（ＨＡ［（Ｓ
　）のＩｕにｔ Ｈ１？リモーフ了由来の染色体ＤＮＡを８ａｌ　ｌ又は
Ｂａｍ　）（Ｉで一剖消什し、相みこみ≠ラスミドＹＩ
ｐ５の単一８８１１と１３ａｍ日工部位にそわそわ連結
させた。大腸菌４９０をアンビシリン耐性に形質転換す
るために、この連結混合物を使用した。

Ｙ工ｐ５は選択マーカーとしてＴＪＲＡろ遺伝子を含む
組みこみテラスミＦである（スチンチコーム等、１９８
０）。

Ｈ，ポリモーフ了Ｆｌａｇ　Ｘクローンのプラスミドゲ
ールはＨ，Ｆ？Ｃリモーファ　変異株ＩＪ　９を形質転
換するの１（使用した、全体に２７の形り転換体を得、
β−ラクタマーゼ試験で陽性であった。こ七らのすべて
から、大腸菌４９０を酵母ばニリセートと共（（ｊｌり
貿転換ｆ麦１ラスミドを回収ｌ−た。テラスミドの：Ｌ
ｌｊ　田分析によ４１は、殆んど（リインサート？まＰ
Ｉしパターンな示した。ぞオｌぞれ０．４とｏ−６Ｋｂ
のインサートな君む、２つの異なつ１こプラスミド。

ｐ晶１（Ｓ　１とｐ　ＨＡＲＳ　２は更に研究用に１史
月した（第２図）。ボ゛リエナレングリコールで処理し
た完全の細胞の形質転換操作に使って、Ｄ１１Δ１μＩ
当り約５００−１．５ｉ］０の形質転換体の類跣で、両
プラスミドはＨ４１リモ一フア変異株ＬＰ　９を形質転
換させる。大ル）菌プラスミド処方物から回収したｐＨ
ＡＦＬ３１とｐ）ｌＡＬＩＥ３２で（（ゴ形買転換段１
１．ポリモーファ形ｙ・仁換体のすず一ン分析は予期し
た７′ラスミドハンドを示し、ウラシルテロトロフィの
原因とし又、ＵＲＡ　３遺伝子の組みこみを排除−［る
。したがって、ΔＲ３ｉ様１（Ａｎｓ配列（ステンチコ
ーム’、’Ｊ、　　１９８２　）はＨ１止りモーフ了の
自律的復製４行な５ど結論ずろ。ＨＡＲＥ　ｉもＨＡＲ
Ｅ　２もＳ、セ１、・″ビシニでは自・津的Ｇ製はでき
な７Ｊ１−フＴこ２゜ＨＡＲ８１は第６図に示すように
、完全に配列を決πさＪまた。

Ｈ．ポリモーフアにおけるプラスミドコピー数の評価 ＡＦＩＳ配列又はＨＡＲ８配列によりＨ，ポ′リモーフ
ァに自律的復製を与えるシラスミドのコピーむけササ・
ンプロット分析により評価した（第４図）。比較のため
に、５〜１０個のコピー斂／細胞（ストルール等、１９
７９　）１に有するＳ、セレビシェのプラスミ）”ＹＲ
Ｐ１７（第４図、レーン６．７）および細胞当り約ろ０
−５０のコピーを有するＳ、セレビシェの高コピーむプ
ラスｉ　１’　ｐＲＢ　５８（第４図、レーン４．５）
を使った。ＹＲＰ　１７はＵＲＡ　３−含有酵母プラス
ミドであり、ＡＲ８配列（ステンチコーム等、１９８２
）を有するが、ｐＲＢ　５８はＵＲＡ　３遺伝子を含有
する２ＰＬ誘導体である（カールソンとホトスタイン、
１９８２）。

ｐＢＲｐＢＲ３２２の２つの絹みこみコピーを有するク
ルイベロミセス・ラクチス形質転換体はコントロールと
して使用した（第４図、レーン２．６）。

オートラジオダラムの染色度が示すところでは、Ｈ．ポ
リモーフアのプラスミドＹＲＰ　ｉ　７はＳ、セレビシ
ェのコピー数と実質的に同じであるが、ｔラスミドｐＨ
ＡＲ−１とｐＨＡＲ８−２はＳ、セレビシェのｐＢＲ５
８のように細胞当り約ろ０−４０のコピー範囲であるコ
ピー数金示す。このことはＨＡＲ８配列の自律的に復製
する性質を再度証明するものである。

形質転換操作 いくつかのゾロトコールを使用した。

ａ）　　Ｈ．ポリモーフア株ＩＪＵ　−１はベッグズ（
１９７８）の方法を使って形質転換させた。

菌株は激しく空気金おくり乍ら３７℃０，０．５の（１
１）６ｏｏまで５［］［］ｌ−！ＢＰＤ液体培地ニ生液
体培地純生を採り、２０　”蒸留水で洗い、２０ｍ１の
１．２Ｍソルビトール、２５　ｍＭ　ＩＤＴＡ　ｐＨＢ
ｏｇ、１５　Ｑ　ｍＭ　ＤＴＴ　ＶＣ再懸濁させ、室温
で１５分培養した。細胞を遠心分離により集め、２０１
１．２Ｍソルビトール、Ｑ、Ｑ　１Ｍ　ＥＤＴＡ、　　
Ｑ、Ｉ　Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５，８および２％Ｖ
／Ｖβ−グルクロンダーゼ溶液（シグマ１５０００００
ユニット／ｍｅ）にとり、３７℃で１０５分培養した。

１時間後、β−グルクロニダーゼの最終濃度を４チＶ／
Ｖにした。形質転換のために、テロドプラスト３　ｍ／
、　ｆ　７　ｅｅｌの氷冷１．２Ｍソルビトール、１１
０ｎ１Ｉトリス−）Ｉ　ＣＬｐＨ７Ｋ添加シタ。

テロドプラストを２０００　ｒｐｍで５分間遠心分離に
より採取し、水冷ソルビトールバッフ了−で６度洗った
。洗った細胞を氷上０．２　、ｑｔ／、　１．２Ｍ７　
ｈ　ｅ　）　−Ａ、、１０ｍＭ０ａＣ！２．１０　ｍＭ
　）リス−ＨＣｊｐ）＋７に再懸濁さセｆ、−０２４（
Ｄ　ＹｇＰ　１３ＤＮＡ−８，セレビシェのＬＥＵ　２
Ｊ伝子および２ミクロン−０ｒ１（ブローチ等、１９７
９）から成る自律的復製Ｓ、セレビシェプラスミド−を
細胞１００ｍ１に加え、室温で培養した。２０チＰＥＧ
　４００．１０　ｍＭ　Ｃａ　Ｃｌ３．１０　ｍＭ　）
　リスー塙酸ｐｌ−ｉ　’７．５の溶液０．５厩を加え
、全体の混合物を室温で２分間培養した。細胞を短時間
（５秒）遠心分離で高速度にセットしたＭＳＧマイクロ
フエーシニ集め、Ｑ、１ｒｎ／　ＹＥＰＤ　１．’ｌ　
ＭンルビトールＰＩ″１７．０に再懸濁させ、室温で１
５分培養した。

細胞は、２％ディフコ寒天、２チダルコース、０．６７
％ディフコ酵母窒素塩基およびＬ−アデニンヘミサルフ
ェート、メチオニン、ウラシル、ヒスチジン、トリシト
ファン、リジンおよび１．２ｔＡソルビトールの各々を
２０ｍ９／ｌ含有するプレート；て拡げて表面に直接培
生した。Ｌｅｖ”形質＋５換休は６７°０で５日培養し
た後、５０コロニー／μ、５ＪＤＮＡの頻度で生じたが
、ＤＮＡを添加し７ない場合は形質転換体は牛じない。

ｂ）別法として、Ｈ，ポリモーフ了Ｌ！！：Ｕ　−１を
ダス等（１９８４）の方法を使って、ｙＦＸｐ　１３で
形質転換させた。指峨的に生育する細胞を０．４の（１
１）６００まで生育させ、ＴＥバッファー（５０ｍＭト
リス−）Ｉ　ＣＪ！　ｐＩ４８．０、ｉ　ＩｌｎＭｇＤ
ＴＡ　）にて洗い、２　Ｑ　ｖｒｌ　ＴＥバッファーに
再ｇ濁させた。０．５ｄ細胞を６０℃で１時間０．５屯
０．２　Ｍ　Ｌｉ（Ｊで培養しＴこ。こｔｌらの細胞ｉ
ｏｏｍｚに、２Ｑ　ｍｌ　’Ｉ’ｍバッファー中４μ、
９ＹＢＩＰ１３を加え、その試料を更（・ζろ０分間３
０°Ｃで培養した。等容量の７０％ｖ／ｖ　Ｐ鴇Ａ　Ｑ
　Ｑ　Ｑを加え、混合物を５０°Ｃで１時間培養し、続
いて４２℃で５分間培養した。

１Ｎの水を加えた後、細胞を上記ａ）のように短時間遠
心分離で隼め、２度水で洗い、ｏ、１ｎｖｓＹＥＰＤ　
１．２　Ｍンルビトールに再懸／蜀させ、空温で１５分
培養した。細胞は上記の通り平板培養した。Ｌｅｕ＋形
質転換体はろ０／μｇＤｔｌＡの頻度で生じる。

ｃ）　　Ｈ，ポリそ一ファＵＲΔ変ｙ株ＴＪＲ９は逆折
１・−カーとしてＳ、セレビシェのＵＲＡ　３遺伝子お
よびＳ、セレビシェの自律的復鯉配列＜　／１−Ｒ８）
　ｙ２含むプラスミド、ＹＲＰｉ７で形質転換させた（
ステイチコーム等、１９８２）っペッグズ（１９７Ｂ）
のプロトプラスト方法を使って、２−５形質転換体／μ
ｇ　ＤＮＡを得た。イト−等（１９８３）のＬ　ｉ８０
　、を使って、この数を１５−２０形質転換体／μ、９
’　ＤＮＡまで拡げた。しかし、最良の方法は、ｐｇｏ
７１０００で処理した完全細胞を使う、クレペ等（１９
８３）の方法であった。３００までの形質ｉＦ５換体が
ＤＮＡ　４　当り間らねた。Ｌ　ｉ８０４法ならびにク
レベ法は６７°Ｃで行なった。

ベクターの自律的復製によるＨ、ポリモーフ了の形質転
換には２つの特長がある：（１）ウラシル１表現型の不
安定性。形質転換体’ｉ　ＹＫＦＤで１０世代生育させ
た後、９９％以上が選択培地で生育する能力を失なった
（表■）。（２）自律的復製は大腸菌を酵母ミニリセー
トで形質転換しかつＨ，ポリモーフ了の再形質転換によ
り更に確かめら七た。

続くサザン分析により、期待したプラスミＦの存在を示
した。

Ｈ，ポリモーフ了ＬＲ９はｐＲ８５８で又はｐＩ（Ｉ（
８５で形質転換することができず、全２ミクロン環状Ｄ
ＮＡ（ホレンバーグ、１９８２）をプラスミドＹ工Ｐ５
のアンピシリン遺伝子のＦａｔ工部位に挿入して構築さ
れる。）ＩＡＲ８１又はＩ（ＡＲ８２のＤＮＡ配列ヲ含
むＹ工Ｐ５はクレベのプロトコールを使って、ＤＮＡμ
Ｉ当り５００−１５００の形質転換体の頻度でＨ，ポリ
モーフ了ＬＲ９に移した。したがって、形’ＩＱ転換頻
度は、６．セレビシェのＹＲＰ１７におけろ異種ｔ７’
ｊ造ＡＲ８ｉを使う、上記よりも２−５倍高い。同様に
、形質転換体中のＨＡＲＳプラスミドの安定性はＡＲ８
ｌ　ｆラスミドより僅かに冒い（表Ｍ）。

Ｓ、セレビシェのＵＲＡ　３遺伝子は、Ｈ，承りモーフ
ァの染色体ＤＮＡに対しニック翻訳したＹエル５７’ラ
スミドＤＮＡのサザンハイブリッドにより示されるよう
に、Ｈ，ポリモーフ了のＯＤＱ遺伝子に対し類似性を示
さない。したがって、Ｈ，ポリモー７アデノムのランダ
ム部位へのＵＲＡ　３遺伝子の低頻度組み込みを予期し
なければならなかった。変異　一体Ｌ＋Ｒ９を組みこみ
ベクターＹ工ｐ５で形質転換すると、永すエチレングリ
コール法を使うＹＮＢプレートでは３０−４０コロニー
／μｌ　ＤＮＡＩＡとなったが、Ｓ、セレビシェ変異体
ＹＩＪＩ！＋　２７の形質転換のためにＹＩｐ　５を使
う対照実験では形質転換体は得られなかった。３８個の
形質転換体の分析では、非選択的培地で生育させた後、
４つの安定な川み込み体を示した。組みこみについては
更にすずン分析（第５図）により証明した。

ＵＲＡ　３遺伝子ヲＨ，ポリモーフ了の染色体ＤＮＡに
組みこむ第２の操作は、プラスミドｐａＡＲｓ　１を有
する形質転換体から安定なＴＩＴｒａ＋形質転換体を増
やして行なった。形質転換体はｍｌ当り１０９細胞密度
まで液体ＹＥＰＤ中で生育させた。５　Ｘ　１０６細胞
を含む試料を使って、新しい培地１００１ＶＣ接λ卓し
５、そしてｍ／当り１０９の細胞密度まで生育させた。

約１００世代になるまでこの操作を繰り返えした。久異
株１．＋Ｒ９の復帰率（ｒｅｎθｒｓｉｏｎｒａｔｅ　
）は２　Ｘ　１０−”でありかつ１０世代当りのプラス
ミドロス用度はｐＨＡＲ８１形質転換体で９７％である
から、１００世代後のＴＪｒａ＋細胞の主部分は組みこ
み体であるべきである。試験した（ｌｒａ＋ゴロニーは
１．ＵＲＡ３遺伝子の組み・ごみを示す安定ブエＴｅｒ
ａ＋表現型を維持することを示した。このことは更にサ
ザンプロット分析により確認された。

更に、和みこみ頻度は５　Ｋ　１０−６であることをこ
れらのテゝ−夕は示している。

例　　１ ハンセヌラ、ポリモーファ由来のアルコールオキシダー
ゼ（ｙｏｘ　）の遺伝子のクローニングメタノールで生
育させた細胞から単離した、全体のＲＮＡとポリアデニ
ール化ＲＮＡはその３′−末端で、ＡＴＰ　：　ＲＮＡ
アデニルトランスフエラーセ９でラベルし、変性ポリア
クリルアミドチルで分別した（第６図）。ｒＲＮＡは別
にして、２群のＲＮＡはそれぞれ長さ１Ｋｂと２．３　
Ｋｂで、ポリアデニール化ＲＮＡレーンにみられる。こ
れらのＲＮＡ群はエタノール生育細胞のポリアデニール
化ＲＮＡにみられない（結果は示してない）から、メタ
ノールで生育させて活性化した遺伝子の転写であること
は明らかである。２．３　Ｋｔ）群は非翻訳配列の長さ
により、７００から８００のアミノ酸のタン白質をコー
−しうる。同様に、１Ｋｂ群は２５０〜３００アミノ酸
のタン白質をコードする。メタノールで生育させて活性
化されかつ７００−８００のアミノ酸鎖を有する酵素は
大概ｙｔｏｘ　（カドー寺、１９７６；ロアとブローベ
ル、１９８３）とＤＨＡＳ　（ビストリック等、１９８
１）である。２５０〜３００アミノ酸範囲における活性
化酵素は多分ホルムアルデヒドと蟻酸デヒドロゲナーゼ
（シュツテ等、１９７６）である。ポリアデニール化Ｒ
ＮＡは網赤血球細胞のない翻訳系における試′験管内翻
訳により更に特徴づけられた。２μｌのポリアデニール
化ＲＮＡ指向タン白混合物を１０　ｔｒｙ　８ＤＳポＩ
ノアク１ノル了ミドデルで直接分別し、一方残りの１８
μｅはＭＯＸに対する抗血清で免疫沈降させた（第７図
）。

夫々７８　Ｋｄ、　７４　Ｋｄ、　５８Ｋｄ、　１２Ｋ
ｄ。

“　　３９　Ｋｄおよび３６ｘａの分子量を有する６つ
の強いバンドが全体のタン白混合物で優位を占めて℃・
る。木質的に、同一分子量はメタノール生育Ｍ１ボリモ
ーファ細胞由来の全体の細胞抽出物にお℃・て、ロアと
ブローベル（１９８３）により見出された。

７　ｄ　Ｋｄメタン質は取敢えずＭＯＸの七ツマ−に、
５　Ｆ３　Ｋｄメタン質はカタラーゼのモノマーに、そ
して３９　Ｋｄと３６Ｋｄのタン白質は夫々ホルムアル
デヒドデヒドロゲナーゼと蟻酸デヒドロゲナーゼのモノ
マーに当てろことができる。７８Ｋｄ　ｄ７リペプチド
は多分ＤＨＡＳであり１，７１２　Ｋｄポリペプチドは
未同定のま〜である。免疫−沈降後、両方の高分子量タ
ン白質はＭＯＸ抗血清と反応する。

メタノールで生育させて誘導した２、３　Ｋ１−ｍＲＮ
Ａ群は明かに少なくとも２つのポリペブチ−をコーＰす
るが、ハイブリッド化によるＨ、ポリモーフアクローン
パンクをスクリーニングするのに良好な候補と思えた。

部分的に５ａｎ３ＡＩ消化Ｈ，ポリモーフ了ＤＮＡの５
〜２０　ＫｂフラクションはファージラムダＬ４７．１
でクローンした。

インサー）　ＤＮＡ８ｇ当り、３０肌［１［１［＋プラ
ークが得られたが、背景は１：１０［］０未詣であった
。約２０，０００のプラークを含む２つのベントンディ
ビスプロットはｍＲＮＡ誘導ｃＤＮＡフ０ローブの１５
＋０００　ｃｐｍとノ・イブリッドした。オートラジオ
グラフ３週間後、約４０〜５０のＩ・イブリッド性プラ
ークが検出できた。すべてのプラークを取り出し、５つ
を低密度で平板培養しそしてｃ　ＤＮＡプローブで第２
のハイブリッド化により精製した。

４つから、単一ハイブリッドプラーク（１，３゜４、　
５　）　ＤＮＡを単離した。インサートの長さは８〜１
３Ｋｂであった。

精製ＭＯＸのアミン末端の３０アミノ酸の配列を測定し
た（第８図）。Ｓ、セレビシェの最も豊富なコドンを使
って、１４塩基ハ配列をこのタン白配列の部分から誘導
できた。不明確は唯一つである。第４図に示した両グロ
ーブを合成した。両プローブには、ＥｃｏＲ工部位が存
在する。ＤＢＭプロットは制限酵素ＢａｎＨ工、Ｅｃｏ
Ｒ工／Ｈ１ｎｄエエエ、Ｍｉｎｄエエエ／Ｓａｌ工およ
びＰｅｔ工／Ｓａｄ工で消化したＭＯＸクローンのＤＮ
Ａから作り、１．５％アガロースデルで分別した。この
プロットを放射線ラベルしたプローブの混合物とハイブ
リッドした後、クローン１、ｌおよび５はハイブリッド
［５たが、クローン３はしなかった。第９図のＨ１ｎｄ
エエエ／Ｓａｌニブロットに示す。しかし、このプロー
ブはこれらのクローンのＥｃｏＲ工／Ｈ１ｎｄエエエ消
化ＤＮＡとハイブリッドしなかった（結果示さず）　、
　ＥｃｏＲＩ部位はプローブに存在するから、クローン
中のハイプリツＰ性ＤＮＡはこの酵素によっても切断さ
れよう。結局、ハイブリッド化オーバラツゾは非常に小
さくなったので、安定なハイブリッドを生成しない。

制限酵素消化物を比較しかつ交差ハイブリッド化実験に
より、クローン１．４および５は同一のＤＮＡストレッ
チをカバーした。

このクローン化ＤＮＡのストレッチの性質を明確に樹立
するために、クローン４のインサートを詳細に分析した
。アミノ末端プローブとのハイブリッド化によれば、完
全ＭＯＸ遺伝子（約２Ｋｂ）が存在し、２　Ｋｂ配列上
流と３．５に、ｂ下流を含む（第１０図）ことを示した
。

最小のＥｃｏＲＩ断片のＤＮＡ配列分析は、アミノ酸配
列分析により測定した様に、ＭＯＸのアミノ末端に相当
するヌクレオチド配列を明らかにした。

配列分析について、いくつかの断片を第１０図に示すよ
うに、２つのオリエンテーションで夫々Ｍ　１３　ｍｐ
　８　／　Ｍ　１３　ｍｐ　９又は１３ｍｐ１８／Ｍ１
３ｍｐ１９にてサブクローンした００．５に１）より小
さいクローンは両側から直接シーケンスした。

より大きいクローンはクローン化断片の中央に位置する
ユニークな制限部位で切断し、「材料と方法」に記述し
たエクソヌクレアーゼＢａｌ　３１　消化サブクローン
を生成した。特異的オリゴヌクレオチ「ゾライマーを使
って、サブクローン化忙使う制限部位周囲の配列および
明白な配列測定のできない配列は、全配列をカバーする
５、５　Ｋｂ　ＢａｍＨＩ／Ｓａｃエサブクローンを使
って、もう一度シーケンスした。完全なヌクレオチド配
列はｇｉｔＡと１１Ｂ図に示す。

この配列は６６４アミノ酸のタン白質をコードしうる２
０４６ヌクレオチドの開口読み取り枠を含む。開口読み
取り枠の最後のコドンはＰｈｅをコードし、精製Ｍｏｘ
のカルボキシ末端と一致している。このタン白質をコー
ドするＤＮＡ配列由来のアミノ酸組成およびＴＩＥ　Ｂ
’Ｊ　ＭＯＸのアミノ酸組成は事実上同一である（表■
）。唯一の重要な差異はセリンとスレオニン残基を含む
ことであり、それらは周知通り測定するのが難しい。

タン白質の計算分子量は７　、！１，０５０ドルトンで
あり、ＭＯｘの７４　Ｋｄの分子量とよく一致する（ポ
リアクリルアミｌ＆／５Ｄｓｐルで測定）。

表■には、ＭＯＸのコドン使用頻度が示されている。選
択的叡のコドンを使う傾向が明らかである。

例　　２ プラスミド、ｐＵＲ３１０５の構築、それにより抗生物
質Ｇ４１８に耐性を示すネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼをコードする遺伝子がＭＯＸレギユロンの管理
下で染色体ＭＯＸ　ｉｆｆ伝子に組みこむ。

プラスミドＹＥＰ　１３、ＹＲＰ　１７、ｐＨＡＲ８１
又はｐＨＡＲ８２で形質転換したＨ１ポリモーファ細胞
は不安定でかつ非選択的条件下生育１０世代後既にその
ｌｅｕ＋又はｕｒａ＋表現型を失なった。安定な形質転
換体を得るためかつＭＯＸプロモーターを試験するため
に、プラスミドｐＵＲ３１Ｄ　５が構築するカ、ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯＲ）は
λ（ＯＸレギユロンの直接管理下になる。ＮＥＯＦ′遺
伝子の最初のＡＴＧがＭＯＸレギュロンノ１．５ｘｂに
結合するように、構築される。このような大きなレギユ
ロン断片のクローニングは必要であり、レギユロンの一
１０００領域を含まない短かい断片は余り有効でないか
らである。

ＮＫＯＲ遺伝子は、最初のＡＴＧの下流３５ｂｐからＴ
ＯＡ翻訳停止コドン下流２４０ｂｐまでに位置するトラ
ンスポソンＴｎ　５由来の１−１　ｘｂ　ｘｍａエエエ
（Ｉ工断片として拒離した。複雑な連結混合物を避ける
ために、最初のｐＵＲ３１０１を構築しく第１２Ａ図）
、これはＭＯＸレギユロンのはるか上流ＳａｌニーＸｍ
ａエエエ（−１５１０から−１１２８）断片とＭ１３ｍ
ｐ９にサブクローンしたＮＥＯＲ遺伝子の融合である。

他のプラスミドｐＵＲ３１０２が構築され、全ＭＯＸレ
ギユロンを殆んどカバーするＭＯＸ　ａ伝子の１−５　
Ｋｂｓａ１ニーＨｇ１Ａ工断片はＭＯＸ−ＮＦ；ＯＲア
ダプター（第１２Ｂ図）配列忙連結されかつＭ１３−ｍ
ｐ９にてクローンされる。このプラスミドの１．２Ｋｂ
Ｘｍａエエエ断片はｐＵＩ（３１０１のＸｍａｌエエ部
位にクローンされ、ｐＵＲ３１０３となり、これはＭＯ
ＸレギユロンとＮＢ２０Ｒ遺伝子（第１２Ｃ図）の正確
な融合である。オリエンテーションはＨｇ１Ａ工と８ａ
１１の切断によりチェックずろ。

ラムダ−ＭＯＸ　−４クローンから、Ｓａ’ｌニーＳａ
ｃ工断片をサブクローンし、構造ＭＯＸ遺伝子（８９４
位）のＳａｌ工部位から、構造ＭＯＸ遺伝子（’３２５
９位）のはるか下流の５ａｃＩ部位まで達する（第１０
図）。

このＭ１３ｍｐ１９サブクローンはｐＵｌ　３１０７ｉ
と呼ぶ。プラスミドｐＵＲ３１０５はｐＵＲ３１０３由
来の２．７　Ｋｂ　Ｓｉ３−工断片をｐＵＲ３１Ｑ　ｄ
の５ａ１１部位に直接連結して得る。オリエンテーショ
ンはＳｍａ工とＳａｃ工の切断により試験した。

このプラスミドをＨｉｎｄエエエとＳａｃ工で切１ヶし
かつこの切断プラスミドをＨ１ポリモーファに形質転換
させた後、０４１８耐性コロニーが見つかり、多くの世
代の間非選択的条件下で生胃させてその耐性を失なわな
かった。

例　　６ ｐＵｆｌ　６００４の構築、それによりＤ−アミノ酸オ
キシダーゼをコードする遺伝子はＭＯＸ−レギユロンの
管理下Ｈ１ポリモーファの染色体に移動する。

Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＡＡＯ）はメチル栄養性（
ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｅｐｈｉｃ　）　Ｈ．ポリモーフア
が非常に適している製造のためのオキシドリダクターゼ
の一例である。Ｍｏｌ様オキシダーゼである酵素は、メ
タノール又はメタノールと炭素源としての発酵糖および
単一窒素源とし７てのＤ−アミノ酸の混合物に生前中誘
導される酵母のベルオキシソームに転座される。これら
の条件下で、細胞は生成するＨ２Ｏ２から保巧される。

別法として、ＡＡＯがＭＯＸ−又はＤＡ８−レギユロン
の管理下にある場合、Ｈ２０□を生成することなく、Ａ
ＡＯを製造することができる。ＡＡＯ（ｎ製造は培地中
メタノールの存在により誘導される。

ＡＡＯ酵素のアミノ酸配列は公表され（ロンチ等、１９
８１）、完全な遺伝子はホスファイト技術（マチュチと
カルサーズ、１９８１）を使って合成される。この遺伝
子は、ＭＯＸ遺伝子の配列から誘導されるように、Ｈ．
ポリモーフアの最適コドンが使われる様に構築される。

更に、いくつかのユニークな制限部位はアミノ酸配列を
変えずに導入され、合成中のサブクローン化を容易にす
る。

ＤＮＡ配列に第１３図に示す。この遺伝子は長さ約５０
ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドで合成される。オリ
ゴヌクレオチドは１６チポリアクリルアミドデルで精製
する。サブクローンを生成するオリゴヌクレオチドはり
ガーゼバッファー（マニアテイス等、１９８２）に−緒
に添加され、湯煎中７０℃に加熱する。湯煎をゆっくり
１６℃に冷却し、Ｔ、−ＩＪガーゼを加える。連結２時
間後、ＤＮＡを１．５憾アガロースゲルで分別し、予期
された長さを有する断片をケゝルから短離する。断片の
末端に位置する各制限部位で切断したＭ　ｉ　３　ｍｐ
１８ベクターにてサブクローンする。この遺伝子を夫々
Ｓａｌニー）（ｉｎｄエエエ（３９−３，４６位）、Ｈ
ｉｎｄエエエーＸｍａ工（３４６−５８９位）　Ｘｍａ
ニーＫｐｎ工（５８９−７２１位）およびＫｐｎニーＳ
ａｌ工（７２１−１０４４位）の４サブクローンにてこ
のようにサブクローンする。　　ＳａｌニーＨｉｎｄエ
エエおよびＨｌ、ｎｄｌエニーＸｍａエサブクローン、
およびＸｍａｌ−Ｋｐｎ工とＫｐｎニーＳａｌエサブク
ローンをＳａｌＩ−Ｘｍａ工切断Ｍ１３ｍｐ１８におけ
る２つのＳａｌニーＸｍａエサブクローンと連結する。

これらの２つのサブクローンをＳａｌ工切断）ｒＬｉ３
ｍｐ８に連結して、ｐｔＴＲ３００１（第１６．１４Ａ
図）を得る。全配列は改良サンガージデオキシシーケン
ス技術（ビギン等、１９８３）を使って、ヌクレオチド
配列の測定により確認する。

ＡＡＯ、ｉｆｉ伝子を含有する組みこみプラスミドの構
築は第ｉ４Ａ、Ｂ図に示す。殆んど完全なＡＡＯ遺伝子
は、ユニークなｐＵＲ３１０４のＳａｌＩ部位（第１４
Ａ図）において、ｐＵＥ　３００１のＡＡＯ遺伝子−含
有５ａｌｌ断片を挿入して、ＭＯＸ末端領域の上流にお
いて、ｐＵＲ３００２を得る。オリエンテーションはＢ
ｉｎｄエエエで切断してチェックする。

ＭＯＸプロモーター領域はｐＵＲ３１０２由来のｉ、４
　Ｋｂ　ＳａｌニーＨｇ１Ａ工断片（第１４Ａ図）とし
て単離する。ついでこの断片を、Ｈｇ１Ａニ−Ｓａ１工
ＭＯＸ−ｊｌｋＡ。

アダプターの存在下部分的Ｂａ１ｌ−消化］）ＵＲ３０
０２（第１４Ａ図）に連結して、ｐＵＲ３００２のＡＡ
Ｏ遺伝子上流におく。生成したプラスミドｐＵＲ３００
３のオリエンテーションはＢｉｎｄエエエで切断して再
度チェックする。このシラスミドは、Ｓａｃ工で切断し
かつＨ．ポリモーフア細胞に形ｒ１転換１−だ後、ＭＯ
Ｘ遺伝子に組みこむ。形質転換体は、インジューサーと
してメタノールの存在下窒素源として〇−アミノ酸に生
育する能力により選択する。

ＡＡＯ遺伝子含有細胞の選択は単純でないので、別の選
択マーカーを導入する。結局、Ｓ、セレビシェＩＪＵ　
２遺伝子は構造ＡＡＯ遺伝子とＭＯＸターミネータ−間
に組みこむ。この構築のために、プラスミドｐＵＲ８５
２８−０３を使う。このプラスミドはヨーロッパ特許出
願第９６９１０号に記載のｐＵＲＹ５２８−０３から誘
導する。構築は第１４Ｃ図に示す。ｐＵＲＹ　　５２８
　　［１３の欠損カルボキシ末端ＬＥ［２遺伝子扉列は
ｐＹｅ　１θｕ１０由来の完全カルボキシ末端ＬＥＵ　
２遺伝子扉列（ラドキンとカーボン、１９７７）と置換
し、大腸菌１ａｃ−１ａｃレギユロンを除いた。続いて
、ＩＪＩ！：Ｕ２遺伝子を含有するｐＵＲ８５２８−０
３のＨｐａルミニー５ａｌ片を、ＡＡＯ構造遺伝子とＭ
ＯＸターミネータ−間にあるＪ）ＵＥ　３００３のＳａ
ｌＩ部位に挿入平滑末端とする。

生成プラスミドｐＵＲ３００４１７”）オリエンテーシ
ョンはＳａｌＩとＳａｃ工で切断してチェックすること
ができろ。Ｓａｃニー切断プラスミドをＢ、ポリモーフ
チ１ｅｕ−変異体に形質転換した後、ｐＵＲ３００４は
Ｈ．ポリモーフアの染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。迅
択し、たｌｅｕ＋形質転換体はＡＡＯ遺伝子と共に、染
色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。

例　　４ ｐＵＲ３２０Ａ、ｐＵＲ３２０５、ｐＵＲ３２１０およ
びｐＵＲ３２１１の構築、それにより小ペプチドホルモ
ン、ヒト成長放出因子を、染色体ＭＯＸ遺伝子（１）Ｕ
Ｒ３２０ろ、ｐＵＥ　３２０４　）に組みこむか、又は
ＨＡＲ８１−含有プラスミド（ｐＵＲ３２０５）に組み
こむか、又はＭＯＸ構造遺伝子（ｐＵＲ３２０９，１）
ＵＲ３２１０およびｐＵＲ３２１１）に融合して、ＭＯ
Ｘ−レヤユロンの管理下発現させる。

ヒト成長ホルモン放出因子（１（ＧＲＦ　）は脳下垂体
由来のヒト成長ホルモンの分泌を活性化する、小さい４
４アミノ酸ペプチドである。ＨＧＲＦは男子の垂体小人
症の診断や治療に使用可能である。

ＨＧＲＦは多くの種の成長ホルモン刺激を銹発すること
が分っているから、動物の成長を刺激し５かつミルクの
生産を増大することにより、ＨＧＲＦは獣医方面にも使
用できる（クーデ等、１９Ｅｌ）。

ヒト由来のＨＧＢＦを得るのは難しいが、遺伝子をクロ
ーンしかつ適当な宿主体に移すバイオチクノロシイの方
法により非常によく製造できた。Ｈ。

ポリそ−ファによるペプチｒホルモンの一般的生産例と
して、ＨＧＲＦの遺伝子がＨ．ポリモーフアの最適コド
ンに合成され、いくつかの方法で発現される。

ｐＵＲ３２０ＡとｐＵＲ３２０５の構築のために、タン
白質のカルボキシ末端部分をコードする遺伝子断片は長
さ約５０ヌクレオチドのＤＮＡオリゴマーで合成され、
Ｈ１ｎｄエエエーＳａｄ工切断Ｍ　１３　ｍｐ　１８の
Ｈ１ｎｄエエエーＳａｌ工断片としてサブクローンし１
、ｐＵＲ３２０１（第１５．１６Ａ図）を得る。このＨ
１ｎｄエエエーＳａｌ工断片はついでＨ１ｎｄエエエー
Ｓａｌ工切断ｐＵＥ３１０　ｄ　（第１６Ａ図）ノＭＯ
ｘターミネーター上流に挿入され、ｐＵＲ３２０２を得
る。ＭＯＸプロモーターは、ＭＯＸ−プロモーターとＨ
ＧＲＦ遺伝子（第１５．１６Ａ図）間に１（ｇｉＡＩ−
Ｈ１ｎｄエエエアダプターを使って、Ｈ１ｎｄエエエ切
断ｐＵＲ３２０２にｐＵＲ３１０２（第１６Ａ図）由来
の８ａｌニ−Ｈｇ１Ａ工ＭＯＸ−プロモーター断片を挿
入して、ＨＧＲＦ遺伝子の前に挿入する。生成シラスミ
ドｐＵＲ３２０３のオリエンテーションはＳａｌ工とＨ
ｇ１Ａ工で切断してチェックする。Ｓａｃ工切断プラス
ミｒの形質転換後、ｐＵＲ３２０３はＨ．ポリモーフア
の染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。形質転換体は免疫活
性について選択する。ｐＵＲ３２０３は５ａｌＩで切断
して、Ｉ、ＥＵ　２遺伝子を含むｐＴＴＲ５２８−０３
（第１６Ｂ図）のＳａ１ニーＨｐａＩ断片を挿入する。

この遺伝子のｐＵＲ３２０４におけるオリエンテーショ
ンはＨ１ｎｄエエエとＥｃｏＲＩで切断してチェックす
る。

Ｓａｃ工切断シラスミド（Ｘｉ　６Ｂ図）を１ｅｕ−Ｈ
．ポリモーフア変異体に形質転換した後、ｐＵＨ３２０
４は染色体Ｈ．ポリモーフアＭＯＸ　ａ伝子に組みこむ
。

ｌｅｕ＋形質転換体について選択。Ｈ．ポリモーフアに
て自律的に複製しかつ）ＩＧＲＦ遺伝子を含むｐＵＲ３
２０５と呼ぶプラスミドは、ＭＯＸ−プロモーターとタ
ーミネータ−間に挿入した）！ＧＲＦ遺伝子を含有する
、ｐＵＲ３２０３のＥｃｏＲＩ、部分的Ｈｉ　ｎａＩＩ
Ｉ切断４Ｋｂ断片を部分的Ｈ１ｎｄＪエニーＥｃｏＲＩ
切断ｐＨＡＲ８１（第２．１６Ｃ図）に挿入して得る。

ｐＵＲ３２０５の横条はＨ１ｎｄエエエで切断してチェ
ックする。

微生物によりＨＧＲＦとして小ペプチドの生産は酵素分
解（板倉等、１９７７）の結果、しばしば不安定である
。タン白根ＭＯＸに対する融合、およびその後のベルオ
キシンームへの移行により分解を防ぐことができた。し
たがって、ＭＯＸ構造遺伝子の１７７５位（アミノ酸５
９１　、＠　ｉ　０図、第１１図）のユニークＫｐｎ工
部位にＨＧＲＦ遺伝子を挿入することを決定した。ＥＧ
ＲＦ遺伝子は長さ５０ヌクレオチＶのＤＮＡオリゴマー
に再゛度合成されるが、Ｍ　１３　ｍｐ　１９の完全Ｈ
ＧＲＦ構造遺伝子としてクローンされる２つのＫｐｎニ
ーＨ１ｎｄエエエサプクローンはＫｐｎ工（プラスミド
ｐＵＲ３２０６、第１７図、第１６Ｄ図）で切断した。

更に、２７位のＨＧＲＦの内部メチオニンをコードする
ＡＴＧ　）リプレット（クーデ等、１９８４　）　（Ｄ
ＮＡ配列の８２位）はシスティンをコーＰするＴＧＴ　
）リプレットに転換されろ。このことはＨＧＲＦ活性を
木質的に変えず、ＣＮＢｒ切断（板倉等、１９７７）に
より融合タン白質由来のＨＧＲＦの切断を容易にする。

ファージラムダｙｏｘ　−ｄ　（第１０図）から、８ｐ
ｈ工（−４９１位）　−Ｋｐｎ工断片を単離し、Ｓｐｈ
ニーＫｐｎ工切断Ｍ１３ｍｐ１９に挿入され、ｐＵＲ３
２０７を得る。ｐＵＲ３２０６をＫｐｎ工で切断し、Ｅ
Ｇｌ’？Ｆ遺伝子をｐＵＲ３２０７のＫｐｎ工部位に挿
入し、ｐＵＲ３２０８を得る。オリエンテーションは］
）ＵＲ３２０８の単一ストランドＤＮＡで直接配列分析
によりチェックする。続いて、ユニークＫｐｎ１部位か
ら＋３ａｃＩ部位まで、ＭＯＸ遺伝子の下流部分はファ
ージラムダＭＯＸ−４由来のｉ、５ｋｂ断片とじて単離
し、Ｓａｃニ一部分的Ｋｐｎ工切断ｐＵＲ３２０８に挿
入する。生成プラスミＫ　ｐＵＲ３２０９のオリエンテ
ーションはＫｐｎ工で消化してチェックする。

８ａｃ工、Ｓｐｈ工切断プラスミドの形質転換後、ｐＵ
Ｒ３２０９はＰ、ポリモーファの染色体ＭＯＸ遺伝子に
組みこむ。免疫活性に関する選択。

このＭＯＸ　−ＨＧＲＦ融合遺伝子は、部分的Ｂｉｎｄ
ＪＩ工、部分的Ｆｉｃ　ｏＲＩ切断］）ＵＲ３２０９由
来の全融合遺伝子を皐離し、てｐ）ＩＡＲ８工に、Ｐｃ
　ｏＲ工部分的Ｈｉｎｄエエエ切断ｐＨＡＲ８工に挿入
される。この結果がｐＵＲ３２１０が得られ、形質転換
後Ｈ．ポリモーフアにて復製する（第１６Ｅ図）。別法
として、ｐＵＨ８５２８−０３のＬＥＵ　２−含有Ｓａ
ｌニーＨｐａ工断片を、ｐＴ］Ｒ３２０９の部分的Ｋｐ
ｎ工切断後、コードしたタン白質のカルボキシ末端にあ
る、ＨＧＲＦ遺伝子の平滑末端Ｋｐｎ　Ｉ部位に挿入す
る。生成シラスミドｐＵＲ３２１１は、Ｓ　ａ　Ｃ工、
Ｓｐｄ■切断プラスミｈ４の形質転換後（第１６Ｆ’図
）、Ｈ．ポリモーフアの染色体ＭＯＸａ伝子に組みこむ
。

考察 開口読み取り枠の長さから、精製ＭＯＸとＤＮＡ由来由
来タン列配列ミノ酸組成の類似性から、および同一の３
ＯＮ−末端アミノ酸から、Ｈ．ポリモーフア由来のＭＯ
Ｘの完全遺伝子をクローンした。

その計算分子量はＳＤＳポリアクリルアミドｒルで…１
１定した分子量とよく一致する。コード配列とは別に、
１２（］Ｏｂｐ以上は５′−と３′−非コード領ｊ或７
Ｐらシーケンスし、コード配列の上流Ｓａｌ工部位から
５ａｃＩ部位下流まで達する。遺伝子は介在配列で妨害
されないようである。

タン白質はプリカーサ−の形で転写されない。

分子量の測定により、Ｎ−末端シグナル配列はロアとブ
ローベル（１９８３）又はロック９ンカンゾ等（１９８
４）の初期研究では検出出来なかった。

類似の実験では、ラット肝臓のバーオキシソマール酵素
ウリカーゼ（ゴールドマンとブローベル、１９７８）お
よびカタラーゼ（ゴールげマンとブローベル、１９７８
；ロビーとうずロウ、１９７８）は切１所可能なＮ−木
端シグナルペプチドを含まないことが示唆された。しか
し、これらの著者により論究されている様に、タン自分
解的劣化はこのようなシグナル配列の検出の欠如を説明
するものである。

本発明者の配列結果がはっきり証明することは、このタ
ン白質をパーオキシソーム’Ｉｃ、　転ｍ　ｉ−７−）
　タンに、切断可能なＮ−末端シグナル配列は必要でな
い。このような転座シグナルは、オボ了ルブミンの場合
のように（リンガツバｆ、１９７９）、成熟タン白質の
内部配列に十分位置しうる。タン白質配列の検査は７５
ノ酸配列ａ１ｙｘａ１ｙＹｚａ１ｙ　（アミノ酸１３−
１８）を示し、ＰＡＤ　−（フラビンアデニンジヌクレ
オチド）−含有酵素（ロンチ等、１９８１）に特長的で
ｔ・る。

上記のＭＯＸ遺伝子の、ｎｉ−離はＭＯＸをコードする
ＤＮＡ配列およびＭＯＸ酵素のアミノ酸配列のＩＩＢ定
方法を示すものである。

同様に、他のオキシダーゼ酵素に属するＤＮＡ配列とア
ミノ酸配列を単離Ｉ、かつ測定することができる。ＭＯ
Ｘ遺伝子配列の知識を利用して、アルコールオキシダー
ゼをコードする遺伝子又は他のオキシダーゼをもコード
する遺伝子の単離を容易にする。酵素の性質と構造を比
較することにより、構造の働きと粘性の関係を多分確立
することができる。部位指向突然変異生成として、タン
白コード配列の短縮化又は伸長化、相当するポリペブチ
ｒを修飾して、改良された性質、例えばアルカリ安定性
の増大を有するオキシダーゼ、又は洗剤製品と一層相容
性の基質を必要とするオキシダーゼを選択する方法も適
用しうる。Ｈ．ポリモーフア由来の）ＪｉＯＸの構造遺
伝子の単離と特性化以外に、Ｈ．ポリモーフア由来のＤ
ＨＡＳの構造遺伝子の単離と特性化を同じよ５に行なっ
た。

ＤＡＢのＤＮＡ配列は第１８Ａ−１８Ｃ図に示す。

制限地図は第１９図に示す。ＤＡＳのＤＮＡ配列から計
算Ｉ７たアミノ酸組成は精製ＤＨＡＳの加水分解後に測
定【またアミノ酸組成と一致している様であった。ＤＨ
Ａ８酵素はホルムアルデヒドとキシルロースモノホスフ
ェートからのジヒドロキシアセトンの合成をｙ　２１す
る。この反応はメタノール−同化反応（ビーンハイス等
、１９８５）において重要な役割を演じている。

前に記述した様に、ＭＯＸとＤＨＡＳの合成はゲルコー
ルリプレッションに供する。０．５％（Ｖ／Ｖ　）メタ
ノールの代りに基質としてゲルコール／メタノール混合
物を用いる場合、高レベルのＭＯＸが得られることが分
った。前に条件下では、後者の条件の２０係と比較して
、３０％までの細胞タン白質はＭＯＸから成る。

ＭＯＸ　トＤＡ８のレギユロンには、グルコースによる
リプレッション／活性又はメタノールによる誘導の調節
に決定的役割を演じる配列が存在せねばならないと考え
られた。したがって、ある相同関係が予期される。

双方共配列ＣＴＡＴＡＡＡＴＡを有する、「ＴＡＴＡ−
ボックス」の著しい相同性が見出された。ＭＯＸとＤＡ
Ｓレギユロンの上流に近い領域には仲の相同性は見出さ
れなかった。期待に反して、両レギユロンの詳細な研究
は、翻訳開始コドンの約１００口ｂｐ上流領域にＭＯＸ
とＤＡＳのレギユロンの顕著な相同性を示した。ＭＯＸ
のレギユロンにおいて６５　ｂｐの実際上完全な連続領
域は、いくつかの非相同性領域（第２０図）により散在
されている、ＤＡＳレギユロンの１３９　ｂｐ領領域相
同している。類似の相同性は両遺伝子の任意の他の領域
にみられない。すなわち、その上流と下流の配列を含め
て長さ４Ｋｂにわたってみられない。これらの相同配列
はグルコースやメタノールによる両遺伝子の調節の役割
を有することが示唆されている。ＭＯＸの構造遺伝子の
ＡＴＧの上流の最初の５００　ｂｐをレギユロンとして
含有するベクターによる形質転換の研究は次の点を示し
た。即ち、この短かくなつｆ、−ＭＯＸ−レギユロンは
インディケータ−遺伝子β−ラクタマーゼの比較的低発
現をおこした。インディケータ−遺伝子は容易にスコア
できる性質をもった酵母を供する遺伝子であり、例えば
抗生物質０４１８に耐性を示すネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼの遺伝子又はロイシンの如キ栄ｉ要求マ
ーカーである。

ＭＯＸとＤＡＳ遺伝子のはるか上流の相同領域が各種妨
害を有するという事実、およびＤＡＳが０看グルコース
で抑制されかつＭＯＸが抑制されないという事実は、こ
れらの相同領域がグルコースによろりプレッション／活
性化にとっておよび／又はメタノールの存在下発現の誘
導にとって重要であることを示唆している。この仮定は
実際圧しいことが分った。したがって、これらの相同領
域の有無は特定の用途に重要である。例えば、若しＭＯ
Ｘ遺伝子の−１０５２から一９８７領域又はＤＡＳ遺伝
子の−１０７６から一９３７領域がメタノールによるＭ
ＯＸ又はＤＡＳの誘導に重要であるならば、これらの領
域の存在はＭＯＸ又はＤＡＳの発現にとっておよび／又
はメタノールによる他の酵素の誘導にとって重要である
。他の例はグルコースによろりプレッションを避けるた
めにその領域を除くことであり、炭素源としてグルコー
スを有するＭＯＸおよび／又はＤＡＳ　１４　’ｒｉｂ
領域の影、１ｆ下ＭＯＸやＤＨＡ　Ｓ以外のタン白質を
コードする遺伝子の発現に必要である。

本発明の−ｔｖＦ徴は、Ｈ８ボリモーファ由来のＭＯＸ
およびＤＢＡＳをコードする構造遺伝子の単離および完
全な特性化に関する。更に、Ｈ．ポリモーフアにおける
ＭＯＸやＤＨＡＳの生合成を調節するＤＮＡ配列、特に
レギユロンやターミネータ−の単離と特性化に関する。

更に、■、ポリモーファｃＢｓ　Ａ　７３２以外のＨ。

ポリモー７ア菌株、又はＨ，ポリモー７ア以外のハンセ
ヌラ種、又はハンセヌラ以外の酵母、又はカビ又はＨ．
ポリモーフアｃＢｓ　４７３２由来のＭＯＸ遺伝子の強
力なレギユロンおよびターミネータ−をイ１つ高級ユー
カリオートから派生するアルコールオキシダーゼその他
のオキシダーゼをコードする遺伝子の組み合わせに関す
る。これらの組み合わせはとりわけＨ．ポリモーフア又
は関連種由来の自律的復製配列又はセントロマーな含む
ミニクロモソーム、および任意には選択マーカーとテロ
マーを有するベクターにおくことができる。

これらの組み合わせはＨ，ポリモー７アの染色体ＤＮＡ
に組みこむこともできる。

更に、強力なレギユロン又はその一部およびＭＯＸおよ
び／又はＤＡＳのターミネータ−および部位方向突然変
異生成又は他の方法により、アルコールオキシダーゼそ
の他のオキシダーゼをコードする変化した構造遺伝子の
組み合わせに関する。

これらの変化した・構造遺伝子はミニクロモソーム中エ
ビソームベクターに組み入れ、又はＨ．ポリモーフア、
Ｈ，ウィンディ、Ｈ，アノマラおよびＳ、センビシエそ
の他の酵母の染色体に組みこむことができる。

これ以外に、本発明はオキシダーゼ以外のタン白質をコ
ー−する構造遺伝子とＨ．ポリモーフアのＭＯＸおよび
／又はＤＡＢ遺伝子のレギユロンおよびターミネータ−
との組み合わせに関する。

本発明の非常に重要でかつ望ましい態様は、微生物を適
当な条件下で培養して、任意にはポリペブチｒを濃縮し
そして公知方法で集取する。タン白質又は酵素の如きポ
リペブチＶの製造法において、組み換えＤＮＡ技術によ
り得られかつこのポリペプチドをコードする構造遺伝子
を含む微生物を使い、プロモーターおよびＨ．ポリモー
フアＣＥＳ　４７３２のＭＯＸ遺伝子の−１０５２から
−９８７領域、又はＨ．ポリモーフアＣＢＳ　、１７３
２のＤＡＳｔ遺伝子の−１０７６から一９３７領域、又
は他のメチロトローフ型カビ又は酵母の相当する領域、
又はこれらの任意の領域の有効的修飾を含むレギユロン
のコントロール下にこの発現を行なう、上記方法である
。

凡くべきことは、第２０図に示されかっこ〜にＭＯＸと
ＤＡＳ遺伝子の一１０００領域として言及されている当
該領域は構造遺伝子の発現に非常に重要であるというこ
とが本発明により見出された。

この領域を除いたＭＯＸレギユロンを含む組み換え体で
行なった実験は低レベルの発現を示した。したがって、
このような−１０００領域又はその有効な修飾（即ちこ
の領域機能の有意な欠損をおこさない任意の修飾）を含
むレギユロンを使うと、比較的高量の目的ポリペプチド
を製造することができる。

本発明方法の望ましい態様は、当該構造遺伝子が遺伝子
産物を微生物宿主のバーオキシソームすなわち均等のミ
クロボディに転座させるのに包含されるアミノ酸配列を
コードする１種以上のＤＮＡ配列を供した点で特徴があ
る。生成したポリペプチドをパーオキシンームすなわち
均等のミクロボディに転座させると、その安定性を改善
１〜、高収率を得る。ある種のポリペプチド特にオキシ
ダーゼでは、このような転座は微生物宿主の生存のため
には肝要である。即ち、微生物宿主細胞かオキシダーゼ
の基質で生育する場合に生成する過酸化水素の毒性効果
から宿主を守ることである。もしこのオキシダーゼが製
造法に使用する微生物の宿主において機能的であるアド
レスシグナルを含まないならば、宿主特異的アドレスシ
グナルをコードする配列を有する構造遺伝子を供すべき
であって、例えばこの様な配列を加えるか又はこれらと
遺伝子の最初のアドレス配列と置換する。融合パートナ
−が適切なアドレスシグナルを有する融合ポリペプチド
の生産は別の可能性である。メチロトローフ型酵母をこ
の製造に使う場合には、ＤＮＡ配列はパーオキシソーム
又はミクロボディにＭＯＸ転座させるＭＯＸ遺伝子又は
その一部から成ることが望ましい。

最後に、本発明の特徴はＨ．ポリモーフア由来のＭＯＸ
を他の酵母において合成することに関する。

アルコールオキシダーゼ産生能を有する若干ノ微生物を
以下に挙げる。

アルコールオキシダーゼを産生ずる酵母（リ−およびコ
マガタによる分類、１９８０）グループ１　　カンジダ
拳ボイジニ グループ２ａ　ハンセヌラ・フィロデンドラピチア・リ
ンドネリ トルロプシス９ネモデンドラ 〃　　　６ピナス 〃　　　・ソルンシス グループ２ｂ　カンジダ・カリオシリグニコラハンセヌ
ラ・グルコチマ 〃　　嗜ヘンリチ 、〃　　・ミヌタ 〃　　・ノンフェルメンタス 〃　　・ボリモーファ 〃　　・ウイツケルハミ ピチア・ビナス 〃　・トレハロフイラ グループ２ｃ　カンシタ・サクシフィラトルロフシスψ
ニトラトフイア グループ３　　ピチア・セロビオサ グループ４　　ハンセヌラｅカプスラタピチア・パスト
リス トルロン０シス・モリシアナ アルコールオキシダーゼを産生ずるカビレンジト・トラ
ペア ポリポラス・ベルシカラー 〃　　・オブツサス ポリアφコンチグア アルコールオキシダーゼ以外のオキシダーゼの中で最も
興味のあるものはニ ーグリセロールオキシダーゼ 一アルデヒドオキシダーゼ 一アミンオキシダーゼ 一アリールアルコールオキシダーゼ −アミノ酸オキシダーゼ −グルコースオキシダーゼ ーガラクトースオキシダーゼ ーソルボースオキシダーゼ ー尿酩オキシダーゼ 一クロロパーオキシダーゼ：および −キサンチンオキシダーゼ。

Ｈ．ポリモーフア由来の２．４０ＸおよびＤＡＳ遺伝子
σ）強力なレギユロンやターミネータ−とオキシダーゼ
の構造遺伝子との組み合わせは、特定の宿主又は宿主群
にわフ造遺伝子を復製できる、例えばＨ。

ポリモーファ由来の配列又はセントロマー（およびテｏ
マー）ヲ、ｎ、ポリモーファおよび関連の酵母又はその
他の顛生物に移行しうる適切なベクターに自作的イＵ製
する。

既述したＨ、ポリモーファ変異株ＬＥＵ　−１とＬＲ９
は夫々ＣＢＳに７１７１と７１７２の番号で寄託されて
いる。

以下に文献、表、図面を説明する。

表　　Ｉ 生育にウラシルを必要とするＨ、ポリモーフ７中のオロ
チジン５′−リン酸塩デカルボキシラーゼおよびオロチ
ジン５′−リン酸塩ぎロホスホリラーゼの活性 ボキシラーゼ　　　ホスホリラーゼ 野生型　　　　　　　　　　Ｉ　Ｄｏ　　　　　１　Ｄ
ＯＬＲ９１０ｄｃｌ　　　（２ｘｌ［］９　　　　　　
＜ｉ　　　　　　　１０６ＭＲ７１０ｄｃｌ　　　　６
ｘ１０７＜１　　　　　　７１ＮＭ　Ｂ１０ｄｃｌ　　
　　３Ｘ１０８　　　　　　＜１　　　　　　１０５Ｃ
ＬＫ　５５１０ｐｐｌ　　測定せず　　　　　９０　　
　　　　〈１Ｃ部６８１０ｐｐ１　　　ｎ　　　　　　
　　　８２　　　　　　　　＜ＩＹＮＮ　２７／ｕｒａ
３　　　　／／　　　　　　　　　　０後期対数期まで
菌株をＹＦｉＰＤで生育させた。細胞力抽出はブラウン
ホモジナイず−を使って、ガラスピーズで行なった。タ
ン白質は２８０　ｎｍで光学密度忙より評価した。

ａ）野生型活性率として表わした。

表　　■ Ｂ、ポリモーファのウラシル要求株の形質転換ＬＲ９Ｙ
ＲＰ１７　　２．２刈０２　　〈１　　　自律的復製Ｌ
Ｒ９ｐＨＡＲ８１１，５刈０”　　　　２　　　　自律
的復製ＬＲ９ｐｎＡＲｓ２　　ａ、６ｘ１０２１．５　
　　自律的復製ＬＲ９ｙ工Ｐ５　　　３　　（３８）０
　１０５　　　　組みこみＬＲ９ｐＲＢ５８　　　　０
　　　　　　−　　　　　−ＬＩｌ！９ｐ皿８５　　　
　０　　　　　　−　　　　　−ＹＮＮ２７Ｙ工Ｐ５　
　　　　０　　　　　　−　　　　　−形質転換用に使
用した。

ｂ）１０世代間、ＹＥＰＤで生育させた後、残存ウラシ
ル原栄養体率として表わす。

Ｃ）（）内のむ字は遊離プラスミＰＹ工Ｐ５含有ミニコ
ロニーの量を示す。

表■ ＭＯＸのアミノ酸組成 アミノ酸　　　　　ＤＮＡ配列　　　　加水分解物ａ）
ＰＩ（Ｅ　　　　　　　　　３１　　　　　　　　　３
２ＬＢＵ　　　　　　　　　　４７　　　　　　　　　
４９工Ｉ、Ｅ　　　　　　　　　３４　　　　　　　　
　３４ＭＥＴ　　　　　　　　　１２　　　　　　　　
　１１ＰＲ０４３４２ ＴＨｎ　　　　　　　　　４４　　　　　　　　３８Ａ
ＬＡ　　　　　　　　　　Ａ７　　　　　　　　　５０
ＴＹＲ２７２７ Ｂ工Ｓ　　　　　　　　　　１９　　　　　　　　　２
１ＧＬＮ　　　　　　　　　　　１５ ＧＬＵ　　　　　　　　　　３６　　　　　　　　　）
　　５１ＡＳＮ　　　　　　　　　　　３２ ＡＳＰ　　　　　　　　　５０　　　　　　　　　］　
８４ＬＹＳ　　　　　　　　　　３５　　　　　　　　
　３８ＡＲＧ　　　　　　　　　　３６　　　　　　　
　　３６ＧＬＹ　　　　　　　　　　５０　　　　　　
　　　５３ａ）加水分解は２４時間行なった ｂ）測定せず 表　　■ Ｓ、セレビシェ、Ｈ．ポリモーフアおよび大腸菌の望ま
しいコドン使用頻度の比軟 サツカロミセス　　　ハンセヌラ　　　　　大腸菌λｌ
０Ｘ ＡＬＡ　ＧＣＵ、　　ＧＣＣＧ（’ＩＣＧＣＣ使用せず
不明 ＳＥＲＵＣＵ、　　ＵＣＣＵＣＣ，ＵＣＧ　　　ＵＣＵ
、　　ＵＣＣＴＨＲＡＣＵ、　　ＡＣＣＡＣＣＡＣＵ、
　ＡｃｅＶＡＬ　ＧＵＵ、　　ＧＵＣＧＵＡ使用せず　
ＧＵＵ、　　ＧＵＡ不明 ＩＬＥ　ＡＵＵ、　　ＡＵ（’　　　ＡＵＣ，ＡＵＵ　
　　ＡＵ（’ＡＳＰ　ＧＡＣＧＡＣＧＡＣ ＰＨＥ　ＵＵＣＵ［Ｔ（’！　　　　　　ＵＵＣＴＹＲ
ＵＡＣＵＡＣＵＡ（’ ＣＹＢ　ＵＧＵ　　　　　　不明　　　　　不明ＡＳＮ
　ＡＡＣＡＡ（’　　　　　　ＡＡＣＨＩＳ　ＣＡＣＣ
ＡＣＣＡＣ ＧＬＵ　ＧＡＡ　　　　　　ＧＡＧ　　　　　　ＧＡＡ
ＧＬＹ　ＧＧＵ　　　　　　ＧＧＣは実際　　ＧＧＵ、
　　ＧＧＣ上使用せず 不明 ＧＬＮ　ＣＡＡ　　　　　　ＣＡＧ　　　　　　ＣＡＧ
ＬＹＳ　ＡＡＧ　　　　　　ＡＡＧ　　　　　　ＡＡＡ
ＰＲＯ（’（：’Ａ　　　　　　Ｃ（”［Ｊ、　ＣＣＡ
　　　Ｃ’Ｃ’ＧＬＥＵ　ＵＵＧ　　　　　　ＣＵＧ、
　　ＣＵＣＣＵＧＡＲＧ　ＡＧＡ　　　　　　ＡＧＡ　
　　　　　ＣＧＵ引用例 １．０Ｂ−ＰＳｌ、２２５．７１３号（コルゲート・パ
ルモリブ・カンパニイ、１９７１年３月２４日公告、優
先８１９６８年４月１９日）。

２、　　Ｄｇ−ＦＡ２，５５７，６２３号（ヘンケル＆
シー社、１９７７年６月６０日公開、優先日１９７５年
１２月２０日）。

３、　０Ｂ−ＦＡ２，１０１．１６’７号（ユニリーバ
−・ビーφエル・シー、１９８３年１月１２日公開、優
先日１９８１年７月７日）。

４．７アンｅデイケン・ジエイψビー、オツトーφアー
ルおよびハーダー・ダブリュー（１９７６）、アーカイ
ブス・オプ・マイクロバイオロジイ１１１．１３７−１
４．ｉ。

５、ビーンハイス・エム、ファン・ディケン・ゾエイ・
ビーおよびハーダー・ダブリュー（１９８３Ｌアドバン
シズ・イン・マイクロバイアル争フイジオロジイ、ロー
ズ中エイチ、ガレス・モリス・ジエイおよびテンペスト
・ディー・ダブリュー著、第２４巻、１−８２、アカテ
ミツク・プレス、ニューヨーク。

６、ロツゲンカンプ・アール、ヤノヴイツツ・ゼット１
．スタニコフスキイービーおよびホレンパーグ・シー・
ビー（１９８１）、モレキュラー−ジーン・ジエネテイ
ツクス１９４．４８９−４９３゜７、サーム）エイチ（
１９７７）、アドバンシズＯイン・マイクロバイオロジ
ック・エンジニアリング、ゴース・ティー・ケイ、フイ
ーヒター・エイおよびブレイクブラウーエヌ著、第６巻
、７７−１０３、スジリンガ−・フエルラーグ、ベルリ
ン。

８、ビストリック・エルψブイ、ソコロフ・エイ拳ビー
およびトロチェンコ・シイ・エイ（１９８１）、ＩＢｓ
レターズ、１５２．３２４−３２８゜９、ロア・エムお
よびブローベル１シイ−（１９８３）、プロシーデイン
ダス・オプ・ナショナル・アカデミイ・サイエンス、Ｕ
ＳＡ。

８０．６８７２−６８７６゜ １０、ビーンハイス・エム、ファン・ディケン・ジエイ
ービー、ピロン、ニス嗜エイ・エフオヨヒハーダー・ダ
ブリュー（１９７８）、アーカイプス・オブ・マイクロ
バイオロシイ、１１７．１９５３−１６３゜ １１、ローネン・ダブリュ・エイ・エムおよびブラマー
、ダブリュー・シイ−（１９８０）、ジーン、２０．２
４９−２５９゜ １２、ホーン・ビー（１９７９）、メソッズ・イン・エ
ンずイモロジイ、ウー・アール著、第６８巻、２９９−
３０９、アカデミツクプレス、ニューヨーク。

１３、イーデンス・エル、ヘスリンガ※エル、クロック
・エル、’）　−テホアー・エイ・エム、マート・ジエ
イ、トーネン・エムΦシイ、ビッサー・シイ−およびベ
リラプス佛シイ−・ティー（１９８２）、ジーン、１８
．１−１２゜１４、ベルハム・エイチ・アール・ビーお
ヨヒシャクソン・アール・シエイ（１９７６）、エアロ
ーゾ・ジャーナル・オブ・バイオケミス）　ＩＪイ、６
７．２４７−２５７゜ １５、バレリオｅディー、ダイベンスタイン・エム・ジ
エイφンー、メーラ書カン響ピー、ギューツφフ了ン・
ケラセル・エイ、ｒロールＰ１１エイおよびファン・デ
ル・ニブ・エイ・ゾエイ（１９８３）、シーン、２５．
２３１−２４０゜１６、ｌＪ−テボアー中エイ・エム、
ベリラプス・シイ−・ティーおよびデツカ−・ビー・エ
ム・エム（１９８４）、ゾーン、３０．２３−３２゜１
７、マニアティス・ティー、フリッチｅイー・エフおよ
びサムプルツク・ジェイ（１９８２）、モレキュラー拳
クローニング、２７８頁、コールド−スプリング・ハー
バ〜・ラボラトリイ版、ニューヨーク。

１８、ベントン・ダブリュー・ディーおよびディビス・
アール・ダブリュー（１９７７）、？イエンス１９６．
１８０−１８２゜ １９、アンブラー・アール・ピ〜（１９７２）、メンツ
ズ・イン・エンずイモロジイ、第２５８．２６２−２７
２、アカデミツク・プレス、ニューヨーク。

２０、マッチュシ・エム・ディ〜およびカルサーズ・エ
ム・エイチ（１９８１）、ジャーナル・オブ・アメリカ
ン・ケミカル・ソサイエテイ１０３．３１８５−３１９
１゜ ２１、ウオレスｅアール・ビー、ジョンソン・エム・ジ
エイ、ヒロセｅティー、ミャケ・ティー、カワシマーイ
ー・エイチおよびイタクラ・ケイ（１９８１）、ニスク
レイツク・アシツズ・リサーチ９．８７９−８９４．、
。

２２、ビギン・エム・ディー、ギブがハチイー・ジェイ
およびホン−ジー・エフ（１９８３）、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミイ・サイエンス、ＵＳ
Ａ　８０．３９６３−３９６５゜２３、　り１７−ソン
・エム・エイ、ウエイツ・エム・　　５ジエイおよびサ
ドベリーΦピー・イー（１９８４）、Ｃ１化合物に対す
る微生物の生育、クローフォート・アールーエルオヨヒ
ハンソンーアール・ニス、エイ・ニス−エム出版、ワシ
ントン、２２８−２３５゜ ２４、フインク・ジー・ディー（１９７０）、メンツズ
・イン・エンずイモロジイ、ティパー・エイチおよびテ
ィパー・シー争ダブリニー著、第１７巻、５９−７８、
アカデミツク・プレス、ニューヨーク。

２５、ホーク・ジエイ・ディー、ラックラウド−エフお
よびフィンク・ジー・ディー（１９Ｅｌ）、モレキュラ
ー・ジーン・ジェネテイック１９７．５４５−３４６゜ ２６、ジョーンズ・イー・ダブリューおよびフィンク・
ジー・ディー（１９８２）、コールド・スプリング・ハ
ーバ−・モノグル・シリーズ、１１　Ｂ、　１８１−２
９９゜ ２７、’　ＩＩ−ベルマン・アイ、コ〜ンバーグ・エイ
およびシムス・イー・ニス（１９５５）、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリイ２１５．４０３−
４１５゜ ２８、ステインクコーム−ディーΦティー、トマス・エ
ム、ケリー・ジエイ、セルカー−イーおよびディビス・
了−ル・ダブリュー（１９８０）、プロシーディンゲス
・オブーナショナル＠アカデミツク・サイエンス、ＵＳ
Ａ　７７．４５５９−４５６５゜ ２９、ステインクコーム−ディー・ティー、マン中シー
、およびディビス・アール・ダブリュー（１９８２Ｌジ
ヤーナル・オプ・モレキュラー・バイオロジイ１５８．
１５７−１７９゜３０、ス）ラ−に・ケイ、ステインク
コーム・ディー−ティー、シェラ−・ニスおよびディビ
ス・アール・ダブリュー（１９７９）、グロシーデイン
ダス・オブΦナショナル・アカデミツク・サイエンス、
ｔｒｓＡ７６．１０３５−１０３９゜３１、カールソン
・エムおよびホトスタイン・ディー（１９８２）、セル
２８．１４５−１５４゜６２、ベッグズ・ジエイ・ディ
ー（１９７８）、ネイチャー２７５．１０４−１０９゜ ６３、フローチ脅ジエイやアール、ストラサーンφジエ
イ°ψニスおよびヒックス命ジエイ・ビー（１９７９）
、ジーン８．１２１−１３３゜３４、ゲス・ニス、ケラ
−マン・イーおよびホレンバーグ・シー・ビー（１９８
４）、ジャーナル・オプ・バクテリオロジイ１５８．１
１６５−１　１　６　７、。

３５．イト−・エイチ、フクダ・シイ、ムラタ・ケイお
よびキムテ・エイ（１９８３）、ジャーナルーオプ・バ
クテリオロジイ１５３．１６３−１６８゜ ３６、クレーベ・アール拳ジエイ、ハリス・ジエイ・ブ
イ、シャープ・ゼットφディーおよびダグラス・エム・
ジー（１９８３）、ジーン２５．３３３−３４１゜ ３７、ホレンバーグ・シー・ビー（１９８２）、カレン
ト中トピックス、マイクロバイオロジカル・イムノロシ
イ９６．１１９−１４４゜ ５８、カド−・エフ、オーモリΦシイ、タニ・シイおよ
びオガタ・ケイ（１９７＜Ｓ）、ユーロピアンージャー
ナル・オプ・バイオケミストリイ６４．３４１−３５０
゜ ３９、シュツテ・エイ、チ、フロスドルフ・ジェイ、サ
ーム争エイチおよびクラ−エム−アール（１９７６）、
ユーロピアン、ジャーナル・オブ・バイオケミストリイ
６２．１５１−１６０゜４０、ロンチ・ニス、ミンチオ
テイｅエル、ガリアノ・エム、カーティ・ビー、スエン
ソンφアールＩＩビー、ウィリアムス・シークエン化お
よびマセイ・ブイ（１９８１）、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリイ２５７．８８２４−８８３
０，１ ４１、ラドキン・ビーおよびカーボン・ジエイ（１９７
７）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ツク・サイエンス、ＵＳＡ７４．４８７−４９１゜ ４２、クーデ・エフ・エックス、ジアズ略ジエイ、モア
ー・エム、ロスカム争ダブリューオヨヒロンクツチ・ア
ール（１９８４Ｌ　　）レンズ・イン・バイオチクノロ
シイ２．８３−８８゜４６、イタクラ・ケイミ　ヒロセ
・ティー、クリ−・アール、リッグズ・エイ０デイー、
ヘインカー・エイチゆエル、ポリバー・エフおよびボイ
アー・エイチ・り７”ｌ　ＩＪユニー　１９７７　）、
サイエンス１９８．１０５６−１０６３゜ ４４、ゴールドマン・ビー・エムオヨヒプローベル・シ
イ−（１９７８）、プロシーデインダス・オブ・ナショ
ナル・アカデミツク−サイエンス、ＵＳＡ　７５．５０
６６−５０７０゜ ４５、ロビー俸エムオＪ：　ヒラ”Ｊ’ロー・ビー−ヒ
−（１９７８）、プロシーデインダス・オブ・ナショナ
ル・アカデミツク−サイエンスｕｓＡ７５．４３、！Ｉ
Ａ−４３４８゜ ７１６、　ＩＩンガツパ・ブイ・アール、リンガツバ・
ジエイ・了−ルおよびブローベル−シイ−（１９７９）
、ネイチャー２８１．１１７−１２１゜ ４７、ワトソン・ジエイΦディー、ツーズ拳ジエイおよ
びフルツ・ディー・ティー（１９８３）、組換えＤＮＡ
　、短期コース、１７８頁、フリーマン・アンーψカン
パニー発行、ニューヨーク、４８、リ−・ジエイ拳ディ
ーおよびコマガタ・ケイ（１９８０）、ジャーナル・オ
ブ・ジエネテイック・アプライド・マイクロパイオロジ
イ２６．１６ろ−１５８゜

【図面の簡単な説明】

第１図　特異的ＭＯＸサブクローンのシークエン化に使
用するエクソヌクレアーゼＢａｔｌ　３１消化方法。Ｍ
ｉ３ｍｐ−３又は−９、 −１８又は−１９にてサブクローンした断片Ｘ−Ｙをユ
ニークな制限Ｚ　Ｈ％位で切断する。ＤＮＡ分子は時間
依存性エクソヌクレアーゼＢａＪ　３１消化に供する。 Ｍ１３シークエンスプライマー近くに位置するＤＮＡ断
片は制限酵素Ｙを使って除く。末端はＴ４−ＤＮＡポリ
メラーゼで培養して平滑末端とし、ついで分子内的に連
結させる。ファージプラークを形質転換後取り上げ、断
片をＸ部位力方向で２部位からシーケンスする。逆転複
数クローニング部位を有するＭ１３．Ｊ４体を使って、
断片をＸ部位の方向に２部位からシーケンスする。 第２０　ＨＡＲ８断片をＹｌ　ｐ５の単−Ｓａｄ工部位
に挿入して誘導したｐＨＡＲｓプラスミドの整列。 第６図　）ＩＡＲ８−ｉ断片の完全ヌクレオチげ配列。 第４図　Ｈ．ポリモーフア形質転換体のササ゛−ンハイ
ブリッドによるコピーわの評価。各フ０ローブ８および
１８ｍ１の試料を電気泳動にかけた。レーン１はＨ１ｎ
ｄエエエとＥｃｏＲ工で消化したファージラムダＤＮＡ
である。レーン２，３はＨ１ｎｄエエエ（エムｅレイネ
ン、ケイ・ブロイニラしおよびシー・ピー・ホレンバー
グ、未公表）で消化した組みこみプラスミドの２つのコ
ピーを含むＫ・ラクテイスの形質転換体である。レーン
４−７はＥｃｏＲ工で消化したｐＲＢ（４５）とＹＲＰ
　１７　（６−７）でそれぞれ形質転換させたＹＮＮ　
２７　：レーン８．９はＥｃ　ｏ’Ｒ工で消化したＹＲ
Ｐ　ｌ　７で形質転換させたＬＲ９；レーン１ｏ、ｉｉ
はＨｉｎｄＩ工Ｉで消化したｐＨＡＲＢ　２で形質転換
したＬＲ９：レーン１２．１３は ＥＣ０ＲＩで消化したｐＨＡＲ８１で形質転換したＬＲ
９である。 第５図　プラスミドＹＩｐ　５の組みこみにより形質転
換さハたＨ、ポリモーファ変異株ＬＥｉ９由来のＤＮＡ
のすず−ンプロットのオートラジオグラム。レーン１は
Ｈｌｎｄｌｌ：工とＥｃｏＲ工双方で消化ｌ−だファー
ジラムダＤＮＡ　：レーン２は未「４化のｐ、ＩＡＩ’
！Ｓ　−１；レーン６．５および６．７は２つの異なる
形質転換体由来のＤＮＡを示す。レーン３は未消化；レ
ーン４はｇｃｏＲＩで消化：レーン５はＰｖｕエエで消
化；レーン６はＥｃｏＲ工で消化；レーン７はＩ’ｖｕ
Ｉ工で消化；レーン８はＫｃｏＲ工で消化：レーン８ば
ＢｃｏＲ工で消化し、たプラスミド子工ｐ５゜ニック翻
訳したＹ工ｐ５はハイブリッドプローブとして使用した
。 ｆｌ、６図　オリゴ（αＴ）セルロースについて一度精
製（レーンＡ）又は二度精製（レーンＢ）した、Ｈ．ポ
リモーフア由来の３２ｐ−ラベル【−たＲＮＡの電気泳
動、電気泳動は変性７　Ｍ尿素２．５係ポリアクリルア
ミドデルについて行なった。酵母ｒＢＮＡ’ｓの位置お
よびそわぞれの分子量は１８Ｓと２５８により示されて
いる。レーンＢに見られろ２．３　ｋｂバンドはｃ　Ｄ
ＮＡプローブに転換し、ついでＨ，ポリモーフアクロー
ンパンクからＭＯＸとＤＨＡＳを単離するのに仕った。 第７図　メタノール活性他Ｈ．ポリモーフアｍＲＮＡを
ウサキ゛網赤血球すセートで試験管内翻訳した後に得た
３５Ｓ−ラベルしたタン白質。全リモート（レーンＡ）
２μｍ又はＭＯＸ特異的抗血性（レーンＢ）を使う残存
１８μｇの免疫沈降物を１１．５憾５ＤＳ−ボアクリル
アミドデルで分別した。公知の分子量・を有するタン白
混合物はマーカーとして使用した。 第８図　ベックマン　シーケネーターで測定した、楯１
！ＩＭＯＸのＮ−末端配列。サツカロミセス所望コドン
を使って、配列Ｐｒｏ−Ａｓｐ−（）Ｉｎ−Ｉ’ｈθ−
Ａｓｐから誘導しうる２つのプローブ。 第９図　Ｈ１ｎｄＩＩ工／Ｓａｌ工切断ＭＯＸクローン
のＤＢＭプロットのハイブリッド化３．このＤＮＡを１
．５係アガロ−スケ８ル（菓９Ａ〆１）で分別し、プロ
ットをＭＯＸ−由来合成ＭＡプローブン昆会合物ハイブ
リッドした（第８図）。クローン１．１！１および５の
唯一のバンドは、第９Ａ図の矢印に示すように、ハイブ
リッドする（　１５９１図）。 レーンＭ：分子量マーカー、レーンＡ。 Ｂ、　ＣおよびＤ＝夫々クローン１，３゜４および５゜
レーンＥニラムダＬ　Ａ　７．ｉ。 第１０図　ＭＯＸクローン４の制限地図、λ（ＯＸ遺伝
子のサブクローン化およびシーフェンス化に使用した適
当な制限部位のみを示しである。構造）τＯＸ配列およ
び作ったＭ１３サブクローンを含む開口読み取り枠を表
わす。使用した制限部位二Ｂ− ＢａｍＨ工、ＷＴ＝　ＥｃｏＲ工、Ｅ、　＝　ｇｃｏＲ
Ｖ　。 Ｐ　＝　Ｐｏｔ工、Ｓｌ　＝　５ａｌＩ、Ｓｃ　＝　Ｓ
ａｃ工、Ｓｔ　　＝　　Ｓｔｕ工、　Ｈ＝　　Ｈｉｎｄ
ＩＩ工、　Ｓｐ　　＝　　Ｓｐｈ工、Ｋ　＝　Ｋｐｎｌ
、）］ｇ　＝　Ｈｇ１Ａ１およびＸ　＝　Ｘｍａ工、Ｆ
ｌｌＡ、Ｂ図　）、１０Ｘ　栴造遺伝子のヌクレオチｒ
−己タリおよびその５′−および３′−フランキング配
列。 ｉｌ　２Ａ、　　Ｃ７ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼ、Ｉｆｆ伝が）１．　ｆ：リモーファの染色体Ｍ
ＯＸ　；２１云子に組みこむことによるプラスミＰｐｕ
Ｒ３１０５の構築。 第１２Ｂ図　グロモーターＭＯＸ−ネオマイシンホスホ
トランスフェラーゼアダプター断片。 第１６図　公表されたアミノ酸配列から誘導されろ。Ａ
Ａ、Ｏ遺伝子のＤＮＡ配列。この遺伝子は約５０ヌクレ
オチド長さのオリゴヌクレオチド中Ｈ．ポリモーフアの
最適コドンに合成する。サブクローンのために使用する
制限部位を示す。Ｈｇ１Ａニ一５ａｌＩ断片は構造ＡＡ
Ｏ遺伝子と１．１ＯＫプロモ一ター間のアダプターを形
成する。翻訳開始コドン（−ｎｅｔ　）と停止コドン（
臀蒼−ｋ）を示す。構造配列は１〜１０４４であり、 ＭＯＸ　７′Ｊロモーターは−３４〜−１である。 第１４Ａ図　ｐＵＲ３００３の構築、それによりＡＡＯ
遺伝子はＨ，ポリモーフ丁の染色体ＭＯＸ遺伝子に組み
こむ。ＡＡＯ遺伝子の活性に関する選択。 デ１４Ｂ図　ｐＵＲ３００４の構築、それによりＡＡＯ
遺伝子はＨ，ポリモーフチ１ｅｕ−誘導体の染色体ＭＯ
Ｘ遺伝子に絹みこむ。Ｉｅｕ”についての選択。 第１４Ｃ図　ｐＵＲ８５２８−０３の構築。ｐｃＲ１配
列の除去および二１Ｊ　ｌａｃ　ＵＶ　５プロモーター
により、このプラスミドはｐＵＲＹ５２８−０３より約
２．２　ｋｂ短かい。 第１５図　公表されたアミノ酸配列から誘導した、Ｉ（
ＧＲ’Ｆ遺伝子のＤＮＡ配列。この遺伝子は約５０ヌク
レオチド長さのオリゴヌクレオチドにおけるＨ、ポリモ
ーフ丁の最適コドンに合成する。Ｈｇ１Ａ工、Ｈｉｎｄ
Ｉ工Ｉおよび８ａｌ工部位はサブクローニングのために
使用する。Ｈｇ　ｉＡニーＨｉｎｄエエエ断片は構造Ｈ
ＧＲＦ遺伝子とＭＯＸプロモーター間のアダプターを形
成する。翻訳開始コドン（ｍｅｔ　）と停止コドン（−
−−）を示す。 構造配列は１〜１４０であり、ＭＯＸ　７°ロモーター
は−３４〜−１である。 第１６Ａ図　ｐＵＲ３２０３の構築、それによりＨＧＲ
Ｆをコードする遺伝子はＢ、ポリモーフ丁の染色体ＭＯ
Ｘ遺伝子に組みこむ。 ＨＧＲＦの免疫活性に対する選択。 第１６Ｂ図　ｐＵＲ３２０＆の構築、それによりＨＧＲ
ＦをコーＦする遺伝子はＨ，ポリモーフ丁１ｅｕ−＋Ｊ
導体の染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。ｌｅｕ＋につい
て選択。 第１６（”図　ｐＵＲ３２０５の構築、それによりＨＧ
ＲＦをコードする遺伝子は、Ｈ，ポリモーフ丁に自律的
に復製するＨＡＲ３−ｉ−含有プラスミドに挿入される
。ｕｒａ−変異株の形質転換体により選択。 第１６Ｄ図　１：ｌＵＲ３２０９の構築、それによりＨ
ＧＲＦをコードする遺伝子は、構造ＭＯＸ遺伝子に融合
した、Ｈ，ポリモーフ丁の染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこ
む、ＨＧＲＦはＣＮＢｒ分解により融合タン白質から切
断する。　ＨＧＲＦの免疫活性に関する選択。 第１６Ｅ図　ｐＵＲ３２１０の構築、それによりＨＧ　
ＲＦをコードずろ遺伝子は、構造ＭＯＸ遺伝子に融合し
、たＨＡＲ８−１−含什プラスミドに挿入されろ。第１
６（’図のように選択。 第１６７図　ｐＵＲ３２１１の構築、それによりＨＧＲ
Ｆをコードする遺伝子は、第１１１．造ＭＯＸ遺伝子に
融合した、Ｈ，ポリモーノア １ａｌｌ−銹導体の染色体ＪＪＯＸ遺伝子に組みこむ。 ｌｅｕ＋について辺択。 第１７図　公表されたアミノ酸配列から６心された、Ｈ
ＧＲＦ遺伝子のＤＮＡ配列。この遺伝子を第１５図のよ
う１（合成するが、才ｊ〜造ＭＯＸ　遺伝子のユニーク
なＫｐｎ工部位に挿入できるように構築する。したがっ
て、遺伝子の両側１ｃＫｐｎＩ部位を供した。 Ｋｐｎｉ　−Ｈｉｎｄエエエ断片はサブクローニング用
に用いた。合成はＭＯＸ酵素に対する融合産物よしてで
ある。８２位の内部 ｍｅｔ　（ＡＴＧ　）はｃｙｓ　（ＴＧＴ　）に転換す
る。 翻訳開始（ｍθｔ）および停止（簀脣餐）コドンを示す
。 １ｉ　８Ａ、Ｂ、Ｃ図　ＤＡＳ　３を造遺伝子のヌクレ
オチド配列とその５′−および６′−フランキング配列
。 第１９図　ＤＡＳ−ラムダクローンの制限地図。唯一の
適切な制限部位を示すが、ＭＯＸ遺伝子のサブクローン
およびシーケンス化に用いた。構造ＤＡＢ配列および作
った Ｍ１３サブクローンを含む開口読み取り枠が示されてい
る。 第２０図　ＤＡＳとＭＯＸ遺伝子の一１０００領域にお
ける同一配列。 〜、２゜ Ｈｔｎ　ｄ　Ｉ　ｌ　ｌ Ｓ ２０□ ＣＣＡ　ＧＡＣＧＡＡ　ＴＴＣ ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣ −Ｇ１ｙ−Ｇ１ｙ−女−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｃｙｓ−Ｃ
ｙ−Ａｌ　ａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌ
　ｎ−ＡｓＡ Ａ ｓ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−”　−Ｌｅｕ−−Ｌｅｕ ＡＢＣＤＥ ９゜ ＡＢＣＤＥ ＧＣＴ　　ＧＴＧ　　ＧＣＣＧＴＧ　　ＡＧＡ　　ＡＣ
Ａ　　ＧＴＧ　　ＣＣＡ　　ＡＴＧ　　ＡＡＧ　　ＣＣ
Ｔ　Ｃ’ｒＧＴＨＲＰＨＥ　　ＡＲＧ　　ＡＬＡ　　Ａ
ＲＧ　　ＬＹＳ　　ＧＬＮ　　ＩＬＥ　　ＶＡＬ　　Ｉ
ＬＥ　　ＳＥＲＣＹＳＡＣＣＴＴＣＡＧＡ　　ＧＣＣＡ
ＧＡ　　ＡＡＧ　　ＣＡＧ　　ＡＴＴ　　ＧＴＧ　　Ａ
ＴＣＴＣＣＴＧＣＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＡＲＧ　　ＳＥ
ＲＧＬＹ　　ＩＬＥ　　ＧＬＹ　　ＡＬＡ　　ＡＬＡ　
　ＨＩＳ　　Ｈａｓ　　ＬＥＵＣ’［’ＣＣＡＧ　　Ａ
ＣＡ　ＴＣＴ　　ＧＧＴ　　ＡＴＴ　　ＧＧＴ　　ＧＣ
Ａ　　ＧＣＴ　　ＣＡＣＣＡＣＴＴＧ（イの４） ＡＡＣＣＣＴ　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＣＣＴ　　ＧＴＧ
　　ＴＣＣＡＧＡＧＬＹ　　ＴＨＲＩＬＥ　　ＳＥＲＳ
ＥＲＰＲＯＬＥＵ　　ＶＡＬＧＧＡ　　ＡＣＣＡＴＣＴ
ＣＧ　　ＴＣＴ　　ＣＣＴ　　ＣＴＧ　　ＧＴＧ八ＲＧ
　　ＳＥＲＶＡＬ　　ＧＬＹ　　ＶＡＬ　　ＬＹＳ　　
ＰＲＯＩＬＥＡＧＡ　　ＴＣＣＧＴＧ　　ＧＧＧ　　Ｇ
ＴＣＡＡＧ　　ＣＣＡ　　ΔＴＣＶΔＬ　八ＳＰ　　Ｌ
ＥＵ　　ＰＲＯＧＬＹ　　ＶＡＬ　　ＧＬＹ　　ＧＬＬ
Ｉ　　ＡＳＮ　　［’１４Ｅ　　ＧＬＮ　　ＡＳＩ）１
Ｃ，ＴＣＣＡＣＣＴＧ　　ＣＣＡ　　ＧＧＴ　　ＧＴＧ
　　ＧＣ；Ｔ　　ＣＡＧ　　ＡＡＴ　　ＴＴＣＣＡＧ　
　ＧＡＣ（てＹＲＶＡＬ　　ＬＹＳ　　ＰＲＯＡＳＰ　
　ＶＡＬ　　ＰＲＯＴＨＲＰＨＥ　　ＡＳＰ　　ＡＳＩ
’　　ＰＩＩＥ　　１ＬＹＳ　　ＡＬＡ　　ＡＬＡ　　
ＰＨＥ　　ＡＳＰ　　ＧＬＮ　　ＴＲＰ　　ＴＹＲＳＥ
ＲＡＳＮ　　ＬＹＳ　　ＡＳＰ　　（ＡＡＧ　　ＧＣＣ
ＧＣ’ｒ　　ＴＴＣＧＡＣＣＡＧ　　ＴＧＧ　　ＴＡＣ
ＴＣＣＡＡＣＡＡＧ　　ＧＡＣ（ＧＬＵ　　Ａｔ、Ａ　
　ＧＬＹ　　ＶＡＬ　　ＬＹＳ　　ＩＬＥ　　ＡＲＧ　
　ＰＲＯＴＩＨｔ　　ＧＬＬＩ　　ＧＬＵ　　ＧＬＵ　
　ＩＧＡΔ　ＧＣＣＧＣＡ　ＧＴＣ、ＡＡＣＡＴＣＡＧ
Ａ　、ＣＣＴ　　ＡＣＣＧＡΔ　ＧへＣＧΔＧ　（ＡＲ
Ｇ　　ＡＲＧ　　ＧＬＹ　　ＴＹＲＡＬＡ　　ＧＬＵ　
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）ＲＯ。 ＡＧＡ　　ＣＧＣＧＧＣＴＡＣＧＣＡ　　ＧＡＧ　　Ｔ
ＡＣＴＴＣＧＡＧ　　ＡＡＣＡＡＧ　　ＣＣＡ　　＋Ｖ
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　　ＧＬＬＩ　　ＴＹＲＰＲＯＰＩＩＥ　ＳＥＲＡＲＧ
　　ＧＬＹ　　Ｐｌ［Ｅ　　′ＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣＴ
Ｇ　　ＧＡＧ　　ＴＡＴ　　ＣＣＡ　　’ｒＴＣＴＣＣ
ＡＧＡ　　ＧＧＡ　　ＴＴＴ　　１ｆの１） ＩＩｓ　　ＴＹＲＣＹＳ　　ｐＨ巳　１）ＩＩＥ　　Ｔ
ｌ１Ｒｌ’Ｒｏ　　ＴＹＲ：ＡＣＴＡＣ’ｒＧＴ　　Ｔ
ＴＣＴ’ｒＣＡＣＴ　　ＣＣＡ　　ＴＡＣＩＡＬ　　Ａ
ＲＧ　　ＧＬＹ　　ＡＳＰ　　１）ＲＯＶＡＬ　　ＡＬ
Ａ　　ＧＴ、Ｎ；’ｒＣＡＧＧ　　ＧＧＣＧＡＣＣＣＡ
　　ＧＴＴ　　ＧＣＣＣＡＧ；ＬＹ　　ＰＲＯＬＥＵ　
　ＴＩＩＲＴＩＩＲＡＳＮ　　ＧＬＹ　　ＩＬＥ；ＧＴ
　　Ｃ：ＣＡ　　ＴＴＧ　　ＡＣＣＡＣ：ＣＡＡＣＧＧ
Ｔ　　ＡＴＴ、ＥＵ　　ＡＬＡ　　Ｔｉ１ＲＡＬＡ　　
ＡＳＰ　　ＧＬＬＩ　　八ＳＰ　　Ｐｌ（Ｅ：ＴＧ　　
ＧＣ’Ｌ”　　ＡＣＣＧＣＧ　　ＧＡＣＧＡＧ　　ＧＡ
ＣＴＴＣｋｓＰＬＹＳＰＩ＜ＯＬＥＵＭＥＴＨＩＳ’ｒ
ＹＲ５ＥＲ；ＡＣＡＡＧ　　ＣＣＴ　　ＣＴＧ　　ＡＴ
ＣＣＡＣＴＡＣＴＣＴ＋ｌＯ４１５ ）ＲＯＡＳＮＧＬＹＬＹＳＩ’ｌｔＥＩ（ＥＴＴＨＲＭ
ＥＴ：ＣＴ　　ＡＡＣＧＧＣＡＡＧ　　ＴＴＣＡ’ｒＧ
　　ＡＣＣＡＴＧ′４３０　　　　　　　　　　　　　
　　　　４３５／ＡＬ　　ＡＲＧ　　ＩＬＥ　　ＴＩＩ
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　　ＰＲＣ−（イ／）１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）適当な条件下で微生物を培養し、任意には生成し
   た酵素を濃縮しついでこの濃縮酵素を公知方法により集
   取してオキシドリダクターゼを製造する方法において、
   組換えＤＮＡ技術により得、そしてオキシドリダクター
   ゼを産生しうる微生物を使用することを特徴とする、上
   記方法。 （２）微生物は １）アルコールオキシダーゼ ２）アルキルアミンオキシダーゼおよびベンジルアミン
   オキシダーゼを含むアミンオキシダーゼ、 ３）Ｄ−アラニンオキシダーゼ、リジンオキシダーゼを
   含むアミノ酸オキシダーゼ、 ４）コレステロールオキシダーゼ、 ５）尿酸オキシダーゼ、 ６）キサンチンオキシダーゼ、 ７）クロロパーオキシダーゼ、および ８）アルデヒドオキシダーゼ から成る群から選択した少なくとも１種の酵素を産生し
   うる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）微生物はカビ又は酵母である、特許請求の範囲第
   １項又は第２項記載の方法。 （４）カビ又は酵母はアスペルギルス属、カンジダ属、
   ゲオトリカム属、ハンセヌラ属、レンジト属、ナドソニ
   ア属、ピチア属、ポリア属、ポリポラス属、サツカロミ
   セス属、スポロボロミセス属、トルロプシス属、トリコ
   スポラ属およびゼンデラ属から成る群から選択する、特
   許請求の範囲第３項記載の方法。 （５）カビ又は酵母はアスペルギルス・ジヤポニカス、
   アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、カ
   ンジダ・ボイジニ、ハンセヌラ・アノマラ、ハンセヌラ
   ・ポリモーフア、ハンセヌラ・ウインゲイ、クローケラ
   ・ｓｐ．２２０１およびピチア・パストリス種から選択
   する、特許請求の範囲第４項記載の方法。 （６）微生物はジヒドロキシアセトンシンターゼ酵素を
   産生することができ、ホルムアルデヒドからジヒドロキ
   シアセトンの生成を促進する酵素を産生する、特許請求
   の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の方法。 （７）特許請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項
   に記載の方法により得たオキシドリダクターゼを酸化方
   法に使用すること。 （８）漂白活性を有する洗剤組成物又は硬質面洗浄組成
   物を含む漂白組成物であつて、特許請求の範囲第１項か
   ら第５項のいずれか１項に記載の方法により得たオキシ
   ドリダクターゼおよびその基質を含有することを特徴と
   する、上記組成物。 （９）組換えＤＮＡ技術により製造でき、かつ特許請求
   の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の方法に
   使用するのに適したオキシドリダクターゼを産生しうる
   、微生物。 （１０）組換えＤＮＡ技術により製造でき、かつ特許請
   求の範囲第６項記載の方法に使用するのに適したジヒド
   ロキシアセトンシンターゼ酵素を産生し得、さらにオキ
   シドリダクターゼを産生し得る、微生物。 （１１）特許請求の範囲第９項記載の形質転換微生物の
   調製方法において、構造遺伝子の発現を調節する１種以
   上の他のＤＮＡ配列と共にオキシドリダクターゼをコー
   ドするＤＮＡ配列をエピソームベクターを介して微生物
   に導入するか又はゲノムにて統合させて、微生物をオキ
   シドリダクターゼ産生可能にさせることを特徴とする、
   上記方法。 （１２）特許請求の範囲第１０項記載の形質転換微生物
   の調製方法において、構造遺伝子の発現を調節する１種
   以上の別のＤＮＡ配列と共にジヒドロキシアセトンシン
   ターゼ酵素をコードするＤＮＡをエピソームベクター又
   はゲノム中の統合を介して導入し、微生物をジヒドロキ
   シアセトンシンターゼ酵素（ＤＨＡＳ酵素）を産生させ
   得ることを特徴とする、上記方法。 （１３）天然のＤＮＡおよび／又はｃＤＮＡおよび／又
   は化学的に合成したＤＮＡから組換えＤＮＡ技術により
   得ることができることを特徴とする、オキシドリダクタ
   ーゼをコードするＤＮＡ配列。 （１４）アルコールオキシダーゼをコードする、特許請
   求の範囲第１３項記載のＤＮＡ配列。 （１５）ポリペプチド１−６６４（ＭＯＸ）をコードす
   る第１１Ａ＋１１Ｂに示したＤＮＡ配列１−１９９２（
   ＭＯＸ遺伝子）を有し、そのアミノ酸配列は第１１Ａ＋
   １１Ｂに示される、特許請求の範囲第１４項記載のＤＮ
   Ａ配列。 （１６）オキシドリダクターゼをコードする構造遺伝子
   および特定の微生物又はある群の微生物中構造遺伝子の
   発現を調節する１種以上の別のＤＮＡ配列を含む、ＤＮ
   Ａ配列の組み合わせ。 （１７）第１１Ａ図に示した上流ＤＮＡ配列−１から約
   −１５００の少なくとも一部および／又は第１１Ｂ図に
   示した下流ＤＮＡ配列１９９３から約３２６０（ＭＯＸ
   遺伝子の制御領域）の少なくとも一部を含む、特許請求
   の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （１８）第１１Ａ図に示した上流ＤＮＡ配列の少なくと
   もポリヌクレオチド−１０５２から−９８７を含む、特
   許請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （１９）第１１Ａ図に示した少なくともポリヌクレオチ
   ド−１０５２から−９８７の欠失により得ることができ
   る変性ＭＯＸプロモーター配列を含む、特許請求の範囲
   第１７項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （２０）第１８Ａ図＋１８Ｂ図に示した上流ＤＮＡ配列
   −１から約−２１２５の少なくとも一部および／又は第
   １８Ｃ図に示した下流ＤＮＡ配列２１０７から約２３５
   ０の少なくとも一部（ＤＡＳ遺伝子の制御領域）を含む
   、特許請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列の組み合わ
   せ。 （２１）第１８Ａ図に示した上流ＤＮＡ配列の少なくと
   もポリヌクレオチド−１０７６から−９３７を含む、特
   許請求の範囲第２０項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （２２）第１８Ａ図に示した少なくともポリヌクレオチ
   ド−１０７６から−９３７の欠失により得ることができ
   る変性ＤＡＳプロモーター配列を含む、特許請求の範囲
   第２０項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （２３）真核生物、カビ又は酵母のオキシドリダクター
   ゼをコードする構造遺伝子を含む、特許請求の範囲第１
   ６項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （２４）ハンセヌラ属、望ましくはＨ．ポリモーフアの
   酵母のオキシドリダクターゼをコードする構造遺伝子を
   含む、特許請求の範囲第２３項記載のＤＮＡ配列の組み
   合わせ。 （２５）オキシドリダクターゼをコードする構造遺伝子
   はアルコールオキシダーゼをコードする、特許請求の範
   囲第１６項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （２５）構造遺伝子はポリペプチド１−６６４（ＭＯＸ
   ）をコードする第１１Ａ図＋１１Ｂ図に示したＤＮＡ配
   列１−１９９２（ＭＯＸ遺伝子）であり、そのアミノ酸
   配列は第１１Ａ図＋１１Ｂ図に示される、特許請求の範
   囲第２５項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （２７）ＤＨＡＳをコードする構造遺伝子を含む、特許
   請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （２８）第１８Ｂ図＋１８Ｃ図に示すアミノ酸配列を有
   するＤＨＡＳをコードする構造遺伝子を含む、特許請求
   の範囲第２７項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （２９）組換えＤＮＡ技術により、ＤＮＡ配列を変性し
   、オキシドリダクターゼをコードする機能又はその制御
   機能を保持する、特許請求の範囲第１６項から第２８項
   のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （３０）ある特定の宿主微生物の後代に上記組み合わせ
   を安定的に遺伝させうる１種以上のＤＮＡ配列を含む、
   特許請求の範囲第１６項から第２９項のいずれか１項に
   記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （３１）特異的酵素又はその他のタン白質を産生するの
   に微生物宿主の形質転換に適するＤＮＡ配列の組み合わ
   せで、そのＤＮＡ配列の組み合わせはレギユロン、その
   特異的酵素又はその他のタン白質をコードする構造遺伝
   子および任意にはターミネーターを含む組み合わせであ
   つて、レギユロンは第１１Ａ図に示すＭＯＸ遺伝子のレ
   ギユロン−１から約−１５００の少なくとも一部又は第
   １８Ａ図に示すＤＡＳ遺伝子のレギユロン−１から約−
   ２１２５の少なくとも一部から成る群から選んで使用し
   、その修飾はレギユロン機能に修復を与えず、そして任
   意にはターミネータは第１１Ｂ図に示すＭＯＸ遺伝子の
   ターミネータ１９９３から約３２６０の少なくとも一部
   又は第１８Ｂ図に示すＤＡＳ遺伝子のターミネータ２１
   １０から約２３５０の少なくとも一部から成る群から選
   択して使用し、その修飾はターミネーター機能に修復を
   与えないことを特徴とする、上記ＤＮＡ配列の組み合わ
   せ。 （３２）ハンセヌラ酵母、特にハンセヌラ・ポリモーフ
   アの形質転換に適する、特許請求の範囲第３１項記載の
   ＤＮＡ配列の組み合わせ。 （３３）サツカロミセス酵母、特にサツカロミセス・セ
   レビシエの形質転換に適する、特許請求の範囲第３１項
   記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （３４）特異的酵素又は他のタン白質をコードする構造
   遺伝子は、その特異的酵素又はその他のタン白質がペル
   オキシソームすなわらこの微生物宿主の同一ミクロボデ
   イにトランスロケーションするように、その機能を修復
   せず、この特異的酵素又はその他のタン白質を修飾する
   ＭＯＸ（第１１Ａ＋１１Ｂ図）をコードする構造遺伝子
   由来のＤＮＡ配列を含む、特許請求の範囲第３１項記載
   のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （３５）ジヒドロオキシシンターゼ酵素をコードするＤ
   ＮＡ配列であつて、天然のＤＮＡおよび／又はｃＤＮＡ
   および／又は化学合成したＤＮＡから組換えＤＮＡ技術
   により得ることができる、上記ＤＮＡ配列。 （３５）ポリペプチド１−７０２（ＤＨＡＳ）をコード
   する、第１８Ｂ＋１８Ｃ図に示すＤＮＡ配列１−２１０
   ６（ＤＡＳ遺伝子）を有し、そのアミノ酸配列は第１８
   Ｂ＋１８Ｃ図に示す、特許請求の範囲第３５項記載のＤ
   ＮＡ配列。 （３７）特定の微生物又は微生物群に構造遺伝子の発現
   を調節する１種以上のＤＮＡ配列およびジヒドロキシア
   セトンシンターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の組み合
   わせ。 （３８）特許請求の範囲第３６項記載のＤＮＡ配列（Ｄ
   ＡＳ遺伝子）および第１８Ａ＋１８Ｂ図に示す上流ＤＮ
   Ａ配列−１から約−２１２５の少なくとも一部および／
   又は第１８Ｃ図に示す下流ＤＮＡ配列２１０７から約２
   ３５０の少なくとも一部（ＤＡＳ遺伝子の制御領域）お
   よび／又は第１１Ａ図に示す上流ＤＮＡ配列−１から約
   −１５００の少なくとも一部および／又は第１１Ｂに示
   す下流ＤＮＡ配列１９９３がら約３２６０の少なくとも
   一部（ＭＯＸ遺伝子の制御領域）から成る、特許請求の
   範囲第３７項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （３９）第１８Ａ図に示す上流ＤＮＡ配列の少なくとも
   ポリヌクレオチド−１０７６から−９３７又は第１１Ａ
   図に示す上流ＤＮＡ配列の少なくともポリヌクレオチド
   −１０５２から−９８７をそれぞれ含む、特許請求の範
   囲第３８項記載のＤＮＡ配列の組み合わせ。 （４０）適当な条件下で微生物を培養し、任意にはポリ
   ペプチドを濃縮しそして公知方法でそれを集取すること
   により、タン白質や酵素の如きポリペプチドを製造する
   方法において、組換えＤＮＡ技術により得、かつこのポ
   リペプチドをコードする構造遺伝子を有する微生物を使
   い、その構造遺伝子の発現はレギユロンの調節下で行な
   い、そのレギユロンはプロモーターおよびハンセヌラ・
   ポリモーフアＣＢＳ４７３２のＭＯＸ遺伝子の少なくと
   も−１０５２から−９８７又はハンセヌラ・ポリモーフ
   アＣＢＳ４７３２のＤＡＳ遺伝子の−１０７６から−９
   ３７領域、又は他のメチルトロフイツクのカビ又は酵母
   の相当する領域、又はこれらの任意の領域の有効修飾か
   ら成ることを特徴とする、上記ポリペプチドの製造法。 （４１）プロモーターはハンセヌラ・ポリモーフア由来
   である、特許請求の範囲第４０項記載の方法。 （４２）微生物はカビ又は酵母である、特許請求の範囲
   第４０項又は第４１項記載の方法。 （４３）カビ又は酵母はアスペルギルス属、カンジダ属
   、ジオトリカム属、ハンセヌラ属、レンジト属、ナドソ
   ニア属、ピチア属、ポリア属、ポリポラス属、サツカロ
   ミセス属、スポロボロミセス属、トルロプシス属、トリ
   コスポラ属およびゼンデラ属から選択する、特許請求の
   範囲第４０項から第４２項のいずれか１項に記載の方法
   。 （４４）カビ又は酵母はアスペルギルス・ジヤポニカス
   、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、
   カンジダ・ボイジニ、ハンセヌラ・アノマラ、ハンセヌ
   ラ・ポリモーフア、ハンセヌラ・ウインゲイ、クロツケ
   ラｓｐ．２２０１およびピチア・パストリスから選択す
   る、特許請求の範囲第４３項記載の方法。 （４５）微生物はハンセヌラ・ポリモーフアである、特
   許請求の範囲第４４項記載の方法。 （４６）構造遺伝子は、遺伝子産物をペルオキシソーム
   すなわら微生物宿主の均等マイクロボデイにトランスロ
   ケーションする１種以上のＤＮＡ配列を有する、特許請
   求の範囲第４０項から第４５項のいずれか１項に記載の
   方法。 （４７）ＤＮＡ配列はＭＯＸ遺伝子又はペルオキシソー
   ムすなわらミクロボデイにＭＯＸトランスロケーション
   するその一部から成る、特許請求の範囲第４６項記載の
   方法。