JP2860100B2 - ヒトのマンガンスーパーオキシドジスムターゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、遺伝子工学によるヒトのMnスーパーオキシ
ドジスムターゼ（hMn−SOD）の製造法、この酵素をコー
ドするDNA配列、これらDNAを含む適当なベクター及びこ
れらDNA配列を発現しうる宿主細胞、及び酵素hMn−SOD
それ自身に関連している。この酵素の使用のためのサジ
ェッションも述べられている。

〔従来技術〕

生物学的システムにおける種々の生化学過程（例え
ば、吸収鎖における酸化還元過程、細胞質における酸
化）の結果として、よく知られているように、連続して
O₂ ^-ラジカルが生成しており、これらラジカルは、非常
に細胞毒性があり、そして組織に障害を与える。それら
ラジカルによるコラーゲン及びシノビアル液の分解が病
理学的状態（例えば、リューマチに起因する病気の経過
のような）に関して議論されている（パスクイア（Pasq
uire）、C,等，炎症（Inflammation）８巻,27−32頁,19
84年）。真核性細胞は２つの型のスーパーオキシドジス
ムターゼを含み、その１つは、サイトゾル中に著しく生
じ（Cu/Zn−SOD）、一方他方は、主にミトコンドリア中
に生じる（Mn−SOD）。肝臓のミトコンドリアにおい
て、Mn−SODが肝臓細胞のサイトゾル中に検出されてい
るにもかかわらず、Mn酵素が内膜を囲むマトリクス中に
局在化していることが分っている（マクコード（MC Cor
d）、J.M.等,1977年，アカデミックプレス（N.Y.）版，
“スーパーオキシド・アンド・スーパーオキシド・ジス
ムターゼ”（A.M.ミシェルソン（Michelson）、J.M.マ
クコード（McCord）、I.フリドビッチ（Fridovich）
編）、129−138頁）。

原核生物中には、Mn−SOD同様係止手Fe−SODがある。
前者は、ある種の植物中同様、藻類及び原生動物中にも
発見されている（ブリッジス（Bridges）S.M.,サリン
（Salin）、M.L.,プラント・フィジオロジー（Plant Ph
ysiol,）68巻,275−278頁、1981年）。これら著しい活
性をもつ酵素は、不均一化O₂ ^-＋O₂ ^-＋2H⁺→H₂O₂＋O₂を
触媒し、そして、スーパーオキシドラジカルのこの不均
一化により、その濃縮及び細胞への障害効果を防ぐ。肝
臓の小胞体とは違って、ミトコンドリアの膜は、動物細
胞におけるO₂ ^-生成の最も重要な部位の１つとみなすこ
とができ、その結果、ミトコンドリアが、使用可能な自
分自身の特別なSOD（Mn−SOD）を有するということは驚
くべきことではない。

原核性Mn−SOD（大腸菌）の構造遺伝子をクローン化
し、そして、その染色体sodA遺伝子の位置を決めた（ト
ウアチ（Tonati）D,ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー（J.Bact.）155巻、1078−1087頁（1983））。

ミトコンドリアのイーストMn−SODの699塩基対長のヌ
クレオチド配列を決定し、そして、その前駆体及び成熟
タンパク質の一次構造をそれから誘導した一前駆体は26
123Da及び成熟タンパク質は23059Daの分子量（マレス
（Marres）C.A.M.等，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）147巻、153−
161頁（1985年））。このように、Mn−及びCu/Zn−SOD
（MW＝14893）,EP−A138111）はその分子量が有意に異
っている。

ヒトの肝臓由来のMn−SODの完全なアミノ酸配列は、
D.バラ（Barra）により報告され、そして、この報告に
より、hMn−SODは、196個のアミノ酸から成り立つこと
が支持されている（バラ（Barra）、Ｄ等、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m,）259巻12595〜12601頁、1984年）。一方、赤血球由
来のヒトのCu/Zn−SODは、153個のアミノ酸から成り立
ち（ヤブシュ（Jabusch）、J.R.,等，バイオケミストリ
ー（Biochemistry）,19巻,2310−2316頁,1980年）、そ
して、hMn−SODと相同的配列は示さなかった（バラ（Ba
rra）、Ｄ等、上記参照）。

一般的に、ある炎症過程に対する予防機能を、スーパ
ーオキシドジスムターゼは持っている。特に、Mn−SOD
の不足は、リューマチ性関節炎の進行に重要な意味をも
っていることが支持されている（パスクイア（Pasquie
r）、C,等上記参照）。SODにも、アルコール由来の肝臓
障害に対する予防的効果があると考えられている（デル
ビラノDel Villano）B.C.等、サイエンス（Seience）、
207巻、991−993頁（1980年））。

ヒトのSODのクローニング及び発現については、ヒト
の肝臓のヒトCu/Zn−SODに対してのみ知られている（EP
−A138111）。

スーパーオキシドジスムターゼ、特にhMn−SODの上述
の基本的性質から考えて、治療そして、または診断への
その使用に対する需要が期待される。この目的のために
は、均一な型の、同種、すなわちヒトの、十分な量のMn
−SODを手に入れることが望ましい。それから誘導され
る、考えうる目的には、例えば治療的使用の後、予期で
きる免疫学的反応を最小限にする、もしくは防止するこ
とである。

ベクターDNAによる外来DNAの組換えのための技術の発
展及び微生物中で安定な形の後者を定着させ、そして、
その中でそれを発現できることによってのみ、大量に、
動物又はヒト由来の均一なタンパク質を産生するのが可
能になった。ここでの目的は別で、すなわち、このよう
にして調製した酵素、hMn−SODは、本来の純粋な、hMn
−SODに特徴的生物学的活性をもっていなければならな
い。

〔発明の内容〕

それゆえ、本発明の目的は、まず第１に、遺伝子工学
を使って、この酵素をコードするDNA配列を発現もしく
は産生すること、及びこの配列を得る方法を示すことで
ある。

本発明に従がい、この問題は、合成的に生産したDNA
プローブ分子を使い、胎盤由来のヒトの細胞から得たcD
NA遺伝子バンクを探索すること、及びそれにより、hMn
−SODをコードする遺伝子を単離することにより解決し
た。hMn−SODの遺伝子を得るため、mRNAを、従来法によ
り、望ましい酵素を生産する細胞から単離することがで
きる。種々の出発物質、例えば、肝臓又は胎盤のような
代謝的に活性な腺組織を用いることができる。単離した
mRNAを用いた逆転写酵素による合成という従来法により
得られるcDNAの生産、ひきつづく適当なベクターへの組
込み、及び完全なcDNA遺伝子バンクを得るための増殖の
後、後者を、この種の多くのプローブ混合物又は、決っ
た、放射性ラベルしたDNAプローブで探索することがで
きる。その遺伝子コードの縮退を考慮するため、決った
DNAプローブ混合物は、１つ及び同じアミノ酸に対する
全ての可能なヌクレオチド変化を示す、又は、合成すべ
き混合物のDNAプローブの数を可能な限り小さくし、探
索されるhMn−SOD DNA配列との相同性ができる限り高く
なるように選択されたものを好んで使用した。DNAプロ
ーブの合成における選択の別な基準は、これらのプロー
ブが、例えば、推定される遺伝子配列の３′及び５′末
端付近というように、少なくとも２つの独立した領域に
相補的であることを要求する。このように、例えば、２
つの独立したDNAプローブに対する、正の信号を示すク
ローンは、少なくとも２つの別々のハイブリダイゼーシ
ョンにより同定することができる。それから、これらの
クローンは、hMn−SODの実質的に一部分の、又は完全な
遺伝子を含むと予期できるので、それらは、hMn−SOD遺
伝子を単離するのにうまく用いることができる。

本発明に従って、DNAプローブのために用いる、特別
のDNA配列は、D.バラ（Barra）等（バラ（Barra）、D.
等、“オキシラジカル及びそのスキャベンジャーシステ
ム"1巻,336−339頁1983年）により報告されたヒトのMn
−SODのアミノ酸配列を用いて、肝臓組織から誘導し
た。特に、少なくとも５個のアミノ酸グループ、好まし
くは、８個のアミノ酸グループをコードする、想像上の
hMn−SOD DNA配列の２つの領域が好んで用いられるの
は、少なくとも14、好ましくは23塩基長のDNAプローブ
が有利だからである。特に、もし、DNAプローブが誘導
されたhMn−SOD DNA配列に相補的な場合は、その遺伝情
報が、アミノ酸グループ39〜46に対応し、そして、第２
のDNAプローブが既知アミノ酸配列のアミノ酸グループ2
00から207をコードするDNA領域に相補的であることが望
ましい。もちろん、同様に、他のMn−スーパーオキシド
ジスムターゼを用いて誘導したDNA配列もプローブとし
て使用することができる。

この種のDNAプローブを用い、hMn−SODをコードする
広範囲の領域を含む、次の式I aに対応するcDNA配列を
単離することができる陽性のクローンを得ることができ
る。

驚くべきことに、現在、発見されたcDNAは、いくつか
のアミノ酸グループ及びそれらの互いの長さにおいて、
報告されていたアミノ酸配列（バラ（Barra）、Ｄ等、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem,）259巻,12595−12601頁、1984年）とは異な
るアミノ酸配列をコードすることが分った。“バラ（Ba
rra）の配列”と、この配列でみられる差は、アミノ酸
部位42,88,109及び131（各々の場合Glnに代ってGlu）及
び部位123と124の間に、２つの付加的アミノ酸Gly及びT
rpの挿入であり、その結果本発明に従ってDNA配列は、1
98個のアミノ酸からなるhMn−SODに対応している。

また、一方、部位29（Lysの代りにGlnに対するコド
ン）のアミノ酸置換があり、この点で“バラ（Barra）
配列”及び式I aに対し、付加的差異をもつ、式I bに対
応する、hMn−SODをコードするcDNAも単離された。

バラ（Barra）の配列が正しく分析されていると仮定
すると、本発明に従ったヌクレオチドもしくはアミノ酸
配列を用いて、第１にそして、驚くべきことに、このこ
とは、hMn−SODの種々の遺伝子、又はその対立表示又は
アイソザイムの存在を示すという可能性を考えさせる。

完全なhMn−SODに必要な末端を欠いているcDNA保持ク
ローンを得ることは可能なので、本発明のもう１つの目
的は、hMn−SODに対する完全な遺伝子を調製することで
あった。

この目的は、種々の既知の戦略法により行うことがで
きる。例えば、得られた配列は、それ自体、DNAプロー
ブとして用いることができ、そして、そのcDNAバンク
を、完全な遺伝子又は、末端を失ったcDNAを検出するた
め、もう１度それを用いて探索することができ、もしく
は、完全なhMn−SOD遺伝子の同定後、単離するために、
遺伝子バンクに対するハイブリダイゼーション・プロー
ブとして、得られたDNA配列を用いることができる。

別に、hMn−SODの欠失末端に対応するヌクレオチド配
列を含むオリゴヌクレオチドを合成すること及び、適当
なリンカー連結後、これらオリゴヌクレオチドの助けを
かりて、hMn−SODに対する完全なcDNAを得ることの可能
性がある。この方法は、例えば、hMn−SODをコードし、
その５′末端が開始コドン（ATG）から直接始まるDNAを
得ることができるという有利さがある。

式IIのDNA配列は、本発明に従って、cDNAを完全なも
のにするというこの問題を解決するのに特に適している
ことが分った。イーストに適応するものと同様に既知の
コドンの参照に基づき、この配列は、例えば、アミノ酸
22又は26からコードし、５′開始コドンATGで始まり、
アミノ酸31に対するコドンで終る（His,一方、AAG〔Ly
s〕＝１）（シャープ（Shaep）、P,M,等，ヌクレイック
アシッズ・リサーチ（Nucl,Acids Res,）,14巻（13）51
25−5143頁,1986年） 同様に、他の既知の同義コドンを、hMn−SOD遺伝子を
完全なものにし、もしくは、イン・ビトロ（in vitro）
での全遺伝子、すなわち、細菌、例えば大腸菌における
至適コドン−アンチコドン置換を可能にし、そして翻訳
効率（グロスジーン（Grosjean）,H.フィアス（Fier
s）,W.,ジーン（Gene）18巻,199−209頁（1982年）、イ
ケムラ（Ikemura）,T.,ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー，バイオロジー（J.Mol.Biol,）151巻,389−407、198
1年）又は、ホ乳細胞における実際の条件に対応するコ
ドン（グランサム（Grantham）Ｒ等、ヌクレイック，ア
シッズ・リサーチ（Nucl,Acids,Res,）９巻,43−47頁,1
981年）を増加するものを合成するのに用いることがで
きる。後者はトランスホーメーション及びひきつづく、
ホ乳細胞中での発現に好んで使用される。

理論的には、例えばCNBr又はCNClを用いる、本来知ら
れている方法を用い、第１アミノ酸リジンで始めること
で、開始コドンATGによってコードされるメチオニン及
び成熟hMn−SODに先行するメチオニンを分離することが
可能である。しかし成熟酵素hMn−SOD中、例えば部位23
又は192に、他の内部メチオニン残基も生ずるので、そ
のような方法は、この場合に、hMn−SODの生物学的活性
に影響することなしに、付加的なＮ末端メチオニン残基
が残存する結果になるこどで、実際的ではない。

しかし、hMn−SOD cDNAを含むベクター上の望ましい
部位に、特別なアミノ酸をコードするコドンを位置させ
ることを期待できるので、適当な合成リンカーを、既知
法の中で用いる、酵素的切断も考えうる。例えば、トリ
プシン切断に対するArg又はLys又は、プロテアーゼ感受
性アミノ酸をコードするコドンが一般に用いられる。こ
れらは、開始コドンの前又は後、又はコード領域内に存
在させる。

本発明の付加的目的は、初めて、遺伝子工学により、
適当な宿主細胞において、hMn−SODをコードする配列を
発現すること、初めて、そのような方法を用いて、均一
な酵素hMn−SODを産生すること、それを単離し、そし
て、それを純粋な形に精製すること、及び初めて、この
ことに必要な操作を述べることである。

本発明に従がい、この目的は、例えば、式III a又はI
II bの、hMn−SODをコードするDNA配列で、場合によっ
ては、対応するシグナル、又はコントロール配列も含め
て、適当なベクター内に挿入し、そして、適当な宿主細
胞にトランスホームすることにより成し遂げられた。そ
のトランスホームした宿主細胞の培養後、生成したポリ
ペプチドを従来の方法で単離、精製した。

得られたポリペプチドは、次の式IV a及びIV bに対応
している。

式III a及びIII bで示した配列は特に，微生物特に大
腸菌又はS,セレビシアエ（sersvisiae）における、式IV
a及びIV bの非グリコシル化hMn−SODの調製に適してい
る。例えば、イーストにおけるグリコシル化の問題は、
タンパク質のグリコシル化に欠陥のある変異体（alg変
異体）を用いることにより避けることができる（例え
ば、ハフェイカー（Huffaker）T.C.,ロビンス（Robbin
s）P.W.プロシーディングス・イン・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc,Natl,Acad,Sci）USA.
80巻,7466−7470頁,1983年）。

もし必要であるか、又は的を得ているなら、例えば式
III a又はIII bに従って、完全なhMn−SOD遺伝子は、成
熟hMn−SODの第１のＮ末端アミノ酸の第１コドンの直
前、又は、開始コドンATGの直前に、リーダー又はシグ
ナル配列を置くこともある。このことは、hMn−SODは、
宿出細胞から排出され、そして、容易に培養培地から単
離できることを保証する。

この種のシグナル配列が述べられている。それらは、
宿主細胞において、翻訳後修飾過程により分離される、
一般的に疎水的なタンパク質成分をコードしている（デ
ービス（Davis）D.B.,タイ（Tai）,P.−C.,ネイチャー
（Nature）283巻,433−438頁,1980年，パールマン（Per
lman）,D.,ハルバーソン（Halvorson）,H.O.,ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー，バイオロジー（J.Mol,Bio
l,）167巻,391−409頁,1983年）。

もし、ATGコドンが、hMn−SODの第１アミノ酸の前に
構築されたなら、リジンの前にＮ末端メチオニンを含む
遺伝子産物が得られる。タンパク質をペリプラズマ中に
分泌するために、そして、それらを正しくプロセシング
するために、原核生物のシグナル配列を用いることが知
られている（デービス（Davis）,B.D.,タイ（Tai）,P.
−C.1980年）。

明らかに、hMn−SOD DNA配列の単離及びクローニング
の後、特に、この配列によりコードされる酵素を修飾す
ることが可能である。酵素の修飾は、例えば、合成オリ
ゴヌクレオチドを用いた、制御されるイン・ビトロ（in
vitro）での突然変異、それにより、hMn−SODの触媒的
性質に影響を与えること、及び新しい酵素活性を得るこ
とにより、行なわれる。これらのタンパク質の取扱うた
めの基本的な操作ステップは、よく知られている（例え
ば、ウインター（Winter）,G.等，ネイチャー（Natur
e）299巻,756−758頁,1982年；ダルバディー マクファ
ーランド（Dalbadie−Mc Farland）,G.等，プロシーデ
ィング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Proc,Natl,Acad,Sci）USA.79巻,6409−6413頁,19
82年）。

hMn−SOD遺伝子のクローニング、すなわち増殖及び精
製のために、大腸菌、好ましくは大腸菌c600（ネルソン
（Nelson）等、ヴィロロジー（Virology）108巻,338−3
50頁,1981年）又はJM101又は、少なくとも１つの既知Su
p−発現型を有する大腸菌を用いることができる。しか
し、そのクローニングも、枯草菌（B,subtilis）のよう
なグラム陽性菌で行うこともできる。この種のシステム
は、何度も報告されてきている。

本発明に従って、hMn−SOD遺伝子を発現するのに適し
た宿主には、微生物及び多細胞器官の培養物が含まれ
る。微生物という語は、原核生物、すなわち、グラム陰
性又は、グラム陽性細菌及び原生生物、藻類、菌類又は
より高等な原生生物を意味している。グラム陰性細菌の
うち、エンテロバクテリアセアエ、例えば大腸菌は好ま
しい宿主であり、一方、グラム陽性細菌のうち、バチラ
セアエ及び非病原性のマイクロコカセアエ、例えば枯草
菌及びスタフィロコッカス、カルノサス（Staph,Carnos
us）が好ましい宿主であり、真核生物の中では、アスコ
ミセテス（Ascomycetes）、特にイースト、例えば、サ
ッカロミセス．セレヴイシアエ（Saccharomyces cerevi
siae）が好ましい宿主である。

単一細胞の微生物には、プラスミド及びウイルス起源
の多くの開始ベクターを用いることができる。これらの
ベクターは、単一コピー又は、多重コピーベクターとし
て生成する。本発明に従ったhMn−SODのクローニング及
び発現、及び真核性DNA配列に適したこの種のベクター
は、一般的に、多くの出版物及びマニュアルに報告され
ており（マニアチス（Maniatis）,T等、モレキュラー・
クローニング・コールドスプリング・ハーバー・ラボラ
トリー（Cold Spring Harbor Laboratory）,1982年；グ
ローバー（glover）D.M.（編）DNAクローニングI,II巻,
1985年）そして市販されている。

一般に、複製オリジン及び転写、翻訳及び発現のため
のコントロール配列を含むプラスミドベクターは、一般
的にこれら宿主と共に用いられる。これらの配列は、そ
の宿主と同系の種に由来するものである。通常、そのベ
クターは、複製部位に加えて、トランスホームした細胞
を発現型により選択することを可能にする認識配列を有
している。この選択は、相補性、抑制、又は、マーカー
の不活性化のいずれかにより行なわれる。最初の２つの
方法に関して、代謝の基本的産物を欠いている細菌及び
イーストの独立栄養変異体、又は、問題の遺伝子の翻訳
に鎖切断を起こすナンセンス変異株がある。種々のサプ
レッサー遺伝子、例えばSup D,E,F（UAGを抑制する）、
Sup C,G（UAG又はUAAを抑制する）がすでに知られてい
る。

第３のプロセスにおいて、そのベクターは、抗生物
質、重金属のような１つ以上の細胞毒試薬に対する耐性
遺伝子を有している。この種のマーカー遺伝子の中に、
外来DNAを挿入すると、前者を不活性化し、その結果、
新しく形成した発現型を、本来の発現型と区別すること
ができる。

例えば、大腸菌は、大腸菌のある種に由来するプラス
ミドpBR322でトランスホームされる（ボリバー（Boliva
r）等、ジーン（Gene）２巻,95頁（1977年））。pBR322
は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺
伝子を含み、それにより、例えば、β−ラクタマーゼ遺
伝子の中のPst I部位に、クローニングすることで、発
現型Ap^r,Tc^rをAp^s,Tr^sに転換することにより、トランス
フォームした細胞を同定する単純な方法を提供してい
る。λ及びM13ベクター及び種々のプラスミド（例えばp
UC,pUR）中のlacZジーンの不活性化が重要である、その
他の方法も等しく用いることができる。これらの非常に
多種の選択システムは、長い間知られており、従って、
このことに関する幅広い文献がある。

この種の選択マーカーに加え、これらのベクター、特
に、発現ベクターには、転写の正しい開始及び終止を保
証するシグナル配列が含まれなければならない。それゆ
え、hMn−SODの正しい転写のために、これらベクター
は、プロモーター、hMn−SOD遺伝子のコード領域及びそ
れに結合したターミネーターを含む細菌性又は、真核性
の転写ユニットを含んでいる。この転写ユニットの性質
に依存して、これらは、例えば、プリブナウ・ボックス
又は、TTG配列又は、CAATボックス、TATAボックス、既
知の終止シグナル（例えばAATAAA、TATGT）及び少なく
とも１つの終止コドンのような保存されている原形配列
を含んでおり、一方、好ましくは、宿主と相同的なプロ
モーター及びターミネーターを用いる。通常生成したmR
NAは、３′ポリ（Ａ）配列および／または５′キャップ
構造を含んでいる。hMn−SOD遺伝子の翻訳には、シャイ
ン／ダルガル／（S/D）配列及びそれから決った間隔、
一般的に３〜12ヌクレオチドおいて存在する開始コドン
及び少なくとも１つの停止コドンを含むリボゾーム結合
部位（RBS）が必要である。それとは別に、RBSは全成的
に調製され、それにより、16S rRNAの３′末端との相同
性を増すことができる。（ジエイ（Jay）,E,等、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res,）10
巻,6319−6329頁,1982年）。

特に、真核性発現システムにおいて（例えば、S.セレ
ビシアエ）イースト中での、条件が、原核生物に適用す
るものと類似しており（16S rRNAの３′末端とのS/D配
列の相似性）、そして、翻訳開始のためのシグナル又は
RBSは、真核生物におけるものと異なる方法で限定され
るので、その宿主に由来する翻訳のための制御システム
を用いるのが好ましい（例えば、コザク（Kozak）,M.,
ヌクレイック，アシッズ，リサーチ（Nucleic Acids Re
s,）９巻,5233−5252頁,1981年；コザク（Kozak）,M.,
ジャーナル・オブ・モレキュラー，バイオロジー（J.Mo
l.Biol,）156巻,807−820頁,1982年）。

好ましくは、そのクローニング又は、発現ベクター
は、スターティングベクター中に初めから存在するか、
又は、適当なリンカーにより後から挿入することができ
る、１つの制限酵素認識部位を有する。リンカーは、簡
単な化学合成によっても得られるし、また市販もされて
いる。

対応する発現プラスミドの産生に、しばしば用いるイ
ーストのプロモーターは、PGKプロモーター（ツイテ（T
uite）,M,F等、EMBOジャーナル、１巻,603〜608頁,1982
年；ヒッシェマン（Hitzeman）,R,A,等，サイエンス（S
cience）,219巻,620〜625頁,1983年）,PHO5プロモータ
ー（ハイネン（Hinnen）,A.,及びメイハック（Meyhac
k）,B.,カレント・トピックス・イン・マイクロバイオ
ロジー・アンド・イムノロジー（Current Topics in Mi
crobiology and Immunology）96巻、101−117頁,1982
年；クレーマー（Kramer）,R,A,等，プロシーディング
・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc,Natl,Acad,Sci,）USA81巻,367−370頁,1984
年）、GAPDHプロモーター（アーデア（Urdea）,M,S,
等，プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Proc,Natl,Acad,Sci,）USA80巻,7
461−7465頁,1983年）、GAL10プロモーター（ブローチ
（Broach）等，エクスペリメンタル・マニュプレーショ
ン・オブ・ジーン・イクスプレッション（Experimental
Manupulation of Gene Expression）,83−117頁,1983
年）、エノラーゼ（ENO）−プロモーター（ホランド（H
olland）,M,J,等，ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol,Chem,）256巻,1385−1395頁,1
981年）、α−因子プロモーター（ビター（Bitter）,G,
A,等，プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Proc,Nati,Acad,Sci,）USA81
巻,5330−5334頁，ヤコタ（Yakota）,T等，マイアミ，
ウインター，シンポジウム（Miami Winter Symp,）17,
ミートティング・オブ・アドバンス・ジーン・テクノロ
ジー（Meet,Adv,Gene Technol,）２巻,49−52頁,1985
年），又は,ADHIプロモーター（アメラー（Ammerer）,
G.,メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in En
zymology）101巻,192−201頁,1983年；ヒッツエマン（H
itzeman）R,A,等，ネンチャー（Nature）,293巻,717−7
22頁,1981年）のような、イーストシステム中で特に効
率よく発現をコントロールするプロモーターを含んでい
る。

また、ヘクトキナーゼ、ピルビン酸テカルボキシラー
ゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェート・イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラー
ゼ及びグルコキナーゼのようなその他の解糖酵素のプロ
モーターも使用することができる（カワサキ（Kawasak
i）及びフランケル（Fraenkel）、バイオケム・バイオ
フィズ・レス・コム（Biochem,Biophys.Res,Comm.）108
巻,1107−1112頁,1982年）。

適当な発現プラスミドを構築するとき、その発現ベク
ター中,mRNAのポリアデニル化及び停止を行うため、発
現すべき配列の３′側に、ターミネーション配列が存在
する。生育条件で制御される転写の有利性を持つその他
のプロモーターは、アルコール・テヒドロゲナーゼ−
２、イソチトリロームＣ、窒素代謝と共役した分解酵
素、上述の、グリセリン・アルデヒド−３−ホスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ（GAPDH）及び、マルトース及び
ガラクトースの代謝に関与する酵素のプロモーターであ
る。イーストの接合型部位により制御されるプロモータ
ー、例えば、遺伝子BAR1，MEC1，STE2，STE3及びSTE5の
プロモーターを、温度依存Sir突然変異の使用により、
温度制御システム中で用いることができる（ライン（Rh
ine）、Ph,D,セシス（Thesis）、オレゴン大学、コージ
ーン（Eugene）、オレゴン（Oregon）（1979年）、ハー
スコヴィツ（Herskowitz）及びオオシマ（Oshima）、ザ
・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・イースト・
サッカロミセス（The Molecular Biology of the Yeast
Saccharomyces）、パートI,181−209頁，（1981年）、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Col
d,Spring Harbour Laboratory））。これらの突然変異
は、イーストのその他の接合型カセットに影響を与え、
そして、間接的に接合型依存プロモーターに影響を与え
る。しかし、一般的に、イースト適合プロモーター、複
製オリジン及びターミネーション配列を含むプラスミド
・ベクターも適している。

もし、hMn−SODの発現が細菌中で起ったなら、mRNAの
合成が高速となり、そして、また誘導可能なプロモータ
ーを用いることが望ましい。用いることができると知ら
れているプロモーターには、UVプロモーター（シルバー
ストーン）（Silverstone）,A,E等，プロシーディング
・イン・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Proc,N
atl,Acad,Sci,）USA66巻,773−779頁,1970年）を誘導す
る、ベーター，ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラ
クトース・プロモーター・システム（チャン（Chang）
等，ネイチャー（Nature）,275巻,615頁（1978年），イ
タクラ（Itakura）等，サイエンス（Science）,198巻,1
056,1977年，ゴーデル（Goeddel）等，ネイチャー（Nat
ure）,281巻,544頁，（1979年））及びトリプトファン
（trp）プロモーター・システム（ゴーデル（Goeddel）
等，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nacleic Acid
s Res.）８巻,4057頁（1980年）；ヨーロッパ特許出
願、公開番号、0036 776号）が含まれる。さらに、他の
微生物プロモーターも開発され用いられてきた。hMn−S
ODの遺伝子配列を、例えば、ラムダーP_Lプロモーターの
制御下、転写することができる。このプロモーターは、
特に強力で、制御可能なプロモーターの１つであること
が知られている。制限切断部位が隣接していることが分
っている、熱感受性レプレッサーcI（例えばcI857）に
より制御が可能である。さらに大腸菌由来のアルカリ、
ホスファターゼのプロモーター（オースエ（Ohsuye）,K
等，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（uacleic Acid
s Res.）,11巻,1283−1294頁,1983年）及び例えば、tac
−プロモーターなどのハイブリッド・プロモーター（ア
マン（Amann）E.等，ジーン（Gene）25巻,167−178頁,1
983年；デボア（De Boer）,H,A,等，プロシーディング
・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc,Natl,Acad,Sci,）USA80巻,21−25頁,1983年）。
保持されうる、この種のプロモーター（Iac uv5,Iac Z
SD,tac）及び大腸菌中で、融合及び非融合真核性タンパ
ク質を調製するためのベクターの使用は、T.マニアチス
（Maniatis）等の、モレキュラー・クローニング、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、1982年、
特に412ff頁に報告されている。細菌中でのhMn−SODの
発現及び翻訳も、その非トランスフォーム状態でのその
生物と“相同”とみなされる、他の制御システムの制御
下、行なうことができる。例えば、アラビノースオペレ
ーター、コリシンE1オペレーター、ガラクトースオペレ
ーター、アルカノホスファターゼオペレーター、trpオ
ペレーター、キシロースＡオペレーター及びそれに類す
るもの、又はそれらの一部も用いることもできる。

細菌、例えば大腸菌又はイースト、例えば、S,セレビ
シアエ（S.cerevisiae）におけるhMn−SODのクローニン
グ又は発現のため、前者の宿主システムに対し、pBRプ
ラスミド（ボリバー（Bolivar）,F等，ジーン（Gene）
２巻,95−113頁,1977年）,pUCプラスミド（ビエイラ（V
ieira）,I.,メシング（Messing）,I.,ジーン（Gene）,1
9巻,259−268頁,1982年）,pOPプラスミド（フラーCFull
er）,F,ジーン（Gene）,19巻,43−54頁,1982年）,pATプ
ラスミド（ウィンダス（Windass）,J,D,等，ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）10巻,6
639−6657頁,1982年）,pHVプラスミド（アーリッヒ（Eh
rlich）,S,P,プロシーディング・イン・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc,Natl,Acad,Sci,）U
SA,75巻,1433−1436頁,1977年），プラスミド含有ラム
ダベクター（ブレナー（Brenner,S,等，ジーン（Gen
e）,17巻,27−44頁,1982年）、コスミド（コリンズ（Co
llins）,J,ホーン（Hohn）、B.,プロシーディング・イ
ン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro
c,Natl,Acad,Sci,）USA,75巻,4242−4246頁,1979年）及
び文献から知れているその他のベクター（例えば、マニ
アチス（Maniatis）,T,等，モレキュラー・クローニン
グ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Harbor,Laboratory,1982年）、特にpBR
及びpUC誘導体、例えば、pBR322及びpUC18を用いるのが
有効であるとよく知られているベクターを使用できる。

イーストにおける適当な発現ベクターは、組込み（YI
p）、複数（YRp）及びエピソーム（YEp）ベクター（ス
トロール（Struhl）,K等，プロシーディング・イン・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc,Natl,
Acad,Sci,）USA,76巻,1035−1039頁,1979年；スチンク
コーム（Stinchcomb）,D.T.等，ネイチャー（Nature）,
282巻,39−43頁,1979年；ホレンバーグ（Hollenber
g）、C.P.カレント・トピックス・イン・マイクロバイ
オロジー・アンド・イムノロジー（Current Topics in
Microbiology and Immunology）,96巻,119−144頁,1982
年）、好ましくはYEp13（ブローチ（Broach）,J.R,等，
ジーン（Gene）,8巻,121−133頁,1979年）、YIp5（スト
ロール（Struhl）,K,等,1979年，上記参照、ATCC3706
1）及びpJD B207（DSM3181）又はpEAS102である。ベク
ターpEAS102はYIp5をPst Iで部分分解、及びBamH Iで完
全分解し、単離した4.3kbの断片（URA3遺伝子を含
む）、pJD B207の4.4kbのBamH I/Pst I断片を連結する
ことにより得ることができる。

微生物に加えて、多細胞生物の培養物も、hMn−SODの
発現に適した宿主生物である。理論的には、脊椎動物由
来でも非脊椎動物由来でも、それらの培養物を用いるこ
とができる。しかし、近年、培養における脊椎動物細胞
の増殖（組織培養）がルーチンになっていることから、
脊椎細胞に興味がある（組織培養、アカデミック・プレ
ス、クルース（Kruse）とパターソン（Patterson）編，
（1973年））。この種の有用な宿主細胞系列の例には、
VERO及びヘラ細胞、ゴールデン・ハムスター・オバリー
（CHO）細胞及びW138,BHK,COS−Ｔ及びMDCK細胞系列が
含まれる。一般に、これら細胞に対応する発現ベクター
は、必須のリボゾーム結合部位、RNAスプライシング部
位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーション配
列と共に、発現すべき、hMn−SODの前に位置する複製部
位、プロモーターを含んでいる。

ホ乳類細胞で用いるとき、発現ベクターにおける制御
機能は、しばしば、ウイルス物質から得られる。例え
ば、通常用いられるプロモーターは、ポリオマウイル
ス、パピローマウイルス、シミアン・ウイルス40（SV4
0）のような、パポバウイルス及びレトロウイルス及び
アデノウイルス２型に由来する。SV40の初期及び後期プ
ロモーター及びそれらの応用もしばしば報告されてい
る。さらに、もし、コントロール配列が宿主細胞システ
ムに適合するなら、元々、望ましい遺伝子配列に結合し
たプロモーター、又はコントロール配列、又は、スプラ
イシング信号を用いることも可能であり、しばしばその
ことは望ましいことである。このように、SV40ベクター
については、後期SV40プロモーターと同様、それ自身の
プロモーター配列及びスプライシング信号を有する遺伝
子外真核性DNAは、安定な転写物を生ずることが知られ
ている。

複製の開始点は、例えば、SV40又は他のウイルス由来
（例えば、ポリオマ、アデノ、VSV、PBV、その他）の遺
伝子外部位を組込むために、対応するベクター構築によ
り提供されるか、又は、宿主細胞の染色体複製メカニズ
ムにより提供される。もし、このベクターが宿主細胞の
染色体に組込まれたら、後者の方法で通常十分である。

ベヒクルを有する細胞のトランスフォーメーション
は、多くの方法で行なうことができる。例えば、細胞を
マグネシウム中で洗浄し、そして、カルシウム中にサス
ペンドした細胞にそのDNAを加えること、さもなくば、
その細胞をDNAとリン酸カルシウムの共沈殿にさらすこ
とにより、カルシウムを用いて行う。ひきつづく遺伝子
発現の間、その細胞を、トランスフォームした細胞を選
択する培地に移す。hMn−SODの細胞内生産において、適
度な細胞の光学密度に到達した後、その細胞を遠心し、
その後、それらを分解することにより、その酵素を単離
した。本発明に従ったhMn−SODの精製は、透析、電気泳
動、沈殿化、クロマトグラフィー及びそれらを組合せた
ような、タンパク質又は酵素を精製するための、従来の
生化学的方法により行った。もし、その酵素が細胞から
分泌する場合、純粋な形で、培養培地からhMn−SODを得
るために、タンパク質を精製する同様の方法が用いられ
る。

これらの方法により精製した、本発明に従ったhMn−S
ODは、イン．ビボ（in vivo）及びイン．ビトロ（in vi
tro）での純粋な酵素と同じ生物学的活性をもってい
る。

これらの活性には、免疫学的性質（例えば、本発明に
従ったhMn−SODに対する、純粋なhMn−SODの抗体との交
差反応）及び生化学及び酵素的活性も含まれる。生化学
的及び酵素的に、hMn−SODを特徴づけるために、例え
ば、Cu/Znを含む酵素と、Mnを含む酵素とは、例えばKCN
（Cu/Zn−SODを阻害するがMn−SODは阻害しない）を加
えること、又は、それらの活性のpH依存性の差から（特
に、イセバート−バネステ（Ysebaert−Vanneste）,M.,
バネステ（Vanneste）,W.H.,アナリティカル，バイオケ
ミストリー（Anal,Biochem,）107巻,86−95頁,1980
年）、厳密に区別されねばならないことに従がい、マー
クランド（Marklund）、S.マークランド（Marklund）、
S.及びマークランド（Marklund）、G.ヨーロピアン・ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー（Enr.J.Bioche
m.）47巻,469−474頁,1974年）により報告された方法を
用いた。

本発明に従ったポリペプチドには、詳細に述べられて
いる成熟したhMn−SODだけでなく、この酵素の全ての修
正したものも含まれる。例えば、これらの修正には、Ｎ
又はＣ末端での分子の短縮化、及び実質的に酵素活性に
影響しないアミノ酸の置換などが含まれる。

本発明は、実施例で述べられ、説明されているhMn−S
ODを特異的にコードする遺伝配列だけでなく、突然変
異、分解、転位又は添加により、容易にそしてルーチン
に得ることができる修正にも関連している。本発明に従
った（すなわち、対応する既知の生物学活性をもつ）hM
n−SODをコードする配列、及び示したものと比較される
変化物である配列も含まれる；当業者は、DNA配列、特
に、コード領域を変化させることができるであろう。同
様に、標準試料のhMn−SODの活性をもつポリペプチドを
コードし、そして、ストリンジェント条件下、示された
配列（又はその一部）とハイブリダイズする配列も含ま
れる。ハイブリダイゼーションを行う（前洗浄、前ハイ
ブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄
を含む）ストリンジェント条件を構成する特別な条件
は、従来技術として定義されている。遺伝子バンクに対
するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対
して（“遺伝子バンクのスクリーニング”）、ウッド
（Wood）,I,M等により報告された条件がよく利用される
（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc,Natl,Acad,Sci,）USA82巻,158
2−1588頁,1985年）。ある特異的DNA配列が、hMn−SOD
をコードする本発明に従うDNA配列の１つへのハイブリ
ダイズするかどうかをテストするため（細菌のプラーク
又はコロニーに対するイン・シチュ（in Situ）でのハ
イブリダイゼーション、又は、サウザーン・ブロッティ
ング）、マニアチス（Maniatis）T.等により詳細に報告
されている方法及び条件を適用したマニアチン（Maniat
is）等，モレキュラー・クローニング，コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory）、1982年、特に、326−328頁，及び387−
389頁）。それゆえ、バックグランドと明らかに区別で
きる全ての信号は、陽性のハイブリダイゼーション信号
を指している。

さらに特別に、上述の問題は、ヒトの組織、特にヒト
の胎盤組織由来のRNAを調製することにより解決した。
組織培養細胞は、熱フェノールを用い直接区別できる一
方、最初の抽出のこの型の組織は、冷凍条件、特に、ド
ライアイスの粉末又は粒の存在下又は液体窒素中でうま
く、分解される。

mRNAと他のRNAのフェノールにより生じた凝集物は、
ホルムアミド又は加熱（例えば65℃）により、分解でき
る。RNAを単離するための好ましい方法は、チャーグウ
ィン（Chirgwin）の方法である（チャーグウィン（Chir
gwin）,J,M,等，バイオケミストリー（Bio chemistry）
18巻,5294−5299頁,1979年）、ポリ（A⁺）RNAは、一般
に、真核性mRNA群は、その３′端にポリ（A⁺）テールを
もつことから、アフィニティー・クロマトグラフィー、
例えば、ポリ（Ｕ）セファロース又はオリゴ（dT）セル
ロースを用い、単離したタンパク質及びDNA調製物か
ら、簡便に精製することができる。

（アビブ（Aviv）,H.,レダー（Leder）,P.,プロシー
ディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（Proc,Natl,Acad,Sci,）USA69巻,1409−1412頁,
1972年；リンドバーグ（Lindberg）,U.,パーソン（Pers
son）,T.,ヨーロピアン，ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Eur.J.Biochem,）31巻,246−254頁,1972
年）。ポリ（A⁺）RNAの単離は、オーフレー（Auffray）
により報告された方法を用いうまく行うことができる
（オーフレー（Auffray）,C.,ロージャン（Rougeon）,
F,ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー（Eur.J.Biochem,）107巻,303−314頁,1980年）。

精製mRNAは、サイズに従って、その全mRNA画分を分画
することにより（例えば、スクロース勾配中での遠心）
濃縮することができる。望ましいmRNAは、例えば、従来
のイン．ビトロ（in vitro）でのタンパク質生合成シス
テムを用い検出することができる（ゼノパス ラエビス
（Xenopus laevis）の網状赤血球、卵母細胞）。

精製mRNA又はその濃縮画分を、逆転写酵素及びプライ
マーを用いて行う、cDNA第１鎖の合成のテンプレートと
して用いる。用いるプライマーはオリゴ（dT）又は合成
プライマーである；後者は、hMn−SODの既知アミノ酸配
列を用いて得られ、そして、逆転写の反復プライミング
を行うことが可能となる（アーレン（Uhlen）,M,等,EMB
Oジャーナル１巻,249−254頁,1982年）。

本発明において、cDNAの第１鎖は、dNTPの存在下、プ
ライマーとしてオリゴ（dT）12−18で合成を開始する。

cDNAの第二鎖は、特筆した相補的プライマー（ローガ
ン（Rougan）,F.,マック（Mach）,B,ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol,chem,）252
巻,2209−2217頁,1977年）、cDNAの３′末端に位置する
“ヘアピン”構造を利用したセルフスプライシング（エ
フストラチアジス（Efstrafiadis）,A.等，セル（Cel
l）,7巻,279頁,1976年）又は、リボヌクレアーゼＨによ
り生成する、オカザキフラグメント様プライマー（グブ
ラー（Gubler）,U,ホフマン（Hoffmann）,B.J.ジーン
（Gene）,25巻,263頁,1982年）を用いたプライミングを
用いる種々の従来法により合成できる。本発明に従った
好ましい方法は、ハイン（Huynh）,T.V.により報告され
たものである（ハイン（Huynh）,T.V.等,DNAクローニン
グ、１巻（D.M.グローバー（Glover）編）,2章、49−78
頁,1985年）。この方法で得られた２本鎖cDNAを適当な
ベクター、例えばコスミド、挿入又は置換ベクター、よ
り特別には、ラムダベクター、好ましくはλgt10にクロ
ーニングするか、又は直接包み込むことができる（ハイ
ン（Huynh）,T.V.等,1985年）。dA−dT又はdC−dGを用
いた“ホモポリマーテーリング”、又は合成リンカーを
用いたリンカー法が実施例で示されているように、ラム
ダ中へのクローニングには多くの方法がある（マニアチ
ス（Maniatis）,T,等，モレキュラー・クローニング，
コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Sprin
g Habor Laboratory）,1982年、ハイン（Huynh）,T.V.
等,DNA cloning1巻（D,M,グローバー（Glover）編）198
5年,1980年；ワトソン（Watson）,C,J,ジャクソン（Jac
kson）,F,dto,1985年,3章）。本発明に従ったcDNAのク
ローニングにおいて、これは、λgt10のEcoR I部位に挿
入される。本発明に従ったcDNAのイン．ビトロ（in vit
ro）でのパッキング及びクローニング及びcDNA遺伝子バ
ンクの構築は、ハイン（Huynh）T.V.等（1985年,49−78
頁）の方法に従って行った。

胎盤組織由来のcDNA遺伝子バンクを代表する、得られ
たファージ群を用いて、適当な宿主、特に大腸菌、好ま
しくは、大腸菌C600への感染及び、各々、ラムダの分解
増殖サイクルを確保することにより、増殖及びプラーク
精製を行った。

報告されているアミノ酸配列を用いることにより得ら
れた放射性ラベルした合成オリゴヌクレオチドを用い、
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、cD
NA遺伝子バンクの研究を行った（バラ（Barra）,D,等，
オキシラジカルとそのスキャベンジャー・システム（Ox
y Radical and their Scanenger System）１巻,336−33
9頁,1983年）。本発明において、ベントン（Benton）お
よびデービス（Davis）により報告された、イン・シチ
ュ（in Situ）でのハイブリダイゼーション法を用いた
（ベントン（Benton）W.D.,デービス（Davis）,R.W.サ
イエンス（Science）196巻,180−182頁,1977年）。好ま
しくは、バラ（Barra）,D,等，（上述）により報告され
たアミノ酸配列の各々、アミノ酸39〜46及び200〜207に
対応し、そして、遺伝コードの縮退を考慮した、式V a
及びV bの８個の合成23マー・オリゴヌクレオチドから
なるものの、２つの混合物を用いた。それらDNAプロー
ブの５′末端の最後の塩基は、Gln（アミノ酸46）又はG
lu（アミノ酸207）に対する全コドンのゆらぎ塩基を欠
いている。A,G,C及びＴは対応するヌクレオチドを表わ
し、Ｉはイノシンを表わしている。

オリゴヌクレオチド・プローブを従来の合成法で調製
した。本発明には、モデル381ADNAシンセサイザー（ア
プライド．バイオシステムズ）を用いた。

これら２種のDNAプローブのあらゆる組合せの合成
は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、そのプロ
ーブと相補的な、望ましいhMn−SOD遺伝子の一本鎖領域
と至適ペアを形成することを保証している。23マー・オ
リゴヌクレオチドの２つの独立した集合の使用は、“誤
り”の陽性物質を選択する可能性を減じている。

２つの23マーDNAプローブとのハイブリダイゼーショ
ン後、陽性信号で同定された、本質的に均一なプラーク
を単離した後、７つの組換えファージを単離し、そし
て、それらのDNAの500〜1000bp長のEcoR I断片を配列決
定することが可能である。サンガー（Sanger）法（サン
ガー（Sanger）等，プロシーディング・イン・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc,Natl,Acad,S
ci）USA,74巻,5463〜5467頁,1977年；サンガー（Sange
r）,F,等,FEBSレターズ（FEBS Letters）87巻,107−11
1,1978年）によりこれらEcoR I断片の配列分析の後、及
びM13ベクターのEcoR I部位へのサブクローン（ブルー
スクライブ（Bluescribe）、ベクタークローニングシス
テム）及び、大腸菌、例えば大腸菌JM101へのトランス
フォーメーションの後、そのEcoR I断片がアミノ酸22
（クローンBS5,BS8,BS9,BS13,BS XIII）又はアミノ酸26
（クローンBS3,BS12）から、hMn−SODをコードするcDNA
挿入物を含むことが発見された。

しかし、驚くべきことに、バラ（Barra）,D,等，（19
84年、上述）により報告されたアミノ酸配列と異なるも
のがいくつか得られたDNA配列から生じることも分っ
た。

得られたクローン、例えばBS8から単離できた617bp長
のEcoR I断片のDNA配列を図１に示した。そのEcoR I断
片は、hMn−SODをコードする532bp長の配列及び、ポリ
（Ａ）₃₀テールを含む、51bp長の非翻訳領域を含んでい
た。EcoR I部位までの（完全な）、リンカー配列部分も
示されている。

部位30〜33はTha I切断部位を示し、一方、部位367〜
372には、BamH I部位がある。驚くべきことに、部位、5
3〜61、155〜163、176〜184及び500〜508に、潜在的な
Ｎ−グリコシル化部位に特徴的な一般的アミノ酸配列As
n−Ｘ−Thr及びAsn−Ｘ−Ser（Ｘは、例えば、バリン、
ヒスチジン又はロイシンを表す）に従って、対応するア
ミノ酸の潜在的Ｎ−グリコシル化部位に相当するコドン
があり、一方、そのサイトゾルのCu/Zn−SODには、１つ
のアミノ酸の組合せしかなかった。

得られたEcoR I断片から誘導された配列と、バラ（Ba
rra）,D,等のアミノ酸配列（バラ（Barra）,D,等，ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l,Chem,）259巻,12595−12601頁,1984年）とのアミノ酸
の差は、ここで先に議論されてきている。

完全なhMn−SOD遺伝子を調製するために、cDNA遺伝子
バンクからのhMn−SOD DNA部位配列の３′そして、また
は、５′末端の欠失した塩基を得るために、種々の戦略
を適用した。例えば、得られたcDNAを、全酵素のコード
配列を得るため、ゲノム遺伝子バンクに、ハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いたり、また、例えば、逆
転写酵素に対する特異的プライマーとして、mRNAと相補
的な合成オリゴヌクレオチドを用い、カキダニ（Kakida
ni）,Hの方法が用いられた（カキダニ（Kakidani）,H,
等，ネイチャー（Nature）,298巻,245−249頁,1982
年）。しかし、既知のアミノ酸配列から、化学的にcDNA
配列の欠失末端を合成し（バラ（Barra）,D,等，ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol,C
hem,）259巻,12595−12601頁,1984年）そして、みつけ
たcDNAにそれを連結し、このことにより、決まった末端
を得ることも可能である。

後者の方法において、hMn−SODに対する、本発明に従
った完全なDNA配列を調製するため、その５′末端は、X
ho I/Xba I又はXba I/Nco Iの、計画的末端をうまく有
する式VI a及びVI bの２つのオリゴヌクレオチドにより
完成させる。本発明に従がい、ADH Iプロモーターの
３′末端は、そのコード鎖の５′末端に付けることが考
えられた（式VI a）。

式VI a及びVI bの２つの合成オリゴヌクレオチドを合
わせ、例えば、相当する修正したpUC18誘導体へのクロ
ーニング、その５′端に少なくともTha I部位を有す
る、得られたクローンの１つに由来する、本発明に従
う、cDNAのTha I/EcoR I断片の付加の後、Tha I部位を
もたない、式VII a及びVII bに対応する正しい読み枠
の、hMn−SOD遺伝子の完全なcDNAを含むプラスミドを得
ることができる。

クローンBS5,BS9,BS13,BS XIII及びクローンBS3及びB
S12の配列決定は、クローンBS5,BS9,BS13及びBS XIIIの
配列は、クローンBS8と同一であることを示した。すで
に述べたように、クローンBS3及びBS12は、アミノ酸29
がクローンBS8と違っていた（AAGの代りにCAG.Lysの代
りにGln、式I b、III b及びIV b）。他に、図１に示し
たEcoR I断片の塩基573までが、クローンBS8と100％の
相同性をもつ（...TA^＊A ACC ACG ATC GTT ATG CT
G⁵⁷³）。この塩基とは別に、２つのクローンBS3及びBS1
2は、式VIIIに示した。５−非翻訳領域については同一
であった。

さらに、多くのcDNAクローンを、λgt11を用いて、cD
NA遺伝子バンク（胎盤）から単離した。このcDNA遺伝子
バンクは、λgt10における胎盤DNA由来の、実施例で述
べられるcDNA遺伝子バンクと同様に調製した。λgt11か
ら単離したクローンの１つ、すなわち、クローン４を、
すでに述べた方法で、ブルースクライブM13＋にサブク
ローンした。配列決定は、合成17マーオリゴヌクレオチ
ドを用いた反復プライミングにより行った。

クローン４は、アミノ酸29（AAG又はLys）と、マルチ
クローニング部位を結合する３′末端の−TCTA−配列は
別にして、λgt10由来のクローンBS3及びBS12と同一で
あった。５′末端の残りの61塩基（Lys〜Gluに対応す
る、コドン＋１〜＋21に対応する、式I a前の、クロー
ンBS8）の分析したDNA配列は、誘導されたDNA配列（式I
II bに含まれる、式II）と比較して、いくつかの塩基変
化を示したにもかかわらず、このDNAセクションの翻訳
は、バラ（Barra）等のものと差違がなかった。ATGの前
のリーダー配列も分析した。式IXは、クローン４の配列
を示している。

＊他の配列決定したクローンは、部位−９はアラニン
（GCT）を示した。

他のクローンは、種々の長さの５′非翻訳領域をもっ
ている。

本発明に従ったDNA配列を、種々の発現ベクターに組
込み、述べてきたコントロールエレメントの助けをかり
て、例えば、ADH IプロモーターをもつpES103（DSM401
3）において、発現することができる。pES103は、Hinc
II切断部位にXhoリンカーを含むpUC18誘導体pES102に、
ADH Iプロモーターの1500bp長のBamH I/Xho I断片を組
み込むことにより得られる（例えば、アメラー（Ammere
r）,G.,メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods i
n Enzymology）、101巻,192−201頁,1983年）。

本来1500bpの、ADH Iプロモーター配列の代りに、Bam
H I/Xho I断片として、約400bp長に短縮したADH Iプロ
モーターも使用できる、この短縮したADH Iプロモータ
ー（ADH IK）は、BamH I/Xho IでプラスミドpWS323E（D
SM4016）を消化し、ADH IKプロモーターを単離すること
により得る。

正しいターミネーションには、適当なターミネーター
配列、簡便には、ADHターミネーター、好ましくは、ADH
IIターミネーターをhMn−SODの後に連結する。そのADH
IIターミネーター（ベイア（Beier）,D.R.,ヤング（Yo
ung）,E.T.,ネイチャー（Nature）,300巻,724〜728頁,1
982年）は、pMW5−ADH II（ワシントン・リサーチ・フ
ァンデーション（Washington Research Foundation））
のSph I消化により、1530bpの断片として得られ、そし
て、ひきつづくHinc II消化ののち、最終的ADH IIター
ミネーター（329bp）として、又は、プラスミドpGD2（D
SM4014）から、336bp長のHind III/Xba I断片として得
られる。

イーストにおける発現のため、本発明に従ったhMn−S
ODを有する発現カセットが組込まれている、入手可能な
種々のイーストベクター、好ましくはYEp13（ブローチ
（Broach）,J.R.等，ジーン（Gene）,8巻,121−133頁,1
979年,ATCC37115）,pJDB207（DSM3181,1984年12月28日
登録）、YIp5（ストラル（Struhl）,K,等，プロシーデ
ィング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Proc,Natl,Acad,Sci）USA,76巻,1035−1039頁,19
79年;ATCC37061）,pEAS102（pEAS102は、YIp5をPst Iで
部分分解し、BamH Iで完全分解し、そのURA3を含む単離
した4.3kbの断片と、4.4kbのpJDB207のBamH I/Pst I断
片を連結することにより得ることができる）。

本発明に従ったhMn−SOD遺伝子を伴う発現カセットを
もつこれらのイーストベクターを用い、従来の方法で、
適当なイースト細胞をトランスホームすることができ
る。発現に適したイースト細胞は、それ自身のイースト
特異的Mn−SODを欠いており、そして、HIS3,URA3,LEU2
及びSUPのような、選択可能なイースト遺伝子を含む全
てのものである。例えば、イン．ビトロ（in vitro）又
はイン・ビボ（in vivo）で構築された変異遺伝子を含
み、そして、それらを、“トランスプレースメント”に
より含む、この種の変異体は、組込みトランスホーメー
ションにより得ることができる（例えば、ウィンストン
（Winston）,F,等，メソッズ・イン・エンザイモロジー
（Methods in Enzymology）、101巻,211−228頁,1983
年）。変異されるイーストのhMn−SOD遺伝子は例えば、
BamH I断片として、プラスミドpL41中に含まれる（バン
・ルーン（Loon）等，ジーン（Gene）,26巻,261−272
頁,1983年）。このBamH I断片の全配列か既知なので、
（マレス（Marres）,C,A,M,等，ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（Eur,J.Biochem,）,1
47巻,153−161頁,1985年），イーストのMn−SOD遺伝子
は、pL41がなくても得ることができる。

このようなトランスホーメーションにより産生したhM
n−SODはタンパク質の単離及びタンパク質精製の従来法
により得ることができる。細胞の分解は、例えば、バン
・ルーン（Van Loon）等の方法に従がい行った（プロシ
ーディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Proc,Natl,Acad,Sci）USA,83巻,3820−3824
頁,1986年）。

細菌、好ましくは、大腸菌、より特別には、大腸菌HB
101,C600及びJM101における、hMn−SODの発現のため、
先に述べた確立されている発現システムを使うことがで
きる。この目的のため、本発明に従ったDNA配列は、真
核性プロモーターではなく、強力な大腸菌プロモーター
の制御下におかなければならない。これらの既知プロモ
ーターには、lac，lac UV5,trp，trp−lac UV5,λP_L,om
p F及びblaがある。大腸菌中の効率的翻訳を保証するた
め、リボゾーム結合部位を必ず用いなければならないこ
とは、すでに詳しく報告されている。

大腸菌による、hMn−SODの活性の発現を説明するた
め、その細胞を、インキュベーション後、適当な慣例的
培養培地中でくずし、そして、その上清を、報告されて
いる方法でhMn−SOD活性を調べた（例えば、マークラン
ド（Marklund）,S,マークランド（Marklund）,G,1974
年;Ch,ビューチャンプ（Beanchamp）及び、I,フリドビ
ッチ（Fridovich）、アナリティカル，バイオケミスト
リー（Anal,Biochem,）,44巻,276−287頁,1971年;H,P,
ミスラ（Misra）及びI,フリドビッチ（Fridovich）、ア
ーク，バイオケム・バイオフィズ（Arch,Bio chem,Biop
hys,）183巻,511−515頁,1977年;B,J,デービス（Davi
s）、アナルス・オブ・ザ・アカデミー・オブ・サイエ
ンス（Annals of the Academy of Science）,121巻,404
−427頁,1964年;M,イセバート・バネステ（Ysekaert−V
anneste）及びW,H,バネステ（Vanneste）、アナリティ
カル・バイオケミストリー（Anal,Biochem,）107巻,86
−95頁,1980年）。

hMn−SOD遺伝子の発現も、マキシセル中のタンパク質
をラベルすることにより、検出することができる。プラ
スミドにコードした、タンパク質を、マキシセル技術を
用い、イン・ビボ（in vivo）を選択的にラベルするこ
とができる（サンカー（Sancar）,A,等ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）137巻,692−693
頁,1979年）。大腸菌CSR603株は、DNAの修復メカニズム
を持たない。適当な量のUV照射は、細菌染色体を破壊す
るが、細胞当り、数コピー存在する、実質的により小さ
いプラスミドDNAのいくつかは、機能を保持する。全て
の非損傷複製細胞を抗生物質−Ｄ−シクロセリンで殺ろ
し、そして、内在mRNAが消費された後、プラスミドにコ
ードされた遺伝子のみが残存する細胞において、転写さ
れ、そして翻訳される。生成したタンパク質を、³⁵S−
メチオニンの取込みにより放射性ラベルし、検出した。

大腸菌CSR603株を、従来法により、発現ベクターでト
ランスホームし、アンピシリン含有寒天プレート上でト
ランスホームした細菌を選択した。マキシセルの調製及
びタンパク質のラベル化は、A,サンカー（Sancar）の方
法で行った（1979年，前述）。¹⁴Cメチル化タンパク質
混合物（アマーシャム（Amercham））を、分子量標準と
して用いた。hMn−SOD遺伝子をもたず、プロモーターの
みを含むプラスミドをコントロールとして用いた。

宿主のトランスホーメーション、遺伝子の発現及び、
本発明に従うタンパク質が発現する条件での発酵もしく
は細胞培養の後、産生物は、通常、従来のクロマトグラ
フ法により抽出し、リーダー及びテーリング配列をもつ
タンパク質、又はもたないタンパク質を含む物質を得
る。本発明に従うhMn−SODは、そのＮ末端にリーダー配
列を伴って発現され、それは、すでに述べてきたよう
に、いくつかの宿主細胞から取り出される。もう、そう
でないなら、リーダーペプチド（もし有るなら）は、切
断し、成熟hMn−SODを得なければならない。別に、その
配列をその熟成酵素が微生物中で直接生産されるよう修
正することもできる。この場合には、融合タンパク質の
正しい“成熟”及び生育培地又は、細胞周辺腔への産物
の分泌を保証するため、イーストの接合フェロモン、MF
−アルファー１の前駆体配列を用いる。イーストのミト
コンドリアにおけるhMn−SODの“分泌”は、イーストの
Mn−SOD遺伝子に対し、そのリーダー配列を、hMn−SOD
遺伝子の直前に置くことにより効果を生む。

例えば、マレス（Marres）C,A,M,等により、ヨーロピ
アン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.
Biochem,）,147巻,153−161頁（1985年）に報じられた
もの、又はその誘導体のような、適当なリーダー配列
は、天然の本来のものでもよいし、対応する真核性細胞
から（例えばS.セレビシアエ（cerevisiae））単離した
ものでもよいし、また合成されたものでもよい。例え
ば、hMn−SODをイーストのミトコンドリアに輸送するの
に必要な、イースト特異的DNA配列は、個々の合成オリ
ゴヌクレオチドを連結することにより得られる。本発明
に従って、完全な配列を、開始コドンATGと、成熟hMn−
SODの第１アミノ酸に対する第１コドン（Lys,例えばAA
G）、又は、式II,III a,III b,VI a,VII a,VII b,VIII
又はXIにおけるような、そのＮ末端の望ましい領域との
間に挿入することができる。同様に、この種の配列をAT
G開始コドンの直後でかつ、配列修飾により、hMn−SOD
の純粋なDNA配列を変異させ、そして、hMn−SOD活性を
もつタンパク質をコードするDNAの第一コドンの直後に
組込まれる。

hMn−SODをイーストのミトコンドリアに輸送する目的
で、本発明に従がい用いることができるリーダー配列
を、既知配列GCA GCT（マレス（Marres）,C,A,M,等,19
85年，上述）を、GCT GCA（両コドンともアラニンをコ
ードする）に置換し、Pvu II認識部位を作った、式Ｘで
示した。

好ましくは、例えば式Ｘのような、リーダー配列が式
VI aのXho I/Xba Iに含まれている。このことは、この
リーダーをもつ128bpリンカーは、そのリーダー配列が
開始コドンATGの直後及びhMn−SODの第１アミン酸（リ
ジン）の直前に位置するように、Xho I及びXba I部位を
介して、残りのhMn−SOD遺伝子に連結することができる
ことを保証している（式XI）。

細胞からのhMn−SODの精製は従来法で行った。

遺伝子工学により調製した、本発明に従がうhMn−SOD
は、一方では、その生物学的／酵素的活性と、他方、純
粋なhMn−SODと、免疫学的に非常に近い、現在入手しう
る高度に精製した酵素量により、炎症性、変質性、悪性
又はリューマチ性の病気における、全ての型の予防、治
療そして、または、診断に、自己免疫病及び移植におけ
る傷治療及びhMn−SOD欠損に伴う、または、通常これと
連結している病気の予防及び治療に適している。例え
ば、この臨床的応用は、バニスター（Bannister）,W.H.
及びバニスター（Bannister）,J.V.（スパーオキシド及
びスーパーオキシドジスムターゼの生物学的及び臨床学
的特性、11B巻，エルスビア／北−オランタ（Elsevier/
North−Holland,1980年）及びミシェルソン（Michelso
n）,A.M.,マコード（Mc Cord）,J.M.フリドビッチ（Fri
dovich）（スーパーオキシド及びスーパーオキシドジス
ムターゼ，アカデミックプレス（Academic Press）,197
7）により議論されたものを含む。さらに、次に示す臨
床的応用も考えられた。潅流性傷害、脳溢血、アルコー
ル傷害の肝臓、未熟児、おそらく膵臓炎、急性呼吸器
病、（ARD）、気腫、透析障害腎臓、骨関節炎、リュー
マチ性関節炎、放射能障害、かま型貧血症。

本発明に従うhMn−SODは、個体又は液状食物の保存性
を高めるのにも適している。

本発明に従うhMn−SODは、組織的に、又は、局所的に
投与される。前者の場合、従来の非経口的投与（例え
ば、i.v.,i.m.,s.c.,i.a.）そして後者の場合、従来の
調製物（例えば、ペースト、軟膏、ゲル、吸入又は、チ
ューイング錠剤、粉末及び、hMn−SOD調製物及び薬学的
に許容されるキャリヤーの局所的吸収を許すその他の本
草的製剤）が用いられる。治療効果量としては、例えば
日に約4mg前後が個人的基準に従がい用いられる（患者
の病気の重度等依存）。

本発明の制限を意図するものではない、次にあげる実
施例で、本発明をより詳細に説明する。

材料 次にあげる実施例中、他言しないかぎり、次の物質、
溶液、プラスミド、ベクター及び微生物を用いた。

ADH Iプロモーター;DSM4013（pES103）,1987,2,27 （1500bp BamH I/Xho I）保管 ADH Iプロモーター,pWS323Eと略記;DSM4016 1987,2,27登録（400bp BamH I/Xho I） ADH Iターミネータ;DSM4014（pGD2）,1987,2,27 （336bp Xba I/Hind III）保管 BamH Iバッファ;150mM NaCl,6mMトリス−塩酸pH7.9,6mM
MgCl₂,100μg/ml BSA, コアバッファ;50mMトリス−塩酸,pH8.0,10mMMgCl₂,50mM
NaCl, 変性溶液;0.5M NaOH,1.5M NaCl, デンハート溶液;1gポリビニルピロリドン,MW360,000, （Denhardt）（x50）1gフィコール,1gウシ血清アルブミ
ン（BSA）,100ml H₂O添加 大腸菌C600;F^-,sup E44,thi1,thr1,leuB6,lac Y1,ton A
21,λ⁻（ATCC23724） 大腸菌JM101;sup E,thi，Δ（lac−pro AB），
〔Ｆ′，tra D36,pro AB,lac I^qZ,ΔM15〕 ハイ・バッファ;100mM NaCl,50mMトリス−塩酸pH7.5,10
mMMgCl₂,1mMジチオスレイトール（DTT） Hine IIバッファ;10mMトリス−塩酸pH7.5,60mM NaCl,10
mMMgCl₂,1mM2−メルカプトエタノール,100μg/ml BSA ハイブリダイジング溶液；サケ精子DNA以外はプレ・ハ
イブリダイジング溶液と同じ、 クレノー反応溶液;22μ DNA/H₂₀,2.5μ10×NTR バ
ッファ（0.5Mトリス−塩酸pH7.2、0.1M MgSO₄,1mM DTT,
500μg/ml BSA）/1ml,2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP,2.5Uク
レノーフラグメント（0.5μ） ラムダバッファ;100mMトリス−塩酸,pH7.5,10mM MgCl₂,
1mM EDTA LB寒天;LB液体培地,15g/バクトアガー（ディフコ） LB液体培地;10g/バクト−トリプトン（ディフコ）,5g
/イーストエキストラクト（ディフコ）,5g/ NaCl,1
0M NaOHでpH7.4に調整 ライゲーション溶液;66mMトリス−塩酸pH7.6,10mM MgCl
₂ 5mM DTT,1mM ATP,1U T₄−DNAリガーゼ 中和溶液;0.5Mトリス−塩酸pH7.5,1.5M NaCl ニトロセルロースフィルター；シュレイチャー・アンド
・シュエル（Schleicher ＆ Schuell）、メンブレンフ
ィルターBA85 Nru Iバッファ;50mM KCl,50mM NaCl,50mMトリス−塩酸p
H8.0,10mM MgCl₂ プレハイブリダイジング溶液;5x SSC,5xデンハード（De
nhavdt）溶液,50mMリン酸ソーダバッファpH6.8,1mM Na₂
P₄O₇,100μM ATP,0.1％SDS,30〜100（50）μg/ml変性、
超音波処理サケ精子DNA pUC18;ファルマシア pURA3;DSM4015,1987,2,27保管 S,セレビシアエDBY747株;a,leu2,his3,trp1,ura３（イ
ースト・ジエネチック，ストックセンター，バークレー
（Berkeley） SC−URA培地;0.67％BYNB（ディフコ）,2％グルコース,2
％50×ASミックス（リットル当り,1gヒスチジン,6gロイ
シン,2.5gトリプトファン,4gリジン,1.2gアデニン,2gア
ルギニン,1gメチオニン,6gフェニルアラニン,5gスレオ
ニン,6gイソロイシン） Sma Iバッファ;10mMトリス−塩酸pH8.0,20mM KCl,10mM
MgCl₂,10mM2−メルカプトエタノール,100μg/ml BSA Sph Iバッファ;10mMトリス−塩酸pH7.5,100mM NaCl,10m
M MgCl₂,10mM2−メルカプトエタノール,100μg/ml BSA SSC（20X）;3.0M NaCl,0.3Mクエン酸ナトリウムpH7.0 SSPE（20X）;3.6M NaCl,0.2M Na₂HPO₄,20mM EDTA,10N N
aOHでpH7.4に調整 TEバッファ;10mMトリス−塩酸pH8.0,1mM EDTA Tha Iバッファ;50mMトリス−塩酸,pH8.0,10mM MgCl₂ トップアガロース;LB液体培地,0.7％アガロース（シー
クン（Seaken）FMアガロース） 前洗浄液;1M NaCl,50mMトリス−塩酸pH8.0,1mM EDTA,0.
1％SDS. 実施例1. cDNA遺伝子バンクの構築 新鮮なヒトの胎盤組織のサイコロ大の小片を液体窒素
につけて、急冷凍結させ、その組織を−80℃以下で粉末
にする。それから、RNAを、チャーグウィン（Chirgwi
n）,J,M,等の方法を用いて、その粉末の組織物質から抽
出し、精製する（チャーグウィン（Chirgwin）,J,M,
等，バイオケミストリー（Biochemistry）18巻,5294−5
299頁,1979年）。

アビブ（Aviv）,H及びレダー（Leder）P,の方法によ
り、そのRNAからポリ（Ａ）⁺RNAを調製した（プロシー
ディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（Proc,Natl,Acad,Sci）USA,69巻,1409−1412頁,
1972年）。“cDNA合成システム”を用い、そのcDNAを合
成した（アマーシャムRPN1256）。

パッキングはギガパック（Gigapack）（ベクタークロ
ーニングシステム）を用いて行った。λgt10のEcoR I部
位へのクローニング手順は、ハイン（Huynh）,T,V,等の
方法を用いて行った（DNAクローニング、１巻,D,M,グロ
ーバ（Glover）編,IRLプレス,2章,1985年）。但し、
“プレーティング細菌”としては、大腸菌C600を用い
た。cDNA遺伝子バンクを表わすλgt10ファージの数は、
1.2×10¹⁰pfu/mlで、独立したクローンの数は、１×10⁶
個であった。

実施例2. λgt10遺伝子バンクの増殖 適当な大腸菌イースト株（C600、遺伝子型F^-,sup E4
4,thi1,thr1,leuB6,lac Y1,ton A21,lamda−（M,A,ホイ
ト（Hoyt）等,1982年，セル,31巻,5658頁））を、0.2％
マルトースを補ったLB培地中、37℃で一晩前培養した。

この培養物を、3000rpmで５分間遠心し、OD600nmが4.
0となるよう、氷冷10mM MgSO₄溶液に再懸濁した。この
ようにして調製したMg細胞を４℃で保存し１週間使用す
ることができた。

滅菌した試験管中、200μのMg細胞12本をファージ
サスペンジョン（プレート当り、cDNA遺伝子バンク5000
0pfu）と混ぜ、37℃で20分間インキュベートした。それ
から、融解し、42℃に調節したトップアガロース６〜7m
lを（最終濃度10mM MgSO₄を含む）、各試験管に入れ、
混合し、そして、10mM SO₄を含む12枚の37℃に予め加熱
された寒天プレート（13.5cm径）に注ぎ、そのプレート
を37℃で６〜12時間インキュベートした。

実施例3. 組換え入ファージを同定するための一次スク
リーニング a.ニトロセルロースフィルターの調製 インキュベーション後、このようにして調製したプレ
ートを４℃に冷やした。鉛筆で数字をうったニトロセル
ロースフィルターをプレートの表面に置き、プレート上
のそれらの位置を、刺しピンで印をつけた。すっかり湿
ってから１分後、そのフィルターを注意して、取り、変
性溶液中に入れ、室温（RT）で１分間インキュベートし
た。それから，それらを、室温で５分間、中和溶液中で
中和し、再び、2x SSPE中、30秒間、インキュベートし
た。

さらに３回の抽出が、各プレートにつき、プレート上
の各時間を30秒長く放置したフィルターにより行なわれ
た。刺しピンの位置は、次のフィルターに対して、正確
に移動した。そのフィルターをロ紙上に置き、空気中で
乾燥し、そのDNAを80℃で２時間焼くことにより固定し
た。そのプレートは次のハイブリダイゼーションの結果
が得られるまで保存した。

b.³²Pラベルしたプローブの調製 合成オリゴヌクレオチド混合物を、381ADNA合成器を
用いて（アプライド、バイオシステム社）調製し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製し（20％、8M尿
素、T,マニアチス（Maniatis）等、モレキュラー，クロ
ーニング，コールドスプリング・ハーバー，ラボラトリ
ー,1982年,173ff頁）、そして、セファデックスG50で脱
塩した（ファルマシア）。このようにして合成したDNA
プローブは、ａ）アミノ酸39−46、又は、ｂ）アミノ酸
200−207をコードするRNA塩基配列に相補的であり（D,
バラ（Barra）等，オキシ・ラジカル及びそれらのスキ
ャベンジャー・システム、１巻,336−339頁,1983年）、
次に示す塩基配列をもっている。

ここで、A,G,C及びＴは、対応するヌクレオチドを、
Ｉはイノシンを示している。

化学合成したDNAプローブ混合物を各々、20pM/μと
なるよう水に溶かした。

反応混合物； エタノール溶液から凍結乾燥した、20〜100pMガンマ
³²P ATP（3000Ci/m mol,アマーシャム）、20〜100p mol
オリゴヌクレオチド,1μ10Xキナーゼ・バッファ（0.7
Mトリス−塩酸pH7.6,0.1M MgCl₂,50mMジチオスレイトー
ル）、10ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（BR
L）、水で10μにする。

反応は37℃で60分間行ない、25mM EDTAを添加して停
止させる。組込まれなかった放射活性物は、1mlのワン
ウェイシリンジ中に作製した、1mlバイオゲルP6−DG
（バイオラド）を用いた排除クロマトグラフィーにより
取り除いた。

c.in Situハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションの間、かなりのバックグラン
ド放射能の原因となる残留アガロース及びバクテリア
を、ニトロセルロースから除くため、そのフィルター
を、十分量の前洗浄溶液中、65℃でインキュベートし、
数時間から一晩の時間範囲で洗った。ニトロセルロース
フィルター上のDNAに対する非特異的結合部位を飽和す
るため、これらのフィルターを、予め、減圧下で脱気し
た、プレハイブリダイジング溶液中、37℃で１〜12時間
インキュベートした。

ハイブリダイゼーションに用いる放射性ラベルしたDN
A（約１×10⁹cpm/μｇ）を、37℃に予め加熱しておいた
必要量の脱気したハイブリダイジング溶液に加た。ハイ
ブリダイジング溶液中でできるだけ高いDNA濃度を維持
するため、液体でそのフィルターが丁度おおわれるのに
十分な量のハイブリダイジング液を用いた。ハイブリダ
イゼーションは、37℃で12〜18時間行った。

そのニトロセルロースフィルターを、ウッド（Wood）
等の方法により、6xSSC及び0.05％SDS（４℃）で３回洗
浄し（プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Proc,Natl,Acad,Sci）USA,82
巻,1585−1588頁,1985年）、そして同様に、４℃で、30
分間２回洗浄した。その後、そのフィルターを、新たに
調製した。3Mテトラメチルアンモニウムクロライド（Me
4NCl）、50mMトリス−塩酸pH8、2mM EDTA及び0.05％SDS
を含む溶液で３回洗い、室温で30分間２回洗い、そして
最後に、49℃で、30分間３回（オリゴヌクレオチド混合
物ａ））又は、52℃で30分間３回（オリゴヌクレオチド
混合物ｂ））洗浄し、空気中で乾燥（オリゴヌクレオチ
ド混合物ｂ））し、ロ紙に重ねた。Ｘ線フィルムは、
“強化スクリーン（“intensifying Screen"）”を用い
−70℃で２〜８日間露光した。

実施例4. プラーク精製 第１探索では個々のプラークは、高密度プラークのた
め、単離できないので、その組換えラムダファージは、
いくつかの連続した探索により精製していき、同時にプ
ラーク密度を減らしていった。２重にハイブリットさせ
た２つのニトロセルロースフィルター上、１つの陽性の
ハイブリダイズ信号を与える寒天プレートから各領域
（３回の一次スクリーニングを行ない、28領域のうちの
２つ、35領域のうちの１つ、及び15領域のうちの５つが
陽性であった。）を単離した。望ましい部位を、滅菌し
たパスツールピペットの鋭い方の端でその寒天からそぎ
取り、0.3〜0.6mlのラムダバッファ（100mMトリス−塩
酸pH7.5、10mM MgCl₂及び1mM EDTA）に移した。これ
に、SMバッファも使うことができる（マニアチス（Mani
atis）,T,モレキュラー，クローニング,1982年,70
頁）。クロロホルム１滴添加の後、そのファージを４
℃、１晩放置し、その寒天から拡散により出させ、そし
て各ファージサスペンジョンを再び何倍かに希釈して、
プレートにまいた。別のニトロセルロースフィルターを
100〜300個のプラークを有するプレートから作り、この
抽出物を２つのDNAプローブでハイブリダイズさせた。
この操作を繰り返し、プレート上の全てのプラークが、
陽性のハイブリダイゼーション信号を与えるまで追いつ
めていった。

実施例5. 得られたファージクローンの分析 a.λファージの測定 ファージサスペンジョンを10倍希釈毎、ラムダバッフ
ァで希釈し、数回傾けることにより混合し、プレートに
まいた。37℃におけるインキュベーションの後、バクテ
リアのローン上に形成したプラークを計数し、その濃度
を測定した（プラーク形成ユニット（pfu）。精製した
ファージサスペンジョンの濃度は、2.2〜8.6×10¹⁰pfu/
mlであった。

b.ラムダファージDNAの調製 本質的に均一なファージクローンの単離及び濃度検出
後、それらを、200mclのC600Mgセル（4 0D600）ととも
に、ペトリ皿（13.5cm）（1.5％アガロース、10g/ト
リプトン、5g/イースト・エキストラクト、5g/ NaC
l、10mM MgSO₄及び0.2％グルコースの組成の培養培地）
当り２×10⁶pfuの密度でまき、37℃で５時間インキュベ
ートし、その後４℃まで冷やした。プレートを、8mlの
ラムダバッファ及び数滴のクロロホルムでおおい、４℃
で１晩、おだやかに傾けることで溶出した。遠心（1500
0rpm、15分、４℃）により精製した上清を取り出し、フ
ァージを50000rpm（ベックマンTi50ローター）、室温で
30分遠心することによりペレット化した。500μのラ
ムダバッファを加え、リボヌクレアーゼＡ（RNasc A,10
μg/ml）及びデオキシリボヌクレアーゼ（DNase,1μg/m
l）と、37℃、30分間インキュベートした後、0.5M EDTA
25μ,1Mトリス−塩酸（pH8.0）12μ及び20％SDS6.5
μを添加することにより、イオン強度を増加させ、残
存する酵素を、70℃、15分間加熱することにより失活さ
せた。等容量のフェノールで１回及びクロロホルム／イ
ソアミルアルコール（24:1）で２回抽出した後、0.1倍
容の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）、及び２倍容のエタノ
ールを添加してDNAを沈殿化し、遠心で落として、70％
アルコールで洗浄、乾燥後50μのTEバッファに溶かし
た。

c.制限分析 2mclのDNA溶液を、ハイバッファ中、５ユニットのEco
R Iと、37℃で２時間インキュベートし、得られた断片
を、１％アガロースゲルを用い、cm当り１〜５ボルトの
電圧で分離し（T.マニアチス（Maniatis）等,1982年,14
9ff頁）、500〜1000塩基対の範囲の長さの断片をゲルか
ら溶出し（G.M.ドレッゼン（Dretzen）等，アナリティ
カル，バイオケミストリー（Anal,Biochem,）,112巻,29
5〜298頁,1981年）、最後に配列決定分析にかけた。

d.配列決定分析 DNA断片の制限処理及びライゲーション及び大腸菌宿
主へのトランスフォーメーションによる通常の方法によ
り（T.マニアチス（Maniatis）等,1982年，モレキュラ
ー，クローニング，コールドスプリングハーバー・プレ
ス,104頁,146ff頁,396頁;DNAクローニング,IRL−プレ
ス,1985年,1巻,6章）サンガーの配列決定法（F.サンガ
ー（Sanger）等，プロシーディング・イン・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc,Natl,Acad,Sc
i,）USA,74巻,5463−5467頁,1977年;F.サンガー（Sange
r）等,FEBSレターズ,87巻,107−111頁,1978年）に適し
たベクター（ブルースクライブM13＋又はM13−，ベクタ
ークローニングシステム（（C,ヤニシ−ペラン（Yanisc
h−Perron）等，ジーン（Gene）,33巻,103−119頁,1985
年））への制限断片のクローニングを行った。この様
に、単離したEcoR I−cDNA断片100ngを,EcoR I部位を介
し、同様に調製したdsDNA型のベクター（複製型,50ng）
（10μのライゲーション溶液中、14℃で２〜12時間の
インキュベーションにより）に挿入し、そして、この組
換え構築物により（BS3,BS5,BS8,BS9,BS12,BS13,BS XII
Iと命名）、大腸菌のコンピテント細胞をトランスフォ
ームした。この組換えファージの一本鎖DNAを単離し、
サンガー（Sanger）の方法に従い配列決定を行った。こ
の配列は、適当なコンピュータプログラムを用いて処理
した（R.スティデン（Staden）、ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ（Nucl,Acids Res.）,10巻,4731−4751頁,
1982年）、この単離したクローン８（BS8）は、成熟酵
素のアミノ酸22からのコード配列を含んでいた（図
１）。

実施例6. 発現カセットの構築 イースト中でhMn−SODを発現するため、単離したDNA
を完全なものにし、そして、本来の長さ（約1500bp、メ
ソッズ・イン・エンザイモロジー,101巻，パートＣ、19
2−201頁,1983年），短縮形（ADHIK約40bp）のADH Iプ
ロモーター、及びADH IIターミネーター（R,ベイアー
（Beier）及びE.T.ヤング（Young），ネイチャー（Natu
re）,300巻,724−728頁,1982年）を用いる発現カセット
を構築する必要がある。

a.遺伝子の完成化 単離したcDNAクローン８は、そのＮ末端の21個のアミ
ノ酸（AA）に対応する塩基を欠いているので、イースト
のコドン選択性（P.M.シャープ（Sharp）等，ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）14巻,51
25−5143頁,1986年）を考慮し、報告されているアミノ
酸配列（D,バラ（Barra）等ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem,）259巻,12595
−12601頁,1984年）に対応する遺伝子を完成するため、
２対のオリゴヌクレオチドをXho−Xba I断片（OPI,式VI
aに対応）又はXba I−Nco I断片（OP2,式VI bに対応）
として構築、合成した。0P Iは、Hinc IIの制限処理及
びXho Iリンカーの挿入後、Xho I/Xba Iを介し、プラス
ミドV17（pUC18から得られたもの（J.ビエイラ（Vieir
a）及びJ.ミシング（Messing）、ジーン（Gene）、19
巻,259頁,1982年）に挿入した（Ncoリンカー；ニューイ
ングランドバイオラブス（New England Biolabs,d（CCC
ATGGG））（図２参照）。一方、OP₂はXba I/Nco Iを介
し挿入した。これを行うため、COREバッファ40mcl中、
４μｇのV17DNAを、10ユニットのXba I及びNco I、又は
Xho I及びXba Iで37℃、２時間、消化し、ゲル電気泳動
により精製した（0.7％アガロース、上記参照）。合成
した１本鎖の0P1又は0P2を５μ（各々10pM/μ），
混合し、65℃で10分間インキュベートし、その後、室温
までゆっくりと冷やした。その10分の１を上述の条件
下、二重切断した（0P1はXho I/Xba I,0P2は、Xba I/Nc
o I）ベクター5ngに連結した（プラスミドHSOD2及びHSO
D3、図２）。最後に、HSOD2及びHSOD3を、その切断ベク
ターのゲル電気泳動による精製、単離、及び上述の条件
下（オリゴマーのペア、0P1と0P2のクローニング）での
連結後、Sca/Xba Iを介して連結し、プラスミドHSOD4を
作った（COREバッファ中、37℃、２時間のSca I及びXba
Iによる二重消化後）（図2,3）。このプラスミドHSOD4
は、Nco I制限処理と、クレノー充填及びEcoR I制限処
理によりTha I/EcoR I cDNA断片を得られるよう調製さ
れている。５μｇのDNAを50μのハイバッファ中、18
ユニットのNco Iと37℃、数時間インキュベートし、そ
の切断DNAをゲル電気泳動により精製し、それを単離
し、その半分を、30μのクレノー反応溶液中、室温
で、１時間インキュベートした。

２μの0.5M EDTAを加えることによりその反応を停
止し、反応溶液を70℃10分間インキュベートした後、そ
のDNAをゲル電気泳動により精製し、単離し、そして、
ハイバッファ20μ中7.5ユニットのEcoR Iで再切断
し、再度精製、単離した（図５）。

そのTha I/EcoR I cDNA断片を次のようにして調製し
た。

大腸菌のコンピテント宿主細胞（JM101株）を、単離
したcDNAクローン８（上述）を述むプラスミドBS8でト
ランスフォームし、そして、そのプラスミドを、適当な
条件下で調製した（T.マニアチス（Maniatis）等,1982
年,368頁）。

Tha Iでの制限処理（10μｇのプラスミドをTha Iバッ
ファ中、25ユニットTha Iで、60℃、８時間の消化処理
を行った）、EcoR Iによる759bpのTha I断片の再切断
（上述）、対応する断片のゲル電気泳動による精製及び
単離の後、そのようにして得たTha I/EcoR I断片を、同
様に調製したプラスミドHSOD4と合わせ、HSOD6を作った
（図５）（約100ngの断片を、10μ中のライゲーショ
ンバッファ中、切断ベクター50ngと連結した（上記）。
このようにして得たプラスミドHSOD6は、Metを含むhMn
−SODに対する完全なcDNAを含んでいる。その読み枠は
保持されている。

b.発現カセットの構築 COREバッファ中、プラスミドHSOD6をXho I及びEcoR I
（DNAμｇ当り５ユニット）で二重消化し、そのXho I断
片（遺伝子）を単離し、Xho I/EcoR Iを介し、プラスミ
ドPKH1又はPKH2に挿入した。プラスミドPKH1及びPKH2は
次のように調製した（図6,7,8）。Sma I制限処理（１μ
ｇのプラスミドを、Sma Iバッファ中、37℃、２時間、
５ユニットのSma Iで消化した）、精製及び消化後、Bg
IIIリンカーを、PES102中の1500bpのBamH I−Xho I断片
として、ADH1プロモーターを含む、プラスミドPES103中
に挿入した（PES102は、Hinc II切断部位中、Xho Iリン
カーを含むpUC18誘導体であり、BamH I−Xho I断片の構
築は、“メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods
in Enzymology）”に述べられている（T.マニアチス（M
aniatis）等,1982年,396頁）。このようにして得たプラ
スミド（P154/1,図６）を、EcoR I制限処理（上述）、
クレノー充填（上述）及び再連結（40μのライゲーシ
ョンバッファ中（上述）、１μｇのDNAを14℃で１晩イ
ンキュベーションした）により、プラスミド154/2に変
換した（図６）。

また、プラスミドpES103から出発して、リンカー、−
Xho I.EcoR I.Xba I.Hind III−（図7,381ADNAシンセサ
イザーを使用して合成）を、COREバッファ中、Xho I及
びHind IIIで二重消化した後挿入した。このリンカーは
配列、 を含む。

生じたプラスミド150/1にXba I/Hind II（COREバッフ
ァ中の二重消化）を介し、ADH IIターミネーターを挿入
した（プラスミド150/2（図７））。ADH IIターミネー
ターは次のようにして得た。プラスミドpMW5ADH II（ワ
シントン・リサーチ・ファンデーション（Washington R
esearch Foundation）をHind IIIで消化（COREバッフ
ァ）、さらにSph I（Sph Iバッファ）で消化し、そし
て、単離した605bpの断片を、ベクターV18中にクローン
化し、Xba Iリンカー（バイオラブス（Biolabs）,CTCTA
GAG）をHinc II切断部位に組込んだ（ライゲーションの
ため、上述）。335bp長のXba I/Sph I断片をpJC18中に
連結した（Xba I/Sph I）（pGD2）。

pUC18のSma I部位にHind IIIリンカーを組込むことに
よりベクター18を得、そして、そのHind III部位を、元
の位置から無くし、その結果、V18における多重クロー
ニング部位は、次にあげるものとなった;EcoR I,Sst I,
Kpn I,Hind III,BamH I,Xba I,Sal I,Pst I,Sph I。

最後に、COREバッファ中、Xba I/Hind IIIでの二重消
化後、従来法により（上述）ADH IIターミネーターを単
離した。このように、プラスミド150/2は、遺伝子発現
に必要で、Xho I/EcoR Iを介して挿入される遺伝子と離
れた単位、すなわち、およそ1500bp（プロモーター）、
7bp（Xhoリンカー）、6bp（EcoR Iリンカー）、7bp（Xb
a Iリンカー）、329bp（ターミネーターを含んでいる。
これらの単位をBamH I/Hind IIIを介し（COREバッファ
における二重消化）；ベクター154/2中に挿入した（図
８）。生じたプラスミドPKH1（図８）において、ADH I
プロモーターをBamH I/Xho I断片（412bp）としての短
縮化プロモーターADHIKに置換えた（pKH2,図９）。

最後に、HSOD6から切り出した完全なcDNA遺伝子（上
述）を、Xho I/EcoR Iを介し、両プラスミドに挿入し
た。生じたプラスミドHSOD7/1及びHSOD7/2（図９はHSOD
7/2のみ示している）は、プロモーターADH I及びADHIK
が違うだけである（上述）。このように調製した発現カ
セットを、同様に調し、自由に得ることができるイース
トのトランスフォーメーションベクターYEp13（J.R.ブ
ローチ（Broach）等，ジーン（Gene）8,121−133頁,197
9年,ATCC37115）,pJDB207（DSM3181,1984年,12月28日保
管）、pEAS102（上述）、YIp5（K.ストラル（Struhl）
等，プロシーディング・イン・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Proc,Natl,Acad,Sci,）USA76巻,1
035−1039頁,1979年,ATCC37061）に、BamH I及びHind I
II切断部位、Bgl III/Hind IIIを介し、挿入した（CORE
バッファ中でのプラスミドの二重消化及び発現カセット
の単離後）。

実施例7. 発現に適したイーストMn−SOD変異株の調製 ベクターPL41中、イーストのMn−SODの遺伝子（A,P,
G,M,バン、ルーン（Van Loon）等，ジーン（Gene）26
巻,261−272頁,1983年）は、BamH I断片として含まれ、
その配列は全て報告されている（C,A,M,マレス（Marre
s）等，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Eur,J,Biochem,）147巻,153−161頁,1985
年）。BamH Iによる制限消化後（150mM MaCl,6mMトリス
−塩酸pH7.9、6mM MgCl₂、100μg/μウシ血清アルブ
ミン中、２μｇのプラスミドを５ユニット、36℃、２時
間で消化した）、その遺伝子を含む2045bp長のBamH I断
片を通常のゲル電気泳動により精製し、単離後、ベクタ
ーVO（pUC18、Hind III切断部位は含まない）にBamH I
部位を介しサブクローンした。

ベクターVOは、１μｇのpUC18をHind III（COREバッ
ファ）で切断し、従来の方法で、線状断片をゲルから単
離し２ユニットのクレノーポリメラーゼでプロジェクテ
ィングエンドを充填し（リガーゼバッファ＋0.2mM dNT
P）そして、室温、30分間後、２ユニットのT4−DNAリガ
ーゼにより、14℃、１晩で再連結することにより得た。

プラスミドSoDY1（図10）は、Nru I制限処理（１μｇ
のプラスミドを、Nru Iバッファ中、５ユニットのNruで
36℃、２時間処理した）及びゲル電気泳動により精製
し、Hind IIIリンカー（CAAGCTTG）の挿入によりSODY3
に変換した（図10）。最後に、URA3遺伝子（pURA3由
来）を、Hind III切断部位に挿入した;SODY3 4μｇを、
COREバッファ中、20ユニットのHind IIIを用い、37℃で
２時間消化し、さらに脱リン酸化した;40μの消化混
合物に、40μH₂O,10μ1M EDTA、５μ1Mトリス−
塩酸pH9.5、１μ100mMスペルミジン、１μウシ腸ア
ルカリホスファターゼ（CIAP,1mg/mlH₂O）を加え、全体
を36℃でインキュベートした。15分後、さらに１μの
cIAPを加え、その混合物を、もう15分間インキュベート
した。脱リン酸化したベクターも、アガロースゲル電気
泳動により精製した。２μｇのプラスミドpURA3をHind
IIIで切断し（上記）、そして、1.2Kpのイーストの遺伝
子URA3を含む断片を単離し、調製したベクター（上記）
に挿入した。

生成したプラスミドSODY7及びSODY8は、イーストのMn
−SOD遺伝子内にURA3遺伝子を含み、それらは、Mn−SOD
遺伝子に対し、URA遺伝子の配向が異なっている。（図1
0）。

URA3遺伝子は、非対称なPst・Ｉ部位を含んでいるの
で、Mn−SODに対するURA3の配向を決めることが可能で
ある。

“遺伝子のトランスプレースメンドは、DBY747の株
（遺伝子型、a,leu2,his3,trp1,ura3,イースト・ジェネ
ティック・ストック・センター（Yeast Genetic Stock
Centre），バークレー（Berkeley））中、プラスミドSO
DY7及びSODY8を用いて行った（メソッズ・イン・エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology）,101,202−211及
び211−228頁）。DBY747株をSODY7及びSODY8由来のBamH
I断片でトランスフォームした（J.D.ベグス（Begg
s）、ネイチャー（Nature）、275巻,104頁,1978年）。
これを行うため、20μｇのSoDY7又はSODY8を、200μ
のBamH Iバッファ中（150mM NaCl,6mMトリス−塩酸pH7.
9,6mM MgCl₂,1mM DTT）、50ユニットのBamH Iで切断
し、全消化混合物（pUC領域を分離することなしに）を
フェノールで抽出し（マニアチス（Maniatis）,T,等，
モレキュラー、クローニング（Molecular Cloning）,19
82年,458ff頁）、そして、エタノール沈殿で濃縮した
（20μの3M酢酸ナトリウム（pH5.5）、500μのエタ
ノールの添加）。そのDNAを10μの水にとかし、イー
ストのトランスフォーメーションに直接使用した。

トランスフォーマントは、ウラシルの栄養要求性で選
択した。

個々のトランスフォーマントを、5mlのSC−URA培地
中、28℃で一晩培養した。その細胞を遠心で収穫し、ヴ
ァン・ルーン（Van Loon）等（プロシーディング・イン
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc,N
atl,Acad,Sci）USA83,3820−3824頁1986年）の方法で破
壊し、そのMn−SoD含量を調べた。ゲル電気泳動によるM
n−SOD及びCu/Zn−SODの測定は、従来の方法（Ch,ビュ
ーチャンプ（Beauchanp）及びI.フリドビッチ（Fridovi
ch），アナリティカル，バイオケミストリー（Anal.Bio
chem.）44巻,276−287頁,1971年;H.P.ミスラ（Misra）
及びI.フリドビッチ（Fridovich），アーク，バイオケ
ム，バイオフィズ（Arch,Bio chem,Biopbys.）,183巻,5
11−515頁,1977年;B,J,デービス（Davis），アナルス・
オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Annals of the New York Academy of Science）,12
1巻,404−427頁,1964年）。最良と思われる方法は、そ
のタンパク質の分離と、ニトロブルー・テトラゾリウム
によるネガティブ染色である（B.J.デービス（Davi
s）、1964年;Ch,ビューチャンプ（Beauchamp）及びI.フ
リードビッチ（Fridovich）,1971年）。ジアニシジンに
よる染色で感度を向上させることができる（H.P.ミスラ
（Misra）及びI.フリードビッチ（Fridovich）,1977
年）。O₂ ^-発生システムとしてのアルカリ、ジメチルス
ルホキシド及び“スキャベンジャー”としてのチトクロ
ムＣを用いた分光学的検定法もある（ハイランド（Hyla
nd）,K,等，アナリティカル，バイオケミストリー（Ana
l.Biochem.）135巻,280−287頁,1983年）。

一方ではMn−SOD及び他方ではCu/Zn−SODがKCNの添加
Ｄにより区別できる（上記参照、M,イセバート−バンネ
ステ（Ysebaert−Vannete）及びW.H.バンネステ（Vanne
ste），アナリティカル，バイオケミストリー（Anal.Bi
ochem.）107巻,86−95頁,1980年）。

SODY7/2,SODY7/6,SODY7/8,及びSODY7/10株は、Mn−SO
D活性を含んでいなかった。

実施例8. 発現ベクターの調製 実施例6bで述べた発現カセットを、Bgl II/Hind III
断片として、各々プラスミドHSOD7/1及びHSOD7/2から切
り出した（各々の場合において、２μｇのプラスミドDN
AをCOREバッファ中、10ユニットの酵素を用い37℃で２
時間切断した）。同様に、１μｇのYEp13、pJDB207及び
pEAS102をHind III−BamH Iで切断した（上述の消化条
件） 50μｇのベクターDNA及び200μｇの挿入物をリガーゼ
バッファ中、１ユニットのリガーゼを用い、14℃１晩で
連結し、大腸菌HB101株をトランスフォームするのに用
いた。次の表には、対応するプラスミドの名称を示し
た。

実施例9. トランスフォーメーションに適したイースト
株（WS30−5g）の調製 イーストSODY7/2株に対して述べた遺伝子マーカーの
他に、リンゾーマル・チーフ・プロテアーゼ（これらの
活性により、他のリソゾーマル・プロテアーゼをも活性
化することができる）の１つに突然変異をもち、そのイ
ースト細胞が破壊したときプロテアーゼをほとんど放出
しない（突然変異pep４）イースト株を調製した（E.W.
ジョーンズ（Jones）等，ジェネティクス（Genetics）,
102巻,665−677頁,1982年）。

Mn−SOD欠失株SoDY7/2を、プロテアーゼ欠失株WS20−
25と交雑させ（α，leu2,his3,trp1,ura3,pep４）、生
じたパプロイドの遺伝子マーカーを調べた（F.シャーマ
ン（Sherman），等，メソッズ・イン・イーストジェネ
ティクス（Methods in Yeast Geneties），コールドス
プリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）,N,Y,1972
年）。

できた株WS30−5g（leu2,his3,trp1,pep4,Sod１）は
容易にトランスフォームされ、望ましい条件を満たして
いる。

そのような交雑は、よく知られていて、簡単に入手で
きるイースト株、例えば、20B−12（イースト・ジェネ
ティック・ストック・センター（Yeast Genetic,Stock
Centre）バークレー（Berkeley））を使っても、良い結
果が得られる。

実施例10. イーストのトランスフォーメーション及び
イーストにおける発現。

イーストのSODY7/2株をプラスミドpWS371A,pWS372A及
びpWS373Aでトランスフォームし（J.D.ベッグス（Begg
s）、ネイチャー（Nature）275巻,104−109頁,1978
年）、そして、そのトランスフォーマントにおける発現
を調べた。

これを行うために、トランスフォーマントの前培養物
をSC−Len液体培地で作った（さらに2.4gのウラシルを
加え、ロイシンを含まないこと以外は、SC−URA培地と
同じである）（28℃で１晩、300rpmで振盪した）。その
100μを、4mlのYP5％Ｄ（１％バクトイースト・エキ
ストラクト,2％パクト・ペプトン、５％グルコース）に
接種し、１晩培養した（前培養と同条件）。その細胞を
収穫し、先に実施例７で述べたように破壊した。培養物
1mlに対応する粗細胞汁を、活性化ゲルに移した。その
活性テストは実施例７で述べた方法で行った。

イーストWS30−5g株（leu2,his3,trp1,pep4,Sod１）
を、プラスミドpWS550A,pWS490A,pWS491Aでトランスフ
ォームした。その前培養物及び培養物の調製及びhMn−S
OD活性の測定は、先に述べたように行った。

イーストWS30−5gにおけるプラスミドpWS490A,pWS491
A,の発現は図11に示したように実施された。

これらの条件下でのイースト中で測定されたMn−SOD
量は、およそ、培養液１リットル当り0.5mgに相当して
いる。

実施例11. イーストのリーダーDNA配列を含むリンカー
の合成 次に示す配列と長さをもつ６種のオリゴヌクレオチ
ド、EBI656,EBI636,EBI643,EBI646,EBI660及びEBI638
を、3bで述べたように、381A DNA合成方式（アプライ
ド，バイオシステムス製）を用いて調製した。

オリゴヌクレオチドEBI636,EBI643,EBI646及びEBI660
は、次のリガーゼ反応のために、下にあげた条件下、そ
の５′端をリン酸化した。

反応混合物１番 ２μEBI636（＝100poml） １μ10xリンカーキナーゼバッファ ３μ10mM ATP １μT4ポリヌクレオチドキナーゼバイオラブス（Bi
olabs）10V/μ ３μ水 反応混合物２番 ２μ（100pmol）EBI660を用いるこ
と以外、１番と同様。

反応混合物３番 ２μオリゴヌクレオチドBEI643（＝
100pmol） ２μオリゴヌクレオチドEBI646（＝100pmol） １μ10xリンカーキナーゼバッファ ３μ10mM ATP １μT4ポリヌクレオチドキナーゼ（10ユニット） １μ水 10xリンカーキナーゼバッファ 0.7Mトリス−塩酸pH7.6 0.1M MgCl₂ 0.05MDTT（ジチオスレイトール） 反応は、37℃で30分間続けた。それから、100℃に加
熱することにより、T4ポリヌクレオチドキナーゼを失活
させた。精密な128bp長のDNA挿入物（式XI）の５′末端
を作るためのオリゴヌクレオチドEBI656及びEBI638はリ
ン酸化せず、次のリガーゼ反応において、多重DNA挿入
物ができるのを防いだ。

個々のオリゴヌクレオチドからの、望ましいリンカー
の構成は次のような計画に従って行った。

アニール反応のため、２μ（100pmol）のEBI656を
反応混合物１番に加え、そして、２μのEBI638（100p
mol）を反応混合物２番に加えた（互いに、相補的オリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションが起こる。）
反応混合物３番はすでに２つの相補的オリゴヌクレオチ
ド（EBI643,EBI646）を含む。全ての三つの反応混合物
を100℃に２分間加熱し、ゆっくりと水浴中で冷却し
た。

反応１番から３番で生成した短かい二本鎖DNA断片を
次のように互いに連結した。

10μの反応混合物 １番（EBI636＋EBI656） 10μの 〃 ２番（EBI660＋EBI638） 10μの 〃 ３番（EBI643＋EBI646） ３μの10mM ATP １μ DNAリガーゼ，ベーリンガー，マンハイム,7ユニ
ット／μ， 反応は４℃、15時間続けた。

１％アガロースゲルでそのDNAを大きさに従って分画
し、式XIで示した128bp長の、目的とするDNA断片をゲル
から溶出した（G.M.ドレツェン（Dretzen）等，アナリ
ティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）112
巻,295−298頁,1981年）。

実施例12. リーダーDNA配列を含む発現ベクターの構築 プラスミドHSOD6をCOREバッファ中、通常の方法でXho
I及びXba I（DNA1μｇ当り５ユニット）により二重消
化し、そこに、従来の方法で128塩基長のリンカー（Xho
I−ミトコンドリアのリーダー−Xba I）を挿入した（p
EO22−Ａ）。そこで、ミトコンドリアのイーストリーダ
ーDNA配列を与えられたhMn−SOD遺伝子をCOREバッファ
中、Xho I−EcoR I（DNA1μｇ当り５ユニット）で二重
消化し、pKH1（例えば6b,図８）にXho I−EcoR Iを介し
て挿入した（pEO23−Ａ）。

このようにして調製した発現カセットを、実施例８と
同様に、切断部位BamH I及びHind IIIを介し、同様に調
製したイーストのトランスフォーメーションベクターYE
p13,pJDB207及びpEAS102に挿入した（COREバッファ中、
そのプラスミドを二重消化し、切り出した発現ベクター
を単離した後）。表IIは得られたベクターの名称を示し
てある。

表 2. 発現ベクターの名称 ベクター プラスミドの名称 pJDB207 pE24−AB pEAS102 pE25−AC YEp13 pE26−AD 実施例13. イーストのトランスフォーメーション及び
イースト中での発現 イーストのWS30−5g（実施例９）を、表２にリストし
たプラスミドでトランスフォームし、そのトランスフォ
ーマントについて、それらの発現を調べた（実施例1
0）。

トランスフォームしたイーストのWS30−5gの発酵のた
めに、その光学密度0D₅₄₆が0.01に到達するまで、次に
あげる組織をもつ前培養培地で、マクネチックスターラ
ーと、通気を用い培養した。67g/イースト・ナイトロ
ジェン・ベースW/Oアミノ酸（ディフコ）、10g/グル
コース、0.16g/アルギニン、0.25g/リジン、0.06g/
トリプトファン、0.08g/メチオニン、0.03g/シス
ティン、0.10g/ヒスチジン、0.16g/チロシン、0.17
g/フェニルアラニン、0.16g/スレオニン、0.18g/
イソロイシン、0.21g/バリン、0.40g/グルタミン
酸、0.21g/グリシン、0.02g/シスチン、0.15g/ア
ラニン、0.20g/アスパラギン酸、0.20g/プロリン、
0.15g/セリン、0.10g/アスパラギン、0.20g/グル
タミン、25mg/アデニン、50mg/ウラシル。

次の本培養の培地組成をあげる;8.0g/（NH₄）₂S
O₄、2.56g/（NH₄）₂HPO₄、1.16g/ KCl.0.60g/ Mg
SO₄・7H₂O,0.56g/ CaCl₂・2H₂O、0.04mg/ビオチ
ン、80mg/ m−イノシトール、40mg/ Ca−パントテ
ン酸塩、8mg/チアミン、2mg/ピリドキシン、3.1mg/
Cu SO₄・5H₂O、19mg/ FeCl₃・6H₂O、12mg/ ZnSO
₄・7H₂O、14mg/ MnSO₄・H₂O、5mg/ H₂BO₃、1mg/
KI、2mg/ Na₂M₀O₄・2H₂O、1g/イーストエキストラ
クト、0.2g/ウラシル、0.1g/アデニン、0.5g/ク
エン酸、15g/グルタミン酸、0.2g/ヒスチジン、0.5
g/トリプトファン、100g/グルコース（/20ファー
メンター（CHEMAP））。この目的のため、前培養物の５
％量を、接種物として用い、培養は、20ファーメンタ
ー中、撹拌（1000rpm）、通気（0.5vvm）及びpH5.0一
定、28℃で行った。

グルコース含量を50g/に落ちたら、さらに50g/の
グルコースを加え、グルコース濃度が10g/（45時間
後）になるまで発酵を続ける。発酵液を冷やし、遠心
し、その生物試料を凍結した。その生物試料の収量はリ
ットル当り、細胞湿重量で18gであった。イーストWS30
−5g株におけるプラスミドpEO24−AB、pEO25−AC及びpE
O26−ADの発現は図12で実証してある。

実施例14. イーストのミトコンドリアの調製 hMn−SOD遺伝子の前に、タンパク質をミトコンドリア
に輸送するイーストのミトコンドリアのリーダー配列が
挿入されているかどうかを決定するため、イーストのミ
トコンドリアを調製し、そのミトコンドリア内及び細胞
質内のMn−SOD活性を分析した。

イーストのミトコンドリアを、G.ダウム（Daum）等
（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol,Chem,）257巻,13028−13033頁）の方法を修正
して調製した。SC−Leu液体培地（実施例10）におけ
る、トランスフォーマントの前培養を、28℃、１晩、振
盪（300rpm）することにより行なった。その25mlを、22
5mlのYPD培地に接種し、前培養と同様に１晩培養した。
その細胞は、光学密度（600nm）で５〜７に調整し、遠
心により（ソーバル（Sorval）、6500rpm、５分間）収
穫した。細胞を100mlの水で１度洗浄した。その細胞ペ
レットを、1Mマニトール、20mM KPi（KH₂PO₄/K₂HPO₄）p
H7.4（細胞重量300mg当り1ml）に懸濁し、1mg/mlのジモ
ラーゼ（マイルス（Miles）、MW500）を加えた。スフェ
ロプラストを28℃、２時間、ゆっくりと振盪する（50rp
m）ことにより作った。そのスフェロプラストを遠心（3
000rpm、５分間、ヘリウス・クリスト・ベンチ・セント
リフュージ（Hereaus Christ Bench Centrifuge））す
ることにより収穫し、1Mマニトール、20mM KPi pH7.4、
1mM PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオライド）で
１度洗った。上清を捨て、１〜２培容のガラスビーズを
加えた（0.1mm直径）。

その細胞を、１分間撹拌することで破壊し、2.5mlの
0.65Mマニトール、1mM EDTA、1mM PMSFに懸濁した。細
胞全体及び細胞破壊物を2000rpm、５分間で遠心（ヘリ
ウス・クリスト・ベンチ・セントリフュージ（Hereaus
Christ Bench Centrifuge））した。そのミトコンドリ
アを上清から遠心で収穫した（ソーバル（Sorval）、Ｊ
−21、12000rpm、10分間）。その上清は、細胞質を含
み、後でhMn−SODを活性を研究するため、取り出した。
ラディッシュ・ブラウン色のミトコンドリアのペレット
を、上述のバッファ（細胞質成分を流し出す）で洗し、
そして、そのミトコンドリアを、2.5mlの同バッファに
懸濁した。再度遠心することにより、全ての不純物を取
り除き（ヘリウス・クリスト・ベンチ・セントリフュー
ジ（Hereaus Christ Bench Centrifuge）:4000rpm、５
分間）、そして、そのミトコンドリアを、二回目の遠心
で上清からペレット化した（ソーバル（Sorval）Ｊ−2
1、12000rpm、10分間）。イースト細胞を壊したときの
方法と同様に、ガラスビーズでミトコンドリアを壊わし
（ヴァン・ルーン（Van Loon）等，プロシーディング・
イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pr
oc,Natl,Acad,Sci,）USA83巻,3820−3824頁,1986年）、
活性ゲル中、そのMn−SOD含量を調べた（図13）。

実施例15. 本発明に従うhMn−SODの精製 組換えhMn−SODを、いくつかのステップでWS30−5g/p
EO24−AB（イーストベクターpJDB207）から単離した。

ステップ1. 細胞の破壊 細胞物質（実施例13）を、湿重量１グラム当り10mlの
蒸留水で洗浄し、16000×ｇで15分間遠心した。その沈
殿を、Na,Kリン酸バッファ（50mM,pH7.0）に比1:3（w/
v）で再懸濁した。それから細胞を、時間当り６リット
ルの流速で、ガラスビーズ（直径0.1mm）を用い、細胞
ミル（ダイノミル（Dynomill）KDL、バコファ（Bachofe
r）、ベイセル（Basel）、スイス;0.6グラインゲィン
グ・コンテナ、水冷）を連続的に運転して壊わした。そ
の細胞抽出物を、15分間（16000×ｇ、４℃）遠心し、
沈殿は捨てた。

ステップ2. ポリエチレンイミン沈殿 ５％（w/v）ポリエチレンイミン水溶液（pH8.0）を、
最終濃度0.5％になるまでステップ１からの上清に撹拌
しながら加えた（ポリエチレンイミン、サーバ（Serv
a）、ハイデルベルグ）。それからその混合物をさらに3
0分間撹拌し、その沈殿を、16000×ｇ（30分間）で遠心
して落とす。

ステップ3. 加熱沈殿 ステップ２からの上清を熱水浴（80℃）により、撹拌
しながらスチール製ビーカー中で60℃まで加熱し、再び
氷水中で室温まで冷やす。沈殿した全てのタンパク質
を、遠心により取り除いた（10,000×g,10分,4℃）。

ステップ4. 硫酸アンモニウム沈殿 ステップ３の上清を、固体の硫酸アンモニウムで20％
飽和にし、そして、その沈殿を、遠心して除去した（1
0,000×g,15分,4℃）。さらに、硫酸アンモニウム濃度
を90％まで増加し、その沈殿を、遠心により集めた（1
0,000×g,15分,4℃）。沈殿を少量のMESバッファーに溶
かし（モルホリンエタンスルホネートバッファ、50mM,p
H6.0,2−モルホリノエタンスルホン酸、（シグマ、デイ
ゼンホヘン（Deisenhofen））、そして、同バッファに
対し、１晩透析を行った。

ステップ5. カチオン交換クロマトグラフィー モノＳカラム（Mono S HR5/5、ファルマシア、スウェ
ーデン）をカラムの５倍容のMESバッファで平衡化し
た。カラムにステップ４からの抽出物をチャージした
後、未結合のタンパク質を、５倍容のMESバッファで洗
い流した。それから本発明に従うhMn−SODを、MESバッ
ファ中、０〜50mM NaClの直線濃度勾配で溶出した（カ
ラム20倍容）。Mn−SOD活性を有する画分を合わせ、Na,
Kリン酸バッファ（5mM,pH7.0）に対して透析した。

本精製ステップで天然のイーストSOD酵素（Mn−SOD,C
uZn−SOD）を分離することができる。図14に溶出曲線を
示した。

ステップ6. ハイドロキシアパタイトにおける吸着クロ
マトグラフィー リン酸バッファ（5mM,pH7.0）で平衡化したハイドロ
キシアパタイトカラム（HAウルトロゲル,IBF,ビレニウ
ブーラ・ガレン（Villeneuve−la−Garenne）、フラン
ス）に、ステップ５の透析物をチャージし、本発明に従
うhMn−SODを、５〜300mMのNa,Kリン酸塩（pH7.0）の直
線勾配（カラム２倍容）で溶出した。

個々の精製ステップで達成したhMn−SODの純度は、還
元的SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動でモニター
した（図15）。

実施例16. 本発明に従ったhMn−SODの特徴 実施例15で精製した、本発明に従うhMn−SODを、ゲル
パーミエーションHPLC、逆相HPLC、Ｎ末端配列決定、SD
Sゲル電気泳動、本来のゲル電気泳動及びアイソエレク
トリックフォーカシングにより分析し、天然のhMn−SOD
と比較した。

a.ゲルパーミエーションHPLC カラム；ウォーター・プロテインパックI125,2×（7.8
×300mm）,10μｍ粒径、 溶出液;0.5M Na₂SO₄,0.02M NaH₂PO₄,pH7.0,0.04％トウ
イーン20,25％プロピレングリコール、 流速;0.5ml/min 検出;UV吸収,214nm、 天然のhMn−SOD又は本発明に従うhMn−SODは、４個の
標準タンパク質によってキャリブレーションすると、各
々、70,000及び76,000の分子量のSODテトラマーの主ピ
ークを示す。この方法の実験誤差範囲内でこれらの値は
同一のものとみなせる。

b.逆相HPLC カラム；ベイカーボンドWP C₁₈;4.6×250mm,5μｍ粒径,
30nm孔径、 溶出液A;0.1％トリフルオロ酢酸水溶液、 溶出液B;0.1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液、 勾配;2分間,20％B,24分間20〜68％B,10分間68％Ｂ、１
分間68〜20％Ｂ、 流速;1.0ml/min 検出;UV吸収,214nm及び280nm、 天然のhMn−SOD及び本発明に従うhMn−SODの双方と
も、丁度21分（各々20.7及び20.9分）の保持時間を示し
た。

c.N末端配列決定 逆相HPLCで脱塩した本発明に従うhMn−SoDのピーク成
分を配列決定した。配列決定は、プログラム02RPTHを用
いて、アプライド，バイオシステムス社製（モデル470
A）の気相シークエネーターで行った。0.8nMの初期量
で、アミノ酸20までの配列決定が可能である。期待され
た配列（天然のタンパク質及びcDNA）と100％の一致を
みた。ミトコンドリアへの移送のためのリーダー配列
は、完全に分離していた。

d.SDSゲル電気泳動 分離用ゲル;15％アクリルアミド スタッキングゲル;4％アクリルアミド 染色;B,R,オークレー（Oakley）等（アナリティカル，
バイオケミストリー（Analyt,Biochem.）,105巻,361−3
63頁,1980年）に従った銀染色）。

ゲル測定;0.75mm（８×10cm） 運転条件;60分,150V 実施例に、SDSゲル電気泳動は、U,K,ラムリ（Ｌmml
i）（ネイチャー（Nature）,227巻,680−685頁,1970
年）により初めて報告された方法に従って行った。hMn
−SODに対する試料の調整においては、試料を、還元剤
としてのDTTと混合し、煮沸した。hMn−SODは、主に、
分子量および25,000のモノマーとして、SDSゲルにバン
ドを生じた。還元の程度により、分子量およそ90,000の
テトラマーも検出された。図15は、銀染色後の15％SDS
ポリアクリルアミドゲルを示している。

e.本来のゲル電気泳動 分離ゲル；デービス（Davis）,B.J.（アニュナルス・イ
ン・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス（An
n,NY,Acad,Sci,）121巻,404〜427頁,1964年）に従がい
7.5％のPAGEスタッキングゲル;2％アクリルアミド＋ス
クロース ゲルの大きさ;0.75mm（８×10cm） 運転条件;75分間,150V（一定） 染色；従来のコマージ・ブルー法及びミスラ（Misr
a）、H,P,フリドビッチ（Fridovich）、I,（アーク、バ
イオケム、バイオフィズ（Arch,Biochem,Biophys,）183
巻,511−515頁,1977年）の方法に従った、Ｏ−ジアミシ
ジンによる活性染色。

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー後に得ら
れた本発明に従ったhMn−SODは、コマージ・ブルー（使
用したhMn−SOD量;0.3μｇ）及びＯ−ジアニシジンによ
る活性染料（使用したhMn−SOD量;75,30又は15ng）を用
いて、検出すると、電気泳動後の位置は同じで均一のバ
ンドを示した。

f.アイソエレクトリック・フォーカシング pH範囲;3.5〜9.5 ゲルプレート;LKB,PAGプレート（1mm×（９×10cm）） 電極溶液;1Mリ酸（アノード） 1M水酸化ナトリウム溶液（カソード） 冷却温度;7℃ サンプル量;4.0又は6.5μｇ 運転条件；プレフォーカシング500Vh フォーカシング3000Vh（全部） 染色；コマージ・ブルー、Ｏ−ジアニシジンによる活性
染色、 pI＝8.15が等電点として測定された。

【図面の簡単な説明】

図1.成熟hMn−SODのアミノ酸22からの、532塩基長のコ
ード領域をもつ、クローンBS8由来のEcoR I断片、51塩
基の３′ut領域及びそのリンカー配列部分。潜在的なＮ
−グリコシル化部位（上線）、単一のTha I及びBamH I
部位（下線）を示した。 図2.Xho I/Nco I断片として、hMn−SOD遺伝子の合成
５′末端を含む、プラスミドHSOD4の構築と戦略図。 図3.プラスミドHSOD2及びHSOD3と、それらから構築した
プラスミドHSOD4の制限地図。 図4.Xho I/EcoR I断片として、hMn−SODに対応する完全
なcDNAを含むプラスミド（HSOD6）の構築。 図5.クローンBS8からの、hMn−SODのTha I/EcoR I断片
の調製。 図6.1500塩基長のBamH I/Xho I断片としてADH Iプロモ
ーターを含む、プラスミドp154/2の構築。 図7.hMn−SODの発現に必要なADH Iプロモーター及びADH
IIターミネーターの単位（336塩基長のXba I/Hind III
断片）を含むプラスミドp150/2の構築。 図8.Xho I/EcoR I部位を介して、hMn−SOD cDNAをさら
に挿入することによる、ADH Iプロモーター又はADHIKプ
ロモーター及びADH IIターミネーターを含む最終的プラ
スミド（pKH1及びpKH2）の調製。pKH2がADH Iプロモー
ターの代りにADHIKプロモーターを含むこと以外、プラ
スミドpKH2はpKH1に対応している。 図9.短縮化した、およそ400塩基長のADH Iプロモーター
（ADHIK）を含む発現カセットHSOD7の構築。本来の長さ
のADH Iプロモーターを含む構築は、pKH1から出発して
同様に行った。 図10.発現に適した、イーストのMn−SOD変異株を調製す
るために、Mn−SOD遺伝子に対し、種々の配向で（SODY
7、SODY8）、マーカーとして、イーストのMn−SOD遺伝
子内にURA3遺伝子を置いた、プラスミドの構築。対応す
るイースト株（DBY747）における遺伝子のトランスプレ
ースメントをSoDY7及びSODY8で行った。 図11.イーストWS30−5g株におけるプラスミドpWS490A及
びpWS491Aを介してのhMn−SODの発現の、ゲル電気泳動
による検出。トラック1;WS30−5g/pWS490A1、トラック
2;WS30−5g/pWS490A2、トラック3;WS30−5g/pWS491A1、
トラック4;WS30−5g/pWS491A2、トラック5;WS21−１（S
OD1）、イーストのMn−SODを含む、トラック6;WS30−5
g、トラック７〜10;肝臓由来のhMn−SOD（0.3μｇトラ
ック８、1.2μｇトラック９、3.0μｇトラック10）。プ
ラスミド名の後の数字１及び２は同じプラスミドでの異
ったトランスフォーマントを示してしる。 図12.ポリアクリルアミドゲル中でのタンパク質の分離
と、それに続く、従来法でのＯ−ジアニシジンを用いた
染色による、発現プラスミドpEO24−AB、pEO25−AC及び
pEO26−ACを含むイースト抽出物中のMn−SOD活性の分
析、ａ＝WS30−5g、ｂ＝WS30−5g/pEO24−AB、ｃ＝WS30
−5g/pEO25−AC、ｄ＝WS30−5g/pEO26−AD、ｅ＝マーカ
ー10.15μｇヒト肝臓Mn−SOD）。 図13.タンパク質のゲル電気泳動による分離と、それに
続く、従来法でのＯ−ジアニシジンでの染色による、６
個の異なるイーストのトランスフォーマントのミトコン
ドリア又は細胞質内の組換えヒトMn−SOD活性の分析。
（CP−ExTr＝細胞質抽出物、MC−ExTr＝ミトコンドリア
抽出物） 図14.（NH₄）₂SO₄沈殿（実施例15,ステップ４）後の、
本発明に従うhMn−SODの、モノＳカチオン交換カラム
（ファルマシア）を用いたククロマトグラフィーの溶出
曲線（実施例15,ステップ５）。 図15.種々の精製段階後の、hMn−SODプローブのSDSポリ
アクリルアミドゲル（15％銀染色） １＝４μのマーカー（LMW−ファルマシア）1:50 ２＝10μｇの粗抽出物 ３＝硫安沈殿後の10μｇ ４＝モノＳクロマトグラフィー後の９μｇ ５＝ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー後の1.
5μｇ ６＝ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー後の５
μｇ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 Ｐ３７４４０３８．１ (32)優先日 1987年12月24日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） 前置審査 (72)発明者 エーリンボルク オシュテルマン オーストリア国 アー1140 ウィーン マウエルバッハシュトラーセ 56―６ (72)発明者 アンドレアス ツェッフェル オーストリア国 アー3040 ノイレング バッハ シューベルトシュトラーセ 100 (72)発明者 エーデルトラウト クリューシュテック オーストリア国 アー1020 ウィーン オーベル ドナウシュトラーセ 37―８ (72)発明者 イングリート マウレル フォーギュ オーストリア国 アー1238 ウィーン リンダウエルガッセ 35 (72)発明者 マリア ヨゼファ ヴイッチェ カシュ タノン オーストリア国 アー1130 ウィーン コシュテノーブルガッセ ２―３―８ (72)発明者 クリスチャン シュトラトヴァ オーストリア国 アー1010 ウィーン シェリングガッセ ３―９ (72)発明者 ルドルフ ハウプトマン オーストリア国 アー2438 エブライク スドルフ デーラッハシュトラーセ 22 (56)参考文献 特開 昭62−289187（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，259 Ｐ. 12595−12601（1984) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/53 C12N 9/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (25)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトのマンガンスーパーオキシドジスムタ
   ーゼ（hMn−SOD）の酵素的、生化学的及び免疫学的性質
   を有する酵素の遺伝的情報の全てをコードするDNAであ
   って、下記式I a又は式I bで表わされるDNA。
2. 【請求項２】ミトコンドリアに輸送することができる未
   成熟hMn−SOD酵素であって、かつhMn−SODの酵素的、生
   化学的及び免疫学的性質を有する、活性のある成熟酵素
   を生じるように正しくプロセシングされる未成熟hMn−S
   OD酵素をコードするDNAであって、下記式I a又は式I b
   を含むDNA。
3. 【請求項３】hMn−SOD及びアミノ末端のリーダー又はシ
   グナル配列の遺伝情報から成り立っていることを特徴と
   する請求項２記載のDNA。
4. 【請求項４】hMn−SODの遺伝情報が、ミトコンドリアの
   リーダー又はシグナル配列の直接後についていることを
   特徴とする請求項３記載のDNA。
5. 【請求項５】ミトコンドリアのリーダー又はシグナル配
   列がイースト由来のものであることを特徴とする請求項
   ４記載のDNA。
6. 【請求項６】構成が、翻訳開始シグナル（ATG）、ミト
   コンドリアのリーダー又はシグナル配列、hMn−SODのDN
   A及び少なくとも１つの終止コドンの順序に対応してい
   ることを特徴とする請求項２〜請求項５記載のDNA。
7. 【請求項７】明細書に記載の式I a、I b、II、III a、I
   II b、V a、V b、VI a、VI b、VII a、VII b、VIII、I
   X、Ｘ、XIに従うヌクレオチド配列に対応することを特
   徴とする請求項２〜請求項６のいずれか１項記載のDN
   A。
8. 【請求項８】請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の
   DNAを含むことを特徴とする、少なくとも１つの選択マ
   ーカー及び／又は複製開始点の外で、他の基本的遺伝子
   領域の外で、できるなら１つの選択マーカーの内に、少
   なくとも１つ制限酵素の認識部位を有する複製ベクタ
   ー。
9. 【請求項９】ウイルス起源のものであることを特徴とす
   る請求項８記載の複製ベクター。
10. 【請求項１０】プラスミド起源であることを特徴とする
    請求項８記載の複製ベクター。
11. 【請求項１１】請求項１〜請求項７のいずれか１項記載
    のDNAの１つを含むプラスミドで、それらプラスミドが
    上記DNAを含む発現カセットをもち、それらが安定した
    形で原核性または真核性宿主にトランスホームでき、そ
    れら宿主細胞中で複製可能で、かつ、その中に含まれる
    hMn−SODの遺伝情報が正しく転写及び翻訳されることを
    特徴とするプラスミド。
12. 【請求項１２】プラスミドが、YEp13（寄託番号ATCC371
    15号）、pEAS102又はYIp5（寄託番号ATCC37061号）であ
    ることを特徴とする請求項11記載のプラスミド。
13. 【請求項１３】pUCであることを特徴とする請求項11記
    載のプラスミド。
14. 【請求項１４】読み取りの方向に正しく配列した、プロ
    モーター要素、開始コドン、ミトコンドリアのリーダー
    又はシグナル配列、hMn−SODの構造遺伝子、終止コド
    ン、ターミネーターをもつ発現カセットが存在すること
    を特徴とする請求項11〜請求項13記載のいずれか１項記
    載のプラスミド。
15. 【請求項１５】プラスミド中に含まれる発現カセットの
    プロモーターが、完全な、約1500塩基対の長さのADHIプ
    ロモーターもしくは、短縮した、約400塩基対の長さのA
    DHIKプロモーターであり、かつその発現カセット中のタ
    ーミネーターがADHIIプロモーターであることを特徴と
    する請求項14記載のプラスミド。
16. 【請求項１６】下記式I a又は式I bを含む、hMn−SODを
    コードする遺伝情報を含むトランスフォームした酵母。
17. 【請求項１７】請求項８〜請求項10のいずれか１項記載
    の複製ベクター、又は請求項11〜請求項15のいずれか１
    項記載のプラスミドを含み、これらを複製及び発現し、
    その合成したhMn−SODを宿主自身のミトコンドリアに輸
    送し、かつそれにプロセシングを行い、それを細胞内に
    蓄積することを特徴とする請求項16記載のトランスホー
    ムした酵母。
18. 【請求項１８】（ａ）mRNAをヒトの組織から単離し、そ
    して、そのポリ（Ａ）⁺RNAを調製する、 （ｂ）このポリ（Ａ）⁺RNAから二本鎖cDNAを合成し、そ
    れからcDNA遺伝子バンクを構築する、 （ｃ）上記cDNAバンクからの、hMn−SODをコードする完
    全な、又は部分的配列のDNAを同定し、hMn−SODのアミ
    ノ酸由来のDNAプローブに対応するプローブにより単離
    する、 （ｄ）場合によっては、このDNAを、開始又は終止コド
    ンに至るまで完全なものにする、 （ｅ）ミトコンドリアのリーダー又はシグナルDNAを、h
    Mn−SOD遺伝子の開始コドン（ATG）の直後及びhMn−SOD
    をコードする第１コドン（Lys）の直前に位置させる、 （ｆ）リーダー又はシグナルペプチドをもつhMn−SODを
    コードするこの完全なDNAをもつ、プロモーター、開始
    シグナル、リーダー又はシグナル配列をもつhMn−SOD遺
    伝子、終止コドン、ターミネーターからなる、宿主酵母
    細胞に依存する、適当な発現カセットを構築する、 （ｇ）この発現カセットを、酵母細胞に適した発現プラ
    スミドに組み込む、 （ｈ）リーダー又はシグナル配列をもつhMn−SOD遺伝子
    を含むこの発現プラスミドを、酵母細胞をトランスホー
    ムするのに用いる、 （ｉ）このトランスホームした酵母細胞により合成さ
    れ、そして正しくプロセシングされたhMn−SODをミトコ
    ンドリアから抽出し、そして精製する、 以上の（ａ）〜（ｉ）の工程を採ることを特徴とする下
    記式IV a又はIV bに従うアミノ酸配列を含むポリペプチ
    ドからなるhMn−SODの調製方法。
19. 【請求項１９】テトラマー形態でhMn−SODを製造する請
    求項18記載の方法。
20. 【請求項２０】用いるDNAが請求項１〜請求項７のいず
    れか１項記載のDNAであることを特徴とする請求項18記
    載の方法。
21. 【請求項２１】用いるベクター及びプラスミドが請求項
    ８〜請求項10のいずれか１項記載のベクター及び請求項
    11〜請求項15のいずれか１項記載のプラスミドであるこ
    とを特徴とする請求項18記載の方法。
22. 【請求項２２】用いる宿主細胞が請求項16又は17記載の
    宿主細胞であることを特徴とする請求項18記載の方法。
23. 【請求項２３】hMn−SOD標準試料の酵素的、生化学的及
    び免疫学的性質を有する、正しくプロセッシングを受け
    たhMn−SODが本方法により直接調製できることを特徴と
    する請求項18〜請求項22のいずれか１項記載の方法。
24. 【請求項２４】請求項18記載の式IV a又は式IV bのアミ
    ノ酸配列を含むポリペプチドであって、hMn−SODの酵素
    的、生化学的及び免疫学的性質をもつポリペプチド。
25. 【請求項２５】請求項24記載のポリペプチドからなるhM
    n−SODをコードするクローン遺伝子を含有するイースト
    発現ベクターであって、hMn−SODをテトラマー形態で発
    現することができるイースト発現ベクター。