HU212920B - Process for the preparation of human superoxide dismotase - Google Patents

Process for the preparation of human superoxide dismotase Download PDF

Info

Publication number
HU212920B
HU212920B HU881204A HU120488A HU212920B HU 212920 B HU212920 B HU 212920B HU 881204 A HU881204 A HU 881204A HU 120488 A HU120488 A HU 120488A HU 212920 B HU212920 B HU 212920B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
priority
sod
dna
hmn
march
Prior art date
Application number
HU881204A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
HUT46739A (en
Inventor
Rudolf Hauptmann
Konrad Heckl
Edeltraud Krystek
Ingrid Maurer-Fogy
Elinborg Ostermann
Walter Spevak
Christian Stratowa
Maria Josefa Wiche-Castanon
Andreas Zoephel
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19873708306 external-priority patent/DE3708306A1/de
Priority claimed from DE19873717695 external-priority patent/DE3717695A1/de
Priority claimed from DE19873722884 external-priority patent/DE3722884A1/de
Priority claimed from DE19873744038 external-priority patent/DE3744038A1/de
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of HUT46739A publication Critical patent/HUT46739A/hu
Publication of HU212920B publication Critical patent/HU212920B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/07—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a mitochondrial localisation signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Inorganic Compounds Of Heavy Metals (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)

Description

A jelen találmány tárgya géntechnológiai eljárás humán Mn-szuperoxid diszmutáz (hMn-SOD) előállítására. A találmány tárgyát képezik azok az eljárások is, amelyek olyan DNS szekvenciák, amelyek ezt az enzimet kódolják, továbbá az ezen DNS szekvenciákat tartalmazó megfelelő vektorok és olyan gazdasejtek előállítására szolgálnak, amelyek ezeket a DNS szekvenciákat kifejezni képesek A leírás ezenkívül az enzim alkalmazására vonatkozó javaslatokat is tartalmazza.
Ismeretes, hogy a biológiai eredetű rendszerekben végbemenő különböző biokémiai folyamatok - például a légzőkör redox-folyamatai, a citoplazmában működő oxidációs folyamatok - következtében állandóan képződnek O2”-gyökök, amelyek erős sejtmérgek, s ezért a szövetek pusztulásához vezethetnek. Kóros állapotokban, például reumás megbetegedések esetén szóba kerülhet, hogy a kollagén és a szinoviális folyadék elfajulását ezek a gyökök okozzák [C. Pasquier és munkatársai, Inflammation, 8, 27-32 (1984)]. Az eukarióta sejtek kétféle szuperoxid-diszmutázt tartalmaznak, ezek közül az egyik főként a sejtfolyadékban (Cu/Zn-SOD), a másik főként a mitokondriumokban (Mn-SOD) fordul elő. Az találták, hogy a máj mitokondriumokban az Mn-enzim a mátrixban - beleértve a belső membránt helyezkedik el, jóllehet a májsejtek citoplazmájában is kimutatták az Mn-SOD jelenlétét [J. M. McCord és munkatársai közlése a „Superoxide and Superoxide Dismutases” c. kiadványban, szerk.: A. M. Michelson,
J. M. McCord, I. Fridovich, kiadó; Acedemic Press, N. Y, 129-138. old. (1977)].
A prokariótákban az Mn-SOD mellett még egy Fe-SOD is létezik. Ez utóbbit algákban és protozoákban (véglényekben), valamint néhány növény-fajban is kimutatták [S. M. Bridges, M. L. Salin, Plánt Physiol., 68,275-278 (1981)]. Ezek a nagyhatású enzimek az
O2 _+O2~+2H+ —> H2O2+O2 folyamatot katalizálják, s a szuperoxid gyökök ezen diszmutációjával megakadályozzák a gyökök feldúsulását, s ezáltal a gyökök sejtkárosító hatását A máj endoplazmatikus retikuluma mellett, az O2~ keletkezése egyik legfontosabb helyének, az állati sejtekben a mitokondriális membránok tekinthetők, így nem csoda, hogy a mitokondriumoknak saját speciális SÓD (MnSOD) áll rendelkezésére.
Ezideig megtörtént egy prokarióta Mn-SOD (E. coli) strukturális génjének a klónozása és lokalizálták a kromoszomális sodA gént is [D. Touati, J. Bact., 155, 1078-1087 (1983)].
Sikerült felderíteni egy élesztő mitokondriális MnSOD 699 bp hosszú nukleotid szekvenciáját és ebből a prekurzor, valamint az érett protein primer szerkezetét levezetni. A prekurzor és az érett protein molekulasúlya 26,123 Da, illetve 23,059 Da volt [C. A. M. Marres és munkatársai, Eur. J. Biochem., 147, 143-161 (1985)]. Tehát az Mn- és a Cu/Zn-SOD (mólsúly: 14,893, EP-A 138 111) molekulasúlya jelentősen különbözik.
Az emberi májból származó Mn-SOD teljes aminosav szekvenciáját D. Bárrá közölte, e szerint a hMnSOD 196 aminosavból áll [D. Bárrá és munkatársai, J.
Bioi. Chem., 259, 12 595-12 601 (1984)]. A vörös vérsejtekből származó humán Cu/Zn-SOD ezzel szemben 153 aminosavból áll [J. R. Jabusch és munkatársai, Biochemistry, 19, 2310-2316 (1980)] és szekvenciája nem homológ és hMn-SOD szekvenciájával [D. Bárra és munkatársai: lásd fent).
Bizonyos gyulladásos folyamatok elleni védőfunkciót tulajdonítanak általában a szuperoxid diszmutáznak. A rheumatoid arthritis kifejlődésénél különleges jelentőséget tulajdonítanak az Mn-SOD hiánynak (C. Pasqueir és munkatársai: lásd fent). Úgyszintén feltételezik, hogy a SÓD védőhatást fejt ki az alkohol indukálta májkárosodásokkal szemben [B. C. De. Villanó és munkatársai, Science, 207, 991-993 (1980)].
A humán-SOD klónozását és kifejezését illetően tudjuk, hogy ez csak az emberi már eredetű humán Cu/Zn-SOD-nál történt meg (EP-A 138 111).
A szuperoxid-diszmutázok - különösen a hMnSOD - előbb említett fontos tulajdonságai alapján várható, hogy igény merül fel az enzim terápiás és/vagy diagnosztikus alkalmazására. Előnyös lenne, ha eree a célra homogén formában és kielégítő mennyiségben fajazonos, azaz humán Mn-SOD állna rendelkezésre. Ebből következik az az elképzelésünk és célunk, hogy például a terápiás alkalmazás után várható immunológiai reakciókat csökkentsük vagy meggátoljuk.
Állati vagy emberi eredetű homogén proteineknek nagy mennyiségben való előállítása akkor vált először lehetővé, amikor olyan technológiákat fejlesztettek ki, amelyekkel idegen DNS és vektor-DNS rekombinációja valósult meg, s amikor sikerült rekombináns DNS-t mikroorganizmusokban stabilan fenntartani és kifejezni. Ebben az eljárásban egy más célt kell elérjünk, mégpedig, hogy az így előállított enzim — a hMn-SOD - az autentikus, természetes hMn-SOD jellemző biológiai hatás-spektrumát fejtse ki.
Ennélfogva a jelen találmányban az a feladatunk, hogy az enzimet kódoló DNS szekvenciát géntechnológiai eljárások segítségével elsőként megtaláljuk, azaz megállapítsuk és elsőként bemutassuk, hogy milyen módszerrel lehet ezt a szekvenciát előállítani.
A találmány szerint ezt a feladatot úgy oldjuk meg, hogy egy placentáris eredetű, humán sejtekből álló cDNS génbankot szintetikus eljárással előállított DNSszonda-molekulákkal átvizsgálunk és így a hMn-SODot kódoló gént megkapjuk és ezekből a sejtekből ismert módszerekkel izoláljuk azokat az mRNS-eket, amelyek a kívánt enzimet előállítják. Kiindulási anyagok gyanánt különböző, például metabolikusan aktív mirigyszövetek, ilyen például a máj vagy a placenta alkalmasak. Az izolált mRNS segítségével, ismert módszerek szerint, reverz transzkriptázzal megindított szintézissel állítjuk elő a cDNS-t amelyet ezután alkalmas vektorba építünk be és szaporítással egy teljes cDNS-génbankot hozunk létre. A génbankot ezután egy meghatározott radioaktív-jelzett DNS szondával vagy különböző ilyen szondák keverékével vizsgáljuk át. Figyelembevéve a genetikai kód degenerációját, előnyös, ha meghatározott DNS szondák keverékeit használjuk, amelyek egy-ugyanazon aminosav számára minden lehet2
HU 212 920 Β séges nukleotid variációt képviselnek, vagyis, hogy ezeket úgy választjuk ki, hogy egy keverékben a szintetizálandó DNS-szondák száma a lehető legkisebb és a keresett hMn-SOD DNS szekvenciához való homológiájuk a lehető legnagyobb legyen.
A DNS szondák szintetizálásánál a kiválasztás egy további kritériuma az, hogy ezek komplementerek legyenek legalább két független szakasszal, például a feltételezett gén-szekvencia 3'- és 5'-végéhez közeli szakaszokkal. Ilyen módon legalább két különböző hibridizálással olyan kiónokat azonosíthatunk, amelyek például mindkét független DNS-szondával pozitív jeleket adnak. Ezeket a kiónokat előnyösen használhatjuk fel a hMn-SOD gén izolálására, mivel ezektől elvárható, hogy a hMn-SOD gén egy lényeges részét vagy a teljes hMn-SOD gént tartalmazzák.
Azokat a speciális DNs-szekvenciákat, amelyet a találmány szerinti DNS-szondákhoz használunk, a májszövetekből származó humán mN-SOD aminosav szekvenciáját illetően D. Bárrá és munkatársai által közöltek alapján [D. Bárrá és munkatársai: Oxy Radicals and their Scavenger Systems, 1. kötet, 336-339 old., (1983)] állapítottuk meg. Különösen előnyös, ha a feltételezett hMnSOD DNS szekvenciából két olyan régiót használunk, amelyek legalább öt aminosav csoportot, előnyösen nyolc aminosav-csoportot kódolnak, azaz hasznos, ha a DNS-szonda hossza legalább 14, előnyösen 23 bázisból áll, de különösen előnyös, ha az egyik DNS-szonda azon kikövetkeztetett hMn-SOD DNS szekvenciával komplementer, melynek genetikus információja a 39—46 aminosav csoportokra vonatkozik, és ha egy másik DNS-szonda azon DNS szakasszal komplementer, amely az ismert aminosav szekvencia 200-207 aminosav csoportjait kódolja. Természetesen olyan DNS szekvenciák is használhatók szondák gyanánt, amelyek más Mn-szuperoxiddiszmutázokból származtathatók.
Egy ilyen DNS-szonda segítségével olyan pozitív kiónokat kaphatunk amelyekből az alábbi la képletű cDNS szekvencia izolálható és amely a hMn-SOD nagy részét kódoló egy szakaszt tartalmazza.
la képlet
G ATC ATG CAG CTG CAC CAC AGC AAG CAC CAC GCG GCC TAC
GTG AAC AAC CTG AAC GTC ACC GAG GAG AAG TAC CAG GAG
GCG TTG GCC AAG GGA GAT GTT ACA GCC CAG ATA GCT CTT
CAG CCT GCA CTG AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT
CAT AGC ATT TTC TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT
GGA GAA CCC AAA GGG GAG TTG CTG GAA GCC ATC AAA CGT
GAC TTT GGT TCC TTT GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG
GCT GCA TCT GTT GGT GTC CAA GGC TCA GGT TGG GGT TGG
CTT GGT TTC AAT AAG GAA CGG GGA CAC TTA CAA ATT GCT
GCT TGT CCA AAT CAG GAT CCA CTG CAA CGA ACA ACA GGC
CTT ATT CCA CTG CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT
TAC TAC CTT CAG TAT AAA AAT GTC AGG CCT GAT TAT CTA
AAA GCT ATT TGG AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT
GAA AGA TAC ATG GCT TGC AAA AAG TAA
Meglepő módon azt találtuk, hogy a talált cDNS egy olyan aminosav szekvenciát kódol, amely a publikált aminosav szekvenciától [D. Bárrá és munkatársai, J. Bioi. Chem., 259, 12 595-12 601 (1984)], néhány csoportot és a hosszát tekintve különbözik. Ebben a szekvenciában a különbségek a „Barra-szekvenciához” képest a 42, 88, 109 és 131-es aminosav pozíciókban vannak (ezeken a helyeken Gin helyett mind Glu áll) és két plusz aminosav, a Gly és Trp található a 123 és 124 pozíció között, s így a találmány szerinti DNS szekvencia egy 198 aminosavból álló hMn-SOD-nak felel meg.
Az is teljesen váratlan volt, hogy egy másik olyan hMn-SOD-ot kódoló szekvenciát tudtunk izolálni, amely a 29-es pozícióban egy aminosav-szubsztitúciót kódol (Glu-kodon a Lys kodon helyett) és így a „Barraszekvenciához” és az la képlethez további különbség jelent meg ezen a ponton, az alábbi lb képlet szerint:
lb képlet
CAC CAC AGC CAG CAC CAC GCG GCC TAC GTG AAC AAC CTG AAC
GTC ACC GAG GAG AAG TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG GGA GAT
GTT ACA GCC CAG ATA GCT CTT CAG CCT GCA CTG AAG TTC AAT
GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT AGC ATT TTC TGG ACA AAC CTC
AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC AAA GGG GAG TTG CTG GAA
GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC TTT GAC AAG TTT AAG GAG
AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT GGT GTC CAA GGC TCA GGT TGG
GGT TGG CTT GGT TTC AAT AAG GAA CGG GGA CAC TTA CAA ATT
GCT GCT TGT CCA AAT CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA ACA GGC
CTT ATT CCA CTG CTG GGG AAT GAT GTG TGG GAG CAC GCT TAC
TAC CTT CAG TAT AAA AAT GTC AGG CCT GAT TAT CTA AAA GCT
HU 212 920 Β
ATT TGG AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG GCT TGC AAA AAG TAA
Ha abból indulunk ki, hogy a Barra-féle szekvencia-analízis helyes volt, akkor a találmány szerinti nuk- 5 leotid-, illetve aminosav-szekvenciák alapján annak lehetősége merül fel itt először és meglepően, hogy különböző géneknek vagy ezek alléi megjelenési formáinak, azaz a hMn-SOD izoenzimeknek a lehetséges létezése áll fenn.
Minthogy olyan cDNS-t hordozó klónokot is kaphatunk, amelyekben a teljes hMn-SOD génhez szükséges végszakasz hiányzik, a jelen találmánynak az a további feladata, hogy elkészítse a hMn-SOD-ot meghatározó teljes gént is.
Ezt a feladatot különböző ismert stratégiák szerint oldhatjuk meg. Például: magát a kapott szekvenciát DNS-szondaként használhatjuk fel és ezzel újra átvizsgálhatjuk a cDNS-bankot, hogy egy teljes gént találjunk, illetve találjunk egy hiányzó végszakasszal rendelkező cDNS-t, vagy a kapott DNs szekvenciát mint hibridizációs szondát használjuk fel egy genom-bank10 nál, hogy a teljes hMn-SOD gén azonosítása után azt izolálhassuk.
De élhetünk azzal a lehetőséggel, hogy olyan oligonukleotidokat szintetizálunk, amelyeknek a nukleotid szekvenciája a hMn-SOD hiányzó végének felel meg és ennek segítségével, megfelelő linker-ligálással előállítsuk a hMn-SOD-ot meghatározó teljes cDNS-t. Ennek a módszernek az az előnye, hogy például egy olyan hMn-SOD-ot kódoló DNS-t kaphatunk, amelynek 5' vége rögtön a start-kodonnal (ATG) kezdődik.
E feladat megoldására, illetve például a 22. vagy 26. aminosavtól kezdődően kódoló, találmány szerinti cDNSek teljessé tételére különösen alkalmasnak bizonyul a Π képlet szerinti DNS szekvencia, amely az ATG 5'-start kodonnal kezdődik és a 31-es aminosavat [His, ahol AAG (Lys) = 1] meghatározó kodonnal végződik, alapul véve az ismert kodon-preferenciákat, mint ahogy ez például az élesztőnél érvényesül [P. M. Sharp és munkatársai, Nucl. AcidsRes., 14, (13), 5125-5143 (1986)].
II. képlet
ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG CCA TAC GAC TAC CGT GCT
TAC TTC GTG AGA AAC GGT CTG AAG GGT ATG CTG ATG CCA CGA
CTA GAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA TTG CAC CAC
GAT CTT GGT GTG TAG TTG CGA GTT TAG TAC GTT AAC GTG GTG
TCT AAG CAC CAT G
AGA TTC GTG GTA C
A hMn-SOD gén teljessé tételére vagy a teljes gén in vitro szintéziséhez fel lehet használni más ismert szinonima kodonokat is, olyanokat, amelyek megkönnyítik baktériumokban, például E. coliban az optimális kodon-antikodon kölcsönhatást, és· ott a transzláció hatékonyságát megnövelik [H. Grosjean, W. Fiers, Gene, 18, 199-209 (1982); T. Ikemura, J. Mól. Bioi, 151, 389-409 (1981)] vagy pedig olyan kodonokat használhatunk, amelyek az emlős állatok sejtjeiben lévő eredeti körülményeknek megfelelnek [R. Grantham és munkatársai, Nucl. Acids. Resl, 9,43-47 (1981)]. Az utóbbiakat előnyösen fel lehet használni emlős állatok sejtjeinek transzformálásához, majd az expresszióhoz.
Elvileg lehetséges a metionin csoportot, amelyet az ATG start-kodon kódol és amely az érett hMn-SOD ennek első aminosava a lizin - előtt helyezkedik el, ismert módszerekkel, például CNBr-mal vagy CNC1dal, lehasítani. Minthogy azonban az érett hMn-SOD enzimben további belső metionin csoportok fordulhatnak elő - például a 23-as vagy 192-es pozíciókban egy ilyen eljárás keresztülvihetetlen és így ebben az esetben a járulékos N-teiminális metionin csoport megmarad, anélkül azonban, hogy befolyásolná a hMnSOD biológiai aktivitását.
Egyébként enzimatikus hasítások is számításba jöhetnek, amikor is ismert módon alkalmas szintetikus linkereket használhatunk, minthogy várható, hogy a vektorban, amely a hMn-SOD cDNS-t tartalmazza, a kívánt pozíciókban megfelelő, speciális aminosavakat meghatározó kodonok találhatók. Például az Arg vagy a Lys csoportok tripszinnel hasíthatók, azaz általában olyan kodonokat alkalmazunk, amelyek proteáz-érzékeny aminosavakat kódolnak. Ezeket vagy a start-kodon elé vagy mögé lehet helyezni, hogy a kódoló szakaszon belül lehet elhelyezni.
A jelen találmány szerinti kiegészítő feladatunk az, hogy elsőként géntechnológiai eljárások segítségével a hMn-SOD kódoló szekvenciát megfelelő gazdasejtben kifejezésre juttassuk, a homogén hMn-SOD enzimet ilyen eljárással elsőként előállítsuk, izoláljuk és tiszta formában elkészítsük, valamint az ehhez szükséges eljárási módokat elsőként leltjük.
A találmány szerint ezt a feladatot úgy oldjuk meg, hogy például a lila vagy Illb képlet szerinti hMnSOD-ot kódoló DNS szekvenciákat.
Illa képlet
5’ ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG CCA TAC GAC TAC GGT GCT CTA GAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA TTG
HU 212 920 Β
CAC CAC TCT AAG CAC CAC GCG GCC TAC GTG AAC AAC CTG
AAC GTC ACC GAG GAG AAG TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG
GGA GAT GTT ACA GCC CAG ATA GCT CTT CAG CCT GCA CTG
AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT AGC ATT TTC
TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC AAA
GGG GAG TTG CTG GAA GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC
TTT GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT
GGT GTC CAA GGC TCA GGT TGG GGT TGG CTT GGT TTC AAT
AAG GAA CGG GGA CAC TTA CAA ATT GCT GCT TGT CCA AAT
CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA ACA GGC CTT ATT CCA CTG
CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT TAC TAC CTT CAG
TAT AAA AAT GTC AGG CCT GAT TAT CTA AAA GCT ATT TGG
AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG
GCT TGC AAA AAG TAA
IHb képlet
ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG CCA TAC GAC TAC GGT
GCT CTA GAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA TTG
CAC CAC TCT CAG CAC CAC GCG GCC TAC GTG AAC AAC CTG
AAC GTC ACC GAG GAG AAG TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG
GGA GAT GTT ACA GCC CAG ATA GCT CTT CAG CCT GCA CTG
AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT AGC ATT TTC
TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC AAA
GGG GAG TTG CTG GAA GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC
TTT GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT
GGT GTC CAA GGC TCA GGT TGG GGT TGG CTT GGT TTC AAT
AAG GAA CGG GGA CAC TTA CAA ATT GCT GCT TGT CCA AAT
CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA ACA GGC CTT ATT CCA CTG
CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT TAC TAC CTT CAG
TAT AAA AAT GTC AAG CCT GAT TAT CTA AAA GCT ATT TGG
AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG
GCT TGC AAA AAG TAA
adott esetben megfelelő szignál vagy szabályozó szekvenciákkal látjuk el, ezeket megfelelő vektorokba építjük be, amelyekkel alkalmas gazdasejteket transzformálunk. A transzformált gazdasejteket tenyésztjük, majd a képződött polipeptideket ismert módszerekkel 35 izoláljuk és tisztítjuk. A kapott polipeptidek az alábbi
IVa és IB képletnek felelnek meg:
IVa képlet
5 10 15
Lys His Ser Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr Gly Alá Leu Glu
20 25 30
Pro His Ile Asn Alá Gin Ile Met Gin Leu His His Ser Lys His
35 40 45
His Alá Alá Tyr Val Asn Asn Leu Asn Val Thr Glu Glu Lys Tyr
50 55 60
Gin Glu Alá Leu Alá Lys Gly Asp Val Thr Alá Gin Ile Alá Leu
65 70 75
Gin Pro Alá Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser
80 85 90
Ile Phe Trp Thr Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro Lys
95 100 105
Gly Glu Leu Leu Glu Alá Ile Lys Arg Asp Phe Gly Ser Phe Asp
110 115 120
Lys Phe Lys Glu Lys Leu Thr Alá Alá ser Val Gly Val Gin Gly
125 130 135
Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Phe Asn Lys Glu Arg Gly His Leu
140 145 150
Gin Ile Alá Alá Cys Pro Asn Gin Asp Pro Leu Gly Gly Thr Thr
HU 212 920 Β
155 160 165
Gly Leu Ile Pro Leu Leu Gly Ile Asp Val Trp Glu His Ala Tyr
170 175 180
Tyr Leu Gin Tyr Lys Asn Val Arg Pro Asp Tyr Leu Lys Ala Ile
185 190 195
Trp Asn Val Ile Asn Trp Glu Asn Val Thr Glu Arg Tyr Met Ala
Cys Lys Lys
IVb képlet
1 5 10 15
Lys His Ser Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala Leu Glu
20 25 30
Pro His Ile Asn Ala Gin Ile Met Gin Leu His His Ser Gin His
35 40 45
His Ala Ala Tyr Val Asn Asn Leu Asn Val Thr Glu Glu Lys Tyr
50 55 60
Gin Glu Ala Leu Ala Lys Gly Asp Val Thr Ala Gin Ile Ala Leu
65 70 75
Gin Pro Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser
80 85 90
Ile Phe Trp Thr Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu Pro Lys
95 100 105
Gly Glu Leu Leu Glu Ala Ile Lys Arg Asp Phe Gly Ser Phe Asp
110 115 120
Lys Phe Lys Glu Lys Leu Thr Ala Ala Ser Val Gly Val Gin Gly
125 130 135
Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Phe Asn Lys Glu Arg Gly His Leu
140 145 150
Gin Ile Ala Ala Cas Pro Asn Gin Asp Pro Leu Gin Gly Thr Thr
155 160 165
Gly Leu Ile Pro Leu Leu Gly Ile Asp Val Trp Glu His Ala Tyr
170 175 180
Tyr Leu Gin Tyr Lys Asn Val Arg Pro Asp Tyr Leu Lys Ala Ile
185 190 195
Trp Asn Val Ile Asn Trp Glu Asn Val Thr Glu Arg Tyr Met Ala
Cys Lys Lys
A Illa és IHb szekvenciák különösen alkalmasak a IVa és IVb képlet szerinti nem glükozilált hMn-SOD előállítására mikroorganizmusokban, főként E. coliban vagy S. cerevisiaeben. A glükoziláció problémáját, például élesztőben azáltal kerülhetjük meg, hogy olyan mutánsokat veszünk igénybe, amelyek a proteinek glükozilálását illetően deficiensek (alg mutánsok), [Például: T. C. Huffaker, P. W. Robbins, Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 7466-7470 (1983)].
Amennyiben szükségesnek vagy célszerűnek látszik például a Illa vagy IHb képlet szerinti teljes hMnSOD génben, az érett hMn-SOD első N-terminális aminosav kodonja elé, illetve közvetlenül az ATG start kodon elé egy vezér-, illetve szignál-szekvenciát kapcsolhatunk. Ezzel azt érhetjük el, hogy a hMn-SOD a gazdasejtből kiszabadul és így a tápoldatból könnyen izolálhatjuk.
Ilyenfajta szignál szekvenciákat már leírtak; ezek egy főként hidrofób proteinrészt kódolnak, amely a transzlációs módosító folyamat következtében a gazdasejtben lebasad [D. B. Davis, P. C: Tai, Natúré, 283,
433-438 (1980); D. Perlman, Η. O. Halvorson, J. Mól. Bioi., 167, 391-409 (1983)]. Ha a hMn-SOD első aminosava elő egy ATG kodont teszünk, egy olyan génterméket kaphatunk, amely a lizin előtt egy N-terminális metionint tartalmaz. Ismeretes, hogy prokariótákból származó szignál szekvenciákat alkalmaznak abból a célból, hogy a proteinek a periplazmába szekretálódjanak és hogy koirekt módon képződjenek (például: B. D. Davis és P. C: Tai, 1980).
A hMn-SOD DNS szekvencia izolálása és klónozása után természetesen lehetséges az ezen szekvencia által kódolt enzim speciális módosítása. Az enzim módosításokat például célzott in vitro mutációkon keresztül, szintetikus oligonukleotidok segítségével lehet elvégezni, ezáltal a hMn-SOD katalitikus tulajdonságait befolyásolhatjuk és így újszerű enzimatikus hatásokat hozhatunk létre. A proteinek ilyenfajta manipulálásának a keresztülviteléhez a szükséges alapvető módszerek lépései ismertek [például G. Winter és munkatársai, Natúré, 299,756758 (1982); Dalbadie-McFarland és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 79,6409-6413 (1982)].
HU 212 920 Β
A hMn-SOD gén klónozásához, azaz a szaporításához és előállításához E. colit használhatunk, előnyösen az E. coli C600 [Nelson és munkatársai, Virology, 108, 338-350 (1981)] vagy JM101 törzset, illetve az ismert sup-genotípusú E. coli törzsek egyikét. A klónozást azonban Gram-pozitív baktériumokban, mint például a
B. subtilisban is elvégezhetjük. Az ilyenfajta rendszerekről bőséges ismertetők állnak rendelkezésre.
A találmány szerinti hMn-SOD gén kifejezéséhez, mint alkalmas gazdák, szóba jöhetnek akár a mikroorganizmusok, akár a többsejtű szervezetek tenyészetei.
Mikroorganizmusok alatt értendők a prokarióták, azaz Gram-negatív vagy Gram-pozitív baktériumok és az eukarióták, ilyenek a véglények (protozoák), algák, gombák, illetve egysejtűek. A Gram-negatív baktériumok közül különösen az Enterobacteriaceae család, például az E. coli, a Gram-pozitívek közül a Bacillaceae család és az apatogén Micrococcaceae család, például a B, subtilis és Staph. camosus, az eukarióták közül az Ascomycetes osztály tagjai, főként az élesztők, például a Sacharomyces cerevisiae az előnybe helyezett gazdák.
Az egysejtű mikroorganizmusok számára igen sok kiindulási vektor áll rendelkezésre, amelyek akár plazmid eredetűek, akár virális eredetűek lehetnek. Ezek a vektorok egyszerű másolatszámú vagy sokmásolatúvektorok (multicopy vector) lehetnek. Azok a vektorok amelyek a találmány szerinti hMn-SOD vagy általában az eukarióta DNS szekvenciák klónozására és expressziójára alkalmasak, sok közleményben és kézikönyvben szerepelnek [például: T. Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; D. M. Glover: DNS Cloning, I., Π. kötet (1985)] és ezek a kereskedelemből beszerezhetők.
Általában az olyan plazmid vektorokat, amelyek rendesen egy replikációs kezdőpontot és a transzkripcióhoz, transzlációhoz és expresszióhoz szabályozó szekvenciákat tartalmaznak, fel lehét használni ezekkel a gazdákkal összekapcsolva. Ezeknek a szekvenciáknak olyan fajból kell származniuk, amelyek a gazdasejtekkel kompatíbilisek. A vektorokban a replikációs hely mellett rendszerint még felismerő szekvenciák is vannak, amelyek lehetővé teszik a transzformált sejtek fenotípus szerinti szelektálását. Aszelekcióegy marker komplementációja,szuppreszsziója vagy inaktivációja alapján történik. Az elsőként említett két folyamatot illetően megjegyezzük, hogy a baktériumoknak és élesztőknek olyan auxotróf mutánsaik vannak, amelyek egy eszenciális anyagcseretermékre nézve deficiensek, vagy a nonszensz mutánsok, amelyekben az illető gén transzlációjakor lánc-szakadás következik be. Különböző szuppresszor gének ismeretesek, ilyenek például a supD, E, F (UAG szuppresszorok), supC, G (UAG vagy UAA szuppresszorok).
A harmadik esetben a vektorok egy rezisztencia gént tartalmaz egy vagy több citotoxikus anyaggal szemben, mint például antibiotikumokkal és nehézfémekkel szemben. Ha ilyen marker génbe egy idegen DNS-t építünk be, a gén inaktiválódik, s így az újonnan keletkezett fenotípust az eredeti fenotípustól meg lehet különböztetni.
Az E. colit például a pBR322-vel transzformálhatjuk. A pBR322 egy E. coli fajból származó plazmid [Bolivár és munkatársai, Gene, 2, 95 (1977)], amely ampicillin- és tetraciklin-rezisztencia gént tartalmaz, s így egyszerű eszközül szolgál a transzformált sejtek azonosítására, amikor is például egy PstI helynek a β-laktamáz génbe való beklónozásával az Apr, Trí fenotípus Aps, Tcr fenotípussá konvertálódik. Más eljárások is alkalmazhatók ehhez hasonlóan, ahol például a lacZ-gén inaktiválása a λ és M13 vektoroknál, valamint különböző plazmidoknál (például pUC, pUR) bír jelentőséggel. A szelekciós rendszerek nagy sokasága régóta ismert és ennek megfelelően bőséges az irodalma.
Ezek mellett a szelekciós markerek mellett olyan vektorokat, főként expressziós vektorokat és szignál szekvenciákat kell biztosítani, amelyek lehetővé teszi a transzkripciók korrekt elindítását és befejezését. A hMn-SOD gén korrekt transzkripciójához ezért ezeknek a vektoroknak egy bakteriális vagy eukarióta transzkripciós-egységet kell tartalmazniuk, amely egy promoterből, a kódoló szakaszból a hMn-SOD génnel együtt és az idecsatlakozó terminátorból áll. Ezek a konzervált prototípus szekvenciák, ilyen például a Prinbow-box, vagy TTG-szekvencia vagy pedig a CAAT-box és TATA-box, a transzkripciós egységek természetének megfelelően tartalmazhatják az ismert terminátor szignálokat (például AATAAA, TATGT), valamint legalább egy stop kodont, s ezeknél a gazdára való tekintettel előnyösen homológ promotereket és terminátorokat alkalmazunk. A képződött mRNS rendszerint egy 3' poli(A)-szekvenciát és/vagy egy 5' capstruktúrát tartalmaz. A hMn-SOD gén transzlációjához egy Shine-Dalgamo szekvenciából (S/D szekvencia) álló riboszomális kötőhelyre és egy ehhez meghatározott távolságban lévő, 3-12 nukleotidból álló iniciációs kodonra, valamint legalább egy stop kodonra van szükség. Az RBS-eket szintetikusan is elő lehet állítani, miáltal a 16S rRNS 3'-végével való homológiát meg lehet növelni [E. Jay és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 10,6319-6329 (1982)].
Főként az eukarióta expressziós rendszerekben (például S. cerevisiae) előnyös, ha a transzlációhoz gazdasejt eredetű szabályozó rendszereket használunk, minthogy az élesztőkben nincsenek a prokariótákkal analóg viszonyok (az S/D szekvencia homológiája a 16S rRNS) végével) és a szignálok, illetve az RBS a transzláció indításához, kissé más módon vannak elrendezve, mint a prokariótáknál [például M. Kozák, Nucl. Acids Rés., 9, 5233-5252 (1981); M. Kozák, J. Mól. Bioi., 156, 807-820 (1982)].
A klónozó-, vagy expressziós vektor előnyösen csak egy restrikciós endonukleáz felismerő helyet tartalmaz, amely a kiindulási vektorban vagy a priori előfordul vagy utólag, megfelelő linker segítségével beépítjük. A linker kémiai úton könnyen szintetizálható vagy a kereskedelemből beszerezhető.
A megfelelő expressziós plazmidok előállításánál gyakran használt élesztő promoterek közé tartoznak az olyan promoterek, amelyek az élesztő-rendszerben a
HU 212 920 Β kifejeződést különösen hatékonyan szabályozzák, mint például a PGK promoter [M. F. Tűit és munkatársai, The EMBO J., 1, 603-608 (1982); R. A. Hitzeman és munkatársai, Science, 219, 620-625 (1983)], a PH05 promoter [A. Hinnen és B. Meyhack, Current Topics in Microbiology and Immunology, 96, 101-117 (1982) R.
A. Kramer és munkatársai, Proc. Natl. Acad, Sci., 81, 367-370 (1984)], GAPDH promoter [M. S. Urdea és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 7461-7465 (1983)], GAL10 promoter [Broach és munkatársai, Experimental Manipulation of Gene Expression, 83-117. old. (1983)], enoláz (ENO)-promoter [M. J. Holland és munkatársai, J. Bioi. Chem., 256, 1385-1395 (1981)], a-faktor promoter [G. A. Bittér és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 5330-5334 (1984); T. Yakota és munkatársai, Miami Winter szimpózium, 17. meeting, Adv. Gene Technoi., 2, 49-52 (1985)] vagy az ADHI promoter [G. Ammerer, Methods in Enzymolgy, 101, 192-201 (1983); R. A. Hitzeman és munkatársai, Natúré, 293, 717-722 (1981)].
Más glükolitikus enzimek promoterei [Kawasaki és Fraenkel, Biochem. Biophys, Rex. Comm., 108, 1107— 1112 (1982)] szintén alkalmasak, ilyenek a hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfo-fruktokináz, glükóz-6foszfát izomeráz, foszfo-glükóz izomeráz és glükokináz. Megfelelő expressziós plazmidok szerkesztésekor ezeket az ezen génekkel asszociált terminátor szekvenciákkal együtt szintén beépíthetjük az expressziós vektorba, a kifejezendő szekvencia 3' végén, hogy a mRNS poliadenilációjáról és terminációjáről gondoskodjunk. Vannak más promoterek, amelyeknek még az az előnyük, hogy transzkripciójuk növekedési feltételekkel szabályozható, ilyenek a következő enzimek promoter szakaszai; alkohol-dehidrogenáz-2, izocitokróm-C, a lebontó enzimek, amelyek a nitrogén anyagcserében vesznek részt, a fent említett glicerinaldehid3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) és azok az enzimek, amelyek a maltóz és galaktóz lebontásáért felelősek. Azokat a promotereket, amelyeket az élesztő mating típusú lókusza szabályoz, például a BARI, MECI, STE2, STE3 és STE5 gének promotereit, hőmérséklettel szabályozható rendszerekben használhatjuk fel, hőmérsékletfüggő sir mutációk alkalmazása révén [Ph. D. Rhine, tézisek, University of Oregon, Eugene, Oregon, USA (1979); Herskowitz és Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, I. rész, 181-209 old. (1981), Cold Spring Harbor Laboratory].
Ezek a mutációk az élesztő nyugvó mating típusú kazettáit befolyásolják és ezáltal indirekt a mating típus-függő promotereket. Általában azonban minden olyan plazmid vektor alkalmas, amely egy élesztőkompatíbilis promotert és originális replikációs és terminációs szekvenciákat tartalmaz.
Abban az esetben, amikor a hMn-SOD kifejeződésének baktériumokban kell megtörténnie, előnyösen olyan promotereket kell alkalmazni, amelyek az mRNS növekvő mértékű szintézisét vonják maguk után és amelyek ezenkívül indukálhatók. Az ismert és használatos promoterek közé tartoznak a következők: a betalaktamáz (penicillináz) és laktóz promoter rendszer [Chang és munkatársai, Natúré, 275,615 (1978); Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977)); Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544 (1979)], ide tartozik az UV5-promoter [A. E. Silverstone és munkatársai), Proc. Natl. Acad. Sci., 66, 773-779 (1970)] és triptofán (trp) promoter rendszer [Goeddel és munkatársai, Nucl. Acids. Rés., 8, 4057 (1980); európai szabadalmi bejelentés, nyilvánosságrahozatali szám: 0 036 779]. Ezenkívül még más mikrobiális promotereket is kifejlesztettek és felhasználtak. A hMn-SOD génszekvencia például a lambda-PL-promoter szabályozása alatt írható át. Ez a promoter arról ismert, hogy egyike a különösen erős, szabályozható promotereknek. A szabályozás egy termolabilis cl represszoron (például a cI857) keresztül történik, s ismertek a szomszédos restrikciós hasítási helyek. Használható ezenkívül az E. coli alkalikus foszfatázának promotere [K. Ohsuye és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 11, 1283— 1294 (1983)] és olyan hibrid promoter is, mint például a tac-promoter [E. Amann és munkatársai, Gene, 25, 167-178 (1983); H. A. De Boer és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 21-25 (1983)]. Az ilyen hasznos vektorokról (lacuv5, lacZ SD, tac), illetve olyan vektorokról, amelyeket fuzionált és nem fuzionált eukarióta proteineknek E. coliban való állítására használunk, T. Maniatis és munkatársai munkájában [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982,412. oldal] olvashatunk. Egy hMn-SOD szekvencia expressziója és transzlációja baktériumokban más olyan szabályozó rendszerek ellenőrzése alatt is végbemehet, amelyek a mikroorganizmus nem transzformált formájával „homológ”-nak számítanak. Felhasználhatók például a következő promoter-operátor rendszerek; arabinóz operátor, kolicin El operátor, galaktóz operátor, alkalikus foszfatáz operátor, trp operátor, xilóz-A operátor és hasonlók vagy ezek részei. A hMn—SOD-nak baktériumokban, például E. coliban vagy élesztőben, például
S. cerevisiae-ban való klónozásához vagy expressziójához jól ismert vektorok állnak rendelkezésre, amelyek közül az elsőnek említett gazda-rendszer szempontjából a következők használhatók előnyösen: pBR plazmidok [F. Bolivár és munkatársai, Gene, 2, 95-113 (1977)], pUC plazmidok [I. Vieira, I. Messing, Gene, 19, 259-268 (1982)] pOB plazmidok [F. Fuller, Gene, 19, 43-54 (1982)], pAT plazmidok [J. D. Windass és munkatársai, Nucl, Acids Rés., 10,6639-6657 (1982)], és pHV plazmidok [S. D. Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 1433-1436 (1977)], lambda vektorok, beleértve a fazmidokat (phasmid) [S. Brenner és munkatársai, Gene, 17, 27-44 (1982)], kozmidok [J. Collins, B. Hohn, Proc. Natl. Acad. Sci., 75,4242-4246 (1979)] és más szakirodalomból ismert vektorok (például T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), főként pedig a pBR- és pUC származékok, például a pBR322 és a pUC18.
Élesztőkben szóba jöhetnek expressziós vektorok gyanánt az integrálódó (YIp), a replikálódó (YRp) és az episzomális (YEp) vektorok [K. Struhl és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 1035-1039 (1979); D. T. Stinchcomb és munkatársai, Nature, 282, 39-43
HU 212 920 Β (1979); C. P. Hollenberg, Current Topics in Microbiology and Immunology, 96, 119-144 (1982)], ezek közül előnyös az YEpl3 [J. R. Broach és munkatársai, Gene, 8, 121-133 (1979)] YIp5 [K. Struhl és munkatársai, lásd fent (1979); ATCC 37 061], valamint a pJDB207 (DSM 3181) vagy pEAS102. A pEAS102 vektort úgy kaphatjuk meg, hogy az YIp5 vektort Petivel részlegesen és BamHI-vel teljesen megemésztjük és az izolált 4,3 kb fragmentumot (az URA3 gént tartalmazza) a pJDB207-ből származó 4,4 kb BamHI/PstI fragmentummal ligáljuk.
A mikroorganizmusokon kívül a többsejtű szervezetek tenyészetei szintén megfelelő gazdák a hMnSOD kifejeződése számára. Elvileg minden ilyen tenyészet felhasználható, akár gerinces, akár gerinctelen állat sejttenyészetéről van szó. A legelőnyösebbek azonban a gerinces állatok sejtjei, ezért az utóbbi években a gerinces állati sejteknek tenyészetben való szaporítása (szövet-tenyészet) rutin módszerré vált [Tissue Culture, Academic Press, Kruse és Patterson (szerkesztők) 1973], Ilyen hasznos gazdasejt vonalak például a következők: VERŐ- és HeLa sejtek, aranyhörcsög petefészek (CHO) sejtek és a W138, BHK, COS-7 és MDCK sejtvonalak. Az ezekhez a sejtekhez való expressziós vektorok rendszerint egy replikációs kezdőpontot, a kifejezendő hMn-SOD előtt elhelyezkedő egy promotert, a szükséges riboszómakötő helyet, RNS splicing-helyet (RNS összetoldó hely), poliadenilációs helyet és transzkripciós terminátor szekvenciákat tartalmaznak.
Emlősállatokból származó sejtek használata esetén az expressziós vektorok szabályozó funkcióit gyakran vírus anyagból biztosítjuk. A szokás szerint használt promoterek például az alábbi vírusokból származnak: Papovavírusokból, ilyenek az polyoma- és papilloma vírusok, valamint a Simian vírus 40 (SV40), Retrovírusokból és a 2-es típusú adenovírusból. Az SV40 korai és későt promotereirőh és felhasználásukról bőséges irodalom áll rendelkezésre. Ezenkívül lehetséges és gyakran ajánlatos olyan promoter- vagy szabályozó szekvenciákat vagy splicing-szignálokat alkalmazni, amelyek a kívánt gén-szekvenciákkal eredetileg össze voltak kapcsolva, feltéve, ha ezek a szabályozó szekvenciák a gazdasejt rendszerrel kompatíbilisek. Ismertek olyan SV40 vektorok, amelyekben egy exogén eukarióta DNS a saját promoter szekvenciájával és splicing-szignáljaival az SV40 késői promotere mellett stabil transzkripciót eredményez.
Replikációs kezdőpontot vagy megfelelő vektor szerkesztése révén kaphatunk úgy, hogy ez a szerkezet egy kívülről származó, például az SV40-ből vagy más virális forrásokból (például Polyoma, Adeno, VSV, PBV stb.) származó startpontot tartalmaz vagy pedig ezt a startpontot a gazdasejt kromoszomális replikációs mechanizmusa szolgáltatja. Amikor a vektor a gazdasejt kromoszómájába integrálódik, ez utóbb említett megoldás legtöbbször megfelelő.
A sejteknek hordozókkal való transzformálását számos eljárással érhetjük el. Például kalcium segítségével, amikor vagy a sejteket mossuk magnézium tartalmú oldatban és a DNS-t adjuk a kalciumot tartalmazó közegben szuszpendált sejtekhez, vagy a sejteket hozzuk össze a DNS és kalcium-foszfát koprecipitátumával. Az ezután következő gén-kifejeződéskor a sejteket olyan táptalajokra visszük át, amelyek a transzformált sejteket szelektálják.
A hMn-SOD sejten belüli termelődése esetén az enzimet úgy különítjük el, hogy miután megfelelően nagy sejtsűrűséget érünk el, a sejteket lecentrifugáljuk, majd enzimatikus vagy mechanikus úton feltárjuk. A találmány szerinti hMn-SOD tisztítását proteinek, illetve enzimek tisztítására kidolgozott, ismert biokémiai eljárásokkal végezzük el, ilyen eljárás például a dialízis, elektroforézis, kicsapás, kromatografálás vagy ezek kombinációi. Ha az enzimet a sejtek szekretálják, analóg protein-tisztítási eljárásokat alkalmazunk arra a célra, hogy a hMn-SOD-ot a tenyészetből tiszta formában izoláljuk.
Az ezekkel a módszerekkel tisztított, találmány szerinti hMn-SOD az eredeti enzimmel azonos biológiai hatás-spektrumot fejt ki in vivő és in vitro.
Ezen aktivitások alatt úgy az immunológiai tulajdonságok (például a természetes hMn-SOD antitestek keresztreakciót adnak a találmány szerinti hMn-SOD biokémiai és enzimatikus jellemzése például S. Markiund [S. Markiund és G. Markiund, Eur. J. Biochem., 47, 469-474 (1974)] szerint történhet, amely szerint a Cu/Zn és Mn tartalmú enzimek között éles különbségek észlelhetők, például KCN hozzáadásakor (gátolja a Cu/Zn SOD-ot, de az Mn-SOD-ot nem) vagy pedig mivel hatásuk pH-függése különbözik [lásd főként M. Ysebaert-Vanneste, W. H. Vanneste, Anal. Biochem., 107, 86-95 (1980)].
A találmány szerinti polipeptid alatt nem kizárólag csak az érett hMn-SOD-ot értjük, amit részletesen leírunk, hanem az enzim mindenfajta módosulatát is. Az ilyen módosítások közé tartozik például, amikor a molekula N- vagy C-terminális végét megrövidítjük vagy amikor aminosavakat más aminosav-csoportra cserélünk úgy, hogy az enzimaktivitás lényegesen ne változzék. A találmány tárgyát nemcsak azok a génszekvenciák képezik, amelyek specifikusan a leírt és példaként felhozott hMn-SOD-ot kódolják, hanem ugyanúgy azok a módosulatok is, amelyeket könnyen és rutinszerűen megkaphatunk mutáció, lebontás, transzpozíció vagy addíció révén. Minden olyan szekvencia, amely a találmány szerinti hMn-SOD-ot kódolja (azaz amelyek a megfelelő és ismert biológiai aktivitás spektrumot fejtik ki) és a bemutatott szekvenciához hasonlítva degenerált, szintén a találmány részét képezi, az ezen a területen dolgozó szakemberek képesek arra, hogy a DNS szekvenciákat, kiváltképpen a kódoló szakaszok DNS szekvenciáit degenerálják. Úgyszintén minden olyan szekvencia, amely az autentikus hMn-SOD aktivitás-spektrumával rendelkező polipeptidet kódolja és amelyek a bemutatott szekvenciákkal (vagy ezek részeivel) szigorúan meghatározott körülmények között hibridizálnak, a találmány tárgyát képezik.
A technika állása határozza meg, hogy milyen meghatározott feltételek mellett hajtunk végre egy hibridizá9
HU 212 920 Β lást (beleértve azt előmosóst, előhibridizálást, hibridizálást és mosást), hogy a szigorúan meghatározott körülményeket elérjük. Egy génbanknál az oligonukleotidok hibridizálásához („gene bank screening”) előnyösen I. M. Wood és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 15821588 (1985)] szerinti körülményeket alkalmazunk. Annak vizsgálatára, hogy egy bizonyos DNS szekvencia vajon valamely találmány szerinti, hMn-SOD-ot kódoló DNS szekvenciával hibridizál-e - akár plakkokkal vagy baktérium telepekkel szembeni in situ hibridizálás segítségével vagy Southem-blotting technikával - a T. Maniatis és munkatársai által részletesen leírt módszereket és körülményeket alkalmazzuk (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, főként a 326-328 és 387-389 oldalak). A háttértől minden élesen elütő jel pozitív hibridizációs szignált jelent.
A fenti, közelebbről megjelölt feladatokat úgy oldjuk meg, hogy emberi szövetből, előnyösen az emberi placenta-szövetből, RNS-t állítunk elő. Míg a szövettenyészet sejtjeit forró fenollal közvetlenül feltárhatjuk, addig a szöveteket az ilyen típusú extrahálásnál először mélyfagyasztott állapotban, előnyösen poralakú vagy darabos szárazjég vagy folyékony nitrogén jelenlétében fel kell aprítani (például Starmix). A fenol miatt az mRNS és az egyéb RNS-ek közt képződött aggregátumokat formamiddal vagy melegítéssel (például 65 ’C-on) újra fel lehet bontani. Az RNS izolálására a Chirgwin [J. M. Chirgwin és munkatársai, Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)] szerinti eljárást helyezzük előnybe. A poli(A)+RNS-t a proteintől és DNS-től megtisztított készítményből célszerűen affinitás kromatográfiával, például poli(U)-Sepharose vagy oligo(dT)-cellulóz segítségével izolálhatjuk, minthogy rendszerint az eukarióta mRNS populációk 3' végükön egy poli(A)-farokkal rendelkeznek [H. Aviv, P. Leder, Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 14091412 (1972); U. Lindberg, T. Persson, Eur. J. Biochem., 31,246-254 (1972)]. Előnyös, ha a poli(A)+RNS izolálását Auflray [C. Auflray,' F. Rougeon, Eur. J. Biochem., 107,303-314 (1980)] módszerével végezzük.
A tisztított mRNS dúsítását úgy érhetjük el, ha a teljes mRNS frakció nagyság szerinti elválasztását elvégezzük, például szacharóz-gradiens centrifugálással. A kívánt mRNS-t például az ismert in vitro proteinbioszintetizáló-rendszerrel (retikulociták, Xenopus laevis petesejtek) mutathatjuk ki.
A tisztított mRNS, vagy a dúsított frakció, templátul szolgál a cDNS első szála szintéziséhez, amely a reverz transzkriptáz és egy primer segítségével megy végbe. Primer gyanánt vagy oligo(dT) vagy szintetikus primer használható, ez utóbbit a hMn-SOD ismert aminosav szekvenciájából származtathatjuk és ezt teszi lehetővé a reverz transzkriptáz reakció ismételt megindítását [M. Uhlen és munkatársai, EMBO Journal, 1, 249-254 (1982)].
A jelen találmány szerint a cDNS első szálának szintézisét oligo(dT)12_18-val, mint primerrel indítottuk, a dNTP-k jelenlétében.
A cDNS második szálának szintetizálásához különféle ismert módszereket alkalmazhatunk, amelyek közül említésre érdemesek a következők: egy komplementer primerrel való indítás [F. Rougeon, B. Mach., J. Bioi. Chem., 252, 2209-2217 (1977)], önindítás a cDNS 3' végén lévő „hajtű” szerkezettel [A. Efstratiadis és munkatársai, Cell, 7, 279 (1976)] vagy egy RNázH révén képződött Okazaki fragmentumhoz hasonló primer alkalmazása [U. Gubler, Β. H. Hoffmann, Gene, 25, 263 (1982)]. A jelen találmányban a T. V. Huynh által leírt módszert [T. V. Huynh és munkatársai, „DNA Cloning” I. kötet, 2. fejezet, 49-78 oldal, szerk.: D. M. Glower (1985)] helyezzük előnybe. A kapott kétszálú cDNS-t ezután egy alkalmas vektorba, leginkább egy lambda vektorba, előnyösen a XgtlO vektorba (T. V. Huynh és munkatársai, 1985) klónozhatjuk, illetve pakolhatjuk. A lambda vektorba való klónozáshoz több ismert módszer áll rendelkezésre, amelyek közül megemlítendő például a dA-dT. illetve dC-dG „homopolymertailing vagy a szintetikus linkerekkel végzett linker-módszer [T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); T. V. Huynh és munkatársai. „DNA Cloning” I. kötet, szerk.: D: M. Glover (1985); C. J. Watson, F. Jackson, ezen kiadvány 3. fejezetében]. A találmány szerinti cDNS klónozása esetében a cDSN-t a XgtlO EcoRI helyére építjük be. A találmány szerinti cDNS in vitro bepakolása és klónozása, illetve a cDNS génbank létesítése T. V. Huynh és munkatársai (1985, 49-78. oldal) szerint történt.
A placenta szövetből származó cDNS génbankot reprezentáló fágpopulációval végeztük el a szaporítást és a plakk-tisztítást azáltal, hogy egy megfelelő gazdasejtet, leginkább E. colit, előnyösen E. coli C600 sejteket fertőztünk a lambda fág lírikus szaporodási ciklusának a biztosítása mellett. A cDNS génbankot radioaktív jelzett, szintetikus oligonukleotidokkal - ezek a közölt aminosav szekvencia [D. Bárra és munkatársai: Oxy Radicals and their Scavenger Systems, 1. kötet, 336-339 old. (1983)] alapján levezethetők - vizsgáltuk át, szigorú hibridizációs körülmények mellett. A jelen találmányban a Benton és Davis [W. D. Benton, R. W. Davis, Science, 196,180182 (1977)] -féle in situ hibridizációs eljárást használtuk. Két keveréket helyeztünk előnybe, mindegyik nyolc szintetikus 23-mer oligonukleotidból állt. Az oligonukleotidok képletét Va-val és Vb-vei jelöltük, s ezek kolineárisak a D. Bárra és munkatársai (lásd fent) által publikált aminosav szekvencia 39-46, illetve 200-207 helyzetű aminosavaival és tekintetbe veszik a genetikai kód degenerációját is. E DNS szondák 5' végéről a Gln-t (46-os aminosav), illetve Glu-t (207-es aminosav) meghatározó teljes kodonhoz a mindenkori utolsó bázis, a Wobble bázis hiányzik.
Va képlet
CCC
5'TGITA TT TC TCIGTIACITT T T T
Vb képlet ACA
5' TCIGTIAC TT TCCCA TTIAT GTG
HU 212 920 Β
A, G, C és T a megfelelő nukleotidok jele. I az inozint jelenti.
Az oligonukleotid szondákat ismert kémiai szintetikus eljárásokkal állíthatjuk elő. A jelen találmányhoz egy DNs-szintetizátort (381A modell; Applied Biosystems) alkalmaztunk.
E két DNS szonda minden lehetséges kombinációjának a szintetizálása biztosítja, hogy a nukleotidok közül legalább egy a keresett hMn-SOD gén komplementer egyszálú DNS szakaszával optimálisan pároso- 10 dik. A 23-mer oligonukleotidok két független pooljának használata csökkenti annak lehetőségét, hogy a szondák „fals” pozitívokat választanak ki.
Az önmagában homogén plakkok izolálása után, amelyeket a két 23-mer szondával való hibridizálás után ka- 15 pott pozitív szignálok révén azonosítottuk, hét rekombináns fágot tudtunk izolálni és ezek DNS-éből az 5001000 bp hosszú EcoRi fragmentumokat szekvenáltunk. Az EcoRi fragmentumok szekvencia analízisét Sanger módszerével [Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci, 74, 5463-5467 (1977)]; F. Sanger és munkatársai, 5 FEBS Letters, 87, 107-111 (1978)] végeztük el, ezután szubklónoztuk az Ml3 vektor EcoRi helyére (Bluescribe, Vector Cloning Systems). A vektorral E. coli, például E. coli JM101 sejteket transzformáltunk, s azt találtuk, hogy az EcoRi fragmentumok olyan cDNS inszertumokat tartalmaznak, amelyek a hMn-SOD-ot a 22-edik aminosavtól (BS5, BS8, BS9, BS13, BSXffl jelű kiónok), illetve a 26. aminosavtól (BS3, BS12 jelű kiónok), illetve a 26. aminosavtól (BS3, BS12 jelű kiónok) kódolják.
Meglepő módon azonban azt is észleltük, hogy a kapott DNS szekvenciában néhány eltérés mutatkozott a D. Bárrá és munkatársai (1984, lásd fenti) szerinti aminosav szekvenciához képest:
Klón Aminosav Kodon Levezetett aminosavak D. Bárrá és munkatársai (1984) szerinti aminosavak
BS3.BS12 29 CAG Gin Lys(29)
BS5, BS9, BS13 29 AAG Lys Lys(29)
BSXIII
BS3.BS12, BS13, BS5, BS9 BSXIII 42 GAG Glu Gin (42)
88 GAG Glu Gin (88)
29 AAG Lys Lys(29)
42 GAG Glu Gin (42)
88 GAG Glu Gin (88)
BS8 109 GAG Glu Gin (109)
124 GGT Gly Δ
125 TGG Trp Δ
139 GAA Glu Gin (129)
Egy 617 bp hosszú EcoRi fragmentumnak a DNS szekvenciáját, amelyet áz egyik kapott klónból - például a BS8 kiónból - izoláltunk, az 1. ábra mutatja be. Az EcoRi fragmentum egy 532 bp hosszú hMn-SOD kódoló szekvenciát tartalmaz, valamint egy 51 bp hosszú nem transzlatált szakaszt egy polifAjjo farokkal. Linker szekvencia részeket szintén bemutat az ábra, a (teljes) EcoRi helyekig.
A 30-33-as pozícióban egy Thai hasítási hely és a 45 367-372 pozícióban egy BamHI hely található. Meglepő, hogy az 53-61, 155-163, 176-184, valamint az 500-508 helyeken olyan kodonok vannak, amelyek a megfelelő aminosavak potenciális N-glükozilációs helyein lehetnek, az általában jellemző aminosav-elren- 50 dezést követve, azaz Asn-X-Thr, illetve Asn-X-Ser, ahol X például valin, hisztidin vagy leucin lehet, ezzel szemben a sejtfolyadék Cu/Zn-SOD enzimjében csak ilyen aminosav kombináció található.
A D. Bárrá és munkatársai [D. Bárrá és munkatár- 55 sai, J. Bioi. Chem., 259, 12 595-12 601 (1984)] szerinti aminosav szekvenciával szembeni aminosav különbségeket, amelyeket a kapott EcoRi fragmentumból vezettünk le, egy korábbi helyen már tárgyaltuk.
Hogy a cDNS génbankból származó hMn-SOD 60
DNS-rész-szekvenciában a 3' és/vagy 5' végekről hiányzó bázisokat kaphassuk a teljes hMn-SOD gén előállítása érdekében, különböző stratégiák szerint 40 járhatunk el. Például a kapott cDNS-t hibridizációs szondaként használjuk egy genomiális génbanknál, hogy a teljes enzimet kódoló szekvenciát kapjuk meg, vagy például H. Kakidani szerint járunk el, úgy, hogy szintetikus, az mRNS-sel komplementer oligonukleotidokat használunk a reverz transzkriptázhoz specifikus primer gyanánt [H. Kakidani és munkatársai, Natúré, 298, 245-249 (1982)]. Azonban az is lehetséges, hogy a cDNS szekvencia hiányzó végeit az ismert aminosav szekvencia alapján (D. Bárrá és munkatársai, 1984, lásd fent) kémiai úton szintetizáljuk és a kapott cDNS elé kapcsoljuk, miáltal meghatározott véghez jutunk.
Az utóbb említett utat választottuk a teljes, találmány szerinti hMn-SOD-ot meghatározó DNS szekvencia 5' végének a teljessé tételére, két oligonukleotid használatával. A Via és VIb képletű oligonukleotidoknak előnyösen Xhol/Xbal, illetve Xbal/NCoI túllógó végei vannak. A találmány szerint a kódoló szakasz 5' végén van az ADHI promoter 3' vége (Via képlet).
HU 212 920 Β
Via képlet
TCGAG TATACA ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG 3 C ATATGT TAC TTC GTG AGA AAC GGT CTG AAG
Xhol
CCA TAC GAC TAC GGT GCT GGT ATG CTG ATG CCA CGA GATC
Xbal
VIb képlet
CTAGAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA 3 TT GGT GTG TAG TTG CGA GTT TAG TAC GTT
Xbal
TTG CAC CAC TCT AAG CAC AAC GTG GTG AGA TTC GTG GTAC
Ncol
A Via és VIb képlet szerinti két szintetikus oligonukleotidot kombináljuk, beklónozzuk egy megfelelő vektorba, például egy megfelelően megváltoztatott pUC18 származékba, majd az egyik kapott kiónból, amelynek 5' vége mindenesetre a Thai helyet tartalmazza, a találmány szerinti cDNS Thal/EcoRI fragmentumát hozzákapcsoljuk, s így egy olyan plazmidot kaphatunk, amely a hMn-SOD gén teljes cDNS-ét - a Vlla és Vllb képlet szerint - a pontos leolvasási keretnek megfelelően tartalmazza, a Thai helyek nélkül.
Vlla képlet
ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG CCA TAC GAC TAC GGT
GCT CTA GAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA TTG
CAC CAC TCT AAG CAC CAT GCG GCC TAC GTG AAC AAC CTG
AAC GTC ACC GAG GAG AAG TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG
GGA GAT GTT ACA GCC CAG ATA GCT CTT CAG CCT GCA CTG
AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT AGC ATT TTC
TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC AAA
GGG GAG TTG CTG GAA GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC
TTT GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT
GGT GTC CAA GGC TCA GGT TGG GGT TGG CTT GGT TTC AAT
AAG GAA CGG GGA CAC TTA CAA ATT GCT GCT TGT CCA AAT
CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA ACA GGC CTT ATT CCA CTG
CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT TAC TAC CTT CAG
TAT AAA AAT GTC AGG CCT GAT TAT CTA AAA GCT ATT TGG
AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG
GCT TGC AAA AAG TAA
Vllb képlet
ATG AAG CAC TCT TTG CCA GAC TTG CCA TAC GAC TAC CGT
GCT CTA GAA CCA CAC ATC AAT GCT CAA ATC ATG CAA TTG
CAC CAC TCT CAG CAC CAT GCG GCC TAC GTG AAC AAC CTG
AAC GTC ACC GAG GAG AAG TAC CAG GAG GCG TTG GCC AAG
GGA GAT GTT ACA GCC CAG ATA GCT CTT CAG CCT GCA CTG
AAG TTC AAT GGT GGT GGT CAT ATC AAT CAT AGC ATT TTC
TGG ACA AAC CTC AGC CCT AAC GGT GGT GGA GAA CCC AAA
GGG GAG TTG CTG GAA GCC ATC AAA CGT GAC TTT GGT TCC
TTT GAC AAG TTT AAG GAG AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT
GGT GTC CAA GGC TCA GGT TGG GGT TGG CTT GGT TTC AAT
AAG GAA CGG GGA CAC TTA CAA ATT GCT GCT TGT CCA AAT
CAG GAT CCA CTG CAA GGA ACA ACA GGC CTT ATT CCA CTG
CTG GGG ATT GAT GTG TGG GAG CAC GCT TAC TAC CTT CAG
TAT AAA AAT GTC AGG CCT GAT TAT CTA AAA GCT ATT TGG
AAT GTA ATC AAC TGG GAG AAT GTA ACT GAA AGA TAC ATG
GCT TGC AAA AAG TAA
HU 212 920 Β
A BS5, BS9, BS13, BSXHI, valamint a BS3 és BS12 kiónok szekvenálása nyomán kitűnt, hogy a BS5, BS9, BS13 és BSXIII klón szekvenciája a BS8 klónéval identikus. A BS3 és BS12 klónoknál, mint említettük, a BS8 klónnal szemben különbség mutatkozik a 5 29-es aminosavban (AAG helyet CAG, azaz Lys helyett Gin; Ib, Illb és IVb képlet). Egyébként a BS8 kiónnal 100%-os homológja áll fenn az 1. ábrán bemutatott EcoRI fragmentum 573. bázisáig.
(.. .TA+A AAC ACG ATC GTT ATG CTG573). Ettől a bázistól kezdve mindkét klón, a BS3 és BS12, a VIII képlet szerinti 5'-ut (ut = untranslated = nem transzlatált) szakaszra nézve, identikus.
vni. képlet
5' AAG CAC TCT ... [Formel Illb] ... AAA AAG TAA ACC ACG ATC GTT ATG CTG AGTAT GTTAA GCTCT TTATG ACTGT TTTTG TAGTG GTATA GAGTA CTGCA GAATA CAGTA AGCTG CTCTA TTGTA GCATT TCTTG
ATGTT GCTTA GTCAC TTATT TCATA AACAA CTTAA TGTTC TGAAT AATTT
CTTAC TAAAC ATTTT GTTAT TGGGC AAGTG ATTGA AAATA GTAAA TGCTT
TGTGT GATTG AATCT GATTG GACAT TTTCT TCAGA GAGCT AAATT ACAAT
TGTCA TTTAT AAAAC CATCA AAAAT ATTCC ATCCA TATAC TTTGG GGACT
TGTAG GGATG CCTTT CTAGT CCTAT TCTAT TGCAG TTATA GAAAA GTAGT
CGACCATGCGGAATTC
Linker EcoRI
Egy cDNS génbankból (placenta) ezenkívül számos cDNS kiónt izoláltunk Xgtll segítségével. Ennek a cDNS génbanknak az előállítását azonos módon végeztük, mint a példákban leírt, placenta-DNS-ból származó cDNS génbanknak a XgtlO-ban való előállítását. Egy Ág ti 1-ből izolált kiónt, a 4-es kiónt, mint leírtuk, szintén a Bluescribe M13+-ban szubklónoztuk. A szekvenálást az alábbi szintetikus 17-mer oligonukleotidokkal való ismételt priming révén végeztük el:
EBI 760: 5' AGATACATGGCTTGCAA 3'
EBI 765: 5' CTCTGAAGAAAATGTCC 3'
EBI 782: 5' GGAGATGTTACAGCCCA 3'
EBI 785: 5' AAGGAACGGGGACACTT 3'
A 4-es klón a 29-es aminosavig (AAG, illetve Lys) és 3' végén egy .. .TCTA... szekvenciáig a multiklónozó helyhez való csatlakozásban, a Ágt 10-ből való BS3 és BS12 klónokkal azonos. Jóllehet az 5' végén maradó 61 bázisból álló DNS szekvencia (la képlet, BS8 klón, megfelel +1-1-21 kodonoknak, illetve Lys-tól Glu-ig) analízise szerint néhány bázis-változás található a levezetett DNS szekvenciával ellentétben (II képlet, a ΙΠΒ képlet tartalmazza), ennek a DNS-részletben a lefordítása nem eredményez különbséget a Bárrá és munkatársai szerinti szekvenciához képest. Az ATG előtt egy vezér szekvenciát szintén analizáltunk. A IX képlet a
4-es kiónra kapott szekvenciát írja le.
IX. képlet
EcoRI (GGGCGAATTCCAGC)
-24 -20 -15
M L S R A V C G T S R Q L P
ATG TTG AGC CGG GCA GTG TGC GGC ACC AGC AGG CAG CTG CCT
-10 ★ -5 -1 +1
P V L G Y L G S R Q K H S L
CCG GTT TTG GGG TAT CTG GGC TCC AGG CAG AAG CAC AGC CTC
+ 5 +10 +15
P D L P Y D Y G A L E P H I
CCC GAC CTG CCC TAC GAC TAC GGC GCC CTG GAA CCT CAC ATC
+20 +21 N A Q I
HU 212 920 Β
AAC GCG CAG ATC ... [Formel la] ... AAA AAG TAA ACC ACG ATC GTT ATG CTG AGTAT GTTAA GCTCT TTATG ACTGT TTTTG TAGTG GTATA GAGTA CTGCA GAATA CAGTA AGCTG CTCTA TTGTA
GCATT TCTTG ATGTT GCTTA GTCAC TTATT TCATA AACAA CTTAA
TGTTC TGAAT AATTT CTTAC TAAAC ATTTT GTTAT TGGGC AAGTG
ATTGA AAATA GTAAA TGCTT TGTGT GATTG AATCT GATTG GACAT
TTTCT TCAGA GAGCT AAATT ACAAT TGTCA TTTAT AAAAC CATCA
AAAAT ATTCC ATCCA TATAC TTTGG GCACT TGTAG GGATG CCTTT
CTAGT CCTAT TCTAT TGCAG TTATA GAAAA TCTA GGAATTCGCCC
EcoRI-Linker + A többi szekvenált kiónban a -9 pozícióban alanin (GCT) van.
Más kiónok különböző hosszúságú 5'-ut-szakaszokat tartalmaznak.
A találmány szerinti DNS-szekvenciákat különböző expressziós vektorokba építhetjük be, előnyösen a pES103-ba az ADHI promoterrel együtt (DSM 4013), ahol a leírt szabályozó elemek segítségével kifejezhetők. A pES103 vektort úgy kapjuk, hogy a pES102 pUC18 származékba, amely a HincII hasítási helyen egy Xhol linkért tartalmaz, beépítjük az ADHI promoter 1500 bp hosszú BamHI/XhoI fragmentumát [például G. Ammerer, Methods is Enzymology, 101,192-201 (1983)].
Az eredetileg 1500 bp hosszú ADHI promoter szekvencia helyett egy körülbelül 400 bp hosszúra lerövidített ADHI promotert is beépíthetünk, BamΗΙ/XhoI fragmentumként. A lerövidített ADHI promotert (ADHIk) úgy állítjuk elő, hogy a pWS323E plazmidot (DSM 4016) BamHI/XhoI-vel emésztjük, majd izoláljuk az ADHIk promotert.
A korrekt termináciő érdekében egy megfelelő terminátor szekvenciát, célszerűen egy ADH terminátort, előnyösen az ADHII terminátort kapcsoljuk a hMnSOD mögé (ligázzal). Az ADHII terminátort [D. R. Beier, Ε. T. Young, Natúré, 300, 724-728 (1982)] úgy állíthatjuk elő, hogy a pMW5-ADHII-t (Washington Research Foundation) SphI-vel emésztjük, majd a kapott 1530 bp hosszú fragmentumot HincII-vel emésztjük, hogy a végleges ADHII terminátorhoz (329 bp) jussunk vagy a pGD2 plazmidból (DSM 4014) állítjuk elő 336 bp hosszú HindlII/Xbal fragmentumként.
Élesztőben való expresszióhoz különböző élesztővektorok állnak rendelkezésre, amelyekben az expressziós kazettákat a találmány szerint hMn-SOD génnel együtt be lehet építeni, ilyen előnyös vektor az YEpl3 [J. R. Broachés munkatársai, Gene, 8,121-133 (1979); ATCC 37 115], a pJDB207 (DSM 3181, letétbe helyezve 1984. december 28-án), az YIp5 [K. Struhl és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 76,1035-1039 (1979); ATCC 37 061] és a pEAS102 (a pEAS102-höz úgy juthatunk, hogy az YIp5-öt Pstl-vel részlegesen és BamHI-vel teljesen megemésztjük, majd az URA3 gént tartalmazó izolált 4,3 kb hosszú fragmentumot a pJDB207 4,4 kb BamHI/PstI fragmentumához ligáljuk).
A találmány szerinti hMn-SOD gént tartalmazó, expressziós kazettát hordozó egy élesztő vektorral ismert módszerekkel - alkalmas élesztő sejteket transzformálunk. Az expresszióhoz alkalmas élesztő sejtek közül előnyösen azok jönnek számításba, amelyek a saját, élesztő-specifikus Mn-SOD enzimre nézve deficiensek és amelyek egy szelekcióra alkalmas élesztő gént tartalmaznak, mint például a HIS3, URA3, LEU2 és SUP gént, hogy néhányat megemlítsünk. Az ilyenfajta mutánsokat, amelyek például in vitro vagy in vivő szerkesztett mutált géneket tartalmaznak és e géneket „transzplacement” révén foglalják magukba, integratív transzformáció révén kapjuk meg [például: F. Winston és munkatársai, Methods in Enzymology, 101, 211— 228 (1983)]. Az élesztő mutálandó Mn-SOD génjét például BamHI fragmentumként van Loon és munkatársai, Gene, 26, 261-272 (1983)] a pL41 plazmid tartalmazza. Minthogy a BamHI fragmentum teljes szekvenciája ismert [C. A. M Marres és munkatársai, Eur. J. Biochem., 147, 153-161 (1985)], az élesztő Mn-SOD gén a pL41 nélkül is hozzáférhető.
Az ilyenfajta transzformált sejtek által termelt hMn-SOD enzimet a protein izolálás és protein tisztítás ismert módszereivel állíthatjuk elő. A sejtfeltárást például [van Loon és munkatársai szerint végezhetjük [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 3820-3824 (1986)].
A hMn-SOD baktériumokban, előnyösen E. coli35 bán, például E. coli HB101, C600 és JM101 sejtekben való kifejezéséhez a már említett és bevezetett expressziós rendszerek állnak rendelkezésre. A találmány szerinti DNS szekvenciákat erre a célra egy erős E. coli promoter/szabályozása alá (lásd fentebb)
- alá nem eukarióta promoter alá - kell helyezni. Ezen ismert promoterekre példák a következők: lac, lacuv5, trp, tac, trp-lacuv5, PL, ompF, Bla. Egy riboszomális kötőhely obiigát alkalmazásáról, hogy hatékony transzláció jöjjön létre E. coliban, már egy előb45 bi helyen írtunk.
A hMn-SOD aktivitás E. coliban való kifejeződése kimutatására a baktériumokat - alkalmas, hagyományos táptalajban való inkubálás után - feltáljuk és a felülúszót hMn-SOD aktivitásra teszteljük a már lefr50 tak szerint [például S. Markiund, G. Markiund (1974); Ch. Beauchamp és I. Fridovich, Anal. Biochem., 44, 276-287 (1971); Η. P. Misra és I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys., 183, 511—515 (1977); B. J. Davis. Ann. Ν. Y. Acad. Sci., 121,404-^127 (1964); M. Yseba55 ért Vanneste és W. H. Vanneste, Anal. Biochem., 107. 86-95 (1980)].
A kifejeződött hMn-SOD gén kimutatását el lehet végezni proteinek jelzésével maxisejtekben. A plazmidok kódolta proteineket a maxisejt technika alkalmazá60 sával [A. Sancar és munkatársai, J. Bacteriol., 137.
HU 212 920 Β
692-693 (1979)] in vivő szelektíven jelezhetjük. A CSR603 (CGSC 5830) E. coli törzsnek nincsenek DNS-repair-mechanizmusai. Megfelelő UV-sugárdózissal a bakteriális kromoszómát elroncsoljuk, ezzel szemben a lényegesen kisebb és a sejtenként több másolatban jelenlévő plazmid-DNS-ek működőképesek maradnak. Minden nem károsodott, szaporodó sejt Dcikloszerin antibiotikummal való elölése és az endogén mRNS kimerítése után a megmaradó sejtekben már csak a plazmid-kódolta gének íródnak át és fordítódnak át. A képződött proteineket 35S metionin beépítése révén radioaktív jelzéssel kimutathatjuk. Az E. coli CSR603 sejteket a szokásos eljárások szerint az expressziós plazmidokkal transzformáljuk és a transzformáit baktériumokat ampicillin tartalmú agarlemezeken szelektáljuk. A maxisejtek előállítása és a proteinek jelölése A. Sancar (1979, lásd fent) előírása szerint történik. Molekulasúly standardként 14C-metilezett protein-keveréket (Amersham) alkalmazunk. Kontrollként olyan plazmidot használunk, amely a promotert a hMn-SOD gén nélkül tartalmazza.
A gazdasejt sikeres transzformációja és a gén expressziója után, majd fermentáció vagy sejt-tenyésztés után, olyan feltételek mellett, hogy a találmány szerinti proteinek kifejeződhessenek, a terméket rendszerint ismert kromatográfiás elválasztási módszerekkel különíthetjük el, s így olyan terméket kapunk, amely a proteineket vezér- és farok-szekvenciákkal együtt vagy ezek nélkül tartalmazza. A találmány szerinti hMnSOD úgy fejeződik ki, hogy N-terminuszán egy vezérszekvencia van, amely - mint már leírtuk - néhány gazdasejt esetén eltávolítható. Ha nem úgy - amint azt szintén leírtuk - a vezér-polipeptidet (ha van) le kell hasítani ahhoz, hogy érett hMn-SOD-ot kapjunk. Alternatív módon a szekvencia úgy módosítható, hogy az érett enzimet magában a mikroorganizmusban termeljük meg. Erre az esetre az élesztő-mating-pheromon MF-alfa-1 prekurzor szekvenciát alkalmazzuk, hogy a fuzionált protein korrekt „érését”, a terméknek a tenyészlébe vagy a sejtplazma körüli térbe való kiválasztását biztosítsuk. A hMn-SOD „szecemálása” az élesztő mitokondriumokban akkor mehet végbe, ha az élesztő-Mn-SOD gén vezérszekvenciáját közvetlenül a hMn-SOD gén elő helyezzük.
Az alkalmas vezérszekvenciák, például azok, amelyeket C. A. M. Marres és munkatársai írtak le [Eur. J. Biochem., 147 153-161 (1985)] vagy ezek származékai vagy természetes eredetűek lehetnek és ezeket a megfelelő eukarióta sejtekből (például S. cerevisiae) izolálhatjuk vagy e szekvenciákat szintetikus úton állítjuk elő. Élesztő-specifikus DNS-pre-szekvenciát, amely a hMn-SOD-nak az élesztő mitokondriumba való beviteléhez szükséges, például egyes szintetikus oligonukleotidok ligálásával állíthatjuk elő. A találmány szerint a teljes preszekvenciát az ATG start-kodon és az érett hMn-SOD első aminosavát kódoló első kodon (Lys, illetve AAg) közé vagy ennek N-terminális végén egy tetszőleges rész - például a H, Illa, IHb, Via, Vlla, Vllb, VIII. vagy XI. képletben közé csatolhatjuk be. Egy ilyenfajta preszekvenciát közvetlenül az
ATG start kodon után és a hMn-SOD eredeti DNS szekvenciájához mérten szekvencia változtatásokkal mutált és hMn-SOD aktivitású proteint kódoló DNs első kodonja elé ugyancsak beépíthetünk.
Egy olyan vezérszekvencia, amelyet a hMn-SODnak az élesztő-mitokondriumba való bevitele céljára a találmány szerint alkalmazunk, az alább X képlettel írható le. A képletben az ismert GCA GCT szekvenciát (C. A. M. Marres és munkatársai, 1985, lásd fent) GCT GCA szekvenciára cseréltük ki (mindkét triplet az alanint kódolja) és a szekvencia egy PvuII felismerő helyet is tartalmaz.
X. képlet PvuII
TTCGCGAAAACAGTGCAGCTAATTTAACCAAGAAGGGTGGTTTGTCATTGCTCT CCACCACACGCAAGGAGAACC
Előnyös, ha a vezérszekvencia - például a X képlet szerinti vezérszekvencia - a Via képlet szerinti Xhol/Xbal fragmentumot tartalmazza. Ezzel azt érjük el, hogy ez a 128 bp hosszú linker a vezérszekvenciával együtt az Xhol és Xbal helyeken keresztül oly módon kapcsolódhat a maradék hMn-SOD génhez, hogy a vezérszekvencia közvetlenül az ATG start kodon után és a hMn-SOD első aminosava (Lys) között helyezkedik el (XI. képlet).
XI. képlet
Xhol PvuII
Start
5' TCGAGTATACAATGTTCGCGAAAACAGCTGCAGCTAA
CATATGTTACAAGCGCTTTTGTCGACGTCGATT
TTTAACCAAGAAGGGTGGTTTGTCATTGCTC
AAATTGGTTCTTCCCACCAAACAGTAACGAG
Lys in
TCCACCACAGCAAGGAGAACCAAGCACTCTTT
AGGTGGTGTCGTTCCTCTTGGTTCGTGAGAAA
GCCAGACTTGCCATACGACTACGGTGCT 3' CGGTCTGAACGGTATGCTGATGCCACGAGATC
Xbal
A hMn-SOD tisztítását sejtekből ismert eljárásokkal végezhetjük el.
A géntechnológiával előállított, találmány szerinti hMn-SOD enzimet egyrészt biológiai-enzimatikus hatás-spektrumuk alapján, másrészt mivel ezekből a természetes hMn-SOD-dal nagy valószínűséggel immunológiailag azonos nagy tisztaságú enzimekből jelenleg mennyiség áll rendelkezésre, a gyulladásos, degeneratív, neoplazmás vagy reumatikus megbetegedések területén a megelőzés, kezelés és/vagy diagnosztika minden fajtájához és autoimmun betegségeknél s transzplantációnál a sebgyógyuláshoz alkalmazhatjuk, illetve olyan betegségek megelőzésére és terápiájára, amelyek hMn-SOD hiánnyal járnak együtt vagy okozatilag ezzel függnek össze. A klinikai felhasználás lehetőségei
HU 212 920 Β
W. H. Bannister és J. V. Bannister [Biological Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase, IIB kötet, Elsevier/Nort-Holland, (1980)] és A. M. Michelson, J.
M. McCord, I. Fridovich [Superoxide and Superoxiddismutases, Academic Press (1977)] munkából kitűnnek. A továbbiakban a következő klinikai felhasználási lehetőségeket is figyelembe kell venni: perfúziós sebek, gutaütés, alkohol által károsodott máj, koraszülöttek, adott esetben pancreatitis, akut légúti megbetegedések (ARDs), emphysema, dialízis által károsodott vese, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, sugárzás indukálta károsodások, sarlósejt-anémia.
A találmány szerinti hMn-SOD enzimek a szilárd és folyékony élelmiszerek eltarthatóságának növelésére szintén alkalmasak.
A találmány szerinti hMn-SOD enzimek szisztémásán vagy helyileg alkalmazhatók, amikor is az első esetben a hagyományos parenterális alkalmazási módok (például i. v., i. m., s. c., i. a.) és a második esetben a megfelelő ismert gyógyszerfonnák (paszták, kenőcsök, gélek, szopogatós- vagy rágó-tabletták, porok és egyéb, a hMn-SOD készítmények lokális reszorpcióját elősegítő galénusi készítmények és gyógyszerészetileg elismert hordozó anyagok) a megfelelőek. A terápiásán hatásos dózistartomány egyéni megítélés alapján (például a kezelendő betegektől, a betegség súlyosságától stb. függően, például napi körülbelül 4 mg-ban adható meg.
Az alábbiakban az ábrák magyarázata következik.
1. ábra A BS8 klón EcoRI fragmentuma az érett
HMn-SOD 22. aminosavától kezdődő 532 bp hosszú kódoló szakasszal, az 51 bp 3z-ut szakasszal, és a linter szekvencia részekkel. A potenciális N-glükozilációs helyeket (fent áthúzva), az egyetlen Thai helyett és a BamHI helyet (aláhúzva) megjelöljük.
2. ábra Vázlatos stratégia a HSOD4 plazmid szerkesztéséhez. · A plazmid a hMn-SOD gén szintetikus 5' végét, mint Xhol/Ncol fragmentumot tartalmazza.
3. ábra A HSOD2 és HSOD3 plazmid restrikciós térképe, valamint az ezekből szerkesztett HSOD4 plazmid.
4. ábra A HSOD6 plazmid szerkesztése, amely a hMh-SOD-ot kódoló teljes cDNS-t, mint XhoI/EcoRI fragmentumot tartalmazza.
5. ábra A hMn-SOD-cDNS Thal/EcoRI fragmentumának előállítása a BS8 kiónból.
6. ábra a pl54/2 plazmid szerkesztése, amely az
ADHI promotert 1500 bp hosszú BamHI/XhoI fragmentumként tartalmazza.
7. ábra A p 150/2 plazmid szerkesztése a hMn-SOD kifejeződéséhez szükséges egységekkel, az ADHI promoterrel és ADHII terminátorral (336 bp Xbal/HindlII fragmentum).
8. ábra A végleges plazmidok (pKHl és pKH2) elkészítése a hMn-SOD cDNS-nek az XhoI/EcoRI helyre való további beépítéséhez az ADHI promoterrel, illetve ADHIk promoterrel és az ADHII terminátorral.
9. ábra A HOSD7 expressziós kazetta elkészítése a megrövidített, körülbelül 400 bp hosszú ADHI promoterrel (ADHIk). Az eredeti hosszúságú ADHI promoterrel való szerkesztés a pKH 1-ból kiindulva, analóg módon történik.
10. ábra Plazmidok szerkesztése az élesztő Mn-SOD génen belül URA3 génnel, mint markerrel, amely az MN-SOD génhez viszonyítva különböző irányítottsággal van beépítve (SODY7, SODY8). A plazmidok egy expresszióhoz alkalmas élesztő Mn-SOD mutáns előállítását célozzák, a gén áthelyezést a megfelelő élesztő törzsbe (DBY747) a SODY7 és SODY8 segítségével végezzük.
11. ábra A hMn-SOD expressziójának gélelektroforetikus kimutatása. A kifejeződés a pWS490A és pWS491A plazmidok által a WS3O-5g élesztő törzsben történik.
1. pálya: WS30-5g/pWS490Al,
2. pálya: WS30-5g/pWS490A2,
3. pálya: WS30-5g/pWS491Al,
4. pálya: WS30-5g/pWS491A2,
5. pálya: WS21-1/SOD1), élesztő MnSOD-ot tartalmaz,
6. pálya: WS30-5g,
7-10. pálya: hMn-SOD májból (8. pálya: 0,3 pg, 9. pálya: 1,2 pg, 10. pálya: 3,0 pg). A plazmidok neve utáni 1-es és 2-es szám ugyanazon plazmidokkal transzformált különböző sejteket jelent.
12. ábra Mn-SOD aktivitás vizsgálata a pE024—AB, pE025-AC, illetve pE026-AC expressziós plazmidokat tartalmazó élesztők kivonataiból. A proteineket poliakrilamid gélben választjuk el, majd az aktivitást o-dianizidinnel festjük, ismert módszer szerint. a = WS30-5g, b = WS30-5g/pE024-AB, c = WS30-5/pE025-AC, d = WS305g/pE026-AD, e+ = marker (0,15 pg humán máj Mn-SOD).
13. ábra Hat különböző transzformált élesztő sejt rekombináns humán Mn-SOD aktivitásának vizsgálata a mitokondriumokban, illetve citoplazmában. A proteinek elválasztását gélelektroforézissel végeztük, majd az aktivitást o-dianizidinnel festjük, ismert módszer szerint (CP-Extr. = citoplazma kivonat, MCExtr. = mitokondrium kivonat).
a = marker, 0,15 pg humán máj Mn-SOD b = CP-Extr. WS30-5g pWS490A MC-vezér nélkül c = MC-Extr. WS3O-5g pWS490A MC-vezér nélkül d = CP-Extr. WS30-5g pE024-AB MC-vezérrel e = MC-Extr. WS3O-5g pE024-Ab MC-vezérrel f = CP-Extr. WS30-5g pWS491A MC-vezér nélkül g = MC-Extr. WS3O-5g pWS491 AMC vezér nélkül h = CP-Extr. WS3O-5g pE025-AC MC-vezérrel i = MC-Extr. WS3O-5g pE025-Ac MC-vezérrel j = CP-Extr. WS3O-5g WS550A MC-vezér nélkül k = MC-Extr. WS30-5 g pWS55OA MC-vezér nélkül
HU 212 920 Β = CP-Extr. WS30-5g pE026Ad MC-vezérrel m = MC-Extr. WS30-5g pE026AD MC-vezérrel n = üres sáv o = marker, 075 gg humán máj Mn-SOD
14. ábra A találmány szerinti hMn-SOD kromatográfiás elúciós diagramja (15. példa, 5. lépés) ammónium-szulfátos kicsapás (15. példa, 4. lépés) után, Mono S kationcserélő oszlopon (Pharmacia).
15. ábra A különböző tisztítási lépések után kivett hMn-SOD minták vizsgálata SDS-poliakrilamid gélben (15%, ezüst festés).
= 4 μΐ, marker (LMW-Pharmacia) 1:50 = 10 gg, nyers kivonat = 10 gg, ammónium-szulfátos kicsapás után = 9 gg, Mono S kromatográfia után = 2,5 gg hidroxilapatiton való kromatografálás után = 5 gg hidroxilapatiton való kromatografálás után
A találmányt az alábbi példákkal részletesen szemléltetjük anélkül, hogy a találmány oltalmi körét e példákra korlátoznánk.
Anyagok
Ha az alábbi példákban külön nem jelezzük, úgy a következő anyagokat, oldatokat, plazmidokat, vektorokat és mikroorganizmusokat használjuk:
ADHI promoter: (1500 bp BamHI/XhoI) DSM 4013 (pES103) letétbe helyezve: 1987.02.27.
ADHI promoter, lerövidített: (400 bp BamHI/XhoI) DSM 4016 (pWS323E) letétbe helyezve: 1987.02. 27.
ADHI terminátor: (336 bp Xbal/ HindlII) DSM 4014 (pGD2) letétbe helyezve: 1987.02. 27.
BamHI-puffer: 150 mmol NaCl, 6 mól trisz·HC1 (pH = 7,9), 6 mmol MgCl2, lOOgg/mlBSA
Core-puffer: 50 mmol trisz-HCl (pH = 8,0), 10 mmol MgCl2,50 mmol NaCl
Denaturáló oldat: 0,5 mól NaOH, 1,5 mól NaCl
Denhardt oldat (50x): 1 g polivinilpirrolidon (moltömeg: 360 000), 1 g Ficoll, 1 g BSA (marha szérum albumin) ad 100 ml H2O
E. coli C600: F“, supE44, thil, thrl, leuB6, lacYl, tonA21,-(ATCC 23 724)
E. coliJMIOl: supE, thi, Δ (Iac-pro AB), [F“, traD36, pro AB, lacIqZ, ΔΜ15]
High-puffer: 100 mmol NaCl, 50 mmol trisz-HCl (pH = 7,5), 10 mmol MgCl2 1 mmol DTT
HincII-puffer: 10 mmol trisz-HCl (pH-7,5), 60 mmol NaCl, 10 mmol MgCl2, 1 mmol merkaptoetanol, 100gg/mlBSA
ADHI promoter: (1500 bp BamHI/XhoI) DSM 4013 (pES103) letétbe helyezve: 1987. 02. 27.
Hibridizáló oldat: mint a prehibridizáló oldat, lazacsperma-DNS nélkül
Klenow-reakció oldat: 22 gl DNS/H2O, 2,5 gl lOx NTRpuffer [0,5 mól trisz-HCl (pH = 7,2), 0,1 mól MgSO4, 1 mmol DTT, 500 gg/ml BSA], 1-1 gl 2 mmol-os dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2,5 egység Klenow-fragment (0,5 gl)
Lambda-puffer: 100 mmol trisz-HCl (pH = 7,5), 10 mmol MgCl2,1 mmol EDTA
LB-agar: LB-folyékony táptalaj, 15 g/1 Bacto-agar (Difco)
LB-folyékony táptalaj: 10 g/1 Bacto-Trypton (Difco), 5 g/1 élesztő-kivonat (Difco), 5 g/1 NaCl, 10 mól NaOH ad pH 7,4
Ligáz-reakció oldat: 66 mmol trisz-HCl (pH = 7,6), 10 mmol MgCl2, 5 mmol DTT, 1 mmol ATP, 1 egység T4-DNS ligáz
Neutralizáló oldat: 0,5 mól trisz-HCl (pH = 7,5), 1,5 mól NaCl
Nitrocellulóz szűrő: Schleicher-Schuell féle membránszűrő BA 85
Nrul-puffer: 50 mmol KC1, 50 mmol NaCl, 50 mmol trisz-HCl (pH = 8,0), 10 mmól MgCl2
Prehidridizáló oldat: 5xSSC, 5xDenhardt oldat, 50 mmol nátrium-foszfát puffer (pH = 6,8), 1 mmol Na2P4O7, 100 gmol ATP, 0,1% SDS, 30100 (50) gg/ml denaturált, ultrahanggal kezelt lazac-sperma DNS
pUC18: Pharmacia
pURA3: DSM 4015, letétbe helyezve: 1987. 02. 27.
S. cerevisiae DBY747: a, leu2, his3, trp 1, ura3 (Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley, USA)
SC-URA-táptalaj: 0,67% BYNB (Difco), 2% glükóz, 2% 50xAS-Mix (literenként 1 g hisztidin, 6 g leucin, 2,5 g triptofán, 4 g lizin, 1,2 g adenin, 2 g arginin, 1 g met ionin, 6 g fenilalanin, 5 g treonin, 6 g izoleucin)
Smal-puffer: 10 mmol trisz-HCl (pH = 8,0), 20 mmol KC1,10 mmol MgCl2, 10 mmol 2-merkapto-etanol, 100 gg/ml BSA
Sphl-puffer: 10 mmol trisz-HCl (pH = 7,5), 100 mmol NaCl, 10 mmol MgCl2,10 mmol 2-merkapto-etanol, 100 gg/ml BSA
SSC (20x): 3,0 mól NaCl, 0,3 mól trinátriumcitrát (pH = 7,0)
HU 212 920 Β
ADHI promoter: (1500 bp BamHI/XhoI) DSM 4013 (pES103) letétbe helyezve: 1987.02. 27.
SSPE (20x): 3,6 mól NaCl, 0,2 mól Na2HPO4, 20 mmol EDTA, 10 n NaOH ad pH 7,4
TE-puffer: 10 mmol trisz-HCl (pH = 8,0), 1 mmol EDTA
Thal-puffer: 50 mmol trisz-HCl (pH = 7,0), 10 mmol MgCl2
Top-agarőz: LB-folyékony táptalaj, 0,7% agaróz (Seaken FM-agaróz)
Előmosó oldat: 1 mól NaCl, 50 mmol trisz-HCl (pH = 8,0), 1 mmol EDTA, 0,1% SDS.
1. példa cDNS génbank létesítése
Friss humán placentából készített kockanagyságú szövetdarabokat folyékony nitrogénben hirtelen megfagyasztunk és szövetet -80 ’C alatt elporítjuk. A porított szövetből ezután az RNS-t J. M. Chirgwin és munkatársai által leírt eljárás szerint extraháljuk és izoláljuk [Biochemistry, 18,5294-5299 (1979)].
A kapott RNs-ből a poli(A)+RNS-t H. Aviv és P. Ledér szerint [Proc. Natl. Acad. Sci., 69,1409-1412 (1972)] állítjuk elő. A cDNS szintézisét a „cDNS synthesis system” (Amersham RPN 1256) szerint végezzük.
A pakolás Gigapack (vector cloning system) segítségével történik. A Ágt 10 EcoRI helyére való klónozási módszer minden további lépését T. V. Huynh és munkatársai előírása szerint [DNA Cloning, 1. kötet, 2. fejezet, szerk.: Glover, IRL Press, (1985)] végezzük azzal a különbséggel, hogy „plating bacteria” gyanánt az E. coli C600 sejteket alkalmazzuk. A cDNS génbankot reprezentáló XgtlO fágok titere l,2xlOlopfu/ml volt, a független kiónok száma: lxlO2 * * * 6, 1,2x10
2. példa
A kgtlO génbank szaporítása
Egy megfelelő E. coli gazda törzs [C600, genotípusa: F“, supE44, thil, thrl, leuB6, lacYl, tonA21, λ-; M.
A. Hoyt és munkatársai, Cell, 31, 5656 (1982)] sejtjeit 0,2% maltózzal kiegészített LB-táptalajban előtenyésztjük egy éjszakán át 37 ’C-on.
Az egy éjszakás előtenyészetet 5 percig 3000 ford/perc mellett lecentrifugáljuk és jéghideg 1 mmolos MgSO4 oldatban szuszpendáljuk úgy, hogy optikai sűrűsége OD^ nm = 4,0 legyen. Az így készített Mgsejteket 4 *C-on tároljuk és egy héten át használhatjuk.
Steril csövekben 12x200 μΐ Mg-sejt szuszpenziót fágszuszpenzióval [lemezenként 50 000 pfu (a cDNS génbankból)] keverünk össze és 20 percig 37 ’C-on inkubáljuk.
Ezután minden csőhöz 6-7 ml felolvasztott, 42 ’Cra beállított top-agarózt (végkoncentráció 10 mmol MgSO4 legyen) pipettázunk, elkeverjük és 12 db 37 ’C-ra előmelegíttet 1 mmol MgSO4 tartalmú LBagar lemezre (13,5 cm átm.) öntjük ki, majd 6-12 órán át 37 ’C-on inkubáljuk.
3. példa
Előzetes szűrővizsgálat a rekombináns Έ-fágok azonosítása
a) Nitrocellulóz szűrők készítése
Az előzőekben előkészített lemezeket az inkubáció után 4 ’C-ra hűtjük le. A ceruzával megszámozott nitrocellulóz szűrőlemezeket ráhelyezzük a lemezek felületére és a lemezen lévő pozíciókat tűvel megjelöljük. Körülbelül 1 perc múlva, amikor már teljesen átnedvesedtek, a szűrőket óvatosan leemeljük, denaturáló oldatba helyezzük és 1 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 5 percig - szobahőmérsékleten - neutralizáló oldatban neutralizáljuk, majd 30 másodpercig szintén szobahőmérsékleten 2xSSPE-ben inkubáljuk.
Minden lemezről 3 további lenyomatot készítünk úgy, hogy a szűrőlemezeket mindig 30 másodperccel tovább hagyjuk állni a lemezeken. A tűszúrások helyzetét a következő szűrőkre pontosan átvisszük.
A szűrőket szűrőpapírra fektetve levegőn szárítjuk meg és a DNS-t 2 órás 80 ’C-on való hevítéssel fixáljuk. A lemezeket az ezután következő hibridizálás eredményéig megőrizzük.
b) i2P-vel jelzett DNS-szondák előállítása
A szintetikus oligonukleotid-keverékeket a 381A DNS szintetizátorral (Applied Biosystem) készítjük el, poliakrilamid gél elektroforézissel (20% 8 mol-os húgysavban; T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) tisztítjuk és Sephadex G50 (Pharmacia) segítségével sótalanítjuk. Az így szintetizált DNS-szondák komplementerek azokkal az RNS bázis szekvenciákkal
a) amelyek a 39-46 aminosavakat, illetve
b) a 200-207 aminosavakat kódolják [D. Bárrá és munkatársai: Oxy Radicals and their Scavenger Systems, 1. kötet, 336-339 oldal (1983)], a bázis szekvenciájuk a következő:
a) CCC
5' TG ITA TT TC TC IGT IAC ITT 3' TTT
b) ACA
5' TC IGT IAC TT TC CCA TT IÁT 3'
G T G ahol A, G, C és T a megfelelő nukleotidokat jelentik és I az inozint.
A kémiailag szintetizált DNS-próba-keverékeket pmol/μΐ koncentrációban, vízben oldjuk. Reakcióelegy:
20-100 pmol gamma32-PATP (>3000 Ci/mmol,
Amersham) etanolos oldatból liofilizálva, ΣΟΙ 00 pmol oligonukleotid, 1 μΐ lOxkináz-puffer [0,7 mól trisz-HCl (pH = 7,6), 0,1 mól MgCl2, 50 mmol DTT, 10 egység T4 polinukleotid kináz (BRL), ad 10 μΐ víz].
HU 212 920 Β
A reakciót 60 percig 37 °C-on hagyjuk lefolyni, majd 25 mmol EDTA hozzáadásával állítjuk le. A be nem épült radioaktivitást kizárásos kromatográfiával távolítjuk el 1 ml-es Biogel P6-DG oszlopon (Biorad), amelyet egy 1 ml-es egyszerhasználatos fecskendőben állítunk elő. Eluáló szerként a TE-puffert használjuk.
c) In situ hibridizálás
Hogy a nitrocellulózról az agaróz és baktérium maradékokat eltávolítsuk, amelyek a hibridizálásnál erős háttér sugárzáshoz vezetnének, a szűrőket nem túl kis mennyiségű előmosó folyadékban himbálva, néhány órát éjszakáig 65 ’C-on inkubáljuk. A DNS nem specifikus kötőhelyeit a nitrocellulóz szűrőkön úgy telítjük, hogy a szűrőket 1-12 órán át, előzőleg vákuumban gáztalanított prehidridizáló oldatban 37 ’C-on inkubáljuk.
A hibridizáláshoz szánt radioaktív jelzett DNS-ekből (körülbelül lxlO9cpm/pg) a szükséges mennyiségeket 37 ’C-ra előmelegített és gázmentesített hibridizáló oldathoz adjuk. Hogy a DNS próbaanyagok koncentrációját a hibridizáló oldatban a lehető legmagasabban tartsuk, csak annyi hibridizáló folyadékot használunk, hogy a szűrőket éppen befedje a folyadék, a hibridizálás 12—18 órát tart 37 ’C-on.
Ezután Wood és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 1585—1588 (1985)] módszere szerint, a nitrocellulóz szűrőket háromszor 6xSSC és 0,0% SDS oldatban öblítjük (4 ’C) és kétszer 30 percig 4 ’C-on ugyanígy mossuk. Ezután a szűrőket egy frissen készített oldatban amely 3 mól tetrametil-ammónium-kloridot (Me4NCl), 50 mmol trisz-HCl-t (pH = 8), 2 mmol EDTA-t és 0,05% SDS-t tartalmaz, háromszor öblítjük szobahőmérsékleten, kétszer 30 percig mossuk szobahőmérsékleten, végül háromszor 30 percig 49 ’C-on (a) oligonukleotid keverék), illetve 52 ’C-on [b) oligonuleotid keverék] mossuk, levegőn szárítjuk [b) oligonukleotid keverék] és papírra ragasztjuk, majd röntgenfilmre exponáljuk 2-8 napon át -70 'C-on „intensifying screen” (erősítő szűrő) használatával.
4. példa
Plakk tisztítás
Minthogy a nagy plakk sűrűség miatt az első keresésnél nem tiidtunk egyes plakkokat izolálni, a rekombináns lambda-fágokat több egymás után következő keresési eljárással - ugyanakkor csökkentett plakk sűrűség mellett - tisztítottuk. A radiogramok kifejlesztése után azokat a területeket izoláltuk az agar lemezekről (három előszűrésből 28 területről 2, 35 területről 1 és 15 területről 5 volt pozitív), amelyek - párhuzamos kísérletben - mindkét hibridizált nitrocellulóz szűrőn pozitív hibridizációs szignált adtak. Ekkor úgy járunk el, hogy egy steril Pasteur pipetta szűk végével a kívánt helyet az agárból kiszúrjuk és 0,3-0,6 ml lambda-pufferbe [100 mmol tris.HCl (pH = 7,5), 10 mmol MgCl2 és 1 mmol EDTA] visszük át. Itt SM-puffert is használhatunk (T. Maniatis, Molecular Cloning, 70. oldal 1982). Egy csepp kloroform hozzáadása után hagyjuk, hogy a fágok egy éjszaka alatt 4 ’C-on az agárból kidiffundáljuk, majd minden egyes fág-szuszpenziót több hígításban újra lemezre visszük. A lemezekről, amelyeken 300-1000 plakk van, újra nitrocellulóz szűrő lenyomatot készítünk és mindegyiket mindkét DNSszondával hibridizáljuk. Ezt az eljárást addig folytatjuk, - azaz tovább követjük az egyedi plakkokat mígnem egy lemezen minden plakk pozitív hibridizációs szignált ad.
5. példa
A kapott fág-klónok vizsgálata
a) A λ-fágok vizsgálata
A fág-szuszpenziókat 1:10 hígítású lépésekkel hígítjuk lambda-pufferrel, többszöri forgatással keverjük, majd lemezre öntjük. A lemezeket 37 ’C-on inkubáljuk, majd a baktérium-pázsitban képződött plakkokat (tarfoltokat) megszámoljuk és megállapítjuk a titert (plaque farming unit = pfu).
A tisztított fág-szuszpenziók titere 2,28,6x10’° pfu/ml volt.
b) A lambda-fág DNS előállítása
Az önmagában homogén fág kiónok izolálása és titrálása után a fágokat 2x104 * 6 pfu/13,5 cm Petri-csésze sűrűségben (a lemezeken a következő összetételű táptalaj van: 1,5% agaróz, 10 g/1 Trypton, 5 g/1 élesztő kivonat, 5 g/1 NaCl, 10 mmol MgSO4 és 0,2% glükóz) 200 μΐ C600 Mg-sejttel (IDgoo = 4) lemezre öntjük, 5 órán át 37 'C-on inkubáljuk, majd 4 ’C-ra lehűtjük. A fágok kioldását úgy végezzük, hogy a lemezekre 88 ml lambda-puffert rétegezünk és néhány csepp kloroformot. A lemezeket enyhén himbálva egy éjszakán át 4 'C-on tartjuk. A felülúszót centrifügálással (15 000 ford/perc 15 perc/ 4 ’C) tisztítjuk, leszívjuk, s a fágokat 30 percig 50 000 ford/perc melletti centrifiigálással (Beckman Ti50 rotor) szobahőmérsékleten ülepítjük. Az üledékhez 500-500 μΐ lambda-puffert adunk, majd ribonukleáz A-val (RNázA, 10 μg/ml) és dezoxiribonukleázzal (DNáz, 1 pg/ml) inkubáljuk 30 percig 37 ’C-on. Ezután megemeljük a sókoncentrációt 25 μΐ 0,5 mol-os EDTA, 12 μΐ 1 mol-os trisz-HCl (pH = 8,0) és 6,5 μΐ 20%-os SDS hozzáadásával és a jelenlévő enzimeket 70 ’C-on 15 percig tartó inkubálással inaktiváljuk. Az elegyet egyszer azonos térfogatú fenollal és kétszer azonos térfogatú kloroform/izoamilalkohol (24:1) elegyével extraháljuk, majd a DNS-t 0,1 térfogat 3 mol-os nátrium-acetát (pH = 5,2) és 2 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk, lecentrifugáljuk, 70%-os etanollal mossuk, szárítjuk, majd 50 μΐ TEpufferben felvesszük.
c) Restrikciós analízis
A DNS oldatok 2 μΐ-eit 5 egység EcoRI-vel Highpufferben 2 órán át 37 ’C-on inkubáljuk, a kapott fragmentumokat 1%-os agaróz gélben (T. Maniatis és munkatársai, 149. oldal 1982) 1-5 volt/cm feszültség mellett elválasztjuk és az 500-1000 bp hosszú fragmentumokat a gélből eluáljuk [G. M. Dretzen és munkatársai, Anal. Biochem., 112, 295-298 (1981)]. Végül szekvencia analízist végzünk.
HU 212 920 Β
d) Szekvencia analízis
A restrikciós fragmentumok szubklónozását egy Sanger-féle [E Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 74,5463-5467 (1977); F. Sanger és munkatársai, FEBS-Letters, 87, 107-111 (1978)] szekvencia meghatározásához alkalmas vektorral [Bluescribe M13+, illetve Ml3-, Vector Cloning Systems, C. Yanisch-Petron és munkatársai, Gene, 33, 103-119 (1985)] végezzük, a szokásos módszereket alkalmazva a DNS fragmentumok hasításának és ligálásának a keresztülvitelére és az E. coli gazdasejtek transzformálására [T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, 104. old. 146. oldal és a következők, 396. oldal (1982; DNA-Cloning, IRLPress, 1. kötet 6. fejezet (1985)]. Ilyen módon 100 ng izolált EcoRI-cDNS fragmentumot építettünk be a vektor megfelelően előkészített dsDNS-alakjának (replikatív alak, 50 ng) EcoRI helyeire (inkubálás 10 μΐ ligációs oldatban 2-12 órán át 14 °C-on) és ezekkel a rekombináns szerkezetekkel (jelük: BS3, BS5, BS8, BS9, BS12, BS13, BSXIII) kompetens E. coli JM101 sejteket transzformáltunk.
A rekombináns fágok egyszálú DNS-ét izoláljuk és Sanger szerint szekvenáljuk. A leolvasott szekvenciákat megfelelő komputer-program [R. Staden, Nucl. Acids Rés., 10, 4731-4751 (1982)] segítségével dolgozzuk fel.
Az izolált 8-as klón (BS8) tartalmazta az érett enzim (1. ábra) 22. aminosavától kódoló szekvenciát.
6. példa
Expressziós kazetta szerkesztése
A hMn-SOD enzimnek élesztőben való expressziójához szükség van az izolált cDNS kiegészítésére, valamint egy expressziós kazetta szerkesztésére, amikor is felhasználásra kerülhet az ADHI promoter az eredeti hosszával [körülbelül 1500 bp, Methods in Enzymology, 101, C rész, 192-201 (1983)], ugyanennek rövidített formája (ADHIk, körülbelül 400 bp) és az ADHII terminátor [R. Beier és E. T. Young, Natúré 300, 724728 (1982)].
a) A gén kiegészítése
Minthogy az izolált 8-as cDNS-klón N-terminálisan 21 aminosavhoz (AS) a megfelelő bázis-szám hiányzik, a gén kiegészítéséhez, a közölt aminosav szekvenciának megfelelően [D. Bárrá és munkatársai, J. Bio. Chem., 259, 12 595-12 601 (1984)] és az élesztőkodon-választék figyelembevételével [P. M. Sharp és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 14, 5125-5143 (1986)] két oligonukleotid párt - az Xhol-Xbal fragmentumot (OPI, a Via képletnek megfelelően), illetve az XbalNcol fragmentumot (OP2, a VIb képletnek megfelelően) - szerkesztünk és szintetizáljuk (381A szintetizátor, Applied Biosystems). Az OPl-et az Xhol/Xbal fragmentumon keresztül (2. ábra), míg az 0P2-t az Xbal/Ncol fragmentumon keresztül építjük be a V 17 plazmidba. Az V 17-et a pUC18-ból [J. Vieira és J. Messing, Gene, 19, 259 (1982)] állítjuk elő úgy, hogy HincII-vel hasítjuk és Xhol linkereket [New England
Biolabs, d(CCTCGAGG)] építünk be, majd a kapott pES102 plazmidot Smal-vel hasítjuk, s ezután Ncollinkereket [New England Biolabs, d(CCCATGGG)] építünk be. Ekkor 4 pg V 17-DNS-t 10-10 egység Xbal-vel és Ncol-vel, illetve Xhol-vel és Xbal-vel emésztünk 40 μΐ Core-pufferben 2 órán át 37 ’C-on és gélelektroforézissel tisztítjuk (0,7%-os agaróz, lásd fent). A szintetizált egyszálú OPI, illetve OP2 5-5 plét (10-10 pmol/pl) összekeverjük, 10 percig 65 C-on inkubáljuk, majd lassan szobahőmérsékletre hűtjük. Ezek 1/10 részét 50-50 ng duplán hasított vektorhoz (Xhol/Xbal az OPl-nél és Xbal/Ncol az OP2-nél) ligáljuk a fent leírt feltételek mellett (HSOD2 és HSOD3 plazmid; 2. ábra). Ezután a HSOD2 és HSOD3 plazmidokat HSOD4 plazmiddá kombináljuk Scal/Xbal-n keresztül (szintén duplán emésztünk Scal-vel és Xbal-vel Core-pufferben 2 órán át (37 ’C-on úgy, hogy a hasított vektorokat gélelektroforézissel tisztítjuk és izoláljuk, majd a fent leírt feltételek mellett (az OPI és OP2 oligopárok klónozása) ligáljuk (2. és 3. ábra). A HSOD4 plazmidot Ncol-vel hasítjuk, ezután Klenowbetöltést végzünk, majd EcoRI-vel hasítjuk, s előkészítjük a Thal/EcoRI-cDNS fragmentumok felvételére: 5 pg DNS-t 50 pl High-pufferben 18 egység Ncol-vel inkubálunk több órán át 37 ’C-on, a hasított DNS-t gélelektroforézissel tisztítjuk, izoláljuk és a felét 30 pl Klenow reakció-elegyben 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk.
A reakciót 2 pl 0,5 mol-os EDTA hozzáadásával és a reakcióelegy 70 ’C-on való inkubálásával (10 perc) állítjuk le. A DNS-t gélelektroforézissel tisztítjuk, izoláljuk és 7,5 egység EcoRI-vel hasítjuk 20 pl Highpufferben újra tisztítjuk és izoláljuk (5. ábra).
A Thal/Ecol fragmentumot a következőképpen készítjük:
A BS8 plazmiddal, amely az izolált 8-as klón cDNS-ét (lásd fent) tartalmazza, kompetens E. coli (JM101 törzs) gazdasejtekkel transzformálunk és a plazmidot megfelelő körülmények mellett izoláljuk (T. Maniatis és munkatársai, 368. oldal. 1982).
A plazmidot Thai-vei hasítjuk (10 pg plazmidot 40 pl Thal-pufferben 25 egység Thal-vel emésztünk 60 ’C-on 8 órán át), majd a 759 bp Thai fragmentumokat EcoRI-vel hasítjuk (lásd fent), a megfelelő fragmentumokat mindig gélelektroforézissel tisztítjuk és izoláljuk, s az így kapott Thal/EcoRI fragmentumot (4. ábra) a megfelelően előkészített HSOD4 plazmiddal [körülbelül 100 ng fragmentumot 10 pl ligációs-oldatban 50 ng hasított vektorral (lásd fent) ligálunk] kombináljuk, amikor is a HSOD6 plazmidhoz jutunk (5. ábra). A HSOD6 plazmid tehát a hMn-SOD-ot meghatározó teljes cDNS-t - a Met-tel együtt - tartalmazza.
b) Az expressziós kazetta szerkesztése
A HSOD6 plazmidot Xhol-vel és EcoRI-vel (5-5 egység 1-1 pg DNS-hez) Core-pufferben duplán emésztjük, az Xhol fragmentumot (gén) izoláljuk és a pKHl, illetve pKH2 plazmidba építjük be XhoI/EcoRi fragmentumként. ApKHl, illetve pKH2 plazmidokat a következőképpen készítjük (6.. 7. és 8. ábra): a pES 103
HU 212 920 Β plazmidba, amely a pES 102-ben lévő ADHI promotert 1500 bp BamHI-XhoI fragmentum gyanánt tartalmazza (a pES102 egy pUC18 származék, amely a HincII hasítási helyen egy Xhol linkért tartalmaz; a BamHIXhoI fragmentum előállítása a Methods in Enzymology 101. kötetében, a 192-201. oldalon van leírva), Smal-vei való hasítás (1 pg plazmidot 5 egység Smalvel emésztjük Smal-pufferben 2 órán át 37 ’C-on), tisztítás és izolálás után BglII linkereket építünk be (T. Maniatis és munkatársai, 386. oldal, 1982). Az így kapott plazmidot (P154/1,6. ábra) EcoRI-vei való hasítás (lásd fent), Klenow betöltés (lásd fent) és religálás [1 pg DNS-t 40 μΐ ligációs oldatban (lásd fent) egy éjszakán át 14 ’C-on inkubálunk] után a 154/2 plazmáddá változtatjuk (6. ábra).
Ugyancsak a pES103 plazmidból kiindulva, Xholvel és Hindffl-mal való dupla emésztés (Core-pufferben) után, beépítjük az -XhoI.EcoRi.Xbal.HindllI-linkert (7. ábra; 381A DNS szintetizátoron szintetizálva). Ez a linker a következő szekvenciát tartalmazza;
TCGAGGAATTCTCTAGAA
CCTTAAGAGATCTTTCGA
Az így kapott 150/1 jelű plazmidba Xbal/HindlIIként (kétszeresen emésztve Core-pufferben) beépítjük az ADHII terminátort [150/2 plazmid (7. ábra)]. Az ADHII terminátort a következőképpen izoláljuk: a pMW5 ADHII plazmidot (Washington Research Foundation) HindlII-mal (Core-puffer), majd SphI-vel (SphI-puffer) emésztjük és az izolált 605 bp fragmentumot beklónozzuk a V18 vektorba, majd a HincII hasítási helyre beépítünk (ligálás, lásd fent) egy Xballinkert (Biolaba, CTCTAGAG). Egy 335 bp hosszú Sbal/Sphl fragmentumot beépítünk a pUC 18-ban (Xbal/Sphl) (pGD2).
A VI8 vektorhoz úgy jutunk, hogy a pUCl8-ban a Smal helyre egy Hindin linkért építünk be és hogy a Hindin hely az eredeti helyről hiányzik, s így a VI 8-ban a többszörös klónozó-hely a következőképpen néz ki:
EcoRI.SstI.KpnI.Hindin.BamHI.XbaI.SalI.PstI.SphI.
Az ADHII terminátort végül úgy izoláljuk, hogy duplán emésztünk Xbal/HindUI-mal Core-pufferben a szokásos módszerek alkalmazásával (lásd fent). Ezzel a 150/2 plazmid az XhoI/EcoRI révén beépítendő génig a következő - génexpresszióhoz szükséges - egységet tartalmazza: körülbelül 1500 bp (promoter), 7 bp (Xhol-linker), 6 bp (EcoRI-linker), 7 bp (Xbal-linker), 329 bp (terminátor). Ezeket az egységeket most a BamHI/HindlII fragmentum által (kétszeresen emésztve Core-pufferben) a 154/2 vektorba építjük be (8. ábra). Az így kapott pKHl plazmidban (8. ábra) az ADHI promotert a rövidített ADHIk promoterrel BamHI/XhoI fragmentum gyanánt - azonos módon cseréljük ki (pKH2; 9. ábra).
Mindkét plazmidba ezután beépítjük XhoI/EcoRI fragmentumként (lásd fent) a HSOD6-ból kihasított teljes cDNS gént (lásd fent). Az így kapott plazmidok, a HSOD7/1, illetve HSOD7/2 (a 9. ábrán csak a HSOD7/2 látható, csak a különböző promoterek révén - ADHI és ADHIk - különböznek egymástól. Az így előállított expressziós kazettákat BglII/HindlII szakaszként [a plazmidok kétszeres emésztése (Core-pufferben) után és a kihasított expressziós kazetták izolálása után] a megfelelően előkészített és közforgalomban kapható alábbi élesztő-transzformációs vektorokba a BamHI és Hindlll hasítási helyekre építjük be: YEpl3 [J. R. Broach és munkatársai, Gene 8, 121-133 (1979); ATCC 37 115], pJDB207 (DSM 3181, letétbe helyezve 1984. 12. 28.) pEAS102 (lásd fent), YIp5 [K. Struhl és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 1035-1039 (1979); ATCC 37 061],
7. példa
Expresszióhoz alkalmas élesztő Mn-SOD mutáns előállítása
Az élesztő Mn-SOD gént [A. P. G. M. van Loon és munkatársai, Gene, 26, 261-272 (1983)], mint BamHi fragmentumot a PL41 vektor (10. ábra) tartalmazza, amelynek teljes szekvenciáját publikálták [C. A. M. Marres és munkatársai, Eur. J. Biochem., 147, 153-161 (1985)]. BamHI-vel való emésztés után [2 pg plazmidot 5 egység enzimmel emésztünk 150 mmol NaCl, 6 mmol trisz-HCl (pH = 7,9), 6 mmol MgCl2 és 100 pg/pl BSA tartalmú oldatban 2 órán át 36 ’C-on] a kapott 2045 bp hosszú BamHi fragmentumot, amely a gént tartalmazza, a szokott módon gélelektroforézissel tisztítjuk és izoláljuk, majd BamHi fragmentumként a V0 vektorba (Hindin hasítási hely nélkül pUC18) szubklónozzuk.
A V0 vektort úgy állítjuk elő, hogy 1 pg pUC18-at HindlII-mal hasítunk (Core-pufferben), a linearizált fragmentumot a gélből ismert módszerek szerint izoláljuk, a túllógó végeket 2 egység Klenow-polimerázzal (ligáz-puffer+0,2 mmol dNTP) betöltjük, majd 20 perc szobahőmérsékleten való tartás után 2 egység T4DNS-ligáz hozzáadásával egy éjszakán át 14 ’C-on religáljuk.
A keletkezett SODY1 plazmidot (10. ábra) Nrulvel hasítjuk (1 pg plazmidot 5 egység Nrul-vel -Nrulpufferben - emésztünk 2 órán át 36 ’C-on), gélelektroforézissel tisztítjuk, s egy Hindlll linker (CAAGCTTG) beépítésével a SODY3 plazmiddá (10. ábra) alakítjuk át. Végül a Hindin hasítási helyre beépítjük az URA3 gént (a pURA3-ból származik): 4 pg SODY-at 20 egység Hindffl-mal emésztünk 2 órán át 37 ’C-on Core-pufferben, majd defoszforizáljuk a következőképpen: 4Ó pl emésztett anyaghoz hozzáadunk 40 pl vizet, 10 pl 1 mmol-os EDTA-t, 5 μΐ 1 mol-os trisz· HCl-t (pH = 9,5), 1 pl 100 mmol-os spermidint és 1 pl borjú-bél-alkalikus foszfatázt (CIAP, 1 mg/ml H2O), majd 36 ’C-on inkubáljuk. Azután 15 perc múlva további 1 pl CIAP-ot adunk az elegyhez és további 15 percig inkubáljuk. A defoszforilált vektort ugyancsak agaróz-elektroforézissel tisztítjuk. A pURA3 plazmid 2 pg-ját Hindffl-mal hasítjuk (lásd fent). Egy
1,2 kb hosszú fragmentumot, amely az URA3 élesztő gént tartalmazza, szintén izolálunk és az előkészített vektorba építjük be (lásd fent).
Az így keletkezett SOD7 és SODY8 plazmidok az URA3 gént az élesztő Mn-SOD génen belül tartalmazzák és az URA génnek az Mn-SOD génhez viszonyított orientációja szerint különböznek egymástól (10. ábra).
HU 212 920 Β
Az URA3 génnek az Mn-SOD génhez viszonyított irányítottsága megállapítható, mivel az URA3 gén egy aszimmetrikus PstI helyet tartalmaz.
A SODY7 és SODY8 plazmiddal a DB Y 747 törzsben (genotípus: a, leu2, his3, tropl, ura3; Yeast Genetic Stock Centre Berkeley, USA) gén-áthelyezését („gentransplacement”) hajtunk végre (Methods in Enzimology, 101, 202-211 és 211-228). A DBY 747 törzset a SODY7-ből és SODY8-ból származó BamHI fragmentummal transzformáljuk [J. D. Beggs, Natúré, 275,104 (1978)] úgy, hogy 20 gg SODY7-et, illetve SODY8-at 50 egység BamHI-vel hasítunk 200 gl BamHI-pufferben [150 mmol NaCl, 6 mmol trisz-HCl (pH = 7,9), 6 mmol MgCl2, 1 mmol DTT] és az egész emésztett elegyet (anélkül, hogy a pUC részt leválasztanánk) fenollal extraháljuk [T. Manniatis és munkatársai, Molecular Cloning, 458. és ezt követő oldalak (1982)] és alkoholos kicsapással koncentráljuk 20 gl 3 mol-os nátrium-acetát (pH = 5,5) és 500 gl etanol hozzáadásával. A DNS-t 10 gl vízben vesszük fel és közvetlenül használjuk az élesztő transzformálásához.
A transzformált sejteket uracil prototrófia alapján szelektáljuk.
Néhány egyedi transzformált sejtet egy éjszakán át 5 ml SC-URA táptalajban, 28 C-on tenyésztjük. A sejteket centrifugálással gyűjtjük össze, van Loon és munkatársai szerint [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 3820-3824 (1986)] tárjuk fel és Mn-SOD tartalomra vizsgáljuk. Egyfelől az Mn-SOD, másfelől a Cu/Zn-SOD gélelektroforetikus kimutatására a már meglévő munkamódszereket alkalmaztuk [Ch. Beauchamp és I. Fridovich, Anal. Biochem., 44, 276-287 (1971); Η. P. Misra és I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys., 183, 511— 515 (1977); B. J. Davis, Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 404-427 (1964)]. A legjobb módszernek a proteinek elválasztása bizonyult és az ezt követő negatív festés nitrokék-tetrazoliummal [B. J. Davis (1964); Ch. Beauchamp és I. Fridovich (1971)]. Az érzékenység növelése dianizidin festéssel érhető el [Η. P. Misra és I. Fridovich (1977)]. A további vizsgálathoz egy spektrofotometriás assay-t [K. Hyland és munkatársai, Anal. Biochem., 135, 280-287 (1983)] vezettünk be, ahol az O2“ gyököt előállító rendszer az alkalikus dimetilszulfoxid és mint „scavenger” a citokróm C szerepel.
Az Mn-SOD és Cu/Zn-SOD megkülönböztetése KCN hozzáadásával történik [lásd fent; M. YsebaertVanneste és W. H. Vanneste, Anal. Biochem., 107, 86-95 (1980)]. A SODY7/2, SODY7/6, SODY7/8 és SODY7/10 törzseknek nem volt Mn-SOD aktivitásuk.
8. példa
Expressziós vektorok előállítása
A 6b példában leírt expressziós kazettákat, mint BglII-HindlII fragmentumokat a HSOD7/1, illetve HSOD7/2 plazmidokból kihasítjuk (2-2 gg plazmidDNS Core-pufferben, 2 órán át 37 ’C-on 10-10 egység enzimmel). Ugyancsak HindHI-BamHI-vel hasítjuk az YEpl3, pJDB207 és pEAS102 1-1 gg-ját (az emésztés feltételeit lásd fent).
A vektor DNS-ek 50 gg-ját és 200 gg inszertumot ligáz-pufferben (a leírtak szerint) 1 egység ligázzal egy éjszakán át 14 ’C-on reagáltatjuk, majd az E. coli HB101 sejtek transzformálására használjuk. A következő táblázat tartalmazza a megfelelő plazmidok jelölését.
1. táblázat
Expressziós vektorok elnevezése
Vektor Inszertum
HSOD7/1 HSOD7/2
YEpl3 pWS550A pWS371A
pJDB207 pWS490A pWS372A
pEAS102 pWS491A pWS373A
9. példa
Transzformálásra alkalmas élesztő törzs (WS305g) előállítása
Egy olyan élesztő törzset állítottunk elő, amelyben a SODY7/2 élesztő törzsnél leírt genetikai markerek mellett még egy mutáció fordul elő (pep4 mutáció) egy lizoszomális fő proteázban (amely hatásánál fogva más lizoszomális proteázokat képes aktiválni), s így az élesztő sejtnek feltárásakor kevesebb proteáz válik szabaddá [E. W. Jones és munkatársai, Genetics, 102, 665-677 (1982)].
Ezenkívül az Mn-SOD deftciens SODY/2 törzset a proteáz-deficiens WS20-25 törzzsel (a, léu2, his3, trpl, ura3, pep4) kereszteztük és az ebből keletkező haploidokat genetikus markereikre megvizsgáltuk [F. Sherman és munkatársai, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, N. Y. (1972)].
A kapott WS3O-5g törzs (leu2, his3, trpl, pep4, sodl) igen jól transzformálható és teljesíti a kívánt feltételeket.
Az ilyenfajta keresztezéseket más jól ismert és hozzáférhető élesztő törzsekkel is, például a 20 B-12 törzzsel is (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley), hasonlóan jó eredménnyel lehet elvégezni.
10. példa
Élesztő transzformálás és kifejeződés élesztőben
A SODY7/2 élesztő törzset a pWS371A, pWS372A, illetve a pWS373Aplazmidokkal transzformáljuk [J. D. Beggs, Natúré, 275 104-106 (1978)] es a transzformált sejteket expressziójukra megvizsgáljuk.
Ennek érdekében a transzformált sejtekből előtenyészetet készítünk SC-leu folyékony táptalajban (azonos az SC-URA táptalajjal, de kiegészítésül 2,4 g uracilt tartalmaz és leucint nem). A sejteket egy éjszakán át 28 ’C-on 300 ford/perc mellett rázatjuk. Az előtenyészet 100 gl-ével 4 ml YP5%D táptalajt (1% Bacto élesztő kivonat, 2% Bacto pepton, 5% glükóz) oltunk be és egy éjszakán át tenyésztjük (mint az előtenyészetet). A sejteket learatjuk és feltárjuk a 7. példában már leírtak szerint. Az aktivitás-gélre 1 ml tenyészetnek megfelelő nyers sejt-levet viszünk fel. Az aktivitás vizsgálatát a 7. példában leírt módon végezzük el.
A WS3O-5g élesztő törzset (leu2, his3, trpl, pep4, sodl) a pWS550A, pWS490A, illetve a pWS491A
HU 212 920 Β plazmidokkal transzformáljuk. Az előtenyészet és a tenyészet előállítása, valamint a hMn-SOD aktivitás mérése az előbbiekben leírt módon történik.
A pWS490A és pWS491A plazmidok kifejeződését a WS3O-5g élesztő törzsben all. ábrán mutatjuk be.
Az élesztőben az ugyanezen körülmények között mért Mn-SOD mennyisége körülbelül 0,5 mg/liter tenyészet volt.
77. példa
Élesztő vezér-DNS szekvenciát tartalmazó linker szintetizálása
Hat különböző oligonukleotidot állítunk elő, mint a 3b példában leírtuk, 381A DNS-szintetizátor (Applied Biosystem) segítségével. Az EBI 656, EBI 636, EBI 643, EBI 646, EBI 660 és EBI 638 oligonukleotidok szekvenciája és hossza a következő:
EBI 656:
5' TCGAGTATACAATGTTCGCGAAA-
ACAGCTGCAGCTAATTTA 3' EBI 636: 41 bp
5' EBI 643: 44 bp
5' EBI 646: 48 bp
5' EBI 660: 48 bp
5' EBI 638: 39 bp
5' 36 bp
Az EBI 636, EBI 643, EBI 646 és EBI 660 oligonukleotidokat az ezt követő ligázreakcióhoz 5' végükön az alábbi feltételek mellett foszforiláljuk:
1. sz. reakcióelegy μΐ EBI 636 (= 100 pmol) μΐ lOxlinker kináz puffer μΐ 10 mmol ATP μΐ T4 polinukleotid kináz (Biolabs) 10 egység/μΙ μΐ víz
2. sz. reakcióelegy azonos az 1. sz. reakcióeleggyel, de μΐ (100 pmol) EBI 660 tartalmú
3. sz. reakcióelegy μΐ (= 100 pmol) EBI 643 μΐ (= 100 pmol) EBI 646 μΐ lOxlinker kináz-puffer μΐ 100 mmol-os ATP μΐ T4 polinukleotid kináz (10 egység) μΐ víz lOxlinker kináz-puffer: 0,7 mól trisz-HCl (pH = 7,6) 0,1 mól MgCl2,
0,05 mól DTT
A reakciót 30 percig 37 °C-on folytatjuk le. Ezután a T4 polinukleotid kinázt 100 ’C-on való hevítéssel inaktiváljuk.
Az EBI 656 és EBI 638 oligonukleotidokat, amelyeknek a kész 128 bp hosszú DNS inszertum 5' végét kell képezniük (ΧΙ-es képlet) nem foszforiláljuk, hogy ez ezután következő ligáz reakciónál a multimer DNS inszertumok keletkezését megakadályozzuk.
Hogy az alábbi vázlat szerinti egyes oligonukleotidokból
5’ EBI656 P EBI643 P EBI660 3'
3' EBI 636 P EBI646 P EBI638 5' a kívánt linker összetételét megkaphassuk, a gyűrűbe zárási reakcióhoz (a komplementer oligonukleotidoknak egymással való hibridizációja) az 1. sz. reakcióelegyhez 2 μΐ (= 100 pmol) EBI656-ot és a 2. sz. reakcióelegyhez 2 μΐ (= 100 pmol) EBI 638-at adunk A 3. sz. reakcióelegy már két komplementer oligonuklotidot (EBI 643 és EBI 646) tartalmaz.
Mindhárom reakcióelegyet 2 percig 100 ’C-on hevítjük, majd vízfürdőn lassan lehűtjük.
Az 1., 2. és 3. sz. reakciókban keletkezett rövid, kettős szálú DNS fragmentumokat az alábbiak szerint kapcsoljuk egymáshoz:
μΐ 1. sz. reakcióelegy (EBI 636+EBI656) μΐ 2. sz. reakcióelegy (EBI 660+EBI638) μΐ 3. sz. reakcióelegy (EBI 643+EBI646) μΐ 10 mmol-os ATP μΐ DNS ligáz (Boehringer Mannheim, 70/egység/pl)
A reakciót 15 óra hosszat 4 ’C-on végezzük.
A DNS-ek nagyság szerinti elválasztása 1%-os agaróz gélben történik és a kívánt, XI. képiét szerinti, 128 bp hosszú DNS fragmentumot a gélből eluáljuk [G. M. Dretzen és munkatársai, Anal. Biochem., 112, 295-298 (1981)].
72. példa
Vezér-DNS szekvenciát tartalmazó expressziós vektorok szerkesztése
A HSOD6 plazmidot a szokásos módon Xhol-vel és Xbal-vel (5-5 egység/μΙ DNS) Core-pufferben duplán emésztjük és a 128 bp hosszú linker (Xhol-mitokondriális vezérszekvencia-Xbal) - ismert módszerek szerint - ide beépítjük (pEO22-A). A mitokondriális élesztő-vezérDNS szekvenciával most már ellátott hMn-SOD gént XhoI-EcoRI-vel (5-5 egységéig DNS) Core-pufferben duplán megemésztjük és XhoI-EcoRI fragmentumként a pKHl-be (6b példa, 8. ábra) beépítjük (pEO23-A).
Az így elkészített expressziós kazettát a 8. példa szerint, mint Bglfl/HindlII fragmentumot (a plazmidot duplán emésztettük Core-pufferben, majd izoláltuk a kihasított expressziós kazettát) a megfelelően előkészített YEpl3, pHDB207 és pEAS102 élesztő transzformációs vektorokba, a BamHI és HindlII hasítási helyekre építjük be. A 2. táblázat tartalmazza a kapott megfelelő plazmidokat.
2. táblázat
Az expressziós plazmidok elnevezése
Vektor Plazmid neve
pJDB207 pEO24-AB
pEAS102 pEO25-AC
YEpl3 pEO26-AD
HU 212 920 Β
13. példa
Élesztő transzformálás és kifejeződés élesztőben
A WS3O-5g élesztő törzset (9. példa) a táblázatban szereplő két plazmiddal transzformáljuk és a transzformáit sejteket expressziójukra vizsgáljuk (10. példa).
A transzformált WS3O-5g élesztő törzs fermentálásához elótenyészetet készítünk mágneses keverővei, levegőztetéssel. Az előtenyésztést OD546 = 0,01 optikai sűrűségig végezzük, a következő összetételű táptalajban: 6,7 g/1 élesztő-nitrogén bázisú aminosavak (Difco), 10 g/1 glükóz, 0,16 g/1 arginin, 0,26 g/1 lizin, 0,06 g/1 triptofán, 0,08 g/1 metionin, 0,03 g/1 cisztein, 0,10 g/1 hisztidin, 0,16 g/1 tirozin, 0,17 g/1 fenilalanin, 0,16 g/1 treonin, 0,18 g/1 izoleucin, 0,21 g/1 valin, 0,40 g/1 glutaminsav, 0,21 g/1 glicin, 0,02 g/1 cisztin, 0,15 g/1 alanin, 0,20 g/1 aszparaginsav, 0,20 g/1 prolin, 0,15 g/1 szerin, 0,10 g/1 aszparagin, 0,20 g/1 glutamin, 25 mg/1 adenin, 50 mg/1 uracil.
Ezután a tenyésztést 20 literes fermentorban (CHEMAP) végezzük, a következő összetételű táptalajban: 8,0 g/1 (NH4)2SO4, 2,56 g/1 (NH4)2HPO4, 1,16 g/1 KCI, 0,60 g/1 MgSO4-7H2O, 0,56 g/1 CaCl2-2H2O, 0,04 mg/1 biotin, 80 mg/1 m-inozit, 40 mg/1 Ca-pantotenát, 8 mg/1 tiamin, 2 mg/1 piridoxin, 3,1 mg/1 CuSO4-5H2O, mg/1 FeCl3-6H2O, 12 mg/l ZnSO4-7H2O, 14 mg/1 MnSO4H2O, 5 mg/1 H3BO3, 1 mg/1 KJ, 2 mg/1 Na2MoO4-2H2O, 1 g/1 élesztő kivonat, 0,2 g/1 uracil, 0,1 g/1 adenin, 0,5 g/1 citromsav, 15 g/1 glutaminsav, 0,2 g/1 hisztidin, 0,5 g/1 triptofán, 100 g/1 glükóz.
Inokolumként az előtenyészet 5%-át használtuk, s a literes fermentorban való tenyésztést keverés (1000 ford/perc), levegőztetés (0,5 térf/térf/perc) és konstans pH (5,0) mellett, 28 C-on végeztük.
Amikor a glükóz tartalom 5 g/l-re csökken, újból 50 g/1 glükózt adunk a tenyészethez és tovább fermentálunk, amíg a glükóz tartalom 10 g/l-re nem csökken (ez 45 óra múlva következik be). Afermentlevet lehűtjük, lecentrifugáljuk és a bidmasszát lefagyasztjuk. A biomassza kitermelés nedves súlyban 18 g sejt/liter volt.
A pEO24-AB, pEO25-AC és pEO26-AD plazmidok expresszióját a WS3O-5g élesztő törzsben a 12. ábrán mutatjuk be.
14. példa
Élesztő mitokondrium preparálás
Annak megállapítására, hogy vajon az élesztő mitokondriális vezérszekvenciának a hMn-SOD gén elé való bevezetése azt eredményezi, hogy a protein a mitokondriumokba kerül-e, élesztő mitokondriumokat preparáltunk és a mitokondriumban, valamint a citoplazmában mértük az Mn-SOD aktivitást.
Az élesztő mitokondriumokat G. Daum és munkatársai módszerének [J. Bioi. Chem., 257, 13 02813 033 (1982)] módosított változatával preparáltuk.
A transzformált sejtek elótenyészetét - SC-leu folyékony táptalajban (10. példa) - rázással (300 ford/perc) egy éjszakán át 28 C-on inkubálva készítjük el. Ebből 25 ml-rel beoltunk 225 ml YPD-táptalajt és mint az előtenyészetet, egy éjszakán át tenyésztjük. A sejteket általában 5-7 optikai sűrűségnél - 600 nm-en mérve - centrifugálással (Sorval; 6500 ford/perc; 5 perc) aratjuk le. A sejteket egyszer mossuk 100 ml vízzel. A sejt-üledéket 1 mól mannit és 20 mmol KPj (KH2PO4-K2HPO4) tartalmú oldatban (pH = 7,4) szuszpendáljuk (300 mg sejthez 1 ml), majd 1 mg/ml Zymolase-t (Miles, molsúly: 500) adunk a szuszpenzióhoz. A szferoplasztok 2 órán át tartó lassú rázás (50 ford/perc) mellett, 28 C-on alakulnak ki. A szferoplasztokat centrifugálással gyűjtjük össze (3000 ford/perc; 5 perc; Hereaus Christ asztali centrifuga), majd egyszer mossuk 1 mól mannit, 20 mmol KPj (pH = 7,4) és 1 mmol PMSF (fenil-metil-szulfonil-fluorid) tartalmú oldatban. A felülúszót elöntjük és 1-2 üledék mennyiségét üveggyöngyökhöz (átmérő: 0,1 mm) adjuk.
A sejteket 1 perces keveréssel tárjuk fel és 2,5 ml 0,65 mól mannitot, 1 mmol EDTA-t és ’ mmol PMSFet tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. Az egész sejteket és a sejt törmeléket lecentrifugáljuk (200 ford/perc; 5 perc; Hereaus Christ asztali centrifuga). Végül a mitokondriumokat a centrifugált (Sorval J—21; 12 000 ford/perc; 10 perc) felülúszóból kapjuk meg. A felülúszó tartalmazza a citoplazmát, amelyet megőrizünk, hogy a későbbiek folyamán hMn-SOD aktivitását megmérjük. A vöröses-barna mitokondrium üledéket a fenti pufferben mossuk (a fehér citoplazma eredetű alkotórészeket kimossuk) és a mitokondriumokat
2,5 ml azonos pufferben szuszpendáljuk. A szennyezéseket egy további centrifugálással (Hereaus Christ, asztali centrifuga, 4000 ford/perc; 5 perc) távolítjuk el és a mitokondriumokat egy második centrifugálással (Sorval J—21; 12 000 ford/perc; 10 perc) ülepítjük le. A mitokondriumokat üveggyöngyökkel tárjuk fel, ugyanúgy, ahogyan az élesztő sejtek feltárását végezzük [van Loon és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 38203824 (1986)], majd aktivitás-gélben Mn-SOD tartalmára vizsgáljuk (13. ábra).
15. példa
A találmány szerinti hMn-SOD tisztítása
A rekombináns hMn-SOD izolálása a WS305g/pEO24-AB (élesztő vektor pJDB207) törzsből történt, számos lépésben.
1. lépés sejtfeltárás
A sejt masszát (13. példa) grammonként (nedves súly) 10 ml desztillált vízzel mossuk és 16 000 g mellett 15 percig centrifugáljuk. A csapadékot Na-K-foszfát-pufferben (50 mmol; pH = 7,0), 1:3 arányban (súly/térf) reszuszpendáljuk. Ezután a sejteket egy folytonos működésű sejt-malomban (Dynomil KDL; Bachofer, Basel, Svájc; tartály: 0,6 liter; vízhűtés), üveggolyók (átm: 0,1 mm) segítségével, 61/óra átfolyási sebességgel táljuk fel. A sejt kivonatot 15 percig centrifugáljuk (16 000 g; 4 °C) és a csapadékot eldobjuk.
2. lépés: kicsapás polietilén-iminnel
Az 1. lépésben kapott felülúszóhoz 5%-os (súly/térf) vizes polietilén-imin (Polyetylenimin, Serva, Heidelberg) oldatot adunk keverés közben, 0,5% végkoncentrációig.
HU 212 920 Β
Ezután még 30 percig tovább kevertetjük, majd az üledéket 16 000 g mellett (30 perc) lecentrifugáljuk.
3. lépés: hőkicsapás
A 2. lépésben kapott felülúszót acélpoharakban, keverés közben 80 ’C-os vízfürdőben 60 ’C-ra melegítjük fel, majd jégfürdőben újra szobahőmérsékletre hűtjük le. A kicsapódott proteineket centrifugálással (10 000 g; 10 perc; 4 ’C) távolítjuk el.
4. lépés: kicsapás ammónium-szulfáttal
A 3. lépésben kapott felülúszót 20%-ra telítjük szilárd ammónium-szulfáttal és a csapadékot centrifugálással (10 000 g; 15 perc; 4 ’C) távolítjuk el. Ezután ammónium-szulfát koncentrációt 90%-ra emeljük és a csapadékot centrifugálással (10 000 g; 15 perc; 4 ’C) gyűjtjük össze. Az üledéket kevés MES-puferben (morfolino-etánszulfonát-puffer; 50 mmol; pH = 6,0;
2-morfolino-etán-szulfonsav; Sigma cég, Deisenhofen) vesszük fel és egy éjszakán át ugyanezen pufferrel szemben dializáljuk.
5. lépés: kationcserélő kromatográfia
Egy Mono S oszlopot (Mono S HR 5/5, Pharmacia, Svédország) 5 oszlop-térfogat MES-pufferrel kiegyensúlyozunk. Az oszlopra rávisszük a 4. lépésben kapott anyagot, majd a közvetlen proteineket ötszörös oszloptérfogatnyi MES-pufferrel kimossuk. Ezután a találmány szerinti hMn-SOD-ot 0,50 mmol NaCl - MES pufferben - lineáris gradiensével eluáljuk (20 oszlop térfogat). Az Mn-SOD aktivitást kifejtő frakciókat egyesítjük és Na-K-foszfát-pufferrel (5 mmol, pH = 7,0) szemben dializáljuk.
Az élesztő saját SÓD enzimjét (Mn-SOD, Cu/ZnSOD) ebben a tisztítási lépésben elkülöníthetjük. A 14. ábrán egy elúciós diagramot mutatunk be.
6. lépés: adszorpciós kromatografálás hidroxilapatiton
Foszfát-pufferrel (5 mmol, pH = 7,0) kiegyensúlyozott hidroxil-apatit oszlopra (HA-Ultrogel, IBF, Villeneuve-la-Garenne, Franciaország) visszük fel az 5. lépésben kapott dializátumot és a találmány szerinti hMn-SOD-ot 5-300 mmol Na-K-foszfát-puffer (pH7,0) lineáris gradiensével eluáljuk (20 oszlop-térfogat).
Az egyes tisztítási lépésekben a hMn-SOD-nál elért tisztasági fokot redukáló SDS-poliakrilamidgél elektroforézissel követjük nyomon (15. ábra).
16. példa
A találmány szerinti hMn-SOD vizsgálata
A 15. példa szerint tisztított találmány szerinti hMn-SOD-ot gélpermeációs-HPLC-vel, reverz fázisú HPLC-vel N-terminális szekvenálással, SDS-gél-elektrorézissel, natív gél-elektroforézissel és izoelektromos fokuszálással analizáltuk, majd a természetes hMnSOD enzimmel hasonlítottuk össze.
a) Gélpermeációs HPLC
Oszlop: Waters Protein pák I 125, 2x(7,8x300 mm).
Részecskeátmérő: 10 pm
Kioldás: 0,5 mól Na2SO4, 0,02 mól NaH2PO4 (pH = 7,0) 0,04% Tween 20, 25% propilénglikol Átfolyás: 0,5 ml/perc Detektálás: UV-abszorpció, 214 nm.
A természetre, illetve találmány szerinti hMnSOD-nál a fő-csúcs 70 000, illetve 76 000 molekulasúlyú SOD-tetramert mutat. A meghatározás 4 standard protein segítségével történt. A módszer kísérleti hibáin belüli értékeket kaptunk, amelyek tehát identikusnak tekinthetők.
b) Reverz fázisú HPLC
Oszlop: Bakerbord WP C, 4,6x250 mm, részecskeátmérő: 5 pm
Pórusátmérő: 30 nm
Akioldó: 0,1% trifluor-ecetsav vízben oldva B kioldó: 0,1% trifluor-ecetsav acetonitrilben oldva Gradiens: 20% B 2 percig, 20-60% B 24 percig, 68%
B 10 percig, 68-20% Β 1 percig Átfolyás: 1,0 ml/perc
Detektálás: UV-abszorpció, 214 nm és 280 nm.
A természetes és a találmány szerinti hMn-SOD egyaránt 21 perces (20,7, illetve 20,9 perc) retenciós időt mutat.
c) N-terminális szekvenálás
Egy reverz-fázisú HPLC-vel sótalanított találmány szerinti hMn-SOD csúcsot szekvenáltunk. A szekvenálást az Applied Biosystems cég gázfázisos szekvenátorával (470A modell) végeztük, a O2RPTH programmal. A kiindulási mennyiség 0,8 nmol-ját a 20. aminosavig szekvenáltuk. A várt szekvenciával (a természetes proteinből és cDNS-ből) 100%-os egyezést kaptunk. A mitokondriumokba való átvitelhez szükséges szekvencia teljesen lehasadt.
d) SDS-gélelektroforézis Elválasztó gél: 15%-os akrilamid Stacking gél: 4%-os akrilamid
Festés: ezüst-festés B. R. Oakley és munkatársai szerint [Anal. Biochem., 105, 361-363 (1980)]
Gélméretek: 0,75 mm (8x10 cm)
Futtatási feltételek: 60 perc, 150 V.
Az SDS-elektroforézist teljes mértékben U. K. Lámmli [Natúré, 227, 680-685 (1970) [eredeti előírása szerint végeztük. A hMn-SOD minta előkészítésekor a mintákhoz DTT-t adtunk redukáló szerként és felfőztük. Az SDS-gélben a hMn-SOD főként mint monomer - körülbelül 25 000 molekulasúllyal - jelentkezett. A teljes reprodukció után a mintegy 90 000 molekulasúlyú tetramer is kimutatható. A 15. ábrán egy 15%-os SDS-poliakrilamid gél látható, ezüst-festés után.
e) Natív gélelektroforézis
Elválasztó gél: 7,5%-os natív PAGE B. J. Davis szerint [Ann. Ν. Y. Acad. Sci., 121,404-427 (1964)] Stacking-gél: 2%-os akrilamid+ szacharóz Gél méretek: 0,75 mm (8x10 cm)
HU 212 920 Β
Futtatási feltételek: 75 perc, 150 V (konst)
Festés: Coomassie Blue-val, ismert módszerek szerint, az aktivitás festést o-dianizidinnel végeztük Η. P.
Misra és I. Fridovich szerint [Arch. Biochem.
Biophys., 183,511-515(1977)].
A hidroxilapatit kromatográfia után kapott találmány szerinti hMn-SOD elektroforézis után akár Coomassie Blue festéssel (a hMn-SOD felvitt mennyisége: 0,3 μg), akár o-dianizidinnel való aktivitás-festéssel (a hMn-SOD felvitt mennyisége: 75, 30, illetve 15 μg) egységes és ugyanabban a pozícióban lévő sávot adott.
f) Izoelektromos fokuszálás pH-tartomány: 3,5-9,5
Gél-lemezek: LKB, PAGplate [1 mmx (9x10 cm)] Elektród oldatok: 1 mol-os foszforsav (anód) mol-os nátronlúg (katód)
Hűtés hőmérséklete: 7 °C A minta mennyisége: 4,0, illetve 6,5 pg Futtatási feltételek: pre-fokuszálás 500 Vh fokuszálás összesen 3000 Vh Festés: Coomassie Blue, aktivitás-festés o-dianizidinnel.
Az izoelektromos pont (pl) 8,15 volt.

Claims (34)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás humán mangán-szuperoxid-diszmutáz (hMn-SOD) enzimatikus, biokémiai és immunológiai tulajdonságaival rendelkező enzim teljes vagy részleges genetikai információját kódoló DNS-szekvenciák előállítására, azzal jellemezve, hogy
    i) emberi szövetből, előnyösen placenta-szövetből izolált mRNS-ből poli(A)+RNS-t preparálunk;
    ii) erről kétszálas cDNS-t szintetizálunk, és ebből egy génbankot hozunk létre;
    iii) a cDNS génbankból a hMn-SOD aminosavszekvenciájából levezetett DNS-szonda segítségével egy hMn-SOD-ot kódoló DNS-t - teljes vagy részszekvenciát - azonosítunk és izolálunk. (Elsőbbsége; 1987.03. 14.)
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érett hMn-SOD aminosavszekvenciájából levezetett DNS-szonda segítségével egy éretlen hMnSOD-t kódoló DNS-t azonosítunk és izolálunk. (Elsőbbsége: 1987.03. 14.)
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hMn-SOD genetikai információját és egy amino-terminális vezérszekvenciát kódoló szakaszt tartalmazó DNS-t izolálunk. (Elsőbbsége: 1987.03. 14.)
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hMn-SOD genetikai információját tartalmazó szakasz előtt közvetlenül elhelyezkedő mitokondriális vezérszekvenciát kódoló szakaszt tartalmazó DNS-t izolálunk. (Elsőbbsége: 1987. 12. 24.)
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy élesztőből származó mitokondriális vezérszekvenciát kódoló szakaszt tartalmazó DNS-t izolálunk. (Elsőbbsége: 1987. 12. 24.)
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egymás után sorrendben egy transzlációs start szignált (ATG), egy mitokondriális vezérszekvenciát, a hMn-SOD-t kódoló szakaszt és legalább egy stop kodont tartalmazó DNS-t izolálunk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az la, lb, II., Illa, Va, Vb, Via, Vlb, VHa, Vllb, VIII., IX., X. és XI. képletekkel leírható nukleotid-szekvenciákat tartalmazó DNS-t izolálunk. (Elsőbbsége: 1987. 12.24.)
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti izolált DNS-szekvenciával szigorúan meghatározott körülmények között hibridizáló, természetes eredetű, félszintetikus vagy szintetikus, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát vagy ennek degenerált változatát izoláljuk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  9. 9. Eljárás replikálódó vektorok előállítására, amelyek legalább egy szelekciós markerral és/vagy a replikációs kezdőponton és más lényeges géntartományokon kívül, adott esetben egy szelekciós markeron belül legalább egy restrikciós enzimre jellemző felismerő hellyel rendelkeznek, azzal jellemezve, hogy egy 1-8. igénypontok bármelyike szerint előállított DNS-szakaszt egy szelekciós markert és megfelelő szabályozó szekvenciákat tartalmazó vektorba ligálunk. (Elsőbbsége: 1987.03. 14.)
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szakasz egy virális eredetű vektorba, előnyösen egy lambda-fágba, legelőnyösebben XgtlO fágba vagy Ml3-ba ligáljuk. (Elsőbbsége: 1987.03. 14.)
  11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szakaszt egy plazmid vektorba ligáljuk. (Elsőbbsége: 1987.03. 14.)
  12. 12. Eljárás hMn-SOD kifejezésére alkalmas expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 9-11. igénypontok bármelyike szerint előállított replikációs vektorból kihasított DNS-szakaszt tartalmazó fragmentumból a helyes leolvasási irányban haladva egy promoterrel és egy terminátorral és adott esetben egyéb szabályozó szakasszal kiegészítve expressziós kazettát szerkesztünk, és ezt egy expressziós vektorba inszertáljuk. (Elsőbbsége: 1987.03. 14.)
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a teljes ADHI promotert, egy megrövidített ADHIk promotert, terminátorként pedig az ADHII terminátort használjuk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  14. 14. Eljárás humán mangán-szuperoxid-diszmutáz (hMn-SOD) enzimatikus, biokémiai és immunológiai tulajdonságaival rendelkező enzimet termelő transzformáit gazdasejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy gazdasejtet a hMn-SOD-t kódoló genetikai információkat tartalmazó expressziós vektorral transzformálunk, és a tárgyi körben megadott enzimet termelő transzformált gazdasejteket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez26
    HU 212 920 Β ve, hogy a gazdasejtet a 9—11. igénypontok bármelyike szerint előállított replikálódó vektorral transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet a 12-14. igénypontok bármelyike szerint előállított expressziós plazmiddal transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  17. 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokariótákat, különösen az Enteriobacteriaceae, Bacillaceae, apatogén Micrococcaceae család tagjait, előnyösen E. colit-t, főként E. coli C600-at és E. coli JMlOl-et transzformálunk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  18. 18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy eukariótákat, előnyösen élesztőket transzformálunk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  19. 19. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlős állatokból származó sejteket transzformálunk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  20. 20. Eljárás humán mangán-szuperoxid-diszmutáz (hMn-SOD) enzimatikus, biokémiai és immunológiai tulajdonságaival rendelkező enzim előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 14-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított transzformált gazdasejtet tenyésztünk, és korrekt formában termelt hMnSOD-t a mitokondriumokból izoláljuk, majd tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy 15. igénypont szerint előállított transzformált sejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  22. 22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy 16. igénypont szerint előállított transzformáit sejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987.03. 14.)
  23. 23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy 17. igénypont szerint előállított transzformáit sejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987.03. 14.)
  24. 24. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy 18. igénypont szerint előállított transzformált élesztősejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  25. 25. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az la, Ib, Illa, Illb, Va, Vb, Via, VIb, VHa, Vllb, VIII vagy IX képletekkel leírható DNS-szekvenciák valamelyikével szigorú körülmények között hidridizáló, hMn-SOD-t kódoló, szintetikus, félszintetikus vagy természetes eredetű DNS-t tartalmazó transzformáit sejtet tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1987.03. 14.)
  26. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az la, Ib, Π, Illa, Illb, Va, Vb, Via, VIb, Vlla, Vllb, VIII vagy IX. képletekkel leírtható DNS-szekvenciák valamelyikét vagy ennek egy részét egy degenerált változatát tartalmazó, hMn-SOD-t kódoló DNS-t tartalmazó transzformált sejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  27. 27. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a IVa vagy IVb képletnek megfelelő aminosavszekvenciájú hMn—SOD-t izoláljuk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  28. 28. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glükozilációtól mentes polipeptidet izolálunk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  29. 29. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az N-terminális első aminosav előtt metionint tartalmazó polipeptidet izolálunk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
  30. 30. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy élesztőspecifikus vezérszekvenciával ellátott DNS-t tartalmazó transzformált sejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987.03. 14.)
  31. 31. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy mitokondriális vezérszekvenciával ellátott DNS-t tartalmazó transzformák sejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987. 12. 24.)
  32. 32. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy élesztővektorral transzformált sejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987. 12. 24.)
  33. 33. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy élesztőspecifikus mitokondriális vezérszekvenciával ellátott DNS-t tartalmazó transzformált sejtet tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1987. 12. 24.)
  34. 34. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 20-33. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított humán mangán-szuperoxid-diszmutáz aktivitású polipeptidet gyógyászatilag elfogadható inért hordozó, hígító és/vagy egyéb más segédanyagokkal összekeverve ismert módon gyógyszerkészítménnyé alakítunk. (Elsőbbsége: 1987. 03. 14.)
HU881204A 1987-03-14 1988-03-14 Process for the preparation of human superoxide dismotase HU212920B (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19873708306 DE3708306A1 (de) 1987-03-14 1987-03-14 Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)
DE19873717695 DE3717695A1 (de) 1987-05-26 1987-05-26 Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)
DE19873722884 DE3722884A1 (de) 1987-07-10 1987-07-10 Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)
DE19873744038 DE3744038A1 (de) 1987-12-24 1987-12-24 Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT46739A HUT46739A (en) 1988-11-28
HU212920B true HU212920B (en) 1996-12-30

Family

ID=27433860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU881204A HU212920B (en) 1987-03-14 1988-03-14 Process for the preparation of human superoxide dismotase

Country Status (18)

Country Link
US (3) US5240847A (hu)
EP (2) EP0676472A1 (hu)
JP (1) JP2860100B2 (hu)
KR (1) KR880011339A (hu)
AT (1) ATE132902T1 (hu)
AU (1) AU618526B2 (hu)
CA (1) CA1341387C (hu)
DE (1) DE3854872D1 (hu)
DK (1) DK133388A (hu)
ES (1) ES2083357T3 (hu)
FI (1) FI881185A (hu)
GR (1) GR3019091T3 (hu)
HU (1) HU212920B (hu)
IE (2) IE71940B1 (hu)
IL (1) IL85701A0 (hu)
MX (1) MX9203619A (hu)
NO (1) NO176884C (hu)
PT (1) PT86955B (hu)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5714362A (en) * 1983-04-29 1998-02-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Human superoxide dismutase cDNA
US6610520B1 (en) * 1985-11-22 2003-08-26 Bio-Technology General Corp. Gene encoding human manganese superoxide dismutase and recombinant polypeptide encoded thereby
US6326003B1 (en) 1986-10-14 2001-12-04 Chiron Corporation Manganese superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms
EP0676472A1 (de) * 1987-03-14 1995-10-11 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Humane Mangan-Superoxiddismutase (hMn-SOD)
DE3854678T2 (de) * 1987-03-27 1996-06-13 Bio Technology General Corp Menschliches Mangansuperoxiddismutase und Behandlungsverfahren.
JP2500543B2 (ja) * 1991-05-24 1996-05-29 住友化学工業株式会社 キメラｐ４５０産生菌株
EP0587055B1 (de) * 1992-09-09 2001-12-05 Bio-Technology General Corporation Verwendung von Mangan-Superoxiddismutase (Mn-SOD) zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen in niedriger Dosierung
US5843641A (en) * 1993-02-26 1998-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods for the daignosis, of familial amyotrophic lateral sclerosis
WO1994021283A1 (en) * 1993-03-24 1994-09-29 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Method for inhibiting pulmonary oxygen toxicity using manganese superoxide dismutase
US6887856B1 (en) * 1993-10-15 2005-05-03 University Of Pittsburgh Protection from ionizing irradiation or chemotherapeutic drug damage by in vivo gene therapy
US6127356A (en) * 1993-10-15 2000-10-03 Duke University Oxidant scavengers
US5994339A (en) * 1993-10-15 1999-11-30 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Oxidant scavengers
US5747026A (en) * 1993-10-15 1998-05-05 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Antioxidants
US5506133A (en) * 1994-04-11 1996-04-09 Human Genome Sciences, Inc. Superoxide dismutase-4
JP2517894B2 (ja) * 1994-08-12 1996-07-24 住友化学工業株式会社 フェレドキシン及びフェレドキシン還元酵素を同時に発現させるキメラｐ４５０産生菌株
AU3758695A (en) * 1994-09-20 1996-04-09 Duke University Oxidoreductase activity of manganic porphyrins
US5834248A (en) * 1995-02-10 1998-11-10 Millennium Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods using rchd534, a gene uregulated by shear stress
US6359194B1 (en) 1995-02-10 2002-03-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment and diagnosis of cardiovascular disease
EP0904277A4 (en) * 1996-02-16 2003-01-22 Millennium Pharm Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AND DIAGNOSING CARDIOVASCULAR DISEASES
US6099823A (en) * 1996-02-16 2000-08-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment and diagnosis of cardiovascular disease
US6171856B1 (en) 1997-07-30 2001-01-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity
WO1999006059A2 (en) * 1997-07-30 1999-02-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity
JP2001521939A (ja) 1997-11-03 2001-11-13 デューク・ユニバーシティー 置換されたポルフィリン類
WO1999043697A1 (en) * 1998-02-25 1999-09-02 The Board Of Regents Of The University And Community College System Of Nevada On Behalf Of The University Of Nevada-Reno Manganese superoxide dismutase exon 3-deleted isoforms and nucleic acid molecules encoding the isoforms
US6737506B1 (en) * 1998-02-25 2004-05-18 Paul Anziano Manganese superoxide dismutase exon 3-deleted isoforms and nucleic acid molecules encoding the isoforms
JP4648542B2 (ja) 1998-04-24 2011-03-09 デューク ユニバーシティ 置換ポルフィリン
US6190658B1 (en) 1998-05-08 2001-02-20 Webb-Waring Institute For Biomedical Research Genetically modified manganese superoxide dismutase for treating oxidative damage
US6221848B1 (en) 1998-05-11 2001-04-24 University Of Pittsburgh Protection of the esophagus from chemotherapeutic or irradiation damage by gene therapy
GB9824282D0 (en) * 1998-11-05 1998-12-30 Microbiological Research Agenc Delivery of superoxide dismutase to neuronal cells
WO2000043395A1 (en) 1999-01-25 2000-07-27 National Jewish Medical And Research Center Substituted porphyrins
US6265172B1 (en) * 1999-02-08 2001-07-24 University Of Kentucky Diagnostic test and therapy for manganese superoxide dismutate (mNsod) associated diseases
FR2806911B1 (fr) * 2000-03-28 2003-01-10 Univ Rene Descartes Utilisation de mimetiques de la sod dans le traitement d'insuffisances hepatocellulaires
CN1322825A (zh) * 2000-05-09 2001-11-21 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——超氧化物歧化酶11和编码这种多肽的多核苷酸
ES2330728T3 (es) 2001-01-19 2009-12-15 National Jewish Health Medicamento para proteccion en radioterapia.
AU2002312194B8 (en) 2001-06-01 2008-05-15 Aeolus Sciences, Inc. Oxidant scavengers for treatment of diabetes or use in transplantation or induction of immune tolerance
WO2002100293A2 (en) * 2001-06-13 2002-12-19 Webb-Waring Institute For Biomedical Research A diagnostic and prognostic method for evaluating ocular inflammation and oxidative stress and the treatment of the same
JP2006501163A (ja) 2002-06-07 2006-01-12 デューク・ユニバーシティー 置換ポルフィリン
US8258105B2 (en) * 2003-10-07 2012-09-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides optimized for kidney targeting
US20050191653A1 (en) * 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
WO2006017559A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-16 University Of Iowa Research Foundation Methods of inhibiting manganese-containing superoxide dismutase 2 (mnsod)
US9546312B2 (en) * 2007-08-31 2017-01-17 Hayes & Associates Endotherm systems and methods utilizing carbohydrate in non-oxidizing environment
RU2506083C2 (ru) 2008-05-23 2014-02-10 Нэшнл Джуиш Хелт Способ лечения поражений, ассоциированных с воздействием алкилирующих веществ

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE813485A (fr) * 1973-04-16 1974-10-09 Superoxyde dismutases et leur application comme inhibiteurs d'oxydation
US4029819A (en) * 1973-04-16 1977-06-14 Etablissement Public Det: Agence Nationale De Valorisation De La Recherche Anver Superoxide dismutase and its application as an oxidation inhibitor
FR2225443B1 (hu) * 1973-04-16 1976-11-12 Anvar
FR2240277B2 (hu) * 1973-08-10 1976-12-17 Anvar
JPS5816685A (ja) * 1981-07-22 1983-01-31 Takeda Chem Ind Ltd 固定化酵素，その製造法および製剤
US5196335A (en) * 1983-04-29 1993-03-23 Yeda Research And Development Co., Ltd. Human superoxide dismutase cDNA
EP0138111B1 (en) * 1983-10-03 1991-11-21 Chiron Corporation Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms
US5066591A (en) * 1983-10-03 1991-11-19 Chiron Corporation Polypeptides of human copper/zinc superoxide dimutase
US4751180A (en) * 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
DK402785D0 (da) * 1985-09-03 1985-09-03 Syn Tek Ab Fremgangsmaade til fremstilling af et enzym
IE59498B1 (en) * 1985-11-22 1994-03-09 Bio Technology General Corp Human manganese superoxide dismutase analog, plasmid for its expression and method of recovering it in enzymatically active form
US5246847A (en) * 1985-11-22 1993-09-21 Bio-Technology General Corp. Polypeptide analogs of human manganese superoxide dismutase and compositions and complexes thereof
US5270195A (en) * 1985-11-22 1993-12-14 Bio-Technology General Corp. Plasmids for expression and method of producing a human manganese superoxide dimutase analog
EP0676472A1 (de) * 1987-03-14 1995-10-11 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Humane Mangan-Superoxiddismutase (hMn-SOD)
US5260204A (en) * 1987-03-14 1993-11-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Human manganese superoxide dismutase (hMn-SOD)
DE3854678T2 (de) * 1987-03-27 1996-06-13 Bio Technology General Corp Menschliches Mangansuperoxiddismutase und Behandlungsverfahren.
US5223538A (en) * 1987-03-31 1993-06-29 Duke University Superoxide dismutase mimic
NZ225760A (en) * 1987-08-14 1991-02-26 Bio Technology General Corp Expression plasmids containing the deo promoter and bacterial hosts containing these plasmids
JPH0283398A (ja) * 1988-09-21 1990-03-23 Ube Ind Ltd 合成ペプチド、それを用いたヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼの測定キットおよび測定法
EP0462836A3 (en) * 1990-06-20 1992-08-26 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Recombinant vector plasmid capable of expressing human manganese superoxide dismutase, and process of producing this enzyme

Also Published As

Publication number Publication date
EP0282899A2 (de) 1988-09-21
DE3854872D1 (de) 1996-02-22
EP0282899B1 (de) 1996-01-10
NO881089D0 (no) 1988-03-11
US5589371A (en) 1996-12-31
NO176884C (no) 1995-06-14
PT86955B (pt) 1992-06-30
DK133388A (da) 1988-09-15
NO176884B (no) 1995-03-06
ES2083357T3 (es) 1996-04-16
CA1341387C (en) 2002-09-03
FI881185A0 (fi) 1988-03-14
EP0282899A3 (en) 1989-11-15
IE71940B1 (en) 1997-03-12
PT86955A (pt) 1988-04-01
NO881089L (no) 1988-09-15
EP0676472A1 (de) 1995-10-11
JP2860100B2 (ja) 1999-02-24
MX9203619A (es) 1992-09-01
IL85701A0 (en) 1988-08-31
KR880011339A (ko) 1988-10-27
DK133388D0 (da) 1988-03-11
US5240847A (en) 1993-08-31
FI881185A (fi) 1988-09-15
HUT46739A (en) 1988-11-28
AU1302788A (en) 1988-09-15
JPS6463383A (en) 1989-03-09
IE960190L (en) 1988-09-14
AU618526B2 (en) 1992-01-02
ATE132902T1 (de) 1996-01-15
GR3019091T3 (en) 1996-05-31
IE880717L (en) 1988-09-14
US5436162A (en) 1995-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU212920B (en) Process for the preparation of human superoxide dismotase
Pompon et al. [6] Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments
Lübben et al. An archaebacterial terminal oxidase combines core structures of two mitochondrial respiratory complexes.
CA2050601C (en) Production in bacteria and yeast of hemoglobin and analogues thereof
JP2592444B2 (ja) ポリペプチドの製造法
EP0804587B1 (en) Mutant luciferases
HU207533B (en) Process for clowning superoxide dismutase, expressing them in microorganisma and improving enzyme-yeald of microorganismus cultures
FI88407B (fi) Dna-molekyl, transformerade jaestceller och foerfarande foer framstaellning av human-lysozym
KR20000060322A (ko) 슈도모나스 플루오레슨스 유래의 외래단백질 분비촉진유전자
US5260204A (en) Human manganese superoxide dismutase (hMn-SOD)
US5066591A (en) Polypeptides of human copper/zinc superoxide dimutase
Chen et al. Expression, purification, and characterization of a recombinant 5-lipoxygenase from potato tuber
WO1994013790A1 (fr) Utilisation d'une sequence d'adn codant pour une proteine susceptible de degrader l'acide oxalique a titre de gene de selection
US5710033A (en) Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms
US5252476A (en) Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms
US5629189A (en) DNA encoding human cytoplasmic Cu/Zn superoxide dismutase
NZ223869A (en) Genetically engineered production of human manganese superoxide dismutase
Seaton et al. Expression of human ferredoxin in Saccharomyces cerevisiae: mitochondrial import of the protein and assembly of the [2Fe-2S] center
Schrank An in vitro mutagenesis study of a metalloenzyme gene
JPH07507439A (ja) 酵母での蛋白質発現用人工プロモーター
US5691139A (en) Genetic modification of superoxide dismutase to increase expression in microorganisms
EP0706572B1 (en) Microbial transformants of hansenula that express glycolate oxydase and catalase
SU1741610A3 (ru) Способ получени человеческой М @ О @ -дисмутазы
DE3744038A1 (de) Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)
DE3722884A1 (de) Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: BIO-TECHNOLOGY GENERAL CORP., US

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee