JPH0283398A

JPH0283398A - 合成ペプチド、それを用いたヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼの測定キットおよび測定法

Info

Publication number: JPH0283398A
Application number: JP63234824A
Authority: JP
Inventors: Taizo Uda; 泰三宇田; Akira Takeyasu; 武安　明; Tetsuo Kawaguchi; 哲男川口; Yukio Nakajima; 中島　由紀生
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1988-09-21
Filing date: 1988-09-21
Publication date: 1990-03-23
Also published as: US5115097A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、合成ペプチド、それを用いたヒ）Ｍｎ−スー
パーオキシドジスムターゼ（以下、ヒトＭ　ｎ　−Ｓ　
ＯＤと略記する。）の測定キットおよび測定法に関する
ものである。

〔従来の技術〕

ヒトＭｎ−ＳＯＤは、ミトコンドリアのマトリックス部
分に存在する酵素（１ドメインの分子量が約２５，００
０であり、そのダイマーまたはテトラマーからなると考
えられている。）であり、次に示すように、毒性酸素の
主要な分子種であるスーパーオキシドアニオンラジカル
（Ｏｓ　）を不均化する反応を触媒する。

ところで、肝疾患における血清中のヒトＭｎ−ＳＯＤ濃
度の測定には、ポリクローナル抗体を用いた検討によっ
て、高い診断的意義が存在すると考えられている（医薬
ジャーナル：稲垣、訳本、１立、１．１９８４年。第５
回腫瘍マーカー研究会；飯塚、新井ら、１９８５年）。

また、呑口らも、ヤギに免疫して作製したポリクローナ
ル抗体を用いた免疫学的な方法で、ヒ）Ｍｎ−ＳＯＤ濃
度が肺癌で高いことを示しており〔ジャーナル・オプ・
ナショナル・カンサー・インスチチュート（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅ）　、７童、５．１９８４年〕、血清中の
ヒトＭｎ−３゜Ｄ濃度の測定の重要性が指摘されている
。

従って、血清中のヒトＭｎ−８ＯＤ濃度を測定するため
には、従来のヒトＭ　ｎ　−Ｓ　ＯＤに対するポリクロ
ーナル抗体の使用にかわって、ヒトＭｎ５ＯＤに対する
高い特異的な反応性を有する酵素標識モノクローナル抗
体、そのモノクローナル抗体に対してヒトＭｎ−ＳＯＤ
と競争的に反応するペプチド、およびヒト血清を用いて
、安価で、簡単で、かつ高感度でヒ）Ｍｎ−ＳＯＤを測
定できる必要があるが、これまでに、このような測定方
法は認められていない。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、合成ペプチド、それを用いたヒトＭｎ
−ＳＯＤの測定キットおよび測定法を提供することであ
る。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定キットを用いてヒト
Ｍｎ−ＳＯＤを測定することによって、ヒ）Ｍｎ−ＳＯ
Ｄを容易に、かつ高感度に測定できることを見出し、本
発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、（１）次式；％式％（Ｘは０〜１０個のアミノ酸残基を表す、）で示される
アミノ酸配列からなる単量体の合成ペプチド（２）前記の合成ペプチドからなる２童体の合成ペプチ
ド（３）ヒトＭｎ−５ＯＤの測定法で用いるものであって
、（ａ）前記の単量体および／または２童体の合成ペプチ
ドおよび（ｂ）前記の単量体および／または２童体の合成ペプチ
ドに対して非常に高い特異的な免疫反応性を有する酵素
標識したモノクローナル抗体を必須とすることを特徴と
するヒトＭｎ−ＳＯＤの測定キット（４）前記の単量体および／または２童体の合成ペプチ
ドを担持体に担持させた後、測定試料中のヒトＭｎ−Ｓ
ＯＤと請求項２に記載の酵素標識したモノクローナル抗
体とを、その担持された合成ペプチドに対して競争的に
反応させることによって、担持体に担持された合成ペプ
チド、°酵素標識したモノクローナル抗体からなる酵素
標識複合体を作製することを特徴とするヒトＭｎ−ＳＯ
Ｄの測定法に関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のヒトＭｎ−ＳＯＤの測定法に用いるヒトＭｎ−
ＳＯＤの測定キットは、ヒトＭｎ−３゜Ｄのカルボキシ
ル末端（Ｃ末端）側のアミノ酸配列からなる単量体およ
び／またはその２童体の合成ペプチド（以下、単量体お
よびその２童体の合成ペプチドを総称して、ｒ合成ペプ
チドｊと略記する。）、およびそのｒ合成ペプチド通に
対して非常に高い特異的な免疫反応性を有する酵素標識
モノクローナル抗体を必須とするものである。なお、酵
素で標識されていないモノクローナル抗体を用いた場合
には、このモノクローナル抗体と特異的に反応すること
ができる酵素標識抗体を使用することによって、本発明
と同様の目的を達成することができる。そして、この酵
素標識抗体における抗体は、モノクローナル抗体と特異
的に反応することができる限り特に限定されない。

本発明のヒトＭｎ−ＳＯＤの測定法においては、これら
の試薬の他に、担持体、洗浄液、ブロッキング液、ヒト
Ｍｎ−ＳＯＤの標準曲線を作成するための既知濃度のヒ
）Ｍｎ−ＳＯＤ溶液（以下、ｒ標準ヒ）Ｍｎ　　ＳＯＤ
溶液」と略記する。）、酵素標識複合体の酵素に対応す
る基質溶液（以下、「基質溶液ｊと略記する。）なども
必要とするので、これらを前もってヒトＭ　ｎ　−Ｓ　
ＯＤの測定キットに組み込んでおいてもよいし、測定前
に準備してもよい。そして、担持体を前もってヒトＭｎ
−ＳＯＤの測定キットに組み込む場合には、ｒ合成ペプ
チドｊを担持体に前もって担持させておくこともできる
。

本発明における酵素標識複合体は、ｒ合成ペプチド」を
担持体に担持させた後、その担持されたｒ合成ペプチド
」または測定試料中のヒトＭｎ−ＳＯＤを、酵素標識し
た該モノクローナル抗体と競争的に反応させることによ
って形成された「担持体に担持されたｒ合成ペプチド」
、酵素標識しり該モノクローナル抗体からなるもの」で
ある。

ナオ、酵素で標識されていないモノクローナル抗体を用
いた場合には、このモノクローナル抗体と特異的に反応
することができる酵素標識抗体を使用することによって
、本発明と同様の目的を達成することができる。そして
、このような場合に形成される酵素標識複合体は、「担
持体に担持されたｒ合成ペプチド」、モノクローナル抗
体、酵素標識抗体からなるもの」である。

本発明の単量体の合成ペプチドは、液相法または固相法
などの通常の方法によって合成することができるが、好
ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体にヒ
トＭｎ−ＳＯＤのＣ末端（カルボキシル末端）側のペプ
チド断片に対応するアミノ酸をＣ末端側から順次ペプチ
ド結合によって結合して行くことによって合成するのが
良い。

一方、その２量体の合成ペプチドは、前記のようにして
得られた単量体の合成ペプチド溶液をそのまま中性また
はアルカリ性状態に保持するか、酸化状態にすることに
よって合成することができる。

そして、このようにして得られた？合成ペプチドｊは、
逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーＣ
ＨＰＬＣ）などを用いた通常の方法で精製することがで
き、アミノ酸分析によってそのアミノ酸配列を確認する
ことができる。

本発明の単量体の合成ペプチドのアミノ酸残基数は、本
発明のヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定法において、担持体に担
持された単量体の合成ペプチドと酵素標識した該モノク
ローナル抗体とが反応して酵素標識複合体を形成できる
限り特に限定されないが、好ましくは１１残基以上であ
るのがよく、そのアミノ酸残基数としては、１１〜２１
残基が好ましい。

そのような単量体の合成ペプチドとしては、ヒトＭ　ｎ
　−Ｓ　ＯＤのＣ末端から１１〜２１アミノ酸残基部分
に相当するもの、例えば、Ａｓ　ｎ−Ｖａ　１−Ｔｈ　ｒ　−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｒ　
ｇ　−Ｔｙ　ｒ−Ｍｅ　ｔ−Ａｌ　ａ−Ｃｙ　５−Ｌｙ
　ｓ　−Ｌｙｓ。

１１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｃｙｌｕ−ＡｓｎＶａ　１−
Ｔｈ　ｒ　−Ｇ　１　ｕ−Ａｒ　ｇ−Ｔｙ　ｒＭｅｔ−
Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ。

Ｌｙｓ−Ａ１１ｅ−Ｔｒ５ｎ−Ｔｒｈｒ−ＧＩＡｌ　ａ　−Ｃｙａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｔｐ−Ａｓｎ　−Ｖａｌ−１ｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ　−Ｖａｕ−Ａｒ　ｇ−Ｔｙ　ｒ−Ｍｅｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ。

ｅ− などを挙げることができる。

また、単量体の合成ペプチドのアミノ酸配列は、ヒトＭ
　ｎ　−Ｓ　ＯＤのＣ末端から１１〜２０残基を含むペ
プチドと抗原抗体反応を示すモノクローナル抗体を用い
る限り、他のアミノ酸残基と入れ代わっていてもよい。

本発明におけるｒ合成ペプチド１としては、前記の各種
単量体の合成ペプチドまたはそれらの２量体を単独また
は組み合わせて用いることができる。

本発明におけるモノクローナル抗体としては、ｒ合成ペ
プチド」と特異的な抗原抗体反応を示す限り特に制限さ
れないが、ｒ合成ペプチド１を特異的に認識できるモノ
クローナル抗体、例えば、免疫マウスのリンパ球とマウ
スミエローマ細胞とを細胞融合することによって作製さ
れたハイプリドーマ株であるＰＧＩＩ株（微工研条寄第
１６０８号）が産生したもの（ＰＧＩＩ）を用いるのが
好ましい。そして、そのようなモノクローナル抗体の純
度としては、硫安などを用いた塩析やイオン交換クロマ
トグラフィーなどによって高純度に精製したものを用い
るのが好ましい。また、必要に応じて、このモノクロー
ナル抗体には、アジ化ナトリウム、エチル水銀チオサリ
チル酸ナトリウムなどのような蛋白質の防腐剤を必要量
添加することもできる。

本発明のヒトＭｎ−ＳＯＤの測定キットにおける酵素標
識モノクローナル抗体の作製において、モノクローナル
抗体を標識する酵素としては、ペルオキシダーゼ、カタ
ラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、
アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、β
−ガラクトシダーゼなどの酸化還元系の酵素、およびア
ルカリフォスファターゼなどのリン酸加水分解酵素など
から選ばれた少なくとも一種以上の酵素を挙げることが
できる。

本発明における酵素標識モノクローナル抗体の作製は、
前記のモノクローナル抗体と前記の１種以上の酵素をグ
ルタルアルデヒドを用いた１段階法〔イムノケミストリ
イ　（Ｉｍｍｕ　ｎ　ｏ　ｃ　ｈ　ｅｍｉｓｔｏｒｙ）
、６．４３　（１９６９））または２段階法〔イムノケ
ミストリイ（Ｔｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ）、８
．１１７５　（１９７１）〕、過沃素酸酸化法〔メソッ
ド・イン・エンジモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　
　Ｅｎｇｙｍｏｒｏｇ）’）、３７，１３３　（１９７
５））やマレイミド法〔ジャーナル・オブ・ザ・バイオ
ケミストリイ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ）、７８，２３５　（１
９７５）〕などで結合して作成することができるが、後
の２つのうちのいずれかの方法で行うのが好ましい。

これをそのまま酵素標識モノクローナル抗体として用い
ることもできるが、ヒトＭｎ−ＳＯＤの測定感度をさら
に高めるためには５ｅｐｈａｄｅｘ、５ｅｐｈａｃｒｙ
ｌなどを用いたゲル濾過でこれを精製して得たものを酵
素標識モノクローナル抗体として用いた方が好ましい。

そのようなゲル濾過で得られた酵素標識モノクローナル
抗体画分は、そのまま使用（蛋白質濃度が低ければ透析
膜などによって所定の濃度まで濃縮し、蛋白質濃度が高
ければ所定の濃度まで希釈する）することもできるが、
中性付近のｐＨに調整した緩衝液〔例えば、リン酸緩衝
液（ＰＢＳ）またはトリス−塩酸緩衝液など］などで透
析し、凍結乾燥または除菌フィルターで濾過して保存し
、必要に応じて酵素標識モノクローナル抗体溶液として
０．０１〜１００　ｕ　ｇ／ｍｊｌ！で、好ましくは０
゜１〜１０μｇ　／　ｍ　ｌの蛋白質濃度で使用するの
がよい。また、必要に応じて、酵素標識モノクローナル
抗体には、この酵素活性の測定で支障がない程度に、ア
ジ化ナトリウム、エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム
などのような蛋白質の防腐剤を必要量添加することもで
きる。

本発明のヒトＭｎ−ＳＯＤの検量線の作成のために用い
る既知量のヒトＭｎ−ＳＯＤ（ｆ標準ヒトＭｎ−ＳＯＤ
溶液Ｊ）は、〔ジャーナル・オブ・ナショナル・キャン
サー・インスチチュート（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　
　、７Ｉ、５、（１９８４）：ｌに準じて、熱処理、硫
安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、等
電点クロマトグラフィーなどで精製して得ることができ
る。

本発明のヒトＭｎ−ＳＯＤの測定で用いる担持体は、ヒ
トＭｎ−ＳＯＤの測定キットにおけるｒ合成ペプチドｊ
を担持するための担持体として必要なものである。

本発明で「合成ペプチド」を担持するために用いること
ができる担持体の形状としては、例えば、イムノアッセ
イ用のプレート、チューブ、ビーズ、膜などを挙げるこ
とができ、その材質としては、例えば、ポリエチレン、
ポリスチレン、ポリプロピレン、ニトロセルロース、ガ
ラスなどを挙げることができる。

本発明でヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定で用いる洗浄液は、担
持体に一定量の「合成ペプチド」を担持した後にその担
持体に担持されなかったものを洗浄して除去したり、担
持体に担持されたｒ合成ペプチド」と酵素標識した該モ
ノクローナル抗体とを反応させた後にその未反応物質を
洗浄して除去するために必要である。

このような目的に用いる洗浄液としては、例えば、水、
反応時のｐＨに調整した緩衝液（リン酸緩衝液、トリス
−塩酸緩衝液などの緩衝液）、前記の緩衝液にＴｗｅｅ
ｎ２０．Ｔｗｅｅｎ６０などの界面活性剤を０〜３容量
％含む）などを挙げることができるが、好ましくは前記
の界面活性剤を０．０２〜０．８容量％含む反応時のｐ
Ｈに調整した緩衝液を用いるのがよい。

本発明のヒトＭ　ｎ　−Ｓ　ＯＤの測定で用いるブロッ
キング液は、ヒトＭｎ−ＳＯＤ、酵素標識した該モノク
ローナル抗体が担持体表面に非特異的に結合するのを防
ぐのに必要であり、また、測定試料の希釈籠を調製する
ときの溶媒としても用いることができる。

このような目的に用いるブロッキング液は、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、陣笠
具ヘモシアニン（ＫＬＨ）、γ−グロブリンなどの高分
子蛋白質、各種動物の血清などを前記の反応時のｐＨに
調整した洗浄液に溶解することによって調製することが
できるが、これらの高分子蛋白質の濃度は、０．１〜１
０ｉｖｔ／ｖ０１％、好ましくは、０．１〜２ｗｔ／ｖ
ｏ１％とするのがよく、各種動物の血清を用いて調製す
る場合には、前記の洗浄液を用いて、１〜５０　ｖｏｌ
／ｖｏ１％、好ましくは、１０〜２０　ｖｏｌ／ｖｏ１
％とするのがよい。

また、必要に応じて、ブロッキング液には、アジ化ナト
リウム、エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム、などの
ような蛋白質の防腐剤を必要量添加することもできる。

本発明のヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定で用いる測定試料とし
ては、ヒトの尿、血液、血清などのヒト体液をそのまま
あるいはヒトＭ　ｎ　−Ｓ　ＯＤを測定できる範囲内に
前記の洗浄液でこれらの測定試料を適当に希釈したもの
を用いることができる。

本発明のヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定で用いる酵素の基質溶
液（ｒ基質溶液Ｊ）としては、酵素標識酸モノクローナ
ル抗体における該モノクローナル抗体の標識に用いた酵
素が反応する基質がＨ，０２である場合には、その酵素
反応によって生じた物質によって呈色する０−フェニレ
ンジアミン、２．２°−アミノビス（３エチルベンゾチ
アゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）などの物質を含
む緩衝液を用いることができ、基質がパラニトロフェニ
ルフォスフエイトである場合には、ジェタノールアミン
などの物質を含む緩衝液を用いることができる。

以上のようにして担持体、洗浄液、ブロッキング液、ｒ
標準ヒトＭｎ−ＳＯＤ溶液」、「基質溶液」を準備し、
ヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定キットであるｒ合成ペプチド」
、酵素で標識した該モノクローナル抗体を用いて、以下
のような方法で各測定の操作段階を経ることによって測
定試料中のヒトＭｎ−ＳＯＤを測定することができる。

■担持体に一定量のｒ合成ペプチド」を担持する段階一定容量のｒ合成ペプチドｊ溶液（濃度は、例えば、０
．０１〜１μｇ　／　ｍ　４２でもよいが、好ましくは
１μｇ　／　ｍ　１以上がよい。）を、担持体の−定の
表面積に一定時間接触させる。「合成ペプチドＪ溶液の
溶媒としては、ＰＢＳ　（リン酸緩衝液）などのような
適当な緩衝液、水などを用いることができる。反応の温
度は、特に限定されないが、好ましくは３０〜４３°Ｃ
がよく、さらに好ましくは３５〜４０°Ｃがよく、例え
ば、３７°Ｃの時には１５時間以上接触させるのがよく
、２０時間接触させれば十分である。

■担持体に担持されていな、い？合成ペプチド」を除去
する段階担持体にｒ合成ペプチドｊ溶液を一定時間接触反応させ
た後、ｒ合成ペプチド」溶液を除去し、さらに担持体に
担持されずに残留したＶ合成ペプチドｊを洗浄液で数回
洗浄することによって除去する。

■測定試料、酵素標識した該モノクローナル抗体が担持
体のｒ合成ペプチド」を担持していない表面に非特異的
に結合するのを防ぐ段階前記■のｒ合成ペプチド」を担持した担持体に一定容量
のブロッキング液を一定時間接触させる。

接触時の温度は、特に限定されないが、好ましくは２〜
４０°Ｃがよい。

■担持体に担持された？合成ペプチド」に対してヒトＭ
ｎ−ＳＯＤと酵素標識した該モノクローナル抗体とを競
争的に反応させることによって、担持体に担持された「
合成ペプチド」、酵素標識した該モノクローナル抗体か
らなる酵素標識複合体を得る段階前記■の担持体に担持された？合成ペプチドｊに対して
、一定容量の測定試料中のヒトＭｎ−ＳＯＤと酵素標識
した該モノクローナル抗体とを競争的に反応させて酵素
標識複合体を得るには、定容量の測定試料と酵素標識し
た該モノクローナル抗体とからなる混合液とを前記■の
担持体に担持されたｒ合成ペプチド」と一定時間接触反
応させ、その未反応溶液を除去した後、「合成ペプチド
１を介して担持体に担持されずに残留した未反応溶液を
洗浄液で数回洗浄して除去することによって、達成する
ことができる。

なお、酵素で標識していない該モノクローナル抗体を用
いて酵素標識複合体を得るには、一定容量の測定試料と
該モノクローナル抗体とを前記■の担持体に担持された
ｒ合成ペプチド」と一定時間競争的に接触反応させ、そ
の未反応溶液を除去洗浄した後、一定容量の該モノクロ
ーナル抗体と特異的に反応する酵素標識抗体を「合成ペ
プチド」を介して担持体に担持された一定容量の該モノ
クローナル抗体と一定時間反応させ、その未反応溶液を
除去洗浄した後、担持体に担持されずに残留した未反応
溶液を洗浄液で数回洗浄して除去することによって、達
成することができる。

■担持体に担持された「合成ペプチド」と酵素標識した
該モノクローナル抗体との未反応液を除去する段階前記■の未反応溶液を洗浄液で数回洗浄することによっ
て除去する。

■酵素標識複合体として担持体に担持された酵素標識し
た該モノクローナル抗体の酵素と１基質溶液１とを反応
させる段階ここで用いる「基質溶液」としては、酵素標識した該モ
ノクローナル抗体における該モノクローナル抗体の標識
に用いた酵素と対応する基質およびその酵素反応が起き
ることによって呈色する物質を含むものを用いる。

その一定容量のｒ基質溶液ｊを、酵素標識複合体として
担持体に担持された酵素標識した該モノクローナル抗体
と一定時間反応させるが、好ましくはＨ２ＳＯ、などの
酸、ＮａＯＨなどのアルカリまたは酵素阻害剤などを用
いて酵素反応を停止した方がよい。反応温度は、そのと
きに用いる酵素の至適温度範囲内であれば特に問題はな
いが、好ましくは２０〜３５°Ｃがよい。

■酵素反応後の反応液の吸光度を測定する段階前記の酵
素反応後の反応液の呈色が最大吸光度を示すときの波長
でその反応液の吸光度を測定する。

以上のようにして、測定試料のかわりに？標準ヒトＭｎ
−ＳＯＤ？容液ｊを用いた結果から、標準曲線を作成し
、測定試料中のヒ！−Ｍ　ｎ　−Ｓ　ＯＤ量を迅速、か
つ高感度に測定することができる。

〔実施例〕

以下、本発明を参考例および実施例によって具体的に説
明する。

なお、これらの実施例は、本発明を例示するためのもの
であって、本発明の範囲を限定するものではない。

参考例１〔抗体の生産と精製］？合成ペプチドｊに対して特異性が高いモノクローナル
抗体を産生ずるＰＧＩＩ株（微工研条寄第１６０８号）
を培養し、リン酸緩衝液で浮遊させたその１０７個の培
養細胞を、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♂、８週齢
、２週間前にプリスタンを０．５ｍ！腹腔内投与）の腹
腔内に投与して行った。マウス体重の顕著な増加は１週
目頃から認められ、１〜３週目に適宜腹水をとりだした
。こうして得られたモノクロ二ナル抗体の抗体価は、１
０６〜１　０８　　で　あ　っ　プこ。

得られた腹水からのモノクローナル抗体の精製は、次の
ようにして行った。

前記の腹水をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）で透析
し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム
に流した。素通り画分を５０％飽和硫安で塩析し、得ら
れた沈澱をリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解し、同緩
衝液に対して透析した。

このようにして得られたヒトＭ　ｎ　−Ｓ　ＯＤに対す
るモノクローナル抗体の純度は、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルを用いたスラブゲル電気泳動で、いずれの抗体
も高純度であることがわかった。

以上のようにして得た該合成ペプチドに対する精製モノ
クローナル抗体（ＰＧＩＩ）を用いたヒｔ−Ｍ　ｎ　−
Ｓ　ＯＤの測定法（Ｅｉ、ＩＳＡ法）によって、高感度
で、かつ迅速なヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定が可能となった
。

実施例１［１５個のアミノ酸残基からなる単量体の合成ペプチド
の合成］Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ’−２−クロロベンジ
ルオキシカルボニルリジン樹脂７１６ｍｇ（リジン含量
；０．７０ｍｍｏｆ／ｇ、スチレン１％−ジビニルベン
ゼン共重合体）を出発原料とし、ペプチド自動合成装置
（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いた固相法
によって１５個のアミノ酸残基からなる合成ペプチドを
合成した。

先ず、Ｉ　ｌ　ｅ−Ａｓ　ｎ−Ｔｒ　ｐ−Ｇ　ｌ　ｕ　
−Ａｓｎ−Ｖａ　ｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−ＡｒｇＴｙｒ−
Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ（Ｃ端）の
１５個のアミノ酸配列からなるペプチドを、常法通り、
そのＣ端（カルボキシル末端）のＬｙｓ側からアミノ酸
を順次１個づつ前記の出発原料と反応させることによっ
て、１．５ｇの保護したペプチド結合樹脂を得た（なお
、このとき用いたアミノ酸は、Ｔｈｒではベンジル基で
、Ｇｌｕではベンジルエステルで、Ｌｙｓでは２クロロ
ベンジルオキシカルボニル基で、Ｔｒｐはホルミル基で
、Ａｒｇはメシチレン−２−スルホニル基で、Ｍｅｔは
メチルスルホキシド基で、Ｃｙｓは５−ｐ−メトキシベ
ンジル基で保護した。

）。

この保護したペプチド結合樹脂１ｇを、２００μｌのエ
タンジチオール、８００μ！のｍ−クレゾール、３ｍｌ
のジメチルスルフィド、Ｉｍｆｉのトリフルオロ酢酸（
以下、ＴＦＡと略記する。）からなる混合液中に懸濁し
て一５°Ｃで３時間攪拌した。その後、この樹脂を５ｍ
Ｅの無水エーテルで数回洗浄し、減圧下で乾燥し、これ
を１ｍｊ２のチオアニソール、５００μ！のエタンジチ
オールからなる混合液中に懸濁して室温で１０分間１児
押した。この溶液に、水冷下で１０ｍｌのトリフルオロ
酢酸を加えてさらに１０分間攪拌した。次に２、この混
合液にトリフルオロメタンスルホン酸を１ｍ！滴下し、
室温で３０分間攪拌した後、その生成物を３０ｍ！の無
水エーテルによって沈澱させて分離し、無水エーテルに
よって洗浄し、減圧下で乾燥した。

このようにして得られた粗生成の合成ペプチド１００ｍ
ｇを２ｍｊ２の蒸留水に溶解し、濾過して得られた濾液
をＡＱＵＡＰＯＲＥ　　ＲＰ−３００（１０Ｘ１００ｍ
ｍ）（アプライド・バイオシステムズ社製）にのせ、（
Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水および（Ｂ）０．１％Ｔ
ＦＡを含有した７０％Ｃ１（３ＣＮからなる溶媒を用い
て、６０分間で（Ａ）が９５＃０％のリニアグラデイエ
ンドモードで？容出した。

３つの大きなピークを示した溶出画分のうちの最初の溶
出画分を分取し、濃縮後凍結乾燥することによって単量
体の合成ペプチド（ａ）１１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌ
ｕ−ＡｓｎＶａ　１−Ｔｈ　ｒ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｒ　ｇ
−Ｔｙ　ｒ　−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓを１５ｍｇ得た。

実施例２〔実施例１の合成ペプチドを用いた２量体の合成ペプチ
ドの合成〕２量体の合成ペプチド（ｂ）は、実施例１の単量体の合
成ペプチド（ａ）５ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，４）（以下、ＰＢＳと略記する。

）に溶解して酸化状態にすることによって、４ｍｇ得る
ことができた。

実施例３〔２１個のアミノ酸残基からなる単量体の合成ペプチド
の合成〕先ず、Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｖａ
　１−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａ、５ｎ−Ｖ
ａ　Ｉ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａ
ｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　（Ｃ端）の２１個のア
ミノ酸配列からなるペプチドを、そのＣ端のＬｙｓ側か
ら実施例１と同様にしてアミノ酸を順次１個づつ連結さ
せることによって合成し、凍結乾燥することによって、
単量体の合成ペプチド（ｃ）Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｔｒｐ−ＡｓｎＶａｌ−１１
ｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａ　１−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｕ−ＡｒｇＴｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｓを２０ｍｇ得た。

実施例４〔実施例３の合成ペプチドを用いた２量体の合成ペプチ
ドの合成〕２量体の合成ペプチド（ｄ）は、実施例３の単量体の合
成ペプチド（ｃ）５ｍｇをＰＢＳに溶解して酸化状態に
することによって、４ｍｇ得ることができた。

実施例５〔１１個のアミノ酸残基からなる単量体の合成ペプチド
の合成〕先ず、Ａｓｎ−Ｖａ　ｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔ
ｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　（Ｃ
端）の１１個のアミノ酸配列からなるペプチドを、その
Ｃ端のＬｙｓ側から実施例１と同様にしてアミノ酸を順
次１個づつ連結させることによって合成し、凍結乾燥す
ることによって、単量体の合成ペプチド（ｅ）Ａｓｎ　−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓを１０ｍｇ得た・実施例６（実施例５の合成ペプチドを用いた２景体の合成ペプチ
ドの合成〕２量体の合成ペプチド（ｆ）は、実施例５の単量体の合
成ペプチド（ｅ）５ｍｇをＰＢＳに溶解して酸化状態に
することによって、４ｍｇ得ることができた。

実施例４〔酵素標識モノクローナル抗体の作成］酵素標識モノク
ローナル抗体におけるモノクローナル抗体としては、参
考例１で得た精製モノクローナル抗体（ＰＧＩＩ）を用
いた。

このモノクローナル抗体を用いて、次のようにこれを酵
素で標識し、本発明の測定キットにおける酵素標識モノ
クローナル抗体を得た。

まず、西洋ワサビペルオキシダーゼ８．５　ｍ　ｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、０．１　Ｍの過沃素酸ナトリウム
を２００μ！加えて室温で３０分間静置した。

この酵素溶液を１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）を用い
て４°Ｃで１晩透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９，５）１００μｌを添加してｐＨ９゜５に調整
した。

一方、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）（ＰＢＳ）
に溶解していた８、　５　ｍ　ｇのモノクローナル抗体
を０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）を用
いて４°Ｃで１晩透析した。このようにして得たペルオ
キシダーゼとモノクローナル抗体とを混合し、室温で２
時間半静置し、この反応液にテトラヒドリドホウ酸ナト
リウムを加え、４°Ｃで２時間静置した。このようにし
て得たペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体は、Ｐ
ＢＳを用いて４°Ｃ下−晩透析し、これを瓶に１０μ２
づつ分注し、ヒトＭｎ−ＳＯＤの測定キットである酵素
標識モノクローナル抗体（３０μｇ／瓶）とした。ヒト
Ｍｎ−ＳＯＤの測定時には、ＰＢＳで適当に希釈して用
いた。

実施例７〜１６〔ヒトＭｎ−ＳＯＤの測定キットを用いたヒトＭｎ−Ｓ
ＯＤの測定］実施例１〜６の各ｒ合成ペプチド３　　（ａ、ｂ、ｃ、
ｄ、ｅ、ｆ）を用いて調製した各ｒ合成ペプチド」の溶
液（ａのみからなるＡ、ｂのみからなるＢ、ｃのみから
なるＣ、ｄのみからなるり、　ｅのみからなるＥ、ｆの
みからなるＦ、等重量のａおよびｂからなるＧ、等重量
のＣおよびｄからなるＨ１等重量のｅおよびｒからなる
Ｉ、等重量のす、　　ｄおよびｆからなるＪ）（２０μ
ｇ／ｍｆ、ｐ　Ｈ７，４のＰＢＳで溶解。）を担持体で
あるイムノアッセイ用９６ウエル平底プレート（Ｎｕｎ
ｃ社のポリスチレン製マイクロプレート）に５０μ２づ
つ分注し、３７°Ｃで２０時間静置してその合成ペプチ
ドを各ウェルに担持した。次に、担持体に担持されなか
ったその合成ペプチドを除去するために０．０５％のＴ
ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳからなる洗浄液で各ウェルを
洗浄した。さらに、このプレートへのヒトＭｎ−ＳＯＤ
やモノクローナル抗体（ＰＣ；１１）の非特異的な吸着
を防ぐために０．５％のＯＶＡ　（卵白アルブミン）を
含むＰＢＳを２００μ！づつ各ウェルに分注して室温で
３０分間静置した。次に、同洗浄液で洗浄後、「標準ヒ
トＭ　ｎ　−Ｓ　ＯＤ　？’４液」　（２０，１００，
２００，５００，１０００，１５００，２０００、また
は３０００ｎｇ／ｍｊ！。ＰＢＳで溶解。）を調製して
各ウェルに５０μｌづつ分注し、さらに、それらの各ウ
ェルに実施例２で得られた酵素標識モノクローナル抗体
（ＰＢＳで２５０倍に希釈した溶液。）を５０μＰづつ
分注し、直ちにプレートミキサーで５分間攪拌し、３７
°Ｃで１時間静置した。次に、同洗浄液で洗浄後、各ウ
ェルに１基質？容）夜Ｊ　　（１０ｍｇの０−ラエニレ
ンジアミンと５μｉの３５％Ｈ２０□をｐ　Ｈ５，０の
０．１　Ｍクエン酸緩衝液２５ｍ１２に溶解）を１００
μ２づつ分注し、遮光して室温で１５分間静置した。最
後に、さらに２Ｎ硫酸を５０μｌづつ分注して酵素反応
を停止し、マイクロプレート光度計を用いてその反応停
止後の溶液の４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、標準
曲線を作成した。Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ，Ｉ
およびＪ（７）ｆ合成ペプチド」溶？Ｆｚを用いた時の
標準曲線を、それぞれ第１図、第２図、第３図、第４図
、第５図、第６図、第７図、第８図、第９図、第１０図
に示す。

次に、前述、のｒ標準ヒトＭｎ−ＳＯＤ溶液」のかわり
に、５０μｉの０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
溶液中に計算上２５ｎｇのヒトＭｎ　−ＳＯＤを含有し
た試料を用いてその測定値を求めた。その結果、Ａ、Ｂ
、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、、ＨｌＩおよびＪの？合成ペプ
チドＪ溶液を用いた時のの測定値は、それぞれ２８．２
６．２２．２６．２５．２４．２８．２７．２３．２７
ｎｇであり、計算値と測定値は殆ど一致した。

〔発明の効果〕

本発明によれば、本発明のｒ合成ペプチドｊ、酵素標識
モノクローナル抗体を必須とするヒトＭｎ−ＳＯＤの測
定キットを用いることによって、ヒ）Ｍｎ−ＳＯＤを容
易、迅速、かつ高感度で測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のヒトＭｎ−ＳＯＤの測定法において
、本発明の測定キットにおける「合成ペプチド」溶液の
Ａを用いて作成したヒトＭｎ−ＳＯＤの標準曲線を示す
。第２図は、本発明のヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定法において
、本発明の測定キットにおけるｒ合成ペプチドＡ溶液の
Ｂを用いて作成したヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの標準曲線を示す
。第３図は、本発明のヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定法において
、本発明の測定キットにおけるｒ合成ペプチドＪ溶液の
Ｃを用いて作成したヒトＭｎ−ＳＯＤの標準曲線を示す
。第４図は、本発明のヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定法において
、本発明の測定キットにおける「合成ペプチド」溶液の
Ｄを用いて作成したヒトＭｎ−ＳＯＤの標準曲線を示す
。第５図は、本発明のヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定法において
、本発明の測定キットにおけるｒ合成ペプチド」溶液の
Ｅを用いて作成したヒトＭ　ｎ　−ＳＯＤの標準曲線を
示す。第６図は、本発明のヒトＭｎ−ＳＯＤの測定法において
、本発明の測定キットにおけるｒ合成ペプチドｊ溶液の
Ｆを用いて作成したヒトＭｎ−ＳＯＤの標準曲線を示す
。第７図は、本発明のヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定法において
、本発明の測定キットにおける？合成ペプチド」溶液の
Ｇを用いて作成したヒトＭｎ−ＳＯＤの標準曲線を示す
。第８図は、本発明のヒ）Ｍｎ　　ＳＯＤの測定法におい
て、本発明の測定キットにおけるｒ合成ペプチド」溶液
のＨを用いて作成したヒトＭｎ−ＳＯＤの標準曲線を示
す。第９図は、本発明のヒ）Ｍｎ−ＳＯＤの測定法において
、本発明の測定キットにおける？合成ペプチド」溶液の
■を用いて作成したヒ１−Ｍｎ−ＳＯＤの標準曲線を示
す。第１０図は、本発明のヒトＭｎ−ＳＯＤの測定法におい
て、本発明の測定キットにおける？合成ペプチドＪ溶液
のＪを用いて作成したヒトＭｎ　−ＳＯＤの標準曲線を
示す。特許出願人　　宇部興産株式会社第１図第２図ヒトＭｎ−ＳＯＤｉ　（ｎ　ｇ／ウェル）ヒトＭｎ５ＯＤ量（ｎ　ｇ／ウェル）第３図ヒトＭｎ−ＳＯＤｉ　（ｎ　ｇ／ウェル）第５図ヒトＭｎ−５００１（ｎ　ｇ／ウェル）第４図ヒトＭｎ−ＳＯＤｆｆｌ　（ｎ　ｇ／ウェル）第６図ヒトＭｎ−ＳＯＤｆｆｉ　（ｎ　ｇ／ウェル）第７図ヒトＭＭｎ−ＳＯＤｆｆｉ（ｎ／ウェル）第９図ヒトＭＭｎ−ＳＯＤｆｆｉ（ｎ／ウェル）第８図工ヒトＭｎ−ＳＯＤｆｆｉ　（ｎ　ｎ／ウェル）第１０図ヒトＭＭｎ−５ＯＤｉ（ｎ／ウェル）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次式；【遺伝子配列があります】（Ｘは０〜１０個のアミノ酸残基を表す。）で示される
アミノ酸配列からなる単量体の合成ペプチド。
（２）請求項１の合成ペプチドからなる２量体の合成ペ
プチド。
（３）ヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（以下
、ヒトＭｎ−ＳＯＤと略記する。）の測定法で用いるも
のであって、（ａ）請求項１および／または２に記載の合成ペプチドおよび（ｂ）請求項１および／または２に記載の合成ペプチド
に対して非常に高い特異的な免疫反応性を有する酵素標
識したモノクローナル抗体を必須とすることを特徴とするヒトＭｎ−ＳＯＤの測定
キット。
（４）請求項１および／または２に記載の合成ペプチド
を担持体に担持させた後、測定試料中のヒトＭｎ−ＳＯ
Ｄと請求項２に記載の酵素標識したモノクローナル抗体
とを、その担持された合成ペプチドに対して競争的に反
応させることによって、担持体に担持された合成ペプチ
ド、酵素標識したモノクローナル抗体からなる酵素標識
複合体を作製することを特徴とするヒトＭｎ−ＳＯＤの
測定法。