JP2000186100A - レニン活性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ヒトプロレニンプロフラグメント（以下ＨＰ
Ｆと称す）中の特定のアミノ酸配列を認識しうる抗ペプ
チド抗体を利用した新規レニン活性物質の提供。 【解決手段】 ４３個のアミノ酸配列をもつＨＰＦ中の
第１１番目のＩｌｅから第４３番目のＡｒｇまでの３３
個のアミノ酸配列中の任意の位置にある１５個以上のア
ミノ酸配列を特異的に認識する抗ペプチド抗体の少なく
とも１種とヒトプロレニンの結合体、又は４３個のアミ
ノ酸配列をもつＨＰＦ中の第１１番目のＩｌｅから第４
３番目のＡｒｇまでの３３個のアミノ酸配列中の任意の
位置にある１５個以上のアミノ酸配列を特異的に認識す
る抗ペプチド抗体の少なくとも１種と、上記ＨＰＦ中の
第１番目のＬｅｕから第１１番目のＩｌｅまでの１１個
のアミノ酸配列を特異的に認識する抗ペプチド抗体との
混合抗体とヒトプロレニンの結合体からなるレニン活性
物質とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトプロレニンプ
ロフラグメントペプチドと結合して結合体を形成しうる
ペプチド特異的抗体とヒトプロレニンとが結合して酵素
活性すなわちレニン活性を発現した新規レニン活性物質
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】プロレニンは、主として腎臓において、
完熟型レニンの前駆体すなわち完熟型レニンのＮ端部に
４３個のアミノ酸配列をもつプロフラグメントが結合し
たものとして産生され、血液中に放出される。このプロ
レニンは、血液中に完熟型レニンの約１０倍量存在する
が、それ自体は酵素活性を示さないので、プロフラグメ
ント部をタンパク質分解酵素例えばトリプシンやペプシ
ンなどで切り離して酵素活性をもつ完熟型レニンに変換
することが古くから行われている。また、比較的新らし
い方法として酵素を用いない方法も提案されており、例
えば酸性及び低温状態において一次構造を変えることな
く活性化させる方法［「ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）」，第２８８巻，第７０２〜７０５ページ（１９８
０）、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」，第２６２巻，第
２４７２〜２４７７ページ（１９８７）、「クリニカル
・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．），第３７巻，
第１８１１〜１８１９ページ（１９９１）」、「ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」，第２６７巻，第１１７５３〜１
１７５９ページ（１９９２）］、低分子のレニン阻害剤
をプロレニンの三次元構造の深い溝に隠れている酵素活
性部位に結合させて開放型とし、完熟型レニンの活性部
位近傍を認識する抗体を結合可能にする方法［「ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」，第２６７巻，第２２８３７〜２
２８４２ページ（１９９２）］などが知られている。そ
のほか、プロレニンプロフラグメントの中間部及びＣ端
部抗ペプチド抗体が、プロレニンと結合して結合体を形
成することについては、これまで多くの報告があるが、
このものが酵素活性を有することは知られていなかっ
た。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトプロレ
ニンプロフラグメント中の特定のアミノ酸配列を認識し
うる抗ペプチド抗体を利用した新規なレニン活性物質を
提供することを目的としてなされたものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、先にヒト
プロレニンプロフラグメントのＮ端部、すなわち第１番
目のロイシンから第１５番目のアルギニンまでのアミノ
酸で構成されたアミノ酸配列をもつペプチドを抗原とし
て特異的に認識する抗体とヒトプロレニンとの結合体か
らなるレニン活性物質を提供したが（特開平１０−２７
９６００号公報）、さらに研究を重ねた結果、ヒトプロ
レニンプロフラグメント中の第１１番目のイソロイシン
から第４３番目のアルギニンまでの３３個のアミノ酸で
構成されたアミノ酸配列の中の任意のアミノ酸配列をも
つペプチドを特異的に認識する抗体もヒトプロレニンと
結合してレニン活性を示す物質になること、及び上記の
抗体に上記ヒトプロレニンプロフラグメント中の第１番
目のロイシンから第１１番目のイソロイシンまでの１１
個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列を特異的に認識
する抗ペプチド抗体を加えた等モル混合抗体とヒトプロ
レニンとの結合体は、各抗ペプチド抗体単独とヒトプロ
レニンとの結合体に比べ、レニン活性が向上することを
見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、４３個のアミノ酸で
構成されたアミノ酸配列をもつヒトプロレニンプロフラ
グメント中の第１１番目のイソロイシンから第４３番目
のアルギニンまでの３３個のアミノ酸で構成されたアミ
ノ酸配列の中の任意の位置にある１５個以上のアミノ酸
で構成されたアミノ酸配列を特異的に認識する抗ペプチ
ド抗体の少なくとも１種とヒトプロレニンの結合体、又
は４３個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列をもつヒ
トプロレニンプロフラグメント中の第１１番目のイソロ
イシンから第４３番目のアルギニンまでの３３個のアミ
ノ酸で構成されたアミノ酸配列の中の任意の位置にある
１５個以上のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列を特異
的に認識する抗ペプチド抗体の少なくとも１種と、上記
ヒトプロレニンプロフラグメント中の第１番目のロイシ
ンから第１１番目のイソロイシンまでの１１個のアミノ
酸で構成されたアミノ酸配列を特異的に認識する抗ペプ
チド抗体との混合抗体とヒトプロレニンの結合体からな
るレニン活性物質を提供するものである。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明は、抗ペプチド抗体とヒト
プロレニンの結合体からなるレニン活性物質であって、
この抗ペプチド抗体がヒトプロレニンプロフラグメント
中の第１１番目のイソロイシンから第４３番目のアルギ
ニンまでの３３個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列
の中の任意の位置にある１５個以上のアミノ酸で構成さ
れたアミノ酸配列をもつペプチドを特異的に認識するも
のである点に特徴がある。そして、上記の抗ペプチド抗
体と、上記ヒトプロレニンプロフラグメント中の第１番
目のロイシンから第１１番目のイソロイシンまでの１１
個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列を特異的に認識
する抗ペプチド抗体との等モル混合抗体を用いるとレニ
ン活性は著しく増大する。このヒトプロレニンプロフラ
グメントは、配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列
を有する物質である。

【０００７】本発明のレニン活性物質は、このプロレニ
ンプロフラグメントの中間部、すなわち第１１番目のイ
ソロイシンから第２６番目のアルギニンまでの１６個の
アミノ酸からなるペプチド（以下Ｍペプチドという）と
Ｃ端部すなわち第２７番目のグリシンから第４１番目の
メチオニンまでの１５個のアミノ酸からなるペプチド
（以下Ｃペプチドという）のそれぞれのペプチドのＣ末
端にシステイン残基を付加したペプチドを合成し、これ
らを用いて例えば以下の方法により調製することができ
る。これらのペプチドをそれぞれマレイミド化合物のよ
うな架橋剤を用いてキャリアタンパク例えばウシ血清ア
ルブミン、卵白アルブミン、キーホールリンペット・ヘ
モシアニンなどに結合させて免疫抗原を調製し、次いで
それぞれの免疫抗原をフロイントの完全アジュバントと
混合して成熟家兎の皮下に２週間間隔で投与して免疫操
作を行い、５回目以降に耳周縁静脈より少量採血し、そ
の抗体価を調べ、十分に抗体価が上昇した時点で全採血
を行い、抗血清を得る。次にこの抗血清を塩析し、それ
ぞれ所定の合成ペプチドを結合したアフィニティゲルを
用いたアフィニティクロマトグラフィ処理により精製す
る。

【０００８】この免疫抗原の調製から抗体のアフィニテ
ィ精製までは、公知方法（例えば平成６年９月１０日秀
潤社発行，大海忍、辻村邦男、稲垣晶樹著，「抗ペプチ
ド抗体実験プロトコール」，第４８ページ）に従って実
施することができる。

【０００９】次いで、このようにしてアフィニティ精製
した抗ペプチド抗体をウシ血清を含む生理食塩水で希釈
したヒトプロレニン液に加え、４℃の温度において１６
〜２４時間反応させることにより結合体を調製すること
ができる。次いでこの反応液に、ヒトレニン基質として
羊アンジオテンシノーゲン液を加え３７℃において６０
分間反応させたのち、氷冷して反応を停止させると、反
応液中にアンジオテンシンＩが産生される。したがっ
て、この結合体は、酵素活性すなわちレニン活性を発現
する物質である。

【００１０】このようにして得たレニン活性物質につい
て、ウエスタンブロット法及び表面プラズモン共鳴を利
用したタンパク−タンパク相互作用測定を行って、精製
抗体がヒトプロレニンと特異的に結合していることを確
認した。次に、それぞれの結合体にレニン基質として羊
アンジオテンシノーゲンと反応させ、ポジティブコント
ロールとしてプロレニンのトリプシン処理物を、またネ
ガティブコントロールとして抗体の代りに正常家兎血清
を用いてレニン活性を比較した。その結果、抗体結合体
は、ポジティブコントロールと同等のレニン活性を示し
たのに対し、ネガティブコントロールはほとんどレニン
活性を示さなかったことから、このものが既に知られて
いる酸性及び低温活性化物質及び低分子レニン阻害剤に
よる開放型物質とは全く異なるレニン活性物質であるこ
とが分った。

【００１１】図１は、ヒトプロレニン及びプロレニンを
トリプシン処理した完熟型レニンを標品としてウエスタ
ンブロット分析した結果を示したものである。これから
分るように、プロレニン（レーン１及び３）については
移動の位置にそれぞれの抗体が結合したスポットが認め
られるのに対し、完熟型レニン（レーン２及び４）につ
いてはスポットは認められない。また、図２及び図３
は、タンパク−タンパク相互作用測定装置（ファルマシ
ア・バイオテク社製，ビアコア１００型）を用いてアフ
ィニティクロマトグラフィ精製した抗体を化学結合させ
たフローセル中にヒトプロレニンを一定流速で通過さ
せ、表面プラズモン共鳴の変化量を測定することによ
り、抗ペプチド抗体とプロレニンの結合能を調べた結果
を横軸を反応時間、縦軸をＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ
Ｕｎｉｔｓ）として示したグラフである。図２はプロフ
ラグメントの第１１番目のイソロイシンから第２６番目
のアルギニンまでの１６個のアミノ酸で構成されたアミ
ノ酸配列を特異的に認識する抗ペプチド抗体（以下抗Ｍ
ペプチド抗体という）についての場合、図３はプロフラ
グメントの第２７番目のグリシンから第４１番目のメチ
オニンまでの１５個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配
列を特異的に認識する抗ペプチド抗体（以下抗Ｃペプチ
ド抗体という）の場合を示し、各図中実線はプロレニ
ン、鎖線はコントロール緩衝液に対するものである。こ
れらの図から分るように、それぞれの抗ペプチド抗体に
ついてはプロレニンとの結合が認められるのに対し、コ
ントロール緩衝液では結合は認められない。

【００１２】次に図４は、アフィニティクロマトグラフ
ィ精製した抗ペプチド抗体とヒトプロレニンとを反応さ
せて得た結合体に、レニン基質として羊アンジオテンシ
ノーゲンを加えて反応させ、酵素すなわちレニン活性物
質により産生されるアンジオテンシンＩ量を酵素免疫学
的測定により定量し、レニン活性を求めた結果を示すグ
ラフであって、この図からポジティブコントロールとし
てプロレニンをトリプシン処理した完熟型レニンのレニ
ン活性と抗Ｍペプチド抗体又は抗Ｃペプチド抗体とヒト
プロレニンとの結合体のレニン活性がほぼ同等の活性能
を示すのに対し、ネガティブコントロールとして抗ペプ
チド抗体の代りに正常家兎血清を用いた系はほとんどレ
ニン活性を示さないことが分かる。

【００１３】このように、プロレニンプロフラグメント
の中間部すなわち第１１番目から第２６番目のアミノ酸
配列をもつ抗Ｍペプチド抗体及びＣ端部すなわち第２７
番目から第４１番目のアミノ酸配列をもつ抗Ｃペプチド
抗体は、特異的にヒトプロレニンと結合し、形成された
結合体はレニン活性を発現することから、これまで知ら
れている活性化物とは全く異なったレニン活性物質に変
換していることが分かる。

【００１４】次に図５は、抗Ｍペプチド抗体又は抗Ｃペ
プチド抗体と、ヒトプロレニンプロフラグメント中、第
１番目のロイシンから第１１番目のイソロイシンまでの
１１個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列を特異的に
認識する抗ペプチド抗体（以下抗Ｎペプチド抗体とい
う）とを等モルずつ混合して得た混合抗体をヒトプロレ
ニンと結合させて形成した結合体及び各抗ペプチド抗体
を単独でヒトプロレニンと結合させた結合体についての
レニン活性を、使用したプロレニンのトリプシン活性化
レベルを１００％として対比したグラフである。この図
より、レニン活性は、抗Ｍペプチド抗体と抗Ｎペプチド
抗体との混合物では、抗Ｍペプチド抗体単独に比べて
１．２２倍、抗Ｃペプチド抗体と抗Ｎペプチド抗体との
混合物では抗Ｃペプチド抗体単独に比べて１．５２倍と
いずれも向上していることが分かる。特に、抗Ｃペプチ
ド抗体と抗Ｎペプチド抗体との組合せは１２８％を示
し、従来知られているプロレニンのトリプシン活性化の
場合を大きく上回っている。

【００１５】

【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に説明
する。

【００１６】実施例１ （１）プロレニンプロフラグメントペプチド免疫抗原の
調製 ペプチド合成に慣用されている固相法に従って、配列表
配列番号２のアミノ酸配列をもつペプチドのＣ端側にシ
ステイン残基を付加した１７個のアミノ酸残基をもつペ
プチドを合成し、高速液体クロマトグラフィにより分
離、精製した。一方、キャリアータンパクとしてのヘモ
シアニン１６ｍｇを０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）１ｍｌに溶解し、得られた溶液にＮ‐（γ‐マレイ
ミドブチロキシ）サクシイミドのジメチルホルムアミド
溶液（１５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、室温で３時
間反応させた。この反応混合物を、セファデックスＧ−
２５カラム（ファルマシアバイオ社製，１５ｍｍφ×３
００ｍｍ）に通し、ゲルろ過して未反応のＮ‐（γ‐マ
レイミドブチロキシ）サクシイミドを除去したのち、
０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて反応生
成物を溶出した。次いで、この溶出液に、前記した精製
ペプチド１０ｍｇを加え室温で３時間反応させてペプチ
ドヘモシアニン結合体すなわち免疫抗原を得た。このよ
うにして得たプロフラグメント中間部ペプチド免疫抗原
は使用時まで−８０℃で保存される。

【００１７】（２）抗ペプチド抗体の調製 （１）で得たプロフラグメント中間部ペプチド免疫抗原
を生理食塩水でタンパク濃度１ｍｇ／ｍｌに調整したの
ち、等量のフロイントの完全アジュバントとよく混和
し、ニュージーランドホワイト種のウサギ（体重約２．
５ｋｇ）の皮下に数か所に分けて注射した。それ以後、
初回の半量の免疫抗原を２週間間隔で皮下注射し、十分
な抗体価の上昇が確認されるまでこれを繰り返したの
ち、常法により全採血して抗血清を得た。

【００１８】（３）アフィニティクロマトグラフィ精製
抗体の調製 前記（１）で得た精製ペプチド１ｍｇをアミン結合ゲル
（バイオラッド社製，商品名アフィゲル１０２）３ｍｌ
に、Ｎ‐（γ‐マレイミドブチロキシ）サクシイミドを
用いて化学結合させ、アフィニティクロマトグラフィカ
ラム３ｍｌを調製した。次いで、（２）で得た抗血清１
０ｍｌと０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混
合し、５０％硫酸アンモニウムを用いて分別沈殿させ、
ＩｇＧ画分を捕集したのち、これを０．１Ｍ−リン酸緩
衝液１０ｍｌを加えて可溶化し、さらに同じ０．１Ｍ−
リン酸緩衝液２０００ｍｌを用い、４℃において１５時
間透析した。次に、透析したＩｇＧ溶液全量を上記のア
フィニティカラム２ｍｌに通して非吸着画分を完全に除
去し、０．１Ｍ−グリシン塩酸溶液（ｐＨ２．５）によ
り抗体を溶出させ、直ちに１Ｍ−トリス緩衝液を加えて
中和した。このようにして得た精製抗Ｍペプチド抗体
は、使用時まで凍結保存される。

【００１９】（４）レニン活性物質の製造 公知方法［「ジャーナル・オブ・ハイパーテンションズ
（Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．」，第４巻，第３８８〜３
９０ページ（１９８６）］に従って、ヒト腎由来のプロ
レニンのｃＤＮＡを発現ベクターに導入し、チャイニー
ズハムスター卵巣細胞（以下ＣＨＯ細胞と略記する）に
組み込んだものを、牛胎児血清１０％を含有するダルベ
ッコ変法イーグル培地で培養し、ＣＨＯ細胞が十分に生
育した時点で無血清培地と交換することにより組換え型
ヒトプロレニンを含む培養上清を得た。このようにして
得たＣＨＯ培養上清を５ｍＭ−ＥＤＴＡを含むリン酸緩
衝液生理食塩水で透析し、精製することによりヒトプロ
レニンを調製した。

【００２０】次に、このヒトプロレニン約８ｎｇを常法
に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度
７．５％）上で電気泳動させたのち、これをニトロセル
ロース膜上に転写し、前記（３）で得たプロフラグメン
ト中間部ペプチドアフィニティ精製抗体と反応させ結合
させた。この反応物をＡＢＣキット（ベクターラボラト
リー社製）を用いて発色させ、分析することにより抗体
がヒトプロレニンの移動位置で結合したことが確認され
た。また、（３）で得たアフィニティクロマトグラフィ
精製抗体をアミンカップリングさせたフローセル（ファ
ルマシアバイオテク社製）中に、ヒトプロレニン８ｎＭ
溶液を溶かしたリン酸緩衝液を流速１０μｌ／分で流
し、タンパク−タンパク相互作用測定装置を用いて表面
プラズモン共鳴の変化量を観察することにより、ヒトプ
ロレニンとアフィニティクロマトグラフィ精製抗体との
結合状態を調べたところ、両者が結合体を形成している
ことが確認された。

【００２１】実施例２ ペプチド合成に慣用されている固相法に従って、配列表
配列番号３のアミノ酸配列のペプチドのＣ端側にシステ
イン残基を付加した１６個のアミノ酸残基をもつペプチ
ドを合成し、実施例１と同様にしてペプチドヘモシアニ
ン結合体を調製し、免疫抗原とした。次いで、この免疫
抗原から実施例１と同様にして抗血清を調製したのち、
精製ペプチドを用いて調製したアフィニティクロマトグ
ラフィカラムで処理し、精製抗Ｃペプチド抗体を得た。
次に、実施例１と同様にして得たヒトプロレニンと上記
の精製抗体とを反応させることにより、レニン活性物質
を製造した。

【００２２】実施例３ ペプチド合成に慣用されている固相法に従って、配列表
配列番号４のアミノ酸配列のＮペプチドのＣ端側にシス
テイン残基を付加した１２個のアミノ酸残基をもつペプ
チドを合成し、実施例１と同様にしてペプチドヘモシア
ニン結合体を調製し、免疫抗原とした。次いで、この免
疫抗原から実施例１と同様にして抗血清を調製したの
ち、精製ペプチドを用いて調製したアフィニティクロマ
トグラフィカラムで処理し、精製抗Ｎペプチド抗体を得
た。次に、０．６μＭヒトプロレニン液５０μｌに、実
施例１で得た精製抗Ｍペプチド抗体又は実施例２で得た
精製抗Ｃペプチド抗体の０．６μＭ抗体液５０μｌ及び
上記のようにして得た精製抗Ｎペプチド抗体の０．６μ
Ｍ抗体液５０μｌを加え、４℃で２０時間反応させるこ
とにより、それぞれの混合抗体とヒトプロレニンとを反
応させることにより、レニン活性物質を製造した。

【００２３】参考例１ （１）酵素標識アンジオテンシンＩの調製 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム
社製）５ｍｇを０．２Ｍ−リン酸緩衝液に溶解し、得た
溶液に２．５％グルタルアルデヒド水溶液１ｍｌを加え
て反応させたのち、ゲルろ過により未反応のグルタルア
ルデヒドを除去した。次いで、この溶液に合成アンジオ
テンシンＩ（ペプチド研製）１ｍｇを精製水１ｍｌに溶
解して調製した溶液１３０μｌを加えて反応させたの
ち、０．２Ｍ−リジン水溶液を加えて反応を停止させ
た。再びゲルろ過して未反応のアンジオテンシンＩを除
去することにより、酵素標識アンジオテンシンＩ液１．
５ｍｌを得た。

【００２４】（２）アンジオテンシンＩ抗体の調製 合成アンジオテンシンＩ ３．６ｍｇを０．２Ｍ−リン
酸緩衝液に溶解し、Ｎ‐（γ‐マレイミドブチロキシ）
サクシイミド３．６ｍｇをテトラヒドロフランに溶解し
た溶液を滴下し、３０℃において３０分間反応させたの
ち、エチルアルコール及びジエチルエーテルを加えて、
−８０℃において１０分間放置して結晶を析出させた。
この結晶をジエチルエーテルで２回洗浄することによ
り、アンジオテンシンＩとＮ‐（γ‐マレイミドブチロ
キシ）サクシイミドとの複合物を得た。別に牛血清アル
ブミン１０ｍｇを８Ｍ尿素を含む０．２Ｍ−トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．６）２ｍｌに溶解し、ジチオスレイト
ール（シグマ社製）１５μｍｏｌを加えて３７℃で１時
間反応させたのち、１０％トリクロロ酢酸３ｍｌを加え
て沈殿させ、この沈殿物を蒸留水で３回洗浄して還元型
牛血清アルブミンを得た。次いで、アンジオテンシンＩ
とＮ‐（γ‐マレイミドブチロキシ）サクシイミドとの
複合物と還元型牛血清アルブミンを尿素６Ｍを含む０．
２Ｍ−エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム水溶液
１．５ｍｌに溶解し、２５℃で２時間反応させた。反応
後透析し、アンジオテンシンＩ−牛血清アルブミン結合
物（免疫抗原）を得た。この溶液は、動物に免疫するま
で−８０℃で保存する。

【００２５】（３）アンジオテンシンＩ抗体 アンジオテンシンＩ−牛血清アルブミン結合物（免疫抗
原）を実施例２と同様に処理して抗血清を得た。

【００２６】（４）アンジオテンシンＩ抗体プレート 前記アンジオテンシンＩ抗血清を０．０５Ｍ−重炭酸ナ
トリウム液（ｐＨ９．６）で５０００倍に希釈した液１
００μｌを９６穴マイクロプレート（グライナー社製）
の各穴に入れて、４℃で１６時間静置し、マイクロプレ
ートに固定化した。このアンジオテンシンＩ抗体固定化
プレートにさらに１％牛血清アルブミンを含むリン酸緩
衝液２００μｌを加え、４℃で１６時間静置した。

【００２７】（５）結合体のレニン活性 ０．６ｎＭヒトプロレニン液５０μｌに０．６μＭ精製
抗ペプチド抗体液５０μｌを加え、４℃で２０時間反応
させることにより、結合体を形成させた。この反応液に
アンジオテンシノーゲン試薬１００μｌを加え、３７℃
で６０分反応させ、氷浴に移して反応を停止させた。次
に、前記酵素標識アンジオテンシンＩ液１００μｌを加
えて混合し、この混合液１００μｌを前記アンジオテン
シンＩ抗体プレートに移し、２５℃で２時間ゆるく振り
まぜた。さらに、発色試薬２００μｌを加え、２５℃で
１５分間反応させて発色させ、１Ｎ−リン酸１００μｌ
を加えて反応を停止させ、比色計を用いて４５０ｎｍの
吸光度を測定した。ポジティブコントロールとして完熟
型レニン１００μｌを用いて同様に操作した。また、ネ
ガティブコントロールとしてヒトプロレニン液に抗Ｍ又
はＣペプチド抗体の代わりに、同量の正常家兎血清を加
えて同様の操作をした。その結果、ヒトプロレニンは抗
Ｍペプチド抗体又は抗Ｃペプチド抗体と結合体を形成す
るとレニン活性を発現し、ポジティブコントロールとし
ての完熟型レニンとほぼ同等のレニン活性を示したのに
対し、ネガティブコントロールとしてのヒトプロレニン
ではほとんどレニン活性を示さなかった。以上から、ヒ
トプロレニンは抗Ｍペプチド抗体又は抗Ｃペプチド抗体
と結合すると、レニン活性を発現する結合体に変換され
たことが分かる。

【００２８】

【発明の効果】本発明により得られるヒトプロレニンと
その抗プロフラグメントペプチド抗体との結合体は、レ
ニン活性を発現した新規レニン活性物質であることか
ら、市販の活性レニン免疫測定試薬又はレニン活性免疫
測定試薬を用いて、体液中プロレニン測定法として実用
化が容易である。

【００２９】

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ 〈110〉Tokiwa Chemical Industries Co.,Ltd; Ishida,Yuichi 〈120〉Renin-active substance 〈130〉PTKK99-001 〈150〉JP10-291124 〈151〉1998-10-13 〈160〉4 〈210〉1 〈211〉43 〈212〉PRT 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉1 Leu Pro Thr Asp Thr Thr Thr Phe Lys Arg Ile Phe Leu Lys Arg Met 1 5 10 15 Pro Ser Ile Arg Glu Ser Leu Lys Glu Arg Gly Val Asp Met Ala Arg 20 25 30 Leu Gly Pro Glu Trp Ser Gln Pro Met Lys Arg 35 40 〈210〉2 〈211〉16 〈212〉PRT 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉2 Ile Phe Leu Lys Arg Met Pro Ser Ile Arg Glu Ser Leu Lys Glu Arg 1 5 10 15 〈210〉3 〈211〉15 〈212〉PRT 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉3 Gly Val Asp Met Ala Arg Leu Gly Pro Glu Trp Ser Gln Pro Met 1 5 10 15 〈210〉4 〈211〉11 〈212〉PRT 〈213〉Artificial Sequence 〈400〉4 Leu Pro Thr Asp Thr Thr Thr Phe Lys Arg Ile 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトプロレニン及び完熟型レニンのウエスタ
ンブロット分析の結果を示すパターン。

【図２】 抗Ｍペプチド抗体についてのヒトプロレニン
との結合能を示すグラフ。

【図３】 抗Ｃペプチド抗体についてのヒトプロレニン
との結合能を示すグラフ。

【図４】 抗ペプチド抗体とヒトプロレニンとの結合体
のレニン活性を示すグラフ。

【図５】 抗ペプチド抗体混合抗体又は単独の抗ペプチ
ド抗体とヒトプロレニンとの結合体の相対レニン活性を
示すグラフ。

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【手続補正書】

【提出日】平成１１年１２月１７日（１９９９．１２．
１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/09 15/00 Ａ (72)発明者 鈴木 文昭 岐阜県岐阜市旦島６−４−12 (72)発明者 石田 雄一 埼玉県北葛飾郡鷲宮町東大輪1947 ウエス トハイツ ８−205

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ４３個のアミノ酸で構成されたアミノ酸
   配列をもつヒトプロレニンプロフラグメント中の第１１
   番目のイソロイシンから第４３番目のアルギニンまでの
   ３３個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列の中の任意
   の位置にある１５個以上のアミノ酸で構成されたアミノ
   酸配列を特異的に認識する抗ペプチド抗体の少なくとも
   １種とヒトプロレニンの結合体からなるレニン活性物
   質。
2. 【請求項２】 ４３個のアミノ酸で構成されたアミノ酸
   配列をもつヒトプロレニンプロフラグメント中の第１１
   番目のイソロイシンから第４３番目のアルギニンまでの
   ３３個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列の中の任意
   の位置にある１５個以上のアミノ酸で構成されたアミノ
   酸配列を特異的に認識する抗ペプチド抗体の少なくとも
   １種と、上記ヒトプロレニンプロフラグメント中の第１
   番目のロイシンから第１１番目のイソロイシンまでの１
   １個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列を特異的に認
   識する抗ペプチド抗体との混合抗体とヒトプロレニンの
   結合体からなるレニン活性物質。
3. 【請求項３】 ４３個のアミノ酸で構成されたアミノ酸
   配列をもつヒトプロレニンプロフラグメント中の第１１
   番目のイソロイシンから第２６番目のアルギニンまでの
   １６個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列を特異的に
   認識する抗ペプチド抗体とヒトプロレニンの結合体から
   なるレニン活性物質。
4. 【請求項４】 ４３個のアミノ酸で構成されたアミノ酸
   配列をもつヒトプロレニンプロフラグメント中の第２７
   番目のグリシンから第４１番目のメチオニンまでの１５
   個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列を特異的に認識
   する抗ペプチド抗体とヒトプロレニンの結合体からなる
   レニン活性物質。
5. 【請求項５】 ４３個のアミノ酸で構成されたアミノ酸
   配列をもつヒトプロレニンプロフラグメント中の第１１
   番目のイソロイシンから第２６番目のアルギニンまでの
   １６個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列を特異的に
   認識する抗ペプチド抗体と上記ヒトプロレニンプロフラ
   グメント中の第１番目のロイシンから第１１番目のイソ
   ロイシンまでの１１個のアミノ酸で構成されたアミノ酸
   配列を特異的に認識する抗ペプチド抗体との混合抗体と
   ヒトプロレニンの結合体からなるレニン活性物質。
6. 【請求項６】 ４３個のアミノ酸で構成されたアミノ酸
   配列をもつヒトプロレニンプロフラグメント中の第２７
   番目のグリシンから第４１番目のメチオニンまでの１５
   個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列を特異的に認識
   する抗ペプチド抗体と上記ヒトプロレニンプロフラグメ
   ント中の第１番目のロイシンから第１１番目のイソロイ
   シンまでの１１個のアミノ酸で構成されたアミノ酸配列
   を特異的に認識する抗ペプチド抗体との混合抗体とヒト
   プロレニンの結合体からなるレニン活性物質。