JPH0225750A - ヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼの測定キットおよび測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（
以下、ヒトＭｎ−３ＯＤと略記する。）の測定キットお
よび測定法に関するものである。

〔従来の技術〕

ヒトＭｎ−３ＯＤは、ミトコンドリアのマトリックス部
分に存在する酵素（１ドメインの分子量が約２５，００
０であり、そのダイマーまたはテトラマーからなると考
えられている。）であり、次に示すように、毒性酸素の
主要な分子種であるスーパーオキシドアニオンラジカル
（Ｏｚ−）を不均化する反応を触媒する。

＋ ２０□　＋２Ｈ−−→ＨｚＯ□　＋０□ところで、肝疾
患における血清中のヒトＭｎ−３ＯＤｉ４度の測定には
、ポリクローナル抗体を用いた検討によって、裔い診断
的意義が存在すると考えられている（医薬ジャーナル；
稲垣、訳本、２０．１．１９８４年。第５回腫瘍マーカ
ー研究会；仮埋、新井ら、１９８５年）。また、呑口ら
も、ヤギに免疫して作製したポリクローナル抗体を用い
た免疫学的な方法で、ヒトＭｎ−３ＯＤ濃度が肺癌で高
いことを示しており（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　７２
．５．１９８４年）、血清中のヒトＭｎ−３ＯＤ濃度の
測定の重要性が指摘されている。

しかし、これらの各疾患における血清中のヒトＭｎ−３
ＯＤＩ度の測定では、ポリクローナル抗体が用いられて
いるので、ヒトＭｎ−３ＯＤに対する反応の特異性をさ
らに高め、常に同品質のヒトＭｎ−３ＯＤ測定試薬を用
いて、簡単に、かつ、高感度でヒトＭｎ−３ＯＤを測定
できる必要がある。

〔発明が解決すべき問題点〕

本発明の目的は、ヒトＭｎ−３ＯＤに対して非常に高い
特異的な免疫反応性を有するモノクローナル抗体を用い
たヒトＭｎ−３ＯＤの測定キットおよび測定法を提供す
ることである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ヒ）Ｍｎ−３ＯＤの測定キットを用いてヒト
Ｍｎ−３ＯＤを測定することによって、ヒ）Ｍｎ−５０
０を容易に、かつ高感度に測定できることを見出し、本
発明を完成するに至即ち、本発明は、 （１）ヒトＭｎ−３ＯＤの測定法で用いるものであって
、 （ａ）ヒトＭｎ−３００に対して非常に高い特異的な免
疫反応性を有するモノクローナル抗体および （ｂ）ヒトＭｎ−５ＯＤに対して非常に高い特異的な免
疫反応性を有するモノクローナル抗体を酵素で標識した
試薬 を必須とすることを特徴とするヒトＭｎ−５ＯＤの測定
キット （２）前記（１）のモノクローナル抗体を担持体に担持
させた後、その担持されたモノクローナル抗体、測定試
料中のヒ）　Ｍ　ｎ　−Ｓ　ＯＤおよび前記（１）の酵
素で標識されたモノクローナル抗体を反応させて、担持
体に担持されたモノクローナル抗体、ヒ）Ｍｎ−３ＯＤ
、酵素で標識されたモノクローナル抗体からなる複合体
を作成することを特徴とするヒトＭｎ−５ＯＤの測定法 に関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のヒトＭｎ−３ＯＤの測定法に用いるヒ）Ｍｎ−
３ＯＤの測定キットは、ヒトＭｎ−３゜Ｄに対して非常
に高い特異的な免疫反応性を有するモノクローナル抗体
（以下、ｒ抗体Ｊと略記する。）およびヒトＭｎ−３Ｏ
Ｄに対して非常に高い特異的な免疫反応性を有するモノ
クローナル抗体を酵素で標識した試薬（以下、ｒ酵素標
識抗体」と略す）を必須とするものである。ヒトＭｎ−
３ＯＤの測定のためのは、これらの試薬の他に、担持体
、洗浄液、ブロワキンダ液、ヒトＭｎ−３ＯＤの検量線
を作成するための既知濃度のヒ）Ｍｎ−３ＯＤ溶液（以
下、ｒ標準ヒトＭｎ−３ＯＤ溶液１と略記する。）、ｒ
酵素標識抗体ｊの酵素に対応する基質溶液（以下、「基
質溶液１と略記する。）なども必要とするので、これら
を前もってヒトＭｎ−３ＯＤの測定キットに組み込んで
おいてもよいし、測定前に準備してもよい。そして、担
持体を前もってヒトＭｎ−３ＯＤの測定キットに岨み込
む場合には、？抗体１を担持体に前もって担持させてお
くこともできる。

本発明のヒトＭｎ−３ＯＤの測定キットにおけるｒ抗体
」としては、ヒ）Ｍｎ−３ＯＤに対して非常に裔い特異
性を有するモノクローナル抗体であれば特に制限されな
いが、例えば、ハイブリドーマ株であるＰＣｌ３株（微
工研条寄第１６０８号）が産生じたものなどを挙げるこ
とができる。

そして、そのようなｒ抗体」としては、硫安などを用い
た塩析やイオン交換クロマトグラフィーなどによって高
純度に精製したものを用いるのが好ましい。また、必要
に応じて、このｒ抗体ｊには、アジ化ナトリウム、エチ
ル水銀チオサルチル酸ナトリウムなどのような蛋白質の
防腐剤を必要量添加することもできる。

本発明のヒトＭｎ−３ＯＤの測定キットにおける「酵素
標識抗体」の作製において、「抗体」を標識する酵素と
しては、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダー
ゼ、モノアミンオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼな
どの酸化還元系の酵素、およびアルカリフォスファター
ゼなどのリン酸加水分解酵素などから選ばれた少なくと
も一種以上の酵素を挙げることができる。

前記の酵素で標識された「抗体」としては、ヒ）Ｍｎ−
３ＯＤに対して非常に高い特異性を有するモノクローナ
ル抗体であれば特に制限されないが、例えば、ハイプリ
ドーマ株であるＰＣｌ３株（微工研条寄第１６０８号）
が産生じたものなどを挙げることができる。そして、そ
のような「抗体ｊとしては、硫安などを用いた塩析やイ
オン交換クロマトグラフィーなどによって高純度に精製
したものを用いるのが好ましい。

本発明における？酵素標識抗体ｊの作製は、前記の１種
以上の「抗体」と前記の１種以上の酵素をグルタルアル
デヒドを用いた１段階法〔イムノケミストリイ（Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ）、−灸、４３　（１９６
９）］または２段階法〔イムノケミストリイ（Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ）、　＠−，１１７５（１９
７１））、過沃素酸酸化法〔メソッド・イン・エンジモ
ロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｇｙｍｏｒｏ
ｇｙ）、−３−７−，１３３（１９７５）］やマレイミ
ド法〔ジャーナル・オブ・ザ・バイオケミストリイ（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｏｒｙ）、エエ、２３５　（１９７５）Ｅなどで結
合して作成することができるが、後の２つの方法で行う
のが好ましい。

これをそのまま「酵素標識抗体１として用いることもで
きるが、ヒトＭｎ−３ＯＤの測定感度をさらに高めるた
めには５ｅｐｈａｄｅｘ、５ｅｐｈａｃｒｙｌなどを用
いたゲル濾過でこれを精製して得たものを「酵素標識抗
体１として用いた方が好ましい。

そのようなゲル濾過で得られたｒ酵素標識抗体ｊ画分は
、そのまま使用（蓋白質濃度が低ければ透析膜などによ
って所定の濃度まで：ａ縮し、蛋白質濃度が高ければ所
定の濃度まで希釈する）することもできるが、中性付近
のｐＨに調整した緩衝１夜（例えば、リン酸謹上液また
はトリス−塩酸］上液など）などで透析し、凍結乾燥ま
たは除石フィルターで濾過して保存し、必要に応じてｒ
酵素標識抗体」溶液として０．０１〜１００μｇ／ｍ２
で、好ましくは０．１〜１０μｇ　／　ｍ　ｌの蛋白質
濃度で使用するのがよい。

また、必要に応じて、「酵素標識抗体ｊには、この酵素
活性の測定で支障がない程度に、アジ化ナトリウム、エ
チル水銀チオサルチル酸ナトリウムなどのような蛋白質
の防腐剤を必要量添加することもできる。

本発明のヒトＭｎ−３ＯＤの検を線の作成のために用い
る既知量のヒトＭｎ−３ＯＤ（ｒ標準ヒトＭｎ−３ＯＤ
溶液１）は、〔ジャーナル・オブ・ナシヨナル・キャン
サー・インスチチュート（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　
、工２．５、（１９８４））に準じて、熱処理、硫安分
画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点
クロマトグラフィーなとで精製して得ることができる。

本発明のヒトＭｎ−３ＯＤの測定で用いる担持体は、ヒ
トＭｎ−３ＯＤの測定キットにおける「抗体ｊを担持す
るための担持体として必要なものである。

本発明でヒトＭｎ−３ＯＤを担持するために用いること
ができる担持体の形状としては、例えば、イムノアッセ
イ用のプレート、チューブ、ビーズ、膜などを挙げるこ
とができ、その材質としては、例えば、ポリエチレン、
ポリスチレン、ポリブロピレン、ニトロセルロース、ガ
ラスなどを挙げることができる。

本発明でヒ）Ｍｎ−３ＯＤの測定で用いる洗浄液は、担
持体に一定量の「抗体」を担持した後にその担持体に担
持されなかったものを洗浄して除去したり、測定試料中
のヒ１−Ｍｎ−３ＯＤを担持体に担持された「抗体Ｊと
反応させた後にその未反応物質を洗浄して除去するため
に必要である。

このような目的に用いる洗浄液としては、例えば、水、
反応時のｐＨに調整した緩衝液（リン酸緩衝液、トリス
−塩酸緩衝液などの緩衝液）、前記の緩衝液にＴｗｅｅ
ｎ２０．Ｔｗｅｅｎ６０などの界面活性剤をＯ〜３容量
％含む）などを挙げることができるが、好ましくは前記
の界面活性剤を０．０２〜０．８容量％含む反応時のｐ
Ｈに調整した緩衝液を用いるのがよい。

本発明のヒトＭｎ−３ＯＤの測定で用いるブロッキング
液は、ｒ酵素標識抗体」や測定試料中のヒ）Ｍｎ−３Ｏ
Ｄが担持体表面に非特異的に結合するのを防ぐのに必要
であり、また、測定試料の希釈液を調製するときの溶媒
としても用いることができる。

このような目的に用いるブロッキング液は、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）　、陣
笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、γ−グロブリンなどの高
分子蒼白質、各種動物の血清などを前記の反応時のｐＨ
に調整した洗浄液に溶屑することによって調製すること
ができるが、これらの高分子蒼白質の濃度は、０．１〜
１０ｗｔ／ｖｏ１％、好ましくは、０．１〜２　ｗｔ／
ｖｏ１％とするのがよく、各種動物の血清を用いて調製
する場合には、前記の洗浄液を用いて、１〜５０　ｖａ
ｔ／ｖｏ１％、好ましくは、１０〜２０　ｖｏｌ／ｖｏ
１％とするのがよい。

また、必要に応じて、ブロッキング液には、アジ化ナト
リウム、エチル水銀チオサルチル酸ナトリウム、などの
ような蛋白質の防腐剤を必要量添加することもできる。

本発明のヒトＭｎ−３ＯＤの測定で用いる測定試料とし
ては、ヒトの尿、血液、血清などのヒト体液をそのまま
あるいはヒトＭｎ−５００を測定できる範囲内に前記の
洗浄液でこれらの測定試料を適当に希釈したものを用い
ることができる。

本発明のヒトＭｎ−３ＯＤの測定で用いる酵素の基質溶
液（ｒ基質溶液Ｊ）としては、ｒ酵素標識抗体」におけ
る抗体の標識に用いた酵素が反応する基質がＨ，Ｏ，で
ある場合には、その酵素反応によって生じた物質によっ
て呈色するＯ−フェニレンジアミン、２．２°−アミノ
ビス（３エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（Ａ
ＢＴＳ）などの物質を含む緩衝液を用いることができ、
ＭＷがパラニトロフェニルフォスフエイトである場合に
は、ジェタノールアミンなどの物質を含む緩衝液を用い
ることができる。

以上のようにして担持体、洗浄液、ブロッキング液、ｒ
標準ヒトＭｎ−５００溶液」、？基質溶液」を準備し、
ヒトＭｎ−３ＯＤの測定キットであるｒ抗体」、「酵素
標識抗体」を用いて、以下のような段階的反応方法また
は混合液反応方法で各測定の操作段階を経ることによっ
て測定試料中のヒトＭ　ｎ　−Ｓ　ＯＤを測定すること
ができる。

■担持体に一定量のｒ抗体１を担持する段階担持体に一
定容量のｒ抗体」溶液を一定時間接触させる。接触時の
温度は、ｒ抗体」溶液が凍結または沸騰しない限りは特
に限定されないが、好ましくは２〜４０℃がよい。

■担持体に担持されていない「抗体」を除去する段階 担持体にｒ抗体１溶液を一定時間接触した後、ｒ抗体ｊ
溶液を除去し、さらに担持体に担持されずに残留したｒ
抗体」を洗浄液で数回洗浄することによって除去する。

■測定試料およびｒ酵素標識抗体」がｒ抗体１を担持し
ていない担持体表面に非特異的に結合するのを防ぐ段階 前記■の「抗体」を担持した担持体に一定容量のブロッ
キング液を一定時間接触させる。接触時の温度は、ブロ
ッキング液が凍結または沸騰しない限りは特に限定され
ないが、好ましくは２〜４０°Ｃがよい。

■担持体に担持されたｒ抗体１、ヒ）Ｍｎ−３゜Ｄおよ
び「酵素標識抗体１を反応させて、担持体に担持された
ｒ抗体ｊ、ヒトＭｎ−３ＯＤ、ｒ酵素標識抗体１からな
る複合体（以下、ｆ複合体ｊと略記する。）を得る段階 前記■の担持体に担持されたｒ抗体」、測定試料中のヒ
トＭｎ−３ＯＤおよび「酵素標識抗体Ｊを反応させてｒ
複合体Ｊを得る方法としては、ｒ抗体１と測定試料とを
反応させた後にｒ酵素標識抗体１を反応させる段階的反
応方法、または測定試料とｒ酵素標識抗体Ｊとからなる
混合液を調製し、この混合液と「抗体」とを反応させる
混合液反応方法を挙げることができる。

段階的反応方法では、前記■の担持体に担持されたｒ抗
体ｊと一定容量の測定試料とを一定時間接触反応させ、
その未反応溶液を除去した後、ｒ抗体ｊを介して担持体
に担持されずに残留した測定試料を洗浄液で数回洗浄す
ることによって除去し、次に、一定容量の「酵素！＝抗
体Ｊと「抗体ｊを介して担持体に担持されたヒトＭｎ−
３゜Ｄとを一定時間接触反応させることによって、「複
合体Ｊを得ることができる。

混合液反応方法では、測定試料とｒ酵素標識抗体」とか
らなる混合液を調製し、この混合液の一定量と前記■の
担持体に担持された「抗体」とを反応させることによっ
て、ｒ複合体ｊを得ることができる。この混合液を調製
するときには、例えば、水冷などによって測定試料と「
酵素標識抗体ｊとの反応を抑止状態にしておくことが好
ましい。

■担持体に担持されたｒ抗体Ｊ１、ヒトＭｎ−３゜Ｄお
よび「酵素標識抗体」を反応させた後の未反応液を除去
する段階 前記■の未反応溶液を洗浄液で数回洗浄することによっ
て除去する。

■「複合体Ｊとして担持体に担持されたｒ酵素標識抗体
ｊとｒ５質溶液１との反応 ここで用いるｒｚ質溶液１としては、「酵素標識抗体ｊ
における抗体の標識に用いた酵素と対応する基賀とその
酵素反応が起きることによって呈色する物賀を含むもの
を用いる。

その一定容量の１１溶液」を、Ｅ合体１として担持体に
担持されたｒ酵素標識、抗体」と一定時間反応させるが
、好ましくはＨｚ　Ｓ　Ｏａなどの酸、Ｎ　ａ　ＯＨな
どのアルカリまたは酵素阻害剤などを用いて酵素反応を
停止した方がよい。反応温度は、そのときに用いる酵素
の至適温度範囲内であれば特に問題はないが、好ましく
は２０〜３５°Ｃがよい。■酵素反応後の反応液の吸光
度を測定する段階 前記の酵素反応後の反応液の呈色が最大吸光度を示すと
きの波長でその反応液の吸光度を測定する。

以上のようにして、測定試料のかわりに！標準ヒ）Ｍｎ
−３ＯＤ溶液１を用いた結果から、検量線を作成し、測
定試料中のヒ１−Ｍｎ−３ＯＤ量を迅速、かつ高感度に
測定することができる。

〔実施例〕

以下、本発明を参考例および実施例によって具体的に説
明する。

なお、これらの実施例は、本発明を例示するためのもの
であって、本発明の範囲を限定するものではない。

参考例１ 〔抗体の生産と精製〕 ヒ）Ｍｎ−３ＯＤに対して特異性が高いモノクローナル
抗体を産生ずるｐｃｉ　ｉ株（微工研条寄第１６０８号
）を培養し、リン酸緩衝液で浮遊させたその１０’個の
培養細胞を、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（♂、８週
齢、２週間前にブリスタンを０．５ｍ２腹腔内投与）の
腹腔内に投与して行った。マウス体重の顕著な増加は１
週目頃から認められ、１〜３週目に適宜腹水をとりだし
た。こうして得られたモノクローナル抗体の抗体価は、
１０”〜１０１′であった。

得られた腹水からのモノクローナル抗体の精製は、次の
ようにして行った。

前記の腹水をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）で透析
し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム
に流した。素通り画分を５０％飽和硫安で塩析し、得ら
れた沈澱をリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解し、同緩
衝液に対して透析した。

このようにして得られたヒトＭｎ−３ＯＤに対するモノ
クローナル抗体の純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ルを用いたスラブゲル電気泳動で、いずれの抗体も高純
度であることがわかった。

以上のようにして得たヒトＭｎ−３ＯＤに対する精製モ
ノクローナル抗体（「抗体１）を用いたヒトＭｎ−３Ｏ
Ｄの測定法（ＥＬＩＳＡ法）によって、高感度で、かつ
迅速なヒ１−Ｍｎ−３ＯＤの測定が可能となった。

実施例１ 〔ｒ酵素標識抗体」の作成〕 「酵素標識抗体１における抗体としては、参考例１で得
た精製モノクローナル抗体（「抗体Ｊ）を用いた。

このモノクローナル抗体を用いて、次のように抗体を酵
素で標識し、本発明の測定キットにおける「酵素標識抗
体１を得た。

まず、西洋ワサビペルオキシダーゼ８．５　ｍ　ｇを薫
留水１ｍｌ１に溶解し、０．１Ｍの過沃素酸ナトリウム
を２００μ２加えて室温で３０分間静置した。

この酵素溶液を１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）を用い
て４°Ｃで１晩透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９，５）１００μ２を添加してｐＨ９゜５に調整
した。

一方、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）（以下、Ｐ
ＢＳと略記する。）に溶解していた８、　５　ｍ　ｇの
モノクローナル抗体（ＰＣ−１１）を０．０１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９，５）を用いて４℃で１晩透析
した。このようにして得たペルオキシダーゼとモノクロ
ーナル抗体とを混合し、室温で２時間半静置し、この反
応液にテトラヒドリドホウ酸ナトリウムを加え、４°Ｃ
で２時間静置した。このようにして得たペルオキシダー
ゼ標識モノクローナル抗体は、ＰＢＳを用いて４℃下−
晩透析し、これを瓶に１０ｕｌづつ分注し、ヒトＭｎ　
　Ｓ。

Ｄの測定キットであるｒ酵素標識抗体」　（３０μｇ／
瓶）とした。ヒトＭｎ−３ＯＤの測定時には、ＰＢＳで
適当に希釈して用いた。

実施例２ 〔ヒトＭｎ−３ＯＤの測定キットを用いたヒトＭｎ−３
ＯＤの段階的反応方法による検量線の作成〕 参考例１のｒ抗体」溶液（１０ｔｔｇ／ｍｌ、ＰＢＳで
溶解。）を担持体であるイムノアッセイ用９６ウエル平
底プレート（Ｎｕｎｃ社のポリスチレン製マイクロプレ
ート）に１００μ２づつ分注し、４℃下−晩装置してｒ
抗体」を各ウェルに担持した。次に、担持体に担持され
なかったｒ抗体ｊを除去するために０．０５％のＴｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳからなる洗浄液で各ウェルを洗浄
した。さらに、このプレートへのヒトＭｎ−３ＯＤや「
酵素標識抗体」の非特異的な吸着を防ぐために０．１％
のＢＳＡを含むＰＢＳを２００μ２づつ各ウェルに分注
して室温で３０分間静１した。次に、同洗浄液で洗浄後
、ｒ標準ヒ）Ｍｎ−３ＯＤ溶液」　（２，５，１３，３
２，８０，２００，５００ｎｇ／ｍｆ、ＰＢＳで溶解、
）を調製し、各ウェルに１００μｌづつ分注して室温で
１時間静置した０次に、同洗浄液で洗浄後、実施例１で
得られたｒ酵素標識抗体」溶液を各ウェルに１００μ２
づつ分注して室温で１時間静置した０次に、同洗浄液°
で洗浄後、各ウェルにｒｙ４質溶液Ｊ　　（１０ｍｇの
０−フェニレンジアミンと５μ２０３５％Ｈ，Ｏ□をｐ
　Ｈ５，０の０．１　Ｍクエン酸暖上液２５ｍ２に溶解
）を１０ＯｕＩｌづつ分注し、遮光して室温で１５分間
静置した。最後に、さらに２Ｎ硫酸を５０μβづつ分注
して酵素反応を停止し、マイクロプレート光度計を用い
てその反応停止後の溶液の４９２　ｎｍにおける吸光度
を測定した。

その結果、ｒ酵素標識抗体１を用いたこの段階的反応方
法によるヒトＭｎ−３ＯＤの測定は、Ｔ抗体１を固定化
したイムノアッセイ用９６ウエル平底プレート（Ｎｕｎ
ｃ社のポリスチレン製マイクロプレート）を用いると、
約２時聞手でヒトＭｎ−３ＯＤを高感度に測定できた。

その結果を第１図に示す。

実施例３〜５ 〔段階的反応方法による血清の希釈直線性試験］実施例
２におけるｒ標準ヒ１−Ｍｎ−３ＯＤ溶液」の代わりに
、ヒト標準血清（化血研製のネスコールＸ）でヒトＭｎ
−３ＯＤ濃度が２２０．６６０、または１８００ｎｇ／
ｍｆとなるように調製した溶液を４倍、８倍、１６倍、
３２倍、６４倍、１２８倍に希釈した溶液を用いた以外
は、実施例２と同様にしてヒトＭｎ−３ＯＤを測定した
。

その結果、８〜１２８倍の希釈範囲で希釈直線性が認め
られた。その結果を第２図に示す。

実施例６〜７ 〔段階的反応方法によるヒ）Ｍｎ−３ＯＤの添加回収試
験］ 実施例２における「標準ヒｔ−Ｍｎ−３００溶液ｊの代
わりに、ヒトＭｎ−３ＯＤを含むヒト標準血清（Ｏ１５
０，１１００ｎ／ｍｆ。化血研製のネスコールＸ溶液に
溶解）を同ヒト標準血清で１１倍に希釈して調製した溶
液を用いた以外は、実施例２と同様にしてヒトＭｎ−３
ＯＤを測定した。その結果、添加したヒトＭｎ−３ＯＤ
量と実際の測定で求められたヒトＭｎ−３ＯＤｆは、殆
ど一致した。その結果を第１表に示す。

第１表 実施例８ 〔ヒトＭｎ−３ＯＤの測定キットを用いたヒトＭｎ−３
ＯＤの混合液反応方法による検量線の作成〕 参考例１のｒ抗体」溶液（１０μｇ／ｍｊ！、ＰＢＳで
溶解、）を担持体であるイムノアッセイ用９６ウエル平
底プレート（Ｎｕｎｃ社のポリスチレン製マイクロプレ
ート）に１００μＥづつ分注し、４°Ｃ下−２晩静置し
てｒ抗体Ｊを各ウェルに担持した。次に、担持体に担持
されなかった「抗体１を除去するために０．０５％の７
ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳからなる洗浄液で各ウェルを
洗浄した。さらに、このプレートへのヒトＭｎ−３ＯＤ
や？酵素標識抗体Ｊの非特異的な吸着を防ぐために０．
１％のＢＳＡを含むＰＢＳを２００μ２づつ各ウェルに
分注して室温で３０分間静置した。次に、同洗浄液で洗
浄後、既知量のヒトＭｎ−３゜Ｄ溶液と実施例１のｒ酵
素標識抗体」溶液からなる混合液を「標準ヒトＭｎ−３
ＯＤ溶液１　（２，５，１３，３２，８０，２００，５
００ｎ　ｇ／ｍ２゜ＰＢＳでン容角￥。）として８周製
し、各ウェルに１００μ２づつ分注して室温で１時間静
置した。

次に、同洗浄液で洗浄後、各ウェルに１１溶液Ｊ　　（
１０ｍｇの０−）ユニレンジアミンと５μ２の３５％Ｈ
２０，をｐ　Ｈ５，０の０．１　Ｍクエン酸緩衝液２５
ｍ２に溶解）を１００μβづつ分注し、遮光して室温で
１５分間静置した。最後に、さらに２Ｎ硫酸を５０μ２
づつ分注して酵素反応を停止し、マイクロプレート光度
計を用いてその反応停止後の溶液の４９２　ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。その結果、ｒ酵素標識抗体ｊを用
いたこの混合液反応方法によるヒ）Ｍｎ−３ＯＤの測定
は、？抗体ｊを固定化したイムノアッセイ用９６ウエル
平底プレート（Ｎｕｎｃ社のポリスチレン製マイクロプ
レート）を用いると、約１時間半でヒトＭｎ−３００を
高感度に測定できた。その結果を第３図に示す。

実施例９〜１０ 〔混合液反応方法によるヒ）Ｍｎ−３ＯＤの添加回収試
験〕 実施例８におけるｒ標準ヒ）Ｍｎ−３ＯＤ溶液Ｊの代わ
りに、ヒトＭｎ−３ＯＤを含むヒト標準血清（０，１０
０，２５０ｎｇ／ｍｆｆ１゜化血研製のネスコールＸ溶
液に溶解）を同ヒト標準血清で１１倍に希釈して調製し
た溶液を用いた以外は、実施例８と同様にしてヒ）Ｍｎ
−３ＯＤを測定した。その結果、添加したヒトＭ　ｎ　
−Ｓ　ＯＤ量と実際の測定で求められたヒ）Ｍｎ−３Ｏ
Ｄｉは、殆ど一致した。その結果を第２表に示す。

第２表 比較例１〜５ 〔段階的反応方法によるヒト血清蛋白質との反応性〕 実施例２の？標準ヒ）Ｍｎ−３ＯＤ溶液１の代わりに、
ヒト血清蛋白質であるアルブミン、α−グロブリン、β
−グロブリン、γ−グロブリン、ヘモグロビン、Ｃｕ、
Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ溶液を用いた以外
は、実施例２と同様にして、それらのヒト血清蛍白質と
の反応性を検討した。その結果、４９２　ｎｍにおける
吸光度は、いずれのヒト血清蛍白質の場合にも殆ど認め
られなかった（Ｈち、いずれのヒト血清蛍白質も本測定
を妨げなかった。なお、α−グロブリン、β−グロブリ
ンは、いずれも全く反応しなかったので、図では省略し
た。）。その結果を第４図に示す。

比較例６〜１０ 〔混合液反応方法によるヒト血清蛍白質との反応性〕 実施例８のｒ標準とトＭｎ−３ＯＤ溶液」の代わりに、
ヒト血清蛍白質であるアルブミン、α−グロブリン、β
−グロブリン、γ−グロブリン、ヘモグロビン、Ｃｕ、
Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ溶液を用いた以外
は、実施例８と同様にして、それらのヒト血清蛍白質と
の反応性を検討した。その結果、４９２ｎｍにおける吸
光度は、いずれのヒト血清蒼白質の場合にも殆ど認めら
れなかった（即ち、いずれのヒト血清蛋白質も本測定を
妨げなかった。なお、α−グロブリン、β−グロブリン
は、いずれも全（反応しなかったので、図では省略した
。）。その結果を第５図に示す。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ｒ抗体１、ｒ酵素標識抗体１を必須と
するヒトＭｎ−３ＯＤの測定キットを用いることによっ
て、ヒトＭｎ−３００を容易、迅速、かつ高感度で測定
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のヒトＭｎ−３ＯＤの測定法で、段階
的反応方法によって作成したヒ）Ｍｎ−３ＯＤの標準曲
線を示す。 第２図は、本発明のヒ）Ｍｎ−３ＯＤの測定法で、段階
的反応方法によって求めた標準血清による希釈直線性を
示す。 第３図は、本発明のヒ）Ｍｎ−３ＯＤの測定法で、混合
液反応方法によって作成したヒトＭ　ｎ−３ＯＤの標準
曲線を示す。 第４図は、ヒト血清蛋白質であるアルブミン、α−グロ
ブリン、β−グロブリン、γ−グロブリン、ヘモグロビ
ン、Ｃｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼとの反
応性を段階的反応方法で検討した結果を示す。 第５図は、ヒト血清蛍白質であるアルブミン、α−グロ
ブリン、β−グロブリン、γ−グロブリン、ヘモグロビ
ン、Ｃｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼとの反
応性を混合液反応方法で検討した結果を示す。 特許出廐人　　宇部興産株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼの測定
   法で用いるものであって、 （ａ）ヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼに対し
   て非常に高い特異的な免疫反応性を有するモノクローナ
   ル抗体 および （ｂ）ヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼに対し
   て非常に高い特異的な免疫反応性を有するモノクローナ
   ル抗体を酵素で標識した試薬 を必須とすることを特徴とするヒトＭｎ−スーパーオキ
   シドジスムターゼの測定キット。（２）請求項１に記載
   のモノクローナル抗体を担持体に担持させた後、その担
   持されたモノクローナル抗体、測定試料中のヒトＭｎ−
   スーパーオキシドジスムターゼおよび請求項１に記載の
   酵素で標識されたモノクローナル抗体を反応させて、担
   持体に担持されたモノクローナル抗体、ヒトＭｎ−スー
   パーオキシドジスムターゼ、酵素で標識されたモノクロ
   ーナル抗体からなる複合体を作成することを特徴とする
   ヒトＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼの測定法。