JPH07507439A - 酵母での蛋白質発現用人工プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵母での蛋白質発現用人工ブロモ−タ一本発明は、酵母における蛋白質、特に異 種蛋白質の発現用新規人工プロモーター、前記プロモーターが組み込まれた蛋白 質発現用ベクター、この発現ベクターにより形質転換された酵母、特にサツカロ マイシス・セレビシアエ株、およびこれらの株の助けによる組換え蛋白質の製造 方法に関するものである。

酵母、特にサツカロマイシス・セレビンアエという、その遺伝的性質が詳細に研 究されている非病原性微生物は、蛋白質、特に異種蛋白質の発現に好ましい真核 生物宿主である。従って、既知プロモーターよりも有利な新規蛋白質発現用プロ モーターを発見または構築することが重要である。

遺伝子から上流に位置するＤＮＡ配列であり、前記遺伝子の転写に関与する酵母 プロモーターの構造については、部分的に知られ、理解され始めている。前記プ ロモーターは、ＡＴリッチ帯に位置するＴＡＴ八成分成分記成分から下流および 適当ならば前記成分から上流の転写開始領域、誘導物質またはリプレッサーの影 響下でプロモーターの長さを調節する上流活性化配列（ＵＡＳ）または上流抑制 配列（ＵＲ３）と呼ばれる配列を含むことが知られている。

本出願人は、２種の既知プロモーターから新規ハイブリッド・プロモーターを構 築した。すなわち、サツカロマイシス・セレビシアエのＧＡＬ７遺伝子のプロモ ーター（タジマ等、１９８６、［モレキユラー・セルラー・バイオロジー、６． ２４６−２５６）および天然ＡＤＨ２プロモーターの場合と似た配列を有するプ ロモーター（ＡＤＨ２遺伝子の５′−近接領域、ラッセル等、（１９８３）、ジ ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２５８．２６７４−２６８２ 頁に記載）であり、後者を本特許出願ではＡＤＨ，プロモーターと呼ぶ。

従って、本発明は、酵母での蛋白質発現を目的とし、−上流活性化配列ＴＪＡＳ １およびＵＡＳ２を含む、サツカロマイシス・セレビノアエのＧＡＬ７遺伝子の プロモーターの配列のＴＡＴＡ成分から上流の部分配列、および −ＴへＴＡ成分および転写開始領域を含むＡ　Ｄ　Ｈ２プロモーターの配列の部 分配列 を含む新規人工プロモーターに関するものである。

好ましくは、サツカロマイシス・セレビシアエのＧＡＬ７遺伝子のプロモーター のＴＡＴＡ成分から上流の部分配列は、下記配列またはその部分配列である。

■ Ｃ丁ＴＴＡＧ（ｊＡＴＧＴＴｃ自ＧＴＴＡＧ丁ＴＴＧＧＣＡ丁Ｇ。

ＴＡＴＡ成分および転写開始領域を含むＡＤＨ，プロモーターの配列の部分配列 は、好ましくは下記配列またはその部分配列から選ばれる。

（ＣＴＡＴＣＡＣＡＴＡＴＡＡＡＴＡＱＡ特に有利なプロモーターは、下記配列 を含むものである。

ＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＣＡＡＧＴＣ〜ｔＴｃＡＡＡｃｃｃ＋τ＾ＣＣＣ＾τＡＱ ＴＧＴ＾ＩＡＴＩＴ＾ｉｃｙ本発明プロモーターは、当業界の熟練者であれば熟 知している慣用的組換えＤＮＡ技術により得られる。

本発明プロモーターは、既知プロモーターおよび特にＡＤＨ！プロモーターおよ びＧＡＬ７遺伝子のプロモーターを凌ぐ重要な利点を有する。

本発明プロモーターは、特にアスペルギルス・フラブス尿酸オキシダーゼに関す る高い最大レベルの転写、従って発現を可能にし、３つのレベルニ ーグルコースの存在下およびガラクトースの非存在下でのゼロ・レベル、発現は 全（検出されず、これは、これらの条件下で生長しているサツカロマイシス・セ レビシアエ株におけるＧＡＬ７遺伝子のプロモーターに関して公表された結果と 同じ結果である（タジマ等、１９８６、「モレキュラー・セルラー・バイオロジ ー」、６．２４６−２５６）。ＡＤＨ，プロモーターは、これらの条件下で低い が検出可能なレベルの発現を示す。

一グルコースおよびガラクトースの非存在下での基本レベル、弱い発現が存在し 、ＡＤＨ！プロモーターについて観察された結果（最大レベル）およびＧＡＬ７ 遺伝子のプロモーターについて公表された結果（ゼロ・レベル：タンマ等、１９ ８６、モレキュラー・セルラー・バイオロジー、６．２４６−２５６）間の中間 的結果である。

−グルコースの非存在下およびガラクトースの存在下での発現の最大レベル で発現を調節する可能性を提供する。

ある種の条件下でゼロ・レベルを示すプロモーターを有する場合の、酵母におけ る異種蛋白質の発現に関する利点は、株の伸長中に最低の生産的細胞に有利に働 ぐ選択圧力を全て回避できる可能性が得られることである。これは、蛋白質が宿 主細胞に対して毒性を示す場合に特に重要である。

２つの発現レベルすなわち、一方は基本レベル（非誘導性）および他方は最大レ ベル（誘導性）を有するプロモーターの利点は、誘導物質の濃度を変えることに より中間レベルを選択できる可能性に存する。

さらに、本発明は、興味の対象である遺伝子の発現、その複製および形質転換細 胞の選択に必要な手段と共に前記遺伝子をもつ酵母用発現ベクターであり、興味 の対象である遺伝子が上記プロモーターの制御下にあるベクターに関するもので ある。

興味の対象である遺伝子は、酵母の内在性遺伝子または真核生物もしくは原核生 物外生遺伝子である。真核生物外生遺伝子として特に貴重なのは、アスペルギル ス・フラブス尿酸オキシダーゼをコードする組換え遺伝子、ヒト・サイトカイニ ンをコードする組換え遺伝子およびヒルジンをコードする組換え遺伝子である。

外生遺伝子によりコードされた蛋白質が自然分泌される場合、この蛋白質をコー ドする配列の前に好ましくはシグナル配列が先行する。宿主細胞に従い選ばれる このシグナル配列の機能は、細胞質から組換え蛋白質を引き出させることであっ て、組換え蛋白質に天然蛋白質の場合と類似した立体配置をとらせ得、その精製 をかなり容易にする。このシグナル配列は、成熟蛋白質を放出するシグナル・ペ プチダーゼによる単一段階（削除された配列は通常プレ配列またはシグナル・ペ プチドと呼ばれる）、または、このシグナル配列がプレ配列と呼ばれるシグナル ・ペプチダーゼにより削除された配列に加えて、プロ配列と呼ばれる、１つまた はそれ以上の蛋白質分解事象の進行中に遅れて削除された配列を含む場合、複数 段階で開裂され得る。

さらに、本発明は、上記発現ベクターにより形質転換された酵母、特にサツカロ マイシス・セレビシアエ株、および興味の対象である蛋白質の製造方法であって 、ガラクトースの存在下での前記株の培養を含む方法に関するものである。

特に、本発明は、下記番号でフランス、パスツール研究所のコレクンオン・ナン オナル・ド・クルツル・ド・ミクロオルガニスムと呼ばれる公的寄託機関に寄託 されたサツカロマイシス・セレビシアエ株に関するものであるニ ドリス−ＨＣｌ　１０ミリモル　ｐＨ７，６、ＥＤＴＡ　１０ミリモル、β−メ ルカプトエタノール５Ｑｎｌ／１゜菌糸体懸濁液を５分間ツエルーミューラー粉 砕機（振動発生式）中で粉砕する。

粉砕材料を採取し、ビーズを傾けて取る。上清を除去しく約４５■ｌ）、塩化リ チウムに関して３モルの最終濃度に戻し、０℃で貯蔵する。

２日後、それを１１０００Ｏｒｐで６０分間遠心分離する。上演を捨て、残留物 を４０ｓｌのＬｉＣ１（３モル）に吸収させ、再び１時間３０分間１００００ｒ ｐ■で遠心分離する。

プロテイナーゼＫ（シグマ）４０．ｃｚｇ／ａ＋１．５ＤＳ（０，ＩＷ／Ｖ％） およびＥＤＴＡ２０ミリモルを加える。混合物を３時間３７℃でインキュベーシ ョンする。２倍容量のエタノールによる沈澱後、７０％エタノールで洗浄する。

残留物を０．５ａ＋１のＴＥ緩衝液（トリス−ＨＣｌ、１０ミリモル、ＥＤＴＡ 、１ミリモル、ｐＨ７，５）に吸収させ、混合物をクロロホルムで２回抽出し、 エタノールにより沈澱させる。

ＲＮＡをアルコール中−８０℃で貯蔵する。

２）ＲＮＡのポリＡ＋フラクションの精製的ｌｌｌ１ｇのＲＮＡを４℃で２０分 間（１５０００ｒｐｍ）沈澱させ、次いで７０％エタノールで洗浄し、乾燥する 。残留物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に吸収させ、ポルテックス中での撹はんにより再 懸濁する。オリゴｄＴ−セルロース３型（コラボレイティブ・リサーチ・インコ ーポレイテッド、バイオメディカルズ・プロダクト・ディビジョンにより市販さ れている）を、製造会社の勧告に従い製造する。ＲＮＡをオリゴｄＴ上に置き、 穏やかに撹はんしてビーズを再懸濁させ、次いで６５℃で１分間加熱する。

懸濁液を０．５モルＮａＣ１に調節し、次いで１０分間穏やかに撹はんする。次 いで、それを１１００Ｏｒｐで１分間遠心分離し、上清を除去し、０．５モルＮ ａＣ１を含むＴＥ緩衝液１ｍｌにより残留物を２回洗浄する。上演を除去する。

１ｍｌのＴＥ緩衝液にビーズを懸濁し、次いでこの懸濁液を６０℃で１分間加熱 し、続いてそれを１０分間傾斜プレート上て撹はんすることにより、ＲＮＡのポ リアデニル化フラクション（メツセンジャーＲＮＡにより構成される）を溶離す る。次いで、それを１０００ｒｐＨで１分間遠心分離することにより、一方では 溶液中に遊離ｍＲＮＡを含む上清が採取され、他方ではセルロース・ビーズの残 留物が採取される。上記連続操作（溶離から出発）を反復する。この方法で得ら れた上演をプールし、過剰のビーズを遠心分離により除去し、常套技術（マニア チス：前掲書中）に従い上清をＮａＣ１含有エタノールにより沈澱させる。

３）ｃＤＮＡライブラリーの構築 前項の記載に従い分離されたメツセンジャーＲＮＡを用いて、ベクターｐＴＺ１ ９Ｒ（ファルマンアにより市販されている）中でｃＤＮＡライブラリーを構築す る。このベクターは、特有の制限部位を含むポリリンカーを含むプラスミドであ る。

使用されるクローニング技術は、ギヤプット等により記載された技術（プライマ ー−アダプター技術、キャブット等、「ブロンーデインダス・オン・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステーブ ・オン・アメリカＪ（１９８６）８３．１６７０−１６７４）である。

上記技術は、第一に、ベクターをＰｓｔｌで消化し、突出した３゜末端へポリｄ Ｃテイルを加え、次いで生成したプラスミドをＢａ■ＨＩで消化することにより 構成される。ベクターに対応するフラグメントを、セファロースＣＬＪＢカラム （ファルマシア）で精製する。

従って、それは、一端にポリｄＣティルを含み、他端はＢａ■Ｈ１型の接着末端 である。第二に、メツセンジャーＲＮＡを、配列５゛＜ＧＡＴＣＣＧＧＧＣＣＣ Ｔ（＋り）＜３を有するプライマーから始まる逆転写に付す。すなわち、ｃＤＮ Ａは、ＢａｍＨＩ接着末端に相補的な配列ＧＡＴＣＣを５′末端に有する。

逆転写酵素により得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを、アルカリ性加水分解 に付すことにより、ＲＮＡが除去され得る。次いで、１重鎖ｃＤＮＡをセファロ ースＣＬ４Ｂカラムでの２サイクルにより精製し、末端トランスフェラーゼでの 処理に付すことにより、３′末端にポリｄＧを加える。ｃＤＮＡを、上記に従い 製造されたベクターへ１本鎖形態で挿入する。プライマーに相補的な第２オリゴ ヌクレオチド、アダプターは、ｃＤＮＡの５′末端に「オーブンＪＢａｍＨ１部 位を生成するために必要である。ベクター、ｃＤＮＡおよびアダプターのハイブ リダイゼーンジン後、組換え分子をファージＴ４のリガーゼの作用により循環さ せる。次いで、１重鎖領域をファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼにより修復する 。

この方法で得られたプラスミドのプールを用いて、アンピシリン耐性に関してＭ Ｃ１０６１株を形質転換する（カサバダン、チａつおよびコーエン、「ジャーナ ル・オン・バクテリオロジーＪ（１９８０）１４３．９７１−９８０頁）。

４）尿酸オキシダーゼの部分配列の決定アスペルギルス・フラブス尿酸オキシダ ーゼ製品（シグマ）を、レッド−アガロース１２０（ングマ）カラムでのクロマ トグラフィーにより再精製し、この後、ウルトロゲル・アカ４４（ＩＢＦ）、ア クリルアミド−アガロース・ゲルでろ過した。

蛋白質の直接的アミノ末端配列決定を試みることにより、精製尿酸オキシダーゼ のアミノ酸配列に関する情報が得られ、ｃＤＮＡのクローニングに必要なプロー ブの合成が可能となった。この配列決定は、恐らくは蛋白質のアミノ末端ブロッ キングのため、不首尾に終わった。

従って、下記ストラテジーを展開することにより、尿酸オキシダーゼの部分配列 が得られたニ ー蛋白質分解酵素による蛋白質の開裂（酵素トリプシンおよびプロテアーゼＶ８ ）、 一生成したペプチドの逆相ＨＰＬＣによる分離、−精製ペプチドの配列決定。

１）トリプシンによる尿酸オキソダーゼの加水分解、ペプチドの精製および配列 決定 炭酸アンモニア緩衝液１００ミリモル、ｐＨ８，９中９＋ｏｇ／ｍｌの濃度の尿 酸オキ／ダーゼを、３０℃で２４時間３０／１の尿酸オキシダーゼ／トリブレン 重量比でトリプシン（ワーシントン、ＴＰＣＫ）により消化した。トリプンン加 水分解後、６０μｇの消化された尿酸オキソダーゼを、水中１％（Ｖ／Ｖ）アセ トニトリルおよび０．１％（Ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸で平衡状態にしたブラウ ンクーＧ１８グラフトンリカの逆相ＨＰＬＣカラム（カラム・１０Ｘ０．２ｃｍ ）へ直接注入した。次いで、ペプチドを、１５０μｍ／分の速度で、６０分でア セトニトリルを１％から６０％に変えながら、トリフルオロ酢酸水溶液（０゜ｌ ｖ／ｖ％）中アセトニトリルの一次勾配により溶離した。

カラムを通過したペプチドは、２１８ｎａでの光学密度の測定により検出された 。

溶離プロフィールを図１に示す。ただし、文字Ｔ（トリプシン）の後の番号は、 同定されたピークに対応する。

各ピークを集め、各分解周期後、形成されたフェニルチオヒダントイン誘導体を 連続分析する、クロマトグラフ（アプライド・バイオシステムズからの４３ＯＡ モデル）を備えた蛋白質シーケンサ−（アプライド・パイオンステムズから４７ ＯＡモデル）での分析時まで一２０℃で貯蔵した。

下表（１）は、同定された９ビークのペプチド配列を示す。

２）プロテアーゼ■８による尿酸オキ／ダーゼの加水分解、ペプチドの精製およ び配列決定： 酢酸アンモニウム緩衝液１００ミリモル、ｐＨ６，８中２ｍｇ／＋ａｌの濃度の 尿酸オキソダーゼを、７２時間３０℃、６０／１の尿酸オキ７ダーゼ／プロテア ーゼｖ８比で、スタフィロコッカス・アウレウスのプロテアーゼＶ８（ベーリン ガーーマンハイム）により消化した。

次いで、消化された尿酸オキシダーゼ１６０μｇを、水中１％アセトニトリルお よび０．１％（Ｖ／Ｖ）　トリフルオロ酢酸により平衡状態にした、ブラウンソ ーＧ１８グラフト・シリカの逆相ＨＰＬＣカラム（カラム：１０Ｘ０．２ｃｍ、 粒子＝７×ｏ、０３μｍ）へ注入した。次いで、ペプチドを、１５０μｌ／分の 速度で、６０分でアセトニトリルを１％から６０％に変えながら、トリフルオロ 酢酸水溶液（０゜１％（Ｖ／Ｖ））中アセトニトリルの一次勾配により溶離した 。カラムを通過したペプチドは、２１８ｎｍでの光学密度の測定により検出され た。

溶離プロフィールを図２に示す。ただし、文字Ｖ（プロテアーゼＶ８）の後の番 号は同定されたピークに対応する。

各ピークを集め、上述の蛋白質ソーケンサーでの分析時まで一２０℃で貯蔵した 。

下表（１）は、同定された５つのピークのペプチド配列を示す。

表（１） ５）細菌のスクリーニング １）標識プローブの製造 蛋白質のアミノ酸配列から誘導されたプローブの２つのプールを、バイオサーチ ４６００ＤＮＡ合成装置の助けにより合成した。第１プールは、残基Ｈｉｓ−Ｔ ｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｐ、すなわち５゛から３°までの配列（Ｔ ２７の配列の部分）：ＴＧＧＧ ＴＣＧＡＴ　ＴＣＡＡ　ＴＡ　ＴＧ ＣＡＡＡ に対応する。このプールは、事実上、可能な組み合わせ全部を表す２’Ｘ３＝４ ８の相異なるオリゴヌクレオチドにより構成される。

第２プールは、アミノ酸残基Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ 、すなわち５°から３“までの配列（Ｖ５の配列の部分）ＧＡＧＴ Ａ　ＡＡＧＣＣＣＣＡ　ＡＡ　ＴＧ に対応する。このプールは２’Ｘ４＝６４の組み合わせにより構成される。

プローブを、末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ（ＴｄＴＸＩ　Ｂ 　Ｌインコーホレイテッドにより市販されている）により標識する。

この反応は、「コバルト」反応緩衝液（Ｉ　Ｂ　Ｉ、インコーホレイテッドによ り１０倍濃縮物として供給）：１．４モルのカコジル酸カリウム−ｐＨ７，２， ３００ミリモルのジチオトレイトール、１μｇの酵素末端デオキシヌクレオチド ・トランスフェラーゼ（ＩＢＩ、インコーホレイテッド）およびＰ３２で標識し た、５０μＣｉのデオキシノチジル・トリホスフェート、ｄＣＴＰ中オリゴヌク レオチド溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）の混合物１００μｇにおいて行なわれる。

この反応は、３７℃で１０分間行なわれ、次いで１μｌの領５モルＥＤＴＡを加 えることにより止められる。

フェノール抽出を行い、抽出物をバイオゲルＰＩＯポリアクリルアミド（バイオ ラド・１５０−１０５０）のカラムにおいて透析する。

２）尿酸オキシダーゼｃＤＮＡを含むコロニーのハイブリダイゼーションおよび 検出 約４００００のコロニーを、グルンスタインおよびホグネスにより開発された正 常部位ハイブリダイゼーション技術（１９７５、プロシーディンゲス・オン・ザ ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ ステーブ・オン・アメリカ、７２．３９６１）によりスクリーニングする。約６ ０００の細菌をペトリ皿で培養することにより、単離されたコロニーが得られる 。３７℃で２４時間インキュベーション後、各国を２つのフィルターで複製し、 各フィルターはプローブの２つのプールのうちの一方により処理されるものとす る。こうして、得られたコロニーを全て、プローブの２つのプールにより平行し て試験する。

フィルターを、６ＸＳＳＣ１１０×デンハルツ溶液および１００μｇ／ｍｌの音 波処理した変性さけ精液ＤＮＡ（シグマ）を含む緩衝液中でプローブの２つのプ ールのうちの一方とハイブリダイゼーションする。このハイブリダイゼーション は、４２℃の温度で１６時間行なわれる。６ＸＳＳＣ溶液は、２０ＸＳＳＣ溶液 を希釈することにより得られる。２０ＸＳＳＣ緩衝液の製法は、マニアチス、フ リーチュおよびサンプルツクにより記載されている（前掲書中）。要約すると、 この緩衝液は、１７５．３ｇ／ｌのＮａＣ１および８８．２ｇ／ｌのくえん酸ナ トリウムを含み、数滴の１ＯＮ−ＮａＯＨによりｐＨ７に調節される。１０×デ ンハルツ溶液は、最終容量５００鵬１当たり１ｇのフィニル、１ｇのポリビニル ピロリドンおよび１ｇのヒト血清アルブミンを含む。

４２℃で５ｘｓｓｃ溶液により洗浄後（浴槽を５回交換して３時間）、フィルタ ーをジョセフ紙で拭い、オートラジオグラフィーにかける。１６時間後フィルタ ーを展開する。約０．５％のコロニーのフラクションは、プローブの２つのプー ルとハイブリダイゼーションすることが見出された。

このフラクションからの５つのコロニーを採取および精製した。

プラスミドＤＮＡをこれらのコロニーの各々から製造し、Ｂａ＋ｓＨＩまたはＨ ｉｎｄＩＩＩまたはＢａ＋ｗＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの両方で消化することに より、このＤＮＡを分析した。

アガロース・ゲルでの分析後、得られた５つのプラスミドは、ＢａｍＨＩおよび ＨｉｎｄＩＩＩにより線形化されたことが見出された。二重消化により、クロー ン化ｃＤＮＡの全体に対応するフラグメントの放出が可能となる。このフラグメ ントのサイズは、３ケースでは約１．２ｋｂであり、他の２ケースでは約０．９ ｋｂである。後で測定するため、０．９ｋｂフラグメントのうちの一つおよび１ ．２ｋｂフラグメントのうちの一つを選択し、再クローン化した（下記６項参照 ）。

６）尿酸オキソダーゼｃＤＮＡの配列の決定一方ではＱ、９ｋｂフラグメントの うちの一つ（クローン９Ａ）および他方では１．２ｋｂフラグメントのうちの一 つ（クローン９Ｃ）を、１本鎖ファージＭ１３の複製形態のＤＮＡにおいて再ク ローン化した。一方はＱ、９ｋｂフラグメントおよび他方は１．２ｋｂフラグメ ントを含むＭ１３クローンのＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化することにより 、一連の部分重複Ｍ１３クローンを生成した（方法：ＩＢＩの「サイクローン■ パイオンステム」）。ノデオキシリボヌクレオチド方法（サンガー等、ＰＮＡＳ −Ｕ、Ｓ、Ａ、−１９７７，１４，５４６３−５４６７）により上記クローンを 配列決定した。

クローン９Ｃのヌクレオチド配列を図３に示す。同様に、矢印によりクローン９ Ａの出発点を示し、アステリスク★を後に付したヌクレオチド記号により、クロ ーン９Ｃの場合とは同一ではないクローン９Ａの配列決定されたヌクレオチドを 示す（２つの配列並びに後続の構築で使用されるＡｃｃｌおよびＢａｍＨＩ制限 部位を対合させる場合（２参照））。

長い方のフラグメント（クローン９Ｃ）のヌクレオチド配列は、２つの差異を例 外として、短い方のフラグメント（クローン９Ａ）のヌクレオチド配列と部分的 に一致することが判る（図３参照）。差異の一つは静止性であり、他方はトリプ トファン残基からグリシン残基への変化に対応する。これらの差異は、単離され たメツセンジャーＲＮＡにおける差異（上記２参照）または上記ｃＤＮＡライブ ラリー（３参照）の構築時に使用された逆転写酵素での誤りに起因し得る。

長い方のフラグメントの場合、ＡＴＧコドン（図３における１０９位）は、約３ ４２４０ダルトンの分子量を有する３０２アミノ酸のポリペプチドに対応する転 写解読枠を開き、その配列は精製アスペルギルス・フラブス尿酸オキシダーゼの 部分配列に対応している（４）参照）。

図４は、ＡＴＧコドンにより開かれたＤＮＡ配列およびフードされたポリペプチ ドを示し、コードされたポリペプチドの反対側矢印により、トリプシンおよびプ ロテアーゼＶ８によるアスペルギルス・フラブス尿酸オキシダーゼの加水分解に より得られた配列決定されたペプチド（４）参照）を示す。

上記ポリペプチドの配列はトリブレットＳｅｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕで終結する ことが見出された。これは、ベルオキシソームに存在する酵素に特有なことであ る（グツドＳＪ１等、「ジャーナル・オン・セル・バイオロジー且０８（１９８ ９）１６５７−１６６４）。

実施例２ 酵母における尿酸オキ／ダーゼに関する３種のｃＤＮＡ発現ベクターＡＤＨ２プ ロモーターをもつプラスミドｐＥＩｖｌＲ４６９、およは括弧で示されている。

びプラスミドｐＥＭＲ４７３、および本発明の人工プロモーターをもつプラスミ ドｐＥＭＲ５１５の構築。

使用されたストラテジーは、一般的に利用可能な先夜プラスミドから得られたフ ラグメント、および現在常用されている技術により合成的に製造されたフラグメ ントを使用する。使用されるクローニング技術は、Ｔ、マニアチス、Ｅ、　Ｆ、 　フリーチュおよびＪ、サンプルツクにより「モレキュラー・クローニング、ア ・ラボラトリ−・マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ −１１９８４）に記載された技術である。オリゴヌクレオチドは、バイオサーチ ４６００ＤＮＡ合成装置の助けにより合成される。

以下の記述は、図５．６および７を参照すればより明確に理解されるはずである 。これらの図は、各々プラスミドｐＥＭＲ４１４、ｐＥＭＲ４６９およびｐＥＭ Ｒ４７３の制限地図を示す。これらの図で使用されている記号は以下の記載で詳 述されている。部位がフレノウ・ポリメラーゼによりプラント化された場合、添 え字「０」が付されている。部位がライゲーションにより削除された場合、それ ら５では士±±士により表されている）。このフラグメントのＨｉｎｄＩｌｌ） プラスミドｐＥＭＲ４６９の構築二このプラスミドは、下記成分の連続ライゲー ションにより構築されたシャトル・ベクターのエノエリヒア・コリー酵母ｐＥＭ Ｒ４１４から構築された。

−ｐＢＲ３２２（サトクリフ、１９７９、コールド・スプリングＳｙｍｐ、Ｑｕ ａｒｔ、Ｂｉｏｌ、４３．７７９）のアンピシリン耐性遺伝子Ａｌｌ１ｐ（Ｒ） の上流部分およびプロモーターの欠失により部分修飾されたサツカロマインス・ セレビンアエのＬＥＵ２遺伝子（ＬＥＵ２ｄと呼ばれる）、遺伝子座５ＴＢ（Ｒ ＥＰ３）および２μフラグメント（ハートレイおよびド不ルソン、１９８０、「 ネイチャー」、２８６．８６〇−８６５）の複製開始点をもつ内在性２μフラグ メントＢ形態を含む、プラスミドｐＪＤＢ２０７（ＢＥＧＧＳ、１９７８：ｒジ ーン・クローニング・イン・イーストＪ−１７５−２０３頁、「ジエネテインク ・エンジニアリング第２巻中−ウィリアムソンーアカデミツク・プレス−ロンド ン、イギリス国）のＰ　ｓｔ　Ｉ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ０フラグメント（図■末端は 、フレノウ・ポリメラーゼの作用によりプラント化されている。それは、図５で はＨｉｎｄＩＩＩ’により示されている。

−ＴＪＲＡ３遺伝子をそのプロモーターと共に含む（ローズ等、１９８４、「ジ ーン」、２９．１１３−１２４頁）酵母染色体■のＨｉｎｄＩＩＩ−８ｍａｌフ ラグメント（図５では７７７７７により表わされている）。このＨｉｎｄＩＩＩ 　−Ｓｍａ　Ｉフラグメントは、プラスミドｐＦＬ１（ンエバリエ等、１９８０ 、「ジーン」１１．１ｌ−１９）から始まる。

このプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ末端は、フレノウ・ポリメラーゼの作用により プラント化されている。

一制限部位の導入を意図した数個の塩基対のみがう・ツセルおよびスミスにより 報告された（ラッセル等、（１９８３）ｒジャーナル・オン・バイオロジカル・ ケミストリー」２５８．２６７４−２６８２）天然バージョンとは異なるＡＤＨ ２遺伝子のプロモーターの合成／（−ジョンを含む５ａＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラ グメント（図５においてく僅かに興なる結果を伴う）。このフラグメントの配列 を下記に示す。

ｍ＋ ＣＣＣＴＧＣＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＣＣＴ　Ｔ　ＯＴ　ＧＧＣＣＣＧＴ　 ＡＧＡＧＧＴ　Ｙ　ＧＡＡＴ　ＡＴ　Ｔ　ＣＡＡＣＣＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＣＴ ＴＡＡＡＧＴＣＴらＡＣＴＣτＣＴＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＡＴＧＧＧＯＴＴＣＡＣＴＴＴ ＴＴＧＧＴＡＡＡＧＣＴＡτＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＴＣＡＣＡＴＡ丁ＡＡＡＴＡ ＧＡＣＧＴＡＴＣＴＴ丁ＡＣＣＣＣＡ白ＧτＧＡＡＡＡＡＣＣＡｉＴＴＣＧＡＴ ＡＴＣＧ’Ｔ白ＣＧＧ＾Ｔ＾ＧＴＧＴ＾Ｔ＾ＴＴＴ白τＣＴＧＴＧＣＣＡＧＴＡ ＧＣＧ＾ＣＴ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　ＴＣＡＣＩ’１ＣＴＣＧＡＧＡＴＡＣＴＣＴ　 ＴＡＣＴ　ＡＣＴＧＣＴＣＴＣＴ　ＴＧs　ＴＧＴ　Ｔ　Ｔ　Ｔ ＣＡＣＧＧ　Ｔ　ＣＡ　Ｔ　ＣＧＣＴＧＡＡＡＡＭＧＴＧ　ＴＧＡＧＣＴ　ＣＴ 　ＡＴ　ＧＡＧＡＡ　Ｔ　ＧＡ　Ｔ　ＧＡＣＧＡＧＡＧＡＡbＡＡＣＡＡＡＡ ＴＡＴＣＡＣＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＩＱＡＡ丁ＡＧＡＡＴＡＴ ＣＡｌ’１ＧＣＴＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡ　ＴＡＧＴＧＡＡ ＧＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧ帥ＣＣＡ　Ｔ　Ｔ　ＴＡ　ＴＣＴ　Ｔ　ＡＴ　ＡＣＴ　 Ｔ　Ｃ０ＡＴＧ　Ｔ　ＴτＴＴＣＧＴＡsＧＴＴ白ＧＴＴ ＧＡＴＡＧＴ　丁ＧＡＴＡＡＴＴＧＡＴＡＴＡＧＣＴＡＴＧＧＴＡＴＡＣＣＴＡ ＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧＣＡＧＣＴＱＡＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧ −酵母ＰＧＫ遺伝子の３゛末端をもツＢ　ｇＩＩＩ　−Ｈ１ｎｄｌＩＩフラグメ ント（図５では閣により表わされている）。このフラグメントは、唯一のＢｇＩ ＩＩ部位を有する、ヒッツエマン等により報告された（１９８２、「ヌクレイツ ク・アシッズ・リサーチ」、１０．７７９１−７８０８）ＰＧＫ遺伝子をもつ酵 母染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのＢｇＩＩＩによる完全消化から 始まる。この消化により２つのＨｉｎｄＩＩＩ　−ＢｇＩＩＩフラグメントが得 られ、そのうち酵母ＰＧＫ遺伝子の３°末端をもつ約０．４ｋｂの小さい方が保 持される。後者のフラグメントの配列は、ヒッツエマン等（前出）により報告さ れている。ＢｇＩＩＩ部位は、先のフラグメントのＢａｍＨ１部位においてクロ ーン化され（従って、Ｂａ畦■およびＢｇＩＩＩ部位は消滅している）、フレノ ウ・ポリメラーゼの作用によりプラント化されたＨｉｎｄＩＩＩ部位は、下記の ｐＢＲ３２２のＰｖｕＩＩ　−Ｐｓｔ　ＩフラグメントのＰｖｕＩＩ部位におい てクローン化される。

一複製開始点およびアンピンリン耐性遺伝子Ａ＋５ｐ（Ｒ）の下流部分により表 わされている）。

従って、この方法で形成されたプラスミドｐＥＭＲ４１４は、下記成分を含む。

一エシェリヒア・コリ細胞におけるプラスミドの複製および選択を可能にする複 製開始点およびアンピンリン耐性遺伝子Ａｍｐ（Ｒ）。

これらの成分は、エシェリヒア・コリ細胞での形質転換を可能にする。

一酵母（ＡＲ３）の複製開始点、遺伝子座ＳＴＢおよびプロモーターをもたない サツカロマイシス・セレビシアエのＬＥＵ２遺伝子およびプロモーターをもつサ ツカロマイシス・セレビシアエのＵＲＡ３遺伝子。これらの成分は、サツカロマ イシス・セレビンアエ細胞におけるプラスミドの複製および選択を可能にし、内 在性２μプラスミドを含む細胞において充分な分配効力を与える。

プラスミドｐＥＭＲ４１４を、制限酵素ＮｈｅｌおよびＣ１ａｌにより完全に消 化した。Ｕ　ＲＡ　３遺伝子を含む小さいＮｈｅｌ−Ｃ１ａｌフラグメント（以 後、フラグメントＡと称す）を精製した。

プラスミドｐＥＭＲ４１４を、酵素ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩにより完全に消化 した。特にＬＥＵ２ｄ遺伝子およびプラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点を含む 大きいＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（以後、フラグメントＢと称す）を精 製した。

また、尿酸オキシダーゼｃＤＮＡ配列（クローン９Ｃ）から誘導された蛋白質を コードする遺伝子の出発点を含む合成Ｃ１ａｌ　−ＡｃｃＩフラグメントを製造 した。このフラグメントは、コードされるアミノ酸を変えずに、酵母において通 例存在するコドンを挿入する目的で導入された（シャープ等、１９８６、［ヌク レイツク・アシッズ・リサーチ」、第１４巻、１３．５１２５−５１４３頁参照 ）、クローン９Ｃに対する修飾を含む。このフラグメント（以後、フラグメント Ｃと呼ぶ）の配列は次の通りである（下線部のヌクレオチドはクローン９Ｃに対 して修飾されたものである）。

クローン９Ｃのプラスミド（図３参照）を、酵素ＡｃｃｌおよびＢａＩＩＨｌに より消化した。尿酸オキシダーゼｃＤＮＡの終結点を含むＡｃｃｌ−Ｂａ論Ｈｌ フラグメント（以後、フラグメントＤと呼ぶ）を精製した。このフラグメントは 下記配列を有する。

フラグメントＡ、ＢＳＣおよびＤをライゲーションすることにより、図６に示す プラスミドｐＥＭＲ４６９が得られた。図６において、記号は図５の場合と同じ 意味を有し、新規Ｃ１ａｌ−ＡｃｃｌおよびＡｃｅ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメ ントは、Ｓにより表されている。

プラスミドｐＥＭＲ４６９は、下記配列を含む、天然ＡＤＨ２プロモーターと類 似したＡＤＨ２プロモーターと呼ばれるプロモーターの制御下で尿酸オキシダー ゼｃＤＮＡの配列から誘導された蛋白質をコードする配列を含む。

門 Ｃ転写開始領域 （ＴＡＴＣＡＩ：ＩｃＴＡＴＴＡＡｃτＡｌＡｌ＋２）プラスミドｐＥＭＲ４７ ３の構築 プラスミドｐＥＭＲ４６９を酵素Ｍ１ｕＩおよび５ｐｈｌで完全に消化した。大 きなＭｌｕｌ−ＳｐｈＩフラグメントは尿酸オキシダーゼ遺伝子を含み、ついで 、次の配列を有する人工フラグメントと結合させる。これはサツカロマイセス・ セレビシアエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のフｃｔモー９−ＧＡＬ７１７） ＴＡＴＡ成分（７）上流配列（７）一部（２００ｂｐ）に対応し、この部分は下 記に四角で囲んだ、ＵＡＳＩおよびＵＡＳ２と称される２種の高親和性上流活性 化配列を含む（Ｒ，Ｊ、プラムら、イー・エム・ビー・オー・ジャーナル、５巻 ３号６０３−６０８頁（１９８６年）参照）。

ＣＴＴＴＡＧＣＴＩ’１ＴＧｒＴＣＩ’１ＧＴＴＡＧｒＴＴＧＣ＋ＣＡＴＧＧＡ ＡＡＴＣＧＡｒＡＣＡＡＧＴＣＭＴＣ自ｎ白Ｃにのようにして得られたプラスミ ドｐＥＭＲ４７３をＦｉｇ、７に示す。図中、記号はＦｉｇ、６と同じ意味を有 し、新しいＭｌｕ　Ｉ　−Ｓ　ｐｈ■フラグメントは　Ｉ　で示しである。

従って、プラスミドｐＥＭＲ４７３は本発明の人工プロモーターの制御下で尿酸 オキシダーゼの配列に由来する蛋白質をコードしており、これは下記の配列を含 む。

ＧＴＧＣＣＡＧＴＡＧＣＧＡＣＴＴＴＴ１ＴＣＡＣＡＩＪＣＧＡＧＡＴ白（ＴＣ ＴＴＡＣｔ＾ｃｔａｃｔｃｔｃ）ＴＧｔＴＧＴマＴＴＣＰＣＧＧＴＣＡＴＣＧＣ ＴＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＴＧ＋！ＩＧｃＴｃＴ自ＴＧＡＧ白＾ＴＱ自ＴＧ＾ＣＣ 自Ｇ＾Ｇ＾口【〜に＾＾＾＾’ＴＱτＣＧＩＣＴＴＣＴｉＧＴＴＴＣＨＣτＴＧ ＧＴＡ＠ＡｆＡＧＡＡｆＡＴＣＡＡＧＣＴＡＣＡＡＡＡＡＯＣＡｆｊｌＣＡＡＴ ＣＭ転写開始領域 ３）プラスミドｐＥＭＲ５１５の構築 プラスミドｐＰＥＭ４７３は部分的に酵素Ｘｂａｌで切断し、全体的に酵素Ｍ１ ｕＩで切断する。大きなＸｂａ　Ｉ　−Ｍｌｕ　Ｉフラグメントを精製する。こ のフラグメントは具体的に複製の起源の配列および２μフラグメントの遺伝子座 ＳＴＢ、ＬＥＵ２ｄ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子Ａ　ｍｐ’、ｐＢＲ３２２ の複製起源および尿酸オキシダーゼの発現カセットを含む。他方、これはＵＲＡ ３遺伝子もＸｂａＩとＮｂｅＩ部位間にある２μフラグメント部分も含まない。

大きなＸｂａ　Ｉ　−Ｍｌｕ　Ｉフラグメントは、Ｍｌｕｌおよび修飾Ｘｂａｌ 付着端を含む下記の配列アダプターにより再環状化する。

修飾　ＸｂａＩ マＣＴＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＡＴＧＣＡこの方法により得られたプ ラスミドｐＥＭＲ５１５は、２μフラグメントのＦＬＰ遺伝子によりコード化さ れた組換体の標的部位ＦＲＴの３種の成分の１種のみを有する。

従って、プラスミドｐＥＭＲ５１５は、本発明の人工ブロモ−ターの制御のもと に、尿酸オキシダーゼｃＤＮＡ配列に由来する蛋白質をコードする配列を有する 。

実施例３ニ プラスミドｐＥＭＲ４６９、ｐＥＭＲ４７３およびｐＥＭＲ５１５によるＥＭＹ ７６１酵母株の形質転換、−プラスミドｐＥＭＲ５１５によるＥＭＹ５００およ びＧＲＦ１８酵母の形質転換、−ロイシンプロトトロピー選択のための形質転換 サツカロミセス０セレビンアエ（Ｓ　ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）の３種の非同遺伝子型株を宿主株として用いたニーＥＭＹ７６１株（Ｍ ａｔａ、１ｅｕ２、ｕｒａ　３、ｈｉｓ　３、ｇａｌ）−ＥＭＹ５００株（Ｍａ ｔａ、１ｅｕ２、ｕｒａ３、ｐｅｐ４）−ＧＲＦ１８株（Ｍａｔａ、１ｅｕ２、 ｈｉｓ３）ＧＲＦ１８株は当業者に周知である（シェリー・フィンク、ＭＩＴ、 ＵＳＡ）。ＥＭＹ７６１およびＥＭＹ５００株はＧＲＦ１８株の近縁である。こ れらはＧＲＦ１８株とＦＬ１００株（ＡＴＣＣ寄託番号：２８３８３）に由来す るｕｒａ３株とＥＷ、ジョーズ（Ｅ。

Ｗ、ジョンズら、ジエネチックス、８５巻２３頁（１９７７年）記載の２０Ｂ１ ２株（Ｍａｔα、ｔｓｐｌ、ｐｅｐ４）との連続的交配により得た。

ＧＲＦ１８株は、受託番号Ｔ−９２０で、１９８９年１２月２８日にＣＮＣＭに 寄託されＧＲＦ１８ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕつのプラスミドｐＥＭＲ５１５を回 復して得、ＥＭＹ５００株は受託番号ｌ−９１９で１９８９年１２月２８日ＣＮ ＣＭに寄託されたＥＭＹ５００ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕつのプラスミドｐＥＭＲ ５１５を回復して得た。

これらの株はＬＥＵ２ｄ欠損選択マーカーにより捕捉され得る突然変異（１ｅｕ ２およびｕｒａ　３　）を含み、これらは各々プラスミドｐＥＲ４６９およびｐ ＥＭＲ４７３中に存在する。

使用した形質転換技術はベソグスら記載の変法である（ベッグスら、ネイチュア 、２７５巻１０４−１０９頁（１９７８年））。これは、浸透圧安定剤、すなわ ち、ソルビトールＩＭ濃度の存在下、ブロトプラスチゼーノヨン処理を酵母に行 うものである。

詳細な形質転換プロトコルを下記に記載する。

ａ）液体ＹＰＧ培地（第１表参照）を静止期で１培地につき約５×１０＠細胞を 接種し、かくして接種した培地を１夜３０℃にて撹拌する。

ｂ）培地の密度が１ｍｌ当たり約１０７細胞に達したとき、細胞を、４００Ｏｒ ｐｍにて５分間遠心分離し、残留物をソルビトールＩＭにて洗浄する。

Ｃ）細胞を、２５ｍＭＥＤＴＡおよび５０ｍＭジチオスレイトールを含むソルビ トール溶液１Ｍ中に懸濁し、１０分間３０℃にてインキュベートする。

ｄ）細胞を、１回ソルビトールＩＭ１０ｍｌで洗浄し、ソルビトール２０ｍＪ中 に懸濁する。チモラーゼ−１００Ｔ（アフィニティカラム上アルドバクター・ル テウス（＾ｒｔｈｏｂａｃｔｅｒ　１ｕｔｅｕｓ）培養上清の部分精製製剤であ り、β−１，３−グルカン　ラミナリペンタヒドロラーゼ含有、セイヤクカガク コウギョウ株式会社から販売）を最終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加し、 懸濁液を室温にて、１５分間インキュベートする。

ｅ）細胞をソルビトールを含む媒体、いわゆるソルビトールＹＰＧ培地（下記第 １表参照）２０ｍｌ中に再懸濁し、２０分間３０℃にて、緩やかに撹拌しつつ、 インキュベートする。

ｆ）細胞を、３分間２５０Ｏｒｐｍにて遠心分離する。

ｇ）細胞を形質転換緩衝液（ソルビトールＩＭ、トリス−ＨＣｌｌｏ−ＨＣ１１ Ｏ，５およびＣａＣ１２ｍＭ）９ｍｌ中に再懸濁する。

ｈ）細胞０．１ｍｌおよびＤＮＡ溶液５μｍ　（約５μｇ）を添加し、得られた 懸濁液を１０−１５分間室温にて放置する。

１）、下記の溶液１ｍｌを添加する： ポリエチレングリコールＰＥＧ４０００　２０％、トリス−ＨＣｌ　１０ｍＭ、 ｐＨ７，５およびＣａ　ＣＩ　２　１０　ｍＭ。

ｊ）　ｉ）で得られた懸濁液をあらかじめ融解したロイシン無含有固体再生培地 （下記第１表参照）を含む管中に入れ、約４５℃にて液状に保つ。懸濁液をロイ シン無含有再生培地１５ｍ１の固体化層を含むペトリ皿中に注ぐ。

ｋ）工程ｊ）をｈ）で得られた細胞懸濁液の残りについて繰り返す。

形質転換された株が３日後に発生する。

形質転換株ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ４６９（ｌｅｕつ、３種の形質転換株、ＥＭＹ ７６１ｐＥＭＲ４７３（Ｉｅｕつ　（クローン１．２および３）、形質転換株Ｅ ＭＹ５００ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕ’）、形質転換株ＥＭＹ５００ｐＥＭＲ５１ ５（ｌｅｕ”）および形質転換株ＧＲＦ１８ｐＥＭＲ５１５（Ｉｅｕつをかくし て維持した。

第１表 実施例３．４．４−ビス、６および７で用いた主培地−ウラシル無含有固体培地 アミノ酸無含有酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ社製）６．７ｇカゼイン加水分解物 （ＤＩＦＣＯ社製のカザミノ酸）５．０ｇグルコースＬｏｇ 寒天２０ｇ 蒸留水中ですべての成分を混合し、最終容量を蒸留水で１１にする。１２０℃に てオートクレーブで１５分。

−ウラシル無含有液体培地 寒天を含まないウラシル無含有固体培地の処方を用いる。１２０℃にてオートク レーブで１５分。

一ロイシン無含有固体培地 アミノ酸無含有酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ社製）６．７ｇアデニン２０ｗ１ｇ ウラシル２０−ｇ ｔ−トリプトファン２０１ｇ １−ヒスチジン２０１ｇ １−アルギニン２０−ｇ １−メチオニン２０ｍｇ １−チロシン３０ｍｇ １−イソロイシン３０ｍｇ １−リジン３０鵬ｇ １−フェニルアラニン５０ｍｇ １−グルタミン酸１００ｍｇ １−バリン１５０＋ａｇ １−ロイシン４００ｍｇ グルコース２０ｇ 寒天２０ｇ 蒸留水中ですべての成分を混合する。蒸留水で最終容量を１１にす私　１２０℃ でオートクレーブで１５分。オートクレーブで処理後、１−スレオニン２００ｍ ｇおよび１−アスパラギン酸１００＋＊ｇを添加する。

一ロインン無含有固体再生培地 ロイシン無含有培地の処方を使用し、寒天２０ｇを３０ｇに置換して混合し、混 合物にソルビトール１８０ｇを添加する。

−ロイシン無含有液体培地 寒天を含まないロイシン無含有固体培地の処方を用いる。１２０℃にてオートク レーブで１５分。オートクレーブ処理後、ｌ−スレオニン２００論ｇおよび１− アスパラギン酸１００■ｇを添加する。

−液体ＹＰ培地 酵母抽出物１０ｇ（Ｄ　Ｉ　ＦＣＯ社製バクトー酵母抽出物）ペプトン２０ｇ（ ＤＩＦＣＯ社製バク社製ペクト−ペプトン中で成分を混合。蒸留水で最終容量を １１にする。１２０℃にてオートクレーブ１５分。

一液体ＹＰＧ培地 液体ＹＰ培地の処方を使用し、オートクレーブ処理後、グルコースを２０ｇ／ｌ の濃度で添加。

一ソルビトールＹＰＧ培地 液体ＹＰＧ培地の処方を使用し、オートクレーブ処理後、ソルビトールをＩＭの 濃度で添加。

−エタノールーグリセリンＹＰ培地 液体ＹＰ培地の処方を使用。オートクレーブ処理後、１００％エタノール１０ｍ １（最終濃度１％）およびグリセリン３０ｇを添加。

−エタノールーグリセリンーガラクトースＹＰ培地液体ＹＰ培地の処方を使用。

オートクレーブ処理後、１００％エタノール１０１１、グリセリン３０ｇおよび ガラクトース３０ｇを添加する。

実施例４ ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ４６９（Ｉｅｕ’）およびＥＭＹ７６１１ＥＭＲ４７３（ ｌｅｕ’）（クローン１．２および３）株−ウェスタンプロテイング免疫検出− 尿酸オキシダーゼおよび可溶性蛋白の検出 １）尿酸オキシダーゼの発現 ａ）形質転換株 第１段階で、ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ４６９（ＩｅｕつおよびＥＭＹ７６１ｐＥＭ Ｒ４７３（Ｉｅｕつ　（クローン１．２および３）株をロイシン無含有液体培地 （第１表、実施例３）２５ｍｌ中で培養した。これにより、プラスミドｐＥＭＲ ４６９およびｐ　ＥＭＲ４７３の有するｌ　ｅｕ２遺伝子による変異体の補足性 を選択することにより、プラスミドの多数の複製を得、維持することが可能にな つｔ二。

３０℃にて２２時間、撹拌後、２種の培地を１０分間７０００ｒｐｍにて遠心分 離した。この残金を滅菌蒸留水１０ｍ１中に添加し、再び、１０分間７０００ｒ ｐｍにて遠心分離した。尿酸オキシダーゼの発現は細胞を、ＥＭＹ７６１ｐＥＭ Ｒ４６９（ＩｅｕＤ株につき、エタノールグリセリンＹＰ培地２０ｍＩ中に添加 し、ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ４７３（ＩｅｕＤ株につき、エタノール−グリセリン −ガラクトース）′Ｐ培地（第１表、実施例３）２０ｍｌ中に添加した。培養は 再び３０℃にて、２７時間撹拌しつつ、インキュベートして行った。

Ｃ）対照株 非形質転換ＥＭＹ７６１株、すなわち、プラスミドを含まないＥＭＹ７６１株を 、第１培養を液体ＹＰＧ培地中で行う以外は上記と同様に培養した。一方で、エ タノール−グリセリン液体ＹＰ培地１０ｍ１中で誘導し、他方、エタノール−グ リセリン−ガラクトースＹＰ培地１０ｍＩ中で誘導した。

２）サンプルの調製 ａ）ｌａ）、ｌｂ）およびｌｃ）中で培養した細胞を遠心分離し、上清を除去し た。残金を蒸留水１０ｍ１中に添加し、１０分間７０００ｒｐｍにて遠心分離し た。このようにして洗浄した残金をトリエチレンアミン緩衝液、ＴＥＡ、ｐＨ８ ，９約１ｍｌ中に添加した。

上記緩衝液中に添加した細胞約３００μＩを最終容量の約半分を示すガラスピー ズ（直径４００μｍから５００μｍ）の存在下、溶菌した。この混合物をポルテ ックス中で４回１分間激しく撹拌し、水中に３０秒間、すり潰し操作を行った。

この液体をパスツールピペットで管から取り出し、マイクロチューブに移した。

ガラスピーズは１回ＴＥＡ緩衝液ｐＨ８，９２００μｌで洗浄した。ビーズをポ ルテックス中で１回１分間撹拌し、液体をパスツールピペットで取り出し、上記 の溶菌物に添加した。ついで、この溶菌物をマイクロチューブ中５分間、７００ ０ｒｐｍにて遠心分離した。この上清を注意深く取り出し、−２０℃にて、ウェ スタンブロッティング、尿酸オキシダーゼ活性および総可溶性蛋白測定のために 保存した。溶解した細胞の残金を一２００Ｃにて、ウェスタンブロッティングの ために別に保存した。（下記３）参照）。

さらに、１ａＬ１ｂ）およびｌｃ）にて調製した培養物のサンプル誘導前にを下 記の方法で採取した二培養物２ｍｌを１０分間、７０００ｒｐｍにて遠心分離し た。残金を蒸留水５００ｍ１中に添加し、再び５分間７０００ｒｐｍにて遠心分 離した。残金を、ＴＥＡ緩衝液、ｐＨ８，９約２００μｌ中に添加し、上記と同 様にガラスピーズの存在下溶菌した。上清および溶菌細胞の残金を一２０℃にて 別々に保存した。オキシダーゼ活性の測定および総画溶性蛋白の測定を上清で行 った。

３）ウェスタンブロッティングによる尿酸オキシダーゼの免疫的検出 ａ）方法 別々のサンプルの残金および上清をウェスタンブロッティング−当業者に周知の 技術−にかけた。これは次のような工程を含むニー負荷緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ 　ｂｕｆｆｅｒ）と称される、トリス−ＨＣｌ０．１２５Ｍ、ｐＨ６，８，５Ｄ Ｓ４％、ブロモフェノールブルー０．００２％、グリセリン２０％、β−メルカ プトエタノール　１０％からなる緩衝液中で１０分間沸騰させて残金を溶解（レ ミリ記載のプロトコルによる（Ｕ、　Ｋ　レミリ、ネイチュア２２７巻６８０− ６８５頁（１９７０年））（残金のみについておこなう工程）−溶解物中に含ま れる種々の蛋白質の電気泳動的分離、レミリに記載のプロトコルによる（Ｕ、　 Ｋ　レミリ、ネイチュア２２７巻６８０−６８５　（１９７０年））、および− ゲル中に含まれる上記蛋白質のニトロセルロース上での移動（Ｈタウビンら、プ ロン−ディング・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス、ｔＪＳＡ ７６巻４３５０−４３５４頁（１９７９年））。

免疫検出はバーネットの技法（Ｗ、Ｗ、バーネ・ソト、アナリテイカル・バイオ ケミストリ、１１２．１９５−２０３　（１９８１年））により行い、は次の連 続的操作を含む・・緩衝液Ａ（トリス−ＨＣｌ　１０ｍＭ５ＮａＣ１１７０ｍＭ 。

ＫＣＩ　１ｍＭ）で１０分間ニトロセルローズフィルターをゆすぐ・ニトロセル ローズフィルターを緩衝液Ｂ　（１００ｍｌに対シ３ｇの割合で添加した雄牛血 清アルブミンを含む緩衝液Ａ）を３０分間３７℃にて接触させる。

・血疫血清（アスペルギルス・フラブス尿酸オキシダーゼを認識するポリクロー ナル抗体）と１時間３７℃にてニトロセルローズフィルターを接触させる； ・ニトロセルローズフィルターを緩衝液Ｂでゆすぐ：・ニトロセルローズフィル ターを０．１マイクロキユリ一／ｍ＋の割合でヨード１２５でラベルしたプロテ ィンＧの溶液と、１時間３７℃で接触させる； ・フィルターを緩衝液Ａでゆすぐ； ・フィルターを２枚の吸取紙間で乾燥する。

・フィルターをＸ−線フイルムと接触させる。

・フィルムを現像する。

ｂ）結果 ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ４６９（１ｅｕつおよびＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ４７３（ｌ ｅｕつ　（クローン１）株は見掛は分子量約３３ＫＤａを有する蛋白質を産生じ 、これはアスペルギルス・フラブス尿酸オキシダーゼ（当業者の周知の技術によ りウサギ中で製造される：ベツケチスら（１９８１年）「酵素学における技法」 、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、７３巻４６頁参照）に対する抗体によ り認識され、これは対照株中には存在しなかった。

残留物および上清についての蛋白質の量の比較により、上記蛋白質の８０％が溶 菌物中溶解した形で存在していると結論づけ得る。

４）尿酸オキシダーゼ活性の測定 尿酸オキシダーゼ活性は溶菌細胞の上清につき測定した。

ａ）原理 尿酸のアラントインへの変換は２９２ｎｍにおける吸収により観察する。反応は 下記のようである： ｂ）試薬 （ａ）ＴＥＡｏ、５Ｍ、ｐＨ８，９／ＥＤＴＡ緩衝液−ＴＥＡ　（分析試薬−プ ロラボ商品番号２８７．４６．２６６）７．５ｇを蒸留水４００ｍ１＋、：、溶 解する。

−コムブレクソンｍ（メルク−商品番号８４１８）０．３７２ｇを蒸留水５０ｍ １に溶解する； 一２種の溶液を一緒にし、５００ｍ１にする（溶液１）ニーこの溶液のｐＨをＨ ＣＩ　０．２Ｎで８．９に調整する：および一容量を蒸留水で１０１００Ｏにす る（溶ｇ＆２）。

ｂ）尿酸保存溶液 一尿酸（カルビオケムー商品番号６６７１）を溶液１　５０ｍ１中に溶解する； −ｐＨをＨＣＩ　０．２Ｎで８．９に調整する。および−容量を蒸留水で１００ ｍ１にする。

得られた溶液は１週間４℃にて保存し得る。

（ｃ）尿酸基質溶液 一尿酸保存溶液（カルビオケムー商品番号６６７１）１．５ｍｌをとり、ＴＥＡ 緩衝液で１００ｍ１に希釈する（分析試薬−プロラボ商品番号２８７．４６．２ ６６） この溶液はその日のうちに使用せねばならない。

Ｃ）操作 下記の量を２９２ｎｍに設定した分光々度肝の石英セルに入れ、温度を３０℃に 維持する。

一尿酸基質溶液６００μｍ　（３０℃に余熱）；および−ＴＥＡｐＨ８，９の２ ００μｍを添加した上記上清１００μｌ混合後、光学密度（以後ＯＤと略す場合 がある）の変化を５分間３０秒毎に読み取る。ΔＥ、１分当たりの光学密度をこ れらの読み取り値から決定する。

ｄ）結果から得られる式 尿酸オキシダーゼ酵素活性ＡはＵ／ｍ＋で表し、△Ｅ測定値から、下記の式：　 ΔＥＸＶｒｘｄ ９ｍｌＬ希釈係数（２）　、２９２ｎｍにおける尿酸の吸光係数および被験サン プルの容量（０，１ｍ１）を示す］を用いて計算する。

５）溶菌液中の総可溶性蛋白の測定 ヒオラド製蛋白質測定キットを溶菌細胞の上清中に存在する総蛋白質の測定に使 用した。蛋白質が結合したときクーマシー・ブリリアントブルーｇ−２５０の酸 性溶液の最大吸収値が４６５　ｎｍから５９５に変化するのを観察する（ライス ナーら、アナリティカル・バイオケミストリー、６４．５０９　（１９７５）参 照）。

操作 下記の量を５９５ｎｍに設定した分光４震計のセル中に入れるニー蒸留水７９０ μｌを添加したサンプル１０ｕｌ；および−濃縮染色試薬（ビオラド）２００μ ｍ。

成分を混合し、５９５ｎｍにて光学密度を読み取る。このようにしてＢＳＡ　（ 牛血清アルブミン）の濃度を大きくした検量曲線をこのようにして作製した。溶 菌液中の総蛋白質の未知濃度を得られた検量曲線から読み取る。

６）結果 得られた結果を下記の表（ＩＩ）中にまとめる。これは各株につき、培養培地、 培養物の炭素およびエネルギー源、尿酸オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）、可溶性 蛋白質（ｍｇ／ｍｌ）および総可溶性蛋白質中の尿酸オキシダーゼの百分率を具 体的に示したものである。この最後のパラメーターは、組み換え蛋白質の特異的 活性はアスペルギルス・フラブスから得られた尿酸オキシダーゼ活性：３０Ｕ／ ｍｇと同じであると仮定して計算されている。

この表は次のことを示す。

ａ）グルコースの存在下、尿酸オキシダーゼの（抑制）レベルは本発明の人工プ ロモーター（株ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ４７３（ｌｅｕ４）（クローン１．２また は３））の場合には検出されないが、ＡＤＨ２プロモーター（株ＥＭＹ７６１ｐ ＥＭＲ４６９（ｌｅｕつ）の場合は検出される。それ故、グルコースの存在下で 人工プロモーターはＡＤＨ！プロモーターよりも良く抑制する。

ｂ）グルコースがなく、エタノール／グリセロールの存在下では、尿酸オキシダ ーゼのレベルはＡＤＨ！プロモーター（総可溶性蛋白約１４％）のときに高く、 人工プロモーターでは低いが検出可能である。

Ｃ）グルコースがなく、エタノール／グリセロール／ガラクトースの存在下では 、尿酸オキシダーゼのレベルはＡＤＨ！プロモーターの前述の場合（総可溶性蛋 白の約１３．５％）と値が変わらないが、人工プロモーターでは高い値を示す（ 総可溶性蛋白の約１８％）。

それ故、本発明の人工プロモーターは組換え体蛋白の高レベルの生成が可能であ り、次の３種の発現のレベルを有する。

−ゼロレベル　ａ） 一基礎レベル　ｂ） 一最小レベル　Ｃ） 実施例４ビス ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ５１５（Ｉ　ｅｕつ、ＥＭＹ５００ｐＥＭＲ５１５（Ｉ　 ｅｕつおよびＧＲＦ１８ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕつ株による尿酸オキシダーゼｃ ＤＮＡのエーレンマイヤーフラスコ中の発現 上記３種の株の各コロニーをロイシンなしの液体培地２０ｍ１で培養した。

撹拌しながら３０℃で一晩後、３種の培養物を７０００ｒｐｍで１０分間遠心し た。細胞残渣を無菌蒸留水１０ｍ１にとり、再び１０分間遠心した。尿酸オキシ ダーゼの発現をエタノール−グリセリン−ガラクトースＹＰ培地２０ｍ１中の細 胞に添加して誘導した（実施例３、第１表参照）。培養物を撹拌しながら約２０ 時間３０℃で再びインキュベートした。対照として、非形質転換宿主株の培養物 を製造した。

６種の培養物の各細胞を遠心により再堆積し、上清を取り除いた。

残留物を蒸留水１０ｍ１にとり、７０００ｒｐｍで１０分間遠心した。このよう にして洗浄した残留物をｐＨ８，９のＴＥＡ緩衝緩衝液約１仁ｌり、粉砕および 遠心による粒子除去を実施例４の２）に記載されたような方法で実施した。各培 養物の上清を前述のように尿酸オキシダーゼおよび総蛋白の検定に使用した。得 られた主要な結果を第３表にまとめた。

第３表 株／培養条件　尿酸オキ　総可溶　可溶性蛋白のンダーゼ　性蛋白　尿酸オキシ 活性（１１／ｍｌ）　（ｍｇ／ｍｌ）　ダーゼ％ＧＲＦ１８　ｐＥｌｌＩｒ５１ ５（ｌｅｕつ／ａ）　＜０．１　２．２　＜０．０５ＥＭＹ５００　ｐＥＭＲ５ １５（ｌｅｕ’）／ａ）　＜　０．１　０．９　＜　０．０５ＥｌｉＹ７６１　 ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕつ／ａ）　＜０．１　１．８　＜０．０５ＧＲＦ１８　 ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕつ／ｂ）　３８　５．４　２３ＥＭＹ５００　ｐＥＭＲ ５１５（ｌｅｕつ／ｂ）　２０　２．５　２６ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ５１５（ ｌｅｕつ／ｂ）　３３　４．２　２６ａ）二重をグルコース存在下で培養した（ 非誘導条件）。

ｂ）二重をグルコースなしでガラクトース存在下で培養した（誘導）。

本発明のプロモーターは３種の非同遺伝子型株中に尿酸オキシダーゼの高レベル 発現を可能にする。

実施例５ 酵母中のβ−ガラクトシダーゼの２種の発現ベクターの構築二ＡＤＨ！プロモー ターをもつプラスミドｐＥＭＲ４２９および本発明の人工プロモーターをもつプ ラスミドｐＥＭＲ４３７使用した計画では市販されている以前からあるプラスミ ドから得たフラグメントおよび一般に使用されている合成技術により製造したフ ラグメントを使用した。実施したクローニング技術は「モレキュラー・クローニ ング、ア・ラボラトリ−・マニュアル」のＴマニアティス、ＥＦ、フリックおよ びＪサムプルツク（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１（１９８ ４年））に記載されている技術である。オリゴヌクレオチドはバイオサーチ４６ ００ＤＮＡシンセサイザーの助けにより合成した。

１）プラスミドｐＥＭＲ４２９の構築 プラスミドｐＥＭＲ４１４（第５図参照）を制限酵素ＢａｍＨＩで完全に消化し た。プロモーター配列（ＡＤＨ２）および末端配列（ＰＧＫ）の間にα１するＢ ａｍＨＩ部位は独特である。ブラスミの直線状ＤＮＡを電気泳動後アガロースゲ ルから溶出して精製した。

プラスミドｐＭｃ１４０３　（カサダバン等、ジャーナル・オン・バクテリオロ ジー、第１４３巻、第９７１−９８０頁（１９８０）参照）を酵素ＢａｍＨＩお よびＥｃｏＲＩで完全に消化し、それはＥ。

コリβ−ガラクトシダーゼをコード化する配列の重要部分（上流部分）を含む約 ３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントの遊離を可能にする。完全 な配列は次の配列の合成フラグメントの助けをかりて再構築した。

ＥｃｏＲｌ、 ５１ＭＡＴＴＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣＧ ＧＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡ ＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＴ＾＾Ｔ＾＾ＧｐＭ ｃ１４０３の二重消化から発するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは上記合 成フラグメントＥｃｏＲＩで結合した。

ついで、得られたＢ　ａｍＨＩ　−Ｂ　ａｍＨＩフラグメントはＢａｍＨｌで消 化したプラスミドｐＥＭＲ４１４の直線状ＤＮＡで結合し、第８図に示したプラ スミドｐＥＭＲ４２９を得、図中その記号は第５図と同じ意味で、ＢａｍＨＩ− ＥｃｏＲＩおよびＩｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩフラグメントは　ｍ　で表して示した 。

このプラスミドでは、β−ガラクトシダーゼをコード化する配列が実施例２に記 載されたＡＤＨ２プロモーターの制御下にある。

２）プラスミドｐＥＭＲ４６１の構築 プラスミドｐ　ＥＭＲ４２９を完全に酵素ＭｌｕＩおよび５ｐｈｌで消化した。

ついで、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む大きいＭＩｕｌ−５ｐｈＩフラグメ ントを合成フラグメントで結合し、その配列は以下に示され、サツカロマイセス ・セレビジアエのＧＡＬ７遺伝子プロモーターの上流活性化配列およびＭ　１　 ｕ　Ｉおよび５ｐｈＩ粘看性末端（ＵＡＳ）を含む。

こうして得たプラスミドｐＥＭＲ４６１は第９図に示され、その記号は第８図と 同じ意味であり、新規Ｍｌｕｌ−ＳｐｈＩフラグメ”トは　ｍ　によって示した 。

このプラスミドでは、β−ガラクトシダーゼをコード化する配列は実施例２で記 載された本発明の人工プロモーターの制御下にあった。

実施例６ プラスミドｐＥＭＲ４２９およびｐＥＭＲ４６１によるＤＢＹ７４６サツカロマ イセス・セレビジアエ株の形質転換ウラシルのプロトトロピーの選択形質転換。

（Ｍａｔα、ｈｉｓ３．１ｅｕ２．ｕｒａ３．ｔｒｐｌ、ｃｙｈｌｌ）（。

−ズ等、プロシーディンゲス・ナショナルアカデミ−・オン・サイエンス・ニー ニスエイ、第７８巻、第２４６０−２４６４頁）記載のＤＢＹ７４６株のコロニ ーを液体ＹＰＧ培地と称する培地１００ｍ１に接種した（実施例３の第１表参照 ）。細胞密度がｍｌあたり１０７細胞に達したら、細胞を０．２Ｍの酢酸リチウ ムで当業者に既知でありイトウ等（イトウ等、ジャーナル・オン・バクテリオロ ジー、第１５３巻、第１６３−１６８頁（１９８３年））に記載された技術によ り形質転換処理した。

ＤＢＹ７４６細胞をプラスミドｐ　ＥＭＲ４２９およびｐＥＭＲ４６１のそれぞ れ約１μｇで平行して形質転換した。形質転換した細胞をウラノルなしの固体培 地と称する培地でウラシル（ｕｒａつの栄養素要求形質を選択した（実施例３の 第１表参照）。形質転換した株ＤＢＹ７４６ｐＥＭＲ４２９（ｕｒａつおよび形 質転換した株ＤＢＹ７４６ｐＥＭＲ４６１（ｕｒａ”）はこうして維持した。

実施例７ ＤＢＹ７４６ｐＥＭＲ４２９（ｕｒａつおよびＤＢＹ７４６ｐＥＭＲ４６１（ｕ 　ｒ　ａ”）株の助けによるβ−ガラクトシダーゼの生成 １）β−ガラクトンダーゼの発現 形質転換コロニーＤＢＹ７４６ｐＥＭＲ４２９（ｕｒａつおよび形質転換コロニ ーＤＢ’ｒ’７４６ｐＥＭＲ４６１（ｕｒａ’）をトリプトファン（１０ｍｇ／ ｌ）をあらかじめ加えたウラシルなしの液体培地２０ｍ１を接種した。撹拌しな がら３０℃で一晩後、１％グルコースを加え、培養を４時間続けた。培養物中に グルコースがまだあるかどうかチェックした。β−ガラクトシダーゼを検定する ためにアリコートをとった。

撹拌しながら３０℃で一晩後、２種の培養物を７００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し た。残渣を無菌蒸留水１０ｍ１にとり、再び７０００ｒｐｍで１０分間遠心した 。β−ガラクトシダーゼの発現をＤＢＹ７４６ｐＥＭＲ４２９（ｕｒａ０株のエ タノール−グリセリンＹＰ培地（実施例３、第１表参照）２０ｍｌおよびＤＢＹ ７４６　ｐＥＭＲ４６１（ｕｒａ“）株のエタノールーグリセリンーガラクトン ダーゼＹＰ培地（実施例３、第１表参照）２０ｍｌ中の細胞にとり、導入した。

培養物を再び一晩３０℃で撹拌しながら接種した。

２）サンプルの調製および検定 上記で培養した細胞を遠心にかけ、上清を取り除いた。残渣を蒸留水１０ｍ１に とり、７０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上記のように洗浄した残渣をβ−ガ ラクトシダーゼ検定緩衝液（ＥＤＴ八２へ１０”Ｍ；Ｎａ、ＨＰｏ、７Ｘ１０− ”Ｍ；ＮａＨ１ＰＯｓ３×１０−宜Ｍ；Ｍｇ５０４１０−”Ｍ；Ｍｎ５０４２Ｘ １０−”Ｍ）　約１ｍｌ１：とった。上記緩衝液にとった約３００μｍの細胞を 最終容量の約半分のり５スｌ：−−ス（ｌ［径４００〜５００μｍ）の存在下溶 解した。この混合物をポルテックスで４回１分間激しく撹拌し、サンプルを３０ 秒間粉砕操作問の水中に置いた。液体をパスツールピペットで管から回収し、微 量管に移した。グラスビーズをｐＨ８，９のＴＥＡ緩衝液約２００μｍで１回洗 浄した。ビーズをポルテックスで１分間激しく撹拌し、液体をパスツールピペッ トで回収し、上記溶解物に加えた。溶解物を微量管で７０００ｒｐｍ５分間遠心 した。上清を注意深く回収し、ウェスタンプロット尿酸オキシダーゼ活性検定お よび捻回溶性蛋白検定のために一２０℃貯蔵した。溶解した細胞の残渣を一２０ ℃で別々に貯蔵した。

β−ガラクトノダーゼ活性をバーディ−（バーディ−等、ジャーナル・オン・モ レキュラー・バイオロジー、第１巻、第１６５６−株は少量のβ−ガラクトシダ ーゼを産生ずるが、この蛋白はＤＢＹ１７８頁（１９５９年））の技術により検 定した。

さらに、捻回溶性蛋白を実施例４に記載したようにビオラド（Ｂ１０ＲＡＤ）蛋 白検定キットを使用して検定した。

得られた結果を以下第４表に示す。

第４表 株　培養の炭素　β−ガラクト　捻回溶性　培養培地およびエネ　シダーゼ活性 　蛋白 ルギー源　Ｕ／ｍｌ　μｇ／■１ ＤＢＹ７４６ｐＥｉｌＲ４２９グルコース　５９　３７５　ウラシルなしの液（ ｕｒａ’）　体培地十トリプト ファン（１０■ｇ／園１）＋ （１％）グルコース ＤＢＹ７４６ｐＥＭＲ４２９エタノール／　６５００　１７００　エタノールグ リセ（ｕｒａつ　グリセリン　リンＹＰ培地ＤＢＹ７４６ｐＥＭＲ４６１グルコ ース　０３５０　ウラシルなしの液（ｕｒａ”）　体培地十トリプト ファン（ｌｈｇ／ｍｌ）＋ （１％）グルコース ＤＢＹ７４６ｐＥＭＲ４６１エタノール／グ　４８０　５２０　エタノール−グ リ（ｕｒａ’）　リセリン／ガラク　セリン−ガラクトドース　−スＹＰ培地 この表は次のことを示す。

一グルコース存在下で、ＥＭＹ７４６ｐＥＭＲ４２９（ｕｒａ’）７４６ｐＥＭ Ｒ４２９（ｕｒａ”）株では検出されない。それ故、本発明の人工プロモーター はＡＤＨ２プロモーターより良い抑制を示す。

一導入条件下、人工プロモーターはβ−ガラクトンダーゼの発現を高レベルに導 入するが、これらの条件では、ＡＤＨ２プロモーターで得られたレベルよりも低 い。

ＡＧＡＴＡτＧＡＡＱ：Ｃ：ＣＱＴＧＡＣＡＡＣτＣＯＣフＴＣＣＣＡＧ？Ａら ＴＣＴＡＴＡ？ＡＡＡＡＧＡＣ２０？ＡＴＩ　ＴＣ：、ＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＡ ＡＩ　ＡＡＧＣＣＡＣＡＣＧＧＴＣＣＡＡＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧＳＡＣＡＱＣτ ＧτＩｃ：、ＣＣ口■ ＡＡＡＧＣＡＡ　Ｔ　ＴＧＧＧ　Ｔ　Ｔ　Ｉ　Ｉ　ＴＡＴ　Ｔ（ＣＣＩ　Ｃ？Ｃ ：Ｃ；ＧＯＴ　７　Ｔ　ｉ　ＴＣｏＣＳＡＧＣＣＴ　Ｃａ　s　Ｔ　ＧＱＣ；” −ＡＣＴ　ＧＧ；Ａ Ｇ２７Ｃ：Ｓ＾ＡＧＳＡＣ：ＣＯ：：ＡＴＡＣＱＧＴＣａ？丁Ｃ，’、（、、、 ，２ＴＡにＣ：ＡＡＧＣ〕ＣＪＡＡＡＡτＡＡτＧτ０τｇf： ｃ：ｇｓｓｃｔＩＣＳ：ＳＡＣ：：ＡｉＡＩＧＴＣ；ＣＡＡＧτＧ１τ１τＡτ Ｃ３ロＴｉｃ二＝ＣτＴＴτＡＴＴＡＣＡＣＡτＣ０ＣττＴＡＳＣ鴎；Ｑｒ： （二Ｃτ：ＡＧｉτ；Ｃ二ＣＡＴＧこ；τａ：ｃ：：ｇ＋ｇｔ＾＾スｔＡＧａＣ ＡＡ貫τにス；二Ｃ二ＡＳτＣ＝丁；Ａ＾ＱＣＣグτみＣに八τ＾Ｇτ６；スＴ ＡＴＢ＾丁Ｃ丁実施例８ 酵母でのヒトシトキニンＧｒｏ−βの発現および選択のための２種のベクターの 構築二本発明の人工プロモーターをもつプラスミド、　ＥＭＲ５７５およびｐＥ ＭＲ５８３上記記載の実施例は局在が細胞内にある蛋白に関する。現在、酵母は 培養培地で組換え体蛋白を分泌することができることが知られている。蛋白分泌 を導く代謝経路の使用はいくつかの重要な利点を有する。

１−かなり純粋で正確に成熟した生成物を培養上清から回収することができる。

２−蛋白はジスルフィド結合、グリコジル化などのような分泌経路に関連した修 飾によって有利になる。

酵母により天然に分泌された蛋白またはポリペプチドがいくつがある。既知の大 部分の場合、これらの蛋白は長い前駆体の形で合成され、そのＮＨ，−末端配列 は分泌を導く代謝経路に入るため決定的である。ある場合では、これらのＮＨ！ −末端配列は異種蛋白の分泌に使用することができる。これらの配列の中で、ア ルファフェロモンのプレープロ系に使用することが知られている。酵母のアルフ ァセックスフェロモンはＭａｔαセックス型のサツカロマイセス・セレビジアエ 酵母により培養基地中分泌される１３個のアミノ酸のペプチドである。

アルファ因子はＧ１相の反対側のセックス型（Ｍａｔａ）の細胞を抑制し、細胞 の２つの型の連結に必要な生化学的および形態学的変化を誘導する。クリャン、 Ｊ、およびヘルスコヴッッ、■、セル、第３０巻、第９３３−９４３頁（１９８ ２年）はアルファ因子の構造的遺伝子をクローン化し、この遺伝子の配列からこ の１３個のアミノ酸のこの因子が１６５個のアミノ酸のプレープロ前駆体蛋白の 形で合成されるという結論に達した。前駆体は２２個のアミノ酸の親木性アミノ 末端配列を含み、３つのグリコジル化部位を含む６１個のアミノ酸の配列、α因 子の４つのコピーを含む。これらの４つのコピーはスペーサー配列により分離さ れ、成熟した蛋白は次の酵素活性により分離した。： １−カルボキシ末端でＬｙｓ−Ａｒｇジペプチドを開裂するカテプンンＢ型（ｙ ｓｃＦと称するＫＥＸ２遺伝子の生成物）のエンドペプチダーゼ ２−切断したペプチドのカルボキシ末端で塩基性残渣を開裂するカルボキシペプ チダーゼ型（ＫＥＸＩ遺伝子の生成物）のエキソペプチダーゼ ３−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａ　ｌ　ａおよびＡｓｐ−Ａｌａダブレットを取り除くジベブ チンルアミノペプチダーゼ（Ａと称する’）（ＳＴＥ１３遺伝子の生成物） この系で分泌し、本発明のプロモーターを使用する蛋白の最初の例はヒトシトキ ニンＧｒｏ−βである。この蛋白のｃＤＮＡはｇｒＯ−β（Ｓハスキル等、ブロ シーデインダス・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス・ニーニスエイ、 第８７巻、第７７３２−７７３６頁（１９９０年））またはＭＩＰ−２α（Ｐ、 テカンブーオルソン等、ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メディシン、 第１７２巻、第９１１−９１９頁（１９９０年））のどちらかで称され、現在そ れはクローン化し、配列化されている。ｇｒｏ−βはシトキニンの属に含まれ、 そのメンバーは炎症応答の調節および成長因子型の作用を含むように思われる。

サツカロマイセス・セレビジアエによるｇｒｏ−βの分泌の前駆体の使用を試験 した。このようにするため、Ｇｒｏ−βの天然のシグナル配列をアルファフェロ モンのプレープロ配列で置換し、本発明のプロモーターの後ろのｇｒｏ−βの前 駆体を置いた。

１−プラスミドｐＥＭＲ５３０の構築（クローン化ベクター）上記記載（実施例 ２の２）−第７図）のプラスミドｐＥＭＲ４７３を酵素Ｘｈｏ　Ｉおよび５ａｌ ｌで消化し、大きいフラグメント（ここではフラグメントＥと称する）を単離し た。大きいフラグメントはＵＲＡ３遺伝子、複製起源および２μフラグメントの 遺伝子座ＳＴＢ、アンビンリン耐性遺伝子Ａｍｐ”、プラスミドｐＢＲ３２２お よびサツカロマイセス・セレビジアエＧＡＬ７遺伝子のプロモーターのＵＡＳの 複製起源、およびＰＧＫ遺伝子のターミネータ−の配列を含む。

約４００塩基対の二重鎖オリゴヌクレオチド配列（フラグメントＦと称する）を ＸｈｏＩ−３ａｌｌフラグメントの形で合成した。

この配列はＴＡＴＡ領域およびＡＤＨ，プロモーターの開始領域をもたらし、ア ルファフェロモンのプレープロ領域の開始前の合成配列により延長される。この アルファフェロモンのプレープロ領域の配列はＴＣＴコドン（フェロモンの前駆 体のセリン８１に相当）からＡＧＣの静的変位にょるＨｉｎｄｌ１１部位の導入 において、クルヤンおよびヘルスコヴイッッ、セル、第３０巻、第９３３−９４ ３頁（１９８２年）に記載されたものと異なる。フラグメントの全配列は次のと おりである。

ＡＡＧＡＡＣＣＡＴＴＴＱＴＣＴＴＡＴＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＴＴＴＴＣＧＴＡ ＴＯＴＴＡＧＴＴｌ：ｉＡＴ＾ＧＴＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴフラグメントＥおよび Ｆを結合して、第１０図に示したプラスミドｐＥＭＲ５３０を得、その記号は第 ７図と同じ意味で、新規ｘｈｏ１−３ａｉｌフラグメント（フラグメントＦ）は で示して入れた。

このプラスミドは本発明の人工プロモーターからなり、その配列は実施例２で与 えられる。

２−プラスミドｐＥＭＲ５８３の構築（ヒトシトキニンｇｒｏ−βの発現プラス ミド） プラスミドｐＥＭＲ５３０を酵素ＮｈｅｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで完全に消化し た。小さいＮｈｅｌ−ＨｉｎｄＩ　１１フラグメントは人工プロモーターおよび αフェロモンのプレープロ領域およびＵＲＡ３遺伝子を含んでおり、それを精製 した（以下、フラグメントＧと称する）。

プラスミドｐＥＭＲ４７３を制限酵素ＮｈｅｌおよびＢａｍＨＩで完全に消化し た。大きいフラグメント（以下、フラグメントＨと称する）は複製開始点および ２μフラグメントの遺伝子座ＳＴＢ、ＬＥＵ２ｄ遺伝子、アンピンリン耐性遺伝 子、ｐＢＲ３２２の源およびＰＧＫ遺伝子のターミネータ−を含んでおり、これ を精製した。

ｇｒｏ−βのｃＤＮＡをテカンブーオルソン等、前述に記載された方法によりク ローン化し、配列化した。ｇｒｏ−βのｃＤＮＡの配列（上記文献で詳細に説明 、特に第２図）はＡＴＴコドン（ｇｒＯ−βの成熟配列の＋１８部位のイソロイ シン、テカンブーオルソン等、前述）を含み、２つのフランキングコドンＧＧΔ およびＣＡＣとも重なるＥｃｏＲ１部位（配列：５°−ＧＡＡＴＴＣ）を有する 。ｇｒｏ−βのクローン化ｃＤＮＡはＢａｍＨＩ制限部位によりフランクされた ポリＡ尾の３′末端で終了する。

ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントはｇｒｏ−βのコード化配列の大部分を含 み、ポリアデニル化尾のフランクしたｍＲＮＡの未翻訳末端に相当する３゛末端 を含み、それはマニアテイス等（前述）に記載された慣用技術により単離した。

フラグメントを以下フラグメントＩと称する。

合成Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントはアルファフェロモンのプ レープロ領域末端（残基ＳｅｒＬｅｕＡｓｐＬｙｓＡｒｇに相当）およびｇｒｏ −βの成熟蛋白をコード化する配列の開始を含み、これも市た製造された。この フラグメントはフラグメントＪと称され、以下に示す。ｇｒｏ−βのｃＤＮＡの 開始に相当する配列はテカンプーオルソン等、前述に記載されたｃＤＮＡの配列 に関連して修飾され、そのため、使用したコドンはＳ、セレビジアエ（シャープ 等、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１４巻、第５１２５−５１４３頁） によりもっとも頻繁に使用されたものである。

Ｈｌｎｄ　？Ｘ！ ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡＡＭ：ＡにＣＣ；ＣＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＴＧｋｋＴＴ ｃＡＧＡＴ（ＴＣｋｋＴＣＴ’ＩゴＣＣｋＡＡＣＣ’ｒＴＣbＡＭ、Ｇ ＡＣＣＴＡＴｒｒＴＣＴＣＣ；ＣＬ：、ＧＡＡＡＣＣにＡＴＣＡＣＴＴＡＡＣＴ ＣＴＡＣＡにＴｒＡＣＡＡＡＣ（ＴＴτＧＧＡＡＣＣＴＴＣbＴＴＡＡ 貼厨Ｕ フラグメントＧ、Ｈ，ＩおよびＪを結合し、第１１図に示したプラスミドｐＥＭ Ｒ５８３を得、その記号は第７および１０図と同じ意味であり、フラグメントＥ は　）に　、フラグメントＦは−で示した。

ｇｒｏ−βの成熟蛋白の開始およびαフェロモンのプレープロ領域の末端のヌク レオチドおよびペプチド配列を以下に示す。

Ｇ　Ｔ　Ａ、Ａ　Ｇ　ｃ、’ｒ　Ｔ　Ｇ、Ｇ　Ａ　Ｔ、Ａ　入Ａ、Ａ　Ｇ　Ａ、 ｌａ　ＣＧ、ＣＣ？、Ｔ　Ｔ　Ｇ。

カテプシンＢ型のエンドペプチダ ーゼの開裂部位：ｙｓｃＦ（ＫＥ Ｘ２遺伝子の生成物） 実施例９ 酵母によるシトキニンｇｒｏ−βの分泌１　プラスミドｐＥＭＲ５８３によるＥ ＭＹ７６１酵母株の形質転換および形質転換株によるｇｒｏ−βの発現。実施例 ３に記載したＥＭＹ７６１株（Ｍａｔα、Ｉｅｕ２．ｕｒａ３．ｈｉｓ３）を実 施例３）にすでに記載した技術によりロイシンのプロトトロピーのプラスミドｐ ＥＭＲ５８３により形質転換した。２つの形質転換した株（以下、ＥＭＹ７６１ ｐＥＭＲ５８３（１）およびＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ５８３（２）と称する）を保 持した。

２　ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ５８３（１）およびＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ５８３（２ ）株によるｇｒｏ−βのｃＤＮＡのエーレンメイヤーフラスコ中の発現。ラエム リ（Ｕ、　Ｋ、ラエムリ、ネイチャー、第２２７巻、第６８０−６８５頁（１９ ７０年））に記載されたプロトコールによりポリアクリルアミドゲル／ドデンル 硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の培養培地中の蛋白の検出。

培養 ａ／ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ５８３（１）およびＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ５８３（２ ）株の各コロニーをウラシルなしの液体培地５０ｍ１中で培養した。この培地は リットルあたり次のものを含む。

アミノ酸なしの酵母窒素源（ＤＩＦＣＯから）　６．７ｇカゼイン氷解物（ＤＩ ＦＣＯからのカザミノ酸）　５．０ｇグルコース　１０ｇ 撹拌しながら一晩後、２つの培養物を１０分間７０００ｒｐｍで遠心した。残渣 を無菌蒸留水１０ｍ１にとり、１０分間７０００ｒｐｍで再び遠心した。ｇｒｏ −βの発現はエタノール−グリセリン−ガラクトースＹＮＢ培地５０ｍ１中の細 胞を添加して誘導した。エタノール−グリセリン−ガラクトースＹＮＢ培地はリ ットルあたり次のものを含む。

アミノ酸なしの酵母窒素源（ＤＩＦＣＯから）　６．７ｇカゼイン氷解物（ＤＩ 　ＦＣＯからのカザミノ酸）　５．０ｇグリセリン３０ｇ ガラクトース３０ｇ エタノール１０ｍ１ 培養物を撹拌しながら３０℃で２４時間再びインキュベートした。

ｂ／対照株 非形質転換ＥＭＹ７６１株、すなわち、プラスミドなしのＥＭＹ７６１株を上記 と同様に培養した。一方には、ウラシルなしの液体培地５０ｍ１中に前培養した ものにウラシルを加え（２０μｇ／ｍｌ）、他方には、エタノール−グリセリン −ガラクトースＹＮＢ培地５０ｍ１中に導入したものにウラシルを加えた（２０ μｇ／ｍｌ）。

サンプルの製造 １ａ／およびｌｂ／”？’培養シタ細胞を１０，０００ｒｐｍｔ’２０分間遠心 し、上清で集めた。デオキシコール酸塩２ｍｇ／ｍｌを含む５０％トリクロロ酢 酸５ｍｌ上清１０ｍ１に加えた。

この混合物を３０分間で＋４℃に冷却し、ついで、３０分間、１１０００Ｑｒｐ で遠心分離した。残金を約１ｍｌの冷アセトン（＋４°Ｃ）中に添加し、再び３ ０分間、１１００００ｒｐで遠心分離した。乾燥後、残金を約１０ｕｌのトリス −ＨＣＩ　０．１２５Ｍ、　ｐＨ６，８，５Ｄ３４％、ブロモフェノールブルー ０．００２％、グリセリン２０％、β−メルカプトエタノール１０％からなるい わゆる負荷緩衝液（レムリ（１９７０）に記載のプロトコルによる）２０μｍ中 に添加する。残金を１５分間沸騰させて溶解し、ブロモフェノールブルーカ情に 変わるまで、ＩＯＮ水酸化ナトリウムを添加して中和する。

サンプルはポリアクリルアミドゲル／ＳＤＳ上に置く。

１／サイズマーカー ２／非誘導、非形質転換ＥＭＹ７６１　：２ｈｌ付着３／非誘導Ｆ：、ＭＹ７６ １　ｐ　ＥＭＲ５８３（１）　＋　２０ｇ１付着４／２４時間誘導ＥＭＹ７６１ ｐＥＭＲ５８３（１）＋１５ｇ１付着５／２４時間誘導ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ５ ８３（１）：　５ａ／付着６／サイズマーカー ７／２４時間誘導ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ５８３（２）：　５＃ｌ付着８／２４時 間非誘導ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ５８３（２）：１５ａｌ付着９／非誘導ＥＭＹ７ ６１ｐＥＭＲ５８３（２）　：２ｈｌ付着１０／誘導、非形質転換ＥＭＹ７６１ 　：２ｈｌ付着電気泳動後、蛋白をクーマシーブルーで染色する。

結果 得られたゲルの分析は、約ＫＤａの明らかな分子量を有する過剰蛋白がＥＭＹ７ ６１　ｐＥＭＲ５８３（１）株（レーン及び５）及びＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ５ ８３（２）株（レーン７及び８）により生成され、非形質転換ＥＭＹ７６１株（ レーン２及び１０）の培養土清液には生成しないことを示す。又、この過剰蛋白 の合成がエタノール−グリセロール−ガラクトース上の生育によるプロモーター の誘導と関連していることも明らかである（レーン３及び９のバンドなし）。

ＨＰＬＣにより精製されたこの蛋白のアミノ末端配列の分析は、それがテカンブ ーオルソン等、前掲により記載された成熟ｇｒｏ−β蛋白であったことの証明を 可能にした。

従って、ントキニンｇｒｏ−βが本発明のプロモーターの制御下に分泌できるこ とは明らかである。

ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ５８３（１）株は番号１−１０２１の下にジ・インステ ィチュート・パスツールに寄託されている。

実施例１０：酵母中ＩＬ−８の発現及び分泌のためのベクターの構築：本発明の 人工的プロモーターを運ぶプラスミドｐＥＭＲ６１１ その発現を本発明のプロモーターにより調節できる分泌蛋白の第二例はヒトサイ トキニンＩＬ−８である。単核球により生成される約８０００Ｄａのこのサイト キニンは、幾つかのチーム、ヨシムラ等（１９８７）、ジャーナル・オン・イム ノロシイ、１３９．７８８−７９３．７ユレーダー等（１９８７）、ジャーナル ・オン・イムノロシイ、１３９．３４７４−３４８３、及びワルツ等（１９８７ ）、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ ンズ、１４９．７５５−７６１により記載されている。ＩＬ−８は好中球の化学 的誘引物として作用する。ＩＬ−８は、β−スロンボグロビンと異常な構造類似 性を有する（ヴアン・ダム等（１９８９）、ユーロピアン・ジャーナル・オン・ バイオケミストシイ、１８１．３３７−３４４）。サイトキニンＩＬ−８は、互 いにそのＮＨ２−末端で異なる幾つかの形で存在する。主な形は７２アミノ酸か ら構成されるが５つの他のマイナー形も生成され、その３つは主な形に比べて先 を切り取ったＮＨ！−末端を有し、他の２つは主な形に比べて５と１のアミノ酸 がそれぞれ伸張している。

ＩＬ−８のｃＤＮＡは、マツシマ等、１９８８、ジャーナル・オン・エクスペリ メンタル・メディシン、１６７．１８８３−１９９３により記載された方法によ りクローンし、配列を決めた。このｃＤＮＡの配列は、成熟部分の４２番目と４ ３番目のコドンをカバーする単−Ｈｉｎｄｍ部位（５’−ＡＡＧＣＡＡ）を含む （形７２ａａ；ｖツンマ等、前掲を見よ）。

さらにこのクローニングに用いたＩ　Ｌ−８のｃＤＮＡのクローンは、ポリＡ− 尾部の末端（３°）に直接隣接する単−Ｂａ■Ｈ１部位を有する。ＩＬ−８ｃＤ ＮＡの３°末を運ぶＢａｍＨＩ　−ＨｌｎｄｌＩ［断片を精製した。

クローニングベクターを以下の方法で調製した。

実施例８に記載したプラスミドｐＥＭＲ５８３をＨｉｎｄｎｌ及びＢａ＋ｏＭＩ で消化した。

この二重消化は５断片を放っ：最も重い断片：クローニングベクターに対応する 。Ｈｉｎｄｍ−ＢａｓＨＩ（約７７６０塩基対）。他の４つ、ｇｒｏ−βのｃＤ ＮＡの配列に対応するＨｉｎｄｍ−Ｈｉｎｄｍ（１６９塩基対、９２塩基対、５ ２９塩基対及び１８７塩基対の大きさを有する）。クローニングベクターのＨｉ ｎｄＩ［１部位は、アルファフェロモンのｐｒｏ配列の末に、挿入部位がら少し 上流に位置する（そしてプレカーサーのコドン−セリン８１−の配列をカバーす る）。Ｂａ■ＨＩ部位はＰＧＫのターミネータ−がら上流に位置する。

Ｈｉｎｄｍ−ＢａｓＨＩ断片のＤＮＡを精製した。ｃＤＮＡの配列の３°部を含 むＨｉｎｄＩ［［−ＢａｍＨＩを合成Ｈｉｎｄｎｌ−ＨｉｎｄｍＤＮＡ断片で連 結した。以下に与える本断片の配列は、切断部位（Ｓｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌ ｙｓ−Ａｒｇ）の配列により先に起こったＩＬ−８（７２アミノ酸）の主な成熟 形の配列を再構成することを意図する。新規Ｈｉｎｄｍ−ＢａｍＨＩ断片を、ク ローニングベクターに対応するＨｉｎｄｎ［−Ｂａ＋＊ＨＩで連結した。合成Ｈ １ｎｄＩ［［−Ｈｉｎｄｍ断片の配列は以下の通りである。

５　’　−ＡＧＣＴＴ（：ＧＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴ（：ＣＴＭＧＧＭＴｒにＡ ＧＡＴＧＴＣＡＡＴＣＴＡＴＣＭＧＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＡfＣＣＡＴＴＣＣ ＡＣＣＴＡＴＴＴＴＣτＡＧＡＣＣＡＴＴＣＣＴｒＭＣＴＣＴＡＣＡにＴＴＡＣ ＡτＡｌｌ：ＴｒＣτＣＡＡＴＣＡＣＡＴＴＣＣＧτＡＡＧf ＡＣＣＣｋｋＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＧＴＴＡＴＣＧＡＡＴ ＣＴＧＧＴ（：ＣＡＣＡＣＴＣＴｃＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＡ`ＴＴＡＴ ＴＬ：、ＣＣＴＴＴＣＡＡＣＴＡＣＴｒＣＣＴＴＡＡＣＴＣＴＣＡＡＴＡＧＣＴ ｒＡＧＡＣＣＡＣＧＴＧＴにＡＣＡＣ（：ＡＴＴＱＴＣＡＣsｒＴＡＡ丁Ａ この方法で得られる、αフェロモンのｐｒｅ−ｐｒｏ配列及び本発明のプロモー ターにより先に起こったＩＬ−８のｃＤＮＡを運ぶ、その配列が実施例２に特定 されたプラスミドは、ｐＥＭＲ６１１と呼ばれる。

実施例１１．プラスミドｐＥＭＲ６１１によるＥＭＹ７６１酵母株の形質転換及 びＩＬ−８の分泌 実施例３に記載したＥＭＹ７６１株（Ｍａｔａ、ｕｒａ３．１ｅｕ２、ｈｉｓ３ ）を既に記載した技術によってプラスミドｐＥＭＲ６１１のＤＮＡにより（ｌｅ ｕ　）株に形質転換した。得られた（ｌｅｕ　）コロニーの一つをランダムに取 ってＩＬ−８の分泌を研究するために培養した。

この株を以後ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ６１１と呼ぶ。

酵母により分泌した蛋白の分析のためのプロトコールは、実施例９に記載された ものである。ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ６１１により分泌した蛋白をＥＭＹ７６１ により分泌したものと比較した。これにより、ガラクトースにより誘導されるＥ ＭＹ７６１　ｐＥＭＲ６１１細胞により分泌した８０００Ｄａの蛋白に対応する 過剰主要バンドが明らかになった。この蛋白は、この分野の当業者によく知られ 、そのプロトコールは実施例４で詳細に示した方法、ウェスタンプロットによる 分析の結果に従って、（エンドゲン：抗ヒトＩＬ−８多価ｐ８０１により与えら れた）ヒｌ−Ｉ　Ｌ−８に向けられたウサギ抗体により特異的に認識される。

従って、発現プラスミドｐＥＭＲ６１１は、形質転換酵母内で高レベルのＩＬ− ８の発現を許す。この発現は本発明の人工的プロモーターの制御下にある。

ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ６１１株は番号ｌ−１０２３の下にジ・インスティチュ ート・パスツール・コレクションに寄託されている。

実施例１２．ヒルディンの発現及び分泌のためのベクターの構築。

本発明の人工的プロモーターを運ぶプラスミドｐＥＭＲ５７６ Ｈｉｒｕｄｏヒルにより天然に生成されたヒルディンは非常に特異的でスロンビ ンの有効なインヒビターである。数多くの変異体が確認され、ＨＶ，ＳＨＶ！及 びＨＶ３により示された（ドッド、ジエイ等（１９８６）ＦＥＢＳレターズ、２ ０２、３７３、３７７）。これらの天然変異体及び他の同族体の幾つかは、次い で種々の宿主細胞中、遺伝手術により調製した。本実施例は特許公開ＥＰ−Ａ− ０２７３８００に記載された変異体ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７に関係する。さらに詳 しくは、成熟ヒルディンの配列の開始に直接先立つシグナル配列：Ｍｅｔ−Ａｒ ｇ　−　Ｐｈｅ　−　Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌ ａ−Ａｌａ　−　Ｔｙｒ　−　Ａｌａ　−　Ｌｅｕ　−　Ｐｈｅ”　Ｐｈｅ−Ｔ ｈｒ−Ａｌａ　−　Ｓｅｒ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａを含むこの変異体 ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７のプレカーサー用の発現配列コード。

このプレカーサーの構成及び構造は特許公開ＥＲ２４４６４３７に記載される。

このプレカーサーの発現は、形質転換細胞の培養土清中に変異体ｒＨＶ２−Ｌｙ ｓ４７の放出を許す。

その構成及び記述が特許出願ＦＲ２６４６４３７に詳細に示されているブラスミ ドｐＴＧ３８６７は、ヒルディンに対する分泌ベクターである。この構成におい て、ヒルディンは、単一配列を含むプレカーサーの形で合成される。ヒルディン は、α抱台型の酵母株中の構造プロモーターであるＭＦα１遺伝子の後に置く。

プラスミドｐＥＭＲ５４７の構築 ブラスミドｐＥＭＲ５４７は、プラスミド２μから始まる小配列の削除によるブ ラスミドｐＥＭＲ５１５（実施例２参照）から誘導され、ＬＥｕ２ｄの遺伝子の 端とブラスミドｐＢＲ３２２の配列と接している（ｂｏｒｄｅｒｉｎｇ）Ｅｃｏ Ｒ　１部位の間に位置する。プラスミドｐＥＭＲ５１５はＢｓｐＭＩで部分的に 、ＥｃｏＲＩで全体的に消化した。ＬＥｕ２の３゜部分及び２μ断片の小さい接 している配列が削除したブラスミドｐＥＭＲ５１５に対応する大きなＢｓｐＭＩ −ＥｃｏＲＩ断片は、ＬＥｕ２ｄ遺伝子の３′部分を再構成することを意図する 合成ＢｓｐＭ　Ｉ　−　Ｅ　ｃｏＲ　Ｉで連結した。

合成配列は以下の通りである。

εｅｏＲ［″　Ａ白ＴＴＧＣＣＣＧＧＧＡＣＧＴＣＴＴＡＴＧＴＡＣＡＡＡＴＡ ＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＴ，ＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧ ＡＡＴＩ：ＩＣＡＴＧＴＴＴＡＴＡＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＡＧＡ白Ａ ＡＡＡＡＧＣＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＴＴ白ＡｃＴＴｃＴＴＣＧＧＣＧＡＣＡＧＣ ＡＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＧＴＧＧＴ白ＣＴＧＴＴＧＧＴＴＣｃｖｙｃｃｒＡ ＡＡＩ！！ｌＧＡｑｒｒＧｐｑＧｑｑａｃｃｃｃＴＧＴＣＧＴＡＧＴＧＧＣＴＧ ＭＧＣＣＡＣＣＡ丁ＧＡＣＡＡＣＣ臼自ＣＣＩ”ｌＣＣＴｌ”ｌＡｌ’ｌＴＣＡ ＣＣＡＧＴＴＣＴＧθＴＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＡＧＴＧ ＧＴＣＡＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＣＧＴＡＧＧＴＴＴＴ再構成したブラスミドはｐ ＥＭＲ５４７と呼ぶ。

ブラスミドｐＥＭＲ５６８の構築 ブラスミドｐＥＭＲ５６８を以下の手段でｐＥＭＲ５４７から誘導する。

プラスミドｐＥＭＲ５４７のＤＮＡをＭｌｕｌ及びＮｈｅｌで消化する。この二 重分解はブラスミドｐＥＭＲ　５　４　７　（６．　６　Ｋｂ）を線状にするこ とを可能にし、２つの部位Ｍｌｕｌ及びＮｈｅｌは互いの少しの塩基対内に位置 する。配列 ＣＴＡ（；ＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＴＣ（：ＡＧＴｒＣ（；ＡＡＴ（ ：ＣＧＣの二本鎮合成オリゴヌクレオチドをこれら２つの部位の間に挿入した。

得られるブラスミドをｐＥＭＲ５６８と呼ぶ。

ブラスミドｐＥＭＲ５７６の構築、ヒルディン用発現プラスミドヒルディンの変 異体ｒＨＶ２−Ｌｙｓ４７の配列を、その構造及び記述が特許出願ＦＲ２６４６ ４３７に詳細になされている、ブラスミドｐＴＧ３８６７から得た。この構築中 、ヒルディンを（開始コドンに対応するメチオニンを含む）２３アミノ酸のシグ ナルペプチドを構成するプレカーサーの形で合成する。プレカーサーをコードす るメッセンジャーＲＮＡを、アルファ抱台型の酵母株中の構成プロモーターであ るＭＦα１プロモーターの助けをかりて転写する。

ブラスミドｐＴＧ３８６７のＡｃｃ　Ｉ　−　Ｓａｌ　Ｉ二重分解は幾つかの断 片を放出し、その最短、約２００塩基対を数えて、　２％アガロースゲル上で容 易に精製できる。この断片と接するＡＣＣＩ部位は、配列 ＴＡＡＴ（；Ｃ　ＡＴＩＡＴＧＴＣＴＧ成熟配列 成熟配列 に従って、成熟配列の開始から少しの塩基対を設置する。

５ａｌ１部位は、ヒルディンのコード付は配列の停止コドンから下流に位置する 。

２００塩基対のＡｃｅ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉ断片は、ヒルディンの成熟配列のより 大きな部分に対する情報を運ぶ。相補性情報（シグナル配列及び成熟配列の開始 ）は、以下に特定される約９０ヌクレオチドの合成配列により与えられる。

ＴＡＴＡＴにＴＧ丁ＴＡＣＧＣＡＡＡＧＡＧＡＴＣ＾τＧＴＣＡにＣＧＡＴＩ： ＡＣ（ＴＣＣＡτＣＡＣＣＣＣＡ丁ＡＡＡＡＡＣＡＴＣ；ＴbＧＣ；Ａ（：Ｃ ベクターｐＥＭＲ４６８は５ａｉｌで線状化し、Ｃ１ａｌで部分的に消化した。

尿酸塩酸化酵素の配列を削除したこのベクターに対応する約５，５ｋｂのＣ１ａ ｌ−３ａｉｌ断片を、成熟ヒルディンの配列に情報を運ぶ、約２００塩基対のＡ ｃｃｌ−３ａｉｌ断片と連結し、又、ヒルディンのプレカーサーの配列を再構成 することを意図する小合成Ｃ１ａＩ−ＡｃｃＩ配列と連結する。得られるプラス ミドを９２ＭＲ５７６と呼ぶ。

実施例１３：ヒルディンの分泌 １）プラスミドｐＥＭＲ５７６にょるＥＭＹ７５１株の形質転換ＥＭＹ７６１株 （Ｍａｔα、ｕｒａ　３、ｈｉｓ　３、ｌｅｕ　２　）を、既に記載した技術に 従ってプラスミドｐＥＭＲ５７６により（ｌｅｕ　）株に形質転換した。

形質転換株、以後ＥＭＹ７６１９２ＭＲ５７６と呼ぶ、を分離した。

２）ヒルディンの発現 陽性対照として、ＥＭＹ７６１から誘導した（ｌｅｕ　）株、以後ＥＭＹ７６１ （ｌｅｕ　）と呼ぶ、を構築した。用いた技術は特許出願ＦＲ２６４６４３７に 詳細に記載される。ＥＭＹ７６１９２ＭＲ５７６及びＥＭＹ７６１（ｌｅｕ　） 株を以下に記載する方法で平行して培養した。

前培養を以下の組成の培地で行なう。酵母窒素塩基（ディフコ）０゜７％、ヒス チジン５０μｇ／ｍｌ及びウラシル５０μｇ／■１０２４時間後、培養物は以下 の組成を有する培地中、１０’細胞に接種する。

酵母窒素塩基（ディフコ）０．７％、エタノール１％、カザミノ酸０゜５％、ウ ラシル１００μｇ／ｌ１１１、グリセロール３％及びガラクトース１に、後者の 培地で７２時間培養後、上清を０．２μ濾過により細胞と分離する。上清液のト ロンビンに対する阻害活性は、ＦＲ２６４６４３７に記載される比色試験を用い ることにより測定する（合成基質上スロンビンの蛋白分解活性：ベーリンガー・ マンハイムにより販売されるクロモザイムＴＨ）。

以下の表は、上清液　調１当りヒルディンの　μｇでの分析の結果、１．の吸光 度即ち０．３Ｘ１０’細胞／ａｌｌを示す。

従って、ヒルディンが本発明のプロモーターの制御上分泌できることは明らかで ある。

ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ５７６株は、番号１−１０２２の下にＣＮＣＭに寄託さ れている。

尿酸オキシダーゼのトリプシン消化生成物の２１８ｎｍにおける光学密度の測定 による溶離プロフィール１　入入入ｃｃｃτＣ）ＮＣτｃｃｃτＣτＣτＣ入τ τＣＣττＣＣＧ　ＧτにＣＣＣＣＣ（、入τＣＣτＣ入Ａ丁ｃｃλ入Ｃ丁τＧ 丁Ａb入　６０ Ｎｈｅ　Ｉ ρｓＬＩ Ｎｈｅ　ｒ ｓＬ　Ｉ プラスミド　ｐＥ叩４６９ Ｎｈｅ　Ｉ ｓＬ　Ｉ プラスミド　ｐＥ門８４７３ ＮｈｅＩ Ｐｓｔ　Ｉ プラスミド　ｐＥ？１Ｒ４２９ ｈｅ　ｒ Ｐｓｔ　Ｉ プラスミド　ｐＥ門８４６１ ｈｅ　ｒ ρｓｔＩ プラスミド　Ｐ猷Ｒ５３Ｏ ｈｅ　Ｉ Ｐｓｔ　Ｉ プラスミド　ｐＥ叩５８３ 国際調査報告 国際調査報告 ＦＲ９０００９５７ ＳＡ　４３５８４ 国際調査報告 ””””””””””’　ＰｃＴ／ＦＲ９０１００９５７国際調査報告 ＦＲ９０００９５７ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号（７２）発明者　プゼ ゲ、ベルナール フランス３１６００ムレ、ラバティブト、ルト・プランジパル１３番 Ｉ Ｃ１２Ｒ１：８６５） （７２）発明者　シル、ダヴイッド フランス３１５２０ラモンヴイル・サン・ターニュ、レジダンス・ル・バルク４ 番

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．一上流活性化配列ＵＡＳ１およびＵＡＳ２を含む、サッカロマイシス・セレ ビシアエのＧＡＬ７遺伝子のプロモーターの配列のＴＡＴＡ成分から上流の部分 配列、および−ＴＡＴＡ成分および転写開始領域を含むＡＤＨ２プロモーターの 配列の部分配列 を含む酵母における蛋白質発現のための人工プロモーター。
2. ２．サッカロマイセス・セレビシアエのＧＡＬ７プロモーターの配列の部分配列 が下記の配列または部分配列である、請求項１記載のプロモーター。 【配列があります】
3. ３．ＴＡＴＡ成分および転写開始領域を含むＡＤＨ２プロモーターの配列の部分 配列が下記の配列または部分配列である、請求項１または２記載のプロモーター 。 【配列があります】
4. ４．下記の配列を含む、請求項１−３のいずれか１項記載のプロモーター。 【配列があります】
5. ５．関心のある遺伝子が請求項１−４のいずれか１項記載のプロモーターの制御 下にあることを特徴とする、その遺伝子の発現、その複製および形質転換細胞の 選択に必要な手段とともに当該遺伝子をもつ酵母用発現ベクター。
6. ６．関心のある遺伝子が酵母に有毒な蛋白質をコードする組み換え遺伝子である 、請求項５記載の発現ベクター。
7. ７．関心のある遺伝子が尿酸オキシダーゼをコードする組み換え遺伝子である、 請求項５記載の発現ベクター。
8. ８．請求項７または８記載の発現ベクターにより形質転換されている酵母株。
9. ９．請求項５−７のいずれか１項記載の発現ベクターにより形質転換されている サッカロマイセス・セレビシアエ株。
10. １０．ガラクトースの存在下に、請求項９記載のサッカロマイセス・セレビシア エ株を培養することを含む、関心のある蛋白質の製造方法。