DE69022380T2 - Künstlicher Promoter zur Proteine Expression in Hefe. - Google Patents

Künstlicher Promoter zur Proteine Expression in Hefe.

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DE69022380T2
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen künstlichen Promotor zur Expression von Proteinen, insbesondere von heterologen Proteinen, in Hefe, einen Expressionsvektor dieser Proteine, der diesen Promotor enthält, die Hefestämme und insbesondere mit diesem Expressionsvektor transformierte Saccharomyces cerevisiae sowie ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins mit Hilfe dieser Stämme.
  • Hefe und insbesondere saccharomyces cerevisiae, ein nicht- pathogener Mikroorganismus, dessen Genetik ausführlich untersucht worden ist, ist einer der gut geeigneten eukaryotischen Wirte für die Expression von Proteinen, insbesondere von heterologen Proteinen. Es ist demnach wichtig, neue Promotoren für die Expression dieser Proteine zu finden oder zu konstruieren, die interessanter sind als die bekannten Promotoren.
  • Die Struktur eines Hefepromotors, bei dem es sich um eine DNA-Sequenz handelt, die stromaufwärts eines Gens gelegen ist und für dessen Transkription verantwortlich ist, wird nach und nach bekannt und verstanden. Man weiß, daß er eine TATA-Box, die in einem AT-reichen Bereich liegt, einen Transkriptionsinitiationsbereich stromabwärts von dieser Box und gegebenenfalls stromaufwärts von diesem Initiationsbereich Sequenzen enthält, die als Stromaufwärts-Aktivierungs-Sequenzen UAS (Upstream Activating Sequence, auch Upstream Aktivatorsequenz genannt) oder Stromaufwärts-Repressions-Sequenzen URS (Upstream Repressing Sequence) bezeichnet werden, die die Promotorstärke unter dem Einfluß eines Induktors oder eines Repressors regulieren.
  • Die Anmelderin hat einen neuen Hybrid-Proinotor aus zwei bekannten Promotoren erzeugt: dem Promotor des GAL7-Gens von Saccharomyces cerevisiae (Tajima et al., 1986, Molecular cellular Biology, 6, 246-256) und einem Promotor mit einer Sequenz, die ähnlich der Sequenz des natürlichen ADH&sub2;-Promotors ist (5'-flankierender Bereich des ADH&sub2;-Gens, beschrieben von Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682), der in dieser Anmeldung als ein ADH&sub2;-Promotor bezeichnet wird.
  • Die Erfindung betrifft einen neuen künstlichen Promotor zur Expression von Proteinen in Hefe; er ist dadurch gekennzeichnet, daß er enthält:
  • - eine Teilsequenz stromaufwärts der TATA-Box der Promotorsequenz des GAL7-Gens von saccharomyces cerevisiae, die die Stromaufwärts-Aktivierungs-Sequenzen UASL und UAS2 enthält,
  • - eine Teilsequenz der Sequenz eines ADH&sub2;-Promotors, die die TATA-Box und die Initiationsregion der Transkription enthält.
  • Vorzugsweise ist die Teilsequenz stromaufwärts der TATA-Box des Promotors des GAL7-Gens von Saccharomyces cerevisiae die folgende Sequenz oder eine Teilsequenz dieser Sequenz
  • Besonders geeignet ist die Teilsequenz der Sequenz eines ADH&sub2;-Promotors mit TATA-Box und Transkriptionsinitiationsbereich, die die folgende Sequenz oder eine Teilsequenz dieser Sequenz darstellt:
  • Ein besonders interessanter Promotor ist der Promotor, der die folgende Sequenz enthält:
  • Der erfindungsgemäße Promotor kann nach herkömmlichen DNA- Rekombinationstechniken hergestellt werden, die dem Fachmann geläufig sind.
  • Der erfindungsgemäße Promotor weist im Vergleich zu den bekannten Promotoren, insbesondere im Vergleich zum ADH&sub2;- Promotor und dem Promotor des GAL7-Gens, große Vorteile auf.
  • Er ermöglicht ein maximales Transkriptionsniveau und demnach eine hohe Expression, insbesondere von Uratoxidase von A. flavus, und bietet die Möglichkeit, dieses Transkriptionsniveau auf drei Niveaus zu regulieren:
  • - Null-Niveau in Gegenwart von Glucose und bei Abwesenheit von Galactose: es wird keine Expression festgestellt; dieses Ergebnis ist identisch mit dem für den Promotor des GAL7-Gens in einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae veröffentlichten Ergebnis, der unter diesen Bedingungen wächst (Tajima et al., 1986, Molecular cellular Biology, 6, 246-256). Der ADH&sub2;-Promotor zeigt ein geringes, aber nachweisbares Expressionsniveau unter diesen Bedingungen.
  • - Grundniveau bei Abwesenheit von Glucose und Galactose: es gibt eine geringe Expression, wobei es sich hierbei um ein mittleres Ergebnis zwischen dem für den ADH&sub2;-Promotor beobachteten Ergebnis (maximales Niveau) und dem für den Promotor des GAL7-Gens veröffentlichten Ergebnis (Null- Niveau: Tajima et al., 1986, Molecular cellular Biology, 6, 246-256) handelt.
  • - Maximales Expressionsniveau bei Abwesenheit von Glucose und in Gegenwart von Galactose.
  • Das Interesse daran, für die Expression von heterologen Proteinen in Hefe einen Promotor zur Verfügung zu haben, der unter bestimmten Bedingungen ein Nullniveau aufweist, hängt mit der Möglichkeit zusammen, jeglichen Selektionsdruck zu vermeiden, der die am wenigsten produktiven Zellen während der Propagierung des Stamms bevorteilen wurde. Dies ist dann besonders wichtig, wenn das Protein für die Wirtszelle toxisch ist.
  • Der Vorteil eines Promotors mit zwei Expressionsniveaus, einem Grundniveau (nicht induziert) und einem maximalen Niveau (induziert), besteht in der Möglichkeit, ein Zwischenniveau zu wählen, indem man verschiedene Konzentrationen des Induktors ausprobiert.
  • Die Erfindung bezieht sich ferner auf einen Expressionsvektor für Hefe, der ein interessierendes Gen trägt sowie Mittel aufweist, die für seine Expression, seine Replikation und die Selektion transformierter Zellen erforderlich sind; er ist dadurch gekennzeichnet, daß das interessierende Gen unter der Kontrolle des zuvor definierten Promotors steht.
  • Dieses interessierende Gen kann ein endogenes Gen der Hefe oder ein eukaryotisches oder prokaryotisches exogenes Gen sein. Als eukaryotische exogene Gene sind insbesondere ein rekombinantes Gen, das die Uratoxidase von Aspergillus flavus codiert, ein rekombinantes Gen, das ein menschliches Cytokin codiert sowie ein rekombinantes Gen geeignet, das Hirudin codiert.
  • Wenn das durch das exogene Gen codierte Protein in natürlicher Weise sezerniert wird, geht der dieses Protein codierenden Sequenz vorzugsweise eine Signalsequenz voraus. Diese Signalsequenz, die in Abhängigkeit von der Wirtszelle ausgewählt wird, hat die Aufgabe, den Transport des rekombinanten Proteins aus dem Cytoplasma heraus zu ermöglichen, was dem rekombinanten Protein die Möglichkeit gibt, eine Konformation einzunehmen, die der Konformation des natürlichen Proteins ähnelt und was seine Reinigung erheblich vereinfacht. Diese Signalsequenz kann abgespalten werden, entweder in einem einzigen Schritt durch eine Signalpeptidase, wodurch das reife Protein freigesetzt wird, wobei die abgetrennte Sequenz üblicherweise als Präsequenz- oder Signalpeptid bezeichnet wird, oder in mehreren Schritten, wenn diese Signalsequenz zusätzlich zu der durch die Signalpeptidase entfernten Sequenz, die als Präsequenz bezeichnet wird, eine Sequenz enthält, die als Prosequenz bezeichnet wird, die nach der Präsequenz während eines oder mehreren proteolytischen Schritten entfernt wird.
  • Die Erfindung betrifft ferner die Hefestämme, insbesondere von Saccaromyces cerevisiae, die mit dem obigen Expressionsvektor transformiert sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung von interessierenden Proteinen, das die Kultivierung dieser Stämme in Gegenwart von Galactose umfaßt.
  • Sie betrifft insbesondere die durch den obengenannten Expressionsvektor transformierten Saccharomyces-cerevisiae- Stämme, die in der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) - Institut Pasteur - 28, rue du Docteur Roux, Paris - Frankreich, hinterlegt worden sind:
  • - Hinterlegungsnummer I - 919, 28. Dezember 1989
  • - Hinterlegungsnummer I - 1021, 27. Dezember 1990
  • - Hinterlegungsnummer I - 1022, 27. Dezember 1990
  • - Hinterlegungsnummer I - 1023, 27. Dezember 1990.
  • Die Erfindung kann mit Hilfe der folgenden Beispiele einfacher verstanden werden:
  • Ein Großteil aller im folgenden verwendeten und dem Fachmann geläufigen Techniken wird ausführlich in dem Buch von Maniatis et al. "Molecular cloning: a Laboratory manual"; Cold Spring Harbor Press, New York, 1989 (2. Ausgabe), dargestellt.
  • Die Synthese der Oligonucleotide wird mit einer DNA-Synthesevorrichtung Biosearch 4600 durchgeführt.
    • Beispiel 1: Bestimmung der cDNA-Sequenz der Uratoxidase von A. flavus 1) Isolierung der Messenger-RNA von Aspergillus flavus
  • Der A.-flavus-Stamm, der Uratoxidase produziert, wurde unter den Produktionsbedingungen von Uratoxidase kultiviert, d.h. in einem Harnsäure enthaltendem Medium der folgenden Zusammensetzung: Glucose 15 g/l, MgSO4 7H&sub2;O 1 g/l, KH&sub2;PO&sub4; 0,75 g/l, CaCO&sub3; 1,2 g/l, Harnsäure 1,2 g/l, KOH 0,5 g/l, Sojaöl 0,66 ml/l, FeSO&sub4; 7H&sub2;O 10 mg/l, CuSO&sub4; 5H&sub2;O 1 mg/l, ZnSO&sub4; 7H&sub2;O 3 mg/l, MnSO&sub4; H&sub2;O 1 mg/l. Der pH-Wert des Mediums wird mit 1 M H&sub2;SO&sub4; auf 7 eingestellt, wonach das Medium 80 min bei 120 ºC sterilisiert wird.
  • In einem 5-l-Erlenmeyer-Kolben werden 1,5 l Medium mit etwa 1 bis 3 10&sup7; Sporen beimpft.
  • Die Kultur wird etwa 40 h bei 30 ºC unter Rühren (Drehzahl 120 min&supmin;¹) inkubiert. Das Mycel wird durch Filtration über Gaze gewonnen, mit Wasser gewaschen und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
  • 15 g Mycel (Feuchtgewicht) werden auf getaut und in 45 ml zur Lyse verwendetem Puffer suspendiert und anschließend in einem gleich großen Volumen von Kugeln (0,45 um Durchmesser) wieder aufgenommen. Der zur Lyse verwendete Puffer besteht aus Guanidiniumthiocyanat 4 M, Tris/HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 10 mM, β-Mercaptoethanol 50 ml/l. Die Mycel- Suspension wird 5 min mit einem Kugel-Vibromischer (Fa. Zellmühler) zerkleinert.
  • Das zerkleinerte Gut wird gewonnen, und die Kugeln werden dekantiert. Der Überstand wird entnommen (etwa 45 ml), auf eine Endkonzentration an Lithiumchlorid von 3 M gebracht und bei 0 ºC gelagert.
  • Nach 2 Tagen wird 60 min bei einer Drehzahl von 10000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Rückstand in 40 ml 3 M LiCl aufgenommen und erneut 1 h 30 min bei 10000 min&supmin;¹ zentrifugiert.
  • Es werden Proteinase K (Sigma) 40 ug/ml, Natriumdodecylsulfat (SDS) (0,1 % G/V) und EDTA bis zum Erhalt einer 20 mM-Lösung zugegeben. Es wird 3 h bei 37 ºC inkubiert. Mit 2 Volumina Ethanol wird gefällt, wonach mit 70%igem Ethanol gewaschen wird. Der Rückstand wird in 0,5 ml TE- Puffer (Tris/HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) aufgenommen, wonach zweimal mit Chloroform extrahiert und anschließend mit Ethanol ausgefällt wird. Die RNA wird bei -80 ºC in Alkohol aufbewahrt.
    • 2) Reinigung der Poly(A)&spplus;-Fraktion der RNAs
  • Etwa 1 mg RNA wird 20 min bei 4 ºC absetzengelassen (15000 min&supmin;¹), anschließend mit 70%igem Ethanol gewaschen und schließlich getrocknet. Der Rückstand wird in 1 ml TE- Puffer aufgenommen und mit einem Vortex-Mischer erneut suspendiert. Die Oligo(dt)-Cellulose Typ 3 (kommerziell von Collaborative Research Inc., Biomedicals Product Division, erhältlich) wird nach den Empfehlungen des Herstellers vorbereitet. Die RNA wird an Oligo-dT gebunden, leicht gerührt, um die Kugeln erneut in Suspension zu bringen und anschließend 1 h bei 65 ºC gehalten.
  • Die Suspension wird auf 0,5 M NaCl eingestellt und anschließend 10 min leicht gerührt. Die Suspension wird dann 1 min bei 1000 min&supmin;¹ zentrifugiert, wonach der Überstand entfernt und der Rückstand zweimal mit 1 ml TE-Puffer, der 0,5 M NaCl enthält, gewaschen wird. Die Überstände werden entfernt. Die Elution der polyadenylierten Fraktion der RNA (die aus Messenger-RNAs besteht) gelingt durch Suspension der Kugeln in 1 ml TE-Puffer, anschließendes Erwärmen dieser Suspension während 1 min auf 60 ºC und 10 min Rühren auf einer Schüttelplatte. Anschließend wird 1 min bei 1000 min&supmin;¹ zentrifugiert, was einerseits die Gewinnung des Überstands, der freie mRNAs in gelöster Form enthält, und andererseits die Gewinnung des Rückstands aus Cellulosekugeln ermöglicht. Alle obengenannten Arbeitsgänge (ab der Elution) werden wiederholt. Die so erhaltenen Überstände werden vereinigt, die überschüssigen Kugeln werden durch Zentrifugieren entfernt, und der Überstand wird mit Ethanol, das NaCl enthält, nach herkömmlichen Techniken gefällt. (Maniatis: obengenanntes Werk).
    • 3) Zusammensetzung der Genbank der cDNAs
  • Aus Messenger-RNAs, die wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben isoliert wurden, wurde eine cDNA-Bank in dem Vektor pTZ19R (im Handel von Pharmacia erhältlich) hergestellt. Bei diesem Vektor handelt es sich um ein Plasmid, das einen Polylinker umfaßt, der nur einmal vorhandene Restriktionsstellen enthält.
  • Es wurde die Klonierungstechnik verwendet, die von Caput et al. beschrieben wurde (Primer-Adapter-Technik): (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) (1986) 83, 1670-1674).
  • Sie besteht einerseits darin, den Vektor mit PstI zu spalten, einen Poly(dC)-Schwanz an das 3'-überhängende Ende anzufügen und anschließend die so erhaltenen Plasmide mit BamHI zu spalten. Das dem Vektor entsprechende Fragment wird auf Sepharose-CL4B-Säule gereinigt (Pharmacia). Es enthält demnach einen Poly(dC)-Schwanz am einen Ende, wobei das andere Ende kohäsiv und vom BamHI-Typ ist. Ferner werden die Messenger-RNAs der inversen Transkription ab einem Primer unterzogen, der die Sequenz 5'> GATCCGGGCCCT(12))> 3 aufweist. So weisen die cDNAs an ihrem 5'-Ende die GATCC- Sequenz auf, die komplementär zum kohäsiven BamHI-Ende ist.
  • Die durch Einwirkung der inversen Transkriptase erhaltenen RNA-DNA-Hybride werden einer alkalischen Hydrolyse unterzogen, wodurch man die RNA entfernen kann. Die einzelsträngigen cDNAs werden anschließend in zwei Durchläufen an Sepharose-CL4B-Säule gereinigt und einer Behandlung mit terminaler Transferase unterzogen, um Poly(dG)-Schwänze am 3'-Ende anzufügen. Die cDNAs werden in einzelsträngiger Form in den Vektor eingefügt, der wie weiter oben beschrieben hergestellt wurde. Ein zweites als "Adapter" bezeichnetes Oligonucleotid, das zum Primer komplementär ist, ist erforderlich, um eine "offene" BamHI-Stelle am 5'-Ende der cDNAs zu erzeugen. Nach der Hybridisierung des Vektors, der cDNA und des "Adapters" werden die rekombinanten Moleküle durch Einwirkung der Ligase des Phagen T4 cyclisiert. Die Einzelstrangbereiche werden dann mit Hilfe der DNA-Polymerase des Phagen T4 repariert.
  • Der so erhaltene Plasmid-Pool dient zur Transformation des Stamms MC 1061 zur Erzielung der Ampicillin-Resistenz (Casabadan Chou und Cohen J. Bact. (1980) 143, S. 9971- 980)
    • 4) Bestimmung der Teilsequenz der Uratoxidase
  • Eine Zubereitung der Uratoxidase von A. flavus (Sigma) wurde erneut durch Chromatographie an einer Red-Agarose- 120-Säule (Sigma) gereinigt, worauf die Filtration durch ein Acrylamid-Agarose-Gel Ultrogel Aca 44 (IBF) folgte.
  • Um Informationen über die Aminosäure-Sequenz der gereinigten Uratoxidase zu erhalten, die die Synthese der für die Klonierung der cDNA erforderlichen Sonden ermöglichen, wurde eine direkte aminoterminale Sequenzierung des Proteins versucht. Dies gelang nicht, was wahrscheinlich auf eine aminoterminale Blockierung des Proteins zurückzuführen ist.
  • Deshalb wurde die folgende Strategie zur Bestimmung der Teilsequenz der Uratoxidase entwickelt:
  • - Zerschneiden des Proteins mit proteolytischen Enzymen (mit Hilfe der Enzyme Trypsin und V8-Protease von Staphylococcus aureus)
  • - Abtrennen der erhaltenen Polypeptide durch Umkehrphasen- HPLC (RP-HPLC)
  • - Sequenzieren der gereinigten Peptide.
    • 1) Hydrolyse der Uratoxidase mit Trypsin, Reinigung und Sequenzierung der Peptide:
  • Uratoxidase (9 mg/ml) in einem 100-mM-Ammoniumcarbonat-Puffer von pH 8,9 wurde mit Trypsin (Worthington, TPCK) in einem gewichtsbezogenen Mengenverhältnis Uratoxidase/Trypsin von 30/1 24 h bei 30 ºC gespalten. Nach der tryptischen Spaltung wurden 60 ug gespaltene Uratoxidase unmittelbar in eine RP-HPLC-Säule aus gepfropftem Siliciumdioxid Brownlee G18 eingespritzt (Säule 10 x 0,2 cm), die mit 1 Vol-% Acetonitril und 0,1 Vol-% Trifluoressigsäure in Wasser äquilibriert wurde. Die Peptide wurden anschließend mit einem linearen Acetonitril-Gradienten in einer wäßrigen Trifluoressigsäurelösung (0,1 Vol-%), der während 60 min von 1 bis 60 % variierte, mit einem Durchsatz von 150 ul/min eluiert. Die Peptide am Auslaß der Säule wurden durch Messung der optischen Dichte bei 218 nm nachgewiesen.
  • Das Elutionsprofil wird in Fig. 1 gezeigt, in der die dem Buchstaben T (Trypsin) folgenden Zahlen den identifizierten Peaks entsprechen.
  • Jeder Peak wurde gesammelt und bei -20 ºC bis zum Zeitpunkt der Analyse in einem Proteinsequenzierer (Modell 470 A von Applied Biosystems) aufbewahrt, der mit einem chromatographischen System (Modell 430 A von Applied Biosystems) ausgestattet war, das kontinuierlich nach jedem Spaltungs- Zyklus die gebildeten Phenylthiohydantoinderivate analysiert.
  • Die folgende Tabelle (1) zeigt die Peptidsequenzen der neun identifizierten Peaks.
    • 2) Hydrolyse der Uratoxidase mit V8-Protease, Reinigung und Sequenzierung der Peptide:
  • Uratoxidase in einer Konzentration von 2 mg/ml in 100-mM- Ammoniumacetat-Puffer von pH 6,8 wurde mit V8-Protease von Staphylococcus aureus (Boehringer-Mannheim) in einem Verhältnis Uratoxidase/V8-Protease von 60/1 72 h bei 30 ºC gespalten. 160 ug gespaltene Uratoxidase wurden anschließend in eine Umkehrphasen-HPLC-Säule aus gepfropftem Siliciumdioxid Brownlee G18 (Säule 10 x 0,2 cm) injiziert, deren Partikeln (7 x 0,03 um) in 1 % Acetonitril in wäßriger 0,1 Vol-% Trifluoressigsäure äquilibriert wurden. Die Peptide wurden anschließend mit einem linearen Acetonitril- Gradienten in einer wäßrigen Trifluoressigsäurelösung (0,1 Vol-%), der während 60 min von 1 bis 60 % variierte, mit einem Durchsatz von 150 ul/ml eluiert. Die Peptide am Auslaß der Säule wurden durch Messung der optischen Dichte bei 218 nm nachgewiesen.
  • Das Elutionsprofil wird in Fig. 2 gezeigt, in der die dem Buchstaben V (V8-Protease) folgenden Zahlen den identifizierten Peaks entsprechen.
  • Jeder Peak wurde gesammelt und bis zur Durchführung der Analyse in dem bereits erwähnten Proteinsequenzierer bei -20 ºC aufbewahrt. Die folgende Tabelle 1 zeigt die Peptidsequenz der fünf identifizierten Peaks: Tabelle 1 Sequenzierung der durch Hydrolyse erhaltenen Produkte mit Trypsin mit V8-Protease
    • 5) Screening der Bakterien 1) Herstellung markierter Sonden:
  • Zwei Sonden-Pools, die von Aminosäuresequenzen des Proteins abgeleitet sind, wurden mit einer DNA-Synthesevorrichtung Biosearch 4600 synthetisiert. Der erste Pool entspricht der Sequenz der Reste His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp (Teil der Sequenz von T 27), d.h. der Sequenz vom 5'- zum 3'-Ende:
  • Dieser Pool besteht aus 2&sup4; x 3 = 48 verschiedenen Oligonucleotiden, die alle möglichen Kombinationen darstellen.
  • Der zweite Pool entspricht der Sequenz der Aminosäurereste Gln-Phe-Trp-Gly-Phe-Leu (Teil der Sequenz von V5), vom 5mi - zum 3'-Ende hin:
  • Dieser Pool besteht aus 2&sup4; x 4 = 64 Kombinationen.
  • Die Sonden werden mit Hilfe der terminalen Desoxynucleotidyltransferase (TdT) markiert (im Handel von IBI, Inc.).
  • Die Umsetzung wird mit 100 ng eines Gemischs von Oligonucleotiden in Lösung (100 mg/ml) in einem zur Umsetzung verwendeten Puffer "Cobalt" durchgeführt (in zehnfacher Konzentration von IBI Inc. geliefert: 1,4 M Kaliumcocodylat-pH 7,2, 300 mM Dithiothreitol, 1 ul des Enzyms terminale Desoxynucleotidyltransferase (IBI Inc.) und 50 uCi Desoxycytidyltriphosphat dCTP, das mit ³²P markiert ist.
  • Die Umsetzung läuft während 10 min bei 37 ºC ab und wird dann durch Zusatz von 1 ul 0,5 M EDTA abgebrochen.
  • Es wird mit Phenol extrahiert und auf Polyacrylamid-Säule Biogel-P-10 (Biorad: 150-1050) dialysiert.
    • 2) Hybridisierung und Nachweis der Kolonien, die die cDNA von Uratoxidase enthalten:
  • Etwa 40000 Kolonien werden gemäß der In-situ-Hybridisierungstechnik, die von Grunstein und Hogness entwickelt wurde (1975, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 72 3961), einem Screening unterzogen. Etwa 6000 Bakterien werden auf Petrischalen verteilt, um isolierte Kolonien zu erhalten. Nach 24stündiger Inkubation bei 37 ºC wird jede Schale auf zwei Filter aufgedrückt, von denen das eine Filter zur Behandlung mit dem einen Sondenpool und das andere Filter zur Behandlung mit dem anderen Sondenpool vorgesehen ist, so daß alle erhaltenen Kolonien parallel mit beiden Sondenpools getestet werden.
  • Die Filter werden mit je einem der beiden Sondenpools in einem Puffer hybridisiert, der 6xSSC, 10x-Denhardt-Lösung und 100 ug/ml mit Ultraschall behandelte und denaturierte Lachsspermien-DNA (Sigma) enthält. Die Hybridisierungstemperatur beträgt 42 ºC, die Hybridisierung dauert 16 h. Die 6xSSC-Lösung wird durch Verdünnung einer 20xSSC-Lösung erhalten. Die Zubereitung des 20xSSC-Puffers ist in Maniatis, Fritsch und Sambrook (oben zitiertes Werk) beschrieben. Zusammenfassend enthält dieser Puffer 175,3 g/l NaCl, 88,2 g/l Natriumcitrat; er wird durch einige Tropfen 10N-NaOH auf pH 7 eingestellt. Die 10x-Denhardt-Lösung enthält 1 g Ficoll, 1 g Polyvinylpyrrolidon, 1 g menschliches Serumalbumin in 500 ml Endvolumen.
  • Nach Waschen in der 6xSSC-Lösung bei 42 ºC (3 h mit 5maligem Badwechsel) werden die Filter mit Joseph-Papier getrocknet und autoradiographisch untersucht. Die Filter werden nach 16 h entwickelt. Es wurde dann festgestellt, daß ein Anteil von etwa 0,5 % der Kolonien mit den beiden Sondenpools hybridisiert hatte.
  • Von diesem Anteil wurden fünf Kolonien zur Weiterverwendung aufgenommen und gereinigt. Von jeder dieser Kolonien wurde die plasmidische DNA präpariert, woraufhin diese DNA durch Spaltung entweder mit BamHI oder HindIII oder gleichzeitig mit BamHI und HindIII analysiert wurde.
  • Nach der Analyse auf Agarosegel zeigte sich, daß die fünf hergestellten Plasmide durch BamHI und HindIII linearisiert werden. Die doppelte Spaltung ermöglicht die Freisetzung eines Fragments, das der vollständigen klonierten cDNA entspricht. Die Größe dieses Fragments beträgt bei drei Plasmiden etwa 1,2 kb und bei den beiden anderen Plasmiden etwa 0,9 kb. Für die nachfolgende Bestimmung wurden eines der Fragmente von 0,9 kb und eines der Fragmente von 1,2 kb ausgewählt, die erneut kloniert wurden (siehe folgenden Punkt 6) ).
    • 6) Bestimmung der cDNA-Sequenz von Uratoxidase
  • Es wurden einerseits eines der 0,9-kb-Fraginente (Klon 9A) und andererseits eines der 1,2-kb-Fragmente (Klon 9C) in die DNA der replizierenden Form des einzelsträngigen Phagens M13 kloniert. Die DNA der M13-Klone, die einerseits das 0,9-kb-Fragment und andererseits das 1,2-kb-Fragment enthalten, wurde zur Erzeugung einer Reihe von überlappenden M13-Klonen einer Spaltung mit Exonuclease unterzogen (Verfahren "Cyclone I Biosystem" von IBI). Diese Klone wurden nach der Didesoxyribonucleotid-Methode sequenziert (Sanger et al., PNAS-U.S.A.-1977, 14, 5463-5467).
  • Die Nucleotidsequenz des Klons 9C ist in Fig. 3 dargestellt, die ferner mit einem Pfeil den Beginn des Klons 9A und mit einem Nucleotidsymbol, das mit einem Sternchen * versehen ist, die Nucleotidsequenzen des Klons 9A anzeigt, die nicht mit den Nucleotidsequenzen von Klon 9C identisch sind (wenn man die beiden Sequenzen und die Restriktionsstellen AccI und BamHI zur Übereinstimmung bringt, die bei den späteren Konstruktionen verwendet werden (vgl. 2) ).
  • Folgendes wird festgestellt:
  • - Die Nucleotidsequenz des längeren Fragments (Klon 9C) entspricht der Sequenz des kürzeren Fragments (Klon 9A) bis auf zwei Unterschiede (siehe Fig. 3). Einer der Unterschiede ist stumm, während der andere den Austausch eines Tryptophanrests durch einen Glycinrest bewirkt. Diese Unterschiede können entweder von Unterschieden in den isolierten Messenger-RNAs (vgl. 2) ) weiter oben oder von Fehlern der beim Aufbau der cDNA-Bank verwendeten inversen Transkriptase (vgl. 3) ) weiter oben herrühren.
  • Im Falle des längeren Fragments eröffnet ein ATG-Codon (in Position 109 in Fig. 3) eine offene Phase, die einem Polypeptid mit 302 Aminosäuren mit einer Molmasse von etwa 34240 Da entspricht, dessen Sequenz der Teilsequenz der gereinigten Uratoxidase von A. flavus (siehe 4) ) entspricht.
  • In Fig. 4 sind die DNA-Sequenz, die mit dem ATG-Codon beginnt, und das codierte Polypeptid sowie durch die Pfeile gegenüber dem codierten Polypeptid die Peptidsequenzen gezeigt (vgl. 4) ), die durch Hydrolyse der Uratoxidase von A. flavus mit Hilfe von Trypsin und V8-Protease erhalten werden.
  • Man stellt fest, daß die Sequenz des Polypeptids durch das Triplett Ser-Lys-Leu beendet wird, das typisch ist für in Peroxisomen vorkommende Enzyme (Gould S.J. et al., J. Cell. Biology 108 (1989) 1657-1664).
    • Beispiel 2: Konstruktion von drei Expressionsvektoren der cDNA von Uratoxidase in Kefe, Plasmid pEMR469, Träger des ADH&sub2;-Promotors und Plasmid pEMR473 sowie Plasmid pEMR515, Träger des erfindungsgemäßen künstlichen Promotors
  • Bei der angewendeten Strategie werden Fragmente, die aus bereits existierenden und der Öffentlichkeit zugänglichen Plasmiden hergestellt wurden, und Fragmente eingesetzt, die nach den Techniken synthetisch hergestellt wurden, die jetzt üblicherweise angewendet werden. Die eingesetzten Klonierungstechniken sind die von T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in "Molecular Cloning, a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) beschriebenen Techniken. Die Synthese der Oligonucleotide erfolgte mit einer DNA-Synthesevorrichtung Biosearch 4600.
  • Die folgende Beschreibung ist einfacher verständlich bei Betrachtung der Fig. 5, 6 und 7, die Restriktionskarten der Plasmide pEMR414, pEMR469 und pEMR473 enthalten. Die in den Figuren verwendeten Symbole werden in der folgenden Darstellung präzisiert. In den Fällen, in denen eine Stelle durch die Klenow-Polymerase aufgefüllt wurde, wird ihr der Index "o" zugeordnet; wenn die Stellen durch Ligation beseitigt wurden, werden sie in Klammern angegeben.
  • 1) Konstruktion des Plasmids pEMR469:
  • Dieses Plasmid wurde aus dem Hefe-E.-coli-Pendelvektor pEMR414 konstruiert, konstruiert durch aufeinanderfolgende Ligationen der folgenden Bestandteile:
  • - Das Fragment PstI-HindIIIo - symbolisiert durch in Fig. 5 - des Plasmids pJDB207 (Beggs, 1978, Gene cloning in yeast - S. 175-203 in: Genetic Engineering Band 2 - Williamson - Academic Press - London UK), das den Stromaufwärtsteil des Ampicillin-Resistenzgens AmpR von pBR322 (Sutcliffe 1979 Cold Spring Symp. Quart. Biol. 43, 779) und ein endogenes 2u-Fragment der B-Form umfaßt, das das LEU2- Gen von S. cerevisiae, von dem ein Teil des Promotors deletiert ist (als LEU2d bezeichnet), den STB-Locus (Rep3) und den Replikationsursprung von 2u (Hartley und Donelson, 1980, Nature, 286, 860-865) enthält. Das HindIII-Ende dieses Fragments wurde durch Einwirkung der Klenow-Polymerase aufgefüllt. Es wird in Fig. 5 als HindIIIo bezeichnet.
  • - Das Fragment HindIII-SmaI - in Fig. 5 durch wiedergegeben - des Chromosoms V der Hefe, das das URA3-Gen mit seinem Promotor (Rose et al., 1984, Gene, 29, S. 113-124) enthält. Dieses HindIII-SmaI-Fragment stammt vom Plasmid pFL1 (Chevallier et al., 1980, Gene 11, 11-19). Das HindIII-Ende dieses Plasmids wurde durch Einwirkung der Klenow-Polymerase aufgefüllt.
  • - Ein Fragment SamI-BamHI - in Fig. 5 durch symbolisiert - das einen synthetisch hergestellten Promotor des ADH&sub2;-Gens enthält, der sich von dem von Russel und Smith (Russel et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 2674-2682) beschriebenen natürlich vorkommenden Promotor nur durch einige Basenpaare unterscheidet, die zur Einführung von Restriktionsstellen bestimmt sind. (Die natürlich vorkommende Sequenz könnte mit wenig verschiedenen Ergebnissen verwendet werden). Die Sequenz dieses Fragments wird im folgenden angegeben:
  • - Das Fragment BglII-HindIII - in Fig. 5 durch symbolisiert - das das 3'-Ende des PGK-Gens der Hefe aufweist. Dieses Fragment stammt von der mit Hilfe von BglII durchgeführten vollständigen Spaltung des HindIII- Fragments der Chromosomen-DNA der Hefe, das das PGK-Gen enthält, das von Hitzemann et al. (1982 Nucleic Acids Res., 10, 7791-7808) beschrieben wurde, welches nur eine BglII- Stelle aufweist. Durch diese Spaltung können zwei Fragmente HindIII-BglII erhalten werden, von denen das kleinere Fragment von etwa 0,4 kb, das das 3'-Ende des PGK-Gens der Hefe trägt, behalten wird. Die Sequenz dieses letzteren Fragments ist von Hitzemann et al. (siehe obiges Literaturzitat) beschrieben. Die BglII-Stelle wird in die BamHI- Stelle des vorhergehenden Fragments (die BamHI- und BglII- Stellen verschwinden demnach) kloniert und die HindIII- Stelle, die durch Einwirkung der Klenow-Polymerase aufgefüllt wurde, wird in die PvuII-Stelle des Fragments von PvuII-PstI von pBR322 kloniert, die im folgenden beschrieben wird.
  • - Das Fragment PvuII-PstI- in Fig. 5 mit symbolisiert - von pBR322, das den Replikationsursprung und den Stromabwärtsteil des Anipicillin-Resistenzgens AmpR enthält.
  • Das so konstruierte Plasmid pEMR414 umfaßt demnach die folgenden Bestandteile:
  • - Einen Replikationsursprung und ein Ampicillin-Resistenzgen AmpR, die die Replikation und die Selektion des Plasmids in E.-coli-Zellen ermöglichen. Diese Bestandteile ermöglichen die Transformation in E.-coli-Zellen.
  • - Einen Replikationsursprung für Hefe (ARS), den STB-Locus und das LEU2-Gen von S. cerevisiae ohne Promotor und das URA3-Gen von S. cerevisiae mit seinem Promotor. Diese Bestandteile ermöglichen die Replikation und die Selektion des Plasmids in den Zellen von S. cerevisiae sowie ein ausreichendes Teilungsvermögen in den Zellen, die das endogene 2u-Plasmid enthalten.
  • Das Plasmid pEMR414 wurde einer vollständigen Spaltung mit den Restriktionsenzymen NheI und ClaI unterzogen. Das kleine Fragment NheI-ClaI, das das URA3-Gen enthält und das im folgenden als Fragment A bezeichnet wird, wurde gereinigt.
  • Das Plasmid pEMR414 wurde einer vollständigen Spaltung mit den Enzymen NheI und BamHI unterzogen. Das große Fragment NheI-BamHI, das insbesondere das LEU2D-Gen und den Replikationsursprung des Plasmids pBR322 enthält und das im folgenden als Fragment B bezeichnet wird, wurde gereinigt.
  • Ferner wurde das synthetische Fragment ClaI-AccI hergestellt, das den Anfang eines Gens enthält, das das Protein codiert, das sich von der cDNA-Sequenz der Uratoxidase (Klon 9C) ableitet. Dieses Fragment weist im Vergleich zu dem Klon 9C Abänderungen auf, die mit dem Ziel eingebracht wurden, in die Hefe gebräuchliche Codons (vgl. Sharp et al., 1986, Nucl. Ac. Res. Vol. 14, 13, S. 5125-5143) ohne Änderung der codierten Aminosäuren einzusetzen. Die Sequenz dieses Fragments, das im folgenden als Fragment c bezeichnet wird, sieht folgendermaßen aus (die unterstrichenen Nucleotide sind die im Vergleich zu Klon 9C abgeänderten Nucleotide).
  • Das Plasmid des Klons 9C (vgl. Fig. 3) wurde einer Spaltung mit den Enzymen AccI und BamHI unterzogen. Das Fragment AccI-BamHI, das das Ende der cDNA der Uratoxidase enthält und das im folgenden als Fragment D bezeichnet wird, wurde gereinigt. Dieses Fragment hat die folgende Sequenz:
  • Die Fragmente A, B, C und D wurden so verknüpft&sub1; daß das in Fig. 6 dargestellte Plasmid pEMR469 erhalten wurde, in der die Symbole die gleiche Bedeutung wie in Fig. 5 haben, wobei die neuen Fragmente ClaI-AccI und AccI-BamHI durch symbolisiert sind.
  • Das Plasmid pEMR469 weist eine Sequenz auf, die das Protein codiert, das sich von der cDNA-Sequenz der Uratoxidase ableitet, unter der Kontrolle eines Promotors, der als ADH&sub2;- Promotor bezeichnet wird, der dem natürlich vorkommenden ADH&sub2;-Promotor ähnelt und die folgende Sequenz enthält: TATA-Box Initiationsbereich der Transkription
    • 2) Konstruktion des Plasmids pEMR473:
  • Das Plasmid pEMR469 wurde einer vollständigen Spaltung mit den Enzymen MluI und SphI unterzogen. Das große Fragment MluI-SphI, das das Gen der Uratoxidase enthält, wurde anschließend mit dem synthetischen Fragment mit der im folgenden angegebenen Sequenz verknüpft, die einem Teil (200 bp) der Sequenz stromaufwärts der TATA-Box des GAL7- Promotors von S. cerevisiae entspricht, die zwei Stromaufwärts-Aktivierungs-Sequenzen von hoher Affinität umfaßt, die als UAS1 und UAS2 bezeichnet werden und in der folgenden Abbildung umrahmt sind (vgl. R. J. Bram et al. (1986) Embo J. Vol. 5 Nr. 3, S. 603-608).
  • Das so erhaltene Plasmid pEMR473 ist in Fig. 7 dargestellt, in der die Symbole die gleiche Bedeutung wie in Fig. 6 haben, wobei das neu eingeführte Fragment MluI-SphI durch smybolisiert wird.
  • Das Plasmid pEMR473 weist demnach eine Sequenz auf, die das Protein codiert, das sich von der cDNA-Sequenz der Uratoxidase ableitet, unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen künstlichen Promotors, der die folgende Sequenz enthält: TATA-Box Initiationsbereich der Transkription
    • 3) Konstruktion des Plasmids pEMR515:
  • Das Plasmid pEMR473 wurde einer teilweisen Spaltung mit dem Enzym XbaI und einer vollständigen Spaltung mit dem Enzym MluI unterzogen. Das große Fragment XbaI-MluI wurde gereinigt. Dieses Fragment enthält insbesondere die Sequenzen des Replikationsursprungs und den STB-Locus von 2u, das LEU2D-Gen, das Ampicillin-Resistenzgen AmpR, den Replikationsursprung von pBR322 und die Expressionskassette der Uratoxidase. Es enthält dagegen weder das URA3-Gen noch den Bereich von 2u, der zwischen den Stellen XbaI und NheI enthalten ist.
  • Das große Fragment XbaI-MluI wurde mit dem folgenden Sequenz-Adaptor, der kohäsive Enden aus modifiziertem XbaI und MluI enthält, wieder cyclisiert: XbaI, modifiziert
  • Das so erhaltene Plasmid pEMR515 weist nur einen der drei Bestandteile der FRT-Stelle auf, an der die Rekombinase, die durch das FLP-Gen des Plasmids 2u codiert wird, angreift.
  • Das Plasmid pEMR515 weist demnach eine Sequenz auf, die das Protein codiert, das sich von der cDNA-Sequenz der Uratoxidase ableitet, unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen künstlichen Promotors.
    • Beispiel 3: Transformation des Hefestums EMY761 mit den Plasmiden pEMR469, pEMR473 und pEMR515 - Transformation der Hefestämme EMY500 und GRF18 mit dem Plasmid pEMR515 - Transformation mit Selektion für die Leucin- Prototrophie
  • Als Empfängerstämme wurden drei nicht isogene Saccharomyces-cerevisiae-Stämme verwendet:
  • - Stamm EMY761 (Matα, leu2, ura3, his3)
  • - Stamm EMY500 (Mata, leu2, ura3, pep4)
  • - Stamm GRF18 (Matα, leu2, his3).
  • Der Stamm GRF18 ist dem Fachmann wohl bekannt (Gerry Fink, MIT, USA). Die Stämme EMY761 und EMY500 sind mit dem Stamm GRF18 verwandt. Sie werden durch aufeinanderfolgendes Kreuzen des Stamms GRF18 mit einem ura3-Stamm, der vom Stamm FL100 (hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 28383) abstammt, und dem Stamm 20B12 (Matα, tsp1, pep4), der von E.W. Jones (E.W. Jones et al. (1977) Genetics, 85, 23) beschrieben wurde, erhalten.
  • Den Stamm GRF18 kann man durch Entfernen des Plasmids pEMR515 des Stamms GRF18 pEMR515 (Leu&spplus;) erhalten, der bei der CNCM unter der Hinterlegungsnummer I-920, 28. Dezember 1989, hinterlegt wurde, und den Stamm EMY500 kann man durch Entfernen des Plasmids pEMR515 des Stamms EMY500 pEMR515 (Leu&spplus;) erhalten, der bei der CNCM unter der Hinterlegungsnummer I-919, 28. Dezember 1989, hinterlegt wurde.
  • Diese Stämme enthalten Mutationen (leu2 und ura3), die durch den defekten selektierbaren Marker LEU2d und den selektierbaren Marker URA3 komplementiert werden können, die in beiden Plasmiden pEMR469 und pEMR473 vorhanden sind.
  • Die verwendete Transformationstechnik ist eine Abwandlung der von Beggs et al. (Beggs et al. (1978), Nature 275, 104- 109) beschriebenen Technik. Sie besteht darin, die Hefen einer Behandlung zur Bildung von Protoplasten in Gegenwart eines osmotischen Stabilisators, nämlich Sorbitol in einer Konzentration von 1 M, zu unterziehen.
  • Das genaue Protokoll der Transformation wird im folgenden ausführlicher angegeben:
  • a) 200 ml flüssiges YPG-Medium (vgl. Tabelle 1) werden mit etwa 5 10&sup6; Zellen einer Kultur beimpft, die sich in der stationären Phase befindet, und die so beimpfte Kultur wird eine Nacht bei 30 ºC gerührt.
  • b) Wenn die Kultur etwa 10&sup7; Zellen pro Milliliter erreicht, werden die Zellen 5 min bei 4000 min&supmin;¹ zentrifugiert, wonach der Rückstand mit 1 M Sorbitol gewaschen wird.
  • c) Die Zellen werden in 5 ml einer 1 M Sorbitol-Lösung suspendiert, die 25 mM EDTA und 50 mM Dithiothreitol enthält, und 10 min bei 30 ºC inkubiert.
  • d) Die Zellen werden einmal mit 10 ml 1 M Sorbitol gewaschen und in 20 ml Sorbitol suspendiert. Zymolase-100T (Zubereitung, die durch teilweise Reinigung des Überstands einer Arthobacter-luteus-Kultur an einer Affinitätssäule erhalten wird und die β-1,3-Glucan-Laminaripentahydrolase enthält, im Handel erhältlich von Seykagaku Kogyo Co. Ltd.) wird bis zu einer Endkonzentration von 20 ug/ml zugesetzt, wonach die Suspension etwa 15 min bei Umgebungstemperatur inkubiert wird.
  • e) Die Zellen werden wieder in 20 ml eines Mediums suspendiert, das Sorbitol enthält und als YPG-Sorbitol-Medium bezeichnet wird (vgl. folgende Tabelle I) und 20 min bei 30 ºC unter leichtem Rühren inkubiert.
  • f) Man zentrifugiert 3 min bei 2500 min&supmin;¹.
  • g) Die Zellen werden in 9 ml eines zur Transformation verwendeten Puffers (Sorbitol 1 M, Tris-HCl von pH 7,5 10 mM und CaCl&sub2; 10 mM) suspendiert.
  • h) Es werden 0,1 ml Zellen und 5 ul DNA-Lösung (etwa 5 ug) zugegeben, woraufhin die erhaltene Suspension 10 bis 15 min bei Umgebungstemperatur belassen wird.
  • i) 1 ml der folgenden Lösung werden zugesetzt: Polyethylenglykol PEG 4000 20 %, Tris-HCl von pH 7,5 10 mM und CaCl&sub2; 10 mM.
  • j) 0,1 ml der in i) hergestellten Suspension werden in ein Röhrchen eingefüllt, das festes Regenerationsmedium ohne Leucin (vgl. folgende Tabelle I) enthält, das zuvor geschmolzen und bei etwa 45 ºC flüssig gehalten wurde. Die Suspension wird auf eine Petrischale gegossen, die eine verfestigte Schicht aus 15 ml Regenerationsmedium ohne Leucin enthält.
  • k) Schritt j) wird mit dem Rest der in h) hergestellten Zellsuspension wiederholt.
  • Die Transformanten werden erstmals nach 3 Tagen sichtbar.
  • Es wurden so ein Transformant EMY761 pEMR469 (Leu&spplus;) und drei Transformanten EMY761 pEMR473 (Leu&spplus;) (Klone 1, 2 und 3), ein Transformant EMY761 pEMR515 (Leu&spplus;), ein Transformant EMY500 pEMR515 (Leu&spplus;) und ein Transformant GRF18 pEMR515 (Leu&spplus;) gewonnen. Tabelle I In den Beispielen 3, 4, 4bis, 6 und 7 verwendete Hauptmedien - Festes Medium ohne Uracil 6,7 g Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren (Yeast nitrogen base without Amino Acids von Difco) 5,0 g Caseinhydrolysat (Casamino acids von Difco) 10 g Glucose 20 g Agar Mischen aller Bestandteile in destilliertem Wasser, Auffüllen mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 l - 15minütige Behandlung im Autoklaven bei 120 ºC. - Flüssiges Medium ohne Uracil Verwendung der Zusammensetzung des festen Mediums ohne Uracil, wobei Agar weggelassen wird - 15minütige Behandlung im Autoklaven bei 120 ºC. - Festes Medium ohne Leucin 6,7 g Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren (Yeast nitrogen base without Amino Acids von Difco) 20 mg Adenin 20 mg Uracil 20 ing L-Tryptophan 20 mg L-Histidin 20 mg L-Arginin 20 mg L-Methionin 30 mg L-Tyrosin 30 mg L-Isoleucin 30 mg L-Lysin 50 mg L-Phenylalanin 100 mg L-Glutaminsäure 150 mg L-Valin 400 mg L-Leucin 20 g Glucose 20 g Agar Vermischen aller Bestandteile in destilliertem Wasser. Auffüllen mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 l - 15minütige Behandlung im Autoklaven bei 120 ºC. Nach der Behandlung im Autoklaven werden 200 mg L-Threonin und 100 mg Asparaginsäure zugesetzt. - Festes Regenerationsmedium ohne Leucin Verwendung der Zusammensetzung des festen Mediums ohne Leucin, wobei 30 g Agar anstelle von 20 g verrührt und 182 g Sorbitol zugesetzt werden. - Flüssiges Medium ohne Leucin Verwendung der Zusammensetzung des festen Mediums ohne Leucin, wobei Agar weggelassen wird - 15minütige Behandlung im Autoklaven bei 120 ºC. Nach der Behandlung im Autoklaven werden 200 mg L-Threonin und 100 mg Asparaginsäure zugesetzt. - Flüssiges YP-Medium 10 g Hefeextrakt (Bacto-yeast-Extrakt von Difco) 20 g Pepton (Bacto-Pepton von Difco) Vermischen der Bestandteile in destilliertem Wasser. Auffüllen mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 l - 15minütige Behandlung im Autoklaven bei 120 ºC. - Flüssiges YPG-Medium Verwendung der Zusammensetzung des flüssigen YP-Mediums, dem nach der Behandlung im Autoklaven Glucose bis zum Erhalt einer Konzentration von 20 g/l zugegeben wird. - YPG-Sorbitol-Medium Verwendung der Zusammensetzung des flüssigen YPG-Mediums, dem nach Behandlung im Autoklaven Sorbitol bis zum Erhalt einer Konzentration von 1 M zugesetzt wird. - YP-Ethanol-Glycerin-Medium Verwendung der Zusammensetzung des flüssigen YP-Mediums. Nach Behandlung im Autoklaven werden 10 ml 100%iges Ethanol (1 % in der fertigen Lösung) und 30 g Glycerin zugesetzt. - YP-Ethanol-Glycerin-Galactose-Medium Verwendung der Zusammensetzung des flüssigen YP-Mediums. Nach Behandlung im Autoklaven werden 10 ml 100%iges Ethanol, 30 g Glycerin und 30 g Galactose zugesetzt.
    • Beispiel 4: Expression der Uratoxidase durch die Stämme EMY761 pEMR469 (Leu&spplus;) und EMY761 pEMR473 (Leu&spplus;) (Klone 1, 2 und 3) - Immundetektion durch Western-Blotting, quantitative Bestimmung der Uratoxidase- Aktivität und der löslichen Proteine 1) Expression der Uratoxidase: a) Transformierte Stämme
  • Zunächst wurde je eine Kolonie der Stämme EMY761 pEMR469 (Leu&spplus;) und EMY761 pEMR473 (Leu&spplus;) (Klone 1, 2 und 3) in 25 ml flüssigem Medium ohne Leucin (vgl. Tabelle I, Beispiel 3) kultiviert. Hierdurch konnte eine hohe Zahl von Plasmidkopien hergestellt und beibehalten werden, indem die Selektion für die Komplementation der Mutation Leu2 durch das Gen LEU2, das die Plasmide pEMR469 und pEMR473 aufweist, angewendet wurde.
  • Nach 22 h Rühren bei 30 ºC wurden die beiden Kulturen 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die Rückstände wurden in 10 ml sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und erneut 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die Expression der Uratoxidase wurde durch Aufnehmen der Zellen in 20 ml YP-Ethanol-Glycerin-Medium für den Stamm EMY761 pEMR469 (Leu&spplus;) und in 20 ml YP-Ethanol-Glycerin-Galactose-Medium (vgl. Tabelle I, Beispiel 3) für dem Stamm EMY761 pEMR473 (Leu&spplus;) induziert. Anschließend wurden die Kulturen 27 h bei 30 ºC gerührt.
    • c) Vergleichsstamm
  • Der nicht transformierte Stamm EMY761, der das Plasmid nicht enthält, wurde wie oben kultiviert mit dem Unterschied, daß die erste Kultivierung in flüssigem YPG-Medium stattfand. Er wurde einerseits in 10 ml flüssigem YP-Ethanol-Glycerin-Medium und andererseits in 10 ml YP-Ethanol-Glycerin-Galactose-Medium induziert.
    • 2) Probenvorbereitung:
  • a) Die in 1a), 1b) und 1c) kultivierten Zellen wurden zentrifugiert, wonach der Überstand verworfen wurde. Die Rückstände wurden in 10 ml destilliertem Wasser aufgenommen und 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die so gewaschenen Rückstände wurden in etwa 1 ml Triethylenamin-TEA-Puffer von pH 8,9 aufgenommen. Etwa 300 ul der so aufgenommenen Zellen wurden in Gegenwart von Glaskügelchen (Durchmesser 400 bis 500 um) lysiert, was etwa der Hälfte des Endvolumens entsprach. Dieses Gemisch wurde viermal jeweils 1 min in einem Vortex-Mischer gerührt, wobei die Proben zwischen diesen Zerkleinerungsschritten 30 s in Eis gekühlt wurden. Die Flüssigkeit wurde mit Pasteurpipetten aus den Röhrchen entnommen und in Mikroröhrchen übertragen. Die Glaskugeln wurden einmal mit etwa 200 ul TEA-Puffer von pH 8,9 gewaschen. Die Kugeln wurden einmal 1 min in einem Vortex- Mischer gerührt, wonach die Flüssigkeit mit der Pasteurpipette entnommen und dem zuvor gewonnenen Lysat zugesetzt wurde. Das Lysat wurde anschließend 5 min bei 7000 min&supmin;¹ in einem Mikroröhrchen zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig entnommen und bei -20 ºC für den Western-Blot, die quantitative Bestimmung der Uratoxidase-Aktivität und die quantitative Bestimmung der gesamten löslichen Proteine aufbewahrt. Der Rückstand der lysierten Zellen wurde getrennt bei -20 ºC für das Western-Blotting aufbewahrt (vgl. 3) weiter unten).
  • Ferner wurden die Entnahmen der in 1a) und 1b) erzeugten Kulturen vor der Induktion wie folgt durchgeführt: 2 ml der Kultur wurden 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die Rückstände wurden in 500 ul destilliertem Wasser aufgenommen und erneut 5 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die Rückstände wurden in etwa 200 ul TEA-Puffer von pH 8,9 aufgenommen und wie oben in Gegenwart von Glaskügelchen lysiert. Die Überstände und die Rückstände der lysierten Zellen wurden getrennt bei -20 ºC aufbewahrt. Die quantitative Bestimmung der Oxidase-Aktivität und die quantitative Bestimmung der gesamten löslichen Proteine wurde mit den Überständen durchgeführt.
    • 3) Immundetektion der Uratoxidase durch Western-Blotting: a) Verfahrensweise
  • Die Rückstände und die Überstände der verschiedenen Proben wurden einem Western-Blot unterzogen, bei dem es sich um eine dem Fachmann geläufige Technik handelt, die die folgenden Schritte umfaßt:
  • - Solubilisierung des Rückstands durch 10minütiges Sieden in einem als Ladungspuffer bezeichneten Puffer, der zusammengesetzt ist aus Tris-HCl 0,125 M pH 6,8, SDS 4 %, Bromphenolblau 0,002 %, Glycerin 20 %, β-Mercaptoethanol 10 % (nach dem von Lämmli beschriebenen Protokoll, U.K. Lämmli, Nature, 227 (1970), 680-685)), (Schritt, der ausschließlich mit den Rückständen durchgeführt wird),
  • - elektrophoretische Trennung der verschiedenen in dem Solubilisat enthaltenen Proteine nach dem von Lämmli beschriebenen Protokoll (U.K. Lämmli, Nature, 227 (1970), 680-685),
  • - Übertragung dieser in dem Gel enthaltenen Proteine auf ein Nitrocellulose-Filter (nach der Technik von H. Towbin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4354).
  • . Die nach der Technik von Burnette (W.W. Burnette Ana. Biochem. 112 (1981) 195-203) durchgeführte Immundetektion umfaßt nacheinander die folgenden Schritte:
  • . Waschen des Nitrocellulose-Filters während 10 min mit einem Puffer A (Tris-HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KCl 1 mM).
  • . Inkontaktbringen des Nitrocellulosefilters während 30 min bei 37 ºC mit einem Puffer B (Puffer A, dem Rinderserumalbumin in einer Menge von 3 g pro 100 ml zugesetzt wurde).
  • . Inkontaktbringen des Nitrocellulosefilters während 1 h bei 37 ºC mit einem Immunserum (polyklonale Antikörper, die Uratoxidase von A. flavus erkennen).
  • . Waschen des Nitrocellulosefilters mit dem Puffer B.
  • . Inkontaktbringen des Nitrocellulosefilters während 1 h bei 37 ºC mit einer Protein-G-Lösung, die mit ¹²&sup5;I in einer Menge von 0,1 Microcurie/ml markiert ist.
  • . Waschen des Filters mit Puffer A.
  • . Trocknen des Filters zwischen zwei saugfähigen Blättern.
  • . Inkontaktbringen mit einem autoradiographischen Film.
  • . Entwicklung des Films.
    • b) Ergebnisse
  • Es wird festgestellt, daß die Stämme EMY761 pEMR469 (Leu&spplus;) und EMY761 pEMR473 (Leu&spplus;) (Klon 1) ein Protein mit einer apparenten Molmasse von etwa 33 KDa erzeugen, das von den Antikörpern erkannt wird, die gegen die Uratoxidase von A. flavus gerichtet sind (die nach den dem Fachmann geläufigen Techniken vom Kaninchen gewonnen wurden: vgl. Vaitukaitis et al. (1981) "Methods in enzymology" Academic Press, New York, Band 73, S. 46) und das beim Vergleichsstamm fehlt.
  • Der Vergleich der Mengen dieses Proteins in den Rückständen und den Überständen erlaubt den Schluß, daß etwa 80 % des Proteins in löslicher Form im Lysat vorliegen.
    • 4) Quantitative Bestimmung der Uratoxidase-Aktivität:
  • Die Uratoxidase-Aktivität der Überstände der lysierten Zellen wurde gemessen.
    • a) Prinzip
  • Man verfolgt die Umwandlung der Harnsäure in Allantoin über die Abnahme der Extinktion bei 292 nm. Folgende Reaktion läuft ab: Uratoxidae Harnsäure (absorbiert bei 292 nm) Allantoin
    • b) Reagentien a) TEA-puffer 0,05 M, pH 8,9/EDTA
  • - Auflösen von 7,5 g TEA (Reagens für Analyse-Prolabo, Referenz-Nr. 287.46.266) in 400 ml destilliertem Wasser,
  • - Auflösen von 0,372 g Complexon III (Merck, Referenz- Nr. 8418) in 50 ml destilliertem Wasser,
  • - Vereinigen der beiden Lösungen und Auffüllen auf 500 ml (Lösung 1),
  • - Einstellen des pH-Werts dieser Lösung auf 8,9 mit 0,2N HCl,
  • - Auffüllen mit destilliertem Wasser auf 1000 ml (Lösung 2).
    • b) Harnsäure-Vorratslösung
  • - Auflösen von 100 mg Harnsäure (Carbiochem Referenz-Nr. 6671) in 50 ml der Lösung 1,
  • - Einstellen des pH-Werts mit 0,2N HCl auf pH 8,9,
  • - Auffüllen mit destilliertem Wasser auf 100 ml.
  • Die erhaltene Lösung kann eine Woche bei 4 ºC aufbewahrt werden.
    • c) Harnsäure-Substratlösung
  • - Entnahme von 1,5 ml Harnsäure-Vorratslösung (Carbiochem Referenz-Nr. 6671) und Verdünnen auf 100 ml mit TEA-Puffer (Analysenreagens-Prolabo Referenz-Nr. 287.46.266).
  • Diese Lösung muß im Verlauf von einem Tag verwendet werden.
    • c) Verfahrensweise
  • In die Quarzküvette eines auf 292 nm eingestellten und auf 30 ºC thermostatisiertem Spektralphotometer werden die folgenden Volumina eingefüllt:
  • - 600 ul Harnsäure-Substratlösung (vorher erwärmt auf 30 ºC),
  • - 100 ul der obigen Überstände, denen 200 ul TEA mit pH 8,9 (vorher erwärmt auf 30 ºC) zugesetzt wurden.
  • Nach dem Mischen wird die Änderung der optischen Dichte, die im folgenden teilweise als OD abgekürzt ist, während 5 min alle 30 s abgelesen. Hieraus wird ΔE berechnet, die Änderung der optischen Dichte pro Minute.
    • d) Auswertung der Ergebnisse
  • Die in U/ml ausgedrückte Enzymaktivität A von Uratoxidase wird mit der ΔE-Messung mit Hilfe der folgenden Formel berechnet:
  • A = ΔE x Vr x d/I x VPE
  • worin die Symbole Vr, d, I und Vpe das Reaktionsvolumen (0,9 ml), den Verdünnungsgrad (2), den Extinktionskoeffizienten von Harnsäure bei 292 nm (12,5) und das Probennahmevolumen (0,1 ml) darstellen.
    • 5) Quantitative Bestimmung der gesamten löslichen Proteine insgesamt in den Lysaten:
  • Der Protein-Assay-Kit von Biorad wurde zur quantitativen Bestimmung der gesamten im Überstand der lysierten Zellen enthaltenen Proteine verwendet. Er basiert auf der Beobachtung, daß sich das Extinktionsmaximum einer sauren Lösung von Coomassie-Brillant Blau G-250 sich von 465 nm nach 595 nm verschiebt, wenn die Proteine an den Farbstoff binden (vgl. Reisner et al., Anal. Biochem. 64, 509 (1975)).
    • Verfahrensweise
  • In die Küvette eines auf 595 nm eingestellten Spektralphotometers werden die folgenden Volumina gegeben:
  • - 10 ul Probe, denen 790 ul destilliertes Wasser zugesetzt wurden
  • - 200 ul konzentriertes "Dye reagent" (Biorad).
  • Nach dem Vermischen wird die optische Dichte bei 595 nm abgelesen. Eine Eichmeßreihe mit zunehmender Konzentration an RSA (Rinderserumalbumin) wurde in dieser Weise erstellt. Die unbekannte Konzentration der gesamten Proteine der Lysate wird aus der erhaltenen Eichkurve ermittelt.
    • 6) Ergebnisse:
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle (II) zusammengefaßt. In dieser Tabelle wird für jeden Stamm genau das Kulturmedium, die Kohlenstoff- und Energiequelle der Kultur, die Uratoxidase-Aktivität in U/ml, die Menge der gesamten löslichen Proteine in mg/ml und der Prozentsatz der Uratoxidase in den gesamten löslichen Proteinen angegeben. Dieser letzte Parameter wird unter der Annahme berechnet, daß die spezifische Aktivität des rekombinanten Proteins gleich der spezifischen Aktivität der aus A. flavus erhaltenen Uratoxidase ist, nämlich 30 U/mg. Tabelle II Stamm Kulturmedium bei der Probenbereitung Kohlenstoff- und Energiequelle der Kultur Aktivität der Uratoxidase (U/ml) Gesamte lösliche Proteine (mg/ml) Prozentsatz d. Uratoxidase in den gesamten lösl. Proteinen Klon nicht transformiert flüss. Med. ohne Leu. flüssiges YPG-Medium YPG-Med. Ethanol/Glyc. YP-Med. Ethanol/Glycerin/Galactose Glucose Ethanol/Glycerin Ethanol/Glycerin Galactose
  • Diese Tabelle zeigt:
  • a) In Gegenwart von Glucose ist das Niveau der Uratoxidase nicht nachweisbar ("unterdrückt") im Falle des erfindungsgemäßen künstlichen Promotors (Stamm EMY761 pEMR473 (leu&spplus;) (Klon 1, 2 oder 3)), während es im Falle des ADH&sub2;-Promotors (Stamm EMY761 pEMR469 (leu&spplus;) nachweisbar ist. Mit dem künstlichen Promotor kann demnach in Gegenwart von Glucose eine bessere Unterdrückung erreicht werden als mit dem ADH&sub2;-Promotor.
  • b) Bei Abwesenheit von Glucose und in Gegenwart von Ethanol/Glycerin ist das Niveau der Uratoxidase für den ADH&sub2;-Promotor beträchtlich (etwa 14 % der gesamten löslichen Proteine) und für den künstlichen Promotor gering, aber nachweisbar.
  • c) Bei Abwesenheit von Glucose, aber in Gegenwart von Ethanol/Glycerin/Galactose, unterscheidet sich der Wert des Niveaus der Uratoxidase wenig vom Wert des vorhergehenden Falls für den ADH&sub2;-Promotor (etwa 13,5 % der gesamten löslichen Proteine), erreicht aber für den künstlichen Promotor einen hohen Wert (etwa 18 % der gesamten löslichen Proteine).
  • Der erfindungsgemäße künstliche Promotor ermöglicht demnach die Produktion des rekombinanten Proteins auf einem hohen Niveau und weist drei Expressionsniveaus auf:
  • - Null-Niveau a)
  • - Grundniveau b)
  • - maximales Niveau c).
    • Beispiele 4bis: Expression der cDNA von Uratoxidase in einem Erlenmeyer-Kolben durch die Stämme EMY761, pEMR515 (leu&spplus;), EMY500 pEMR515 (leu&spplus;) und GRF18 (pEMR515 (leu&spplus;)
  • Von jedem der drei obengenannten Stämme wurde eine Kolonie in 20 ml flüssigem Medium ohne Leucin kultiviert.
  • Die drei Kulturen wurden nach Rühren bei 30 ºC über Nacht 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die Zellrückstände wurden in 10 ml sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und erneut 10 min zentrifugiert. Die Expression der Uratoxidase wurde durch Aufnehmen der Zellen in 20 ml YP- Ethanol-Glycerin-Galactose-Medium induziert (vgl. Tabelle I, Beispiel 3). Anschließend wurden die Kulturen erneut etwa 20 h bei 30 ºC gerührt. Als Vergleich wurde von jedem Wirtsstamm, und zwar dem nicht transformierten Stamm, eine Kultur erzeugt.
  • Die Zellen von allen sechs Kulturen wurden durch Zentrifugieren sedimentiert. Die so erhaltenen Rückstände wurden in 10 ml destilliertem Wasser aufgenommen und 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die so gewaschenen Rückstände wurden in etwa 1 ml TEA-Puffer von pH 8,9 aufgenommen und die Zerkleinerung sowie die Entfernung der Partikeln durch Zentrifugieren wurden wie in Beispiel 4, 2) beschrieben durchgeführt. Der Überstand jeder Kultur dient wie zuvor der quantitativen Bestimmung der Uratoxidase und der gesamten Proteine. Die dabei erhaltenen wichtigen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengefaßt: Tabelle III Stamm/Kulturbedingungen Uratoxidase-Aktivität (U/ml) Gesamte lösliche Proteine (mg/ml) Uratoxidase in den löslichen Proteinen (%)
  • a): Die Stämme werden in Gegenwart von Glucose kultiviert (nicht induzierende Bedingungen)
  • b): Die Stämme werden in Abwesenheit von Glucose und in Gegenwart von Galactose kultiviert (Induktion).
  • Der erfindungsgemäße Promotor ermöglicht demnach ein hohes Expressionsniveau der Uratoxidase in drei nicht isogenen Stämmen.
    • Beispiel 5: Konstruktion von zwei Expressionsvektoren der β-Galactosidase in Hefe: Plasmid pEMR429, das einen ADH&sub2;-Promotors enthält, und Plasmid pEMR437, das den erfindungsgemäßen künstlichen Promotor enthält
  • Bei der verwendeten Strategie werden Fragmente, die aus schon vorher existierenden und der Öffentlichkeit zugänglichen Plasmiden hergestellt wurden, und Fragmente eingesetzt, die synthetisch nach den jetzt üblicherweise eingesetzten Techniken hergestellt wurden. Bei den Klonierungstechniken handelt es sich um die von T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in "Molecular Cloning, a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) beschriebenen Techniken. Die Synthese der Oligonucleotide wird mit einer DNA-Synthesevorrichtung Biosearch 4600 durchgeführt.
    • 1) Konstruktion des Plasmids pEMR429:
  • Das Plasmid pEMR414 (vgl. Fig. 5) wurde einer vollständigen Spaltung mit dem Restriktionsenzym BamHI unterzogen. Die BamHI-Stelle, die zwischen der Promotorsequenz (ADH&sub2;) und der Terminationssequenz (PGK) angeordnet ist, ist nur einmal vorhanden. Die lineare DNA des Plasmids wird durch Elution eines Agarosegels nach der Elektrophorese gereinigt. Das Plasmid pMC1403 (Referenz: Casadaban et al. (1980), J. Bacteriol., 143, 971-980) wurde einer vollständigen Spaltung mit den Enzymen BamHI und EcoRI unterzogen, wodurch ein DNA-Fragment BamHI-EcoRI von etwa 3 kb herausgeschnitten werden konnte, das den wesentlichen Teil (Stromabwärts-Teil) der Sequenz enthält, die die β-Galactosidase von E. coli codiert. Die vollständige Sequenz wurde mit Hilfe des synthetisch hergestellten Fragments der folgenden Sequenz wieder hergestellt:
  • Das Fragment BamHI-EcoRI, das von der doppelten Spaltung von pMC1403 stammt, wird in EcoRI mit dem obigen synthetisch hergestellten Fragment verknüpft.
  • Das erhaltene Fragment BamHI-BamHI wird anschließend mit der linearen DNA des Plasmids pEMR414 verknüpft, das durch BamHI gespalten wurde, um das Plasmid pEMR429 zu erhalten, das in Fig. 8, in der die Symbole die gleiche Bedeutung wie in Fig. 5 haben, dargestellt ist, wobei die eingeführten Fragmente BaHI-EcoRI und EcoRI-BamHI durch dargestellt werden.
  • In diesem Plasmid steht die Sequenz, die die β-Galactosidase codiert, unter der Kontrolle des in Beispiel 2 beschriebenen ADH&sub2;-Promotors.
    • 2) Konstruktion des Plasmids pEMR461:
  • Das Plasmid pEMR429 wurde einer vollständigen Spaltung mit den Enzymen MluI und SphI unterzogen. Das große Fragment MluI-SphI, das das Gen der β-Galactosidase enthält, wurde anschließend mit dem synthetisch hergestellten Fragment verknüpft, dessen im folgenden angegebene Sequenz die Stromaufwärts-Aktivierungs-Sequenzen (Upstream Activation Sequence: UAS) des Promotors des GAL7-Gens von S. cerevisiae und kohäsive Enden MluI und SphI enthält.
  • Das so erhaltene Plasmid pEMR461 ist in Fig. 9 dargestellt, in der die Symbole die gleiche Bedeutung wie in Fig. 8 haben, wobei das eingeführte neue Fragment MluI-SphI durch symbolisiert ist.
  • In diesem Plasmid steht die Sequenz, die die β-Galactosidase codiert, unter der Kontrolle des in Beispiel 2 beschriebenen erfindungsgemäßen künstlichen Promotors.
    • Beispiel 6: Transformation des S.-cerevisiae-DBY746-Stamms mit den Plasmiden pEMR429 und pEMR461
  • Transformation mit Selektion auf Uracil-Prototrophie:
  • Eine Kolonie des Stamms DBY746, die (Matα, his3, leu2, ura3, trp1, cyhR) ist (Rose et al. (1981) PNAS USA, 78, 2460-2464), diente zur Beimpfung von 100 ml eines als flüssiges YPG-Medium bezeichneten Mediums (vgl. Tabelle I von Beispiel 3). Nachdem eine Zelldichte von 10&sup7; Zellen pro Milliliter erreicht wurde, wurden die Zellen mit 0,2-M- Lithiumacetatlösung zur Transformation nach einer dem Fachmann geläufigen Technik behandelt, die von Ito et al. (Ito et al., 1983, J. Bacteriology 153, 163-168) beschrieben wurde.
  • Die DBY746-Zellen wurden parallel mit jeweils 1 mg der beiden Plasmide pEMR429 und pEMR461 transformiert. Die transformierten Zellen wurden hinsichtlich der Eigenschaft der Uracil-Auxotrophie (ura&spplus;) auf einem als festes Medium ohne Uracil bezeichneten Medium selektiert (vgl. Tabelle I von Beispiel 3). Es wurden so ein Transformant DBY746 pEMR429 (ura&spplus;) und ein Transformant DBY746 pEMR461 (ura&spplus;) gewonnen.
    • Beispiel 7: Erzeugung von β-Galactosidase mit den Stämmen DBY746 pEMR429 (ura&spplus;) und DBY746 pEMR461 (ura&spplus;) 1) Expression der β-Galactosidase:
  • Eine transformierte Kolonie DBY746 pEMR429 (ura&spplus;) und eine transformierte Kolonie DBY746 pEMR461 (ura&spplus;) dienten zur Beimpfung von je 20 ml flüssigem Medium ohne Uracil, dem zuvor Tryptophan (10 mg/l) zugesetzt wurde. Nach Rühren über Nacht bei 30 ºC wurde 1 % Glucose zugesetzt, wonach man die Kultivierung 4 h fortsetzt. Es wird dann nachgeprüft, ob die Kulturen noch Glucose enthalten. Zur Bestimmung der β-Galactosidase wird eine aliquote Menge entnommen.
  • Nach Rühren über Nacht bei 30 ºC wurden die beiden Kulturen 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die Rückstände wurden in 10 ml sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und erneut 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die Expression der β-Galactosidase wurde induziert, indem die Zellen in 20 ml YP-Ethanol-Glycerin-Medium (vgl. Tabelle I, Beispiel 3) für den Stamm DBY746 pEMR429 (ura&spplus;) und in 20 ml YP- Ethanol-Glycerin-Galactose-Medium (vgl. Tabelle I, Beispiel 3) für den Stamm DBY746 pEMR461 (ura&spplus;) aufgenommen wurden. Die Kulturen wurden erneut über Nacht bei 30 ºC gerührt.
    • 2) Probenvorbereitung und quantitative Bestimmung:
  • Die obigen kultivierten Zellen wurden zentrifugiert und anschließend der Überstand verworfen. Die Rückstände wurden in 10 ml destilliertem Wasser aufgenommen und 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die so gewaschenen Rückstände wurden in etwa 1 ml Puffer zur quantitativen Bestimmung der β-Galactosidase (EDTA: 2 10&supmin;³ M; Na&sub2;HPO&sub4; 7 10&supmin;² M; NaH&sub2;PO&sub4; 3 10&supmin;³ M; MgSO&sub4; 10&supmin;³ M; MnSO&sub4; 2 10&supmin;³ M) aufgenommen. Etwa 300 ul so aufgenommene Zellen wurden in Gegenwart von Glaskügelchen (Durchmesser 400 bis 500 um) lysiert, was etwa der Hälfte des Endvolumens entspricht. Dieses Gemisch wurde viermal während 1 min in einem Vortex-Mischer gerührt, wobei die Proben zwischen diesen Zerkleinerungsschritten 30 s in Eis gekühlt wurden. Die Flüssigkeit wurde mit einer Pasteurpipette aus den Röhrchen entnommen und in Mikroröhrchen übertragen. Die Glaskügelchen wurden einmal mit etwa 200 ul TEA-Puffer von pH 8,9 gewaschen. Die Kügelchen wurden einmal 1 min in einem Vortex-Mischer gerührt, wonach die Flüssigkeit mit der Pasteurpipette entnommen und dem obengenannten Lysat zugesetzt wurde. Das Lysat wurde anschließend 5 min bei 7000 min&supmin;¹ in einem Mikroröhrchen zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig entnommen und für das Western-Blotting, die quantitative Bestimmung der Uratoxidase-Aktivität und die quantitative Bestimmung der gesamten löslichen Proteine aufbewahrt. Der Rückstand aus lysierten Zellen wurde getrennt bei -20 ºC aufbewahrt.
  • Die β-Galactosidase-Aktivität wurde nach der Technik von Pardee (Pardee et al., J. Mol. B. (1959), 1, 1656-178) quantitativ bestimmt.
  • Die gesamten löslichen Proteine wurden ferner mit Hilfe eines Protein-Assay-Kits von Biorad, wie in Beispiel 4 beschrieben, quantitativ bestimmt.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt Tabelle IV Stamm Kohlenstoff- und Energiequelle der Kultur β-Galactosidase-Aktivität Gesamte lösliche Proteine Kulturmedium Glucose Ethanol/Glycerin Ethanol/Glycerin/Galactose flüssiges Medium ohne Uracil + Tryptophan + Glucose YP-Ethanol/Glycerin-Medium flüssiges Medium ohne Uracil/Tryptophan + Glucose YP-Ethanol-Glycerin-Galactose-Medium
  • Diese Tabelle zeigt:
  • - In Gegenwart von Glucose erzeugt der Stamm EMY746 pEMR429 (ura&spplus;) wenig β-Galactosidase, während dieses Protein bei dem Stamm DBY746 pEMR461 (ura&spplus;) nicht nachweisbar ist. Der erfindungsgemäße künstliche Promotor ermöglicht demnach eine bessere Enzymrepression als der ADH&sub2;-Promotor.
  • - Unter induzierenden Bedingungen führt der künstliche Promotor zu einem hohen Expressionsniveau der β-Galactosidase, obgleich dieses Niveau unter diesen Bedingungen niedriger ist als das mit dem ADH&sub2;-Promotor erhaltene Niveau.
    • Beispiel 8: Konstruktion von zwei Expressions- und Sekretionsvektoren des menschlichen Cytokins gro-β in Hefe: die Plasmide pEMR575S und pEMR583, die den erfindungsgemäßen künstlichen Promotor enthalten:
  • Die zuvor beschriebenen Beispiele betreffen Proteine, die intrazellulär vorhanden sind. Man weiß nun, daß die Hefe rekombinante Proteine in das Kulturmedium sezernieren kann. Die Nutzung des Stoffwechselweges, der zur Sekretion des Proteins führt, hat mehrere wesentliche Vorteile.
  • 1 - In dem Kulturüberstand kann ein annehmbar reines und fehlerfrei gereiftes Produkt gewonnen werden,
  • 2 - dem Protein kommen Modifizierungen zugute, die mit dem Sekretionsweg verbunden sind, wie z.B. die Bildung von Dischwefelbrücken, die Glykosylierung etc.
  • Es gibt mehrere von der Hefe natürlich sezernierte Proteine oder Polypeptide. In den meisten bekannten Fällen werden diese Proteine in Form eines längeren Vorläufers synthetisiert, dessen aminoterminale Sequenz von entscheidender Bedeutung für den Eintritt in den Stoffwechselweg ist, der zur Sekretion führt. Diese aminoterminalen Sequenzen können in bestimmten Fällen zur Sekretion heterologer Proteine verwendet werden. Es ist bekannt, daß man von diesen Sequenzen das Präpro-System des α-Pheromons verwenden kann. Das sexuelle α-Pheromon von Hefe ist ein Peptid aus 13 Aminosäuren, das von S.-cerevisiae-Hefen vom Paarungstyp Matα in das Kulturmedium sezerniert wird.
  • Der α-Faktor stoppt die Zellen des anderen Paarungstyps (Mata) in der G1-Phase und induziert die biochemischen und morphologischen Veränderungen, die für die Konjugation der beiden Zelltypen erforderlich sind - J. Kurjan und I. Herskowitz (1982) Cell, 30, 933-943 haben das Strukturgen des α-Faktors kloniert und aus der Sequenz dieses Gens hergeleitet, daß dieser Faktor aus 13 Aminosäuren in Form eines Präpro-Proteinvorläufers von 165 Aminosäuren synthetisiert wird. Der Vorläufer enthält eine aminoterminale hydrophobe Sequenz von 22 Aminosäuren, auf die eine Sequenz von 61 Aminosäuren folgt, die 3 Glykosylierungsstellen enthält, woran sich 4 Kopien des α-Faktors anschließen. Diese 4 Kopien sind durch Brückensequenzen voneinander getrennt, und das reife Protein wird durch die Aktivitäten folgender Enzyme aus dem Vorläufer herausgeschnitten:
  • 1 - Eine Cathepsin-B-ähnliche Endopeptidase, die im Bereich des carboxyterminalen Endes Lys-Arg-Dipeptide schneidet (Produkt des Gens KEX2, als yscF bezeichnet).
  • 2 - Eine Exopeptidase vom Carboxypeptidase-Typ (Produkt des KEX1-Gens), die die basischen Reste im Bereich des carboxyterminalen Endes der herausgeschnittenen Peptide schneidet.
  • 3 - Eine Dipeptidylaminopeptidase (als A bezeichnet), die die Dupletts Glu-Ala und Asp-Ala entfernt (Produkt des STE 13-Gens).
  • Ein erstes Beispiel für ein von diesem System sezerniertes Protein und bei dem der erfindungsgemäße Promotor verwendet wird ist das menschliche Cytokin gro-β. Die cDNA dieses Proteins, die entweder als gro-β (S. Haskill, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 87, 7732-7736) oder als MIP-2α (P. Tekamp-Olson et al., 1990, J. Exp., 172, 911-919) bezeichnet wird, wurde vor kurzem kloniert und sequenziert. gro-β gehört zu einer Familie von Cytokinen, deren Mitglieder bei der Modulation der Entzündungsantwort und bei wachstumsfaktorähnlichen Aktivitäten beteiligt sind.
  • Die Anmelderin hat die Verwendung des Promotors zur Sekretion von gro-β durch S. cerevisiae untersucht. Hierfür hat sie die natürlich vorkommende Signalsequenz von gro-β durch die Präpro-Sequenz des α-Pheromons ersetzt und den Vorläufer von gro-β hinter den erfindungsgemäßen Promotor gesetzt.
  • 1 - Konstruktion des Plasmids pEMR 530 (Klonierungsvektor):
  • Das weiter oben beschriebene Plasmid pEMR 473 (Beispiel 2.2) - Fig. 7 wurde mit den Enzymen XhoI und SalI gespalten, woraufhin das große, im folgenden als Fragment E bezeichnete Fragment, isoliert wurde. Dieses große Fragment umfaßt die Sequenzen des URA3-Gens, den Replikationsursprung und den STB-Locus von 2u, das Ampicillin-Resistenzgen AmpR, den Replikationsursprung des Plasmids pBR322 und die UAS-Sequenzen des Promotors des GAL7-Gens von S. cerevisiae sowie die Termination des PGK-Gens.
  • Eine doppelsträngige Oligonucleotidsequenz von etwa 400 Basenpaaren, die als Fragment F bezeichnet wird, wurde in Form eines Fragments XhoI-SalI synthetisiert. Diese Sequenz bringt die TATA-Box und den Initiationsbereich des ADH&sub2;- Promotors ein, der durch eine synthetische Sequenz verlängert wird, die dem Anfang des Präpro-Bereichs des α-Pheromons vorausgeht. Die Sequenz dieses Präpro-Bereichs des α- Pheromons unterscheidet sich von der von Kurjan und Herskowitz 1982, Cell, 30, 933-943 beschriebenen Sequenz durch die Einführung einer HindIII-Stelle durch stumme Mutation des Codons TCT - entspricht dem Serin 81 des Vorläufers des Pheromons - in AGC. Die gesamte Sequenz des Fragments wird im folgenden angegeben:
  • Die Fragmente E und F wurden so verknüpft, daß das Plasmid pEMR530 erhalten wurde, das in Fig. 10 dargestellt ist, in der die Symbole die gleiche Bedeutung wie in Fig. 7 haben, wobei das neue eingeführte Fragment XhoI-SalI (Fragment F) durch dargestellt wird.
  • Dieses Plasmid enthält den erfindungsgemäßen künstlichen Promotor, dessen Sequenz in Beispiel 2 angegeben wurde.
  • 2- Konstruktion des Plasmids pEMR583 (Plasmid zur Expression des menschlichen Cytokins gro-β)
  • Das Plasmid pEMR530 wurde einer vollständigen Spaltung durch die Enzyme NheI und HindIII unterzogen. Das kleine Fragment NheI-HindIII, das den künstlichen Promotor und den Präpro-Bereich des α-Pherons sowie das URA3-Gen enthält, wurde gereinigt (dieses Fragment wird im folgenden als Fragment G bezeichnet).
  • Das Plasmid pEMR473 wurde einer vollständigen Spaltung durch die Restriktionsenzyme NheI und BamHI unterzogen. Das große Fragment (im folgenden als Fragment H bezeichnet), das den Replikationsursprung und den STB-Locus von 2u, das LEU2d-Gen, das Ampicillin-Resistenzgen, den Ursprung von pBR322 und die Termination des PGK-Gens enthält, wurde gereinigt.
  • Die cDNA von gro-β wurde nach dem von Tekamp-Olson et al. beschriebenen Verfahren (Quellenangabe weiter oben) kloniert und sequenziert. Die Sequenz der cDNA von gro-β (sie wird ausführlich in dieser Literaturstelle beschrieben -insbesondere Fig. 2) weist eine EcoRI-Stelle auf (Sequenz: 5'-GAATTC), die das Codon ATT mit einschließt (Isoleucin in der Position +18 der reifen Sequenz von gro-b, Tekamp-Olson et al., siehe oben angegebene Literatur) und reicht über die beiden flankierenden Codons GGA und CAC hinaus. Die klonierte cDNA von gro-β wird am 3'-Ende von einem Poly(A)- Schwanz abgeschlossen, flankiert von einer Restriktionsstelle BamHI.
  • Das Fragment ECORI-BAMHI, das den Hauptteil der Sequenz enthält, die gro-β codiert, gefolgt von der 3'-Sequenz, die dem nicht übersetzten Ende der mRNA entspricht, die vom polyadenylierten Schwanz flankiert ist, wurde nach den herkömmlichen und in Maniatis et al. (weiter oben angebene Literaturstelle) angegebenen Techniken isoliert. Das Fragment wird im folgenden als Fragment I bezeichnet.
  • Ferner wurde ein synthetisches Fragment HindIII-EcoRI hergestellt, das das Ende des Präpro-Bereichs des a-Pheromons (entsprechend den Resten Ser Leu Asp Lys Arg) und den Anfang der Sequenz enthält, die das reife Protein von gro-β codiert. Die Sequenz dieses Fragments, das als Fragment J bezeichnet wird, wird im folgenden angegeben. Man wird feststellen, daß die Sequenz, die dem Anfang der cDNA von gro-β entspricht, im Vergleich zur Sequenz der von Tekamp- Olson et al. (siehe obige Literaturstelle) beschriebenen cDNA so modifiziert wurde, daß die verwendeten Codons zu den am häufigsten von S. cerevisiae verwendeten Codons gehören (vgl. Sharp et al. 1986 Nucleic Acids Research, Band 14, 13, 5125-5143).
  • Die Fragmente G, H, I und J wurden so verknüpft, daß das Plasmid pEMR583 erhalten wurde, das in Fig. 11 dargestellt ist, worin die Symbole die gleiche Bedeutung wie in den Fig. 7 und 10 haben, wobei das Fragment E durch und das Fragment F durch wiedergegeben wird.
  • Die Nucleotid- und Peptid-Symbole des Anfangs des reifen gro-β-Proteins und des Endes des Präpro-Bereichs des α- Pheromons sind im folgenden angegeben. Ende des Präpro-Bereichs des α-Pheromons Anfang des reifen Proteins Schnittstelle der Cathepsin-B-ähnlichen Endopeptidase: yscF (Produkt des Gens KEX2).
    • Beispiel 9: Sekretion des Cytokins gro-β durch die Hefe:
  • 1 Transformation des Hefestamms EMY761 durch das Plasmid pEMR583 und Expression von gro-β durch den transformierten Stamm.
  • Der in Beispiel 3 beschriebene Stamm EMY761 (Matα, leu2, ura3, his3) wurde für die Prototrophie für Leucin durch das Plasmid pEMR583 nach der bereits in Beispiel 3 beschriebenen Technik transformiert. Es wurden zwei Transformanten gewonnen, die im folgenden als EMY761 pEMR583 (1) und EMY761 pEMR583 (2) bezeichnet werden.
  • 2 Expression der cDNA von gro-β durch die Stämme EMY761 pEMR583 (1) und EMY761 pEMR583 (2) im Erlenmeyer-Kolben. Nachweis des Proteins in dem Kulturmedium auf Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamidgel nach dem von Lämmli (U.K. Lämmli, Nature, 227 (1970) 680-685) beschriebenen Protokoll.
    • Kultur
  • a) Je eine Kolonie der beiden Stämme EMY761 pEMR583 (1) und EMY761 pEMR583 (2) wurde in 50 ml flüssigem Medium ohne Uracil kultiviert. Dieses Medium enthält pro 1 Liter:
  • 6,7 g Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren (Yeast Nitrogen Base without aminoacids von Difco)
  • 5,0 g Caseinhydrolysat (Casaminoacids von Difco)
  • 10 g Glucose.
  • Nach Rühren über Nacht bei 30 ºC wurden die beiden Kulturen 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die Rückstände wurden in 10 ml sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und erneut 10 min bei 7000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die Expression von gro-β wurde durch Aufnehmen der Zellen in 50 ml YNB- Ethanol-Glycerin-Galactose-Medium induziert. Das YNB-Ethanol-Glycerin-Galactose-Medium enthält pro 1 Liter:
  • 6,7 g Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren (Yeast Nitrogen base without Aminoacids von Difco).
  • 5,0 g Caseinhydrolysat (Casaminoacids von Difco)
  • 30 g Glycerin
  • 30 g Galactose
  • 10 ml Ethanol.
  • Die Kulturen wurden erneut bei 30 ºC 24 h gerührt.
  • b) Vergleichsstamm:
  • Der nicht transformierte Stamm EMY761, d.h. der Stamm ohne Plasmid, wurde wie oben angegeben kultiviert. Er wurde einerseits einer Vorkultivierung in 50 ml flüssigem Medium ohne Uracil, dem wieder Uracil (20ug/ml) zugesetzt wurde, und andererseits der Induktion in 50 ml YNB-Ethanol-Glycerin-Galactose-Medium, dem wieder Uracil zugesetzt wurde (20 ug/ml), unterzogen.
    • Probenbereitung:
  • Die in 1 a) und 1 b) kultivierten Zellen wurden 20 min bei 10000 min&supmin;¹ zentrifugiert, wonach der Überstand entnommen wurde. Zu 10 ml Überstand wurden 5 ml 50%ige Trichloressigsäure, die 2 mg/ml Desoxycholat enthält, gegeben.
  • Das Gemisch wurde 30 min bei +4 ºC gehalten und anschließend 30 min bei 10000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Der Rückstand wurde in etwa 1 ml kaltem Aceton (+ 4 ºC) aufgenommen und erneut 30 min bei 10000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Der Rückstand wurde nach seiner Trocknung in etwa 20 ul Puffer, der als Ladungspuffer bezeichnet wird, aufgenommen, der aus Tris- HCl 0,125 M von pH 6,8 SDS 4 %, Bromphenolblau 0,002 %, Glycerin 20 % und β-Mercaptoethanol 10 % (nach dem von Lämmli beschriebenen Protokoll (1970)) besteht. Der Rückstand wird durch 15minütiges Sieden solubilisiert und anschließend durch Zusatz von 10N Natriumhydroxidlösung neutralisiert, bis das Bromphenolblau nach Blau umschlägt.
  • Die Proben werden auf Polyacrylamid/SDS-Gel aufgebracht:
  • 1) Größenmarker
  • 2) Nicht transformiertes EMY761, nicht induziert: 20 ul aufgebracht
  • 3) EMY761 pEMR 583 (1), nicht induziert: 20 ul aufgebracht
  • 4) EMY761 pEMR583 (1), 24 h induziert: 15 ul aufgebracht
  • 5) EMY761 pEMR583 (1), 24 h induziert: 5 ul aufgebracht
  • 6) Größenmarker
  • 7) EMY761 pEMR 583 (2), 24 h induziert: 5 ul aufgebracht
  • 8) EMY761 pEMR583 (2), 24 h induziert: 15 ul aufgebracht
  • 9) EMY761 pEMR583 (2), nicht induziert: 20 ul
  • 10) nicht transformiertes EMY761, induziert: 20 ul aufgebracht.
  • Nach der Elektrophorese werden die Proteine mit Coommassie- Blau angefärbt.
    • Ergebnisse
  • Die Analyse des erhaltenen Gels zeigt, daß ein überzähliges Protein mit einer apparenten Molmasse von etwa 8 kDa von den Stämmen EMY761 pEMR583 (1) (Spuren 4 und 5) und EMY761 pEMR583 (2) (Spuren 7 und 8), aber nicht in den Kulturüberständen des nicht transformierten Stamms EMY761 (Spuren 2 und 10) produziert wurde. Es zeigt sich ferner, daß die Synthese dieses überzähligen Proteins mit der Induzierung des Promotors durch Wachstum auf Ethanol-Glycerin-Galactose verbunden ist (fehlende Banden in den Spuren 3 und 9).
  • Die Analyse der aminoterminalen Sequenz dieses durch HPLC gereinigten Proteins hat den Nachweis dafür erbracht, daß es sich um das reife, von Tekamp-Olson et al. (Literaturstelle siehe weiter oben) beschriebene gro-β-Protein handelte.
  • Es zeigt sich also, daß das Cytokin gro-β unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors sezerniert werden kann.
  • Der Stamm EMY761 pEMR583 (1) ist bei der Collection Nationale de Culture de Micro-organismes CNCM, Institut Pasteur, Frankreich, unter der Hinterlegungsnummer I-1021 hinterlegt worden.
    • Beispiel 10: Konstruktion eines Expressions- und Sekretionsvektors von IL-8 in Hefe: Plasmid pEMR611, das den erfindungsgemäßen künstlichen Promotor enthält:
  • Ein zweites Beispiel für ein sezerniertes Protein, dessen Expression durch den erfindungsgemäßen Promotor reguliert werden kann, ist das menschliche Cytokin IL-8. Dieses Cytokin von etwa 8000 Da, das von den Monocyten erzeugt wird, wurde von mehreren Forschergruppen beschrieben: Yoshimura et al. (1987) J. Immunol., 139, 788-793, Schröder et al. (1987), J. Immunol., 139, 3474-3483 und Walz, et al., (1987) Biochem-Biophys. Res. Commun, 149, 755-761). IL-8 wirkt wie ein Chemotaxis-Lockstoff für Neutrophile. IL-8 weist bemerkenswerte Strukturähnlichkeiten mit β-Thromboglobin auf (Van Damme et al. (1989) Eur. J. Biochem 181, 337-344). Das Cytokin IL-8 kommt in mehreren Formen vor, die sich durch ihr aminoterminales Ende voneinander unterscheiden. Die Hauptform besteht aus 72 Aminosäuren, wobei jedoch auch 5 andere, untergeordnete Formen erzeugt werden, von denen im Vergleich zur Hauptform drei ein stumpfes aminoterminales Ende aufweisen und zwei eine Verlängerung um 5 bzw. 1 Aminosäure im Vergleich zu dieser Hauptform zeigen.
  • Die cDNA von IL-8 wurde nach dem von Matsushima et al., 1988, J. exp. Med. 167, 1883-1993 beschriebenen Verfahren kloniert und sequenziert. Die Sequenz dieser cDNA enthält eine einzige HindIII-Stelle (5'-AAGCTT), die mit dem 42- und 43e-Codon des reifen Teils übereinstimmt (Form 72 aa: vgl. Matsushima et al., siehe Literaturstelle weiter oben).
  • Andererseits weist der bei dieser Klonierung verwendete Klon der cDNA von IL-8 eine einzige BamHI-Stelle auf, die das 3'-Ende des Poly(A)-Schwanzes unmittelbar flankiert. Das Fragment BamHI-HindIII, das das 3'-Ende der cDNA von IL-8 trägt, wurde gereinigt.
  • Ein Klonierungsvektor wurde in folgender Weise hergestellt:
  • Das in Beispiel 8 beschriebene Plasmid pEMR583 wurde mit HindIII und BamHI gespalten.
  • Durch diese doppelte Spaltung wurden fünf Fragmente freigesetzt:
  • Das schwerste Fragment HindIII-BamHI entspricht dem Klonierungsvektor (etwa 7760 Basenpaare). Die vier anderen Fragmente, HindIII-HindIII (mit einer Größe von 169 Basenpaaren, 92 Basenpaaren, 529 Basenpaaren und 187 Basenpaaren) entsprechen der Sequenz der cDNA von gro-β. Die HindIII-Stelle des Klonierungsvektors ist etwas stromaufwärts von der Insertionsstelle des Endes der Pro-Sequenz des α-Pheromons angeordnet (und stimmt mit der Sequenz des Codons -Serin 81- des Vorläufers überein). Die BamHI-Stelle ist stromaufwärts von der Termination von PGK angeordnet.
  • Die DNA des Fragments HindIII-BamHI wurde gereinigt. Das Fragment HindIII-BamHI, das den 3'-Teil der cDNA-Sequenz enthält, wurde mit einem synthetischen DNA-Fragment HindIII-HindIII verknüpft. Die im folgenden angegebene Sequenz dieses Fragments soll die Sequenz der reifen Hauptform von IL-8 (72 Aminosäuren) rekonstruieren, der die Sequenz der Spaltungsstelle (Ser-Leu-Asp-Lys-Arg) vorausgeht. Das neue Fragment HindIII-BamHI wurde mit dem Fragment HindIII-BamHI, das dem Klonierungsvektor entspricht, verknüpft. Die folgende Abbildung zeigt die Sequenz des synthetischen Fragments HindIII-HindIII:
  • Das so erhaltene Plasmid, das die cDNA von IL-8 aufweist, der die Präpro-Sequenz des α-Pheromons und der erfindungsgemäße Promotor vorausgehen, dessen exakte Sequenz in Beispiel 2 angegeben wurde, wird als pEMR611 bezeichnet.
    • Beispiel 11: Transformation des Hefestamms EMY761 durch das Plasmid pEMR611 und Sekretion von IL-8
  • Der in Beispiel 3 beschriebene Stamm EMY761 (Matα, ura3, leu2, his3) wurde mit der DNA des Plasmids pEMR611 nach der bereits beschriebenen Technik in einen (leu&spplus;)-Stamm transformiert. Von den erhaltenen (leu&spplus;)-Kolonien wurde eine Kolonie zufällig entnommen und zur Untersuchung der Sekretion von IL-8 kultiviert. Dieser Stamm wird im folgenden als EMY761 pEMR611 bezeichnet.
  • Das Protokoll für die Analyse der durch die Hefe sezernierten Proteine entspricht dem in Beispiel 9 dargelegten Protokoll. Die von EMY761 pEMR611 sezernierten Proteine wurden mit den von EMY761 sezernierten Proteinen verglichen. Es konnte so eine überzählige Hauptbande ermittelt werden, die einem Protein von 8000 Da entspricht, das von den mit Galactose induzierten Zellen EMY761 pEMR611 sezerniert wurde. Dieses Protein wird in spezifischer Weise von Antikörpern des Kaninchens erkannt, die gegen menschliches IL-8 gerichtet sind (lieferbar von der Gesellschaft Endogen: Anti human IL-8 polyvalent P801), nach den Ergebnissen der Western-Blot-Analyse, bei der es sich um ein dem Fachmann geläufiges Verfahren handelt und deren Protokoll detailliert in Beispiel 4 angegeben ist.
  • Das Expressionsplasmid pEMR611 ermöglicht demnach die Expression von IL-8 in den transformierten Hefen auf einem hohen Niveau. Diese Expression steht unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen künstlichen Promotors.
  • Der Stamm EMY761 pEMR611 wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes CNCM, Institut Pasteur, Frankreich, unter der Hinterlegungsnummer I-1023 hinterlegt.
    • Beispiel 12: Konstruktion eines Expressionsvektors zur Sekretion von Hirudin: Plasmid pEMR576, das den erfindungsgemäßen künstlichen Promotor enthält:
  • Hirudin, das in der Natur von dem Blutegel Hirudo erzeugt wird, ist ein sehr spezifischer und sehr wirksamer Thrombin-Inhibitor. Einige abgewandelte Formen wurden identifiziert und als HV&sub1;, HV&sub2;, HV&sub3; bezeichnet (Dodt J. et al. (1986) FEBS Lett. 202, 373, 377). In der Folge wurden bestimmte dieser natürlich vorkommenden abgewandelten Formen sowie weitere Analoge gentechnisch in verschiedenen Wirtszellen hergestellt. Das Beispiel betrifft die abgewandelte Form rHV&sub2;-Lys47, die in EP-A-0 273 800 beschrieben ist. Genauer codiert die exprimierte Sequenz einen Vorläufer dieser abgewandelten Form rHV&sub2;-Lys47, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er die Signalsequenz Met-Arg-Phe-Ser- Thr-Thr-Val-Ala-Thr-Ala-Ala-Tyr-Ala-Leu-Phe-Phe-Thr-Ala- Ser-Gln-Val-Ser-Ala enthält, die dem Anfang der Sequenz des reifen Hirudins unmittelbar vorangeht.
  • Die Konstruktion und die Struktur dieses Vorläufers sind in der Patentschrift FR 2 646 437 beschrieben. Die Expression dieses Vorläufers ermöglicht die Freisetzung der abgewandelten Form rHV&sub2;-Lys47 in den Überstand der Kultur der transformierten Zellen.
  • Das Plasmid pTG3867, dessen Konstruktion und Beschreibung in der Patentanmeldung FR 2 646 437 genau angegeben werden, ist ein Sekretionsvektor für Hirudin. Bei dieser Konstruktion wird Hirudin in Form eines Vorläufers synthetisiert, der eine Signalsequenz enthält. Das Hirudin wird hinter dem Promotor des MFα1-Gens angeordnet, das bei Hefestämmen vom α-konjugierenden Typ konstitutiv ist.
    • Konstruktion des Plasmids pEMR547
  • Das Plasmid pEMR547 wird vom Plasmid pEMR515 (vgl. Beispiel 2) durch Deletion der kleinen Sequenz abgeleitet, die vom 2u-Plasmid stammt und zwischen dem Ende des LEU2d-Gens und der EcoRI-Stelle angeordnet ist, die die Sequenz des Plasmids pBR322 begrenzt. Das Plasmid pEMR515 wurde teilweise mit BspMI und vollständig mit EcoRI gespalten. Das große Fragment BspMI-EcoRI, das dem Plasmid pEMR515, von dem der 3'-Teil von LEU2 deletiert ist, und der kleinen angrenzenden Sequenz von 2u entspricht, wurde mit einer synthetischen Sequenz BspMI-EcoRIo verknüpft, die zur Wiederherstellung des 3'-Bereichs des LEU2d-Gens bestimmt ist.
  • Diese synthetische Sequenz sieht folgendermaßen aus:
  • Das wiederhergestellte Plasmid wird als pEMR547 bezeichnet.
    • Konstruktion des Plasmids pEMR568
  • Das Plasmid pEMR568 leitet sich in folgender Weise von pEMR547 ab:
  • Die DNA des Plasmids pEMR547 wurde mit MluI und NheI gespalten. Diese doppelte Spaltung ermöglicht die Linearisierung des Plasmids pEMR547 (6,6 kb), wobei die beiden Stellen MluI und NheI einige Basenpaare voneinander entfernt angeorndet sind. Zwischen diesen beiden Stellen wurde ein synthetisches doppelsträngiges Oligonucleotid mit folgender Sequenz eingebracht:
  • Das resultierende Plasmid wird pEMR568 genannt.
    • Konstruktion des Plasmids pEMR576. Expressionsplasmid von Hirudin
  • Die Sequenz der abgewandelten Form rHV&sub2;-Lys47 von Hirudin wurde aus dem Plasmid pTG3867 hergestellt, dessen Konstruktion und Beschreibung ausführlich in der Patentanmeldung FR 2 646 437 dargestellt ist. Bei dieser Konstruktion wird Hirudin in Form eines Vorläufers synthetisiert, der aus einem Signalpeptid von 23 Aminosäuren (darin enthalten Methionin, das dem Initiationscodon entspricht) zusammengesetzt ist. Die Messenger-RNA, die den Vorläufer codiert, wird mit Hilfe des MFα1/8-Promotors transkribiert, der bei Hefestämmen vom α-konjugierenden Typ konstitutiv ist.
  • Durch die doppelte Spaltung mit AccI-SalI des Plasmids pTG3867 werden mehrere Fragmente freigesetzt, von denen das kürzeste, das etwa 200 Basenpaare aufweist, leicht an 2%igem Agarosegel gereinigt werden kann. Die AccI-Stelle, die an dieses Fragment grenzt, ist gemäß der folgenden Sequenz einige Basenpaare entfernt vom Anfang der reifen Sequenz angeordnet: reife Sequenz
  • Die SalI-Stelle ist stromabwärts vom Stop-Codon der das Hirudin codierenden Sequenz angeordnet.
  • Das Fragment AccI-SalI aus 200 Basenpaaren trägt die Information für den größten Teil der reifen Sequenz von Hirudin. Die Vervollständigung der Information (Signalsequenz und Anfang der reifen Sequenz) wird von einer synthetischen Sequenz aus etwa 90 Nucleotiden geliefert, die im folgenden veranschaulicht wird.
  • Der Vektor pEMR468 wurde mit SalI linearisiert und teilweise mit ClaI gespalten. Das Fragment ClaI-SalI von etwa 5,6 kb, das diesem Vektor entspricht, von dem die Sequenz der Uratoxidase deletiert ist, wurde mit dem Fragment AccI- SalI aus etwa 200 Basenpaaren, das die Information für die Sequenz des reifen Hirudins trägt, und mit der kleinen synthetischen Sequenz ClaI-AccI, die zur Nachbildung der Sequenz des Vorläufers von Hirudin vorgesehen ist, verknüpft. Das resultierende Plasmid wird pEMR576 genannt.
    • Beispiel 13: Sekretion von Hirudin
  • 1) Transformation des Stamms EMY761 durch das Plasmid pEMR576.
  • Der Stamm EMY761 (Matα, ura3, his3, leu2) wurde durch das Plasmid pEMR576 unter Anwendung der bereits beschriebenen Technik in einen (leu&spplus;)-Stamm transformiert.
  • Ein Transformant wurde isoliert, der im folgenden als EMY761 pEMR576 bezeichnet wird.
  • 2) Hirudin-Expression
  • Als negativer Vergleichsstamm wurde ein Stamm (leu&spplus;) konstruiert, der von EMY761 abgeleitet ist und im folgenden als EMY761 (leu&spplus;) bezeichnet wird. Die verwendete Technik ist ausführlich in der Patentanmeldung FR 2 646 437 beschrieben. Die Stämme EMY761 pEMR576 und EMY761 (leu&spplus;) wurden parallel und wie im folgenden beschrieben kultiviert:
  • Die Vorkultivierung erfolgt in einem Medium der folgenden Zusammensetzung: Yeast Nitrogen Base (Difco) 0,7 %, Histidin 50 ug/ml und Uracil 50 ug/ml. Nach 24 h wird ein Medium der Zusammensetzung Yeast Nitrogen Base (Difco) 0,7 %, Ethanol 1 %, Casamino acids 0,5 %, Uracil 100 ug/ml, Glycerin 3 % und Galactose 1 %, mit den Kulturen mit 10&sup5; Zellen beimpft.
  • Nach 72 h Kultivierung in diesem letzteren Medium trennt man durch Filtration über ein 0,2 um-Filter den Überstand von den Zellen. Die inhibierende Aktivität des Überstands auf Thrombin wird unter Verwendung des in FR 2 646 437 beschriebenen kolorimetrischen Tests (proteolytische Aktivität von Thrombin auf ein synthetisches Substrat, Chromozym TH, kommerziell von Boehringer Mannheim erhältlich) gemessen.
  • Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der quantitativen Bestimmungen, angegeben in Mikrogramm Hirudin pro Milliliter Überstand, bei einer optischen Dichte von 1, was 0,3 10&sup7; Zellen/ml entspricht. Stamm nicht nachweisbar
  • Es zeigt sich demnach, daß Hirudin unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Promotors sezerniert werden kann.
  • Der Stamm EMY761 pEMR576 wurde bei der Collection Nationale de Culture de Micro-organismes CNCM -Institut Pasteur - Frankreich, unter der Hinterlegungsnummer I-1022 hinterlegt.

Claims (10)

1. Künstlicher Promotor zur Expression von Proteinen in Hefe,
dadurch gekennzeichnet, daß er enthält:
- eine Teilsequenz stromaufwärts der TATA-Box der Promotorsequenz des GAL7-Gens von Saccharomyces cerevisiae, die die Stromaufwärts-Aktivierungssequenzen UAS1 und UAS2 enthält,
- eine Teilsequenz der Sequenz eines ADH&sub2;-Promotors, die die TATA-Box und die Initiationsregion der Transkription enthält.
2. Promotor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilsequenz der GAL7-Promotorsequenz von Saccharomyces cerevisiae die folgende Sequenz oder eine der Teilsequenzen dieser Sequenz ist:
3. Promotor nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilsequenz der Sequenz eines ADH&sub2;-Promotors, die die TATA-Box und die Initiationsregion enthält, die folgende Sequenz oder eine der Teilsequenzen dieser Sequenz ist:
4. Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er die folgende Sequenz enthält:
5. Expressionsvektor für Hefe, der ein interessierendes Gen trägt sowie Mitteln aufweist, die für die Expression, die Replikation und die Selektion transformierter Zellen erforderlich sind, dadurch gekennzeichnet, daß das interessierende Gen unter der Kontrolle des Promotors nach einem der Ansprüche 1 bis 4 steht.
6. Expressionsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das interessierende Gen ein rekombinantes Gen ist, das die Uratoxidase codiert.
7. Expressionsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das interessierende Gen ein rekombinantes Gen ist, das ein menschliches Cytokin codiert.
8. Expressionsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das interessierende Gen ein rekombinantes Gen ist, das Hirudin codiert.
9. Saccharomyces-cerevisiae-Stamm, dadurch gekennzeichnet, daß er durch einen Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 5 bis 8 transformiert ist.
10. Verfahren zur Herstellung eines interessierenden Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß es die Kultivierung eines Saccharomyces-cerevisiae- Stamms nach Anspruch 9 in Gegenwart von Galactose umfaßt.
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