DE3722884A1 - Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod) - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Human Mn-Superoxiddismutase (hMn-SOD), die DNA-Sequenzen, die für dieses Enzym codieren, geeignete Vektoren, die diese DNA-Sequenzen enhalten und Wirtszellen, die diese DNA-Sequenzen exprimieren können, sowie das Enzym hMn-SOD selbst. Vorschläge zur Verwendung dieses Enzyms werden außerdem beschrieben.

Als Folge verschiedener biochemischer Prozesse in biologischen Systemen (z. B. Redoxprozesse in der Atmungskassette, Oxydationen im Cytoplasma) werden bekannterweise laufend O^-₂-Radikale gebildet, die hochcytotoxisch sind und zu Gewebezerstörungen führen können. Bei pathologischen Situationen, z. B. im Verlauf rheumatisch bedingter Erkrankungen, werden Degradationen von Collagen und Synovialflüssigkeit durch solche Radikale diskutiert (Pasquier, C. et al., Inflammation 8, 27-32, 1984). Eukaryotische Zellen enthalten zwei Formen von Superoxiddismutasen, von denen die eine vornehmlich in Cytosol (Cu/Zn-SOD) und die andere hauptsächlich in den Mitochondrien (Mn-SOD) vorliegen. In Lebermitochondrien wurde gefunden, daß Mn-Enzym in der Matrix einschließlich der inneren Membran lokalisiert ist, obwohl die Mn-SOD auch im Cytosol der Leberzellen nachgewiesen wurde (Mc Cord J. M. et al., In: Superoxide and Superoxide Dismutases (A. M. Michelson, J. M. Mc Cord, I. Fridovich, eds.) Acedemic Press, N. Y., 129-138, 1977).

In Prokaryoten existiert neben einer Mn-SOD noch eine Fe-SOD. Letztere wurde auch in Algen und Protozoen sowie in einigen Pflanzenspezies nachgewiesen (Bridges, S. M., Salin, M. L., Plant Physiol. 68, 275-278, 1981). Diese hochaktiven Enzyme katalysieren die Disproportionierung O^-₂+O^-₂+2H⁺₄H₂O₂+O₂ und verhindern durch diese Dismutation der Superoxidradikale deren Anreicherung und somit deren zellschädigende Wirkung. Neben dem endoplasmatischen Retikulum der Leber können die mitochondrialen Membranen als einer der wichtigsten Orte der O^-₂-Entstehung in tierischen Zellen angesehen werden, so daß es nicht verwundert, daß Mitochondrien ihrer eigene, spezielle SOD(Mn-SOD) zur Verfügung haben.

Das Strukturgen einer prokaryotischen Mn-SOD (E.coli) wurde cloniert und das chromosomale sodA-Gen lokalisiert (Touati, D., J. Bact. 155, 1078-1087, 1983).

Die 699 bp lange Nuleotidsequenz einer mitchondrialen Hefe Mn-SOD konnte aufgeklärt und die Primärstruktur sowohl des Precursors als auch des maturen Proteins davon abgeleitet werden - mit Molekulargewichten von 26123 Da für den Precursor und 23059 Da für das mature Protein (Marres, C. A. M. et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161 (1985). Somit unterscheiden sich die Mn - und Cu/Zn-SOD (MG=14893, EP-A 1 38 111) in ihren Melokulargewichten deutlich.

Die vollständige Aminosäuresequenz der Mn-SOD aus Menschenleber wurde von Barra, D. publiziert, wonach die hMn-SOD aus 196 Aminosäuren zusammengesetzt sein soll (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984). Die Human Cu/Zu-SOD aus Erythrocyten besteht demgegenüber aus 153 Aminosäuren (Jabusch, J. R., et al., Biochemistry 19, 2310-2316, 1980) und zeigt keine Sequenzhomologien zur hMn-SOD) (Barra. D. et al., siehe oben).

Generell wird den Superoxiddismutasen eine Schutzfunktion gegenüber bestimmten Endzündungsprozessen zugesprochen. Insbesondere soll eine Difizienz an Mn-SOD bei der Entwicklung der rheumatoiden Arthritis eine Bedeutung zukommen (Pasquier, C. et al., siehe oben). Ein protektiver Effekt der SOD gegen alkoholinduzierte Leberschädigungen wird ebenfalls angenommen (Del Villano B. C. et al., Science 207, 991-993, 1980).

Die Klonierung und Expression einer Human-SOD ist nur für die Human Cu/Zn-SOD aus Menschenleber bekannt (EP-A 1 38 111).

Anhand der vorgenannten essentiellen Eigenschaften der Superoxiddismutasen, insbesondere der hMn-SOD, ist ein Bedarf für den therapeutischen und/oder diagnostischen Einsatz zu erwarten. Dabei ist es vorteilhaft, zu diesem Zweck specieseigene, d. h. humane Mn-SOD in homogener Form und in ausreichenden Mengen zur Verfügung zu haben. Die sich daraus ableitende Zielvorstellung ist, zu erwartende immunologische Reaktionen z. B. nach therapeutischem Einsatz, zu minimieren oder zu verhindern.

Erst die Entwicklung von Technologien zur Rekombination von Fremd-DNA mit Vektor-DNA mit der Möglichkeit, auch erstere in Mikroorganismen stabil zu etablieren und zu exprimieren, gestattet es, homogene Proteine tierischer oder humaner Herkunft in großen Mengen bereitzustellen. Hierbei soll ein anderes Ziel erreicht werden, nämlich, daß das damit hergestellte Enzym - die hMn-SOD - ein gegenüber der authentischen genuinen hMn-SOD charakteristisches biologisches Aktivitätsspektrum zeigt.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, mit Hilfe gentechnologischer Verfahren erstmals die für dieses Enzym codierende DNA-Sequenz zu finden bzw. darzustellen und erstmals aufzuzeigen, nach welchen Methoden diese Sequenz erhalten werden kann.

Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine aus Humanzellen plazentalen Ursprungs gewonnene cDNA-Genbank mit synthetisch hergestellten DNA-Sondenmolekülen durchsucht wurde und dadurch das für hMn-SOD codierende Gen isoliert werden konnte. Um das Gen für hMn-SOD zu erhalten, kann nach bekannten Methoden die mRNA aus solchen Zellen isoliert werden, die das gewünschte Enzym produzieren. Als Ausgangsmaterial sind verschiedene, z. B. metabolisch aktive drüsige Gewebe wie z. B. Leber oder Plazenta geeignet. Nach Herstellung der cDNA, die nach bekannten Methoden durch geprimte Synthese mit reverser Transkriptase anhand der isolierten mRNA erhalten werden kann, nachfolgendem Einbau in einen geeigneten Vektor und Amplifikation zu einer vollständigen cDNA-Genbank, kann diese mit einer definierten, radioaktiv markierten DNA-Sonde oder einer Mischung aus verschiedenen solcher Sonden durchsucht werden. Um die Degeneration des genetischen Codes zu berücksichtigen werden vorzugsweise definierte DNA-Sondenmischungen verwendet, die alle möglichen Nukleotidvariationen für ein und dieselbe Aminosäure repräsentieren bzw., die derart ausgewählt werden, daß die Anzahl der zu synthetisierenden DNA-Sonden einer Mischung möglichst gering und die Homologie zur gesuchten hMn-SOD DNA-Sequenz möglichst hoch ausfällt. Ein weiteres Auswahlkriterium für die Synthese von DNA-Sonden kann darin bestehen, daß diese komplementär sind zu mindestens zwei unabhängigen Regionen, beispielsweise nahe dem 3′- und 5′-Ende der putativen Gensequenz. Dadurch können anhand von mindestens zwei getrennten Hybridisierungen Klone identifiziert werden, die gegen beispielsweise beide unabhängige DNA-Sonden positive Signale zeigen. Diese Klone können dann vorzugsweise für die Isolierung des hMn-SOD Gens benutzt werden, da von ihnen zu erwarten ist, daß sie entweder einen wesentlichen Teil oder das komplette Gen für hMn-SOD enthalten.

Die besonderen DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen DNA-Sonden verwendet wurden, wurden anhand der von Barra, D. et al. publizierten Aminosäuresequenz der Human Mn-SOD aus Lebergeweben (Barra, D. et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983) abgeleitet. Insbesondere können vorzugsweise zwei Regionen der putativen hMn-SOD DNA-Sequenzen verwendet werden, die für mindestens fünf Aminosäurereste, vorzugsweise für 8 Aminosäurereste codieren, wobei eine DNA-Sondenlänge von mindestens 14, vorzugsweise 23 Basen vorteilhaft ist. Besonders vorteilhaft ist es, wenn eine DNA-Sonde komplementär ist zu jener, abgeleiteten hMn-SOD DNA-Sequenz, deren genetische Information kolinear ist mit den Aminosäureresten 39 bis 46 und eine zweite DNA-Sonde komplementär ist zu der entsprechenden DNA-Region, die für die Aminosäurereste 200 bis 207 der bekannten Aminosäuresequenz codiert. Ebenso können natürlich aus DNA-Sequenzen als Sonden eingesetzt werden, die anhand anderer Mn-Superoxiddismutasen abgeleitet werden können.

Mit Hilfe einer solchen DNA-Sonde können positive Klone erhalten werden, aus denen eine cDNA-Sequenz nach folgender Formel Ia, isoliert werden kann, die einen großen Anteil einer für hMn-SOD codierenden Region enthält:

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die gefundene cDNA für eine Aminosäuresequenz codiert, die sich von der publizierten Aminosäuresequenz (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984) in einigen Resten und in ihrer Länge voneinander unterscheidet. Die gefundenen Unterschiede dieser Sequenz zur "Barra-Sequenz" betreffen die Aminosäure-Positionen, 42, 88, 109 und 131 (jeweils Glu anstatt Gln) sowie zwei zusätzliche Aminosäure Gly und Trp zwischen Position 123 und 124, so daß die erfindungsgemäße DNA-Sequenz einer hMn-SOD von 198 Aminosäuren entspricht.

Völlig unerwartet war auch, daß andererseits eine für hMn-SOD codierende cDNA isoliert werden konnte, die eine Aminosäuresubstitution an Position 29 bedeutet (Codon für Gln anstatt für Lys) und somit in diesem Punkt einen weiteren Unterschied "zur Barra-Sequenz" und zur Formel Ia aufweist, entsprechend Formel Ib:

Geht man davon aus, daß die Barra-Sequenz richtig analysiert worden ist, kann anhand der erfindungsgemäßen Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenz die Möglichkeit eingeräumt werden, daß hiermit erstmals und überraschend die mögliche Existenz verschiedener Gene oder deren allele Ausprägungsformen oder Isoenzyme für hMn-SOD aufgezeigt wird.

Da cDNA tragende Klone erhalten werden können, denen das für das komplette hMn-SOD Gen notwendige Ende fehlt, war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung des kompletten Gens für hMn-SOD.

Die Lösung dieser Aufgabe kann nach verschiedenen, bekannten Strategien erfolgen. Beispielsweise kann die erhaltene Sequenz selbst als DNA-Sonde eingesetzt und damit die cDNA-Bank nochmals durchsucht werden, um ein komplettes Gen bzw. eine cDNA mit dem jeweils fehlenden Ende zu finden oder die erhaltene DNA-Sequenzen kann als Hybridisierungssonde gegen eine genomische Bank verwendet werden, um nach Identifizierung das komplette hMn-SOD Gen zu isolieren.

Oder man bedient sich der Möglichkeit, Oligonukleotide zu synthetisieren, deren Nukleotidsequenz dem fehlenden Ende der hMn-SOD entspricht und mit Hilfe dieser, nach geeigneter Linker-Ligation, die vollständige cDNA für hMn-SOD zu erhalten. Diese Methode besitzt den Vorteil, daß beispielsweise eine für hMn-SOD codierende DNA erhalten werden kann, deren 5′-Ende direkt mit dem Startcodon (ATG) beginnt.

Als besonders geeignet, diese Aufgabe zu lösen, erwies sich für die Komplettierung der beispielsweise ab Aminosäure 22 oder 26 codierenden, erfindungsgemäßen cDNAs die DNA-Sequenz der Formel II, beginnend mit dem 5′-Startcodon ATG und endend mit dem Codon für Aminosäure 31 (His, wobei AAG [Lys]=1) unter Zugrundelegung der bekannten Codonpräferenzen wie sie beispielsweise für die Hefe Gültigkeit besitzen (Sharp, P. M. et al., Nucl. Acids. Res. 14 (13), 5125-5143, 1986).

Ebenso können andere bekannte synonyme Codons für die Komplettierung des hMn-SOD Gens oder zur in vitro Synthese des gesamten Gens verwendet werden, z. B. solche, die eine optimale Codon-, Anticodon- Wechselwirkung in Bakterien, z. B. E.coli, erleichtern und dort die Effizienz der Tanslation erhöhen (Grosjean, H. Fiers, W., Gene 18, 199-209, 1982; Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151, 389-409, 1981) oder solche Codons, die den genuinen Verhältnissen in Säugetierzellen entsprechen (Grantham, R. et al., Nucleic Acid Research 9, 43-47, 1981). Letztere können vorzugsweise zur Transformation und nachfolgend zur Expression in Säugetierzellen eingesetzt werden.

Es ist prinzipiell möglich, den Methioninrest, der durch das Startcodon ATG kodiert wird und dem reifen hMn-SOD, beginnend mit der ersten Aminosäure Lysin, vorangestellt ist, nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise mit CNBr oder CNCl, abzuspalten. Da aber im reifen Enzym hMn-SOD weitere interne Methioninreste vorkommen können z. B. an Positionen 23 oder 192 - kann eine solche Vorgehensweise nicht durchführbar sein, so daß in diesem Fall der zusätzliche N-terminale Methioninrest erhalten bleibt, ohne Einfluß auf die biologische Aktivität der hMn-SOD.

Es können jedoch auch enzymatische Spaltungen vorgesehen werden, wobei bekannterweise geeignete synthetische Linker eingesetzt werden können, da zu erwarten ist, daß sich Codons für entsprechende, spezifische Aminosäuren an den gewünschten Positionen auf dem Vektor, der die hMn-SOD cDNA enthält, befindet. Z. B. sind Arg oder Lys-Reste für eine tryptische Spaltung zu nennen bzw. man bedient sich allgemein Codons, die für Protease-empfindliche Aminosäuren codieren. Diese können vor oder hinter dem Start-Codon positioniert werden oder innerhalb der codierenden Region.

Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, mit Hilfe gentechnologischer Verfahren die für hMn-SOD codierende Sequenz in geeigneten Wirtszellen erstmals zur Expression zu bringen, das homogene Enzym hMn-SOD noch solchen Verfahren erstmalig herzustellen, zu isolieren und in reiner Form bereitzustellen und die dafür erforderliche Vorgehensweise erstmals zu beschreiben.

Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe dadurch gelöst, indem die für hMn-SOD codierenden DNA-Sequenzen, beispielsweise der Formeln IIIa oder IIIb.

gegebenenfalls mit entsprechenden Signal- oder Kontrollsequenzen versehen, in geeignete Vektoren inseriert und damit geeignete Wirtszellen transformiert wurden. Nach Kultivierung der transformierten Wirtszellen werden die gebildeten Polypeptide nach an sich bekannten Verfahren isoliert und gereinigt. Die erhaltenen Polypeptide entsprechen den nachfolgenden Formeln IVa und IVb.

Die Sequenz gemäß Formeln IIIa und IIIb eignen sich besonders zur Herstellung von nicht-glykolisierter hMn-SOD der Formeln IVa und IVb in Mikroorganismen, insbesondere in E.coli oder S. cerevisiae. Das Problem der Glykosylierung beispielsweise in Hefe kann dadurch umgangen werden, daß man sich Mutanten bedient, die Defizient sind in der Glykosylierung von Proteinen (alg Mutanten) (z. B. Huffaker, T. C., Robbins P. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7466-7470, 1983).

Falls es notwendig oder sinnvoll erscheint, kann dem kompletten hMn-SOD Gen, beispielsweise gemäß Formeln IIIa oder IIIb eine Leader- bzw. Signalsequenz direkt dem ersten Codon der ersten N-terminalen Aminosäure der reifen hMn-SOD bzw. vor dem Startcodon ATG vorangestellt werden. Hiermit kann erreicht werden, daß die hMn-SOD aus der Wirtszelle transportiert und leicht aus dem Kulturmedium isoliert werden kann.

Derartige Signalsequenzen sind beschrieben worden; sie codieren für einen meist hydrophoben Proteinanteil, der durch posttranslationale Modifikationsprozesse in der Wirtszelle abgespalten wird (Davis, D. B., Tai. P.-C., Nature 283, 433-438, 1980; Perlman, D., Halvorson, H. O., J. Mol. Biol. 167, 391-409, 1983). Wenn vor die erste Aminosäure der hMn-SOD ein ATG-Codon konstruiert worden ist, kann ein Genprodukt erhalten werden, das vor dem Lysin ein N-terminales Methionin enthält. Daß Signalsequenzen von Prokaryoten verwendet werden, um Protein in das Periplasma zu sekretieren und korrekt zu prozessieren, ist bekannt (z. B. Davis, B. D., Tai, P.-C., 1980).

Selbstverständlich ist es nach Isolierung und Klonierung der hMn-SOD DNA-Sequenz möglich, das durch diese Sequenz codierte Enzym spezifisch zu modifizieren. Enzymmodifikationen können beispielsweise über gezielte in vitro Mutationen mit synthetischen Oligonukleotiden erfolgen, wodurch die katalytischen Eigenschaften der hMn-SOD beeinflußt und neuartige enzymatische Aktivitäten geschaffen werden können. Die grundlegenden methodischen Schritte zur Durchführung derartiger Proteinmanipulationen sind bekannt (z. B. Winter, G. et al., Nature 299, 756-758, 1982; Dalbadie - Mc Farland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409-6413, 1982).

Für die Klonierung, d. h. Amplifikation und Präparation, des hMn-SOD Gens kann E.coli verwendet werden, vorzugsweise E.coli C600 (Nelson et al. Virology 108, 338-350, 1981) oder JM 101, bzw. E.coli-Stämme mit mindestens einem der bekannten sup-Genotypen. Die Klonierung kann aber auch in Gram-positiven Bakterien wie z. B. B. subtilis erfolgen. Derartige Systeme sind vielfach beschrieben.

Als geeignete Wirte für die Expression des erfindungsgemäßen hMn-SOD Gens kommen sowohl Mikroorganismen als auch Kulturen multizellulärer Organismen in Frage.

Unter Mikroorganismen sind Prokaryoten, d. h. Gram-negative oder Gram-positive Bakterien, und Eukaryoten, wie Portozoen, Algen, Pilze bzw. höhere Protisten, zu verstehen. Von den Gram-negativen Bakterien sind besonders die Enterobacteriaceae, z. B. E.coli, von den Gram-positiven die Bacillaceae und apathogenen Micrococcaceae, z. B. B. subtilis und Staph. carnosus, von den Eukaryoten die Ascomyceten insbesondere die Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, bevorzugte Wirte.

Für einzellige Mikroorganismen stehen eine Vielzahl an Ausgangsvektoren zur Verfügung, die sowohl plasmidischen als auch virales Ursprungs sein können. Diese Vektoren können in einfacher Kopienzahl oder als Multicopy-Vektoren vorliegen. Derartige Vektoren, die zur Klonierung und Expression der erfindungsgemäßen hMn-SOD wie allgemein für eukaryotische DNA-Sequenzen geeignet sind, werden in vielen Publikationen und Manuals beschrieben (z. B. Maniatis, T. et al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Glover, D. M. (ed.) DNA Cloning Vol. I, II, 1985) und sind kommerziell erhältlich.

Im allgemeinen können Plasmid-Vektoren, die in der Regel einen Replikationsursprung und Kontrollsequenzen für die Transkription, Translation und Expression enthalten, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Diese Sequenzen sollten aus Spezies stammen, die kompatibel mit den Wirtszellen sind. Der Vektor trägt üblicherweise neben einer Replikationsstelle zusätzlich Erkennungssequenzen, die es ermöglichen, in transformierten Zelle phänotypisch zu selektionieren. Die Selektion kann entweder durch Komplementation, Suppression oder durch Inaktivierung eines Markers erfolgen. Hinsichtlich der beiden erstgenannten Verfahren sind auxotrophe Mutanten von Bakterien und Hefen, die defizient sind für ein essentielles Stoffwechselprodukt, oder Nonsense-Mutanten, in denen es bei der Translation des betroffenen Gens zum Kettenabbruch kommt. Verschiedene Suppressor-Gene, z. B. supD, E, F (supprimieren UAG), supC, G (supprimieren UAG oder UAA) sind bekannt.

Beim dritten Verfahren trägt der Vektor ein Resistenz-Gen gegen ein oder mehrere cytotoxische Agenzien, wie z. B. Antibiotika, Schwermetalle. Durch Insertion einer fremden DNA in solch ein Marker-Gen wird dieses inaktiviert, so daß der neu entstandene Phänotyp vom ursprünglichen Phänotyp unterschieden werden kann.

Zum Beispiel kann E.coli mit pBR322 transformiert werden, ein Plasmid das aus E.coli Species stammt (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und liefert damit einfache Mittel, transformierte Zellen zu identifizieren, indem durch Klonieren in beispielsweise die PstI-Stelle im β-Lactamase-Gen der Phänotyp Ap^r, Tc^r zu Ap^s, Tc^r konvertiert wird. Andere Verfahren sind gleichsam anwendbar, wofür beispielsweise die lacZ-Geninaktivierung bei λ- und M 13-Vektoren sowie bei verschiedenen Plasmiden (z. B. pUC, pUR) bedeutend ist. Diese sehr vielfältigen Selektionssysteme sind altbekannt und enstprechend liegt darüber eine Fülle an Literatur vor.

Neben solchen Selektionsmarkern müssen derartige Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, Signalsequenzen aufweisen, die die korrekte Initiation und Termination der Transkription gewährleisten. Für die korrekte Transkription des hMn-SOD Gens können daher diese Vektoren eine bakterielle oder eukaryotische Transkriptionseinheit enthalten, bestehend aus einem Promotor, der kodierenden Region mit dem hMn-SOD Gen und des sich daran anschließenden Terminators. Entsprechend der Natur der Transkriptionseinheiten können diese konservierte Prototyp-Sequenzen wie z. B. Pribnow-Box oder TTG-Sequenz oder aber CAAT-Box, TATA-Box, die bekannten Terminationssignale (z. B. AATAAA, TATGT), sowie mindestens ein Stop-Codon enthalten, wobei vorzugsweise hinsichtlich des Wirtes homologe Promotoren und Terminatoren verwendet werden. Die gebildete mRNA enthält üblicherweise eine 3′poly(A)-Sequenz und/oder eine 5′cap-Struktur. Für die Translation des hMn-SOD Gens bedarf es einer ribosomalen Bindungsstelle (RBS), bestehend aus Shine/Dalgarno (S/D)-Sequenz und einem dazu in definiertem Abstand von allgemein 3 bis 12 Nukleotiden stehendem Initiationscodon sowie mindestens einem Stop-Codon. Alternativ können RBSs synthetisch hergestellt werden, wodurch die Homologie mit dem 3′-Ende der 16S rRNA erhöht werden kann (Jay, E. et al., Nucleic Acids Res. 10, 6319-6329, 1982).

Insbesondere bei eukaryotischen Expressionssystemen (z. B. S. cerevisiae) sollten vorzugsweise Regulationssysteme für die Translation wirtseigenem Ursprungs benutzt werden, da in Hefen keine den Prokaryoten analogen Verhältnisse (Homologie der S/D-Sequenz mit dem 3′-Ende der 16S rRNA) vorliegen und die Signale bzw. die RBS für die Initiation der Translation auf eine etwas andere Weise als bei Prokaryoten definiert sind (z. B. Kozak, M., Nucleic Acids Res. 9, 5233-5252, 1981; Kozak, M. J. Mol., Biol. 156, 807-820, 1982).

Vorzugsweise besitzt der Klonierungs- oder Expressionsvektor nur eine Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle, die entweder im Ausgangsvektor a priori vorliegt oder nachträglich über entsprechende Linker eingeführt werden kann. Linker können entweder chemisch leicht synthetisiert werden oder sind kommerziell erhältlich.

Häufig benutzte Hefe-Promotoren bei der Herstellung von entsprechenden Expressionsplasmiden beinhalten solche Promotoren, die im Hefesystem die Expression besonders effizient steuern, wie z. B. PGK Promotor (Tuite, M. F. et al., The EMBO Journal 1, 603-608, 1982; Hitzeman, R. A. et al., Science 219, 620-625, 1983), PH05 Promotor (Hinnen, A., & Meyhack, B., Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 101-117, 1982; Kramer, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 367-370, 1984), GAPDH Promotor (Urdea, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7461-7465, 1983), GAL10 Promotor (Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression 83-117, 1983), Enolase (ENO)-Promotor (Holland, M. J. et al., J. Biol. Chem. 256, 1385-1395, 1981), α-Faktor Promotor (Bitter, G.-A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5330-5334; Yakota, T. et al., Miami Winter Symp. 17. Meet. Adv. Gene Technol. 2, 49-52, 1985)) oder der ADHI Promotor (Ammerer, G., Methods in Enzymology 101, 192-201, 1983; Hitzeman, R. A. et al., Nature 293, 717-722, 1981).

Auch sind Promotoren anderer glykolytischer Enzyme (Kawasaki und Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108, 1107-1112, 1982) geeignet, wie Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphat Isomerase, Phosphoglucose Isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide können die mit diesen Genen assoziierte Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressions-Vektor am 3′-Ende der zu exprimierenden Sequenz eingesetzt werden, um Polyadenylierung und Termination der mRNA vorzusehen. Andere Promotoren, die zudem noch den Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Promotor-Regionen der Alkohol-Dehydrogenase-2, des Isocytochrom C, der abbauenden Enzyme, die mit dem Stickstoff-Metabolismus gekoppelt sind, die oben erwähnte Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) und der Enzyme, die für die Metabolisierung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Promotoren, die durch den Hefe Mating Typ Locus reguliert werden, beispielsweise Promotoren der Gene BARI, MECI, STE2, STE3, STE5 können bei temperaturregulierten Systemen durch die Verwendung von temperaturabhängigen sir Mutationen eingesetzt werden. (Rhine, Ph. D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory).

Diese Mutationen beeinflussen die Expression der ruhenden Mating Typ Kassetten von Hefen und dadurch indirekt die Mating Typ abhängigen Promotoren. Generell ist jedoch der Plasmid-Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, originäre Replikations- und Terminationssequenzen enthält, geeignet.

Für den Fall, daß die Expression von hMn-SOD in Bakterien erfolgen soll, sind vorzugsweise solche Promotoren einzusetzen, die eine hohe Syntheserate an mRNA bedingen und die darüberhinaus induzierbar sind. Bekannte und verwendete Promotoren beeinhalten die Beta-Lactamase-(Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979) inclusive des UV5-Promotors (Silverstone, A. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66, 773-779, 1970) und Tryptophan (trp) Promotor-Systeme (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); Europa-Anmeldung, Offenlegungs-Nr. 00 36 776). Darüberhinaus sind auch andere mikrobielle Promotoren entwickelt und benutzt worden. Die Gen-Sequenz für hMn-SOD kann beispielsweise unter der Kontrolle des Lambda-P_L-Promotors transkribiert werden. Dieser Promotor ist bekannt als einer der besonders starken, steuerbaren Promotoren. Die Steuerung wird möglich durch einen thermolabilen Repressor cI (z. B. cI857), von dem benachbarte Restriktionsschnittstellen bekannt sind. Daneben können auch der Promotor der alkalischen Phosphatase aus E.coli (Ohsuye, K. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1283-1294, 1983) und hybride Promotoren, wie z. B. den tac-Promotor (Amann, E. et al., Gene 25, 167-178, 1983; De Boer, H. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25, 1983). Über die Anwendung solcher tragbaren Promotoren (lacuv5, lacZ SD, tac) bzw. über Vektoren zur Herstellung fusionierter und nicht-fusionierter eukaryotischer Proteine in E.coli, kann auch in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, insbesondere S. 412f nachgelesen werden. Die Expression und Translation einer hMn-SOD Sequenz in Bakterien kann auch unter Kontrolle anderer Regulationssysteme, die als "homolog" zu dem Organismus in seiner untransformierten Form gelten können, ablaufen. Beispielsweise können auch Promotor-Operator-Systeme wie Arabinose-Operator, Colicin El-Operator, Galactose-Operator, alkalische Phosphatase-Operator, trp-Operator, Xylose A Operator, u. ä. oder Teile davon verwendet werden.

Zur Klonierung oder Expression von hMn-SOD in Bakterien, beispielsweise in E.coli, oder in Hefen, beispielsweise in S. cerevisiae, stehen gutbekannte Vektoren zur Verfügung, von denen für die erstgenannten Wirtssysteme verteilhaft die pBR-(Bolivar, F. et al., Gene 2, 95-113, 1977), pUC-(Vieira, I., Messing. I., Gene 19, 259-268, 1982) pOP-(Fuller, F., Gene 19, 43-54, 1982), pAT-(Windass, J. D. et al., Nucleic Acids Res. 10, 6639-6657, 1982) pHV-Plasmide (Ehrlich, S. D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1433-1436, 1977), Lambda-Vektoren inclusive Plasmide (Brenner, S. et al., Gene 17, 27-44, 1982), Cosmide (Collins, J., Hohn. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4242-4246, 1979) und die andere literaturbekannten Vektoren (z. B. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, 1982), insbesondere pBR- und pUC-Derivate, beispielsweise pBR322, pUC18 verwendet werden können.

Als Expressionsvektoren in Hefen bieten sich integrierende (YIp), replizierende (YRp) und episomale (YEp) Vektoren (Struhl, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035-1039, 1979; Stinchcomb, D. T. et al., Nature 282, 39-43, 1979; Hollenberg, C. P., Current Topica in Microbiology and Immunology 96, 119-144, 1982) an, vorzugsweise YE13 (Broach, J. R. et al., Gene 8, 121-133, 1979), YIp5 (Struhl, K. et al., 1979 s. o., ATCC 37061) sowie pJDB207 (DSM 3181) oder pEAS102. Der Vektor pEAS102 kann erhalten werden, indem YIp5 mit PstI teilweise und mit BamHI vollständig verdaut und das isolierte 4,3 kb Fragment (enthält das URA3 Gen) mit dem 4,4 kb BamHI/PstI-fragment von pJDB207 ligiert werden.

Zusätzlich zu Mikroorganismen sind Kulturen multizellulärer Organismen ebenfalls geeignete Wirte für die Expression von hMn-SOD. Im Prinzip ist jede dieser Kulturen einsetzbar, ob von Wirbeltier- oder wirbellosen Tierzellkulturen. Größtes Interesse besteht jedoch an Wirbeltier-Zellen, so daß die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebe-Kultur) in den letzten Jahren zu einer routinemäßigen Methode wurde. (Tissue, Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors, 1973). Beispiele solche nützlichen Wirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Goldhamster-Eierstock (CHO)-Zellen und W138, BHK, COS-7 und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für diese Zellen enthalten üblicherweise einen Replikationsursprung, einen Promotor, der vor der zu exprimierenden hMn-SOD lokalisiert ist, eine notwendige Ribosomenbindungsstelle, RNA-Spleißstelle, Polyadenylierungsstelle und transkriptionelle Terminations-Sequenzen.

Bei der Verwendung von Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressions-Vektoren oftmals aus viralem Material vorgesehen. Beispielsweise stammen die überlicherweise verwendeten Promotoren aus Papovaviren wie Polyoma-, Papilloma Viren, Simian Virus 40 (SV40) und aus Retroviren, Adenovirus Typ 2. Die frühen und späten Promotoren des SV40 und deren Anwendungen sind vielfältig beschrieben. Außerdem ist es möglich und oft empfehlenswert, Promotor- oder Kontroll-Sequenzen oder Spleißsignale zu verwenden, die mit den gewünschten Gensequenzen ursprünglich verknüpft sind, vorausgesetzt, die Kontrollsequenzen sind kompatibel zu den Wirtszellsystemen. So sind SV40-Vektoren bekannt, in denen eine exogene eukaryotische DNA mit ihren eigenen Promotorsequenzen und Spleißsignalen neben dem späten SV40-Promotor ein stabiles Transkript liefern.

Ein Replikationsursprung kann entweder durch eine entsprechende Vektorkonstruktion erhalten werden, so daß diese einen exogenen Startpunkt, beispielsweise aus SV40 oder anderen viralen Quellen (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, etc.) enthält oder dieser kann durch die chromosomalen Replikationsmechanismen der Wirtszelle geliefert werden. Wird der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert, reicht die zuletztgenannte Maßnahme meistens aus.

Die Transformation der Zellen mit den Vehikeln kann durch eine Vielzahl an Verfahren erreicht werden. Beispielsweise kann sie durch Kalzium erfolgen, wobei entweder die Zellen in Magnesium gewaschen und die DNA den in Kalzium suspendierten Zellen zugegeben wird oder die Zellen werden einem Kopräzipitat von DNA und Kalziumphosphat ausgesetzt. Bei nachfolgender Genexpression werden die Zellen auf Medien übertragen, die für transformierte Zellen selektieren.

Bei intrazellulärer Produktion von hMn-SOD kann das Enzym dadurch isoliert werden, daß die Zellen nach Erreichen einer entsprechend hohen Zelldichte abzentrifugiert und danach enzymatisch oder mechanisch aufgeschlossen werden. Die Reinigung der erfindungsgemäßen hMn-SOD kann über bekannte biochemische Verfahren zur Protein- bzw. Enzymreinigung wie z. B. Dialyse, Elektrophorese, Präzipitation, Chromatographie oder Kombinationen davon erfolgen. Wenn das Enzym aus der Zelle sekretiert wird, werden analoge Verfahren zur Proteinreinigung durchgeführt, um hMn-SOD aus dem Kulturmedium in reiner Form zu erhalten.

Das mit diesen Methoden gereinigte, erfindungsgemäße hMn-SOD zeigt ein dem genuinem Enzym identisches biologisches Aktivitätsspektrum in vivo und in vitro.

Unter diesen Aktivitäten sind sowohl immunologische Eigenschaften (z. B. Kreuzreaktionen mit Antikörpern von genuiner hMn-SOD gegen die erfindungsgemäße hMn-SOD) als auch biochemische und enzymatische Aktivitäten zu verstehen. Für die biochemische und enzymatische Charakterisierung der hMn-SOD kann z. B. die Lehre von Marklund, S. (Marklund, S. & Marklund, G., Eur J. Biochem. 47, 469-474, 1974) gefolgt werden, wonach auch eine strickte Unterscheidung zwischen den Cu/Zn und Mn enthaltenden Enzymen, z. B. durch Zusatz von KCN (inhibiert Cu/Zn-SOD nicht aber Mn-SOD) oder anhand der unterschiedlichen pH-Abhängigkeit ihrer Aktivitäten gegeben ist (siehe insbesondere: Ysebaert-Vanneste, M., Vanneste, W. H., Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980).

Bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid handelt es sich nicht ausschließlich nur um das reife hMn-SOD, das im einzelnen beschrieben ist, sondern ebenfalls um jedwede Modifikation dieses Enzyms. Diese Modifikationen beinhalten z. B. Verkürzung des Moleküls am N- oder C-terminalen Ende, Austausch von Aminosäuren durch andere Reste, wodurch die Enzymaktivität nicht wesentlich verändert wird.

Gegenstand der Erfindung sind nicht nur Gensequenzen, die spezifisch für die beschriebene und beispielhaft belegte hMn-SOD codieren, sondern ebenfalls Modifikationen, die leicht und routinemäßig über Mutation, Abbau, Transposition oder Addition erhalten werden können. Jede Sequenz, die für die erfindungsgemäße hMn-SOD codiert (d. h. die das entsprechende und bekannte biologische Aktivitätsspektrum aufweist) und im Vergleich mit der gezeigten degeneriert ist, ist ebenfalls eingeschlossen; Fachleute auf diesem Gebiet sind in der Lage, DNA-Sequenzen insbesondere der codierenden Regionen zu degenerieren. Ebenso ist jede Sequenz, die für ein Polypeptid mit dem Aktivitätsspektrum der authentischen hMn-SOD codiert, und die mit den gezeigten Sequenzen (oder Teilen davon) unter stringenten Bedingungen hybridisiert beinhaltet.

Es gehört zum Stand der Technik, unter welchen definierten Bedingungen eine Hybridisierung (inclusive Vorwaschen, Prähybridisierung, Hybridisierung, Waschen) durchzuführen ist, um stringente Bedingungen zu erreichen. Für die Hybridisierung von Oligonukleotiden gegen eine Genbank ("gene bank screening") ist vorzugsweise unter den Bedingungen nach Wood, I. M. et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1582-1588, 1985) zu verfahren. Um zu testen, ob eine bestimmte DNA-Sequenz mit einer der erfindungsgemäßen, für hMn-SOD codierenden DNA-Sequenzen hybridisierten - entweder via in situ Hybridisierung gegen Plaques oder Bakterienkolonien oder via Southern-Blotting - sind die von Maniatis, T. et al., detailliert beschriebenen Methoden und Bedingungen zu übernehmen (Maniatis. T. et al., Molecular Cloning, Cold Sping Harber Laboratory, 1982, insbesondere S. 326-328 und S. 387-389). Alle vom Hintergrund sich deutlich abhebenden Signale zeigen demgemäß ein positives Hybridisierungssignal an.

Spezifischer werden die oben näher bezeichneten Aufgaben dadurch gelöst, daß aus Menschengewebe, vorzugsweise aus Gewebe der Plazenta des Menschen, die RNA präpariert wird. Während der Aufschluß von Gewebekulturzellen direkt mit heißem Phenol erfolgen kann, müssen Gewebe für diese Art der Extraktion erst in tiefgefrorenem Zustand, vorteilhafterweise in Gegenwart von pulverisiertem oder körnigem Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff, zerkleinert werden (z. B. Starmix).

Durch Phenol gebildete Aggregate zwischen mRNA und anderen RNAs können durch Formamid oder durch Erwärmen (z. B. 65°C) wieder aufgelöst werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur RNA-Isolierung ist dasjenige nach Chirgwin (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299, 1979). Die poly(A)⁺RNA kann aus dem von Protein und DNA gereinigtem Präparat zweckmäßigerweise durch Affinitätschromatographie, z. B. Poly(U)-Sepharose oder Oligo(dt)-Cellulose isoliert werden, da in der Regel eukaryotische mRNA-Populationen einen Poly(A)-Schwanz an ihrem 3′-Ende aufweisen (Aviv, H., Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1409-1412, 1972; Lindberg, U., Persson, T., Europ. J. Biochem. 31, 246-254, 1972). Zur Isolierung der poly(A)⁺-RNA kann bevorzugt nach Auffray (Auffray, C., Rougeon, F., Eur. J. Biochem. 107, 303-314, 1980) vorgegangen werden.

Eine Anreicherung der gereinigten mRNA kann dadurch erfolgen, daß die gesamte mRNA-Fraktion nach ihrer Größe aufgetrennt wird - z. B. durch Zentrifugation in einem Saccarosegradient. Die gewünschte mRNA kann z. B. über bekannte in-vitro-Proteinbiosynthese-Systeme (Retikulotyten, Oozyten von Xenopus laevis) nachgewiesen werden.

Die gereinigte mRNA oder die angereicherte Fraktion dient als Template für die Synthese des ersten Stranges der cDNA, die mit Hilfe der reversen-Transkriptase und einem Primer erfolgt. Als Primer sind entweder Oligo (dT) oder synthetische Primer einsetzbar, letztere können anhand der bekannten Aminosäuresequenz der hMn-SOD abgeleitet werden und gestatten das wiederholte Primen der reversen Transkription (Uhlen, M. et al., EMBO Journal 1, 249-254, 1982).

Bei der vorliegenden Erfindung wurde die Synthese des ersten Stranges der cDNA mit Oligo(dT)12-18 als Primer in Gegenwart von dNTPs gestartet. Für die Synthese des zweiten Stranges der cDNA können verschiedene bekannte Methoden angewendet werden, von denen auswahlweise das Primen mit einem komplementären Primer (Rougeon, F., Mach, B., J. Biol. Chem. 252, 2209-2217, 1977) das Selbstprimen anhand einer am 3′-Ende der cDNA liegenden "hairpin"-Struktur (Efstratiadis, A. et al., Cell 7, 279, 1976) oder mit einem durch RHaseH gebildeten Okazaki Fargment-ähnlichen Primer (Gubler, U., Hoffmann, B. J., Gene 25, 263, 1982) genannt sein sollen. In der vorliegenden Erfindung wurde die Methode bevorzugt, wie sie von Huynh, T. V. beschrieben wird (Huynh. T. V. et al., in DNA Cloning Vol I, (D. M. Glover ed.), chap. 2, S. 49-78, 1985). Die danach erhaltene doppelsträngige cDNA kann direkt in einem geeigneten Vektor, beispielsweise in einem Cosmid, Insertions- oder Substitionsvektor, insbesondere in einem Lambda-Vektor, vorzugsweise in λgt10 (Huynh, T. V. et al., 1985) kloniert bzw. verpackt werden. Für die Klonierung in Lambda stehen mehrere bekannte Methoden zur Verfügung, von denen beispielsweise das "Homopolymertailing über dA-dT bzw. dC-dG oder die Linker-Methode mit synthetischen Linkern genannt sein sollen (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Huynh, T. V. et al., DNA cloning Vol I (D. M., Glover ed.) 1985, 1980; Watson, C. J., Jackson, F. dto, 1985, chapter 3). Im Falle des Klonierens der erfindungsgemäßen cDNA wurde diese in die EcoRI-Stelle von λgt10 inseriert. Die in-vitro-Verpackung und Klonierung der erfindungsgemäßen cDNA bzw. die Konstruktion der cDNA-Genbank erfolgte nach Huynh, T. V. et al., 1985, S. 49-78.

Mit der erhaltenen, eine cDNA-Genbank aus Plazentagewebe repräsentierenden Phagenpopulation wurde die Amplifikation und Plaque-Reinigung durch Infektion eines geeigneten Wirts, insbesondere von E.coli, vorzugsweise von E.coli C600, bzw. unter Sicherstellung des lytischen Vermehrungszyklus von Lambda, durchgeführt.

Die cDNA-Genbank wurde mit radioaktiv markierten, synthetischen Oligonukleotiden, die anhand der publizierten Aminosäuresequenz (Barra, D. et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983) abgeleitet wurde, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durchsucht. Bei der vorliegenden Erfindung wurde das in situ Hybridisierungsverfahren nach Benton und Davis (Benton, W. D., Davis, R. W., Science 196, 180-182, 1977) angewendet. Bevorzugt wurden zwei Gemische aus je acht synthetischen 23-mer Oligonukleotiden der Formel Va und Vb, die kolinear sind mit den Aminosäuren 39 bis 46 bzw. 200-207 der von Barra, D. et al., (s. o.) publizierten Aminosäuresequenz und die die Degeneration des genetischen Codes berücksichtigen. Der jeweils letzten Base am 5′-Ende dieser DNA-Sonden fehlt die Wobble-Base für das vollständige Codon für Gln (Aminosäure 46) bzw. Glu (Aminosäure 207).
A, G, C und T stehen für die entsprechenden Nukleotide, I für Inosin.

Die Oligonukleotid-Sonden können nach an sich bekannten chemischen Syntheseverfahren hergestellt werden. Für die vorliegende Erfindung wurde ein DNA-Synthesizer Modell 381A (Applied Biosystems) verwendet.

Die Synthese aller möglichen Kombinationen dieser beiden DNA-Sonden sichert, daß mindestens eines der vorhandenen Oligonukleotide optimal mit der für die Sonde komplementären einzelsträngigen DNA-Region des gesuchten hMn-SOD Gens paart. Der Einsatz zweier unabhängiger Pools von 23-mer Oligonukleotiden vermindert die Möglichkeit, daß die "falschen" Positiven ausgewählt werden.

Nach der Isolierung in sich homogener Plaques, die anhand positiver Signale nach Hybridisierung mit den beiden 23-mer DNA-Sonden identifiziert wurden, konnten sieben rekombinante Phagen isoliert und von deren DNA 500 bis 1000 bp lange EcoRI-Fragmente sequenziert werden. Nach Sequenzanalyse dieser EcoRI-Fragmente nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977; Sanger F. et al., FEBS Letters 87, 107-111, 1978) und nach Subklonierung in die EcoRI-Stelle des M13-Vektors (Bluescirbe, Vector Cloning Systems) und Transformation in E.coli, beispielsweise E.coli JM101, konnte gefunden werden, daß die EcoRI-Fragmente cDNA-Inserts enthalten, die für hMn-SOD ab Aminosäure 22 (Klone BS5, BS8, BS9, BS13 BSXIII] bzw. ab Aminosäure 26 (Klone BS3, BS12) codieren.

Es wurde jedoch überraschenderweise auch gefunden, daß sich aus den ermittelten DNA-Sequenzen einige Abweichungen zu der Aminosäuresequenz von Barra, D. et al., (1984, s. o.) ergeben:

Die DNA-Sequenz eines 617 bp langen EcoRI-Fragments, welches aus einem der erhaltenen Klonen, z. B. BS8 isoliert werden konnte ist in Fig. 1 dargestellt. Das EcoRI-Fragment enthält eine 532 bp lange für hMn-SOD codierende Sequenz sowie eine 51 bp lange nicht-translatierte Region, inclusive eines poly(A)₃₀ Schwanzes. Anteile von Linker-Sequenzen sind bis zu den (vollständigen) EcoRI-Stellen ebenfalls dargestellt.

Die Positionen 30 bis 33 zeigen eine ThaI-Schnittstellen, an Position 367 bis 372 ist eine BamHI-Stelle zu erkennen. Überraschenderweise finden sich Codons an Positionen 53 bis 61, 155 bis 163, 176 bis 184 sowie 500 bis 508, die kolinear sind für potentielle N-Glykosylierungsstellen der entsprechenden Aminosäuren gemäß der dafür charakteristischen allgemeinen Aminosäurenanordnungen Asn-X-Thr bzw. Asn-X-Ser, wobei X beispielsweise für Valin, Histidin oder Leucin steht, wohin gegen die Cu/Zn-SOD des Cytosols nur eine solche Aminosäurekombination aufweist.

Auf die Aminosäureunterschiede gegenüber der Aminosäure-Sequenz von Barra, D. et al., (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984), die von dem erhaltenen EcoRI-Fragment abgeleitet wurden, wurde schon an früherer Stelle eingegangen.

Um die fehlenden Basen an den 3′ und/oder 5′ Termini der hMn-SOD DNA-Teilsequenz aus der cDNA-Genbank zur Herstellung eines vollständigen hMn-SOD Gens zu erhalten, können verschiedene Strategien verfolgt werden. Beispielsweise kann die erhaltene cDNA als Hybridisierungssonde gegen eine genomische Genbank eingesetzt werden, um die für das ganze Enzym kodierende Sequenz zu erhalten, oder man verfährt z. B. nach Kakidani, H. unter Verwendung synthetischer, zur mRNA komplementärer Oligonukleotide als spezifische Primer für die reverse Transkription (Kakidani, H. et al., Nature 298, 245-249, 1982). Es ist jedoch auch möglich, das fehlende Ende der cDNA-Sequenz anhand der bekannten Aminosäuresequenz (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984) chemisch zu synthetisieren und mit der gefundenen cDNA zu verbinden, wobei ein definiertes Ende erhalten wird.

Für den zuletzt genannten Weg wurde zur Herstellung der vollständigen, erfindungsgemäßen DNA-Sequenz für hMn-SOD das 5′-Ende durch zwei Oligonukleotide der Formeln VIa und VIb komplettiert, die vorteilhafterweise XhoI/XbaI - bzw. XbaI/NcoI - überstehende Enden aufweisen. Erfindungsgemäß ist am 5′-Ende des kodierenden Stranges das 3′-Ende des ADIH-Promotors berücksichtigt worden (Formel VIa).

Nach Kombination beider synthetischer Oligonukleotide der Formeln VIa und VIb, Klonierung in einen geeigneten Vektor, beispielsweise in ein entsprechend verändertes pUC18-Derivat und Hinzufügen des ThaI/EcoRI-Fragments der erfindungsgemäßen cDNA aus einem der erhaltenen Klone, dessen 5′-Ende mindestens die ThaI-Stelle aufweist, kann ein Plasmid erhalten werden, das eine vollständige cDNA des hMn-SOD Gens im richtigen Leserahmen entsprechend Formeln VIIa und VIIb enthält, ohne die ThaI-Stellen.

Die Durchsequenzierung der Klone BS5, BS9, BS13, BSXIII sowie der Klone BS3 und BS12 ergab, daß die Sequenzen der Klone BS5, BS9, BS13 und BSXIII identisch mit Klon BS8 sind. Die Klone BS3 und BS12 zeigen, wie bereits angegeben, gegenüber Klon BS8, einen Unterschied in Aminosäure 29 (CAG statt AAG bzw. Gln statt Lys, Formeln Ib, IIIb und IVb). Ansonsten besteht 100% Homologie zu Klon BS8 bis zur Base 573 des in Fig. 1 dargestellten EcoRI-Fragments (. . . TA*A ACC ACG ATC GTT ATG CTG⁵⁷³). Ab dieser Base sind beide Klone BS3 und BS12 hinsichtlich der in Formel VIIIa angegebenen 5-ut-Region identisch.

Weiterhin wurden mehrere cDNA-Klone aus einer cDNA-Genbank (Plazenta) über λgt11 isoliert. Die Herstellung dieser cDNA-Genbank erfolgte in gleicher Weise zu der in den Beispielen beschriebenen Herstellung der cDNA-Genbank aus Placenta-DNA in λgt10. Einer dieser aus λgt11 isolierten Klone, Klon 4, wurde ebenfalls wie beschrieben, in Bluescribe M13+ subkloniert. Die Sequenzierung erfolgte durch wiederholtes Priming mit den synthetischen 17mer Oligonukleotiden

Klon 4 ist bis auf Aminosäure 29 (AGG bzw. Lys) und einer . . .TCTA. . .-Sequenz am 3′-Ende im Anschluß an die Multiklonierungsstelle mit den Klonen BS3 und BS12 aus λgt10 identisch. Obwohl die analysierte DNA-Sequenz der verbliebenen 61 Basen des 5′-Endes (vor Formel Ia, Klon BS8, entsprechend Codons +1 bis +21 entsprechend Lys bis Glu) einige Basenänderungen gegenüber der abgeleiteten DNA-Sequenz (Formel II, enthalten in Formel IIIb) aufweist, ergibt die Übersetzung dieses DNA-Abschnittes keine Unterschiede zu Barra et al., 1984. Eine Leader-Sequenz vor dem ATG konnte ebenfalls analysiert werden. Die Formel IX zeigt die gefundene Sequenz von Klon 4.

Andere Klone haben unterschiedlich lange 5′-ut-Regionen.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können in verschiedenen Expressionsvektoren eingebaut und mit Hilfe der beschriebenen Kontrollelemente exprimiert werden, vorzugsweise in pES103 mit dem ADHI-Promotor (DSM 4013). pES103 wird dadurch erhalten, daß in das pUC18-Derivat pES102, welches in der HincII-Schnittstelle einen Xho-Linker enthält, das 1500 bp lange BamHI/XhoI-Fragment des ADHI-Promotors (z. B. Ammerer, G., Methods in Enzymology 101, 192-201, 1983) eingebaut wird.

Anstelle dieser ADHI-Promotor-Sequenz von ursprünglich 1500 bp kann auch ein auf ca. 400 dp Länge verkürzter ADHI-Promotor als BamHI/XhoI-Fragment verwendet werden. Den verkürzten ADHI-Promotor (ADHIk) erhält man dadurch, daß Plasmid pW323E (DSM 4016) mit BamHI/XhoI verdaut und der ADHIk-Promotor isoliert wird.

Für die korrekte Termination wird eine geeignete Terminatorsequenz, zweckmäßigerweise ein ADH-Terminator, vorzugsweise der ADHII-Terminator hinter dem hMn-SOD ligiert. Der ADHII-Terminator (Beier, D. R., Young, E. T., Nature 300, 724-728, 1982) kann über SphI-Verdauung von pMW5-ADHII (Washington Research Fundation) als 1530 bp langes Fragment und nachfolgender HincII-Verdauung als endgültiger ADHII-Terminator (329 bp) enthalten werden, oder aus Plasmid pGD2 (DSM 4014) als 336 bp langes HindIII/XbaI-Fragment.

Für die Expression in Hefe stehen verschiedene Hefevektoren zur Verfügung, in die die Expressionskassetten mit dem erfindungsgemäßen hMn-SOD Gen eingebaut werden können, vorzugsweise YEp13 (Broach, J. R. et al., Gene 8, 121-133, 1979; ATCC 37115), pJDB207 (DSM 3181, hinterlegt am 28. 12. 1984), YIp5 (Struhl, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035-1039, 1979; ATCC 37061), pEAS102 (pEAS102 kann dadurch erhalten werden, daß VIp5 mit PstI teilweise und mit BamHI vollständig verdaut wird und das das URA3 Gen enthaltende, isolierte 4,3 kb Fragment mit dem 4,4 kb BamHI/PstI-Fragment von pJDB207 ligiert wird).

Mit diesen, eine Expressionskassette mit dem erfindungsgemäßen hMn-SOD Gen tragenden Hefevektoren können geeignete Hefezellen nach bekannten Verfahren transformiert werden. Als geeignete Hefezellen für die Expression können vorzugsweise alle diejenigen angesehen werden, die defizient sind für ihre eigene, hefespezifische Mn-SOD und die ein selektierbares Hefe-Gen, wie z. B. HIS3, URA3, LEU2, SUP, um nur einige zu nennen, erhalten. Derartige Mutanten, die beispielsweise durch in vitro oder in vivo konstruierte mutierte Gene und diese über ein "Transplacement" enthalten, sind über integrative Transformation zu erhalten (z. B. Winston, F. et al., Methods in Enzymology 101, 211-228, 1983). Das zu mutierende Mn-SOD Gen der Hefe ist beispielsweise in Plasmid pL41 als BamHI-Fragment enthalten (van Loon et al., Gene 26, 261-272, 1983). Da die vollständige Sequenz dieses BamHI-Fragments bekannt ist (Marres, C. A. M. et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161, 1985), ist das Mn-SOD Gen der Hefe auch ohne pL41 zugänglich.

Die durch solche Transformanten produzierte hMn-SOD kann nach bekannten Methoden der Proteinisolierung und Proteinreinigung gewonnen werden. Der Zellaufschluß kann z. B. nach van Loon et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3820-3824, 1986) erfolgen.

Für die Expression von hMn-SOD in Bakterien, vorzugsweise E.coli, beispielsweise E.coli HB101, C600, JM101, stehen die schon erwähnten und etablierten Expressionssysteme zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen müssen zu diesem Zweck unter Kontrolle eines starken E.coli Promotors (s. o.), nicht unter einen eukaryotischen Promotor gebracht werden. Beispiele solcher bekannten Promotoren sind lac, lacuv5, trp, tac, trp-lacuv5, λP_L, ompF, bla. Die obligate Anwendung einer ribosomalen Bindungsstelle, um eine effiziente Translation in E.coli zu gewährleisten, wurde schon an früherer Stelle ausführlich beschrieben.

Zum Nachweis der Expression der hMn-SOD Aktivität durch E.coli werden die Baterien nach der Inkubation in einem geeigneten, herkömmlichen Kulturmedium aufgeschlossen und der Überstand auf hMn-SOD Aktivität, wie beschrieben (z. B. Marklund, S., Marklund, G., 1974; Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H. P. Misra und I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys. 183, 511-515, 1977; B. J. Davis, Annals of the NY Academy of Science 121, 404-427, 1964; M. Ysebaert-Vanneste and W. H. Vanneste, Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980) getestet.

Der Nachweis des exprimierten hMn-SOD-Gens kann auch durch Markierung der Proteine in Maxizellen erbracht werden. Plasmidcodierte Proteine können durch Verwendung der Maxizelltechnik (Sancar, A. et al., J. Bacteriol, 137, 692-693, 1979) selektiv in vivo markiert werden. Der E.coli Stamm CSR603 (CGSC 5830) besitzt keine DNA-Repair-Mechanismen. Durch eine geeignete UV-Strahlendosis wird das bakterielle Chromosom zerstört, einige der wesentlich kleineren und in mehreren Kopien pro Zelle vorhandene Plasmid-DNAs bleiben dagegen funktionell erhalten. Nach Abtöten aller nicht geschädigten, sich vermehrenden Zellen durch das Antibiotikum D-Cycloserin und Aufbrauchen der endogenen mRNA werden in den verbleibenden Zellen nur noch Plasmid-codierte Gene transkribiert und translatiert. Die gebildeten Proteine können durch Einbau von ³⁵S-Methionin radioaktiv markiert und nachgewiesen werden. E.coli CSR603 wird nach üblichen Verfahren mit den Expressionsplasmiden transformiert und auf ampicillinhaltigen Agarplatten auf transformierte Bakterien selektioniert. Die Präparation der Maxizellen und das Markieren der Proteine erfolgt nach der Vorschrift von A. Sancar (1979, s. o.). Als Molekulargewichtsstandard wird ein ¹⁴C-methyliertes Proteingemisch (Amersham) verwendet. Als Kontrolle wird das Plasmid, das nur den Promotor ohne das hMn-SOD-Gen enthält, eingesetzt.

Nach erfolgter Transformation des Wirtes, Expression des Gens und Fermentation oder Zellkultivierung unter Bedingungen, bei denen die erfindungsgemäßen Proteine exprimiert werden, kann das Produkt üblicherweise durch bekannte chromatographische Trennmethoden extrahiert werden, um so ein Material zu erhalten, das die Proteine mit oder ohne Leader und Tailing-Sequenzen enthält. Die erfindungsgemäße hMn-SOD kann mit einer Leader-Sequenz am N-Terminus exprimiert werden, die wie schon beschrieben, von einigen Wirtszellen entfernt werden kann. Wenn nicht, so ist, wie ebenfalls schon beschrieben, eine Abspaltung des Leaderr-Polypeptids (wenn vorhanden) erforderlich, um reifes hMn-SOD zu erhalten. Alternativ kann die Sequenz so modifiziert werden, daß das reife Enzym im Mikroorganismus direkt produziert wird. Für diesen Fall kann die Precursor-Sequenz des Hefe-Mating-Pheromons MF-alpha-1 verwendet werden, um eine korrekte "Reifung" des fusionierten Proteins und die Ausscheidung der Produkte in das Wachstumsmedium oder den periplasmischen Raum zu gewährleisten. Die "Sezernierung" der hMn-SOD in Hefemitochondrien kann dadurch erfolgen, indem direkt vor das hMn-SOD Gen die Leadersequenz für das Hefe-Mn-SOD Gen gestellt wird.

Die Reinigung der hMn-SOD aus Zellen kann nach bekannten Verfahren erfolgen.

Die gentechnisch hergestellten, erfindungsgemäßen hMn-SOD sind aufgrund des biologisch-enzymatischen Wirkungsspektrums einerseits und wegen der jetzt verfügbaren Menge an hochreinem Enzym mit höchstmöglicher immunologischer Identität gegenüber der genuinen hMn-SOD andererseits für jede Art der Prävention, Behandlung und/oder Diagnostik im Bereich von entzündlichen, degenerativen, neoplastischen oder rheumatischen Erkrankungen zur Wundheilung, bei Autoimmunkrankheiten und bei Transplantationen geeignet - bzw. zur Prävention und Therapie von Krankheiten, die mit einer Defizienz an hMn-SOD einhergehen oder kausal damit verbunden sind. Beispielsweise umfassen die klinischen Anwendungsmöglichkeiten jene, wie sie aus Bannister W. H. und Bannister J. V. (Biological ans Clinical Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase, Vol. 11B, Elsevier/North-Holland, 1980) und aus Michelson, A. M., McCord, J. M., Fridovich (Superoxide and Superoxiddismutases, Academic Press, 1977) zu entnehmen sind. Ferner sind folgende klinische Anwendungsmöglichkeiten in Betracht zu ziehen: bei Perfusionswunden, Schlaganfall, alkoholgeschädigter Leber, Frühgeborenen, evtl. Pankreatitis, akuten Atemwegserkrankungen (ARDs), Emphysem, dialysegeschädigten Nieren, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, strahleninduzierten Schäden, Sichelzellanämie.

Ebenso sind die erfindungsgemäßen hMn-SODs zur Erhöhung der Haltbarkeit von festen oder flüssigen Nahrungsmitteln geeignet. Die erfindungsgemäßen hMn-SODs können entweder systemisch oder topisch verabreicht werden, wobei sich im einzelnen Fall herkömmliche parenterale Applikationsrouten (z. B. i. v., i. m., s. c., i. a.) und für den zweiten Fall die entsprechend bekannten Darreichungsformen (z. B. Pasten, Salben, Gele, Lutsch- oder Kautabletten, Pulver, und andere die lokale Resorption des hMn-SOD-Präparates ermöglichende galenische Formulierungen und pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe) eignen. Als therapeutisch wirksamer Dosisbereich können nach individuellen Kriterien (z. B. Patienten, Krankheitsschwere etc.) beispielsweise ca. 4 mg täglich eingesetzt werden.

Legenden zu den Abbildungen:

Abb. 1: EcoRI-Fragment aus Klon BS8 mit der 532 bp langen codierenden Region ab Aminosäure 22 der reifen hMn-SOD, der 51 bp 3′-ut-Region und den Sequenzanteilen des Linkers. Die potentiellen N-Glykosylierungsstellen (überstrichen), die einzige ThaI-Stelle und die BamHI-Stelle (unterstrichen) sind angegeben.

Abb. 2: schematische Strategie zur Konstruktion von Plasmid HSOD4, welches das synthetische 5′-Ende des hMn-SOD Gens als XhoI/NcoI-Fragment enthält.

Abb. 3: Restriktionskarten der Plasmide HSOD2 und HSOD3, sowie von dem daraus konstruierten Plasmid HSOD4.

Abb. 4: Konstruktion eines Plasmid (HSOD6) mit der vollständigen cDNA für hMn-SOD, als XhoI/EcoRI-Fragment.

Abb. 5: Präparation des ThaI/EcoRI-Fragments der hMn-SOD cDNA aus Klon BS8.

Abb. 6: Konstruktion von Plasmid p154/2, das den ADHI-Promotor als 1500 bp BamHI/XhoI-Fragment enthält.

Abb. 7: Konstruktion von Plasmid p150/2 mit den zur Expression von hMn-SOD notwendigen Einheiten ADHI-Promotor und ADHII-Terminator (336 bp XbaI/HindIII-Fragment).

Abb. 8: Fertigstellung der endgültigen Plasmide (pKH1 und pKH2) mit dem ADHI-Promotor bzw. dem ADHIk-Promotor und dem ADHII-Terminator, zur weiteren Insertion der hMn-SOD cDNA über die XhoI/EcoRI-Stelle. Das Plasmid pKH2 entspricht pKH1, außer, daß pKH2 anstelle des ADHI-Promotors den ADHIk-Promotor enthält.

Abb. 9: Konstruktion der Expressionskassette HSOD7 mit dem verkürzten ca. 400 bp langen ADHI-Promotor (ADHIk). Die Konstruktion mit dem ADHI-Promotor der ursprünglichen Länge erfolgt ausgehend von pKH1 in analoger Weise.

Abb. 10: Konstruktion von Plasmiden mit dem innerhalb des Hefe Mn-SOD Gens liegenden URA3-Gens als Marker in unterschiedlichen Orientierungen zum MN-SOD Gen (SODY7, SODY8), zur Herstellung einer für die Expression geeigneten Hefe Mn-SOD Mutante. Das Gen-Transplacement im entsprechenden Hefe-Stamm (DBY747) wurde mit SODY7 und SODY8 durchgeführt.

Abb. 11: Gelelektrophoretischer Nachweis der Expression von hMn-SOD über die Plasmide pWS490A und pWS491A im Hefestamm WS30-5 g. Bahn 1: WS30-5 g/pWS490A1, Bahn 2: WS30-5 g/pWS490A2, Bahn 3: WS30-5 g/pWS491A1, Bahn 4: WS30-5 g/pWS491A2, Bahn 5: WS21-1(SOD1), enthält Hefe-MnSOD, Bahn 6: WS30-5 g, Bahnen 7 bis 10: hMn-SOD aus Leber (0,3 µg Bahn 8, 1,2 µg Bahn 9, 3,0 µg Bahn 10). Mit den Ziffern 1 bis 2 hinter den Plasmidbezeichnungen sind unterschiedliche Transformanten mit denselben Plasmiden gemeint.

Die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht eingrenzen sollen, veranschaulichen die Erfindung im Detail.

Verwendete Materialien

Wenn in den folgenden Beispielen nicht besonders angegeben, wurden folgende Materialien, Lösungen, Plasmide, Vektoren und Mikroorganismen benutzt:

ADHI-Promotor: (1500 dp BamHI/XhoI)DSM 4013 (pES103), hinterlegt am 27. 2. 87 ADHI-Promotor, verkürzt: (400 bp BamHI/XhoI)DSM 4016 (pWS323E), hinterlegt am 27. 2. 87 ADHII-Terminator: (336 bp XbaI/HindIII)DSM 4014 (pGD2), hinterlegt am 27. 2. 87 BamHI-Puffer:150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl₂, 100 µg/ml BSA Core-Puffer:50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl Denaturierlösung:0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl Denhardt-Lösung (50×):1 g Polyvinylpyrrolidon MG 360 000, 1 g Ficoll, 1 g Rinderserumalbumin (BSA) ad 100 ml H₂O E.coli C600:F^-, supE44, thil, thrl, leuB6, lacY1, tonA21, λ ^- (ATCC 23724) E.coli JM101:supE, thi, Δ(lac-pro AB), [F′, traD36, pro AB, lacI^qZ, ΔM15] High-Puffer:100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol (DTT) HincII-Puffer:10 mM Tris-HCl pH 7,5, 60 mM NaCl, 10 Mm MgCl₂, 1 mM 2-Merkaptoäthanol, 100 µg/ml BSA Hybridisierlösung:wie Prähybridierlösung, ohne Lachssperma-DNA Klenow-Reaktionslösung:22 µl DNA/H₂O, 2,5 µl 10× NTR-Puffer (0,5 M Tris-HCl pH 7,2, 0,1 M MgSO₄, 1 mM DTT, 500 µg/ml BSA) je 1 µl 2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2,5 U Klenow-Fragment (0,5 µl) Lambda-Puffer:100 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA LB-Agar:LB-Flüssigmedium, 15 g/l Bacto-Agar (Difco) LB-Flüssigmedium:10 g/l Bacto-Trypton (Difco), 50 g/l Hefe-Extrakt (Difco), 5 g/l NaCl, 10 M NaOH ad pH 7,4 Ligationslösung:66 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 1 U T4-DNA Ligase Neutralisationslösung:0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl Nitrozellulosefilter:Schleicher & Schuell, Membranfilter BA 85 NruI-Puffer:50 mM KC1, 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl₂ Prähybridisierlösung:5× SSC, 5× Denhardtlösung, 50 mM Na-Phosphatpuffer pH 6,8, 1 mM Na₂P₄O₇, 100 µM ATP, 0,1% SDS, 30-100 (50) µg/ml denaturierte, ultraschall­ behandelte Lachssperma-DNA puC18:Pharmacia pURA3:DSM 4015, hinterlegt am 27. 2. 87 S. cerevisiae DBY747:a, leu2, his3, trp1, ura3 (Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley) SC-URA-Medium:0,67% BYNB (Difco), 2% Glukose, 2% 50× AS-Mix (pro Liter: 1 g Histidin, 6 g Leucin, 2,5 g Tryptophan, 4 g Lysin, 1,2 g Adenin, 2 g Arginin, 1 g Methionin, 6 g Phenylalanin, 5 g Threonin, 6 g Isoleucin) SmaI-Puffer:10 mM Tris-HCl pH 8,0, 20 mM KC1, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Merkaptoäthanol, 100 µg/ml BSA SphI-Puffer:10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Merkaptoäthanol, 100 µg/ml BSA SSC (20×):3,0 M NaCl, 0,3 M Na₃-Citrat, pH 7,0 SSPE (20×):3,6 M NaCl, 0,2 M Na₂HPO₄, 20 mM EDTA, mit NaOH (10 N) ad pH 7,4 TE-Puffer:10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA ThaI-Puffer:50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl₂ Top-Agarose:LB-Flüssigmedium, 0,7% Agarose (Seaken FM-Agarose) Vorwaschlösung:1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1% SDS

1. Konstruktion einer cDNA-Genbank

Aus einer frischen Human-Placenta wurden würfelgroße Gewebestücke in flüssigem Stickstoff schockgefroren und das Gewebe bei unter -80°C pulverisiert. Aus dem pulverisiertem Gewebematerial wurde anschließend die RNA nach der von Chirgwin, J. M. et al. beschriebenen Prozedur extrahiert und präpariert (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299, 1979).

Aus der danach erhaltenen RNA wurde die poly(A)⁺RNA nach Aviv, H. und Leder, P. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1409-1412, 1972) präpariert. Die Synthese der cDNA wurde mit "cDNA synthesis system" (Amersham RPN 1256) durchgeführt.

Das Packaging erfolgte mit Gigapack (Vector cloning systems). Alle weiteren methodischen Schritte zur Klonierung in die EcoRI-Stelle von λgt10 wurden nach der Vorschrift von Huynh T. V. et al., (DNA Cloning Vol. 1, D. M. Glover ed., IRL Press, Chapter 2, 1985) durchgeführt, außer daß als "plating bacteria" E.coli C600 verwendet wurde. Der Titer der die cDNA-Genbank repräsentierenden λgt10 Phagen betrug 1,2×10¹⁰ pfu/ml, die Zahl der unabhängigen Klone 1×10⁶.

2. Amplifikation der λgt10-Genbank

Ein geeigneter E.coli Wirtsstamm (C600, Genotyp F-, supE44, thil, thrl leuB6 lacY1 tonA21 lambda- (M. A. Hoyt et al., 1982, Cell 31, 5656) wurde über Nacht in LB-Medium, supplementiert mit 0,2% Maltose, bei 37°C vorgezüchtet.

Diese Übernachtkultur wurde 5 min bei 3000 upm abzentrifugiert und in eiskalter 10 mM MgSO₄-Lösung suspendiert, so daß die OD600 nm 4,0 betrug. Die so bereiteten Mg-Zellen wurden bei 4°C gelagert und konnten eine Woche verwendet werden.

12×200 ul Mg-Zellen in sterilen Röhrchen mit einer Phagensuspension (je 50 000 pfu der cDNA-Genbank/Platte) gemischt und 20 min bei 37°C inkubiert.

Anschließend wurden zu jedem Röhrchen 6-7 ml geschmolzene, auf 42°C temperierte Top-Agarose (enthält 10 mM MgSO₄, Endkonzentration) pipettiert, gemischt und auf 12 bei 37°C vorgewärmte LB-Agarplatten (13,5 cm Durchmesser) mit 10 mM MgSO₄ ausgegossen und 6-12 Stunden bei 37°C inkubiert.

Primärscreening zur Identifikation rekombinanter λ-Phagen a) Präparation der Nitrozellulosefilter

Die so bereiteten Platten wurden nach erfolgter Inkubation auf 4°C abgekühlt. Mit Bleistift numerierte Nitrozellulosefilter wurden auf die Plattenoberfläche gelegt und die Positionen auf den Platten durch Nadelstiche markiert. Etwa 1 min, nachdem sie vollkommen durchfeuchtet waren, wurden die Filter wieder vorsichtig abgezogen, in Denaturierlösung gelegt und 1 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend erfolgte die Neutralisation in Neutralisationslösung für 5 min bei RT und eine Inkubation für 30 sec in 2×SSPE ebenfalls bei RT.

Bis zu 3 weitere Abzüge wurden von jeder Platte angefertigt, wobei die Filter jeweils 30 sec länger auf der Platte belassen wurden. Die Positionen der Nadelstiche wurden auf die folgenden Filter genau übertragen.

Die Filter wurden auf Filterpapier liegend an der Luft getrocknet und die DNA durch zweistündiges Backen bei 80°C fixiert. Die Platten bewahrte man bis zum Ergebnis der nachfolgenden Hybridisierung auf.

b) Präparation der ³²P-markierten DNA-Sonden

Die synthetischen Oligonukleotidgemische wurden am 381A DNA-Synthesizer (Applied Biosystems) hergestellt, durch Polyacrylamidgelelektrophorese (20% in 8 M Harnstoff, T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p173ff) gereinigt und über Sephadex G50 (Pharmica) entsalzt.

Die so synthetisierten DNA-Sonden sind komplementär zu RNA-Basensequenzen, die a) für die Aminosäuren 39-46 bzw. b) 200-207 kodieren (D. Barra et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983) und haben folgende Basensequenzen:

wobei A, G, C und T für die entsprechenden Nukleotide, I für Inosin steht.

Die chemisch synthetisierten DNA-Probengemische wurden je in einer Konzentration von 20 pM/ul in Wasser gelöst.

Reaktionssatz:
20-100 mM gamma³²-PATP (<3000 Ci/mmol, Amersham), lyophilisiert aus äthanolischer Lösung, 20-100 pmol Oligonukleotid, 1 ul 10×Kinasepuffer (0,7 M Tris-HCl pH 7,6, 0,1 m MgCl₂, 50 mM Dithiothreit, 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (BRL), Wasser ad 10 ul.

Die Reaktion erfolgte 60 min bei 37°C und wurde durch Zugabe von 25 mM EDTA gestoppt. Nicht eingebaute Radioaktivität entfernte man durch Ausschlußchromatographie über eine 1 ml Biogel P6-DG (Biorad) Säule, hergestellt in einer 1 ml Einwegspritze. Als Elutionsmittel wurde TE-Puffer verwendet.

c) In situ Hybridisierung

Um Reste von Agarose und Bakterien von der Nitrozellulose zu entfernen, die bei der Hybridisierung zu starker Hintergrundstrahlung führen, wurden die Filter in einem nicht zu kleinem Volumen Vorwaschlösung einige Stunden bis zu über Nacht unter Schwenken bei 65°C inkubiert. Um unspezifische Bindungsstellen für DNA auf den Nitrozellulosefiltern abzusättigen, wurden diese 1-12 Stunden bei 37°C in der zuvor im Vakuum entgasten Prähybridisierlösung inkubiert.

Die zum Hybridisieren eingesetzten, radioaktiv markierten DNAs (ca. 1×10⁹ cpm/µg) wurden zur erforderlichen Menge an auf 37°C vorgewärmter und entgaster Hybridisierlösung zugegeben. Um die Konzentration der jeweiligen DNA-Probe in der Hybridisierlösung möglichst hoch zu halten, wurde nur so viel Hybridisierflüssigkeit verwendet, daß die Filter gerade von Flüssigkeit bedeckt waren. Die Hybridisierung erfolgte 12-18 Stunden bei 37°C.

Die Nitrozellulosefilter wurden anschließend entsprechend der Methode von Wood et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 82, 1585-1588, 1985) 3mal in 6×SSC und 0,05% gespült (4°C) und 2×30 min bei 4°C ebenso gewaschen. Anschließend wurden die Filter in einer frisch bereiteten Lösung, die 3 M Tetramethylammoniumchlorid (Me4NCl), 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM EDTA und 0,05% SDS enthält, 3mal bei Raumtemperatur (RT) gespült, 2×30 min (RT) gewaschen und schließlich 3×30 min bei 49°C (Oligonukleotidgemisch a)) bzw. bei 52°C (Oligonukleotidgemisch b)) gewaschen, an der Luft getrocknet (Oligonukleotidgemisch b) und auf Papier geklebt. Röntgenfilme wurden 2-8 Tage bei -70°C unter Verwendung eines "intensifiyind-screen" exponiert.

4. Plaquereinigung

Da bei der angewandten hohen Dichte der Plaques im ersten Suchvorgang keine einzelnen Plaques isoliert werden konnten, wurden die rekombinanten Lambda-Phagen durch mehrere aufeinanderfolgende Suchvorgänge bei gleichzeitig verringerter Plaquedichte gereinigt. Nach Entwicklung der Autoradiogramme wurden Regionen von der Agarplatte isoliert, (von drei durchgeführten Primärscreenings waren von 28 Regionen 2, von 35 Regionen 1 und von 15 Regionen 5 positiv), die auf beiden im Duplikat hybridisierten Nitrozellulosefiltern ein positives Hybridisiersignal ergaben. Dazu wurde die gewünschte Stelle mit dem engen Ende einer sterilen Pasteurpipette aus dem Agar gestochen und in 0,3-0,6 ml Lambda-Puffer (100 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂ und 1 mM EDTA) überführt. Es kann aber auch SM-Puffer (Maniatis T., Molecular-Cloning, 1982, S. 70) genommen werden. Nach Zugabe von einem Tropfen Chloroform ließ man die Phagen über Nacht bei 4°C aus dem Agar herausdiffundieren und plattierte jede einzelne Phagensuspension in mehreren Verdünnungen erneut aus. Von Platten, die 300-1000 Plaques aufwiesen, wurde erneut ein Nitrozellulosefilterabzug hergestellt und jeweils gegen beide DNA-Sonden hybridisiert. Dieser Vorgang wurde wiederholt, wobei Einzelplaques weiterverfolgt wurden, bis alle Plaques einer Platte ein positives Hybridisiersignal ergaben.

5. Analyse der erhaltenen Phagenklone a) Titration der λ-Phagen

Die Phagensuspensionen wurden in Verdünnungsschritten von 1 : 10 mit Lambda-Puffer verdünnt, durch mehrmaliges Umschwenken gemischt und ausplattiert. Nach Inkubation bei 37°C konnten die auf dem Bakterienrasen entstandenen Plaques gezählt und der Titer (plaque forming units (pfu)) bestimmt werden.
Der Titer betrug für die gereinigten Phagensuspensionen 2,2-8,6×10¹⁰ pfu/ml.

b) Präparation der Lambdaphagen-DNA

Nach Isolation und Titration der in sich homogenen Phagenklone wurden diese in einer Dichte von 2×10⁶ pfu/13,5 cm Petrischale (mit dem Kulturmedien der Zusammensetzung: 1,5% Agarose, 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 10 mM MgSO₄ und 0,2% Glukose) mit 200 ul C600 Mg-Zellen (4 OD₆₀₀) plattiert, 5 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend auf 4°C abgekühlt. Die Elution der Phagen erfolgte durch Überschichten der Platten mit je 8 ml Lambdapuffer und einigen Tropfen Chloroform und leichtes Schwenken bei 4°C über Nacht. Der durch Zentrifugation (15 000 upm, 15 min, 4°C) gereinigte Überstand wurde schließlich abgenommen und die Phagen durch Zentrifugation bei 50 000 upm (Beckman Ti50 Rotor) 30 min bei RT pelletiert. Nach Zugabe von je 500 µl Lambdapuffer und Inkubation mit Ribonuklease A (RNase A, 10 µ/ml) und Desoxiribonuklease (DNase, 1 µg/ml), 30 min bei 37°C, wurde die Salzkonzentration durch Zugabe von je 25 ul 0,5 M EDTA, 12 ul 1 M Tris-HCl pH 8,0 und 6,5 ul 20% SDS erhöht und die vorhandenen Enzyme durch Inkubation bei 70°C für 15 min inaktiviert. Nach einer Extraktion mit Phenol und zweimaliger Extraktion mit Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) zu jeweils gleichen Volumina wurde die DNA durch Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumazetat pH 5,2 und 2 Vol. Alkohol ausgefällt, abzentrifugiert, mit 70% Alkohol gewaschen, getrocknet und in 50 µl TE-Puffer aufgenommen.

c) Restriktionsanalyse

Je 2 ul DNA-Lösung wurden mit 5 Einheiten EcoRI in HIGH-Puffer 2 Stunden bei 37°C inkubiert, die erhaltenen Fragmente auf einem 1% Agarosegel (T. Maniatis et al., 1982, pl49ff) unter einer Spannung von 1-5 Volt/cm aufgetrennt, die Fragmente mit Längen zwischen 500 und 1000 Basenpaaren vom Gel eluiert (G. M. Dretzen et al., Anal. Biochem. 112, 295-298, 1981) und schließlich einer Sequenzanalyse unterworfen.

d) Sequenzanalyse

Die Subklonierung der Restriktionsfragmente in einen für die Sequenzbestimmung nach Sanger (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467, 1977; F. Sanger et al., FEBS-Letters 87, 107-111, 1978) geeigneten Vektor (Bluescribe M13+ bzw. M13-, Vektor Cloning Systems (C. Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119, 1985)) erfolgte nach den üblichen Methoden zur Durchführung von Restriktion und Ligation von DNA-Fragmenten und Transformation von E.coli Wirtszellen (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, p104, 146ff, 396; DNA-Cloning, IRL-Press 1985, Vol. 1, chapter 6). So wurden 100 ng isolierte EcoRI-cDNA-Fragmente über EcoRI-Stellen in die entsprechend vorbereitete dsDNA-Form (replikative Form, 50 ng) des Vektors insertiert (durch Inkubation von 2-12 Stunden bei 14°C in 10 ul Ligationslösung) und mit dieser rekombinanten Konstruktion (mit den Bezeichnungen BS3, BS5, BS8, BS9, BS12, BS13, BSXIII) kompetente E.coli (Stamm JM101) Zellen transformiert.
Es wurde die Einzelstrang-DNA der rekombinanten Phagen isoliert und nach Sanger sequenziert. Die gelesenen Sequenzen wurden mittels geeigneter Computerprogramme (R. Staden, Nucl. Acid. Res. 10, 4731-4751, 1982) verarbeitet.
Die isolierte Klon 8 (BS8) enthält die kodierende Sequenz ab Aminosäure 22 des reifen Enzyms (Abb. 1).

6. Konstruktion einer Expressionskassette

Zur Expression der hMn-SOD in Hefe sind Vervollständigung der isolierten cDNA, sowie die Konstruktion einer Expressionskassette notwendig, wobei der ADHI-Promotor in seiner ursprünglichen Länge (ca. 1500 bp, Methods in Enzymology, Vol. 101, Part C, 192-201, 1983), derselbe in verkürzter Form (ADHIK ca. 400 bp) und der ADHII-Terminator (Dr. R. Beier and E. T. Young, Nature 300, 724-728, 1982) zur Anwendung kommt.

a) Vervollständigung des Gens

Da dem isolierten cDNA-Klon 8 am N-Terminus die den 21 Aminosäuren (AS) entsprechende Basenanzahl fehlt, wurden zur Vervollständigung des Gens entsprechend der berichteten Aminosäure-Sequenz (D. Barra et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984) unter Berücksichtigung der Hefe-Codon-Auswahl (P. M. Sharp et al., Nucl. Acids. Res. 14, 5125-5143, 1986) 2 Oligonukleotidpaare als XhoI-XbaI-Fragment (OP1, entsprechend Formel VIa) bzw. XbaI-NcoI-Fragment (OP2, entsprechend Formel VIb) konstruiert und synthetisiert (381A DNA-Synthesizer, Applied Biosystems).

OP1 wurde über XhoI/XbaI in das Plasmid V 17 (entstanden aus pUC18 (J. Vieira and J. Messing, Gene 19, 259, 1982) nach HincII Restriktion und Insertierung von XhoI-Linkern (New England Biolabs, d(CCTCGAGG) und SmaI-Restriktion des entsprechenden Plasmids pES102 mit nachfolgender Insertierung von NcoI-Linkern (New England Biolabs, d(CCCATGGG), insertiert (Abb. 2), OP2 über XbaI/NcoI: Dazu wurden je 4 µg V 17-DNA mit je 10 Einheiten XbaI und NcoI bzw. XhoI und XbaI in 40 ul CORE-Puffer 2 Stunden bei 37°C verdaut und durch Gelelektrophorese (0,7% Agarose, s. o.) gereinigt. Je 5 µl der synthetisierten Einzelstränge von OP1 bzw. von OP2 (jeweils 10 pM/ul) wurden gemischt, 10 min bei 65°C inkubiert und langsam auf RT abgekühlt. Jeweils 1/10 davon wurden mit je 50 ng doppelt geschnittenem Vektor (XhoI/XbaI für OP1 und XbaI/NcoI für OP2) unter oben beschriebenen Bedingungen ligiert (Plasmide HSOD2 und HSOD3, Abb. 2). Schließlich wurden HSOD2 und HSOD3 über ScaI/XbaI (also nach doppelter Verdauung mit ScaI und XbaI in CORE-Puffer 2 Stunden bei 37°C) nach Reinigung und Isolierung der geschnitten Vektoren durch Gelelektrophorese und Ligation unter oben beschriebenen Bedingungen (Klonieren oder Oligopaare OP1 und OP2) zu Plasmid HSOD4 kombiniert (Abb. 2, 3), dieses durch NcoI-Restriktion, darauffolgendem Klenow-Fill-in und EcoRI-Restriktion für die Aufnahme des ThaI/EcoRI-cDNA-Fragments vorbereitet: 5 ug DNA wurden in 50 ul High-Puffer mit 18 Einheiten NcoI bei 37°C mehrere Stunden inkubiert, die geschnittene DNA durch Gelelektrophorese gereinigt, isoliert und die Hälfte davon in 30 ul Klenow-Reaktionslösung 1 Stunden bei RT inkubiert.

Nach Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 2 ul 0,5 M EDTA und Inkubation der Reaktionslösung bei 70°C (10 min) wurde die DNA durch Gelelektrophorese gereinigt, isoliert und mit 7,5 Einheiten EcoRI in 20 ul HIGH-Puffer nachgeschnitten, nochmals gereinigt und isoliert. (Abb. 5).

Das ThaI/EcoRI-cDNA-Fragment wurde wie folgt präpariert: Mit dem Plasmid BS8, das den isolierten cDNA-Klon 8 (s. o.) enthält, wurden kompetente E.coli (Stamm JM101) Wirtszellen transformiert, und das Plasmid unter geeigneten Bedingungen präpariert (T. Maniatis et al., 1982, p368).

Nach Restriktion mit ThaI (10 ug Plasmid wurden in 40 ul ThaI-Puffer mit 25 Einheiten ThaI 8 Stunden bei 60°C verdaut), Nachschneiden des 759 dp ThaI-Fragments mit EcoRI (s. o.), mit jeweils nachfolgender gelelektrophoretischer Reinigung und Isolation des ensprechenden Fragments, wurde das so erhaltene ThaI/EcoRI-Fragment (Abb. 4) mit dem entsprechend vorbereitetem Plasmid HSOD4 (ca. 100 ng Fragment wurden mit 50 ng geschnittenem Vektor in 10 ul Ligationslösung ligiert (s. o.)) zu HSOD6 (Abb. 5) kombiniert. Plasmid HSOD6 enthält somit die vollständige cDNA für hMn-SOD inklusive Met. Der Leserahmen bleibt dabei erhalten.

b) Konstruktion der Expressionskassette

Plasmid HSOD6 wurde mit Xho und EcoRI (je 5 Einheiten/ug DNA) in CORE-Puffer doppelt verdaut, das XhoI-Fragment (Gen) isoliert und in das Plasmid PKH1 bzw. PKH2 oder XhoI/EcoRI insertiert. Die Plasmide PKH1 bzw. PKH2 wurden wie folgt präpariert (Abb. 6, 7, 8): In Plasmid PES 103, das den ADHI-Promotor als 1500 bp BamHI-XhoI-Fragment in PES 102 (PES 102 ist ein pUC18 Derivat, welches in der HincII-Schnittstelle einen XhoI-Linker enthält, die Konstruktion des BamHI-XhoI-Fragments ist in Methods in Enzymology 101, 192-201 beschrieben) enthält, wurden nach SmaI-Restriktion (1 ug Plasmid wurde mit 5 Einheiten SmaI in SmaI-Puffer für 2 Stunden bei 37°C verdaut), Reinigung und Isolation BgIII-Linker insertiert (T. Maniatis et al., 1982, p396). Das so entstandene Plasmid (P154/1, Abb. 6) wurde durch EcoRI-Restriktion (s. o.), Klenow-Fill-in (s. o.) und Religation (1 ug DNA wurde in 40 ul Ligationslösung (s. o.) über Nacht bei 14°C inkubiert) zu Plasmid 154/2 verändert (Abb. 6).

Ebenfalls ausgehend von Plasmid pES103 wurde nach doppelter Verdauung mit XhoI und HindIII in CORE-Puffer der Linker - XhoI. EcoRI. XbaI. HindIII - (Abb. 7, synthetisiert am 381A DNA-Synthesizer) insertiert. Dieser Linker enthält die Sequenz

In das so erhaltene Plasmid 150/1 wurde über XbaI/HindIII (doppelte Verdauung in CORE-Puffer) der ADHII Terminator insertiert (Plasmid 150/2 ( Abb.7)). Der ADHII-Terminator wurde wie folgt erhalten: Plasmid pMW5 ADHII (Washington Research Fundation) wurde mit HindIII (Core-Puffer), danach mit SphI (in SphI-Puffer) verdaut und das isolierte 605 bp Fragment in den Vektor V18 kloniert und in die HincII-Schnittstelle ein XbaI-Linker (Biolabs, CTCTAGAG) eingebaut (Ligation s. o.). Ein 335 bp langes XbaI/SphI Fragment wurde in pUC18 (XbaI/SphI) einligiert (pGD2).

Der Vektor V18 wurde dadurch erhalten, daß in pUC18 in die SmaI-Stelle ein HindIII-Linker eingebaut wurde und die HindIII-Stelle am ursprünglichen Ort fehlt, so daß die Multiklonierstelle in V18 EcoRI. SstI. KpnI. HindIII. BamHI. XbaI. SalI. PstI. SphI lautet.

Der ADHII-Terminator wurde schließlich nach doppelter Verdauung mit XbaI/HindIII in CORE-Puffer nach den üblichen Methoden (s. o.) isoliert. Plasmid 150/2 enthält somit bis auf das über XhoI/EcoRI zu insertierende Gen die für eine Genexpression notwendigen Einheiten von ca. 1500 bp (Promotor), 7 bp (XhoI-Linker), 6 bp (EcoRI-Linker), 7 bp (XbaI-Linker), 329 bp (Terminator). Diese Einheiten wurden nun über BamHI/HindIII (doppelte Verdauung in CORE-Puffer) in den Vektor 154/2 (Abb. 8) inseriert. In dem so erhaltenen Plasmid PKH1 (Abb. 8) wurde in analoger Weise der ADHI-Promotor durch den verkürzten Promotor ADHIk als BamHI/XhoI-Fragment (412 bp) ersetzt (pKH2, Abb. 9).

In beide Plasmide wurde schließlich über XhoI/EcoRI (s. o.) das aus HSOD6 herausgeschnittene vollständige cDNA-Gen (s. o.) insertiert. Die so erhaltenen Plasmide HSOD7/1 bzw. HSOD/2 (Abb. 9) unterscheiden sich voneinander nur durch die verschiedenen Promotoren ADHI und ADHIk (s. o.). Die so fertiggestellte Expressionskassetten wurden über BglII/HindIII (nach doppelter Verdauung der Plasmide in CORE-Puffer und Isolation der herausgeschnittenen Expressionskassetten) in die entsprechend vorbereiteten Hefetransformationsvektoren YEp13 (J. R. Broach et al., Gene 8, 121-133, 1979), pJDB207 (DSM 3281, hinterlegt am 28. 12. 84), pEAS102, YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035-1039, 1979, ATCC 37061) über die Schnittstellen BamHI und HindIII insertiert.

7. Herstellung einer für die Expression geeigneten Hefe Mn-SOD-Mutante

Das Gen für Hefe-Mn-SOD (A.P.G.M. van Loon et al., Gene 26, 261-272, 1983) ist als BamHI-Fragment im Vektor PL 41 (Abb. 10) enthalten und die Sequenz vollständig publiziert (C.A.M. Marres et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161, 1985). Nach Restriktion mit BamHI (2 ug Plasmid wurden mit 5 Einheiten in 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl₂, 100 ug/ul Rinderserumalbumin 2 Stunden bei 36°C verdaut) wurde das 2045 bp lange BamHI-Fragment, das das Gen enthält, wie üblich durch Gelelektrophorese gereinigt und isoliert und über BamHI in den Vektor VO (pUC18, jedoch ohne HindIII-Schnittstelle) subkloniert.

Der Vektor VO wurde dadurch erhalten, indem 1 µg pUC18 mit HindIII geschnitten wurde (CORE-Puffer), das linearisierte Fragment aus dem Gel nach bekannten Methoden isoliert, die überstehenden Enden mit 2 U Klenow-Polymerase (Ligasepuffer +2,0 mM dNTP) aufgefüllt und nach 30 min bei RT durch Zugabe von 2 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 14°C regligiert wurde.

Das entstendene Plasmid SODY1 (Abb. 10) wurde durch NruI-Restriktion (1 ug Plasmid wurde mit 5 Einheiten NruI in NruI-Puffer 2 Stunden bei 36°C verdaut) durch Gelelektrophorese gereinigt und durch Insertieren eines HindIII-Linkers (CAAGCTTG) zu SODY3 (Abb. 10) verändert. Schließlich wurde in die HindIII-Schnittstelle das URA3-Gen (enthalten aus pURA3) insertiert: 4 ug SODY3 wurden mit 20 Einheiten HindIII 2 Stunden bei 37°C in CORE-Puffer verdaut und dephosphoryliert:
Zu 40 ul Verdauungsansatz wurden 40 µl H₂O, 10 µl 1 mM EDTA, 5 µl 1 M Tris-HCl pH 9,5, 1 µl 100 mM Spermidin 1 ul Calf Intestinal Alkaline Phophatase (CIAP, 1 mg/ml H₂O) zugegeben und bei 36°C inkubiert. Nach 15 min wurde nochmals 1 ul CIAP zugegeben und weitere 15 min inkubiert. Der dephosphorylierte Vektor wurde ebenfalls durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. 2 ug Plasmid pURA3 wurden mit HindIII geschnitten (siehe oben) und ein 1,2 kb Fragment, welches das Hefegen URA3 enthält, ebenfalls isoliert und in den vorbereiteten Vektor insertiert (s. o.).

Die so entstandenen Plasmide SODY7 und SODY8 enthalten das URA3-Gen innerhalb des Hefe-Mn-Gens und unterscheiden sich in der Orientierung des URA-Gens relativ zum Mn-SOD-Gen (Abb. 10).

Die Orientierung des URA3-Gens relativ zum Mn-SOD-Gen ist feststellbar, da das URA3-Gen eine asymetrische PstI-Stelle enthält.

Mit dem Plasmid SODY7 und SODY8 wurden im Stamm DBY 747 (Genotyp a, leu2, his3, trp1, ura3, Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley) ein "Gen-Transplacement" durchgeführt (Methods in Enzymology 101, 202-211 und 211-228). Der Stamm DBY 747 wurde mit dem BamHI-Fragment aus SODY7 und SODY8 transformiert (J. D. Beggs, Nature 275, 104, 1978). Dazu wurden 20 ug SODY7 bzw. SODY8 mit 50 U BamHI in 200 ul BamHI-Puffer (150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl₂, 1 mM DTT) geschnitten und die gesamte Verdauungsmischung (ohne den pUC-Anteil abzutrennen) mit Phenol extrahiert (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, 1982, S. 458f) und durch Äthanolfällung konzentriert (Zusatz von 20 ul 3 M Natriumacetat pH 5,5, 500 ul Äthanol). Die DNA wurde in 10 ul Wasser aufgenommen und direkt zur Transformation von Hefe eingesetzt.

Die Transformanten wurden auf Uracilprotophie selektioniert.

Einzelne Transformanten wurden über Nacht in 5 ml SC-URA-Medium bei 28°C gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, nach van Loon et al., aufgeschlossen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3820-3824, 1986) und auf ihren Gehalt an Mn-SOD untersucht. Zur gelelektrophoretischen Erfassung von Mn-SOD einerseits und Cu/Zn-SOD andererseits wurden bereits bestehende Arbeitsvorschriften (Ch. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H. P. Misra und I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys. 1983, 511-515, 1977; B. J. Davis, Annals of the NY Academy of Sciences Vol. 121, 404-427, 1964) zur Anwendung gebracht. Bestens bewährt hat sich dabei die Auftrennung der Proteine mit anschließender Negativ-Färbung mit Nitroblautetrazolium (B. J. Davis, 1964; Ch. Beauchamp und I. Fridovich, 1971). Eine Erhöhung der Empfindlichkeit ist durch die Anfärbung mit Dianisidin möglich (H. P. Misra und I. Fridovich, 1977). Zur weiteren Charakterisierung wurde ein spektrophotometrischen Assay (Hyland, K. et al., Anal. Biochem. 135, 280-287, 1983) mit alkalischem Dimethylsulfoxid als O^-₂-erzeugendes System und mit Cytochrom c als "scavenger" eingesetzt.

Die Unterscheidung zwischen Mn-SOD einerseits und Cu/Zn-SOD andererseits erfolgt durch Zusatz von KCN (s. o. und M. Ysebaert-Vanneste and W. H. Vanneste, Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980). Die Stämme SODY7/2, SODY7/6, SODY7/8 und SODY7/10 enthielten keine Mn-SOD Aktivität.

8. Herstellung der Expressionsvektoren

Die unter Beispiel 6b beschriebenen Expressionskassetten wurden als BglII/HindIII-Fragmente aus den Plasmiden HSOD7/1 bzw. HSOD7/2 herausgeschnitten (jeweils 2 µg Plasmid-DNA im Core-Puffer, 2 Stunden bei 37°C mit je 10 U Enzym). Ebenso wurde je 1 µg YEp13, pJDB207 und pEAS102 mit HindIII-BamHI geschnitten (Verdauungsbedingungen wie oben beschrieben).
Je 50 µg Vektor-DNA und 200 ug Insert wurden in Ligasepuffer (wie beschrieben) mit 1 U Ligase über Nacht bei 14°C ligiert und zur Transformation des E.coli-Stammes HB101 eingesetzt. In der folgenden Tabelle ist die Bezeichnung der entsprechenden Plasmide angegeben.

Tabelle 1

Benennung der Expressionsvektoren

9. Herstellung eines zur Transformation geeigneten Hefestammes (WS30-5 g)

Es wurde ein Hefestamm hergestellt, der neben den für den Hefestamm SODY7/2 beschriebenen genetischen Markern zusätzlich eine Mutation in einer der lysosomalen Hauptproteasen (die durch ihre Aktivität andere lysosomale Proteasen aktivieren kann) enthält und somit beim Aufbrechen der Hefezellen weniger Proteasen freisetzt (Mutation pep4) (E. W. Jones et al., Genetics 102, 665-677, 1982).

Dazu wurde der MnSOD-defiziente Stamm SODY7/2 mit dem proteasedefizienten Stamm WS20-25 (α leu2 his3 trp1 ura3 pep4) gekreuzt und die daraus resultierenden Haploiden auf ihre genetischen Marker hin untersucht (F. Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, N. Y., 1972).

Der erhaltene Stamm WS30-5 g (leu2 his3 trp1 pep4 sod1) ist sehr gut transformierbar und erfüllt die gewünschten Bedingungen.

Derartige Kreuzungen können auch mit anderen gut bekannten und erhältlichen Hefestämmen, beispielsweise mit 20 B-12 (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley) mit ähnlich guten Resultaten durchgeführt werden.

Hefetransformation und Expression in Hefe

Der Hefestamm SODY7/2 wurde mit den Plasmiden pW371A, pWS372A bzw. pWS373A transformiert (J. D. Beggs, Nature 275, 104, 19) und die Transformanten auf ihre Expression hin untersucht.

Dazu wurde eine Vorkultur der Transformanten in SC-leu-Flüssigmedium (analog dem beschriebenen SC-URA-Medium, enthält aber zusätzlich 2,4 g Uracil, jedoch ohne Leucin) hergestellt (Schütteln bei 300 rpm, 28°C, über Nacht). Davon wurden 100 ul in 4 ml YP5%D (1% Bacto Yeast Extract, 2% Bacto Pepton, 5% Glucose) inokuliert und über Nacht gezüchtet (wie die Vorkultur). Die Zellen wurden geerntet und aufgeschlossen wie unter Beispiel 7 bereits beschrieben. Auf das Aktivitätsgel wurde die Menge Zellrohsaft, die 1 ml Kultur entspricht, aufgetragen. Der Aktivitätstest wurde wie unter Beispiel 7 beschrieben, durchgeführt.

Der Hefestamm WS30-5 g (leu2 his3 trp1 pep4 sod1) wurde mit den Plasmiden pWS550A, pWS490A, pWS491A transformiert. Die Herstellung der Vorkultur, Kultur und die Messung der hMn-SOD-Aktivität erfolgten wie oben beschrieben.

Die Expression der Plasmide pWS490A, pWS491A im Hefestamm WS30-5 g dokumentiert Abb. 11.

Die in der Hefe unter diesen Bedingungen gemessenen MnSOD-Menge entsprach ungefähr 0,5 mg/Liter Kultur.

Claims (36)

1. DNA-Sequenzen, die die gesamte oder partielle genetische Information für ein Enzym tragen, das die enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der human Mn-Superoxiddimutase (hMn-SOD) aufweist.

2. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die genetische Information für eine hMn-SOD mit einer aminoterminalen Leader- oder Signalsequenz enthalten.

3. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie für das mature Enzym hMn-SOD kodieren.

4. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß diesen dem ersten Codon für die erste Aminosäure der maturen hMn-SOD ein Translationsstartcodon vorangestellt ist.

5. DNA-Sequenzen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß dem letzten Codon für die letzte Aminosäure der hMn-SOD ein Stopcodon folgt.

6. DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Nukleotidsequenzen gemäß Formeln Ia, Ib, II, IIIa, IIIb, Va, Vb, VIa, VIb, VIIa, VIIb, VIII, IX entsprechen.

7. DNA-Sequenzen, die mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 unter stringenten Bedingungen hybridisieren, wobei diese DNA-Sequenzen synthestischen, halbsynthetischen oder natürlichen Ursprungs sein können und mit den DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie deren Mutationen jedweder Art verwandt sein können und für ein Enzym mit den enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der hMn-SOD codieren.

8. Replizierende Vektoren mit mindestens einem Selektionsmarker, vorzugsweise mit einer Erkennungsstelle für mindestens ein Restriktionsenzym außerhalb des Replikationsursprungs und anderer essentieller Genbereiche, aber innerhalb eines Selektionsmarkers, dadurch gekennzeichnet, daß diese eine der DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthalten.

9. Replizierende Vektoren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie viralen Ursprungs sind, vorzugsweise Lambda-Phagen, insbesondere λgt10 oder M13-Phagen.

10. Replizierende Vektoren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie plasmidischen Ursprungs sind, vorzugsweise pUC18.

11. Plasmide, eine der DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthaltend, dadurch gekennzeichnet, daß diese Plasmide eine diese besagten DNA-Sequenzen enthaltende Expressionskassette tragen, prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen stabil transformieren können, in einer dieser Wirtszellen replizierbar sind und die darin enthaltende genetische Information für hMn-SOD korrekt transkribiert und translatiert wird.

12. Plasmide nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie YEp13, pJDB207, pEAS102, YIp5 sind.

13. Plasmide nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie pUC Plasmide sind, vorzugsweise pUC18.

14. Plasmide nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die sie tragende Expressionskassette die Elemente Promotor, hMn-SOD Strukturgen mit Initiations- und Stopcodon, Terminator oder Promotor, alle in korrekter Leserichtung, enthält.

15. Plasmide nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der vollständige ca. 1500bp lange ADHI ADHIk-Promotor und der Terminator der ADHII Terminator sind.

16. Transformierte Wirtszellen, die für hMn-SOD codierende genetische Information enthaltend.

17. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie replizierende Vektoren nach einem der Ansprüche 8 bis 10 oder Plasmide nach einem der Ansprüche 11 bis 15 enthalten, diese replizieren und exprimieren und das synthetisierte hMn-SOD intrazellulär akkumulieren, in der Periplasma oder extrazellulär transportieren.

18. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese Prokaryoten sind, besonders Enterobacteriaceae, Bacillaceae, apathogene Micrococcaceae, vorzugsweise E.coli, insbesondere E.coli C600, E.coli JM101.

19. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese Eukaryoten sind, vorzugsweise S. cerevisiae.

20. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese Säugetierzellen sind.

21. Verfahren zur Herstellung von hMn-SOD, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) die mRNA aus menschlichen Gewebe, vorzugsweise Plazentagewebe, isoliert und die poly(A)⁺RNA präpariert,
• b) von dieser poly(A)⁺RNA die doppelsträngige cDNA synthetisiert und davon eine cDNA-Genbank konstruiert,
• c) eine für hMn-SOD codierende DNA, Gesamt- oder Teilsequenz aus besagter cDNA-Bank mittels DNA-Sonden, vorzugsweise solchen entsprechend Formeln Va und Vb, isoliert,
• d) diese DNA-Sequenz gegebenenfalls bis zum Start- oder Stopcodon komplettiert und gegebenenfalls mit einer Leader- oder Signalsequenz vor dem Startcodon versehen und in einen Vektro oder Plasmid kloniert,
• e) mit dieser kompletten, für hMn-SOD codierenden DNA-Sequenz eine je nach Wirtszellen geeignete Expressionskassette konstruiert,
• f) mit einem diese Expressionskassette tragenden Vektor oder Plasmid eine geeignete Wirtszelle transformiert,
• g) das durch diesen transformierten Wirt synthetisierte hMn-SOD isoliert und gereinigt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 definiert sind.

23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektoren und Plasmide gemäß den Ansprüchen 8 bis 10 sowie 11 bis 15 definiert sind.

24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen, die nach Ansprüchen 16 bis 20 definierten Eigenschaften aufweisen.

25. Verfahren nach Ansprüchen 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß danach eine hMn-SOD herstellbar ist, welche die enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der authentischen hMn-SOD aufweist.

26. Verfahren nach Ansprüchen 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß danach eine hMn-SOD herstellbar ist, vorzugsweise mit den Aminosäuresequenzen gemäß Formeln IVa oder IVb.

27. Polypeptid mit den enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der hMn-SOD in im wesentlichen reiner Form.

28. Polypeptid nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es frei von nativer Glykolisierung vorliegt.

29. Polypeptid nach Ansprüchen 27 und 28, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäure Methionin vor der 1. Aminosäure des N-Terminus aufweist.

30. Polypeptid nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Leader-Peptid enthält.

31. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenzen gemäß den Formeln IVa oder IVb aufweist.

32. Polypeptid nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäure Methionin vor der 1. Aminosäure des N-Terminus der maturen hMn-SOD aufweist.

33. Polypeptid nach Anspruch 31 und 32, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Leader-Peptid enthält.

34. Polypeptid, herstellbar nach einem der Ansprüche 21 bis 26.

35. Verwendung eines Polypeptides nach einem der Ansprüche 27 bis 34 zur therapeutischen Behandlung.

36. Mittel für die therapeutische Behandlung des Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß es neben pharmazeutisch inerten Trägerstoffen eine wirksame Menge eines Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 27 bis 34 enthält.