DE68927583T2 - Für menschliches Serum Albumin (HSA) kodierende DNA, Plasmide und Wirtzellen, die solche DNA enthalten sowie die Herstellung von HSA - Google Patents
Für menschliches Serum Albumin (HSA) kodierende DNA, Plasmide und Wirtzellen, die solche DNA enthalten sowie die Herstellung von HSAInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Produktion von humanem Serumalbumin A (HSA) in eukaryontischen Zellen, wie z.B. Hefezellen, und die davon verwendeten Genbestandteile. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird reifes humanes Serumalbumin A extrazellulär sezerniert und kann daher leicht gewonnen und gereinigt werden, womit es industrielle Vorteile bietet.
- Als bekannte Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin durch Gentechnologie gibt es Verfahren, die Escherichia coli verwenden (Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103 - 6114, 1981; Latta et al., Biotechnology, 5, 1309 - 1314, 1987; die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung KOKAI, 58-150517), ein Verfahren, welches Bacillus subtilis verwendet (Saunders et al., J. Bacteriol., 169, 2917 - 2925, 1987), und ein Verfahren, welches Hefe verwendet[Etcheverry et al., Biotechnology, 4, 726 - 730, 1986]. Diese Verfahren sind jedoch nachteilig darin, daß sie Serumalbumine liefern, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche in einem gewissen Ausmaß von der von natürlichem humanem Serumalbumin A abweicht; das produzierte Serumalbumin wird in einer unlöslichen Form ausgefällt; die Prozessierungseffizienz des Signalpeptids ist gering; und die extrazelluläre Sekretion ist schwierig.
- Generell ist als ein effizientes Verfahren zum Sezernieren eines gewünschten Proteins durch einen gentechnologischen Prozeß ein Verfahren bekannt, worin ein fusioniertes Protein, welches das gewünschte Protein und ein Präpropeptid (Signalpeptid + Propeptid) umfaßt, in einer Wirtszelle exprimiert wird und dann intrazellulär durch Enzyme des Wirts gespalten (prozessiert) wird und dann extrazellulär sezerniert wird. Gemäß diesem Verfahren muß das fusionierte Protein jedoch zweimal durch Enzyme des Wirts gespalten werden, um zu einem reifen Protein zu werden, was zu einer geringeren Ausbeute des reifen Proteins und zu einer Kontamination des reifen Proteins mit restlichem fusioniertem Protein führt. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, ist ein Verfahren in Betracht gezogen worden, worin ein fusioniertes Protein ein gewünschtes Protein und ein Signalpeptid allein (ohne Propeptid) umfaßt. Gemäß diesem Verfahren bleiben, obwohl ein gewünschtes reifes Protein durch eine einzige Spaltung gebildet wird, Probleme hinsichtlich einer geringen Prozessierungseffizienz und einer geringen extrazellulären Sekretionseffizienz bestehen.
- Gemäß dem allgemein akzeptierten Schleifenmodell (loop model) wird angenommen, daß ein sekretorisches Protein über seine basische Aminosäure, welche neben dem N-Terminus eines Signalpeptids angeordnet ist, mit der Innenseite einer Zellmembran interagiert, und dann über eine Reihe von hydrophoben Aminosäureresten des Signalpeptids mit einer Lipiddoppelschicht der Zellmembran interagiert, was zu einer Insertion des Proteins in die Zellmembran führt (Inouye, S., Wang, S., Seligawa, J., Halegova, S. und Inouye, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1004 - 1008, 1977). Die gemeinsamen strukturellen Eigenschaften von Signalpeptiden sind wie folgt: 1) es gibt basische Aminosäuren nahe dem Aminoterminus; 2) es gibt einen Cluster, welcher hydrophobe Aminosäurereste umfaßt; und 3) der Carboxyterminus eines Signalpeptids, welches durch die Signalpeptidase gespalten wird, ist eine Aminosäure mit einer kleinen Seitenkette. Als ein Ergebnis eines Experimentes, welches durchgeführt wurde, um zu bestimmen, ob Leitsequenzen, welche durch Einführung in einer in vitro-Mutagenese hergestellt wurden, tatsächlich in einem in vivo- oder in vitro- Translations-/Translokationssystem funktionieren, wurde berichtet, daß die Konformation des Clusters der hydrophoben Aminosäurereste wichtig ist, wenn das Signalpeptid seine Funktion zeigen soll. Insbesondere wurde die Wichtigkeit einer α-Helixstruktur, welche in einem hydrophoben Aminosäureduster gebildet wird, durch das folgende Experiment gezeigt.
- Eine Interaktion zwischen einem Signalpeptid des E. coli Lam B-Proteins und einer Lipideinzelschicht wurde getestet, und Sekundärstrukturen eines Signalpeptids, welches die Membran durchdringen kann, und eines Signalpeptids, welches die Membran nicht durchdringen kann, wurden abhängig von unterschiedlichen Drucken unter Verwendung des Zirkulardichroismus und der Fourrier-Transform-Infrarotspektrometrie analysiert. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß das Signalpeptid, welches die Membran durchdringen kann, die Tendenz hat, die α-Helixstruktur zu bilden, und das Signalpeptid, welches die Membran nicht durchdringen kann, sehr wahrscheinlich die β-Schleifenstruktur bildet (Briggs, M.S., Cornell, D.G., Dluhy, R.R. und Gierash, L.M., Science 233, 203 - 208, 1986). Nach diesen Ergebnissen wurde ein Modell vorgeschlagen, worin ein Signalpeptid durch eine Interaktion mit der Membran zuerst die β-Schleifenstruktur bildet und diese Struktur in die α-Helixstruktur umgewandelt wird, wenn das Signalpeptid in die Membran eingefügt wird.
- Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die Produktion von humanem Serumalbumin zur Verfügung, wobei die Verfahren eine große Menge an sezerniertem reifem humanem Serumalbumin A in einer löslichen Form und in derselben räumlichen Struktur wie der von natürlichem humanem Serumalbumin zur Verfügung stellen können, wodurch sie eine leichte Gewinnung und Reinigung des humanen Serumalbumins durch ein industrielles Verfahren ermöglichen.
- Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine neue Leitsequenz zur Verfügung gestellt, welche eine Umwandlung eines fusionierten Vorläufer-Proteins zu einem reifen Protein durch eine einzige Spaltung (Prozessierung) und eine effektive extrazelluläre Sekretion des reifen Proteins ermöglicht.
- Die vorliegende Erfindung stellt eine DNA zur Verfügung, welche eine Leit-DNA, die für ein chimäres Leitpeptid codiert, und eine cDNA, welche für das reife HSA codiert, welche stromabwärts der Leit-DNA vorhanden ist, umfaßt, wobei das chimäre Leitpeptid an seiner N-terminalen Seite eine Aminosäuresequenz, die leicht eine α-Helix bildet, und an seiner C-terminalen Seite eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche dem C-Terminus einer Leitsequenz eines Proteins entspricht, das effizient in einem ausgewählten Wirt prozessiert wird. Insbesondere stellt die Erfindung zur Verfügung: eine DNA, welche eine Leit-DNA, die für ein chimäres Leit-Peptid codiert, das die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
- Met Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Les Phe Ser Ala Lys Ile Ser Ala
- und stromabwärts davon eine cDNA, die für reifes HSA codiert, umfaßt; eine rekombinante DNA, welche eine DNA, die für ein chimäres Leitpeptid mit der obigen Sequenz codiert, eine cDNA, die für reifes HSA codiert, ein poly A- Additionssignal und eine poly A-Sequenz in dieser Reihenfolge umfaßt; ein Plasmid, welches einen Promotor und einen Terminator umfaßt, die in einer Wirtszelle funktionieren, wobei die oben beschriebene rekombinante DNA zwischen dem Promotor und dem Terminator in einer Orientierung eingefügt wurde, welche eine Expression der cDNA erlaubt; einen Wirt, vorzugsweise Hefe, welcher mit dem Plasmid transformiert ist; ein Verfahren zur Herstellung von reifem HSA, welches ein Kultivieren des transformierten Wirtes, um reifes HSA zu produzieren und zu sezernieren, und ein Gewinnen des reifen HSA umfaßt.
- Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein chimäres Leit-Peptid, welches an seiner N-terminalen Seite eine Aminosäuresequenz, welche leicht eine α-Helix bildet, und an seiner C-terminalen Seite eine Aminosäuresequenz, welche dem C-Terminus einer Leitsequenz eines Proteins entspricht, das in vivo effizient prozessiert wird, umfaßt und eine DNA, die für das oben erwähnte chimäre Leit-Peptid codiert, zur Verfügung.
- Insbesondere stellt die Erfindung ein chimäres Leitpeptid mit der Aminosäuresequenz
- Met Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ala Lys Ile Ser Ala
- und eine DNA, welche für die obige Aminosäuresequenz codiert, zur Verfügung.
- In den begleitenden Zeichnungen zeigt:
- Figur 1 ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pUC-X- HSA-A;
- Fig. 2 ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pJDB- NeO;
- Fig. 3-1 bis 3-2 ein Verfahren zur Konstruktion des ADHI- Promotor-Kassettenvektors pDE6-10(Xho);
- Fig. 4-1 bis 4-2 ein Verfahren zur Konstruktion des ADHI- Terminator-Kassettenvektors pUC-ATE;
- Fig. 5 ein Verfahren zur Konstruktion des Hefe-Expressionsvektors (ADHI-Sandwichvektor) pAH6-10-Neo-ATE;
- Fig. 6 ein Verfahren zur Konstruktion des Expressionsplasmids pJDB-ADH-HSA-A;
- Fig. 7 die Ergebnisse einer Elektrophorese, worin (A) reifes HSA darstellt, das durch Kultivieren einer Transformante AH22 (pJDB-ADH-HSA-A), die HSA-cDNA enthielt, produziert wurde, welches durch eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese abgetrennt und mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt wurde, und (B) einen entsprechenden Western-Blot darstellt;
- Fig. 8 eine cDNA (HSA-cDNA), die für das gesamte normale humane Serumalbumin A codiert, wie auch eine cDNA (HSA-IA), die für den C-terminalen Bereich von HSA codiert, und eine cDNA (HSA II), welche für den N-terminalen Bereich von HSA codiert, welche zur Konstruktion der gesamten cDNA verwendet wurden;
- Fig. 9 Nukleotidsequenzen von drei Sonden, die zum Screenen von HSA-cDNA-Klonen verwendet wurden;
- Fig. 10 ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pUC HSA-CH;
- Fig. 11-1 bis 11-5 eine Nukleotidsequenz einer cDNA, die für das gesamte HSA codiert;
- Fig. 12 ein Ergebnis eines Vergleichs von Molekulargewichten von HSA, das durch Hefetransformanten erzeugt wurde, und HSA, das aus humanem Serum präpariert wurde, welches durch eine SDS-Polyacrylamidgradienten-Gelelektrophorese erhalten wurde;
- Fig. 13 ein Ergebnis eines Vergleichs von HSA, das durch Hefetransformanten erzeugt wurde, und HSA, das aus humanern Serum präpariert wurde, welches durch eine native Polyacrylamidgradienten-Gelelektrophorese erhalten wurde;
- Fig. 14 ein Ergebnis eines Vergleichs von HSA, das durch Hefetransformanten erzeugt wurde, und HSA, das aus humanem Serum präpariert wurde, in einer isoelektrischen Fokussierung;
- Fig. 15 ein Ergebnis eines Vergleichs von HSA, das durch Hefetransformanten erzeugt wurde, und HSA, das aus humanem Serum präpariert wurde, durch das Ouchterlony-Verfahren;
- Fig. 16 ein Ergebnis eines Vergleichs von HSA, das durch Hefetransformanten erzeugt wurde, und HSA, das aus humanem Serum präpariert wurde, durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), wobei A HSA aus humanem Serum darstellt, B HSA darstellt, welches durch Hefetransformanten erzeugt wurde, und C die Mischung von A und B darstellt;
- Fig. 17 ein Ergebnis eines Vergleichs von HSA (A), das durch Hefetransformanten hergestellt wurde, und HSA (B), das aus humanem Serum präpariert wurde, durch Hydroxylapatit-Chromatographie;
- Fig. 18 ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pUC-X- LY3-HSA;
- Fig. 19 ein Verfahren zur Konstruktion des Expressionsplasmids pJDB-ADH-LY3-HSA-A;
- Fig. 20 ein Ergebnis einer Elektrophorese, worin HSA, das durch Kultivieren einer Transformante AH22 (pJDB-ADH-LY3- HSA-A), welche HSA-cDNA enthielt, erzeugt wurde, einer SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen wurde und durch Anf ärben mit Coomassie Brilliant Blue nachgewiesen wurde;
- Fig. 21 ein Ergebnis eines Vergleichs von HSA, das durch Hefetransformanten hergestellt wurde, und HSA, das aus humanem Serum präpariert wurde, durch native Polyacrylamidgradienten-Gelelektrophorese;
- Fig. 22 ein Ergebnis eines Vergleichs von HSA, das durch Hefetransformanten hergestellt wurde, und HSA, das aus humanem Serum präpariert wurde, durch isoelektrische Fokussierung;
- Fig. 23 ein Ergebnis eines Vergleichs von HSA, das durch Hefetransformanten hergestellt wurde, und HSA, das aus humanem Serum präpariert wurde, durch Umkehrphasen-HPLC; und
- Fig. 24 ein Ergebnis eines Vergleichs von HSA, das durch Hefetransformanten hergestellt wurde, und HSA, das aus humanem Serum präpariert wurde, durch das Ouchterlony-Verfahren.
- Da das normale IISA-Molekül viele Disulfidverknüpfungen enthält, müssen die Disulfidverknüpfungen in der eingesetzten Erzeugerwirtszelle korrekt gebildet werden, um durch eine rekombinante DNA-Technologie normales HSA zu erhalten, welches dieselbe Sekundärstruktur wie die von natürlichem HSA aufweist. Vor kurzem wurde vorgeschlagen, daß Enzyme, wie z.B. Proteindisulfidisomerase, Peptidylprolyl-cis-trans-Isomerase und dergleichen, an der Bildung einer normalen Sekundär- und Tertiärstruktur beteiligt sind. Es wird erwartet, daß die Wirkung solcher Faltungsenzyme in prokaryontischen Zellen, wie z.B. E. coli oder Bacillus subtilis, nicht vorhanden ist, oder auf einem sehr niedrigen Niveau vorhanden ist, da diese prokaryontischen Zellen sehr wenige Proteine haben, die viele Disulfidverknüpfungen enthalten, und keine komplizierte Sekundär- und/oder Tertiärstruktur ausbilden. Nichtsdestotrotz ist es bekannt, daß - obwohl höhere eukaryontische Zellen einschließlich humaner Zellen verschiedene Arten an Proteinen einschließlich Glycöproteinen und anderen modifizierten Proteinen mit in hohem Maße komplizierter Sekundär- und/oder Tertiärstruktur sezernieren - Hefe und niedere Eukaryonten ebenfalls über einen Weg, welcher dem von höheren Eukaryonten ähnelt, Protein sezernieren (Huffaker, T.C. und Robbins, P.W., J. Biol. Chem. 257, 3203 - 3210, 1982; Snider, M.D. in Ginsburg, V. und Robbins, P.W. (Herausg.) Biology of Carbohydrates, Bd. 2, Wiley, New York, 1984, Seiten 163 - 198). Demgemäß wurden viele Versuche unternommen, ein heterogenes (insbesondere aus Säugetieren stammendes) Gen in Hefezellen zu exprimieren, was zu einer extrazellulären Sekretion der Expressionsprodukte führte.
- Im allgemeinen wird angenommen, daß die Verwendung von Hefezellen als Wirt in folgender Hinsicht vorteilhaft ist:
- 1. Die Fermentation in einer großen Kulturmenge mit einer hohen Zelldichte ist einfach und ökonomisch. Darüber hinaus benötigt das Kultivieren der Hefezellen keine präzise gesteuerte Vorrichtung, welche im Fall einer Tier- oder Pflanzenzellkultur nötig ist.
- 2. Über die Hefefermentation wurden viele Erfahrungen gesammelt.
- 3. Die Kenntnis der molekularen Genetik bezüglich Hefe wächst rasch an.
- 4. Die Einführung eines fremden genetischen Materials in eine Zelle und die Integration in ein Genom ist einfach.
- 5. Das genetische und physiologische Verständnis des intrazellulären Transports von Proteinen und deren extrazelluläre Sekretion wächst rasch an.
- 6. Ein fremdes genetisches Material kann durch die Auswahl eines geeigneten Plasmidvektors in einer Hefezelle in vier verschiedenen Zuständen vorhanden sein, d.h. es wird durch Verwendung eines Plasmids vom YEp-Typ als ein Episom beibehalten; es wird durch Verwendung eines YIp-Plasmids in ein Genom integriert; es kann durch Verwendung eines YCp- Plasmids, welches ein Centromer enthält, gleichzeitig mit der Zellteilung replizieren; und es kann durch Verwendung eines YRp-Plasmids, das eine autonome Replikationssequenz (ARS) enthält, autonom repliziert werden.
- 7. Eine Hefezelle weist einen Mechanismus zum intrazellulären Prozessieren eines Signalpeptids und einer Prosequenz auf.
- 8. Obwohl Oligosaccharide, welche in Glycoprotein gefunden werden, das durch eine Hefezelle synthetisiert wird, relativ große Mengen an Mannose enthalten und sich von Oligosacchariden in dem Glycoprotein höherer Tiere unterscheiden, ist ein Verfahren der Addition einer Kern-Oligosaccharidkette, welche in dem endoplasmatischen Retikulum von Hefe auftritt, dieselbe wie das entsprechende Verfahren in einem höheren Tier, und daher liegt der einzige Unterschied in der Addition einer äußeren Oligosaccharidkette.
- 9. Eine Hefetransformante kann in einem synthetischen Medium wachsen, das mit Vitaminen und Spurenelementen ergänzt ist und
- 10. eine Hefetransformante kann in einem Medium kultiviert werden, das Rohzucker anstelle von reiner Glucose enthält.
- Aufgrund der oben erwähnten Vorteile wird gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein Hefewirt verwendet.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Sequenz zur Förderung der Sekretion verwendet, um die Sekretion des gewünschten Proteins zu fördern.
- Die Sequenz, welche in der vorliegenden Erfindung zu diesem Zweck verwendet wird, ist eine chimäre Leitsequenz, welche die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
- Met Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ala Lys Ile Ser Ala
- Diese chimäre Leitsequenz hat an ihrer N-terminalen Seite eine Aminosäuresequenz, welche leicht eine α-Helix bildet, und an ihrer C-terminalen Seite eine Aminosäuresequenz, die in dem verwendeten Wirt leicht prozessiert wird. Die Sequenz, die leicht die α-Helix bildet, ist die Aminosäuresequenz, welche einen hohen Anteil an Leucin aufweist, insbesondere die Aminosäuresequenz, die mehr als einen zusammenhängenden Leucinrest enthält. Darüber hinaus haben andere neutrale Aminosäure, wie z.B. Alanin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin und dergleichen, eine Tendenz, eine α-Helix zu bilden.
- Der C-terminale Bereich der vorliegenden chimären Leitsequenz, welcher eine Prozessierungsstelle zur Verfügung stellt, ist eine entsprechende Stelle einer Leitsequenz eines Proteins, das in einem ausgewählten Wirt effizient prozessiert wird. Wenn beispielsweise Hefe als ein Wirt verwendet wird, kann ein C-terminaler Bereich des Signalpeptids Invertase SUC2 vom Sekretionstyp verwendet werden.
- Die Aminosäuresequenz dieses Signalpeptids ist
- Prozeesierungsstelle
- SUC 2 MLLQAFLFLLAGFAAKISA
- Bei der vorliegenden chimären Leitsequenz, sind der N-terminale Bereich, welcher für die Bildung der α-Helix verantwortlich ist, und der C-terminale Bereich, welcher für die Prozessierung verantwortlich ist, direkt oder über einen Linker verknüpft. Der Linker besteht aus einer oder mehr als einer Aminosäure. Insbesondere wird die chimäre Leitsequenz der Erfindung durch eine Kombination eines N-terminalen Bereichs, welcher einige zusammenhängende Leucinreste enthält, und eines C-terminalen Bereiches, welcher einem Signalpeptid Invertase SUC2 eines Sekretionstyps entspricht, gebildet und stellt sich wie folgt dar:
- Met Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu ATG AAG TTG TTG CTC CTC CTT CTT TTG CTC TAC TTC AAC AAC GAG GAG GAA GAA AAC GAG
- Phe Leu Phe Ser Ala Lys Ile Ser Ala TTC TTG TTC TGT GCT AAC ATT TCT GCC AAC AAC AAC ACA CGA TTC TAA AGA CGG
- Bei den oben beschriebenen Sequenzen stellt die erste Zeile eine Aminosäuresequenz dar, und die zweite und dritte Zeile stellen eine Ausführungsform einer Nukleotidsequenz dar, welche für die Aminosäuresequenz codiert.
- Obwohl eine Nukleotidsequenz, die für die vorliegende chimäre Leitsequenz codiert, jegliche Codons umfassen kann, die in einem verwendeten Wirt verwendet werden können, umfaßt die Nukleotidsequenz vorzugsweise Codons, die in einem verwendeten Wirt häufig verwendet werden. Wenn bei spielsweise Hefe als ein Wirt verwendet wird, wird eine Nukleotidsequenz, die für die vorliegende Leitsequenz codiert, vorzugsweise so gestaltet, daß Codons verwendet werden, von denen gut bekannt ist, daß sie häufig in Hefe verwendet werden.
- Ein Gen (cDNA), welches für HSA codiert, wurde kloniert, und seine Nukleotidsequenz wie auch eine Aminosäuresequenz, welche von der Nukleotidsequenz abgeleitet wurde, sind in der japanischen Patentanmeldung Nr. 63-037453 offenbart. Demgemäß können in der vorliegenden Erfindung das Plasmid pUC HSA CH und dergleichen, welche ein Gen für HSA enthalten, als eine Genquelle für das HSA-Gen verwendet werden. Man beachte, daß ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pUC HSA CH in den Referenzbeispielen 1 und 2 beschne ben ist.
- Die oben erwähnte chimäre Leitsequenz, die einen N-terminalen Bereich, welcher leicht eine α-Helix bildet, und einen C-terminalen Bereich, welcher eine Prozessierungsstelle zur Verfügung stellt, umfaßt, ist neu, und die vorliegende Erfindung schließt jedes Expressionssystem ein, welches die chimäre Leitsequenz enthält. Strukturgene, die mit der chimären Leitsequenz verknüpft werden können, umfassen jene, die für Interferone, Interleukine, Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor, Prochymosin, Endoglucanase 1, α-Amylase, epidermalen Wachstumsfaktor, β-Endorphin, Calcitonin, Somatomedin C, Insulin, Thrombininhibitoren, Hirudine und dergleichen codieren.
- Strukturgene, die für diese Proteine codieren, sind gemäß herkömmlichen Verfahren als cDNA, synthetische Polynukleotide oder genomische DNAs verfügbar.
- Es wurde berichtet, daß eine poly A-Sequenz und ein AATAAA- Signal, welche stromabwärts eines 3'-Terminus einer codie- renden Sequenz vorhanden sind, bewirken, daß die mRNA eines Eukaryonten stabilisiert wird (Bergmann und Brawerman, Biochemistry 16, 259 - 264, 1977; Huez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 908 - 911, 1981). Demgemäß werden in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine poly A-Sequenz und ein AATAAA-Signal stromabwärts der HSA-cDNA zur Verfügung gestellt. Als die poly A-Sequenz und das AATAAA-Signal können jene verwendet werden, die natürlicherweise mit dem HSA-Strukturgen verknüpft sind. Das HSA-Gen, welches diese Sequenzen enthielt, wurde kloniert und ist in der japanischen Patentanmeldung Nr. 63- 037453 offenbart. Als eine Quelle dieser Sequenzen kann beispielsweise λgt11 (HSA-IA) verwendet werden, dessen Konstruktionsverfahren in Referenzbeispiel 1 beschrieben wird.
- Bei der vorliegenden Erfindung kann jeder Promotor verwendet werden, der in einer Hefezelle funktionieren kann, aber es wird vorzugsweise eher ein konstitutiver Promotor als ein induzierbarer Promotor verwendet. Wenn ein induzierbarer Promotor verwendet wird, wird in manchen Fällen durch die Induktion HSA rasch in der Hefezelle akkumuliert, was zu der Bildung von intermolekularen Disulfidbindungen führt, die HSA-Moleküle liefern, welche Sekundärstrukturen aufweisen, die von der des natürlichen HSA verschieden sind.
- Konstitutive oder schwach induzierbare Hefepromotoren, welche eine starke Promotoraktivität zeigen, umfassen Alkoholdehydrogenase (ADH 1) -Promotor, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP) -Promotor und Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor. Von diesen wird vorzugsweise der ADH 1-Promotor verwendet.
- Eine Nukleotidsequenz von ca. 2.100 bp, welche ein Hefe- ADH I-Gen (ADC 1) einschließt, wurde bestimmt und diese umfaßt zusätzlich zu einer Sequenz mit ca. 1.100 Nukleotiden, die für ADH I codiert, eine nicht-codierende 5'- Sequenz mit ca. 750 bp und eine nicht-codierende 3'-Sequenz mit ca. 320 bp (Bennetzen, J. und Hall, B., J. Biol. Chem. 257, 3018 - 3025, 1982). Die Goldberg-Hogness-Box (TATA- Box), von welcher angenommen wird, daß sie eine Sequenz ist, welche von RNA-Polymerase erkannt wird, ist 128 bp stromaufwärts des Translationsstartcodons ATG angeordnet, und die ADH I-Promotorfunktion wird durch eine Deletion eines Bereichs stromaufwärts der Sphi-Stelle, die bei -410 vorhanden ist, nicht verloren (Beier und Young, Nature 300, 724 - 728, 1982). Das Transkript von dem ADH I-Promotor umfaßt gewöhnlich wenigstens 1% der gesamten poly (A)-RNA in Hefe (Ammerer, G., Methods Enzymol. 101, 192 - 201, 1983).
- Es wurde berichtet, daß ein "Durchlesen"("Read-Through") während der Transkription die Menge des Genproduktes vermindert (Zaret, K.S. und Sherman, F., Cell 28, 563 - 573, 1982). Um dieses zu verhindern, wird vorzugsweise stromabwärts eines zu exprimierenden Strukturgens ein Terminator zur Verfügung gestellt. Beispielsweise wird ein PGK-Promotor/Terminator-Sandwichvektor für die Expression von Kalbschymosin verwendet und dieser liefert eine Expression in einer Menge von bis zu zehn mal höher als die Menge, welche erhalten wird wenn kein Terminator verwendet wurde (Mellor et al., Gene 24, 1 - 14, 1983). Ein von irgendeinem Gen abgeleiteter Terminator kann für diesen Zweck verwendet werden. Beispielsweise kann ein Terminator eines TRP5 (tryptophansynthetisierendes Enzym)-Gens oder eines CYC 1 (Iso-1-cytochrom C)-Gens verwendet werden. Wo ein starker Promotor verwendet wird, wird vorzugsweise ein starker Terminator verwendet, um das "Durchlesen" effektiv zu verhindem.
- Demgemäß wird in der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein starker Terminator, wie z.B. der ADH I-Terminator, der GAP-Terminator oder dergleichen verwendet.
- Zusätzlich zu den oben erwähnten Bestandteilen eines Vektors, welche direkt an der Expression beteiligt sind, muß das vorliegende Expressionsplasmid einen Replikationsursprung und ein Markergen für einen Hefewirt enthalten. Ein Hefe-Replikationsursprung ist beispielsweise ein Replikationsursprung der 2 µm-Plasmid-DNA. Als Markergene können herkömmliche Markergene, wie z.B. Gene, die dem Wirt eine Arzneimittelresistenz verleihen, Gene, welche die Auxotro phie eines Wirtes komplementieren, und dergleichen verwendet werden. Da die intermediären Plasmide im Verlauf der Konstruktion eines am Ende gewünschten rekombinanten Plasmids in einem E. coli-Wirt amplifiziert werden müssen, sind jene Plasmide darüber hinaus vorzugsweise Shuttle-Plasmide, welche zusätzlich einen Replikationsursprung und ein selektives Markergen enthalten. Als ein Shuttle-Vektor, welcher die oben erwähnten Erfordernisse erfüllt, ist das Plasrnid pJDB207 oder dergleichen im Handel erhältlich. Das Plasmid pJDB207 enthält als ein Hefe-Markergen ein LEU2-Gen, das für β-Isopropylmalatdehydrogenase codiert.
- Demgemäß werden in einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Plasmids ein Promotor, eine Leitsequenz, ein HSA-Strukturgen, eine poly A-Sequenz und ein Terminator in dieser Reihenfolge in einen Shuttle-Vektor eingefügt, welcher einen Replikationsursprung und ein selektives Markergen für einen Hefewirt wie auch einen Replikationsursprung und ein selektives Markergen für einen E. coli-Wirt umfaßt.
- Die Transformation des Hefewirtes mit den vorliegenden Plasmiden wird durch ein herkömmliches Verfahren durchgeführt. Details dieses Verfahrens sind in den Beispielen angegeben.
- Der Hefewirt, welcher mit dem vorliegenden Plasmid transformiert ist, wird durch ein herkömmliches Verfahren, das für das Kultivieren von Hefe verwendet wird, kultiviert. Ein Beispiel ist ein Vollmedium wie z.B. YPD und ein unvollständiges synthetisches Medium wie z.B. ein SD-Medium, das mit 1 % Hefeextrakt ergänzt ist.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird in vielen Fällen HSA, das in Hefezellen produziert wird, extrazellulär sezerniert. Das HSA, welches in eine Kulturnährlösung sezerniert wurde, kann durch verschiedene herkömmliche Verfahren gewonnen und gereinigt werden. Beispiele sind eine differentielle Ausfällung unter Verwendung von Ethanol, Aceton, Ammoniumsulfat oder dergleichen, eine Konzentrierung und teilweise Reinigung durch isoelektrische Fokussierung, eine Ultrafiltration oder dergleichen und eine abschließende Reinigung unter Verwendung verschiedener Chromatographien, allein oder in Kombination.
- Wenn eine chimäre Leitsequenz verwendet wird, welche einen N-terminalen Bereich, der leicht eine α-Helix bildet, und einen C-terminalen Bereich, der einem Prozessierungsbereich einer Leitsequenz eines Proteins entspricht, welches natürlicherweise durch einen Wirt erzeugt wird, umfaßt, dringt die Leitsequenz leicht in die Membran ein, was zu einem effizienten Transport eines gewünschten Proteins führt, und das Vorläuferprotein kann durch ein Einschritt-Verfahren richtig gespalten werden, um ein fehlerfreies reifes Protein zur Verfügung zu stellen.
- Die vorliegende Erfindung wird nun weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, ist aber in keiner Weise darauf beschränkt.
- In den Beispielen wurden Enzymreaktionen unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
- Verdau von DNA: Zum Verdau mit EcoR I (Nippon Gene; 12 Einheiten/µl), Cla I (New England Biolabs; 5 Einheiten/µl), Hind III (Nippon Gene; 12 Einheiten/µl), Xho I (Takara Shuzo; 12 Einheiten/µl) oder BamH I (Nippon Gene; 35 Einheiten/µl) wurden 1 µg DNA, 1 µl Enzym und 3 µl 10 x EcoR I-Puffer (1 M Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 500 mM NaCl) gemischt und steriles destilliertes Wasser wurde bis auf 30 µl zugegeben, und es wurde eine Stunde lang bei 37ºC eine Reaktion durchgeführt. Für Sal I (Nippon Gene; 15 Einheiten/µl), Pst I (Nippon Gene; 20 Einheiten/µl), Xba I (Nippon Gene; 15 Einheiten/µl) und Bste II (Nippon Gene) wurde ein Puffer verwendet, der 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 70 mM MgCl&sub2;, 1,75 M NaCl, 70 mM 2-Mercaptoethanol, 2 mM EDTA und 0,1 % Kalbsserumalbumin enthielt. Für Sal I, Pst 1 und Xba I wurde eine Reaktion eine Stunde lang bei 37ºC durchgeführt. Für Bste II wurde eine Reaktion für eine Stunde bei 60ºC durchgeführt. Für Msp 1 (Hpa II) (Nippon Gene; 12 Einheiten/µl) wurde ein Puffer, der 100 mM Tris- HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl&sub2; und 60 mM NaCl enthielt, verwendet und für Sma I (Nippon Gene; 15 Einheiten/µl) wurde ein Puffer, der 200 mM KCl, 60 mM Tris-HCl (pH 7,9) und 60 mM MgCl&sub2; enthielt, verwendet.
- Zu 1 µg DNA, 1 µg EcoR I, 1 µg Hind III und 2 µl 10 x EcoRI-Puffer wurde steriles destilliertes Wasser bis auf 20 µl zugegeben und nach einer Inkubation für eine Stunde bei 37ºC wurde die Mischung 5 Minuten lang bei 90ºC erwärmt, um die Enzyme zu inaktivieren. Als nächstes wurden 38 µl steriles destilliertes Wasser und 2 µl (0,5 Einheiten/µl; Takara Shuzo) bakterielle alkalische Phosphatase zugegeben, und nach einer Inkubation für eine Stunde bei 37ºC wurden Phenolextraktion und Ethanolfällung durchgeführt.
- Beispielsweise wurden 30 µl steriles destilliertes Wasser zu 1 µg Vektor-DNA, DNA-Fragment in einer Menge, welche der der Vektor-DNA entsprach, 3 µl 10 x Ligasepuffer (660 mM Tris-HCl, [pH 7,5], 66 mM MgCl&sub2;, 100 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP) und 1 µl T4-DNA-Ligase (ca. 400 Einheiten/µl; Takara Shuzo) zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert.
- Ungefähr 30 pmol DNA-Fragment wurden 60 Minuten lang bei 37ºC mit 6 Einheiten T4-Polynukleotidkinase in einem Puffer behandelt, welcher 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol und 0,2 mM ATP enthielt. Die Lösungen, welche ein phosphoryliertes Fragment enthielten, wurden gemischt (Gesamtvolumen 100 µl), und die Mischung wurde 5 Minuten lang in einem Wasserbad mit 100ºC stehen gelassen. Der Reaktionsmischung wurde dann erlaubt, auf Raumtemperatur abzukühlen, um die Fragmente reassozueren zu lassen. Dann wurden 2 µl T4-DNA-Ligase zu der Mischung zugegeben und bei 16ºC wurde über Nacht eine Inkubation durchgeführt, um das Fragment zu ligieren und ein doppelsträngiges Fragment zu bilden.
- Zu 1 µg DNA, 1 µl DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment, Takara Shuzo, 3,5 Einheitenll µl), 1 µl 1 mM dXTP (dTP, dGTP, dCTP, TTP) und 3 µl lox-Puffer (70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl und 70 mM MgCl&sub2;) wurde steriles destilliertes Wasser bis auf 30 µl zugegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
- Zehn Mikroliter eines Puffers, welcher 1 µg synthetische DNA, 50 µCi wäßrige λr-³²P-ATP-Lösung (3000 Ci/mmol), 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 10 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (Takara Shuzo) enthielt, wurde eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert, und nicht-umgesetzte Nukle otide wurden entfernt, indem eine Nick-Säule (Pharmacia) gemäß der Vorschrift, die von dem Hersteller geliefert wurde, verwendet wurde, um ³²P-rnarkierte DNA (1 x 108 cpm/l µg DNA/400 µl) zu erhalten.
- Eine Membran, auf welcher DNA fixiert worden war, wurde 3 Stunden lang bei 42ºC in 10 ml einer Hybridisierungslösung (6 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), 5 x Denhardt's Lösung (0,1 % Kalbsserumalbumin, 0,1 % Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon), 0,5 % SDS, 100 µg denaturierte Lachssperma-DNA) inkubiert. Nachdem die Lösung verworfen worden war wurden 10 ml einer Hybridisierungslösung, die 1 x 10&sup6; cpm/ml enthielt, zu der Membran zugegeben und eine Inkubation wurde 3 Minuten lang bei 80ºC durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 42ºC. Nachdem die Lösung verworfen worden war wurde die Membran 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2 x SSC und dann 30 Minuten lang bei 60ºC mit 2 x SSC gewaschen.
- Man beachte, daß wenn ein Plasmid enzymatisch konstruiert wurde, die Reaktionsmischung verwendet wurde, um E. coli HB101 durch ein herkömmliches Verfahren zu transformieren, Transformanten abhängig von dem verwendeten E. coli-Markergen durch ein geeignetes Verfahren selektiert wurden, und die gewünschten Plasmide z.B. durch ein Minipräparationsverfahren aus den Transformanten extrahiert wurden, und durch Restriktionsspaltung gefolgt von einer elektrophoretischen Analyse analysiert wurden (siehe Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J., Molecular doning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Als nächstes wurde der selektierte Klon kultiviert und Plasmid- DNA wurde aus den kultivierten Zellen extrahiert, und wenn nötig wurde das Plasmid amplifiziert und erneut gewonnen. Dieses allgemeine Verfahren wurde, wenn nötig, bei der Konstruktion durchgeführt.
- Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, wobei in den Beispielen 1 bis 11 Verfahren durchgeführt werden, die einige der Ausgangsmaterialien zur Verwendung in den Beispielen 12 bis 17 zur Verfügung stellen, welche Konstruktion und Verwendung einer chimären Leitsequenz gemäß der Erfindung beispielhaft darstellen. Die Herstellung weiterer Ausgangsmaterialien ist in den Referenzbeispielen 1 und 2 beschrieben.
- Die folgenden vier Nukleotide:
- 1. AATTCATGAAGTGGGTTACTTTCATCTCTTTGTTGTT
- 2. AGAACAACAACAACAAAGAGATGAAAGTAACCCACTTCATC
- 3. CTTGTTCTCTTCTGCTTACTCTAGAGGTGTTTTCAGACG
- 4. CCCGTCTCAAAACACCTCTAGAGTAAGCAGAAG
- wurden durch das Phosphoamidit-Verfahren synthetisiert, das von Matteucci, M.D. und Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters, 21, 719 (1980) beschrieben wird, wobei ein automatisches DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems Modell 380D) verwendet wurde. Die Oligonukleotide wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase an ihren 5'-Enden phosphoryliert, reassozueren gelassen und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, um eine doppelsträngige DNA zu bilden, welche für eine Präprosequenz von HSA codiert. Diese doppelsträngige DNA hatte die Struktur, wie sie oben beschrieben ist.
- Das Plasmid pUC-HSA-CH, welches HSA-cDNA enthielt (Referenzbeispiel 2), wurde mit den Restriktionsenzymen EcoR 1 und Cla 1 doppelt verdaut, um ein größeres Fragment zu erhalten, welches dann unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit der oben erwähnten synthetischen DNA ligiert wurde, um das Plasmid pUC-HSA-EH zu konstruieren. Das Plasmid pUC- HSA-EH wurde mit EcoR I gespalten, durch bakterielle alkalische Phosphatase 5'-dephosphoryliert und mit einem Xho I- Linker mit der folgenden Sequenz:
- 5'-AATTCTCGAG
- GAGCTCTTAA-5'
- welcher eine Xho I-Erkennungsstelle enthielt, rezirkularisiert, um das Plasmid pUC-X-HSA zu bilden.
- Der Phage λgt 11 (HSA-1A), welcher einen 3'-terminalen Bereich der für HSA codierenden cDNA enthielt (Referenzbeispiel 1, Fig. 8), wurde mit EcoR I verdaut, um ein DNA- Fragment zu erhalten, welches HSA-cDNA enthielt, und dieses Fragment wurde mit dem Plasmid pUC 18 ligiert, welches mit EcoR I gespalten worden war, um das Plasmid pUC-HSA-I' zu erhalten. Das Plasmid pUC-HSA-I' wurde mit Hind III gespalten, um ein kleineres Fragment zu erhalten, welches eine HSA-poly A-Sequenz und ein AATAAA-Signal enthielt, und dieses Fragment wurde mit pUC-X-HSA ligiert, welches durch Hind III-Verdau linearisiert worden und durch alkalische Phosphatase 5'-dephosphoryliert worden war, um das Plasmid pUC-X-HSA-A zu konstruieren.
- Als ein grundlegender E. coli/Hefe-Shuttlevektor wurde das im Handel erhältliche Plasmid pJDB207 (Amersham) verwendet. Als eine Quelle für das Neo[aminoglucosid-3'-phosphotransferase (II)]gen wurde das Plasmid pNEO (Pharmacia) verwendet. Das Plasmid pNEO wurde mit Hind III und EcoR I doppelt verdaut, um ein größeres Fragment zu erhalten. Als nächstes wurde ein doppelsträngiges Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz:
- 5'-AATTCAAGCTTATCTCGAGGCCCGGG CTTCGAATAGAGCTCCGGGCCCTCGA-5'
- mit dem oben erwähnten größeren Fragment von pNEO unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, um das Plasmid pNEO PL zu erhalten. Das oben erwähnte doppelsträngige Oligonukleotid hatte, zusätzlich zu einem kohäsiven EcoR I-Ende am 5'-Terminus und einem Hind III-Ende am 3'-Terminus, interne Hind III-, Xho I- und Sma I-Stellen. Demgemäß hatte das Plasmid pNeO-PL mehr als eine Restriktionsspaltungsstelle stromaufwärts des Neo-Gens. Als nächstes wurde das Plasrnid pNEO-PL doppelt verdaut, um ein 1,4 kb-Fragment zu erhalten. Das Plasmid pJDB207 wurde mit Hind III und BamH I dop- pelt verdaut, um ein Vektorfragment zu erhalten, das einen 2 µm-Replikationsursprung und ein Markergen LEU2 enthielt, und dann wurden diese Fragmente unter Verwendung von T4- DNA-Ligase ligiert, um das Plasmid pJDB-Neo zu erhalten.
- Nachdem 100 µg chromosomale DNA aus Saccharomyces cerevi siae AH22 bei 37ºC 15 Minuten lang mit einer Einheit Sau 3A I in 200 µl 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl verdaut worden waren, wurden 10 µl 0,5 M EDTA (pH 8,0) zugegeben und es wurde 10 Minuten lang bei 65ºC inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren. Dann wurden 5 % Sucrose-TE (TE = 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) und 20 % Sucrose- TE verwendet, um in einem Gesamtvolumen von 12 ml einen Dichtegradienten herzustellen. Die oben erwähnte Reaktionsmischung wurde über diesen Gradienten geschichtet, und der Gradient wurde 15 Stunden lang bei 22 K UpM und 16ºC in einem SW41-Rotor (Beckmann) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde jede Fraktion einer Elektrophorese unterzogen, um eine Fraktion auszuwählen, welche 15 kb - 20 kb- Fragmente enthielt. Zu der Fraktibn wurden 50 µl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und dann 1 ml Ethanol zugegeben und das Ganze wurde gründlich gemischt und bei -20ºC über Nacht stehen gelassen, um DNA zu fällen. Die gefällte DNA wurde durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 4ºC und 15 K UpM gewonnen, der Niederschlag wurde mit 70% Ethanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, so daß 5 µg DNA erhalten wurden.
- Dann wurde 1 µg der so hergestellten DNA mit 2 µg EMBL3-arm (Stratagene) und 350 Einheiten T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo) gemischt und über Nacht bei 16ºC in 10 µl einer Reaktionsmischung inkubiert, welche 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP enthielt. Ein Mikroliter der Reaktionsmischung wurde verwendet, um eine in vitro-Verpak- kung unter Verwendung des GIGA-PACK Plus-Kits (Stratagene, #GP6-P) durchzuführen. Als Ergebnis wurden 3 x 10&sup5; Phagen erhalten, welche E. coli P2392 [hsdR 514 (rk&supmin;, mk&spplus;), supE44, supF58, lacY I, galK2, galT22, met B1, trpR55, (P2)] infizieren können. Die Phagen (1000 pfu) wurden zu 50 E. coli P2392-Zellen zugegeben, und nach einer Inkubation bei 37ºC für 20 Minuten wurde die Zeilmischung in 2,5 ml L-Top-Agarose [0,7 % Agarose in LB-Medium (1% Trypton, 0,5 % Hefeextrakt und 1% NaCl)] auf einer L-Platte (LB- Medium + 1,5% Agar) mit einem Durchmesser von 90 mm verteilt. Fünf Platten wurden hergestellt und über Nacht bei 37ºC inkubiert, um die Bildung von Plaques zu erlauben. Die Platten, auf welchen sich Plaques gebildet hatten, wurden eine Stunde lang bei 4ºC gelagert.
- Eine Hybond-N-Membran (Amersham) wurde auf die Agaroseschicht gelegt und zwei Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Membran wurde von der Agaroseoberfläche abgezogen und auf einen 3MM-Filter (Whatman), welcher mit 0,5 N NaOH-1 M NaCl getränkt war, gelegt, so daß die Oberfläche der Membran, welche mit der Agaroseoberfläche in Kontakt war, nach oben zeigte. Nachdem die Membran 5 Minuten lang stehen gelassen wurde, wurde sie dann auf einen 3MM-Filter überführt, welcher mit 0,5 M Tris-HCl (pH 7,2) - 1,5 M NaCl getränkt war, und 5 Minuten lang stehen gelassen, und die Membran wurde mit 2 x SSC gewaschen und an der Luft getrocknet. Die getrocknete Membran wurde mit SARAN- WRAP(TM) eingewickelt und mit UV-Licht bestrahlt, um die DNA auf der Membran zu fixieren. Die Membran wurde mit einer synthetischen ADH-Sonde (5'-ATG TCT ATC CCA GAA ACT CAA AAA GGT GTT-3) hybridisiert, welche der Nukleotidsequenz eines ADCL-Gens entsprach, das für die 10 N-terminalen Aminosäuren codierte. Die Membran wurde gewaschen und mit SAPANWRAP( ) eingewickelt, und bei -70ºC für 5 Stunden an einen XAR-5-Film (Kodack) ausgesetzt, wobei eine Verstärkerfolie verwendet wurde.
- Nach der Entwicklung wurde jeder Plaque, der ein Hybridisierungssignal zeigte, mit der Spitze einer Pasteur-Pipette aufgenommen und zu 50 µl P2392-Zellen zugegeben, die Mischung wurde 20 Minuten lang bei 37ºC stehen gelassen, in 2 ml LB-Medium - 10 mM MgSO&sub4; angeimpft und 6 Stunden lang bei 37ºC unter Schütteln kultiviert. Zu der Kultur wurden 100 µl Chloroform zugegeben und die Mischung wurde mit einem Vortex-Mischer gemischt, um Zellen zu lysieren. Das Lysat wurde 6 Minuten lang bei 25.000 UpM zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten. Der Überstand enthielt ungefähr 10¹&sup0; Phagen. Zu 800 µl des Überstandes wurden 100 µl 5 M NaCl und dann 540 µl Isopropanol zugegeben, und nach einem gründlichen Mischen wurde die Mischung 20 Minuten lang bei -20ºC stehen gelassen. Die Mischung wurde dann zentrifu giert, um einen Niederschlag zu erhalten, welcher mit 500 µl 70% Ethanol gewaschen wurde und in 200 µl TE gelöst wurde.
- Zu der Lösung wurden 1 µl DNase I (60 Einheiten/µl; Takara Shuzo) und 2 µl 1 M MgCl&sub2; zugegeben, und es wurde 30 Minuten lang bei 37ºC eine Reaktion durchgeführt. Zu der Mischung wurden 100 µl TE-gesättigtes Phenol zugegeben und die Mischung wurde mit einem Vortex-Mischer behandelt. Die Mischung wurde dann 5 Minuten lang bei 12 K UpM zentrifugiert, um eine wäßrige Schicht zu erhalten, welche einmal mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert wurde. Zu einer resultierenden wäßrigen Lösung wurden 20 µl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und dann 500 µl Ethanol zugegeben, und die Mischung wurde zentrifugiert, um DNA zu fällen. Die gefällte DNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und in 50 µl TE gelöst. Bei diesem Vorgang wurde 1 µg Phagen-DNA erhalten, und zu 20 µl der so erhaltenen Lösung wurden 2,2 µl 10 x EcoRI-Puffer (0,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,51 70 mM MgCl&sub2;) und dann 1 µl EcoR I (5 Einheiten/µl; Nippon Gene) und 1 µl 10 mg/ml RNase A (Sigma) zugegeben und eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung einer Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel unterzogen und DNA-Banden wurden durch ein herkömmliches Verfahren auf eine Hybond N-Membran geblottet. Die Hybond N-Membran, auf welcher die DNA gebunden war, wurde unter denselben Bedingungen, wie sie oben für die Plaque-Hybridisierung beschrieben wurden, einer Hybridisierung unterzogen. Bei einigen der so erhaltenen Klone war die Sonde an ein 8,4 kb-EcoR I-Fragment des Klons Ä-ADL gebunden. Dann wurden 20 µl der verbleibenden DNA-Lösung mit EcoR I behandelt und DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel abgetrennt, die Bande, welche das 8,4 kb-EcoR I-Fragment enthielt, wurde ausgeschnitten, und die DNA wurde aus der Agarosebande durch ein Glaspulver-Verfahren (Gene Clean , Bio-101) abgetrennt und gereinigt.
- Die DNA, welche in 10 µl TE eluiert wurde, wurde mit 30 ng pUC19 in 30 µl 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 350 Einheiten T4-DNA-Ligase 2 Stunden lang bei 16ºC ligiert, und 5 µl der Reaktionsmischung wurden verwendet, um E. coli JM107 zu transformieren. Die transformierten E. coli wurden auf einer L-Platte plattiert, die 50 µg/ml X-Gal, 5 mM IPTG und 50 µg/ml Ampicillin enthielt (X-G-Platte), um Kolonien zu bilden. Weiße Kolonien wurden gepickt und in 5 ml LB-Medium, welches 50 µg/ml Ampicillin enthielt, angeimpft und über Nacht bei 37ºC kultiviert. DNA wurde durch ein Minipräparationsverfahren präpariert, mit Ethanol gefällt und in 50 µl TE gelöst. So hergestellte DNA in 5 µl TE wurde mit EcoR I (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 1 mg/ml RNase A, 5 Einheiten EcoR 1/15 µl) gespalten und die Reaktionsmischung wurde einer Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel unterzogen, um die Einfügung des EcoR I-Fragmentes in pUC19 zu bestätigen. DNA des so erhaltenen Klons peco 8.4 wurde gereinigt, und 0,5 µg der DNA wurden vollständig mit Sau 3AI verdaut (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 7 InM MgCl&sub2;, 4 Einheiten Sau 3AI/15 µl, 37ºC, 2 Stunden), und DNA-Fragmente wurden durch eine Elektrophorese auf 0,7%igem Agarosegel getrennt. Dann wurde unter Verwendung von Gene Clean ein 1,6 kb-DNA- Fragment aus dem Agarosegel in 10 µl TE gewonnen.
- Diese DNA wurde mit pUC 119, das mit BamH I gespalten worden war, ligiert, und 5 µl der Reaktionsmischung wurden verwendet, um E. coli MV 1184 zu transformieren. Die transformierten E. coli-Zellen wurden auf einer X-G-Platte verteilt, um Kolonien zu bilden. DNA aus weißen Kolonien wurde durch das Minipräparationsverfahren präpariert und analysiert. Dann wurden 5 µg der DNA mit 5 Einheiten EcoR I und Einheiten ilind III oder mit 6 Einheiten Sph I gespalten, und jede Reaktionsmischung wurde durch Gelelektrophorese analysiert. Ein Klon, welcher in der ersten Spaltungsreaktion ein 1,6 kb-DNA-Fragment und in der folgenden Spaltungsreaktion ein 1,0 kb-DNA-Fragment ergab, wurde ausgewählt, und aus dem so erhaltenen Klon psau 1.6 wurde DNA präpariert und in dem folgenden Experiment verwendet.
- Zuerst wurden 5 µg der DNA mit Sma I und Sac I gespalten (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM KCl, 7 mM MgCl&sub2;, 20 Einheiten Sma I, 20 Einheiten Sac I/50 µl, 37ºC, 2 Stunden). Die Reaktionsmischung wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, und DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen. Der DNA-Niederschlag wurde in 50 µl Exo 111-Puffer (50 Ttim Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol) gelöst. Jeweils 50 µl MB-Puffer (40 mM Natriumacetat, pH 4,5, 100 mM NaCl, 2 mM ZnCl&sub2;, 10% Glycerol) wurden in Röhrchen gegeben, welche dann auf Eis gestellt wurden. Zu der oben hergestellten DNA-Lösung wurden 180 Einheiten Exo Ill-Nuklease (Takara Shuzo) zugegeben und die Mischung wurde bei 37ºC inkubiert. Aus der Reaktionsmischung wurden alle 30 Sekunden jeweils 5 µl der Proben entnommen und in die Röhrchen, welche MB-Puffer enthielten, gegeben. Nachdem das Probenehmen beendet war, wurden die Röhrchen von dem Eis zu einer Inkubation für 5 Minuten bei 65ºC überführt und auf 37ºC abgekühlt. Zu der Reaktionsmischung wurden 50 Einheiten Mungbohnen-Nuklease zugegeben, und das Ganze wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde mit TE-gesättigtem Phenol extrahiert. DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen und in 30 µl TE gelöst. Dann wurden zu 1 µl der DNA-Lösung 2 µl 10 x Ligationspuffer (500 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT, 10 mM ATP), und dann 16 µl TE und 1 µl T4-DNA-Ligase (350 Einheiten/µl) zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert. Als nächstes wurde die Mischung 10 Minuten lang bei 70ºC inkubiert, um die Ligase zu inaktivieren, 2 µl 0,2 M KCl und 1 µl Sma I (10 Einheiten/µl) wurden zugegeben, und das Ganze wurde eine Stunde lang bei 37ºC und dann 5 Minuten lang bei 70ºC inkubiert und auf Eis gestellt.
- Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli MV1184- Zellen zu transformieren, welche dann über Nacht bei 37ºC kultiviert wurden, um Kolonien zu bilden. DNA wurde aus den Kolonien präpariert und die Klone mit einer Deletionsmutation wurden selektiert. Als nächstes wurden einzelsträngige Phagen-DNAs der Klone mit der Deletion präpariert. Die Phagen-DNAs wurden sequenziert, indem ein 7-DEAZA-Dideoxy- Sequenzierungskit (Takara Shuzo) gemäß der Vorschrift des Herstellers verwendet wurde, und der Klon pDE 6-10, welchem ein Bereich von dem ATG bis zu einer Position -10 bp stromaufwärts fehlte, selektiert. DNA von pDE 6-10 wurde präpariert und 1 µg der DNA wurde vollständig verdaut und in 100 µl TE gelöst. Zu 2 µl dieser Lösung wurden 100 ng Xho-Linker (AATTGCTCGAGC) zugegeben, und eine Ligation wurde 2 Stunden lang bei 16ºC in 10 µl der Reaktionsmischung durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten lang bei 70ºC inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren, und nach einer Zugabe von 1 µl 0,5 M NaCl und 5 Einheiten EcoR I 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und verwendet, um E. coli MV1184 zu transformieren. DNA wurde aus den resultierenden Kolonien präpariert und ein Klon, welcher nicht mit EcoR I gespalten wurde, aber mit Xho I gespalten wurde, wurde selektiert. Aus diese Weise wurde ein Promotor-Kassettenvektor pDE6-10 (Xho) erhalten.
- Escherichia coli MV1184/pDE6-10 (Xho), welche den oben erwähnten Vektor pDE6-10 (Xho) enthielt, wurde am 30. September 1988 bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRL), 1-3, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan als FERM P- 10311 hinterlegt, und am 8. September 1989 als FERM BP-2589 in eine internationale Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag überführt.
- Zuerst wurde 1 µg pECO 8.4 eine Stunde lang bei 37ºC mit 4 Einheiten Bal 1 in 20 µl 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2; gespalten. Als nichstes wurden zu der Reaktionsmischung 3 µl 1 M NaCl und 4 Einheiten Sph I zugegeben, und die Mischung wurde eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde einer Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel unterzogen, um ein 1 kb-DNA-Fragment abzutrennen, welches dann mit Gene Clean( ) extrahiert wurde. Die gewonnene DNA wurde mit pUC 18 ligiert, welches mit Sph I und Sma I gespalten worden war, und die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli MV1184 zu transformieren. DNA wurde aus den Transformanten präpariert und ein Klon, welcher das Fragment enthielt, wurde selektiert. Aus dem Klon wurde DNA präpariert und 1 µg der DNA wurde mit 4 Einheiten Sph I und 12 Einheiten Hind III in 1 x EcoR I- Puffer gespalten und einer Elektrophorese auf 1,2%igem Agarosegel unterzogen, um ein 0,33 kb-DNA-Fragment abzutrennen, welches dann mit Gene Clean(TM) extrahiert wurde. Dieses DNA-Fragment wurde in einem Gesamtvolumen von 20 µl mit 50 ng des 5.7 kb-DNA-Fragmentes ligiert, welches durch Doppelverdau des Plasmids PMMTV-PLI mit Hind III und Sph I erhalten worden war.
- Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli JM107 zu transformieren, welchen dann erlaubt wurde, auf einer L- Platte, die Ampicillin enthielt (L-Amp-Platte), Kolonien zu bilden. DNA wurde aus den Kolonien präpariert, und die eingefügte DNA wurde durch Restriktionsanalyse getestet, um einen Klon zu erhalten, welcher ein gewünschtes DNA-Fragment enthielt. DNA wurde aus dem Klon präpariert und 0,5 µg der DNA wurden mit Hind III gespalten. Nach einer Inkubation für 5 Minuten bei 70ºC wurde die Reaktionsmischung auf Eis überführt und nach einer Zugabe von 2 Einheiten DNA- Polymerase (Klenow-Fragment; Takara Shuzo) 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Nach einem Entfernen von Proteinen durch Phenol/Chloroform-Extraktion wurde DNA mit Ethanol gefällt, die DNA wurde in 10 µl 1 x Ligationspuffer gelöst und nach der Zugabe von 350 Einheiten T4-DNA-Ligase wurde die Mischung über Nacht bei 16ºC inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten lang bei 70ºC behandelt, um die Ligase zu inaktivieren, und nach der Zugabe von 1,2 µl 0,5 M NaCl und 12 Einheiten Hind III 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli JM107 zu transformieren. Einige Kolonien, die sich auf einer L-Amp-Platte gebildet hatten, wurden in flüssigem L- Amp-Medium (L-Amp-Medium ohne Agar) kultiviert und aus den resultierenden Zellen wurde DNA präpariert, und ein Klon, welcher ein Plasmid enthielt, dem eine Hind III-Stelle fehlte, wurde selektiert. DNA wurde aus dem selektierten Klon präpariert und 0,5 µg der DNA wurden mit 4 Einheiten BamH I und 12 Einheiten Sph I in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl und 7 mM MgCl&sub2; gespalten. Dann wurde ein 0,34 kb-DNA-Fragment durch eine Elektrophorese auf einem 1,4%igen Agarosegel abgetrennt und in 10 µl TE über Gene Clean TM gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde mit einem 3,5 kb-DNA-Fragment ligiert, welches durch Spalten von 30 ng patls3 mit BamH I und Sph I erhalten wurde.
- Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli JM107 zu transformieren, um Kolonien auf einer L-Amp-Platte zu bilden, und einige Kulturen wurden in flüssigem L-Amp-Medium kultiviert, DNA wurde aus den kultivierten Zellen präpariert, und ein Klon, welcher bei einem Doppelverdau mit BamH I/Sal I ein 0,42 kb-DNA-Fragment ergab, wurde selektiert. Dann wurden 0,5 µg der so erhaltenen klonierten DNA mit BamH I und Sal I gespalten, und ein 0,42 kb-DNA-Fragment wurde über eine Elektrophorese aufl,4%igem Agarosegel abgetrennt und über Gene Clean( ) in 5 µl TE gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde mit 10 ng pUC119 ligiert, welcher mit BamH I und Sal I gespalten worden war, und die Reaktionsmischung wurde verwendet, um E. coli MV1184 zu transformieren, welche dann auf einer X-G-Platte plattiert wurden, um Kolonien zu bilden. DNA wurde aus den resultierenden weißen Kolonien präpariert und ein Klon, welcher das DNA- Fragment enthielt, wurde erhalten. Dieser Terminator-Kassettenvektor wurde als pUC-ATE bezeichnet.
- Escherichia coli MV1184 (pUC-ATE), welche den Vektor pUC- ATE enthielt, wurde am 30. September 1988 als FERM P-10310 bei der FRI hinterlegt und am 8. September 1989 als FERM BP-2588 in eine internationale Hinterlegung überführt.
- Der Promotor-Kassettenvektor pDE6-10 (Xho) (0,5 µg) wurde mit Hind III und Xho I gespalten und ein 1,6 kb-DNA-Fragment wurde durch eine Elektrophorese auf 0,7%igem Agarosegel isoliert. Andererseits wurden 0,5 µg pJDB-Neo mit Hind III und Xho I gespalten und ein 8 kb-DNA-Fragment wurde isoliert. Beide DNA-Fragmente wurde zusammen ligiert und die Ligationsprodukte wurden verwendet, um E. coli JM107 zu transformieren, was zu der Bildung von ampicillinresistenten Kolonien führte. DNA wurde aus den Kolonien erhalten und ein Klon mit einem gewünschten Plasmid, welches als pAH6-10-Neo bezeichnet wurde, wurde bestätigt. Das Plasmid pJDB-Neo (0,5 µg) wurde mit BamH I und Sal I gespalten, um ein DNA-Fragment mit ca. 8 kb in der Größe zu erhalten. Andererseits wurde 1 µg pUC-ATE mit BamH 1 und Sal I verdaut, um ein 0,42 kb-Fragment zu erhalten. Die beiden Fragmente wurden ligiert und das Ligationsprodukt wurde verwen det, um E. coli JM107 zu transformieren. DNA wurde aus den ampicillinresistenten Klonen präpariert und analysiert, um zu bestätigen, daß der Klon ein gewünschtes Plasmid enthielt, welches als pJDB-Neo-ATE bezeichnet wurde. Dann wurden 0,5 µg des Plasmids pJDB-Neo-ATE mit Hind III und Xho I gespalten, um ein DNA-Fragment mit ca. 8 kb in der Größe zu erhalten. Andererseits wurde aus pDE-6-10 (Xho) ein 1,6 kb- Hind III-Xho I-Fragment gewonnen. Beide Fragmente wurden ligiert und die resultierenden Plasmide wurden verwendet, um E. coli JM107 zu transformieren. DNA aus ampicillinresi stenten Kolonien wurde getestet, um einen Klon zu finden, welcher das gewünschte Plasmid, das als pAH6-10-Neo-ATE bezeichnet wurde, aufwies.
- Escherichia coli JM107/PAH6-10-Neo-ATE, welche den oben hergestellten Vektor enthielt, wurde am 30. September 1968 als FERM P-10309 bei der FRI hinterlegt und am 8. September 1989 als FERM BP-2587 in eine internationale Hinterlegung überführt.
- Das Plasmid PAH6-10-Neo-ATE, welches wie oben beschrieben hergestellt wurde, das einen ADH-Promotor stromaufwärts des Neo-Gens und einen ADH-Terminator stromabwärts des Neo-Gens aufwies, wurde mit Xho I und BamH I doppelt verdaut, um ein Vektorfragment zu erhalten, dem das Neo-Gen fehlte. Andererseits wurde das Plasmid pUC-X-HSA-A, welches HSA-cDNA (Beispiel 3) enthielt, mit Xho I und BamH 1 doppelt ver daut, um ein DNA-Fragment zu erhalten, welches eine cDNA enthielt, die für Präpro-HSA codierte, welche eine künstliche Leitsequenz und eine poly A-Sequenz umfaßte. Diese DNA- Fragmente wurden ligiert, um ein Expressionsplasmid pJDB- ADH-HSA-A zu konstruieren.
- Eine Transformation von Hefe-Wirtszellen mit Expressionsplasmiden wurde durch eine leichte Modifikation des KUR- Verfahrens durchgeführt, welches von H. Hashimoto und H. Kimura beschrieben wird (Hakko To Kogyo, 43, 630 - 637, 1985). Zuerst wurden 0,1 ml einer Übernacht-Vorkultur von Saccharomyces cerevisiae AH22 (MATA, leu 2-3, leu 2-112, his 4-519, Canl) in YPD-Medium [2% Polypepton (Difco), 1% Hefeextrakt (Difco) und 2% Glucose] in 5 ml YPD-Medium angeimpft und ca. 4 Stunden lang unter Schütteln bei 30ºC kultiviert, bis die Trübung bei OD&sub6;&sub0;&sub0; 0,5 erreichte. Die Kultur wurde dann 5 Minuten lang bei 4ºC und 2.000 UpM zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, welche dann in 5,0 ml 1,0 M LiSCN resuspendiert wurden, und 1,5 ml der Suspension wurden 5 Minuten lang bei 2.000 UpM oder eine Minute lang bei 10.000 UpM zentrifugiert. Die so erhaltenen Zellen wurden in 10 µ1 2 M LiSCN und 46 µl 50% PEG 4000 resuspendiert, und zu dieser Suspension wurden 10 µl DNA-Lösung zugegeben (welche 5 bis 10 µg DNA enthielt), und die Mischung wurde über Nacht bei 30ºC inkubiert. Zu der Suspension wurde 1 ml steriles destilliertes Wasser zugegeben und das Ganze wurde leicht mit einem Vortex-Mischer vermischt. Als nächstes wurde die Suspension 5 Minuten lang bei 2.000 UpM oder eine Minute lang bei 10.000 UpM zentrifugiert, und die gesammelten Zellen wurden in 100 µl sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Die Suspension wurde dann auf einer selektiven Agarplatte verteilt. [SD- Medium: 20 µg/ml Adeninsulfat, 20 µg/ml Argininhydrochlorid, 20 µg/ml Methionin, 20 µg/rnl Histidinhydrochlorid, 20 µg/ml Tryptophan, 20 µg/ml Uracil, 30 µg/ml Isoleucin, 30 µg/ml Lysinhydrochlorid, 30 µg/ml Tyrosin, 50 µg/ml Phenylalanin, 150 µg/ml Valin, 0,15% aminosäurefreie Hefe-Stickstoffbase (Difco), 0,5% Ammoniumchorid, 2% Dextrose und 1,5% Agar]. Die resultierenden Kolonien (Leu&spplus;) wurden in 5 ml SD-Medium suspendiert und 2 Tage lang bei 30ºC kultiviert. Die Kultur wurde 5 Minuten lang bei 4ºC und 2.000 UpM zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, welche dann in 0,5 ml 1 M Sorbitol resuspendiert wurden. Die Suspension wurde zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, welche dann in 0,5 ml 1 M Sorbitol, 0,1% 2-Mercaptoethanol und 400 µg/ml Zymolase-100T (Seikagaku Kogyo) resuspendiert wurden. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 30ºC inkubiert, um Sphäroplasten zu bilden, welche dann 5 Minuten lang bei 2.000 UpM zentrifugiert wurden. Die gesammelten Sphäroplasten wurden in 100 µl Lösung I (50 Mm Glucose, 10 mM EDTA und 25 mM Tris-HCl, pH 8,0) resuspendiert, und nach der Zugabe von 200 µl Lösung II (0,2 N NaOH, 1% SDS) wurde die Suspension gründlich gemischt und 5 Minuten lang auf Eis gestellt. Zu der Suspension wurden 150 µl 5 M Kaliumacetat zugegeben und die Suspension wurde gründlich gemischt, und nachdem sie 10 Minuten lang auf Eis gestellt wurde, 5 Minuten lang bei 4ºC und 15.000 UpM zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, welcher dann in ein frisches Röhrchen überführt wurde. Ein gleiches Volumen Phenol/Chloroform (1:1) wurde zu dem Überstand zugegeben und das Ganze wurde kräftig gemischt und 5 Minuten lang bei 12.000 UpM zentrifugiert, um eine wäßrige Schicht zu erhalten, welche dann in ein frisches Röhrchen überführt wurde. Zu der wäßrigen Schicht wurden 750 µl Ethanol zugegeben und die Mischung wurde mit einem Vortex-Mischer gründlich gemischt. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei 15.000 UpM zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten, zu welchem 0,5 ml 70% Ethanol zugegeben wurden. Diese Mischung wurde mit einem Vortex-Mischer gemischt und 5 Minuten lang bei 15.000 UpM zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten. Der so erhaltene DNA-Niederschlag wurde unter vermindertem Druck getrocknet und in 30 µl TE-Puffer gelöst. Die DNA-Präparation, welche aus den AH22-Transformanten erhalten wurde, die das Plasmid pJDB-ADH-HSA-A enthielten, wurde allein oder in Kombination mit verschiedenen Restriktionsenzymen, wie z.B. Hind III, Xho I, EcoR I, BamH I und Sal I verdaut, und die resultierenden Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese und Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert, um die Struktur des Plasmids zu bestätigen.
- Eine einzelne Kolonie, die sich auf einer SD (-Leu)-Platte gebildet hatte, wurde in 5,0 ml frischem flüssigem SD (- Leu)-Medium suspendiert und 2 Tage lang unter Schütteln bei 30ºC kultiviert, bis eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von ca. 2,0 erreicht war, dann wurden 0,1 ml der Kultur zu 5,0 ml YPD-Medium zugegeben und 24 Stunden lang bei 30ºC kultiviert, bis eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von ca. 3,0 erreicht war. Die Kultur wurde 10 Minuten lang bei 4ºC und 5.000 UpM zentrifugiert, um eine Überstandsfraktion zu erhalten. Zu der Überstandsfraktion wurde ein gleiches Volumen 99%iges Ethanol zugegeben und das Ganze wurde gemischt und 30 Minuten lang bei 4ºC stehen gelassen. Als nächstes wurde die Mischung 10 Minuten lang bei 4ºC und 12.000 UpM zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten. Der Niederschlag wurde in 100 µl 1 x Beladungspuffer (5% 2-Mercaptoethanol, 0,0025% Bromphenolblau, 2% SDS, 0,025 M Tris-HCl und 8% Glycerol) gellst, und 10 µl der Lösung wurden auf ein Elektrophoresegel [SDS-PolyacrylamidpH 8,4, 0,192 M Glycin und 0,1% SDS) bei einem konstanten Strom von 60 mA 60 Minuten lang durchgeführt. Als Molekulargewichts(MW)-Marker wurden Eiweißlysozym (MW 14.400), Sojabohnentrypsininhibitor (MW 21.500), Carbonsäureanhydrase (MW 31.000), Ovalbumin (MW 45.000), Rinderserumalbumin (MW 66.200) und Phosphorylase B (MW 92.500) verwendet, welche alle von BIO-RAD erhalten wurden. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine in dem Gel mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt oder wie im folgenden beschrieben nach Western-Blotten immunologisch nachgewiesen. Nach der Elektrophorese wurden die getrennten Proteine auf einen Nitrocellulosefilter (BIO-RAD) überführt, indem ein Halbtrocken- Blotter (Sartonus) verwendet wurde. Der Filter wurde nämlich eine Stunde lang in Methanol und dann in 25 mM Tris- HCl (pH 10,4)/20% Methanol getränkt und an einem Elektrophoresegel befestigt. Dieses wurde von beiden Seiten mit Filterpapieren bedeckt, welche in dem oben erwähnten Puffer und 0,3 M Tris-HCl (pH 10,0), welcher 20% Methanol und 25 mM Tris-HCl (pH 9,4)/40 InM 6-Amino-n-capronsäure enthielt, getränkt worden waren, und wurde in den Blotter gegeben. Nach dem Anlegen einer konstanten Spannung von 6 V für ca. 1,5 Stunden wurde der Filter gewaschen, indem er eine Stunde lang bei 37ºC in einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,5)/500 mM NaCl (TBS), welche 3% Gelatine enthielt, und dann 5 Minuten lang in TBS/0,05% Tween-20 geschüttelt wurde. Als nächstes wurde der Filter über Nacht bei Raumtemperatur in 40 ml einer Lösung, welche einen anti-humanes Serumalbumin-Kaninchenantikörper (Cappel) enthielt, welcher 2.000-fach mit TBS, welcher 1% Gelatine enthielt, verdünnt worden war, geschüttelt. Der Filter wurde unter Schütteln mit TBS (pH 7,5), welcher 0,05% Tween-20 (T-TBS) enthielt, gewaschen. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt. Der Filter wurde dann einer Stunde lang bei Raumtemperatur in 40 ml einer Lösung, welche einen sekundären Antikörper (anti- Kaninchen IGG-Antikörper aus Ziegen, mit Merrettich-Peroxidase markiert; BIO-RAD) enthielt, der 3.000-fach mit TBS, welcher 1% Gelatine enthielt, verdünnt worden war, geschüttelt. Als nächstes wurde der Filter zweimal 5 Minuten lang mit T-TBS und einmal 5 Minuten lang wie oben beschrieben mit TBS gewaschen. Der Filter wurde in einer Mischung aus ml Methanol, welches 30 mg 4-Chlornaphtol enthielt, 50 ml TBS und 30 µl 30% Wasserstoffperoxid getränkt, um eine Bande nachzuweisen, welche HSA entsprach, und die Entwicklungsreaktion wurde durch Verdünnen mit destilliertem Wasser beendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt. In dieser Figur stellt (A) ein Ergebnis der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, gefolgt von einer Färbung mit Coomassie Brilliant Blue dar, worin die linke Bahn Molekulargewichtsmarker darstellt und die rechte Bahn ein Ergebnis für eine Probe, die HSA enthält, welches von Hefetransformanten produziert und sezerniert wurde, darstellt; und (B) ein Ergebnis einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, gefolgt von einem Western-Blotten und einem Binden mit einem anti-HSA Antikörper, um spezifisch HSA und die Fragmente davon anzufärben, darstellt, worin die linke Bahn ein Ergebnis für HSA darstellt, welches aus humanem Serum gereinigt wurde, und die rechte Bahn ein Ergebnis für HSA darstellt, welches von Hefetransformanten produziert und sezerniert wurde.
- Eine Probe von HSA, das aus einer Hefekultur isoliert wurde, wurde mit 2-Mercaptoethanol reduziert, mit SDS behandelt und auf ein 12% - 30% Polyacrylamid-Gradientengel in SDS aufgetragen, und eine Elektrophorese wurde unter den Bedingungen durchgeführt, die von Laemmli, U.K., Nature, 227, 680 - 685, 1970 beschrieben werden. Als Molekulargewichtsmarker wurden Phosphorylase B (MW 94.000), Rinderserumalbumin (MW 67.000), Ovalbumin (MW 45.000), Carbonsäureanhydrase (MW 31.000), Sojabohnentrypsininhibitor (MW 21.500) und Lactalbumin (MW 14.000) verwendet. Proteine wurden durch Färben mit Coomassie Brilliant Blue nachgewiesen. Gleichzeitig wurde als eine Kontrolle im Handel erhältliches HSA, welches aus humanem Serum gereinigt war, mitlaufen gelassen, und die Mobilität der beiden HSAS wurde verglichen. Als ein Ergebnis zeigten HSA, welches von Hefetransformanten erzeugt wurde, und HSA, welches aus humanem Serum stammte, dieselbe Mobilität, und ihr Molekulargewicht betrug 67.000, wie in Fig. 12 gezeigt ist.
- Eine Probe von HSA, welche aus einer Hefekultur isoliert worden war, wurde auf ein 12% - 30% Polyacrylamid-Gradientengel ohne SDS aufgetragen, und eine Elektrophorese wurde unter den Bedingungen wie sie oben beschrieben sind, aber ohne SDS, durchgeführt. Proteinbanden wurden durch Färben mit Coomassie Brilliant Blue nachgewiesen. Gleichzeitig wurde als Kontrolle ein im Handel erhältliches HSA, welches aus humanem Serum gereinigt worden war, mitlaufen gelassen, und deren elektrisches Verhalten wurde verglichen. Bei der nativen (ohne SDS) Gelelektrophorese zeigten HSA, welches von Hefetransformanten produziert wurde, und HSA, welches aus humanem Serum stammte, dasselbe elektrophoretische Verhalten, wie in Fig. 13 gezeigt ist.
- Eine isoelektrische Fokussierung wurde durchgeführt, indem eine Ampholin-PAG-Platte, pH-Bereich von 3,5 - 9,5 (LKB), gemäß der Vorschrift des Herstellers verwendet wurde. Als Marker für den isoelektrischen Punkt wurden LKB's PI- Marker, d.h. C-Phycocyanin (pl 4,75, 4,85), Azurin (pI 5,65), trifluoracetyliertes Myoglobin (aus Schweinen pI 5,9), Myoglobin (aus Schweinen pI 6,45), Myoglobin (aus Pferden pI 7,3), Myoglobin (aus Wal pI 8,3) und Cytochrom C (pI 10,6) verwendet. HSA, das von Hefetransformanten produziert wurde, zeigte eine Hauptbande bei PI 4,9 und zwei Nebenbanden bei pI 4,7 und 4,65, welche dieselben waren wie bei HSA, das aus humanem Serum gereinigt wurde. Dieses Ergebnis ist in Fig. 14 dargestellt.
- Eine Immundiffusion wurde gemäß einem Verfahren von Ouchterlony, Ö, Progr. Allergy, 6, 30, 1962 durchgeführt. Nach der Bildung von Präzipitationslinien (precipitin lines) und Deproteinierung mit physiologischer Salzlösung wurden die Präzipitationslinien mit Coornassie Brilliant Blue gefärbt. Die Antiseren, welche für den Immundiffusionstest verwendet wurden, waren anti-HSA-Antiserum aus Kaninchen (Cappel) und anti-HSA-Antiserum aus Ziegen (PEL FREEG). Bei der Verwendung jedes Serums war die Präzipitationslinie von HSA, welches durch Hefetransformanten produziert wurde, mit einer Präzipitationslinie von HSA, welches aus humanem Serum gereinigt wurde, vollständig verschmolzen, was das Fehlen eines antigenen Unterschiedes zwischen den HSAs zeigt. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 dargestellt.
- (4) Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz Die N-terminale Aminosäuresequenz von HSA, welches von Hefetransformanten produziert wurde, wurde bestimmt, indem ein Gasphasen-Proteinsequenziergerät 477 A (Applied Biosystems) gemäß der Vorschrift des Herstellers verwendet wurde. Als ein Ergebnis ergab sich eine Aminosäuresequenz von dem N-terminalen Asp bis zu dem 32. Gln, welche mit der berichteten Aminosäuresequenz von dem N-Terminus bis zu der 32. Aminosäure von HSA aus humanem Serum völlig identisch war. Von der Rückgewinnung der N-terminalen Aminosäuren aus berechnet wurde abgeschätzt, daß die getestete HSA-Präparation eine N-terminale Homogenität von wenigstens 93% aufwies. Bei der Bestimmung der N-terminalen Sequenz wurde die Abwesenheit eines Präpro- oder Pro-HSA aufgrund einer unvollständigen Prozessierung bestätigt.
- Die N-terminale Aminosäuresequenz von HSA, das von Hefetransformanten produziert wurde, war wie folgt:
- Als Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Gerät wurde ein Applied Biosystems 130A Trennsystem, welches mit einer Aquapore RP-300-Säule (2,1 mm I.D x 30 mm) ausgerüstet war, verwendet. Die Säule wurde mit 0,1% Trifluoressigsäure äquilibriert, und die Elution von Proteinen wurde 45 Minuten lang bei einer Flußgeschwindigkeit von 200 µl/Minute mit einem Acetonitril-Konzentrationsgradienten von 0% bis 100% in 0,1% Trifluoressigsäure durchgeführt.
- Unter diesen Bedingungen lieferte HSA, welches von Hefetransformanten produziert wurde, einen einzigen scharfen Peak mit einer Retentionszeit und einer Gestalt, die nicht von jenen des HSA, welches aus humanem Serum gereinigt wurde, zu unterscheiden waren. Wenn diese zwei HSAs gemischt wurden und die Mischung auf der Säule chromatographiert wurde, lieferte darüber hinaus die Mischung einen einzigen scharfen Peak, was zeigte, daß das Verhalten dieser zwei HSAs auf der Umkehrphasensäule völlig identisch war.
- Das Ergebnis ist in Fig. 16 dargestellt. In dieser Figur stellen A, B und C ein Ergebnis einer Umkehrphasensäulenchromatographie für HSA, das von Hefetransformanten produziert wurde, HSA, das aus hurnanem Serum stammte, bzw. eine Mischung daraus dar.
- Für die HPLC wurde ein SCL-6A-System, LC-6A Serie, (Shimazu Seisakusho), welches mit einer analytischen Hochtrennungs Hydroxylapatitsäule TAPS-020810 (7,2 mm I.D x 10 cm) (Tonen) ausgerüstet war, verwendet. Die Elution wurde für Minuten bei einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute mit einem linearen Gradienten von 10 mM Phosphatpuffer/0,05% Natriumazid bis 0,3 M Phosphatpuffer/0,05% Natriumazid durchgeführt. Um eine Probe für die Analyse herzustellen, wurde der Überstand der Kultur von Hefetransformanten unter Verwendung von DEAE-Sepharose CL-6B konzentriert, das Konzentrat wurde einer Ammoniumsulfatfällung bei 40% Sättigung unterworfen, um den Überstand zu erhalten, welcher dann einer Ammoniumsulfatfällung bei 60% Sättigung unterworfen wurde, um einen Niederschlag zu erhalten. Die Retentionszeit von HSA, das von Hefetransformanten produziert wurde, betrug 11,5 Minuten, was mit der von HSA, das aus humanem Serum gereinigt wurde, identisch war. Demgemäß waren auch bei dem Verhalten auf einer Hydroxylapatitsäule die HSAS nicht zu unterscheiden.
- Dieses Ergebnis ist in Fig. 17 dargestellt, worin A und B ein Ergebnis einer Hydroxylapatitchromatographie für eine Konzentratfraktion aus einer Hefekultur bzw. aus HSA, das aus humanem Serum gereinigt wurde, darstellen.
- Eine DNA-Sequenz, die für ein chimäres Signalpeptid codiert, welches an seinem N-Terminus eine Aminosäuresequenz, die leicht eine α-Helix bildet, und an seinem C-Terminus eine Aminosäuresequenz eines entsprechenden Bereichs des Hefeinvertase-Signalpeptids umfaßt, wurde wie folgt entworfen. Für eine bequeme Einfügung der synthetischen DNA in einen Vektor war der 5'-Terminus der DNA ein kohäsives EcoR I-Ende. Um eine direkte Ligation der synthetischen DNA an ihrem 3'-Terminus mit dem 5-Terminus einer DNA zu erlauben, die für ein gewünschtes reifes Protein codierte, wurde die 3'-terminale Nukleotidsequenz der synthetischen DNA so ausgewählt, daß ein Codon für die C-terminale Aminosäure Alanin der DNA und eine benachbarte Adapter-Nukleotidsequenz die Nae I-Erkennungssequenz bilden. Man beachte, daß die synthetische DNA-Sequenz, da die Nae I-Erkennungssequenz GCCGGC eine Hpa II-Erkennungssequenz enthält, mit einem Gen für ein reifes Protein, welches ein 5'-terminales kohäsives Hpa 11-Ende aufweist, ligiert werden kann.
- Um die DNA zu konstruieren, welche für das chimäre Signalpeptid codiert, wurden die folgenden vier Oligodeoxyribonu kleotide synthetisiert:
- 1. 5'-AATTCATGAAGTTGTTGCTCCTCCTTCTTTTGCTCTT
- 2. 5'-AGAACAAGAAGAGCAAAAGAAGGAGGAGCAACAACTTCATG
- 3. 5'-CTTGTTCTCTGCTAAGATTTCTGCCGGC
- 4. 5,-GCCGGCAGAAATCTTAGCAG.
- Die synthetischen Oligonukleotide 2 und 3 wurden an ihren 5-Termini unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und mit den synthetischen Oligonukleotiden 1 und 4 gemischt, um zu reassozueren. Als nächstes wurde die reassozuerte Mischung mit T4-DNA-Ligase behandelt, um eine DNA zu konstruieren, die für ein chimäres Signalpeptid in voller Länge codierte. Die so konstruierte doppelsträngige DNA hatte die folgende Sequenz:
- Die doppelsträngige DNA, welche für das chimäre Signalpeptid codierte, hatte ein 5'-terminales kohäsives EcoR I-Ende und ein 3'-terminales glattes Ende. Um die DNA zu amplifizieren, wurde das Plasmid pUC19 mit EcoR I und Sma I doppelt verdaut, um ein größeres Fragment zu erhalten. Das Vektorfragment wurde mit der synthetischen DNA ligiert, um das Plasmid pUC-LY3 zu konstruieren. In dem Plasmid pUC- HSA-CH (Referenzbeispiel 2) lag vor einem GAT, das für Asp codiert, was eine N-terminale Aminosäure von reifem HSA war, ein C, um eine Sequenz CGAT zu bilden, welche ein kohäsives Cla I-Ende liefert, und in dem 3'-terminalen nicht-Translationsbereich dehnt sich die HSA-cDNA bis zu der Hind III-Stelle aus. Daher kann durch doppeltes Verdauen des Plasmids pUC-HSA-CH mit Cla I und Hind III eine cDNA erhalten werden, die für ein vollständiges reifes HSA codiert. Das Plasmid pUC-LY3 wurde mit EcoR I und Hpa II doppelt verdaut, um ein doppelsträngiges Fragment mit 63 bp zu erhalten, und das Plasmid pUC-HSA-CH wurde mit EcoR I und Cla I doppelt verdaut, um ein größeres Fragment zu erhalten. Diese Fragmente wurden unter Verwendung von T4- DNA-Ligase ligiert, um ein rekombinantes Plasmid pUC-LY3- HSA zu konstruieren.
- Das oben erwähnte Plasmid wurde mit EcoR I gespalten und die Phosphatgruppe an dem 5'-Terminus des linearen Plasmids wurde durch alkalische Phosphatase entfernt. Dieses lineare Plasmid wurde mit einem synthetischen Linker mit kohäsiven EcoR I-Enden an beiden Enden und mit einer internen Xho I- Stelle (Eco-Xho-Eco-Linker):
- 5'-AATTCTCGAG-3'
- 3'-GAGCTCTTAA-5'
- rezirkularisiert, um das Plasmid pUC-X-LY3-HSA zu konstruieren. Das Plasmid pUC-X-LY3-HSA wurde an der Hind III- Stelle, welche stromabwärts eines Strukturgens, das für HSA codiert, vorhanden ist, gespalten und das lineare Plasmid wurde mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Ein rekombinantes Plasmid pUC-HSA-I' (Beispiel 3) wurde mit Hind III verdaut, um ein Hind III-Fragment mit ca. 200 bp zu erhalten, welches einen nicht-codierenden 3'-Bereich (ein poly A-Additionssignal und eine poly A-Sequenz) der HSA-cDNA enthielt. Diese DNAs wurden ligiert, um ein rekombinantes Plasmid pUC-LY3-HSA-A zu konstruieren. Dieses Plasmid wurde mit Xho I und BamH I doppelt verdaut, um ein 2,0 kb-Fragment zu erhalten, welches dann mit einern Xho I- BamH I-Fragment von 8,1 kb aus einem Hefe-Expressionsvektor PAH6-10-Neo-ATE (Beispiel 7) ligiert wurde, welches einen Promotor und einen Terminator des Hefe-Alkoholdehydrogenase (ADHI)-Gens (ADCI) enthielt, um ein rekombinantes Expressionsplasmid pJDB-ADH-LY3-HSA-A für die Produktion eines fusionierten Proteins, welches das künstliche Signalpeptid und reifes HSA umfaßte, zu konstruieren.
- Escherichia coli HB101/pJDB-ADH-LY3-HSA-A, welche das oben erwähnte Plasmid enthielt, wurde am 8. Juni 1989 bei der FRI unter dem Budapester Vertrag als FERM BP-2455 hinterlegt.
- Die Transformation von Hefe-Wirtszellen mit dem Expressionsplasmid pJDB-ADH-LY3-HSA-A wurde durch eine leichte Modifikation des KUR-Verfahrens durchgeführt, welches von H. Hashimoto und H. Kimura, Hakko to Kogyo, 43, 630 - 637, 1985 beschrieben wird. Zuerst wurden 0,1 ml einer Übernacht-Vorkultur von Saccharomyces cerevisiae AH 22 (MATA, leu 2-3, leu 2-112, his 4-519, Can I) in YPD-Medium (2% Polypepton (Difco), 1% Hefeextrakt (Difco) und 2% Glucosej in 5. ml YPD-Medium angeirnpft und ca. 4 Stunden lang bei 30ºC unter Schütteln kultiviert, bis die Trübung bei OD&sub6;&sub0; 0,5 erreichte. Die Kultur wurde 5 Minuten lang bei 4ºC und 2.000 UpM zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, welche dann in 5,0 ml 0,1 M LiSCN resuspendiert wurden, und 1,5 ml der Suspension wurden 5 Minuten lang bei 2.000 UpM oder eine Minute lang bei 10.000 UpM zentrifugiert. Die so erhaltenen Zellen wurden in 10 µl 2 M LiSCN und 46 µl 50% PEG 4000 resuspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 µl DNA-Lösung (welche 5 bis 10 µg DNA enthielt) zugegeben, und die Mischung wurde bei 30ºC über Nacht inkubiert. Zu der Suspension wurde 1 ml steriles destilliertes Wasser zugegeben und das Ganze wurde leicht mit einem Vortex-Mischer gemischt. Als nächstes wurde die Suspension 5 Minuten lang bei 2.000 UpM oder eine Minute lang bei 10.000 UpM zentrifugiert, und die gesammelten Zellen wurden in 100 µl stenlem destilliertem Wasser resuspendiert. Die Suspension wurde dann auf einer selektiven Agarplatte (SD-Medium 20 µg/ml Adeninsulfat, 20 µg/ml Argininhydrochlorid, 20 µg/ml Methionin, 20 µg/ml Histidinhydrochlorid, 20 µg/ml Tryptophan, 20 µg/ml Uracil, 30 µg/ml Isoleucin, 30 µg/ml Lysinhydrochlorid, 30 µg/ml Tyrosin, 50 µg/ml Phenylalanin, 150 µg/ml Valin, 0,15% aminosäurefreie Hefe-Stickstoffbase (Difco), 0,5% Ammoniumchlorid, 2% Dextrose und 1,5% Agar) verteilt. Die resultierenden Kolonien (Leu+) wurden in 5 ml SD-Medium suspendiert und 2 Tage lang bei 30ºC kultiviert. Die Kultur wurde 5 Minuten lang bei 4ºC und 2.000 UpM zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, welche dann in 0,5 ml 1 M Sorbitol resuspendiert wurden. Die Suspension wurde zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, welche dann in 0,5 ml 1 M Sorbitol, 0,1% 2-Mercaptoethanol und 400 µg/ml Zymolyase-100T (Seikagaku Kogyo) resuspendiert wurden. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 30ºC inkubiert, um Sphäroplasten zu bilden, welche dann 5 Minuten lang bei 3.000 UpM zentrifugiert wurden. Die gesammelten Sphäroplasten wurden in 100 µl Lösung I (50 mM Glucose, 10 Mm EDTA und 25 Mm Tris-HCl, pH 8,0) resuspendiert, und nach der Zugabe von 200 II Lösung II (0,2 N NaOH, 1% SDS) wurde die Suspension gründlich gemischt und 5 Minuten lang auf Eis gestellt. Zu der Suspension wurden 150 µl 5 M Kaliumacetat zugegeben und die Suspension wurde gründlich gemischt und nach einem Auf-Eis-Legen für 10 Minuten 5 Minuten lang bei 4ºC und 15.000 UpM zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten, welcher dann in ein frisches Röhrchen überführt wurde. Zu dem Überstand wurde ein gleiches Volumen Phenol/Chloroform (1:1) zugegeben und das Ganze wurde kräftig gemischt und 5 Minuten lang bei 12.000 UpM zentrifugiert, um eine wäßrige Schicht zu erhalten, welche dann in ein frisches Röhrchen überführt wurde. Zu der wäßrigen Schicht wurden 750 µl Ethanol zugegeben und die Mischung wurde mit einem Vortex-Mischer gründlich gemischt. Die Mischung wurde Minuten lang bei 15.000 UpM zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten, zu welchem 0,5 ml 70% Ethanol zugegeben wurden. Die Mischung wurde mit einem Vortex-Mischer gemischt und 5 Minuten lang bei 15.000 UpM zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten. Der so erhaltene DNA- Niederschlag wurde unter vermindertem Druck getrocknet und in 30 µl TE-Puffer gelöst. Die DNA-Präparation, die aus den AH22-Transformanten erhalten wurde, die das Plasmid pJDB- ADH-LY3-HSA-A enthielten, wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen, wie z.B. Hind III, Xho I, EcoR I, BamH I und Sal I, allein oder in Kombination verdaut und die resultierenden Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese und Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert, um die Struktur des Plasmids zu bestätigen.
- Eine einzelne Kolonie, welche sich auf einer SD (-Leu)- Platte gebildet hatte, wurde in 5,0 ml frischem SD(-Leu)- Flüssigmedium suspendiert und 2 Tage lang unter Schütteln bei 30ºC kultiviert, bis eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von ca. 2,0 erreicht war. Einhundert Mikroliter der Kultur wurden zu 5,0 ml YPD- Medium zugegeben und 24 Stunden lang bei 30ºC kultiviert, bis eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von ca. 3,0 erreicht war. Die Kultur wurde 10 Minuten lang bei 4ºC und 5.000 UpM zentrifugiert, um eine Überstandsfraktion zu erhalten. Zu der Überstandsfraktion wurde ein gleiches Volumen 99% Ethanol zugegeben und das Ganze wurde gemischt und 30 Minuten lang bei 4ºC stehen gelassen. Als nächstes wurde die Mischung 10 Minuten lang bei 4ºC und 12.000 UpM zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten. Der Niederschlag wurde in 100 µl 1 x Beladungspuffer (5% 2-Mercaptoethanol, 0,0025% Bromphenolblau, 2% SDS, 0,025 M Tris-HCl und 8% Glycerol) gelöst und 10 µl der Lösung wurden auf ein Elektrophoresegel [SDS-Polyacrylamidgel; 4 bis 20% Konzentrationsgradient; 84 mm (Breite) x 90 mm (Höhe) x 1,0 mm (Dicke)] aufgetragen. Eine Elektrophorese wurde in einem Elektrophoresepuffer (0,025 M Tris- HCl, pH 8,4, 0,192 M Glycin und 0,1% SDS) 60 Minuten lang bei einem konstanten Strom von 60 InA durchgeführt. Als die Molekulargewichts (MW)-Marker wurden Eiweißlysozym (MW 14.400), Sojabohnentrypsininhibitor (MW 21.500), Carbonsäureanhydrase (MW 31.000), Ovalbumin (MW 45.000), Rinderserumalbumin (MW 66,200) und Phosphorylase B (MW 92.500) verwendet, die alle von BIO-RAD erhalten wurden. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine indem Gel mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt oder, wie im folgenden beschrieben, nach Western-Blotten immunologisch nachgewiesen. Nach der Elektrophorese wurden die getrennten Proteine auf einen Nitrocellulosefilter (BIO-RAD) überführt, indem ein Halbtrocken-Blotter (Sartonus) verwendet wurde. Der Filter wurde nämlich eine Stunde lang in Methanol und dann in 25 mM Tris-HCl (pH 10,4)/20% Methanol getränkt und an einem Elektrophoresegel befestigt. Dieses wurde von beiden Seiten mit Filterpapieren bedeckt, welche in dem oben erwähnten Puffer und 0,3 M Tris-HCl (pH 10,0), welcher 20% Methanol und 25 mM Tris-HCl (pH 9,4)/40 mM 6-Amino-n-capronsäure enthielt, getränkt worden waren, und wurde in den Blotter gegeben. Nach dem Anlegen einer konstanten Spannung von 6 V für ca. 1,5 Stunden wurde der Filter gewaschen, indem er eine Stunde lang bei 37ºC in einer Lösung von 20 mM Tris- HCl (pH 7,5)/500 mM NaCl (TBS), welche 3% Gelatine ent hielt, und dann 5 Minuten lang in TBS/0,05% Tween-20 geschüttelt wurde. Als nächstes wurde der Filter über Nacht bei Raumtemperatur in 40 ml einer Lösung, welche einen anti-humanes Serumalbumin-Kaninchenantikörper (Cappel) enthielt, der 2.000-fach mit TBS, welcher 1% Gelatine ent hielt, verdünnt worden war, geschüttelt. Der Filter wurde unter Schütteln mit TBS (pH 7,5), welcher 0,05% Tween-20 (T-TBS) enthielt, gewaschen. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt. Der Filter wurde dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 40 ml einer Lösung, welche einen sekundären Antikörper (anti-Kaninchen IGG-Antikörper aus Ziegen, mit Merrettich-Peroxidase markiert; BIO-RAD) enthielt, der 3.000-fach mit TBS verdünnt worden war, welcher 1% Gelatine enthielt, geschüttelt. Als nächstes wurde der Filter zweimal 5 Minuten lang mit T-TBS und einmal 5 Minuten lang wie oben beschrieben mit TBS gewaschen. Der Filter wurde in einer Mischung aus 10 ml Methanol, welches 30 mg 4-Chlornaphtol enthielt, 50 ml TBS und 30 µl 30% Wasserstoffperoxid getränkt, um eine Bande nachzuweisen, welche HSA entsprach, und die Entwicklungsreaktion wurde durch Verdünnen mit destilliertem Wasser beendet.
- Eine Probe von HSA, welches aus einer Hefekultur isoliert wurde, wurde mit 2-Mercaptoethanol reduziert, mit SDS behandelt und auf ein 12% - 30% Polyacrylamidgradientengel in SDS aufgetragen, und eine Elektrophorese wurde unter den Bedingungen, welche von Laemmli, U.K., Nature, 227, 680 - 685, 1970 beschrieben wurden, durchgeführt. Als Molekulargewichtsmarker wurden Phosphorylase B (MW 92.500), Rinderserumalbumin (MW 66.200), Ovalbumin (MW 45.000), Carbonsäureanhydrase (MW 31.000), Sojabohnentrypsininhibitor (MW 21.500) und Eiweißlysozym (MW 14.400) verwendet. Proteine wurden durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blue nachgewiesen. Gleichzeitig wurde als eine Kontrolle die Mobilität von im Handel erhältlichem HSA, das aus humanem Serum gereinigt wurde, mitlaufen gelassen und die beiden HSAS wurden verglichen, und als Ergebnis zeigten HSA, welches von Hefetransformanten produziert wurde, und HSA, welches aus humanem Serum stammte, dieselbe Mobilität und ihr Molekulargewicht betrug 67.000, wie in Fig. 20 gezeigt ist.
- Eine Probe von HSA, welche aus einer Hefekultur isoliert wurde, wurde auf ein 12% - 30% Polyacrylamid-Gradientengel ohne SDS aufgetragen, und eine Elektrophorese wurde unter den Bedingungen wie sie oben beschrieben sind, aber ohne SDS, durchgeführt. Proteinbanden wurden durch Färben mit Coomassie Brilliant Blue nachgewiesen. Gleichzeitig wurde als Kontrolle ein kommerziell erhältliches HSA, welches aus humanem Serum gereinigt wurde, mitlaufen gelassen, und deren elektrisches Verhalten wurde verglichen. Bei der nativen Gelelektrophorese (ohne SDS) zeigten HSA, welches von Hefetransformanten produziert wurde, und HSA, welches aus humanem Serum stammte, dieselbe elektrophoretische Eigenschaft, wie in Fig. 21 gezeigt ist.
- Eine isoelektrische Fokussierung wurde durchgeführt, indem eine Ampholin-PAG-Platte, pH-Bereich von 3,5 - 9,5 (LKB), gemäß der Vorschrift des Herstellers verwendet wurde. Als Marker für den isoelektrischen Punkt wurden LKB's pI- Marker, d.h. C-Phycocyanin (pl 4,75, 4,85), Azurin (pI 5,65), trifluoracetyliertes Myoglobin (aus Schweinen pI 5,9), Myoglobin (aus Schweinen pl 6,45), Myoglobin (aus Pferden pI 7,3), Myoglobin (aus Wal pl 8,3) und Cytochrom C (pI- 10,6) verwendet. HSA, das von Hefetransformanten produziert wurde, zeigte mehrere Banden zwischen pI 4,8 und pI 5,2, welche dieselben waren wie bei HSA, das aus humanem Serum gereinigt wurde. Dieses Ergebnis ist in Fig. 22 dargestellt.
- Die N-terminale Aminosäuresequenz von HSA (20 µg), welches von Hefetransformanten produziert wurde, wurde bestimmt, indem ein Gasphasen-Proteinsequenziergerät 477 A (Applied Biosystems) gemäß der Vorschrift des Herstellers verwendet wurde. Als ein Ergebnis ergab sich eine Aminosäuresequenz von dem Aminoterminus aus von Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val- Ala-His-Arg, welche mit der berichteten Aminosäuresequenz der aminoterminalen Aminosäuresequenz von HSA völlig identisch war. Von der Rückgewinnung der N-terminalen Aminosäuren aus berechnet wurde abgeschätzt, daß die getestete HSA- Präparation eine N-terminale Homogenität von wenigstens 95% aufwies. Aus diesem Ergebnis wurde die Abwesenheit einer Prä-HSA-Sequenz aufgrund einer unvollständigen Prozessierung bestätigt.
- Als HPLC-Gerät wurde ein Shimazu Gradienten-LC-System vom LC-6A-Typ, welches mit einer TSK-Gel-Phenyl-5PW RP-Säule ausgerüstet war, verwendet. Die Säule wurde mit 0,1% Trifluoressigsäure/Wasser äquilibriert, und HSA, welches von Hefetransformanten produziert wurde, ein im Handel erhältliches HSA, welches aus humanem Serum gereinigt wurde, und die Mischungen davon wurden getrennt aufgetragen. Die Elution des Proteins wurde 60 Minuten lang bei einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/Minute mit einem Acetonitril-Konzentrationsgradienten von 0% bis 70% in 0,1% Trifluoressigsäure durchgeführt.
- Unter diesen Bedingungen lieferte HSA, welches durch Hefetransformanten produziert wurde, einen einzigen scharfen Peak, dessen Retentionszeit und Gestalt von jenen von HSA, welches aus humanem Serum gereinigt wurde, nicht zu unterscheiden waren. Wenn diese zwei HSAS gemischt wurden und die Mischung auf der Säule chromatographiert wurde, lieferte darüber hinaus die Mischung einen einzigen scharfen Peak, was zeigte, daß das Verhalten dieser zwei HSAs auf der Umkehrphasensäule völlig identisch war. Die Ergebnisse sind in Fig. 23 dargestellt.
- Eine Immundiffusion wurde gemäß einem Verfahren von Ouchterlony, Ö, Progr. Allergy, 6, 30, 1962 durchgeführt. Nach der Bildung von Präzipitationslinien und Deproteinierung mit physiologischer Salzlösung wurden die Präzipitationslinien mit Coomassie Brilliant Blue gefirbt. Das Antiserum, welches für den Immundiffusionstest verwendet wurde, war anti-HSA-Antiserum aus Kaninchen (Cappel). Die Präzipitationslinie von HSA, welches von den Hefetransformanten produziert wurde, war mit der Präzipitationslinie von HSA, welches aus humanem Serum gereinigt wurde, vollständig verschmolzen, was das Fehlen eines antigenen Unterschiedes zwischen beiden HSAS zeigt. Die Ergebnisse sind in Fig. 24 dargestellt.
- Eine humane Leber-cDNA-Bibliothek, welche unter Verwendung eines Vektorphagen λgt11 konstruiert wurde, welcher im Handel bei Clontech, U.S.A., erhältlich ist, wurde verwendet, um die Klone durch eine Plaque-Hybridisierung zu selektieren, welche ein cDNA-Fragment enthielten, das für normales humanes Serumalbumin A codierte. Die rekombinanten λgt11 Phagen in der Bibliothek wurden zur Infektion in E. coli Y1090 verwendet, welche dann auffestem LB-Agar-Medium plattiert wurden, um 5,5 x 10&sup5; Transformantenplaques zu bilden. Rekombinante DNAs in den Plaques wurden auf Membranfilter (Hybond-N; Amersham) überführt und unter Verwen dung von drei synthetischen Oligonukleotidsonden gescreent, die durch das Verfahren von Benton und Davis, Science, 196, 180 - 182 (1977) mit 32p (spezifische Radioaktivität ≥ 10&sup7; cpm/µg) markiert waren. Diese drei Sonden sind die Sonde HSA-1, welche dem nicht-codierenden 5'-Bereich und dem codierenden 5'-Bereich, der 12 Basenpaare stromaufwärts des ATG-Startcodons beginnt und bei dem Codon für die 9. Aminosäure Leucin endet, entspricht; die Sonde HSA-2, welche für das 248. Glycin bis zu dem 260. Leucin codiert; und die Sonde HSA-3, welche den 3'-terminalen codierenden Bereich und den 3'-terminalen nicht-codierenden Bereich umfaßt, welcher mit dem Codon für das 576. Valin beginnt und 9 Nukleotide stromabwärts von dem C-terminalen Leucin-Codon endet, wobei alle Sequenzen von Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103'- 6114 (1981) beschrieben werden. Die Nukleotidsequenzen, welche als Sonden verwendet wurden, befanden sich auf dem komplementären oder negativen Strang. Die Nukleotidsequenzen dieser drei Sonden sind in Fig. 5 gezeigt. Diese Oligonukleotidsonden wurden durch ein automatisches DNA-Synthesegerät synthetisiert und unter Verwen dung von [y-32P]-ATP und Polynukleotidkinase markiert. Unter 200 λgt11-Klonen, welche mit der Sonde HSA-2 ein positives Signal ergaben, wurde aus 4 Klonen durch das Verfahren von Blattner et al., Science, 202, 1279 - 1284 (1978) DNA präpariert und mit EcoR I verdaut, und ein Southern-Blot des verdauten Produktes wurde mit der Sonde HSA-2 durch das Verfahren von Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 - 517 (1975) hybridisieren gelassen. DNA-Fragmente mit einer Größe von 1,8 kb, 1,4 kb bzw. 1,3 kb wurden mit der Sonde HSA-2 hybridisiert. Von diesen wurden die DNA-Fragmente mit 1,8 kb und 1,3 kb in den Vektor pUC19 subkloniert, und diese Subklone wurden durch das Verfahren von Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961 - 3965 (1975) einer Koloniehybridisierung unter Verwendung der Sonden HSA-1 und HSA-3 unterworfen. Als Ergebnis wurde ein Klon λgt11 (HSAI-A), welcher nur mit HSA-3 hybridisierte, erhalten. Die DNA in diesem Klon wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, und die resultierenden DNA-Fragmente wurden in Phagenvektor M13mp18- und M13mp19-RF-DNA eingefügt, und die Nukleotidsequenz der DNA wurde durch das Dideoxy-Kettenabbruchverf ahren von Sanger, F., Nicklen, S. und Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 - 5467 (1977) bestimmt.
- Auf der anderen Seite wurden 20 Klone unter den Klonen, welche bei der Plaquehybridisierung von λgt11-Klonen unter Verwendung der HSA-2-Sonde ein positives Signal ergaben, einer Plaquehybridisierung unter Verwendung der HSA-1-Sonde unterworfen und ein positiver Klon λgt11 (HSA-II) wurde erhalten. Aus diesem Klon wurde Phagen-DNA präpariert und mit EcoR I verdaut. Die Verdauungsprodukte wurden einer Southern-Hybridisierung unter Verwendung der HSA-I-Sonde unterworfen, und bei einem DNA-Fragment mit 1,25 kb, welches als HSA-II bezeichnet wurde, wurde gefunden, daß es mit der HSA-I-Sonde hybridisiert. Die Nukleotidsequenz dieses DNA-Fragmentes wurde durch das Dideoxy-Kettenabbruchverfahren bestimmt. Das HSA-II hybridisierte nicht mit der HSA-3-Sonde.
- Als Ergebnis wurde gefunden, daß dem HSA-II ein DNA-Bereich fehlt, welcher für den C-terminalen Bereich von humanem Serumalbumin codiert, und dem HSA-I-A ein DNA-Bereich fehlt, welcher für den N-terminalen Bereich von humanem Serumalbumin codiert und ein "opal"-Codon TGA als ein Stop- Codon anstelle des Codons TCA enthält, welches für das 304.
- Serin codiert. Restriktionsenzym-Spaltungskarten dieser DNA-Fragmente sind in Fig. 1 gezeigt. In diesen Karten wurden die genauen Positionen von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen aus der am Ende bestimmten Nukleotidsequenz erhalten.
- Wie man in Fig. 8 sieht, können HSA-I-A und HSA-II an einer geeigneten Stelle gespalten werden und an der entsprechenden Stelle wieder verknüpft werden, um eine cDNA zu konstruieren, die richtig für das Vorläuferprotein von normalem humanem Serumalbumin in voller Länge, das mit dem Signalpeptid und der Prosequenz verknüpft ist, codiert.
- Ein Klon λgt11 (HSA-II), welcher HSA-cDNA enthielt, die aus einer humanen Leber-cDNA-Bibliothek stammte, wurde mit EcoR I und Xba I gespalten, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das die cDNA enthielt. Das Plasmid pUC19 wurde mit EcoR I und Xba 1 gespalten, um ein größeres DNA-Fragment zu erhalten. Diese DNA-Fragmente wurden zusammen ligiert, indem T4-DNA-Ligase verwendet wurde, um ein rekombinantes Plasmid pUC-HSA-EX zu konstruieren.
- Das Plasmid pUC-HSA-EX wurde mit Aha III und Sal I verdaut, um ein kleineres DNA-Fragment zu erhalten, welches für die Aminosäuresequenz vom 12. Lys bis zum 356. Thr des normalen reifen humanen Serumalbumins A codiert. Um ein Gen zu konstruieren, das für das normale reife humane Serumalbumin A codiert, wurde ein DNA-Fragment, das dem 5'-Bereich des reifen Albumingens entsprach, hergestellt, indem zwei chemisch synthetisierte Oligonukleotide reassozuert wurden. Dieses DNA-Fragment hat an seiner 5'-terminalen Seite eine Hpa II-Spaltungsstelle und eine Cla I-Spaltungsstelle, um kohäsive Enden zur Verfügung zu stellen, welche mit der DNA fusionieren können, die für das Signalpeptid von alkalischer Phosphatase codiert, und umfaßt Codons, die für die Aminosäuresequenz von dem ersten Asp bis zu dem 11. Phe des reifen humanen Serumalbumins A codieren. Das reassozuerte DNA-Fragment wurde an seinem 5'-Ende unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert. Auf der anderen Seite wurde der typische E. coli-Multiklonierungsvektor PAT 153 (Amersham; Twigg, A.J. und Sherratt, D., Nature, Zßi, 216 - 218, 1980) mit Cla I und Sal I gespalten, um ein größeres DNA-Fragment zu erhalten. Die oben hergestellten drei DNA-Fragmente wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, um ein rekombinantes Plasmid PAT-HSA-CX zu konstruieren. In diesem Plasmid ist DNA, welche für das erste Asp bis zu dem 11. Phe codiert, mit einer DNA fusioniert, die für das 12. Lys bis zu dem 356. Phe codiert. Das Plasmid pAT-HSA-CX wurde mit EcoR I und Xba I verdaut, um ein kleineres DNA-Fragment zu erhalten, das für das erste Asp bis zu dem 356. Phe des normalen humanen Serumalbumins codierte.
- Auf der anderen Seite wurde der Phage λgt11 (HSA I-A), welcher wie oben beschrieben aus der humanen Leber-cDNA-Bibliothek selektiert wurde, mit EcoR I verdaut, um ein DNA- Fragment zu erhalten, welches eine cDNA enthielt, die für die C-terminale Hälfte des normalen humanen Serumalbumins A codierte. Das DNA-Fragment wurde in die EcoR I-Stelle des Plasmids puclB eingefügt, um ein rekombinantes Plasmid pUC- HSA-1 zu konstruieren. Dieses Plasmid wurde mit Xba I und Hind III verdaut, um ein cDNA-Fragment zu erhalten, das den Bereich enthielt, der für das 358. Leu bis zu dem 585. carboxylterminalen Leu codierte, und einen 3'-terminalen nicht-codierenden Bereich, welcher aus 62 Nukleotiden bestand. Auf der anderen Seite wurde das Plasmid pUC18 mit EcoR I und Hind III verdaut, um ein größeres Fragment zu erhalten. Die oben hergestellten drei DNA-Fragmente wurden ligiert, indem T4-DNA-Ligase verwendet wurde, um ein rekombinantes Plasmid pUC-HSA-CH zu konstruieren, welches eine gesamte cDNA-Sequenz enthielt, die für normales reifes humanes Serumalbumin codierte.
- Eine Nukleotidsequenz von cDNA, die für die gesamte Aminosäuresequenz von normalem reifem humanem Serumalbumin A codiert und die entsprechende Aminosäuresequenz sind in den Figuren 11-1 bis 11-5 gezeigt.
Claims (10)
1. DNA, welche eine Leit-DNA-Sequenz, die für ein chimäres
Leitpeptid codiert, und eine cDNA, die für reifes HSA
codiert, welche stromabwärts der Leit-DNA vorhanden
ist, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das chimäre
Leitpeptid die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
Met Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
Phe Leu Phe Ser Ala Lys Ile Ser Ala.
2. DNA gemäß Anspruch 1, wobei das chimäre Leitpeptid
durch die folgende Nukleotidsequenz codiert wird:
ATG AAG TTG TTG CTC CTC CTT CTT TTG CTC
TTC TTG TTC TCT GCT AAG ATT TCT CCC.
3. DNA gemäß Anspruch 1 oder 2, welche rekombinant ist und
welche in der folgenden Reihenfolge DNA, die für das
chimäre Leitpeptid aus Anspruch 1 codiert, eine cDNA,
die für reifes HSA codiert, ein poly A-Additionssignal
und eine poly A-Sequenz umfaßt.
4. Plasmid, welches einen Promotor und einen Terminator,
die in einer Wirtszelle funktionsfähig sind, umfaßt,
worin eine rekombinante DNA gemäß Anspruch 3 in einer
Orientierung, welche eine Expression der cDNA erlaubt,
zwischen den Promotor und den Terminator eingefügt
wurde.
5. Plasmid, wie in Anspruch 4 beansprucht, wobei der
Promotor und der Terminator in einer Hefezelle
funktionsfähig sind.
6. Hefezelle, die mit einem Plasmid gemäß Anspruch 5
transformiert ist.
7. Verfahren zur Herstellung von reifem HSA, welches ein
Kultivieren von Wirtszellen gemäß Anspruch 6, um reifes
HSA zu erzeugen und zu sekretieren, und ein Gewinnen
des reifen HSA umfaßt.
8. Chimäres Leitpeptid, das für eine korrekte
Prozessierung eines Vorläufers von HSA und für eine Sekretion
von HSA nützlich ist, welches die folgende
Aminosäuresequenz aufweist:
Met Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
Phe Leu Phe Ser Ala Lys Ile Ser Ala.
9. DNA, die für das chimäre Leitpeptid gemäß Anspruch 8
codiert.
10. DNA gemäß Anspruch 9, welche die folgende
Nukleotidsequenz aufweist:
ATG AAC TTG TTG CTC CTC CTT CTT TTG CTC
TTC TTG TTC TCT GCT AAG ATT TCT GCC.
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