DE3744038A1

DE3744038A1 - Humane mangan-superoxiddismutase (hmn-sod)

Info

Publication number: DE3744038A1
Application number: DE19873744038
Authority: DE
Inventors: Elinborg Dr Ostermann; Walter Dr Spevak; Andreas Dr Zoephel; Edeltraud Dipl Biol Dr Krystek; Ingrid Dr Maurer-Fogy
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1987-12-24
Filing date: 1987-12-24
Publication date: 1989-11-02

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Human Mn-Superoxiddismutase (hMn-SOD), die DNA-Sequenzen, die für dieses Enzym codieren, geeignete Vektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten und Wirtszellen, die diese DNA-Sequenzen exprimieren können, sowie das Enzym hMN-SOD selbst. Vorschläge zur Verwendung dieses Enzyms werden außerdem beschrieben.

Als Folge verschiedener biochemischer Prozesse in biologischen Systemen (z. B. Redoxprozesse in der Atmungskette, Oxydationen im Cytoplasma) werden bekannterweise laufend O₂⁻-Radikale gebildet, die hochcytotoxisch sind und zu Gewebezerstörungen führen können. Bei pathologischen Situationen, z. B. im Verlauf rheumatisch bedingter Erkrankungen, werden Degradationen von Collagen und Synovialflüssigkeit durch solche Radikale diskutiert (Pasquier, C. et al., Inflammation 8, 27-32, 1984). Eukaryotische Zellen enthalten zwei Formen von Superoxiddismutasen, von denen die eine vornehmlich in Cytosol (Cu/Zn-SOD) und die andere hauptsächlich in den Mitochondrien (Mn-SOD) vorliegen. In Lebermitochondrien wurde gefunden, daß Mn-Enzym in der Matrix einschließlich der inneren Membran lokalisiert ist, obwohl die Mn-SOD auch im Cytosol der Leberzellen nachgewiesen wurde (McCord J. M. et al., In: Superoxide and Superoxide Dismutases (A. M. Michelson, J. M. McCord, I. Fridovich, eds.) Academic Press, N. Y., 129-138, 1977).

In Prokaryoten existiert neben einer Mn-SOD noch eine Fe-SOD. Letztere wurde auch in Algen und Protozoen sowie in einigen Pflanzenspezies nachgewiesen (Bridges, S. M., Salin, M. L., Plant Physiol. 68, 275-278, 1981). Diese hochaktiven Enzyme katalysieren die Disproportionierung

O₂⁻ + O₂⁻ + 2 H⁺ → H₂O₂ + O₂

und verhindern durch diese Dismutation der Superoxidradikale deren Anreicherung und somit deren zellschädigende Wirkung. Neben dem endoplasmatischen Retikulum der Leber können die mitochondrialen Membranen als einer der wichtigsten Orte der O₂⁻-Entstehung in tierischen Zellen angesehen werden, so daß es nicht verwundert, daß Mitochondrien ihrer eigene, spezielle SOD(Mn-SOD) zur Verfügung haben.

Das Strukturgen einer prokaryotischen Mn-SOD (E. coli) wurde cloniert und das chromosomale sodA-Gen lokalisiert (Touati, D., J. Bact. 155, 1078-1087, 1983).

Die 699 bp lange Nukleotidsequenz einer mitochondrialen Hefe Mn-SOD konnte aufgeklärt und die Primärstruktur sowohl des Precursors als auch des maturen Proteins davon abgeleitet werden - mit Molekulargewichten von 26123 Da für den Precursor und 23059 Da für das mature Protein (Marres, C. A. M. et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161 (1985)). Somit unterscheiden sich die Mn- und Cu/Zn-SOD (MG=14893, EP-A 1 38 111) in ihren Molekulargewichten deutlich.

Die vollständige Aminosäuresequenz der Mn-SOD aus Menschenleber wurde von Barra, D. publiziert, wonach die hMn-SOD aus 196 Aminosäuren zusammengesetzt sein soll (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984). Die Human Cu/Zn-SOD aus Erythrocyten besteht demgegenüber aus 153 Aminosäuren (Jabusch, J. R., et al. Biochemistry 19, 2310-2316, 1980) und zeigt keine Sequenzhomologien zur hMn-SOD) (Barra, D. et al. siehe oben).

Generell wird den Superoxiddismutasen eine Schutzfunktion gegenüber bestimmten Entzündungsprozessen zugesprochen. Insbesondere soll eine Defizienz an Mn-SOD bei der Entwicklung der rheumatoiden Arthritis eine Bedeutung zukommen (Pasquier, C. et al., siehe oben). Ein protektiver Effekt der SOD gegen alkoholinduzierte Leberschädigungen wird ebenfalls angenommen (Del Villano B. C. et al., Science 207, 991-993, 1980).

Die Klonierung und Expression einer Human-SOD ist nur für die Human Cu/Zn-SOD aus Menschenleber bekannt (EP-A 1 38 111).

An Hand der vorgenannten essentiellen Eigenschaften der Superoxiddismutasen, insbesondere der hMn-SOD, ist ein Bedarf für den therapeutischen und/oder diagnostischen Einsatz zu erwarten. Dabei ist es vorteilhaft, zu diesem Zweck specieseigene, d. h. humane Mn-SOD in homogener Form und in ausreichenden Mengen zur Verfügung zu haben. Die sich daraus ableitende Zielvorstellung ist, zu erwartende immunologische Reaktionen z. B. nach therapeutischem Einsatz, zu minimieren oder zu verhindern.

Erst die Entwicklung von Technologien zur Rekombination von Fremd-DNA mit Vektor-DNA mit der Möglichkeit, auch erstere in Mikroorganismen stabil zu etablieren und zu exprimieren, gestattet es, homogene Proteine tierischer oder humaner Herkunft in großen Mengen bereitzustellen. Hierbei soll ein anderes Ziel erreicht werden, nämlich, daß das damit hergestellte Enzym - die hMn-SOD - ein gegenüber der authentischen genuinen hMn-SOD charakteristisches biologisches Aktivitätsspektrum zeigt.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, mit Hilfe gentechnologischer Verfahren erstmals die für dieses Enzym codierende DNA-Sequenz zu finden bzw. darzustellen und erstmals aufzuzeigen, nach welchen Methoden diese Sequenz erhalten werden kann.

Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine aus Humanzellen plazentalen Ursprungs gewonnene cDNA-Genbank mit synthetisch hergestellten DNA-Sondenmolekülen durchsucht wurde und dadurch das für hMn-SOD codierende Gen isoliert werden konnte. Um das Gen für hMn-SOD zu erhalten, kann nach bekannten Methoden die mRNA aus solchen Zellen isoliert werden, die das gewünschte Enzym produzieren. Als Ausgangsmaterial sind verschiedene, z. B. metabolisch aktive drüsige Gewebe wie z. B. Leber oder Plazenta geeignet. Nach Herstellung der cDNA, die nach bekannten Methoden durch geprimte Synthese mit reverser Transkriptase an Hand der isolierten mRNA erhalten werden kann, nachfolgendem Einbau in einen geeigneten Vektor und Amplifikation zu einer vollständigen cDNA-Genbank, kann diese mit einer definierten, radioaktiv markierten DNA-Sonde oder einer Mischung aus verschiedenen solcher Sonden durchsucht werden. Um die Degeneration des genetischen Codes zu berücksichtigen werden vorzugsweise definierte DNA-Sondermischungen verwendet, die alle möglichen Nukleotidvariationen für ein und dieselbe Aminosäure repräsentieren bzw. die derart ausgewählt werden, daß die Anzahl der zu synthetisierenden DNA-Sonden einer Mischung möglichst gering und die Homologie zur gesuchten hMn-SOD DNA-Sequenz möglichst hoch ausfällt. Ein weiteres Auswahlkriterium für die Synthese von DNA-Sonden kann darin bestehen, daß diese komplementär sind zu mindestens zwei unabhängigen Regionen, beispielsweise nahe dem 3′- und 5′-Ende der putativen Gensequenz. Dadurch können an Hand von mindestens zwei getrennten Hybridisierungen Klone identifiziert werden, die gegen beispielsweise beide unabhängige DNA-Sonden positive Signale zeigen. Diese Klone können dann vorzugsweise für die Isolierung des hMn-SOD Gens benutzt werden, da von ihnen zu erwarten ist, daß sie entweder einen wesentlichen Teil oder das komplette Gen für hMn-SOD enthalten.

Die besonderen DNA-Sequenzen, die für die erfindungsgemäßen DNA-Sonden verwendet wurden, wurden an Hand der von Barra, D. et al. publizierten Aminosäuresequenz der Human Mn-SOD aus Lebergeweben (Barra, D. et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1938) abgeleitet. Insbesondere können vorzugsweise zwei Regionen der putativen hMn-SOD DNA-Sequenz verwendet werden, die für mindestens fünf Aminosäurereste, vorzugsweise für 8 Aminosäurereste codieren, wobei eine DNA-Sondenlänge von mindestens 14, vorzugsweise 23 Basen vorteilhaft ist. Besonders vorteilhaft ist es, wenn eine DNA-Sonde komplementär ist zu jener, abgeleiteten hMn-SOD DNA-Sequenz, deren genetische Information kolinear ist mit den Aminosäureresten 39 bis 46 und eine zweite DNA-Sonde komplementär ist zu der entsprechenden DNA-Region, die für die Aminosäurereste 200 bis 207 der bekannten Aminosäuresequenz codiert. Ebenso können natürlich auch DNA-Sequenzen als Sonden eingesetzt werden, die an Hand anderer Mn-Superoxiddismutasen abgeleitet werden können.

Mit Hilfe einer solchen DNA-Sonde können positive Klone erhalten werden, aus denen eine cDNA-Sequenz nach folgender Formel Ia, isoliert werden kann, die einen großen Anteil einer für hMn-SOD codierenden Region enthält:

Formel Ia

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die gefundene cDNA für eine Aminosäuresequenz codiert, die sich von der publizierten Aminosäuresequenz (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984) in einigen Resten und in ihrer Länge voneinander unterscheidet. Die gefundenen Unterschiede dieser Sequenz zur "Barra-Sequenz" betreffen die Aminosäure-Positionen, 42, 88, 109 und 131 (jeweils Glu anstatt Gln) sowie zwei zusätzliche Aminosäuren Gly und Trp zwischen Position 123 und 124, so daß die erfindungsgemäße DNA-Sequenz einer hMn-SOD von 198 Aminosäuren entspricht.

Völlig unerwartet war auch, daß andererseits eine für hMn-SOD codierende cDNA isoliert werden konnte, die eine Aminosäuresubstitution an Position 29 bedeutet (Codon für Gln anstatt für Lys) und somit in diesem Punkt einen weiteren Unterschied "zur Barra-Sequenz" und zur Formel Ia aufweist, entsprechend Formel Ib:

Formel Ib

Geht man davon aus, daß die Barra-Sequenz richtig analysiert worden ist, kann an Hand der erfindungsgemäßen Nukleotid- bzw. Amiosäuresequenz die Möglichkeit eingeräumt werden, daß hiermit erstmals und überraschend die mögliche Existenz verschiedener Gene oder deren allele Ausprägungsformen oder Isoenzyme für hMn-SOD aufgezeigt wird.

Da cDNA tragende Klone erhalten werden können, denen das für das komplette hMn-SOD Gen notwendige Ende fehlt, war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung des kompletten Gens für hMn-SOD.

Die Lösung dieser Aufgabe kann nach verschiedenen, bekannten Strategien erfolgen. Beispielsweise kann die erhaltene Sequenz selbst als DNA-Sonde eingesetzt und damit die cDNA-Bank nochmals durchsucht werden, um ein komplettes Gen bzw. eine cDNA mit dem jeweils fehlenden Ende zu finden oder die erhaltene DNA-Sequenz kann als Hybridisierungssonde gegen eine genomische Bank verwendet werden, um nach Identifizierung das komplette hMn-SOD Gen zu isolieren.

Oder man bedient sich der Möglichkeit, Oligonukleotide zu synthetisieren, deren Nukleotidsequenz dem fehlenden Ende der hMn-SOD entspricht und mit Hilfe dieser, nach geeigneter Linker-Ligation, die vollständige cDNA für hMn-SOD zu erhalten. Diese Methode besitzt den Vorteil, daß beispielsweise eine für hMn-SOD codierende DNA erhalten werden kann, deren 5′-Ende direkt mit dem Startcodon (ATG) beginnt.

Als besonders geeignet, diese Aufgabe zu lösen, erwies sich für die Komplettierung der beispielsweise ab Aminosäure 22 oder 26 codierenden, erfindungsgemäßen cDNAs die DNA-Sequenz der Formel II, beginnend mit dem 5′-Startcodon ATG und endend mit dem Codon für Aminosäure 31 (His, wobei AAG [Lys]=1) unter Zugrundelegung der bekannten Codonpräferenzen wie sie beispielsweise für die Hefe Gültigkeit besitzen (Sharp, P. M. et al., Nucl. Acids. Res. 14 (13), 5125-5143, 1986)

Formel II

Ebenso können andere bekannte synonyme Codons für die Komplettierung des hMn-SOD Gens oder zur in vitro Synthese des gesamten Gens verwendet werden, z. B. solche, die eine optimale Codon-Anticodon Wechselwirkung in Bakterien, z. B. E. coli, erleichtern und dort die Effizienz der Translation erhöhen (Grosjean, H. Fiers, W., Gene 18, 199-209, 1982; Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151, 389-409, 1981) oder solche Codons, die den genuinen Verhältnissen in Säugetierzellen entsprechen (Grantham, R. et al., Nucleic Acid Research 9, 43-47, 1981). Letztere können vorzugsweise zur Transformation und nachfolgend zur Expression in Säugetierzellen eingesetzt werden.

Es ist prinzipiell möglich, den Methioninrest, der durch das Startcodon ATG kodiert wird und dem reifen hMn-SOD, beginnend mit der ersten Aminosäure Lysin, vorangestellt ist, nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise mit CNBr oder CNCl, abzuspalten. Da aber im reifen Enzym hMn-SOD weitere interne Methioninreste vorkommen können z. B. an Positionen 23 oder 192 - kann eine solche Vorgehensweise nicht durchführbar sein, so daß in diesem Fall der zusätzliche N-terminale Methioninrest erhalten bleibt, ohne Einfluß auf die biologische Aktivität der hMn-SOD.

Es können jedoch auch enzymatische Spaltungen vorgesehen werden, wobei bekannterweise geeignete synthetische Linker eingesetzt werden können, da zu erwarten ist, daß sich Codons für entsprechende, spezifische Aminosäuren an den gewünschten Positionen auf dem Vektor, der die hMn-SOD cDNA enthält, befindet. Z. B. sind Arg- oder Lys-Reste für eine tryptische Spaltung zu nennen bzw. man bedient sich allgemein Codons, die für Protease-empfindliche Aminosäuren codieren. Diese können vor oder hinter dem Start-Codon positioniert werden oder innerhalb der codierenden Region.

Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, mit Hilfe gentechnologischer Verfahren die für hMn-SOD codierende Sequenz in geeigneten Wirtszellen erstmals zur Expression zu bringen, das homogene Enzym hMn-SOD noch solchen Verfahren erstmalig herzustellen, zu isolieren und in reiner Form bereitzustellen und die dafür erforderliche Vorgehensweise erstmals zu beschreiben.

Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe dadurch gelöst, indem die für hMn-SOD codierenden DNA-Sequenzen, beispielsweise der Formeln IIIa, oder IIIb

Formel IIIa

Formel IIIb

gegebenenfalls mit entsprechenden Signal- oder Kontrollsequenzen versehen, in geeignete Vektoren inseriert und damit geeignete Wirtszellen transformiert wurden. Nach Kultivierung der transformierten Wirtszellen werden die gebildeten Polypeptide nach an sich bekannten Verfahren isoliert und gereinigt. Die erhaltenen Polypeptide entsprechen den nachfolgenden Formeln IVa und IVb.

Formel IVa

Formel IVb

Die Sequenz gemäß Formel IIIa und IIIb eignen sich besonders zur Herstellung von nicht-glykolisierter hMn-SOD der Formeln IVa und IVb in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder S. cerevisiae. Das Problem der Glykosylierung beispielsweise in Hefe kann dadurch umgangen werden, daß man sich Mutanten bedient, die Defizient sind in der Glykosylierung von Proteinen (alg Mutanten) (z. B. Huffaker, T. C., Robbins P. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7466-7470, 1983).

Falls es notwendig oder sinnvoll erscheint, kann dem kompletten hMn-SOD Gen, beispielsweise gemäß Formeln IIIa oder IIIb eine Leader- bzw. Signalsequenz direkt dem ersten Codon der ersten N-terminalen Aminosäure der reifen hMn-SOD bzw. vor dem Starcodon ATG vorangestellt werden. Hiermit kann erreicht werden, daß die hMn-SOD aus der Wirtszelle transportiert und leicht aus dem Kulturmedium isoliert werden kann.

Derartige Signalsequenzen sind beschrieben worden; sie codieren für einen meist hydrophoben Proteinanteil, der durch posttranslationale Modifikationsprozesse in der Wirtszelle abgespalten wird (Davis, D. B., Tai. P.-C., Nature 283, 433-438, 1980; Perlman, D., Halvorson, H. O., J. Mol. Biol. 167, 391-409, 1983). Wenn vor die erste Aminosäure der hMn-SOD ein ATG-Codon konstruiert worden ist, kann ein Genprodukt erhalten werden, das vor dem Lysin ein N-terminales Methionin enthält. Daß Signalsequenzen von Prokaryoten verwendet werden, um Proteine in das Periplasma zu sekretieren und korrekt zu prozessieren, ist bekannt. (z. B. Davis, B. D., Tai, P.-C., 1980).

Selbstverständlich ist es nach Isolierung und Klonierung der hMn-SOD DNA-Sequenz möglich, das durch diese Sequenz codierte Enzym spezifisch zu modifizieren. Enzymmodifikationen können beispielsweise über gezielte in vitro Mutationen mit syntetischen Oligonukleotiden erfolgen, wodurch die katalytischen Eigenschaften der hMn-SOD beeinflußt und neuartige enzymatische Aktivitäten geschaffen werden können. Die grundlegenden methodischen Schritte zur Durchführung derartiger Proteinmanipulationen sind bekannt (z. B. Winter, G. et al., Nature 299, 756-758, 1982; Dalbadie - McFarland, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409-6413, 1982).

Für die Klonierung, d. h. Amplifikation und Präparation, des hMn-SOD Gens kann E. coli verwendet werden, vorzugsweise E. Coli C600 (Nelson et al. Virology 108, 338-350, 1981) oder JM 101, bzw. E. coli-Stämme mit mindestens einem der bekannten sup-Genotypen. Die Klonierung kann aber auch in Gram-positiven Bakterien wie z. B, B. subtilis erfolgen. Derartige Systeme sind vielfach beschrieben.

Als geeignete Wirte für die Expression des erfindungsgemäßen hMn-SOD-Gens kommen sowohl Mikroorganismen als auch Kulturen multizellulärer Organismen in Frage.

Unter Mikroorganismen sind Prokaryoten, d. h. Gram-negative oder Gram-positive Bakterien, und Eukaryoten, wie Protozoen, Algen, Pilze bzw. höhere Protisten, zu verstehen. Von den Gram-negativen Bakterien sind besonders die Enterobacteriaceae, z. B. E. coli, von den Gram-positiven die Bacillaceae und apathogenen Micrococcaceae, z. B. B. subtilis und Staph. carnosus, von den Eukaryoten die Ascomyceten insbesondere die Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, bevorzugte Wirte.

Für einzellige Mikroorganismen stehen eine Vielzahl an Ausgangsvektoren zur Verfügung, die sowohl plasmidischen als auch virales Ursprungs sein können. Diese Vektoren können in einfacher Kopienzahl oder als Multicopy-Vektoren vorliegen. Derartige Vektoren, die zur Klonierung und Expression der erfindungsgemäßen hMn-SOD wie allgemein für eukaryotische DNA-Sequenzen geeignet sind, werden in vielen Publikationen und Manuals beschrieben (z. B. Maniatis, T. et al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Glover, D. M. (ed.) DNA Cloning Vol. I, II, 1985) und sind kommerziell erhältlich.

Im allgemeinen können Plasmid-Vektoren, die in der Regel einen Replikationsursprung und Kontrollsequenzen für die Transkription, Translation und Expression enthalten, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Diese Sequenzen sollten aus Spezies stammen, die kompatibel mit den Wirtszellen sind. Der Vektor trägt üblicherweise neben einer Replikationsstelle zusätzlich Erkennungssequenzen, die es ermöglichen, in transformierten Zellen phänotypisch zu selektionieren. Die Selektion kann entweder durch Komplementation, Suppression oder durch Inaktivierung eines Markers erfolgen. Hinsichtlich der beiden erstgenannten Verfahren sind auxotrophe Mutanten von Bakterien und Hefen, die defizient sind für ein essentielles Stoffwechselprodukt, oder Nonsense-Mutanten, in denen es bei der Translation des betroffenen Gens zum Kettenabbruch kommt. Verschiedene Suppressor-Gene, z. B. supD, E, F (supprimieren UAG), supC, G (supprimieren UAG oder UAA) sind bekannt.

Beim dritten Verfahren trägt der Vektor ein Resistenz-Gen gegen ein oder mehrere cytotoxische Agenzien, wie z. B. Antibiotika, Schwermetalle. Durch Insertion einer fremden DNA in solch ein Marker-Gen wird dieses inaktiviert, so daß der neu entstandene Phänotyp vom ursprünglichen Phänotyp unterschieden werden kann.

Zum Beispiel kann E. coli mit pBR322 transformiert werden, ein Plasmid das aus E. coli Species stammt (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und liefert damit einfache Mittel, transformierte Zellen zu identifizieren, indem durch Klonieren in beispielsweise die PstI-Stelle im b-Lactamase-Gen der Phänotyp Ap^r, Tc^r zu Ap^s, Tc^r konvertiert wird. Andere Verfahren sind gleichsam anwendbar, wofür beispielsweise die lacZ-Geninaktivierung bei g- und M 13-Vektoren sowie bei verschiedenen Plasmiden (z. B. pUC, pUR) bedeutend ist. Diese sehr vielfältigen Selektionssysteme sind altbekannt und entsprechend liegt darüber eine Fülle an Literatur vor.

Neben solchen Selektionsmarkern müssen derartige Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, Signalsequenzen aufweisen, die die korrekte Initiation und Termination der Transkription gewährleisten. Für die korrekte Transkription des hMn-SOD Gens können daher diese Vektoren eine bakterielle oder eukaryotische Transkriptionseinheit enthalten, bestehend aus einem Promotor, der kodierenden Region mit dem hMn-SOD Gen und des sich daran anschließenden Terminators. Entsprechend der Natur der Transkriptionseinheiten können diese konservierte Prototyp-Sequenzen wie z. B. Pribnow-Box oder TTG-Sequenz oder aber CAAT-Box, TATA-Box, die bekannten Terminationssignale (z. B. AATAAA, TATGT), sowie mindestens ein Stop-Codon enthalten, wobei vorzugsweise hinsichtlich des Wirtes homologe Promotoren Terminatoren verwendet werden. Die gebildete mRNA enthält üblicherweise eine 3′poly(A)-Sequenz und/oder eine 5′cap-Struktur. Für die Translation des hMn-SOD Gens bedarf es einer ribosomalen Bindungsstelle (RBS) bestehend aus Shine/Dalgarno (S/D)-Sequenz und einem dazu in definiertem Abstand von allgemein 3 bis 12 Nukleotiden stehendem Initiationscodon sowie mindestens einem Stop-Codon. Alternativ können RBSs synthetisch hergestellt werden, wodurch die Homologie mit dem 3′-Ende der 16S rRNA erhöht werden kann (Jay, E. et al. Nucleic Acids Res. 10, 6319-6329, 1982).

Insbesondere bei eukaryotischen Expressionssystemen z. B. S. cerevisiae) sollten vorzugsweise Regulationssysteme für die Translation wirtseigenem Ursprungs benutzt werden, da in Hefen keine den Prokaryoten analogen Verhältnisse Homologie der S/D-Sequenz mit dem 3′-Ende der 16S rRNA) vorliegen und die Signale bzw. die RBS für die Initiation der Translation auf eine etwas andere Weise als bei Prokaryoten definiert sind (z. B. Kozak, M., Nucleic Acids Res. 9, 5233-5252, 1981; Kozak, M. J. Mol., Biol. 156, 807-820, 1982).

Vorzugsweise besitzt der Klonierungs- oder Expressionsvektor nur eine Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle, die entweder im Ausgangsvektor a priori vorliegt oder nachträglich über entsprechende Linker eingeführt werden kann. Linker können entweder chemisch leicht synthetisiert werden oder sind kommerziell erhältlich.

Häufig benutzte Hefe-Promotoren bei der Herstellung von entsprechenden Expressionsplasmiden beinhalten solche Promotoren, die im Hefesystem die Expression besonders effizient steuern, wie z. B. PGK Promotor (Tuite, M. F. et al., The EMBO Journal 1, 603-608, 1982; Hitzeman, R. A. et al., Science 219, 620-625, 1983), PH05 Promotor (Hinnen, A., & Meyhack, B., Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 101-117, 1982; Kramer, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 367-370, 1984), GAPDH Promotor (Urdea, M. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7461-7465, 1983), GAL10 Promotor (Broach et al. Experimental Manipulation of Gene Expression 83-117, 1983), Enolase (ENO)-Promotor (Holland, M. J. et al., J. Biol. Chem. 256, 1385-1395, 1981), α-Faktor Promotor (Bitter, G.-A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5330-5334; Yakota, T. et al. Miami Winter Symp. 17. Meet. Adv. Gene Technol. 2, 49-52, 1985) oder der ADHI Promotor Amerer, G., Methods in Enzymology 101, 192-201, 1983; Hitzeman, R. A. et al. Nature 293, 717-722, 1981).

Auch sind Promotoren anderer glykolytischer Enzyme (Kawasaki und Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108, 1107-1112, 1982) geeignet, wie Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphat Isomerase, Phosphoglucose Isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide können die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressions-Vektor am 3′Ende der zu experimentierenden Sequenz eingesetzt werden, um Polyadenylierung und Termination der mRNA vorzusehen. Andere Promotoren, die zudem noch den Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Promotor-Regionen der Alkohol-Dehydrogenase-2, des Isocytochrom C, der abbauenden Enzyme, die mit dem Stickstoff-Metabolismus gekoppelt sind, die oben erwähnte Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) und der Enzyme, die für die Metabolisierung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Promotoren, die durch den Hefe Mating Typ Locus reguliert werden, beispielsweise Promotoren der Gene BARI, MECI, STE2, STE3, STE5 können bei temperaturregulierten Systemen durch die Verwendung von temperaturabhängigen sir Mutationen eingesetzt werden. (Rhine, Ph. D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory).

Diese Mutationen beeinflussen die Expression der ruhenden Mating Typ Kassetten von Hefen und dadurch indirekt die Mating Typ abhängigen Promotoren. Generell ist jedoch jeder Plasmid-Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, originäre Replikations- und Terminationssequenzen enthält, geeignet.

Für den Fall, daß die Expression von hMn-SOD in Bakterien erfolgen soll, sind vorzugsweise solche Promotoren einzusetzen, die eine hohe Syntheserate an mRNA bedingen und die darüber hinaus induzierbar sind. Bekannte und verwendete Promotoren beinhalten die Beta-Lactamase-(Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979) inclusive des UV5-Promotors (Silverstone, A. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66, 773-779, 1970) und Tryptophan (trp) Promotor-Systeme (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 4057 (1980); Europa-Anmeldung, Offenlegungs-Nr. 0036 776). Darüber hinaus sind auch andere mikrobielle Promotoren entwickelt und benutzt worden. Die Gen-Sequenz für hMn-SOD kann beispielsweise unter der Kontrolle des Lambda-P_LPromotors transkribiert werden. Dieser Promotor ist bekannt als einer der besonders starken, steuerbaren Promotoren. Die Steuerung wird möglich durch einen thermolabilen Repressor cI (z. B. cI857), von dem benachbare Restriktionsschnittstellen bekannt sind. Daneben können auch der Promotor der alkalischen Phosphatase aus E. coli (Ohsuye, K. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1283-1294, 1983) und hybride Promotoren, wie z. B. den tac-Promotor (Amann, E. et al. Gene 25, 167-178, 1983; De Boer, H. A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25, 1983). Über die Anwendung solcher tragbaren Promotoren (lacuv5, lacZ SD, tac) bzw. über Vektoren zur Herstellung fusionierter und nicht-fusionierter eukaryotischer Proteine in E. coli, kann auch in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, insbesondere S. 412 f nachgelesen werden. Die Expression und Translation einer hMn-SOD Sequenz in Bakterien kann auch unter Kontrolle anderer Regulationssysteme, die als "homolog" zu dem Organismus in seiner untransfomrierten Form gelten können, ablaufen. Beispielsweise können auch Promotor-Operator-Systeme wie Arabinose-Operator, Colicin El-Operator, Galactose-Operator, alkalische Phosphate-Operator, trp-Operator, Xylose A Operator, u. ä. oder Teile davon verwendet werden.

Zur Klonierung oder Expression von hMn-SOD in Bakterien, beispielsweise in E. coli, oder in Hefen, beispielsweise in S. cerevisiae, stehen gutbekannte Vektoren zur Verfügung, von denen für die erstgenannten Wirtssysteme verteilhaft die pBR-(Bolivar, F. et al., Gene 2, 95-113, 1977), pUC-(Vieira, I., Messing. I., Gene 19, 259-268, 1982) pOP-(Fuller, F., Gene 19, 43-54, 1982), pAT-(Windass, J. D. et al., Nucleic Acids Res. 10, 6639-6657, 1982) pHV-Plasmide (Ehrlich, S. D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1433-1436, 1977), Lambda-Vektoren inclusive Phasmide (Brenner, S. et al., Gene 17, 27-44, 1982), Cosmide (Collins, J., Hohn, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4242-4246, 1979) und die anderen literaturbekannten Vektoren (z. B. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, 1982), insbesondere pBR- und pUC-Derivate, beispielsweise pBR322, pUC18 verwendet werden können.

Als Expressionsvektoren in Hefen bieten sich integrierende (YIp), replizierende (YRp) und episomale (YEp) Vektoren (Struhl, K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035-1039, 1979; Stinchcomb, D. T. et al., Nature 282, 39-43, 1979; Hollenberg, C. P., Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 119-144, 1982) an, vorzugweise YEp13 (Broach, J. R. et al. Gene 8, 121-133, 1979), YIp5 (Struhl, K. et al., 1979 s. o., ATCC 37061) sowie pJDB207 (DSM 3181) oder pEAS102. Der Vektor pEAS102 kann erhalten werden, indem YIp5 mit PstI teilweise und mit BamHI vollständig verdaut und das isolierte 4.3 kb Fragment (enthält das URA3 Gen) mit dem 4.4 kb BamHI/PstI-fragment von pJDB207 ligiert werden.

Zusätzlich zu Mikroorganismen sind Kulturen multizellulärer Organismen ebenfalls geeignete Wirte für die Expression von hMn-SOD. Im Prinzip ist jeder dieser Kulturen einsetzbar, ob von Wirbeltier- oder wirbellosen Tierzellkulturen. Größtes Interesse besteht jedoch an Wirbeltier-Zellen, so daß die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebe-Kultur) in den letzten Jahren zu einer routinemäßigen Methode wurde. (Tissue, Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors, 1973). Beispiele solcher nützlichen Wirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Goldhamster-Eierstock (CHO)-Zellen und W138, BHK, COS-7 und MDCK-Zellinien. Expressionvektoren für diese Zellen enthalten üblicherweise einen Replikationsursprung, einen Promotor, der vor der zu exprimierenden hMn-SOD lokalisiert ist, eine notwendige Ribosomenbindungsstelle, RNA-Spleißstelle, Polyadenylierungsstelle und transkriptionelle Terminations-Sequenzen.

Bei der Verwendung von Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressions-Vektoren oftmals aus viralem Material vorgesehen. Beispielsweise stammen die üblicherweise verwendeten Promotoren aus Papovaviren wie Polyoma-, Papilloma Viren, Simian Virus 40 (SV 40) und aus Retroviren, Adenovirus Typ 2. Die frühen und späten Promotoren des SV 40 und deren Anwendungen sind vielfältig beschrieben. Außerdem ist es möglich und oft empfehlenswert, Promotor- oder Kontroll-Sequenzen oder Spleißsignale zu verwenden, die mit den gewünschten Gensequenzen ursprünglich verknüpft sind, vorausgesetzt, diese Kontrollsequenzen sind kompatibel zu den Wirtszellsystemen. So sind SV40-Vektoren bekannt, in denen eine exogene eukaryotische DNA mit ihren eigenen Promotorsequenzen und Spleißsignalen neben dem späten SV40-Promotor ein stabiles Transkript liefern.

Ein Replikatonsursprung kann entweder durch eine entsprechende Vektorkonstruktion erhalten werden, so daß diese einen exogenen Startpunkt, beispielsweise aus SV 40 oder anderen viralen Quellen (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, etc.) enthält oder dieser kann durch die chromosomalen Replikationsmechanismen der Wirtszelle geliefert werden. Wird der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert, reicht die zuletzt genannte Maßnahme meistens aus.

Die Transformation der Zellen mit den Vehikeln kann durch eine Vielzahl an Verfahren erreicht werden. Beispielsweise kann sie durch Kalzium erfolgen, wobei entweder die Zellen in Magnesium gewaschen und die DNA den in Kalzium suspendierten Zellen zugegeben wird oder die Zellen werden einem Kopräzipitat von DNA und Kalziumphosphat ausgesetzt. Bei nachfolgender Genexpression werden die Zellen aus Medien übertragen, die für transfomrierte Zellen selektieren.

Bei intrazellulärer Produktion von hMn-SOD kann das Enzym dadurch isoliert werden, daß die Zellen nach Erreichen einer entsprechend hohen Zelldichte abzentrifugiert und danach enzymatisch oder mechanisch aufgeschlossen werden. Die Reinigung der erfindungsgemäßen hMn-SOD kann über bekannte biochemische Verfahren zur Protein- bzw. Enzymreinigung wie z. B. Dialyse, Elektrophorese, Präzipitation, Chromatographie oder Kombinationen davon erfolgen. Wenn das Enzym aus der Zelle sekretiert wird, werden analoge Verfahren zur Proteinreinigung durchgeführt, um hMn-SOD aus dem Kulturmedium in reiner Form zu erhalten.

Das mit diesen Methoden gereinigte, erfindungsgemäße hMn-SOD zeigt ein dem genuinem Enzym identisches biologisches Aktivitätspektrum in vivo und in vitro.

Unter diesen Aktivitäten sind sowohl immunologische Eigenschaften (z. B. Kreuzreaktion mit Antikörpern von genuiner hMn-SOD gegen die erfindungsgemäße hMn-SOD) als auch biochemische und enzymatische Aktivitäten zu verstehen. Für die biochemische und enzymatische Charakterisierung der hMn-SOD kann z. B. der Lehre von Marklund, S. (Marklund, S. & Marklund, G., Eur J. Biochem. 47, 469-474, 1974) gefolgt werden, wonach auch eine strikte Unterscheidung zwischen den Cu/Zn und Mn enthaltenden Enzymen, z. B. durch Zusatz von KCN (inhibiert Cu/Zn-SOD nicht aber Mn-SOD) oder an Hand der unterschiedlichen pH-Abhängigkeit ihrer Aktivitäten gegeben ist (siehe insbesondere: Ysebaert-Vanneste, M., Vanneste, W. H., Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980).

Bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid handelt es sich nicht ausschließlich nur um das reife hMn-SOD, das im einzelnen beschrieben ist, sondern ebenfalls um jedwede Modifikation dieses Enzyms. Diese Modifikationen beinhalten z. B. Verkürzung des Moleküls am N- oder C-terminalen Ende. Austausch von Aminosäuren durch andere Reste, wodurch die Enzymaktivität nicht wesentlich verändert wird.

Gegenstand der Erfindung sind nicht nur Gensequenzen, die spezifisch für die beschriebene und beispielhaft belegte hMn-SOD codieren, sondern ebenfalls Modifikationen, die leicht und routinemäßig über Mutation, Abbau, Transposition oder Addition erhalten werden können. Jede Sequenz, die für die erfindungsgemäße hMn-SOD codiert (d. h. die das entsprechende und bekannte biologische Aktivitätsspektrum aufweist) und im Vergleich mit der gezeigten degeneriert ist, ist ebenfalls eingeschlossen; Fachleute auf diesem Gebiet sind in der Lage, DNA-Sequenzen insbesondere der codierten Regionen zu degenerieren. Ebenso ist jede Sequenz, die für ein Polypeptid mit dem Aktivitätsspektrum der authentischen hMn-SOD codiert, und die mit den gezeigten Sequenzen (oder Teilen davon) unter stringenten Bedingungen hybridisierbar beinhaltet.

Es gehört zum Stand der Technik, unter welchen definierten Bedingungen eine Hybridisierung (inclusive Vorwaschen, Prähybridisierung, Hybridisierung, Waschen) durchzuführen ist, um stringente Bedingungen zu erreichen. Für die Hybridisierung von Oligonukleotiden gegen eine Genbank ("gene bank screening") ist vorzugsweise unter den Bedingungen nach Wood, I. M. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1582-1588, 1985) zu verfahren. Um zu testen, ob eine bestimmte DNA-Sequenz mit einer der erfindungsgemäßen, für hMn-SOD codierenden DNA-Sequenzen hybridisiert - entweder via in situ Hybridisierung gegen Plaques oder Bakterienkolonien oder via Southern-Blotting - sind die von Maniatis, T. et al. detailliert beschriebenen Methoden und Bedingungen zu übernehmen (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Sping Harber Laboratory, 1982, insbesondere S. 326-328 und S. 387-389). Alle vom Hintergrund sich deutlich abhebenden Signale zeigen demgemäß ein positives Hybridisierungssignal an.

Spezifischer werden die oben näher bezeichneten Aufgaben dadurch gelöst, daß aus Menschengewebe, vorzugsweise aus Gewebe der Plazenta des Menschen, die RNA präpariert wird. Während der Aufschluß von Gewebekulturzellen direkt mit heißem Phenol erfolgen kann, müssen Gewebe für diese Art der Extraktion erst in tiefgefrorenem Zustand, vorteilhafterweise in Gegenwart von pulverisiertem oder körnigen Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff, zerkleinert werden (z. B. Starmix).

Durch Phenol gebildete Aggregate zwischen mRNA und anderen RNAs können durch Formamid oder durch Erwärmen (z. B. 65°C) wieder aufgelöst werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur RNA-Isolierung ist dasjenige nach Chirgwin (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299, 1979). Die poly(A)⁺ RNA kann aus dem von Protein und DNA gereinigtem Präparat zweckmäßigerweise durch Affinitätschromatographie, z. B. Poly(U)-Sepharose oder Oligo(dT)-Cellulose isoliert werden, da in der Regel eukaryotische mRNA-Populationen einen Poly(A)-Schwanz an ihrem 3′-Ende aufweisen (Aviv, H., Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1409-1412, 1972; Lindberg, U., Persson, T., Europ. J. Biochem. 31, 246- 254, 1972). Zur Isolierung der poly(A)⁺-RNA kann bevorzugt nach Auffray (Auffray, C., Rougeon, F., Eur. J. Biochem. 107, 303-314, 1980) vorgegangen werden.

Einen Anreicherung der gereinigten mRNA kann dadurch erfolgen, daß die gesamte mRNA-Fraktion nach ihrer Größe aufgetrennt wird - z. B. durch Zentrifugation in einem Saccharosegradient. Die gewünschte mRNA kann z. B. über bekannte in-vitro-Proteinbiosynthese-Systeme (Retikulotyten, Oozyten von Xenopus laevis) nachgewiesen werden.

Die gereinigte mRNA oder die angereicherte Fraktion dient als Template für die Synthese des ersten Stranges der cDNA, die mit Hilfe der reversen Transkriptase und einem Primer erfolgt. Als Primer sind entweder Oligo (dT) oder synthetische Primer einsetzbar, letzteres können an Hand der bekannten Aminosäuresequenz der hMn-SOD abgeleitet werden und gestatten das wiederholte Primen der reversen Transkription (Uhlen, M. et al. EMBO Journal 1, 249-254, 1982).

Bei der vorliegenden Erfindung wurde die Synthese des ersten Stranges der cDNA mit Oligo(dT)12-18 als Primer in Gegenwart von dNTPs gestartet.

Für die Synthese des zweiten Stranges der cDNA können verschiedene bekannte Methoden angewendet werden, von denen auswahlweise das Primen mit einem komplementären Primer (Rougeon, F., Mach, B., J. Biol. Chem. 252, 2209- 2217, 1977) das Selbstprimen an Hand einer am 3′-Ende der cDNA liegenden "hairpin"-Struktur (Efstratiadis, A. et al., Cell 7, 279, 1976) oder mit einem durch RNaseH gebildeten Okazaki Fragment-ähnlichen Primer (Gubler, U., Hoffmann, B. J., Gene 25, 263, 1982) genannt sein sollen. In der vorliegenden Erfindung wurde die Methode bevorzugt, wie sie von Huynh, T. V. beschrieben wird (Huynh, T. V. et al., in DNA Cloning Vol. I, (D. M. Glover ed.), chap. 2, S. 49-78, 1985). Die danach erhaltene doppelsträngige cDNA kann direkt in einem geeigneten Vektor, beispielsweise in einem Cosmid, Insertions- oder Substitionsvektor, insbesondere in einem Lambda-Vektor, vorzugsweise in λgt10 (Huynh, T. V. et al., 1985) kloniert bzw. verpackt werden. Für die Klonierung in Lambda stehen mehrere bekannte Methoden zur Verfügung, von denen beispielsweise das "Homopolymertailing über dA-dT bzw. dC-dG oder die Linker-Methode mit synthetischen Linkern genannt sein sollen (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Huynh, T. V. et al. DNA cloning Vol. I (D. M., Glover ed.) 1985, 1980; Watson, C. J., Jackson, F. dto., 1985, chapter 3). Im Falle des Klonierens der erfindungsgemäßen cDNA wurde diese in die EcoRI-Stelle von λgt10 inseriert. Die in-vitro-Verpackung und Klonierung der erfindungsgemäßen cDNA bzw. die Konstruktion der cDNA Genbank erfolgte nach Huynh, T. V. et al. 1985, S. 49-78.

Mit der erhaltenen, eine cDNA-Genbank aus Plazentagewebe repräsentierenden Phagenpopulation wurde die Amplifikation und Plaque-Reinigung durch Infektion eines geeigneten Wirts, insbesondere von E. coli, vorzugsweise von E. coli C 600, bzw. unter Sicherstellung des lytischen Vermehrungszyklus von Lambda, durchgeführt.

Die cDNA-Genbank wurde mit radioaktiv markierten, synthetischen Oligonukleotiden, die an Hand der publizierten Aminosäuresequenz (Barra, D. et al. Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. I, 336-339, 1983) abgeleitet wurde, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen durchsucht. Bei der vorliegenden Erfindung wurde das in situ Hybridisierungsverfahren nach Benton und Davis (Benton, W. D., Davis, R. W., Science 196, 180-182, 1977) angewendet. Bevorzugt wurden zwei Gemische aus je acht synthetischen 23-mer Oligonukleotiden der Formel Va und Vb, die kolinear sind mit den Aminosäuren 39 bis 46 bzw. 200-207 der von Barra, D. et al. (s. o.) publizierten Aminosäuresequenz und die die Degeneration des genetischen Codes berücksichtigen. Der jeweils letzten Base am 5′-Ende dieser DNA-Sonden fehlt die Wobble-Base für das vollständige Codon für Gln (Aminosäure 46) bzw. Glu (Aminosäure 207).

A, G, C und T stehen für die entsprechenden Nukleotide, I für Inosin.

Formel Va

Formel Vb

Die Oligonukleotid-Sonden können nach an sich bekannten chemischen Syntheseverfahren hergestellt werden. Für die vorliegende Erfindung wurde ein DNA-Synthesizer Modell 381A (Applied Biosystems) verwendet.

Die Synthese aller möglichen Kombinationen dieser beiden DNA-Sonden sichert, daß mindestens eines der vorhandenen Oligonukleotide optimal mit der für die Sonde komplementären einzelsträngigen DNA-Region des gesuchten hMn-SOD Gens paart. Der Einsatz zweier unabhängiger Pools von 23-mer Oligonukleotiden vermindert die Möglichkeit, daß die "falschen" Positiven ausgewählt werden.

Nach der Isolierung in sich homogener Plaques, die an Hand positiver Signale nach Hybridisierung mit den beiden 23-mer DNA-Sonden identifiziert wurden, konnten sieben rekombinante Phagen isoliert und von deren DNA 500 bis 1000 bp lange EcoRI-Fragmente sequenziert werden. Nach Sequenzanalyse dieser EcoRI-Fragmente nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977; Sanger F. et al. FEBS Letters 87, 107-111, 1978) und nach Subklonierung in die EcoRI-Stelle des M13-Vektors (Bluescribe, Vector Cloning Systems) und Transformation in E. coli, beispielsweise E. coli JM101, konnte gefunden werden, daß die EcoRI-Fragmente cDNA-Inserts enthalten, die für hMn-SOD ab Aminosäure 22 (Klone BS5, BS8, BS9, BS13 BSXIII) bzw. ab Aminosäure 26 (Klone BS3, BS12) codieren.

Es wurde jedoch überraschenderweise auch gefunden, daß sich aus den ermittelten DNA-Sequenzen einige Abweichungen zu der Aminosäuresequenz von Barra, D. et al. (1984, s. o.) ergeben:

Die DNA-Sequenz eines 617 bp langen EcoRI-Fragments, welches aus einem der erhaltenen Klonen, z. B. BS8 isoliert werden konnte, ist in Fig. 1 dargestellt. Das EcoRI-Fragment enthält eine 532 bp lange für hMn-SOD codierende Sequenz sowie eine 51 bp lnage nicht-translatierte Region, inclusive eines poly(A)₃₀ Schwanzes. Anteile von Linker-Sequenzen sind bis zu den (vollständigen) EcoRI-Stellen ebenfalls dargestellt.

Die Positionen 30 bis 33 zeigen eine ThaI-Schnittstelle, an Position 367 bis 372 ist eine BamHI-Stelle zu erkennen. Überraschenderweise finden sich Codons an Positionen 53 bis 61, 155 bis 163, 176 bis 184 sowie 500 bis 508, die kolinear sind für potentielle N-Glykosylierungsstellen der entsprechenden Aminosäuren gemäß der dafür charakteristischen allgemeinen Aminosäurenanordnungen Asn-X-Thr bzw. Asn-X-Ser, wobei X beispielsweise für Valin, Histidin oder Leucin steht, wohin gegen die Cu/Zn-SOD des Cytosols nur eine solche Aminosäurekombination aufweist.

Auf die Aminosäureunterschiede gegenüber der Aminosäure-Sequenz von Barra, D. et al. (Barra, D. et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984), die von dem erhaltenen EcoRI-Fragment abgeleitet wurden, wurde schon an früherer Stelle eingegangen.

Um die fehlenden Basen an den 3′ und/oder 5′Termini der hMn-SOD DNA-Teilsequenz aus der cDNA-Genbank zur Herstellung eines vollständigen hMn-SOD Gens zu erhalten, können verschiedene Strategien verfolgt werden. Beispielsweise kann die erhaltene cDNA als Hybridisierungssonde gegen eine genomische Genbank eingesetzt werden, um die für das ganze Enzym kodierende Sequenz zu erhalten, oder man verfährt z. B. nach Kakidani, H. unter Verwendung synthetischer, zur mRNA komplementärer Oligonukleotide als spezifische Primer für die reverse Transkription (Kakidani, H. et al. Nature 298, 245-249, 1982). Es ist jedoch auch möglich, das fehlende Ende der cDNA-Sequenz an Hand der bekannten Aminosäuresequenz (Barra, D. et al., J. Biol, Chem. 259, 12595-12601, 1984) chemisch zu synthetisieren und mit der gefundenen cDNA zu verbinden, wobei ein definiertes Ende erhalten wird.

Für den zuletzt genannten Weg wurde zur Herstellung der vollständigen, erfindungsgemäßen DNA-Sequenz für hMn-SOD das 5′-Ende durch zwei Oligonukleotide der Formel VIa und VIb komplettiert, die vorteilhafterweise XhoI/XbaI - bzw. XbaI/NcoI - überstehende Enden aufweisen. Erfindungsgemäß ist am 5′-Ende des kodierenden Stranges das 3′-Ende des ADHI-Promotors berücksichtigt worden (Formel VIa)

Formel VIa

Formel VIb

Nach Kombination beider synthetischer Oligonukleotide der Formeln VIa und VIb, Klonierung in einen geeigneten Vektor, beispielsweise in ein entsprechend verändertes pUC18-Derivat und Hinzufügen des ThaI/EcorRI-Fragments der erfindungsgemäßen cDNA aus einem der erhaltenen Klone, dessen 5′-Ende mindestens die ThaI-Stelle aufweist, kann ein Plasmid erhalten werden, das eine vollständige cDNA des hMn-SOD Gens im richtigen Leserahmen entsprechend Formeln VIIa und VIIb enthält, ohne die ThaI-Stellen.

Formel VIIa

Formel VIIb

Die Durchsequenzierung der Klone BS5, BS9, BS13, BSXIII sowie der Klone BS3 und BS12 ergab, daß die Sequenzen der Klone BS5, BS9, BS13 und BSXIII identisch mit Klon BS8 sind. Die Klone BS3 und BS12 zeigen, wie bereits angegeben, gegenüber Klon BS8, einen Unterschied in Aminosäure 29 (CAG statt AAG bzw. Gln statt Lys, Formeln Ib, IIIb und IVb). Ansonsten besteht 100% Homologie zu Klon BS8 bis zur Base 573 des in Fig. 1 dargestellten EcoRI-Fragments (. . . TA*A ACC ACG ATC GTT ATG CTG⁵⁷³). Ab dieser Base sind beide Klone BS3 und BS12 hinsichtlich der in Formel VIII angegebenen 5-ut-Region identisch.

Formel VIII

Weiterhin wurden mehrere cDNA-Klone aus einer cDNA-Genbank (Plazenta) über λgt11 isoliert. Die Herstellung dieser cDNA-Genbank erfolgte in gleicher Weise zu der in den Beispielen beschriebenen Herstellung der cDNA-Genbank aus Placenta-DNA in λgt10. Einer dieser aus λgt11 isolierten Klone, Klon 4, wurde ebenfalls wie beschrieben, in Bluescribe M13+ subkloniert. Die Sequenzierung erfolgte durch wiederholtes Priming mit den synthetischen 17mer Oligonukleotiden

EBI 760 : 5′ AGATACATGGCTTGCAA 3′
EBI 765 : 5′ CTCTGAAGAAAATGTCC 3′
EBI 782 : 5′ GGAGATGTTACAGCCCA 3′
EBI 785 : 5′ AAGGAACGGGGACACTT 3′

Klon 4 ist bis auf Aminosäure 29 (AAG bzw. Lys) und einer . . . TCTA . . .-Sequenz am 3′-Ende im Anschluß an die Multiklonierungstelle mit den Klonen BS3 und BS12 aus λgt10 identisch. Obwohl die analysierte DNA-Sequenz der verbliebenen 61 Basen des 5′-Endes (vor Formel Ia, Klon BS8, entsprechend Codons +1 bis +21 entsprechend Lys bis Glu) einige Basenänderungen gegnüber der abgeleiteten DNA-Sequenz (Formel II, enthalten in Formel IIIb) aufweist, ergibt die Übersetzung dieses DNA-Abschnittes keine Unterschiede zu Barra et al. 1984. Eine Leader-Sequenz vor dem ATG konnte ebenfalls analysiert werden. Die Formel IX zeigt die gefundene Sequenz von Klon 4.

Formel IX

Andere Klone haben unterschiedlich lange 5′-ut-Regionen.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können in verschiedenen Expressionsvektoren eingebaut und mit Hilfe der beschriebenen Kontrollelemente exprimiert werden, vorzugsweise in pES103 mit dem ADHI-Promotor (DSM 4013). pES103 wird dadurch erhalten, daß in das pUC18-Derivat pES102, welches in der HincII-Schnittstelle einen Xho-Linker enthält, das 1500 bp lange BamHI/XhoI-Fragment des ADHI-Promotors (z. B. Ammerer, G., Methods in Enzymology 101, 192-201, 1983) eingebaut wird.

An Stelle dieser ADHI-Promotor-Sequenz von ursprünglich 1500 bp kann auch ein auf ca. 400 bp Länge verkürzter ADHI-Promotor als BamHI/XhoI-Fragment verwendet werden. Den verkürzten ADHI-Promotor (ADHIk) erhält man dadurch, daß Plasmid pWS323E (DSM 4016) mit BamHI/XhoI verdaut und der ADHIk-Promotor isoliert wird.

Für die korrekte Termination wird eine geeignete Terminatorsequenz, zweckmäßigerweise ein ADH-Terminator, vorzugsweise der ADHII-Terminator hinter dem hMn-SOD ligiert. Der ADHII-Terminator (Beier, D. R., Young, E. T., Nature 300, 724-728, 1982) kann über SphI-Verdauung von pMW5-ADHII (Washington Research Fundation) als 1530 bp langes Fragment und nachfolgender HincII-Verdauung als endgültiger ADHII-Terminator (329 bp) erhalten werden, oder aus Plasmid pGD2 (DSM 4014) als 336 bp langes HindIII/XbaI-Fragment.

Für die Expression in Hefe stehen verschiedene Hefevektoren zur Verfügung, in die die Expressionskassetten mit dem erfindungsgemäßen hMn-SOD-Gen eingebaut werden können, vorzugsweise YEp13 (Broach, J. R. et al., Gene 8, 121-133, 1979; ATCC 37115), pJDB 207 (DSM 3181, hinterlegt am 28. 12. 1984), YIp5 (Struhl, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035-1039, 1979; ATCC 37061), pEAS102 (pEAS102 kann dadurch erhalten werden, daß YIp5 mit PstI teilweise und mit BamHI vollständig verdaut wird und das das URA3 Gen enthaltende, isolierte 4.3 kb Fragment mit dem 4.4 kb BamHI/PstI-Fragment von pJDB207 ligiert wird.).

Mit diesen, eine Expressionskassette mit dem erfindungsgemäßen hMn-SOD Gen tragenden Hefevektoren können geeignete Hefezellen nach bekannten Verfahren transformiert werden. Als geeignete Hefezellen für die Expression können vorzugsweise alle diejenigen angesehen werden, die defizient sind für ihre eigene, hefespezifische Mn-SOD und die ein selektierbares Hefe-Gen, wie z. B. HIS3, URA3, LEU2, SUP, um nur einige zu nennen, enthalten. Derartige Mutanten, die beispielsweise durch in vitro oder in vivo konstruierte mutierte Gene und diese über ein "Transplacement" enthalten, sind über integrative Transformation zu erhalten (z. B. Winston, F. et al., Methods in Enzymology 101, 211-228, 1983). Das zu mutierende Mn-SOD Gen der Hefe ist beispielsweise in Plasmid pL41 als BamHI-Fragment enthalten (van Loon et al., Gene 26, 261-272, 1983). Da die vollständige Sequenz dieses BamHI-Fragments bekannt ist (Marres, C. A. M. et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161, 1985), in das Mn-SOD Gen der Hefe auch ohne pL41 zugänglich.

Die durch solche Transformanten produzierte hMn-SOD kann nach bekannten Methoden der Proteinisolierung und Proteinreinigung gewonnen werden. Der Zellaufschluß kann z. B. nach van Loon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3820-3824, 1986) erfolgen.

Für die Expression von hMn-SOD in Bakterien, vorzugsweise E. coli, beispielsweise E. coli HB101, C600, JM101, stehen die schon erwähnten und etablierten Expressionssysteme zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen müssen zu diesem Zweck unter Kontrolle eines starken E. coli Promotors (s. o.), nicht unter einen eukaryotischen Promotor gebracht werden. Beispiele solcher bekannten Promotoren sind lac, lacuv5, trp, tac, trp-lacuv5, λP_L, ompF, bla. Die obligate Anwendung einer ribosomalen Bindungsstelle, um eine effiziente Translation in E. coli zu gewährleisten, wurde schon an früherer Stelle ausführlich beschrieben.

Zum Nachweis der Expression der hMn-SOD-Aktivität durch E. coli werden die Bakterien nach der Inkubation in einem geeigneten, herkömmlichen Kulturmedium aufgeschlossen und der Überstand auf hMn-SOD-Aktivität, wie beschrieben (z. B. Marklund, S., Marklund, G., 1974; Ch. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H. P. Misra und I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys. 183, 511-515, 1977; B. J. Davis, Annals of the NY Academy of Sciences 121, 404-427, 1964; M. Ysebaert-Vanneste and W. H. Vanneste, Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980) getestet.

Der Nachweis des exprimierten hMn-SOD-Gens kann auch durch Markierung der Proteine in Maxizellen erbracht werden. Plasmidcodierte Proteine können durch Verwendung der Maxizelltechnik (Sancar, A. et al., J. Bacteriol, 137, 692- 693, 1979) selektiv in vivo markiert werden. Der E. coli Stamm CSR603 (CGSC 5830) besitzt keine DNA-Repair-Mechanismen. Durch eine geeignete UV-Strahlendosis wird das bakterielle Chromosom zerstört, einige der wesentlich kleineren und in mehreren Kopien pro Zelle vorhandenen Plasmid-DNAs bleiben dagegen funktionell erhalten. Nach Abtöten aller nicht geschädigten, sich vermehrenden Zellen durch das Antibiotikum D-Cycloserin und Aufbrauchen der endogenen mRNA werden in den verbleibenden Zellen nur noch Plasmid-codierte Gene transkribiert und translatiert. Die gebildeten Proteine können durch Einbau von ³⁵S-Methionin radioaktiv markiert und nachgewiesen werden. E. coli CSR603 wird nach üblichen Verfahren mit den Expressionsplasmiden transformiert und auf ampicillinhaltigen Agarplatten auf transformierte Bakterien selektioniert. Die Präparation der Maxizellen und das Markieren der Proteine erfolgt nach der Vorschrift von A. Sancar (1979, s. o.). Als Molekulargewichtsstandard wird ein ¹⁴C-methyliertes Proteingemisch (Amersham) verwendet. Als Kontrolle wird das Plasmid, das nur den Promotor ohne das hMn-SOD-Gen enthält, eingesetzt.

Nach erfolgter Transformation des Wirtes, Expression des Gens und Fermentation oder Zellkultivierung unter Bedingungen, bei denen die erfindungsgemäßen Proteine exprimiert werden, kann das Produkt üblicherweise durch bekannte chromatographische Trennmethoden extrahiert werden, um so ein Material zu erhalten, das die Proteine mit oder ohne Leader und Tailing-Sequenzen enthält. Die erfindungsgemäße hMn-SOD kann mit einer Leader-Sequenz am N-Terminus exprimiert werden, die wie schon beschrieben, von einigen Wirtszellen entfernt werden kann. Wenn nicht, so ist, wie ebenfalls schon beschrieben, eine Abspaltung des Leader-Polypeptids (wenn vorhanden) erforderlich, um reifes hMn-SOD zu erhalten. Alternativ kann die Sequenz so modifiziert werden, daß das reife Enzym im Mikroorganismus direkt produziert wird. Für diesen Fall kann die Precursor-Sequenz des Hefe-Mating-Pheromons MF-alpha-1 verwendet werden, um eine korrekte "Reifung" des fusionierten Proteins und die Ausscheidung der Produkte in das Wachstumsmedium oder den periplasmischen Raum zu gewährleisten. Die "Sezernierung" der hMn-SOD in Hefemitochondrien kann dadurch erfolgen, indem direkt vor das hMn-SOD-Gen die Leadersequenz für das Hefe-Mn-SOD-Gen gestellt wird.

Geeignete Leader-Sequenzen, beispielsweise die von Marres C. A. M. et al., Eur. J. Biochem. 147, 153-161 (1985) beschriebene oder Derivate davon, können entweder natürlichen Ursprungs sein und aus entsprechenden eukaryotischen Zellen (z. B. S. cerevisiae) isoliert werden oder synthetisch hergestellt werden. Beispielsweise kann eine hefespezifische DNA-Präsequenz, die für den Import der hMn-SOD in das Hefe-Mitochondrium notwendig ist, durch Ligieren einzelner synthetischer Oligonukleotide erhalten werden. Erfindungsgemäß kann die komplette Präsequenz zwischen dem Startcodon ATG und dem ersten Codon für die erste Aminosäure der maturen hMn-SOD (Lys, z. B. AAG) oder einer beliebigen Portion eines N-terminalen Endes davon, beispielsweise in Formeln II, IIIa, IIIb, VIa, VIIa, VIIb, VIII oder XI, eingeführt werden. Ebenso kann eine derartige Präsequenz direkt nach dem ATG-Startcodon und direkt vor dem ersten Codon einer gegenüber der genuinen DNA-Sequenz der hMn-SOD durch Sequenzveränderungen mutierten und für ein Protein mit hMn-SOD-Aktivität codierenden DNA eingebaut werden.

Eine Leader-Sequenz, die für den Zweck eines Imports einer hMn-SOD in das Hefe-Mitochondrium erfindungsgemäß verwendet werden kann, zeigt nachstehende Formel X, in der die bekannte Sequenz GCA GCT (Marres, C. A. M. et al., 1985, s. o.) zu GCT GCA ausgetauscht (beide Tripletts kodieren für Alanin) und eine PvuII-Erkennungsstelle geschaffen wurde.

Formel X

Vorzugsweise kann die Leader-Sequenz, beispielsweise gemäß Formel X, in dem XhoI/XbaI Fragment der Formel VIa enthalten sein. Damit wird erreicht, daß dieser 128 bp Linker mit dem Leader über die XhoI- und XbaI-Stellen derart mit dem restlichen hMn-SOD Gen verbunden werden kann, daß die Leadersequenz direkt nach dem Start ATG und direkt vor der ersten Aminosäure (Lysin) der hMn-SOD liegt (Formel XI).

Formel XI

Die Reinigung der hMn-SOD aus Zellen kann nach bekannten Verfahren erfolgen.

Die gentechnisch hergestellten, erfindungsgemäßen hMn-SOD sind auf Grund des biologisch-enzymatischen Wirkungsspektrums einerseits und wegen der jetzt verfügbaren Menge an hochreinem Enzym mit höchstmöglicher immunologischer Identität gegenüber der genuinen hMn-SOD andererseits für jede Art der Prävention, Behandlung und/oder Diagnostik im Bereich von entzündlichen, degenerativen, neoplastischen oder rheumatischen Erkrankungen zur Wundheilung, bei Autoimmunkrankheiten und bei Transplantationen geeignet bzw. zur Prävention und Therapie von Krankheiten, die mit einer Defizienz an hMn-SOD einhergehen oder kausal damit verbunden sind. Beispielsweise umfassen die klinischen Anwendungsmöglichkeiten jene, wie sie aus Bannister, W. H. und Bannister, J. V. (Biological and Clinical Aspects of Superoxide and Superoxide Dismutase, Vol. 11B, Elsevier/North-Holland, 1980) und aus Michelson, A. M., McCord, J. M., Fridovich (Superoxide and Superoxiddismutases, Academic Press, 1977) zu entnehmen sind. Ferner sind folgende klinische Anwendungsmöglichkeiten in Betracht zu ziehen: bei Perfusionswunden, Schlaganfall, alkoholgeschädigter Leber, Frühgeborenen, evtl. Pankreatitis, akuten Atemwegserkrankungen (ARDs), Emphysem, dialysegeschädigten Nieren, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, strahleninduzierten Schäden, Sichelzellanämie.

Ebenso sind die erfindungsgemäßen hMn-SODs zur Erhöhung der Haltbarkeit von festen oder flüssigen Nahrungsmitteln geeignet.

Die erfindungsgemäßen hMn-SODs können entweder systematisch oder topisch verabreicht werden, wobei sich im ersten Fall herkömmliche parenterale Applikationsrouten (z. B. i. v., i. m. s. C., i. a.) und für den zweiten Fall die entsprechend bekannten Darreichungsformen (z. B. Pasten, Salben, Gele, Lutsch- oder Kautabletten, Pulver und andere die lokale Resorption des hMn-SOD-Präparates ermöglichende galenische Formulierungen und pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe) eignen. Als therapeutisch wirksamer Dosisbereich können nach individuellen Kriterien (z. B. Patienten, Krankheitsschwere etc.) beispielsweise ca. 4 mg täglich eingesetzt werden.

Legenden zu den Figuren:

Fig. 1: EcoRI-Fragment aus Klon BS8 mit der 532 bp langen codierenden Region ab Aminosäure 22 der reifen hMn-SOD, der 51 bp 3′ ut-Region und den Sequenzanteilen des Linkers. Die potentiellen N-Glykosylierungsstellen (überstrichen), die einzige ThaI-Stelle und die BamHI-Stelle (unterstrichen) sind angegeben.

Fig. 2: schematische Strategie zur Konstruktion von Plasmid HSOD4, welches das synthetische 5′-Ende des hMn-SOD-Gens als XhoI/NcoI-Fragment enthält.

Fig. 3: Restriktionskarten der Plasmide HSOD2 und HSOD3, sowie von dem daraus konstruierten Plasmid HSOD4.

Fig. 4: Konstruktion eines Plasmid (HSOD6) mit der vollständigen cDNA für hMn-SOD, als XhoI/EcoRI-Fragment.

Fig. 5: Präparation des ThaI/EcoRI-Fragments der hMn-SOD cDNA aus Klon BS8.

Fig. 6: Konstruktion von Plasmid p154/2, das den ADHI-Promotor als 1500 bp BamHI/XhoI-Fragment enthält.

Fig. 7: Konstruktion von Plasmid p150/2 mit den zur Expression von hMn-SOD notwendigen Einheiten ADHI-Promotor und ADHII-Terminator (336 bp XbaI/HindIII-Fragment).

Fig. 8: Fertigstellung der endgültigen Plasmide (pKH1 und pKH2) mit dem ADHI-Promotor bzw. dem ADHIk-Promotor und dem ADHII-Terminator, zur weiteren Insertion der hMn-SOD cDNA über die XhoI/EcoRI-Stelle. Das Plasmid pKH2 entspricht pKH1, außer daß pKH2 anstelle des ADHI-Promotors den ADHIk-Promotor enthält.

Fig. 9: Konstruktion der Expressionskassette HSOD7 mit dem verkürzten ca. 400 bp langen ADHI-Promotor (ADHIk). Die Konstruktion mit dem ADHI-Promotor der ursprünglichen Länge erfolgt ausgehend von pKH1 in analoger Weise.

Fig. 10: Konstruktion von Plasmiden mit dem innerhalb des Hefe Mn-SOD-Gens liegenden URA3-Gens als Marker in unterschiedlichen Orientierungen zum MN-SOD-Gen (SODY7, SODY8), zur Herstellung einer für die Expression geeigneten Hefe Mn-SOD Mutante. Das Gen-Transplacement im entsprechenden Hefe-Stamm (DBY747) wurde mit SODY7 und SODY8 durchgeführt.

Fig. 11: Gelelektrophoretischer Nachweis der Expression von hMn-SOD über die Plasmide pWS490A und pWS491A im Hefestamm WS30-5g. Bahn 1: WS30-5g/pWS490A1, Bahn 2: WS30-5g/pWS490A2, Bahn 3: WS30-5g/pWS491A1, Bahn 4: WS30-5g/pWS491A2, Bahn 5: WS21-1(SOD1), enthält Hefe-MnSOD, Bahn 6: WS30-5g, Bahnen 7 bis 10: hMn-SOD aus Leber (0,3 ug Bahn 8, 1.2 ug Bahn 9, 3.0 ug Bahn 10). Mit den Ziffern 1 bzw. 2 hinter den Plasmidbezeichnungen sind unterschiedliche Transformanten mit denselben Plasmiden gemeint.

Fig. 12: Analyse der MnSOD-Aktivität in Hefeextrakten, welche die Expressionsplasmide pEO24-AB, pEO25-AC bzw. pEO26-AC enthalten, durch Auftrennung der Proteine im Polyacrylamidgel und anschließender Aktivitätsfärbung mit o-Dianisidin nach bekannter Methode: a=WS30-5g, b=WS30-5g/pEO24-AB, c=WS30-5g/pEO25-AC, d=WS30-5g/pEO26AD, e=Marker (0.15 µg human-Leber MnSOD).

Fig. 13: Analyse der Aktivität von rekombinanter humaner MnSOD in den Mitochondrien bzw. im Cytoplasma von 6 verschiedenen Hefetransformanten, durch gelelektrophoretische Auftrennung des Proteins und anschließende Aktivitätsfärbung mit o-Dianisidin nach bekannter Methode (CP-Extr. = Cytoplasma Extrakt, MC-Extr. = Mitochondrien Extrakt):

a = Marker, 0,15 µg humane Leber MnSOD
b = CP-Extr., WS30-5g, pWS490A, ohne MC-Leader
c = MC-Extr., WS30-5g, pWS490A, ohne MC-Leader
d = CP-Extr., WS30-5g, pEO24-AB, mit MC-Leader
e = MC-Extr., WS30-5g, pEO24-AB, mit MC-Leader
f = CP-Extr., WS30-5g, pWS491A, ohne MC-Leader
g = MC-Extr., WS30-5g, pWS491A, ohne MC-Leader
h = CP-Extr., WS30-5g, pEO25-AC, mit MC-Leader
i = MC-Extr., WS30-5g, pEO25-AC, mit MC-Leader
j = CP-Extr., WS30-5g, pWS550A, ohne MC-Leader
k = MC-Extr., WS30-5g, pWS550A, ohne MC-Leader
l = CP-Extr., WS30-5g, pEO26-AD, mit MC-Leader
m = MC-Extr., WS30-5g, pEO26-AC, mit MC-Leader
n = freie Spur
o = Marker, 0,075 µg humane Leber MnSOD

Fig. 14: Elutionsdiagramm (Beispiel 15, Schritt 5) der Chromatographie der erfindungsgemäßen hMn-SOD nach (NH₄)₂SO₄-Fällung (Beispiel 15, Schritt 4) durch eine Mono S Kationenaustauschersäule (Pharmacia).

Fig. 15: SDS-Polyacrylamidgel (15%, Silberfärbung) von hMn-SOD Proben nach verschiedenen Reinigungsstufen.

Die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht eingrenzen sollen, veranschaulichen die Erfindung im Detail.

Verwendete Materialien

Wenn in den folgenden Beispielen nicht besonders angegeben, wurden folgende Materialien, Lösungen, Plasmide, Vektoren und Mikroorganismen benutzt:

ADHI-Promotor:
DSM 4013 (pES103), hinterlegt am (1500 bp BamHI/XhoI) 27. 2. 87
ADHI-Promotor, verkürzt:	DSM 4016 (pWS323E), hinterlegt am (400 bp BamHI/XhoI) 27. 2. 87
ADHII-Terminator:	DSM 4014 (pGD2), hinterlegt am (336 bp XbaI/HindIII) 27. 2. 87
BamHI-Puffer:	150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7.9, 6 mM MgCl₂, 100 µg/ml BSA
Core-Puffer:	50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl
Denaturierlösung:	0,5 M NaOH, 1.5 M NaCl
Denhardt-Lösung (50×):	1 g Polyvinylpyrrolidon MG 360 000, 1 g Ficoll, 1 g Rinderserumalbumin (BSA) ad 100 ml H₂O
E. coli C600:	F^-, supE44, thi1, thr1, leuB6, lacY1, tonA21, λ ^- (ATCC 23724)
E. coli JM101:	supE, thi, Δ (lac-pro AB), [F′, traD36, proAB, lacI^qZ,Δ M15]
High-Puffer:	100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol (DTT)
HincII-Puffer:	10 mM Tris-HCl pH 7.5, 60 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM 2-Merkaptoäthanol, 100 µg/ml BSA
Hybridisierlösung:	wie Prähybridisierlösung, ohne Lachssperma-DNA
Klenow-Reaktionslösung:	22 µl DNA/H₂O, 2,5 µl 10x NTR-Puffer (0,5 M Tris-HCl pH 7.2, 0.1 M MgSO₄, 1 mM DTT, 500 µg/ml BSA) je 1 µl 2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 2.5 U Klenow-Fragment (0.5 µl)
Lambda-Puffer:	100 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCL₂, 1 mM EDTA
LB-Agar:	LB-Flüssigmedium, 15 g/l Bacto-Agar (Difco)
LB-Flüssigmedium:	10 g/l Bacto-Trypton (Difco), 5 g/l Hefe-Extrakt (Difco), 5 g/l NaCl, 10 M NaOH ad pH 7.4
Ligationslösung:	66 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 1 U T4-DNA Ligase
Neutralisationslösung:	0,5 M Tris-HCl pH 7.5, 1,5 M NaCl
Nitrozellulosefilter:	Schleicher & Schuell, Membranfilter BA 85
NruI-Puffer:	50 mM KCl, 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl₂
Prähybridisierlösung:	5×SSC, 5×Denhardtlösung, 50 mM Na-Phosphatpuffer pH 6.8, 1 mM Na₂P₄O₇, 100 µM ATP, 0,1% SDS, 30-100 (50) µg/ml denaturierte, ultraschallbehandelte Lachssperma-DNA
puC18:	Pharmacia
pURA3:	DSM 4015, hinterlegt am 27. 2. 87
S. cerevisiae DBY747:	a, leu2, his3, trp1, ura3 (Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley)
SC-URA-Medium:	0,67% BYNB (Difco), 2% Glukose, 2% 50×AS-Mix (pro Liter: 1 g Histidin, 6 g Leucin, 2,5 g Tryptophan, 4 g Lysin, 1,2 g Adenin, 2 g Arginin, 1 g Methionin, 6 g Phenylalanin, 5 g Threonin, 6 g Isoleucin)
SmaI-Puffer:	10 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Merkaptoäthanol, 100 µg/ml BSA
SphI-Puffer:	10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Merkaptoäthanol, 100 µg/ml BSA
SSC (20×):	3.0 M NaCl, 0.3 M Na₃-Citrat, pH 7.0
SSPE (20×):	3.6 M NaCl, 0,2 M Na₂HPO₄, 20 mM EDTA, mit NaOH (10 N) ad pH 7.4
TE-Puffer:	10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA
ThaI-Puffer:	50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl₂
Top-Agarose:	LB-Flüssigmedium, 0,7% Agarose (Seaken FM-Agarose)
Vorwaschlösung:	1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 0,1% SDS

Beispiel 1. Konstruktion einer cDNA-Genbank

Aus einer frischen Human-Placenta wurden würfelgroße Gewebestücke in flüssigem Stickstoff schockgefroren und das Gewebe bei unter -80°C pulverisiert. Aus dem pulverisierten Gewebematerial wurde anschließend die RNA nach der von Chirgwin, J. M. et al beschriebenen Prozedur extrahiert und präpariert (Chirgwin, J. M. et al, Biochemistry 18, 5294-5299, 1979).

Aus der danach erhaltenen RNA wurde die poly(A)⁺RNA nach Aviv, H. und Leder, P. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1409-1412, 1972) präpariert. Die Synthese der cDNA wurde mit "cDNA synthesis system" (Amersham RPN 1256) durchgeführt.

Das Packaging erfolgte mit Gigapack (Vector cloning systems). Alle weiteren methodischen Schritte zur Klonierung in die EcoRI-Stelle von λgt10 wurden nach der Vorschrift von Huynh T. V. et al. (DNA Cloning Vol. 1, D. M. Glover ed., IRL Press, Chapter 2, 1985) durchgeführt, außer daß als "plating bacteria" E. coli C 600 verwendet wurde. Der Titer, der die cDNA-Genbank repräsentierenden λgt10 Phagen, betrug 1.2×10¹⁰ pfu/ml, die Zahl der unabhängigen Klone 1×10⁶.

Beispiel 2. Amplifikation der λgt10-Genbank

Ein geeigneter E. coli Wirtstamm (C600, Genotyp F-, supE44, thi1, thr1 leuB6 lacY1 tonA21 lambda (M. A. Hoyt et al., 1982, Cell 31, 5656)) wurde über Nacht in LB-Medium, supplementiert mit 0,2% Maltose, bei 37° vorgezüchtet.

Diese Übernachtkultur wurde 5 min bei 3000 upm abzentrifugiert und in eiskalter 10 mM MgSO₄-Lösung suspendiert, so daß die 0D600 nm 4,0 betrug. Die so bereiteten Mg-Zellen wurden bei 4°C gelagert und konnten eine Woche verwendet werden.

12×200 ul Mg-Zellen wurden in sterilen Röhrchen mit einer Phagensuspension (je 50 000 pfu der cDNA-Genbank/-Platte) gemischt und 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden zu jedem Röhrchen 6-7 ml geschmolzene, auf 42°C temperierte Top-Agarose (enthält 10 mM MgSO₄, Endkonzentration) pipettiert, gemischt und auf 12 bei 37°C vorgewärmte LB-Agarplatten (13,5 cm Durchmesser) mit 10 mM MgSO₄ ausgegossen und 6-12 Stunden bei 37°C inkubiert.

Beispiel 3. Primärscreening zur Identifikation rekombinanter λ-Phagen a. Präparation der Nitrozellulosefilter

Die so bereiteten Platten wurden nach erfolgter Inkubation auf 4°C abgekühlt. Mit Bleistift numerierte Nitrozellulosefilter wurden auf die Plattenoberfläche gelegt und die Positionen auf den Platten durch Nadelstiche markiert. Etwa 1 min, nachdem sie vollkommen durchfeuchtet waren, wurden die Filter wieder vorsichtig abgezogen, in Denaturierlösung gelegt und 1 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend erfolgte die Neutralisation in Neutralisationslösung für 5 min bei RT und eine Inkubation für 30 sec in 2×SSPE ebenfalls bei RT.

Bis zu 3 weitere Abzüge wurden von jeder Platte angefertigt, wobei die Filter jeweils 30 sec länger auf der Platte belassen wurden. Die Positionen der Nadelstiche wurden auf die folgenden Filter genau übertragen.

Die Filter wurden auf Filterpapier liegend an der Luft getrocknet und die DNA durch zweistündiges Backen bei 80°C fixiert. Die Platten bewahrte man bis zum Ergebnis der nachfolgenden Hybridisierung auf.

b. Präparation der ³²P-markierten DNA-Sonden

Die synthetischen Oligonukleotidgemische wurden am 381A DNA-Synthesizer (Applied Biosystems) hergestellt, durch Polyacrylamidgelelektrophorese (20% in 8 M Harnstoff, T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 173 ff.) gereinigt und über Sephadex G50 (Pharmacia) entsalzt. Die so synthetisierten DNA-Sonden sind komplementär zu RNA-Basensequenzen, die a) für die Aminosäuren 39-46 bzw. b) 200-207 kodieren (D. Barra et al., Oxy Radicals and their scavenger Systems, Vol. 1, 336-339, 1983) und haben folgende Basensequenzen:

wobei A, G, C und T für die entsprechende Nukleotide, I für Inosin steht.

Die chemisch synthetisierten DNA-Probengemische wurden je in einer Konzentration von 20 pM/ul in Wasser gelöst.

Reaktionssatz

20-100 pM gamma³²-PATP (<3000 Ci/mmol, Amersham), lyophilisiert aus äthanolischer Lösung, 20-100 pmol Oligonukleotid, 1 ul 10×Kinasepuffer (0,7 M Tris-HCl pH 7,6, 0,1 m MgCl₂, 50 mM Dithiothreit, 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (BRL), Wasser ad 10 ul.

Die Reaktion erfolgte 60 min bei 37°C und wurde durch Zugabe von 25 mM EDTA gestoppt. Nicht eingebaute Radioaktivität entfernte man durch Ausschlußchromatographie über eine 1 ml Biogel P6-DG (Biorad) Säule, hergestellt in einer 1 ml Einwegspritze. Als Elutionsmittel wurde TE-Puffer verwendet.

c. In-situ-Hybridisierung

Um Reste von Agarose und Bakterien von der Nitrozellulose zu entfernen, die bei der Hybridisierung zu starker Hintergrundstrahlung führen, wurden die Filter in einem nicht zu kleinem Volumen Vorwaschlösung einige Stunden bis zu über Nacht unter Schwenken bei 65°C inkubiert. Um unspezifische Bindungsstellen für DNA auf den Nitrozellulosefiltern abzusättigen, wurden diese 1-12 Stunden bei 37°C in der zuvor im Vakuum entgasten Prähybridisierlösung inkubiert.

Die zum Hybridisieren eingesetzten, radioaktiv markierten DNAs (ca. 1×10⁹ cpm/µg) wurden zur erforderlichen Menge an auf 37°C vorgewärmter und entgaster Hybridisierlösung zugegeben. Um die Konzentration der jeweiligen DNA-Probe in der Hybridisierlösung möglichst hoch zu halten, wurde nur so viel Hybridisierflüssigkeit verwendet, daß die Filter gerade von Flüssigkeit bedeckt waren. Die Hybridisierung erfolgte 12-18 Stunden bei 37°C.

Die Nitrozellulosefilter wurden anschließend entsprechend der Methode von Wood et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 82, 1585-1588, 1985) 3mal in 6×SSC und 0,05% SDS gespült (4°C) und 2×30 min bei 4°C ebenso gewaschen. Anschließend wurden die Filter in einer frisch bereiteten Lösung, die 3 M Tetramethylammoniumchlorid (Me4NCl), 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM EDTA und 0,05% SDS enthält, 3mal bei Raumtemperatur (RT) gespült, 2×30 min (RT) gewaschen und schließlich 3×30 min bei 49°C (Oligonukleotidgemisch a)) bzw. bei 52°C (Oligonukleotidgemisch b)) gewaschen, an der Luft getrocknet (Oligonukleotidgemisch b)) und auf Papier geklebt. Röntgenfilme wurden 2-8 Tage bei -70°C unter Verwendung eines "intensifiying-screen" exponiert.

Beispiel 4. Plaquereinigung

Da bei der angewandten hohen Dichte der Plaques im ersten Suchvorgang keine einzelnen Plaques isoliert werden konnten, wurden die rekombinanten Lambda-Phagen durch mehrere aufeinanderfolgende Suchvorgänge bei gleichzeitig verringerter Plaquedichte gereinigt. Nach Entwicklung der Autoradiogramme wurden Regionen von der Agarplatte isoliert, (von drei durchgeführten Primärscreenings waren von 28 Regionen 2, von 35 Regionen 1 und von 15 Regionen 5 positiv), die auf beiden im Duplikat hybridisierten Nitrozellulosefiltern ein positives Hybridisierungssignal ergaben. Dazu wurde die gewünschte Stelle mit dem engen Ende einer sterilen Pasteurpipette aus dem Agar gestochen und in 0,3-0,6 ml Lambda-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂ und 1 mM EDTA) überführt. Es kann aber auch SM-Puffer (Maniatis T., Molecular-Cloning, 1982, S. 70) genommen werden. Nach Zugabe von einem Tropfen Chloroform ließ man die Phagen über Nacht bei 4°C aus dem Agar herausdiffundieren und plattierte jede einzelne Phagensuspension in mehreren Verdünnungen erneut aus. Von Platten, die 300-1000 Plaques aufwiesen, wurde erneut ein Nitrozellulosefilterabzug hergestellt und jeweils gegen beide DNA-Sonden hybridisiert. Dieser Vorgang wurde wiederholt, wobei Einzelplaques weiterverfolgt wurden, bis alle Plaques einer Platte ein positives Hybridisiersignal ergaben.

Beispiel 5. Analyse der erhaltenen Phagenklone a. Titration der λ-Phagen

Die Phagensuspensionen wurden in Verdünnungsschritten von 1 : 10 mit Lambda-Puffer verdünnt, durch mehrmaliges Umschwenken gemischt und ausplattiert. Nach Inkubation bei 37°C konnten die auf dem Bakterienrasen entstandenen Plaques gezählt und der Titer (plaque forming units (pfu)) bestimmt werden. Der Titer betrug für die gereinigten Phagensuspensionen 2,2-8,6×10¹⁰ pfu/ml.

b) Präparation der Lambdaphagen-DNA

Nach Isolation und Titration der in sich homogenen Phagenklone wurden diese in einer Dichte von 2×10⁶ pfu/ 13.5 cm Petrischale (mit dem Kulturmedien der Zusammensetzung: 1,5% Agarose, 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 10 mM MgSO (Glukose) mit 200 ul C600 Mg-Zellen (4 OD₆₀₀) plattiert, 5 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend auf 4°C abgekühlt. Die Elution der Phagen erfolgte durch Überschichten der Platten mit je 8 ml Lambdapuffer und einigen Tropfen Chloroform und leichtes Schwenken bei 4°C über Nacht. Der durch Zentrifugation (15 000 upm, 15 min, 4°C) gereinigte Überstand wurde schließlich abgenommen und die Phagen durch Zentrifugation bei 50 000 upm (Beckman Ti50 Rotor) 30 min bei RT pelletiert. Nach Zugabe von je 500 µl Lambdapuffer und Inkubation mit Ribonuklease A (RNase A, 10 µg/ml) und Desoxiribonuklease (DNase, 1 µg/ml), 30 min bei 37°C, wurde die Salzkonzentration durch Zugabe von je 25 ul 0,5 M EDTA, 12 ul 1 M Tris-HCl pH 8.0 und 6.5 ul 20% SDS erhöht und die vorhandenen Enzyme durch Inkubation bei 70°C für 15 min inaktiviert. Nach einer Extraktion mit Phenol und zweimaliger Extraktion mit Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) zu jeweils gleichen Volumina wurde die DNA durch Zugabe von 0,1 Vol. 3 M Natriumazetat pH 5,2 und 2 Vol. Alkohol ausgefällt, abzentrifugiert, mit 70% Alkohol gewaschen, getrocknet und in 50 ul TE-Puffer aufgenommen.

c. Restriktionsanalyse

Je 2 ul DNA-Lösung wurden mit 5 Einheiten EcoRI in HIGH-Puffer 2 Stunden bei 37°C inkubiert, die erhaltenen Fragmente auf einem 1% Agarosegel (T. Maniatis et al., 1982, p. 149 ff.) unter einer Spannung von 1-5 Volt/cm aufgetrennt, die Fragmente mit Längen zwischen 500 und 1000 Basenpaaren vom Gel eluiert (G. M. Dretzen et al., Anal. Biochem. 112, 295-298, 1981) und schließlich einer Sequenzanalyse unterworfen.

d. Sequenzanalyse

Die Subklonierung der Restriktionsfragmente in einen für die Sequenzbestimmung nach (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467, 1977; F. Sanger et al. FEBS-Letters 87, 107-111, 1978) geeigneten Vektor (Bluescribe M13+ bzw. M13-, Vektor Cloning Systems (C. Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119, 1985)) erfolgte nach den üblichen Methoden zur Durchführung von Restriktion und Ligation von DNA-Fragmenten und Transformation von E. coli Wirtszellen (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, p 104, 146 ff., 396; DNA-Cloning, IRL-Press 1985, Vol. 1, chapter 6). So wurden 100 ng isolierte EcoRI-cDNA-Fragmente über EcoRI-Stellen in die entsprechend vorbereitete dsDNA-Form (replikative Form, 50 ng) des Vektors insertiert (durch Inkubation von 2-12 Stunden bei 14°C in 10 ul Ligationslösung) und mit dieser rekombinanten Konstruktion (mit den Bezeichnungen BS3, BS5, BS8, BS9, BS12, BS13, BSXIII) kompetente E. coli (Stamm JM 101) Zellen transformiert.

Es wurde die Einzelstrang-DNA der rekombinanten Phagen isoliert und nach Sanger sequenziert. Die gelesenen Sequenzen wurden mittels geeigneter Computerprogramme (R. Staden, Nucl. Acid. Res. 10, 4731-4751, 1982) verarbeitet.

Der isolierte Klon 8 (BS8) enthält die kodierende Sequenz ab Aminosäure 22 des reifen Enzyms (Fig. 1).

Beispiel 6. Konstruktion einer Expressionskassette

Zur Expression der hMn-SOD in Hefe sind Vervollständigung der isolierten cDNA, sowie die Konstruktion einer Expressionskassette notwendig, wobei der ADHI-Promotor in seiner ursprünglichen Länge (ca. 1500 bp, Methods in Enzymology, Vol. 101, Part C, 192-201, 1983), derselbe in verkürzter Form (ADHIK ca. 400 bp) und der ADHII-Terminator (Dr. R. Beier and E. T. Young, Nature 300, 724-728, 1982) zur Anwendung kommt.

a. Vervollständigung des Gens

Da dem isolierten cDNA-Klon 8 am N-Terminus die den 21 Aminosäuren (AS) entsprechende Basenanzahl fehlt, wurden zur Vervollständigung des Gens entsprechend der berichteten Aminosäure-Sequenz (D. Barra et al., J. Biol. Chem. 259, 12595-12601, 1984) unter Berücksichtigung der Hefe-Codon-Auswahl (P. M. Sharp et al., Nucl. Acids. Res. 14, 5125-5143, 1986) 2 Oligonukleotidpaare als XhoI-XbaI-Fragment (OP1, entsprechend Formel VIa) bzw. XbaI-NcoI-Fragment (OP2, entsprechend Formel VIb) konstruiert und synthetisiert (381A DNA-Synthesizer, Applied Biosystems). OP1 wurde über XhoI/XbaI in das Plasmid V 17 (entstanden aus pUC18 (J. Vieira and J. Messing, Gene 19, 259, 1982) nach HincII Restriktion und Insertierung von XhoI-Linkern (New England Biolabs, d(CCTCGAGG)) und SmaI-Restriktion des entstandenen Plasmids pES102 mit nachfolgender Insertierung von NcoI-Linkern (New England Biolabs, d(CCCATGGG)), insertiert (Fig. 2), OP2 über XbaI/NcoI: Dazu wurden je 4 ug V 17-DNA mit je 10 Einheiten XbaI und NcoI bzw. XhoI und XbaI in 40 ul CORE-Puffer 2 Stunden bei 37°C verdaut und durch Gelelektrophorese (0,7% Agarose, s. o.) gereinigt. Je 5 µl der synthetisierten Einzelstränge von OP1 bzw. von OP2 (jeweils 10 pM/ul) wurden gemischt, 10 min bei 65°C inkubiert und langsam auf RT abgekühlt. Jeweils 1/10 davon wurden mit je 50 ng doppelt geschnittenem Vektor (XhoI/XbaI für OP1 und XbaI/NcoI für OP2) unter oben beschriebenen Bedingungen ligiert (Plasmide HSOD2 und HSOD3, Fig. 2). Schließlich wurden HSOD2 und HSOD3 über ScaI/XbaI (also nach doppelter Verdauung mit ScaI und XbaI in CORE-Puffer 2 Stunden bei 37°C) nach Reinigung und Isolierung der geschnittenen Vektoren durch Gelelektrophorese und Ligation unter oben beschriebenen Bedingungen (Klonieren der Oligopaare OP1 und OP2) zu Plasmid HSOD4 kombiniert (Fig. 2, 3), dieses durch NcoI-Restriktion, darauffolgendem Klenow-Fill-in und EcoRI-Restriktion für die Aufnahme des ThaI/EcoRI-cDNA-Fragments vorbereitet: 5 ug DNA wurden in 50 ul High-Puffer mit 18 Einheiten NcoI bei 37°C mehrere Stunden inkubiert, die geschnittene DNA durch Gelelektrophorese gereinigt, isoliert und die Hälfte davon in 30 ul Klenow-Reaktionslösung 1 Stunde bei RT inkubiert.

Nach Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 2 ul 0,5 M EDTA und Inkubation der Reaktionslösung bei 70°C (10 min) wurde die DNA durch Gelelektrophorese gereinigt, isoliert und mit 7,5 Einheiten EcoRI in 20 ul HIGH-Puffer nachgeschnitten, nochmals gereinigt und isoliert (Fig. 5).

Das ThaI/EcoRI-cDNA-Fragment wurde wie folgt präpariert:

Mit dem Plasmid BS8, das den isolierten cDNA-Klon8 (s. o.) enthält, wurden kompetente E. coli (Stamm JM 101) Wirtszelen transformiert, und das Plasmid unter geeigneten Bedingungen präpariert (T. Maniatis et al., 1982, p. 368).

Nach Restriktion mit ThaI (10 ug Plasmid wurden in 40 ul ThaI-Puffer mit 25 Einheiten ThaI 8 Stunden bei 60°C verdaut), Nachschneiden des 759 bp ThaI Fragments mit EcoRI (s. o.), mit jeweils nachfolgender gelelektrophoretischer Reinigung und Isolation des entsprechenden Fragments, wurde das so erhaltene ThaI/ EcoRI-Fragment (Fig. 4) mit dem entsprechend vorbereitetem Plasmid HSOD4 (ca. 100 ng Fragment wurden mit 50 ng geschnittenem Vektor in 10 ul Ligationslösung ligiert (s. o.)) zu HSOD6 (Fig. 5) kombiniert. Plasmid HSOD6 enthält somit die vollständige c-DNA für hMn-SOD inklusive Met. Der Leserahmen bleibt dabei erhalten.

b. Konstruktion der Expressionskassette

Plasmid HSOD6 wurde mit XhoI und EcoRI (je 5 Einheiten/ug DNA) in CORE-Puffer doppelt verdaut, das XhoI-Fragment (Gen) isoliert und in das Plasmid PKH1 bzw. PKH2 über XhoI/EcoRI insertiert. Die Plasmide PKH1 bzw. PKH2 wurden wie folgt präpariert (Fig. 6, 7, 8): In Plasmid PES 103, das den ADHI-Promotor als 1500 bp BamHI-XhoI-Fragment in PES 102 (PES 102 ist ein pUC18-Derivat, welches in der HincII-Schnittstelle einen XhoI-Linker enthält, die Konstruktion des BamHI-XhoI-Fragments ist in Methods in Enzymology 101, 192-201 beschrieben) enthält, wurden nach SmaI-Restriktion (1 ug Plasmid wurde mit 5 Einheiten SmaI in SmaI-Puffer für 2 Stunden bei 37°C verdaut), Reinigung und Isolation BgIII-Linker insertiert (T. Maniatis et al., 1982, p. 396). Das so entstandene Plasmid (P154/1, Fig. 6) wurde durch EcoRI-Restriktion (s. o.), Klenow-Fill-in (s. o.) und Religation (1 ug DNA wurde in 40 ul Ligationslösung (s. o.) über Nacht bei 14°C inkubiert) zu Plasmid 154/2 verändert (Fig. 6).

Ebenfalls ausgehend von Plasmid pES103 wurde nach doppelter Verdauung mit XhoI und HindIII in CORE-Puffer der Linker - XhoI.EcoRI.XbaI.HindIII - (Fig. 7, synthetisiert am 381A DNA-Synthesizer) insertiert. Dieser Linker enthält die Sequenz

In das so erhaltene Plasmid 150/1 wurde über XbaI/HindIII (doppelte Verdauung in CORE-Puffer) der ADHII-Terminator insertiert (Plasmid 150/2 (Fig. 7)). Der ADHII-Terminator wurde wie folgt erhalten: Plasmid pMW5 ADHII (Washington Research Fundation) wurde mit HindIII (Core-Puffer), danach mit SphI (in SphI-Puffer) verdaut und das isolierte 605 bp Fragment in den Vektor V18 kloniert und in die HincII-Schnittstelle ein XbaI-Linker (Biolabs, CTCTAGAG) eingebaut (Ligation s. o.). Ein 335 bp langes XbaI-/SphI-Fragment wurde in pUC18 (XbaI/SphI) einligiert (pGD2).

Der Vektor V18 wurde dadurch erhalten, daß in pUC18 in dei SmaI-Stelle ein HindIII-Linker eingebaut wurde und die HindIII-Stelle am ursprünglichen Ort fehlt, so daß die Multiklonierstelle in V18 EcoRI.SstI.KpnI.HindIII.BamHI.XbaI.SalI.PstI.SphI lautet.

Der ADHII-Terminator wurde schließlich nach doppelter Verdauung mit XbaI/HindIII in CORE-Puffer nach den üblichen Methoden (s. o.) isoliert. Plasmid 150/2 enthält somit bis auf das über XhoI/EcoRI zu insertierende Gen die für eine Genexpression notwendigen Einheiten von ca. 1500 bp (Promotor), 7 bp (XhoI-Linker), 6 bp (EcoRI-Linker), 7 bp (XbaI-Linker), 329 bp (Terminator). Diese Einheiten wurden nun über BamHI/HindIII (doppelte Verdauung in CORE-Puffer) in den Vektor 154/2 (Fig. 8) inseriert. In dem so erhaltenen Plasmid PKH1 (Fig. 8) wurde in analoger Weise der ADHI-Promotor durch den verkürzten Promotor ADHIk als BamHI/XhoI-Fragment (4 26515 00070 552 001000280000000200012000285912640400040 0002003744038 00004 2639612 bp) ersetzt (pKH2, Fig. 9).

In beide Plasmide wurde schließlich über XhoI/EcoRI (s. o.) das aus HSOD6 herausgeschnittene vollständige cDNA-Gen (s. o.) insertiert. Die so erhaltenen Plasmide HSOD7/1 bzw. HSOD7/2 (Fig. 9 zeigt nur HSOD7/2) unterscheiden sich voneiander nur durch die verschiedenen Promotoren ADHI und ADHIk (s. o.). Die so fertiggestellten Expressionskassetten wurden über Bg1II/HindIII (nach doppelter Verdauung der Plasmide in CORE-Puffer und Isolation der herausgeschnittenen Expressionskassetten) in die entsprechend vorbereiteten und öffentlich erhältlichen Hefetransformationsvektoren YEp13 (J. R. Broach et al., Gene 8, 121-133, 1979, ATCC 37115), pJDB207 (DSM 3181, hinterlegt am 28. 12. 84), pEAS102 (siehe oben), YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 76, 1035-1039, 1979, ATCC 37061) über die Schnittstellen BamHI und HindIII insertiert.

Beispiel 7. Herstellung einer für die Expression geeigneten Hefe Mn-SOD-Mutante

Das Gen für Hefe-Mn-SOD (A. P. G. M. van Loon et al., Gene 26, 261-272, 1983) ist als BamHI-Fragment im Vektor PL 41 (Fig. 10) enthalten und die Sequenz vollständig publiziert (C. A. M. Marres et al. Eur. J. Biochem. 147, 153-161, 1985). Nach Restriktion mit BamHI (2 ug Plasmid wurden mit 5 Einheiten in 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7.9, 6 mM MgCl₂, 100 ug/ul Rinderserumalbumin 2 Stunden bei 36° C verdaut) wurde das 2045 bp lange BamHI-Fragment, das das Gen enthält, wie üblich durch Gelelektrophorese gereinigt und isoliert und über BamHI in den Vektor VO (pUC18, jedoch ohne HindIII-Schnittstelle) subkloniert.

Der Vektor VO wurde dadurch erhalten, indem 1 µg pUC18 mit HindIII geschnitten wurde (CORE-Puffer), das linearisierte Fragment aus dem Gel nach bekannten Methoden isoliert, die überstehenden Enden mit 2 U Klenow-Polymerase (Ligasepuffer + 0,2 mM dNTP) aufgefüllt und nach 30 min bei RT durch Zugabe von 2 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 14°C regligiert wurde.

Das entstandene Plasmid SODY1 (Fig. 10) wurde durch NruI-Restriktion (1 ug Plasmid wurde mit 5 Einheiten NruI in NruI-Puffer 2 Stunden bei 36°C verdaut) durch Gelelektrophorese gereinigt und durch Insertieren eines HindIII-Linkers (CAAGCTTG) zu SODY3 (Fig. 10) verändert. Schließlich wurde in die HindIII-Schnittstelle das URA3-Gen (erhalten aus pURA3) insertiert: 4 ug SODY3 wurden mit 20 Einheiten HindIII 2 Stunden bei 37°C in CORE-Puffer verdaut und dephosphoryliert:

Zu 40 ul Verdauungsansatz wurden 40 µl H₂O, 10 µl 1 mM EDTA, 5 µl 1 M Tris-HCl pH 9.5, 1 µl 100 mM Spermidin 1 ul Calf Intestinal Alkaline Phophatase (CIAP, 1 mg/ml H₂O) zu gegeben und bei 36°C inkubiert. Nach 15 min wurde nochmals 1 ul CIAP zugegeben und weitere 15 min inkubiert. Der dephosphorylierte Vektor wurde ebenfalls durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. 2 ug Plasmid pURA3 wurden mit HindIII geschnitten (siehe oben) und ein 1,2 kb Fragment, welches das Hefegen URA3 enthält, ebenfalls isoliert und in den vorbereiteten Vektor insertiert (s. o.).

Die so entstandenen Plasmide SODY7 und SODY8 enthalten das URA3-Gen innerhalb des Hefe-Mn-Gens und unterscheiden sich in der Orientierung des URA-Gens relativ zum Mn-SOD-Gen (Fig. 10).

Die Orientierung des URA3-Gens relativ zum Mn-SOD-Gen ist feststellbar, da das URA3-Gen eine asymmetrische PStI-Stelle enthält.

Mit dem Plasmid SODY7 und SODY8 wurden im Stamm DBY 747 (Genotyp a, leu2, his3, trp1, ura3, Yeast Genetic Stock Centre, Berkeley) ein "Gen-Transplacement" durchgeführt (Methods in Enzymology 101, 202-211 und 211-228). Der Stamm DBY 747 wurde mit dem BamHI-Fragment aus SODY7 und SODY8 transformiert (J. D. Beggs, Nature 275, 104, 1978). Dazu wurden 20 ug SODY7 bzw. SODY8 mit 50 U BamHI in 200 ul BamHI-Puffer (150 mM NaCl, 6 mM TrisHCl pH 7.9, 6 mM MgCl₂, 1 mM DTT) geschnitten und die gesamte Verdauungsmischung (ohne den pUC-Anteil abzutrennen) mit Phenol extrahiert (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, 1982, S. 458 f) und durch Äthanolfällung konzentriert (Zusatz von 20 ul 3 M Natriumacetat pH 5.5, 500 ul Äthanol). Die DNA wurde in 10 ul Wasser aufgenommen und direkt zur Transformation von Hefe eingesetzt.

Die Transformanten wurden auf Uracilprototrophie selektioniert.

Einzelne Transformanten wurden über Nacht in 5 ml SC-URA-Medium bei 28°C gezüchtet. Diese Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, nach van Loon et al. aufgeschlossen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3820-3824, 1986) und auf ihren Gehalt an Mn-SOD untersucht. Zur gelelektrophoretischen Erfassung von Mn-SOD einerseits und Cu-/Zn-SOD andererseits wurden bereits bestehende Arbeitsvorschriften (Ch. Beauchamp und I. Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276-287, 1971; H. P. Misra und I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys. 183, 511-515, 1977; B. J. Davis, Anals of the NY Academy of Sciences Vol. 121, 404-427, 1964) zur Anwendung gebracht. Bestens bewährt hat sich dabei die Auftrennung der Proteine mit anschließender Negativ-Färbung mit Nitroblautetrazolium (B. J. Davis, 1964; Ch. Beauchamp und I. Fridovich, 1971). Eine Erhöhung der Empfindlichkeit ist durch die Anfärbung mit Dianisidin möglich (H. P. Misra und I. Fridovich, 1977). Zur weiteren Charakterisierung wurde ein spektrophotometrischer Assay (Hyland, K. et al. Anal. Biochem. 135. 280-287, 1983) mit alkalischem Dimethylsulfoxid als O₂^--erzeugendes System und mit Cytochrom c als "scavenger" eingesetzt.

Die Unterscheidung zwischen Mn-SOD einerseits und Cu-/Zn-SOD andererseits erfolgt durch Zusatz von KCN (s. o. und M. Ysebaert-Vanneste und W. H. Vanneste, Anal. Biochem. 107, 86-95, 1980). Die Stämme SODY7/2, SODY7/6, SODY7/8 und SODY7/10 enthielten keine Mn-SOD- Aktivität.

Beispiel 8. Herstellung der Expressionsvektoren

Die unter Beispiel 6b beschriebenen Expressionskassetten wurden als BglII-/HindIII-Fragmente aus dem Plasmiden HSOD7/1 bzw. HSOD7/2 herausgeschnitten (jeweils 2 µg Plasmid-DNA im CORE-Puffer, 2 Stunden bei 37°C mit je 10 U Enzym). Ebenso wurde je 1 µg YEp13, pJDB207 und pEAS102 mit HindIII-BamHI geschnitten (Verdauungsbedingungen wie oben beschrieben).

Je 50 µg Vektor-DNA und 200 ug Insert wurden in Ligasepuffer (wie beschrieben) mit 1 U Ligase über Nacht bei 14°C ligiert und zur Transformation des E. coli-Stammes HB101 eingesetzt. In der folgenden Tabelle ist die Bezeichnung der entsprechenden Plasmide angegeben.

Tabelle 1: Benennung der Expressionsvektoren

Beispiel 9. Herstellung eines zur Transformation geeigneten Hefestammes (WS30-5g)

Es wurde ein Hefestamm hergestellt, der neben den für den Hefestamm SODY7/2 beschriebenen genetischen Markern zusätzlich eine Mutation in einer der lysosomalen Hauptproteasen (die durch ihre Aktivität andere lysosomale Proteasen aktivieren kann) enthält und somit beim Aufbrechen der Hefezellen weniger Proteasen freisetzt (Mutation pep4) (E. W. Jones et al., Genetics 102, 665-677, 1982).

Dazu wurde der MnSOD-defiziente Stamm SODY7/2 mit dem proteasedefizienten Stamm WS20-25 (α leu2 his3 trp1 ura3 pep4) gekreuzt und die daraus resultierenden Haploiden auf ihre genetischen Marker hin untersucht (F. Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, N. Y., 1972).

Der erhaltene Stamm WS30-5g (leu2 his3 trp1 pep4 sod1) ist sehr gut transformierbar und erfüllt die gewünschten Bedingungen.

Derartige Kreuzungen können auch mit anderen gut bekannten und erhältlichen Hefestämmen, beispielsweise mit 20 B-12 (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley) mit ähnlich guten Resultaten durchgeführt werden.

Beispiel 10. Hefetransformation und Expression in Hefe

Der Hefestamm SODY7/2 wurde mit den Plasmiden pWS371A, pWS372A bzw. pWS373A transformiert (J. D. Beggs, Nature 275, 104-109, 1978) und die Transformanten auf ihre Expression hin untersucht.

Dazu wurde eine Vorkultur der Transformanten in SC-leu-Flüssigmedium (analog dem beschriebenen SC-URA-Medium, enthält aber zusätzlich 2,4 g Uracil, jedoch ohne Leucin) hergestellt (Schütteln bei 300 rpm, 28°C, über Nacht). Davon wurden 100 ul in 4 ml YP5%D (1% Bacto Yeast Extract, 2% Bacto Pepton, 5% Glucose) inokuliert und über Nacht gezüchtet (wie die Vorkultur). Die Zellen wurden geerntet und aufgeschlossen wie unter Beispiel 7 bereits beschrieben. Auf das Aktivitätsgel wurde die Menge Zellrohsaft, die 1 ml Kultur entspricht, aufgetragen. Der Aktivitätstest wurde wie unter Beispiel 7 beschrieben, durchgeführt.

Der Hefestamm WS30-5g (leu2 his3 trp1 pep4 sod1) wurde mit den Plasmiden pWS550A, pWS490A, pWS491A transformiert. Die Herstellung der Vorkultur, Kultur und die Messung der hMn-SOD-Aktivität erfolgten wie oben beschrieben.

Die Expression der Plasmide pWS490A, pWS491A im Hefestamm WS30-5g dokumentiert Fig. 11.

Die in der Hefe unter diesen Bedingungen gemessenen MnSOD-Menge entsprach ungefähr 0,5 mg/Liter Kultur.

Beispiel 11. Synthese eines die Hefe-Leader DNA-Sequenz enthaltenden Linkers

Es wurden sechs verschiedene Oligonukleotide EBI 656, EBI 636, EBI 643, EBI 646, EBI 660 und EBI 638 folgender Sequenzen und Längen

über einen 381-A-DNA-Synthesizer (Applied Biosystems), wie unter 3b beschrieben, hergestellt.

Die Oligonukleotide EBI 636, EBI 643, EBI 646 und EBI 660 wurden für die anschließende Ligasereaktion jeweils an ihren 5′-Enden unter folgenden Bedingungen phosphoryliert:

Reaktionsansatz Nr. 1
2 µl EBI 636 (= 100 pMol)
	1 µl 10 × Linker Kinase Puffer
	3 µl 10 mM ATP
	1 µl T4 Polynukleotid Kinase, Biolabs 10 U/µl
	3 µl Wasser
Reaktionsansatz Nr. 2	analog zu Nr. 1, aber mit 2 µl (100 pMol) EBI 660
Reaktionsansatz Nr. 3	2 µl Oligonukleotid EBI 643 (= 100 pMol)
	2 µl Oligonukleotid EBI 646 (= 100 pMol)
	1 µl 10 × Linker Kinase Puffer
	3 µl 10 mM ATP
	1 µl T4 Polynukleotid Kinase (10 Units)
	1 µl Wasser
10 × Linker Kinase Puffer:	0,7 M Tris.Cl pH 7,6
	0,1 M MgCL₂
	0,05 M DTT (Dithiotreitol)

Die Reaktion erfolgte 30 Minuten lang bei 37°C. Anschließend wurde die T4-Polynukleotid-Kinase durch Erhitzen auf 100°C inaktiviert.

Die Oligonukleotide EBI 656 und EBI 638, welche die 5′-Enden des fertigen 128 bp langen DNA Inserts bilden sollen (Formel XI), wurden nicht phosphoryliert, um die Ausbildung multimerer DNA-Inserts in der anschließenden Ligasereaktion zu vermeiden.

Um eine Zusammensetzung des gewünschten Linkers aus den einzelnen Oligonukleotiden nach dem Schema

zu erreichen, wurden für die Annealingreaktion (Hybridisierung der komplementären Oligonukleotide miteinander) zum Reaktionsansatz Nr. 1 2 µl (= 100 pMol) EBI 656 und zum Reaktionsansatz Nr. 2 2 µl EBI 638 (= 100 pMol) hinzugefügt. Im Reaktionsansatz Nr. 3 sind bereits 2 komplementäre Oligonukleotide (EBI 643, EBI 646) enthalten. Alle 2 Reaktionsansätze wurden 2 Minuten lang bei 100°C erhitzt und langsam im Wasserbad abgekühlt.

Die in den Reaktionen Nr. 1 bis Nr. 3 entstandenen kurzen doppelsträngigen DNA-Fragmente wurden wie folgend miteinander ligiert:

10 µl Reaktionsansatz Nr. 1 (EBI 636 + EBI 656)
10 µl Reaktionsansatz Nr. 2 (EBI 660 + EBI 638)
10 µl Reaktionsansatz Nr. 3 (EBI 643 + EBI 646)
3 µl 10 mM ATP
1 µl DNA-Ligase, Boehringer Mannheim, 7 Units/µl

Die Reaktion erfolgte 15 Stunden lang bei 4°C.

Die DNA wurde ihre Größe nach einem 1prozentigen Agarosegel aufgetrennt und das gewünschte 128 bp lange DNA Fragment gemäß Formel XI vom Gel eluiert (G. M. Dretzen et al., Anal. Biochem. 112, 295-298, 1981).

Beispiel 12. Konstruktion der die Leader-DNA-Sequenz enthaltenden Expressionsvektoren

Plasmid HSOD6 wurde wie üblich mit XhoI und XbaI (je 5 Einheiten/µg DNA) im CORE-Puffer doppelt verdaut und der 128 bp lange Linker (XhoI - mitochondrialer Leader - XbaI) nach bekannten Methoden darin insertiert (pEO22-A). Das nun mit der mitochondrialen Hefe-Leader-DNA-Sequenz versehene hMn-SOD-Gen wurde mit XhoI-EcoRI (je 5 Einheiten/µg DNA) im CORE-Puffer doppelt verdaut und über XhoI-EcoRI in pKH1 (Beispiel 6b, Fig. 8) insertiert (pEO23-A).

Die so fertiggestellte Expressionskassette wurde analog Beispiel 8 über BglII/HindIII (nach doppelter Verdauung der Plasmide in CORE-Puffer und Isolation der herausgeschnittenen Expressionskassette) in die entsprechend vorbereiteten Hefetransformationsvektoren YEp13, pJDB207 und pEAS102 über die Schnittstellen BamHI und HindIII insertiert. Die folgende Tabelle 2 bezeichnet die entsprechend erhaltenen Plasmide.

Tabelle 2: Benennung der Expressionsvektoren
Vektor
Plasmidbezeichnung
PJDB207
pEO24-AB
pEAS102	pEO25-AC
YEp13	pEO26-AD

Beispiel 13. Hefetransformation und Expression in Hefe

Der Hefestamm WS30-5g (Beispiel 9) wurde mit den in Tabelle 2 angeführten Plasmiden transformiert und die Transformation auf ihre Expression hin untersucht (Beispiel 10).

Für die Fermentation des transformierten Hefestamms WS30-5g wurde eine Vorkultur der Zusammensetzung: 6,7 g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (Difco), 10 g/l Glucose, 0,16 g/l Arginin, 0,25 g/l Lysin, 0,06 g/l Tryptophan, 0,08 g/l Methionin, 0,03 g/l Cystein, 0,10 g/l Histidin, 0,16 g/l Tyrosin, 0,17 g/l Phenylalanin, 0,16 g/l Thronin, 0,18 g/l Isoleucin, 0,21 g/l Valin, 0,40 g/l Glutaminsäure, 0,21 g/l Glycin, 0,02 g/l Cystin, 0,15 g/l Alanin, 0,20 g/l Asparaginsäure, 0,20 g/l Prolin, 0,15 g/l Serin, 0,10 g/l Asparagin, 0,20 g/l Glutamin, 25 mg/l Adenin, 50 mg/l Uracil mit Magnetrührstab und unter Belüftung bis zur optischen Dichte OD₅₄₆ = 0.01 vorgezüchtet.

Die anschließende Hauptkultur mit der Zusammensetzung:

8,0 g/l (NH₄)₂ SO₄, 2,56 g/l (NH₄)₂HPO₄, 1,16 g/l KCl, 0,60 g/l MgSO₄ · 7 H₂O, 0,56 g/l CaCl₂ · 2H₂O, 0,04 mg/l Biotin, 80 mg/l m-Inosit, 40 mg/l Ca-Pantothenat, 8 mg/l Thiamin, 2 mg/l Pyridoxin, 3,1 mg/l CuSO₄ · 5 H₂O, 19 mg/l FeCL₃ · 6 H₂O, 12 mg/l ZnSO₄ · 7 H₂O, 14 mg/l MnSO₄ · H₂O, 5 mg/l H₃BO₃, 1 mg/l KJ, 2 mg/l Na₂MoO₄ · 2 H₂O, 1 g/l Hefeextrakt, 0,2 g/l Uracil, 0,1 g/l Adenin, 0,5 g/l Citronensäure, 15 g/l Glutaminsäure, 0,2 g/l Histidin, 0,5 g/l Tryptophan, 100 g/l Glucose erfolgte im 20-l-Fermenter (CHEMAP). Für diesen Zweck wurde als Inoculum 5% der Menge der Vorkultur verwendet und unter Rühren (1000 rpm), Belüften (0.5 vvm) und konstantem ph (5.0) bei 28°C im 20-l-Fermenter gezüchtet.

Nach Absinken des Glucosegehalts auf 50 g/l wurden nochmals 50 g/l Glucose zugegeben und weiterfermentiert, bis der Glucosegehalt 10 g/l betrug (was bei 45 Stunden der Fall war). Die Fermentationsbrühe wurde daraufhin abgekühlt, zentrifugiert und die Biomasse eingefroren. Die Ausbeute an Biomasse betrug 18 g/l Zellnaßgewicht.

Die Expression der Plasmid pEO24-AB, pEO25-AC und pEO26-AD im Hefestamm WS30-5g dokumentiert Fig. 12.

Beispiel 14. Hefe-Mitochondrien Präparation

Um festzustellen, ob das Einführen der Hefe-mitochondrialen Leader-Sequenz vor das hMn-SOD-Gen dazu führt, daß das Protein in die Mitochondrien importiert wird, wurden Hefe- Mitochondrien präpariert und die Mn-SOD-Aktivität in den Mitochondrien sowie im Cytoplasma analysiert.

Hefe-Mitochondrien wurden nach einer abgeänderten Form der Methode von G. Daum et al., The Journal of Biol. Chem., 257, 13028-13033, 1982, präpariert.

Eine Vorkultur der Transformanten in SC-leu-Flüssigmedium (Beispiel 10) wurde durch Schütteln (300 rpm) bei 28°C über Nacht gezüchtet. Davon wurden 25 ml in 225 ml YPD-Medium inokuliert und wie die Vorkultur über Nacht gezüchtet. Die Zelen wurden im allgemeinen bei einer optischen Dichte 5-7, bei 600 nm gemessen, durch Zentrifugieren (Sorval, 6500 rpm, 5 min) geerntet. Die Zellen wurden 1mal mit 100 ml Wasser gewaschen. Das Zellpellet wurde in 1 M Mannit, 20 mM KP_i (KH₂PO₄/K₂HPO₄) pH 7,4 suspendiert (1 ml pro 300 mg Zellgewicht) und 1 mg/ml Zymolase (Miles, MG.500) hinzugefügt. Spheroplasten wurden durch zweistündiges langsames Schütteln (50 rpm) bei 28°C erzeugt. Die Spheroplasten wurden durch Zentrifugation geerntet (3000 rpm, 5 min, Hereaus Christ Tischzentrifuge) und 1mal mit 1 M Mannit, 20 mM KP_i pH 7,4, 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) gewaschen. Der Überstand wurde verworfen und 1-2 Pelletvolumina an Glasperlen (Durchmesser 0,1 mm) hinzugefügt.

Die Zellen wurden durch 1minütiges Rühren aufgebrochen und in 2,5 ml 0,65 M Mannit, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF suspendiert. Ganze Zellen und Zelltrümmer wurden bei 2000 rpm, 5 Minuten lang (Hereaus Christ Tischzentrifuge) abzentrifugiert. Die Mitochondrien wurden anschließend durch Zentrifugation (Sorval J-21, 12 000 rpm, 10 min) aus dem Überstand gewonnen. Der Überstand enthält das Zytoplasma und wurde aufgehoben, um später auf hMn-SOD-Aktivität untersucht zu werden. Das rotbraune Mitochondrienpellet wurde mit dem oben angeführten Puffer gewaschen (weiße zytoplasmatische Bestandteile wurden weggespült) und die Mitochondrien in 2,5 ml des gleichen Puffers suspendiert. Verunreinigungen wurden nochmals durch Zentrifugation (Hereaus Christ, Tischzentrifuge, 4000 rpm, 5 min) entfernt und die Mitochondrien in einer zweiten Zentrifugation (Sorval, J-21, 12 000 rpm, 10 min) aus dem Überstand pelletiert. Die Mitochondrien wurden mit Glasperlen aufgebrochen, analog der Methode, um Hefezellen aufzubrechen (van Loon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3820-3824, 1986), und im Aktivitätsgel auf ihren Gehalt an hMn-SOD untersucht (Fig. 13).

Beispiel 15. Reinigung der erfindungsgemäßen hMn-SOD

Die Isolierung der rekombinanten hMn-SOD erfolgte aus dem Stamm WS30-5g/pEO24-AB (Hefevektor PJDB207) über mehrere Schritte.

Schritt 1: Zellaufschluß

Die Zellmasse (Beispiel 13) wurde in 10 ml destilliertem Wasser pro Gramm Naßgewicht gewaschen und bei 16 000×g, 15 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in Na, K-Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) im Verhältnis 1 : 3 (w/v) resuspendiert. Die Zellen wurden dann in einer kontinuierlich arbeitenden Zellmühle (Dynomill KDL; Bachofer, Basel, Schweiz; 0,6-l-Mahlbehälter, Wasserkühlung) mit Hilfe von Glaskugeln (0,1 mm Durchmesser) bei einer Flußrate von 6 l/h aufgeschlossen. Der Zellextrakt wurde 15 Minuten zentrifugiert (16 000×g, 4°C) und der Niederschlag verworfen.

Schritt 2: Polyethylenimin-Fällung

Zum Überstand aus Schritt 1 wurde eine 5prozentige (w/v) wäßrige Polyethyleniminlösung (pH 8,0) unter Rühren bis zu einer Endkonzentration von 0,5% zugesetzt (Polyethylenimin, Serva, Heidelberg). Danach wurde noch 30 Minuten weitergerührt und dann der Niederschlag bei 16 000×g (30 Minuten) abzentrifugiert.

Schritt 3: Hitzefällung

Der Überstand aus Schritt 2 wurde in Stahlbechern unter Rühren in einem 80°C heißen Wasserbad auf 60°C erhitzt und im Eisbad wieder auf Raumtemperatur abgekühlt. Ausgefälltes Protein wurde durch Zentrifugieren (10 000×g, 10 min, 4°C) entfernt.

Schritt 4: Ammoniumsulfat-Fällung

Der Überstand aus Schritt 3 wurde mit festem Ammoniumsulfat auf 20% Sättigung gebracht und das Präzipitat durch Zentrifugation (10 000×g, 15 min, 4°C) entfernt. Die Ammoniumsulfatkonzentration wurde dann auf 90% erhöht und der Niederschlag durch Zentrifugation (10 000×g, 15 min, 4°C) gewonnen. Das Sediment wurde in wenig MES-Puffer (Morpholinoethansulfonatpuffer, 50 mM, pH 6,0; 2-Morpholinoethansulfonsäure von Sigma, Deisenhofen) aufgenommen und über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert.

Schritt 5: Kationenaustauschchromatographie

Eine Mono-S-Säule (Mono S HR 5/5, Pharmacia, Schweden) wurde mit 5 Säulenvolumen MES-Puffer äquilibriert. Nachdem die Säule mit dem Extrakt aus Schritt 4 beladen war, wurden nicht gebundene Proteine mit 5 Säulenvolumen MES-Puffer ausgewaschen. Die erfindungsgemäße hMn-SOD wurde dann in einem linearen Gradienten von 0-50 mM NaCl in MES-Puffer eluiert (20 Säulenvolumen). Fraktionen, die hMn-SOD-Aktivität enthielten, wurden vereinigt und gegen Na, K-Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,0) dialysiert.

Die hefeeignen SOD-Enzyme (Mn-SOD, CuZn-SOD) können in diesem Reinigungsschritt abgetrennt werden. Ein Elutionsdiagramm ist in Fig. 14 dargestellt.

Schritt 6: Adsorptionschromatographie an Hydroxylapatit

Eine mit Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,0) äquilibrierte Hydroxylapatitsäule (HA-Ultrogel, IBF, Villeneuve-la-Garenne, Frankreich) wurde mit dem Dialysat aus Schritt 5 beladen und die erfindungsgemäßen hMn-SOD mit einem linearen Gradienten (20 Säulenvolumen) von 5-300 mM Na,K-Phosphat pH 7,0 eluiert.

Der in den einzelnen Reinigungsschritten erzielte Reinheitsgrad von hMn-SOD wurde durch reduzierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese verfolgt (Fig. 15).

Beispiel 16. Charakterisierung der erfindungsgemäßen hMn-SOD

Die nach Beispiel 15 gereinigte erfindungsgemäße hMn-SOD wurde über Gelpermeations-HPLC, Reverse Phase HPLC, N-terminale Sequenzierung, SDS-Gelelektrophorese, native Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung analysiert und mit der natürlichen hMn-SOD verglichen.

a. Gelpermeations-HPLC

Säule: Waters Protein Pak I 125, 2×(7,8×300 mm), 10 µm Teilchendurchmesser
Eluens: 0,5 M Na₂SO₄, 0,02 M NaH₂PO₄, pH 7,0, 0,04% Tween 20, 25% Propylenglycol
Fluß: 0,5 ml/min
Detektion: UV-Absorption, 214 nm

Natürliche bzw. erfindungsgemäße hMn-SOD zeigen den Hauptpeak des SOD-Tetrameren bei einem Molekulargewicht von 70 000 bzw. 76 000, wobei die Eichung über vier Standardproteinen erfolgte. Innerhalb des experimentellen Fehlers dieser Methode sind diese Werte als identisch anzusehen.

b. Reverse Phase HPLC

Säule: Bakerbond WP C₁₈, 4,6×250 mm, 5 µm Teilchendurchmesser, 30 nm Porendurchmesser
Eluens A: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser
Eluens B: 0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril
Gradient: 20% B für 2 min, 20-68% B in 24 min, 68% B für 10 min, 68-20% B in 1 min
Fluß: 1,0 ml/min
Detektion: UV-Absorption, 214 nm und 280 nm

Natürliche und erfindungsgemäße hMn-SOD zeigen eine Retentionszeit von knapp 21 min (20.7 bzw. 20.9 min).

c. N-terminale Sequenzierung

Sequenziert wurde ein über Reverse Phase HPLC entsalzter Peak von erfindungsgemäßer hMn-SOD. Die Sequenzierung erfolgte mit einem Gasphasensequenator der Firma Applied Biosystems (Modell 470 A) mit dem Programm 02RPTH. Mit einer Ausgangsmenge von 0,8 nM konnte bis zur Aminosäure 20 sequenziert werden. Es wurde 100%ige Übereinstimmung mit der erwarteten Sequenz (aus natürlichem Protein und cDNA) gefunden. Die Leader-Sequenz zum Transport in die Mitochondrien war vollständig abgespalten.

d. SDS-Gelelektrophorese

Trenngel: 15% Acrylamid
Stackinggel: 4% Acrylamid
Färbung: Silberfärbung nach B. R. Oakley et al. (Analyt. Biochem. 105, 361-363, 1980).
Gelmaße: 0.75 mm (8×10 cm)
Laufbedingungen: 60 min, 150 V

Die SDS-Gelelektrophorese wurde weitgehend nach der Originalvorschrift von U. K. Lämmli (Nature 227, 680-685, 1970) durchgeführt. Bei der Probenvorbereitung für hMn-SOD wurden die Proben mit DTT als Reduktionsmittel versetzt und aufgekocht. Am SDS-Gel tritt hMn-SOD hauptsächlich als Monomeres mit M etwa 25 000 auf. Je nach Vollständigkeit der Reduktion ist auch das Tetramere bei M etwa 90 000 nachweisbar. Fig. 15 zeigt ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel nach Silberfärbung.

e. Native Gelelektrophorese

Trenngel: 7,5% native PAGE nach Davis, B. J. (Ann: NY Acad. Sci. 121, 404-427, 1964)
Stackinggel: 2% Acrylamid + Saccharose
Gelmaße: 0.75 mm (8×10 cm)
Laufbedingungen: 75 min, 150 V (const.)
Färbung: Coomassie Blue nach bekannten Methoden und Aktivitätsfärbung mit o-Dianisidin nach Misra, H. P., Fridovich, I. (Arch. Biochem. Biophys. 183, 511-515, 1977)

Die nach der Hydroxypatit-Chromatographie erhaltene erfindungsgemäße hMn-SOD zeigte nach der Elektrophorese sowohl mit Coomassie-Blue-Anfärbung (aufgetragene Menge an hMn-SOD: 0.3 µg) als auch nach Aktivitätsfärbung mit o-Dianisidin (aufgetragene Menge an hMn-SOD: 75, 30 bzw. 15 ng) eine einheitliche und in gleicher Position liegende Bande.

f. Ioselektrische Fokussierung

pH-Bereich: 3.5-9.5
Gelplatten: LKB, PAGplate (1 mm×(9×10 cm))
Elektrodenlösungen: 1 M Phosphorsäure (Anode), 1 M Natronlauge (Kathode)
Kühltemperatur: 7°C
Probenmenge: 4.0 bzw. 6.0 µg
Laufbedingungen: Präfokussierung 500 Vh, Fokussierung 3000 Vh insgesamt
Färbung: Coomassie Blue, Aktivitätsfärbung mit o-Dianisidin

Als isoelektrischer Punkt wurde pI=8.15 ermittelt.

Claims

1. DNA-Sequenzen, die für die gesamte oder partielle genetische Information eines Enzyms kodieren, welches die enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der human-Mangan-Superoxiddismutase (hMn-SOD) aufweist.

2. DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein prämatures Enzym hMn-SOD kodieren, welches in das Mitochondrium importiert werden kann, dabei korrekt zum aktiven maturen Enzym prozessiert wird, welches die enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der hMn-SOD aufweist.

3. DNA-Sequenzen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusammengesetzt sind aus der genetischen Information für eine hMn-SOD und einer aminoterminalen Leader- oder Signalsequenz.

4. DNA-Sequenzen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der genetischen Information für hMn-SOD direkt eine DNA-Sequenz vorangestellt ist, die eine mitochondriale Leader- oder Signalsequenz ist.

5. DNA-Sequenzen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die mitochondriale Leader- oder Signalsequenz aus Hefe stammt.

6. DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Zusammensetzung der Reihenfolge Translationsstartsignal (ATG), mitochondriale Leader- oder Signalsequenz, DNA-Sequenz für hMn-SOD, mindestens ein Stopcodon, entspricht.

7. DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Nukleotidsequenzen gemäß Formeln Ia, Ib, II, IIIa, IIIb, Va, Vb, VIa, VIb, VIIa, VIIb, VIII, IX, X, XI entsprechen.

8. DNA-Sequenzen, die mit einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 unter stringenten Bedingungen hybridisieren, wobei diese DNA-Sequenzen synthetischen, halbsynthetischen oder natürlichen Ursprungs sein können und demnach mit den DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 sowie deren Mutationen jedweder Art verwandt sind und für ein Enzym mit den enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der hMn-SOD codieren.

9. Replizierende Vektoren mit mindestens einem Selektionsmarker und/oder mit einer Erkennungsstelle für mindestens ein Restriktionsenzym außerhalb des Replikationsursprungs und außerhalb anderer essentieller Genbereiche, gegebenenfalls innerhalb eines Selektionsmarkers, dadurch gekennzeichnet, daß diese eine der DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthalten.

10. Replizierende Vektoren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie viralen Ursprungs sind, vorzugsweise Lambda-Phagen, insbesondere λgt10 oder M13-Phagen.

11. Replizierende Vektoren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie plasmidischen Ursprungs sind.

12. Plasmide, eine der DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthaltend, dadurch gekennzeichnet, daß diese Plasmide eine diese besagten DNA-Sequenzen enthaltende Expressionskassette tragen, prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen stabil transformieren können, in einer dieser Wirtszellen replizierbar sind und die darin enthaltende genetische Information für hMn-SOD korrekt transkribiert und translatiert wird.

13. Plasmide nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie YEp13, pJDB207, pEAS102, YIp5 sind.

14. Plasmide nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie pUC-Plasmide sind, vorzugsweise pUC18.

15. Plasmide nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sich darin die Expressionskassette mit den Elementen Promotor, Initiationscodon, mitochondriale Leader- oder Signalsequenz, hMn-SOD-Strukturgen, Stopcodon, Terminator, alle in korrekter Orientierung zur Leserichtung, befindet.

6. Plasmide nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der in diesen Plasmiden enthaltenen Expressionskassette der vollständige ca. 1500 bp lange ADHI-Promotor oder der verkürzte ca. 400 bp lange ADHIk-Promotor und der Terminator in besagter Expressionskassette der ADHII-Terminator sind.

17. Die Plasmide pWS490A, pWS491A, pWS550A, pWS371A, pWS372A, pWS373A, pEO24-AB, pEO25-AC, pEO26-AD.

18. Transformierte Wirtszellen, die für hMn-SOD codierende genetische Information enthaltend.

19. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie replizierende Vektoren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, insbesondere Plasmide nach einem der Ansprüche 12 bis 17, enthalten, diese replizieren und exprimieren, die synthetisierte hMn-SOD in die wirtseigenen Mitochondrien importieren und prozessieren und intrazellulär akkumulieren.

20. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß diese Prokaryoten sind, besonders Enterobacteriaceae, Bacillaceae, apathogene Micrococcaceae, vorzugsweise E. coli, insbesondere E. coli C600, E. coli JM 101.

21. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß diese Eukaryoten sind, vorzugsweise Hefen.

22. Transformierte Wirtszellen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese Säugetierzellen sind.

23. Verfahren zur Herstellung von hMn-SOD, dadurch gekennzeichnet, daß

a. die mRNA aus menschlichem Gewebe, vorzugsweise Plazentagewebe, isoliert und die poly(A)⁺RNA präpariert wird,
b. von dieser poly(A)⁺RNA die doppelsträngige cDNA synthetisiert und davon eine cDNA-Genbank konstruiert wird,
c. eine für hMn-SOD codierende DNA, Gesamt- oder Teilsequenz, aus besagter cDNA-Bank mittels von der Aminosequenz der hMn-SOD abgeleiteter DNA-Sonden, vorzugsweise solchen entsprechend Formeln Va und Vb, identifiziert und isoliert wird,
d. diese DNA-Sequenz gegebenenfalls bis zum Start- oder Stopcodon komplettiert wird,
e. eine mitochondriale Leader- oder Signal-DNA- Sequenz, vorzugsweise entsprechend Formel X, direkt nach dem Startcodon (ATG) des hMn-SOD-Gens und vor dem ersten für hMn-SOD kodierenden Codon (Lys) positioniert wird,
f. mit dieser kompletten, für mit einem Leader- oder Signalpeptid ausgestatteten hMn-SOD codierenden DNA-Sequenz eine je nach Wirtszelle geeignete Expressionskassette bestehend aus Promotor, Initiationssignal, hMn-SOD-Gen mit Leader- oder Signalsequenz, Stopcodon, Terminator, konstruiert wird,
g. diese Expressionskassette in ein für eukaryotische Zellen geeignetes Expressionsplasmid, vorzugsweise einen Hefevektor, inkorporiert wird,
h. mit diesem Expressionsplasmid, welches das mit einer Leader- oder Signalsequenz ausgestattete hMn-SOD-Gen enthält, vorzugsweise eukaryotische Wirtszellen, insbesondere Hefezellen, transformiert werden,
i. die durch diesen transformierten Wirt synthetisierte und korrekt prozessierte hMn-SOD aus Mitochondrien extrahiert und anschließend gereinigt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die zu verwendenden DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 definiert sind.

25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die zu verwendenden Vektoren und Plasmide gemäß den Ansprüchen 9 bis 11 sowie 12 bis 17 definiert sind.

26. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die zu verwendenden Wirtszellen nach Ansprüchen 18 bis 22 definiert sind.

27. Verfahren nach Ansprüchen 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß danach direkt eine korrekt prozessierte hMn-SOD herstellbar ist, welche die bekannten enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der authentischen hMn-SOD aufweist.

28. Verfahren nach Ansprüchen 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß danach eine korrekt prozessierte hMn-SOD entsprechend den Aminosäuresequenzen gemäß Formeln IVa oder IVb herstellbar ist.

29. Polypeptid mit den bekannten enzymatischen, biochemischen und immunologischen Eigenschaften der hMn-SOD in im wesentlichen reiner Form.

30. Polypeptid nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es frei von nativer Glykosylierung oder glykosyliert vorliegt.

31. Polypeptid nach Ansprüchen 29 und 30, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäure Methionin vor der 1. Aminosäure des N-Terminus aufweist.

32. Polypeptid nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mit einem mitochondrialen Leader-Peptid ausgestattet ist, welches vor der ersten Aminosäure der hMn-SOD (Lys) positioniert ist.

33. Polypeptid nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es in korrekt prozessierter Form vorliegt.

34. Polypeptid nach Ansprüchen 29 und 33, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenzen gemäß Formeln IVa oder IVb aufweist.

35. Polypeptid nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäure Methionin vor der 1. Aminosäure des N-Terminus der maturen hMn-SOD aufweist.

36. Polypeptid nach Ansprüchen 34 und 35, dadurch gekennzeichnet, daß es ein mitochondriales Leader-Peptid enthält, welches zwischen dem vom Startcodon kodierten Methionin und der ersten Aminosäure der hMn-SOD (Lysin) positioniert ist.

37. Polypeptid, herstellbar nach einem der Ansprüche 23 bis 28.

38. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 29 bis 37 zur Herstellung eines Medikaments.

39. Mittel für die therapeutische Behandlung des Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß es neben pharmazeutisch inerten Trägerstoffen eine wirksame Menge eines Polypeptides gemäß einem der Ansprüche 29 bis 37 enthält.