FI88407B - Dna-molekyl, transformerade jaestceller och foerfarande foer framstaellning av human-lysozym - Google Patents

Description

1 88407 DNA-molekyyli, transformoidut hiivasolut ja menetelmä ihmis-lysotsyymin valmistamiseksi - DNA-molekyl, transformerade jästceller och förfarande för framställning av human-lysozym

Esillä olevan keksinnön kohteena on DNA-molekyyli, transformoidut hiivasolut sekä ihmis-1ysotsyymin valmistaminen.

Keksinnön kohteena olevalle DNA-molekyylille on tunnusomaista se, että se muodostuu nukleotidisekvenssistä, jonka kaava on 5'AAGGTCTTTGAAAGGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGÄAAAGATTGGGAATGGATGG CTACAGGGGAATCAGCCTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTAC AACACACGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATATTTC AGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTG TCATTTATCCTGCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCA AAGAGGGTTGTCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGAGÄAATCGTT GTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTG.

Keksinnön kohteena on myös menetelmä ihmis-lysotsyymin valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, että se käsittää seuraavat vaiheet: a) eristetään ihmis-lysotsyymi-mRNA kokonais-RNA:sta ihmisso-lulinjasta, b) konstruoidaan cDNA vaiheessa a) saadusta eristeestä ja : lopuksi kloonataan kaksoissäikeinen cDNA, c) seulotaan vaiheesta b) saatu cDNA-geenipankki hybridisoin- : nin kautta käyttämällä sopivaa oligonukleotidia, d) konstruoidaan täydellinen ihmis-lysotsyymia koodaava cDNA, *:* jossa on nukleotidisekvenssi, jonka kaava on

5'AAGGTCTTTGAAAGGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATGG CTACAGGGGAATCAGCCTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTAC AACACACGAGCTACAAACTACAATOCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATATTTC AGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTG TCATTTATCCTGCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCA AAGAGGGTTGTCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGAGAAATCGTT :' GTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTG

2 88407 tai sen aileelimuunnokset, jolla on ihmis-lysotsyymin koodausfunktiot, tai nukleotidisekvenssi, joka edellä olevan kaavan mukaisella nukleotidisekvenssillä stringenteissä olosuhteissa, jotka selektoivat enemmän kuin 85 % homologian, hybridisoi-tu ja koodaa ihmis-lysotsyymin, e) yhdistetään vaiheesta d) saatu cDNA, sen 5'-pääty johtosek-venssiin, f) rekombinoidaan vaiheesta e) saatu DNA vektoriaalisen DNA:n kanssa ja konstruoidaan ekspressioplasmidi, joka oleellisesti muodostuu elementeistä promoottori, translaatio aloi-tussignaali, vaiheesta e) saatu DNA-molekyyli, pysäytyskoodi ja terminaattori, ja g) transformoidaan hiivasolu vaiheesta f) saadulla rekombinoi-dulla DNA-molekyylil la, viljellään näitä soluja sopivassa väliaineessa ja erotetaan näin saatu ihmis-lysotsyymi vällaineesta.

Lysotsyymit on määritelty 1,4-beta-N-asetyylimuramidaaseiksi, jotka katkaisevat glykosidisidoksen N-asetyyli-muramiinihapon (MurNAc) Cl atomin ja N-asetyyliglukosamiinin (ClcNAc) C4 atomin välillä bakteereiden peptidoglykaanissa (1). Alexander Fleming havaitsi 1922, että sekä erilaiset kudokset että myös munanvalkuainen pystyvät lyysaamaan eräitä gram-positiivisia bakteereita. Hän kutsui tätä lyyttistä tekijää lysotsyymiksi, entsyymik-• si, joka kykenee lyysaamaan bakteereita. Fleming osoitti, että lysotsyymiä esiintyy ruston ja mahan kudoshomogenaateissa, kyynelissä, syljessä ja leukosyyteissä, mutta ei terveiden henkilöiden virtsassa, aivo-selkäydinnesteessä tai hiessä (2).

Lysotsyymin vaikutus bakteereiden vastaisena aineena tulee näkyviin sekä sen suorana bakteriolyyttisenä vaikutuksena makrofaa-gien fagosytoosin yhteydessä (3, 4).

Lysotsyymin merkitsevä osuus välittäjänä rottien aiveolaaristen makrofaagien suorittamassa mikrobien torjunnassa on osoitettu: Ehjillä bakteereilla ei tapahtunut fagosytoosia, mutta lysotsyy- 3 88407 min vaurioittamat bakteerit fagosytoituivat nopeasti (3). Samoin on osoitettu, että lysotsyymi voi suoraan lisätä liuskatumaisten kipujen lievittämiseen, ja sillä on terapeuttinen vaikutus reumaattis-artriittisissa Fromkreis-sairauksissa (Third Int. symp. on Flemings lysozyme, Milan 1964). Myöhemmin lysotsyymi1 le on myös annettu analgeettisia ominaisuuksia (Bianchi, Eur. J. Pharmacol. 71, 211-221, 1981). Viime aikoina on voitu lysotsyy-mille löytää antinotsitseptiivinen vaikutustapa (Bianchi, Clin. Exp, Pharmacol. Physiol. 10, 45-52, 1983). Lysotsyymin tämän laajan vaikutustapakirjon vuoksi on sille vastaavasti löydettävissä suuri terapeuttinen käyttökirjo ja tästä myös merkittävä taloudellinen arvo.

Kaikissa tässä mainituissa lysotsyymin farmaseuttisissa käytöissä on ihmis-lysotsyymiä (HLZ) pidettävä parempana kuin munanvalkuaisesta saatua lysotsyymiä, koska lajille vierasta lysotsyymiä käytettäessä on helposti odotettavissa laadultaan anafylaktisia ja/tai ailergeenisia ei-toivottuja sivuvaikutuksia, jotka voivat olla esteenä hoidolle.

Ihmis-lysotsyymin ainoita kaupallisia lähteitä ovat tähän mennessä olleet ihmisen maito ja ihmisen istukka. Näitä lähtöaineita on kuitenkin saatavissa vain hyvin rajoitetusti ja ilmeistä ·.: on, että erästä erään saadaan erilaisia preparaatteja. Pitkälle / kehitettyä teol1isuusmikrobiologiaa ja äskettäin kehitettyä .: : rekombinatti-DNA-teknologiaa hyödyntämällä on saavutettavissa \ : : etuja ihmis-lysotsyymin valmistamiselle mikro-organismien avul- la.

φ m ♦ ' Munanvalkuaislysotsyymin geeni on kyetty eristämään (11, 12) ja /.- määrittämään munanvalkuaislysotsyymin mRNA:n ja geenissä olevan eksonin sekä sen viereisten alueiden nukleotidisekvenssi (13).

*. : Edelleen on selvitetty bakteerifaagin T4 lysotsyymigeenin nuk- 1eotidisekvenssi (14). Ihmis-lysotsyymin aminohapposekvenssi tunnetaan (21, 22, 23), mutta ei tässä keksinnössä esitettyä :*·· ihmis-lysotsyymiä koodaavaa nukleotidisekvenssiä. Patenttijul-....: kaisussa EPÄ 181 634 on kuvattu ihmis-lysotsyymin ekspressio 4 88407 hiivassa ja Bacillus·substi1is-bakteerissa. Julkaisussa EPÄ 181 634 ei käytetä mitään erityistä hiiva-terminaattoria eikä autenttista HLZ-geeniä. Hiivassa tapahtuvassa ekspressiossa ei tässä HLZ-DNA-sekvenssissä ole mitään eteenkytkettyä, Leader-peptidiä koodaavaa DNA-sekvenssiä. Muodostunutta ihmis-1ysotsyy-mia ei voida siten kuljettaa pois isännästä, jolloin vaikeutuu vastaavien disulfidisiltojen muodostumisen kautta tapahtuva eksaktin tertiäärirakenteen kehittyminen. Sen vuoksi ei ole tiedossa, kuinka patenttijulkaisun 181 634 mukaisesti päästään autenttiseen ihmis-lysotsyymiin. Myöskään ei ole tiedossa, kuinka lähtömetioniini voidaan poistaa. Esillä olevan keksinnön tavoitteena on siten kehittää strategia, jolla syntetisoidaan cDNA, kloonataan ja ekspressoidaan biologisesti aktiivista HLZ-proteiinia käyttämällä minimaalista informaatiota ihmis-proteiinin aminohapposekvenssistä. Ongelma ratkaistiin siten, että käyttämällä mRNA:ta templaattina voitiin rakentaa bakteeri-hybridiplasmideja, jotka sisältävät ihmis-lysotsyymiä koodaavan cDNA:n. Bakteeri-hybridivektorin osana HLZ-DNA voi olla peräisin mistä tahansa ihmis-lysotsyymiä tuottavista ihmissoluista. Sopivia soluja ovat esimerkiksi istukkasolut, akuuttia monoplastista ja/tai myieomonosyyttistä leukemiaa sairastavien ihmisten leuko-·.: syytit, ihmisen paksusuolen syöpäsolut, U-937 solulinjat tai .·. muut ihmis-lysotsyymiä tuottavat solulinjat. Esillä olevan kek-* sinnön kohteena käytetään parhaiten ihmisen U-937 soluja ATCC CRL 1593). HLZ-DNA voidaan eristää geenipankista, joka sisältää HLZ-geenin. Esillä olevassa keksinnössä ei pidetty parhaana ‘ kromosomaalista DNA:ta, koska se sisältää todennäköisesti koo-daavassa alueessaan introneja (munanvalkuais-1ysotsyymigeeni sisältää esimerkiksi kolme intronia (13)), joita hiiva ei voi katkaista pois. Esillä olevassa keksinnössä pidettiin parhaana ihmis-1ysotsyymi-cDNA:ta.

Soluista U-937 eristetty mRNA on parhaana pidetty templaatti ihmis-lysotsyymi-cDNA:n synteesille. HLZ-cDNA:n ensimmäisen säikeen synteesiä varten aloitetaan reaktio käyttämällä pri-meerinä oligo(dT)ig, joka parhaiten muodostaa parin mainitun mRNA:n 3*-pään kanssa. Yksisäikeistä cDNA:ta pidennetään edel- 5 38407 leen dNTP:n ja käänteistranskriptaasin läsnäollessa. Tämän jälkeen voidaan yksisäikeinen cDNA muuntaa erilaisilla tunnetuilla menetelmillä kaksisäikeiseksi cDNA:ksi. Esillä olevassa keksinnössä pidettiin parhaan Gubler'in ja Hoffmann'in menetelmää (15) .

Toisen cDNA-säikeen synteesi yksisäikeisestä DNA:sta tapahtui käsittelemällä mRNA-hybridi RNaseH:lla ja DNA-polymeraasilla I dNTP:n läsnäollessa. Tällä menetelmällä saadaan kaksisäikeisen cDNA, joka voidaan kloonata suoraan sellaisenaan. Kaksisäikeisen cDNA:n kloonaus bakteerivektoreissa voidaan suorittaa erilaisilla tunnetuilla menetelmillä. Kaksisäikeinen cDNA voidaan kloonata suoraan "blunt end"-fragmenttina synteettisen linkkerin kautta tai "homopolymeerihännän muodostamismenetelminä" tunnettujen menetelmien avulla. HLZ-cDNA:n tapauksessa pidettiin parhaana homopolymeerihännän muodostamismenetelmiä. Näissä menetelmissä muodostetaan terminaalisella transferaasilla yksittäissäikeet HLZ-DNA:n 3'-päähän lisäämällä nukleotideja (parhaiten dGTP) "blunt"- tai "staggered"-päihin. Erillisessä reaktiossa line-arisoidaan bakteeriplasmidi restriktioendonukleaasilla (HLZ-DNA:n kloonauksen tapauksessa pidettiin parhaana pUC9-vektoria) ja varustettiin kömpiementtisi 1 la hännillä (parhaiten dCTP) : niin, että saatiin 3'-päissään kömpiementtisia yksittäissäikei- tä. Seuraavassa vaiheessa homopolymeerilla pidennetty kaksisäi-··/ keinen cDNA sekoitetaan vastaavan kömpiementtisen, hännällisen vektorin kanssa näiden liittämiseksi sopivissa olosuhteissa.

: : : Tapahtuneen rekombinaation jälkeen transformoidaan CaCl2“käsi- tellyt E. coli solut tällä seoksella ja maljataan selektiivisille maljoille. HLZ-cDNA:ta sisältävät kloonit voidaan tunnistaa erilaisilla tunnetuilla menetelmillä. Esillä olevassa keksinnös-sä pidettiin parhaana seulomista radioaktiivisesti leimatuilla : : : synteettisillä oligonukleotideillä. HLZ-proteiinin julkaistun * . aminohapposekvenssin perusteella syntetisoitiin kaksi erää nukleotideja, joiden pituus oli kulloinkin 17 emästä. Sillä perus-’·**' teella, että eri kodonit voivat spesifioida yhden ja saman ami-: .*. nohapon, sisältää kukin erä seoksen erilaisia oligonukleotidejä.

6 88407

Kaikkien mahdollisten kombinaatioiden synteesi varmistaa, että yksi läsnäolevista oligonukleotideistä muodostaa optimaalisesti parin HLZ-geenin kanssa. Käyttämällä kahta toisistaan riippumatonta 17-mer oligonukleotidien kuulia pienennettiin mahdollisuutta, että valitaan "väärät" positiiviset kloonit.

Seulontakokeissa siirretään nitroselluloosasuodattimelle "pesä-kehybridisoinnissa" käytetyillä menetelmillä niiden bakteeri-kloonien DNA, joissa on cDNA-insertit. Sen jälkeen nitrosellu-1oosasuodattimet hybridisoidaan sopivissa olosuhteissa ihmis-lysotsyymille spesifisten 17-mer oligonukleotidien radioaktiivi-sesti leimattujen kuulien kanssa. Vastaavien kloonien identifioinnin jälkeen valmistetaan jokaisen kloonin plasmidi-DNA ja insertit sekvenssoidaan Maxam'in ja Gilberfin menetelmällä (kemiallinen menetelmä) tai Sanger'in menetelmällä (synteesi didesoksinukleotidei1lä). Positiivisista klooneista saatujen cDNA-inserttien DNA-sekvenssin määrittäminen mahdollistaa potentiaalisen proteiinin aminohapposekvenssien johtamisen. Vertaamalla tätä sekvenssiä julkaistuun HLZ-aminohapposekvenssiin voidaan todeta, sisältääkö kloonattu cDNA todella HLZ-proteiinia koodaavan alueen.

Näiden isäntien yhteydessä voidaan yleisesti käyttää plasmidi-vektoreita, jotka ovat peräisin lajeista, jotka ovat yhteensopivia isäntäsolujen kanssa. Vektorissa on tavallisesti replikaa-tiokohdan lisäksi tunnistamissekvenssejä, jotka mahdollistavat : fenotyypin selektoinnin transformoiduissa soluissa. Esimerkiksi E. coli transformoidaan tavallisesti pBR322-plasmidilla, joka on peräisin E. coli-lajeista (Bolivar, et ai., Gene 2., 95 (1977), pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasykliini-resistenttiys-geenit ja toimii siten yksinkertaisena keinona, jolla transfor-: moidut solut voidaan identifioida. pBR322-plasmidi tai myös muut plasmidit eivät sitä paitsi saa sisältää promoottoreita tai ne on modifioitava niin, että mikro-organismit voivat käyttää niitä omien proteiiniensa ekspressoimiseen. Promoottoreihin, joita useimmiten käytetään rekombinantti-DNA:n valmistuksessa, kuuluvat beta-laktamaasi-(penisillanaasi)- ja laktoosi-promoottori- η 88407 systeemit (Chang et al., Nature 275. 615 (1978); Itakura et ai., Nature 281, 544 (1979) ja tryptofaani (trp) promoottorisysteemi (Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. 8., 4057 (1980); Eurooppaha-kemus, julkiseksitulo-n:o 0036 776). Vaikkakin mainitut ovat käyttökelpoisimpia promoottoreita, on kehitetty lisäksi myös muita mikrobiperäisiä promoottoreita ja käytetty näitä hyväksi. Ihmis-lysotsyymin geeni-sekvenssi voidaan laittaa esimerkiksi lambda-bakteerifaagin (P^) Leftward-promoottorin kontrollin alaiseksi. Tämä promoottori on yksi erityisen voimakkaasti tunnetuista promoottoreista, joita voidaan ohjata. Ohjauksen mahdollistaa lambda-repressori, josta tunnetaan vierekkäisiä restriktiokatkaisukohtia.

Tämän geenin, joka koodaa lämpölabiilia repressoria, mutaatio voidaan liittää vektoriin, joka sisältää täydellisen HLZ-sek-venssin. Jos lämpötila nostetaan 42°C:een, repressori inaktivoi-tuu ja promoottori ekspressoituu maksimaaliseen konsentraatioon-sa. Näissä olosuhteissa muodostuvan mRNA:n summan tulisi riittää sellaisen solun saamiseen, joka uusissa synteettisissä ribonuk-leiinihapoissaan sisältää noin 10 % PL-promoottorista peräisin olevia ribonukleiinihappoja. Tällä tavoin on mahdollista perus-: .! taa kloonipankki, jossa funktionaalinen HLZ-sekvenssi sijaitsee ; .'. ribosomien sitoutumiskohdan läheisyydessä vaihtelevilla etäi-j’V syyksillä 1ambda-P^-promoottorista. Nämä kloonit voidaan sen jälkeen tutkin ja selektoida mitä korkeimmalla saannolla.

: HLZ-sekvenssin ekspressio ja translaatio voi tapahtua myös .*.·. muiden säätelyjärjestelmien, jotka organismin kannalta ovat transformoitumattomassa muodossaan "homologisia", kontrollin alaisena. Siten sisältää esimerkiksi laktoosista riippuvan ·*.*·: E. coli'n kromosomaalinen DNA laktoosi- tai Lac-operonin, joka : mahdollistaa laktoosin hajottamisen muodostamalla beta-galak- . tosidaasientsyymiä.

Lac-kontrollielementti voidaan saada lambda-plac5-bakteerifaa-. *. gista, joka infektoi E. coli'a. Faagin Lac-operoni voidaan saada samasta bakteerila jista transduktoimal la . Säätelysysteemit, 8 88407 joilla voi olla käyttöä keksinnön mukaisessa menetelmässä, voidaan saada organismille ominaisesta plasmidi-DNA:sta. Lac-promoottori-operaattori-systeemi voidaan indusoida IPTG:llä.

Yhtä hyvin voidaan käyttää muita promoottori-operaattori-systee-mejä tai niiden osia: esimerkiksi arabinoosi-operaattoria, kolisiini E^-operaattoria, galaktoosi-operaattoria, alkalinen fosfataasi-operaattoria, trp-operaattoria, ksyloosi A-operaat-toria, tac-promoottoria jne.

Hiivapromoottori voidaan parhaiten kytkeä ihmis-lysotsyymin koodaavaan alueeseen siten, että mahdollistetaan ihmis-lysotsyy-min tehokas ekspressio. Erityisesti tulisi hiivapromoottori sijoittaa suoraan ennen valmista ihmis-lysotsyymiä koodaavan alueen eteen - käyttämällä tähän liittämiskohtaan insertoitua translaation aioitussignaalia (ATG). Edelleen voidaan tämä HLZ-ekspressiomoduli insertoida erilaisiin hiivavektoreihin, jotta nämä sen jälkeen voitaisiin sijoittaa hiivaan tunnetuilla hiivan transformointimenetelmillä. Hybridiplasmideja sisältäviä hiivasoluja voidaan viljellä erilaisissa alustoissa ja haluttu HLZ-tuote eristää näistä ja puhdistaa tunnetuilla menetelmillä. Vaihtoehtoisesti voidaan liittää hiivan signaalisekvenssi HLZ-ekspressiomodulin rakentamisen yhteydessä. Tässä tapauksessa tällaisella plasmidilla transformoidut hiivasolut kykenevät erittämään ihmis-lysotsyymin soluseinämänsä läpi kasvatusalustaan, josta haluttu tuote -HLZ- voidaan ottaa talteen ja edelleen puhdistaa.

Ekspression isäntäorganismina pidetään erityisen hyvinä hiiva-soluja, koska hiivasoluja on helppo viljellä, fermentaatio-olosuhteet suuressa mitassa ovat tunnettuja ja hiivat eivät sisällä endotoksiineja. Sen vuoksi voidaan esillä olevassa keksinnössä parhaiten käyttää eukaryoottisia mikro-organismeja, kuten hiivaviljelmiä. Useimmiten käytetty eukaryoottinen mikro-organismi on Saccharomvces cerevisiae. vaikkakin yleisesti on saatavissa joukko muitakin lajeja.

9 88407

Ekspressioon Saccharomyces-hiivassa käytetään tavallisesti esimerkiksi plasmidia YRp7 (Stinchcomb. et ai. Nature 282, 39 (1979); Kingsman et ai., Gene 7, 141 (1979); Tschumper et ai. Gene 10, 157 (1980) ja plasmidia YEp 13 (Broach et ai.. Gene 8, 121-133 (1979)). Plasmidi YRp7 sisältää TRPI-geenin, joka toimii valmiina seiektointimarkkerina hiivamutanti11 e, joka ei kykene kasvamaan tryptofaania sisältämättömässä alustassa; esimerkiksi ATCC n:o 44076. TRPl-deletio hiivaisännän genomin ominaispiirteenä on tällöin tehokas apukeino transformaation osoittamiseen viljelmällä ilman tryptofaania. Aivan samoin on asianlaita YEpl3-plasmidin kyseessä ollen, joka sisältää hiivageeni LEU 2, jota voidaan käyttää LEU-2-mutantin täydentämiseen. Hiivavekto-reiden sopiviin promoottorisekvensseihin kuuluvat seuraavien 5'-puoleinen alue: ADHI (Ammerer, G., Methode of Enzymology 101, 192-201, 1983), 3-fosfoglyseraatti-kinaasi (Hitzemann, et ai., J. Biol. Chem. 255, 2073, 1980) tai muut glykolyyttiset entsyymit (Kawasaki ja Fraenkel, BBRC 108. 1107-1112 (1982)), kuten enolaasi, glyseriinialdehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, hekso-kinaasi, pyruvaattidekarboksylaatti, fosfofruktokinaasi, glukoo-si-6-fosfaatti-isomeraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja gluko-kinaasi. Sopivia ekspressioplasmideja rakennettaessa voidaan Y näihin geeneihin liittyneitä terminaatiosekvenssejä käyttää myös ekspressiovektorissa ekspressoitavan sekvenssin 3'-päässä mRNA:n polyadelynointiin ja terminaatioon.

Muita promoottoreita, joilla lisäksi on vielä etuna kasvuolosuh-YY teiden kontrolloima transkriptio, ovat seuraavien promoottori- Y; alueet: alkoholidehydrogenaasi-2, isosytokromi C, hapan fosfa- taasi, typpimetaboliaan kytkeytyneet hajottavat entsyymit, . . edellä mainittu glyseriinialdehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi ja - entsyymit, jotka vastaavat maltoosin ja galaktoosin metaboloitu-Y ·' misesta. Lämpötilan säätelemissä systeemeissä voidaan käyttää promoottoreita, joita säätelee hiivan Mating Typ Locus, esimer-‘ kiksi geenien BARI, MECl. STE3. STE3. STE5 promoottoreita, käyt-" : tämällä lämpötilasta riippuvia sir-mutaatjoita. (Rhine, Ph.D.

: Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz YY ja Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomvces, 10 88407 osa I, 181-209 (19820/ Cold Spring Harbor Laboratory). Nämä mutaatiot vaikuttavat hiivan lepäävien Mating Typ-kasettien ekspressioon ja siten epäsuorasti Mating Typ-riippuviin promoot-toreihin. Yleisesti ovat kuitenkin sopivia kaikki plasmidivekto-rit, jotka sisältävät hiivaa sopivan promoottorin, alkuperäiset replikaatio- ja terminaatiosekvenssit. Ehjän HLZ cDNA-sekvenssin mukanaolo mahdollistaa HLZ-geenin rakentamisen sen ekspressoimi-seksi muissa mikro-organismeissa, kuten esimerkiksi hiivoissa. Ihmis-lysotsyymin keksinnön mukaista ekspressiointia varten hiivasoluissa voidaan sen vuoksi käyttää esimerkiksi sellaisia eritysplasmideja, jotka on koottu joko osista; ADHI-promoottori-ct-faktori-Leader - HLZ-geeni - ADHII-terminaattori , tai osista: α-faktori-geenistä ovat tunnettuja. (Jeffrey, L., et ai., J. Biol. chem. 257, 3018-25, 1982; Russell, D.W. et ai., J. Biol. chem. 258, 2674-82, 1983; Nucleic Acids Res. 12, 4049-63, 1983). Tällä tavoin valmistettu HLZ-geeni voidaan yhdistää funktionasiisesti valitun hiiva-promoottorin kanssa. Tällainen ekspressioyksikkö voidaan lisäksi integroida erilaisiin hiivavektoreihin. Nämä voivat fransformoida hiivoja, mikä johtaa ihmis-lysotsyymin synteesiin.

Ihmis-lysotsyymin ekspressoimiseksi suositellun ADHI-promootto-rin kontrollin alaisena voidaan rakentaa plasmidi, joka ADHI-promoottorin 3'-pään jälkeen sisältää täydellisen a-faktori-Leader-osan. α-faktori-Leader-osan 3'-päähän ligitoidaan valmista ihmis-lysotsyymiä koodaava DNA-sekvenssi (HLZ-geeni) oikeaan orientaatioon α-faktori-Leader-osaan nähden. Parhaana pidetään rakennetta, joka sallii muodostetun HLZ:n eksaktin N-pään muodostamisen. Ekspressiokasetin lopullista rakentamista varten rakennetaan ADHII-terminaattorisekvenssi, joka vaikuttaa HLZ-geenin yhtenäiseen terminaatioon ja osaltaan vaikuttaa nRNA:n stabii1isuuteen niin, että se tulee sijaitsemaan suoraan yhteydessä HLZ-geenin pysäytyskodoniin. Tällainen ekspressioplas-midi sisältää kaikki kuvatut osat oikeassa järjestyksessä ja toisiinsa nähden oikeassa orientaatiossa sekä eksatit siirtymis-kohdat AHDI-promoottorin, α-faktori-Leader-osan, HLZ-geenin ja ADHII-terminaattorin välillä. Erityisen edullista on, että 11 88407 α-faktori-Leader-osan ja sitä seuraavan HLZ-geenin välinen liitos tehdään siten, että α-faktorin kypsymisestä vastaava LYS ARG-jälkeinen proteaasikatkaisukohta on juuri valmiin ihmis-lysotsyymin ensimmäisen aminohapon sekvenssin edessä, jolloin saadaan isäntäsolujen muodostaman HLZ-proteiinin eksakti N-pää.

Tällainen ekspressiokasetti voidaan ligitoida erilaisiin hiivan ekspressioplasmideihin. Tähän tulevat kysymykseen parhaiten monikoliplasmidit YEp13 (Broach, J.R. et ai. Gene 8., 121-133, 1979), PJDB207 (DSM 3181, tallennettu 28.12.1984), YIp5 (Struhl, K. et ai., Proc. Natl . Acad. Sei. USA 76., 1035-1039, 1979) ja pEAS102, pEAS102-vektori voidaan saada siten, että YIp5 pilkotaan osittain PstI-entsyymi 1lä ja täydellisesti BamHI-ent-syymillä ja eristetty 4,3 kb fragmentti (sisältää URA3-geenin) pjDB207-plasmidin 4,4 kb BamHI/Pstl-fragmentin kanssa. Näillä, tällaisen ekspressiokasetin sisältävillä hiivavektoreilla voidaan transformoida tunnetuilla menetelmillä kumpaakin Mating-tyyppiä olevat hiivasolut. Tällaiset transformanttien tuottama ja kasvatusalustaan vapautunut HLZ voidaan helposti eristää proteiinien tunnetuilla puhdistusmenetelmillä.

HLZ-geenin ekspressio voi yhtä hyvin tapahtua myös a-faktori-promoottorin kontrollin alaisena. Tätä varten liitetään valmista ihmis-lysotsyymiä koodaava DNA-sekvenssi oikeassa orientaatiossa "·.* α-faktori-promoottorin ja α-faktori-Leader-osan väliin. Ekspressiokasetin täydellistä konstruointia varten sijoitetaan peräk-käin α-f aktori-promoottori , α-f aktori-Leader-osa, HLZ-geeni ja α-f aktori-terminaattori. Myös tässä tapauksessa sama siirtymis-kohta valmistetaan α-faktori-Leader-osan 3'-pään ja HLZ-geenin . . 5'-pään välille samalla tavoin kuin on kuvattu valmistettaessa ADHI-promoottorin kontrol1inalaista ekspressiokasettia. Tällai-'.· ·' nen ekspressiokasetti voidaan rakentaa jo kuvattuun hiivaeks- pressioplasmidiin, jolla tämän jälkeen voidaan hiivasolut trans-[ formoida tunnetuilla menetelmillä.

Parhaina pidettyjä isäntiä ovat tässä tapauksessa hiivakannat, joiden Mating-tyyppi on a. Tällaisten transformanttien viljele- 12 88407 minen ja niiden vapauttaman ihmis-lysotsyymin eristäminen tapah tuu tunnetuilla menetelmillä.

Näillä konstruktioilla saadaan joukko etuja: 1. Yhtenäinen mRNA:n terminaatio ja siten tämän mRNA:n suurempi stabiilisuus.

2. Yksinkertainen ihmis-lysotsyymin eristäminen kasvatusalustan supernatantista.

3. Suurempi määrä tertiäärirakenteeltaan oikeaa ihmis-lysot-syymiä, koska eritetyssä proteiinissa voidaan helpommin muodostaa disulfidisiltoja kuin hiivasolujen sisällä.

4. Eritettäessä signaali- tai Leader-peptidiosa erotetaan endoproteolyyttisesti eksaktisti valmiista ihmis-lysotsyy-mistä.

Tällä tavoin saadaan tarkkaan määritelty proteiinin N-pää. Valmiissa HLZ-proteiinissa on N-päässä lysiini. Plasmidirakenne voidaan nyt valita siten, että eritysplasmidissa sijaitsee proteaasikatkaisukohta ennen lysiinikodonia. Siten eritetyn ihmis-lysotsyymin ensimmäinen aminohappo on lysiini.

Solunsisäisessä tuotossa on valmiin lysotsyymin ensimmäisen aminohapon edessä oltava aloitus-ATG (metioniini), jotta translaatio voisi ylipäätään alkaa. Kun solun mekanismi ei lohkaise tätä metioniinia, se voi olla erittäin häiritsevä (aktiivisuus, stabiilisuus, antigeenisyys).

Sopivia isäntiä ihmis-lysotsyymin ekspressiossa ovat mikro-organismien lisäksi myös monisoluisten organismien viljelmät. Periaatteessa voidaan käyttää jokaista tällaista viljelmää riippumatta siitä, ovatko ne selkärankaisten tai selkärangattomien eläinten eläinsoluvi1jelmiä. Suurin mielenkiinto on kuitenkin selkärankaisten eläinten soluilla, ja viime vuosina selkä- 13 88 407 rankaisten eläinten solujen kasvattaminen viljelmässä (kudos-viljelmä) on johtanut rutiinimenetelmään. (Tissue, Gulture, Academic Press, Kruse and Patterson, toim. (1973)). Tällaisista hyödyllisistä isäntäsolulinjoista ovat esimerkkejä VERO- ja HeLa-solut, kultahamsteri-munasarja (CHO)-solut ja W138, BHK, COS-7 ja MDCK-solulinjät. Näille solulinjoille tarkoitetut ekspressiovektorit sisältävät tavallisesti (tarvittaessa) repli-kaatiokohdan, promoottorin, joka sijaitsee ennen ekspressoitavaa geeniä, yhdessä kunkin tarvittavan ribosomien sitoutumiskohdan, RNA:n haikaisukohdan, polyadelynointikohdan ja transkriptionaa-lisen terminaatio-sekvenssin kanssa.

Nisäkässoluja käytettäessä käytetään useimmiten virusmateriaa-lista saatuja kontrollifunktioita ekspressiovektoreissa. Esimerkiksi tavallisesti käytetyt promoottorit ovat peräisin Polyoma-viruksesta, Adenovirus-2-viruksesta ja erityisen usein SV 40 (Simian Virus 40)-viruksesta. SV 40-viruksen alku- ja loppupro-moottorit ovat erityisen hyödyllisiä, koska kummatkin saadaan helposti viruksesta fragmenttina, joka sisältää myös SV 40-viruksen viraalisen replikaatiokohdan (Fiers ai.. Nature 273, 113 (1978). Myös pienempiä tai suurempia SV 40-viruksen fragmentteja /.] voidaan käyttää edellyttäen, että ne sisältävät lähes 250 bp pitkän sekvenssin, joka ulottuu Hindlll-katkaisukohdasta Bgll-katkaisukohtaan viruksen repiikointikohdassa. Lisäksi on myös mahdollista ja usein suositeltavaa käyttää promoottori- tai kontrolli-sekvenssejä, jotka tavallisesti ovat liittyneitä haluttujen geenisekvenssien kanssa edellyttäen, että nämä kont-rol1isekvenssit sopivat yhteen isäntäsolusysteemien kanssa.

. . Replikaatiokohta voidaan varustaa joko vastaavalla vektorikon-struktiolla eksogeenisen kohdan rakentamiseksi, esimerkiksi SV 40-viruksesta tai muista virus 1 ähteistä (esim. Polyoma, ____: Adeno, VSV, PBV, jne.) tai se voidaan varustaa isäntäsolun kro- mosomaalisella repiikaatiomekanismi11 a. Jos vektori integroidaan isäntäsolun kromosomiin, useimmiten viimeksi mainittu toimenpide : .·. on riittävä.

14 88407

Solujen transformointi vehikkelei 11 e voidaan toteuttaa lukuisilla menetelmillä. Esimerkiksi se voi tapahtua kalsiumin avulla, jolloin joko solut pestään magnesiumissa ja DNA lisätään kalsiumiin suspendoituihin soluihin tai solut asetetaan alttiiksi DNA:n ja kaisiumfosfaatin lisäsakalle. Seuraavassa geeniekspres-siossa siirretään solut alustoille, jotka selektoivat transformoidut solut. Keksinnön mukaisen polypeptidin tapauksessa kyseessä ei ole ainoastaan vain valmis ihmis-lysotsyymi (HLZ), joka on yksityiskohtaisesti kuvattu, vaan myös tämän polypeptidin kaikki modifikaatiot. Näihin modifikaatioihin sisältyy esimerkiksi molekyylin lyhentäminen N- tai C-terminaalisessa päässä, aminohappojen vaihtaminen muihin ryhmiin, millä ei oleellisesti muuteta aktiivisuutta.

Keksinnön kohteena eivät ole ainoastaan geenisekvenssit, jotka spesifisesti koodaavat annettua ihmis-lysotsyymiä, vaan myös modifikaatiot, jotka saadaan helposti ja rutiinimaisesti muta-toimalla, hajottamatta, transposition tai addition avulla.

Mukaan luetaan jokainen sekvenssi, joka koodaa kuvattua ihmis-lysotsyymiä (so. jolla on vastaava ja tunnettu biologinen aktii-visuuskirjo) ja joka annettuun sekvenssiin verrattuna on siitä degeneroitu. Samoin näihin kuuluvat jokainen sekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, jolla on ihmis-lysotsyymin aktiivisuuskir-jo, ja jotka stringenteissä olosuhteissa hybridisoituvat annettujen sekvenssien (tai niiden osien) kanssa (esimerkiksi olosuhteissa, joissa selektoitu homologia on yli 85 %, parhaiten yli : 90 %).

Keksinnön mukainen aine voidaan tunnetulla tavalla formuloida niin, että saadaan farmaseuttisesti käyttökelpoisia aineita, jolloin keksinnön mukainen polypeptidi sekoitetaan antamista varten joko yksinään tai yhdessä muiden komponenttien, kuten erilaisten antibioottien (tetrasykliini, basitrasiini), entsyymien (aifa-amylaasi, papaiini) tai vitamiinien kanssa.

15 38407

Seuraavat esimerkit, kuvaavat keksintöä yksityiskohtaisesti.

Kuvien lvhvt kuvaus

Kuvio 1 esittää tuloksia primeerin jatkamiskokeesta, jossa ΕΪ-ΟΝ19 ja ΕΪ-ΟΝ20 olivat primeerejä ja templaatti oli solulinjasta U-937 eristetty RNA.

Kuvio 2 esittää dot-blot-hybridisoinnin tuloksia.

Kuvio 3a esittää HLZ-cDNA:n (klooni HL 14-1) rakennetta ja 3b esittää strategiaa, jolla määritetään HLZ cDNA:n nuk-leotidisekvenssiä.

Kuvio 4a esittää kloonin HL 14-1 HLZ-cDNA:n DNA-sekvenssiä.

4b esittää kloonin HL 14-1 HLZ-cDNA:n restriktiokarttaa.

Kuvio 5 esittää vertailua julkaistun HLZ-aminohapposekvenssin (ylempi rivi) ja kloonin HL 14-1 cDNArsta johdetun aminohapposekvenssin (alempi rivi) välillä.

; : : Kuvio 6 esittää monikopiohybridivektoria pEAS 102 (rakenne ja : käyttö, kts. tekstin s. 15) -·; Kuvio 7 esittää ADHI-promoottorin liittämistä a-faktori-: Leader-osaan ja jatkokonstruktiota plasmidiksi - : · pWS215D, jossa HLZ-geeni on yhdistetty oikeaan orien taatioon α-faktori-Leader osan kanssa.

• Kuvio 8 esittää sekä Linker-1igaatiota HindiII-1inkkerin (esimerkiksi 8b) kanssa että Sali- ja Hindi11-1inkkerin (esimerkiksi 9b, johtaa plasmidiin pWS208D) kanssa, minkä tarkoituksena on rakentaa HLZ-geeni oikeaan orientaatioon α-faktori-promoottori- tai -terminaatto-; -·. riosaan nähden.

ie 88407

Kuvio 9 esittää in.vitro-mutaqeneesiä synteettisten oligonuk-leotidien EBI 124 ja EBI 234 kanssa tavoitteena valmistaa eksakti siirtymiskohta ot-faktori-Leader-osan ja HLZ-geenin välille.

Kuvio 10 esittää plasmidin pWS235D rakentamista, johon rakennettiin HLZ-geenin eksakti 3'-pää oikeaan orientaatioon ennen ADHII-terminaattoria.

Kuvio 11 esittää HLZ-geenin ja ADHII-terminaattorin välissä sijaitsevan BamHI-kohdan poistamista (pWS257D) sekä lopullista rakentamista ekspressiokasetiksi (pWS290D).

Kuvio 12 esittää, kuinka α-faktori-geeni kloonattiin puC13-johdoksesta paF EcoRI-fragmenttina vektoriin V2 (puC18-johdos, rakentaminen esimerkissä 9a) (pWS230D).

Kuvio 13 selventää tapaa, jolla HlZ-geeni yhdistettiin oikeaan orientaatioon α-faktori-promoottorin ja -terminaatto-rin kanssa (pWS231D).

Kuviot 14a ja 14b esittävät α-faktori-geenin 5'-päätä lähinnä sijaitsevan Pstl-kohdan poistamista (pWS294D) ja α-faktori-promoottorin kontrol1inalaisen ekspressio-kasetin pWS296D valmistamista ligitoimalla kuviossa 9 esitetty mutagenisoitu Pstl-fragmentti A2 plasmidin pWS294D ainoaan Pstl-kohtaan.

Kokeellinen osa

Esimerkeissä käytetyt lyhennykset HLZ: Ihmis-1ysotsyymi RPMI: Roswell Park Memorial instituutti

TrisHCl: Tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani, pH säädetty suolahapolla EDTA: Ety 1eenidiamiinitetraetikkahappo 17 88407 DEP: Dietyy1ipyrokarbonaatti SDS: Natriumdodekyylisulfaatti

NaAC: Natriumasetaatti BSA: Naudanseerumialbumiini DTT: 1,4-ditiotreitoli (1,4-dimerkapto-2,3-butaanidioli) PCI: Fenoli'.kloroformi : isoamyylialkoholi (15:24:1)

Beta-NAD: Beta-nikoti iniamidiadeniinidinukleotidi sscDNA: Yksisäikeinen cDNA

E. coli: Escherichia coli SSC: Liuos, jonka koostumus: 0,15M NaCl, 0,015M natriumsit- raatti, jonka pH säädetty arvoon 7 ION natriumhydrok-sidi11 a.

Denhardt'in liuos: Liuos, joka koostuu 0,1 % Ficoll, 0,1 % po-

lyvinyylipyrrolidoni, 0,1 % BSA

TBE: Liuos, jonka koostumus: 0,082M Tris, 0,082M boorihap- po, 0,002M EDTA pH 8.

Esimerkki 1: HLZ-aktiivisuuden määritys soluliniasta U-937

Hematopoeettisen solulinjan U-937 tiedetään tuottavan lysotsyy-·' miä (16). Jotta HLZ cDNA:n synteesissä voitaisiin käyttää solu-; linjaa U-937 PolyA+RNA:n lähtöaineena, määritettiin HLZ-aktiivi-suus, jonka U-937 solut vapauttivat mediumiin. RPMI 1640 alus-··.: taan (10 % vasikansikiöseerumi, 100 yksikkÖ/ml (E/ml) penisil- liini, 50 E/ml streptomysiini) juuri siirrostettua U-937 solu-:Y: linja-vil jelmää kasvatettiin 37°C:ssa 3 päivää, kunnes tiheys oli 3 x 10^ solua/ml. Solut poistettiin sentrifugoimal1 a ja . . alustaan vapautuneen ihmis-1ysotsyymin aktiivisuus määritettiin Gold’in ja Schweiger'in menetelmällä (17). Inkuboitiin 2 tuntia : radioaktiivisen substraatin kanssa, minkä jälkeen mitattiin vapautuneen radioaktiivisuuden määrä 100 μΐ:n tilavuuksissa, jotka otettiin 2 ml:n inkubaatioseoksesta. Negatiivisina kont-"·"* rolleina käytettiin yksinään RPMI-alustaa. U-937-soluista vapau-: .·. tuneen standardikäyrän avulla (ihmis-lysotsyymin aktiivisuus ihmismaidosta (Sigma) RPMI-alustassa) .

ie 88407

Tulokset on esitetty(taulukossa 1.

Taulukko 1

Alustan CPM 100 pirsta CPM 100 pirsta Vapautuneen HLZrn laimennukset inkubaatioseosta alustaa määrä (μΐ/ml) 2 x 10 457 20 914 2,09 4 x 3 963 15 852 1,59 10 x 1 485 14 850 1,49 20 x 794 15 880 1,59

Kuten taulukosta 1 havaitaan, vapauttavat U-937 solut RPMI-alustaan noin 1,5 pg ihmis-lysotsyymiä alustan ml kohti. Johtopäätöksenä oli, että U-937 solulinja on käyttökelpoinen lähde HLZ-mRNA:lie.

Esimerkki 2: Ihmis-1vsotsvvmi-mRNA;ta sisältävän RNArn valmistaminen a. Kokonais-RNA:n eristäminen

Ihmisistä saatu histiosyyttistä lymfoomasolulinjaa U-937 viljeltiin 37°C:ssa RMPI-alustassa 1640 (10 % vasikansikiöseerumi, 100 E/ml penisilliini, 50 E/ml streptomysiini) (16). 1,6 litran viljelmästä kerättiin solut sentrifugoimalla, pestiin kerralla 150 ml :11a jääkylmää 10 mM Tris HCl pH 7,4/140 mM NaCl/1,5 mM MgCl2-seosta ja suspendoitiin uudelleen jääkylmää 10 mM Tris HCl pH 8,4/140 mM NaCl/1,5 mM MgCl2 seosta. Tähän lisättiin 0,5 % 1oppukonsentraatioon ei-ionillista Detergenz Nonidet P 40 deter-genttiä. Suspension annettiin seistä 5 minuuttia jäissä ja sen jälkeen solumembraanit lyysattiin sekoittamalla voimakkaasti 10 sekuntia. Tumat poistettiin tämän jälkeen sentrifugoimalla 4°C:ssa. 10 ml:aan supernatanttia lisättiin: 0,5 ml 20-prosent-tinen SDS, 0,25 ml 2 M Tris HCl, pH 9,0 0,1 ml 500 mM EDTA pH 7,5. Tähän näytteeseen lisättiin yhtä suuri tilavuus juuri tislattua, 10 mM Tris HCl 8/1 mM EDTA puskurilla tasapainotettua fenolia ja ravisteltiin voimakkaasti 10 minuuttia. Sen jälkeen faasit erotettiin sentrifugoimalla. Vesifaasi uutettiin kaksi 19 88407 kertaa edellä kuvatuilla tavalla ja lopuksi yhtä suurella tilavuudella kloroformia. Tähän lisättiin 3M kaliumasetaattia (1/10 vesifaasin tilavuudesta) ja sen jälkeen 2,5 tilavuutta etanolia. Liuoksen annettiin seistä yön yli -20°C:ssa, saostunut RNA otettiin talteen sentrifugoimal1 a, pestiin kerran 3 ml :11a 70-prosenttista etanolia ja kuivattiin tyhjössä. RNA liuotettiin 3 ml:aan vettä, saostettiin, otettiin talteen ja kuivattiin ja liuotettiin jälleen edellä kuvatulla tavalla. Saanto oli noin 8 mg RNA:ta.

b. PolyAfRNA:n eristäminen

PolyA+RNA eristettiin kokonais-RNA:sta oligo (dT)-seiluloosan (P-L Biochemicals Inc.) kautta. 0,5 g oligo (dT)-seiluloosaa suspendoitiin steriiliin veteen ja annettiin seistä yön yli 14°C:ssa. Seuraavana päivänä DEP-käsitelty, steriilillä vedellä pesty pylväs (Biorad Plastic, 18 cm, O 1,5 cm) pakattiin 0,5 g:lla oligo (dT)-seiluloosaa, pestiin 3 ml:lla Proteinase K (tyyppi XI, Sigma)-liuoksella ja annettiin seistä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Proteinase K oli liuotettu 1 mg/ml lop-pukonsentraatioon 0,lx pakkauspuskuriin (lx pakkauspuskuri: 50 mM Tris HCl pH 7,4, IM NaCl, 1 mM EDTA, 0,2 % EDTA, 0,2 % SDS). Sen jälkeen pylväs pestiin 5 ml :11a steriiliä 0,1M nat-:.·. riumhydroksidia ja tämän jälkeen steriilillä vedellä, kunnes eluaatin pH oli 8, ja tämän jälkeen 10 ml :11a lx pakkauspusku-ria. 500 pl:aan steriiliä vettä uudel 1 eensuspendoitu kokonaisiin RNA laimennettiin 4,5 ml :11a pakkauspuskuria, kuumennettiin 5 minuuttia 65°C:ssa (vesihaude) ja valmistettu oligo (dT)-selluloosapylväs ladattiin tällä. Eluaatti otettiin talteen, . . kuumennettiin uudelleen 65°C:ssa 5 minuuttia ja vietiin jälleen pylvääseen. Pylväs pestiin 7 ml :11a pakkauspuskuria PolyA RNA:n eluoimiseksi pylväästä. 1 ml:n jakeet otettiin talteen ja jokai-' sesta jakeesta mitattiin OD^®. PolyA+RNA eluoitiin 5 ml :11a steriiliä vettä. Sekä PolyA RNA että PolyA+RNA saostettiin yön yli aikana -20°C:ssa 0,3 M natriumasetaatilla etanolin läsnäol-: lessa.

20 88407

Esimerkki 3: HLZ-mRNA:n osoittamistesti a. Sekasekvenssisten oiiaonukleotidien synteesi

Kiinteäfaasisella fosforitriesteraasimenetelmällä (20) syntetisoitiin 2 poolia HLZ-homologisia, sekasekvenssisiä oligonukle-otidejä. 17-mer oiigonukleotidi-koetinseoksen ΕΪ-0Ν19 rakentamiseksi käytettiin aminohapporyhmien 63-68 (Tyr Trp Cys Asn Asp Gly) sekvenssiä ihmis-lysotsyymi-proteiinin NH2-päästä (21, 22, 23). Ei-ON19-koetin muodostui seuraavanlaisesta 16 oligonukleo-tidin seoksesta:

A A A A

5’ CC TC TT CA CCA TA 3’

G G G G

17-mer oiigonukleotidi-koetinseoksen ΕΪ-ΟΝ20 rakentamiseksi käytettiin aminohapporyhmien 26-31 (Ala Asn Trp Met Cys Leu) sekvenssiä ihmis-lysotsyymi-proteiinin NH2~päästä (21, 22, 23). Ei-ON20-koetin muodostui seuraavanlaisesta 32 oligonukleotidin seoksesta:

A

.AA AT

5' A CA CAT CCA TT GC 3'

G G G C

; G

b. Primeerin iatkamisanalvvsi U-937 solulinjasta eristetystä mRNA:sta analysoitiin HLZ mRNA:n läsnäolo primeerin jatkamismenetelmäl1ä. 5'-päästä leimattiin 60 minuutin sisällä 37°C:ssa radioaktiivisesti 100 ng ΕΪ-ΟΝ19-koetinta tai Ei-ON20-koetinta 20 μΐ reaktiopanoksessa. Reak-tioseoksen koostumus oli: 70 mM Tris HCl pH 7,6, 1 mM MgCl2, 30 uCi (Gamma-^p)ATP (500 Ci/mmol, Amersham PB. 218) 100 ug/ml BSA, 10 mM DTT, 1 mM spermidiini ja 2-4 yksikköä polynukleotidi-kinaasi (New England Biolabs). Reaktio lopetettiin kuumentamalla seosta 10 minuuttia 70°C:ssa.

21 88407

Primeerin jatkamisreaktio suoritettiin 40 μ1:η reaktioti1avuu-dessa 60 minuutin aikana 42°C:ssa. Reaktioseoksen koostumus oli: 50 mM Tris HCl, pH 8,3, 10 mM MgC^, 10 mM DTT, 4 mM natriumpy-rofosfaatti, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dCTP, 1,25 mM dTTP, 150 ng solulinjasta U-937 eristetty mRNA, 40 ng radioak-tiivisesti leimattu ΕΪ-0Ν19 tai ΕΪ-ΟΝ20 ja 200 yksikköä kään-teistranskriptaasi (BRL). Reaktio lopetettiin lisäämällä 50 μΐ 50 mM EDTA:ta, minkä jälkeen uutettiin PCI:llä ja seostettiin etanolilla. Primeerin jatkamistuotteet koottiin sentrifugoimal-la, kuivattiin ja liuotettiin 20 pl:aan värjättyä formamidi1iu-osta, jonka koostumus oli: 90 % deionisoitu formamidi, 10 % 10 x TBE, 0,1 % ksyleenisyanoli FF, 0,1 % bromifenolisininen.

Jokaisesta koettimesta laitettiin 10 nl 5-prosenttiselle polyak-ryyliamidi/8M urea-geelil 1 e. Elektroforeesi suoritettiin 2 tunnin aikana 15 watin teholla. Geelin kuivaamisen jälkeen mustattiin sillä. Kodak X-Omat RP röntgenfilmi Kodak X-Omatic Kassette C-2 kasetissa. Tämän kokeen tulokset on esitetty kuviossa 1.

Koska kummatkin primeerit Ei-ON19 ja ΕΪ-ΟΝ20 ovat komplementti -siä HLZ mRNA:n kanssa, oli odotettavissa, että näistä HLZ mRNA-templaatille sijoitetuista primeereistä saataisiin määrättyjä jatkamistuotteita. Koska HLZ mRNA:n pituus oli tuntematon, Y syntetisoidun DNA:n pituutta ei voitu ennalta tietää. Kuitenkin 011 todettavissa seuraavaa: : : : Primeeri Ei-ON19 muodostaa parin HLZ mRNA:n alueella, joka koodaa aminohapporyhmiä 63-68, joten syntetisoidun DNA:n pituu-. . den on oltava vähintään 203 bp + X (X on niiden nukleotidien lukumäärä, jotka kuuluvat Leader-sekvenssiin ja ei-koodaavaan v : 5'-alueeseen). Samanlainen laskemistapa on primeerille ΕΪ-ΟΝ20 ,.Y arvon 92 bp + X. Siten oli odotettavissa kaksi vyöhykettä, joiden kokojen eron tulisi olla 111 bp. Kuviossa 1 esitetyistä tuloksista on nähtävissä, että primeerille Ei-ON19 saatu voimak-• .·. kaampi vyöhyke on noin 290 bp pitkä, ja primeerille Ei-ON20 saadun voimakkaimman vyöhykkeen pituus on noin 175 bp. Näiden 22 8 8 407 kummankin vyöhykkeen, välinen ero (111 bp) on siten hyvin lähellä ennalta laskettua arvoa, ja oli pääteltävissä, että analysoitu, solulinjasta U-937 eristetty mRNA-preparaatti sisälsi HLZ mRNA:n.

Esimerkki 4: U-937 cDNA-aeenipankin rakentaminen a) cDNA.’n synteesi cDNA:n ensimmäisen säikeen synteesi suoritettiin 50 μΐ reaktio-tilavuudessa käyttämällä seuraavaa koostumusta: 50 mM Tris HC1 pH 8,3, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM natriumpyrof osfaatti, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dTTP, 0,5 mM dCTP, 20 uCi (Alfa-32P) dCTP (3000 Ci/mmol, Amersham, PB. 10205), 100 ug/ml Oligo d(T)^3 (New England Biolabs), 40-100 ug/ml solulinjasta U-937 eristetty polyA+RNA ja 250 yksikköä käänteistranskriptaasi (BRL). Reaktio tapahtui kuitenkin 60 minuutin aikana 42°C:ssa.

Se lopetettiin lisäämällä 50 μΐ mM EDTArta ja reaktiotuotteet uutettiin PCI-seoksella. RNA/DNA-hybridi seostettiin etanoli/2M NH4-asetaatilla -20°C:ssa yön aikana. Syntetisoidun ensimmäisen säikeen määrä saatiin määrittämällä TCA:an liukenematon radioaktiivisuus. Yhdestä reaktiosta saatiin yksisäikeistä cDNA:ta välillä 200 ja 300 ng. Toisen säikeen synteesiä varten pelletoi-tiin yksisäikeinen cDNA sentrifugoimalla, pestiin kerran 80-pro-senttisella etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin sopivaan tilavuuteen tislattua vettä. Yksisäikeisen DNA:n (sscDNA) muuntamiseksi kaksisäikeiseksi cDNA:ksi (dscDNA) voidaan 100 μ1:η reaktiot! lavuudessa käsitellä 500 ng asti yksisäikeistä DNA:ta. Reaktioseoksen koostumus oli: 20 mM Tris HC1, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2 S04, 100 mM KCl, 0,15 mM Beta-NAD, 50 ug/ml BSA, 40 μΜ dNTPs, 8 E/ml E. coli RNaseH (BRL), 230 E/ml DNA polymeraasi I (New England BioLabs), 10 E/ml E. coli DNA ligaasi (New England Biolabs). Reaktioseosta inkuboitiin peräkkäin 60 minuuttia 12°C:ssa ja 60 minuuttia 22°C:ssa. Reaktio lopetettiin lisäämällä EDTA:ta 20 mM loppukonsentraatioon. dscDNA uutettiin PCI-seoksella ja saostettiin kuten edellä (15).

23 88407 b. dscDNA:n kloonaus<

Kloonausvektori, jolla oli alhainen transformaatiotausta, preparoitiin seuraavasti: 300 pg pUC9 plasmidi-DNA:ta pilkottiin täydellisesti PstI-restriktio-endonukleaasi11 a. Pilkottu plas-midi-DNA puhdistettiin agaroosigeeli-elektroforeesin avulla, elektroeluoitiin ja saostettiin etanolilla. Ägaroosigeeli-puh-distettu vektori tuotti transformointikokeessa noin 1-2 pesäkettä ng kohti, kun taas transformaation määrä superkierukka-pUC9:llä oli noin 2000 - 4000 pesäkettä plasmidi-DNA:n ng kohti.

Tällä tavoin preparoidulla pUC9 plasmidi-DNA:1 la suoritettiin sen jälkeen 50 μ1:η reaktiot!lavuudesta homopolymeerihännän liittäminen. Reaktioseoksen koostumus oli: 100 mM kalium-kakody-laatti pH 7,5 2 mM CoCl2, 0,2 mM DTT, 0,9 mM dCTP, 5 pCi (5-3H) dCTP (19 Ci/mmol, Amersham TRK, 352). 5 mg/ml BSA, 28 pg PstI - pilkottu pUC9 plasmidi-DNA ja 45 yksikköä terminaalista trans-feraasia (PL-Biochemicals). Reaktioseosta inkuboitiin 5 minuuttia 22°C:ssa ja reaktio lopetettiin lisäämällä 50 pl 25 mM EDTA:ta ja sen jälkeen inkuboimalla 15 minuuttia 70°C:ssa.

Näissä olosuhteissa syntetisoitui jokaiseen 3'-päähän 22 nukleotidiä - pätkä, joka tarvitaan maksimaaliseen transformaa- : : tiomäärään (19).

Homopolymeerihännän liittäminen dscDNA:an dGTP:llä suoritettiin "·; samoissa olosuhteissa paitsi, että 100 ng kohti dscDNA:ta käy- tettiin 30 yksikköä terminaalista transferaasia 30 minuutin ajan : 37°C:ssa. Reaktio lopetettiin lisäämällä 50 pl 25 mM EDTA:ta ja inaktivoimalla lämmön avulla 15 minuuttia 70°C:ssa. dGTP-häntäi-. . sen dscDNA:n analyyttinen uudel1eenliittyminen dCTP-häntäiseen •pUC9-vektoriin suoritettiin 120 minuutin aikana 58°C:ssa seok-; sessa, jonka koostumus oli: 50 pl 10 mM Tris HCl pH 7,5 1 mM EDTA, 150 mM NaCl . dscDNA:n eri suhteita vektori-DNA:an käytettiin hyödyksi määrittämään suurin saavutettavissa oleva klooni-‘ ‘ nen määrä käytettyä dscDNA-määrää kohti. Transformointi suori-: .·. tettiin CaCl 2_komponentei 11 a E. coli RRI soluilla (19) siten, että 100 pl näitä soluja sekoitettiin 50 pl:n kanssa uudelleen- 24 88407 liittämis-reaktioseosta ja tämä sen jälkeen maljättiin LB-mal-joille, jotka sisälsivät 50 pg/ml ampisi11iinia. Sitä suhdetta, joka antoi korkeimman transformaatioluvun, käytettiin kiinnittämään lopullinen cDNA-geenipankki "Scale-up" koetta varten. Käyttämällä 50 ng dscDNA:ta saadaan noin 20.000 riippumatonta kloonia.

Esimerkki 5: U-937 cDNA-oeenipankin seulonta HLZ-kloonien suhteen a. Pesäke-hybridisointi

Positiivisten, täydellisen HLZ-geenin tai palan sisältävien transformanttien löytämistä varten suoritettiin ensin cDNA-geenipankin "skriinaus" pesäkehybridisoinnin kautta. Ne trans-formantit, jotka näyttivät positiivisilta, seulottiin vielä "dot-blot"-analyysin kautta.

Transformantteja viljeltiin yön yli LB + ampisilliini (50 ug/ml)-maljoi 11 a 37°C:ssa. Pesäkkeet siirrettiin sen jälkeen mikrosel1 uioosasuodattimella (0,45 pm, Schleicher und Shuell). Sekä maljoille että suodattimille oli tunnusomaista, että ne mahdollistivat positiivisten transformanttien identifioinnin. Suodattimet laitettiin huolellisesti maljoille, annettiin olla niillä 20 minuuttia huoneen lämpötilassa (RT), sen jälkeen nostettiin pois ja laitettiin 0,5N NaOH/l,5M NaCl-kyl1ästetyi11 e 3MM suodattimille (3 MM Chr, Whatman) (pesäkkeet ylöspäin). NaOH-ylimäärän poistamiseksi siirrettiin nitroselluloosasuodat-timet 15 minuutin inkuboinnin jälkeen kuivalle 3MM suodattimelle ja sen jälkeen annettiin olla 3 minuuttia 3MM suodattimella, joka oli etukäteen kyllästetty 1 M Tris HCl pH 7/1,5 M NaCl-seoksella. Sen jälkeen suodattimia pidettiin 20 sekuntia upoksissa 3x SSC-seoksessa, kuivattiin ilmassa ja paistettiin kaksi tuntia 80°C:ssa. Tällä tavoin preparoidut suodattimen esipes-tiin yön aikana 65°C:ssa 3x SSC, 0,1 % SDS (Serva), 10 mM EDTA-seoksessa, hitaasti ravistelemalla. Puskuri vaihdettiin kerran. Esipesua pidettiin loppuneena, kun suodoksesta ei voitu havaita 25 88407 lainkaan tunnistettavia bakteeripesäkejäämiä. Välittömästi pesun jälkeen suodattimet esihybridisoitiin seoksessa, jonka koostumus oli: 6x SSC lx Denhard'in liuos, 0,5 % SDS, 100 ug/ml denaturoitu vasikankateenkorva DNA (Sigma), 0,05 % natriumpyro-fosfaatti. Inkuboitiin 3 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen suodattimen hybridisoitiin yön aikana 37°C:ssa (gamma - 32p) ATP-lei-matulla 17-mer Ei-ON19-koettimella. Hybridisointi1iuos sisälsi 6x SSC/lx Denhardt'in liuosta, 20 ug/ml hiiva-tRNA:ta (tyyppi XX, Sigma), 0,05 % natriumpyrofosfaattia ja polynukleotidi-ki-naasilla pääteleimattua 17-mer Ei-ON19-koetinta. Kinaasireaktio on kuvattu esimerkissä 3. Hybridisoinnin jälkeen suodattimet pestiin seuraavalla tavalla 6x SSC, 0,05 % natriumpyrofosfaatti-seoksessa: 3 kertaa 5 minuuttia huoneen lämpötilassa, 30 minuuttia 37°C:ssa, 10 minuuttia 47°C:ssa ja 10 minuuttia 53°C:ssa (ei-pakollinen). Tämän jälkeen suodattimet kuivattiin ilmassa ja röntgenfilmi (X-Omat RP, Kodak) mustattiin 24 tunnin aikana -70°C:ssa "Dupont intensifying screen" skriinin avulla. Filmin kehittämisen jälkeen valittiin jatkoanalyyseihin (dot-blot-analyysit) 48 pesäkettä, jotka epäilyksettä antoivat voimakkaammat signaalit kuin tausta.

b. Dot-blot-hybridisointi : 2 ml näyte LB-alustasta, joka sisälsi 30 ug/ml ampisi 11 iinia, siirrostettiin 48 valitulla pesäkkeellä. Viljelmiä ravisteltiin yön yli 37°C:ssa voimakkaasti ravistellen. DNA preparoitiin Birnboim'in ja Doly'n menetelmällä (25). Jokainen DNA-preparaat-ti liuotettiin 67,5 uljaan vettä, lisättiin 7,5 ui 4N natrium-hydroksidia ja sen jälkeen inkuboitiin yksi tunti 65°C:ssa vesi-. hauteessa. Näytteet jäähdytettiin sen jälkeen jäissä ja lisät-; / tiin peräkkäin 20 ui 1/5 N suolahappoa ja 195 ui 2 x SSC-liuos-ta. Jokaisen näytteen kokonaistilavuus oli 290 ui· 145 ui erät suodatettiin Bio-Dot-laitteen (Bio-Rad) läpi DNA:n kiinnittämiseksi kahteen nitroselluloosasuodattimeen. Ennen suodattamista nitroselluloosasuodattimet kyllästettiin 20 minuutin ajan 2 x : SSC-liuoksella. Suodattamisen jälkeen suodattimet kuivattiin *···. ilmassa ja paistettiin 80°C:ssa. Toinen suodatin hybridisoitiin 26 88407 (gamma-32P)ATP-leimatulla ΕΪ-ΟΝ19 17-mer koettimella ja toinen gamma-^2p)ATP-leimatulla ΕΪ-ΟΝ20 17-mer koettimella. Hybridi-sointi- ja pesuolosuhteet on kuvattu esimerkissä 5a. Suodatti-milla mustattiin Kodak X-Omat RP röntgenfilmi 6 tunnin ajan -70°C:ssa. Tunnistettiin kuusi kloonia, jotka antoivat positiiviset hybridisointisignaalit ja alkuperäisille transformantei11 e annettiin nimiksi pHL2, pHL8, pHL14-l, pHL21, pHL23 ja pHL35. cDNA-inserttien suuruudet valituissa klooneissa määritettiin restriktioanalyysin avulla. Mainittujen kloonien DNA, joka oli eristetty Birnboim'in ja Doly'n menetelmällä, pilkottiin entsyymeillä BamHI ja Hindlll ja erotettiin 0,8-prosenttisessa agaroo-si-minigeelissä 4 tunnin ajan (150 V). Plasmidit pHL14-l, pHL21 ja pHL23 sisälsivät 500 bp pitkiä inserttejä. Kloonien pHL2 ja pHL8 inserttien suuruus oli 300 bp.

Esimerkki 6: HLZ cDNA:n rakenne ia DNA-sekvenssi (klooni HL14-1

Yksi positiivinen klooni (esimerkki 5b), jolle nimeksi annettiin HL14-1, sisälsi noin 500 bp pitkän insertin ja se valittiin yksityiskohtaiseen analyysiin. HLZ cDNA:n rakenne on annettu kuviossa 3a.

20 ug pHL14-l p lasini di-DNA: ta pilkottiin täydellisesti restrik-tioendonukleaasilla BamHI ja Hindlll, leimattiin radioaktiivisesta 5'-päässä (gamma-^2P)ATP:1lä (esimerkki 3b) ja sen jälkeen katkaistiin toisella endonukleaasilla. Yhdessä kohdassa leimatut DNA-fragmentit erotettiin polyakryyliamidi- tai agaroosi-geeli-elektroforeesin avulla.

Leimatut DNA-fragmentit otettiin uudelleen talteen elektroeluoi-malla ja sekvenssoitiin Maxam'in ja Gilbert'in menetelmällä (26) . Kuvion 3b ylemmät nuolet osoittavat tällä menetelmällä suoritetun sekvenssianalyysin suunnan ja osoittavat tällä menetelmällä suoritetun sekvenssianalyysin suunnan ja laajuuden; tähdet merkitsevät radioaktiivisesti leimautuneita kohtia. PHL14-1 cDNA:n sisäosa sekvenssoitiin Sanger'in menetelmällä (27) . HLZ cDNA:n sisältävä, pHL14-l kloonin BamHI-HndIII-res- 27 88407 triktiofragmentti pilkottiin MnlI-restriktioendonukleaasi11 a , varustettiin Klenow-polymeraasia käyttämällä Maniatis'in et al menetelmällä (28) "blunt"-päillä ja kloonattiin Smal-katkaistus-sa vektorissa M 13 mp9. Sekä kaikki DNA-manipuloinnit M13:lla että myös sekvenssointi suoritettiin tarkalleen Amersham'in prosyyrissä "M 13 cloning and sequencing handbook" kuvatulla menetelmällä. Ne restriktiofragmentit, jotka on kloonattu ja sekvenssoitu tällä menetelmällä, on esitetty kuviossa 3b (alemmat nuolet). Kuviossa on annettu vain relevanttien restriktio-paikkojen sijainnit HL14-l-kloonissa. Endonukleaasien MnlI, Maelll ja Hinfl tunnistamiskohtien läsnäolo vahvistettiin ko-keel1isesti.

DNA-sekvenssoinnin tulos on esitetty kuviossa 4. 20. nukleotidistä lähtien myötävirtaan on löydettävissä avoin lukukehys HLZ cDNA-sekvenssissä. Nukleotidit 62-451 vastaavat tarkalleen ihmis-1ysotsyymin aminohapposekvenssiä (kuvio 5), ja näitä seuraa translaation päättymiskodoni TAA. Nukleotidit 20-61, jotka koodaavat 14 pääasiallista hydrofobista aminohappoa: 5’ Ile Vai Leu Gly Leu Vai Leu Leu Ser Vai Thr Vai Gin Gly LYS VAL jne., . . koodaavat osaa HLZ-Leader- tai signaali-peptidistä, kuten muil-’· lakin erittyneillä proteiineilla (29). Ihmis-esi 1 ysotsyymin aminohappokoostumus liittymiskohdassa ("splice junction") on hyvin samankaltainen kuin munanvalkuaislysotsyymin vastaava koostumus (Gin Gly LYS VAL ihmis-esi 1 ysotsyymi 1 lä verrattuna kananvalku-aislysotsyymin Leu Gly LYS VAL aminohappoihin (Weisman L.S. et ai., J. Biol. Chem. , 26., 2309 - 2313, 1986).

Esimerkki 7: pHLl4-23:n rakentaminen

Ihmis-lysotsyymin valmistuksessa tarvittavan ekspressioplasmidin rakentamista varten yhdistettiin HLZ-insertin (klooni HL14-1, • plasmidi pHL14-l) pisin 5'-pää HLZ-insertin (klooni HL23, plas-midi pHL23) pisimpään 3'-päähän - esimerkki 5b. pHL23-plasmidin HLZ-DNA:n 3'-pään sekvenssi on 28 88407 *

PstI 10 20 30 40

5' GACTOCAGTG CTTTGCTGCA AGATAACATC GCTGATGCTG

50 60 70 80

TAGCTTGTGC AAAGAGGGTT GTCCGTGATC CACAAGGCAT

90 100 110 120

TAGAGCATGG GTGGCATGGA GAAATCGTTG TCAAAACAGA

Maelll 130 140 150 160

GATGTCCGTC AGTATGTTCA AGGTTGTGGA GTGTAACTCC

170 180 190 200

AGAATTTTCC TTCTTCAGCT CATTTTGTCT CTCTCACÄAT

Maelll 210 220 230 240

TAAGGGAGTA GGTTAAGTGA AAGGTCACAT ACCATTATTT

250 260 CGGGGGGOGG GGGGGGGGGG 3’ 5'-pää Pstl-kohtaan (kuvio 4) asti vastaa pHL14-l DNA-sekvens-siä. Noin 1 pg pHL23-plasmidia pilkottiin PstI ja HindIII-ent-syymeillä 36°C:ssa (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl) ja erotettiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä.

G. Dretzen'in menetelmällä (Dretzen, G. et ai. Anal. Biochem.

112, 295-298, 1981) agaroosigeelistä esitetty 260 bp Pstl/Hindlll-fragmentti sisältää HLZ-rakennegeenin 3’-pään.

Tämä fragmentti (noin 500 ng) ligitoitiin pHL14-l plasmidiin (noin 50 ng), sen jälkeen, kun plasmidista pHLl4-l oli poistettu 190 bp pitkä Pstl/Hindlll-fragmentti DNA:n ligitointi suoritettiin 20 μ1:η panoksessa 14°C:ssa yön yli ligitointipuskurissa (66 mM TrisHCl pH 7,6, 6,6 mM MgCl^m 10 mM DTT, i mM rATP) käyttämällä 1U T4 DNA-ligaasia ja käyttämällä tunnetuilla menetelmillä (Maniatis, T. et ai. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, s. 220, 1982) kompetenttien E. coli HB101 solujen trans-formointiin käytettyä ligaasiseosta.

29 88 407

Esimerkki 8: ADHI-promoottorin kontrollinalaisen ekspressio-kasetin rakentaminen a· ADHI-promoottorin ia α-faktori-Leader-osan liittäminen Lähdettiin pUC18-johdoksesta pES103, joka sisältää ADHI-pro-moottorina 1,5 kb suuruisen BamHI/XhoI-fragmentin. pES103:n asemesta voidaan käyttää samalla tavoin myös YEpl3 (ATCC 37 115) (Ammerer, G., Methods in Enzymology, 101. 192-201, 1983). Xhol-paikan lisäksi mukana on yksi Pstl-kohta ja yksi Hindlll-kohta, joten pES103:n Hindlll- ja Pstl-kohtien väliin voidaan ligitoida paF:n α-faktori-geenin 250 bp suuruinen HindIII/PstI-fragmentti, joka sisältää pääosan α-faktori-Leader-osasta (kuvio 7). HindIII/PstI-fragmentin, jossa on α-faktori-Leader-osa, DNA-sekvenssi on julkaisu (Singh, A. et ai., Nucleic Acid res. 11 (12), 4049-63, 1983).

Hindlll- ja Pstl-entsyymeillä pilkottiin täydellisesti 36°C:ssa tätä varten 1 ug pES103 ja 5 pg paF seoksessa: 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgC^/ 50 mM NaCl, ja ligitoitiin edellä kuvatulla . . tavalla (esimerkki 7) käyttämällä noin 50 ng pES103 (Hindlll/-’· PstI) ja noin 500 ng paF (HindiII/PstI). E. coli HBlOl-baktee-rissa transformoidulle, muodostuneelle plasmidille, jossa on : α-faktori-Leader-osan oikea orientaatio ADHI-promoottorin suh- teen, annettiin nimeksi pWS205D. Kohdassa, jossa tapahtuu liittyminen ADHI-promoottoriin, puuttuva 25 bp α-faktori-Leader-sekvenssi sekä ATG aloituskoodi korvattiin fosfotriesteri-: menetelmällä (Efimov, V.A. et ai., Nucleic Acid Res. 10., 6675- 94, 1982) syntetisoitu 40 mer oiigonukleotidi. Tätä tarkoitusta varten pilkottiin 36°C:ssa täydellisesti 1 pg pWS205D XhoI ja Pstl-entsyymeillä seoksessa, jonka koostumus oli: 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl. XhoI- ja Pstl-päillä varustettu oi igonukelotidi 5' TCGAGAAAAGAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA 3' 3’ CTTTTCTTACTCTAAAGGAAGTTAAAAATG 5'

XhoI PstI

30 88 407 ligitoitiin XhoI/Pstl-katkaistun pWS205D:n kanssa: oligonukleo-tidit otettiin 10 pmol/μΐ konsentraatiossa veteen, yhdistettiin kulloinkin 5 μΐ kummankin DNA-säikeen liuoksia, kuumennettiin 10 minuuttia 65°C:ssa ja huoneen lämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen 1 μΐ tätä liuosta käytettiin 1igaasireaktiossa ligaasi-puskurissa ja esimerkissä 7 kuvatuissa olosuhteissa. Muodostunut pWS209D-plasmidi sisältää siten noin 1,5 kb pitkän alueen, jossa on ADHI-promoottori ja täydellinen Q-faktori-Leader-osa q-fakto-rin koodaavan alueen alkuun asti.

b. q-faktori-Leader-osan liittäminen HLZ-aeeniin

Koska q-faktori-Leader-sekvenssi plasmidissa pWS209D päättyy HindiII-kohtaan ja HLZ-geeni plasmidissa pH14-23 rajoittuu Hindi 11-kohdan 3'-päähän ja Sali-kohdan 5*-päähän, pilkottiin PH14-23 täydellisesti 36°C:ssa Sali-entsyymillä seoksessa: 6 mM TrisHCl pH 8,0, 6 mM MgC^, 150 mM NaCl ja ylipitkät päät täytettiin Klenow'in polymeraasin avulla (kokonaistilavuus 25 μΐ esimerkin 7 mukaisessa 1igaasipuskurissa, 0,6 pg katkaistua DNA:ta ja 100 μΜ kutakin; dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 1 yksikkö . . Klenow'in polymeraasia, 30 minuuttia, huoneen lämpötila). Tasa-päisten SaiI-pilkkomistuotteiden seuraava puhdistaminen suoritettiin 1-prosenttisessa agaroosigeelissä. Tämän jälkeen tapahtui linkkerin ligitointi käyttämällä synteettistä Hindi 11-1ink-keriä (New England Biolabs (Maniatis, T. et ai., Molecular (Cloning, Cold Spring, Harbor Press, s. 316, 1982). Linkkerit otettiin 1 μg/μl konsentraatiossa veteen. Hindlll-linkkeri kinasoitiin yhden tunnin aikana 37°C:ssa reaktioseoksessa, jonka koostumus oli: 1 μ? 10 x linkkerin kinasointipuskuri (0,66 m TrisHCl pH 7,9, 10 mM ÄTP, 10 mM spermidiini, 0,1 M MgC^/ 150 mM DTT, 2 mg/ml BSA), 1 μΐ linkkeri, 6 μΐ H2 sekä 2 yks.

T4 DNA kinaasi. Linkkerin ligitointi kinasoidun Hindlll-linkke-rin kanssa suoritettiin yön aikana 14°C:ssa käyttämällä noin 0,5 μg/μl Sali- ja Klenow-polymeraasi-käsiteltyä pHLl4-23-plas-midia 10 pl:ssa 1 x linkkerin kinasointipuskuria ja 10 yksikköä T4 DNA-1igaasia. E.-coli HB101 transformoitiin saadulla pWS207D- 3i 38407 plasmidilla, jossa HLZ-geenin kummallakin puolella on nyt kaksi Hindlll-kohtaa.

Sen jälkeen, kun 1 ug pWS207D-plasmidia oli pilkottu Hindlll-entsyymi11ä (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C), voitiin HLZ-geeni nyt ligitoida Hindi11-katkaistuun pWS209D-plasmidiin (5 ug) Hindi 11-fragmenttina α-faktori-Leader-osan taakse. Sen jälkeen, kun Hindlll-fragmentti oli erotettu ja eristetty 1-prosenttisessa agaroosigeelissä (Dretzen et ai., kts. edellä), käytettiin ligaasireaktiossa noin 50 ng pWS207D-plasmidia ja noin 500 ng pWS209D-plasmidia 20 μ1:η panoksessa, joka muodostui 1igitointipuskurista (66 mM TrisHCl pH 7,6, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM rATP ja 1 U 7 DNA ligaasi). Reaktio tapahtui 14°C yön aikana. Muodostuneelle plasmidille annettiin nimeksi pWS215D, joka sisältää HLZ-geenin oikeassa orientaatiossa o-faktori-Leader-osaan tai ADHI-promoottoriin nähden.

c. Eksakti siirtymiskohta α-faktori-Leader-osan ia HLZ-geenin välillä . . HLZ-geenin eksaktin N-pään valmistamista varten on välttämätöntä, että proteaasikatkaisukohta, joka on vastuussa o-faktorin valmistumisesta, sijoitetaan juuri ennen valmiin ihmis-lysotsyy-min ensimmäisen aminohapon sekvenssiä. Rakenteesta oli siten poistettava cDNA-peräiset ylimääräiset nukleotidit (noin 20 dG-dC-paria) sekä ne nukleotidit, jotka koodaavat autenttista HLZ-•:·· Leader-sekvenssiä.

Plasmidi pWS125D pilkottiin täydellisesti PstI-entsyymi 11ä .·. ; (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl , 36°C) ja 1-pro- senttisesta agaroosigeelistä eristettiin 500 bp suuruinen fragmentti, joka sisältää pääosan α-faktori-Leader-osasta sekä HLZ-geenin 5'-pään (Dretzen et ai. kts. edellä), kloonattiin uudelleen P. Carter’in et ai. menetelmällä (Carter, P., Bedoulle, H., Witner, G., Nucleic Acid Res. 13., 4431-43, 1985) M13 ampl8-: am4:ään ja transformoitiin E. coli TGl-kannassa.

32 88407

In vitro mutageneesissä käytettiin yksisäikeisen DNA:n lähtöaineena rekombinanttifaagia A2, jossa oli haluttu orientaatio. Templaatti-DNA preparoitiin samalla tavoin kuin didesoksi-sek-venssointiin (M13 cloning and sequencing handbook, Amersham International plc, Amersham UK). Fosfotriesteri-menetelmällä (Efimov, v.A, et ai., Nucleic. Acid Res. 10., 6675-94, 1982) syntetisoitiin 20-mer oiigonukleotidi EBI124, joka sisälsi halutun siirtymiskohdan α-faktori-Leader-osan ja HLZ-geenin välissä, ja 17-mer selektio-oligonukleotidi EBI234, joka korjaa M13-vektorissa olevan Amber-mutaation, puhdistettiin preparatii-visella polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja käytettiin primeerinä toisen DNA-säikeen synteesissä. Oligonukleotidi-muta-geneesi suoritettiin oleellisesti M.J. Zoller'in ja M. Smith'in menetelmällä DNA 3, 479-488, 1984; 150 pmol selektio-oligonukle-otidia EBI234, jonka sekvenssi oli 5' AAGAGTCTGTCCATCAA 3' ja 150 pmol mutageenistä primeeriä EBI124, jonka sekvenssi oli 5' GGATAAAAGAAAGGTCTTTG 3’

fosforyloitiin 4 yksiköllä T4 polynukleotidi-kinaasia (New England Biolabs) 20 pl:ssa seosta: 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 1 mM rATP, 5 mM DTT, 37°C:ssa 45 minuutin aikana ja sen jälkeen kuumennettiin 10 minuuttia 70°C:ssa. Kinasoidut primee-rit, kumpaakin 7,5 pmol, hybridisoitiin 0,5 pmol tempiaatti-DNA:ta vasten 10 pl:ssa seosta: 10 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, jolloin kuumennettiin 3 minuuttia 100°C:ssa ja sen jälkeen jäähdytettiin tunnin ajan huoneen lämpötilaan. Renaturoitu seos jäähdytettiin jäissä, säädettiin tilavuus : 20 uliksi 10 mM TrisHCl ph 8,0, 10 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 0,25 mM

dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 0,25 mM rATP ja primeeri jatkettiin yhdellä yksiköllä DNA-polymeraasin I suurta fragmenttia (Biolabs), kun mukana oli 10 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs). Reaktio suoritettiin 16 tunnin aikana 14°C:ssa. 0,1, 1,5 ja 10 μ1:η pienet osat seoksesta käytettiin sen jälkeen transfek- 33 88407 toimaan E. coli HB2154-kannan (ilman supressoria) komponentit solut samalla, kun valmistettiin solukenttä HB2155 kannalla (Carter P., et ai. Nucleic Acid Res. 13., 4431-4443, 1985).

222:sta transfektoidun DNA:n avulla saadusta plakista siirrettiin 84 LB-maljoi 11 e, kunnes kehittyi infektoitujen bakteereiden pesäkkeitä (37°C, 16 tuntia). Preparoitiin "nitroselluloosa-blot" ja seulottiin 32p-leimatulla mutageenisel1 a oligonukleoti-dilla RBI124. Nitroselluloosasuodatin esipestiin 5 minuuttia huoneen lämpötilassa 6xSSPE-liuoksella (0,9 M) NaCl, 0,06 M NaH2P04, 6 mM EDTA), esihybridisoitiin hybridisointipuskurissa (6xSSPE, 1 % sarkosyyli /Sigma/, 100 pg/ml satunnaisesti katkaistu tRNA) 15 minuutin ajan 37°C:ssa ja hybridisoitiin huoneen lämpötilassa (22°C) 16 tunnin ajan hybridisointipuskurissa, joka sisälsi 0,4 x 10® cpm/ml koetinta. Koetin 5'-pääleimattiin (y _32P) ATP:llä seuraavasti: 30 pmol mutageenistä primeeriä EBI124 fosforyloitiin 37°C:ssa 45 minuutin ajan yksiköllä T4 polynukleotidikinaasia (Biolabs) 20 pl:ssa seosta: 50 mM TrisHCl pH 7,6, 10 mM MgC^/ 10 mM DTT, 1 mM spermidiini, 100 pg/ml BSA ja 10 pmol (γ _32P) ATP (5000 Ci/mmol, Amersham). Sen jälkeen . . reaktioseos puhdistettiin kromatografisesti Biogel P-6DG-gee-Iillä (Biorad) TE-puskurissa (10 mM TrisHCl pH 7,5, 1 mM EDTA) sisäänmenemättömän (γ -32P) ATP:n erottamiseksi 32p-leimatuista oiigonukleotideistä.

Hybridisoinnin jälkeen suodattimet pestiin kolme kertaa 6xSSC-liuoksessa (0,9 M NaCl, 0,09 M Na-sitraatti) huoneen lämpötilassa 5 minuutin ajan ja kerran esi lämmitetyssä 6xSSC-liuoksessa 37, 47,5 50 ja 56°C:ssa 5 minuutin ajan ja jokaisen pesun jäl-: keen autoradiografoitiin. 56°C:ssa (TD+2°C) suoritettu autora- diografia teki näkyväksi yhden kloonin, A2/25, joka hybridisoitu voimakkaasti mutageenista oligonukleotidiä vasten. Oletettu mutanttifaagi plakkipuhdistettiin, seulottiin vielä kerran puhtaiden mutanttifaagien indentifioimiseksi ja sekvenssoitiin deletion toteennäyttämiseksi.

34 88407

Yanisch-Perron menetelmällä (Yanisch-Perron et al., Gene 33. 103-119, 1985) preparoitiin kaksisäikeinen DNA kloonista A2/25 ja pilkottiin Pstl-entsyymil lä (noin 5 ug seoksessa: 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C).

440 bp Pstl-fragmentti, joka nyt sisälsi halutun siirtymiskohdan - faktori-Leader-osan ja valmiin ihmis-lysotsyymin välillä, eristettiin 1-prosenttisesta agaroosigeelistä kuvatulla tavalla (Dretzen et ai., s.o.) ja käytettiin seuraavassa lähemmin selvitetyissä ligitoinneissa (esimerkit 8e ja 9d).

d. ADHII-terminaattori ia HLZ-aeenin 3'-pää ADHII-terminaattori (Beier, D.R., Young, E.T., Nature 300. 724-728, 1982; Russell, D.W. et ai., J.Biol. Chem. 258. 2674-2682, 1983) eristettiin pAS5-plasmidista pilkkomalla 5 ug pAS5-plasmidia SphI/Xbal-entsyymeillä (6 mM TrisHCl pH 7,4, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT 36°C) ja eristettiin kuvatulla tavalla 1-prosenttisesta agaroosigeelistä. D.W. Russell et ai. (kts. edellä) ovat kuvanneet ADHII-terminaattorin DNA-sekvens- : sin. pUC18 pilkkominen (Vieira, J. Messing, J., Gene 19., 259-268, 1982; Yanisch-Perron et ai. Gene 33., 103-119, 1985) suoritettiin Sphl- ja Xbal-entsyymeillä edellä annetuissa olosuhteissa. Sen jälkeen ligitoitiin noin 50 ng pilkottua vektoria ja noin 500 ng AHII-terminaattoria (SphI/Xbal-fragmentti) 20 μ1:η reaktiopanoksessa 1igitointipuskurissa (66 mM TrisHCl pH 7,6, 6,6 mM MgC^, 10 mM DTT, 1 mM rÄTP) käyttämällä yksi yksikkö T4 DNA-ligaasia 14°C:ssa yön aikana. E. coli HB101 transformoitiin saadulla plasmidilla pWS213D.

Koska pHL14-23-plasmidista saadussa HLZ-DNA:ssa on pysäytys-kodonin jälkeen ei-koodaavan alueen muita nukleotidejä sekä 20 dC-dG-parin pätkä, joka on peräisin cDNArn valmistuksesta, nämä poistettiin. Tätä tarkoitusta varten pilkottiin pHL14-23 Maelll-entsyymillä (20 mM TrisHCl pH 8,0, 6 mM MgCl2, 350 mM NaCl, 1 mM DTT, 45°C) ja eristettiin (Dretzen et ai. kts. edel- 35 88407 lä). Saatu 220 bp suuruinen MaeIII-fragmentti katkaistiin eksaktisti pysäytyskodonissa, ja se sisältää HLZ-geenin 3'-pään.

Ylipitkät päät täytettiin Klenow'in polymeraasilla siten, että noin 0,5 pg MaelII-entsyymi 1lä katkaistua DNA:ta saatettiin reagoimaan 25 μ1:η 1igaasipuskurin kokonaistilavuudessa (kts. edellä) kulloinkin 100 μΜ kanssa seuraavia; dATP, dTTP, dCTP, dGTP käyttämällä 1 yksikkö Klenow'in polymeraasia 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Noin 1 ug pWS213D-plasmidia pilkottiin 36°C:ssa Smal-entsyymillä (6 mM TrisHCl pH 8,0, 6 mM MgCl2» 20 mM KCl) ja pHLl4-23 tylppäpäinen MaelII-fragmentti (noin 500 ng) ligitoitiin pWS213D-plasmidin (50 ng) Smal-kohtaan (olosuhteet samat kuin edellä on kuvattu).

Muodostuneelle plasmidille, jossa HLZ-geenin orientaatio oikea ADHII-terminaattoriin nähden, annettiin nimeksi pWS235D. Tämä plasmidi sisältää HLZ-geenin 3'-pään pysäytyskodoniin asti ja ADHII-terminaattorin jälkeen. HLZ-geenin ja ADHII-terminaattorin välissä on vielä BamHI-katkaisukohta ja Xbal-katkaisukohta, jotka ovat peräisin pUC18-plasmidin multikloonauskohdasta. Koska ; BamHI-kohta häiritsee myöhempää rakentamista, se poistettiin. Tätä varten pWS235D pilkottiin BamHI-entsyymi 11ä 36°C:ssa (6 mM TrisHCl pH 8,0, 6 mM MgC^/ 150 mM NaCl, 1 mM DTT), ylipitkät päät täytettiin Klenow'in polymeraasilla (kts. edellä) ja rakennettiin mukaan SaiI-linkkeri jo kuvatuissa olosuhteissa (esimerkki 8b). Muodostuneelle plasmidille annettiin nimeksi pW257D (*; ja E. coli HB101 transformoitiin sillä. HLZ-geenin 3'-pään ja ADHII-terminaattorin 5'-pään välinen liitossekvenssi on: : 5'HLZ-- GTAAC GGG GGATC GGTCGACC GATCC TCTAGA -- AHDII-T. 3 ' ‘ ; -- CATTG CCC CCTAG CCAGCTGG CTAGG AGATCT — *;*: 1 2 3 4 5 6 1 = Ihmis-lysotsyymin 3'-pää, joka on pilkottu Maelll-entsyy-:.f millä ja täytetty Klenow'in polymeraasil la pysäytyskodoni 1 -

la TAA

36 88407 2 = Smal kloonauskohdan jäännösosa (pWS213D) 3 = Avattu ja Klenow'in polymeraasil la täytetty BamHI-kohta 4 = SalI-linkkeri (New England Biolabs) 5 = Kohdan 3 BamHI-kohdan toinen pää (avattu ja täytetty

Klenow’in polymeraasi1 la) 6 = Xbal-kohta ja ADHII-terminaattorin alku e. Ekspressiokasetin rakentaminen

Esimerkissä 8b rakennettu plasmidi pWS215D (noin 1 ng) pilkottiin PstI- ja HindiII-entsyymei1lä (olosuhteet kuten esimerkissä 8a), minkä avulla saadusta 4,2 kb fragmentista leikattiin irti koko HLZ-geeni sekä pääosa a-faktori-Leader-osasta. Samoissa olosuhteissa pilkottiin pWS257D PstI- ja HindiII-entsyymei11ä ja saatu fragmentti, jossa oli ADHII-terminaattoria HLZ-geenin 3'-pää, ligitoitiin Pstl/Hindlll-kohtaan. Ligaasireaktio suoritettiin kuten edellä (esimerkki 8d). Saadussa plasmidissa pWS218D on juuri ct-faktori-Leader-osan edessä HLZ-geenin 3'-pää, joka päättyy pysäytyskodoniin, sekä sen jälkeen ADHII-terminaat-tori. Valmiista ekspressiokasetista puuttuu vielä pääosa a-fak-tori-Leader-osasta ja HLZ-geenin 51-pää sekä oikea siirtymiskoh-ta kummankin näiden osan välillä. Sitä vaaten esimerkissä 8c valmistettu mutagenisoitu 440 bp suuruinen PstI-fragmentti (noin 500 ng) ligitoitiin pWS218D-plasmidin (noin 50 ng) Pstl-katkai-sukohtaan edellä kuvatuissa olosuhteissa. Plasmidille, jossa 440 bp pitkä PstI-fragmentti (HLZ-geenin 5'-pää ja α-faktori-Leader-osan pääosa (3'-pää)) on oikeassa orientaatiossa ADHI-promoottoriin tai HLZ-geenin 3'-päähän nähden, annettiin nimeksi -f pWS290D.

Plasmidi pWS290 sisältää siten kaikki kuvatut osat oikeassa järjestyksessä ja orientaatiossa toisiinsa nähden sekä modifi oidut, eksaktit siirtymiskohdat yksittäisten osien välillä: 37 8 8 407 145 bp ADHI-promoottori, 260 bp α-faktori-Leader-osa (loppuu sekvenssiin, joka koodaa proteaasikatkaisukohtaa), 390 bp HLZ geeni (alkaa 1ysiinikodoni1 la, jota seuraa valmiin HLZ-proteiinin sekvenssi, ja päättyy HLZ-geenin pysäytyskodoniin), 330 bp ADHII-terminaattori.

f. Ihmis-1Ysotsyvmin ekspressio hiivassa

Ekspressiokasetti PWS290 (5 pg) pilkottiin Hindlll-entsyymeillä 36°C:ssa (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl) ja ligitoitiin myös Hindlll- ja BamHI-entsyymeillä katkaistuun monikopiovektoriin pJDB207 (1 pg).

Sekä ekspressiokasetti pWS290D (5 ng) että monikopiovektori pJDB207 (1 pg) (Beggs, J.D., Gene cloning in yeast, in: Williamson, R, (toim.), Genetic engineering, Vol. 2, Academic Press, London 1981, 175-203; DSM 3181) pilkottiin Hindlll- ja BamHI-entsyymeillä 36°C:ssa (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl). Näin avattuun monikopioplasmidiin pJDB207 (noin 50 ng) liitettiin preparoitu HindIII/BamHI-fragmentti (noin . . 500 ng) (20 pi panos, jossa ligitointipuskuria, ja esimerkin 7 olosuhteissa käyttämällä 1 yksikkö T4 DNA-1igaasia). Tällä plasmidilla 129/29 transformoitiin seuraavalla tavalla erilaisia heterotal1 isiä Saccharomvces cerevisiae-hiivakantoja (Beggs, J.D. Nature 275. 104-109, 1978): Yön yli YPD-alustassa (1 % Bacto-hiivauute, 2 % Bacto-peptoni, 2 % glukoosi) viljellystä esivi1jelmästä siirrostettiin 107 solua/ml 50 ml:aan YPD alustaa ja viljeltiin kahden sukupolven ajan 28°C:ssa (yleensä 3 tuntia). Nopeudella 5000 kierr./min. sentrifugoitiin : 5 minuuttia, solut suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan SED-liuosta (1 M Sorbit, 35 mM EDTA pH 8,0, 50 mM DTT) ja ravisteltiin hitaasti 10 minuuttia 30°C:ssa. Nopeudella 1600 kierr./min. sentrif ugoitiin 5 minuuttia, suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan SCE-liuosta (1 M Sorbit, 0,1 M Na3 Citrat, pH 5,8, 10 mM EDTA), tästä otettiin 100 pl ja suspendoitiin 2,9 mlraan vettä. Sfero-plastinen muodostuminen mitattiin aallonpituudella 600 nm. Tämän jälkeen suoritettiin käsittely 50 piillä glusulaasia hitaasti 38 88407 ravistelemalla 28°C:Bsa. Eri aikojen jälkeen otettiin jälleen 100 μΐ sferoplasteja, suspendoitiin 2,9 ml:aan vettä ja määritettiin E600.

Heti, kun ekstinktioaallonpituudella 600 mm oli laskenut noin 30 %:iin lähtöarvosta (useimmiten 20 - 30 minuutin kuluttua), solut erotettiin sentrifugoimalla nopeudella 1600 kierr./min. (pöytäsentrifuugi). Sferoplastit pestiin kerran 5 ml :11a CaS-seosta (1 M Sorbit, 10 mM CaCl2/ 10 mM TrisHCl pH 7,5), jälleen erotettiin hitaasti sentrifugoimalla ja otettiin 0,5 ml:aan CaS-seosta. Sferoplasteista otettiin yhtä suuret määrät, lisättiin 1 pg plasmidi-DNA:ta (129/29) suurempien DNA-liuostilavuuk-sien ollessa kyseessä nämä on säädettävä 1 M sorbiittikonsent-raatioon, annettiin seistä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa ja lisättiin 1 ml PEG-seosta (20 % w/v PEG 4000, 10 mM CaCl2/ 10 mM TrisHCL pH 7,5, sterii1isuodatettu). Annettiin seistä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa, erotettiin sentrifugoimalla nopeudella 1600 kierr./min. (pöytäsentrifuugi), pelletti suspendoitiin uudelleen 150 pl:aan SOS-liuosta (1 M sorbiitti 33 % v/v YPD, 6,5 mM CaCl2, 13,5 pg suodattamalla steriloitu aminohappo, ; jonka suhteen seiektoidaan) ja annettiin seistä 20 minuuttia 30°c:ssa. Tätä seosta ravisteltiin lievästi 3 mlrssa 45°C:een esi jäähdytettyä pinta-agaria (1 M sorbiitti, 2,5 % agar, 0,67 % BYNB wo aa [Bacto yeast nitrogen base ilman aminohappoja], 2 % glukoosi, 1 % 100 x aminohappo-seos), valittiin pohja-agar-maljoille (2 % agar, 0,67 % BYNB wo aa, 2 % glukoosi, amino-happoseos kuten pinta-agari1 le) ja viljeltiin 2-4 päivää 30°C:ssa.

100 x aminohapposeos-leu sisälsi 2 g/1 kutakin seuraavia: ade-niinisulfaatti, arginiini, urasiili, asparagiini, glutamiini, histidiini, metioniini, lysiini, tyrosiini, fenyylialaniini, väliini, treoniini, tryptofaani. Transformoituja hiivakantoja (Saccharomvces cerevisiae) kasvatettiin sc-leu-alustassa (0,67 % Bacto yeast nitrogen base ilman aminohappoja, 5 % glukoosi, 1 % 100 x aminohapposeos-leu) 30°C:ssa.

39 88407

Seuraavassa taulukossa on annettu 1ysotsyymiekspression tulokset. Lysotsyymin määrät saatiin käyttämällä spesifistä vasta-aineen sitoutumista lysotsyymiin (Elisa-testi).

Transformaatti Kanta Lysotsyymi (mg/1 vilejlmä) 1/29 WS21-5 0,4 1/31 WS21-5 0,31 2/30 WS21-3 0,89 2/31 WS21-3 0,42 6/30 WS21-1 1,0 6/31 WS21-1 1,2 WS21-1 = a leu2 his3 trpl pep4 WS21-3 = o leu2 his3 ura3 pep4 WS21-5 = a leu2 his3 trpl argl pep4

Esimerkki 9: a-faktori-promoottorin kontrollinalaisen ekspres-siokasetin rakentaminen

Julkaistuissa töissä (Bitter, G.A. et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA £11, 5330-34, 1984; Brake, A. J. et ai. Proc. Natl . Acad.

Sei. USA 8JL, 4642-46, 1984) on kuvattu heterologisten geenien sijoittaminen α-faktori-geenin Hindlll- ja Sali-kohtien väliin. Tällöin toimii EcoRI- ja HindiII-kohtien välinen sekvenssi • · promoottorina ja Leader-peptidinä sekä Sali- ja EcoRI-kohtien välinen sekvenssi transkription terminaattorina.

a. q-faktorin kloonaus sopivaan vektoriin α-faktori-geeni eristettiin pUC13-derivaatta poF:stä (5 pg)

EcoRI-fragmenttina (100 mM TrisHCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 36°C) ja kloonattiin V2-vektoriin. V2-vektori konstruoitiin seuraavasti: pUC18 pilkottiin Sami- ja Hindlll-entsyymeilla, päät täytettiin jo kuvatulla tavalla Klenow'in polymeraasilla ja jäljelle jäänyt pUC18-osa ligitoitiin uudelleen niin, että muodostunut V2-vektori sisälsi vielä kolme (EcoRI, SstI, Kpnl) alkuperäisestä 10 kloonauskohdasta. Siten 40 88407 V2-vektori ei sisällä enää mitään Hindlll- ja Sali-kohtia, joten näiden kummankin entsyymin ainoat katkaisukohdat ovat α-faktori-geenissä. V2-vektori (1 ug) pilkottiin EcoRI-entsyy-millä ja liitettiin noin 500 ng EcoRI-pilkottua pctF noin 50 ng:aan EcoRI-pilkottua V2-vektoria (ligaasireaktio kuten on kuvattu kohdassa 7). Muodostunutta ja E. coli HBlOl-bakteerissa transformoitua pWS230D-plasmidia käytettiin jatkokonstruoinnissa (esimerkki 9b, c). pWS230D-plasmidista saatu Pastl/BglΙΙ-frag-mentti (kuvio 14a) sisältää noin 900 bp pitkän promoottorin. Sen vieressä sijaitseva Pstl-kohta on noin 25 bp verran translatoi-dun alueen sisäpuolella.

α-faktori-geenin transkriptioon tarpeelliset DNA-alueet ovat noin 25 bp ennen Pstl-kohtaa, joka on neljän HindiII-kohdan vieressä sekä siitä myötävirtaan, α-faktorin Leader-sekvenssi alkaa noin 25 bp vasemmalle tästä toisesta Pstl-kohdasta (ATG) ja päättyy jokseenkin täsmälleen ensimmäisessä neljästä Hindlll-kohdasta. Pituus on noin 280 bp. Terminaattori on Sali- ja EcoRI-kohtien välissä.

b. HLZ-geenin yhdistäminen a-faktori-geeniin

Jotta HLZ-geeni voitaisiin rakentaa oikeaan orientaatioon a-fak-toripromoottoriin tai -terminaattoriin nähden, oli pHL14-23:n kummallakin puolella olevat restriktioleikkauskohdat Hindlll ja Sali vaihdettava keskenään. Tätä varten katkaistiin noin 5 ug pHL14-23-plasmidia Sali-entsyymillä (6 mM TrisHCl pH 8,0, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 36°C) tai Hindlll-entsyymillä (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgC^, 50 mM NaCl, 36°C), ylipitkät päät täytettiin kulloinkin Klenow'in polymeraasilla (0,5 ug pilkottua DNA:ta 25 μΐ reaktiotilavuudessa, kuten esimerkissä 8b) ja reaktioseos puhdistettiin 1-prosenttisessa agaroosigeelissä. Hindlll-linkke-ri (New England Biolabs) ligitoitiin SaiI-(pWS207-D)-kohtaan ja SaiI-linkkeri (New England Biolabs) Hindlll-kohtaan (pWS206D) (kulloinkin noin 0,5 ug/μΐ DNA-fragmenttia) esimerkissä 8b kuvatulla tavalla, ja transformoitiin E. coli HBlOl-kannassa.

41 38407

Muodostuneet plasmidit pWS206D ja pWS207D (kumpaakin noin 5 pg) katkaistiin EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2/ 50 mM NaCl, 36°C) ja ligitoitiin toisiinsa edellä kuvatun 1igaasireaktion olosuhteissa (esimerkki 7), jolloin saatiin plasmidi pWS208D. Myös nyt esimerkissä 8d kuvattu HLZ-geenin 3'-pää on ongelmallinen, sillä pysäytinkodonin jälkeen on mukana vielä nukleotidejä. Tästä syystä lyhennettiin HLZ-geenin 3'-pää pysäytyskodoniin asti seuraavalla tavalla: Plasmidi pWS257D (esimerkin 8d konstruktion) sisältää HLZ-geenin 3'-pään pysäytyskodoniin asti, sen jälkeen Sali-kohdan ja ADHII-termi -naattorin, jolla ei kuitenkaan ole tässä konstruktiossa merkitystä. Plasmidit pWS208D ja pWS257D pilkottiin täydellisesti Sali- ja Pstl-entsyymeillä (PstI 50 mM:ssä TrisHCl pH 8,9, 10 mM MgCl2/ 50 mM NaCl, 36°C; 1 tunti, minkä jälkeen NaCl-konsentraa-tio nostetaan 150 mM:ksi ja lisätään Sali) ja puhdistettiin 1-prosenttisessa agaroosissa ja eristettiin (Dretzen et ai. kts. edellä). pWS257D-plasmidin SaiI/Pstl-fragmentti, joka sisältää HLZ-geenin 3'-pään, korvasi pWS208D-plasmidista saadun Sal 1I/Pstl-fragmentin siten, että edellä kuvatulla tavalla ligitoitiin pWS257D-plasmidi (noin 500 ng) fragmentti pWS208D-plasmidin (noin 50 ng) SaiI/Pstl-kohtaan. Saatu plasmidi pWS212D sisältää nyt täydellisen HLZ-geenin Hindlll/Sall-fragmenttina, jolloin HLZ-geenin 3’-pää päättyy pysäytyskodoniin. Plasmidit PWS212D ja pWS230D (esimerkki 9a) pilkottiin täydellisesti Hindlll- ja SalI-entsyymeillä (Hindlll seoksessa: 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C, 1 tunti, minkä jälkeen HaCl-konsentraatio nostettiin 150 mM:iin ja lisättiin Sali (siten, että pWS212D-plasmidista leikattu HLZ-geeni voitiin ligitoida (ligaasireaktio, kuten on annettu esimerkissä 7)

Hindu Ι/SalI-fragmenttina (noin 50 ng) eristäminen edellä kuvatulla tavalla 1-prosenttisesta agaroosigeelistä (HindiIΙ/Sal I-avattuun vektoriin (noin 50 ng). HLZ-geeni on nyt syntyneessä pWS231D-plasmidissa oikeassa orientaatiossa α-faktoripromootto-rin ja -terminaattorin suhteen.

42 88407 c. Pstl-kohdan poistaminen α-faktori-qeenistä α-faktori-geeni sisältää 2 Pstl-kohtaa. Ei-koodaavassa alueessa sijaitseva kohta on hyvin haitallinen jatkokonstruktioinnissa, joten tämä poistettiin seuraavalla tavalla: pWS230D-plasmidi (rakennettiin esimerkin 9a mukaisesti) PstI katkaistiin osittain pilkkomalla 10 ug pWS203D-plasmidia 36°C 10 minuutin ajan 10 yksiköllä Pstl-entsyymiä seoksessa; 50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl. 1-prosenttisesta agaroosigeelistä eristettiin ne fragmentit, joissa oli vain yksi leikkauskohta (fragmentit B ja C kuviossa 14a). Jotta 3'-ylipitkät päät voitaisiin pilkkoa pois Mung Bean-nukleaasi1 la, otettiin noin 1 ug näin saatua 1inearisoitua DNA:ta pWS230D-plasmidista 13 ug:aan vettä ja tähän lisättiin; 2 μΐ 10 mM ZnCl2, 1 μΐ 4 M NaCl, 2 μΐ, 0,3 M natriumasetaatti pH 4,75, 2 μΐ Mung Bean-nukleaasi (300 yks. Pharmacia). Tämän seoksen annettiin seistä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen vietiin suoraan 1-prosenttiselle agaroosigeeli11 e ja geelistä eristettiin fragmentit (Dretzen et ai. kts. edellä). Tämän jälkeen liitettiin uudelleen fragmentit B ja C (olosuhteet kuten esimerkissä 7), jolloin tuhottiin Pstl-kohta, joka osittaisessa pilkkomisessa oli katkaistu, ja ei-katkennut kohta jäi jäljelle. Tällä tavoin voitiin eristää plasmidi, jossa haluttua Pstl-kohtaa ei enää ollut mukana ja toinen kuitenkin oli jäljellä (C*). Sekä tämä plasmidi (C) että myös pWS231D pilkottiin täydellisesti PstI- ja Bglll-ent-syymeillä (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C). Plasmidista C' (noin 500 ng) saatu eristetty C2-fragmentti (850 bp) ligitoitiin Pstl/BglII-pilkottuun pWS231D-plasmidiin (noin 50 ng) (1igaasireaktio kuten on kuvattu esimerkissä 7), jolloin saatiin plasmidi pWS294D. Tämä plasmidi pWS294D sisältää vielä α-faktorigeenin, jossa on yksi Pstl-kohta ja jossa HLZ-geenin 3'-pää on insertoitu oikeaan orientaatioon.

d. Ekspressiokasetin rakentaminen pWS294D-plasmidi sisältää α-faktori-promoottorin ja a-faktori-peptidin alkukohdan Pstl-katkaisukohtaan asti (noin 20 bp «3 88407

Leader-peptidi) sekaisen jälkeen HLZ-geenin 3'-pään Pstl-kohdas-ta alkaen pysäytyskodoniin asti. Täydellisestä ekspressiokase-tista puuttuvat vielä o-faktori-Leader-osan 3'-pää, HLZ-geenin 5'-pää sekä näiden kahden osan välinen oikea siirtymiskohta. Plasmidi pWS294D (noin 1 pg) pilkottiin täydellisesti Pstl-entsyymillä (50 mM TrisHCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 36°C) ja plasmidista A2/25 (esimerkki 8c) (noin 500 ng) saatu mutagenisoitu 440 bp PstI-fragmentti ligitoitiin esimerkin 8e mukaisesti pWS294D-plasmidin Pstl-kohtaan.

Saatu plasmidi pWS296D sisältää ekspressiokasetin, joka muodostuu α-faktori-geenin 900 bp promoottorisekvenssistä, 260 bp α-faktori-Leader-osasta (identtinen esimerkissä 8e) kuvatun sekvenssipalan kanssa), 390 bp HLZ-geenistä (identtinen esimerkissä 8e kuvatun sekvenssipalan kanssa ja 290 bp a-faktori-terminaattorista.

Claims (13)

44 88407

1. DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se muodostuu nukleotidisekvenssistä, jonka kaava on 5'AAGGTCTTTGAAAGGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATGG CTACAGGGGAATCAGCCTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTAC AACACACGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATATTTC AGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTG TCATTTATCCTGCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCA AAGAGGGTTGTCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGAGAAATCGTT GTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTG, tai sen aileelimuunnoksista, joilla on ihmis-lysotsyymin koodausfunktio.

2. DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää nukleotidisekvenssin, joka hybridisoituu patenttivaatimuksen 1 mukaisella DNA-molekyyli1 la stringenteissä olosuhteissa, jotka ovat selektiivisiä yli 85 % homologial1 e, ja koodaa ihmis-lysotsyymin.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että hybridisoinnin stringentit olosuhteet selektoivat enemmän kuin 90 % homologian.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että molekyylin 5'-päädyssä on ATG-tripeltti ja 3'-päädyssä on pysäytyssignaali.

5. DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että siinä on nukleotidisekvenssi, jonka kaava on 45 38407 5'ATTGTTCTGGGGCTTGTCCTCCTTTCTGTTACGGTTCAAGGCAAGGTCTTTGAAAG gtgtgagttggccagaactctoaaaagattgggaatggatggctacaggggaatcagc CTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTACAACACACGAGCTACAA ACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATATTTCAGATCAATAGCCGCTA CTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAOCAGTTAATGCCTGTCATTTATCCTGCAGT GCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCAAAGAGGGTTGTCCGTG ATCCACAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGAGAAATCGTTGTCAAAACAGAGATGT CCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTGTAACTCCAGAATTTTCCTTCTTCAGCTCAT TTTGTCTCTCTCACAATTAAGGGAGTAGGTTAAGTGAAAGGTCACATACCATTATTTC

6. Rekombinoitu DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on yhdistetty vektoriaalisesta nukleotidisekvenssistä ja jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisesta DNA-molekyylista.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen rekombinoitu DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on ekspressiovektori.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen rekombinoitu DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että ekspressiovektori on yhdistetty elementeistä promoottori, translaatio-aloitussignaali, johto-sekvenssi, jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen DNA-molekyyli ja terminaattori.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen rekombinoitu DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että promoottori on AHI-promoottori tai a-tekijä promoottori, johtosekvenssi on α-tekijä johtaja ja terminaattori on ADHII-terminaattori tai α-tekijä-termi-naattori.

10. Transformoidut hiivasolut, tunnettu siitä, että ne sisältävät jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaista DNA-molekyylia tai jonkin patenttivaatimuksen 6-9 mukaista rekombinoitua DNA-molekyyliä.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen transformoitu isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on Saccharomvces cerevisiae. « 88407

12. DNA-oligonukleotidi, jonka kaava on AAA A 5’ CC TC TT CACCA TA 3’ G G G G A AA AT 5' A CACATCCA TT GCA 3' GG G C G

13. Menetelmä valmistaa ihmis-lysotsyymia, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: a) eristetään ihmis-lysotsyymi-mRNA kokonais-RNA:sta ihmis-solulinjasta, b) konstruoidaan cDNA vaiheessa a) saadusta eristeestä ja lopuksi kloonataan kaksoissäikeinen cDNA, c) seulotaan vaiheesta b) saatu cDNA-geenipankki hybridi-soinnin kautta käyttämällä sopivaa oligonukleotidia, d) konstruoidaan täydellinen ihmis-lysotsyymia koodaava cDNA, jossa on nukleotidisekvenssi, jonka kaava on 5'AAGGTCTTTGAAAGGTGTGÄGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATGG CTACAGGGGAATCAGCCTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTAC AACACACGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATATTTC AGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTG TCATTTATCCTGCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCA AAGAGGGTTGTCCGTGATCCÄCAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGAGAAATCGTT GTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTG tai sen aileelimuunnokset, jolla on ihmis-lysotsyymin koodausfunktiot, tai nukloetidisekvenssi, joka edellä olevan kaavan mukaisella nukleotidisekvenssillä stringenteissä olosuhteissa, jotka selektoivat enemmän kuin 85 % homologian, hybri-disoitu ja koodaa ihmis-lysotsyymin, 47 88407 e) yhdistetään vaiheesta d) saatu cDNA, sen 5'-pääty joh-tosekvenssiin, f) rekombinoidaan vaiheesta e) saatu DNA vektoriaalisen DNA:n kanssa ja konstruoidaan ekspressioplasmidi, joka oleellisesti muodostuu elementeistä promoottori, translaatio aloitussignaali, vaiheesta e) saatu DNA-molekyyli, pysäytyskoodi ja terminaattori, ja g) transformoidaan hiivasolu vaiheesta f) saadulla rekom-binoidulla DNA-molekyylil la, viljellään näitä soluja sopivassa väliaineessa ja erotetaan näin saatu ihmis-lysotsyymi väliaineesta. 48 8 8 4 0 7 Patentkrav 1