HU202923B - Process for producing humanizozime - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás humán lizozim proteint meghatározó cDNS szintézisére és izolálására, valamint a humán lizozim előállítására. Részletezve, a találmány egy olyan bakteriális plazmidra vonatkozik, amely a humán lizozim szignál-peptidjének egy részét meghatározó cDNS szekvenciát, a teljes érett humán lizozim proteint meghatározó cDNS szekvenciát és 3’ végén a humán lizozim gén egy nem-kódoló szekvenciájának egy részét tartalmazza. A találmány tárgyát képezik ezenkívül kifejező vektorok is, ilyenek a humán lizozimet kódoló nukleotid szekvenciát inszertumként tartalmazó plazmidok és különböző olyan gazdaszervezetek és tenyészetek, amelyek a humán lizozim előállítását lehetővé teszik.

A lizozimek l,4-P-N-acetil-muramidázok, amelyek a baktériumok peptidoglükánjában az N-acetil-muraminsav (MurNAc) C- 1 szénatomja és az N-acetil-glükózamin C-4 szénatomja közötti glükozidos kötést hasítják [D.C. Phillips, Sci. Am., 215, 78-90 (1966)]. Alexander Fleming fedezte fel 1922-ben, hogy különböző szövetek és szekrétumok, valamint a tyúktojásfehérje, bizonyos Gram-pozitív baktériumokat lizálni képesek. Ezt a lizáló faktort ő lizozimnek nevezte el, minthogy ez egy olyan enzim, amely baktériumok feloldására (lizálására) képes. Fleming kimutatta, hogy a lizozim előfordul porc- és gyomor-szövet homogenizátumokban, könnyben, nyálban, köpetben, orrváladékban, patológiás vizeletben, szérumban és a leukocitákban, de nem található meg egészséges emberek vizeletében, a cerebrospinális folyadékban vagy az izzadságban [A. Fleming, Proc. Roy, Soc., Ser 893, 306307 (1922)]. Úgy tűnik, hogy a lizozimnek, mint antibakteriális szemek a hatása közvetlen bakteriolitikus hatása révén, vagy a makrofágok fagocitózisával összefüggésben, stimuláló tulajdonsága révén nyilvánul meg [W.D. Biggar és J. M. Sturgess, Infect. Immunoi., 16, 974-982 (1977); M. Thacore és H.P. Willet, Am. Rév. Resp. Dis., 93, 786-790 (1966)].

Ki lehetett mutatni, hogy a lizozimnek jelentős szerepe van mint közvetítőnek a patkányok alveoláris makrofágjai által kifejtett, a mikroorganizmusokkal szembeni védekezésben: intakt baktériumoknál nem történt fagocitózis, míg a lizozim által károsított kabtériumok gyorsan fagocitálódtak [W.D. Biggar és J.M. Sturgess, Infect. Immunoi., 16, 974-982 (1977)]. Ugyancsak kimutatták, hogy a lizozim közvetlenül meg tudja növelni a polimorfonukleáris leukociták [M.I. Klockars és P. Roberts, Acta Haematol., 55,289292 (1976)] és a makrofágok [M. Thacore és H.P. Willet, Am.Rev. Resp. Dis., 93, 786-790 (1966)] fagocitáló aktivitását. A lizozim hatásmechanizmusának a vizsgálatát, azaz hogy hogyan hat a száj mikroorganizmusaira, a következő törzsekkel végezték el: a Streptococcus mutáns hét szerotípusával, a Veillonella ascalescens-sel és az Actinomyces viscosus T14 virulens és avirulens törzseivel. Az eredmények azt mutatták, hogy a bakteriosztatikus, litikus és baktericid tulajdonságokért különböző mechanizmusok lehetnek felelősek, s hogy az enzim nemcsak szelektív, hanem hatékony faktor is a száj mikroorganizmusai elleni küzdelemben [V.J. Iacono, B.J. Mackay, S. DiRienzo és J.J. Pollok, Infect. Immunoi., 29, 623-632 (1980)]. A lizozim egyéb feltételezett funkciói közé tartozik az immunstimuláció [P. Jolles, Biomedicine, 25, 275-276 (1976)] és a gazdamembránok immunológiai és nem immunológiai ellenőrzése neoplazmás transzformáció vonatkozásában [E.F. Ossermann, Adv. Pathobiol., 4,98-102 (1976)]. A lizozim meghatározását szérumból és vizeletből, különböző betegségek diagnosztizálására használják fel vagy mint e betegségek indikátora gyanánt. Az akut limfoblasztoid leukémiánál a szérum lizozim szintje jelentősen csökkent, míg krónikus mieloid leukémiánál és akut monoblasztoid és mielomonocitóziso leukémiánál a lizozim koncentrációja a szérumban erősen emelkedett [P. Jolles, M. Stemberg, G. Mathe, Isr. J. Med. Sci., I, 445-447 (1965); E.F. Ossermann és D.P. Lawlor, J. Exp. Med., 124, 921-952 (1966)].

A lizozim hatásos terápiás alkalmazása a különböző bakteriális- és vírusos-fertőzések (Zóna, Herpes zoster) esetén képzelhető el, továbbá colitisnél, különböző fájdalmak esetén, allergiáknál, gyulladásoknál, továbbá a gyermekgyógyászatban (a tehéntej matemizálása lizozim hozzáadásával).

A lizozim más biológiailag aktív proteinekkel úgy reagál, hogy azok teljesen kibontakoztathassák hatásukat (Adinolfi közleménye Lampert és Woods kiadványában, Academic Press, London, 1981, 19-47. oldal). Ilyen proteinek például a komplement fehérjék, a laktotranszferrin, amely bizonyos mikroorganizmusok szaporodását vas-kelát-komplex képződés révén gátolja és az antitestek, mint a tejben lévő szérum lg A, amely a laktotranszferrin antibakteriális hatását fokozza [Spik és munkatársai: Bull. Eur. Physiopath. Resp., 19, 123-130 (1983)]. A lizozimet, laktotranszferrint és az immunglobulinokat együttesen is meg lehet találni a különböző természetes szekrétumokban, mint a nyálban, könnyben, a különböző tej-féleségekben [Jorieux és munkatársai, Protides of the Biological Fluids, 31. kollokvium (1984)], a hörgő- nyálkahártyában, valamint a tojásfehérjében. Ami a lizozim további felhasználását illeti, előnyösen alkalmazható reumás láz és reumás fájdalmak csillapítására és terápiás hatást fejt ki a reumatoid-artritiszes tünetkor betegségeinél („Fleming-féle lizozim”; 3. nemzetközi szimpózium, 1964, Milánó). Később a lizozimnek analgetikus tulajdonságokat is tulajdonítottak [Bianchi, Eur. J. Phanmacol., 71, 211-221 (1981)]. Újabban antinociceptív hatást is ki tudtak mutatni a lizozimnél [Bianchi, Clin. Exp. Phamacol. Physiol., 10, 45-52 (1983)]. A lizozim hatásmódjának széles palettája arra enged következtetni, hogy megfelelően széles spektrumú a terápiás alkalmazhatósága és így jelentős gazdasági értéket képvisel.

A lizozim fent felsorolt gyógyászati alkalmazásainál a humán lizozimet (HLZ) kell előnybe helyezni a tojásfehérjéből előállított lizozimmel szemben, mivel a fajidegen lizozimek felhasználásakor anafilaxiás és/vagy allergiás természetű mellékhatások várhatók, s ezek a gyógyítás útjába állhatnak.

HU 202 923 Β

A humán lizozim előállításának mindmáig egyetlen kereskedelmi fonása az emberi tej és emberi placenta volt. Ezeket a kiindulási anyagokat azonban csak nagyon korlátozottan lehetett beszerezni és nyilvánvaló, hogy belőlük gyártási tételenként különböző készítmények nyerhetők. A nagyon fejlett ipari mikorbiológia és a legújabban kifejlesztett rekombináns DNS technológia hasznosításának az előnyei a humán lizozimnek mikroorganizmusokban való termelésénél is megmutatkoznak.

A tojásfehérje lizozimet meghatározó gént izolálták [A.E. Sippel, H. Land, W. Lindenmair, M.C. NguyenHum, T. Wurtz, K.N. Timmis, K. Giesecke és G. Schütz, Buci. Acid. Rés., 5, 3275-3294 (1978); P. Baldacci, A. Royal, B. Cami, R. Perrin, A. Krust, A. Garapin és P. Kourilsky, Nucl. Acid Rés., 6, 2667-2681 (1979)] és a tojásfehérje lizozim mRNS, valamint a génen lévő exon - ennek határszakaszait is beleértve

- nukleotid szekvenciáját is meghatározták [A. Jung. A.E. Sippel, M. Grenz és G. Schütz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5759-5763 (1980)]. Megállapították továbbá a T4 bakteriofágból származó lizozim gén nukleotid szekvenciáját [J.E. Owen, D.W. Schultz, A. Taylor és G.E Smith, J. Mól. Bioi., 165,229-248 (1983)].

Ismert volt a HLZ aminosav szekvenciája [J. Jolles és P. Jolles, Helv. Chim. Acta, 54, 2668-2675 (1971); R. E. Canfield, S. Kammermann, J.H. Sobel és F.J. Morgan, Natúré New Bioi., 232, 16-17 (1971); P. Jolles és J. Jolles, Molec. and Cellul. Biochem., 63, 165— 189 (1984)], de nem volt ismeretes a találmány szerinti HLZ-t kódoló nukleotid szekvencia.

Muraki, M. és munkatársai az Agric. Bioi. Chem., 49(9), 2829-31 (1985) közleményben leírják humán lizozim E. cliban (E. coli SK 107) egy szintetikusan előállított nukleotidszekvencia alkalmazásával végzett kifejezését. Az expresszió azonban mégsem eredményez használható anyagot, mert oldhatatlan és inaktív termék keletkezik, amely a gazdasejten belül halmozódik fel. Javasolják ugyan a probléma megoldására, hogy a HLZ-t valamilyen eljárással oldatba kellene vinni, és ezzel regenerálni biológiai aktivitását, de ilyen regenerálási eljárást nem közölnek.

Az EPA 181 634 számú európai szabadalmi bejelentés leírja a humán lizozimnek az élesztőben és a Bacillus subtilisben való kifejeződését. Attól eltekintve, hogy az EPA 181 634 számú európai szabadalmi bejelentés szerint nem alkalmaznak speciális élesztőterminátort és autentikus HLZ gént, ezen HLZ-DNS szekvenciához - élesztőben való kifejeződés esetében

- nem kapcsolódik vezérpeptidet kódoló DNS szekvencia. így a képződött HLZ-t nem lehet a gazdasejtből kivonni, s ezáltal megnehezedik a pontos tercier szerkezetnek a kialakítása diszulfid hidak képzésével. Tehát nem lehet megtudni a szóban forgó 181 634 számú bejelentésből, hogy hogyan juthatunk az autentikus HLZ-hez. Szintén nem tudjuk meg belőle, hogy hogyan távolítják el a start metionint.

A feladat, amely a jelen találmány alapját képezi, abban áll, hogy egy olyan stratégiát dolgozzon ki, amelynek segítségével a HLZ aminosav szekvenciájáról meglévő minimális információ alapján cDNS-t lehessen szintetizálni, majd klónozni és hogy ez egy biológiailag aktív HLZ protein kifejezésében nyilvánuljon meg.

A problémát úgy oldjuk meg, hogy egy mRNS templát segítségével olyan bakteriális hibrid-plazmidokat szerkesztünk, amelyek HLZ-t meghatározó cDNS-t tartalmaznak. A HLZ-DNS, amely a bakteriális hibrid vektor részét képezik, valamilyen emberi HLZ-termelő sejtből származhat. Alkalmas sejtek például a placenta sejtek, az akut monoblasztoid és/vagy nüelomonocitózisos leukémiában szenvedő emberek leukocitái, az emberi vastagbél ráksejtjei, az U-937 sejtvonal vagy más, HLZ-t termelő sejtvonalak.

A jelen találmány előnybe helyezi az ember U-937 sejteket (ATCC CRL 1593) és ezt használja. A HLZDNS-t HLZ gént tartalmazó génbankból izolálhatjuk. Ebben a találmányban nem használunk kromoszómális DNS-t, mivel ez a kódoló szakaszán belül valószínűleg intronokat tartalmaz [például a tyúktojás-fehérje lizozim génje három intront tartalmaz; A Jung, A. E. Sippel, M. Grez és G. Schütz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,5759-5763 (1980)], amelyeket élesztő segítségével nem lehet kihasítani. A jelen találmány a humán cDNS-t helyezi előnybe.

Az U-937 sejtekből izolált mRNS előnyös templátot jelent a humán lizozim cDNS szintézise számára. A HLZ-cDNS első szála szintézisének reakcióját oligo (dT)i8 primerrel indítjuk meg, amely előnyös módon a szóban forgó mRNS 3’ végével tud párt képezni: Dezoxiribonukleozid-trifoszfátok (dNTP-k) és reverz transzkriptáz jelenlétében történik a cDNS szimpla szálának a meghosszabbítása. Az egyszálú cDNS-t ezután különböző ismert módszerekkel lehet kettős szálú cDNS-sé konvertálni. Ebben a találmányban a Gubler és Hoffinann féle módszer [U. Gubler és B.J. Hoffmann, Gene, 25, 263-269 (1983)] használatát tartjuk előnyösnek. Az egyszálú cDNS-ből úgy történik a kétszálú cDNS szintetizálása, hogy a mRNS hibridet RNázH-val és DNS-polimeráz I-vel kezeljük dNTP-k jelenlétében. Ezzel a módszenei olyan kétszálú cDNSt kapunk, amelyet közvetlenül klónozhatunk. A kétszálú cDNS-nek baktérium-vektorokban való klónozását különböző ismert módszerekkel lehet elvégezni. A kétszálú cDNS-t, mint tompa végű fragmentumot közvetlenül, szintetikus linker közvetítésével vagy a „homopolimer-tailing” néven ismert módszerrel lehetklónozni. A HLZ-cDNS klónozása esetében a homopolimer-tailing módszert helyezzük előnybe. Ennél a módszernél a HLZ-DNS 3’ végén lévő tompa (blunt), illetve lépcsős (staggered) végekre terminális transzferáz segítségével és nukleotidok (előnyösen dGTP) hozzáadásával, szimpla szálakat építünk Egy másik reakcióban a baktérium plazmidot valamilyen restrikciós endonukleázzal linearizáljuk (a HLZ-cDNS klónozása esetén a pUC9 vektort helyezzük előnybe) és komplementer farkakkal (előnyösen dCTP-vel) látjuk el, hogy 3’ végükön komplementer szimpla szálakat kapjunk. A következő lépésben a homopolimer módszerrel meghosszabbított kétszálú cDNS-t a megfelelő

HU 202 923 Β komplementer farkakkal ellátott vektorral keverjük össze, s ezek alkalmas fetételek mellett összekapcsolódnak. A rekombináció megtörténte után ezzel a keverékkel CaCh-dal kezelt E. coli sejteket traszformálunk, amelyeket ezután szelektív táptalajt tartalmazó lemezekre szélesztünk. A HLZ-cDNS- t tartalmazó kiónokat különböző ismert módszerekkel azonosíthatjuk. A jelen találmányban a radioizotóppal jelzett, szintetikus oligonukleotidok segítségével végzett szűrést tartjuk előnyösnek. A HLZ proteinre leközölt aminosav szekvencia alapján két oligonukleotid készletet - mindkettőt 17 bázis hosszúsággal - szintetizálunk. Abból a tényből kiindulva, hogy különböző kodonok egy és ugyanazt az aminosavat határozhatják meg, mindegyik készlet különböző oligonukleotidokból álló keveréket tartalmazott.

A minden lehető kombinációval járó szintézis biztosítja, hogy a meglévő oligonukleotidok egyike optimálisan párosul a HLZ génnel. A két egymástól független 17mer oligonukleotid pool alkalmazása csökkenti annak lehetőségét, hogy „fals pozitív” szekvenciákat válasszunk ki.

A szűrővizsgálatokban a cDNS inszertumot tartalmazó baktérium kiónoknak a DNS-ét - telep-hibridizációs módszer alkalmazásával — nitrocellulóz szűrőkre visszük át. A nitrocellulóz szűrőket ezután - megfelelő feltételek mellett - a humán lizozim- specifikus 17-merek radiológiailag jelzett pooljaival hibridizáljuk. A megfelelő kiónok azonosítása után, minden klón DNS-ét izoláljuk és az inszertumokat Maxam és Gilbert módszerével (kémiai eljárás) vagy Sanger módszerével (szintézis dezoxinukleotidokkal) szekvenáljuk.

A pozitív kiónok cDNS inszertumainak DNS szekvenciáit meghatározván lehetővé válik, hogy a potenciális protein aminosav szekvenciáját levezessük. Ennek a szekvenciának és a leközölt HLZ-aminosavszekvenciának az összehasonlítása alapján meg lehet állapítani, hogy a klónozott cDNS valóban tartalmazza-e a HLZ proteint kódoló szakaszt.

Általában azok a vektorok használhatók fel a gazdasejtekben, amelyek a gazdasejtekkel kompatibilis fajokból származnak. A vektor a replikációs kezdőponton kívül rendszerint olyan felismerő szekvenciákat hordoz, amelyek lehetővé teszik a transzfomált sejtek fenotípus szerinti szelektálását. Például az E. colit rendszerint pBR322-vel transzformálják, azaz egy olyan plazmiddal, amely a E. coli fajból származik [Bolivár és munkatársai, Gene, 2, 95 (1977)]. A pBR322 ampicillin- és tetraciklin-rezisztencia gént tartalmaz, melyek egyszerű eszközül szolgálnak a transzformáit sejtek azonosításánál. A pBR322 plazmidnak és más plazmidoknak is ezenkívül saját promotereket kell tartalmazniuk vagy olyanképpen kell promotereiket módosítani, hogy a mikroorganizmus ezeket a saját proteinjeinek az expressziójához felhasználhassa. A rekombináns DNS-ek előállításánál leggyakrabban használt promoterek közé sorolható a béta-laktamáz (penicillináz) és a laktóz-promoter rendszer [Chang és munkatársai, Natúré, 275, 615 (1978); Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977); Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544 (1979)] és a triptofán (trp) promoter rendszer [Goeddel és munkatársai, Nucleic Acids, Rés., 8,4057 (1980); 0036 776 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés]. Bár az említett promotereket használják a leggyakrabban, azonban ezeken kívül más mikrobiális promoterek alkalmazását is kifejlesztették. A HLZ-t meghatározó génszekvencia például a lambda bakteriofág bal (leftward) promoterének (Pl) a szabályozása alá helyezhető. Ez a promoter egy különösen erősnek ismert, szabályozható promoter. A szabályozást a lambda represszor teszi lehetővé. A vele szomszédos restrikciós hasítási helyek ismertek. Ezen génnek egy mutánsát amely egy hőérzékeny represszort kódol - be lehet vinni egy olyan vektorba, amely a teljes HLZ szekvenciát tartalmazza. Ha a hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, a represszor inaktiválódik és a promoter maximális koncentrációban fejeződik ki. Az ilyen feltételek mellett képződő össz-mRNS elégséges kell legyen ahhoz, hogy egy olyan sejtet kapjunk, amelyben az új szintetikus ribonukleinsavaknak mintegy 10%-a a Pl promotertől származik.

Ilyen módon lehetségessé válik egy olyan klónbanknak a létrehozása, amelyben egy funkcionális HLZ-szekvencia egy riboszóma kötőhely szomszédságában helyezkedik el, különböző távolságokra a lambda-PL-promotertől. Ezeket a kiónokat azután megvizsgálhatjuk és a legnagyobb kitermelést adó kiónokat szelektálhatjuk.

A HLZ-szekvencia kifejeződése és transzlációja más olyan szabályozó rendszerek ellenőrzése alatt is végbemehet, amelyeket a szervezet nem transzformált alakjához is „homológ”nak számíthatunk. Egy laktózfüggő E, coli például laktóz- vagy lac- operont tartalmaz, amely a β-galaktozidáz enzim beindítása révén lehetővé teszi a laktóz lebontását.

A lac szabályozó elemeket az E. colit fertőzni képes lambda-plac5 bakteriofágból kaphatjuk meg. A fág lac-operonja ugyanezen baktérium fajból származhat transzdukció révén. Azok a szabályozó rendszerek, amelyek a találmány szerinti eljárásban nyernek alkalmazást, olyan plazmid DNS-ből származhatnak, amely a szervezetre jellemző. A lac-promoter-operátor rendszert IPTG-vel (izopropil^-D-tiogalaktropiranozid) indukálhatjuk. Más promoter-operátor rendszerek vagy ezeknek részei éppilyen jól felhasználhatók: például az arabinóz-operátor, kolicin Ei- operátor, galaktóz-operátor, alkalikus foszfatáz operátor, trp- operátor, xilóz-A-operátor, tac-promoter és így tovább.

Ilyen módon előnyösen lehet élesztő promotert is a HLZ-t kódoló szakaszhoz kapcsolni abból a célból, hogy biztosítsuk a HLZ hatékony kifejeződését. Az élesztő promotert speciálisan közvetlenül az érett HLZ-t kódoló szakasz elé kell helyezni egy transzlációs start szignállal (ATG), amit a kacsolódási helyre építünk be. Ezenfelül a HLZ expresszió-egységet különböző élesztő vektorokba is beépíthetjük, hogy ezután - az élesztő transzformálásának ismert eljárásai szerint - élesztőbe telepíthessük. A hibrid-plazmidokat

HU 202 923 Β tartalmazó élesztő sejteket különböző táptalajokban tenyészthetjük, majd a kívánt HLZ terméket innen izoláljuk és ismert módszerek segítségével tisztítjuk. A HLZ expresszió-egység szerkesztésénél - alternatív megoldásként - egy élesztő szignál szekvenciát is beépíthetünk. Ebben az esetben azok az élesztő sejtek, amelyeket ilyen plazmiddal transzformálunk, képesek arra, hogy sejtfalukon keresztül a tenyészlébe válasszák ki a HLZ-t, ahonnan a kívánt termék - a HLZ - kinyerhető, majd tisztítható.

A kifejeződéshez különösen előnyösek az élesztő sejtek, mint gazdaszervezetek mivel az élesztő sejtek könnyen tenyészthetők, a fermentálás feltételei a nagy volumenű termeléshez adottak és az élesztők nem tartalmaznak endotoxinokat. Ennélfogva a jelen találmányban előnybe helyezzük az eukrióta mikroorganizmusok - ilyenek az élesztő tenyészetek - használatát. Az eukarióta mikroorganizmusok közül a leggyakrabban a Saccharomyces cerevisiae-t alkalmazzák, jóllehet általában számos más faj is hozzáférhető.

Saccharomycesben való expresszióhoz rendszerint például az YRp7 plazmidot [Stinchcomb és munkatársai, Natúré, 282, 39 (1979); Kingsman és munkatársai, Gene, 7 141 (1979); Tschumper és munkatársai, Gene, 8, 157 (1980)] és az YEpl3 plazmidot [Broach és munkatársai, Gene, 8,121-133 (1979)] használják. Az YRp7 a TRP1 gén tartalmazza, amely egy olyan élesztő mutánsnál, amely triptofán-mentes táptalajban képtelen növekedni, szelekciós markerül szolgál; ilyen például az ATCC 44076 letéti számú törzs. A TRP1 deléció, mint az élesztő-gazda genomjának jellemzője, hatásos segítséget jelent a transzformáció kimutatására, amikor a gazdasejtet triptofán nélkük tenyésztjük. Hasonló a helyzet az YEpl3 plazmidnál, amely a LEU 2 élesztő gént tartalmazza, s amelyet egy LEU-2 mutáns kiegészítésére lehet alkalmazni.

Az élesztő vektorokhoz alkalmas promoter szekvenciák közé tartozik az ADHI 5’ határoló szakasza [G. Ammerer, Methods of Enzymology, 101,192-201 (1983)], a 3-foszfoglicerát kináz [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 2073 (1980)] vagy más glükolitikus enzimek [Kawasaki és Fraenkel, BBRC, 108, 1107-1112 (1982)], mint az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát- dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfo-ffukto- kináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, foszfo-glükóz-izomeráz és glükokináz. A megfelelő expressziós plazmidok szerkesztésénél az ezekkel a génekkel asszociált terminátor szekvenciákat az expressziós vektorban a kifejezendő szekvencia 3’ végéhez szintén hozzá lehet fűzni, hogy a mRNS poliadenilációját és terminációját biztosítsuk.

Vannak más promoterek, amelyeknek még az az előnyük, hogy transzkripciójukat növekedési feltételek szabályozzák, ilyen promoter szakaszokat tartalmaz az alkohol-dehidrogenáz-2, az izocitokróm-C, a savanyú foszfatáz, továbbá azok a lebontó enzimek, amelyek a nitrogén anyagcserével függnek össze, a fent említett gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz és azok az enzimek, amelyek a maltóz és galaktóz lebontásáért felelősek. Azokat a promotereket, amelyeket az élesztő mating-type lokusza szabályoz, például a BARi, MEC1, STE2, STR3, STE5 gének promotereit - hőmérséklettel szabályozott rendszereknél - a hőmérséklet-függő sir mutációk révén lehet alkalmazni [Rhine: doktori tézisek, Oregoni Egyetem, Eugene, Oregon (1979); Herskowitz és Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces I. rész, 181-209 oldal, Cold Spring Harbor Laboratory (1981)].

Ezek a mutációk befolyásolják az élesztő nyugvó mating-type kazettáit, s ezáltal közvetve a mating-type függő promotereket. Általában azonban minden olyan plazmid vektor alkalmas, amely élesztő-kompatibilis promotert és eredeti replikációs és terminátor szekvenciákat tartalmaz.

Ha intakt HLZ-cDNS szekvenciával rendelkezünk, lehetővé válik más mikroorganizmusokban, például élesztőben való kifejezés céljára HLZ gént szerkeszteni. A HLZ-nek élesztőben való, találmány szerinti kifejeződéshez például olyan szekréciós plazmidokat alkalmazhatunk, amelyek vagy az ADHI-promoter-afaktor vezérszekvencia - HLZ gén - ADHH-terminátor szekvencia elemekből vagy az a-faktor-promoter - a- faktor-vezérszekvencia - HLZ gén - a-faktorterminátor szekvencia elemekből tevődnek össze. Az ADHI-promoter, az ADHII-tenninátor és az a-faktorgén szekvenciái ismertek [L. Jeffrey és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257, 3018-3025 (1982); D.VÍ Russell és munkatársai, J. Bioi. Chem., 258, 2674-2682 (1983); Nucleic Acids Rés., 12, 4049-4063 (1983)].

Egy ilyen módon szerkesztett HLZ gént egy kiválasztott élesztő promoterrel működőképesen, lehet összekötni. Ezenkívül egy ilyen expresszió-egységet különböző élesztő vektorokba is integrálhatunk. E vektorok képesek az élesztőt transzformálni, s ez a humán lizozim szintéziséhez vezet el.

A HLZ kifejeződéséhez, amely az ADHI promoter előnyös szabályozása alatt áll, egy olyan plazmidot szerkeszthetünk, amely az ADHI promoter 3’ vége mögött a teljes a- faktor vezérszekvenciát tartalmazza. Az α-faktor vezérszekvencia 3’ végéhez kapcsoljuk az érett HLZ-t kódoló DNS szekvenciát (HLZ gént) az α-faktor vezérszekvenciához képest megfelelő irányítottsággal. Egy olyan szerkezetet helyezünk előnybe, amely a képződő HLZ-nél pontos N- terminális létrejöttét biztosítja. Az expressziós kazetta végleges szerkezetébe az ADHH terminátor szekvenciát -^amely a HLZ gén egységes terminációját eredményezi - úgy építjük be, hogy az közvetlenül a HLZ gén stop-kodonjához csatlakozva helyezkedjék el. Egy ilyen expressziós plazmidba minden említett elem a megfelelő sorrendben és egymáshoz képest a megfelelő irányítottsággal van jelen, továbbá pontos átmeneteket tartalmaz az ADHI promoter, α-faktor vezérszekvencia, HLZ gén és ADHII terminátor szekvenciák között. Különösen előnyös, ha az α-faktor vezérszekvencia és a rákövetkező HLZ gén közti kapcsolat úgy van kialakítva, hogy a LYS ARG után az α-faktor éréséért felelős proteáz hasítási hely pontosan az érett HLZ el5

HU 202 923 Β só aminosavát meghatározó szekvencia előtt helyezkedjék el úgy, hogy a gazdasejt által előállított HLZ protein egzakt N-terminális véget nyerjen.

Az ilyen fajta expressziós kazettát különböző élesztő kifejező plazmidokba kapcsolhatjuk be. Előnyösek a multi-coli plazmidok, mint az YEpl3 [J.R. Broach és munkatársai, Gene, 8, 121-133 (1979)], a pJDB207 (letétbe helyezve 1984. december 28-án DSM 3181 letéti szám alatt), az YIp5 [K. Struhl és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035-1039 (1979)] és a pEAS102. A pEAS102 plazmidhoz úgy juthatunk, hogy az YIp5 plazmidot Pstl-vel részlegesen és BamΗΙ-vel teljesen megemésztjük és az izolált 4,3 kb (kilo bázis-pár) fragmentumot (az URA3 gént tartalmazza) a pJDB207-ből nyert 4,4 kb BamHI/PstI fragmentumhoz kapcsoljuk. Ezzel és az ilyen expressziós kazettát hordozó élesztő vektorokkal mindkét mating-type élesztő sejtet transzformálhatjuk az ismert eljárások szerint. A transzformált sejtek által termelt és a tenyészlébe kiválasztott HLZ-t ezután ismert protein tisztítási módszerekkel könnyen izolálhatjuk.

Ugyancsak előnyösen mehet végbe a HLZ gén expressziója az α-faktor promoter szabályozása alatt is. Ekkor az érett HLZ-t meghatározó DNS szekvenciát megfelelő irányítottsággal kapcsoljuk be az a-faktor promoter és az α-faktor vezérszekvencia mögé. Az expressziós kazetta végleges szerkesztésénél az a-faktor vezérszekvenciát, HLZ gént és α-faktor terminátor szekvenciát egymás mögé soroljuk. Ebben az esetben is ugyanazt az átmenetet képezzük ki az α-faktor vezérszekvencia 3’ vége és a HLZ gén 5’ vége között, mint amilyet az ADHI promoter szabályozásával előállított expressziós kazettánál leírtuk. Ezt az expressziős kazettát beépíthetjük a már leírt élesztő kifejező-plazmidba, amellyel ezután ismert módszerek szerint transzformálhatunk élesztő sejteket.

Ebben az esetben az α-mating-type élesztő törzsek az előnyös gazdák. E transzformált sejteknek a tenyésztése és az általuk kiválasztott HLZ izolálása ismert módszerekkel történik.

Ezeknek a szerkezeteknek a révén számos előnyhöz jutunk:

1. A mRNS-nek egységes lesz a terminációja és így a mRNS stabilitása nő.

2. A HLZ izolálása a tenyészlé felülúszójából egyszerű lesz.

3. Nagy részaránya lesz a megfelelő tercier szerkezetű

HLZ-nek, mivel a kiválasztott proteinben könnyebben képződhetnek diszulfid hidak, mint az élesztő sejtben.

4. A szekretáláskor az érett HLZ-től a szignál- vagy vezérpeptid endoproteolitikus úton egzakt módon válik le.

Ezáltal pontosan meghatározott N-terminális véggel kapjuk meg a proteint. Az érett HLZ protein N-terminális végén lizin van. A plazmid szerkezetét tehát úgy választjuk meg, hogy a szekréciós plazmidnál a lizin kodonja elé helyezzük a proteáz hasítási helyet. így a kiválasztott HLZ első aminosava a lizin lesz. A sejten belüli termelésnél az érett lizozim első aminosava elé egy start-ATG-t (metionin) kell helyezni, hogy a transzláció egyáltalán megindulhasson. Ez a metionin, amennyiben sejtes mechanizmus nem hasítja le, igen zavaró lehet (aktivitás, stabilitás, antigenitás).

A mikroorganizmusokon kívül többsejtű szervezetek tenyésztett setjei szintén megfelelő gazdasejtek lehetnek. A HLZ kifejeződése szempontjából. Elvileg minden ilyen tenyészet alkalmazásra kerülhet, legyen az akár gerinces, akár gerinctelen állat sejt- tenyészete. A legnagyobb érdeklődésre mégis a gerinces állatok sejtjei tartanak számot, s így a gerinces állati sejtek tenyészetben való szaporítása (szövet-tenyésztés) az utóbbi években rutin módszerré vált [Tissue Culture, szerkesztők: Kruse és Patterson, kiadó: Academic Press (1973)]. Példák az alkalmas gazda-sejtvonalakra: VERŐ- és HeLa-sejtek, CHO-sejtek, W138, BHK, COS-7 és MDCK sejtvonalak. Az ezen sejteknél számbajövő kifejező vektorok rendszerint (ha szükséges) replikációs kezdőpontot, a kifejezendő gén elé helyezett promotert, a szükséges riboszóma kötőhelyekkel együtt, RNS illeszkedési helyet, poliadenilációs helyet és transzkripció-terminátor szekvenciát tartalmaznak.

Emlős sejtekben való alkalmazás esetén az expressziós vektorok szabályozó funkcióit gyakran vírus eredetű anyagok látják el. A szokásosan alkalmazott promoterek például polyomából, adenovírus 2-ből és különösen gyakran a Simian vírus 40-ből (SV40) származnak. Az SV40 korai és késői promoterei különösen hasznosak, mivel a vírusból mindkettőt olyan fragmentum alakjában kaphatjuk meg, amelyek az SV40 virális replikációs kezdőpontját is tartalmazzák [Fiers és munkatársai, Natúré, 273, 113 (1978)]. Az SV40-nek ezenkívül kisebb és nagyobb fragmentumait is felhasználhatjuk, feltéve, ha ezek azt a mintegy 250 bp hosszú szekvenciát tartalmazzák, amely Hindül hasítási helytől a BglI hasítási helyig - a vírus replikációs helyéig terjed. Ugyancsak lehetséges és gyakran ajánlatos olyan promotereknek és szabályozó szekvenciáknak az alkalmazása, amelyek rendszerint a kívánt génszekvenciákhoz kapcsolódnak, feltéve, ha ezek a szabályozó szekvenciák a gazdasejt-rendszerrel kompatibilisek.

Replikációs helyről vagy a megfelelő vektor szerkesztése révén gondoskodunk, amikor is kívülről származó helyet építünk be, például az SV40-ből vagy más virális forrásból (például polyoma, adeno, VSV, PBV, stb.) vagy pedig a gazdaszervezet kromoszómális replikációs mechanizmusa révén. Ha a vektort a gazdasejt kromoszómájába integráljuk, akkor az utóbb említett eljárás alkalmazása legtöbbször elegendő.

A sejtek klónozó vektorokkal történő transzformációját számos eljárással elérhetjük, például kalcium segítségével, amikor vagy úgy járunk el, hogy a sejteket magnézium jelenlétében mossuk és a DNS-t a sejtek kalciumos szuszpenziójához adjuk hozzá vagy a sejteket a DNS és kálium-foszfát koprecipitátumával hozzuk össze. A gén ezután bekövetkező expressziójánál a sejteket olyan táptalajokra visszük át, amelyek a transzformált sejteket szelektálják. A találmány szerinti polipeptiden nemcsak az érett humán lizozimet (HLZ) értjük, amelyet részletesen tárgyalunk, hanem

HU 202 923 Β éppúgy e polipeptid mindenfajta módosulata is a találmány oltalmi körébe tartozik. A módosítások közé tartozik például a molekula megrövidítése az N- vagy C-terminális végén vagy aminosavak kicserélése másik csoportra úgy, hogy a molekula aktivitása lényegesen ne változzék.

A találmány nemcsak azokra a génszekvenciákra vonatkozik, amelyek specifikusan az adott HLZ-t kódolják, hanem éppúgy azokra a módosulatokra is, amelyek rutinszerűen előállíthatók mutáció, lebontás, transzpozíció vagy addíció segítségével. Minden olyan szekvencia, amely a leírt HLZ-t kódolja (azaz amely a megfelelő és ismert biológiai aktivitás-spektrummal rendelkezik) és azok, amelyek a bemutatott szekvenciával összehasonlítva degeneráltak, szintén a találmány oltalmi körébe tartozik; az e területen működő szakemberek el tudják végezni a kódoló szakaszok DNS szekvenciáinak a módosítását. Hasonlóan minden olyan szekvencia, amely a HLZ aktivitás-spektrumával rendelkező valamely polipeptidet kódol és azok is, amelyek a bemutatott szekvenciákkal (vagy ezekből részekkel) szigorúan meghatározott feltételek mellett hibridizálnak (például olyan feltételek mellett, amelyek több mint 85%-os, előnyösen több mint 90%-os homológia esetén szelektálnak), a találmányhoz tartoznak.

Hogy a találmány szerinti anyagot gyógyszerként alkalmazhassuk, ismert módon állíthatjuk össze a receptúrát, mely szerint a találmány szerinti polipeptid egyedül vagy más komponensekkel együtt, így különböző antibiotikumokkal (tetraciklin, bacitracin), enzimekkel (alfa-amiláz, papain) vagy vitaminokkal kiegészítve kerül alkalmazásra.

A következő példákban részleteiben írjuk le a találmányt, azonban a találmány oltalmi körét nem korlátozzuk e példákra.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákát.

Az 1. ábrán a primer-extenziós kísérlet eredményét mutatjuk be, amelyben az EÍ-ON19 és az ΕΪ-ΟΝ20 oligonukleotidok a primerek és az U-937 sejtvonalból izolált RNS a templát.

A 2. ábra a dot-blot-hibridizálás eredményét ábrázolja.

A 3/a ábra a HLZ-cDNS (HL14-1 klón) szerkezetét és a 3/b ábra a HLZ-cDNS nukleotid szekvenciája meghatározásának stratégiáját mutatja be.

A 4/a ábra a HLZ-cDNS (HL14-1 klón) DNS szekvenciáját és a 4/b ábra a HL14-1 kiónból származó HLZ-cDNS restrikciós térképét ábrázolja.

Az 5. ábra a HLZ-re leközölt aminosav szekvencia (felső sor) és a HL14-1 klón cDNS-éből levezetett aminosav szekvencia (alsó sor) összehasonlítását mutatja be.

A 6. ábra a pEAS102 sokmásolatú hibrid-vektort ábrázolja (szerkesztését és alkalmazását lásd fentebb).

A 7. ábrán bemutatjuk, hogy hogyan kapcsoljuk össze az ADHI promotert az α-faktor vezérszekvenciával, valamint a pWS215D további szerkesztését, amelynél a HLZ gént a megfelelő irányítottsággal kapcsoljuk össze az α-faktor vezérszekvenciával.

A 8. ábra a Hindlü-linker bevezetését mutatja be (8.b példa), valamint a Sáli- és Hindül-linker beépítését (9.b példa; eredmény: a pWS208D szerkezet); a linkerek beépítésének az a célja, hogy a HLZ gént a megfelelő irányítottsággal építhetssük be az a-faktor vezérszekvenciához, illetve az α-faktor promoterhez, illetve -teiminátorhoz képest.

A 9. ábra az EBI124 és EBI234 szintetikus oligonukleotidokkal megvalósított in vitro mutációkat ábrázolja, amelykenek az a céljuk, hogy pontos átmenetet létesíthessünk az a- faktor vezérszekvencia és a HLZ gén között.

A 10. ábrán a pWS235D szerkesztését mutatjuk be. Ebben a HLZ gén egzakt 3’ vége a megfelelő irányítottsággal van beépítve az ADHII terminátor elé.

A 11. ábrán bemutatjuk, hogy hogyan távolítjuk el a HLZ gén és az ADHII terminátor között lévő BamHI helyet (pWS257D) és bemutatjuk az expressziós kazetta végleges szerkezetét is (pWS290D).

A 12. ábra azt mutatja, hogy a pUC13 plazmid paF származékából származó α-faktor gén hogyan klónozzuk be - mint EcoRI fragmentumot - a V2 vektorba, amely pUCl8 származék (szerkesztését lásd a 9.d példában; pWS230D).

A 13. ábra megvilágítja azt a módot, hogy hogyan kötjük össze a HLZ gént az α-faktor promoterrel és -terminátorral a megfelelő irányítottságggal (pWS231D).

A 14/a és 14/b ábrákon azt mutatjuk be, hogy hogyan távolítjuk el az α-faktor gén 5’ vége közelében lévő PstI helyet (pWS294D); bemutatjuk továbbá az α-faktor promoter irányítása alatt álló pWS296D expressziós kazetta végleges formájának elkészítését, amikor is a 9. ábrában ábrázolt A2 mutáns PstI fragmentumot a pWS294D egyetlen PstI helyére kapcsoljuk be ligáz reakcióval.

A példákban használt rövidítések:

HLZ humán lizozim

RPMI Roswell Park Memóriái Institute

Tris.HCl trisz-(hidroximetil)-aminometán, pH-ja HCl-dal beállítva

EDTA etilén-diamin-tetraecetsav

DEP dietil-pirokarbonát

SDS nátrium-dodecil-szulfát

NaAC nátrium-acetát

BSA marha szérum albumin

DTT 1,4-ditiotreitol (l,4-dimerkapto-2,3-butándiol)

PCI fenol:kloroform:izoamil-alkohol (15:24:1) β-NAD β-nikotinamid-adenin-dinukleotid ' sscDNS szimpla szálú cDNS E.coli Escherichia coli

SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M nátrium-citrát tartalmú oldat, ρΗ-7-re beállítva 10 n NaOH-val

Denhardt oldat 0,1% Ficoll, 0,1% polivinil-pirrolidon és 0,1% BSA tartalmú oldat

TBE 0,082 M trisz, 0,082 M bórsav és 0,002 M EDTA tartalmú oldat; pH-8.

1. példa

HLZ aktivitás meghatározása U-937 sejtvonalból

Ismeretes, hogy az U-937 emberi hematopopetikus

HU 202 923 Β sejtvonal humán lizozimet termel [P. Ralph, M.A.S. Moore és K. Nillson, J. Exp. Med., 143, 1528-1533 (1976)]. Hogy az U-937 sejtvonalat a poliA+RNS kiindulási anyagaként használhassuk a HLZ-cDNS szintetizálásához, meghatározzuk az U-937 sejtek által a tá- 5 poldatba kiválasztott HLZ aktivitását. RPMI tápoldatba (10% fetális borjúszérum, 100 egység/ml penicillin, 50 egység/ml sztreptomicin) frissen beoltott U-937 sejtek tenyészetét 3.10⁵ sejt/ml sűrűségig tenyésztjük 37 ’Con 3 napon át. A sejteket centrifugálással távolítjuk el 10 és a tápoldatba kiválasztott HLZ aktivitását Gold és Schweiger módszerével határozzuk meg [L.M. Gold és M. Schweiger, Methods in Enzymology, XX. kötet, C.

fejezet, 537-542 oldal; szekesztók: K. Moldave és L. Grossman, kiadó: Academic Press, New York és London (1971)]. A radioaktív szubsztrátummal való két órás inkubálás után felszabadult radioaktivitást a 2 mles inkubációs keverékekből kivett 100 μΐ-nyi alikvot mennyiségekben megmérjük. Negatív kontroll gyanánt az RPMI tápoldat szolgál. Az U-937 sejtek által termelt HLZ mennyiségi meghatározása standard görbe segítségével történt [humán lizozim emberi tejből (Sigma); aktivitásának meghatározása RPMI tápoldatban történik].

Az eredményeket az 1. táblázat foglalja össze.

1. táblázat

Tápoldat hígítása	Beütések száma 100 μί inkubációs keverékben	Beütések száma 100 μί tápoldatban	A kiválasztott HLZ mennyisége (Mg/ml)
2·	10 457	20 914	2,09
4·	3 963	15 852	1,59
10·	1 485	14 850	1,49
20·	794	15 880	1,59

Az 1. táblázat szerint az U-937 sejtek körülbelül 1,5 pg HLZ-t választanak ki az RPMI tápoldat 1 miébe. Ebből azt következtettük, hogy az U-937 sejtvonal használható forrása lesz a HLZ mRNS-nek.

2. példa

Humán lizozim mRNS tartalmú RNS előállítása

a) Az össz-RNS izolálása

Az emberi hisztiocitás lymphomából származó U937 sejtvonalat RPMI 1640 tápoldatban (10% fetális borjú szérum, 100 E/ml penicillin, 50 E/ml sztreptomicin) tenyésztjük 37 ’C-on. A sejteket centrifugálással gyűjtjük össze 1,6 liter tenyészetből. A sejteket egyszer mossuk 50 ml jéghideg 10 mM trisz.HCl-t (pH=7,4), 140m M NaCl-t és 1,5 mM MgCh-t tartalmazó oldattal, majd jéghideg 10 ml 10 mM trisz.HCl (pH-8,4), 140 mM NaCl és 1,5 mM MgCfe tartalmú oldatban reszuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz Nonidet P40 nem ionos detergens [polietilénglikol- (4-izooktilfenil)-éter] adunk 0,5% végkoncentrációig. A szuszpenziót 5 percig jégben állni hagyjuk, majd 10 másodpercig erősen keverjük, hogy a sejtmembránok feloldódjanak. A sejtmagokat ezután 4 °C-on való centrifugálással távolítjuk el. A felülúszó 10 ml-éhez 0,5 ml 20%-os SDS-t, 0,25 ml 2 mólos trisz.HCl-t (pH-9,0) és 0,1 ml 500 mmólos EDTA-t (pH-7,5) adunk. A mintához azonos mennyiségű frissen desztillált és 10 mM trisz.HCl-el (pH-δ) és 1 mM EDTAval kiegyensúlyozott fenolt adunk és 10 percig erősen rázzuk. Ezután centrifugálással választjuk el a fázisokat. A vizes fázist kétszer extraháljuk úgy, ahogy fent leírtuk, végül azonos mennyiségű kloroformmal. Az extraktumhoz 3 M kálium-acetátot (a vizes fázis térfogatának 1/10-e) és végül 2,5 térfogatrész etanolt adunk. Az oldatot -20 ’C-on egy éjszakán át állni hagyjuk, a kicsapódott RNS-t centrifugálással összegyűjtjük, egyszer mossuk 3 ml 70%-os etanollal és vákuumban szárítjuk. Az RNS-t 3 ml vízben feloldjuk, kicsapjuk, összegyűjtjük, szárítjuk és mint fent, újra feloldjuk. A kitermelés mintegy 8 mg RNS.

b) A poliA⁺RNS izolálása

A poliA⁺RNS-t az össz-RNS-ből oligo(dT)-cellulóz (P-L Biochemicals Inc.) segítségével izoláljuk. Steril vízben 0,5 g oligo(dT)-cellulózt szuszpendálunk és 14°C-on egy éjszakán át állni hagyjuk. A következő nap egy DEP-pel kezelt, steril vízzel kimosott oszlopba (BioRad Plastic, 18 cm, 1,5 cm 0) töltjük a 0,5 g oligo(dT)-cellulózt, 3 ml proteináz-K (XI típusú proteáz, Sigma) oldattal mossuk és 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A proteináz-K-t 0,1· kiegyensúlyozó pufferben [1· kiegyensúlyozó puffer: 50 mM trisz.HCl (pH-7,4), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,2% SDS] oldjuk fel 1 mg/ml végkoncentrációig. Az oszlopot ekkor 5 ml steril 0,1 mólos NaOH-val mossuk, majd steril vízzel addig, amíg az eluátum el nem éri a pH-8 értéket, végül 1· kiegyensúlyozó oldattal. Az 500 μΐ vízben reszuszpendált össz-RNS-t 4,5 ml kiegyensúlyozó pufferrel hígítjuk, 5 percig 65 ‘C-on tartjuk (vízfürdőn), majd az előkészített oligo(dT)-cellulóz oszlopra visszük fel. Az eluátumot összegyűjtjük, még egyszer 5 percig tartjuk 65 ’C-on és újra felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 7 ml kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, s ekkor a poliA'RNS eluálódik.

HU 202 923 Β

Frakciószedővel 1-1 ml-eket gyűjtünk és megmérjük minden frakció OD26O értékét. A poliA+RNS-t 5 ml steril vízzel eluáljuk. Mind a poliA’RNS-t, mind a poliA⁺RNS-t etanol jelenlétében egy éjszakán át -20 ’Con tartva, 0,3 ml NaOAC-tal csapjuk ki.

3. példa

A HLZ-mRNS jelenlétének vizsgálata a) Kevert szekvenciájú oligonukleotidok szintetizálása

Szilárd fázisú-foszfotriészter módszerrel [G. Alvaradó-Urbina, G.M. Sathe, W.C. Liv, M.F. Gillen, P. Duck, R. Bender és K.K. Ogilivie, Science, 214, 270274 (1981)] HLZ-vel homológ két pool kevert szekvenciájú oligonukleotidot szintetizálunk. Az EÍ-ON19 17mer oligonukleotid-minta keverék szeikesztésénél a humán lizozim protein [J. Jolles és P. Jolles, Helv. Chim. Acta, 54, 2668-2675 (1971)]; R.E. Canfield, S. Kammermann, J.H. Sobel és F.J. Morgan, Natúré New Bioi., 232,16-17 (1971); P. Jolles és J. Jolles, Molec. and Cellul. Biochem., 63, 165-189 (1984)] NH2-terminális végéről a 63-68. aminosav csoportból álló szekvenciát (Tyr Trp Cys Asn Asp Gly) vettük alapul. Az EÍ-ON19 minta 16 oligonukleotid keverékéből áll, ezek szekvenciája a következő:

5’CCq TC^Tí^CA CCAg TA 3’

Az EÍ-ON20 17mer oligonukleotid-minta keverék szerkesztésénél a humán lizozim protein (lásd J. Jolles és munkatársai, R.E. Canfield és munkatársai, valamint P. Jolles és munkatársa fent idézett közleményét) NH2-terminális végéről a 26-31. aminosav csoportból álló szekvenciát (Alá Asn Trp Met Cys Leu) vettük alapul. Az EÍ-ON20 minta 32 oligonukleotid keverékéből áll, ezek szekvenciája a következő:

A

5’ Aq <~CA CAT CCA £ TT £ GC 3’

C

b) Primer-extenziós analízis

Az U-937 sejtvonalból izolált mRNS-t primer-extenziós módszerrel vizsgáljuk a HLZ-mRNS jelenlétére. Az EÍ-ON19 vagy EÍ-ON20 100 ng-ját 5’ végükön radioizotóppal jelezzük 60 perc alatt 37 ’C-on, 20 μΐ reakcióelegyben. A reakcióelegy tartalma a következő: 70 mM trisz.HCl (pH-7,6), 1 mM MgCk, 30 pCi γ-³²Ρ-ΑΤΡ (5.000 Ci/mmól; Amersham PB .218), 100 pg/ml BSA, 10 mM DTT, 1 mM Spermidin [N(3-amino-propil)-l,4-butándiamin] és 2-4 egység polinukleotid kináz (New England Biolabs). A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 10 percig 70 ’C-on hevítjük.

A primer-extenziós reakciót 40 μΐ reakcióelegyben, 60 percen át 42 ’C-on végezzük. A reakcióelegy a következőkből áll: 50 mM trisz.HCl (pH-8,3), 10 mM MgCb, 10 mM DTT, 4 mM nátrium-pirofoszfát, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dCTP, 1,25 mM dTTP, 150 ng U-937 sejtvonalból izolált mRNS, 40 ng jelzett EÍ-ON19 vagy EÍ-ON20 és 200 egység reverz transzkriptáz (BRL). A reakciót 50 μΐ 50 mmólos EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd az elegyet PCIvel extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A primer-extenziós terméket centrifugálással gyűgyjük össze, szárítjuk és 20 μΐ színezett formamid oldatban, mely 90% ioncserélt formamidból, 10% 10· TBE-ből, 0,1% xiléncianol FF-ből (C.I. 42135) és 0,1% brómfenolkékból áll, feoldjuk.

Minden mintából 10 μΐ-t viszünk fel egy 5%-os poliakrilamid - 8 mólos karbamid gélre. Az elektroforézist 2 óra hosszat 15 watt mellett végezzük. Szárítás után a gélt Kodak X- Ómat RP röntgen filmre exponáljuk Kodak X-Omatic C-2 kazettában. E vizsgálat eredményét az 1. ábrán mutatjuk be.

Minthogy mind az EÍ-ON19, mind az EÍ-ON20 primer komplementer a HLZ mRNS-sel, a reverz transzkriptáz reakció után várható, hogy a HLZ-mRNS templáton elhelyezkedő, ezen primerekkel meghatározott extenziós termékek keletkeznek [C.D. Lee és D. C. Juse, Focus, 4,1-3 (1982)]. Mivel a HLZ-mRNS hoszsza nem volt ismert, a szintetizálódott DNS hosszát sem lehetett előre megjósolni. Mindazonáltal a következőket állapíthattuk meg: az EÍ-ON19 primer azzal a HLZ-mRNS szakasszal párosodik, amely a 63-68. aminosavakat kódolja, tehát a szintetizálódott DNS hossza legalább 203 bp + X kell legyen (X azon nukleotidok számát jelenti, amelyek a vezérszekvenciához és a nem kódoló 5’ szakaszhoz tartoznak). Ugyanilyen számítás szerint az EÍ-ON20 primemél 92 bp + X érték adódik. így tehát két olyan sáv volt várható, melyek nagysága 111 bp-ban különbözik. Az 1. ábra alapján látható, hogy az EÍ-ON19 primerrel kapott legerősebb sáv körülbelül 290 bp hosszú és az EÍ-ON20 primertel kapott legerősebb sáv körülbelül 175 bp hoszszú szekvenciát jelent A két sáv közti különbség (115 bp) igen közel esik a számított értékhez és ebből azt lehet következtetni, hogy az U-937 sejtvonalból származó, vizsgált mRNS preparátum HLZ-mRNS-t tartalmaz.

4. példa

U-937 cDNS génbank létehozása a) A cDNS szintetizálása

A cDNS első szálának a szintézisét 50 μΐ reakciótérfogatban, az alábbi összetételben végezzük el: 50 mM trisz.HCl (pH-8,3), 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 4 mM nátrium-pirofoszfát, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dTTP, 0,5 mM dCTP, 20 pCi α- PdCTP (3.000 Ci/mmól; Amersham, PB.10205), 100 pg/ml oligo (dT)i8 (New England Biolabs), 40-100 pg/ml U-937 sejtvonalból izolált poliA+RNS és 250 egység reverz transzkriptáz (BRL). A reagáltatás 60 percen át, 42 ’C-on történik. A reakciót 50 μΐ 50 mmólos EDTA hozzáadásával állítjuk le és a reakció-termékeket PCI-vel extraháljuk. Az RNS/DNS hibridet etanol/2 mólos ammónium-acetát elegyével -20 ’C-on egy éjszakán át csapjuk ki. A szintetizált első szál me9

HU 202923 Β nyiségét a TCA-ban (triklórecetsavban) oldhatatlan radioaktivitás meghatározásával állapítjuk meg. Egyetlen reagáltatás 200-300 ng egyszálú cDNS-t eredményez. A második szál szintézise érdekében az egyszálú cDNS-t centrifugálással ülepítjük, egyszer mossuk 80%-os etanollal, szárítjuk, majd megfelelő mennyiségű desztillált vízben feloldjuk. A szimpla szálú DNS (sscDNA) dupla szálú DNS-sé (dscDNA) való konvertálásához 500 ng sscDNA-t lehet 100 μΐ reakciótérfogatban feldolgozni. A reakcióelegy összetétele a következő: 20 mM trisz.HCl (pH-7,5), 5 mM MgCh, 10 mM (NH4)2SO4, 100 mM KC1, 0,15 mM bétaNAD, 50 gg/ml 1BSA, 40 μΜ a dNTP-kből, 8 E/ml E.coli RNázH (BRL), 230 E/ml DNS polimeráz I (New England Biolabs) és 10 E/ml E.coli DNS-ligáz (New England Biolabs). A reakcióelegyet 60 percen át 12 ’C-on, majd ezután 60 percen át 22 °C-on inkubáljuk. A reakciót EDTA hozzáadásával - 20 mmól végkoncentrációig - állítjuk le. A dscDNA-t PCI-vel extraháljuk és mint fent, kicsapjuk [U. Gubler és B.J. Hoffmann, Gene, 25, 263-269 (1983)].

b) A duplaszálú DNS klónozása

Egy alacsony transzformációs tulajdonságú klónozó vektort a következőképpen állítottunk elő: 300 gg pUC9 plazmid DNS-t [Gene, 19,259-268 (1982)] PstI restrikciós endonukleázzal teljesen megemésztünk. A megemésztett plazmid-DNS-t agaróz-gél elektroforézissel tisztítjuk, elektroeluáljuk és etanollal kicsapjuk. Az agaróz-gél elektroforézissel tisztított vektor a transzformációs kísérletekben mintegy 1-2 telepet ad ng-onként, míg szuperspiralizált pUC9-cel a transzformáció aránya körülbelül 2.000-4.000 telep a plazmid DNS 1 ng-jára számítva.

Az ilyen módon előállított pUC9 plazmid DNS-el, 50 gl reakció-térfogatban, homopolimer-tailing-et (homopolimer farok ráépítést) végzünk. A reakció elegy öszetétele a következő: 100 mM kálium-kakodilát (pH-7,5), 2 mM C0CI2, 0,2 mM DTT, 0,9 mM dCTP, 5 gCi (5-³H)-dCTP (19 Ci/mmól, Amersham TRK.352), 5 mg/ml BSA, 28 gg Pstl-gyel hasított pUC9 plazmid-DNS és 45 egység terminális transzferáz (P- L Biochemicals). A reakcióelegyet 5 percig 22 ’C-on inkubáljuk és a reakciót 50 gl 25 mmólos EDTA hozzáadását követően 15 percig tartó 70 ’C-on való inkubálással állítjuk le. Ilyen feltételek mellett minden 3’ véghez 22 nukleotidot szintetizálunk, ez az a hosszúság, ami a maximális transzfoimációs rátához szükséges [S.L. Peacock, C.M. Mclver és J.J. Monahan, Biochim. Biophys. Acta, 655, 243-250 (1981)].

A kettős szálú DNS-nek dGTP-vel való homopolimer-farkazását azonos feltételek mellett végezzük, de a reakciónként a dscDNA mintegy 100 ng-ját 30 egység terminális transzferázzal reagáltatjuk 30 percig 37’C-on. A reakciót 50 gl 25 mmólos EDTA hozzáadásával és 15 percig 70 ’C-on történő hőinaktiválással fejezzük be. A dGTP farokkal ellátott duplaszálú cDNS-nek a dCTP farokkal ellátott pUC vektorral való összakapcsolását 50 gl oldatban végezzük, mely 10 mM trisz.HCl-t (pH-7,5), 1 mM EDTA-t és 150 mM

NaCl-t tartalmaz. A reagáltatás 120 percig 58 ’C-on történik. A duplaszálú cDNS és a vektor DNS közötti különböző arányokat arra használtuk, hogy megállapítsuk a duplaszálú cDNS beadagolt mennyiségével elérhető maximális klónszámot. A transzformálást CaCl2-vel és kompetens E. coli RRI sejtekkel [S.L. Peacock, C.M. Mclver és J.J. Monahan, Biochim. Biophys. Acta, 655, 243-250 (1981)] végezzük, azaz 100 gl sejtszuszpenziót 50 gl fenti reakcióeleggyel keverünk el, majd kikenjük 50 gg/ml ampicillint tartalmazó LB lemezekre. Azt az arányt, amelynél a legmagasabb transzformációs számot kaptuk, használjuk fel a cDNS génbank végleges megalapozása érdekében végzett „scale-up” kísérleteknél. A duplaszálú cDNS 50 ng-jának felhasználásával körülbelül 20.000 független telepet kaptunk.

5. példa

Az U-937 cDNS génbank szűrése HLZ klánokra a) Telep-hibridizálás

Abból a célból, hogy a pozitív, azaz a teljes HLZ gént, vagy ennek egy fragmentumát tartalmazó transzformált sejtet kapjunk, először telep-hibridizációval szűrjük a génbankot. Azoknál a transzformált sejteknél, amelyek pozitívnek mutatkoznak, további szűrést végzünk „dot-blot” analízissel.

A transzformált sejteket egy éjszakán át LB+ampicillin (50 gg/ml) lemezeken tenyésztjük 37 ’C-on. A telepeket ezután nitrocellulóz membránokra (0,45 gm, Schleicher-Schüll) visszük át. Úgy a lemezeket, mint a szűrőket úgy jelöljük, hogy lehetőség legyen a pozitív transzformált sejtek azonosítására. A szűrőket gondosan ráhelyezzük a lemezekre, rajtahagyjuk 20 percig szobahőmérsékleten, majd levesszük és 0,5 n NaOH/1,5 M NaCl-el telített 3MM szűrőre (3MM Chr, Whatman) helyezzük őket (a telepek felül legyenek). A NaOH feleslegének eltávolítására a nitrocellulóz szűrőket 15 percig tartó inkubálás után száraz 3MM szűrőre visszük át, majd 3 percre olyan 3MM szűrőre, amelyet előzőleg 1 mólos trisz.HCl (pH-7) 1,5 mólos NaCl oldatával itattunk be. A szűrőket ezután 20 másodpercre 3· SSC oldatba merítjük, levegőn megszárítjuk és 80 ’C-on 2 órán át hevítjük. Az ilyen módon kezelt szűrőket egy éjszakán át 65 ’C-on lassú rázogatás mellett előmossuk 3· SSC pufferben, amely 0,1% SDS-t (Serva) és 10 mM EDTA-t tartalmaz. A puffért néhányszor cseréljük. Az előmosást akkor tekintjük befejezettnek, ha már nem találhatók a szűrőkön baktérium telepeknek tűnő nyomok sem. Közvetlenül a mosás után a szűrőket előhibridizáljuk a következő összetételű oldatban: 6· SSC, 1· Denhardt oldat, 0,5% SDS, 100 gg/ml denaturált burjú timusz DNS (Sigma), 0,05% nátrium-pirofoszfát. A szűrőket 37 ’C- on 3 órán át inkubáljuk és ezután egy éjszakán át 37 ’C-on y-³²P-ATP-vel jelzett EÍ-ON19 17merrel hibridizáljuk. A hibridizáló oldat tartalma a következő: 6· SSC, 1· Denhardt oldat, 20 gg/ml élesztő tRNS (XX típus, Sigma), 0,05% nátrium-pirofoszfát és polinukleotid kináz révén végén jelzett 17mer EÍ-ON19. A nukleotid kináz reakciót a 3. példában már leírtuk.

-101

HU 202 923 Β

Hibridizálás után a szűrőket 0,05% nátrium- pirofoszfát tartalmú 6· SSC pufferben mossuk a következőképpen: 3*5 percig szobahőmérsékleten, 30 percig 37’C-on, 10 percig 47 ’C-on és 10 percig 53 ’C-on (fakultatív). A szűrőket ezután levegőn megszárítjuk, majd röntgen filmre (X-Omat RP, Kodak) exponáljuk Dupont erősítő szúfő (Dupont intensifying screen) segítségével 24 órán át -70 ’C-on. A filmek előhívása után 48 telepet választottunk ki a további vizsgálatra (dot-blot analízis); ezek a telepek a háttérrel szemben kétségtelenül erősebb jeleket adtak.

b) Dot-blot hibridizáció

A 48 kiválasztott teleppel beoltunk 30 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajból 2 ml-es mintákat. A tenyészeteket egy éjszakán át 37 ’C-on, erős rázás mellett tenyésztjük. A DNS-eket Bimbóim és Doly módszerével [H.C. Bimbóim és J. Doly, Nucleic Acids Rés., 7, 1513-1523 (1979)] izoláljuk. Minden egyes DNS preparátumot feloldunk 67,5 μΐ vízben, hozzáadunk 7,5 μΐ 4 n NaOH-t, majd az anyagot 1 órán át 65 ’C-on vízfürdőben inkubáljuk. A mintákat jégen lehűtjük és egymás után 20 μΐ 1,5 n HCl-t és 195 μ! 2· SSC puffért adunk hozzájuk. Minden minta összmenynyisége 290 μΐ lesz. Bio-Dot készüléken (Bio-Rad) 145 μΐ-es adagokat szűrünk át úgy, hogy a DNS-eket két nitrocellulóz szűrőre fixálhassuk, A szűrés előtt a nitrocellulóz szűrőket 20 percig 2· SSC-ben áztattuk. Szűrés után a szűrőmembránokat levegőn szárítjuk és 2 órán át 80 ’C-on hevítjük. Az egyik szűrőmembránt y-³²P-ATP-vel jelzett EÍ-ON19 17mer oligonukleotiddal, a másikat y-³²P-ATP-vel jelzett EÍ-ON20 17merrel hibridizáljuk. A hibridizáció és a mosás feltételeit az 5.a) példában írtuk le. A szűrőket Kodak X- Ómat RP röntgen filmre exponáljuk 6 órán át -70 ’C-on. Hat pozitiven hibridizáló kiónt kaptunk, ezeket azonosítottuk és az eredeti transzformált sejteket pHL2, pHL8, pHL14-l, pHL21, pHL23, illetve pHL35 jelzéssel láttuk el. A kiválasztott kiónokban lévő cDNS inszertumok nagyságát restrikciós analízissel határoztuk meg. Az illető kiónok DNS-ét, melyet Bimbóim és Doly módszerével izolálunk, BamHI-gyel és Hindm-mal emésztjük, majd egy 0,8%-os agaróz-minigélben 4 órán át (150 V mellett) elválasztást végzünk. A pHL14-l, pHL21 és pHL23 plazmidok 500 bp hosszú inszertumot tartalmaztak. A pHL2 és pHL8 inszertumai 300 bp hosszúak voltak. ^{6 * * * * * * * * * * *}

6. példa

A HLZ-cDNS (HL14-1 klón) szerkezete és DNS szekvenciája

A pozitív kiónok egyikét (5. példa), melyet HL141-nek neveztük el és amely egy körülbelül 500 bp hoszszú inszertumot tartalmaz, részletes analízisre választottuk ki. A HLZ-cDNS szerkezetét a 3.a) álra ábrázolja.

A pHL14-l plazmid DNS-ének 20 pg-ját teljesen megemésztjük BamHI és HindlII restrikciós endonukleázzal, az 5’ végeket y-³²-P-ATP-vel jelezzük (3.b példa), majd egy második endonukleázzal hasítjuk. Az egy helyen jelzett DNS fragmentumokat poliakrilamid- és agaróz-gél elektroforézissel különítjük el. A jelzett DNS fragmentumokat elektroelúcióval izoláljuk és Maxam és Gilbert módszerével [A.M. Maxam és W. Gilbert, Methods Enzymol., 65, 498-560 (1980)] szekvenáljuk. A 3/b árbán a felső nyilak mutatják az ezzel a módszerrel végzett szekvencia analízis irányát és kiterjedését; a csillagocskák a radioaktív helyeket jelzik. A pHL14-l cDNS belső részét Sanger módszerével [F. Sanger, S. Nicklen és A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)] szekvenáltuk. A pHL14-l plazmid HLZ-cDNS-t tartalmazó BamHI-HindlH restrikciós fragmentumát részlegesen emésztjük Mnll restrikciós endonukleázzal, a fragmentumokat Maniatis módszere szerint [T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)] tompa végekkel látjuk el Klenow polimeráz segítségével, majd beklónozzuk a Smal-gyel hasított M13 mp9 vektorba. Mind az M13mal végzett minden DNS-manipulációt, mind a szekvenálást pontosan az Amersham brossurában („Ml3 cloning and sequencing handbook”) (Order No. N.4502) leírt módszerek szerint végeztük. Azokat a restrikciós fragmentumokat, amelyeket ezzel a módszerrel klónoztunk és szekvenáltunk, a 3/b ábra mutatja be (alsó nyilak). A HL 14-1 kiónban csak a fontos restrikciós helyek pozícióit jelöltük meg. Az Mnll, MaelII és HinfI endonukleáz felismerő helyek jelenlétét kísérletileg bizonyítottuk.

A DNS szekvenálás eredménye a 4. ábrán látható. A 20. nukleotidtól felfelé, a HLZ-cDNS szekvenciának nyitott leolvasási szerkezete van. A 62-451. nukleotid pontosan megfelel a humán lizozim aminosav szekvenciájának (5. ábra), melyet a TAA transzlációs terminátor kodon követ. A 20-61. nukleotid 14, főleg hidrofób aminosavat kódolt, s ezek a következők: 5’ De Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val Gin Gly Lys Val és így tovább. E nukleotidok a HLZ vezér- vagy szignál-peptidjének egy részét kódolják, ahogyan ez más szekretált proteineknél hasonlóképpen megtalálható [V.R. Lingappa és G. Blobel, Recent Prog. Horni. Rés., 36, 451-475 (1980)]. A humán prelizozimben a kapcsolódási helyen („splice junction”) lévő aminosavak összetétele nagyon hasonló a tyúk tojásfehérje-lizozim ezen helyének aminosav összetételével (humán prelizozimben: Gin Gly Lys Val; tyúk tojásfehérje-lizozimben: Leu Gly Lys Val; L.S, Weisman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 261, 2306-2313 (1986)].

7. példa

A pHL14-23 plazmid szerkesztése

A HLZ előállításához szolgáló expressziós plazmid szerkesztésénél a HLZ inszertum leghosszabb 5’ végét (HL14-1 klón, pHL14-l plazmid) a HLZ inszertum leghosszabb 3’ végével (HL23 klón, pHL23 plazmid) - 5.b) példa - kombináljuk.

A pHL23-ban a HLZ-DNS 3’ végének a szekvenciája a következő;

-111

HU 202 923 Β

Pstl 10 GACTGCAGTG 50 TAGCTTGTGC 90 TAGAGCATGG	20 CTTTGCTGCA 60 AAAGAGGGTT 100 GTGGCATGGA
130	140
GATGTCCGTC	AGTATGTTCA
170	180
AGAATTTTCC	TTCTTCAGCT
210	220
TAAGGGAGTA	GGTTAAGTGA
250	260
CGGGGGGGGG	GGGGGGGGGG

30	40
AGATAACATC	GCTGATGCTG
70	80
GTCCGTGATC	CACAAGGCAT
110	120
GAAATCGTTG	TCAAAACAGA MaelII
150	160
AGGTTGTGGA	GTGTAACTCC
190	200
CATTTTGTCT	CTCTCACAAT MaelII
230	240
AAGGTCACAT	ACCATTATTT

3’

A Pstl helyig tartó 5’ vég (4. ábra) szekvenciája megfelel a pHL14-l DNS szekvenciájának. ApHL23ból körülbelül 1 pg-ot Pstl-gyel és HindlII-mal emésztünk 36 ’C-on [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl], majd 1%-os agaróz gélben elválasztást végezünk. Az egaróz gélből Dretzen módszerével [G. Dretzen és munkatársai, Anal. Biochem., 112, 295-298 (1981)] egy 260 bp hosszú Pstl-HindlII fragmentumot izolálunk, amely a HLZ strukturális génjének 3’ végét foglalja magába. Ezt a fragmentumot (körülbelül 500 ng) bekapcsoljuk a pHL14-l plazmidba (körülbelül 50 ng), miután a pHL14-l-ből a 190 bp hosszú Pstl/HindlII fragmentumot eltávolítottuk. A DNS bekapcsolása 14 ’C-on, egy éjszakán át, 20 μΐ ligázpufferben [66 mM trisz.HCl (pH-7,6), 6,6 mM MgCh, 10 mM DTT, 1 mM rATP] történik, 1 egység T4 DNS ligáz segítségével, majd e ligázos keverékkel kompetens E.coli HB101 sejteket transzformálunk ismert módszerrel [T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, 220. oldal (1982)].

8. példa

ADHI-promoter által szabályozott expressziós kazetta szerkesztése

a) Az ADHI promoter és az α-faktor vezérszekvencia összekapcsolása (7. ábra)

Kiindulási anyagként a pES103 plazmidot-pUC 18 származék - használjuk, amely az ADHI promotert egy 1,5 kb hosszú BamHI/XhoI fragmentumként tartalmazza. A pES103 helyett az YEpl3-at (ATCC letéti száma 37.115) is használhatjuk azonos módon [G. Ammerer, Methods in Enzymology, 101, 192-201 (1983)]. Az Xhol hely mellett egy Pstl és egy Hindin hely található, így a paF-ből származó α-faktor gén 250 bp hosszú HindlII/PstI fragmentumát, amely az α-faktor vezérszekvencia nagy részét magába foglalja (7. ábra), a pES 103-ban lévő HindlII és Pstl hely közé beépíthetjük ligáz segítségével. Az a- faktor vezérszekvenciával rendelkező HindlII/PstI fragmentum DNS szekvenciáját leközölték [A. Singh és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 11, 4049-4063 (1983)].

A pES103 1 pg-ját és a paF 5 pg-ját 50 mM trisz.HCl-t (pH-8,0), 10 mM MgCh- t és 50 mM NaCl-t tartalmazó oldatban HindlII-mal és Pstl-gyel teljesen megemésztjük és mint fent leírtuk (7. példa), ligázzal összekapcsolunk mintegy 50 ng pESlO3 (HindlII/Pstl) és mintegy 500 ng paF (HindlII/PstI) termé35 két. A kapott plazmiddal E.coli HB101 sejteket transzformálunk. Azt a plazmidot, amely az α-faktor vezérszekvenciát az ADHI promoterhez viszonyítva a megfelelő orientációban tartalmazza, pWS205D-nek neveztük el. Az ADHI promoterrel való kapcsolat he40 lyén az α-faktor vezérszekvenciából hiányzó 25 bp-t az ATG start kodonnal együtt egy foszfotriészter módszerrel [V.A. Efimov és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 10, 6675-6694 (1982)] szintetizált 40mer oligonukleotiddal helyettesítettük. Erre a célra 1 pg pWS205D-t Xhol-gyel és Pstl-gyel 36 ’C-on, 50 mmól trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh és 50 mM NaCl tartalmú oldatban teljesen megemésztünk. Az Xhol és Pstl végekkel rendelkező oligonukleotidot

5’ TCGAGAAAAGAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA 3’ 3’ CmTCTTACTCTAAAGGAAGTTAAAAATG 5’

Xhol Pstl az XhoI/Pstl-gyel hasított pWS205D piazmidba építjük be úgy, hogy az oligonukleotidot 10 pmól/pl koncentrációban vízben vesszük fel, a két DNS szál 5-5 pl-es oldatait egyesítjük, 10 percig 65 'C-on melegítjük és szobahőmérsékletre való lehűtés után ennek az oldatnak 1 pl-jét használjuk fel a ligáz reakcióhoz.

A reagáltatást ligáz pufferben végezzük a 7. példában leírt feltételek mellett.

Az így keletkezett pWS209D plazmid most már tartalmazza a körülbelül 1,5 kb hosszú szakaszt az ADHI promoterrel és a komplett α-faktor vezérszekvenciával együtt, az α-faktor kódoló szakaszának kezdetéig.

-121

HU 202 923 Β

b) Az α-faktor vezérszekvencia és a HLZ gén összekapcsolása (7. ábra)

Minthogy a pWS209D-ben lévő α-faktor vezérszekvencia egy HindlII hellyel végződik és a pHL14-23ban lévő HLZ gént 3’ végén egy Hindin és 5’ végén egy Sáli hely határolja, a pHL14- 23-mat 6 mM trisz.HCl-t (pH-8,0), 6 mM mgCh-t és 150 mM NaCl-t tartalmazó oldatban Sall-gyel 36 ’C-on teljesen megemésztjük és a túllógó végeket Klenow-polimerázzal (25 pl összmennyiségű ligáz pufferben - lásd a 7. példában - 0,5 pg hasított DNS, 100-100 pmól dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 1 egység Klenow- polimeráz; 30 perc; szobahőmérséklet) betöltjük. A SaU-gyel emésztett tompa végű termék tisztítását ezután 1% agaróz gélben végezzük el. Ezután következik a linker beépítése, mely egy szintetikus HindlII linker (New England Biolabs; T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, 316. oldal, 1982); A linkért 1 pg/ml koncentrációban, vízben vesszük fel. A HindlII-linker kinázzal való kezelését 1 órán át 37 ’Con a következő reakcióelegyben végezzük: 1 pl 10· linker-kináz-puffer [0,66 M trisz.HCl (pH-7,9), 10 mM ATP, 10 niM Spermidin, 0,1 M MgCh, 150 mM DTT, 2 mg/ml BSA], 1 pl linker, 6 pl víz és 2 egység T4 DNS kináz. A kinázzal kezelet HindEI-linker ligáz reakciója 14 ’C-on egy éjszakán át a következő elegyben megy végbe: 10 pl lx linker-kináz-pufferben 0,5 pg/ml SaUgyel és Klenow-polimerázzal kezelt pHL14- 23-mat 10 egység T4 DNS ligázzal hozunk össze. A kapott pWS207D plazmiddal, amelyben a HLZ gént most már két HindlII hely határolja, E. coli HB101 sejteket transzformálunk.

Ezután a pWS207D-t Hindffl-mal megemésztjük [50 mM trisz.HCl (pH—8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl; 36 ’C] és most már a HLZ gént, mint HindlII fragmentumot, be tudjuk építeni (ligáz segítségével) a HindlII-mal hasított pWS209D-be (5 pg) az a-faktor verérszekvencia mögé. A ligáz reakcióhoz a HindlII fragmentumokat 1%-os agaróz gélben különítjük el, majd izoláljuk (Dretzen és munkatársai szerint, lásd fent). A pWS207D-ből mintegy 50 ng-ot és a pWS209D-ből mintegy 500 ng-ot használunk fel, a reakcióelegy 20 pl, mely ligáz puffért [66 mM trisz.HCl (pH-7,6), 6,6 mM MgCh, 10 mM DTT, 1 mM rATP] és 1 egység T4 DNS ligázt tartalmaz. A reakció 14 ’C-on megy végbe, egy éjszakán át. A keletkezett plazmidot pWS215D-nek neveztük el, s ez a HLZ gént az α-faktor vezérszekvenciához, illetve az ADHI promoterhez képest a megfelelő irányítottsággal tartalmazza.

c) Egzakt átmenet az α-faktor vezérszekvencia és a

HLZ gén között

A HLZ génnél egzakt N-terminális vég létrehozása azért szükséges, hogy az a proteáz hasítási hely, amely az α-faktor éréséért felelős, pontosan az érett HLZ első aminosavát meghatározó szekvencia előtt helyezkedjék el. Ezért azokat a felesleges nukleotidokat (körülbelül 20 dG-dC pár), amelyek a cDNS szerkesztéséből származtak, valamint a nukleotidoknak azon részét, amely az autentikus HLZ vezérszekvenciát kódolja, el kell távolítani.

A pWS2l5D plazmidot Pstl-gyel teljesen megemésztjük [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl; 36 ’C], majd egy 500 bp hosszú fragmentumot, mely az α-faktor vezérszekvencia nagy részét, valamint a HLZ gén 5’ végét tartalmazza, 1%-os agaróz gélből izoláljuk (Dretzen és munkatársai, lásd fent). A fragmentumot M13 (ampl8-am4) vektorba klónozzuk P. Carter és munkatársai szerint [P. Carter, H. Bedoulle, G. Winter, Nucleic Acids Rés., 13, 4431-4443 (1985)], s ezzel E. coli TG1 törzset (Amersham cég) transzformálunk.

Az A2 rekombináns fágot, amely a megfelelő orientációt mutatta, használjuk kiindulási anyagként az in vitro mutagenezishez. A DNS templátot úgy készítettük, mint a didezoxiszekvenáláshoz készített templátokat (Ml3 cloning and sequencing; kézikönyv; Amersham International, Egyesült Királyság). Foszfotriészter módszerrel [V.A. Efimov és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 10, 6675-6694 (1982)] szintetizáljuk az EBI124 20mer oligonukleotidot, amely az a-faktor vezérszekvencia és a HLZ gén közötti kívánt átmenetet tartalmazza és az EBI234 17mer oligonukleotidot, amely az M13 vektorban lévő ambermutációt korrigálja. Az oligonukleotidokat preparatív poliakrilamidgél elektroforézissel tisztítjuk és printerként használjuk a második szál szintetizálásához. Az oligonukleotidmutagenezist lényegében Zoller és Smith módszerével [M.J. Zoller és M. Smith, DNA, 3, 479-488 (1984)] végezzük: 150 pmól EBI234 szelekciós oligonukleotidot, amelynek szekvenciája

5’ AAGAGTCTGTCCATCAA 3’ és 150 pmól EBI124 mutagén prímért, amelynek szekvenciája

5’ GGATAAAAGAAAGGTCTTTG 3’ foszforilálunk 4 egység T4 polinukleotid kinázzal (New England Biolabs) 20 pl oldatban - az oldat 50 mM trisz.HCl-t (pH-8,0), 10 mM MgCh-t, 1 mM rATP-t és 5 mM DTT-t tartalmaz - 37 C-on 45 percig, majd 10 percig 70 ’C-on hevítjük. A kinázzal kezelt primer minden 7,5 pmólját 70 ’C-on hevítjük. A kinázzal kezelt primer minden 7,5 pmólját 0,5 pmól DNS-templáttal hibridizáljuk 10 pl 10 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh és 50 mM NaCl tartalmú oldatban, amelyet 3 percig 100 ’C-on hevítünk, majd ezután 1 órán keresztül szobahőmérsékletre hűtjük. A denaturált keveréket jégen lehűtjük, s a térfogatát 20 pl-re állítjuk be. Az oldat 10 mM trisz.HCl-t (pH-8,0), 10 mM MgCh-t, 25 mM NaCl-t, 0,25-0,25 mM-t a dNTP-kből (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) és 0,25 mM rATP-t tartalmaz. A prímért a DNS polimeráz I nagy fragmentuma (Biolabs; 1 egység) segítségével 10 egység T4 DNS ligáz (Biolabs) jelenlétében meghosszabítjuk. A reakciót 16 órán át 14 ’C-on folytatjuk le. A keverékből 0,1, 1,5 és 10 pl-es kis alikvot mennyiségekkel kompetens E. coli HB2154 (szuppresszor nélkül) sejteket transzficiálunk, míg a sejtpázsitot HB2155 sejtekkel állítjuk elő [P. Carter és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 13, 4431-4443 (1985)].

-131

HU 202 923 Β

A transzficiált DNS segítségével kapott 222 plakkból 84-et LB- lemezre viszünk át, ahol az inficiált baktériumokból telepek fejlődnek (37 ’C, 16 óra). Egy „nitrocellulóz-blot”-ot készítünk és az EBI124 ³²P-vel jelzett mutagén oligonukleotiddal szűrővizsgálatot végezünk. A nitrocellulóz szűrőt 6« SSPE-vel (0,9 M NaCl, 0,06 M NaH2PO4, 6 mM EDTA) 5 percig szobahőmérsékleten előmossuk, hibridizáló pufferben [6· SSPE, 1% Sarkosyl (Sigma), 100 pg/ml alkalmilag hasított tRNS] 15 percen át 37 °C-on előhibridizáljuk és szobahőmérsékleten (22 °C) 16 órán át hibridizáló pufferben 0,4· 10⁶ cpm/ml próba- anyaggal hibridizáljuk. A próba-anyagot 5’ végén y^P-ATP-vel jelezzük a következőképpen: az EBI124 mutagén primer 30 pmólját 4 egység T4 polinukleotid kinázzal (Biolabs) 20 pl 50 mM trisz.HCl (pH-7,6), 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 1 mM Spermidin, 100 pg/ml BSA és 10 pmól γ-³²ΡATP (5.000 Ci/mmól, Amersham) tartalmú oldatban 37 ’C-on 45 percig foszforiláljuk. A reakcióelegyet ezután Biogel P-6DG (Biorad) géllel, TE pufferben [10 mM trisz.HCl (pH-7,5), 1 mM EDTA] kromatográfiásan tisztífiuk, hogy elválasszuk a be nem épült γ-³²ΡATP-t a ³²P-vel jelzett oligonukleotidoktól.

Hibridizálás után a szűrőket háromszor mossuk 6· SSC oldatban (0,9 M NaCl, 0,09 M nátrium-citrát) szobahőmérsékleten 5 percig és egyszer előmelegített 6· SSC oldatban 37, 47,5 50 és 56 ’C-on 5-5 percig és minden mosás után autoradiográfiás vizsgálatot végzünk. Az 56 ’C-on (Td+2 ’C) végzett autobiográfia egy olyan kiónt- A2/25 - mutatott ki, amely a mutagén oligonukleotiddel erősen hibridizált. A feltehetően mutáns fágot plakk módszerrel tisztítottuk, még egyszer szűrtük, hogy a tiszta mutáns fágot azonosítsuk, s hogy a deléciót igazoljuk, szekvencia analízist végeztünk.

Az A2/25 klón kétszálú DNS-ét Yanisch-Perron és munkatársai szerint [Yanisch-Perron és munkatársai, Gene, 33, 103-119 (1985)] izoláljuk és Pstl-gyel hasítjuk [körülbelül 5 pg 50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh és 50 mM NaCl tartalmú oldatban, 36 ’Con].

A 440 bp hosszú PstI fragmentumot, amely most már az α-faktor vezérszekvencia és az érett HLZ közt a kívánt átmenetet tartalmazza, 1%-os agaróz gélből izoláljuk (Dretzen és munkatársai szerint, lásd fent) és felhasználjuk az alábbiakban közelebbről megvilágított ligáz reakciókban (8.e és 9.d példa).

d) Az ADHII terminátor és a HLZ gén 3’ vége

Az ADHH terminátort [D.R. Beier, Ε.Τ. Young, Natúré, 300, 724-728 (1982); D.W. Russel és munkatársai, J. Bioi. Chem., 258, 2674-2682 (1983)] a pA55 plazmidból olyan módon izoláljuk, hogy a pA55 5 pgját SphI/Xbal-gyel emésztjük [6 mM trisz.HCl

5’ HLZ (pH-7,4), 6 mM MgCh, 150 mM NaCl, 1 mM DTT; 36 ’C] és mint már leírtuk, 1%-os agaróz gélből izoláljuk. Az ADHII DNS szekvenciáját D.W. Russel és munkatársai (lárs fent) írták le. A pUC18 emésztését [J. Vieira és J. Messing, Gene, 19,259-268 (1982); Yanisch-Perron és munkatársai, Gene, 33, 103-119 (1985)] Sphlgyel és Xbal-gyel végezzük a fent megadott feltételek mellett. Ezután az emésztett vektorból körülbelül 50 ng-ot és az ADHII terminátorból körülbelül 500 ng-ot (SphI/Xbai fragmentum) 20 pl reakcióelegyben, ligáz pufferben [66 mM trisz.HCl (pH-7,6), 6,6 mM MgCh, 10 mM DTT, 1 mM rATP] 1 egység T4 DNS ligáz segítségével 14 ’C-on egy éjszakán át - összekapcsolunk. A kapott pWS213 plazmiddal E.coli HB101 sejteket transzformálunk. Minthogy a pHL14-23-ból származó HLZ-DNS a stop kodon után egy nem kódoló szakaszból még további nukleotidokat és egy 20 dC-dG párból álló területet tartalmaz, amelyek a cDNS előállítása során keletkeztek, ezeket eltávolítjuk. Ebből a célból a pHL 14-23-mát Maelü-mal emésztjük [20 mM trisz.HCl (pH-8,0), 6 mM MgCh, 350 mM NaCl, 1 mM DTT; 45 ’C]. A kapott 280 bp hosszú fragmentumot pontosan a stop kodonban hasítjuk és így a HLZ gén 3’ végét tartalmazza.

A túllógó végeket Klenow polimerázzal töltjük be olyan módon, hogy a Maelü-mal hasított DNS körülbelül 0,5 pg-ját 25 pl ligáz-puffer összmennyiségében (lásd fent) 100-100 pM dATP, dTTP, dCTP és dGTPvel és 1 egység Klenow polimerázzal reagáltatjuk 30 percig szobahőmérsékleten. Körülbelül 1 pg pWS213D-t Smal-gyel emésztünk [6 mM trisz.HCl (ph-8,0), 6 mM MgCh, 20 mM KC1] 36 ’C-on és a pHL 14-23 tompa végű MaeDI fragmentumát (körülbelül 500 ng) a pWS213D (körülbelül 50 ng) Smal helyére kötjük be (a feltételeket fent leírtuk).

A keletkezett plazmidot, mely a HLZ gént az ADHII terminátorhoz viszonyítva a megfelelő orientációban tartalmazza, pSW235Dnek neveztük el. Ez a plazmid a HLZ gén 3’ végét tartalmazza a stop kodonig bezárólag és rögtön ezután az ADHII terminátort. A HLZ gén és az ADHII terminátor közt van még egy BamHI és egy Xbal hasítási hely, melynek a pUC18 plazmidból származnak. Minthogy a BamHI hely a további szerkesztéseknél zavar, eltávolítjuk. E célból a pWS235D-t BamHI-gyel hasítjuk 36 ’C-on [6 mM trisz.HCl (pH-8,0), 6 mM MgCh, 150 mM NaCl, 1 mM DTT], a túllógó végeket Klenow polimerázzal betöltjük (lásd fent) és beépítünk egy Saü-linkert a már leírt feltételek mellett (8.b példa). A keletkezett plazmidot pWS257D-nek neveztük és ezzel transzformálunk E.coli HB101 sejteket. A HLZ gén 3’ vége és az ADHII terminátor 5’ vége között lévő összekötő szekvencia szerkezete tehát a következő:

- GTAAC GGG GGATC GGTCGACC GATCC TCTAGA - ADHII-T 3’ CATTG CCC CCTAG CCAGCTGG CTAGG AGATCT 1 2 3 4 5 6

- a HLZ 3’ vége Maelü-mal emésztve és Klenow polimerázzal betöltve, a TAA stop kodonnal együtt 60

- a Smal klónozó hely maradék része (pWS213D)

-141

HU 202 923 Β

- kinyitott és Klenow polimerázzal betöltött BamHI hely

- Sall-linker (New England Biolabs)

- a 3-as pont alatt említett BamHI hely (kinyitott és Klenow polimerázzal betöltött) másik vége

- Xbal hely és az ADHD-tenninátor startja.

e) Az expressziós kazetta szerkesztése

A 8.b példa szerint szerkesztett pWS2l5D plazmidot (körülbelül 1 pg) Pstl-gyel és HindlII-mal emésztjük (a feltételeket lásd a 8.a példában), miáltal a kapott 4,2 kb nagyságú fragmentummal kihasítottuk a teljes HLZ gént, valamint az α-faktor vezérszekvenciának nagy részét. Ugyanilyen feltételek mellett emésztjük Pstl-gyel és HindlII-mal a pWS257D-t és a kapott ADHII-teiminátort és a HLZ gén 3’ végét magában foglaló fragmentumot ligáz segítségével beépítjük a Pstl/HindlII helyre. A ligáz reakciót úgy végezzük mint fent (8.d példa). A kapott pWS218D plazmidban éppen az α-faktor vezérszekvencia kezdeténél van a HLZ gén 3’ vége, amely a stop kodonnal végződik és ehhez kapcsolódik az ADHII terminátor. Az expressziós kazetta elkészítéséhez hiányzik még az afaktor vezérszekvenciának egy nagy része és a HLZ gén 5’ vége, valamint két elem közötti korrekt átmenet. Ennek érdekében a 8.c példa szerint előállított mutagénezett 440 bp hosszú Pstl fragmentumot (körülbelül 500 ng) a pWS218D (körülbelül 50 ng) Pstl hasítási helyére kapcsoljuk be a fent leírt feltételek mellett. A plazmidot, amely a 440 bp hosszú Pstl fragmentumot [a HLZ gén 5’ vége és az α-faktor vezérszekvencia nagy része (3’ vége)] a megfelelő orientációban tartalmazza az ADHI pormoterhez, illetve a HLZ gén 3’ végéhez viszonyítva, pWS290D-nek neveztük el.

Ezzel a pWS290D plazmid az összes leírt elemet a megfelelő sorrendben és egymáshoz viszonyítva a helyes irányítottsággal tartalmazza, valamint a módosított, egzakt átmeneteket az egyes elemek között: 1450 bp ADHI promoter, 260 bp α-faktor vezérszekvencia (olyan szekvenciával végződik, mely egy proteáz hasítási helyet kódol), 390 bp HLZ gén (lizin kodonnal kezdődik, melyet az érett HLZ-t meghatározó szekvencia követ és a HLZ gén stop kodonjával végződik), 330 bp ADHII terminátor.

f) A HLZ kifejeződése élesztőben

A pWS290D expressziós kazetta 5 pg-ját HindlIImal és BamHI-gyel emésztjük 36 *C-on [50 mM trisz.HCL (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl] és beépítjük az ugyancsak HindlH-inal és BamHI-gyel hasított sokmásolatú pJDB207 vektorba (1 pg).

Mind a pWS290D expressziós kazettát (5 ng), mind a pJDB207 sokmásolatú vektort [1 pg; J.D. Beggs: Gene cloning in yeast, R. Williamson: „Genetic Engineering” c. kiadványának 2. kötetének 175-203 oldalain, kiadó: Acadamic Press, London (1981); DSM 3181] HindlII-mal és BamHI-gyel emésztjük 36 ’C-on [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh. 50 mM NaCl]. Az ilyen módon kinyitott pJDB207 sokmásolatú plazmidba (körülbelül 50 ng) beépített az izolált HindüI/BamHI fragmentumot (körülbelül 500 ng) ligáz segítségével (20 pl ligáz-pufferes reakcióelegy 1 egység T4 DNS ligázzal, a feltételeket lásd a 7. példában). Ezzel a plazmiddal - 129/29 - különféle, különböző telepi Saccharomyces cerevisiae élesztő törzseket transzformálunk [J.D. Beggs, Natúré, 275,104109 (1978)]: YPD táptalajban (1% Bacto élesztő kivonat, 2% Bacto pepton, 2% glükóz) egy éjszakán át tenyésztett előtenyészetből beoltunk 50 ml YPD táptalajt úgy, hogy sűrűsége 10⁷ sejt/ml legyen, majd 2 generációt tenyésztünk 28 ’C-on (általában 3 óra). A táptalajt 5.000 ford/perc mellett lecentrifugáljuk, a sejteket 5 ml SED-ben [1 M szorbit, 25 mM EDTA (pH-8,0), 50 mM DTT] reszuszpendáljuk és 30 ’C-on 10 percig lassan rázzuk. A szuszpenziót 1.600 ford/perc mellett lecentrifugáljuk, az üledéket 5 ml SCE-ben [1 M szorbit, 0,1 M trinátrium-citrát (pH=5,8), 10 mM EDTA] reszuszpendáljuk, kiveszünk belőle 100 μΐ-t és 2,9 pl vízben szuszpendáljuk. A szferoplasztok kialakulását 600 nm-en mérjük. Ezután 50 pl Glusulase-zal (pglükuronidáz/szulfatáz márkanév) való kezelés következik lassú rázogatás mellett 28 ‘C-on. Különböző időközönként megint 100 pl szferoplaszt mintákat veszünk, 2,9 ml vízben szuszpendáljuk, s az extinkciót 600 nm-en megmérjük.

Ahogy az extinkció (600 nm-en mért) a kiindulási érték 30%-ára csökken (általában 20-30 perc múlva), a sejteket 1.600 ford/perc mellett lecentrifugáljuk (asztali centrifugán). A szferoplasztokat egyszer mossuk 5 ml CaS oldattal [1 M szorbit, 10 mM CaCh, 10 mM trisz.HCl (pH-7,5)], megint lassan lecentrifugáljuk és 0,5 ml CaS oldatban veszünk fel. A szferoplasztokból alikvot mennyiségeket veszünk ki, 1 pg plazmid DNSt (129/29) adunk hozzá (ha nagyobb mennyiségű a DNS oldat, úgy szorbit koncentrációját 1 M-ra kell beállítani), 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 1 ml PEG-es oldatot [20% (tömeg/térf) PEG 4.000,10 mM CaCh, 10 mM trisz.HCl (pH—7,5); sterilre szűrve] adunk hozzá. A reakciókeveréket 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, 1.600 ford/perc mellett lecentrifugáljuk (asztali centrifugán), az üledéket 150 pl SOS oldatban [1 M szorbit, 33% (térf/térf) YPD, 6,5 mM CaCh, 13,5 pg annak az aminosavnak a steril oldatából, amire nézve a szelekciót végezzük] reszuszpendáljuk és 20 percig 30 ’C-on állnihagyjuk. Ezt a keveréket 3 ml 45 ’C-ra lehűtött „top”-agarban [1 M szabit, 2,5% agar, 0,67% BYNB (Bafto Yeast Nitrogén Base) aminosavak nélkül, 2% glükóz, 1% 100· aminosav keverék] könnyedén összerázzuk, majd agarlemezre (2% agar, 0,67% BYNB, 2% glükóz és annyi az aminosav-keverékből, mint a „top”-agarban) öntjük és 2-4 napig 30 ’C-on tenyésztünk.

A 100*-aminosav-keverék -leu 2-2 g/l-t tartalmaz az alábbi anyagokból: adenin-szulfát, aiginin, uracil, asparagin, glutamin, hisztidin, metionin, lizin, tirozin, fenil-alanin, valin, treonin, triptofán. A transzformált

S.cerevisiae élesztő törzseket SC -leu táptalajon (0,67% BYNB, 5% glükóz, 1% 100·- aminosav-keverék -leu) tenyésztjük 30 ’C-on.

-151

HU 202 923 Β

Az alábbi táblázatban a lizozim kifejeződés eredményeit mutatjuk be.

Transzformált sajt	Törzs	Lizozim mg/ml tenyészet
1/29	WS21-5	0,4
1/34	WS21-5	0,31
2/30	WS21-3	0,89
2/31	WS21-3	0,42
6/30	WS21-1	1,0
6/31	WS21-1	1,2

WS21-1 - aleu2 his3 trpl pep4 WS21-3 - aleu2 his3 ura3 pep4 WS21-5 - aleu2 his3 trpl argl pep4

9. példa α-faktor promoter által szabályozott expressziós kazetta szerkesztése

Különböző közlemények [G.A. Bittér és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330-5334 (1984); A.J. Brake és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4642-4646 (1984)] írják le, hogyan lehet beépíteni heterológ géneket az α-faktor gén Hindin és Sáli helye közé. Itt az EcoRI és a Hindül hely közötti szekvencia mint promoter és a Sáli és EcoRI közötti szekvencia mint transzkripciós terminátor működik.

a) Az α-faktomak egy megfelelő vektorba való klónozása

Az α-faktor gént a pUC13-ból származó paF-ból (5 ng), mint EcoRI-fragmentumot izoláljuk [100 mM trisz.HCl (pH-7,5), 5 mM MgCh, 50 mM NaCl, 1 mM DTT; 36 ’C] és a V2 vektorba klónozzuk be. A V2 vektort a következőképen szerkesztjük meg: a pUC18-at (Pharmacia cég) Smal- gyei és HindlII-mal hasítjuk, és végeket a már leírt módon Klenow- polimerázzal kitöltjük és a pUC18 megmaradt részét összekapcsoljuk ligáz segítségével úgy, hogy a keletkező V2 vektorban az eredetileg tíz klónozó helyből már csak három (EcoRI, SstI, KpnI) maradjon. így a keletkezett V2 vektor többé már nem tartalmaz HindHI és SaU helyeket, tehát e két enzim számára már csak az α-faktor génben vannak hasítási helyek. A V2 vektort (1 pg) EcoRI-gyel emésztjük, majd az EcoRI-gyel emésztett paF 500 ng-ját az EcoRI- gyei emésztett V2 50 ng-jával kapcsoljuk össze (a ligáz reakciót úgy végezzük, amint azt a 7. példában leírtuk). A keletkezett és E.coli HB101 sejtbe transzformált pWS203D plazmidot a további szerkesztéseknél használjuk fel (9.b és c példa). A pWS230D plazmid Pstl/BglII fragmentuma (14.a ábra) tartalmazza körülbelül 900 bp hosszú promotert. A mellette lévő PstI hely mintegy 25 bpal a transzlatált területen belül fekszik. A négy HindHI hely szomszédságában lévő PstI hely előtt 25 bp-al és tovább felfelé találhatók az α-faktor gén transzkripci16 ójához szükséges DNS szakaszok. Az α-faktor vezérszekvenciája e második PstI helytől (ATG) körülbelül 25 bp- al balra kezdődik és meglehetősen pontosan a négy Hindül hely közül az elsőnél fejeződik be. Hoszszúsága körülbelül 280 bp-t tesz ki. A terminátor a Sáli és EcoRI hely között van.

b) A HLZ gén és az α-faktor gén összekapcsolása

Hogy a HLZ gént a megfelelő irányítottsággal építhessük be az α-faktor-promoterhez, iüetve -terminátorhoz, a pHL14-23-at határoló Hindül és Sáli restrikciós hasítási helyeket ki kell cserélni. Ezért körülbelül 5 pg pHLK14-23-at Sall-gyel [6 mM trisz.HCl (pH=8,0), 6 mM MgCh, 150 mM NaCl; 36 ’C], illene Hindül-mal [50 mM trisz-HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl; 36 ’C] hasítunk, a túllógó részeket egyenként kitöltjük Klenow-polimeráz segítségével (0,5 pg hasított DNS 25 pl reakciótérfogatban, mint a 8.b példában), majd a reakcióelegyet 1%-os agaróz gélben tisztítjuk. Egy HindlII-linkert (New England Biolabs) kötünk be a Sáli helyre (pWS207D) és egy Sall-linkert (New England Biolabs) kötünk be a HindlII-helyre (pWS206D) ligáz segítségével (a DNS fragmentumokból körülbelül 0,5 pg/pl-t veszünk) úgy, ahogy a 8.b példában leírtuk, majd ezen új plazmidokkal E.coü HB101 sejteket transzformálunk. A kapott pWS206D és pWS207D plazmidot (egyenként körülbelül 0,5 pg) EcoRI-gyel és Pstl-gvel hasítjuk [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl; 36 ’C] és a fent leírt ligáz reakció feltételei mellett (7. példa) összekapcsoljuk, miáltal a pWS208D plazmidhoz jutunk.

A HLZ gén 3’ végével itt is, mint ahogy a 8.d példában leírtuk, az a probléma, hogy a stop kodon után további nukleotidok vannak jelen. Emiatt a HLZ gén 3’ végét a stop kodonig megrövidítjük a következőképpen: a pWS257D plazmid (a 8.d példában leírt szerkezet) tartalmazza a HLZ gén 3’ végét a stop kodonig, ezt követően egy SaU helyet és az ADHü terminátort, aminek egyébként ebben a szerkezetben nincs jelentősége. A pWSW208D és a pWS257D plazmidot Sall-gyel és Pstl-gyel teljesen megemésztjük [PstI- gyei 1 óra hosszat emésztünk 36 ’C-on, 50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl tartalmú oldatban, majd a NaCl koncentrációt 150 mM-ra növeljük és SaU-gyel emésztünk tovább], majd 1%-os agarózban tisztítjuk és izoláljuk (Dretzen és munkatársai; lásd fentebb). A pWS257D-ből származó Sa11/PstI fragmentum, amely tartalmazza a HLZ gén 3’ végét, pótolja a pWS208D Sall/PstI fragmentumát, amikor a pWS257D (körülbelül 500 ng) fragmentumát beépítjük a pWS208D (körülbelül 50 ng) Sall/PstI helyére ligáz segítségével úgy, mint fent. A keletkezett pWS212D elnevezésű plazmid (13. ábra) most már a teljes HLZ gént HindlII/Sall fragmentumként tartalmazza, melyben a HLZ gén 3’ vége a stop kodonnal végződik. A pWS212D és a pWS230D (9.a példa) plazmidot Hindül-mal és SaU-gyel teljesen megemésztjük [Hindül- mai 1 óra hosszat emésztünk 36’C-on 50 mmól trisz.HCl (pH-8,0), 10 mmól

-161

HU 202 923 Β

MgCh, és 50 mmól NaCl tartalmú oldatban, majd a NaCl koncentrációt 150 mmól-ra emeljük és hozzáadjuk a Sall-et], így a pWS212D-ból kihasított HLZ gént, mint Hindül/Sall fragmentumot (körülbelül 500 ng, amelyet 1%-os agaróz gélből izolálunk a fent leírtak szerint) a HindlII/Sall-gyel kinyitott vektorba (körülbelül 50 ng) építhetjük be (a ligáz reakciót a 7. példában írtuk le). Az így kapott pWS231D plazmádban a HLZ gén most a megfelelő orientációban helyezkedik el az a- faktor promoterhez és terminátorhoz viszonyítva.

c) Egy PstI hely eltávolítása az α-faktor génből

Az α-faktor génben két PstI hely van. Az a hely, amelyik nem a kódoló szakaszon belül helyezkedik el, a további szerkesztést nagyon akadályozza és így a következő eljárással távolítjuk el: a pWS203D plazmidot (szerkesztését lásd a 9.a példában) Pstl-gyel részlegesen hasítjuk úgy, hogy 10 pg pWS203D-t emésztünk 36 “C-on 10 percig 10 egység Pstl-gyel 50 mM trisz.HCl-t (pH-8,0), 10 mM MgCh-t és 50 mM NaCl-t tartalmazó oldatban. Azokat a fragmentumokat izoláljuk 1%-os agaróz gélből, amelyekben pontosan egy hasítás jött létre (a 14.a ábrán a B és C fragmentum).

A pWS230-ből így kapott linearizált DNS-ek 3 ’-túllógó végeinek elemésztésére mung bean nukleázt (arany paszuly csíra nukleáz) használunk úgy, hogy a DNS 1 pg-ját 13 pl vízben vesszük fel, majd hozzáadunk 2 pl 10 mmólos ZnCh-t, 1 pl 4 mólos NaCl-t, 2 pl 0,3 mólos nátrium-acetátot (pH-4,75) és 2 pl mung bean nukleázt (300 egység, Pharmacia). Ezt az elegyet 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ezután közvetlenül 1%-os agaróz gélre visszük fel, majd a fragmentumokat a gélből izoláljuk (Dretzen és munkatársai, lásd fent). Ezután következik a B és C fragmentum összekapcsolása (a feltételek azonosak a 7. példában leírtakkal), amikor is azok a PstI helyek, amelyek a részleges emésztésnél elhasadtak, megsemmisülnek és amelyek nem hasadtak el, megmaradnak. Ilyen módon egy olyan plazmidot izoláltunk, amely az illető PstI helyet már nem tartalmazta, de a másik megmaradt (C’). Ezt a plazmidot (C’), valamint a pWS231D-t is Pstl-gyel és BglII-vel teljesen megemésztjük [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl; 36 ’C]. A C’-ből (körülbelül 50 ng) izolált C2-fragmentumot (850 bp) a Pstl/BglH- vei emésztett pWS231D plazmidba (körülbelül 50 ng) építjük be (a ligáz reakciót a 7. példában írtuk le), s így kapjuk a pWS294D plazmidot. Ez a plazmid most egy PstI hellyel rendelkező α-faktor gént tartalmaz, amelybe a HLZ gén 3’ vége a megfelelő orientációban van beépítve.

d) Az expressziós kazetta megszerkesztése

A pWS294D plazmid tartalmazza az α-faktor promotert és az α-faktor pepiid kezdetét a PstI hasítási helyig terjedően (körülbelül 20 bp hosszú vezér-peptid), valamint - ehhez kapcsolódva - a HLZ gén 3’ végét a PstI helytől a stop kodonig terjedően. A teljes expressziós kazettából hiányzik még az α-faktor vezérszekvencia 3’ vége, a HLZ gén 5’ vége, valamint az átmenet e két elem között. A pWS249D plazmidot (körülbelül 1 pg) Pstl-gyel teljesen megemésztjük [50 mM trisz.HCl (pH-8,0), 10 mM MgCh, 50 mM NaCl; 36 ’C] és az A2/25 plazmidból (8.c példa) való mutagén 440 bp hosszú PstI fragmentumot (körülbelül 500 ng) a 8.e példa szerint beépítjük ligáz segítségével a pWS294 PstI helyére.

A kapott pWS296D elnevezésű plazmid tartalmazza azt az expressziós kazettát, amely az α-faktor gén 900 bp hosszú promoter szekvenciájából, a 260 bp hosszú a- faktor vezérszekvenciából (azonos a 8.e) példában leírt hosszúságú szekvenciával) és a 290 bp hosszú α-faktor terminátorból áll.

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás humán lizozimot (HLZ) kódoló komplementer DNS (cDNS) előállítására, azzal jellemezve, hogy egy humán sejt izolált össz-DNS-éből elkülönítjük a poliA⁺mRNS-t, az így nyert izolátumból cDNS-t készítünk, a kapott kettős szálú cDNS klónozásával cDNS géntárat szerkesztünk, a kapott cDNS géntárat alkalmas oligonukleotidok segítségével végzett hibridizálással szűrjük, és a teljes humán lizozimot kódoló, adott esetben vezérszekvenciával ellátott cDNS-t izoláljuk, és kívánt esetben 5’-végéhez egy startkodont és 3’-végéhez egy stopkodont kapcsolunk.
2. 2 Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a

   5’ATTGTTCTGGGGCTTGTCCTCCTTTCrGTTACGGTTCAAGGCAAGGTCTTTGAAA

   GGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATGGCTACAGGGGAATCA

   GCCTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTACAACACACGAGCTA

   CAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATATTTCAGATCAATAGCC

   GCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCCT

   GCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCAAAGAGGGTTG

   TCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGAGAAATCGTTGTCAAAACA

   GAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTGTAACTCCAGAATITrCCTTCTT

   CAGCTCATTTTGTCTCTCTCACAATTAAGGGAGTAGGTTAAGTGAAAGGTCACATAC

   CATTATTTC és

   -171

   HU 202 923 Β

   5’AAGGTCTTTGAAAGGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATG

   GCTACAGGGGAATCAGCCTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTT

   ACAACACACGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGA’ITATGGGATAT

   ITCAGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATG

   CCTGTCAnTATCCTGCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTT

   GTGCAAAGAGGGTTGTCCGTGATCCACAAGGCAITAGAGCATGGGTGGCATGGAGAA

   ATCGTTGTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTG.

   nukleotidszekvenciájú, humán lizozimot kódoló cDNS-t, vagy humán lizozimot kódoló allél-változatait állítjuk elő.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypontban megadott szekvenciájú cDNSek egyikével több, mint 85% homológiát igénylő szigorúan meghatározott körülmények között hibridizáló és humán lizozimet kódoló, adott esetben vezérszekvenciával ellátott cDNS-t állítunk elő.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szűrést az
5. 5 ’ CC ^TC £τΓ ACC A £tA 3 ’ és az

   A ⁵’ ^A G G^CACATCCA G¹^ C°^{C 3}’

   G képletű oligonukleotidok segítségével végzett hibri10 dizálással hajtjuk végre.

   5. Eljárás humán lizozim aktív formában való előállítására transzformált élesztősejtben történő kifejezéssel, azzal jellemezve, hogy egy promoterből, transzlációs startkodonból, vezérszekvenciából, az 1-4. igénypontok szerint előállított cDNS- ek valamelyikéből és terminátorból álló expressziós plazmidot szerkesztünk, amellyel egy élesztősejtet transzformálunk, és a transzformált sejteket alkalmas táptalajban tenyésztjük, végül a táptalajból kinyerjük a képződött humán lizozimot.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ADHI- promoterből, ATP-startkodonból, a-faktor vezérszekvenciából, az 1-4. igénypontok szerint előállított cDNS- ek egyikéből és α-faktor terminátorból szerkesztünk expressziós plazmidot.
7. 7. Az 5. és 6. igénypontok szerinti eljárás az

   Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val Gin Gly Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Alá Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly Met Asp Gly iyr Arg Gly Ile Ser Leu Alá Asn Trp Met Cys Leu Alá Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Alá Thr Asn Tyr Asn Alá Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gin Ile Asn Ser ARg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Alá Val Asn Alá Cys His Leu Ser Cys Ser Alá Leu Leu Gin Asp Asn Ile Alá Asp Alá Val Alá Cys Alá Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gin Gly Ile Arg Alá Trp Val Alá Trp Arg Asn Arg Cys Gin Asn Arg Asp Val Arg Gin iy_r Val Gin Gly Cys Gly Val 40

   aminosavszekvenciájú humán lizozim előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti aminosavszekvenciát kódoló cDNS-t használunk az expressziós plazmid szerkesztéséhez.
8. 8. Eljárás humán lizozimot vagy annak egy alléi változatát kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns klónozó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 14. igénypontok szerint előállított cDNS-ek valamelyikét egy replikálható bakteriális plazmidba építjük be.
9. 9. Eljárás aktív humán lizozim transzformált élesztősejtben való kifejezésére képes expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított cDNS-ek egyikét promoterrel, transzlációs startszignállal, vezérszekvenciával és terminátorral összekapcsolva rekombináns alkotórészként egy élesztővektorba visszük be.
10. 10. Eljárás az 5-7. igénypontok bármelyike szerinti előállított aktív humán lizozim szintetizálására képes gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy élesztősejteket egy 9. igénypont szerint előállítót expressziós vektorral transzformálunk.