JP3021826B2 - 変異型黄麹菌アルカリプロテアーゼ - Google Patents
変異型黄麹菌アルカリプロテアーゼInfo
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- JP3021826B2 JP3021826B2 JP22748491A JP22748491A JP3021826B2 JP 3021826 B2 JP3021826 B2 JP 3021826B2 JP 22748491 A JP22748491 A JP 22748491A JP 22748491 A JP22748491 A JP 22748491A JP 3021826 B2 JP3021826 B2 JP 3021826B2
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- Japan
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- alkaline protease
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- aspergillus oryzae
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は蛋白質分解酵素として有
用な黄麹菌由来のアルカリプロテアーゼの変異体に関す
る。
用な黄麹菌由来のアルカリプロテアーゼの変異体に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】従来、黄麹菌の１種であるアスペルギル
ス・オリゼー（Aspergillus oryzae）由来のアルカリプ
ロテアーゼ遺伝子の構造については、全く未知であり、
また、該遺伝子の単離すらされていないのが実情であ
る。アルカリプロテアーゼは、蛋白質又はその部分加水
分解物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解
酵素であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられて
いる。
ス・オリゼー（Aspergillus oryzae）由来のアルカリプ
ロテアーゼ遺伝子の構造については、全く未知であり、
また、該遺伝子の単離すらされていないのが実情であ
る。アルカリプロテアーゼは、蛋白質又はその部分加水
分解物に作用して、ペプタイド結合を分解する加水分解
酵素であって、医薬、飲食品、洗剤等広範に用いられて
いる。
【０００３】そこで、本発明者等は、先にアスペルギル
ス・オリゼー由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子につい
て種々検討した結果、アスペルギルス・オリゼー由来の
アルカリプロテアーゼ遺伝子及びプレプロ型アルカリプ
ロテアーゼ遺伝子を初めて単離及び構造決定することに
成功し、特許出願を行った（特開平2-2374号及び特開平
2-131580号 特許出願明細書、配列表の配列番号１参
照）。
ス・オリゼー由来のアルカリプロテアーゼ遺伝子につい
て種々検討した結果、アスペルギルス・オリゼー由来の
アルカリプロテアーゼ遺伝子及びプレプロ型アルカリプ
ロテアーゼ遺伝子を初めて単離及び構造決定することに
成功し、特許出願を行った（特開平2-2374号及び特開平
2-131580号 特許出願明細書、配列表の配列番号１参
照）。
【０００４】さて、アルカリプロテアーゼをはじめ有用
酵素を有効な触媒として生体外で利用するには、温度、
pＨ、酸素、溶媒、圧力などに対する蛋白質の安定性を
高める必要がある。特に温度、即ち熱安定性を高める試
みが遺伝子の部位特異変異技術を用いたいわゆるプロテ
インエンジニアリングにより盛んに行われている。例え
ば、野生型サチライシンＥ酵素中の１〜２個のアミノ酸
を各々他のアミノ酸に置換することにより、野生型に比
べて熱安定性の向上した変異型サチライシンＥを調製で
きることが報告されている（特開平1-137972号）。
酵素を有効な触媒として生体外で利用するには、温度、
pＨ、酸素、溶媒、圧力などに対する蛋白質の安定性を
高める必要がある。特に温度、即ち熱安定性を高める試
みが遺伝子の部位特異変異技術を用いたいわゆるプロテ
インエンジニアリングにより盛んに行われている。例え
ば、野生型サチライシンＥ酵素中の１〜２個のアミノ酸
を各々他のアミノ酸に置換することにより、野生型に比
べて熱安定性の向上した変異型サチライシンＥを調製で
きることが報告されている（特開平1-137972号）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の課題
は、まず、野生型の黄麹菌アルカリプロテアーゼに比べ
熱安定性等の性質において優れた変異型のアルカリプロ
テアーゼ及び該酵素を製造するための新たな方法を提供
することにあり、併せて部位特異的変異を導入した該変
異型アルカリプロテアーゼの遺伝子、該遺伝子により組
換えられたプラスミド及び該プラスミドを有する形質転
換体を提供することにある。
は、まず、野生型の黄麹菌アルカリプロテアーゼに比べ
熱安定性等の性質において優れた変異型のアルカリプロ
テアーゼ及び該酵素を製造するための新たな方法を提供
することにあり、併せて部位特異的変異を導入した該変
異型アルカリプロテアーゼの遺伝子、該遺伝子により組
換えられたプラスミド及び該プラスミドを有する形質転
換体を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、鋭意研究
の結果、野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼ中の４個の
アミノ酸を各々システインに置換することにより、野生
型に比べて熱安定性（耐熱性）の向上した変異型黄麹菌
アルカリプロテアーゼを調製できることを見出し、本発
明を完成するに至ったものである。
の結果、野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼ中の４個の
アミノ酸を各々システインに置換することにより、野生
型に比べて熱安定性（耐熱性）の向上した変異型黄麹菌
アルカリプロテアーゼを調製できることを見出し、本発
明を完成するに至ったものである。
【０００７】例えば、本発明の変異型黄麹菌アルカリプ
ロテアーゼのうち野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼの
Ｎ末端より69番目、101 番目、169番目及び200番目のア
ミノ酸を各々システインに置換したものは、 (1) 分子量 25000〜30000程度。 (2) 熱安定性（耐熱性）を示す。
ロテアーゼのうち野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼの
Ｎ末端より69番目、101 番目、169番目及び200番目のア
ミノ酸を各々システインに置換したものは、 (1) 分子量 25000〜30000程度。 (2) 熱安定性（耐熱性）を示す。
【０００８】具体的には50℃、１時間で酵素活性が90％
以上残存する。 (3) 酵素活性の至適温度が野生型に比べ＋５℃以上上
昇する。 (4) 導入したシステインのうち、69番目と101 番目の
システイン間、および169番目と200 番目のシステイン
間で各々ジスルフィド結合を形成。 (5) 酵素活性は野生型と同程度。 等の性質を示す。
以上残存する。 (3) 酵素活性の至適温度が野生型に比べ＋５℃以上上
昇する。 (4) 導入したシステインのうち、69番目と101 番目の
システイン間、および169番目と200 番目のシステイン
間で各々ジスルフィド結合を形成。 (5) 酵素活性は野生型と同程度。 等の性質を示す。
【０００９】この変異型黄麹菌アルカリプロテアーゼの
調製方法としては、野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼ
をコードする遺伝子から遺伝子工学的手法を用いて行わ
れる。すなわち、本発明は以下(1)〜(7)の特徴を有する
ものである。 (1) 野生型黄麹アルカリプロテアーゼ中の４個のアミ
ノ酸を各々システインに置換することにより分子内に２
個のジスルフィド結合を形成した変異型黄麹菌アルカリ
プロテアーゼ。 (2) 野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼのＮ末端より6
9番目のセリン、101 番目 のグリシン、169番目のグリ
シンおよび200番目のバリンを各々システインに置換し
たものである上記(1)記載の変異型黄麹菌アルカリプロ
テアーゼ。 (3) 上記(1)又は(2)記載の変異型黄麹菌アルカリプロ
テアーゼをコードする遺伝子 。 (4) 上記(3)記載の遺伝子を導入した組換えプラスミ
ド。 (5) 上記(4)記載の組換えプラスミドにより形質転換さ
れた形質転換体。 (6) (ａ) 上記(3)記載の遺伝子を調製する。(ｂ) 上
記(3)記載の遺伝子をプラスミドに導入して組換えプラ
スミドを調製する。(ｃ) (ｂ)の組換えプラスミドを用
いて宿主を形質転換して形質転換体を調製する。およ
び、(ｄ) (ｃ)の形質転換体を培養して上記(1)又は(2)
記載の変異型黄麹菌アルカリプロテ アーゼを産生させ
る。 以上の(ａ)〜(ｄ)の工程からなる変異型黄麹菌アルカリ
プロテアーゼの製造方法。
調製方法としては、野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼ
をコードする遺伝子から遺伝子工学的手法を用いて行わ
れる。すなわち、本発明は以下(1)〜(7)の特徴を有する
ものである。 (1) 野生型黄麹アルカリプロテアーゼ中の４個のアミ
ノ酸を各々システインに置換することにより分子内に２
個のジスルフィド結合を形成した変異型黄麹菌アルカリ
プロテアーゼ。 (2) 野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼのＮ末端より6
9番目のセリン、101 番目 のグリシン、169番目のグリ
シンおよび200番目のバリンを各々システインに置換し
たものである上記(1)記載の変異型黄麹菌アルカリプロ
テアーゼ。 (3) 上記(1)又は(2)記載の変異型黄麹菌アルカリプロ
テアーゼをコードする遺伝子 。 (4) 上記(3)記載の遺伝子を導入した組換えプラスミ
ド。 (5) 上記(4)記載の組換えプラスミドにより形質転換さ
れた形質転換体。 (6) (ａ) 上記(3)記載の遺伝子を調製する。(ｂ) 上
記(3)記載の遺伝子をプラスミドに導入して組換えプラ
スミドを調製する。(ｃ) (ｂ)の組換えプラスミドを用
いて宿主を形質転換して形質転換体を調製する。およ
び、(ｄ) (ｃ)の形質転換体を培養して上記(1)又は(2)
記載の変異型黄麹菌アルカリプロテ アーゼを産生させ
る。 以上の(ａ)〜(ｄ)の工程からなる変異型黄麹菌アルカリ
プロテアーゼの製造方法。
【００１０】以下、本発明を更に詳述する。本発明の変
異型黄麹菌アルカリプロテアーゼは４個のアミノ酸を各
々システインに置換することにより分子内に２個のジス
ルフィド結合を新たに形成したものであり、具体的に
は、 (1) 野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼのＮ末端より1
69番目のグリシンおよび200番目のバリンを各々システ
インに置換することにより第１のジスルフィド結合を形
成させ、さらに野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼのＮ
末端より69番目のセリンおよび 101番目のグリシンを各
々システインに置換することにより、第２のジスルフィ
ド結合を形成させたもの。 (2) 野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼのＮ末端より3
6番目のチロシンおよび1 25番目のアルギニンを各々シ
ステインに置換することにより第１のジスルフィ ド結
合を形成させ、さらに野生型黄麹菌アルカリプロテアー
ゼのＮ末端より1 80番目のイソロイシンおよび254番目
のスレオニンあるいは 253番目のバリンを各々システイ
ンに置換することによる第２のジスルフィド結合を形成
させたもの。
異型黄麹菌アルカリプロテアーゼは４個のアミノ酸を各
々システインに置換することにより分子内に２個のジス
ルフィド結合を新たに形成したものであり、具体的に
は、 (1) 野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼのＮ末端より1
69番目のグリシンおよび200番目のバリンを各々システ
インに置換することにより第１のジスルフィド結合を形
成させ、さらに野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼのＮ
末端より69番目のセリンおよび 101番目のグリシンを各
々システインに置換することにより、第２のジスルフィ
ド結合を形成させたもの。 (2) 野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼのＮ末端より3
6番目のチロシンおよび1 25番目のアルギニンを各々シ
ステインに置換することにより第１のジスルフィ ド結
合を形成させ、さらに野生型黄麹菌アルカリプロテアー
ゼのＮ末端より1 80番目のイソロイシンおよび254番目
のスレオニンあるいは 253番目のバリンを各々システイ
ンに置換することによる第２のジスルフィド結合を形成
させたもの。
【００１１】これには、まず、部異特異的変異法を用い
て野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼをコードする遺伝
子の変異目的部位の塩基配列を、システインに対応する
塩基配列に変更して変異型の黄麹菌アルカリプロテアー
ゼの遺伝子を調製する。この部異特異的変異法は、原型
の遺伝子ＤＮＡが組み込まれたプラスミドの一本鎖ＤＮ
Ａを鋳型にして、変異させようとする塩基配列を含む合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして変異型の遺伝
子を合成するものである(Sambrook etal., Molecular
cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laborator
y, Cold Spring Harbor, NewYork (1989) 。
て野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼをコードする遺伝
子の変異目的部位の塩基配列を、システインに対応する
塩基配列に変更して変異型の黄麹菌アルカリプロテアー
ゼの遺伝子を調製する。この部異特異的変異法は、原型
の遺伝子ＤＮＡが組み込まれたプラスミドの一本鎖ＤＮ
Ａを鋳型にして、変異させようとする塩基配列を含む合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして変異型の遺伝
子を合成するものである(Sambrook etal., Molecular
cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laborator
y, Cold Spring Harbor, NewYork (1989) 。
【００１２】本発明においては、野生型の黄麹菌アルカ
リプロテアーゼ遺伝子の一本鎖ＤＮＡとアニーリング可
能であるが、置換しようとする目的部位に対応する塩基
配列がシステインをコードするものである点で相異する
オリゴヌクレオチドを化学合成し、この合成オリゴヌク
レオチドをプライマーとし、かつ該野生型の黄麹菌アル
カリプロテアーゼ遺伝子が組み込まれたプラスミドの一
本鎖ＤＮＡを鋳型として変異型の黄麹菌アルカリプロテ
アーゼ遺伝子を合成するものである。
リプロテアーゼ遺伝子の一本鎖ＤＮＡとアニーリング可
能であるが、置換しようとする目的部位に対応する塩基
配列がシステインをコードするものである点で相異する
オリゴヌクレオチドを化学合成し、この合成オリゴヌク
レオチドをプライマーとし、かつ該野生型の黄麹菌アル
カリプロテアーゼ遺伝子が組み込まれたプラスミドの一
本鎖ＤＮＡを鋳型として変異型の黄麹菌アルカリプロテ
アーゼ遺伝子を合成するものである。
【００１３】次いで、変異型黄麹菌アルカリプロテアー
ゼをコードする遺伝子は、発現ベクター系に挿入して、
発現用宿主・ベクター系を構築する。本発明において用
いられる宿主としては、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌
等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではな
い。また発現用ベクターとしては、これら宿主細胞とコ
ンパーチブルな種から由来するレプリコンと制御配列を
有するプラスミドベクターが用いられ、該プラスミドベ
クターは一般に複製部位を有しており、又形質転換細胞
中で表現型の選択が可能となるマーカーの配列を有して
いる。
ゼをコードする遺伝子は、発現ベクター系に挿入して、
発現用宿主・ベクター系を構築する。本発明において用
いられる宿主としては、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌
等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではな
い。また発現用ベクターとしては、これら宿主細胞とコ
ンパーチブルな種から由来するレプリコンと制御配列を
有するプラスミドベクターが用いられ、該プラスミドベ
クターは一般に複製部位を有しており、又形質転換細胞
中で表現型の選択が可能となるマーカーの配列を有して
いる。
【００１４】例えば大腸菌は通常 pBR322 を用いて形質
転換されるが、このプラスミドは大腸菌株由来である
〔Bolivar et al. Gene, ２, 95 (1977)〕。 pBR322 は
アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を
持っているので形質転換した細胞を検出する簡単な方法
を与える。pBR322プラスミドや、他の微生物プラスミド
は微生物体が利用できて、それが支配する蛋白質を発現
させることが可能なプロモーターを有するか、あるいは
プロモーター配列を挿入してある。組み換えＤＮＡの構
成に通常使われるプロモーターとしてはβ−ラクタマー
ゼ（ペニシリナーゼ）やラクトースプロモーター系〔Ch
ang et al. Nature, 275, 615 (1978)；Itakura et al.
Science, 198, 1056 (1977)；Goeddel et al. Nature,
281,544(1979)〕あるいはトリプトファン(trp）プロモ
ーター系〔Goeddel et al. Nucl.Acids Res., ８, 4057
(1979)；ヨーロッパ特許出願公開第0036776号明細書〕
がある。これらは最も一般的に使われているが、他の微
生物プロモーターも発見され、使用されている。それら
の塩基配列の詳細も発表されており研究者はそれらをプ
ラスミドベクターに機能的に導入することが可能である
〔Siebenlist et al. Cell, 20, 269 (1980)〕。
転換されるが、このプラスミドは大腸菌株由来である
〔Bolivar et al. Gene, ２, 95 (1977)〕。 pBR322 は
アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を
持っているので形質転換した細胞を検出する簡単な方法
を与える。pBR322プラスミドや、他の微生物プラスミド
は微生物体が利用できて、それが支配する蛋白質を発現
させることが可能なプロモーターを有するか、あるいは
プロモーター配列を挿入してある。組み換えＤＮＡの構
成に通常使われるプロモーターとしてはβ−ラクタマー
ゼ（ペニシリナーゼ）やラクトースプロモーター系〔Ch
ang et al. Nature, 275, 615 (1978)；Itakura et al.
Science, 198, 1056 (1977)；Goeddel et al. Nature,
281,544(1979)〕あるいはトリプトファン(trp）プロモ
ーター系〔Goeddel et al. Nucl.Acids Res., ８, 4057
(1979)；ヨーロッパ特許出願公開第0036776号明細書〕
がある。これらは最も一般的に使われているが、他の微
生物プロモーターも発見され、使用されている。それら
の塩基配列の詳細も発表されており研究者はそれらをプ
ラスミドベクターに機能的に導入することが可能である
〔Siebenlist et al. Cell, 20, 269 (1980)〕。
【００１５】そして本発明においては、これらプロモー
ターを含むプラスミドベクターあるいは大腸菌に対し通
常用いられているプラスミドベクター等を適宜使用すれ
ばよく、宿主となる大腸菌としては大腸菌HB101株、C60
0株、W3110株などを挙げることができる。本発明におけ
る宿主酵母としては例えば、サッカロミセス・セルビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）のNA87-11A株、 GRF18
株、AH22株等が使用できる。
ターを含むプラスミドベクターあるいは大腸菌に対し通
常用いられているプラスミドベクター等を適宜使用すれ
ばよく、宿主となる大腸菌としては大腸菌HB101株、C60
0株、W3110株などを挙げることができる。本発明におけ
る宿主酵母としては例えば、サッカロミセス・セルビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）のNA87-11A株、 GRF18
株、AH22株等が使用できる。
【００１６】また、使用する酵母ベクターを構築するた
めの適当なプロモーターとして、３−ホスホグリセレー
トキナーゼ(PGK）のプロモーター〔Chang etal., Mol C
ell.Biol., 6,1812(1986)〕や他の解糖系酵素〔Hess et
al., J.Adv. Enzyme.Reg.,７, 149 (1968)；Holland
et al. Biochemistry, 17, 4900(1978)〕であるエノラ
ーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ (GAPDH)、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシ
ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リ
ン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセルリン酸ムター
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼの
様な酵素のプロモーター等が挙げられるが、これらの中
でも、GAPDHプロモーター、 PGKプロモーターは有用で
ある。適当な発現ベクターを作製する場合、これらの遺
伝子に存在する転写終結配列も又発現したい遺伝子の
３′側に挿入し、ｍＲＮＡのポリＡ化と転写終結が生じ
る様にする。増殖条件により、転写の制御ができる様な
利点を有するプロモーターとして、アルコールデヒドロ
ゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、
あるいは窒素代謝に関連した分解酵素、あるいはマルト
ースやガラクトースを使用するのに関連した酵素のプロ
モーターも使える。そして本発明においては、これらの
酵母のコンパーチブルプロモーター、複製起点及び転写
終結配列を含むすべてのプラスミドベクターが使える。
めの適当なプロモーターとして、３−ホスホグリセレー
トキナーゼ(PGK）のプロモーター〔Chang etal., Mol C
ell.Biol., 6,1812(1986)〕や他の解糖系酵素〔Hess et
al., J.Adv. Enzyme.Reg.,７, 149 (1968)；Holland
et al. Biochemistry, 17, 4900(1978)〕であるエノラ
ーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ (GAPDH)、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシ
ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リ
ン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセルリン酸ムター
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼの
様な酵素のプロモーター等が挙げられるが、これらの中
でも、GAPDHプロモーター、 PGKプロモーターは有用で
ある。適当な発現ベクターを作製する場合、これらの遺
伝子に存在する転写終結配列も又発現したい遺伝子の
３′側に挿入し、ｍＲＮＡのポリＡ化と転写終結が生じ
る様にする。増殖条件により、転写の制御ができる様な
利点を有するプロモーターとして、アルコールデヒドロ
ゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、
あるいは窒素代謝に関連した分解酵素、あるいはマルト
ースやガラクトースを使用するのに関連した酵素のプロ
モーターも使える。そして本発明においては、これらの
酵母のコンパーチブルプロモーター、複製起点及び転写
終結配列を含むすべてのプラスミドベクターが使える。
【００１７】さらに宿主となる枯草菌としては、例えば
バチルス・ナットー（B.natto)、バチルス・ズブチリス
（B.subtilis）等が用いられる。これら枯草菌の分泌発
現ベクターとしては、プラスミドpUB110等の枯草菌中で
複製できるプラスミドの複製起点をもち、かつ、α−ア
ミラーゼ遺伝子あるいはアルカリプロテアーゼ（サチラ
イシン）遺伝子等のプロモーター、シグナルペプチド、
ターミネーターを有するプラスミドが利用できる。
バチルス・ナットー（B.natto)、バチルス・ズブチリス
（B.subtilis）等が用いられる。これら枯草菌の分泌発
現ベクターとしては、プラスミドpUB110等の枯草菌中で
複製できるプラスミドの複製起点をもち、かつ、α−ア
ミラーゼ遺伝子あるいはアルカリプロテアーゼ（サチラ
イシン）遺伝子等のプロモーター、シグナルペプチド、
ターミネーターを有するプラスミドが利用できる。
【００１８】また何れの宿主を用いる場合においても、
ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれるならば、ベ
クター中に複製起点を必要とせず、宿主細胞染色体の複
製機構を利用することができる。宿主細胞の形質転換は
公知の方法、例えば、塩化カルシウム、プロトプラスト
ポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーショ
ン法などにより行う。
ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれるならば、ベ
クター中に複製起点を必要とせず、宿主細胞染色体の複
製機構を利用することができる。宿主細胞の形質転換は
公知の方法、例えば、塩化カルシウム、プロトプラスト
ポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーショ
ン法などにより行う。
【００１９】得られた形質転換株は、宿主細胞の自体公
知の培地で培養する。培地としては、大腸菌、枯草菌で
はＬ培地、酵母ではＹＰＤ培地などが例示される。培養
は、通常15〜43℃(好適には30〜37℃程度) で行い、必
要により通気や攪拌を加えることもできる。培養後、培
養上清を回収し、自体公知の方法、例えばアフィニティ
クロマトグラフィー、分画法などにより変異型黄麹菌ア
ルカリプロテアーゼを精製する。
知の培地で培養する。培地としては、大腸菌、枯草菌で
はＬ培地、酵母ではＹＰＤ培地などが例示される。培養
は、通常15〜43℃(好適には30〜37℃程度) で行い、必
要により通気や攪拌を加えることもできる。培養後、培
養上清を回収し、自体公知の方法、例えばアフィニティ
クロマトグラフィー、分画法などにより変異型黄麹菌ア
ルカリプロテアーゼを精製する。
【００２０】
【発明の効果】本発明の変異型黄麹菌アルカリプロテア
ーゼは野生型と同程度の酵素活性を有し、しかも熱安定
性（耐熱性）は著しく向上するという性質を有してい
る。従って、本発明の変異型黄麹菌アルカリプロテアー
ゼは食品、飲料水、試薬、医薬品の各分野で有用性が期
待できる。
ーゼは野生型と同程度の酵素活性を有し、しかも熱安定
性（耐熱性）は著しく向上するという性質を有してい
る。従って、本発明の変異型黄麹菌アルカリプロテアー
ゼは食品、飲料水、試薬、医薬品の各分野で有用性が期
待できる。
【００２１】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例を
挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるもの
ではない。
挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるもの
ではない。
【００２２】
【実施例１】 鋳型ＤＮＡと変異プライマーの調製 本発明者らは、高度好熱菌Thermus aquticus YT-1が菌
体外に分泌するセリンプロテアーゼ、アクアライシンＩ
の知見をもとに黄麹菌アルカリプロテアーゼにジスルフ
ィド結合を導入して熱安定性を高めることを試みた。即
ち、アクアライシンＩは 281のアミノ酸から成る分子量
約28,000のアルカリ性セリンプロテアーゼで、至適温度
が80℃付近にある耐熱性酵素である〔Matsuzawa, H.
等, Eur.J.Biochem., 171, 441-447(1988)〕。アクアラ
イシンＩと黄麹菌アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列
を比較した結果、アクアライシンＩは黄麹菌アルカリプ
ロテアーゼと相同性が高く（一致率46％）、しかも分子
内に耐熱性の原因の一つと考えられるジスルフィド結合
が２ヵ所に存在しており、システイン残基の存在しない
黄麹菌アルカリプロテアーゼにも相当する位置にシステ
イン残基を導入しジスルフィド結合を導入すれば、耐熱
性の向上した黄麹菌アルカリプロテアーゼに改変できる
と考えた。
体外に分泌するセリンプロテアーゼ、アクアライシンＩ
の知見をもとに黄麹菌アルカリプロテアーゼにジスルフ
ィド結合を導入して熱安定性を高めることを試みた。即
ち、アクアライシンＩは 281のアミノ酸から成る分子量
約28,000のアルカリ性セリンプロテアーゼで、至適温度
が80℃付近にある耐熱性酵素である〔Matsuzawa, H.
等, Eur.J.Biochem., 171, 441-447(1988)〕。アクアラ
イシンＩと黄麹菌アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列
を比較した結果、アクアライシンＩは黄麹菌アルカリプ
ロテアーゼと相同性が高く（一致率46％）、しかも分子
内に耐熱性の原因の一つと考えられるジスルフィド結合
が２ヵ所に存在しており、システイン残基の存在しない
黄麹菌アルカリプロテアーゼにも相当する位置にシステ
イン残基を導入しジスルフィド結合を導入すれば、耐熱
性の向上した黄麹菌アルカリプロテアーゼに改変できる
と考えた。
【００２３】ジスルフィド結合を形成させるには、黄麹
菌アルカリプロテアーゼ中の偶数箇所のアミノ酸残基を
システインに置換する必要がある。そこで、以下に示す
ように、アクアライシンＩの２ヵ所のジスルフィ結合と
相同的な位置のアミノ酸残基をシステインで置換し、こ
れらの変異体を SS-Ｉ及びSS-IIと命名することにし
た。
菌アルカリプロテアーゼ中の偶数箇所のアミノ酸残基を
システインに置換する必要がある。そこで、以下に示す
ように、アクアライシンＩの２ヵ所のジスルフィ結合と
相同的な位置のアミノ酸残基をシステインで置換し、こ
れらの変異体を SS-Ｉ及びSS-IIと命名することにし
た。
【００２４】SS-Ｉ：Ser-69/Gly-101 SS-II：Gly-169/Val-200 上記アミノ酸置換を導入する方法として、合成オリゴヌ
クレオチドを用いた部位特異的変異法を用いた。本方法
で変異を導入するには、一本鎖ＤＮＡの鋳型と変異プラ
イマーを必要とする。
クレオチドを用いた部位特異的変異法を用いた。本方法
で変異を導入するには、一本鎖ＤＮＡの鋳型と変異プラ
イマーを必要とする。
【００２５】黄麹菌A.oryzae ATCC 20386 株からクロー
ニングされたアルカリプロテアーゼｃＤＮＡは、プラス
ミドベクター pUC119 〔Vieira, J.等, Method in Enzy
mology，153, 3-11 (1987)〕のEcoRＩサイトに挿入さ
れ、pOAP10と命名された（特願昭63-170018号)。アルカ
リプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を
図１に示す。 pUC119 には大腸菌に感染する M13ファー
ジのinter-genic region(IG) が挿入されているため、
M13系のヘルパーファージの感染によりプラスミドは一
本鎖ＤＮＡとなり、ファージ粒子内に包み込まれた状態
で大腸菌々体外に放出される。そこで、pOAP10を大腸菌
JM109株〔Messing, J., Gene, 33, 103-119 (1985)〕に
導入した後、宝酒造製の pUC119 の添付されているプロ
トコールに従ってpOAP10の一本鎖ＤＮＡを調製し、これ
を部位特異的変異の鋳型として用いた。
ニングされたアルカリプロテアーゼｃＤＮＡは、プラス
ミドベクター pUC119 〔Vieira, J.等, Method in Enzy
mology，153, 3-11 (1987)〕のEcoRＩサイトに挿入さ
れ、pOAP10と命名された（特願昭63-170018号)。アルカ
リプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を
図１に示す。 pUC119 には大腸菌に感染する M13ファー
ジのinter-genic region(IG) が挿入されているため、
M13系のヘルパーファージの感染によりプラスミドは一
本鎖ＤＮＡとなり、ファージ粒子内に包み込まれた状態
で大腸菌々体外に放出される。そこで、pOAP10を大腸菌
JM109株〔Messing, J., Gene, 33, 103-119 (1985)〕に
導入した後、宝酒造製の pUC119 の添付されているプロ
トコールに従ってpOAP10の一本鎖ＤＮＡを調製し、これ
を部位特異的変異の鋳型として用いた。
【００２６】変異プライマーとして、以下の四種類のオ
リゴヌクレオチドをアプライドバイオシステムズ社製Ｄ
ＮＡ合成機381A型を用いて合成した後、同社製「オリゴ
ヌクレオチド精製カートリッジ」にて精製した。 ＩＡ： 69 Gln His Val Asp Cys Ile Gly His Gly Thr His 5′-CAG CAT GTG GAC TGC ATT GGT CAT GGC ACC CAC-3′ * * NcoＩ not digest ＩＢ： 101 Lys Val Phe Gln Cys Glu Ser Ser Ser Thr Ser Val Ile 5′-AAA GTT TTC CAG TGT GAA TCG AGC TCG ACT TCC GTC ATT-3′ * SacＩ *** IIＡ： 169 Asn Ser Asp Ala Cys Gln Thr Ser Pro AAC TCT GAT GCA TGC CAA ACC AGC CCT SphI ** IIＢ： 200 Asn Phe Gly Lys Cys Val Asp Val Phe Ala AAC TTT GGC AAG TGC GTC GAC GTC TTC GCT ** * SalＩ * は置換した塩基を示す。塩基置換の結果、それぞれ制
限酵素サイトの消長が起こる。番号は成熟型アルカリプ
ロテアーゼのＮ末端からのアミノ酸番号を示す。
リゴヌクレオチドをアプライドバイオシステムズ社製Ｄ
ＮＡ合成機381A型を用いて合成した後、同社製「オリゴ
ヌクレオチド精製カートリッジ」にて精製した。 ＩＡ： 69 Gln His Val Asp Cys Ile Gly His Gly Thr His 5′-CAG CAT GTG GAC TGC ATT GGT CAT GGC ACC CAC-3′ * * NcoＩ not digest ＩＢ： 101 Lys Val Phe Gln Cys Glu Ser Ser Ser Thr Ser Val Ile 5′-AAA GTT TTC CAG TGT GAA TCG AGC TCG ACT TCC GTC ATT-3′ * SacＩ *** IIＡ： 169 Asn Ser Asp Ala Cys Gln Thr Ser Pro AAC TCT GAT GCA TGC CAA ACC AGC CCT SphI ** IIＢ： 200 Asn Phe Gly Lys Cys Val Asp Val Phe Ala AAC TTT GGC AAG TGC GTC GAC GTC TTC GCT ** * SalＩ * は置換した塩基を示す。塩基置換の結果、それぞれ制
限酵素サイトの消長が起こる。番号は成熟型アルカリプ
ロテアーゼのＮ末端からのアミノ酸番号を示す。
【００２７】
【実施例２】 変異アルカリプロテアーゼｃＤＮＡの作
製 変異アルカリプロテアーゼｃＤＮＡの作製には、アマー
シャム社製「オリゴヌクレオチド−ディレクテッド・イ
ンビトロ・ミュータジェネシスシステム」を用いた。ま
た、操作は同システムに添付されているマニュアルに従
った。 (1) 部位特異的変異操作 実施例１で得たpOAP10の一本鎖ＤＮＡ６μｇ（約４pmo
l）11μl）と、5′末端をリン酸化した変異プライマー
（各40〜60ng，約４pmol）をＩＡ＋ＩＢ, IIＡ＋II
Ｂという組み合わせで一度に二種類の変異プライマーを
アニーリングさせた後、マニュアルに従い、dCTPαS 存
在下での相補鎖伸長と連結、不用な一本鎖ＤＮＡの除
去、NciＩによるニッキング、エキソヌクレアーゼIII処
理、相補鎖伸長の操作を行った。最終的に得られたＤＮ
Ａの 1/5量を用いて大腸菌TG１株（同キットに添付）を
形質転換した。 (2) 変異体のスクリーニング (1)で得られた形質転換体から、榊の方法〔榊佳之，ベ
クターＤＮＡ,講談社サイエンティフィク(1986)〕によ
りプラスミドを調製し、実施例１に示した変異プライマ
ー上に設計された制限酵素認識サイトの有無によりスク
リーニングを行った。予定された制限酵素消化パターン
を示すクローンについて、榊の方法〔前述〕に従ってプ
ラスミドをアルカリ変性させた後、ダイデオキシ法によ
り変異箇所の塩基配列を決定し、設計通りの変異が導入
されていることを確認した。変異プライマーＩＡとＩＢ
により変異が導入されたプラスミド(SS-Ｉ：Ser69→ Cy
s,Gly101→ Cys)をpAPO61、変異プライマーIIＡとIIＢ
により変異が導入されたプラスミド（SS-II：Gly169→C
ys,Val200 →Cys) をpAPO62と命名した。 (3) pAP061をBglII-EcoRＶ消化することにより640bp
の断片を得た後にDdeI消化することにより435bp のBglI
I-DdeI 断片を得た。
製 変異アルカリプロテアーゼｃＤＮＡの作製には、アマー
シャム社製「オリゴヌクレオチド−ディレクテッド・イ
ンビトロ・ミュータジェネシスシステム」を用いた。ま
た、操作は同システムに添付されているマニュアルに従
った。 (1) 部位特異的変異操作 実施例１で得たpOAP10の一本鎖ＤＮＡ６μｇ（約４pmo
l）11μl）と、5′末端をリン酸化した変異プライマー
（各40〜60ng，約４pmol）をＩＡ＋ＩＢ, IIＡ＋II
Ｂという組み合わせで一度に二種類の変異プライマーを
アニーリングさせた後、マニュアルに従い、dCTPαS 存
在下での相補鎖伸長と連結、不用な一本鎖ＤＮＡの除
去、NciＩによるニッキング、エキソヌクレアーゼIII処
理、相補鎖伸長の操作を行った。最終的に得られたＤＮ
Ａの 1/5量を用いて大腸菌TG１株（同キットに添付）を
形質転換した。 (2) 変異体のスクリーニング (1)で得られた形質転換体から、榊の方法〔榊佳之，ベ
クターＤＮＡ,講談社サイエンティフィク(1986)〕によ
りプラスミドを調製し、実施例１に示した変異プライマ
ー上に設計された制限酵素認識サイトの有無によりスク
リーニングを行った。予定された制限酵素消化パターン
を示すクローンについて、榊の方法〔前述〕に従ってプ
ラスミドをアルカリ変性させた後、ダイデオキシ法によ
り変異箇所の塩基配列を決定し、設計通りの変異が導入
されていることを確認した。変異プライマーＩＡとＩＢ
により変異が導入されたプラスミド(SS-Ｉ：Ser69→ Cy
s,Gly101→ Cys)をpAPO61、変異プライマーIIＡとIIＢ
により変異が導入されたプラスミド（SS-II：Gly169→C
ys,Val200 →Cys) をpAPO62と命名した。 (3) pAP061をBglII-EcoRＶ消化することにより640bp
の断片を得た後にDdeI消化することにより435bp のBglI
I-DdeI 断片を得た。
【００２８】pAP062をStuＩ-Hind III 消化することに
より940bp の断片を得た後にDdeI消化することにより69
3bp のDdeI-Hind III 断片を得た。pAP061由来の断片と
pAP062由来の断片を連結し、BglII-AflIIで消化するこ
とにより861bp の断片を得た。
より940bp の断片を得た後にDdeI消化することにより69
3bp のDdeI-Hind III 断片を得た。pAP061由来の断片と
pAP062由来の断片を連結し、BglII-AflIIで消化するこ
とにより861bp の断片を得た。
【００２９】
【実施例３】 アルカリプロテアーゼ分泌発現ベクター
の構築 (1) ADH1プロモーターを用いた分泌発現ベクターの構築 アルコール脱水素酵素１遺伝子（ADH1）のプロモーター
・ターミネーターを用いたアルカリプロテアーゼ分泌発
現ベクターの構築方法を図１に示す。先ず、既にEcoRＩ
サイトでADH1プロモーター（図中Ｐと表示）とターミネ
ーター（図中Ｔと表示）が連結している AAR６ (ワシン
トン・リサーチ・ファウンデーションより入手) のEcoR
ＩサイトにpOAP10（特開平2-131580号) の1.5 kbのEcoR
Ｉ断片（野生型アルカリプロテアテアーゼｃＤＮＡ、図
中ＡＬＰと表示）を連結し、 pOPA103と命名した。この
プラスミドは、複製起点がARS1であるために酵母内では
不安定であることが予測されたため、複製起点を２μm
ＤＮＡ由来に変更した。即ち、２μm ＤＮＡ由来の複製
起点を有するAAH5（ワシントン・リサーチ・ファウンデ
ーションより入手)とpOAP103のBamHＩ断片を連結し、pO
AP107 を得た。このプラスミドは、選択マーカーとして
LEU2を用いているためにプラスミドのサイズが14.2kbと
大きくなっている。そこでプラスミドを小型化するため
に、選択マーカーをLEU2からTRP1に変更した。即ち、pO
AP107のPstＩ断片（ADH1プロモーター・アルカリプロテ
アーゼｃＤＮＡ・ADH1ターミネーターを含む）とTRP1を
選択マーカーとして有するMA56（ワシントン・リサーチ
・ファウンデーションより入手)のPstＩ断片を連結する
ことにより、pOAP108 を作製した。 (2) Zygosaccharomyces rouxii由来 GAPDHプロモータ
ーを用いた分泌発現ベクターの構築 ザイゴサッカロマイセス・ルーキシ（Zygosaccharomyce
s rouxii)のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素(GAPDH）のプロモーターが、サッカロマイセス・セレ
ビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のGAPDH プロモー
ターと同様に高発現であることは既に東江ら（Imura,T.
等，Agric.Biol.Chem., 53, 813-819 (1989)) によって
明らかにされている。更に、GAPDH遺伝子は、酵母の遺伝
子の中で最も高発現のものの１つであることが知られて
いる。(Holland,J.P.等, Biochemistry, 17, 4900-4907
(1978))。
の構築 (1) ADH1プロモーターを用いた分泌発現ベクターの構築 アルコール脱水素酵素１遺伝子（ADH1）のプロモーター
・ターミネーターを用いたアルカリプロテアーゼ分泌発
現ベクターの構築方法を図１に示す。先ず、既にEcoRＩ
サイトでADH1プロモーター（図中Ｐと表示）とターミネ
ーター（図中Ｔと表示）が連結している AAR６ (ワシン
トン・リサーチ・ファウンデーションより入手) のEcoR
ＩサイトにpOAP10（特開平2-131580号) の1.5 kbのEcoR
Ｉ断片（野生型アルカリプロテアテアーゼｃＤＮＡ、図
中ＡＬＰと表示）を連結し、 pOPA103と命名した。この
プラスミドは、複製起点がARS1であるために酵母内では
不安定であることが予測されたため、複製起点を２μm
ＤＮＡ由来に変更した。即ち、２μm ＤＮＡ由来の複製
起点を有するAAH5（ワシントン・リサーチ・ファウンデ
ーションより入手)とpOAP103のBamHＩ断片を連結し、pO
AP107 を得た。このプラスミドは、選択マーカーとして
LEU2を用いているためにプラスミドのサイズが14.2kbと
大きくなっている。そこでプラスミドを小型化するため
に、選択マーカーをLEU2からTRP1に変更した。即ち、pO
AP107のPstＩ断片（ADH1プロモーター・アルカリプロテ
アーゼｃＤＮＡ・ADH1ターミネーターを含む）とTRP1を
選択マーカーとして有するMA56（ワシントン・リサーチ
・ファウンデーションより入手)のPstＩ断片を連結する
ことにより、pOAP108 を作製した。 (2) Zygosaccharomyces rouxii由来 GAPDHプロモータ
ーを用いた分泌発現ベクターの構築 ザイゴサッカロマイセス・ルーキシ（Zygosaccharomyce
s rouxii)のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素(GAPDH）のプロモーターが、サッカロマイセス・セレ
ビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のGAPDH プロモー
ターと同様に高発現であることは既に東江ら（Imura,T.
等，Agric.Biol.Chem., 53, 813-819 (1989)) によって
明らかにされている。更に、GAPDH遺伝子は、酵母の遺伝
子の中で最も高発現のものの１つであることが知られて
いる。(Holland,J.P.等, Biochemistry, 17, 4900-4907
(1978))。
【００３０】そこで、(1)で作製した pOAP108を基に、
Z.ルーキシ GAPDHプロモーターを用いた高発現型プラス
ミドを作製した。その構築方法を図２に示す。まず、Z.
ルーキシ GAPDHプロモーターの pUC19へのサブクローニ
ングを行った。即ち、GAPDH プロモーターのうち翻訳開
始コドン(ATG）上流を４塩基欠失させたプラスミド pTI
43（広島大学、東江教授より分譲）のGAPDH プロモータ
ーを含むEcoRＩ-PstＩ断片を pUC19のEcoRＩ-PstＩサイ
トに挿入することにより pUG43を得た。更に、Z.ルーキ
シのGAPDH ターミネーターを付加するための準備とし
て、pUG43のSspＩサイトをBamHＩサイトに変換したpUBG
43を作製した。
Z.ルーキシ GAPDHプロモーターを用いた高発現型プラス
ミドを作製した。その構築方法を図２に示す。まず、Z.
ルーキシ GAPDHプロモーターの pUC19へのサブクローニ
ングを行った。即ち、GAPDH プロモーターのうち翻訳開
始コドン(ATG）上流を４塩基欠失させたプラスミド pTI
43（広島大学、東江教授より分譲）のGAPDH プロモータ
ーを含むEcoRＩ-PstＩ断片を pUC19のEcoRＩ-PstＩサイ
トに挿入することにより pUG43を得た。更に、Z.ルーキ
シのGAPDH ターミネーターを付加するための準備とし
て、pUG43のSspＩサイトをBamHＩサイトに変換したpUBG
43を作製した。
【００３１】次に、pUBG43へのGAPDH ターミネーターの
付加を行った。即ち、pUBG43をEcoRＩとBamHＩで消化
し、ここにpGAP4-Zr（広島大学、東江教授より分譲）の
EcoRＩ-BamHＩ断片（GAPDHの終止コドンの下流約700bp
を含む）を挿入し、GAPDHプロモーターとターミネータ
ーがEcoRＩサイトを介して結合したpUGT43を得た。次
に、このpUGT43のEcoRＩサイトにpOAP10(特開平2-13158
0号) のアルカリプロテアーゼｃＤＮＡを含む 1.5kbのE
coRＩ断片を挿入し、pGAT43を得た。続いて、pGAT43が
有するGAPDH プロモーター・アルカリプロテアーゼｃＤ
ＮＡ・GAPDH ターミネーターから成る発現ユニットに酵
母での複製起点と選択マーカーを付加した。即ち、(1)
で作製したpOAP108 のBamHＩ-SphＩサイト間に、pGAT43
のBamHＩ-SphＩ断片を挿入することにより、pOAP106Bが
得られた。
付加を行った。即ち、pUBG43をEcoRＩとBamHＩで消化
し、ここにpGAP4-Zr（広島大学、東江教授より分譲）の
EcoRＩ-BamHＩ断片（GAPDHの終止コドンの下流約700bp
を含む）を挿入し、GAPDHプロモーターとターミネータ
ーがEcoRＩサイトを介して結合したpUGT43を得た。次
に、このpUGT43のEcoRＩサイトにpOAP10(特開平2-13158
0号) のアルカリプロテアーゼｃＤＮＡを含む 1.5kbのE
coRＩ断片を挿入し、pGAT43を得た。続いて、pGAT43が
有するGAPDH プロモーター・アルカリプロテアーゼｃＤ
ＮＡ・GAPDH ターミネーターから成る発現ユニットに酵
母での複製起点と選択マーカーを付加した。即ち、(1)
で作製したpOAP108 のBamHＩ-SphＩサイト間に、pGAT43
のBamHＩ-SphＩ断片を挿入することにより、pOAP106Bが
得られた。
【００３２】
【実施例４】 変異アルカリプロテアーゼ発現ベクター
の構築 実施例２で得られたBglII-AflII断片及び実施例３で得
られたアルカリプロテアーゼ分泌発現ベクターpOAP106B
を用いて、図３に示す工程により変異アルカリプロテア
ーゼを酵母で分泌発現させるためのベクターを構築し
た。すなわち、BglII-AflII断片は、変異アルカリプロ
テアーゼｃＤＮＡのうちの成熟アルカリプロテアーゼを
コードする領域が 861bpのＤＮＡ断片として得られる。
一方、実施例３で構築した酵母アルカリプロテアーゼを
分泌発現させるためのベクターpOAP106Bを同様にBglII
とAflIIで消化した後、常法通り電気泳動によって 8.9k
bの断片を得た。次いで、これら二種類のＤＮＡ断片を
ライゲーションすることにより、変異アルカリプロテア
ーゼを酵母で発現させるためのベクターを得た。BglII-
AflII断片を組み込んだベクターをpAPO80と命名した。
の構築 実施例２で得られたBglII-AflII断片及び実施例３で得
られたアルカリプロテアーゼ分泌発現ベクターpOAP106B
を用いて、図３に示す工程により変異アルカリプロテア
ーゼを酵母で分泌発現させるためのベクターを構築し
た。すなわち、BglII-AflII断片は、変異アルカリプロ
テアーゼｃＤＮＡのうちの成熟アルカリプロテアーゼを
コードする領域が 861bpのＤＮＡ断片として得られる。
一方、実施例３で構築した酵母アルカリプロテアーゼを
分泌発現させるためのベクターpOAP106Bを同様にBglII
とAflIIで消化した後、常法通り電気泳動によって 8.9k
bの断片を得た。次いで、これら二種類のＤＮＡ断片を
ライゲーションすることにより、変異アルカリプロテア
ーゼを酵母で発現させるためのベクターを得た。BglII-
AflII断片を組み込んだベクターをpAPO80と命名した。
【００３３】
【実施例５】 酵母による変異アルカリプロテアーゼの
分泌生産 実施例４で得られた変異アルカリプロテアーゼ発現ベク
ターpAPO80及び実施例３で得られた野生型アルカリプロ
テアーゼ発現ベクターpOAP106Bを用い、Hinnen等の方法
〔Hinnen, A.等, Proc.Natl.Acad.Sic.USA, 75, 1929-1
933 (1978)〕に従い、サッカロマイセス・セルビジエ
（Saccharomyces cerevisiae）NA87-11Aをトリプトファ
ン要求性の解除を指標として形質転換し、S.セレビジエ
NA87-11A/pAPO80及びS.セレビジエ NA87-11A/pOAP106B
の２株の形質転換酵母を得た。
分泌生産 実施例４で得られた変異アルカリプロテアーゼ発現ベク
ターpAPO80及び実施例３で得られた野生型アルカリプロ
テアーゼ発現ベクターpOAP106Bを用い、Hinnen等の方法
〔Hinnen, A.等, Proc.Natl.Acad.Sic.USA, 75, 1929-1
933 (1978)〕に従い、サッカロマイセス・セルビジエ
（Saccharomyces cerevisiae）NA87-11Aをトリプトファ
ン要求性の解除を指標として形質転換し、S.セレビジエ
NA87-11A/pAPO80及びS.セレビジエ NA87-11A/pOAP106B
の２株の形質転換酵母を得た。
【００３４】次に、得られた２種類の形質転換体をＳＤ
培地〔１l当たり Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acid
s（ディフコ社製）6.７ｇ，グルコース20ｇ, Ｌ−ロイ
シン30mg, Ｌ−ヒスチジン塩酸塩20mg〕50mlを含む 300
ml容三角フラスコに接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。この培養液25mlをＹＰＤ培地〔１l当たり Bacto-Pe
ptone（ディフコ社製）20ｇ, 酵母エキス（ディフコ社
製）10ｇ, グルコース20ｇ〕 500mlを含む３l容三角フ
ラスコ２本に移し、30℃で72時間振盪培養した。培養終
了後、3,500rpm, 20分間の遠心分離により培養上清を回
収し、これを変異型アルカリプロテアーゼの精製に供し
た。
培地〔１l当たり Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acid
s（ディフコ社製）6.７ｇ，グルコース20ｇ, Ｌ−ロイ
シン30mg, Ｌ−ヒスチジン塩酸塩20mg〕50mlを含む 300
ml容三角フラスコに接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。この培養液25mlをＹＰＤ培地〔１l当たり Bacto-Pe
ptone（ディフコ社製）20ｇ, 酵母エキス（ディフコ社
製）10ｇ, グルコース20ｇ〕 500mlを含む３l容三角フ
ラスコ２本に移し、30℃で72時間振盪培養した。培養終
了後、3,500rpm, 20分間の遠心分離により培養上清を回
収し、これを変異型アルカリプロテアーゼの精製に供し
た。
【００３５】
【実施例６】 変異型アルカリプロテアーゼの精製 変異型アルカリプロテアーゼの精製は、陰イオン交換カ
ラムクロマトグラフィーと疎水相互作用カラムクロマト
グラフィーとゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより
行った。酵母培養上清の pＨは約7.5で10〜15mmhoであ
り、0.4μmフィルター濾過後、水で平衡化を行ってある
Q-Sepharoseカラムクロマトグラフィーにより未吸着分
画を集合した。この未吸着分画には約80％のアルカリプ
ロテアーゼ活性が回収された。この未吸着分画に最終濃
度２M となる様に硫安を加え、 pＨ6.0 に調整した後に
Millipore Filtor HV 0.45μmにて濾過を行い、不溶物
を除いた。この濾液を 2.0M (NH4)2SO4-0.05％ NaN3-10
mM酢酸緩衝液(pＨ６) にて平衡化してある Butyl Toyop
eal 630Mカラムクロマトグラフィーに供し、２M→０M
(NH4)2SO4直線グラジエントにて溶出を行い、アルカリ
プロテアーゼ活性分画を集合した。酵素活性回収率は約
80％〜90％であった。このアルカリプロテアーゼ活性分
画を前もって 100mM NaCl-1mM EDTA-0.05％ NaN3-50mM
酢酸緩衝液pＨ６にて平衡化してある Superose 12カラ
ムクロマトグラフィーに供し、アルカリプロテアーゼ活
性分画を集合し、最終標品とした。本標品は SDS電気泳
動的に単一バンドであり、逆相クロマトグラフィー的に
95％以上の純度であった。
ラムクロマトグラフィーと疎水相互作用カラムクロマト
グラフィーとゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより
行った。酵母培養上清の pＨは約7.5で10〜15mmhoであ
り、0.4μmフィルター濾過後、水で平衡化を行ってある
Q-Sepharoseカラムクロマトグラフィーにより未吸着分
画を集合した。この未吸着分画には約80％のアルカリプ
ロテアーゼ活性が回収された。この未吸着分画に最終濃
度２M となる様に硫安を加え、 pＨ6.0 に調整した後に
Millipore Filtor HV 0.45μmにて濾過を行い、不溶物
を除いた。この濾液を 2.0M (NH4)2SO4-0.05％ NaN3-10
mM酢酸緩衝液(pＨ６) にて平衡化してある Butyl Toyop
eal 630Mカラムクロマトグラフィーに供し、２M→０M
(NH4)2SO4直線グラジエントにて溶出を行い、アルカリ
プロテアーゼ活性分画を集合した。酵素活性回収率は約
80％〜90％であった。このアルカリプロテアーゼ活性分
画を前もって 100mM NaCl-1mM EDTA-0.05％ NaN3-50mM
酢酸緩衝液pＨ６にて平衡化してある Superose 12カラ
ムクロマトグラフィーに供し、アルカリプロテアーゼ活
性分画を集合し、最終標品とした。本標品は SDS電気泳
動的に単一バンドであり、逆相クロマトグラフィー的に
95％以上の純度であった。
【００３６】ローリー法（Lowry, O.H. 等, J.Biol.Che
m., 193, 265 (1951))による蛋白定量の結果、アルカリ
プロテアーゼの分子量を 29000ダルトンとすると、SS-
Ｉ／IIは33μM の濃度であった。本方法で精製された野
生型とSS-Ｉ変異型（SS−Ｉ／II）の比活性は、アゾカ
ゼインを基質にしたところ同程度であった。基質溶液は
１％ アゾカゼイン 50mM MOPS［3-(N-Morpholine) prop
ane sulfonic acid］緩衝液pＨ７である。反応温度は30
℃である。
m., 193, 265 (1951))による蛋白定量の結果、アルカリ
プロテアーゼの分子量を 29000ダルトンとすると、SS-
Ｉ／IIは33μM の濃度であった。本方法で精製された野
生型とSS-Ｉ変異型（SS−Ｉ／II）の比活性は、アゾカ
ゼインを基質にしたところ同程度であった。基質溶液は
１％ アゾカゼイン 50mM MOPS［3-(N-Morpholine) prop
ane sulfonic acid］緩衝液pＨ７である。反応温度は30
℃である。
【００３７】
【実施例７】 精製変異型アルカリプロテアーゼのジス
ルフィド結合形成の確認 ジスルフィド結合形成の確認はDTNB法及びDTT とDTNB法
を組み合わせた方法（Butterworth, P.H.Wetal Arch.Bi
ochem. Biophys.,118,716 (1967))に修正を加えて行っ
た。つまりは、非還元状態下で遊離SH基の定量を行い、
更に、還元状態下で遊離SH基の定量を行うものである。
非還元状態下での遊離SH基の定量法を以下に記す。PD-1
0 カラムを 0.1M トリス緩衝液 pＨ8.0 で平衡化する。
検体2.5mlをアプライし、3.5mlの同緩衝液にて溶出す
る。PD-10 カラム溶出液と等量の８M 塩酸グアニジンを
加える（グアニジン終濃度４M)。この溶液の 280nmの吸
光度を測定し、アルカリプロテアーゼの分子量を 29000
ダルトンとしＥ1cm,1%＝7.81 A280(Nakadai,T.et al.Ag
r.Biol.Chem, 37, 2685(1973))より蛋白濃度を求める。
この溶液400μlに 10mM DTNB-50mMトリス緩衝液pＨ8.0
を800μl加えて瞬時に攪拌するとともに 412nmの吸光度
を測定する。ブランクは 0.1Mトリス緩衝液pＨ8.0 を用
いて以上と同様の操作を行う。SH基の定量はブランク値
を差引き、その値を 13600で割ってSH基のモル濃度を求
める。蛋白１分子あたりのSH基の数を蛋白濃度から求め
る。
ルフィド結合形成の確認 ジスルフィド結合形成の確認はDTNB法及びDTT とDTNB法
を組み合わせた方法（Butterworth, P.H.Wetal Arch.Bi
ochem. Biophys.,118,716 (1967))に修正を加えて行っ
た。つまりは、非還元状態下で遊離SH基の定量を行い、
更に、還元状態下で遊離SH基の定量を行うものである。
非還元状態下での遊離SH基の定量法を以下に記す。PD-1
0 カラムを 0.1M トリス緩衝液 pＨ8.0 で平衡化する。
検体2.5mlをアプライし、3.5mlの同緩衝液にて溶出す
る。PD-10 カラム溶出液と等量の８M 塩酸グアニジンを
加える（グアニジン終濃度４M)。この溶液の 280nmの吸
光度を測定し、アルカリプロテアーゼの分子量を 29000
ダルトンとしＥ1cm,1%＝7.81 A280(Nakadai,T.et al.Ag
r.Biol.Chem, 37, 2685(1973))より蛋白濃度を求める。
この溶液400μlに 10mM DTNB-50mMトリス緩衝液pＨ8.0
を800μl加えて瞬時に攪拌するとともに 412nmの吸光度
を測定する。ブランクは 0.1Mトリス緩衝液pＨ8.0 を用
いて以上と同様の操作を行う。SH基の定量はブランク値
を差引き、その値を 13600で割ってSH基のモル濃度を求
める。蛋白１分子あたりのSH基の数を蛋白濃度から求め
る。
【００３８】以上の測定結果は、アルカリプロテアーゼ
１分子当り、野生型、変異型（SS-Ｉ／II）とも SH基の
数は０個であった。還元状態下での遊離SH基の定量法を
以下に記す。蛋白溶液にグアニジン塩酸を加えて終濃度
４M とし、この溶液に 100mM DTT溶液を1/10量加え、攪
拌し室温で30分以上静置する。PD-10 カラムを１mM EDT
A-10mM酢酸 pＨ４で平衡化する。検体 2.0mlをアプライ
し、 0.5mlの同緩衝液で洗浄した後、3.０mlの同緩衝液
で溶出する。同溶出液と等量の８M グアニジン塩酸を加
える（グアニジン終濃度４M)。この溶液の 280nmの吸光
度を測定して蛋白濃度を求める。この溶液400μlに 10m
M DTNB-50 mMトリス緩衝液 pＨ8.0を800μl加えて瞬時
に攪拌するとともに、412nm の吸光度を測定する。ブラ
ンクは蛋白溶液の代わりに、１mM EDTA-10mM酢酸緩衝液
pＨ4.0 を用いて同様の操作を行う。SH基の定量は、ブ
ランク値を差引き、その値を 13600で割ってSH基のモル
濃度求める。蛋白１分子あたりのSH基の数を蛋白濃度か
ら求める。
１分子当り、野生型、変異型（SS-Ｉ／II）とも SH基の
数は０個であった。還元状態下での遊離SH基の定量法を
以下に記す。蛋白溶液にグアニジン塩酸を加えて終濃度
４M とし、この溶液に 100mM DTT溶液を1/10量加え、攪
拌し室温で30分以上静置する。PD-10 カラムを１mM EDT
A-10mM酢酸 pＨ４で平衡化する。検体 2.0mlをアプライ
し、 0.5mlの同緩衝液で洗浄した後、3.０mlの同緩衝液
で溶出する。同溶出液と等量の８M グアニジン塩酸を加
える（グアニジン終濃度４M)。この溶液の 280nmの吸光
度を測定して蛋白濃度を求める。この溶液400μlに 10m
M DTNB-50 mMトリス緩衝液 pＨ8.0を800μl加えて瞬時
に攪拌するとともに、412nm の吸光度を測定する。ブラ
ンクは蛋白溶液の代わりに、１mM EDTA-10mM酢酸緩衝液
pＨ4.0 を用いて同様の操作を行う。SH基の定量は、ブ
ランク値を差引き、その値を 13600で割ってSH基のモル
濃度求める。蛋白１分子あたりのSH基の数を蛋白濃度か
ら求める。
【００３９】以上の測定結果は、アルカリプロテアーゼ
１分子当り、野生型では SH基は０個で、変異型（SS-Ｉ
／II）ではSH基は４個であった。以上の結果より、変異
型（SS-Ｉ／II）では、分子内ジスルフィド結合が２組
形成されていると結論される。
１分子当り、野生型では SH基は０個で、変異型（SS-Ｉ
／II）ではSH基は４個であった。以上の結果より、変異
型（SS-Ｉ／II）では、分子内ジスルフィド結合が２組
形成されていると結論される。
【００４０】
【実施例８】 熱安定性と酵素活性発現の至適温度の比
較 (ｉ) 熱安定性の測定 実施例６で得られた最終標品を50℃で各時間incubation
を行い、その後30℃で活性の測定を行った。50℃でのin
cubationの溶液組成は 100mMNaCl-１mM EDTA-0.05％ Na
N3-50mM酢酸緩衝液pＨ６である。30℃における活性測定
の基質溶液は１％ アゾカゼイン 50mMMOPS緩衝液 pＨ７
である。野生型アルカリプロテアーゼは50℃incu-batio
n、60分以内にて速やかに残存活性の低下が見られた
が、 SS-Ｉ／II型アルカリプロテアーゼはほとんど活性
の低下は見られなかった。50℃における熱失活の半減期
は野性型が９分であり、 SS-Ｉ／II型は359分であり、S
S-Ｉ／II型にCaイオンが２個結合したものは840分であ
った。
較 (ｉ) 熱安定性の測定 実施例６で得られた最終標品を50℃で各時間incubation
を行い、その後30℃で活性の測定を行った。50℃でのin
cubationの溶液組成は 100mMNaCl-１mM EDTA-0.05％ Na
N3-50mM酢酸緩衝液pＨ６である。30℃における活性測定
の基質溶液は１％ アゾカゼイン 50mMMOPS緩衝液 pＨ７
である。野生型アルカリプロテアーゼは50℃incu-batio
n、60分以内にて速やかに残存活性の低下が見られた
が、 SS-Ｉ／II型アルカリプロテアーゼはほとんど活性
の低下は見られなかった。50℃における熱失活の半減期
は野性型が９分であり、 SS-Ｉ／II型は359分であり、S
S-Ｉ／II型にCaイオンが２個結合したものは840分であ
った。
【００４１】
配列番号： １ （１）配列の長さ： 1487塩基対 （２）配列の型： 核酸 （３）鎖の数： 一本鎖 （４）トポロジー： 線状 （５）配列の種類： cDNA （６）起源： （ａ）生物名： Aspergillus oryzae （ｂ）株 名： Aspergillus oryzae ATCC 42149 （７）配列の特徴： １〜52 5'−非コード化領域 53〜385 プレ配列 386〜1264 成熟蛋白 1265〜1487 3'−非コード化領域 （８）配列：
【００４２】
【００４３】
【図１】 ADH1プロモーターを用いたアルカリプロテア
ーゼ分泌発現ベクター構築の行程を示す。
ーゼ分泌発現ベクター構築の行程を示す。
【図２】 Z.ルーキシのGAPDH プロモーターを用いたア
ルカリプロテアーゼ分泌発現ベクター構築の行程を示
す。
ルカリプロテアーゼ分泌発現ベクター構築の行程を示
す。
【図３】 変異アルカリプロテアーゼ分泌発現ベクター
構築の行程を示す。
構築の行程を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/62 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 真崎 厚司 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株式会社 ミドリ十字 中央研究所内 (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株式会社 ミドリ十字 中央研究所内 (72)発明者 有村 博文 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株式会社 ミドリ十字 中央研究所内 (72)発明者 村上 成治 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社 研究本部内 (72)発明者 辰巳 宏樹 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社 研究本部内 (72)発明者 牛島 重臣 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社 研究本部内 (72)発明者 中野 衛一 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社 研究本部内 (72)発明者 茂田井 宏 千葉県野田市野田339番地 キッコーマ ン株式会社 研究本部内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 1/00 - 1/38 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 野生型黄麹菌アルカリプロテアーゼのＮ
末端より69番目のセリン、101 番目のグリシン、169 番
目のグリシンおよび200 番目のバリンを各々システイン
に置換したものであることを特徴とする、変異型黄麹菌
アルカリプロテアーゼ。 - 【請求項２】 請求項１記載の変異型黄麹菌アルカリプ
ロテアーゼをコードする遺伝子。 - 【請求項３】 請求項２記載の遺伝子を導入した組換え
プラスミド。 - 【請求項４】 請求項３記載の組換えプラスミドにより
形質転換された形質転換体。 - 【請求項５】 以下の(a) 〜(d) の工程からなる変異型
黄麹菌アルカリプロテアーゼの製造方法。 (a) 請求項２記載の遺伝子を調製する； (b) 請求項２記載の遺伝子をプラスミドに導入して組
換えプラスミドを調製する； (c) (b) の組換えプラスミドを用いて宿主を形質転換
して形質転換体を調製する；および、 (d) (c) の形質転換体を培養して請求項１記載の変異
型アルカリプロテアーゼを産生させる。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22748491A JP3021826B2 (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | 変異型黄麹菌アルカリプロテアーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22748491A JP3021826B2 (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | 変異型黄麹菌アルカリプロテアーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0564587A JPH0564587A (ja) | 1993-03-19 |
| JP3021826B2 true JP3021826B2 (ja) | 2000-03-15 |
Family
ID=16861611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22748491A Expired - Lifetime JP3021826B2 (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | 変異型黄麹菌アルカリプロテアーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3021826B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4787571B2 (ja) * | 2004-10-08 | 2011-10-05 | 花王株式会社 | アルカリプロテアーゼ |
-
1991
- 1991-09-06 JP JP22748491A patent/JP3021826B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0564587A (ja) | 1993-03-19 |
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