FI111549B - Rekombinantti-DNA-materiaali, joka koodaa ksylanaasin kypsyvää muotoa, ja isäntäsolu - Google Patents

Description

111549

Rekombinantti-DNA-materiaali, joka koodaa ksylanaasin kypsyvää muotoa, ja isäntäsolu - Rekombinant-DNA-material, som kodar en mognande form av xylanas, och en värdcell v 5 Tämä keksintö liittyy rekombinantti-DNA-teknologiaan ja sen kohteena on jossakin prosessissa tietyn toiminnon omaava solu, joka sisältää vähintään yhtä entsyymiä koodaavan rekombinantti-DNA:n. Keksinnön kohteena on erityisesti elintarvikkeiden prosessoinnissa toimiva solu ja myös solut, joilla on jokin toiminto prosesseissa, joissa käytetään selluloosapitoista raaka-10 ainetta, kuten oluen, paperin, tärkkelyksen, gluteenin jne. valmistusprosesseissa, ja prosesseissa, joilla hajotetaan selluloosapitoista jätettä, kuten maanviljelysjätettä, paperitehtaiden jätettä jne.

Erityisesti keksinnön kohteena ovat solut, joilla on jokin toiminto fermentaa-15 tioprosessissa, erityisesti solut, joilla on jokin toiminto leivontatuotteiden valmistusprosessissa.

Keksinnön mukaiselle solulle on tunnusomaista, että vähintään yhtä entsyymiä koodaavan rekombinantti-DNA:n ekspressoituessa solu tulee sen proses-20 sin kannalta monitoiminnolliseksi, jossa sillä on jokin toiminto. Esimerkiksi fermentaatioprosessin, kuten leivänvalmistuksen tapauksessa, käytetään hii-

Φ I

’· vaa soluna, jolla on tälle prosessille nimenomainen tehtävä. Keksinnön mu kaisella hiivasolulla ei ole ainoastaan sen normaali tehtävä, so. tehtävä, jonka myös hiiva, jolla ei ole rekombinantti-DNA:a, voi suorittaa, vaan myös toinen 25 toiminto mainitussa leivänvalmistusprosessissa. Eräs esimerkki tällaisesta lisätoiminnosta on leipää parantavan entsyymin ekspressointi ja erittäminen.

> · ·

Esillä olevan keksinnön kohteena on erityisesti solu, jolla on jokin toiminto leivontatuotteiden valmistuksessa. Sopivia ovat sellaiset solut, jotka sisältävät 30 rekombinantti-DNA:n, joka koodaa sellaisten entsyymien joukosta valittuja 2 111549 entsyymejä, joilla on amylolyyttinen ja/tai hemisellulolyyttinen ja/tai seluro-lyyttinen aktiivisuus.

Keksinnön kohteena on myös menetelmä, jolla tuotetaan vähintään yhtä ent-5 syymiä edellä kuvatulla monitoiminnollisella solulla, jossa menetelmässä viljellään tällaista monitoiminnollista solua sopivassa ravintoalustassa ja valinnaisesti eristetään saatu entsyymimuoto. Entsyymi valitaan tässä menetelmässä mieluummin sellaisten entsyymien joukosta, joilla on amylolyyttinen ja/tai hemisellulolyyttinen ja/tai selluiolyyttinen aktiivisuus. Eräs sopiva alus-10 ta, jolla keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan, voi muodosta alustasta, jossa toteutetaan prosessi, jossa solu on monitoiminnollinen. Leivontatuot-teen valmistusmenetelmässä tämä alusta voi olla esimerkiksi leivottava taikina. Luonnollisesti voidaan käyttää myös muita solujen viljelyyn tavanomaisia alustoja. Alustojen valinta riippuu siitä, onko entsyymi tarkoitus käyttää 15 in situ tai onko se eristettävä. Eräissä tapauksissa on riittävää käyttää mainittua entsyymiä sisältävää alustaa ja toisissa tapauksissa entsyymi on eristettävä alustasta.

Keksinnön kohteena on myös tässä monitoiminnollisessa solussa olevan re-20 kombinantti-DNA:n koodaama entsyymi, jolloin tämä entsyymi voidaan saada tästä monitoiminnollisesta solusta edellä mainitulla entsyymin tuottomene-'· telmällä. Keksinnön kohteena on edelleen tällaisen monitoiminnollisen solun tai tällaisen entsyymin käyttö esimerkiksi edellä kuvatuissa prosesseissa, kuten elintarvikkeiden prosessoinnissa ja prosesseissa, joissa käytetään sellu-25 loosaa sisältävää raaka-ainetta, mieluummin leivontatuotteen valmistusprosessissa.

Leivän ja muiden leivontatuotteiden peruskomponentteja ovat jauhot, hiiva, vesi ja suola. Leivän ja samanlaisten leivontatuotteiden valmistuksessa, mitä 30 jäljempänä kutsutaan yksinkertaisuuden vuoksi leivän valmistukseksi, on jo vuosisatoja lisätty aineita, joilla on positiivinen vaikutus taikinan käsiteltävyy- < 3 111549 teen tai leivotun tuotteen laatuun. Nämä lisäaineet, joita kutsutaan "leivän-parannusaineiksi", sisältävät mallas- tai mikrobiperäisiä entsyymejä, joilla on tärkeä osuus leivänvalmistuksen eri vaiheissa, so. leipätaikinan valmistukses- sa, fermentoinnissa, paistamisessa ja leipätuotteen säilytyksessä.

5

Eräs leivälle tunnusomaisista ominaisuuksista, johon spesifisten entsyymien lisääminen vaikuttaa, on nk. leivän tilavuus. Jotta leivälle saataisiin suuri tilavuus, käytännössä lisätään sellulolyyttisiä, hemisellulolyyttisiä ja/tai amylo-lyyttisiä entsyymejä sisältäviä seoksia. Kaupallisesti saatavissa olevat mikro-10 biperäiset seokset, jotka on useimmiten saatu jonkin Aspergillus- ja Tricho-derma-suvun sienestä, ovat oleellisesti puhdistamattomia eri entsyymiaktiivisuuksien monimutkaisia seoksia. Tällöin ei tarkalleen tiedetä, mitä entsyymejä seoksessa on ja millä on leipää parantava aktiivisuus. Tämä tiedon puute haittaa leipien jatkokehitystä ja erityisesti se haittaa taikinan prosessoinnin ja 15 leivän eri ominaisuuksien, kuten leivän tilavuuden säätelyä.

Leivontatuotteiden valmistusprosessiin kohdistuneet jatkotutkimukset johtivat havaintoon, että a-amylaasin lisäksi ainakin myös ksylanaasientsyymi on tärkeä leivän tilavuudelle. Ksylanaasi on entsyymi, joka katalysoi "tärkkelyshän-20 tien” pentosaaniosassa esiintyvien ksylaanien hajoamista. Nimityksellä "tärk-kelyshännät" tarkoitetaan esimerkiksi vehnätärkkelysjaetta, joka muodostuu :· veteen liukenemattomasta hemiselluloosasta (pentosaaneista ja arabinoksy- laaneista) ja vaurioituneesta tärkkelyksestä. Tämä jae muodostuu tärkkelys-rakeen väli- tai päälikerroksena sentrifugoitaessa taikinasuspensiota, joka on 25 saatu, kun gluteenijae poistetaan taikinasta pesemällä. Kirjallisuudessa on jo kuvattu erilaisia ksylanaaseja, mukaanlukien bakteerilajien Bacillus pumilus • « (Panbangred et ai., Mol. Gen. Genet. 192, 335-341, 1983, ja Fukusaki et ai., FEBS Lett. 171.197-201,1984), Bacillus subtilis (Paice et ai., Arch.

30 Microbiol. 144. 201-206, 1986), ja Bacillus circulans (Yang et ai., Nucl. Acids Res. 16, 7187,1988) ksylanaasit, Auerobasidium-hiivan (Leathers, Biotech.

4 111549

Lett. 101. 775-780,1988) ksylanaasit ja Aspergillus niaer-sienen ksylanaasit (Fournier et al., Biotechnology and Bioengineering 2Z, 539-546,1985).

Eurooppalaisesta patenttihakemuksesta EP-A-0338452 tiedetään, että taiki-5 nan ominaisuuksia ja leivän laatua voidaan parantaa lisäämällä taikinaan erilaisia entsyymiseoksia, mukaanlukien entsyymiseos, jolla on hemiselluloosaa hajottava tai ksylanaasiaktiivisuus. Tämän alkuperää ei ole tarkemmin määritelty. Tällainen hemisellulolyyttinen entsyymiseos on suhteellisen määrittelemätön entsyymiseos, joka voi sisältää erilaisia hemisellulolyyttisiä entsyyme-10 jä, joilla on erilaiset vaikutukset taikinan ja leivän ominaisuuksiin. Ksylanaasi-en, joilla on leipää parantava aktiivisuus pienemmässä tai suuremmassa määrin, mukana on sattumanvarainen seuraus tavasta, jolla leivänparannus-aineeksi tarkoitettu entsyymiseos on saatu. Leivänparannusaineiden optimointi edelleen hallitusti ei kuitenkaan ollut mahdollista tarvittavan tiedon 15 puutteen vuoksi ja koska ei ollut sopivia rekombinantti-DNA-rakennelmia, jotka koodasivat leivänparannusaktiivisuutta ja joita olisi voitu käyttää tällaisen ksylanaasin tehokkaaseen tuottoon.

Tämän keksinnön tavoitteen kannalta tarkoitetaan "leivänparannusaktiivisuu-20 della" yleisesti sanoen edullista vaikutusta mihin tahansa valmistetun leivon-tatuotteen (mukaanlukien leivän) tai taikinan, josta leivontatuote tai leipä on tehty, ominaisuuteen ja erityisesti sillä tarkoitetaan suotuisaa vaikutusta leivän tilavuuteen.

25 Tutkimus, johon keksintö perustuu, on ulottunut entsyymiä, ksylanaasia, jolla on leivänparannusaktiivisuus ja joka on peräisin Aspergillus niger var. awa-mori-laiin sienestä, koodaavan geenin (xy|A) tunnistamiseen ja kloonaamiseen sekä erilaisten isäntäsolulajien transformoimiseen sellaisella tavalla, että geeni on ekspressoitu tai voidaan ekspresssoida näissä isäntäsoluissa. Kek-30 sintö käsittää kuitenkin kaikki sienistä ja erityisesti saman suvun sienilajeista 5 111549 peräisin olevat ksylanaasigeenit, eikä keksintö siten rajoitu kloonattuun geeniin.

<

Esillä olevan keksinnön kohteena on siten rekombinantti-DNA-materiaali, jolle 5 on tunnusomaista se, että se käsittää DNA:n, jossa on nukleotidisekvenssi, joka koodaa ainakin sieniperäisen ksylanaasin kypsyvää muotoa, jolla on leipää parantava aktiivisuus ja joka rekombinantti-DNA-materiaali käsittää DNA:n, jolla on kuviossa 1 esitetty nukelotidisekvenssi tai kuvan 1 mukaisen aminohapposekvenssin koodaavan nukleotidisekvenssin tai ne osat kuvan 1 10 mukaisesta aminohapposekvenssistä, jotka ovat oleellisia ksylanaasin aktiiviselle kypsyvälle muodolle, jolla on samantyppinen ksylanaasiaktiivisuus kuin kuvan 1 mukaisella aminohapposekvenssillä; ja nukleotidisekvenssi, jossa on delletioita, insertioita tai muutoksia, ja jolla on komplimentaarinen säie, joka kykenee hybridisoitumaan kovissa hybri-15 disoivissa olosuhteissa kuvan 1 mukaiseksi nukleotidisekvenssiksi, jotka kovat hybridisointisolosuhteet tarkoittavat inkubointia 6 x SSC lämpötilassa 68°C pesuvaiheella lämpötilassa 68°C 2x ja 0,4x SSC, ja koodaa samantyyppistä ksylanaasiaktiivisuutta kuin kuvan 1 mukainen aminohapposekvenssi, joka kypsyvä ksylanaasimuoto valitaan ryhmästä, johon kuuluu kypsät pre-, 20 pro- ja prepro-muodot.

Nimityksellä "kypsyvä muoto" tarkoitetaan eri muotoja, joissa entsyymi voi olla siihen liittyvän geenin ekspressoitumisen jälkeen. Tarkemmin sanoen se viittaa sekä luonnossa että ei-luonnossa esiintyviin prepro-, pre- ja pro-25 muotoihin ja "johtopeptidin" katkaisun jälkeen saatuun entsyymin lopulliseen valmiiseen muotoon.

Keksinnön tämän osan kohteena on mieluummin rekombinantti-DNA-materiaali, joka käsittää DNA:n, jossa on Aspergillus niger-peräisen ksylanaasin, 30 erityisesti Aspergillus niger var. ayvamori-peräisen ksylanaasin kypsyvää muotoa koodaava nukleotidisekvenssi.

111549 e

Keksinnön mukainen rekombinantti-DNA sisältää vähintään sekvenssin, joka koodaa sieniperäistä, erityisesti Asperaillus-ksvlanaasin kypsyvää muotoa. Rekombinantti-DNA voi lisäksi sisältää monen muun tyyppistä informaatiota, kuten säätelysekvenssejä (erityisesti transkription promoottorin) ja yhden tai 5 useamman markkerigeenin tavallisesti antaman vektoriosan. Nämä muut in-formaatiotyypit ovat usein yhteydessä valittuun isäntään. Siten esimerkiksi vektori, markkerigeenit ja säätelysekvenssit valitaan valitusta isännästä riippuen.

10 Rekombinantti-DNA, joka koodaa vähintään sieniperäistä kypsyvää ksylanaa-sia, voi kuitenkin sisältää myös muita valitussa isännässä ekspressoitavia geenejä. Tämä geeni voi edullisesti koodata vähintään yhtä muuta entsyymiä, jolloin tällä muulla entsyymillä on amylolyyttinen ja/tai hemisellulolyytti-nen ja/tai sellulolyyttinen aktiivisuus.

15

Keksinnön kohteena on edelleen isätäsolu, joka sisältää edellä määritellystä keksinnön mukaisesta rekombinantti-DNA-materiaalista saatua geneettistä materiaalia, ja vieläkin tarkemmin sanoen tällainen solu, joka kykenee eks-pressoimaan ainakin mainittuun rekombinantti-DNA-materiaaliin koodatun 20 ksylanaasin kypsyvän muodon. Erityisen hyvänä pidetään tällaista solua, joka on myös keksinnön mukainen monitoiminnollinen solu, ja erityisesti tällainen monitoiminnollinen solu, joka kykenee ekspressoimaan sieniperäisen ksylanaasin kypsyvää muotoa koodaavan rekombinantti-DNA-materiaalin raaka-aineessa olevissa olosuhteissa leivontatuotteen valmistuksen aikana.

25

Sekä monitoiminnollinen solu, joka sisältää keksinnön mukaista vähintään yhtä entsyymiä koodaavaa rekombinantti-DNA:a, että solu, joka sisältää keksinnön mukaista rekombinantti-DNA-materiaalia, joka koodaa sieniperäisen ksylanaasin kypsyvää muotoa, (sekä näiden yhdistelmä) voi joko olla solu, 30 joka itse on suora seuraus geenimanipulaatiosta, tai solu, joka on peräisin jollain tavalla solusta, joka on transformoitu tällaisen geenimanipuloinnin 7 111549 avulla. Keksintö käsittää lisäksi sekä elävät solut että solut, jotka eivät enää ole eläviä.

Keksintö ei periaatteessa millään tavoin erityisesti rajoitu solujen laadun suh-5 teen, vaikkakin suositeltuja ovat ne solut, jotka kykenevät ekspressoimaan sieniperäisen ksylanaasin kypsyvän muodon. Solut on kuitenkin mieluummin valittu joukosta, johon kuuluvat bakteerisolut, sienisolut, hiivasolut ja kasvi-solut.

10 Hyvänä pidettyjä esimerkkejä erityisen sopivista isäntäsoluista ovat (a) jomman kumman Aspergillus- tai Trichoderma-suvun sienisolut, erityisesti jonkin seuraavan lajin sienisolut: Aspergillus nioer var. niger. Aspergillus nioer var. awamori, Aspergillus nidulans. Aspergillus orvzae.

15 Trichoderma reisei ja Trichoderma viride; (b) jonkin Saccharomvces-, Kluvveromvces-. Hansenula- ja Pichia-suvun hiivasolut, erityisesti jonkin seuraavan lajin hiivasolut: Saccharomyces cerevisiae. Saccharomvces cariberoensis. Kluvveromvces lactis. Kluvve- 20 romvces marxianus. Hansenula polvmorpha ja Pichia rastoris: • (c) seuraavasta joukosta valitun kasvisuvun kasvisolut: vehnä, ohra, kaura, maissi, herne, peruna ja tupakka, kuten jomman kumman Soianum tuberosum- ja Nicotiana tabacum-laiin kasvisolut; ja 25 (d) jonkin Bacillus-. Lactobacillus- ja Streptococcus-baktee risuvun baktee- • · risolut, kuten Bacillus subtilis-lajin bakteerit.

Edellä määritellyt keksinnön mukaiset solut (monitoiminnolliset ja/tai vain 30 yksinkertaisesti solut, jotka sisältävät sieniperäisen ksylanaasin kypsyvää muotoa koodaavaa rekombinantti-DNA:a) voivat olla tärkeitä rekombinantti- 8 111549 DNA:n monistavina aineina tai aineina, joilla tuotetaan vähintään yhtä mainittuun rekombinantti-DNA:an koodattua entsyymiä, kuten ksylanaasin kypsyvää muotoa.

5 Entsyymin tuoton tapauksessa on mahdollista käyttää solua tuottamaan entsyymiä ja joko eristämään entsyymi viljelyalustasta tai käyttämällä entsyymiä sisältävää alustaa solujen poistamisen jälkeen sellaisenaan, tai monitoimin-nollisten solujen tapauksessa, voidaan itse soluja käyttää tuottamaan entsyymi in situ prosessissa, jossa ne ovat monitoiminnollisia.

10

Itse solujen suorakäyttö on mahdollista, esimerkiksi jos isäntäkantaa voidaan ilman vastaväitteitä käyttää elintarvikkeiden valmistuksessa, kuten on asianlaita erilaisten sieni-, hiiva-, kasvi- ja bakteerilajien kyseessä ollen. Leivänte-on yhteydessä voidaan esimerkiksi käyttää suoraan hiivakantoja, jotka on 15 geneettisesti käsitelty esillä olevan keksinnön mukaisesti.

Osittain valitusta isännästä riippuen käytetään ksylanaasia koodaava geeni joko tässä geenissä esiintyvien intronien kanssa tai ilman niitä, joko sen omien transkription terminaatiosignaalien kanssa tai muusta geenistä saatujen 20 kanssa, ja joko sen oman johtosekvenssin kanssa tai muusta geenistä saadun signaalisekvenssin kanssa. Hiivan, kuten Saccharomvces cerevisiae-hiivan (leivinhiivan) transformoinnissa on suositeltavaa, että intronit poistetaan, ja että oma johtosekvenssi korvataan hiivalle sopivalla signaalisekvens-sillä, kuten invertaasigeenin signaalisekvenssillä, millä varmistetaan kypsän 25 proteiinin oika prosessointi ja erittyminen.

*

Intronit on poistettava bakteereita, kuten Bacillus subtilis-bakteeria transformoitaessa. Signalaisekvenssinä voidaan tässä tapauksessa käyttää esimerkiksi a-amylaasin signaalisekvenssiä.

30 9 111549

Monille organismeille, mukaanlukien erilaisille bakteeri-, hiiva-, sieni- ja kasvilajeille tunnetaan jo sopivia transformointimenetelmiä ja sopivia ekspressoin-tivektoreita, jotka on varustettu esimerkiksi sopivalla transkriptiopromoottoril-la, sopivilla transkription lopetussignaaleilla ja sopivilla markkergigeeneillä, 5 joilla valitaan transformoidut solut. Hiivalle viite voi olla esimerkiksi Tajima et ai., Yeast 1,67-77, 1985, jossa on esitetty vieraan geenin ekspressointi hiivassa galaktoosilla indusoitavan GALZ-promoottorin kontrollin alaisena, ja Bacillus subtilis:lle esimerkiksi EP-A-0 157 441, jossa on kuvattu ekspressoin-tivektorina pmS48-plasmidi, jossa on SP02-promoottori. Muiden mahdolli-10 suuksien suhteen näissä ja muissa organismeissa viitattakoon yleiskirjallisuu-teen.

Esillä olevan keksinnön kohteena on myös sienen, erityisesti Asperaillus-peräisen ksylanaasin kypsyvä muoto, joka on saatu ekspressoimalla edellä 15 määritelty keksinnön mukainen rekombinantti-DNA-materiaali. Tässä yhteydessä pidetään erityisen hyvänä kypsää ksylanaasia, jolla on kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi, sekä pre(pro)-ksylanaasia, jolla on kuviossa 1 kuvattu aminohapposekvenssi, ja ksylanaasin aktiivisen vastaavan muodon mitä tahansa aminohapposekvenssiä, joka käsittää kuvion 1 mukaisen sek-20 venssin aminohapot, jotka ovat oleellisia ksylanaasiaktiivisuudelle. Keksinnön kohteena on siten tertiääriseen entsyymirakenteeseen johtava aminohappo-rakenne, jolla on sama entsyymiaktiviisuus kuin kuvion 1 sekvenssin omaavalla entsyymillä.

25 Keksinnön kohteena on myös menetelmä valmistaa sienen, erityisesti Asper-qillus-peräisen ksylanaasin kypsyvä muoto, jossa menetelmässä viljellään Φ · 4 9 monitoiminnollista solua, joka kykenee ekspressoimaan ksylanaasin kypsyvän muodon, tai solua, joka kykenee ekspressoimaan keksinnön mukaisen re-kombinantti-DNA-mäteriaalin, joka koodaa sieniperäisen ksylanaasin kypsy-30 vää muotoa, sopivassa ravintoalustassa ja valinnaisesti eristetään saatu ksylanaasin kypsyvä muoto. Nimitys "eristetään saatu ksylanaasin kypsyvä muo- 10 111549 to" käsittää myös osittaisen puhdistamisen, jossa otetaan talteen saadun ksylanaasin käsittävä entsyymiseos.

Esillä olevan keksinnön kohteena ovat edelleen leivänparannusseos, joka si-5 sältää entsyymiä valittuna joukosta entsyymejä, joilla on amylolyyttinen ja/tai hemisellulolyyttinen ja/tai sellulolyyttinen aktiivisuus, kuten ksylanaasin kypsyvää muotoa, erityisesti sienen, erityisesti Asperoillus-peräistä kypsää ksyla-naasia, jolloin tämä entsyymi on saatavissa keksinnön mukaisesta monitoi-minnollisesta solusta ja/tai keksinnön mukaisen rekombinantti-DNA:n, joka 10 koodaa sieniperäisen ksylanaasin kypsyvää muotoa, ekspressoinnista, ja leivänparannusseos, joka sisältää keksinnön mukaisia monitoiminnollisia soluja; jauhon ja taikinan seos, joka sisältää entsyymiä valittuna joukosta entsyymejä, joilla on amylolyyttinen ja/tai hemisellulolyyttinen ja/tai sellulolyyttinen aktiivisuus, kuten ksylanaasin kypsyvää muotoa, erityisesti sienen, erityisesti 15 Asperoillus-peräistä kypsää ksylanaasia, jolloin tämä entsyymi on saatavissa keksinnön mukaisesta monitoiminnollisesta solusta ja/tai keksinnön mukaisen rekombinantti-DNA:n, joka koodaa sieniperäisen ksylanaasin kypsyvää muotoa, ekspressoinnista; jauhon ja taikinan seos, joka sisältää keksinnön mukaisia monitoiminnollisia soluja; leivontatuote, joka on saatu käyttämällä näi-20 tä edellä kuvattuja jauhon ja taikinan seoksia; ja leivontatuotteen valmistusprosessi käyttämällä tällaisia jauhon tai taikinan seoksia, erityisesti joissa on mukana sienen, erityisesti AspergiHus-peräistä kypsää ksylanaasia.

Keksintö käsittää myös sieniksylanaasien muut käytöt, kuten niiden käyttö 25 oluen valmistuksessa suodatettavuuden parantamiseen, erityisesti valmistettaessa vehnäpohjaisia oluita, niiden käyttö paperinvalmistusteollisuudessa paperimateriaalin aiheuttaman veden absorption pienentämiseksi, niiden käyttö maanviljelysjätteen käsittelyssä jne.

30 Keksintöä on seuraavassa selitetty kuvaamalla laajalti leivänparannusaineeksi sopivan ksylanaasin tunnistamista, kloonausta ja ekspressointia. Esimerkeissä 11 111549 kuvatussa koetoiminnassa ksylanaasilähteenä käytetty sienikanta on Aspergillus niaer var. awamori CBS 115.52 (ATCC 11358). Keksijöiden suorittamien tutkimusten mukaan kanta kykenee vehnäleseellä indusoinnin jälkeen tuottamaan ksylanaasia, jolla on leipää parantavia ominaisuuksia, kun kasva-5 tusalustalla on näissä indusointiolosuhteissa a-amylaasiaktiivisuutta, alhainen glutanaasiaktiivisuus ja alhainen proteaasiaktiivisuus. Villityyppisen kannan tuottama ksylanaasimäärä on kuitenkin liian alhainen kaupallisessa prosessissa käytettäväksi. Tästä syystä keksintö tuo myös esiin geenikäsittelyt, joilla mahdollistetaan ksylanaasin biotekninen tuotto kaupallisessa mitassa.

10

Suoritetuissa kokeissa on eristetty ksylanaasientsyymiä koodaava geeni (xyJA-geeni) λ-vektorissa tehdystä kromosomaaliseen Aspergillus niger var. awamori-DNA-geenikiriastosta. Tätä eristämistä varten valmistettiin koetin, jonka koostumus johdettiin keksijöiden määrittämästä puhdistetun kypsän 15 proteiinin N-terminaalisesta aminohapposekvenssistä. Tämän koettimen avulla eristettiin joukko λ-klooneja, jotka mahdollisesti sisälsivät tämän geenin. Näistä positiivisista λ-klooneista kloonattiin edelleen DNA-fragmentti.

Tämän jälkeen määritettiin kloonatun kromosomaalisen DNA-fragmentin osan DNA-sekvenssi. Näiden tulosten ja mRNA-analyysin avulla on määritetty xvIA-20 geenin pituus, mRNA:n pituus ja intronin mahdollinen läsnäolo ja paikka.

Tuloksista voitiin päätellä, että svIA-oeeni koodaa 211 aminohapon proteiinia .' (pre(pro)-muoto), jossa 27 ryhmän pituinen "johtopeptidi" edeltää 184 aminohapon pituista kypsää proteiinia.

25 Ksylanaasigeenin, mukaanlukien xvlA-terminaattorin, sisältäviä ekspressointi-vektoreita on rakennettu kolme. Yhdessä näistä vektoreista sen omat eks- • · pressointisignaalit edeltävät xvlA-oeeniä. Toisessa vektorissa on xvIA-ekspressointisignaalit (ATG-kodoniin asti) korvattu Aspergillus nidulans-glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (gpdA)-geenin konstitutiivisilla eks-30 pressointisignaaleilla (kts. Punt et ai., Gene 69,49-57,1988), kun taas kolmannessa vektorissa xvlA-oeeniä edeltävät Aspergillus niger var. niger- 12 111549 glukkoamylaasi (glaA)-geenin indusoitavat ekspressointisignaalit. Kaikki eks-pressointivektorit sisältävät Aspergillus nidulans-asetamidaasi (amdS)-geenin selektointimarkkerin, kuten on kuvattu K. Wernars'in väitöskirjassa "DNA mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus nidulans", this, 5 Landbouw Hogeschool Wageningen 1986). Tämän selektointimarkkerin avulla voidaan saada transformantteja, joissa vektori, ja siten myös xvlA-aeeni. on integroitunut genomiin suuressa määrässä kopioita.

Monikopioisia transformantteja saatiin transformoimalla Asperaillus-kannat A.

10 niaer var. awamori ja A. niaer var. niaer N402 edellä mainituilla ekspressoin-tivektoreilla. Ksylanaasin tuotto mitattiin ravistelupullokokeissa sen jälkeen, kun saatuja transformantteja oli viljelty eri alustoissa. Tulokset (suurimmat tuottomäärät) on luetteloitu jäljempänä annetussa taulukossa A, jossa ksyla-naasiaktiivisuus on ilmoitettu 103 yksikköinä (U) ml:ssa. Yksi yksikkö määri-15 tellään siksi entsyymimääräksi, joka minuutissa vapauttaa ksylaanista 1 mg ksyloosia vastaavan määrän pelkistäviä ryhmiä.

13 111549

Taulukko A

Yhteenveto suurimmista ksylanaasin tuottomääristä ravistelupullokokeissa eri alustoissa viljeltynä 5 rikas tärk- kanta_promoottori ksvlaani alusta kelvs lese A. niaer 10 var.awamori xvl A s.c. 15 0 0 14 A. niaer var. niaer N402 xy[ A s.c. 5 n.d. n.d. 4 A. niaer 15 var.awamori xvl A m.c. 59 78 A. niaer var. niaer N402 xvl A m.c. n.d. 120 A. niaer var.niaer AB4.1 xvl A m.c. 36 140 20 A. niaer var.awamori gpdA m.c. 20 32 A. niaer var. niaer N402 gpdA m.c. 11 12 25 A. niaer var.awamori alaA m.c. 71 45 A. niaer var. niaer N402 alaA m.c. 54 72 30 s.c.: yksikopioinen villityyppinen kanta m. c.: monikopioiset transformantit n. d.: ei määritetty • · < 35 Ksylaanilla indusoinnin jälkeen monikopioiset A. niaer var. wamori- ja A. nl· aer var. niaer N402 "xvlA"-transformantit. joissa on xvlA-promoottori. tuottavat paljon enemmän ksylanaasia kuin villityyppiset A. niaer var. awamori- ja A. niaer var. niaer-kannat. Tästä ja geenin molekyylianalyysistä saatujen tulosten perusteella voidaan päätellä, että kloonattu koodi koodaa funktionaa- 14 111549 lista ksylanaasia. Edellä olevasta on lisäksi ilmeistä, että monikopioiset trans-formantit kykenevät aktiivisen entsyymin ylituottoon. Tällä entsyymiseoksella on myös leivontakokeissa halutut ominaisuudet.

5 Myös isäntä kantojen monikopioiset transformantit, joissa on heterologinen gpdA- tai alaA-promoottori. kykenevät tuottamaan aktiivista ksylanaasia enemmän. Rikkaassa alustassa "gpdA"-transformantit tuottavat ksylanaasia selvästi suuremman määrän kuin villityyppinen A. niaer var. awamori-kanta. Tehdyissä kokeissa havaitut tuottotasot ovat kuitenkin oleellisesti alhaisempia 10 kuin määrä, joka saadaan "xy!A"-monokopioisilla transformanteilla suoritetuissa testeissä. Tärkkelyksellä indusoinnin jälkeen "alaA"-monikopioisten transformanttien tuottotasot ovat verrattavissa "χνΙΑ''-monikopioisten trans-formanttien tuottomääriin ksylaanialustassa.

15 Vehnälesettä sisältävässä alustassa parhaimmat monikopioiset A. niaer var. awamori "χνΙΑ''-transformantit tuottavat paljon enemmän ksylanaasia kuin ksylaanialustan tapauksessa. Tässä alustassa parhaimmat A. niaer var. niaer N402 "xviA"-transformantit saavuttavat erittäin korkean ksylanaasin tuottotason. Parhaimmin tuottavat sekä A. niaer var. awamori- että A. niaer var. nl· 20 ger N402 monikopioiset "gpdA"-transformantit leseellä yhtä paljon ksylanaasia kuin rikkaassa alustassa. A. niaer var. awamori "alaAl,-tranformanttien tuotto vehnälesettä sisältävässä alustassa on alhaisempi kuin tärkkelyksellä.

A. niaer var. niaer N402 "alaA"-transformantit tuottavat kuitenkin tässä alustassa enemmän kuin tärkkelyksellä.

25

Aspergillus niaer var. niaer N402-transformanttien saavuttama tuotto on korkeampi kuin Aspergillus niaer var. awamori-transformanteilla. A. niaer var. awamori-transformanttien tuottotasoa voidaan kuitenkin vielä parantaa käyttämällä sopviia A. niaer var. awamori-mutanttikantoia. kuten A. niaer var.

30 awamori #40-kantaa, joka tuottaa selvästi enemmän ksylanaasia kuin villi-tyypin kanta. A. niaer var, awamori #40-mutantti on saatu mutagenoimalla 111549 15 A. giger var. awamori-itiot ia selektoimalla ksylanaasin tuoton suhteen. "xylA" A. niaer var. awamori #40-transformantti tuotti vehnäalustalla 190 000 U-ksylanaasia, mikä on huomattava kasvu verrattuna parhaiten tuottavaan A. niaer var. awamori-transformanttiin.

5

Muut kokeet koskevat näin tuotetun ksylanaasin eristämistä ja käyttöä leivänpä ran n usaineena (kts. esimerkki II) ja ekspressointikokeita hiivakannassa ja bakteerissa (vastaavasti esimerkit III ja IV). Esimerkki V taas osoittaa keksinnön mukaisen monitoiminnollisen hiivan käytettävyyden leivän valmistuk-10 sessa, jolloin tämä hiiva tuottaa ksylanaasia laihan leipätaikinan fermentoin-nin aikana.

Piirustuksissa: 15 Kuvio 1 esittää pAW14B-plasmidissa olevan noin 2,1 kb Pstl-PstI Asperoil-lus niaer var. awamori-fraamentin osan DNA-sekvenssiä. tämä fragmentti sisältää ksylanaasia koodaavan geenin, josta on käytetty nimitystä xvlA-aeeni. Translaation aloitus- ja pysäytyskodonit on alleviivattu kahdesti. 49 bp introni on alleviivattu. Kypsän pro-20 teiinin alkukohta on osoitettu. Kuviossa 1 on annettu myös yksikir jaimisella koodilla proteiinin (sekä pre(pro)-muodon että kypsän proteiinin) aminohapposekvenssi.

Kuvio 2 esittää A. niaer var. awamori'n, jossa on xvlA-qeeni kloonattuna 25 faageihin λ-l ja λ-14, genomi-DNA-alueen restriktiokarttaa. Käyte tyt lyhennykset: S: Sali; E: EcoRI; H: Hindlll; P: Esti; B: BamHI: S#: A-EMBL3:n polylinkkeristä saatu Sali-kohta; D: Sau3A.

Xyl06:n kanssa hybridisoituva 1,2 kb PstI*-BamHI-fragmentti on merkitty paksulla merkillä.

30 ,. 111549 16

Kuvio 3 esittää pAW14B-plasmidia, joka on saatu insertoimalla 5,3 kb A. niaer var. awamori Sali-fragmentti plasmidiin pUC19.

Kuvio 4 esittää pAW14S-plasmidia, joka sisältää xvlA-aeenin omine pro-5 moottoreineen ja amdS:ien selektiomarkkerina.

Kuvio 5 esittää pAW14B-2-plasmidia, joka sisältää xvlA-aeenin translaa-tiofuusion A. niculans qpdA-promoottorin kanssa.

10 Kuvio 6 esittää pAW14S-2-plasmidia, jossa on xvlA-aeenin translaatiofuu-sio Aspergillus nidulans gpdA-promoottorin kanssa ja amdS:ien selektiomarkkerina.

Kuvio 7 esittää pAW14S-3-plasmidia, joka sisältää xvlA-aeenin translaa-15 tiofuusion Aspergillus niaer olaA-promoottorin kanssa ja amdS:ien selektiomarkkerina.

Kuvio 8 esittää DNA-fragmentin BAK1 ja niiden synteettisten oligonukle-otidien, joista tämä fragmentti on muodostettu, nukleotidise-20 kvenssiä.

Kuvio 9 esittää kaaviollisesti pBAKl-plasmidin rakennetta.

Kuvio 10 esittää DNA-fragmentin pBAK2 ja niiden synteettisten oligonuk-25 leotidien, joista tämä fragmentti on muodostunut, nukleotidise- kvenssejä.

• ·'

Kuvio 11 esittää kaaviollisesti pBAK21-plasmidin rakennetta.

30 Kuvio 12 esittää kaaviollisesti pl)R2901-plasmidin rakennetta.

17 111549

Kuvio 13 esittää kaaviollisesti pUR2904-plasmidin rakennetta.

Kuvio 14 esittää kaaviollisesti pUR2921-plasmidin rakennetta.

5 Kuvio 15 esittää DNA-fragmentin BAK4 ja niiden synteettisten oligonukle-otidien, joista tämä fragmentti muodostuu, nukleotidisekvensse-jä.

Kuvio 16 esittää kaaviollsiesti pl)R2950-plasmidin rakennetta.

10

Kuvio 17 esittää kaaviollisesti pUR2951-plasmidin rakennetta.

Kuvio 18 esittää in vitro monistetun S. cerevisiae PGK-promoottorin nuk-leotidisekvenssiä. Kaksisäikeisessä sekvenssissä on primeerit esi- 15 tetty paksunnettuina, ATG-aloituskodoni on annettu varjostetulla alustalla ja restriktiokohdat EcoRI, Bglll, BspMI ja HindHI on annettu.

Kuvio 19 esittää kaaviollisesti pUR2918-plasmidien rakennetta.

20

Kuvio 20 esittää DNA-fragmentin BAK5 ja niiden synteettisten oligonukle-otidien, joista tämä fragmentti muodostuu, nukleotidisekvensse-jä.

25 Kuvio 21 esittää kaaviollisesti pUR2920-plasmidin rakennetta.

«·«

Kuvio 22 esittää kaaviollisesti pUR2922-plasmidin rakennetta.

Kuvio 23 esittää kaaviollisesti pUR2923-plasmidin rakennetta.

30 18 111549

ESIMERKKI I

ASPERGILLUS NIGER VAR. AWAMOR'IN KSYLANAASIGEENIN fxvIA) KLOONAUS JA KARAKTERISOINTI 5 1.1. Asoeraillus niaer var. awamori xvlA-aeenin eristäminen xylA-aeenin eristämiseksi Aspergillus niaer var. awamori'in kromosomaalises-ta DNA:sta syntetisoitiin erilaisia koettimia, jotka muodostuivat oligonukleoti-10 dien seoksesta (taulukko B). Näiden seosten koostumus johdettiin puhdistetun ksylanaasiproteiinin N-terminaalisesta aminohapposekvenssistä.

Taulukko B

15 Ksylanaasiproteiinin N-terminaalisesta aminohapposekvenssistä johdetut ko-ettimet

Ksylanaasiproteiinin N-terminaalinen aminohapposekvenssi:

XylOl TTAATACAXGTTTTAATATTACC

20 G G C G G G

Xy 10 4 CGGCCGTAGTTGATGCAGGTCTTG atgttgccgttgg acccgctgaa

Xyl05 ATGTTGCCATTAAAXCCACTGAA

G GG G

’· CC

Xyl06 CGGCCGTÄGTTGATGCAGGTCTTGATGTTGCCGTTGGAGCCGCTGAA

-C. C C_£_1_C CC_ 25

X=A, G, C tai T

XylOl: 256 oligonukleotidin seos, jossa on 23 desoksinukleotidin pala, jonka sekvenssi on komplementtien koodaavan säikeen aminohappoja 5-12 koo-daavan osan kanssa.

30 19 111549

Xyl04: Oligonukleotidi, jossa on 47 desoksinukleotidin pala, jonka sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja 2-17 koodaavan osan kanssa.

5 Xyl05:144 oligonukleotidin seos, jossa on 23 desoksinukleotidin pala, jonka sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja 10-17 koodaavan osan kanssa.

Xyl06: 256 oligonukleotidin seos, jossa on 47 desoksinukleotidin pala, jonka 10 sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja 2-17 koodaavan osan kanssa.

Xyl05:ssa ja Xyl06:ssa kodonien kolmanteen asemaan ei ole tuotu kaikkia niitä emäksiä, jotka voisivat olla mahdollisia, jotta seokseen ei saataisi enem-15 pää kuin 256 oligonukleotidiä.

Southern blot-analyysin avulla todettiin, että kromosomaalisen DNA:n pilk-komisseoksissa hybridisoitu stringenteissä olosuhteissa vain yksi vyöhyke käytettyjen koettimien kanssa. Aspergillus niaer var. awamori-DIMA;n EcoRI-, 20 Sali- ja BamHI-digesteissä hybridisoitu yksi vyöhyke, vastaavasti 4,4, 5,3 ja 9,5 kb, sekä Xyl01:n, Xyl04:n että Xyl06:n kanssa. Xyl05:lla ei havaittu mitään selvää signaalia 41°C:ssa. Tämän tuloksen perusteella hybridisoitiin Aspergillus nioer var. awamori-DNA:n -geenikirjasto 65°C:ssa koettimena käytetyn oligonukleotidiseoksen Xyl06:n kanssa. 650000:sta testatusta plakista 25 (tämä on 32 kertaa genomi) tämän koettimen kanssa hybridisoitu kolme plakkia (λ-1, λ -14 ja λ -63). λ -1- ja λ -14-DNA:n digestien ja Xyl06:n hybri- • % disoinnin jälkeen löydettiin λ -l:n EcoRI-digestistä >10 kb suuruinen hybridi-soituva vyöhyke. Hybridisoituvan vyöhykkeen koko λ -14:ssa ja kromosomaa-lisessa EcoRI-digestissä oli 4,4 kb. λ -l:n Sall-digestissä hybridisoitu 4,6 kb 30 vyöhyke; λ-14:η Sall-digestissä tämä on 5,3 kb vyöhyke, kuten kromoso-maalisessa DNArssakin. Myös 1,2 kb Pstl-BamHI-fragmentti (kuvio 2) hybri- 20 111549 disoituu Xyl06:n kanssa. Eri entsyymeillä saatujen restriktiokuvien ja λ-1:η ja λ-14:η digestien ja λ-14:η 5,3 kb Sali-fragmentin ristiinhybridisoitumisen perusteella varmistettiin, että nämä A:t sisälsivät Aspergillus niaer var. awamo-ri'n genomin päällekkäin meneviä fragmentteja. Myös koko indusoidun RIMA:n 5 homologinen hybridisoituminen vastaavasti λ-1:η, λ-14:η ja λ1-14:η 5,3 kb Sali-fragmentin kanssa vahvisti xylA-sekvenssien läsnäolon näissä plakeissa. Hybridisoituminen havaittiin noin 1 kb suuruisen, ksylaanilla indusoidun mRNA:n kanssa. Sen koko vastaa Xyl06:n kanssa hybridisoituvan mRNA-molekyylin kokoa.

10 1.2 A. niaer var. awamori zvl A-aeenin iatkokloonaus

Sali-fragmentit, jotka hybridisoituivat Xyl06:n kanssa ja olivat vastaavasti λΐ (4,6 kb) ja Λ14 (5,3 kb), kloonattiin kahdessa orientaatiossa pUC19:n Sall-15 kohtaan, jolloin saatiin vastaavasti plasmidit pAWl (A ja B) ja pAW14 (A ja B, kts. kuvio 3). Xyl06:n kanssa hybridisoituva 1,2 kb Pstl-BamHI-fraamentti ja viereinen 1,0 kb VamHI-Pstl-fraamentti vastaavasti plasmideista pAW14A ja pAWlA kloonattiin edelleen BamHI:lla ja Pstl:lla katkaistuun M13mpl8:aan ja M13mpl9:aan, jolloin saatiin taulukon C ml8/ml9 AW-vektorit.

20

Taulukko C

λ-1- ja A14-fragmenttien yksisäikeiset jatkokloonit 25 fragmentti_ Saadut vektorit

... PAM ** (1,2 kb) ml SAW iA-1 / ol9AW

1A-1 PAW14A BamHI-££tI* (1,2 kb) «18AW14A-1 / BU9AW14A-1

pAW IA £g£I-BainHI (1,0 kb) ml8AW 1A-2 / al9AW

30 3A-2 pAWl4A ££tI-BainHI (1.0 kb) ml8AW14A-2 / JD19AW14A-2 21 111549 1.3 xvlA-aeenin transkriptiosuunnan määrittäminen xvlA-aeenin transkriptiosuunta saatiin selville spot-blot-hybridisoimalla vastaavasti ml8AW14A-l:n ja ml9AW14A-l:n ss-DNAXyl06:n kanssa.

5 ml9AW14A-l:n ss-DNA:n (5' *PstI-BamHI 3') havaittiin hybridisoituvan tämän koettimen kanssa. Koska Xyl06:n sekvenssi vastaa ei-koodaavan säikeen sekvenssiä, ml9AW14A-l sisältää koodaavan säikeen. Tämän perusteella määritettiin kuviossa 2 esitetty transkriptiosuunta. Tämä suunta vahvistettiin primeerillä jatkamiskokeen tuloksista.

10 1.4 xvlA-aeenin tunnistaminen

Promoottorialueen osan DNA-sekvenssi määritettiin sekvenssianalysoimalla pAW14 käyttämällä Xyl06:a primeerinä (geenin 5'-osa). Tällä alueella primee-15 riksi valittiin Xylll, jonka sekvenssi oli 5'- GCA TAT GAT TAA GCT GC-3’ ja jonka avulla määritettiin ml8AW14A-l:n ja ml8AWlA-l:n komplementtisen säikeen DNA-sekvenssi. Tulokset osoittivat, että nämä vektorit sisälsivät DNA-sekvenssin, joka oli oleellisesti sama kuin Xyl06:lla, kun taas emäspa-risekvensseistä johdettu aminohapposekvenssi oli identtinen kypsän ksyla-20 naasiproteiinin N-terminaalisen aminohapposekvenssin kanssa. Näin todistettiin ainakin xylA-aeenin 5'-pään kloonautuminen. Geenin 5'-pään Sall-frao-'· menteissa olevan sijainnin (kuvio 2) ja xvIA mRNA:n koon (noin 1 kb) perus teella näytti todennäköiseltä, että pAW14- ja pAWl-vektoreissa oli xvlA-aeeni mukana kokonaisuudessaan.

25 1.5. Sekvenssianalyysi • · xvlA-aeenin emässekvenssi määritettiin kahteen suuntaan sekä ml3AW14-että ml3AWl-jatkoklooneissa Sanger'in dideoksimenetelmällä (Sanger et ai., 30 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467,1977). BamHI-kohdan ympärillä PstI*-kohdasta alavirtaan sijaitseva sekvenssi (kuvio 2) määritettiin kaksi- 22 111549 säikeisen pAW14- ja pAWI DNA:n sekvenssianalyysin avulla. Kompressiokoh-dat selvitetään käyttämällä dITP:a dGTP:n asemesta. Itsenäisissä klooneissa λ -1 ja λ-14 määritetään identtinen xvlA-sekvenssi. Kuviossa 1 on annettu pre(pro)-ksylanaasigeenin täydellinen (koodaava) sekvenssi. Kypsää ksyla-5 naasiproteiinia edeltää 27 aminohapon johtopeptidi. Asemien 16 ja 17 alanii-niryhmien välissä on luultavasti katkaisukohta signaalipeptidaasille. Johtopep-tidin pituudesta voidaan päätellä, että proteiinissa on toinen prosessointikoh-ta. Arg (27):n ja Ser (28):n välisen liitoksen katkaisee mahdollisesti KEX2-mainen proteaasi.

10 1.6 Intronin paikallistaminen xylA-geeniin ennustettiin 49 tai 76 bp:n (231-279 tai 231-306, kts. kuvio 1) suuruinen introni sillä perusteella, että mukana on sekvenssejä, jotka vastaa-15 vat intronien "donorikohtia" ja "akseptorikohtia" Asperoillus-sienissä. Selvä todistus 76 bp intronin puuttumisesta saatiin eristämällä ksylanaasipeptidi, jolla oli sekvenssi Tyr-Ser-Ala-Ser-Gly... Tämä peptidi voidaan sijoittaa proteiiniin vain asemasta 302 alkaen (kts. kuvio 1).

20 1.7 xvlA-oeenin 3'-oään määrittäminen : ‘ xvlA-oeenin pysäytyskodonin asema (asema 683 kuviossa 1) johdettiin DNA- sekvenssitiedoista. Tämän pysäytyskodonin varmisti se, että peptidin aminohapposekvenssi on identtinen DNA-sekvenssitiedoista johdetun C-terminaa-25 lisen aminohapposekvenssin kanssa (asemat 641-682 kuviossa 1).

1.8 DNA- ia proteiini-tietoien arviointi

Edellä olevien tietojen perusteella kloonataan Aspergillus niaer var. awamo-30 rfn ksylanaasia koodaava geeni 5,3 kb Sali-fragmenttiin. Geenin DNA-sek-venssi, intronin paikka ja mRNA:n pituus määritettiin. DNA-sekvenssi vahvisti 23 111549 täysin määritetyn kypsän proteiinin N-terminaalisen aminohapposekvenssin. Edellä saatujen tietojen perusteella voidaan päätellä, että xylA-aeeni koodaa 211 aminohapon proteiinia, ja että ensimmäiset 27 aminohappoa poistetaan translaation jälkeen. Aminohapposekvenssillä, joka on johdettu xvlA-aeenin 5 DNA-sekvenssistä, on korkea homologia Bacillus pumilus (201 aminohappoa) ja Bacillus ciculans (213 aminohappoa mukaanlukien signaali)-ksylanaasien aminohapposekvenssin kanssa.

2 Ekspressointivektorit 10

Rakennettiin kolme ekspressointivektoria, jotka sisälsivät genomisen xvIA-geenin translaation alkukohdasta lähtien, mukaanlukien xvlA-terminaattori.

Nämä vektorit saatiin pAW14B:sta (kuvio 3).

15 2.1 Vektori PAW14S. jossa on Aspergillus niaer vara, awamori'n xvlA- promoottori

Vektori pAW14S (kuvio 4) käsittää 5,3 kb suuruisen Aspergillus niaer var. awamori'n kromosomaalisen DNA-fragmentin, jossa on xvlA-aeeni omine 20 ekspressointisignaaleineen. Tässä plasmidissa on lisäksi Aspergillus nidulans-homeen 5,3 kb fragmentti, jossa asetamidaasi (amdS)-geeni sijaitsee. amdS-’· ja xylA-aeenillä on pAW14S:ssa sama transkription suunta.

2.2. Vektori PAW14S-2. jossa on Aspergillus nidulans'in apdA-promoottori 25

Plasmidi pAW14S-2 (kuvio 6) eroaa pAW14S:sta siinä suhteessa, että xylA- • * geenin ATG-kodonista vastavirtaan sijaitseva Aspergillus niaer var. awamori-fragmentti on korvattu Aspergillus nidulans-alvseraldehvdi-3-fosfaattidehvd-rogenaasi (gdpA)-geenin konstitutiivisilla ekspressointisignaaleilla (ATG-trip-30 lettiin asti). amdS- ja xvlA-qeenien orientaatio on plasmidissa sama. Oikea yhteys gpdA-promoottorin ja xvlA-aeenin ATG-kodonin välille saatiin synteet- 24 111549 tisen DNA-fragmentin avulla. Rakentamisen aikana saatiin myös plasmidi pWA14B-2f josta puuttuu amdS-selektointimarkkeri (kuvio 5).

2.3 Vektori PAW14S-3. jossa on Aspergillus niaer var. niaer'in alaA-5 promoottori

Vektori pAW14S-3 (kuvio 7) käsittää Aspergillus niaer var. njger-glukoamy-laasi falaAVaeenin indusoitavat ekspressointisignaalit ATG-kodoniin asti ja tämän jälkeen Aspergillus niaer var. awamori'n sekvenssit alkaen xvlA-aeenin 10 ATG-tripietistä. Tämä plasmidi sisältää lisäksi selektointimarkkerina Aspergillus nidulans'in amdS-aeenin. amdS-ia xvlA-aeeneillä sama orientaatio.

amdS-selektointimarkkerin avulla voidaan saada transformantteja, joissa on kolme edellä mainittua plasmidia ja joissa vektori, ja siten myös valinnaisesti 15 hybridi xy|A-geeni, on integroitu genomiin suuressa määrässä kopioita, millä lisätään ksylanaasiproteiinin tuottoa.

3 Speraillus'in transformoin^ 20 Aspergillus niaer var. awamori'n transformointitiheys vaihteli välillä 0,03 - 0,23 (AW) transformanttia vektori-DNA:n μg kohti. Tällä tavoin saatiin yhteensä viisi AW14S fxvIA-promoottorO. neljäkymmentä AW14S-2-fgpdA-promoottori) ja kahdeksan AW14S-3-(glaA-piOmoottori)-transformanttia. Eri transformanteilla osoittautui jatkotutkimuksissa olevan erilainen käyttäyty-25 minen kasvussa. Yksi niistä, AW14S #1, tuotti hyvin itiöiviä (AW14S #1A) ja huonosti itiöiviä (AW14S #1B) pesäkkeitä.

Aspergillus niaer var. niaer N402:n transformointi tapahtui tehokkaammin kuin Aspergillus niaer var. awamori'n. Vektoreilla pAW14S, pAW14S-2 ja 30 pAW14S-3 saatiin vastaavasti 0,3, 0,3 ja 1 (AB) tranformanttia DNA: n mg kohti. Maljoille siveltiin kaksikymmentä pAB14S- fxvIA-promoottorO. kolme- 25 111549 kymmentä pAB14S-2- (gpdA-promoottori) ja kuusitoista pAB14S-3- (glaA-promoottori)-transformanttia.

Aspergillus niaer var. niaer pvrG-AB4.1:n ko-transformointi pAW14S:n kanssa 5 ja Aspergillus niger var. niger pvrG-geenin ko-transformointi pAB4.1:ssa johti 0,2 transformanttiin pAW14S-DNA:n μς kohti, kun molemmat markkerit se-lektoitiin. Selektoitatessa ensimmäisen kerran amdS:n suhteen saatiin 2 transformanttia ϋΝΑ-μς kohti, kun taas ensimmäisessä selektoinnissa ovrG:n selektoinnin suhteen frekvenssi oli noin 20 μς pAW14S-DNA. Noin 30 %:lla 10 ko-transformanteista (AB4.1-14S) näytti olevan molemmat markkerit. Kuusi niistä analysoitiin tarkemmin.

4 Monikopioisten transformanttien analyysi 15 4.1 A. nioer var. awamori "xvlAMransformanttien (AW14S1! analyysi sen jäl keen. kun näitä oli analysoitu alustassa, jossa oli indusorina ksvlaania

Kun AW14S-transformantteja viljeltiin indusorina käytetyn ksylaanin kanssa, saavutettu ksylaanin tuottotaso alustassa 10 päivänä jälkeen oli merkittävästi 20 suurempi kuin villityyppisellä Aspergillus nioer var. awamori-kannalla. Kun entsyymiä säilytetään 4°C:ssa alustassa, se on täysin stabiili. Seuraavassa taulukossa D on annettu tuottotasot ksylaanialustassa.

Taulukko D 25 AW14S-transformanttien ksylanaasin tuottotasot (103 U/ml) eripituisten vilje-

9 · I

lyjen jälkeen ksylaanialustassa 25°C:ssa 26 111549 N:o_3 päivää_10 päivää IA 28 58 2 21 56 3 20 31 5 4 25 58 5 8 22 wt 5 13 4.2 Aspergillus niaer var. niaer N402 "xvlAVko’ltransformanttien ΓΑΒ4.1-10 14S^ analwsi sen jälkeen, kun niitä on viljelty ksvlaania indusorina sisältä vässä alustassa

Ksylanaasiaktiivisuus määritettiin Aspergillus niaer var. niaer pvrG AB4.1-isäntäkannan ja seitsemän AB14S-1 Pyr+ ko-transformantin ksylaanialustas-15 sa vastaavasti 48 ja 72 tunnin viljelyn jälkeen (kts. taulukko E). Aspergillus niaer var. niaer AB4.1 tuottaa ksylanaasia vähän (noin 5000 U). Neljällä ko-transformantilla seitsemästä saatiin korkea ksylanaasiaktiivisuus, joka oli noin 30 000 U. Muut ko-transformantit tuottivat jonkin verran vähemmän ksylanaasia.

20

Taulukko E

AB4.1-14S-ja AB14S-transformanttien ksylanaasin tuotttasot (103 U/ml) eripituisten viljelyjen jälkeen ksylaanialustassa 25°C:ssa 25 * · a 27 111549 AB4.1-14S_48 tuntia 72 tuntia #1 36 36 #6 31 20 #12 29 23 5 #23 10 6 #42 15 10 #44 21 30 #45 pyrG 22 18 AW.wt 3 7 10 N402 3 5 ABA.l 4 5 4.3 Ylituotetun ksvlanaasientswmin karakterisointi 15 Aspergillus nioer var. awamori ja Aspergillus niger var. niger N4Q2 monikopi-oisten "xvlA"-transformanttien alustan suuresti nousseesta ksylanaasiaktiivi-suudesta voidaan päätellä, että kloonattu geeni koodaa Aspergillus niger var. awamori'n ksylanaasia ja että transformantit kykenevät ylituottamaan aktiivista ksylanaasia. Halutun tuotteen läsnäolo osoitettiin AW14S #lA:n alustan 20 proteiinin kemiallisella analyysillä. Alustassa oli mukana yhtä vallitsevaa proteiinia. Tämän pääkomponentin isoelektrinen piste (pl) ja N-terminaalinen aminohapposekvenssi vastasivat villityyppisestä Aspergillus nioer var. awa-mori'sta saadun puhdistetun ksylanaasin arvoja. Saatu pl-arvo vastasi 184 aminohapon kypsälle proteiinille laskettua arvoa, kun proteiinin koostumus oli 25 johdettu DNA-sekvenssistä. Tuotetulla ksylanaasilla osoittautui olevan halutut ominaisuudet myös leivontatesteissä.

28 111549 4.4 A. niaer var. awamori (rAAW14S-21 la A. niaer var. niaer fAB14S-2^ "QDdA,,-transformanttien analwsi rikkaassa alustassa viljelemisen jälkeen

Kuutta AW14S-2-transformanttia viljeltiin rikkaassa alustassa (taulukko F).

5 Kahden - kolmen päivän kuluttua kolmen transformantin alustassa saatiin ksylanaasiaktiivisuudeksi 15 000 - 20 000 U, kun taas muut kolme tuottivat alle puolet tästä aktiivisuudesta. Villityyppinen kanta ei tuota ksylanaasia rikkaassa alustassa. Lisäksi testattiin kymmenen AB14S-2-transformanttia. Näistä kolme tuotti ksylanaasia noin 11 000 U 40 tunnin jälkeen, mikä taso säilyi 10 vähintään 72 tuntiin asti. Muut viisi tuottivat vähemmän ksylanaasientsyymiä, jolloin #21B:n alustassa aktiivisuus laski 9 000 yksiköstä 0 yksikköön 24 tunnissa.

Parhaiten tuottavien AW14S-2- ja AB14S-2-transformanttien tuottomaksimien 15 osoitettiin olevan yleisesti ottaen toistettavia. Maksimia ei kuitenkaan saavuteta, kun rihmasto kasvaa suurina pallosina, kun taas korkeampi maksimi (11 000 U:n asemesta 19 000) havaittiin AB14S-2 #5:n toisessa kaksoisvil-jelmässä. Tuottotasot on annettu taulukossa F.

20 Tulokset osoittavat, että on mahdollista tuottaa aktiivista ksylanaasia trans-laatiofuusioimalla gpdA-promoottori ja xvlA-aeeni. gpdA-promoottorin säätelemien kummankin AW14S-2- ja AW14S-2-transformanttien avulla tapahtuva tuotto rikkaassa alustassa on kuitenkin alhaisempi kuin "xvlA"-transformant-tien ksylanaasituotto alustassa, jossa on ksylaania.

25

Taulukko F

AW14S-2- ja AB14S-2-transormanttien ksylanaasin tuottotasot (103 U/ml) eripituisten viljelyjen jälkeen rikkaassa alustassa 25°C:ssa 30 29 111549 AW14S-2 24 tuntia 48 tuntia 72 tuntia #1 <1 3 >3 #4 1 2 2 #10 11 15 13 #22 A * 4 20 20 #36 3 77 #39 * 10 16 12 AB14S~2 24 tuntia 40 tuntia48 tuntia gg tuntia 72 tuntia 10 #2 4 4 9 #5 A 3 11 11 11 12 ' kaksois 15 16 19 ; #7 A 1 5 5 5 4 #8 4 3 4 #11 <1 <1 1 1 0 15 #14 2 2 3 #16 A3 10 10 11 10 #17 A3 10 11 10 10 #18 1 5 8 10 8 #2 IB 4 8 9 0 0 20 Δ-maksimit saatiin toistamalla viljely; AB14S-2 #5:n kaksoisviljely antoi suuremman maksimin. A. nioer var. awamori ja AW14S #4-transfromantti eivät tuota rikkaassa alustassa ksylanaasia.

4.5 Aspergillus niaer var. awamori (AW14S-3) ia Asperoillus niaer var. niaer 25 (AB14S-3) "alaA'-transformanttien analyysi sen jälkeen, kun niitä on viljelty alustassa, ioka sisältää indusorin tärkkelystä

Muutamia AW14S-3-transformantteja ja Aspergillus nioer var. awamori-villityyppistä kantaa viljeltiin tärkkelysalustassa (taulukko G). Yhden trans-30 formantin alustassa saatiin ksylanaasiaktiivisuudeksi 67 000 U/ml 90 tunnin viljelyn jälkeen, kun taas kahden muun transformantin aktiivisuus oli 30 111549 36 000 U/ml asti. Kuuden analysoidun AW14S-3-transformantin tuottomak-simi on yhtä päivää varhaisempi kuin AW14S-3-transformanttien. Yhden transformantin alustan aktiivisuudeksi saatiin 51 000 U/ml, kun taas muut kaksi tuottivat noin 43 000 U/ml 63 tunnin viljelyn jälkeen. Tulokset osoitta-5 vat, että alaA-promoottorin ja xvlA-oeenin translaatiofuusio on tapahtunut oikealla tavalla. Sekä AW14S-3- että AB14S-3-transformantit tuottavat oleellisesti yhtä paljon ksylanaasientsyymiä tärkkelysalustassa alaA-promoottorin sääteleminä kuin "χνΙΑ''-transformantit ksylaania sisältävässä alustassa.

10 Taulukko G

"glaA"-transformanttien AW14S-3 ja AB14S-3 ksylanaasituottotasot (103 U/ml) eripituisten viljelyjen jälkeen (tuntia) tärkkelysalustassa 25°C:ssa 15 40 tuntia 63 tuntia 90 tuntia AW14S-3 #1 37 37 #2 4 14 15 #4 8 31 36 #7 16 49 67 2Q AB14S-3 #4 23 51 29 #5 19 37 21 #7 23 44 18 #8 17 28 32 #14 21 43 19 25 #16 6 21 10 · 3i 111549 4.6 "xvlA"-transformanttien analwsi sen jälkeen, kun niitä on viljelty vehnä-lesettä sisältävässä alustassa

Tuloksista (taulukot H ja I) näkyy, että AW14S #4:Ha havaittu tuottotaso on 5 korkeampi vehnälesettä sisältävässä alustassa viljeltynä kuin ksylaanialustas-sa. AB4.1-14S (#1 ja #44) ja AB14S (#5 ja #14) -transformanteilla saatu tuottotaso oli korkea. Näillä transformanteilla saatiin määritetyksi ksylanaasi-aktiivisuudeksi niinkin korkea luku kuin 140 0000 U/ml. Tämä tarkoittaa huomattavaa kasvua verrattuna ksylaanialustassa tapahtuvaan tuottoon 10 (30 000 U/ml). Lisäksi näyttää siltä, että näiden Aspergillus niaer var. niger- transformanttien tuottotaso säilyy viljelyajan pidentyessä, kuten aikaisemmin havaittiin Aspergillus niger var. awamori "χνΙΑ''-transformanteilla ksylaanialustassa.

15 4.7 "gpdA"-transformanttien analyysi sen jälkeen, kun niitä on viljelty vehnä- lesettä sisältävässä alustassa AW14S-2 #22 ja #39 tuottivat ksylanaasia 28 000 U/ml asti. AB14S-2 #5 ja #17-transformantit tuottivat suhteellisen vähän ksylanaasia (aktiivisuus 20 15 000 U/ml asti) vehnäleseellä, kuten myös havaittiin rikkaalla alustalla.

Tuottotasot on annettu taulukoissa H ja I.

4.8 "glaA"-transformanttien analyysi sen jälkeen, kun niitä on viljelty alustassa. jossa on vehnälesettä 25

Testatut AW14S-3 (#1 ja #7)-transformantit tuotttivat vastaavasti ksylanaasia 25 000 ja 45 000 U/ml asti vehnälesettä sisältävässä alustassa, mikä on kummallekin noin 60 - 65 % tärkkelyksellä saaduista arvoista (taulukko I).

Sen sijaan transformanteilla AB14S-3 (#4 ja #14) saatiin korkeampi tuotto 30 vehnäleseellä kuin tärkkelyksellä. Määritellyt tuottotasot ovat 1,5 kertaa kor- 32 111549 keammat kuin tärkkelyksellä. AB14S-3:lla saatiin 72 000 U/ml. AB14S-3 #14:lla saatiin arvoksi 66 000 U/ml (taulukko I).

Taulukko H 5

Eräiden AW ja AB "xvIA" ja "gpdA"-transformanttien ksylanaasin tuottotasot (103 U/ml) eripituisten viljelyjen jälkeen lesettä sisältävässä alustassa 25°C:ssa 10 40 tuntia 63 tuntia 4 päivää 7 päivää 12 päivää

Aw vt 1 2 16 17 AW14S /4 8 20 27 61 80 AB14S #14 6 74 114 126 122 AB4.1-14S #1 17 87 123 135 145 AW14S-2 #22 17 22 22 34 33 AW14S-2 #39 18 22 21 24 20 15 AB14S-2 #5 13 15 11 8 8 AB14S-2 #17 9 13 11 7 7 * 1 · 33 111549

Taulukko I

AW- ja AB-transformanttien ksylanaasin tuottotasot (103 U/ml) sen jälkeen, kun niitä on viljelty eri ajat vehnälesealustassa 25°C:ssa 5 2 päivää 3 päivää 4 päivää 7 päivää 9 päivää 14 päivää AV Vt 2 8 10 11 H402 Vt 421

AW14S

#1A 18 39 51 10 #4 - 34 67 76 76

AB14S

#5 45 80 100 111 109 118 #14 45 77 79 100 92

AB4.1-14S

#1 95 90 73 #44 121 144 148 145 15 AW14S-2 #22 22 29 29 #39 17 26 28 AB14S-2 #5 15 14 12 #17 10 11 9 - AW14S-3 20 #1 18 26 25 #7 37 45 45 41 AB14S-3 #4 72 54 44 23 17 #14 64 66 69 55 55 55 25 4.9 Tulosten arviointi * ·

Taulukkoon A kootut tulokset osoittavat, että Aspergillus niaer var. awamo-ri'n (AW14S) ja Aspergillus nioer var. nioer'in (AB14S) monikopioiset trans-formantit kykenevät ylituottamaan aktiivista ksylanaasia sen jälkeen, kun nii-30 den oma xvlA-promoottori on vastaavasti indusoitu indusorina käytetyllä ksy-laanilla ja vehnäleseellä. Aspergillus nioer var. awamori'n ja Aspergillus nioer „ 111549 34 var. niaer N402:n, kun niissä on xvlA-geeni qpdA-promoottorin (vastaavasti AW14S-2 ja AB14S-2) ja alaA-promoottorin (vastaavasti AW14S-3 ja AB14S- 3) kontrollin alaisena, monikopioisten transformanttien ksylanaasin ekspres-sointi osoittaa, että ksylanaasia voidaan tuottaa hyvin erilaisissa substraateis-5 sa. Eri transformanttien välisten tuottokykyjen vaihtelu voi johtua kopioluvun eroista ja/tai genomiin tapahtuvan integraation paikan eroista. Luonnollisesti myös testausolosuhteilla voi olla merkittävä vaikutus ksylanaasin tuottoon.

Tuoton optimoimiseksi ensisija on kuitenkin kannoilla, joilla on suhteellisen korkea tuottokyky.

10 5 Materiaalit ia menetelmät 5.1 Kannat ia plasmidit 15 Kokeissa käytettiin seuraavia kantoja ja plasmideja: - Asoeraillus niaer var. awamori kanta CBS 115.52, ATCC11358; - Asoeraillus niaer var. niaer kanta N402 Asoeraillus niaer var. niaer ATCC9029, CBS 120.49:in cspAl (lyhyet konidioforit)-mutantti; 20 - Asoeraillus niaer var. niaer AB4.1, Van Hartingsveldt'in et ai.,

Mol.Gen.Genet. 206, 71-75,1987, kuvaama Asoeraillus niaer var. niaer N4Q2:n PvrG-mutantti: - Escherichia coli-kanta JM109 (plasmidin eristäminen, kts. Yanisch-Perron et ai., Gene 33, 103-119, 1985); 25 - Escherichia co|i-kanta NM539 (lambda-geenikirjasto rakentamista ja monis tamista varten); : ♦ € - plasmidi pGW325, jossa on Asoeraillus nidulans’in amdS-aeeni (kts. K.

Wernars, "DNA-mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus nidulands", väitöskirja, Agricultural University of Wageningen, 1986; 30 - plasmidi pAB4.1, jossa on Aspergillus niaer var. niaer N402:n pvrG-geeni, kts. Van Hartingsveldt et ai., Mol.Gen.Gent. 206, 71-75,1987; 35 1 1 15 4 9 - plasmidi pAN52-l, jonka on kuvannut Punt et al., Gene 56, 117-124,1987; ja plasmidi pAN52-6, jonka on kuvannut PJ. Punt, J. Biotechn., painossa; - vektori -EMBL3 fAspergillus niaer var. awamori-geenikiriaston rakentamista varten), saatavissa Promega Biotec.:Itä.

5

Escherichia coli JM109-kanta, jossa on plasmidi pAW14B, tallennettiin CBS-kokoelmaan (Centraalbureau voor Schimmelcultures), Baarn, Holland, numerolla CBS 237.90, toukokuun 31. päivänä 1990.

10 5.2 Asperoillus'in transformointi

Aspergillus niger var. awamori-protoplastit tehtiin myseelistä Novozym 234-entsyymin (NOVO) avulla. Protoplastien saanto oli 1 - 5 x 107/g myseeliä ja eloonjäänti 3 - 8%. Transformaatiota varten inkuboitiin 3 - 8 x 105 elävää 15 protoplastia 5,10 tai 2 0 mg kanssa plasmidi-DNA:a, joka oli kahdesti puhdistettu CsCI:n avulla. Transformoidut protoplastit maljattiin osmoottisesti stabiloiduille selektointimaljoille (typpilähteen asetamidi) ja inkuboitiin 25°C:ssa. Pesäkkeet olivat havaittavissa 6-10 päivän kuluttua. Aspergillus niger var. nioer N402:n ja vastaavasti A. niger var. niger AB4.1:n transfor-20 mointi suoritettiin periaatteessa edellä kuvatulla tavalla. Aspergillus nioer var. nioer pvrG AB4.1:n tapauksessa alustaan lisättiin kuitenkin uridiinia. A. nioer * • var. nioer AB4.1:n ko-transformoinnissa sekoitettiin pAW14S- ja pAB4.1- DNA:a painosuhteessa 4:1; transformantit selektoitiin vastaavasti uridiinia sisältävillä asetamidimaljoilla (amdS-selektointi), ilman uridiinia (amdS- ja 25 pvrG-selektointi) ja minimimaljoilla, joissa oli nitraattia (pyrG-selektointi). Pesäkkeet tulivat näkyviin 4-5 päivän kuluttua. (Ko-)transformantit siveltiin kahdesti asetamidimaljoille. Jotta saataisiin suuri määrä itiöitä, toisesta sive-lystä otetut itiöt siveltiin rikasta alustaa sisältäville maljoille ja inkuboitiin 5-6 päivää 25 -28°C:ssa. Saadut itiöt säilytettiin suspensiona (108 - 109 itiö-30 tä/ml) tai silikageelille adsorboituna niin, että itiöitä voidaan säilyttää pitkän aikaa.

36 111549 5.3 A. niaer var. awamori-aeenikiriaston rakentaminen

Kromosomaalinen DNA eristettiin Aspergillus niaer var. awamori'n myseelistä. Suurimolekyylinen DNA pilkottiin osittain Sau3Al:lla. minkä jälkeen 13,17 kb 5 fragmentit eristettiin 0,4-prosenttisella agaroosigeelillä suoritetun elektroforeesin jälkeen. Näitä fragmentteja ligatoitiin 0,4 mg 1,2 mg kanssa -EMBL3-DNA:a, joka oli pilkottu BamHI:lla ja EcoRI:lla. Ligatointiseokseen laitettiin faagikalvoja in vitro-pakkaussysteemin (Amersham) avulla. Noin 154 000 plakin geenikirjasto saatiin transduktoimalla e. colj NM539:aan. Tämä oli noin 10 75 x A. niaer var. awamori'n genomi. 65 000 plakkia siirrettiin nitroselluloosa- suodattimille (duplikaatteina).

5.4 Hvbridisointikokeet 15 Southern blot-analyysi: kromosomaalisen A. niaer var. awamori-DNA:n diges-tien hybridisointi radioaktiivisesti leimattujen oligonukleotidiseosten Xyl04 ja Xyl06 (47 mer) kanssa suoritettiin 6 x SSC:ssa vastaavasti 68°C:ssa, 62°C:ssa ja 56°C:ssa; Xyl01:lle ja Xyl05:lle (23 mer) kätyettiin 41°C hybridisointilämpö-tilaa. Valittu hybridisointilämpötila oli vähintään 5°C alempi kuin laskettu su-20 lamislämpötila. Täplät pestiin hybridisointilämpötilassa vastaavasti 5 x SSC:lla ja 3 x SSC:lla. Hybridisointi suoritettiin 68°C:ssa 6 x SSC:ssa, jolloin viimeiset » t pesuvaiheet suoritettiin samassa lämpötilassa vastaavasti 2 x SSC:lla ja 0,4 x SSC.IIa.

25 Northern blot-analyysi: A. niaer var. awamori'n indusoimaton kokonais-RNA eristettiin rikasalustaisista viljelmistä saadusta rihmastosta (viljelty 3 päivää ' · · 25°C:ssa). Indusoitu RNA saatiin viljelmistä, joissa oli käytetty indusorina 1 % ksylaania tai 4 % vehnälesettä. Myseeli kerättiin viime mainituista viljelmistä eripituisten viljelyaikojen jälkeen. Alustasta, jossa oli vehnälesettä, 30 eristettiin myseeli vastaavasti 3 ja 6 päivän jälkeen. Ksylaanialustan myseeli 37 111549 otettiin talteen vastaavasti 6 ja 11 päivän viljelyn jälkeen. Hybridisointiolo-suhteet olivat samat kuin Southern blot-analyysissä.

5.5 Viljelyolosuhteet 5

Alustat: ksylaanialusta sisältää 1 % ksylaania, 0,67 % hiivauutetta (Difco), jossa on amihappoja ja 0,1 % cas.aminohappoja. Vehnälesettä sisältävä alusta sisältää 4 g vehnälesettä 50 ml:ssa vesijohtovettä, johon on lisätty 50 ml suolaliuosta (pH 5,0) niin, että loppukonsentraatiot ovat: 0,5 % 10 (NH4)2S04, 0,15 % KH2P04, 0,025 % MgS04 ja 0,025 % KCI. Rikas alusta ekspressointitestejä varten on minimialusta (0,05 % MgS04, 0,6 % NaNCh, 0,05 % KCI, 0,15 % KH2P04 ja hivenalkuaineet), jossa on 1 % glukoosia, 0,2 % tryptikaasia (BBL), 0,5 % hiivauutetta, 0,1 % cas.aminohappoja ja vitamiineja. Tärkkelysalusta sisältää 5 % tärkkelystä ja 0,1 % glukoosia mi-15 nimialustassa. Alustoja steriloitiin 30 minuuttia 120°C:ssa. Alusta (100 ml 500 ml:n pulloissa) siirrostettiin 2 x 105 itiöllä/ml, minkä jälkeen viljeltiin ilma-inkubaattorissa (300 kierr./min.) 25°C:ssa eri aikoja. Vehnälesettä indusorina sisältävät viljelmät (taulukko I) siirrostettiin 4 x 105 itiöllä/ml.

20 5.6 Ksvlanaasiaktiivisuuden määrittäminen Asoeraillus'in vilielvalustoissa

Ksylanaasiaktiivisuus määritettiin pelkistävien sokereiden muodostumisen avulla. Valmistus: (laimennettu) alustenäyte lisättiin 125 μΙ^θη 2-prosenttista ksylaania (Sigma) 0,5 M Na-asetaatti, pH 5,0, -puskurissa 40°C:ssa, minkä 25 jälkeen reaktioseosta inkuboitiin 30 minuuttia 40°C:ssa. Reaktio pysäytettiin välittömästi 0,5 ml:lla 2-hydroksi-3,5-dinitro-bentsoehappo (DNS)-reagenssia, •« minkä jälkeen tilavuus täytettiin vedellä 1 ml:ksi. Reaktioseosta kuumennettiin 5 minuuttia 100°C:ssa ja jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Optinen tiheys määritettiin 534 nm:ssa nollaa vasten. Yhden näytteen ksylanaasiaktii-30 visuuden määrittäminen tehtiin vähintään kaksi kertaa. Alustojen laimentamiseen käytettiin 0,5 M Na-asetaatti, pH 5,0, puskuria.

38 111549 5.7 Transformanttien selektointi

Monien transformanttien analyysissä viljeltiin isäntäkantoja ja noin 6 trans-formanttia yhdestä sarjasta rikkaassa tai selektiivisessä alustassa, minkä jäl-5 keen määritettiin ksylanaasin tuottotaso. Kustakin sarjasta kaksi transfor-manttia, joilla oli korkein ksylanaasituotto, analysoitiin uudelleen samassa alustassa. Näiden transformanttien tuottotaso määritettiin myös vehnälesettä sisältävässä alustassa.

10 5.8 Ekspressointivektoreiden rakentaminen pAW14S (jossa Aspergillus niaer var. niaer xvlA-promoottorO: ekspressointi-vektori pAW14S (kuvio 4) rakennettiin insertoimalla pGW325-plasmidin 5,0 kb EcoRI-fragmentti, johon Aspergillus nidulans amdS-oeeni on paikan-15 nettu, pAW14B:n polylinkkerin EcoRI-kohtaan (kuvio 3). amdS- ja xylA-geeneillä on pAW14S:ssa sama transkription suunta.

pAW14S-2 (jossa A. nidulans gpdA-promoottori): pAN52-l:n lineaarinen 1.8 kb StuI-NcoI-fraomentti. johon A. nidulans gpdA-promoottori (ATG-trip-20 lettiin asti) on paikannettu, ligatoitiin pAW14B:n 7,2 kb NcoI*-SmaI-fraomen- tin kanssa, joka oli saatu pilkkomalla NcoIMIa osittain ja SmaLlla täydellisesti.

E. coli JM109:n transformointi johti plasmidin pAW14B-l (0,0 kbl) eristämiseen. pAW14B-l:n 7,2 kb NruI*-NcoI*-fragmentti, joka oli saatu pilkkomalla NcoI:lla osittain ja Nrul:lla täydellisesti, liitettiin synteettisen fragmentin 25 kanssa (79 bp, koodaavan säikeen nukleotidit n:ot 1-78 ja mallisäikeen nukleotidit n:ot 4-78), joka muodostui xy!A-sekvensseistä ATG-tripletistä alkaen, jolloin saatiin pAW14B-2 (kuvio 5). pGW325:n 5,0 kb EcoRI-fragmentti (Aspergillus nidulans amdS-geeni) vietiin pAW14B-2:n ainutkertaiseen EcoRI-kohtaan, jolloin saatiin pAW14S-2 (kuvio 6). amdS:lla ja xylA-geenillä on täs-30 sä plasmidissa sama orientaatio. opdA-promoottorin liittyminen xvlA-oeenin ,α 111549 39 ATG-kodoniin sekä synteettisen fragmentin sekvenssi varmistettiin DNA-sekvenssianalyysin avulla.

pAW14S-3 (jossa A. niaer var. niaer N402 g|aA-promoottori): pAN52-6 pilkot-5 tiin osittain XmnIMIa (3 kohtaa). Eristettiin lineaarinen 7,5 kb fragmentti, johon A. nioer var. niaer N402 alaA-promoottori on paikannettu. Tämä fragmentti pilkottiin BssHII:lla, minkä jälkeen 7,35 kb BssHII-Xmnl-fraomentti ligatoitiin synteettisen DNA-fragmentin kanssa (noin 150 bp), joka sisälsi glaA-promoottorin 3-pään ATG-triplettiin asti ja tämän jälkeen xylA-aeenin 10 ATG-tripletistä lähtien geeniin paikannettuun Nrul-kohtaan asti ja tämän takana BssHII-päähän. Näin saatu pAN52-6.URL-plasmidi pilkottiin Ncolilla ja Nrul:lla Ncol-kohdan täyttämisen jälkeen. Synteettisen fragmentin DNA-sekvenssi pAN52-6.URL:ssa tarkistettiin. alaA-promoottori sijoitettiin ennen xvlA-aeeniä liittämällä pAN52-6.URL:sta saatu 2,5 kb "täytetty NcoI"-NruI-15 fragmentti pAW14S:n noin 10 kb Nrul-fragmentin kanssa. pAW14S-3 (kuvio 7) saatiin insertoimalla tämä fragmentti oikeaan orientaatioon.

ESIMERKKI II

20 LEIVONTATESTIT

Fermentaatioliuoksesta eristämisen jälkeen saadun ksylanaasin leipää parantava aktiivisuus testattiin mittaamalla tilavuuden kasvu belgialaisissa sämpylöissä, jotka oli paistettu lisäämällä kasvavat määrät entsyymiä ja taikinaa.

25 Ksylanaasi eristettiin seuraavasti.

I « ·

Aspergillus niaer var. awamori-transformanttia AW14S.1A viljeltiin 7 päivää 4 % vehnälesettä sisältävässä alustassa fermenttorissa, jonka käyttötilavuus oli 8 litraa. Ksylanaasin tuotto oli noin 85 000 U/ml. Homesolut poistettiin 30 suodattamalla kankaan läpi. Sen jälkeen 6 litraan suodosta lisättiin sekoittaen ammoniumsulfaattia 50 paino-% asti. Sakka sentrifugoitiin Sorvali GSA- 40 111549 roottorissa 10 000 g 20 minuuttia. Pelletti suspendoitiin 500 mkaan tislattua vettä ja sen jälkeen sentrifugoitiin jälleen 10 000 g. Supernatantti väkevöitiin tämän jälkeen ultrasuodattamalla Amicon PM10-ultrasuodatuskalvon läpi 60 mkksi. Ammoniumsulfaatin poistamista varten ultrasuodatus toistettiin 5 kaksi kertaa vastaavasti laimentamalla tislatulla vedellä 300 ja 600 mkksi.

Sen jälkeen pakkaskuivattiin lopulta saatu aine, jonka tilavuus oli 50 ml.

Saanto oli 4,8 g ja ominaisaktiivisuus 60 000 U/mg (kokonaissaanto 56 %). Leivontatesteissä käyttämistä varten ksylanaasi sekoitettiin tärkkelyksen kanssa 240 U/mg konsentratioon.

10 1000 g:aan Banket Extra-vehnäjauhoa (Wessanen) lisättiin 600 ml vettä, 20 g suolaa, 20 g sokeria (sakkaroosi), 50 g hiivaa (Koningsgist Gist Broca-des-yhtiöltä) ja 0, 50,100 tai 200 mg/kg ksylanaasia (240 U/mg). Taikinoita vaivattiin 15

Eberhardt'in vaivauskoneessa 10 minuuttia 24°C taikinan lämpötilassa. Taikinaa nostatettiin 20 minuuttia 28°C:ssa, minkä jälkeen se lyötiin alas, jaettiin pieniin noin 50 g suuruisiin taikinaeriin ja nostatettiin uudelleen nostatus-uunissa 60 minuuttia 35 - 38°C:ssa. Sen jälkeen taikinaerät paistettiin 20 mi-20 nuuttia 230°C:ssa. Ominaistilavuudet (ml/g) määritettiin jakamalla painolla (g) tilavuus (ml), joka oli määritetty siementen syrjäytysmenetelmällä.

10 sämpylälle saatiin keskiarvona seuraavat tulokset: 25 entsvvmimäärä_0 50 pom 100 oom 200 ppm ominaistilavuus 6,8 7,9 8,7 8,9 *«'

Samat suuntaukset voidaan todeta, jos lisätään lisäksi muita leivänparannus-aineita, kuten C-vitamiinia, rasvaa, emulgointiaineita ja a-amylaasia. Ksyla-30 naasientsyymin lisääminen vaikuttaa positiivisesti myös muihin ominaisuuksiin, kuten taikinan käsittelyyn ja sisuksen rakenteeseen.

41 111549

ESIMERKKI III

ASPERGILLUS NIGER VAR. AWAMORI'n KSYLANAASIN TUOTTO SACCHARO-MYCES CEREVISIAE:lla 5

Jotta saataisiin esimerkki Aspergillus nioer var. awamori'n ksylanaasin hete-rologisesta tuotosta mikro-organismien avulla, rakennettiin ekspressointivek-toreita ksylanaasin ekspressoimiseksi Saccharomvce cerevisiae-hiivassa indusoitavan GAL7-promoottorin (Nogi ja Fukasawa, 1983) säätelyn alaisena.

10 GAL7-promoottori vaikuttaa entsyymin tuottoon indusointiolosuhteissa: kasvu alustassa, joka sisältää hiililähteenä vain kalaktoosia (Hopper ja Rowe, 1978). Tämän promoottorin käyttö heterologisten proteiinien indusoituun tuottoon on jo kuvattu (Tajima et ai., 1985). Ksylanaasia koodaava homegeeni tehtiin ensin Saccharomvces cerevisiae-ekspressointiin sopivaksi poistamalla introni 15 (ei-koodaava sekvenssi) synteettisen DNA-fragmentin avulla. Samaa tekniikkaa on käytetty liittämään ksylanaasigeeni oikealla tavalla Saccharomvces cerevisiae GAL7-promoottoriin. Valinnaisesti laitettiin myös Saccharomvces cerevisiae'n signaalisekvenssi, invertaasin signaalisekvenssi, jotta Saccharomvces cerevisiae-hiiva saataisiin erittämään sieniperäisen ksylanaasientsyy-20 min. Aspergillus niger var. awamori-ksvlanaasin tuottamiseen Saccharomvces cerevisiae-hiivan avulla on käytetty autonomisesti replikoituvia vektoreita sekä (monikopioisia) integroituvia vektoreita. Kaikki kloonaustoimenpiteet tehtiin E. coli JM109-kannassa (Yanisch-Perron et ai., 1985) ja kaikki menetelmät ja tekniikat tapahtuivat Maniatis'in et ai. (1982) mukaisesti.

25 pUR2901-vektorin rakentaminen

Ensimmäinen välivaiheen konstruktio kohdistettiin intronin oikealla tavalla tapahtuvaan poistamiseen ksylanaasigeenistä, so. muuttamatta tai haittaa-30 matta koodaussekvenssiä. Kuviossa 8 esitetyt synteettiset DNA-oligonukleo-tidit (BAK 02, 03,04, 05, 06, 07, 08, 09,10, 23 ja 24) käsiteltiin ja liitettiin 42 111549 toisiinsa fragmentiksi BAKl. BAKl-fragmentin koko on 205 bp ja se käsittää Sacl - Kgnl-ksylanaasifragmentin (bp 185 - bp 427), josta introni on poistettu. Synteettiset DNA-oligonukleotidit on suunniteltu siten, että intronin poistamisen jälkeen saadaan oikea liitäntä fragmentteihin niin, että avoin lukuke-5 hys (koodaa ksylanaasia) ei häiriinny. Edelleen rakentamisen yksinkertaistamista varten Sacl-kohta muutettiin Xhol-kohdaksi. Fragmentin 5'-puoli varustettiin EcoRI-kohdalla. Ligatointiseos digestoitiin Kpnl- ja EcoRI-resktrik-tioentsyymeillä ja oikea 205 bp fragmentti eristettiin agaroosigeelielektrofo-reesin avulla, minkä jälkeen fragmentti eristettiin agaroosigeelistä eluoimalla 10 geeli. Kpnl-EcoRI BAKl-fragmentti kloonattiin vektorin pTZ19R (saatiin

Pharmacia-yhtiöltä) Kpnl- ja EcoRI-kohtaan. jolloin saatiin pBAKl (kts. kuvio 9). Rakennetun pBAKl-plasmidin insertoitu fragmentti tarkistettiin sekvenssianalyysin avulla.

15 Jatkokonstruktioiden avulla toteutettiin Aspergillus niaer var. awamori'in ksy-lanasigenin oikea liittyminen Saccharomvces cerevisiae GAL7-promoottoriin.

Tätä tarkoitusta varten käsiteltiin ja ligatoitiin kuviossa 10 esitetyt synteettiset DNA-oligonukleotidit (BAK13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27 ja 28), jolloin saatiin fragmentti BAK2. BAK2-fragmentin koko on 202 bp ja se käsit-20 tää synteettisen siirtymisen GALZ-promoottorin Sacl-kohdasta invertaasisig-naalisekvenssin kautta kypsäksi ksylanaasigeeniksi Sacl (bp 185)-kohtaan asti. Jatkorakentamisen yksinkertaistamista varten Sacl-kohta vaihdettiin Xhol-kohtaan samalla tavoin kuin mitä käytettiin pBAKl:n rakentamisessa. Fragmentin 5'-puoli varustettiin ylimääräisellä EcoRI-kohdalla. Ligatointiseos 25 digestoitiin EcoRI:lla ja XhoI:lla ja eristettiin oikea 202 bp BAK2-fragmentti. pBAKl-plasmidi pilkottiin EcoRI:lla ja XhoI:lla ja BAK2-fragmentti, jolla oli v 9 l samat päät, kloonattiin vektorifragmentteihin, jolloin saatiin plasmidi pBAK21 (kts. kuvio 11). Insertoitu BAK2-fragmentti tarkistettiin sekvenssianalyysin avulla. Fragmenttien BAKl ja BAK2 liittyminen Xhol-kohtaan pBAK21-plas-30 midissa toteutettiin sellaisella tavalla, että ksylanaasia koodaava avoin luku-kehys palautui oikealla tavalla. Plasmidi pBAK21 sisältää siten Saccharomvces 43 111549 cerevisiae GALJ-promoottorin siirtymisen Sacl-kohdasta Saccharomvces ce-revisiae'm invertaasisignaalin sekvenssin (mukaanlukien ATG-alotuskodoni) ja Aspergillus niaer var. awamori'n ksylanaasin (koodaa kypsää ksylanaasia) kautta, josta homeen introni (ei-koodaava sekvenssi) on oikealla tavalla pois-5 tettu, Kpnl-kohtaan asti (ksylanaasigeenin 5'-osa).

Plasmidi pAW14B pilkottiin Koni:Ha ja BamHI:lla ja eristettiin 327 bp Koni -BamHI-fraamentti. joka sisälsi ksylanaasigeenin 3-osan. Myös plasmidi pBAK21 pilkottiin Kpnl:lla ja BamHI:lla ja eristettiin vektorifragmentti. Eristet-10 ty 327 bp fragmentti ja vektorifragmentti ligatoitiin yhteen, jolloin saatiin pUR2901-plasmidi (kts. kuvio 12). Plasmidi pUR2901 tarkistettiin restriktio-entsyymianalyysin avulla. Plasmidi pl)R2901 sisältää S. cerevisiae GAL7-pro-moottorin fuusiokohdan Sacl-kohdassa. S. cerevisiae'n invertaasin signaalise-kvenssin (mukaanlukien ATG-aloituskodoni) ja täydellisen Aspergillus niger 15 var. awamori'n ksylanaasigeenin (koodaa kypsää ksylanaasia), josta homeen introni (ei-koodaava sekvenssi) on poistettu oikealla tavalla.

S. cerevisiae'n eksoressointivektorin pUR2904 rakentaminen 20 Ekspressointivektorin pUR2904 rakentaminen aloitettiin pUR2740-plasmidista. pl)R2740-plasmidi on johdannainen pUR2730:sta (Overbeeke 1987), jota on : ' käytetty O-galaktosidaasin tuottoon S. cerevisiae'ssa. Plasmidi pUR2740 ei eroa oleellisesti pUR2730:sta, vain eräitä tarpeettomia sekvenssejä vektorin ei-funktionaalisesta osasta on poistettu. Plasmidi pUR2740 on E. coli/S. cere-25 visiae-sukkulavektori. 2 μΐη replikaation alkukohta käytettiin hyödyksi, ja S.

cervisiae LEU2d-geeni toimi S. cerevisiae'ssa tapahtuvan replikaation selek-* tointigeeninä. pUR2740-plasmidi pilkottiin Sacl:lla ja HindIII:lla ja vektori- fragmentti eristettiin. Tämän pilkkomisen tuloksena poistettiin a-galakto-sidaasigeeni. Myös pUR2901-plasmidi pilkottiin Sacl:lla ja HindIII:lla ja eris-30 tettiin 730 bp fragmentti, joka sisälsi S. cerevisiae GAL7-promoottorin fuusi-oitumiskohdan Sacl-kohdassa. S. cerevisiae'n invertaasisignaalisekvenssin 44 111549 (mukaanlukien AGT-aloituskodoni) ja täydellisen A. niaer var. awamori-ksylanaasigeenin (koodaa kypsää ksylanaasia). pUR2740-vektorifragmentti ja pUR2901:n 730 bp fragmentti liitettiin toisiinsa, jolloin saatiin pUR2904 (kts. kuvio 13). Plasmidi pUR2904 tarkistettiin restriktioentsyymianalyysin avulla.

5 Plasmidi pUR2904 on ekspressointivektori Saccharomvces cerevisiae-hiivan avulla tapahtuvan Aspergillus niaer var. awamori-ksvlanaasin tuotolle. Plasmidi pUR2904 on E. coli/S. cerevisiae-sukkulavektori. Se sisältää ksylanaasia koodaavan DNA-sekvenssin ja siihen fuusioituneen invertaasin signaalisek-venssin; invertaasin signaalisekvenssi pitää huolen ksylanaasin erittymisestä.

10 DNA-sekvenssi pUR2904:ssa koodaa täsmälleen samaa ksylanaasia kuin villi-tyyppinen A. niaer var. awamori-kanta. Erittymisen aikana saatu fuusioprote-iini prosessoituu periaatteessa Saccharomvces cerevisiae'n signaalipeptidaa-sin prosessoinnin vaikutuksesta, jolloin seurauksena on erittynyt kypsä ksy-lanaasientsyymi. Saccharomvces cerevisiae'n galaktoosilla indusoitava GAL7-15 promoottori säätelee ksylanaasin ekspressointia.

A. niaer var. awamori-ksvlanaasin S. cerevisiae'lla tapahtuvan tuoton analyysi

Saccharomvces SUlO-kannan (0, Ieu2, ura3, his3. cir±; tallennettu Centraal-20 bureau voor Schimmelcultures-kokoelmaan, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Hollanti, numerolla CBS 323.87) hiivasolut transformoitiin pUR2904-plasmi-: ' dilla sferoplastimenetelmällä (Beggs, 1978). Saaduista leu+-transformoi- duista hiivasoluista analysoitiin ksylanaasin läsnäolo. Hiivasoluja kasvatettiin kaksi kertaa yön yli MM-alustalla (0,67 % Yeast Nitrogen Basew/o aminoha-25 pot, 2 % glukoosi), joka oli täydennetty urasiililla ja histidiinillä. Tämän jälkeen hiivasolut siirrettiin kymmenen kertaa suurempaan tilavuuteen YPG- • 4· alustaa (1 % hiivauute, 2 % Bacto-peptoni, 5 % galaktoosi) ja kasvatettiin, kunnes hiivasolut saavuttivat stationäärivaiheen. Hiivasoluja viljeltiin sekoittaen 30°C:ssa. Hiivasolut otettiin alustasta sentrifugoimalla. Alustasta analy-30 soitiin ksylanaasin läsnäolo esimerkissä I kuvatulla entsyymin määritysmenetelmällä. Ksylanaasin ekspressoitumistaso oli noin 10 000 yksikköä 1 mkssa 45 111549 alustaa. Saccharomvces cerevisjae'n tuottama ksylanaasi osoitettiin isoelekt-risen fokusoinnin avulla (kts. esimerkki I) identtiseksi villityyppisen Asperoil-lus niaer var. awamori'n tuottaman ksylanaasin kanssa. Saccharomvces cere-visiae'n tuottaman ja erittämän ksylanaasin toimivuus osoitettiin esimerkissä 5 II kuvatulla tavalla suoritetuissa leivontatesteissä. Edellä kuvatut tulokset osoittavat, että Saccharomvces cerevisiae-hiiva kykenee tehokkaasti tuottamaan ja erittämään Aspergillus niaer var. awamori-ksvlanaasia.

S. cerevisiae-ekspressointivektorin PUR2921 rakentaminen (monikopioinen 10 integraatiot

Aspergillus niaer var. awamori'n ksylanaasigeenin ekspressoitumista Saccharomvces cerevisiae'ssa tutkittiin myös integroivalla vektorisysteemillä. Tätä tarkoitusta varten käytettiin suurikopioista integrointisysteemiä (Lopes, 15 1989).

Ekspressointivektorin pUR2921 rakentaminen alkoi plasmidista pUR2778.

Plasmidi pUR277 on moni-integroiva plasmidi, joka integroituu S. cerevisiae'n ribosomaaliseen DNA-kohtaan. Sitä käytettiin α-galaktosidaasin ekspressoin-20 tikasetin stabiiliin monikopioiseen integrointiin S. cerevisiae-hiivaan. Se sisältää myös vektorisekvenssit E. coH'ssa tapahtuvaa replikointia ja selektointia varten ja S. cerevisiae LEU2d-geenin hiivan selektointigeeninä. Plasmidi pUR2778 on pMIRY2:n (Lopes, 1989) johdannainen, josta on poistettu Soiro-della oliaorhiza-DNA:n sisältävä Smal - Bglll-fragmentti ja jossa osan DNA-25 sekvenssejä sisältävästä BamHI - Hindlll-fragmentista on korvattu pUR2730:n (Overbeeke, 1987) Bglll - Hindlll-fragmentilla, joka sisältää • » α-galaktosidaasin ekspressointikasetin. Plasmidi pUR2778 pilkottiin Sacl:lla ja HindIII:lla ja vektorifragmentti eristettiin agaroosigeelistä. Tämän digestoin-nin tuloksena poistettiin α-galaktosidaasia koodaava sekvenssi, mukaanlukien 30 invertaasi signaalisekvenssi. Tämä vektorifragmentti ligatoitiin pl)R2901:sta saadun 730 bp Sacl - Hindlll-fragmentin kanssa, jota käytettiin myös 46 111549 pUR2904:n rakentamiseen. Näin saatiin plasmidi pUR2921 (kts. kuvio 14). pUR2901:n 730 bp Sacl - Hindlll-fragmentti käsittää S· cerevisiae GAL7-promoottorin fuusiokohdan Sacl-kohdassa. S. cerevisiae-invertaasin signaa-lisekvenssin (mukaanlukien ATG-aloituskodoni) ja täydellisen A. niaer var.

5 awamori-ksvlanaasiaeenin (koodaa kypsää ksylanaasia), josta homeen introni (ei-koodaava sekvenssi) on oikealla tavalla poistettu. Plasmidi pUR2921 tarkistettiin restriktioentsyymianalyysin avulla. Plasmidi pUR2921 on ekspres-sointivektori Aspergillus niaer var. awamori'n ksylanaasin tuottamiselle Sac-charomvces cerevisiae-hiivalla. Plasmidi pUR2921 sisältää S. cerevisiae'n 10 kromosomaalisen DNA:n ribosomaalisen DNA-kohdan sekvenssejä. Koska se ei sisällä mitään hiivan replikoitumisen alkukohtia, vektori integroituu riboso-maaliseen DNA-kohtaan S. cerevisiae-hiivaan transformoitaessa. Kun pUR2921-plasmidi transformoidaan S. cerevisiae LEU2-kantaan, vektorin mul-tippelikopiot integroituvat selektiivisissä olosuhteissa pUR2921-plasmidin 15 LEU2-markkerigeenin alhaisen ekspressoitumisen vuoksi. Tämän tapahtuman seurauksena hiivan kromosomissa on mukana ksylanaasin ekspressointi-kasetti multippelikopioina. Koska ksylanaasin ekspressointikasetti on täsmälleen sama kuin pUR2904-plasmidissa, tämä S. cerevisiae-kanta erittää kypsää ksylanaasientsyymiä samalla tavoin kuin S. cerevisiae-kanta. jossa on 20 pUR2904-plasmidi.

S. cerevisiae'n avulla tapahtuvan A. niaer var. awamori-ksvlanaasin tuoton analyysi 25 Saccharomvces SU50-kannan (VT6-2-1, a, Ieu2, hjs4, canl, cir°; Erhart ja Hollenberg, 1981) hiivasolut transformoitiin sferoplastimenetelmällä > ·« pUR2921-plasmidilla, joka oli linearisoitu HoaI:lla. Saaduista leu+-transfor-moiduista hiivasoluista analysoitiin ksylanaasin tuotto samalla tavoin kuin edellä on kuvattu pl)R2904-plasmidilla transformoitujen SUlO-hiivasolujen 30 yhteydessä. MM-alusta täydennettiin näitä hiivasoluja varten ainoastaan his-tidiinillä. Ekspressointitaso oli 60 000 yksikköä 1 alusta-mkaan erittyneenä.

47 111549

Kirjallisuusviitteet

Beggs, 3.D. (1978), Nature 275:104-109.

Erhart, Hollenberg (1981), Curr. Genet. 3:83-89.

5 Hopper, 3.E. ja Rowe, L.B. (1978), J. Biol. Chem. 253:7566-7569.

Lopes, T.S., Klootwijk, 3., Veenstra, A.E., van der Aar, P.C., van Heerikhui-zen, H., Raue, H.A. ja Planta, R.3. (1989), GEne 79:199-206.

Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook, 3. (1982), Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory.

10 Nogi, Y. ja fukasawa, T. (1983), Nucleic Acids Res. 11:8555-8568.

Overbeeke, N., Fellinger, AJ. ja Hughes, S.G. (1987), PCT International. WO 87/07641.

Tajima, M., Nogi, Y. ja Fukasawa, T. (1985), Yeast 1:67-77.

Yanisch-Perron, C, Viera, 3. ja Messing, 3. (1985) Gene 33:103-119.

15

ESIMERKKI IV

ASPERGILLUS NIGER VAR. AWAMQRI-KSYLANAASIN TUOTTO BACILLUS SUBTILIS:lla 20

Esimerkkinä Aspergillus niaer var. awamori-ksvlanaasin heterologisesta tuotosta prokaryoottisen mikro-organismin avulla rakennettiin ekspressointivek-torit ksylanaasin tuottamiseksi Bacillus subtilis-bakteerilla. Heterologisten proteiinien tuottamista varten tunnetaan erilaisia vektorisysteemejä, promootto-25 reita ja signaalisekvenssejä. Tässä esimerkissä ksylanaasientsyymin ekspres-sointiin käytettiin SP02-promoottoria ja α-amylaasin signaalisekvenssiä. Tä- •« mä lähestymistapa on onnistunut kasvin α-galaktosidaasin ekspressoimiseksi B.subtilis:ssa (Overbeeke et ai, 1990).

30 Aspergillus niger var. awamori-ksvlanaasin Bacillus subtilis-bakteerin avulla tapahtuvan ekspressoinnin vektorin rakentamista varten käytettiin lähtökoh- 48 111549 tana plasmideja, jotka oli rakennettu ksylanaasin ekspressoimiseksi Saccha-romvces cerevisiae-hiivassa (kts. esimerkki III) ja joista ksylanaasigeenin introni (ei-koodaava sekvenssi) oli oikealla tavalla poistettu. Intronin poistaminen on oleellista, koska prokaryoottinen mikro-organismi, kuten Bacillus 5 subtilis. ei kykene vastoin Aspergillus niaer var. awamori-eukaryoottia poistamaan introneja silmukoinniksi kutsutulla prosessilla.

pUR2950-vektorin rakentaminen 10 Kuviossa 15 esitetyt synteettiset DNA-oligonukleotidit (BAK 15,18, 26, 27,41 ja 42) käsiteltiin ja liitettiin toisiinsa, jolloin saatiin fragmentti BAK4. BAK4-fragmentin koko on 107 bp ja se käsittää kypsää ksylanaasia koodaavan DNA-sekvenssin Sacl-kohtaan asti (bp 185 kuviossa 1). Edelleenrakentami-sen yksinkertaistamiseksi vaihdettiin Sacl-kohta Xhol-kohtaan muuttamatta 15 johdettua aminohapposekvenssiä. Lisäksi, jotta rakentamista jatkettaessa saataisiin aikaan kypsän ksylanaasin oikea liittyminen a-amylaasin signaalise-kvenssiin, muutettiin kypsän ksylanaasin ensimmäinen kodoni, joka koodaa alaniinia. GCT-kodoni muutettiin GCC:ksi, joka myös koodaa alaniinia. BAK4-fragmentin 5'-puolelle muodostettiin näin SacII-kohta. Tämän SacII-kohdan 20 kanssa jatkuvana varustettiin BAK4-fragmentti EcoRI-kohdalla. Ligatointiseos pilkottiin EcoRI:lla ja XhoI:lla ja agaroosigeelistä eristettiin 107 bp EcoRI -• Xhol-fragmentti. Plasmidi pUR2901 (kts. esimerkki III) digestoitiin EcoRI:Ha ja XhoI:lla ja BAK4-fragmentti kloonattiin vektorifragmenttiin, jossa oli samat restriktioentsyymien päät. Näin saatiin pUR2950 (kts. kuvio 16). Insertoitu 25 fragmentti BAK4 pUR2950:ssa tarkistettiin sekvenssianalyysin avulla. pUR2950-plasmidissa suoritettiin fragmenttien BAK4 ja BAK1 liittäminen Xhol-kohdan avulla sellaisella tavalla, että ksylanaasin 5'-osaa koodaava avoin lukukehys palautui oikealla tavalla. Lisäksi poistettiin oikealla tavalla ksylanaasigeenin introni esimerkissä III kuvatun mukaisesti. Plasmidi 30 pUR2950 sisältää siten DNA-sekvenssin alkaen kypsän ksylanaasin ensimmäi sestä alaniinikodonista, johon kohtaan on tehty SacII-kohta. ja kypsää ksy- 49 111549 lanaasia koodaavan Aspergillus niaer var. awamori-ksylanaasigeenin, josta on oikealla tavalla poistettu homeintroni (ei-koodaava sekvenssi).

B. subtilis-ekspressointivektorin PUR2951 rakentaminen 5 pUR2601-plasmidia (Overbeeke, 1990) käytettiin perustana rakenteelle, jossa kypsän Aspergillus nioer var. awamori-ksylanaasin geeni pUR2950:ssa on fuusioitu α-amylaasin signaalisekvenssiin tuotettavan entsyymin erittämistä varten, kun tätä fuusiogeeniä säätelee SP02-promoottori. Plasmidi pUR2601 10 pilkottiin SacII:lla ja HindIII:lla ja eristettiin vektorifragmentti, joka sisälsi SP02-promoottorin ja α-amylaasin signaalisekvenssin. pUR2950:n SacII -Hindlll-fraomentti. jossa on kypsän ksylanaasin geeni, eristettiin ja ligatoitiin pUR2601-vektorifragmenttiin, jolloin saatiin plasmidi pUR2951 (kuvio 17). α-amylaasin signaalisekvenssi on plasmidissa pUR2951 fuusioitu täsmälleen 15 oikealla tavalla kypsän ksylanaasin geeniin. Ligatointiseos transformoitiin Bacillus subtilis DB104-kantaan (Kawamuri ja Doi, 1984) käyttämällä protoplas-ti/PEG-menetelmää (Chang ja Cohen, 1979) ja selektointiin kanamysiiniä.

Plasmidi pUR2951 tarkistettiin restriktioentsyymianalyysin avulla.

20 B. subtilis'lla tapahtuvan A. nioer var. awamori-ksvlanaasin tuoton analyysi • < *· Koska DB104-kannalla on jäljellä jonkin verran proteaasiaktiivisuutta, DB104:n, jossa on pUR2951, fermentointi on suoritettava kontrolloiduissa olosuhteissa, jotta vältettäisiin erittyneen entsyymin proteolyysi. Overbeeke'n 25 et ai. (1990) kuvaamaa tapaa tuottaa B. subtilis'in avulla kasvin a-galaktosi-daasia voidaan käyttää lähtökohtana Asoeroillus nioer var. awamori- • · ksylanaasin tuotolle Bacillus subtilis-bakteerin avulla. Tässä fermentaatiossa kiinnitetään erityistä huomiota glukoosi- ja ammoniumtasoihin fermentaation aikana.

30 50 111549

Kirjallisuusviitteet

Chang, S., ja Cohen, S.N. (1979), Mol. Gen. Genet. 182:77-81.

Kawamura, F., ja Doi, R.H. (1984), J. Bacteriol. 160:442-444.

5 Overbeeke, N., Termorshuizen, G.H.M., Giuseppin, M.L.F., Underwood, D.R., ja Verrips, C.T. (1990), Appi. Environ. Microbiol. 56:1429-1434.

ESIMERKKI V

10 ASPERGILLUS NIGER VAR. AWAMORI-KSYLANAASIN TUOTTO SACCHARO-MYCES CEREVISIAE'n TOIMESTA LAIHAN TAIKINAN FERMENTOIIMIMIIM AIKANA

Esimerkkinä sellaisten solujen suorasta käytöstä, jotka tuottavat Aspergillus 15 niaer var. awamori'n ksylanaasia elintarvikkeissa, on rakennettu Saccharo-mvce cerevisiae-kanta. joka tuottaa ksylanaasia laihan taikinan fermentoinnin aikana. Tätä tarkoitusta varten on S. cerevisiae-kannan eritettävä ksylanaasia vehnätaikinan fermentoinnin aikana vallitsevissa olosuhteissa. Laihaan veh-nätaikinaan ei ole lisätty lainkaan sokeria, ja sen vuoksi fermentoivan leivin-20 hiivan hiivalähteinä ovat glukoosi ja maltoosi. Promoottorin, johon glukoosi-depressio ei vaikuta, tulisi siten säädellä ksylanaasigeeniä. Tähän tarkoitukseen erittäin hyödyllisiä ovat hiivan glykolyyttisen reitin geenien (GAPDH, PGK. ADH1. PYK. jne.) promoottoreita. Vain esimerkkinä käytettiin Saccha-romvces cerevisiae'n fosfoglyseraattikinaasi (PGK)-geenin promoottoria. Tätä 25 promoottoria käytetään lukuisten heterologisten proteiinien ekspressointiin S. cdrevisiae'n toimesta, esimerkiksi ihmisen α-interferonin tuottoon (Tuite et ai., 1982).

Hyvänä pidetty tapa saada aikaan entsyymin ekspressointi leivänvalmistuk-30 sen aikana on integroituvan vektorin (yksikopioinen tai monikopioinen integ- 51 111549 roituminen) käyttö, vaikkakin voidaan myös käyttää autonomisesti replikoitu-via vektoreita.

pUR2921-plasmidista saatu GAL7-promoottori. jota käytettiin Aspergillus nl· 5 ger vaar. awamori-ksvlanaasin ekspressoimiseen Saccharomvces cere-visiae:ssa (kts. esimerkki III), korvattiin PGK-promoottorilla. Tällä uudella vektorilla transformoituja S. cerevisiae-kantoia. jotka erittävät ksylanaasient-syymin glukoosia sisältäviin viljelyalustoihin, voitiin käyttää leivänvalmistuk-sessa. Tämän hiivan lisääminen taikinaan ennen sekoittamista saa aikaan 10 ksylanaasientsyymin erittymisen leivänvalmistuksen aikana. Tämän leivänpa-rannusentsyymin positiivinen vaikutus voi siten tulla esiin ja leivän ominaisti-lavuus kasvaa.

Plasmidin PUR2918 rakentaminen 15

Saccharomyces cerevisiae PGK-promoottorisekvenssien fuusioimiseksi Aspergillus nioer var. awamori'n ksylanaasigeeniin oli useita mahdollisuuksia. Eräs näistä oli sopivan restriktioendonukleaasikohdan muodostaminen promoottorin päähän paikkakohdistetun mutageneesin avulla. Tällä tavoin voitaisiin 20 saada DNA-molekyyli, joka esimerkiksi voitaisiin fuusioida pUR2904:n, jota plasmidia käytettiin kypsän ksylanaasin ekspressoimiseen Saccharomvces cerevisiae'n toimesta, GAL7-promoottorin ja invertaasin signaalisekvenssin väliseen Sacl-kohtaan. Toinen tapa muodostaa sopivia restriktiokohtia DNA-molekyylin päähän oli polymeerasin ketjureaktiona tunnetun DNA:n in vitro-25 valmistustekniikka. Tämän PCR-tekniikan avulla muodostettiin DNA-molekyyli, joka sisälsi Saccharomyces cerevisiae'n fosfoglyseraatttikinaasipromoot- • *

torin kaikki tärkeät sekvenssit ATG-aloituskodoniin asti niin, että EcoRI- ja BolII-kohta oli sen 5-päässä, ja BspMI-tunnistussekvenssin ja Hindlll-kohdan (kts. kuvio 18) 3'-päässä ATG-aloituskodoniin asti. Monistamiseen 30 käytetyt primeerit olivat PGP01: 5'-GGA ATT CAG ATC TTG AAT TGA TGT TAC CCT CAT AAA GCA CGT G-3' ja PGP02: 5'-CCC AAG CTT ACC TGC TGC

52 1 1 15 4 9 GCA TTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG ATA ATT ACT TCC-3'. Malli-DNA oli pUR2801, hiivan ekspressointivektori, jossa on täydellinen Saccha-romvces cerevisiae PGK-promoottori. Reaktioseoksen (kokonaistilavuus 100 μΙ) koostumus oli seuraava: noin 1 ng Sali-katkaistua pUR2801:a, 5 100 pikomoolia PGP01:a ja 100 pikomoolia PGP02:a, 1 U Amplitaq-polyme- raasia (Perkin Elmer), 0,2 mmol/l kutakin dNTP:a: dATP, dCTP, dGTP ja dTTP, 1,5 mmol/l MgCh, 50 mmol/l KCI, 10 mmol/l Tris.HCI pH 8,3 (25°C:ssa), 0.001 % (w/V) gelatiinia. Inkuboitiin 2 minuuttia 95°C:ssa, minkä jälkeen suoritettiin seuraavat lämpötilavaiheet 25 syklinä: 1 min. 95°C:ssa, 10 1:45 min. 52°C;ssa, 2 min. 72°C:ssa. Näiden syklien jälkeen reaktioseosta pidettiin 5 minuuttia 72°C:ssa ennen 4°C:een jäähdyttämistä. Kaikki lämpöti-lasyklit suoritettiin Perkin Elmer DNA Thermal Cycler-laitteessa. Reaktioseok-sesta saostettiin 60 μΙ etanolilla ja sen jälkeen agaroosigeelistä eristettiin noin 600 bp suuruinen vyöhyke. Eristetty DNA pilkottiin sen jälkeen EcoRI:lla 15 ja HindIII:lla ja eristettiin jälleen agaroosigeelistä. Tämä DNA-fragmentti alkaa EcoRI-tarttuvalla päällä ja sitä seuraa Bglll-kohta ja ATG-kodonin suhteen asemasta -568 ulottuva sekvenssi Saccharomvces cerevisiae'n fosfogly-seraattikinaasipromoottorin ATG-kodoniin asti. ATG-kodonia seuraa BspMI-kohta ja Hindlll-tarttuva pää. Monikäyttöinen kloonausplasmidi pTZ19R (saa-20 tiin Pharmacia-yhtiöltä) pilkottiin EcoRI:lla ja HindIII:lla ja ligatoitiin PGK-promoottorifragmentin kanssa, jolloin saatiin pUR2918 (kts. kuvio 19). Plas- « ·» < * midi tarkistettiin sekvenssianalyysin avulla.

Plasmidin PUR2920 rakentaminen 25 pUR2918:n PGK-promoottorin fuusioimiseksi ksylanaasigeeniin käsiteltiin kuviossa 20 esitetyt synteettiset DNA-oligonukleotidit (BAK14,15,18,19, 20, 21,51, 52 ja 53) ja ligatoitiin toisiinsa BAK5-fragmentiksi. Oligonukleotidejä BAK51 ja BAK53 ei fosforyloitu, jotta estettäisiin saadun fragmentin itseliga-30 toituminen, ja tämän jälkeen fragmentti eristettiin agaroosigeelistä. Fragmentin BAK5 koko on 169 bp ja se käsittää invertaasin signaalisekvenssin ja 53 111549 kypsän ksylanaasin geenin Xhol-kohtaan asti oikeaa fuusioitumista varten BAKl-fragmenttiin (kts. esimerkki III). Se eroaa kummankin pään suhteen aikaisemmin mainitusta BAK2-fragmentista (esimerkki III). Se sisältää 5'-päässä tarttuvan pään juuri ennen invertaasin signaalisekvenssin toista ko-5 donia, jotta saataisiin täsmällinen fuusioituminen PGK-promoottorisekvenssiin pl)R2918:ssa. Xhol-kohdan 3'-puolella se sisältää lisäksi HindlH-tarttuvan pään. Plasmidi pUR2918 katkaistaan BspMIrlla ja HindIII:lla ja ligatoidaan BAK5-fragmenttiin, jolloin saadaan plasmidi pUR2920 (kts. kuvio 21). Inser-toitu fragmentti BAK5 tarkistettiin sekvenssianalyysin avulla. Plasmidi 10 pl)R2920 sisältää Saccharomvces cerevisiae'n fosfoglyseraattikinaasi (PGK)- promoottorin ATG-aloituskodonin suhteen nukleotidistä -568 alkaen ATG-aloituskodoniin asti, Saccharomvces cerevisiae'n invertaasin signaalisekvenssin oikealla tavalla fuusioituna tähän ATG-kodoniin, ja Aspergillus nioer var. awamori'n ksylanaasigeenin Sacl-kohtaan asti. Edelleen rakenta-15 misen yksinkertaistamiseksi muutettiin Sacl-kohta Xhol-kohdaksi esimerkissä III kuvatulla tavalla.

Plasmidien PUR2922 ia PUR2923 rakentaminen 20 2 mikronin episomaalisen ekspressointivektorin pUR2904 (kts. esimerkki III) avulla rakennettiin plasmidivektori, jolla ksylanaasigeeni ekspressoitiin S.

: ' cerevisiae PGK-promoottorin säätelyn alaisena. Plasmidi pUR2920 katkaistiin

BglII:lla ja Xhol.'lla ja agaroosigeelistä eristettiin 735 bp fragmentti, joka sisälsi PGK-promoottorin. invertaasin signaalisekvenssin ja ksylanaasigeenin 25 Xhol-kohtaan asti. Myös plasmidi pUR2904 katkaistiin BglII:lla ja XhoI:lla ja eristettiin suuri vektorifragmentti. Tämä digestointi poisti GAL7-promoottorin ja invertaasin signaalisegvenssin. Tämä pUR2904-vektori ligatoitiin pUR2920:n Bglll - Xhol-fraamentin kanssa, jolloin saatiin pUR2922 (kts. kuvio 22). Plasmidi pUR2922 eroaa Saccharomvces cerevisiae-ekspressointi-30 vektorista pUR2904 (esimerkki III) siten, että se sisältää Saccharomvces 111549 54 cerevisiae'n fosfoglyseraattikinaasipromoottorin ennen invertaasin signaalisekvenssiä GAL7-promoottorin asemesta.

Monikopioisen integrointivektorin, jossa on PKG-ksylanaasiekspressointi-5 kasetti, rakentamiseksi käytettiin lähtökohtana pUR2792-plasmidia. Plasmidi pUR2792 on pMIRY2:n (Lopes, 1989) johdannainen. Se sisältää ΒαΙΙΙ - Ηιτν dlll-polylinkkerin Bglll -HindHI-osan. jossa on S. oligorhiza DNA, asemesta ja osa, joka on pAT153 sekvenssin Ball-kohdan ja rDNA-sekvenssin HindHI-kohdan välissä, on deletoitu. Plasmidi pUR2792 katkaistiin BglII:lla ja Hin-10 dIII:lla ja vektorivyöhyke eristettiin agaroosigeelistä. Plasmidista pUR2922 eristettiin Bglll - Hindlll-fragmentti, joka sisälsi PGK:n kontrolloiman ksyla-naasin ekspressoi nti kasetin, ja tämä ligatoitiin pUR2792-vektoriin, joka oli pilkottu Bgjll - HindIII:lla. Saatu plasmidi pUR2923 (kts. kuvio 23) on Sac-charomvces cerevisiae'n monikopioinen integraatioplasmidi, joka sisältää 15 Saccharomvces cerevisiae'n fosfoglyseraattikinaasipromoottorin ATG-aloituskodoniin asti, tähän promoottoriin fuusioidun Saccharomvces cerevisiae'n invertaasin signaalisekvenssin ja Aspergillus niger var. awamori'n kypsän ksylanaasin geenin fuusioituneena kehyksessä invertaasin signaalise-kvenssiin. Introni (ei-koodaava sekvenssi) on oikealla tavalla poistettu ksy-20 lanaasigeenistä.

Saccharomvces cerevisiae SU50-kannan hiivasolut transformoitiin sferoplas-timenetelmällä pUR2923-plasmidilla, joka oli linearisoitu Hpal:lla (kts. esimerkki III). Saaduista jeu+ transformoiduista hiivasoluista analysoitiin ksy-25 lanaasin tuotto samalla tavoin kuin mitä on kuvattu pUR2921-plasmidilla varustettujen SU50-hiivasolujen tapauksessa, sillä yhdellä muutoksella, että viimeisessä viljelyvaiheessa käytettiin YPG:n asemesta YPD-alustaa (1 % hii-vauutetta, 2 % baktopeptonia, 2 % glukoosia). Ekspressointitaso oli noin 10 000 yksikköä erittyneenä 1 ml:aan alustaa.

30 55 111549

Ksvlanaasin tuotto pUR2923:n sisältävällä hiivalla taikinassa Jäljempänä kuvatussa leipätestissä käytettiin Saccharomvces cerevisiae SU50-soluja, jotka sisälsivät pUR2923-plasmidin monikopioisena ja hiivan 5 kromosomiin integroituna. Ksylanaasilisäyksen aiheuttama leivän tilavuuden kasvu johtuu tärkkelyshäntien entsymaattisesta muutoksesta, mistä johtuen taikina kykenee paremmin käyttämään hyödyksi hiivan aiheuttaman kaasunmuodostuksen taikinassa. Jotta ksylanaasientsyymin lisäyksestä hyödyttäisiin täydellisesti, tarvitaan siten hiiva, jolla on suuri nostatuskyky. Koska SU50-10 kanta on laboratoriokanta, sillä ei ole hyviä nostatusominaisuuksia. Ksylanaa-sia tuottavalla SU50-hiivakannalla tehtävää leivontakoetta varten tarvitaan siten täydennyksenä hiivakanta, joka nostattaa hyvin.

Jäljempänä kuvattu leivontatesti perustui 10 gramman pienoisviipaletestiin 15 (Shogren ja Finney, 1984). Taikinan formulaatio oli 10 g vehnäjauhoa (Columbus: MENEBA, Hollanti); 0,15 g NaCI; 5,9 ml vettä; 0,2 g tuorehiivaa (Koningsgist; Gist-Brocades, Hollanti). Tämän formulaation lisäaineet (ksylanaasia tuottava ja ksylanaasia tuottamaton hiiva, ksylanaasientsyymi) liuotettiin veteen juuri ennen taikinan sekoittamista. Sekoittaminen tehtiin 5 20 minuutin aikana 10 gramman mixograph-laitteessa (National Manufacturing Co. Lincoln, NE). Sekoittamisen jälkeen > · • taikinaa fermentoitiin 80 minuuttia 30°C:ssa. Taikina lyötiin alas kaksi kertaa, toinen alaslyönti 40 minuutin ja toinen 80 minuutin kohdalla. Alaslyöntiin 25 käytettyjen levitystelojen väli oli 2,0 mm. Fermentoinnin jälkeen taikina laitettiin muottiin ja annettiin nousta 70 minuuttia 30°C:ssa ennen paistamista.

• ·'

Paistaminen tapahtui 12 minuutin ajan 240°C:ssa. Leipien tilavuudet mitattiin punnitsemisen jälkeen syijäytysmenetelmällä, jossa käytettiin pienoisrapsin-siemeniä.

30 56 111549

Taikinan lisäaineet olivat: Saccharomvces cerevisiae SU50, jossa pUR2923 (ksylanaasia tuottava hiiva), Saccharomvces cerevisiae SU50 (emokanta) ja puhdistettu ksylanaasientsyymi. Käytettyjä SU50-hiivakantoja kasvatettiin ensin selektiivisellä alustalla: YNB ilman aminohappoja (Difco) ja 20 g/l glu-5 koosi, joka on täydennetty 60 mg/l leusiinilla (vain SU50-emäkanta) ja 20 mg/l histidiinillä. Näitä viljelmiä kasvatettiin 40 tuntia 30°C:ssa ja sen jälkeen siirrostettiin 5 ml:Ha 45 ml YPD-alustaa (kts. edellä), ja kasvatettiin 16 tuntia 30°C:ssa. Hiivasolut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin kerran tuoreella YPD:lla ja sentrifugoitiin uudelleen. 5,9 rnkaan vettä suspendoitiin uu-10 delleen eri määriä (märkää) pellettiä juuri ennen taikinan sekoittamista. Kun puhdisettua ksylanaasia lisättiin, sen määrä oli 5 μΙ 40 U/μΙ liuosta (200 U). Seuraavassa taulukossa on annettu eri lisäaineiden vaikutukset leivän omi-naistilavuuteen (S.V): 15 Lisäaine_S.V. fml/al ei mitään 3,31 ei mitään 3,40 5 mg SU50 3,40 20 15 mg SU50 3,39 50 mg SU50 3,66 5 mg SU50; 200 U ksylanaasi 3,78 15 mg SU50; 200 U ksylanaasi 3,97 50 mg SU50; 200 U ksylanaasi 4,01 25 5 mg SU50:pUR2923 3,88 15 mg SU50:pUR2923 4,03 50 ma SU50:pUR2923_4,31 Tässä taulukossa esitetyistä tuloksista on selvää, että ksylanaasia tuottavalla 30 hiivakannalla (SU50:pUR2923) on positiivinen vaikutus leivän ominaistilavuu-teen. Tämä vaikutus on verrattavissa puhdistetun ksylanaasientsyymin lisä- 57 111549 ykseen. Yhtä suurilla määrillä lisätyllä emäkannalla ei ole tätä vaikutusta.

Tämä vaikutus saadaan luonnollisesti aikaan sekoittamalla leivinhiivaa, jolla on hyvät nostatusominaisuudet, ja rakennetulla laboratoriohiivalla. Sama positiivinen vaikutus voidaan kuitenkin saada, kun leivinhiiva, jolla on hyvä nos-5 tatuskyky, rakennetaan samanlaisella tavalla tuottamaan homeksylanaasia. Nämä hiivakannat voidaan lisäksi rakentaa tuottamaan muita entsyymejä, joilla on leivänparannusominaisuuksia (a-amylaaseja, hemisellulaaseja jne.).

Kirjallisuusviitteet 10

Lopes, T.S., Klootwijk, 3., Veenstra, A.E., van der Aar, P.C., van Heerikhui-zen, H., Raue, H.A. ja Planta, RJ. (1989), Gene 79:199-206.

Shogren, M.D ja Finney, K.F. (1984), Cereal Chem. 61:418-423.

Tuite, M.F., Dobson, J.M., Roberts, N.A., King, R.M., Burke, D.C., Kingsman, 15 S.M. ja Kingsman, AJ. (1982), EMBO Journal 1:603-608. 1 «

Claims (18)

111549

1. Rekombinantti-DNA-materiaali, tunnettu siitä, että se käsittää DNA:n, jossa on nukleotidisekvenssi, joka koodaa ainakin sieniperäisen ksylanaasin 5 kypsyvää muotoa, jolla on leipää parantava aktiivisuus ja joka rekombinantti-DNA-materiaali käsittää DNA:n, jolla on kuviossa 1 esitetty nukelotidisek-venssi tai kuvan 1 mukaisen aminohapposekvenssin koodaavan nukleotidise-kvenssin tai ne osat kuvan 1 mukaisesta aminohapposekvenssistä, jotka ovat oleellisia ksylanaasin aktiiviselle kypsyvälle muodolle, jolla on samantyppinen 10 ksylanaasiaktiivisuus kuin kuvan 1 mukaisella aminohapposekvenssillä; ja nukleotidisekvenssi, jossa on deletioita, insertioita tai muutoksia, ja jolla on komplementaarinen säie, joka kykenee hybridisoitumaan kovissa hybridi-soivissa olosuhteissa kuvan 1 mukaisen nukleotidisekvenssin kanssa, jotka kovat hybridisointisolosuhteet tarkoittavat inkubointia 6 x SSC lämpötilassa 15 68°C pesuvadeilla lämpötilassa 68°C 2x ja 0,4x SSC, ja koodaa samantyyp pistä ksylanaasiaktiivisuutta kuin kuvan 1 mukainen aminohapposekvenssi, joka kypsyvä ksylanaasimuoto valitaan ryhmästä, johon kuuluu kypsät pre-, pro- ja prepro-muodot.

2. Rekombinantti-DNA-materiaali, tunnettu siitä, että se käsittää DNA:n, jossa on nukleotidisekvenssi, joka koodaa ainakin sieniperäisen ksylanaasin : kypsyvää muotoa, jolla on leipää parantava aktiivisuus ja joka rekombinantti- DNA-materiaali käsittää DNA:n, jolla on kuviossa 1 esitetty nukelotidisek-venssi tai kuvan 1 mukaiseen nukleotidisekvenssiin verrattuna ekvivalentti 25 nukleotidisekvenssi siten, nukleotidisekvenssi, jossa on deletointeja, inser-tointeja tai muutoksia vastaa kuvan 1 mukaista aminohapposekvenssiä; ja/tai nukleotidisekvenssi, jossa on deletioita, insertioita tai muutoksia, ja jolla on komplementaarinen säie, joka kykenee hybridisoitumaan kovissa hybridisoi-30 vissa olosuhteissa kuvan 1 mukaisen nukleotidisekvenssin kanssa, jotka kovat hybridisoitumisolosuhteet tarkoittavat inkubointia 6 x SSC lämpötilassa 111549 68°C pesuvaiheilla lämpötilassa 68°C 2x ja 0,4x SSC, ja koodaa samantyyppistä ksylanaasiaktiivisuutta kuin kuvan 1 mukainen aminohapposekvenssi, joka kypsyvä ksylanaasimuoto valitaan ryhmästä, johon kuuluu kypsät pre-, pro- ja prepro-muodot. 5

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen rekombinantti-DNA-materiaali, tun-. nettu siitä, että DNA kykenee hybridisoitumaan tässä kuvatuksi koettimen kanssa xyl06, kovissa hybridisoituvissa olosuhteissa, jotka kovat hybridisoi-tumisolosuhteet tarkoittavat inkubointia 6 x SSC lämpötilassa 68°C pesuvai- 10 heella lämpötilassa 68°C 2x ja 0,4x SSC.

4. Patenttivaatimuksen 1,2 tai 3 mukainen rekombinantti-DNA-materiaali, tunnettu siitä, että se käsittää DNA:n, jossa on nukleotidisekvenssi, joka koodaa ainakin Aspergillus·, edullisesti Aspergillus niger-, kuten Aspergilus 15 nigervzx. awamorhpexB\sen ksylanaasin kypsyvää muotoa.

5. Rekombinantti DNA-materiaali, tunnettu siitä, se käsittää DNA:n, jossa on nukleotidisekvenssi, joka koodaa ainakin ksylanaasin kypsyvät muodot kuvan 1 mukaisella nukleotidisekvenssillä tai ekvivalentin nukleotidisekvens- 20 sin, joka koodaa kuvan 1 mukaisen aminohapposekvenssin. • ; 6. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 5 mukainen rekombinantti-DNA-materiaali, tunnettu siitä, että se koodaa lisäksi ainakin yhtä muuta entsyymiä, jolla muulla entsyymillä on amylolyyttinen ja/tai hemisellulolyyttinen ja/tai sellulo-25 lyyttinen aktiivisuus.

7. Isäntäsolu, joka on transformoitu jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukaisella rekombinantti-DNA-materiaalilla ja joka ilmentää ja erittää ksylanaasia. 111549

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen solu, tunnettu siitä, että se kykenee ilmentämään ja suositellusti erittämään ainakin ksylanaasin kypsyvän muodon, joka on koodattu rekombinantti DNA-materiaalille.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen solu, tunnettu siitä, että se sovel tuu käytettäväksi menetelmässä, jossa käytetään selluloosaa ja/tai hemisellu-loosaa sisältävää raaka-ainetta, joka solu muuttuu monitoiminalliseksi prosessia varten kun ksylanaasin kypsyvää muotoa koodaava rekombinantti DNA on ekspressoitu. 10

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen solu, tunnettu siitä, että prosessi, jonka suhteen solu on monitoiminnollinen, liittyy elintarvikkeiden prosessointiin ja tuottoon, suositellusti prosessi on fermentoi nti prosessi.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen solu, tunnettu siitä, että prosessi, jonka suhteen solu on monitoiminnollinen, kohdistuu leivontatuot-teiden valmistamiseen.

12. Patenttivaatimuksen 7-11 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on 20 valittu suvuista Aspergillusja Trichoderma, kuten Aspergillus nigersax. awa- mori, Aspergilus nigervax. niger, Aspergillus nidulansia Aspergilus oryzae. * ♦

13. Ksylanaasin kypsyvä muoto, jolla on leipää parantava aktiivisuus, tunnettu siitä, että se on kypsä muoto, joka voidaan saada ilmentämällä jonkin 25 patenttivaatimuksen 1-6 mukainen rekombinantti-DNA-materiaali.

14. Ksylanaasin kypsyvä muoto, jolla on leipää parantava aktiivisuus, tunnettu siitä, että se on kypsyvä muoto, joka voidaan saada ilmentämällä jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen rekombinantti-DNA-materiaali eriste- 30 tyssä muodossa. 111549

15. Menetelmä valmistaa ksylanaasin kypsyvää muotoa, tunnettu siitä, että - viljellään jonkin patenttivaatimuksen 7-12 mukaista solua sopivassa ravintoalustassa, ja - valinnaisesti eristetään saadun entsyymin kypsyvä muoto. 5

16. Leivänparannusseos, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukaista ksylanaasin kypsyvää muotoa suositellusti kypsää muotoa, tai jonkin patenttivaatimuksen 7-12 mukaisen solun.

17. Menetelmä leivontatuotteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että käyte tään patenttivaatimuksen 16 mukaista leivän parannusseosta.

18. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukaisen ksylanaasin kypsyvän muodon tai jonkin patenttivaatimuksen 7 -12 mukaisen solun käyttö prosesseissa, 15 joissa käytetään selluloosapitoista raaka-ainetta, kuten prosesseissa, joilla valmistetaan olutta, paperia, tärkkelystä tai gluteenia ja prosesseissa, joilla hajotetaan selluloosapitoista jätettä, kuten maanviljelysjätettä, eläinrehun valmistamiseksi, tai paperitehtaiden jätettä. 111549