CN102112605B - 来自枯草芽孢杆菌的变体α-淀粉酶及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyE)、其变体、编码AmyE或其变体的核酸，以及含有该核酸的宿主细胞。本发明公开了包括淀粉液化和/或糖化的使用AmyE或其变体的方法。此类方法可以产生用于乙醇产生或高果糖玉米糖浆产生的糖。在一些情况下，可以在低pH、不存在钙和/或不存在葡糖淀粉酶的情况下使用该淀粉酶。

Description

来自枯草芽孢杆菌的变体α-淀粉酶及其使用方法
优先权
本申请要求2008年6月6日提交的美国临时专利申请61/059,513和61/059,618的优先权，这两个临时专利申请以其整体引入作为参考。
技术领域
提供来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的α-淀粉酶(AmyE)、其变体、编码AmyE或其变体的核酸以及含有该核酸的宿主细胞。公开了使用AmyE或其变体的方法，其包括淀粉液化和/或糖化。此类方法可以产生用于乙醇产生或高果糖玉米糖浆产生的糖类。在一些情况下，可以在低pH、不存在钙和/或不存在葡糖淀粉酶的情况下使用这些淀粉酶。
背景技术
谷粒、谷物和植物淀粉，例如玉米淀粉被广泛用于工业制备诸如糖浆和生物燃料的产物。例如，高果糖玉米糖浆(HFCS)是加工形式的玉米糖浆，其具有高果糖含量和与糖相当的甜度，使得HFCS可在软饮料和其他加工食物中用作糖替代物。HFCS生产目前代表了十亿美元的产业。生产乙醇作为生物燃料也是不断增长的产业。
可以通过催化淀粉降解为葡萄糖的酶促方法从淀粉产生糖浆和生物燃料。此酶促方法通常涉及一系列酶催化的反应。
(1)液化：α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)首先催化可含有30-40％w/w干固体(ds)的淀粉悬液降解为麦芽葡聚糖(maltodextran)。α-淀粉酶是催化随机切割内部的α-1，4-D-糖苷键的内水解酶(endohydrolase)。因为通常在高温，例如90-100℃下进行液化，所以优选将热稳定的α-淀粉酶，如来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的α-淀粉酶用于此步骤。目前用于此步骤的α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(AmyS)的α-淀粉酶不产生显著量的葡萄糖。相反，产生的液化产物(liquefact)具有低葡萄糖当量(DE)且含有麦芽糖和高聚合度(DPn)糖类。
(2)糖化：葡糖淀粉酶和/或产麦芽糖α-淀粉酶催化液化后形成的麦芽葡聚糖的非还原端水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。糖化产生富含葡萄糖的糖浆或高麦芽糖糖浆。在前者的情况下，葡糖淀粉酶通常于升高的温度在酸性条件下催化糖化，例如在60℃、pH 4.3下。用于此方法中的葡糖淀粉酶通常获自真菌，例如用于
Figure BDA0000045914770000021
L400中的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶或灰腐质霉(Humicula grisea)葡糖淀粉酶。脱支酶，如支链淀粉酶可以辅助糖化。
备选地，产麦芽糖(maltogenic)α-淀粉酶可以催化糖化来形成高麦芽糖糖浆。产麦芽糖α-淀粉酶通常具有比葡糖淀粉酶更高的最适pH和更低的最适温度，且产麦芽糖淀粉酶通常需要Ca2+。目前用于此应用中的产麦芽糖α-淀粉酶包括枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、植物淀粉酶以及来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α-淀粉酶(L的活性成分)。用于产生多种产物的示例性糖化反应显示于以下：
(3)进一步加工：此方法中的分支点出现在产生富含葡萄糖的糖浆(显示于以上反应途径左侧)之后。如果最终希望的产物是生物燃料，那么酵母可将富含葡萄糖的糖浆发酵为乙醇。另一方面，如果最终希望的产物是富含果糖的糖浆，那么葡萄糖异构酶可催化富含葡萄糖的糖浆转化为果糖。
糖化是产生富含葡萄糖的糖浆中的限速步骤。糖化通常进行48-72小时，许多真菌葡糖淀粉酶在该时间内丧失显著的活性。此外，虽然产麦芽糖α-淀粉酶和葡糖淀粉酶都可以催化糖化，但如上文所示，这两种酶通常在不同的最适pH和温度下操作。如果顺次使用两种酶，那么两种酶间反应条件的差异使得必需调节pH和温度，这减慢了整体方法，并且可引起不可溶直链淀粉聚集体的形成。
因此，本领域中存在对从淀粉产生工业产物的改善的方法的需要。尤其是，存在对糖化步骤中改善的效率的需要。
发明概述
所描述的是涉及来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyE)和相关多肽的组合物和方法。AmyEα-淀粉酶的独特性在于它在pH 5.0以下，甚至在约pH 4-4.5显示高比活。此外，Ca2+不影响AmyE的热稳定性，这避免了向淀粉液化或糖化反应加入外源Ca2+的需要。AmyE多肽的这些特征允许在同一反应混合物中(且可选地在同一反应容器中)进行液化和糖化而无需在液化和糖化之间调节反应混合物的pH。具体而言，使用AmyE和葡糖淀粉酶时，不必调节反应条件，这避免了液化和糖化之间的步骤和时间延迟，以及不可溶直链淀粉聚集体的可能形成。因此，可以在葡糖淀粉酶最适的pH和Ca2+浓度下，将AmyE与葡糖淀粉酶顺次或同时用于液化和/或糖化淀粉。AmyE还显示葡糖淀粉酶活性，这减少或消除了用具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽来进行糖化的需要。
一方面，提供用于在淀粉转化方法中液化和糖化淀粉的方法，其包括使淀粉底物与AmyE多肽接触，形成反应混合物，以在该反应混合物中液化和糖化淀粉底物来产生葡萄糖，其中液化和糖化在同一反应混合物中进行而无pH调节。
在一些实施方案中，在不存在具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽的情况下进行糖化(saccharifying)(即糖化(saccharification))。在一些实施方案中，在适合于葡糖淀粉酶多肽活性的pH下进行液化(liquefying)(即液化(liquifaction))。在一些实施方案中，pH是5.0或更低。在一些实施方案中，pH是4.5或更低。在特定实施方案中，pH是4.0或更低。在一些实施方案中，不向反应混合物加入外源钙。在一些实施方案中，反应混合物中的钙浓度低于约8ppm。
在一些实施方案中，使淀粉底物与AmyE多肽接触前向反应混合物中加入具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽。在一些实施方案中，在使淀粉底物与AmyE多肽接触后向反应混合物中加入具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽。在一些实施方案中，在使淀粉底物与AmyE多肽接触的同时向反应混合物中加入具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽。
在一些实施方案中，该方法进一步包括发酵通过液化和糖化产生的葡萄糖来产生生物燃料，如醇。在一些实施方案中，该醇是乙醇。在一些实施方案中，该醇是丁醇。在一些实施方案中，如在SSF的情况下，至少一部分糖化和发酵同时发生在同一反应混合物中。
在一些实施方案中，在封闭系统中使用批发酵法，其中在发酵开始时选择且在发酵过程中不改变反应混合物的组成(包括pH)。在另一实施方案中，使用“补料分批发酵”系统，其中随着发酵的进展递增加入淀粉底物。还在另一实施方案中，使用连续发酵系统，其中连续向生物反应器加入确定成分的发酵培养基，并取出等量条件反应混合物进行加工。
在一些实施方案中，将糖化的淀粉溶液转化为果糖淀粉基糖浆(fructose-starch based syrup，HFSS)，如HFCS。可以在约6.0至约8.0的pH，例如pH 7.5下催化转化为HFSS，且产物可含有约40-45％果糖。在一些实施方案中，该方法进一步包括使通过液化和糖化产生的葡萄糖与葡萄糖异构酶接触来产生果糖(例如以HFCS的形式)。在一些实施方案中，不向反应混合物加入外源钙。在一些实施方案中，反应混合物中的钙浓度低于约8ppm。在一些实施方案中，该方法进一步包括在不降低反应混合物中钙的量的情况下使通过液化和糖化产生的葡萄糖与葡萄糖异构酶接触来产生果糖。
在一些实施方案中，以每公吨干固体(ds)约0.03-1kg的量向反应混合物中加入AmyE多肽。在一些实施方案中，反应混合物是具有约20-35％ds(w/w)的淀粉浆(starch slurry)。可以在约60℃至约90℃，例如70℃至85℃，或甚至低于淀粉糊化(gelation)温度(即约75℃)10、12、14、16、18或甚至20℃的温度和约4.0至约6.0，例如约4.2至约4.8的pH下进行糖化反应。在一些实施方案中，糖化反应的产物是富含葡萄糖的糖浆。葡萄糖浓度可达到至少约95％w/w ds。
在一些实施方案中，AmyE多肽是任意天然存在的AmyE多肽，例如具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或例如用BLAST序列比对算法测量时与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列的AmyE多肽。在特定实施方案中，用于该方法中的AmyE多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在特定实施方案中，用于该方法中的AmyE多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，用于该方法中的AmyE多肽包含C端淀粉结合结构域的缺失。在特定实施方案中，具有C端缺失的AmyE多肽具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，从残基D425(参考SEQ ID NO：1)截短AmyE多肽。
另一方面，提供具有有利特性的AmyE变体。与野生型AmyE多肽相比，AmyE变体可以具有改变的一种特性或多种特性，例如，就针对淀粉、麦芽七糖和/或麦芽三糖底物的比活、底物特异性、热稳定性、最适温度、最适pH、pH和/或温度范围、氧化稳定性、降低淀粉组合物粘度的能力等而言的改变的特性。在一些情况下，AmyE变体的改变的特性涉及特定pH(例如4或5.8)下对特定玉米粉、麦芽三糖、麦芽七糖(maltoheptaose)底物的比活；特定温度(例如60℃)下的热稳定性；或特定pH(例如8或pH 10)下的清洁性能。改变的特性可表征为性能指数(PI)，其中PI是AmyE变体与野生型AmyE的性能比。在一些实施方案中，PI大于约0.5，而在其他实施方案中，PI是约1或大于1。
一方面，变体多肽具有α-淀粉酶活性和至少一种改善酶性能的改变的特征，该变体多肽包含：
与选自AmyE(SEQ ID NO：1)或AmyE的截短变体(SEQ ID NO：2)的亲本α-淀粉酶多肽具有至少60％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和
选自以下的一个或多个位置上的修饰：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424和425；
其中该修饰产生就至少一种改善酶性能的特征而言具有大于1.0的性能指数(PI)的变体多肽。
在一些实施方案中，该变体多肽包含选自以下的一个或多个位置上的修饰：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，39，42，43，44，45，447，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，63，64，65，66，67，68，69，72，73，74，76，778，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，98，99，100，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，118，119，121，124，125，126，128，129，130，131，132，134，135，136，140，141，142，143，144，147，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，170，171，172，175，179，180，181，184，186，187，188，189，190，192，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，207，209，211，212，213，214，217，218，219，221，222，223，224，225，226，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，267，268，270，271，272，273，274，275，276，277，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，324，325，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424和425；
其中该修饰产生就蛋白质表达而言具有大于0.5的性能指数(PI)，且就至少一种改善酶性能的特征而言具有大于1.1的PI的变体多肽。
在一些实施方案中，该一个或多个位置选自1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，98，99，100，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，121，122，124，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424和425，该位置在全长或截短亲本多肽中对性能而言是非完全限制性位置。
在一些实施方案中，该修饰是在选自1A，1C，1D，1E，1F，1G，1H，1K，1M，1N，1Q，1R，1S，1T，1V，1W，1Y，2A，2C，2D，2E，2F，2G，2H，2I，2K，2L，2M，2N，2P，2Q，2R，2S，2V，2W，2Y，3C，3D，3E，3F，3G，3H，3I，3K，3L，3M，3N，3P，3Q，3R，3S，3V，3W，3Y，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4K，4L，4M，4N，4Q，4S，4T，4V，4W，4Y，5A，5C，5D，5E，5F，5G，5H，5I，5K，5L，5N，5R，5V，5W，5Y，6C，6D，6E，6H，6K，6L，6M，6N，6P，6Q，6R，6S，6T，6V，6W，7A，7C，7D，7E，7F，7G，7H，7I，7L，7M，7N，7P，7Q，7R，7S，7T，7W，7Y，8A，8C，8E，8F，8G，8H，8I，8K，8L，8M，8N，8P，8Q，8R，8T，8V，8W，8Y，9A，9C，9D，9E，9F，9H，9I，9K，9M，9N，9P，9R，9S，9T，9V，9W，9Y，10A，10I，10L，10M，10N，10P，10Q，10S，10V，11A，11F，11G，11H，11M，11S，11V，11W，11Y，12I，12M，12V，13A，13C，13D，13E，13F，13G，13I，13L，13M，13Q，13T，13V，13W，13Y，14C，14F，14G，14M，14N，14S，14T，14V，15A，15F，16A，16D，16E，16F，16G，16H，16I，16L，16M，16Q，16S，16T，16V，17A，17F，17I，17M，17Q，17Y，18A，18C，18D，18E，18G，18H，18M，18N，18Q，18R，18T，19A，19C，19H，19L，19M，19N，19S，19W，19Y，20A，20C，20D，20F，20G，20H，20I，20K，20L，20M，20P，20Q，20R，20S，20T，20V，20W，20Y，21A，21C，21D，21E，21H，21I，21K，21L，21M，21N，21Q，21R，21S，21V，22I，22M，22Q，22S，22T，22V，23A，23C，23D，23E，23F，23G，23H，23I，23L，23M，23N，23R，23S，23T，23V，23W，23Y，24A，24C，24D，24F，24G，24L，24N，24P，24Q，24R，24S，24T，24V，24Y，25A，25C，25D，25E，25F，25G，25H，25I，25K，25L，25R，25S，25T，25V，25W，25Y，26A，26F，26I，26L，26V，27A，27C，27D，27E，27F，27G，27H，27I，27L，27M，27N，27P，27Q，27R，27S，27T，27V，27W，27Y，28A，28C，28F，28G，28H，28I，28K，28L，28M，28N，28P，28Q，28R，28S，28T，28V，28W，28Y，29A，29C，29F，29L，29M，29T，29V，30A，30C，30D，30E，30F，30G，30I，30K，30L，30M，30N，30P，30Q，30R，30S，30T，30V，30W，30Y，31A，31C，31E，31F，31G，31H，31I，31K，31L，31M，31N，31Q，31S，31T，31V，31W，31Y，32D，32F，32G，32H，32K，32L，32M，32Q，32S，32T，32V，32Y，33A，33C，33D，33E，33F，33H，33I，33K，33L，33M，33P，33Q，33S，33T，33W，33Y，34A，34F，34I，34P，34W，35A，35C，35F，35G，35H，35I，35L，35M，35N，35P，35Q，35R，35S，35V，35W，35Y，36C，36D，36E，36F，36H，36I，36K，36L，36M，36N，36Q，36R，36S，36T，36Y，37L，37M，37N，37V，38A，38C，38D，38E，38H，38L，38M，38N，38P，38V，39A，39C，39I，39L，39M，39N，39P，39S，39V，40A，40D，40M，40N，40P，40Q，40T，40V，40W，41A，41C，41E，41G，41N，41S，41V，42A，42L，42M，42P，42V，43A，43G，43H，43L，43M，43Q，43S，43T，43V，44A，44C，44D，44E，44F，44G，44H，44I，44K，44L，44M，44N，44P，44R，44S，44T，44V，44W，44Y，45A，45C，45F，45G，45H，45I，45L，45M，45N，45P，45Q，45S，45T，45Y，46A，46C，46D，46E，46F，46H，46I，46L，46M，46N，46Q，46R，46S，46T，46V，46W，46Y，47A，47C，47D，47F，47G，47H，47I，47K，47L，47N，47P，47R，47S，47T，47V，47Y，48A，48C，48D，48E，48F，48H，48I，48K，48L，48N，48P，48S，48T，48V，48W，49A，49C，49D，49F，49G，49H，49I，49K，49L，49P，49Q，49R，49S，49T，49V，49W，49Y，50A，50C，50E，50F，50G，50H，50I，50K，50L，50M，50N，50P，50R，50S，50T，50V，50W，50Y，51A，51C，51D，51E，51F，51H，51I，51K，51L，51M，51N，51P，51Q，51R，51S，51T，51V，51W，52A，52C，52E，52F，52G，52H，52I，52K，52L，52M，52N，52P，52Q，52R，52S，52T，52V，52W，52Y，53A，53C，53E，53F，53G，53H，53I，53L，53N，53P，53R，53S，53T，53V，53W，53Y，54A，54C，54D，54F，54G，54H，54I，54L，54M，54N，54P，54Q，54R，54T，54V，54W，54Y，55A，55C，55D，55E，55F，55G，55H，55I，55N，55P，55Q，55S，55T，55Y，56A，56D，56E，56F，56G，56I，56K，56L，56M，56N，56P，56Q，56R，56T，56V，56W，56Y，57A，57C，57D，57E，57F，57H，57I，57K，57L，57M，57Q，57R，57S，57T，57V，57W，57Y，58A，58F，58H，59A，59C，59D，59E，59F，59G，59H，59K，59L，59N，59P，59R，59S，59T，59V，59W，60A，60C，60D，60E，60G，60I，60K，60L，60M，60N，60Q，60R，60T，60V，61C，61D，61E，61F，61M，61S，61T，61V，62A，62C，62D，62F，62G，62H，62I，62K，62L，62Q，62S，62T，62V，63A，63C，63D，63F，63G，63H，63K，63M，63N，63R，63S，64A，64G，64H，64I，64L，64M，64N，64S，64V，64Y，65A，65C，65E，65H，65I，65K，65L，65M，65Q，65R，65S，66D，66E，66F，66G，66H，66I，66K，66L，66M，66N，66Q，66R，66T，66V，66W，66Y，67A，67C，67D，67E，67F，67G，67I，67K，67L，67N，67P，67Q，67S，67T，67W，68A，68C，68D，68E，68F，68G，68H，68I，68L，68M，68N，68P，68R，68S，68T，68V，68W，68Y，69A，69C，69M，69P，69T，69V，70A，70E，70H，70N，70S，71S，72C，72D，72E，72F，72G，72H，72I，72K，72L，72P，72Q，72S，72T，72V，72W，72Y，73A，73C，73E，73F，73H，73I，73K，73L，73M，73P，73S，73T，73V，73W，74A，74E，74F，74M，74S，74T，74Y，75A，75C，75D，75E，75P，76A，76D，76E，76F，76G，76I，76L，76M，76P，76Q，76R，76S，76V，76Y，77A，77C，77D，77G，77H，77I，77K，77L，77R，77S，77T，77V，77W，77Y，78A，78C，78D，78E，78F，78G，78H，78I，78K，78L，78M，78N，78P，78R，78S，78T，78V，78W，78Y，79A，79G，79L，79M，79N，79Q，79S，79T，80A，80L，80M，80W，80Y，81A，81C，81D，81E，81G，81H，81I，81L，81M，81N，81Q，81R，81S，81T，81V，81W，81Y，82A，82D，82F，82G，82I，82K，82L，82M，82Q，82R，82S，82T，82V，82W，82Y，83A，83F，83I，83L，83T，83V，84A，84D，84E，84G，84I，84K，84M，84N，84Q，84S，84T，84V，85D，85E，85F，85G，85I，85K，85L，85M，85N，85R，85S，85T，85V，85W，86C，86D，86E，86F，86G，86I，86K，86L，86M，86N，86Q，86R，86S，86V，86W，86Y，87F，87G，87T，88A，88C，88D，88F，88G，88H，88I，88K，88L，88M，88N，88Q，88R，88S，88T，88V，88W，88Y，89A，89C，89D，89F，89G，89H，89I，89K，89L，89M，89N，89P，89Q，89R，89S，89T，89V，89W，89Y，90C，90D，90E，90F，90G，90H，90I，90K，90L，90M，90N，90Q，90R，90S，90T，90V，90W，91A，91C，91D，91E，91F，91H，91K，91L，91M，91N，91P，91Q，91R，91S，91T，91W，91Y，92L，92N，92T，92V，93A，93C，93D，93E，93F，93G，93I，93L，93M，93N，93P，93Q，93R，93S，93T，93V，93W，93Y，94A，94C，94I，94M，94T，95A，95F，95L，95M，95V，95Y，96A，96C，96I，96L，96M，96P，96T，97A，97E，97M，97W，98C，98G，98I，98L，98M，98T，98V，99A，99C，99E，99F，99G，99I，99L，99M，99N，99P，99S，99T，100A，100C，100F，100M，100N，100P，100T，100V，100Y，101A，102A，102G，102Q，102S，102W，102Y，103A，103C，103I，103M，103N，103S，103V，104A，104C，104S，105C，105D，105E，105F，105G，105H，105K，105L，105M，105Q，105R，105T，105V，105W，105Y，106A，106C，106E，106F，106H，106I，106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在一些实施方案中，该修饰是在选自1A，1D，1F，1G，1H，1K，1M，1N，1Q，1R，1S，1T，1V，1W，1Y，2A，2E，2F，2G，2II，2I，2P，2Q，2R，2S，2W，3D，3E，3F，3G，3II，3I，3K，3L，3M，3N，3P，3Q，3R，3S，3V，3W，3Y，4D，4E，4F，4G，4I，4K，4L，4Q，4S，4T，4V，4W，5A，5D，5E，5F，5G，5K，5L，5V，5W，6D，6H，6K，6L，6P，6Q，6S，6V，6W，7A，7D，7E，7H，7N，7Q，7R，7S，8A，8C，8E，8F，8G，8H，8I，8K，8L，8N，8P，8Q，8R，8T，8V，8W，8Y，9A，9D，9E，9F，9H，9I，9K，9M，9N，9P，9R，9V，9W，9Y，10I，10L，10M，10P，10S，10V，11A，11F，11M，11V，12I，12M，13A，13D，13Q，14G，14S，14T，14V，15F，16M，16Q，18G，18N，18R，19H，19W，20A，20D，20F，20G，20H，20I，20K，20M，20R，20S，20V，20W，20Y，21E，21I，21M，21Q，21S，21V，22I，22T，22V，23A，23D，23E，23F，23G，23H，23I，23L，23M，23N，23R，23S，23T，23V，23W，23Y，24A，24C，24F，24G，24R，24S，24T，24V，24Y，25E，25F，25K，25L，25R，25S，25T，25V，25W，25Y，26I，26L，27A，27E，27F，27G，27H，27I，27L，27P，27Q，27R，27S，27T，27V，27W，27Y，28A，28C，28G，28H，28I，28K，28L，28M，28N，28P，28Q，28R，28S，28V，28W，28Y，29F，29L，29V，30A，30C，30D，30E，30F，30G，30L，30M，30N，30Q，30R，30S，30T，30V，30W，30Y，31A，31F，31G，31H，31I，31K，31L，31M，31N，31Q，31S，31T，31V，31Y，32G，32S，33A，33D，33E，33H，33Q，33S，34W，35A，35F，35G，35H，35I，35L，35M，35N，35Q，35R，35S，35V，35W，36F，36H，36I，36L，36S，36T，36Y，37L，37V，39A，39P，39S，39V，42V，43A，43S，43T，43V，44A，44D，44E，44F，44G，44H，44I，44K，44N，44R，44S，44T，44Y，45F，45H，45I，45L，45M，45S，45T，46A，46D，46F，46H，46L，46M，46N，46R，47A，47D，47F，47G，47H，47I，47K，47L，47N，47P，47R，47S，47T，47V，47Y，48A，48E，48F，48H，48N，48P，48W，49A，49F，49G，49H，49K，49L，49Q，49R，49S，49T，49V，49W，49Y，50E，50F，50H，50I，50K，50L，50M，50P，50R，50S，50T，50V，50W，50Y，51D，51E，51F，51H，51I，51K，51L，51P，51Q，51R，51S，51T，51V，51W，52E，52F，52G，52H，52I，52K，52L，52M，52N，52Q，52R，52S，52T，52V，52W，52Y，53A，53E，53F，53H，53I，53L，53P，53R，53S，53T，53V，54A，54C，54F，54G，54H，54L，54N，54P，54R，54T，54W，54Y，55A，55F，55H，55N，55P，55Q，55S，55T，55Y，56D，56E，56F，56G，56I，56K，56L，56P，56Q，56R，56T，56V，56W，56Y，57A，57E，57H，57M，57Q，57R，57S，57Y，58F，59A，59C，59F，59H，59N，59P，59R，59S，59T，59W，60L，60N，63H，63N，64A，64S，65A，65I，65R，66D，66E，66G，66M，66N，66Q，66R，67A，67F，67G，67I，67L，67N，67Q，67T，67W，68D，68F，68H，68I，68L，68N，68R，68S，68T，68V，68W，69M，69V，72E，72F，72G，72H，72I，72K，72Q，72S，72T，72V，72W，72Y，73F，73M，73W，74M，74T，76A，76L，76M，76P，76Q，76R，76Y，77A，77D，77K，77L，77R，77Y，78D，78E，78F，78G，78H，78I，78K，78L，78P，78R，78S，78T，78W，78Y，79A，79M，79Q，79S，80M，81E，81G，81H，81L，81M，81N，81Q，81R，81S，81T，81V，81Y，82D，82F，82G，82I，82K，82L，82M，82Q，82R，82S，82T，82Y，83A，83F，83L，84A，84N，84S，84T，85D，85E，85F，85G，85I，85K，85R，85S，85T，85V，85W，86D，86E，86F，86G，86I，86K，86L，86M，86N，86Q，86R，86S，86V，86W，86Y，87G，88A，88D，88F，88G，88H，88K，88L，88M，88N，88Q，88R，88S，88T，88W，88Y，89D，89F，89G，89H，89I，89K，89L，89M，89N，89P，89Q，89R，89S，89T，89V，89W，89Y，90D，90E，90F，90H，90I，90K，90M，90N，90R，90S，90T，90V，90W，91D，91E，91H，91K，91N，91Q，91R，91S，92L，92V，93A，93D，93G，93M，93N，93R，93S，93Y，94I，95F，95M，96I，98C，99I，100C，100F，100M，100V，103A，103C，103V，104A，104S，105C，105D，105E，105F，105G，105M，105W，105Y，106E，106H，106N，106Q，106S，106T，106Y，107A，107C，107E，107F，107G，107H，107I，107K，107L，107M，107N，107P，107Q，107R，107S，107T，107V，107W，108C，108D，108E，108F，108G，108H，108I，108K，108L，108N，108P，108R，108S，108T，108V，108W，108Y，109D，109H，109I，109K，109L，109N，109R，109S，109V，109W，109Y，110V，111C，111E，111F，111G，111H，111K，111L，111M，111N，111Q，111R，111T，112A，112D，112E，112H，112K，112L，112R，112S，112T，112W，112Y，113A，114L，115A，115H，115I，115L，115R，115V，115Y，116A，116F，116G，116H，116I，116L，116N，116Q，116R，116T，116V，116W，116Y，118D，118F，118G，118H，118K，118L，118M，118N，118Q，118R，118S，118T，118V，118W，118Y，119E，119F，119I，119K，119L，119M，119Q，119S，119T，119Y，121S，124A，124K，124Q，124R，124S，124T，125A，125D，125F，125I，125K，125Q，125R，125V，125Y，126A，126C，126D，126F，126G，126H，126I，126K，126L，126N，126P，126R，126S，126T，126V，126W，126Y，128A，128C，128E，128F，128G，128H，128I，128L，128M，128N，128Q，128R，128S，128T，128V，129C，129D，129E，130A，130F，130L，130T，130Y，131A，131C，131D，131F，131G，131H，131I，131K，131L，131N，131Q，131T，131V，131W，131Y，132I，132N，132S，132W，134E，134F，134L，134M，134R，134Y，135E，136L，140A，141F，141H，142C，142D，142F，142G，142H，142I，142K，142M，142Q，142R，142S，142T，142W，142Y，143C，143D，143K，143L，143N，143Q，143S，144T，147F，147L，150H，151C，151D，151E，151G，151H，151K，151L，151M，151Q，151S，151T，152A，152C，152E，152F，152G，152H，152I，152K，152L，152M，152N，152P，152Q，152R，152S，152V，152W，152Y，153E，153F，153H，153K，153L，153N，153R，153T，153V，153W，153Y，154A，155M，156A，156F，156G，156K，156L，156Q，156R，156V，156Y，157F，157H，158A，158I，158M，158T，158V，159H，159I，159L，159M，160A，160C，160D，160E，160F，160G，160H，160I，160K，160L，160M，160Q，160S，160T，160V，162I，162M，163A，163E，163F，163G，163H，163I，163K，163L，163N，163Q，163R，163S，163T，163V，163W，163Y，164G，164H，164L，164N，164S，164T，164V，164W，164Y，165C，165I，165L，165M，165T，165V，166C，166I，166M，166V，167A，167C，167E，167F，167G，167I，167K，167L，167M，167Q，167R，167S，167T，167V，167W，167Y，168C，168E，168F，168G，168K，168L，168M，168N，168S，168T，168V，168W，168Y，170C，171E，171H，171I，171M，171N，171Q，171R，172A，175Y，179A，179C，179G，179H，179S，179W，180M，181V，184D，186E，187E，187F，187H，187I，187K，187M，187Q，187S，187V，187W，188A，188D，188F，188G，188I，188K，188L，188M，188P，188Q，188R，188T，188V，189F，189W，190H，190K，190Q，190R，190S，192G，192K，192L，192P，192S，192V，195D，195F，195G，195H，195K，195M，195R，195V，195W，196A，196C，196E，196F，196H，196I，196K，196L，19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8V，348W，348Y，349A，349F，349G，349I，349K，349M，349N，349R，349S，349V，349W，349Y，350D，351A，351D，351G，351H，351K，351L，351M，351P，351Q，351R，351T，351V，351W，351Y，352A，352H，352Q，352T，352Y，353A，353D，353E，353G，353I，353K，353L，353M，353Q，353V，353W，353Y，355C，355F，355I，355L，355M，355V，355Y，356D，356F，356G，356I，356K，356L，356P，356Q，356T，356W，356Y，357A，357H，357I，357K，357L，357N，357Q，357R，357S，357T，357V，357W，357Y，358C，358D，358F，358G，358H，358I，358K，358L，358M，358Q，358R，358S，358T，358V，358Y，359D，359E，359H，359L，359M，359P，359Q，359R，359T，359V，359W，360F，360P，360T，361C，361L，361M，361N，361Q，361S，361T，361V，362A，362C，362I，362L，362V，362Y，363D，363G，363H，363Q，363R，363S，363V，363W，363Y，364A，364C，364G，364I，364L，364M，364Q，364S，364T，364V，365C，365I，365K，365L，365N，365R，365S，365V，366A，366K，367L，367M，367N，367R，367S，367T，367W，367Y，368G，368I，368K，368L，368R，368T，368V，368W，369C，369D，369E，369F，369G，369I，369K，369L，369N，369Q，369S，369T，369V，369Y，371A，371C，371F，371I，371L，371M，371N，371S，371T，371Y，372A，372C，372I，372L，372N，372S，372T，373A，373C，373F，373I，373M，373T，373V，374C，374G，374I，374M，374S，374T，374V，375A，375C，375D，375F，375H，375L，375M，375Q，375S，375T，375Y，376G，376I，376S，376T，376V，377F，377H，377L，377T，377W，377Y，378C，378E，378F，378G，378H，378I，378K，378L，378M，378N，378Q，378R，378T，378V，378W，378Y，379A，379G，379H，379I，379K，379L，379Q，379T，379Y，380C，380E，380F，380G，380H，380L，380M，380N，380P，380Q，380R，380T，380V，380W，380Y，381G，381I，381Q，381R，381S，381T，381W，381Y，382A，382C，382F，382I，382K，382Q，382R，382T，382W，382Y，383A，383F，383L，383P，383Q，383V，384A，384G，384H，384I，384K，384P，384Q，384V，384W，385C，385F，385H，385I，385K，385L，385N，385P，385Q，385R，385S，385V，385W，385Y，386D，386F，386G，386H，386L，386N，386R，386S，386T，386V，386W，386Y，387I，387L，388A，388C，388G，388H，388L，388P，388S，388T，388W，388Y，389C，389F，389I，389M，389Q，389V，390F，390I，390K，390L，390N，390R，390S，390T，390V，390W，390Y，391F，391K，391N，391P，391R，391T，391W，391Y，392A，392C，392D，392E，392F，392H，392K，392L，392N，392Q，392R，392S，392V，392Y，393A，393C，393D，393F，393G，393H，393I，393L，393Q，393S，393T，393V，393W，393Y，394A，394C，394F，394H，394I，394K，394L，394Q，394V，394W，395F，395G，395H，395K，395L，395Q，395R，395S，395T，395V，395W，395Y，396C，396D，396S，397C，397D，397F，397G，397H，397I，397L，397P，397S，397T，397V，397W，398C，398G，398N，398S，398T，398V，399C，399F，399I，399K，399L，399R，399S，399T，399V，399W，399Y，400C，400D，400E，400F，400G，400H，400I，400K，400L，400M，400Q，400R，400S，400T，400V，400W，400Y，401A，401C，401D，401E，401F，401I，401K，401L，401M，401N，401Q，401R，401S，401T，401V，401W，401Y，402A，402C，402D，402E，402F，402G，402H，402I，402K，402L，402M，402N，402P，402Q，402R，402T，402V，402W，402Y，403A，403C，403H，403I，403M，403V，403W，403Y，404F，404H，404M，404R，404T，404V，404W，404Y，405G，405Q，405S，405T，406L，406T，407F，407G，407H，407I，407K，407M，407Q，407R，407S，407T，407V，407W，407Y，408D，408E，408F，408N，408V，409C，409F，409I，409L，409R，409T，409V，409W，409Y，410V，411E，411F，411M，411Q，411R，411S，411Y，412N，412T，413C，413F，413G，413I，413L，413P，413R，413S，413V，413W，413Y，414H，414L，414N，414Q，414T，414V，414W，415D，415E，415G，415I，415R，415V，415W，416F，416L，416Q，416Y，417A，417C，417D，417F，417G，417H，417I，417K，417M，417N，417Q，418D，418F，418H，418I，418K，418N，418W，418Y，419E，419F，419H，419I，419L，419S，419T，420D，420E，420F，420G，420H，420I，420K，420L，420Q，420S，420T，420V，420W，420Y，421C，421L，421M，421S，421T，422F，422I，422S，422W，423D，423I，423Q，423R，423T，424M，424Q，424R，424V，424Y，425A，425I，425K，425L，425V和425Y的一个或多个位置上将存在于亲本多肽中的一个或多个氨基酸残基取代为不同的氨基酸残基。
在一些实施方案中，该取代将存在于位置153上的氨基酸残基改变为N、K或F，且与亲本多肽相比，该变体多肽显示提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。在一些实施方案中，该取代将存在于位置153上的氨基酸残基改变为K，且与亲本多肽相比，该变体多肽显示提高的将DP7底物转化为葡萄糖的能力。
在一些实施方案中，该取代选自L142F、L142G、L142Q、L142S、L142W、L142Y、A214I、A214V、S245Y、Q126F、Q126L、Q126P、Q126V、S131L和S254I，且其中与SEQ ID NO：1的亲本多肽相比，该取代改善了变体多肽的淀粉液化性能。在一些实施方案中，该取代选自W60L、W60M、W60N、I100F、I100M、S105M、S105W、G207A、T270A、T270E、T270L、T270N、T270V和T279A，且其中与SEQ ID NO：2的亲本多肽相比，该取代改善了变体多肽的淀粉液化性能。
在一些实施方案中，该取代选自052D、052E，052I，0052K，052L，052N，052Q，052R，052V，056D，0056E，056I，0056K，0056L，056N，056Q，056R，056V，089D，089E，089I，089K，089L，089N，089Q，089R，089V，152D，152E，152I，152K，152L，152N，152Q，152R，152V，153D，153E，153I，153K，153L，153N，153Q，153R，153V，201D，201E，201I，201K，201L，201N，201Q，201R，201V，251D，251E，251I，251K，251L，251N，251Q，251R，251V，284D，284E，284I，284K，284L，284N，284Q，284R，284V，297D，297E，297I，297K，297L，297N，297Q，297R，297V，308D，308E，308I，308K，308L，308N，308Q，308R，308V，321D，321E，321I，321K，321L，321N，321Q，321R，321V，328D，328E，328I，328K，328L，328N，328Q，328R，328V，347D，347E，347I，347K，347L，347N，347Q，347R，347V，357D，357E，357I，357K，357L，357N，357Q，357R，357V，359D，359E，359I，359K，359L，359N，359Q，359R，359V，369D，369E，369I，369K，369L，369N，369Q，369R，369V，385D，385E，385I，385K，385L，385N，385Q，385R，385V，388D，388E，388I，388K，388L，388N，388Q，388R，388V，391D，391E，391I，391K，391L，391N，391Q，391R、391V、400D、400E、400I、400K、400L、400N、400Q、400R、400V、416D、416E、416I、416K、416L、416N、416Q、416R和416V，该突变就蛋白质和活性二者而言具有＞0.5的PI值。
在一些实施方案中，变体多肽不包含选自亲本多肽75、97、101、102、120、123、133、137、182、266和306位置上的氨基酸残基的修饰。在一些实施方案中，变体多肽不包含选自75和123位置上的氨基酸残基的修饰，已将其测定为在截短亲本多肽中对性能而言是完全限制性位置。在一些实施方案中，变体多肽不包含选自75、97、101、102、120、133、137、182、266和306位置上的氨基酸残基的修饰，已将其测定为在全长亲本多肽中对性能而言是完全限制性位置。
在一些实施方案中，亲本多肽与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，亲本多肽与SEQ IDNO：1或2的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，亲本多肽与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，改善酶性能的特征选自提高的热稳定性、提高的比活和提高的蛋白质表达。
在一些实施方案中，改善酶性能的特征选自提高的热稳定性、提高的比活和提高的蛋白质表达。
还提供淀粉加工组合物，其含有AmyE多肽(包含变体)和可选地含有葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)、异淀粉酶或其组合。在特定实施方案中，该组合物含有具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽。
还提供烘焙组合物，其含有在溶液中或在凝胶中的AmyE多肽(包含变体)。烘焙方法包括向待烘焙的物质中加入烘焙组合物并烘焙该物质。
另一方面，提供清洁组合物，其含有在水溶液中的AmyE多肽(包含变体)和可选地含有另一种酶、洗涤剂和/或漂白剂。该清洁溶液可以用于洗衣、洗餐具或清洁其他表面。在相关方法中，使餐具、衣物或其他表面与清洁组合物接触足以清洁该物品的时间。
另一方面，提供纺织品脱浆组合物，其含有在水溶液中的AmyE多肽(包含变体)和可选地含有另一种酶。在相关方法中，使纺织品与脱浆组合物接触足以脱浆该纺织品的时间。
另一方面，提供编码AmyE变体的核酸、包含此类多核苷酸的表达载体和表达AmyE变体的宿主细胞。还在另一方面，提供与编码本文所示的任意AmyE变体的核酸互补的核酸。此外，提供能够与编码本文所示的任意AmyE变体的核酸杂交的核酸或其互补物。另一方面，提供涉及编码本文所示的任意AmyE变体的合成核酸的组合物和方法，其中针对在特定宿主生物中的表达可选地优化密码子。
可从以下描述和附图理解该组合物和方法的这些及其他方面和实施方案。
附图简述
图1显示具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE(本文称为“AmyE全长”)和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的AmyE(本文称为“Amy31A”)间的序列比对。以黑体显示氨基酸序列中的差异。从成熟形式的酶中的第一个氨基酸编号残基。
图2显示质粒pME630-7，其包含编码AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的多核苷酸(标记为“SAMY 425aa”)。该质粒包含与SAMY基因符合读框的多核苷酸，该多核苷酸编码来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号序列(标记为“pre LAT”)。
图3显示AmyE(SEQ ID NO：1；“AmyE全长”)、AmyE-tr(SEQ IDNO：2；“AmyE截短(的)”)和Amy31A(SEQ ID NO：3)对用RemazolBrilliant Blue(RBB)标记的不可溶玉米淀粉底物的相对比活。在50℃，pH 4.5、5.0或5.6下催化底物水解30分钟。通过所释放的RBB标记在595nm的吸光度测定酶活性。
图4A显示在pH 4.5或5.8、存在0.7mg AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的情况下测量为时间(分钟)的函数的15g ds淀粉底物的粘度(μNm)。
图4B将pH 4.5或5.8、存在2.2mg AmyE(SEQ ID NO：1)下的底物粘度显示为时间的函数。图4C将pH 4.5或5.8、存在1.4mg Amy31A(SEQID NO：3)下的底物粘度显示为时间的函数。图4D将pH 4.5或5.8、存在4.1mg Amy31A下的底物粘度显示为时间的函数。
图5A显示存在或不存在2mM Ca2+的情况下，AmyE(SEQ ID NO：1；“AmyE全长”)和AmyE-tr(SEQ ID NO：2；“AmyE截短”)的过量热容量功能的差示扫描量热法(DSC)分析。图5B显示存在或不存在2mMCa2+的情况下Amy31A(SEQ ID NO：3)的DSC分析。图5C显示存在或不存在2mM Ca2+的情况下嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)α-淀粉酶(AmyS)的DSC分析。
图6显示与AmyE位置Q153变体和截短AmyS(SEQ ID NO：4)相比，通过AmyE-tr(SEQ ID NO：2)从麦芽糖底物产生葡萄糖的结果。
图7显示与AmyE位置Q153变体和截短AmyS(SEQ ID NO：4)相比，通过AmyE-tr(SEQ ID NO：2)从麦芽七糖底物产生葡萄糖的结果。
图8显示AmyE-tr与麦芽七糖(DP7)孵育0小时(顶部)和72小时(底部)后通过HPLC检测的降解产物。
图9显示AmyS与DP7底物孵育0小时、2小时、4小时和24小时(从顶部至底部)后通过HPLC检测的降解产物。
图10显示通过将AmyE-tr Q153K变体与麦芽七糖(DP7)孵育所形成的产物。从顶部至底部显示的HPLC图对应于时间0小时、1小时、2小时、3小时和24小时。
图11显示在pH 4.3和5.8下的常规发酵中通过截短AmyE和
Figure BDA0000045914770000311
Xtra淀粉酶的乙醇形成。
图12显示在pH 4.3和pH 5.8下与AkAA单独，或AkAA与StargenTM002相比，通过全长(FL)和截短(tr)AmyE将不可溶颗粒(未蒸煮)淀粉水解为乙醇。
图13显示在pH 4.5和5.6下与AmyS相比，通过枯草芽孢杆菌AmyE全长、AmyE截短和Amy31A的葡萄糖形成。
图14显示将全长AmyE与粗淀粉(玉米粉)孵育并通过HPLC检测来检测寡糖随时间(0、30、90分钟)产生的结果。
图15显示在使用AmyE多肽的淀粉水解测定中获得的最高粘度值和最终粘度值。
图16显示使用AmyE多肽的面包陈化测定的结果。
序列简述
在本申请中提到以下序列：
SEQ ID NO：1：全长枯草芽孢杆菌AmyE氨基酸序列。未显示天然信号序列。
1   LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ
51  GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI
101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ
151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT
201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS
251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST
301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE
351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA
401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPDDIAKA PHVFLENYKT GVTHSFNDQL
451 TITLRADANT TKAVYQINNG PETAFKDGDQ FTIGKGDPFG KTYTIMLKGT
501 NSDGVTRTEK YSFVKRDPAS AKTIGYQNPN HWSQVNAYIY KHDGSRVIEL
551 TGSWPGKPMT KNADGIYTLT LPADTDTTNA KVIFNNGSAQ VPGQNQPGFD
601 YVLNGLYNDS GLSGSLPH
SEQ ID NO：2：截短枯草芽孢杆菌AmyE(AmyE-tr)氨基酸序列。未显示天然信号序列。
1   LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ
51  GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI
101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ
151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT
201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS
251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST
301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE
351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA
401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPD
SEQ ID NO：3：枯草芽孢杆菌α-淀粉酶变体Amy31A氨基酸序列(UniProtKB/TrEMBL检索号O82953)。以黑体显示天然信号序列。
1   MFEKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLSGPAA ANAETANKSN KVTASSVKNG
51  TILHAWNWSF NTLTQNMKDI RDAGYAAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY
101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKDMCAAAEK YGVKVIVDAV VNHTTSDYGA
151 ISDEIKRIPN WTHGNTQIKN WSDRWDITQN ALLGLYDWNT QNTEVQAYLK
201 GFLERALNDG ADGFRYDAAK HIELPDDGNY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI
251 LQDSASRDTA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRILSVSNI SHYASDVSAD
301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIGSRSGS TPLFFSRPEG
351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FKDQAITAVN QFHNEMAGQP EELSNPNGNN
401 QIFMNQRGSK GVVLANAGSS SVTINTSTKL PDGRYDNRAG AGSFQVANGK
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601 TKNADGIYTL TLPANADTAD AKVIFNNGSA QVPGQNHPGF DYVQNGLYNN
651 SGLNGYLPH
SEQ ID NO：4：截短嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)蛋白质序列(Xtra淀粉酶)。信号序列显示为黑体。
1   MLTFHRIIRK GWMFLLAFLL TASLFCPTGQ HAKAAAPFNG TMMQYFEWYL
51  PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YGVYDLYDLG
101 EFNQKGTVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADVVFDH KGGADGTEWV
151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKW RWYHFDGVDW
201 DESRKLSRIY KFIGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADLDMDH PEVVTELKNW
251 GKWYVNTTNI DGFRLDAVKH IKFSFFPDWL SYVRSQTGKP LFTVGEYWSY
301 DINKLHNYIT KTNGTMSLFD APLHNKFYTA SKSGGAFDMR TLMTNTLMKD
351 QPTLAVTFVD NHDTEPGQAL QSWVDPWFKP LAYAFILTRQ EGYPCVFYGD
401 YYGIPQYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDHSDI IGWTREGVTE
451 KPGSGLAALI TDGPGGSKWM YVGKQHAGKV FYDLTGNRSD TVTINSDGWG
501 EFKVNGGSVS VWVPRKTT
SEQ ID NO：5：编码SEQ ID NO：1的AmyE的核苷酸序列。
CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGT
TAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAA
CCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCG
ACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAG
CCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTA
TGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAA
AACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACAC
AAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGA
CGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAA
TTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTG
CCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCAT
AAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTG
TCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGT
CGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAG
TACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGC
CAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTC
ACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTAT
GAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAAT
ACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGA
ACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGATGATAT
TGCAAAAGCGCCTCATGTTTTCCTTGAGAATTACAAAACAGGTGTAACACATTCTTTCAATGAT
CAACTGACGATTACCTTGCGTGCAGATGCGAATACAACAAAAGCCGTTTATCAAATCAATAATG
GACCAGAGACGGCGTTTAAGGATGGAGATCAATTCACAATCGGAAAAGGAGATCCATTTGGCAA
AACATACACCATCATGTTAAAAGGAACGAACAGTGATGGTGTAACGAGGACCGAGAAATACAGT
TTTGTTAAAAGAGATCCAGCGTCGGCCAAAACCATCGGCTATCAAAATCCGAATCATTGGAGCC
AGGTAAATGCTTATATCTATAAACATGATGGGAGCCGAGTAATTGAATTGACCGGATCTTGGCC
TGGAAAACCAATGACTAAAAATGCAGACGGAATTTACACGCTGACGCTGCCTGCGGACACGGAT
ACAACCAACGCAAAAGTGATTTTTAATAATGGCAGCGCCCAAGTGCCCGGTCAGAATCAGCCTG
GCTTTGATTACGTGCTAAATGGTTTATATAATGACTCGGGCTTAAGCGGTTCTCTTCCCCAT
SEQ ID NO：6：编码AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列。
CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGT
TAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAA
CCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCG
ACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAG
CCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTA
TGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAA
AACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACAC
AAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGA
CGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAA
TTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTG
CCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCAT
AAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTG
TCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGT
CGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAG
TACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGC
CAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTC
ACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTAT
GAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAAT
ACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGA
ACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGAT
SEQ ID NO：7：编码枯草芽孢杆菌Amy31A(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列。
TCTGTTAAAAACGGCACTATTCTGCATGCATGGAACTGGAGCTTTAACACGCTGACCCAGAACA
TGAAAGATATTCGTGACGCGGGCTATGCTGCGATCCAAACCAGCCCTATCAACCAGGTCAAAGA
AGGCAACCAAGGCGACAAATCCATGTCCAACTGGTACTGGCTGTATCAACCGACGTCCTATCAG
ATTGGCAACCGTTATCTGGGCACGGAGCAAGAGTTCAAAGACATGTGTGCTGCGGCTGAGAAAT
ATGGTGTGAAAGTTATCGTGGACGCTGTGGTAAACCACACGACCTCTGATTATGGTGCTATTAG
CGACGAGATTAAACGTATTCCAAATTGGACCCATGGTAATACCCAGATCAAAAATTGGAGCGAC
CGCTGGGACATTACCCAGAATGCGCTGCTGGGTCTGTATGACTGGAACACGCAAAACACCGAAG
TACAGGCATATCTGAAGGGCTTCCTGGAACGCGCTCTGAACGATGGTGCTGATGGTTTTCGCTA
CGACGCCGCAAAGCATATTGAGCTGCCGGATGACGGCAACTACGGTTCCCAATTCTGGCCGAAC
ATCACCAACACCTCTGCCGAATTCCAGTACGGCGAGATCCTGCAAGACTCCGCGAGCCGTGACA
CCGCTTATGCCAACTATATGAACGTAACTGCCTCTAACTATGGCCATTCCATTCGTTCTGCGCT
GAAAAATCGTATCCTGTCCGTGTCCAATATCTCCCACTATGCATCCGACGTTTCTGCTGACAAA
CTGGTAACTTGGGTCGAGTCTCACGACACCTATGCAAATGATGACGAGGAGAGCACCTGGATGA
GCGATGATGATATTCGTCTGGGTTGGGCGGTTATTGGTTCTCGCTCTGGTTCTACTCCGCTGTT
CTTTAGCCGTCCGGAAGGTGGCGGCAATGGCGTTCGTTTCCCGGGTAAATCTCAAATTGGTGAT
CGTGGCTCTGCACTGTTTAAAGATCAAGCTATTACGGCGGTGAATCAGTTCCATAATGAGATGG
CAGGTCAACCTGAAGAACTGTCCAATCCAAACGGTAACAACCAAATCTTCATGAACCAGCGTGG
CAGCAAAGGCGTCGTCCTGGCGAACGCCGGTAGCTCTTCTGTTACCATCAACACGTCTACCAAA
CTGCCAGACGGCCGCTATGATAACCGTGCGGGTGCTGGTTCCTTTCAGGTAGCCAACGGCAAGC
TGACGGGCACCATCAACGCTCGTTCTGCTGCTGTTCTGTACCCGGACGACATTGGCAACGCTCC
GCACGTGTTCCTGGAGAATTACCAGACCGAAGCGGTACATAGCTTTAATGACCAGCTGACCGTC
ACTCTGCGTGCCAACGCAAAAACCACGAAAGCAGTCTATCAGATCAATAATGGTCAAGAAACTG
CTTTCAAGGATGGCGACCGTCTGACTATTGGTAAGGAGGACCCGATTGGCACCACTTATAACGT
TAAACTGACTGGCACCAATGGCGAGGGCGCTAGCCGCACTCAAGAGTATACGTTCGTAAAGAAA
GACCCGTCTCAAACCAACATCATCGGTTACCAGAATCCTGACCACTGGGGTAATGTGAACGCTT
ACATCTATAAACATGATGGTGGCGGTGCTATCGAACTGACCGGCTCTTGGCCAGGTAAAGCCAT
GACGAAAAACGCGGATGGCATCTATACCCTGACCCTGCCGGCCAATGCGGATACCGCAGATGCG
AAGGTTATCTTCAATAACGGCTCCGCGCAGGTTCCGGGCCAAAACCATCCGGGCTTTGACTACG
TACAAAATGGTCTGTATAACAACTCTGGCCTGAACGGTTACCTGCCGCAC
SEQ ID NO：8：编码嗜热脂肪土芽孢杆菌AmyS(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列。
GCCGCACCGTTTAACGGTACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACGT
TATGGACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCTTTGGCT
GCCGCCCGCTTACAAAGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAGTATACGACTTGTATGAC
CTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCCGCACAAAATATGGAACAAAAGCTCAATATCTTC
AAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGATGTCGTGTTCGACCATAA
AGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAATCCGTCCGACCGCAACCAA
GAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTGATTTTCCCGGGCGGGGCAACA
CCTACTCCAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGGCGTTGACTGGGACGAAAGCCGAAA
ATTAAGCCGCATTTACAAATTCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGA
AACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGATCATCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGA
AAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATGCCGTCAA
GCATATTAAGTTCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCG
CTATTTACCGTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAA
CAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATC
AGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTCTCATGAAAGATCAACCGACATTG
GCCGTCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAACCCGGCCAAGCGCTGCAGTCATGGGTCGACC
CATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTCTT
TTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCG
CTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACA
TCATCGGGTGGACAAGGGAAGGGGTCACTGAAAAACCAGGATCCGGGCTGGCCGCACTGATCAC
CGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGTGTTCTAT
GACCTTACCGGCAACCGGAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGAATTCAAAG
TCAATGGCGGTTCGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACC
SEQ ID NO：9：SEQ ID NO：1的AmyE的天然信号序列。
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE
SEQ ID NO：10：引物PSTAMYE-F 5′。
CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGG
AAC
SEQ ID NO：11：引物AMYENOPST-R 5′
CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTGGAACTCTGCTGATGTATTTGTG
SEQ ID NO：12：引物AMYENOPST-F 5′。
CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG
SEQ ID NO：13：引物HPAIAMYE-R 5′。
CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGAGTC
SEQ ID NO：14：引物HPAIAMYE466-R 5′。
CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG
SEQ ID NO：15：引物AMYE SEQ-F15′。
TACACAAGTACAGTCCTATCTG
SEQ ID NO：16：引物AMYE SEQ-F25′。
CATCCTCTGTCTCTATCAATAC
SEQ ID NO：17：Buttiauxiella肌醇六磷酸酶的BP-17变体。
NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT
PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE
AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA
QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS
IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWASLL
KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI
LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV
SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR
VVSQSVEPGC QLQ
发明详述
本组合物和方法涉及来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyE)及其变体(共同称为AmyE多肽)，与其他α-淀粉酶相比，其提供某些优势。例如，AmyE多肽在酸性pH下显示对淀粉底物的高比活，这允许在也适合于糖化的条件下将AmyE用于淀粉液化。这消除了在液化和糖化之间调节淀粉浆pH的需要。AmyE多肽还具有葡糖淀粉酶活性，这消除或降低了用分开的葡糖淀粉酶进行糖化的需要。此外，AmyE多肽的热稳定性需要很少的钙或不需要钙，这消除了在随后进行异构化之前去除所加入的钙的需要，从而消除了产生高果糖玉米糖浆所需的至少一个步骤。
下文更详细地描述了该组合物和方法的这些及其他特征。
1.定义和缩写词
除非另作定义，否则所有技术和科学术语及缩写词应符合本领域普通技术人员所理解的其普通意义。为了清楚而定义了以下术语和缩写词。
1.1.定义
本文所用的术语“淀粉”指包含植物复合多糖糖类的任意物质，其包含具有化合式(C6H10O5)x(其中x可以是任意数字)的直链淀粉和支链淀粉。具体而言，该术语指任意基于植物的物质，其包括但不限于谷粒、草、块茎和根，更具体而言是小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸、木薯、小米、马铃薯、甘薯和木薯淀粉。
本文所用的术语“寡糖”指包含3-20个单糖的糖类分子。
如本文所使用，“淀粉酶”指能够催化淀粉降解的酶。通常，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)是以随机方式切割淀粉分子内α-D-(1→4)O-糖苷键的内切酶。与此相反，外切淀粉分解酶如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如产麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)从底物的非还原端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)，以及产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的低聚麦芽糖(malto-oligosaccharides)。如本文所使用，淀粉酶包含任意/所有淀粉酶，其包含葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和野生型α-淀粉酶，如芽孢杆菌属物种，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的那些，而α-淀粉酶包含这些酶的前述亚组。
如本为所使用，“α-淀粉酶变体”及类似的短语指参考α-淀粉酶的变体/突变体，就该参考α-淀粉酶的亲本(野生型；参考)氨基酸序列而言，其包含氨基酸取代、插入和/或缺失。术语“变体”与术语“突变体”可互换使用。就亲本信号序列而言，变体α-淀粉酶可在信号序列中包含突变。此外，变体α-淀粉酶可以是含有异源α-淀粉酶信号序列(如来自地衣芽孢杆菌(LAT))的融合蛋白质的形式。
“亲本核酸/多核苷酸”、“野生型核酸/多核苷酸”或“参考核酸/多核苷酸”指编码亲本多肽的核酸序列及与其互补的核酸。
“变体核酸/多核苷酸”指编码变体多肽的核酸序列或与其互补的核酸，或就亲本多核苷酸序列或与其互补的核酸而言具有至少一个碱基取代、插入或缺失的多核苷酸序列。指定时，此类核酸可以包含与参考序列具有指定程度的同一性的序列，或能够例如在严格条件[例如，50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)]或高度严格条件[例如，65℃和0.1X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)]下与参考序列杂交的序列。可以优化变体核酸以反映用于指定的宿主生物，如甲基营养酵母(例如毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)等)或丝状真菌(例如木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉(T.reesei))等)或其他表达宿主(例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)等)的优选的密码子选择。
“信号序列”是与蛋白质N端部分连接的氨基酸序列，其便于蛋白质分泌至细胞外。“信号序列”还可称为“前导序列”或“前序列(pro-sequence)”。
如本文所使用，“未成熟”或“全长(FL)”形式的淀粉酶包含信号肽。未成熟形式可以包含其他翻译后修饰。
如本文所使用，“成熟”形式的胞外蛋白质(如淀粉酶)缺乏信号序列。信号序列可以在分泌过程中切除。备选地，多肽可以例如作为胞内蛋白质以其成熟形式表达，或以其成熟形式合成。
如本文所使用，“截短”形式的AmyE(即“AmyE-tr”)指具有全部或部分C端淀粉结合结构域缺失的AmyE多肽。在SEQ ID NO：2的AmyE-tr中，例如，在残基D425处截短SEQ ID NO：1的AmyE。可在Protein Databank检索号1BAG下获得此AmyE-tr的
Figure BDA0000045914770000391
分辨率晶体结构，其公开于Fujimoto等，“Crystal structure of a catalytic-site mutantalpha-amylase from B.subtilis complexed with maltopentaose，”J.Mol.Biol.277：393-407(1998)中。可以在其他位置，例如SEQ ID NO：1的AmyE的Y423、P424、D426或I427处截短AmyE-tr，只要去除全部或部分C端淀粉结合结构域。
当用于提到主题细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组体”指已通过异源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变修饰该主题，或指该细胞衍生自经这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达不见于该细胞的天然(非重组体)形式内的基因或表达否则将异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。
术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指从至少一种其天然与之结合和见于自然界中的成分移出的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。本文所用的术语“纯化的”指处于相对纯的状态的，例如至少约90％纯的，至少约95％纯的，至少约98％纯的，或甚至至少约99％纯的物质(例如分离的多肽或多核苷酸)。
术语“热稳定的”和“热稳定性”指酶暴露于升高的温度后保持活性的能力。通过其以分钟、小时或天给出的半衰期(t1/2)测量酶，如α-淀粉酶的热稳定性，在限定的条件下，酶活性在半衰期内丧失一半。可以通过在暴露于(即通过其攻击)升高的温度后测量残留的α-淀粉酶活性来计算半衰期。
“pH范围”指酶显示催化活性的pH值的范围。
本文所用的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”指酶在大范围的pH值保持活性预定的时期(例如15分钟、30分钟、1小时等)的能力。
本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义词，可互换使用。这种氨基酸序列显示活性时，可将它们称为“酶”。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母密码。
术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体和合成分子。核酸可以是单链的或双链的，且可以是化学修饰的。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码是简并的，所以可用一个以上密码子编码特定的氨基酸，本组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，分别以5′至3′的方向从左至右书写核酸；以氨基至羧基的方向从左至右书写氨基酸序列。
术语“同源物”指与参考氨基酸或核苷酸序列具有某种程度的同一性，或具有另一指定的共同结构或功能特征的氨基酸或核苷酸序列。同源序列用来包含这样的氨基酸序列，使用常规序列比对工具(例如Clustal、BLAST等)，其与主题序列具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性。通常，除非另作指定，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点残基。
如本文所使用，“杂交”指一条核酸链通过其与互补链形成碱基配对的方法，如印迹杂交技术和PCR技术过程中所发生。
如本文所使用，核酸中的“简并序列”包含这样的序列，其中多个核苷酸序列编码相同的密码子，即由遗传密码的简并性引起。例如由于密码子优选，可以针对所编码的多肽在特定宿主生物中的最佳表达来选择简并序列。
如本文所使用，通过体外化学或酶促合成产生而非通过生物产生“合成”分子。
如本文所使用，用来谈论细胞时，术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”指该细胞具有整合入其基因组或作为保持多代的附加型质粒携带的非天然(例如异源的)核酸序列。
在将核酸序列插入细胞的背景中，术语“引入”指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。
“宿主菌株”或“宿主细胞”是已将包含编码目的多肽(例如变体α-淀粉酶)的多核苷酸的表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体引入其中的生物。示例性宿主菌株是细菌细胞。术语“宿主细胞”包含从细胞，如芽孢杆菌属物种的细胞产生的原生质体。
提到多核苷酸或蛋白质时，术语“异源的”指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
提到多核苷酸或蛋白质时，术语“内源的”指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
如本文所使用，术语“表达”指通过其来根据基因的核酸序列产生多肽的方法。该方法包括转录和翻译二者。
“选择性标记”或“选择标记”指能够在宿主中表达以便于选择携带该基因的宿主细胞的基因。选择标记的实例包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或新霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势，如营养优势的基因。
“培养”指在适宜的条件下在液体或固体培养基中培养微生物细胞群体。培养包括发酵性生物转化含有颗粒淀粉的淀粉底物为终产物(通常在容器或反应器中)。
“发酵”是通过微生物酶促降解有机物来产生更简单的有机化合物。虽然发酵通常发生于厌氧条件下，但此术语并非旨在仅限于严格的厌氧条件，因为在氧气存在下也发生发酵。
“基因”指涉及产生多肽的DNA片段，并包含编码区、编码区之前和之后的区域和单个编码片段(外显子)间的间插序列(内含子)。
“载体”指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包含克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。
“表达载体”指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，该DNA序列与能够影响该DNA在适宜的宿主中表达的适宜的控制序列有效连接。此类控制序列可以包含影响转录的启动子、控制转录的可选的操纵基因序列、编码mRNA上适宜的核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译终止的序列。
“启动子”是涉及结合RNA聚合酶以起始基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。示例性启动子是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyL)启动子。
术语“有效连接”指指定的成分处于允许它们以预期的方式发挥功能的关系(包括但不限于毗连)中。例如，与编码序列有效连接的调控序列将如此连接，使得该编码序列的表达处于该调控序列的控制下。
术语“处于转录控制下”指多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录依赖于其与促成转录起始或促进转录的元件有效连接。
术语“处于翻译控制下”指多核苷酸序列(通常是RNA序列)翻译为多肽依赖于其与促成翻译起始或促进翻译的元件有效连接。
如本文所使用，“生物活性的”指具有指定的生物活性，如酶活性的序列。在本淀粉酶的情况下，该活性是α-淀粉酶活性。
“水硬度”是存在于水中的矿物质(例如钙和镁)的量度。
“糊化(作用)”指淀粉分子通过烹饪的增溶作用形成粘性悬液。
如本文所使用，名词或动词形式的术语“液化”指通过其将淀粉转化为较低分子量(例如较短)的糊精的过程，糊精一般比起始淀粉材料更可溶且粘度更低。此过程涉及在淀粉糊化的同时或之后加入AmyE或其变体。
如本文所使用，术语“初次液化(primary liquefaction)”指浆液温度升至或接近其糊化温度时的液化步骤。继温度升高之后，使浆液传送通过热交换器或喷射蒸煮器达到温度约90-150℃，例如100-110℃(200-300°F，例如220-235°F)。继应用于热交换器或喷射器温度之后，使浆液在该温度保持为期3-10分钟。这种保持浆液处于90-150℃(200-300°F)的步骤为初次液化。
如本文所使用，术语“二次液化”是指继初次液化(加热至90-150℃(200-300°F))之后，当浆液被允许冷却至室温时的液化步骤。此冷却步骤可以是30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。
如本文所使用，术语“二次液化的分钟数”指从开始二次液化到测量DE时所过去的时间。
“糖化”通常指酶促转化液化后形成的麦芽葡聚糖为葡萄糖。
术语“聚合度(DP)”指给定的糖中脱水吡喃葡萄糖单位的数目(n)。DP1的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖类，如麦芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合物具有大于3的聚合度。
就淀粉转化而言，术语“终产物”或“希望的终产物”指通过酶转化自淀粉底物的指定碳源衍生的分子。
如本文所使用，术语“干固体含量(ds)”指以％干重表示的浆液中的总固体。
术语“浆液”指含有不可溶固体的水性混合物。
术语“残留淀粉”指发酵或酶水解含有底物的淀粉后组合物中剩余的淀粉(可溶的或不可溶的)。
如本文所使用，“回收步骤”指醪液成分的回收，其可含有残留淀粉、酶和/或发酵含淀粉底物的微生物。
术语“醪液”指含有可发酵碳源(例如糖类)的水性混合物，其可以用来产生发酵产物，如乙醇。术语“啤酒”和“醪液”可互换使用。
术语“釜馏物”指未发酵的固体和水的混合物，其表示从发酵醪液去除醇后的残留物。
术语“干酒糟(DDG)”和“具有可溶物的干酒糟(DDGS)”指谷粒发酵的有用副产物。
如本文所使用，“产乙醇微生物”指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。产乙醇微生物由于它们表达单独或一起将糖转化为乙醇的一种或多种酶的能力而是产乙醇的。
如本文所使用，术语“乙醇产生者”或“产乙醇微生物”指能够从己糖或戊糖产生乙醇的任意生物或细胞。通常，产乙醇细胞包含醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物的实例包含真菌微生物，如酵母。优选的酵母包含酵母属(Saccharomyces)菌株，尤其是酿酒酵母(S.cerevisiae)。
就淀粉酶和它们的底物而言，术语“接触”指将酶置于足够接近底物，以使酶能够将底物转化为终产物。接触可包括混合。
取决于背景，术语“衍生自”指“源自”、“基于”、“获自”、“可获自”或“分离自”。
术语“酶促转化”通常指通过酶作用(例如淀粉酶)修饰底物(例如淀粉)。
如本文所使用，术语“分解”指与生物膜中的单个微生物细胞连接和结合在一起的生物膜基质中的多糖的水解，从而可从生物膜释放和去除微生物细胞。
“样片(swatch)”是可以在其上应用污渍用于评估组合物清洁效率的一片材料，如织物。
如本文所使用，术语“比活”指在特定条件下每单位时间通过酶制剂转化为产物的底物摩尔数。比活表示为单位(U)/mg蛋白质。
如本文所使用，术语“生物活性的”指显示预先选定的生物学功能的分子。
术语“产量”指例如以浓度、体积、量或起始物质的百分比表示的通过一种过程产生的终产物的量。
“ATCC”指位于Manassas，Va.20108(ATCC)的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。
如本文所使用，用于纯化目的的“沉淀剂”指从溶液中有效沉淀多肽，如AmyE或其变体的化合物。沉淀物的形式可以是，例如，晶体、无定形物或其混合物。
“NRRL”指Agricultural Research Service Culture Collection，National Center for Agricultural Utilization Research(之前称为USDANorthern Regional Research Laboratory)，Peoria，IL。
如本文所使用，“样片”是可以在其上应用污渍或已在其上应用污渍的一片材料，如织物。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。备选的，该材料还可以是纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬材料，例如陶瓷、金属或玻璃。示例性污渍包含血液、乳、墨水、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、色素、油或其组合。
如本文所使用，“小样片”是用单孔穿孔装置，或定制的96孔穿孔装置或等同物(该多孔穿孔模式与标准96孔微量滴定板匹配)从样片上切下，或者以其他方式从样片上取下的一片样片。样片可以是纺织品、纸、金属或其他适宜的材料。小样片可以在放入24孔、48孔或96孔微量滴定板孔之前或之后被污渍固着。
如本文所使用，术语“食品”既包含准备好的食品，又包含食品配料(ingredient)，如面粉，其能够向消费者的食品制备者提供益处。食品配料包含可以为了例如酸化或乳化的目的而加入食品或食料的制剂。食品配料可以是溶液或固体形式，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
如本文所使用，术语“谷粉”指研磨或磨碎的粮谷(cereal grain)或已磨碎或捣碎的西米或块茎产品。在一些实施方案中，谷粉还可以含有除研磨或捣碎的谷类或植物材料之外的成分，如发酵剂(leavening agent)。粮谷包括小麦、燕麦、黑麦和大麦。块茎产品包括木薯淀粉(tapioca flour)、木薯粉(cassava flour)和蛋糊粉(custard powder)。谷粉还包括磨碎的玉米粉、玉米面、米粉(rice flour)、粗谷粉、自发粉(self-rising flour)、木薯淀粉、木薯粉、米粉(ground rice)、强化面粉和蛋糊粉。
如本文所使用，术语“原材料(stock)”指粉碎或破碎的谷粒和植物成分。例如，啤酒生产中所用的大麦是已被粗磨或粉碎的谷类，以便提供适于产生发酵醪的粘稠度。原材料包括任意前述类型的粉碎或粗磨形式的植物和谷粒。
如本文所使用，术语“性能指数(PI)”指变体多肽与亲本多肽针对指定的性能特征的性能比。在此背景中，“向上突变(up mutation)”指PI＞1的突变；“中性突变”指PI＞0.5的突变；“无害突变”指PI＞0.05的突变；和“有害突变”指PI≤0.05的突变。
如本文所使用，术语“添加的(或其他)葡糖淀粉酶(或葡糖淀粉酶多肽)”或“具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽”指与AmyE不是同一多肽的葡糖淀粉酶。
除非上下文另有明确指明，否则单数形式“此”、“一个”和“该”包括复数形式。因此，例如，提到“一种酶”包括多种此类酶，而提到“该制剂”包括一种或多种制剂以及本领域技术人员已知的其等同制剂等。
数值范围包含定义该范围的数字。标题是描述性的而不是旨在作为限制。本文引用的所有参考文献引入作为参考。
1.2.缩写词
除非另有说明，使用下列缩写词：
AE      醇乙氧基化物
AEO     醇乙氧基化物
AEOS    醇乙氧基硫酸盐
AES     醇乙氧基硫酸盐
AGU     葡糖淀粉酶活性单位
AkAA    白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶
AmyE    枯草芽孢杆菌α-淀粉酶
AmyS    嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶
AS      醇硫酸盐
BAA     细菌α-淀粉酶
cDNA    互补DNA
CMC     羧甲基纤维素
DE      葡萄糖当量
DI      蒸馏的，去离子的
DNA     脱氧核糖核酸
DP3     具有3个亚单位的聚合度
DPn     具有n个亚单位的聚合度
DS或ds  干固体
DTMPA   二乙基三胺五乙酸
EC      酶学委员会
EDTA    乙二胺四乙酸
EDTMPA  乙二胺四亚甲基磷酸
EO      环氧乙烷
F&HC    织物和家居护理
GAU     葡糖淀粉酶单位
HFCS    高果糖玉米糖浆
HFSS    高果糖淀粉基糖浆
IPTG    异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
LA     Luria琼脂
LB     Luria培养基
LU     脂肪酶单位
L1T    用苏氨酸(T)残基取代位置1上的亮氨酸(L)残基，其中通过本领域公知的单字母缩写指定氨基酸
MW      分子量
NCBI    美国国家生物技术信息中心
nm      纳米
NOBS    壬酰基氧基苯磺酸盐
NTA     次氮基三乙酸
OD      光密度
PCR     聚合酶链式反应
PEG     聚乙二醇
pI      等电点
ppm     百万分之几
PVA     聚乙烯醇
PVP     聚乙烯基吡咯烷酮
RAU     参考淀粉酶单位
RNA     核糖核酸
SAS     仲烷基磺酸盐
1X SSC  0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0
SSF     同时糖化和发酵
SSU     可溶淀粉单位，等于每分钟释放1mg葡萄糖的还原力
TAED    四酰乙二胺
TNBS    三硝基苯磺酸
TrGA    里氏木霉葡糖淀粉酶
w/v     重量/体积
w/w     重量/重量
wt      野生型
μL     微升
μNm    微牛顿×米
2.AmyE多肽
2.1.亲本AmyE多肽
AmyEα-淀粉酶指SEQ ID NO：1所示例的来自枯草芽孢杆菌的天然存在的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。相关多肽具有不同于天然存在的AmyE序列的氨基酸序列，例如，以默认匹配参数用BLAST序列比对算法测量时，与SEQ ID NO：1具有至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或甚至至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
另一示例性AmyE多肽是具有SEQ ID NO：3(Amy31A)的氨基酸序列的Amy31A。Amy31A描述于Ohdan等，“Characteristics of two forms ofalpha-amylases and structural implication，”Appl.Environ.Microbiol.65(10)：4652-58(1999)和UniProtKB/TrEMBL检索号O82953(SEQ ID NO：3)中。使用BLAST算法，Amy31A与SEQ ID NO：1的AmyE具有约86％序列同一性。其他AmyE多肽包括但不限于具有描述于NCBI检索号ABW75769、ABK54355、AAF14358、AAT01440、AAZ30064、NP_388186、AAQ83841和BAA31528中的氨基酸序列的AmyE，这些检索号的内容在此引用作为参考。
SEQ ID NO：1中所示的代表性AmyE氨基酸序列是缺乏天然信号序列的成熟形式的序列。AmyE的成熟形式在其他地方称为“AmyE全长”。通常，AmyE的成熟形式作为酶是最有利的，虽然可以希望表达未成熟形式(具有信号序列)来影响从宿主细胞分泌。此AmyE的天然信号序列长度为41个氨基酸残基并显示为SEQ ID NO：9。SEQ ID NO：3的N端45个氨基酸残基是Amy31A的信号序列。AmyE(SEQ ID NO：1)和Amy31A(不含信号序列)间的序列比对显示于图1中。
如具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的截短AmyE多肽(AmyE-tr)所示例，AmyE多肽可以具有C端淀粉结合结构域的缺失。从残基D425(参考SEQ ID NO：1)截短此多肽。可在Protein Databank检索号1BAG下获得AmyE-tr的
Figure BDA0000045914770000501
分辨率晶体结构，其公开于Fujimoto等(1998)“Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from B.subtiliseomplexed with maltopentaose，”J.Mol.Biol.277：393-407中。可在其他位置，例如SEQ ID NO：1的AmyE的Y423、P424、D426或I427处截短AmyE-tr，只要除去全部或部分C端淀粉结合结构域。可对Amy31A和其他AmyE多肽产生类似的截短。
2.2.AmyE变体
与SEQ ID NO：1的天然存在的AmyE相比，或与SEQ ID NO：2(截短多肽)相比，AmyE变体包含至少一个氨基酸修饰。因此，可将SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的AmyE多肽称为衍生AmyE变体的“亲本多肽”、“亲本酶”或“亲本序列”。未修饰的氨基酸残基(即其余毗邻氨基酸序列)可以与SEQ ID NO：1或2的残基相同，或与SEQ ID NO：3的残基相同，或与NCBI检索号ABW75769、ABK54355、AAF14358、AAT01440、AAZ30064、NP_388186、AAQ83841和BAA31528的残基相同。备选地，如以默认比对参数用蛋白质序列BLAST比对所测量，其余氨基酸序列可以与这些序列中的一条或多条具有指定程度的序列同一性。例如，其余序列可以与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的AmyE具有至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或甚至至少约99％序列同一性。
与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，AmyE变体可以具有单个氨基酸修饰或可以具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸修饰。修饰包括取代、插入、缺失或其组合。在一些情况下，对非生物学功能所需的氨基酸进行修饰。可以通过AmyE序列间的同源性来指导待修饰的氨基酸残基的选择。通常，在AmyE序列中很保守的氨基酸为生物活性所需的可能性较大。相反，在AmyE序列间不同的氨基酸位置为生物活性所需的可能性较小。例如，可能可在AmyE变体中修饰在AmyE和Amy31A间的比对中不同的氨基酸残基(在图1中以黑体显示)而不丧失生物活性。
与天然存在的AmyE相比，优选的AmyE变体具有至少部分1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶活性，且与天然存在的AmyE相比，其具有至少一种改变的特性。改变的特性可以是就对淀粉、麦芽七糖和/或麦芽三糖底物的比活、底物特异性、热稳定性、最适温度、最适pH、pH和/或温度范围、氧化稳定性、降低淀粉组合物粘度的能力等而言的。在一些情况下，AmyE变体的改变的特性涉及在特定pH(例如4或5.8)下对特定玉米粉、麦芽三糖、麦芽七糖底物的比活；在特定温度(例如60℃)下的热稳定性；或在特定pH(例如8或pH 10)下的清洁性能。改变的特性可以表征为性能指数(PI)，其中PI是AmyE变体与野生型AmyE的性能比。在一些实施方案中，PI大于约0.5，而在其他实施方案中，PI是约1或大于1。
可以取代来赋予所产生的AmyE变体有益特性的具体残基包括以下的一个或多个：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，442，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，668，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，994，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，11115，116，117，118，119，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424和425。在任意这些位置上的修饰产生变体多肽，其就蛋白质表达而言具有大于0.5的性能指数(PI)，就至少一种改善酶性能的特征而言具有大于1的PI。
可以取代来赋予所产生的AmyE变体有益特性的残基亚组包含以下一个或多个：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，39，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，63，64，65，66，67，68，69，72，73，74，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，98，99，100，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，118，119，121，124，125，126，128，129，130，131，132，134，135，136，140，141，142，143，144，147，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，170，171，172，175，179，180，181，184，186，187，188，189，190，192，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，207，209，211，212，213，214，217，218，219，221，222，223，224，225，226，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，267，268，270，271，272，273，274，275，276，277，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，324，325，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424和425。在任意这些位置上的修饰产生变体多肽，其就蛋白质表达而言具有大于0.5的性能指数(PI)，就至少一种改善酶性能的特征而言具有大于1.1的PI。
在一些情况下，一个或多个位置选自：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，98，99，100，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，121，122，124，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424和425，该位置在全长或截短亲本多肽中对性能而言是非完全限制性位置。
将一些位置测定为在截短AmyE亲本多肽的背景中对性能而言是非完全限制性位置(即1，2，3，4，5，8，18，20，23，24，25，27，28，30，35，44，45，47，49，50，51，52，54，56，59，68，73，76，78，85，88，89，90，91，106，107，108，109，112，115，116，118，119，124，125，126，127，131，132，134，142，143，152，153，156，160，163，166，167，184，185，187，188，190，192，195，199，200，201，202，203，212，213，214，218，219，221，222，223，233，234，238，240，241，243，245，247，248，250，251，252，253，254，255，257，259，260，274，275，276，277，282，283，284，287，307，308，309，310，311，312，313，314，317，318，319，320，321，323，324，325，327，328，331，333，344，346，347，349，357，358，359，367，368，369，378，380，382，385，386，388，390，393，395，400，401，402和406)，而将一些位置测定为在全长AmyE亲本多肽的背景中对性能而言是非完全限制性位置(即6，7，9，10，11，12，13，14，15，16，17，19，21，22，26，27，29，30，31，32，33，34，36，37，38，39，40，41，42，43，45，46，48，52，53，55，57，58，60，61，62，63，64，65，66，67，69，70，71，72，74，77，79，80，81，82，83，84，86，87，88，89，92，93，94，95，96，98，99，100，103，104，105，110，111，113，114，117，121，122，126，128，129，130，131，135，136，138，139，140，141，144，145，146，147，148，149，150，151，154，155，157，158，159，161，162，164，165，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，183，184，186，189，191，193，194，196，197，198，204，205，206，207，208，209，210，211，215，216，217，220，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，235，236，237，238，239，241，242，244，246，249，256，258，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273，278，279，280，281，285，286，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，312，315，316，322，326，329，330，332，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，348，350，351，352，353，354，355，356，360，361，362，363，364，365，366，370，371，372，373，374，375，376，377，379，380，381，383，384，387，389，391，392，394，396，397，398，399，402，403，404，405，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425).
在一些情况下，修饰是将存在于亲本多肽中的一个或多个氨基残基取代为不同的氨基酸残基，例如：1A，1C，1D，1E，1F，1G，1H，1K，1M，1N，1Q，1R，1S，1T，1V，1W，1Y，2A，2C，2D，2E，2F，2G，2H，2I，2K，2L，2M，2N，2P，2Q，2R，2S，2V，2W，2Y，3C，3D，3E，3F，3G，3H，3I，3K，3L，3M，3N，3P，3Q，3R，3S，3V，3W，3Y，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4K，4L，4M，4N，4Q，4S，4T，4V，4W，4Y，5A，5C，5D，5E，5F，5G，5H，5I，5K，5L，5N，5R，5V，5W，5Y，6C，6D，6E，6H，6K，6L，6M，6N，6P，6Q，6R，6S，6T，6V，6W，7A，7C，7D，7E，7F，7G，7H，7I，7L，7M，7N，7P，7Q，7R，7S，7T，7W，7Y，8A，8C，8E，8F，8G，8H，8I，8K，8L，8M，8N，8P，8Q，8R，8T，8V，8W，8Y，9A，9C，9D，9E，9F，9H，9I，9K，9M，9N，9P，9R，9S，9T，9V，9W，9Y，10A，10I，10L，10M，10N，10P，10Q，10S，10V，11A，11F，11G，11H，11M，11S，11V，11W，11Y，12I，12M，12V，13A，13C，13D，13E，13F，13G，13I，13L，13M，13Q，13T，13V，13W，13Y，14C，14F，14G，14M，14N，14S，14T，14V，15A，15F，16A，16D，16E，16F，16G，16H，16I，16L，16M，16Q，16S，16T，16V，17A，17F，17I，17M，17Q，17Y，18A，18C，18D，18E，18G，18H，18M，18N，18Q，18R，18T，19A，19C，19H，19L，19M，19N，19S，19W，19Y，20A，20C，20D，20F，20G，20H，20I，20K，20L，20M，20P，20Q，20R，20S，20T，20V，20W，20Y，21A，21C，21D，21E，21H，21I，21K，21L，21M，21N，21Q，21R，21S，21V，22I，22M，22Q，22S，22T，22V，23A，23C，23D，23E，23F，23G，23H，23I，23L，23M，23N，23R，23S，23T，23V，23W，23Y，24A，24C，24D，24F，24G，24L，24N，24P，24Q，24R，24S，24T，24V，24Y，25A，25C，25D，25E，25F，25G，25H，25I，25K，25L，25R，25S，25T，25V，25W，25Y，26A，26F，26I，26L，26V，27A，27C，27D，27E，27F，27G，27H，27I，27L，27M，27N，27P，27Q，27R，27S，27T，27V，27W，27Y，28A，28C，28F，28G，28H，28I，28K，28L，28M，28N，28P，28Q，28R，28S，28T，28V，28W，28Y，29A，29C，29F，29L，29M，29T，29V，30A，30C，30D，30E，30F，30G，30I，30K，30L，30M，30N，30P，30Q，30R，30S，30T，30V，30W，30Y，31A，31C，31E，31F，31G，31H，31I，31K，31L，31M，31N，31Q，31S，31T，31V，31W，31Y，32D，32F，32G，32H，32K，32L，32M，32Q，32S，32T，32V，32Y，33A，33C，33D，33E，33F，33H，33I，33K，33L，33M，33P，33Q，33S，33T，33W，33Y，34A，34F，34I，34P，34W，35A，35C，35F，35G，35H，35I，35L，35M，35N，35P，35Q，35R，35S，35V，35W，35Y，36C，36D，36E，36F，36H，36I，36K，36L，36M，36N，36Q，36R，36S，36T，36Y，37L，37M，37N，37V，38A，38C，38D，38E，38H，38L，38M，38N，38P，38V，39A，39C，39I，39L，39M，39N，39P，39S，39V，40A，40D，40M，40N，40P，40Q，40T，40V，40W，41A，41C，41E，41G，41N，41S，41V，42A，42L，42M，42P，42V，43A，43G，43H，43L，43M，43Q，43S，43T，43V，44A，44C，44D，44E，44F，44G，44H，44I，44K，44L，44M，44N，44P，44R，44S，44T，44V，44W，44Y，45A，45C，45F，45G，45H，45I，45L，45M，45N，45P，45Q，45S，45T，45Y，46A，46C，46D，46E，46F，46H，46I，46L，46M，46N，46Q，46R，46S，46T，46V，46W，46Y，47A，47C，47D，47F，47G，47H，47I，47K，47L，47N，47P，47R，47S，47T，47V，47Y，48A，48C，48D，48E，48F，48H，48I，48K，48L，48N，48P，48S，48T，48V，48W，49A，49C，49D，49F，49G，49H，49I，49K，49L，49P，49Q，49R，49S，49T，49V，49W，49Y，50A，50C，50E，50F，50G，50H，50I，50K，50L，50M，50N，50P，50R，50S，50T，50V，50W，50Y，51A，51C，51D，51E，51F，51H，51I，51K，51L，51M，51N，51P，51Q，51R，51S，51T，51V，51W，52A，52C，52E，52F，52G，52H，52I，52K，52L，52M，52N，52P，52Q，52R，52S，52T，52V，52W，52Y，53A，53C，53E，53F，53G，53H，53I，53L，53N，53P，53R，53S，53T，53V，53W，53Y，54A，54C，54D，54F，54G，54H，54I，54L，54M，54N，54P，54Q，54R，54T，54V，54W，54Y，55A，55C，55D，55E，55F，55G，55H，55I，55N，55P，55Q，55S，55T，55Y，56A，56D，56E，56F，56G，56I，56K，56L，56M，56N，56P，56Q，56R，56T，56V，56W，56Y，57A，57C，57D，57E，57F，57H，57I，57K，57L，57M，57Q，57R，57S，57T，57V，57W，57Y，58A，58F，58H，59A，59C，59D，59E，59F，59G，59H，59K，59L，59N，59P，59R，59S，59T，59V，59W，60A，60C，60D，60E，60G，60I，60K，60L，60M，60N，60Q，60R，60T，60V，61C，61D，61E，61F，61M，61S，61T，61V，62A，62C，62D，62F，62G，62H，62I，62K，62L，62Q，62S，62T，62V，63A，63C，63D，63F，63G，63H，63K，63M，63N，63R，63S，64A，64G，64H，64I，64L，64M，64N，64S，64V，64Y，65A，65C，65E，65H，65I，65K，65L，65M，65Q，65R，65S，66D，66E，66F，66G，66H，66I，66K，66L，66M，66N，66Q，66R，66T，66V，66W，66Y，67A，67C，67D，67E，67F，67G，67I，67K，67L，67N，67P，67Q，67S，67T，67W，68A，68C，68D，68E，68F，68G，68H，68I，68L，68M，68N，68P，68R，68S，68T，68V，68W，68Y，69A，69C，69M，69P，69T，69V，70A，70E，70H，70N，70S，71S，72C，72D，72E，72F，72G，72H，72I，72K，72L，72P，72Q，72S，72T，72V，72W，72Y，73A，73C，73E，73F，73H，73I，73K，73L，73M，73P，73S，73T，73V，73W，74A，74E，74F，74M，74S，74T，74Y，75A，75C，75D，75E，75P，76A，76D，76E，76F，76G，76I，76L，76M，76P，76Q，76R，76S，76V，76Y，77A，77C，77D，77G，77H，77I，77K，77L，77R，77S，77T，77V，77W，77Y，78A，78C，78D，78E，78F，78G，78H，78I，78K，78L，78M，78N，78P，78R，78S，78T，78V，78W，78Y，79A，79G，79L，79M，79N，79Q，79S，79T，80A，80L，80M，80W，80Y，81A，81C，81D，81E，81G，81H，81I，81L，81M，81N，81Q，81R，81S，81T，81V，81W，81Y，82A，82D，82F，82G，82I，82K，82L，82M，82Q，82R，82S，82T，82V，82W，82Y，83A，83F，83I，83L，83T，83V，84A，84D，84E，84G，84I，84K，84M，84N，84Q，84S，84T，84V，85D，85E，85F，85G，85I，85K，85L，85M，85N，85R，85S，85T，85V，85W，86C，86D，86E，86F，86G，86I，86K，86L，86M，86N，86Q，86R，86S，86V，86W，86Y，87F，87G，87T，88A，88C，88D，88F，88G，88H，88I，88K，88L，88M，88N，88Q，88R，88S，88T，88V，88W，88Y，89A，89C，89D，89F，89G，89H，89I，89K，89L，89M，89N，89P，89Q，89R，89S，89T，89V，89W，89Y，90C，90D，90E，90F，90G，90H，90I，90K，90L，90M，90N，90Q，90R，90S，90T，90V，90W，91A，91C，91D，91E，91F，91H，91K，91L，91M，91N，91P，91Q，91R，91S，91T，91W，91Y，92L，92N，92T，92V，93A，93C，93D，93E，93F，93G，93I，93L，93M，93N，93P，93Q，93R，93S，93T，93V，93W，93Y，94A，94C，94I，94M，94T，95A，95F，95L，95M，95V，95Y，96A，96C，96I，96L，96M，96P，96T，97A，97E，97M，97W，98C，98G，98I，98L，98M，98T，98V，99A，99C，99E，99F，99G，99I，99L，99M，99N，99P，99S，99T，100A，100C，100F，100M，100N，100P，100T，100V，100Y，101A，102A，102G，102Q，102S，102W，102Y，103A，103C，103I，103M，103N，103S，103V，104A，104C，104S，105C，105D，105E，105F，105G，105H，105K，105L，105M，105Q，105R，105T，105V，105W，105Y，106A，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在一些情况下，修饰是将存在于亲本多肽中的一个或多个氨基残基取代为不同的氨基酸残基，如以下所示例：1A，1D，1F，1G，1H，1K，1M，1N，1Q，1R，1S，1T，1V，1W，1Y，2A，2E，2F，2G，2H，2I，2P，2Q，2R，2S，2W，3D，3E，3F，3G，3H，3I，3K，3L，3M，3N，3P，3Q，3R，3S，3V，3W，3Y，4D，4E，4F，4G，4I，4K，4L，4Q，4S，4T，4V，4W，5A，5D，5E，5F，5G，5K，5L，5V，5W，6D，6H，6K，6L，6P，6Q，6S，6V，6W，7A，7D，7E，7H，7N，7Q，7R，7S，8A，8C，8E，8F，8G，8H，8I，8K，8L，8N，8P，8Q，8R，8T，8V，8W，8Y，9A，9D，9E，9F，9H，9I，9K，9M，9N，9P，9R，9V，9W，9Y，10I，10L，10M，10P，10S，10V，11A，11F，11M，11V，12I，12M，13A，13D，13Q，14G，14S，14T，14V，15F，16M，16Q，18G，18N，18R，19H，19W，20A，20D，20F，20G，20H，20I，20K，20M，20R，20S，20V，20W，20Y，21E，21I，21M，21Q，21S，21V，22I，22T，22V，23A，23D，23E，23F，23G，23H，23I，23L，23M，23N，23R，23S，23T，23V，23W，23Y，24A，24C，24F，24G，24R，24S，24T，24V，24Y，25E，25F，25K，25L，25R，25S，25T，25V，25W，25Y，26I，26L，27A，27E，27F，27G，27H，27I，27L，27P，27Q，27R，27S，27T，27V，27W，27Y，28A，28C，28G，28H，28I，28K，28L，28M，28N，28P，28Q，28R，28S，28V，28W，28Y，29F，29L，29V，30A，30C，30D，30E，30F，30G，30L，30M，30N，30Q，30R，30S，30T，30V，30W，30Y，31A，31F，31G，31H，31I，31K，31L，31M，31N，31Q，31S，31T，31V，31Y，32G，32S，33A，33D，33E，33H，33Q，33S，34W，35A，35F，35G，35H，35I，35L，35M，35N，35Q，35R，35S，35V，35W，36F，36H，36I，36L，36S，36T，36Y，37L，37V，39A，39P，39S，39V，42V，43A，43S，43T，43V，44A，44D，44E，44F，44G，44H，44I，44K，44N，44R，44S，44T，44Y，45F，45H，45I，45L，45M，45S，45T，46A，46D，46F，46H，46L，46M，46N，46R，47A，47D，47F，47G，47H，47I，47K，47L，47N，47P，47R，47S，47T，47V，47Y，48A，48E，48F，48H，48N，48P，48W，49A，49F，49G，49H，49K，49L，49Q，49R，49S，49T，49V，49W，49Y，50E，50F，50H，50I，50K，50L，50M，50P，50R，50S，50T，50V，50W，50Y，51D，51E，51F，51H，51I，51K，51L，51P，51Q，51R，51S，51T，51V，51W，52E，52F，52G，52H，52I，52K，52L，52M，52N，52Q，52R，52S，52T，52V，52W，52Y，53A，53E，53F，53H，53I，53L，53P，53R，53S，53T，53V，54A，54C，54F，54G，54H，54L，54N，54P，54R，54T，54W，54Y，55A，55F，55H，55N，55P，55Q，55S，55T，55Y，56D，56E，56F，56G，56I，56K，56L，56P，56Q，56R，56T，56V，56W，56Y，57A，57E，57H，57M，57Q，57R，57S，57Y，58F，59A，59C，59F，59H，59N，59P，59R，59S，59T，59W，60L，60N，63H，63N，64A，64S，65A，65I，65R，66D，66E，66G，66M，66N，66Q，66R，67A，67F，67G，67I，67L，67N，67Q，67T，67W，68D，68F，68H，68I，68L，68N，68R，68S，68T，68V，68W，69M，69V，72E，72F，72G，72H，72I，72K，72Q，72S，72T，72V，72W，72Y，73F，73M，73W，74M，74T，76A，76L，76M，76P，76Q，76R，76Y，77A，77D，77K，77L，77R，77Y，78D，78E，78F，78G，78H，78I，78K，78L，78P，78R，78S，78T，78W，78Y，79A，79M，79Q，79S，80M，81E，81G，81H，81L，81M，81N，81Q，81R，81S，81T，81V，81Y，82D，82F，82G，82I，82K，82L，82M，82Q，82R，82S，82T，82Y，83A，83F，83L，84A，84N，84S，84T，85D，85E，85F，85G，85I，85K，85R，85S，85T，85V，85W，86D，86E，86F，86G，86I，86K，86L，86M，86N，86Q，86R，86S，86V，86W，86Y，87G，88A，88D，88F，88G，88H，88K，88L，88M，88N，88Q，88R，88S，88T，88W，88Y，89D，89F，89G，89H，89I，89K，89L，89M，89N，89P，89Q，89R，89S，89T，89V，89W，89Y，90D，90E，90F，90H，90I，90K，90M，90N，90R，90S，90T，90V，90W，91D，91E，91H，91K，91N，91Q，91R，91S，92L，92V，93A，93D，93G，93M，93N，93R，93S，93Y，94I，95F，95M，96I，98C，99I，100C，100F，100M，100V，103A，103C，103V，104A，104S，105C，105D，105E，105F，105G，105M，105W，105Y，106E，106H，106N，106Q，106S，106T，106Y，107A，107C，107E，107F，107G，107H，107I，107K，107L，107M，107N，107P，107Q，107R，107S，107T，107V，107W，108C，108D，108E，108F，108G，108H，108I，108K，108L，108N，108P，108R，108S，108T，108V，108W，108Y，109D，109H，109I，109K，109L，109N，109R，109S，109V，109W，109Y，110V，111C，111E，111F，111G，111H，111K，111L，111M，111N，111Q，111R，111T，112A，112D，112E，112H，112K，112L，112R，112S，112T，112W，112Y，113A，114L，115A，115H，115I，115L，115R，115V，115Y，116A，116F，116G，116H，116I，116L，116N，116Q，116R，116T，116V，116W，116Y，118D，118F，118G，118H，118K，118L，118M，118N，118Q，118R，118S，118T，118V，118W，118Y，119E，119F，119I，119K，119L，119M，119Q，119S，119T，119Y，121S，124A，124K，124Q，124R，124S，124T，125A，125D，125F，125I，125K，125Q，125R，125V，125Y，126A，126C，126D，126F，126G，126H，126I，126K，126L，126N，126P，126R，126S，126T，126V，126W，126Y，128A，128C，128E，128F，128G，128H，128I，128L，128M，128N，128Q，128R，128S，128T，128V，129C，129D，129E，130A，130F，130L，130T，130Y，131A，131C，131D，131F，131G，131H，131I，131K，131L，131N，131Q，131T，131V，131W，131Y，132I，132N，132S，132W，134E，134F，134L，134M，134R，134Y，135E，136L，140A，141F，141H，142C，142D，142F，142G，142H，142I，142K，142M，142Q，142R，142S，142T，142W，142Y，143C，143D，143K，143L，143N，143Q，143S，144T，147F，147L，150H，151C，151D，151E，151G，151H，151K，151L，151M，151Q，151S，151T，152A，152C，152E，152F，152G，152H，152I，152K，152L，152M，152N，152P，152Q，152R，152S，152V，152W，152Y，153E，153F，153H，153K，153L，153N，153R，153T，153V，153W，153Y，154A，155M，156A，156F，156G，156K，156L，156Q，156R，156V，156Y，157F，157H，158A，158I，158M，158T，158V，159H，159I，159L，159M，160A，160C，160D，160E，160F，160G，160H，160I，160K，160L，160M，160Q，160S，160T，160V，162I，162M，163A，163E，163F，163G，163H，163I，163K，163L，163N，163Q，163R，163S，163T，163V，163W，163Y，164G，164H，164L，164N，164S，164T，164V，164W，164Y，165C，165I，165L，165M，165T，165V，166C，166I，166M，166V，167A，167C，167E，167F，167G，167I，167K，167L，167M，167Q，167R，167S，167T，167V，167W，167Y，168C，168E，168F，168G，168K，168L，168M，168N，168S，168T，168V，168W，168Y，170C，171E，171H，171I，171M，171N，171Q，171R，172A，175Y，179A，179C，179G，179H，179S，179W，180M，181V，184D，186E，187E，187F，187H，187I，187K，187M，187Q，187S，187V，187W，188A，188D，188F，188G，188I，188K，188L，188M，188P，188Q，188R，188T，188V，189F，189W，190H，190K，190Q，190R，190S，192G，192K，192L，192P，192S，192V，195D，195F，195G，195H，195K，195M，195R，195V，195W，196A，196C，19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8H，348I，348K，348R，348S，348T，348V，348W，348Y，349A，349F，349G，349I，349K，349M，349N，349R，349S，349V，349W，349Y，350D，351A，351D，351G，351H，351K，351L，351M，351P，351Q，351R，351T，351V，351W，351Y，352A，352H，352Q，352T，352Y，353A，353D，353E，353G，353I，353K，353L，353M，353Q，353V，353W，353Y，355C，355F，355I，355L，355M，355V，355Y，356D，356F，356G，356I，356K，356L，356P，356Q，356T，356W，356Y，357A，357H，357I，357K，357L，357N，357Q，357R，357S，357T，357V，357W，357Y，358C，358D，358F，358G，358H，358I，358K，358L，358M，358Q，358R，358S，358T，358V，358Y，359D，359E，359H，359L，359M，359P，359Q，359R，359T，359V，359W，360F，360P，360T，361C，361L，361M，361N，361Q，361S，361T，361V，362A，362C，362I，362L，362V，362Y，363D，363G，363H，363Q，363R，363S，363V，363W，363Y，364A，364C，364G，364I，364L，364M，364Q，364S，364T，364V，365C，365I，365K，365L，365N，365R，365S，365V，366A，366K，367L，367M，367N，367R，367S，367T，367W，367Y，368G，368I，368K，368L，368R，368T，368V，368W，369C，369D，369E，369F，369G，369I，369K，369L，369N，369Q，369S，369T，369V，369Y，371A，371C，371F，371I，371L，371M，371N，371S，371T，371Y，372A，372C，372I，372L，372N，372S，372T，373A，373C，373F，373I，373M，373T，373V，374C，374G，374I，374M，374S，374T，374V，375A，375C，375D，375F，375H，375L，375M，375Q，375S，375T，375Y，376G，376I，376S，376T，376V，377F，377H，377L，377T，377W，377Y，378C，378E，378F，378G，378H，378I，378K，378L，378M，378N，378Q，378R，378T，378V，378W，378Y，379A，379G，379H，379I，379K，379L，379Q，379T，379Y，380C，380E，380F，380G，380H，380L，380M，380N，380P，380Q，380R，380T，380V，380W，380Y，381G，381I，381Q，381R，381S，381T，381W，381Y，382A，382C，382F，382I，382K，382Q，382R，382T，382W，382Y，383A，383F，383L，383P，383Q，383V，384A，384G，384H，384I，384K，384P，384Q，384V，384W，385C，385F，385H，385I，385K，385L，385N，385P，385Q，385R，385S，385V，385W，385Y，386D，386F，386G，386H，386L，386N，386R，386S，386T，386V，386W，386Y，387I，387L，388A，388C，388G，388H，388L，388P，388S，388T，388W，388Y，389C，389F，389I，389M，389Q，389V，390F，390I，390K，390L，390N，390R，390S，390T，390V，390W，390Y，391F，391K，391N，391P，391R，391T，391W，391Y，392A，392C，392D，392E，392F，392H，392K，392L，392N，392Q，392R，392S，392V，392Y，393A，393C，393D，393F，393G，393H，393I，393L，393Q，393S，393T，393V，393W，393Y，394A，394C，394F，394H，394I，394K，394L，394Q，394V，394W，395F，395G，395H，395K，395L，395Q，395R，395S，395T，395V，395W，395Y，396C，396D，396S，397C，397D，397F，397G，397H，397I，397L，397P，397S，397T，397V，397W，398C，398G，398N，398S，398T，398V，399C，399F，399I，399K，399L，399R，399S，399T，399V，399W，399Y，400C，400D，400E，400F，400G，400H，400I，400K，400L，400M，400Q，400R，400S，400T，400V，400W，400Y，401A，401C，401D，401E，401F，401I，401K，401L，401M，401N，401Q，401R，401S，401T，401V，401W，401Y，402A，402C，402D，402E，402F，402G，402H，402I，402K，402L，402M，402N，402P，402Q，402R，402T，402V，402W，402Y，403A，403C，403H，403I，403M，403V，403W，403Y，404F，404H，404M，404R，404T，404V，404W，404Y，405G，405Q，405S，405T，406L，406T，407F，407G，407H，407I，407K，407M，407Q，407R，407S，407T，407V，407W，407Y，408D，408E，408F，408N，408V，409C，409F，409I，409L，409R，409T，409V，409W，409Y，410V，411E，411F，411M，411Q，411R，411S，411Y，412N，412T，413C，413F，413G，413I，413L，413P，413R，413S，413V，413W，413Y，414H，414L，414N，414Q，414T，414V，414W，415D，415E，415G，415I，415R，415V，415W，416F，416L，416Q，416Y，417A，417C，417D，417F，417G，417H，417I，417K，417M，417N，417Q，418D，418F，418H，418I，418K，418N，418W，418Y，419E，419F，419H，419I，419L，419S，419T，420D，420E，420F，420G，420H，420I，420K，420L，420Q，420S，420T，420V，420W，420Y，421C，421L，421M，421S，421T，422F，422I，422S，422W，423D，423I，423Q，423R，423T，424M，424Q，424R，424V，424Y，425A，425I，425K，425L，425V和425Y。
在一些情况下，取代选自052D，052E，052I，052K，052L，052N，052Q，052R，052V，056D，056E，056I，056K，056L，056N，056Q，056R，056V，089D，089E，089I，089K，089L，089N，089Q，089R，089V，152D，152E，152I，152K，152L，152N，152Q，152R，152V，153D，153E，153I，153K，153L，153N，153Q，153R，153V，201D，201E，201I，201K，201L，201N，201Q，201R，201V，251D，251E，251I，251K，251L，251N，251Q，251R，251V，284D，284E，284I，284K，284L，284N，284Q，284R，284V，297D，297E，297I，297K，297L，297N，297Q，297R，297V，308D，308E，308I，308K，308L，308N，308Q，308R，308V，321D，321E，321I，321K，321L，321N，321Q，321R，321V，328D，328E，328I，328K，328L，328N，328Q，328R，328V，347D，347E，347I，347K，347L，347N，347Q，347R，347V，357D，357E，357I，357K，357L，357N，357Q，357R，357V，359D，359E，359I，359K，359L，359N，359Q，359R，359V，369D，369E，369I，369K，369L，369N，369Q，369R，369V，385D，385E，385I，385K，385L，385N，385Q，385R，385V，388D，388E，388I，388K，388L，388N，388Q，388R，388V，391D，391E，391I，391K，391L，391N，391Q，391R，391V，400D，400E，400I，400K，400L，400N，400Q，400R，400V，416D，416E，416I，416K，416L，416N，416Q，416R和416V，该突变就蛋白质和活性二者而言具有＞0.5的PI值。
将存在于亲本AmyE多肽位置153上的氨基酸残基改变为N、K或F的取代显示了提高的将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。将存在于亲本AmyE多肽位置153上的氨基酸残基改变为K的取代显示了提高的将DP7底物转化为葡萄糖的能力。
在全长AmyE多肽的背景中，取代L142F、L142G、L142Q、L142S、L142W、L142Y、A214I、A214V、S245Y、Q126F、Q126L、Q126P、Q126V、S131L和S254I改善了淀粉液化性能。在截短AmyE多肽的背景中，取代W60L、W60M、W60N、I100F、I100M、S105M、S105W、G207A、T270A、T270E、T270L、T270N、T270V和T279A改善了淀粉液化性能。
一个或多个以下位置的取代就蛋白质和活性二者而言具有＞0.5的PI值，且预期其可组合用于影响AmyE多肽的多种特性：052D，052E，052I，052K，052L，052N，052Q，052R，052V，056D，056E，056I，056K，056L，056N，056Q，056R，056V，089D，089E，089I，089K，089L，089N，089Q，089R，089V，152D，152E，152I，152K，152L，152N，152Q，152R，152V，153D，153E，153I，153K，153L，153N，153Q，153R，153V，201D，201E，201I，201K，201L，201N，201Q，201R，201V，251D，251E，251I，251K，251L，251N，251Q，251R，251V，284D，284E，284I，284K，284L，284N，284Q，284R，284V，297D，297E，297I，297K，297L，297N，297Q，297R，297V，308D，308E，308I，308K，308L，308N，308Q，308R，308V，321D，321E，321I，321K，321L，321N，321Q，321R，321V，328D，328E，328I，328K，328L，328N，328Q，328R，328V，347D，347E，347I，347K，347L，347N，347Q，347R，347V，357D，357E，357I，357K，357L，357N，357Q，357R，357V，359D，359E，359I，359K，359L，359N，359Q，359R，359V，369D，369E，369I，369K，369L，369N，369Q，369R，369V，385D，385E，385I，385K，385L，385N，385Q，385R，385V，388D，388E，388I，388K，388L，388N，388Q，388R，388V，391D，391E，391I，391K，391L，391N，391Q，391R，391V，400D，400E，400I，400K，400L，400N，400Q，400R，400V，416D，416E，416I，416K，416L，416N，416Q，416R和416V。
虽然可以突变AmyE多肽的许多位置，但AmyE多肽的位置75、97、101、102、120、123、133、137、182、266和306是限制性位置，即这些位置上的突变通常降低性能。具体而言，将位置75和123测定为在截短形式的亲本多肽中对性能而言是完全限制性位置，而将位置75、97、101、102、120、133、137、182、266和306测定为在全长形式的亲本多肽中对性能而言是完全限制性位置。
应注意，虽然在大的组和亚组背景中列出了许多突变，但每种突变是分开的实体，可以将所鉴定的突变中的任意一种或多种包含或排除于另一突变亚组。因此，该组合物和方法包括具有本文所述的任意一种或多种变体或其组合的AmyE变体。
3.AmyE多肽的产生
可以用表达载体以酶的形式表达编码AmyE多肽的DNA序列，该表达载体通常包含编码适合的启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号及可选的阻抑基因或多种激活基因的控制序列。
还提供包含编码AmyE或其变体的核酸的载体。提供包含该载体的宿主细胞。宿主细胞可以表达编码AmyE变体的多核苷酸。宿主细胞可以是芽孢杆菌属物种，例如枯草芽孢杆菌。
3.1多核苷酸和载体
本组合物和方法的方面包含编码AmyE多肽的多核苷酸，以及用于根据此类多核苷酸表达AmyE多肽的载体和宿主细胞。编码AmyE多肽的核酸包括但不限于SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6(其分别编码SEQ IDNO：1的AmyE和AmyE-tr(SEQ ID NO：2))的多核苷酸及其变体。其他代表性多核苷酸包含SEQ ID NO：7的多核苷酸，其编码Amy31A(SEQID NO：3)。公开于NCBI检索号ABK54355、AAF14358、AAT01440、AAZ30064、NP_388186、AAQ83841和BAA31528中的AmyE由公开于可公开进入的数据库中的多核苷酸类似地编码，这些序列在此引用作为参考。核酸可以是DNA、mRNA或cDNA序列。核酸还包含对应于任意前述核酸的简并序列。可以通过使用特定宿主生物优选的密码子来设计简并序列用于最佳表达。
携带编码AmyE多肽(包含变体)的DNA序列的重组表达载体可以是可以方便地进行重组DNA操作的任意载体，且载体的选择通常将取决于待引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。备选地，载体可以是当被引入到宿主细胞中时整合到宿主细胞基因组中并与其所整合到的染色体一起复制的载体。该整合的基因也可以通过使用可扩增构建体来扩增，以在染色体中产生该基因的多个拷贝，所述可扩增构建体可以由抗生素选择或者其他选择压力(如必需调控基因)来驱动，或者可以利用必需代谢途径基因的互补作用来驱动。
表达载体一般包含克隆载体的成分，例如允许载体在所选择的宿主生物中自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型上可检测的标记。表达载体一般包含编码启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号、可选的阻抑基因或一个或多个激活基因的调控核苷酸序列。一方面，所用的所有信号序列将物质靶向至细胞培养基，以更容易地收集和可选地纯化酶。用来连接编码AmyE或其变体、启动子、终止子和其他元件的DNA构建体，并将它们插入包含复制必需信息的适合载体的操作为本领域技术人员公知(见如Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor，1989和第三版，2001)。
在载体中，DNA序列应与适宜的启动子序列有效连接。启动子可以是任何在所选宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，并且可衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码AmyE或其变体的DNA序列转录(尤其在细菌宿主中)的适宜启动子包含多种芽孢杆菌属来源的启动子，如源自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子；大肠杆菌(E.coli)lac操纵子的启动子；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA或celA启动子；枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的那些启动子。当在诸如大肠杆菌的细菌物种中表达编码AmyE或其变体的基因时，可以例如从噬菌体启动子(包括T7启动子和λ噬菌体启动子)选择适宜的启动子。用于在酵母物种中表达的适宜启动子的实例包括但不限于酿酒酵母的Gal 1和Gal 10启动子和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的AOX1或AOX2启动子。
表达载体也可以包含与编码α-淀粉酶变体的DNA序列有效连接的适宜的转录终止子以及(在真核生物中)多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地与启动子源自相同的来源。载体还可包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pICatH和pIJ702的复制起点。
载体也可包括选择标记，例如其产物能在宿主细胞中弥补缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包括曲霉属(Aspergillus)选择标记，如amdS、argB、niaD和xxsC，产生潮霉素抗性的标记，或者可通过如本领域已知的共转化实现选择。参见例如WO 91/17243。
3.2AmyE多肽表达和宿主生物
在宿主细胞中表达时，AmyE多肽分泌进入培养基中通常是有益的。为此目的，AmyE多肽可包含允许所表达的酶分泌进入培养基的信号序列。信号序列可以由与AmyE相同的基因编码。例如，用信号序列及具有序列MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE(SEQ IDNO：9)的其他N端氨基酸天然地表达SEQ ID NO：1中所示的AmyE。备选地，信号序列可以是来自不同AmyE或甚至不同蛋白质的枯草芽孢杆菌物种信号序列。此外，信号序列可以来自不同物种，例如地衣芽孢杆菌。例如，可以选择信号序列以提供AmyE或其变体在特定宿主细胞中的最佳表达。可以由于从N端蛋白酶剪切不是信号序列的其他序列而产生成熟AmyE。例如，可以将来自地衣芽孢杆菌的31个氨基酸残基的信号序列(“LAT前导序列”)与AmyE序列符合读框地融合。例如，在图2所示的表达载体中将编码AmyE的核酸与地衣芽孢杆菌信号序列有效连接。
有益地，将含有DNA构建体或表达载体的分离的细胞用作重组产生AmyE或其变体的宿主细胞。可用编码AmyE或其变体的DNA构建体，可选地通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中而转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。可以按照常规方法，例如通过同源或异源重组，实现DNA构建体向宿主染色体的整合。备选地，可以用上述有关不同类型宿主细胞的表达载体转化细胞。
适宜的细菌宿主生物的实例是革兰氏阳性细菌物种，例如芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)；链霉菌属物种(Streptomyces spp.)，如鼠灰链霉菌(S.murinus)；乳酸细菌物种，包含乳球菌属物种(Lactococcus spp.)，如乳酸乳球菌(L.lactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)，包含罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)；明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)；片球菌属物种(Pediococcus spp.)；和链球菌属物种(Streptococcus spp.)。其他有用的宿主还包括芽孢杆菌属物种，例如A 7-7。备选地，可选择隶属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包含大肠杆菌)或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性菌物种作为宿主生物。
适宜的酵母宿主生物可选自生物技术相关的酵母物种，例如，但不限于毕赤酵母属物种(Pichia spp.)、汉逊酵母属物种(Hansenula spp.)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromyces spp.)、耶氏酵母属物种(Yarrowinia spp.)、酵母属物种(Saccharomyces spp.)(包含酿酒酵母)或隶属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种(如粟酒裂殖酵母(S.pombe))。甲基营养酵母物种巴斯德毕赤酵母的菌株可用作宿主生物。备选地，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适宜的宿主生物包括曲霉属的物种，例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(A.tubigensis)、泡盛曲霉(A.awamori)或构巢曲霉。备选地，镰孢霉属物种(Fusarium spp.)(例如尖镰孢(Fusarium oxysporum))或根毛霉属物种(Rhizomucor spp.)(如米黑根毛霉)菌株可用作宿主生物。其他适宜的酵母包含嗜热丝孢菌属物种(Thermomyces spp.)和毛霉属物种(Mucor spp.)。真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、接着再生细胞壁的方法以本领域已知的方式进行转化。转化曲霉属宿主细胞的适宜操作例如描述于EP238023中。
本组合物和方法的一方面是产生AmyE变体的方法，该方法包括在有利于变体产生的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基回收变体。用于培养细胞的培养基可以是适于生长所讨论的宿主细胞和获得AmyE变体表达的任意常规培养基。适宜的培养基和培养基组分可获自商品供应商或可根据公开的配方(例如按美国典型培养物保藏中心(ATCC)的目录中所述)制备。示例性培养基包括但不限于用于在三千升(3,000L)搅拌釜发酵罐中进行补料分批发酵的那些培养基。该情况下生长培养基可以包含玉米浆固体和大豆粉作为有机化合物的来源，连同无机盐作为钠、钾、磷酸、镁和硫酸的来源，以及微量元素。通常，糖类来源如葡萄糖也是起始培养基的部分。一旦培养物自身已经建立并开始生长，即可以如本领域已知的那样向罐中定量供应糖类来维持培养物。定期从发酵罐中取样，以便利用例如比色测定法来测量酶滴度。根据测量结果，当酶产生速率停止增加时终止发酵过程。
可通过公知的方法方便地从培养基中回收分泌自宿主细胞的AmyE多肽，其包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换层析、亲和层析等的层析方法。
可在允许AmyE多肽表达的适宜条件下培养宿主细胞。蛋白质的表达可以是组成型的，从而它们可以连续产生，或可以是诱导型的，从而需要刺激来起始表达。在诱导型表达的情况下，可以在需要时通过例如向培养基中加入诱导物(例如地塞米松、IPTG或Sepharose)来起始蛋白质产生。也可以在体外无细胞体系，如TnTTM(Promega)兔网织红细胞体系中重组产生多肽。
也可以在有氧条件下，于对宿主适宜的培养基中培养表达AmyE多肽的宿主。可以提供振荡或搅拌和通气的组合，在对于该宿主适宜的温度，例如约30℃至约75℃下进行产生，这取决于宿主和产生所希望的α-淀粉酶变体的需要。可以培养约12至约100小时或更长(以及其间的任何小时值)或更尤其是24至72小时。通常，培养基(culture broth)pH在约5.5至约8.0，这也取决于宿主细胞相对于AmyE变体的产生所需的培养条件。
可以用例如马铃薯淀粉为底物来测定所表达的酶的淀粉分解活性。此方法基于该酶对改性马铃薯淀粉的降解，并在反应后接着将淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。最初形成蓝黑色，但在淀粉降解期间，蓝色变弱，逐渐变成红棕色，将其与有色玻璃标准进行比较。
可以将AmyE多肽表达为融合蛋白质，其在成熟形式的AmyE的N端和/或C端含有便于表达、检测和/或纯化的序列，例如信号序列或His标签。这种序列含有信号序列，其便于AmyE在宿主生物中的分泌和表达。如Yang等，“Nucleotide sequence of the amylase gene from Bacillussubtilis，”Nucleic Acids Res.11：237-49(1983)中所讨论，可在切割信号肽后从AmyE的N端切割其他氨基酸残基。
4.AmyE多肽的纯化
在一些情况下，可以使用常规方法来制备纯化的AmyE多肽。在培养物中培养宿主生物后获得生长(或“发酵”)液，并通过常规分离技术去除微生物细胞和多种悬浮固体(包含残留的发酵原料)以获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微量过滤、转鼓真空过滤、随后超滤、提取或层析等。
通常希望浓缩包含所表达的AmyE或其变体的溶液以优化回收，因为使用未浓缩的溶液需增加孵育时间来收集含有纯化的酶的沉淀物。用常规技术浓缩溶液至获得期望的酶水平。可通过上文讨论的任意技术实现含酶溶液的浓缩。在一个实施方案中，使用旋转真空蒸发和/或超滤。备选地，可使用超滤。
可以使用例如金属卤化物沉淀剂进行沉淀。金属卤化物沉淀剂包含：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。金属卤化物可以选自氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。适宜的金属卤化物包含氯化钠和氯化钾，尤其是氯化钾，其还可用作防腐剂。在常规试验之后，本领域普通技术人员可以显而易见地选择用于最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和AmyE或其变体的浓度。
通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，且通常是至少8％w/v。通常，向浓缩的酶变体溶液中加入不超过约25％w/v的金属卤化物，且通常不超过约20％w/v。金属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于具体的AmyE或其变体的性质以及其在溶液中的浓度等。
实现酶沉淀的备选方法是使用有机化合物，其可以添加到浓缩的酶变体溶液中。有机化合物沉淀剂可包含：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在金属卤化物沉淀剂的添加之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加都可顺次进行或同时进行。进一步的描述见例如Danisco A/S的美国专利号5,281,526。
通常，有机化合物沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(如钠盐或钾盐)，以及4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-12个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-10个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。适宜的有机化合物包含4-羟基苯甲酸的线性烷基酯(其中烷基含有1-6个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲基酯、4-羟基苯甲酸的丙基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。其他有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(称为甲基PARABEN)、4-羟基苯甲酸丙酯(称为丙基PARABEN)，它们也是淀粉酶防腐剂。就pH、温度、酶浓度、沉淀剂浓度和孵育时间而论，这种有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件的高度灵活性的优势。通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常是至少0.02％w/v。通常向浓缩的酶变体溶液中加入不超过0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常不超过0.2％w/v。
可以调整含有金属卤化物沉淀剂和(一方面)有机化合物沉淀剂的浓缩酶溶液的pH，该pH必然地将取决于待纯化的酶变体。通常，将pH调整至淀粉酶等电点(pI)附近。例如，可以在低于pI大约2.5个pH单位至高于pI约2.5个pH单位的范围内调整pH。若变体的pI不同于野生型的pI，则可以相应地调节pH。
获得纯化的酶沉淀物所需的孵育时间取决于具体酶的性质、酶浓度、以及具体的沉淀剂(一种或多种)及其浓度。通常，有效沉淀酶变体的时间为约1至约30小时；通常不超过约25小时。在有机化合物沉淀剂存在下，孵育时间还可以减至小于约10小时，且在大多数情况下甚至是约6小时。
通常，孵育期间的温度为约4℃至约50℃。通常，在约10℃至约45℃，且尤其是约20℃至约40℃的温度进行该方法。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶或所用沉淀剂(一种或多种)而变化。
可以通过搅拌包含酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液，来改善纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的孵育期均可以进行搅拌步骤。适宜的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强有力的通风或任意类似的技术。
可以通过常规分离技术，如过滤、离心、微量过滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微量过滤(cross membrane microfiltration)、交叉流膜微量过滤(cross flow membrane microfiltration)等进一步纯化所纯化的酶。所使用的一种方法可以是交叉膜微量过滤。可以通过用水洗涤沉淀物获得对纯化的酶沉淀物的进一步纯化。例如，可以用含有金属卤化物沉淀剂的水来洗涤纯化的酶沉淀物，例如用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水。
培养期间，所表达的酶可以累积在培养基中。为了分离和纯化所表达的酶，离心或过滤培养基以除去细胞，且可以将产生的无细胞液体用于进行酶的纯化。在一个实施方案中，使用约70％饱和度的硫酸铵对无细胞液进行盐析；然后将该70％饱和度沉淀的级分溶解在缓冲液中并施加到诸如Sephadex G-100柱的柱中，并洗脱以回收酶活性级分。为了进一步纯化，可以使用诸如离子交换层析的常规方法。
纯化的酶可用于通常利用酶的所有应用中。例如，它们可以用于衣物洗涤剂和除斑剂，用于食品工业，用于淀粉加工和烘焙，且可作为消化助剂用于药物组合物。可以将它们制成液体(溶液，浆液)或固体(颗粒，粉末)的终产物。
备选地，可以回收酶产物，并向培养基中加入絮凝剂，以通过过滤或离心除去细胞和细胞碎片，而无需进一步纯化酶。
通过上述方法产生和纯化的AmyE多肽可用在多种有用的工业应用中。酶具有便于织物和家庭护理(F&HC)相关应用的有价值的特性。例如，AmyE多肽可以用作洗涤、餐具洗涤和硬表面清洁洗涤剂组合物中的组分。AmyE多肽也可用于从淀粉产生增甜剂和乙醇，和/或用于纺织品脱浆。如在例如WO 2005/111203和美国公开申请号2006/0014265(DaniseoA/S)中所述，AmyE多肽在淀粉转化过程(包括淀粉液化和/或糖化过程)中尤其有用。下文更详细地描述了AmyE多肽的这些用途。
5.AmyE多肽的组合物和使用方法
5.1.淀粉加工组合物和方法
5.1.1.概述
AmyE多肽可以用于淀粉加工/转化，其是产生增甜剂、产生用于燃料或饮料(即可饮用醇)的醇、产生饮料、加工蔗糖或产生所需的有机化合物(例如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、酮类、氨基酸、抗生素、酶、维生素、激素等)的中心。淀粉转化通常涉及水解糊化淀粉或颗粒淀粉的浆液为可溶淀粉水解产物。常规淀粉转化涉及三个连续的酶促过程：液化过程、糖化过程和从葡萄糖产生所希望的产物的其他过程。取决于所希望的产物，该其他过程可以是异构化、发酵等。在将淀粉转化为果糖糖浆的方法中，该其他过程是异构化。
5.1.2.淀粉组合物
待加工的淀粉可以获自块茎、根、茎、豆荚、谷物或整个谷粒。更具体地，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米芯、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。具体考虑的是蜡质及非蜡质类型的玉米和大麦。淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，例如至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯。备选地，淀粉可以是较为粗制的含淀粉材料，其可以含有碾磨过的整个谷粒，包括非淀粉级分如胚芽残留物和纤维。碾磨原料如整个谷粒以打开其结构，从而允许进一步加工。
两种碾磨方法是适用的：湿磨法和干磨法(干磨(dry grinding))。在干磨法中，碾磨和使用整个谷粒。干磨的谷粒除淀粉外还可包含显著量的非淀粉糖类化合物。当通过喷射蒸煮加工这样的异质原料时，往往仅能实现淀粉的部分糊化。湿磨法提供胚芽和粗磨粉(meal，淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，通常用于产生糖浆。该方法可在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。该方法还可在具有超滤膜的连续膜反应器中进行，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。该方法还可在具有微量过滤膜的连续膜反应器中进行，其中保留物在酶、粗淀粉和水的存在下保持再循环，且其中透过物为可溶淀粉水解产物。
在上述任何方面中使用的淀粉浆可以具有约20％至约55％的干固体颗粒淀粉，约25％至约40％的干固体颗粒淀粉，或约30％至约35％的干固体颗粒淀粉。酶变体将颗粒淀粉中的可溶淀粉以至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的量转化成可溶淀粉水解产物。
5.1.3.液化和糖化
在液化步骤期间，通过α-淀粉酶将存在于淀粉浆中的长链淀粉分子降解为较短链和线性的分子(麦芽糖糊精)。大量α-淀粉酶是市售的，包含
Figure BDA0000045914770000841
Xtra(Genencor)和
Figure BDA0000045914770000842
(Novozymes)。
液化过程通常在约105-110℃下进行约5至10分钟，随后在95℃下进行1-2小时。液化的pH通常为约5.0至约6.2，且通常在5.5以上。为了促进α-淀粉酶在这些条件下的稳定性，通常添加1mM的钙(40ppm游离钙离子)。在此处理后，液化的淀粉组合物将包含大量糊精，且将具有约10-15的“葡萄糖当量”(DE)。
液化过程之后，通常通过添加葡糖淀粉酶(例如AMGTM)在分开的糖化步骤中将糊精转化为葡萄糖。还可以添加脱支酶，如异淀粉酶或支链淀粉酶(例如
Figure BDA0000045914770000843
)。为了为糖化步骤作准备，通常将浆液的pH降至低于约4.5的值，同时维持温度在95℃或更高，以使液化α-淀粉酶变性。然后将温度降低至约60℃，并添加葡糖淀粉酶和脱支酶以影响从糊精产生葡萄糖。糖化过程通常进行约24至约72小时。
5.1.4.通过糖化产生的葡萄糖的进一步加工
糖化过程之后，可以利用例如固定化的葡萄糖异构酶(如
Figure BDA0000045914770000844
)将葡萄糖浆转化为高果糖糖浆。一方面，将该过程的可溶淀粉水解产物转化为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。这种转化可利用葡萄糖异构酶，尤其是固定在固相支持物上的葡萄糖异构酶实现。所考虑的异构酶包含商品
Figure BDA0000045914770000845
IT(NOVOZYMES A/S)；
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IMGI、
Figure BDA0000045914770000847
G993、
Figure BDA0000045914770000851
G993、
Figure BDA0000045914770000852
G993液体和
Figure BDA0000045914770000853
IGI。虽然Ca2+提高常规α-淀粉酶的稳定性，但其强烈抑制葡萄糖异构酶的活性。因此，通常在异构化之前，例如通过离子交换去除Ca2+，以使Ca2+水平低于3-5ppm。此过程是耗时且昂贵的。
备选地，将通过糖化产生的葡萄糖用于发酵，以产生发酵产物，例如乙醇、丁醇以及本文所述和本领域已知的其他化合物。通过发酵从含淀粉原料产生乙醇的典型的完整过程包括：(i)用AmyE或其变体液化含淀粉原料；(ii)糖化所获得的液化醪；和(iii)在发酵生物的存在下发酵步骤(ii)中获得的物质。可选地，该过程还包括回收乙醇。发酵期间，乙醇含量达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％，例如至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少15％、或至少16％乙醇。
糖化和发酵的过程可以作为同时糖化和发酵(SSF)法实施。当发酵与水解同时进行时，温度可以在30℃-35℃之间，尤其是31℃-34℃之间。该方法可以在超滤体系中进行，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。同等考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法，其中保留物在酶、粗淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下保持再循环，且其中透过物为含乙醇的液体。
还可以将通过糖化产生的葡萄糖用于产生发酵产物，如乙醇、丁醇、柠檬酸、谷氨酸单钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸δ-内酯或异抗坏血酸钠(sodium erythorbate)。
5.1.5.AmyEα-淀粉酶的优势
当用于淀粉水解时，AmyE多肽提供几种优势，这将它们与其他α-淀粉酶区分开，并允许使淀粉水解方法合理化。首先，可以在适于葡糖淀粉的相同反应条件下，通过AmyE多肽将糊精转化为葡萄糖。这排除了针对α-淀粉酶优化反应混合物(例如浆液)的pH和温度，然后例如通过降低浆液的pH和温度来将反应条件调节为适于葡糖淀粉酶的需要。以这种方式，AmyE在淀粉水解中的使用允许在相同的浆液条件下进行液化和糖化，从而消除了淀粉水解中的一个步骤。
在一些情况下，液化和糖化都可以在4-7，例如约4-5，约4-6，约5-6，约5-7和约6-7之间的单一pH下进行。应注意，单个pH的标准忽略了液化或糖化期间反应混合物pH发生的任意微小变化，但其不涉及添加酸或碱来有意改变反应混合物的pH。在一些情况下，液化和糖化都可以在低于进行常规液化方法的pH的pH下进行，例如，低于约5.0，低于约4.8，低于约4.6，低于约4.4，低于约4.2的pH，或甚至约4.0的pH。用AmyE进行液化还允许用于液化的淀粉组合物中包含更高百分比的稀釜馏物，例如反应混合物的＞50％，或甚至＞60％。在一些情况下，液化和糖化都可以在约20-105℃，例如60-85℃的温度下，或在低于淀粉糊化温度(即约75℃)约10、12、14、16、18或甚至20℃的温度下进行。重要地，可以完整地进行液化和糖化而无需中间的pH调节。备选地，当仍然希望在液化和糖化之间调节pH时，与常规方法中所用的量相比，可以用降低量的酸或碱进行，从而向反应混合物中引入较少的盐。
此外，AmyE多肽催化复合糖，如麦芽糖、麦芽三糖和麦芽七糖降解为葡萄糖。这种酶活性通常与葡糖淀粉酶而非α-淀粉酶相关。AmyE多肽的此活性允许在不存在分开的葡糖淀粉酶的情况下，或存在降低量(与使用常规α-淀粉酶所需的量相比)的葡糖淀粉酶的情况下进行淀粉至葡萄糖的水解。以这种方式，AmyE多肽在淀粉水解中的使用允许利用作为α-淀粉酶和葡糖淀粉酶二者发挥作用的单个酶同时进行液化和糖化，从而消除或降低了对分开的酶的需要。
AmyE多肽的稳定性还需要很少的Ca2+或不需要Ca2+，这降低或消除了向液化反应添加Ca2+的需要。除避免了添加Ca2+的步骤外，这还避免了随后在使浆液与对Ca2+敏感的酶，如葡萄糖异构酶接触前从浆液去除(例如通过离子交换)Ca2+的需要。避免Ca2+的去除节约了时间和成本，且提高了产生高果糖糖浆的效率。
最后，AmyE多肽对未糊化的淀粉具有高活性，其可与常规α-淀粉酶的酶活性相当。这允许将喷射蒸煮的干磨淀粉用于液化和糖化，其中通常优选湿磨淀粉以改善转化效率。
应理解，AmyE适宜用于与发酵、异构化或任意其他随后的方法连接的液化/糖化方法，包括SSF。
5.1.6.AmyE与葡糖淀粉酶和其他酶的组合
AmyE多肽可以单独使用(例如作为淀粉加工中唯一的淀粉分解酶)，或可以与其他α-或β-淀粉酶或其他酶组合以提供具有宽活性谱的“混合物(cocktail)”。例如，可以使淀粉与选自以下的一种或多种酶接触：真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、细菌α-淀粉酶(例如芽孢杆菌属α-淀粉酶或非芽孢杆菌属α-淀粉酶)或β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)。可以将另一种淀粉分解酶或脱支酶，如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)与AmyE多肽组合。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1，6-D-糖苷分支键，且可以通过异淀粉酶不能攻击支链淀粉及其对α-极限糊精的有限作用而与支链淀粉酶区别开来。
β-淀粉酶是外切产麦芽糖淀粉酶，其催化水解直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷键，从而释放麦芽糖。已从多种植物和微生物分离了β-淀粉酶(Fogarty等，PROGRESS IN INDUSTRIALMICROBIOLOGY，15卷，112-115页，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃至65℃范围内的最适温度，以及约4.5至约7.0范围内的最适pH。考虑的β-淀粉酶包括但不限于来自大麦的
Figure BDA0000045914770000871
BBA 1500、
Figure BDA0000045914770000872
DBA、OPTIMALTTM ME、OPTIMALTTM BBA(DANISCOA/S)；和NOVOZYMTM WBA(Novozymes A/S)的β-淀粉酶。
如本文所述，AmyE多肽具有葡糖淀粉酶活性，且可以在不存在单独的葡糖淀粉酶的情况下使用。备选地，与常规淀粉水解方法所需的量相比，可以以降低的量添加葡糖淀粉酶。优选地，葡糖淀粉酶可以以不超过(即少于)0.5葡糖淀粉酶活性单位(AGU)/g DS(即每克干固体的葡糖淀粉酶活性单位)、不超过0.4AGU/g DS、不超过0.3AGU/g DS、不超过0.2AGU/g DS或甚至不超过0.1AGU/g DS的量存在。更一般地，可以以0.02-2.0AGU/g DS或0.1-1.0AGU/g DS的量添加葡糖淀粉酶，虽然这些范围考虑使用比与AmyE组合所需更多的葡糖淀粉酶。因为AmyE多肽与葡糖淀粉酶在相同的pH和温度下具有活性，所以可在添加葡糖淀粉酶之前或之后，或与葡糖淀粉酶同时添加AmyE多肽，例如利用包含AmyE和葡糖淀粉酶二者的混合物。因此，添加α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的顺序和方式不再关键，这允许提高淀粉水解过程中的灵活性。
葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)可以衍生自微生物或植物。存在多种已知的源自真菌和细菌的葡糖淀粉酶。示例性细菌葡糖淀粉酶有曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984、)，EMBO J.3：1097-1102)或其变体，如WO 92/00381和WO 00/04136中所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)55(4)：941-949)或其变体或片段。曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等(1996)Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等(1995)Prot.Eng.8：575-582)；N182(Chen等(1994)Biochem.J.301：275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等(1996)Biochemistry，35：8698-8704)；在A435和S436位引入Pro残基(Li等(1997)Protein Eng.10：1199-1204)。其他葡糖淀粉酶包括里氏木霉葡糖淀粉酶(例如WO 2006/060062的SEQ ID NO：3；TrGA)；踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森踝节菌(T.emersonii)(WO 99/28448)、T.leycettanus(美国专利号RE 32,153)、杜邦踝节菌(T.duponti)或嗜热踝节菌(T.thermophilics)(美国专利号4,587,215)。细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。其他适宜的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，例如与WO 00/04136中的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的葡糖淀粉酶。市售葡糖淀粉酶也适宜，如AMG 200L、AMG 300L、SANTMSUPER和AMGTM E(Novozymes)；
Figure BDA0000045914770000881
300(Genencor Division，Danisco US Inc.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；
Figure BDA0000045914770000891
G900(Enzyme Bio-Systems)；和
Figure BDA0000045914770000892
G990ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。
肌醇六磷酸酶是能够降解见于谷粒和含油种子中的植酸(肌醇六磷酸(phytate))的酶。据信，肌醇六磷酸及其降解中间物使α-淀粉酶不稳定或以其他方式负面影响α-淀粉酶，从而降低它们的效率。可以与变体α-淀粉酶组合使用的肌醇六磷酸酶能够在所定义的孵育和液化步骤的条件下水解肌醇六磷酸。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶能够从肌醇六磷酸(inositol hexaphosphate)(肌醇六磷酸(phytic acid))释放至少一个无机磷酸。可根据其对肌醇六磷酸分子上起始水解作用的磷酸酯基团的具体位置的偏好来分组肌醇六磷酸酶(例如分为3-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8)或分为6-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.26))。肌醇六磷酸酶的典型实例是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶。
肌醇六磷酸酶可以获自微生物如，如真菌生物和细菌生物。这些微生物中的一些包括例如曲霉属(例如黑曲霉、土曲霉(A.terreus)、无花果曲霉(A.ficum)和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉(M.thermophila))、踝节菌属(嗜热踝节菌)、木霉属物种(Trichoderma spp.)(里氏木霉)和嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(WO 99/49740)。肌醇六磷酸酶还可获自青霉属(Penicillium)物种，例如P.hordei(ATCC号22053)、桧状青霉(P.piceum)(ATCC号10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC号48944)。见例如USP 6,475,762。此外，肌醇六磷酸酶可获自芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌)、假单胞菌属(Pseudomonas)、枹蕈属(Peniophora)、大肠杆菌、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、Enterbacter和Buttiauxiella(见WO2006/043178)。
可获得市售肌醇六磷酸酶，如
Figure BDA0000045914770000893
(BASF)，
Figure BDA0000045914770000894
P(Novozymes A/S)，
Figure BDA0000045914770000895
(Danisco A/S，Diversa)和(AB Enzymes)。Engelen等(1994)J.AOAC Int.77：760-764发表了测定微生物肌醇六磷酸酶活性的方法和肌醇六磷酸酶单位的定义。肌醇六磷酸酶可以是野生型肌醇六磷酸酶、其变体或片段。
示例性肌醇六磷酸酶衍生自细菌Buttiauxiella。Buttiauxiella spp.包含B.agrestis、B.brennerae、B.ferragutiase、B.gaviniae、B.izardii、B.noackiae和B.warmboldiae。Buttiauxiella物种的菌株可获自DSMZ，德国生物材料保藏中心(German National Resource Center for Biological Material，Inhoffenstrabe 7B，38124 Braunschweig，德国)。在保藏号NCIMB 41248下保藏的Buttiauxiella sp.菌株P1-29是尤其有用的菌株实例，可从其获得肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶可以是BP-野生型，其变体(如BP-11)描述于WO 06/043178中，或描述于2007年3月6日提交的美国专利公开号US20080220498中的变体(见例如表1和SEQ ID NO：3)。
肌醇六磷酸酶还可以是Buttiauxiella肌醇六磷酸酶的BP-17变体(其具有下文所示的SEQ ID NO：17的氨基酸序列)，或与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％序列同一性的肌醇六磷酸酶。
用于孵育和/或液化过程的肌醇六磷酸酶的量(剂量)可以在约0.001-50FTU/g ds的范围内，例如在约0.01-25FTU/g ds、约0.01-15FTU/g ds、约0.01-10FTU/g ds、约0.05-15FTU/g ds和约0.05-5.0FTU/g的范围内。
可以与AmyE多肽组合使用的其他酶包括脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶/半纤维素酶、过氧化物酶、果胶酶、果胶(pectine)裂合酶、漆酶或其组合。在一些情况下，可以使用WO 98/22613中所公开的类型的糖类结合结构域。
5.2.清洁和餐具洗涤组合物和方法
可以将AmyE多肽配制在用于清洁餐具或其他硬表面的洗涤剂组合物中。这些组合物可以是凝胶、粉末或液体。组合物可以包含AmyE多肽作为组合物中的专一淀粉分解酶。备选地，组合物可以包含其他/额外的淀粉分解酶、其他清洁酶以及清洁组合物中常用的其他组分。衣物洗涤剂组合物可以额外包含一种或多种其他酶，如脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、果胶酶、果胶裂合酶和/或漆酶，或其组合。
餐具洗涤洗涤剂组合物通常包含一种或多种表面活性剂，其可以是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性离子型或这些类型的混合物。该洗涤剂可以含有按重量计0％至约90％的非离子表面活性剂，如低或无泡沫乙氧基化丙氧基化直链醇。
液体洗涤剂组合物可以包含丙二醇。例如通过在含有10％氯化钙的25％体积/体积丙二醇溶液中循环，可以使AmyE多肽溶解于丙二醇。
餐具洗涤洗涤剂组合物可以含有无机和/或有机类型的洗涤剂助剂盐。洗涤剂助剂可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1％至约90％的洗涤剂助剂。含磷的无机碱性洗涤剂助剂的实例是水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和多磷酸盐。含磷的有机碱性洗涤剂助剂的实例是水溶性膦酸盐。不含磷的无机助剂的实例是水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐，以及多种类型的水不可溶晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。
适宜的有机助剂的实例包含碱金属；铵和取代的铵；柠檬酸盐；琥珀酸盐；丙二酸盐；脂肪酸磺酸盐；羧基甲氧基琥珀酸盐；聚乙酸铵；羧酸酯；聚羧酸酯；氨基聚羧酸酯；聚乙酰基羧酸酯；和多羟基磺酸酯(polyhydroxsulphonates)。其他适宜的有机助剂包含已知具有助剂特性的较高分子量的聚合物和共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，以及它们的盐。
清洁组合物可含有例如氯/溴类型或氧类型的漂白剂。无机氯/溴类型漂白剂的实例是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐(hypobromite)，以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴类型漂白剂的实例是杂环N-溴和N-氯酰亚胺类，如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸和二氯异氰脲酸，及其与水增溶性阳离子(如钾和钠)的盐。乙内酰脲化合物也是适宜的。
清洁组合物可含有氧漂白剂，例如以无机过酸盐的形式，可选地与漂白前体一起或以过氧酸化合物的形式。过氧漂白化合物的典型实例是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物)、碱金属过碳酸盐、碱金属过硅酸盐和碱金属过磷酸盐。适宜的活性剂材料包含四乙酰乙二胺(TAED)和三乙酸甘油酯。酶促漂白活化体系也可以存在，例如过硼酸盐或过碳酸盐、三乙酸甘油酯和过水解酶(perhydrolase)，如WO 2005/056783中所公开的那样。
可使用常规用于酶的稳定剂来稳定清洁组合物，该稳定剂例如多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳族硼酸酯)。清洁组合物也可含有其他常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂材料、填充剂材料、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、螯合剂、防污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。
最后，AmyE多肽可用于常规餐具洗涤洗涤剂中，例如用于以下专利公开中描述的任意洗涤剂中(理解为用AmyE多肽替代或加入以下专利和公开的专利申请中描述的α-淀粉酶)：CA 2006687、GB 2200132、GB2234980、GB 2228945、DE 3741617、DE 3727911、DE 4212166、DE4137470、DE 3833047、DE 4205071、WO 93/25651、WO 93/18129、WO93/04153、WO 92/06157、WO 92/08777、WO 93/21299、WO 93/17089、WO 93/03129、EP 481547、EP 530870、EP 533239、EP 554943、EP 429124、EP 346137、EP 561452、EP 318204、EP 318279、EP 271155、EP 271156、EP 346136、EP 518719、EP 518720、EP 518721、EP 516553、EP 561446、EP 516554、EP 516555、EP 530635、EP 414197和美国专利号5,112,518、5,141,664和5,240,632。
含有AmyE多肽的洗涤剂组合物可以配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
5.3.衣物洗涤剂组合物和方法
AmyE多肽可以是衣物洗涤剂组合物的成分，例如以无粉尘颗粒、稳定的液体、受保护的酶等形式。可以例如，按美国专利号4,106,991和4,661,452所公开的那样来产生无粉尘颗粒，并且可以可选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均摩尔质量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如英国专利号1,483,591中描述了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。
可以按照已建立的方法，通过加入诸如丙二醇的多元醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定液态酶制品。其他酶稳定剂是本领域已知的。可按照例如US 5,879,920(Danisco A/S)或EP 238216中公开的方法来制备受保护的酶。长期以来，多元醇被公认为是蛋白质的稳定剂，以及用于提高蛋白质的溶解性。参见例如，Kaushik等，J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)和其中引用的参考文献；以及M.Conti等，J.Chromatography 757：237-245(1997)。
衣物洗涤剂组合物可以是任意便利的形式，例如凝胶、粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂，其也可以是只含有约30％水的压缩凝胶(compactgel)类型的形式。
衣物洗涤剂组合物通常含有一种或多种表面活性剂，其可以是阴离子型、非离子型(包含半极性型)、阳离子型、或两性离子型或其组合。表面活性剂通常以0.1wt％至60wt％的水平存在。在一些情况下，洗涤剂将通常包含0％至约40％或至约50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐；α-烯属磺酸盐；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。该组合物也可以包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺(如WO 92/06154中所述)或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
衣物洗涤剂组合物可额外包含一种或多种其他酶，如脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、果胶酶、果胶裂合酶、漆酶和/或另一淀粉分解酶(例如另一α-淀粉酶)，或其组合。在一些情况下，可将2，6-β-D-果聚糖水解酶掺入衣物洗涤剂组合物中，并用于去除/清洁家居和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜。
衣物洗涤剂可含有约1％至约65％的洗涤剂助剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是无助剂的，即基本上不含洗涤剂助剂。可以在与酶的稳定性兼容的任何组合物中使用酶。通常可以通过已知的包囊化形式(例如通过造粒或隔离在水凝胶中)来保护酶免于遭遇有害组分。具有或不具有淀粉结合结构域的酶(尤其是α-淀粉酶)不局限于洗衣和餐具洗涤应用，而是可用于表面清洁剂以及用于从淀粉或生物质(biomass)产生乙醇。
衣物洗涤剂可包含一种或多种聚合物。实例包含羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
衣物洗涤剂可含有漂白体系，其可包含H2O2来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，其可选地与形成过酸的漂白活性剂，如TAED或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)组合。备选地，漂白体系可包含例如酰胺、亚胺或砜类的过氧酸。漂白体系也可以是酶促漂白体系，其中过水解酶活化过氧化物，例如WO 2005/056783中所述的那些。
可使用常规稳定剂来稳定衣物洗涤剂组合物中的酶(包含AmyE多肽)，该稳定剂例如诸如丙二醇或甘油的多元醇；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物如芳族硼酸酯；并且可按例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制组合物。
衣物洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如包括粘土的织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂或香料。如在淀粉水解的情况下，虽然AmyE多肽也在低pH条件下工作，但pH(在使用浓度下于水溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。
一种或多种AmyE多肽可以按衣物清洁组合物中常规利用的浓度(例如每升洗液0.00001-1.0mg(按纯酶蛋白质计算)AmyE多肽)存在于这类组合物中。示例性洗涤剂组合物包含以下：
(1)配制为具有至少600g/L的体积密度(bulk density)的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，其包含约7％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约2％至约6％的可溶硅酸盐；约15％至约22％的沸石(例如NaAlSiO4)；0％至约6％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na3O7/C6H8O7)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO3·H2O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0-5％次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。
(2)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，其包含约6％至约11％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶硅酸盐；约24％至约34％的沸石(例如NaAlSiO4)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na3O7/C6H8O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
(3)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，其包含约5％至约9％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO)；约1％至约3％的皂如脂肪酸(例如C16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na2CO3)；约3％至约9％的可溶硅酸盐；约23％至约33％的沸石(如NaAlSiO4)；0％至约4％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约8％TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
(4)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，其包含约8％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na2CO3)；约1％至约5％的可溶硅酸盐；约25％至约35％的沸石(例如NaAlSiO4)；0％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
(5)水性液体洗涤剂组合物，其包含约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
(6)水性结构型液体洗涤剂组合物，其包含约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；3-9％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaAlSiO4)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG，PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(anchoringpolymer)(例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
(7)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，其包含约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶硅酸盐；约20％至约40％的沸石(例如NaAlSiO4)；约2％至约8％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂，抑泡剂、香料)。
(8)配制为颗粒剂形式的洗涤剂组合物，其包含约8％至约14％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶硅酸盐；约30％至约50％的沸石(例如NaAlSiO4)；约3％至约11％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如C6H5Na3O7)；约1％至约5％的聚合物(例如PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
(9)配制为颗粒剂形式的洗涤剂组合物，其包含约6％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约18％至约32％的沸石(例如NaAlSiO4)；约5％至约20％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如C6H5Na3O7)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯或PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、香料)。
(10)水性液体洗涤剂组合物，其包含约15％至约23％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的助水溶物(例如甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。
(11)水性液体洗涤剂组合物，其包含约20％至约32％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；6-12％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如助水溶物、分散剂、香料、荧光增白剂)。
(12)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，其包含约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约5％至约15％的可溶硅酸盐；0％至约5％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约15％至约28％的沸石(NaAlSiO4)；0％至约20％的过硼酸钠(例如NaBO3·H2O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-3％的次要成分(例如香料、荧光增白剂)。
(13)上文组合物1)-12)中所述的洗涤剂组合物，其中所有或者部分的线性烷基苯磺酸盐被(C12-C18)烷基硫酸盐代替。
(14)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，其包含约9％至约15％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如NaAlSiO4)；约10％至约20％的层状焦硅酸盐(例如来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如Na2CO3)；0％至约6％的可溶硅酸盐；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。
(15)配制为具有至少600g/L的体积密度的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，其包含约4％至约8％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na2CO3)；0％至约4％的可溶硅酸盐；约13％至约22％的过碳酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-3％的次要成分(例如荧光增白剂、膦酸盐、香料)。
(16)上文1)-15)中所述的洗涤剂制剂，其含有被稳定化的或囊化的过酸作为额外组分或者作为已经指定的漂白体系的替代物。
(17)上文1)、3)、7)、9)和12)中所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。
(18)上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的洗涤剂组合物，其还含有锰催化剂。
(19)配制为非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，其包含液态非离子表面活性剂，例如，线性烷氧基化伯醇、助剂体系(例如磷酸盐)、酶(一种或多种)和碱。该洗涤剂也可包含阴离子表面活性剂和/或漂白体系。
可以将包含AmyE多肽的衣物洗涤剂组合物配制为手洗或机洗的衣物洗涤剂组合物，其包含适于预处理污染的织物的洗衣添加剂组合物和适于漂洗添加的织物软化剂组合物，或者配制为用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物。
洗涤剂组合物可以包含2，6-β-D-果聚糖水解酶，一种或多种其他α-淀粉酶，和一种或多种其他清洁酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶(mannanase)、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且所述酶应以有效量存在。
可以将洗涤剂添加剂，即分开的添加剂或组合的添加剂配制为颗粒、液体、浆液等。适宜的颗粒洗涤剂添加剂制剂包括无粉尘颗粒。
考虑以对应于约0.01至约100mg酶蛋白质每升洗液，尤其是约0.05至约5.0mg酶蛋白质每升洗液，或甚至更尤其是0.1至约1.0mg酶蛋白质每升洗液的量，将AmyE多肽加入洗涤剂组合物中。
5.4.与AmyE多肽组合使用的酶
如上文所述，含有AmyE多肽的清洁组合物可以包含一种或多种其他酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶、2，6-β-D-果聚糖水解酶、其他α-淀粉酶及其组合。通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且所述酶应以有效量存在。示例性酶描述于下文。这些酶中的许多还可以与AmyE多肽组合用于清洁组合物以外的组合物中。
蛋白酶：适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。还包括经化学修饰或蛋白质改造的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是源自芽孢杆菌属物种的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(见如美国专利号6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如源于猪或牛)和镰孢霉属(Fusarium)蛋白酶(参见例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例还包括但不限于WO 92/19729和WO98/20115中所述的变体。适宜的市售蛋白酶包括
Figure BDA0000045914770001011
PRIMASETM、DURALASETM、
Figure BDA0000045914770001013
和KANNASETM(NOVO NORDISK A/S)；
Figure BDA0000045914770001014
MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、
Figure BDA0000045914770001015
PURAFECT OXPTM、FN2TM和FN3TM(DANISCO A/S)。
脂肪酶：适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质改造的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质霉属(Humicola)(与嗜热丝孢菌属同义)，例如疏毛腐质霉(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见例如，EP 258068和EP305216)、特异腐质霉(H.insolens)(参见例如，WO 96/13580)的脂肪酶；假单胞菌属脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(参见例如EP 218 272)；洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331 376)；斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如GB 1,372,034)；荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属物种菌株SD 705(参见例如，WO 95/06720和WO 96/27002)；P.wisconsinensis(参见例如WO 96/12012)的脂肪酶)；芽孢杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌(参见例如Dartois等Biochemica Biophysica Acta，1131：253-360(1993))；嗜热脂肪芽孢杆菌(参见例如JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如WO 91/16422)的脂肪酶)。其他可以考虑在制剂中使用的脂肪酶变体包括例如在WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些。一些市售脂肪酶包括和
Figure BDA0000045914770001017
ULTRA(Novo NordiskA/S)。
聚酯酶：适宜的聚酯酶包括但不限于WO 01/34899(Danisco A/S)和WO 01/14629(Danisco A/S)中描述的那些，并且可以包含于与本文讨论的其他酶的任意组合。
淀粉酶：组合物可与其他α-淀粉酶组合，如非变体α-淀粉酶。这些酶可包括市售淀粉酶，例如但不限于
Figure BDA0000045914770001021
TERMAMYLTM、
Figure BDA0000045914770001022
和BANTM(Novo Nordisk A/S)；
Figure BDA0000045914770001023
和
Figure BDA0000045914770001024
(Danisco A/S)。
纤维素酶：可以向组合物中加入纤维素酶。适宜的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。适宜的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如如美国专利号4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757和WO 89/09259中公开的产生自特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢的真菌纤维素酶。可以考虑使用的示例性纤维素酶为对纺织品具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的实例是描述于例如EP 0495257；EP 531372；WO 99/25846(Danisco A/S)、WO 96/34108(Danisco A/S)、WO 96/11262；WO 96/29397和WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，例如描述于WO 94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK98/00299；EP 531315；美国专利号5,457,046；5,686,593；和5,763,254中的纤维素酶变体。市售纤维素酶包括
Figure BDA0000045914770001025
和
Figure BDA0000045914770001026
(Novo Nordisk A/S)；CLAZINASETM和
Figure BDA0000045914770001027
HA(Danisco A/S)；和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
过氧化物酶/氧化酶：考虑用于组合物中的适宜的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。包括经化学修饰或蛋白质改造的突变体。有用的过氧化物酶的实例包含描述于WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中的来自鬼伞属(Coprinus)(例如灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶及其变体。市售过氧化物酶包含例如GUARDZYMETM(Novo Nordisk A/S)。
5.5.用于测量AmyE多肽清洁性能的测定
下文和所附实施例中描述了测量AmyE多肽清洁性能的示例性测定。可以用来测试含有AmyE多肽的清洁组合物效力的一种标准测定涉及样片测试。在多种材料类型上具有已知“强度”的污渍的样片是市售可得的(EMPA，St.Gallen，Switzerland；wfk-Testgewebe GmbH，Krefeld德国；或Center for Test Materials，Vlaardingen，荷兰)和/或可以由从业者制得(Morris和Prato，Textile Research Journal 52(4)：280286(1982))。样片可包含例如含棉织物，其含有通过血液/乳/墨水(BMI)、菠菜、草或巧克力/乳/烟灰产生的污渍。可以用例如0.0003％至0.3％的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。其他组合包括用0.001％-1％戊二醛固着的草或菠菜、用0.001％-1％戊二醛固着的明胶和考马斯染料、或用0.001％-1％戊二醛固着的巧克力、乳和烟灰。
也可以在用AmyE多肽和/或洗涤剂制剂孵育期间搅拌样片。洗涤性能数据取决于孔中，尤其是在96孔板中的样片的取向(水平对垂直)。这表明在孵育期间混合是不充分的。尽管存在许多方式来保证孵育期间的充分搅拌，但可以构建将微量滴定板夹在两个铝板之间的板夹。这可以简单地例如在孔上方放置粘性板密封物，然后用任何类型的适宜的、市售可得的夹子将两个铝板与96孔板夹紧而实现。然后可以将它放到商品化的孵育摇床中。将摇床设定为约400转/分钟导致非常有效的混合，而板夹有效地阻止了泄漏或交叉污染。
可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来定量洗液中的氨基基团浓度。这可以用作从样片中去除的蛋白质量的量度(参见例如Cayot和Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200(1997))。然而，如果洗涤剂或酶样品导致异乎寻常小的肽片段的形成(例如，因样品中存在肽酶所致)，那么人们将获得较大的TNBS信号，即更多“噪音”。
另一用于测量对血液/乳/墨水的洗涤性能的手段是基于墨水的释放，这可以通过测量洗液的吸光度而量化。可以在350和800nm之间的任何波长，例如410nm或620nm测量吸光度。也可以检查洗液以确定对含有草、菠菜、明胶或考马斯染料的污渍的洗涤性能。对于这些污渍，适宜的波长包括对于菠菜或草的670nm和对于明胶或考马斯染料的620nm。例如，移出等份试样的洗液(例如，通常是来自96孔微板的100-150μL)并放到小杯或多孔微板中。然后将它放到分光光度计中并在适当的波长读取吸光度。也可以使用该体系，例如通过使用在诸如布、塑料或陶瓷的适宜载污体上的血液/乳/墨水污渍，来测定用于餐具洗涤的适宜的酶和/或洗涤剂组合物。
在一个实例中，可以通过在25℃下将0.3％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟或通过在60℃下将0.03％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟来在棉上固着BMI污渍。从BMI/棉样片上切下约0.25″的小样片并放入96孔微量滴定板的孔中。向各孔中放入已知的洗涤剂组合物和酶如变体蛋白质的混合物。向微量滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微量滴定板与铝板夹在一起，并在定轨摇床上以约250转/分钟搅拌约10-60分钟。这个时间结束后，将上清转移到新的微量滴定板的孔中并测量620nm的墨水吸光度。这可以类似地用通过在25℃下向菠菜/棉样片或草/棉样片施加0.01％戊二醛30分钟而固着在棉上的菠菜污渍或草污渍来进行检测。这也可以用巧克力、乳和/或烟灰污渍完成。
5.6.纺织品脱浆组合物和方法
还考虑使用一种或多种AmyE多肽处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。AmyE多肽可以用于本领域已知的任何织物处理方法中(参见例如美国专利号6,077,316)。例如，可以通过涉及将织物可选地在压力下与AmyE多肽溶液接触的方法，改善该织物的触感和外观。
在纺织品纺织期间或之后、或在脱浆阶段或者一个或多个其他织物加工步骤的过程中施加AmyE多肽。在纺织品纺织期间，纺线暴露于相当大的机械张力。在机械织机上纺织之前，径纱通常涂上淀粉或淀粉衍生物浆料，以增加其抗张强度并防止断裂。可以施加AmyE多肽以除去这些淀粉或淀粉衍生物浆料。在纺织品织成之后，织物可以进入脱浆阶段。这之后可接着一个或多个其他织物加工步骤。脱浆是从纺织品中除去浆料的行为。纺织后必须除去浆料涂层，之后再进一步加工织物，以确保均一和耐洗效果。然后可将AmyE多肽用于脱浆织物的方法中，其包括通过AmyE多肽的作用来酶促水解浆料。
AmyE多肽可以单独或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起用来脱浆织物(包括含棉织物)。AmyE多肽还可用于在靛蓝染色的粗斜棉布织物和衣服上产生石洗外观的组合物和方法中。为生产衣服，织物可以剪裁并缝纫成衣服或衣物，之后对其进行整理(finish)。特别是，为生产粗斜棉布牛仔服(denim jeans)，已研发了不同的酶促整理方法。粗斜棉布衣服的整理通常始于酶促脱浆步骤，在此期间淀粉分解酶作用于衣服，以使织物柔软，并使该棉布更易于接受随后的酶促整理步骤。AmyE多肽可用于整理粗斜棉布衣服(例如“生物打磨法(bio-stoning)”)、酶促脱浆及为织物提供柔软度和/或整理方法中。
5.7.用于烘焙和食物制备的组合物和方法
可以在用于烘焙和食物制备的组合物和方法中使用AmyE多肽。对于面粉在烘焙和食品生产中的商用和家用而言，重要的是维持面粉中适当水平的α-淀粉酶活性。太高的活性水平可能产生粘性和/或面团似的滞销产品。相反，α-淀粉酶活性不足的面粉可能不含足够的糖用于正常酵母功能，导致干的易碎的面包。因此，可以将AmyE多肽单独或与其他一种或多种α-淀粉酶组合加入面粉来增加面粉中内源性α-淀粉酶活性的水平。如本文所述，AmyE多肽具有30-90℃、50-80℃、55-75℃或甚至60-70℃范围内的最适温度，这使得它们非常适合烘焙和食物制备应用。可以例如在1％的可溶淀粉溶液中于pH 5.5下，或使用本文描述或本领域已知的其他方法测量不同AmyE变体的最适温度。
除了在烘焙中使用谷粒及其他植物产品外，诸如大麦、燕麦、小麦的谷粒以及诸如玉米、啤酒花和稻的植物成分还应用于商业酿造以及家庭酿造二者。酿造中所用的成分可以是未制芽或是制芽的(malted)，这意味着部分发芽，从而导致包括α-淀粉酶在内的酶水平增加。为成功酿造，充足水平的α-淀粉酶酶活性是必要的，以确保有适当水平的糖进行发酵。可以将AmyE多肽单独或与其他一种或多种α-淀粉酶组合加入麦芽汁或醪液中，以改善淀粉转化。如本文其他地方所述，AmyE多肽显示葡糖淀粉酶活性，这允许在不使用其他葡糖淀粉酶，或使用降低量(与使用其他α-淀粉酶所需的量相比)的葡糖淀粉酶的情况下，从含淀粉谷粒产生葡萄糖。
还可单独地或与其他淀粉酶组合添加AmyE多肽以防止或延缓陈化(即烘焙产品的面包心固化)。用于抗陈化淀粉酶的AmyE多肽的量一般可在每公斤面粉0.01-10mg酶蛋白质的范围内，例如1-10mg/kg。可与AmyE多肽组合使用的其他抗陈化淀粉酶包括内切淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属的细菌内切淀粉酶。其他淀粉酶还可以是产麦芽糖α-淀粉酶(EC3.2.1.133)，例如来自芽孢杆菌属。
Figure BDA0000045914770001061
是来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的适宜的产麦芽糖α-淀粉酶，并描述于Christophersen等(1997)Starch，50：39-45中。抗陈化内切淀粉酶的其他实例包括衍生自芽孢杆菌属，如地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶，以及外切淀粉酶，如β-淀粉酶，例如来自植物来源(如大豆)或来自微生物来源(如芽孢杆菌属)。
含有AmyE多肽的烘焙组合物还可以包含磷脂酶。磷脂酶可具有A1或A2活性，以从磷脂中移去脂肪酸，形成溶血磷脂。磷脂酶可以具有或不具有脂肪酶活性，即对甘油三酸酯的活性。它通常具有30-90℃(例如30-70℃)范围内的最适温度。所添加的磷脂酶可以是动物来源的，例如来自胰腺(例如牛或猪胰腺)、蛇毒液或蜂毒液。备选地，磷脂酶可以是微生物来源的，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如来自如下属或种：曲霉属，黑曲霉；网柄菌属(Dictyostelium)，盘基网柄菌(D.discoideum)；毛霉属(Mucor)，爪哇毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)、细孢毛霉(M.subtilissimus)；脉孢霉属(Neurospora)，粗糙脉孢霉(N.crassa)；根毛霉属(Rhizomucor)，微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)，少根根霉(R.arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)、匐枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)，大豆核盘菌(S.libertiana)；发癣菌属(Trichophyton)，红色发癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，W.sclerotiorum；芽孢杆菌属，巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；柠檬酸细菌属，弗氏柠檬酸细菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)，迟钝爱德华氏菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，大肠杆菌；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形杆菌属(Proteus)，普通变形杆菌(P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属(Salmonella)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，弗氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属，紫红链霉菌(S.violeceoruber)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)；镰孢霉属，尖镰孢(例如菌株DSM 2672)。
以在烘焙后的初始阶段，特别是头24个小时改善面包柔软度的量添加磷脂酶。磷脂酶的量通常在每公斤面粉0.01-10mg酶蛋白质的范围内，例如0.1-5mg/kg。磷脂酶活性一般在每公斤面粉20-1,000脂肪酶单位(LU)的范围内，其中脂肪酶单位定义为用阿拉伯树胶为乳化剂、三丁酸甘油酯为底物，在30℃、pH 7.0下，每分钟释放1μmol丁酸所需的酶量。
面团(dough)的组合物通常包含小麦面或小麦粉和/或其他类型的面、粉或淀粉，如玉米粉、玉米淀粉、黑麦面、黑麦粉、燕麦粉、燕麦面、大豆粉、高粱面、高粱粉、马铃薯面、马铃薯粉或马铃薯淀粉。面团可以是新鲜的、冷冻的或是部分烘焙的。面团可以是发酵的面团或待进行发酵的面团。面团可以以多种方式进行发酵，例如通过添加化学发酵剂(例如小苏打)或通过添加起子(即发酵面团)。例如，面团还可通过添加适宜的酵母培养物(例如酿酒酵母(面包酵母)培养物，例如市售酿酒酵母菌株)来发酵。
面团还可以包含其他常规面团成分，例如蛋白质，如奶粉、面筋和大豆；蛋(全蛋、蛋黄或蛋清)；氧化剂，如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮双甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸，如L-半胱氨酸；糖；盐，如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。面团还可以包含脂肪(例如甘油三酸酯)如颗粒状脂肪或起酥油，和/或乳化剂，如甘油单酸酯或甘油二酸酯、甘油单酸酯或甘油二酸酯的双乙酰基酒石酸酯、脂肪酸的糖脂、脂肪酸的聚甘油酯、甘油单酸酯的乳酸酯、甘油单酸酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯(polyoxyetliylene stearates)或溶血卵磷脂。还可以不加入乳化剂制备面团。
可选地，可与抗陈化淀粉酶和磷脂酶一起使用其他酶。其他酶可以是第二(即其他)淀粉酶，如淀粉葡糖苷酶、β-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶；肽酶，特别是外肽酶；转谷氨酰胺酶；脂肪酶；纤维素酶；半纤维素酶，特别是戊聚糖酶，如木聚糖酶；蛋白酶；蛋白质二硫键异构酶，例如WO 95/00636中所述的蛋白质二硫键异构酶；糖基转移酶；分支酶(1，4-α-葡聚糖分支酶)；4-a-葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)；或氧化还原酶，例如过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂加氧酶、L-氨基酸氧化酶或糖氧化酶。其他酶可以是任何来源的，包括哺乳动物和植物来源，尤其是微生物(细菌、酵母或真菌)来源，并可通过本领域常规使用的技术获得。
木聚糖酶通常是微生物来源的，例如源自细菌或真菌，如曲霉属菌株，特别是棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉(例如WO 91/19782)、泡盛曲霉(例如WO 91/18977)或塔宾曲霉(例如WO 92/01793)；源自木霉属菌株，例如里氏木霉；或源自腐质霉属菌株，例如特异腐质霉(例如WO92/17573)。
Figure BDA0000045914770001081
和
Figure BDA0000045914770001082
是市售的由里氏木霉产生的木聚糖酶制剂。淀粉葡糖苷酶可以是黑曲霉淀粉葡糖苷酶(如
Figure BDA0000045914770001083
)。其他有用的淀粉酶产品包括
Figure BDA0000045914770001084
A 1000或A 5000(可从Grindsted Products，丹麦获得)，以及
Figure BDA0000045914770001085
H或P(可从Gist-Brocades，荷兰获得)。葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，特别是黑曲霉葡萄糖氧化酶(如
Figure BDA0000045914770001087
)。示例性蛋白酶有
Figure BDA0000045914770001088
示例性脂肪酶可源自嗜热丝孢菌属(腐质霉属)、根毛霉属、假丝酵母菌属(Candida)、曲霉属、根霉属或假单胞菌属的菌株，特别是来自疏棉状嗜热丝孢菌(疏毛腐质霉)、米黑根毛霉、南极洲假丝酵母(Candida antarctica)、黑曲霉、德氏根霉(Rhizopus delemar)或少根根霉或洋葱假单胞菌。脂肪酶可以是如WO 88/02775中所述源自南极洲假丝酵母的脂肪酶A或脂肪酶B，或者脂肪酶可以如EP 238,023中所述源自米黑根毛霉，或如EP 305,216中所述源自疏毛腐质霉，或如EP 214,761和WO 89/01032中所述源自洋葱假单胞菌。
含有AmyE多肽的酶制剂可以可选地为颗粒或团聚的粉末的形式。制剂可以具有窄的粒径分布，95％(以重量计)以上的颗粒处于25-500μm的范围内。颗粒和团聚的粉末可通过常规方法制备，例如通过在流化床制粒机中向载体上喷AmyE多肽。载体可包括具有适宜粒径的粒核。载体可以是可溶或不可溶的，例如盐(如NaCl或硫酸钠)、糖(如蔗糖或乳糖)、糖醇(如山梨糖醇)、淀粉、稻、玉米渣或大豆。
还可以用食品级脂质囊化含有AmyE多肽的颗粒，食品级脂质可以是任何天然的不溶于水但溶于非极性有机溶剂如烃或乙醚的有机化合物。适宜的食品级脂质包括但不限于饱和或不饱和的脂肪或油形式的甘油三酸酯。构成饱和甘油三酸酯的脂肪酸及其组合的实例包括但不限于丁酸(来源于乳脂肪)、棕榈酸(来源于动物及植物脂肪)和/或硬脂酸(来源于动物及植物脂肪)。构成不饱和甘油三酸酯的脂肪酸及其组合的实例包括但不限于棕榈油酸(来源于动物及植物脂肪)、油酸(来源于动物及植物脂肪)、亚油酸(来源于植物油)和/或亚麻酸(来源于亚麻子油)。其他适宜的食品级脂质包括但不限于衍生自上文所讨论的甘油三酸酯的甘油单酯和甘油二酯、磷脂及糖酯。
将尤其是液体形式的食品级脂质与粉末形式的AmyE多肽以这样的方式接触，使得脂质物质覆盖(包封)至少大多数(例如100％)AmyE多肽颗粒的至少一部分表面。包封AmyE多肽颗粒的优势有两层。首先，对热不稳定性酶而言，食品级脂质在烘焙过程中保护酶免受热变性。结果，虽说AmyE多肽在醒发和烘焙阶段被稳定化和受保护，但其在最终的烘焙产品中从保护性包膜中释放出来，在这里水解多聚葡聚糖中的糖苷键。包载的递送载体也确保向烘焙品持续释放活性酶。也就是说，继烘焙过程之后，活性AmyE多肽从保护性包膜中持续释放，其释放速率抵消并因此减小陈化的速率。
一般而言，向AmyE多肽颗粒使用的脂质的量可从α-淀粉酶总重的几个百分点到该重量的许多倍进行变动，这取决于脂质的性质、向颗粒使用脂质的方式、待处理面团混合物的组成、以及所涉及的面团混合操作的强度。
以有效延长烘焙商品保存限期的量向用于制备烘焙商品的成分中添加脂质包封的酶。面点师可以计算实现期望的抗陈化效果所需的按上文所讨论制备的包封α-淀粉酶的量。所需的包封α-淀粉酶的量基于所包封的酶的浓度，以及α-淀粉酶与指定面粉的比例来计算。虽然已发现广范围的浓度有效，但是正如已经讨论过的那样，抗陈化方面的可见改善与α-淀粉酶浓度并不线性相关，而是超过一定的最低水平后，α-淀粉酶浓度的大幅增加仅产生很小的额外改善。在特定烘焙生产中实际应用的α-淀粉酶浓度可能比最低需要量高得多，以便向面点师提供一定的保障以对抗因其无意低估引起的错误。酶浓度的下限由面点师希望达到的最低抗陈化效果决定。
制备烘焙品的方法可以包括：(a)制备脂质包被的AmyE多肽颗粒，其中基本上100％的颗粒被包被；(b)混合含面粉的面团；(c)在完成混合之前向面团中添加脂质包被的α-淀粉酶，并在脂质包衣从α-淀粉酶上去掉之前终止混合；(d)醒发面团；和(e)烘焙面团以提供烘焙品，其中α-淀粉酶在混合、醒发和烘焙阶段无活性，而在烘焙品中有活性。可在混合周期(例如接近混合周期结束的时候)中向面团中添加包封的AmyE多肽，以允许充分地遍及整个面团分布；但是，混合阶段在保护性包膜从颗粒剥落之前终止。
在一些情况下，可将细菌α-淀粉酶(BAA)加入包含AmyE多肽的脂质包被颗粒。BAA使面包缩小成为粘团，这是由于其在充分烘焙的面包块中具有过度的热稳定性和保留活性；然而，当在脂质包被的颗粒中掺入BAA时，可以获得相当大的附加抗陈化保护作用，即便在非常低的BAA剂量水平也是如此。
可以对该组合物和方法作出多种修改和变动。本文引用的所有参考文献为了所有目的以其整体引入作为参考。
实施例
在前面的描述和后面的实施例中，使用以下缩写：wt％(重量百分数)；℃(摄氏度)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μL和μl(微升)；mL和ml(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；DO(溶解的氧)；W/V(重量对体积)；W/W(重量对重量)；V/V(体积对体积)；IKA(IKA Works Inc.2635 North ChaseParkway SE，Wilmington，NC)；Genencor(Danisco US Inc，GenencorDivision，Palo Alto，CA)；Ncm(牛顿厘米(Newton centimeter))和ETOH(乙醇)；eq(等同物)；N(正常)；ds或DS(干固体含量)；SAPU(分光光度计测量的酸性蛋白酶单位，其中1SAPU是在测定条件下每分钟从酪蛋白底物释放1微摩尔酪氨酸的蛋白酶酶活性量)和GAU(葡糖淀粉酶单位，其定义为在pH 4.2和60℃下，每小时从可溶淀粉底物产生1g按葡萄糖计算的还原糖的酶量)。
实施例1
质粒构建和蛋白质表达
以下一般方法用于进行质粒构建和蛋白质表达。
1.1.质粒构建
将编码SEQ ID NO：1的AmyE或C端截短AmyE变体AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的核酸克隆入美国专利号5,024,943中所述的枯草芽孢杆菌pHPLT表达载体。图2显示包含编码AmyE-tr的核酸的载体。
pHPLT载体包含地衣芽孢杆菌LAT启动子(“Plat”)，编码LAT信号肽(“preLAT”)的序列，其后为用于克隆的PstI和HpaI限制位点。“ori-pUB”是来自pUB110的复制起点；“reppUB”是来自pUB110的复制酶基因；“neo”是来自pUB110的新霉素/卡那霉素抗性基因；“bleo”是博来霉素抗性标记；“Tlat”是来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的转录终止子。质粒pUB110的这些及其他特征描述于McKenzie等，Plasmid 15(2)：93-103(1986)中。
用Yang等，“Nucleotide sequence of the amylase gene from Bacillussubtilis，”Nucl.Acids Res.11(2)：237-49(1983)所述的AmyE编码序列组装用于表达AmyE和AmyE-tr的质粒构建体。质粒pME629.5包含编码SEQID NO：1的全长AmyE的核酸。与Yang等所描述的序列相比，该基因在编码淀粉结合结构域的序列中具有三个碱基缺失。
显示于图2中的质粒pME630.7包含截短AmyE序列(即AmyE-tr)。在SEQ ID NO：1的位置D425处截短AmyE-tr。如Fujimoto等，“Crystalstructure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from Bacillus subtiliscomplexed with maltopentaose，”J.Mol.Biol.277：393-407(1998)中所述，AmyE-tr是基于缺乏淀粉结构域的AmyE变体的晶体结构设计的。还见RCSB Protein Data
Figure BDA0000045914770001121
检索号1BAG，“Alpha-Amylase From BacillusSubtilis Complexed With Maltopentaose.”
为了构建表达质粒，用
Figure BDA0000045914770001122
(Stratagene，La Jolla，CA，USA)PCR扩增编码AmyE多肽的核酸，用Qiagen QIAQUIKTM PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)中提供的柱纯化，并重悬在50μLMilli-QTM纯化的水中。顺次用HpaI(Roche)和PstI(Roche)消化50μL纯化的DNA，将产生的DNA片段重悬在30μL Milli-QTM纯化的水中。用PstI和HpaI克隆位点将10-20ng/μl DNA克隆入质粒pHPLT。直接将连接混合物转化进入感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，degUHy32oppA，ΔspoIIE3501，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)。这些枯草芽孢杆菌细胞具有置于木糖诱导型启动子控制下的感受态基因(comK)。通过加入木糖诱导DNA结合和摄取的感受态。因为亲本质粒中的amyE基因具有两个PstI位点，所以进行了PCR融合反应来在克隆前去除这些位点。在两个分开的PCR反应之后进行PCR融合。以下引物用于通过HpaI和PstI位点制备pHPLT构建体：
SEQ ID NO：10：引物PSTAMYE-F′
5′-CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC-3′
SEQ ID NO：11：引物AMYENOPST-R′
5′-CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTG-GAACTCTGCTGATGTATTTGTG-3′
SEQ ID NO：12：引物AMYENOPST-F′
5′-CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAA-TCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG-3′
SEQ ID NO：13：引物HPAIAMYE-R′
5′-CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGA-GAACCGCTTAAGCCCGAGTC-3′
SEQ ID NO：14：引物HPAIAMYE-R′
5′-CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAA-AGCACAGCTACAGACCTGG-3′
SEQ ID NO：15：引物AMYE SEQ-F′
5′-TACACAAGTACAGTCCTATCTG-3′
SEQ ID NO：16：引物AMYE SEQ-F′
5′-CATCCTCTGTCTCTATCAATAC-3′
质粒pME629.5和pME630.7表达带有31个残基的信号序列的AmyE，该信号序列在翻译后被切除。随后的10个N端氨基酸按Yang等(1983)所提出的那样分开加工。pME629.5编码“全长”AmyE，而pME630.7编码“截短”AmyE。
1.2.蛋白质表达
在含10μg/ml新霉素、1％不可溶淀粉的Luria琼脂(LA)上选择并在37℃下过夜孵育含有编码AmyE全长和截短多肽的构建体的细菌转化体。选择菌落周围显示通明(或晕圈)的转化体进行进一步研究。将每个转化体的预培养物在含有10μg/ml新霉素的LB中培养8小时。将30μl的每种预培养物加入装有30mL补充了10μg/ml新霉素和5mM CaCl2的培养基(下文所述)的250mL瓶中。该培养基是基于MOP缓冲液的富集半确定成分培养基，以尿素为主要的氮源、葡萄糖为主要的碳源，并为使细胞旺盛生长而补充1％的大豆胨(soytone)。将摇瓶在37℃、250转/分混合下孵育60-65小时。通过在锥形管中于5,000转/分离心20分钟收集培养物。由于AmyE全长和AmyE截短蛋白质都以高水平表达，所以将培养物上清用于随后的测定而不进一步纯化。
实施例2
常见测定
在下文所述的实施例中使用以下测定。从所提供的方案的变动在单个实施例中指出。在这些实验中，在反应完成后用分光光度计测量所形成的产物的吸光度。
2.1.淀粉酶活性测定
通过分光光度计测量淀粉酶活性。将与Remazol Brilliant Blue R标记共价连接的不可溶玉米淀粉(“RBB-玉米淀粉”，Sigma S7776)用作底物。将72μL在50mM乙酸钠，pH4.5、5.0或5.6中的2％(wt ds)RBB-玉米淀粉浆加入10μL 100μg/mL的酶中并充分混合。然后在50℃下孵育混合物30分钟。然后将样品放置在冰上，并通过用台式离心机在4,100转/分离心20分钟去除底物。通过测量从淀粉释放的蓝色染料的量来测定产物的量。于595nm重复测量染料的光密度(OD)三次。
2.2.粘度测量测定
用粘度计于pH 4.5和5.8在淀粉酶的存在下测量玉米淀粉底物的粘度。用硫酸将pH降低至4.5或5.8，新鲜制备一批30％ds的玉米淀粉底物。对每一反应，称量出50g浆液(15g ds)并加热10分钟至70℃。加入α-淀粉酶后，立即将温度从70℃提高到85℃，并以75转/分搅拌反应物。一旦浆液和酶的混合物温度达到85℃，即监测粘度额外的30分钟。
2.3.测量热稳定性的差示扫描量热法(DSC)
在存在或不存在2mM氯化钙的情况下，用超灵敏扫描高流通量微热量计(VP-Capillary DSC；MicroCal，Inc.，Northampton，MA，USA)测量AmyE或其变体的过量热容量功能。在30-120℃温度范围内扫描了约500μL 0.5mg/mL的AmyE或其变体。将截短嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)用作对照。包含34个氨基酸的信号序列的AmyS氨基酸序列显示于SEQ ID NO：4中。然后重新扫描同一样品以检验该过程的可逆性。所使用的缓冲液是10mM乙酸钠，pH 5.5。使用200℃/小时的扫描速率以最小化聚集引起的任意假象。将DSC曲线的热中点(Tm)用作热稳定性的指示。所有Tm测量结果中的标准误差均小于1％。
2.4.96孔微量滴定板中的Bradford测定
用Bradford QUICKSTARTTM Dye Reagent(BioRad，Hercules，CA，USA)测定样品上清中的蛋白质浓度。通过过滤来自在37℃、280转/分和湿润通气下在微量滴定板(MTP)中培养3天的培养物的培养基获得样品。将10μL培养物滤液与200μL Bradford QUICKSTART TM Dye Reagent在第二MTP的孔内组合。充分混合后，将MTP于室温下孵育至少10分钟。去除气泡，并在595nm测量OD(光密度)。为了测定蛋白质浓度，从样品读数扣除背景读数(来自未接种的孔)。
2.5.通过HPLC测量的葡萄糖形成
麦芽糖和麦芽七糖的水解
按每一实验的具体情况，在50mM乙酸钠pH 4.5或5.6中，或在50mM苹果酸pH 5.6中配制0.5％的麦芽糖或麦芽七糖溶液。最初将所有酶样品稀释至1mg/mL。通过用适当的底物溶液稀释酶以产生1ppm的酶终浓度来制备反应混合物，然后将200μL等份试样转移至无菌螺口管并放置在37℃的温箱中。在所示的时间通过10倍稀释于10mM氢氧化钠中终止反应。
不可溶淀粉的水解
为了测量不可溶颗粒淀粉的水解，将纯化的AmyE或其变体(24.5g/L)在苹果酸缓冲液pH 5.6中稀释至20.4ppm的终浓度。然后将蛋白质加入配制在苹果酸缓冲液pH 5.6中的5％玉米粉溶液至终浓度为1ppm，然后于32℃在摇床中孵育混合物。定时取出样品并10倍稀释于50mM NaOH中淬灭反应。
HPLC检测方法
使用装配有Dionex PA-1柱和电化学检测器的Agilent 1100LC系统，通过HPLC分析葡萄糖及底物的其他降解产物的形成。在25℃下注入10μL样品并按1.0mL/分施加NaOH和乙酸钠的梯度。从之前运行的标准品测定糖的分布。获得45分钟的洗脱图。用经验证的葡萄糖参考标准(Sigma，MO，USA)将糖的峰面积转化为实际的糖浓度来获得所产生的葡萄糖的量化(报告为g/L)。
2.6.使用麦芽糖和麦芽七糖底物的葡萄糖形成
通过HPLC测定麦芽糖或麦芽七糖降解为葡萄糖。在pH 4.5和pH 5.6的50nM乙酸钠缓冲液中配制0.5％的麦芽糖和麦芽七糖溶液。将酶样品从纯化的贮液稀释至1mg/mL。进一步将1mg/mL的酶样品稀释于麦芽糖溶液中，以产生1μg/mL的酶终浓度。然后将200μL等份试样加入无菌螺口管，并放置在37℃温箱中。2、5和8天后通过加入氢氧化钠终止反应。使用实施例2.5中所述的方法，通过HPLC针对验证的标准分析葡萄糖的形成和麦芽糖的降解。
2.7三重测定
分开进行标准总还原糖类、葡萄糖和碘的测定来表征支链淀粉消化的产物。通过伴随搅拌煮沸混合物30分钟，然后冷却至室温，在55mM乙酸钠缓冲液pH 5.8中配制2.2％(w/w)的玉米支链淀粉底物。将100μl底物放置在96孔中结合力聚苯乙烯介质(medium binding polystyrene)的微量滴定板的孔中，并向其中加入10μl稀释的AmyE变体培养物上清。密封(Nunc，目录号236366)平板，并立即放置在iEMS振荡温箱中，并在50℃、1150转/分下孵育10分钟。通过加入20μl 0.5N NaOH并混合来终止淀粉酶反应。
通过将20μl 5％w/v 4-羟基苯酰肼(Sigma H9882，配制在0.5N HCl中)在全裙(full skirt)PCR板(Axygen PCR-96-FS-C)中与80μl 0.5NNaOH混合，然后与20μl淀粉酶反应物混合来测定存在的总还原糖类。密封(Microseal B粘性密封物，BioRad MSB-1001)平板，并在PCR式热循环加热块上于95℃孵育2小时，然后立即冷却至25℃。将80μl反应样品转移至聚苯乙烯96孔微量滴定板，并用Spectramax酶标仪在440nm测量光密度。
通过将20μl反应样品与50μl含0.005％v/v Tween 80的50mM磷酸钾缓冲液pH 6.8中的5.8mg/ml 2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(Sigma，A1888)混合，然后加入30μl配制在相同缓冲液中的含0.33U/ml来自辣根VI型(Sigma，P8375)的过氧化物酶、3.33U/ml OxyGo(葡萄糖氧化酶，Genencor)的溶液，在微量滴定板中测定淀粉酶反应物中存在的总葡萄糖。立即将微量滴定板放置在Spectramax酶标仪中，振荡5秒，并以9秒的间隔在405nm监测光密度为期60-180秒。
通过将淀粉酶反应样品的1∶4稀释液(在水中)与80μl 1∶20稀释于水中的Lugols试剂(5g碘，10g碘化钾溶解在100ml水中)在聚苯乙烯微量滴定板中混合来进行淀粉酶反应物的碘分析。用Spectramax酶标仪在580nm测定光密度。用Microsoft Excel汇总从Softmax Pro软件(酶标仪)获得的数据。
碘的结果报告为总OD580；链长/残留直链淀粉是总OD的函数，因此，淀粉酶活性与总OD成反比。总还原糖类报告为总OD440，且与OD成比例，因此，淀粉酶活性与OD成正比。总葡萄糖报告为葡萄糖测定中的动态速率且成正比。在转化为已知量的地方，用从葡萄糖构建的标准曲线报告OD和速率。用原始数据报告速率，因此其是无单位的。用图表将三种类型的数据组合为碘除以总还原糖类与葡萄糖之比的比率。
2.8用于粘度降低速率测定的高流通量粘度测量法测定
用市售分子转子CCVJ(9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)久洛尼定(julolidine))发展了高流通量粘度测定。分子转子是量子产量(所发射的光子数除以所吸收的光子数)依赖于微环境自由体积的荧光类别，微环境的自由体积反过来与粘度相关。对于此类分子，分子内旋转是从激发态弛豫的优选方式。分子内旋转以与微环境粘度、通过辐射弛豫(荧光发射)消耗的能量的平衡成比例的方式被抑制。
为了测量酶活性引起的粘度降低速率，按如下将分子转子CCVJ掺入玉米支链淀粉的缓冲悬液。通过将186μl二甲基亚砜加入含有5mg冷冻干燥的CCVJ(Sigma Aldrich Corporation，St.Louis，MO)的管中来配制100mM的CCVJ贮液。CCVJ贮液在室温下避光保存，并在使用前检查有无沉淀。将90g来自玉米的支链淀粉(MP Biomedicals LLC，Solon，OH)加入2,850mL蒸馏水中。伴随不断搅拌将其加热至沸腾，支链淀粉在该条件下逐渐糊化和溶解。将产生的粘性均一的胶状支链淀粉悬液从热源移出，并继续搅拌至其回到室温，此时加入150mL 1M乙酸钠缓冲液pH 5.8(预先通过用1摩尔的乙酸滴定1摩尔的乙酸钠配制)，然后加入150μlTween-80(Sigma Aldrich Corporation，St.Louis，MO)。Tween-80完全溶解时，加入150μl 100mM CCVJ贮液并使其溶解，此时支链淀粉/CCBJ试剂配制完成并准备使用。在完成粘度测定法筛选所耗费的三天中将该试剂伴随不断搅拌于室温下保存在透明玻璃瓶中。
对于该测定，所有液体处理任务均由Biomek FXP机器人执行，其配备有能够同时吸移96孔微量滴定板的全部96个孔的多通道头。向黑色的未处理的聚苯乙烯96孔微量滴定板(Corning Incorporated，Corning，NY)的每个孔中加入60μl支链淀粉/CCVJ试剂。在其顶部加入30μl酶样品，并立即在Spectramax M2e荧光光度计(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)上对微量滴定板进行读数，该荧光光度计按如下设置：顶部读取荧光模式；激发波长435纳米(nm)；发射波长495nm；截止波长455nm；具有24秒读取间隔的动态读取模式；起始读取前振荡15秒，读取间振荡3秒；具有20秒停滞期(从每一动态速率消除计算所收集的9个数据点的第一个)的192秒总读取时间。
在此测定中，根据荧光信号下降速率来测量粘度降低速率。SoftmaxPro(随Spectramax仪器提供的软件)自动将荧光信号降低的动态速率计算为“Vmax(毫单位/分钟)”。
2.9用于液化后粘度测定的高流通量粘度测量法测定
为了测量酶活性引起的液化后粘度的降低，按如下将分子转子CCVJ掺入玉米粉的缓冲浆液。通过将186μl二甲基亚砜加入含有5mg冷冻干燥的CCVJ(Sigma Aldrich Corporation，St.Louis，MO)的管中来配制100mM的CCVJ贮液。CCVJ贮液在室温下避光保存，并在使用前检查有无沉淀。使有机玉米粉(Azure Farm，Dufur，OR)穿过600微米的筛子，然后在95℃下烘焙16小时并回到室温。通过组合1520g蒸馏水、80mL 1M乙酸钠缓冲液pH 5.6(预先通过用l摩尔的乙酸滴定1摩尔的乙酸钠配制)、80μl Tween-80(Sigma Aldrich Corporation，St.Louis，MO)、80μl100mMCCVJ贮液和400g筛过的有机玉米粉，按2kg的批次配制20％(重量/重量)、pH 5.8的玉米粉浆液。用磁力搅拌棒剧烈地和不断地搅拌浆液半小时，此时检验pH并确认其为5.8。剧烈地和不断地搅拌浆液以保持玉米粉均一地分散，同时用带有200μl吸头的多通道移液器将90μl浆液加入黑色的未处理的聚苯乙烯96孔微量滴定板(Corning Incorporated，Corning，NY)的每个孔中，该200μl吸头修剪至通过游标卡尺(MitutoyoCorporation，Kure，Hiroshima，日本)测定内径约为2.3毫米。对于每个微量滴定板孔，吸取10μl酶样品至玉米粉浆液顶部，然后用粘性密封物(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)密封平板，并牢固地夹在预先在设置为80℃的高温烤箱中预平衡的金属板之间。将平板孵育1小时，然后移出至室温，并在室温下过夜放置。第二天，去除平板密封物，在按如下设置的Spectramax M2e荧光光度计(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)上读数：顶部读取荧光模式；激发波长435纳米(nm)；发射波长495nm；截止波长455nm。在此测定中，荧光信号的降低对应于糊化玉米粉密度的降低，其反过来对应于酶活性引起的液化的提高。
实施例3
比活和最适pH
用实施例2.1中所述的测定来测量全长AmyE(SEQ ID NO：1)、AmyE-tr(SEQ ID NO：2)及其变体的比活和最适pH。在50℃和pH 4.5、5.0及5.6下通过分光光度计测定30分钟内从RBB-玉米淀粉底物释放的染料量来测定比活。图3显示，与pH 5或5.6相比，AmyE-tr和Amy31A在pH 4.5下具有最高的比活。AmyE在pH 5下显示比pH 5.6下高的比活。
实施例4
玉米淀粉底物的粘度降低
用实施例2.2中所述的测定方法来测定AmyE、AmyE-tr及其变体降低玉米淀粉底物粘度的能力。对每种酶，在pH 4.5和5.8下将粘度测量为时间的函数。图4A和4B分别显示，AmyE-tr和AmyE在pH 4.5和5.8下都降低底物粘度。最大粘度相同，但在pH 5.8下观察到较低的最终粘度。图4C和4D分别显示，Amy31A在pH 4.5下比在pH 5.8下具有更好的性能。
实施例5
热稳定性
使用实施例2.3中所述的差示扫描量热法(DSC)，在存在和不存在Ca2+的情况下测量AmyE、AmyE-tr及其变体的热稳定性，以确定Ca2+是否促进酶的稳定性。DSC揭示，热解折叠(thermal unfolding)过程是可逆的。图5A显示AmyE和AmyE-tr在有和无2mM Ca2+的情况下的DSC解折叠曲线。图5B显示全长Amy31A变体的解折叠曲线。钙对热熔点无任何影响，这表明AmyE、AmyE-tr或Amy31A都不结合Ca2+或被mM浓度范围内的钙稳定化。如图5C中所示，对嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)获得了相反的结果。表1总结了所测试的酶的熔解温度。Ca2+的添加不显著改变AmyE、AmyE-tr或Amy31A的热稳定性，但Ca2+显著提高AmyS的稳定性。
表1.DSC Tm测量结果总结
实施例6
麦芽糖和麦芽七糖转化为葡萄糖
使用实施例2.3中所述的葡萄糖形成测定，在pH 5.6下测试了AmyE-tr(SEQ ID NO：2)和AmyE-tr位置Q153的6个AmyE变体(C、F、I、K、N和V)将麦芽糖和麦芽七糖转化为葡萄糖的能力。1、2和3天后测量产生的葡萄糖。按1ppm使用AmyE-tr和AmyE变体。以相似的剂量使用截短AmyS(SEQ ID NO：4)用于比较。
图6显示从麦芽糖底物产生葡萄糖的结果。AmyS的葡萄糖产生最少，而AmyE-tr和Q153位置变体产生显著量的葡萄糖。在这些条件下，变体Q153N是最佳的葡萄糖产生者。这些结果确认了AmyE和AmyE变体有效地从麦芽糖产生葡萄糖。
图7显示从麦芽七糖底物产生葡萄糖的结果。如以麦芽糖为底物的情况，AmyS以低效率将麦芽七糖转化为葡萄糖。相反，AmyE-tr和Q153位置变体非常有效地将麦芽七糖转化为葡萄糖，Q153K和F变体在第三天显示最大转化。此实例表明，AmyE和AmyE变体有效地从复合寡糖产生葡萄糖。
实施例7
麦芽七糖转化为葡萄糖
测试了AmyE-tr(SEQ ID NO：2)、AmyS和AmyE变体Q153K将麦芽七糖(DP7)转化为葡萄糖(DP1)的能力。用实施例2.2中所述的HPLC法分析反应产物。代表性洗脱图显示于图8-10中。
图8显示AmyE-tr将DP7主要转化为DP1以及孵育72小时后麦芽糖(DP2)的残留量。相反，图9显示AmyS随时间将DP7转化为较小的寡糖，产生DP5、DP4、DP3、DP2和DP1寡糖的混合物。图10显示DP7在AmyE变体Q153K的存在下转化为较小的寡糖的时程。在少至1小时内检测到了显著水平的DP1、DP2和DP3。在第三小时，Q153K变体主要将DP7转化为DP1。这些结果显示，AmyE及其变体可以有效地从DP7底物产生葡萄糖(DP1)。
实施例8
位置变体的产生和表达
此实施例涉及位置变体文库的产生和表达。
8.1位置文库的产生
将质粒pME630.7(图2，实施例1)用于在AmyE-tr的150个不同氨基酸残基处产生位置文库。表1列出了针对其产生位置文库的每个残基。根据其在SEQ ID NO：2中的位置编号残基。在每个位置上列出的氨基酸是出现在SEQ ID NO：2的AmyE中的残基(即野生型残基)。
表1
Figure BDA0000045914770001221
针对表1列出的150个残基中的每个残基的位置文库大约包含16个氨基酸取代变体。文库由转化的枯草芽孢杆菌细胞组成，该细胞含有编码所述150个位置处的AmyE变体序列的表达质粒。在蛋白质活性评估之前通过DNA测序分析确认每个变体。按下文所述培养单个克隆以获得不同的AmyE变体用于功能表征。
8.2.蛋白质表达
将含有AmyE取代变体的枯草芽孢杆菌转化体于96孔板内在含10μg/ml新霉素的LB(Luria培养基)中培养8小时，并将30μl此预培养物加入装有30mL补充了25ppm氯霉素和5mM CaCl2的培养基(下文所述)的250mL瓶中。将瓶子在37℃下伴随以250转/分不断旋转混合孵育60-65小时。通过在锥形管中以5,000转/分离心20分钟收集培养物。将培养物上清用于进行测定。培养基是基于MOP缓冲液的富集半确定成分培养基，以尿素为主要的氮源、葡萄糖为主要的碳源，并为使细胞旺盛生长而补充1％的大豆胨。
实施例9
测量比活和热稳定性的淀粉水解测定
用淀粉水解测定测量比活和热稳定性来评估AmyE位置变体。还用清洁样片测定测量污渍去除性能来测定了AmyE变体。通过测量对麦芽七糖底物的淀粉酶活性评估了AmyE变体的pH稳定性。通过在热应激之前和之后测量对麦芽三糖底物的淀粉酶活性测定了每种AmyE变体的热稳定性。
9.1.比活和热稳定性的测定
用淀粉水解测定来测量AmyE和AmyE变体的比活和热稳定性。使用近似模拟清洁和谷粒加工中的真实应用的条件。活性定义为通过酶促降解玉米粉产生的还原端。用下文所述的PAHBAH(对羟基苯甲酰肼)测定来测定还原端。稳定性定义为在80℃下的持续活性。
硬件：具有PCR板衔接头的Inheco Variomag Teleshake 95加热振荡器(Hamilton Company，Reno NV)；Thermo Electron Multidrop自动分配器(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)；iEMS温箱(ThermoFisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)；V&P Scientific搅拌盘(stir disc)分配器(VP722B型)；Axygen PCR-96-FS-C全裙PCR板(Axygen Scientific，Inc.，Union City，CA)；四联体热循环仪(MJ Research，Waltham，MA)；
Figure BDA0000045914770001251
FX液体处理仪(Beckman Coulter，Fullerton，CA)。
淀粉水解：将Azure Farms Organic Corn Flour(Norco，CA，USA)过筛以获得＜600微米的级分，在80℃下烘焙4小时，然后使其在室温下过夜平衡。用VP722B单元作为翻粉分配器(powder flip dispenser)，将所制备的干玉米粉递送至Axygen PCR板。测定递送至每个孔的面粉质量为约5mg。向每个孔加入100μl 50mM乙酸钠pH 5.6(为了最终的悬液pH为～5.8)并混合。将AmyE和AmyE变体的培养物上清在稀释缓冲液(水+0.005％Tween-80)中稀释至约20μg/mL。将10μl稀释的上清转移至8分钟和30分钟的反应板，并通过上下抽吸混合一次。将50μl轻矿物油等分试样转移至每个孔。将平板转移至预热至80℃的Inheco单元。在孵育后的多个时间点，通过向每个孔加入10μl 4N NaOH终止淀粉水解反应。通过PAHBAH测定分析淀粉水解反应产物。
PAHBAH测定：向空PCR板(“PAHBAH反应板”)的所有孔加入80μL 0.5N NaOH的等份试样，然后加入20μLPAHBAH试剂(溶解在0.5N HCl中的5％w/v对羟基苯甲酰肼(Sigma # H9882，St.Luois，MO，USA))。通过上下抽吸混合溶液。向PAHBAH反应板的每个孔加入10μL淀粉水解反应上清。密封平板，并放置在编程为95℃下2分钟、然后冷却至20℃的热循环仪中。将产生的PAHBAH反应混合物的80μL样品转移至新平板，并在分光光度计中于405nm测量吸光度。
9.2.污渍去除性能的测定
用CS-28稻淀粉污渍微样片(microswatch)测定AmyE和AmyE变体的污渍去除性能。1/4英寸圆直径的微样片获自CFT Vlaardingen(荷兰)。将两个微样片放置在96孔微量滴定板的每个孔中。
通过用10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％Tween-80的混合物稀释至20x性能测试中所希望的终浓度，在适当的浓度下测试过滤的培养基样品。酶的终浓度为约0.025-0.10ppm。在pH 8和pH 10二者下测量了淀粉酶性能。
向包含微样片的每个板孔中加入190μL(A)含有25mM HEPES(Sigma，H7523)、2mM CaCl2、0.005％Tween-80、pH 8.0的缓冲液，或(B)含有25mM CAPS(Sigma，C2632)、2mM CaCl2、0.005％Tween-80、pH 10.0的缓冲液。向每个孔加入10μL稀释的淀粉酶样品以提供200μL/孔的总体积。用板密封物盖上平板，并在40℃下伴随1,150转/分搅拌放置于iEMS温箱中60分钟。在适当的条件下孵育后，从每个孔取出100μL溶液放入新的微量滴定板，并在分光光度计中于488nm测量吸光度。在测试中还包含“空白对照”，其含有每孔2个微样片和洗涤剂，但不含淀粉酶样品。
CS-28稻淀粉水解性能的计算：针对空白对照值校正所获得的吸光度值。产生的吸光度“AOD488”是淀粉酶活性的量度。对于每个AmyE或AmyE变体，通过用变体的活性除以野生型酶的活性计算性能指数。因此，性能指数表示变体(实际值)和标准AmyE参考酶(理论值)在相同蛋白质浓度下的性能比较。此外，用标准AmyE酶的Langmuir方程的参数计算理论值。
通过性能指数(PI)表征变体与野生型酶的性能差异。大于1的PI(PI＞1)鉴定比标准(例如野生型)更好的变体，而PI为1(PI＝1)鉴定表现得与标准相同的变体。小于1的PI(PI＜1)鉴定表现得比标准差的变体。
9.3.pH稳定性的测定
使用将麦芽七糖用作底物的淀粉酶活性测定来测定AmyE和AmyE变体的pH稳定性。通过用酶偶联的比色动态测定在pH 5.8和pH 4下监测葡萄糖的产生来测量α-淀粉酶活性。酶反应于室温下在平底的聚苯乙烯96孔微量滴定板中进行。对于在pH 5.8下进行的测定，将5μl 5x稀释于0.005％(w/v)Tween-20(水中)中的AmyE或AmyE变体的培养物上清与45μl缓冲液混合，该缓冲液含有乙酸钠、pH 5.8、CaCl2、Tween-20、辣根过氧化物酶(Sigma-Aldrich，目录号8375)和葡萄糖氧化酶(OxyGoTM；Genencor Division，Danisco US Inc.)。最终的50μl体积分别含有50mM、2.6mM、0.005％(w/v)、20U/ml和50U/ml的每种成分。通过加入50μl缓冲液起始反应，之后混合5秒，该缓冲液含有50mM乙酸钠、pH 5.8、5.4mg/ml 2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(Sigma-Aldrich，目录号A1888)和10mM麦芽七糖(Sigma-Aldrich，目录号M7753)。用SpectraMAX 250分光光度计(Molecular Devices，UnionCity，CA)以9秒的间隔在405nm下监测反应中的颜色形成240秒。酶活性报告为120-240秒监测区间的颜色形成速率。对于在pH 4.0下进行的测定，除使用pH 4.0的缓冲液和20μl稀释的AmyE或AmyE变体样品与30μl含过氧化物酶/葡萄糖氧化酶的缓冲液，适当调节成分浓度外，精确重复上文所述的方法。
9.4.热稳定性的测定
通过用酶偶联的比色动态测定监测葡萄糖产生，测定pH 5.8下对麦芽三糖底物的淀粉酶活性来测量AmyE和AmyE变体的热稳定性。此处使用的测定方法与上文所述的使用麦芽七糖底物的方法相同。使用20μl稀释的AmyE或AmyE变体培养物上清样品，在反应的60-180秒区间监测颜色形成。此外，然后将80μl稀释的培养物样品转移至新平板，装上板密封物，并在iEMS装置(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)上于60℃伴随650转/分振荡孵育30分钟。将平板在冰上冷却4分钟，然后按上文所述测定20μl样品对麦芽三糖底物的活性。如之前的测定，对于每个AmyE或AmyE变体，通过用变体的活性除以野生型酶的活性来计算性能指数。性能指数比较变体(实际值)和标准AmyE参考酶(理论值)在相同蛋白质浓度下的性能。
实施例10
AmyE位置变体的相对性能
用实施例9中的方法，将AmyE-tr的相对性能或活性与按实施例6中所述产生的AmyE变体比较。评估了具有6个或更多个成员的总计142种位置变体。
定义：适用以下定义。
性能指数(PI)：变体与亲本蛋白质的性能比
向上突变：PI＞1
中性突变：PI＞0.5
无害突变：PI＞0.05
有害突变：PI≤0.05
完全限制性位置：就蛋白质和活性而言无中性突变
非完全限制性位置：就所测试的特性之一而言具有至少一种中性突变
非限制性位置：就至少一种特性而言具有≥20％的中性突变
表2总结了AmyE-tr和AmyE变体的位点评估筛查的结果。在表2中，列1显示所考查的氨基酸位置。列2显示野生型酶中该位置上的氨基酸。列3显示此研究中所考察的该位置上的变体数。随后的列给出通过所进行的每种测定鉴定的变体数，接着为中性突变的百分比(％)。所测试的特性如下：列4和5(玉米粉ddG)，对玉米粉底物的比活；列6和7(DP3ddG)，pH 5.8下的麦芽三糖水解；列8和9(DP7 pH 4ddG)，pH 4下的麦芽七糖水解；列10和11(DP7 pH 5.8ddG)，pH 5.8下的麦芽七糖水解；列12和13(DP3HS ddG)，使用麦芽三糖水解测定的热稳定性(60℃下30分钟)；列14和15(清洁pH 8ddG)，pH 8下的稻淀粉污渍微样片测定；列16和17(清洁pH 10ddG)，pH 10下的稻淀粉污渍微样片测定。在截短AmyE中所评估的150个位点包含两个完全限制性位置，即75和123。在全长AmyE中所评估的295个位点包含10个完全限制性位置，即75、97、101、102、120、133、137、182、266和306。
Figure BDA0000045914770001291
Figure BDA0000045914770001301
Figure BDA0000045914770001311
Figure BDA0000045914770001321
实施例11
通过AmyE的乙醇形成
在此实施例中，用常规乙醇发酵测定进行实验，以测试截短AmyE在常规乙醇发酵中对Illinois River Energy(IRE)液化产物(liquefact，31％DS)的性能。简言之，配制多个批次的含400ppm尿素的31％DS IllinoisRiver Energy(IRE)液化产物，并用5N H2SO4调节其中一个批次的pH至4.3，其他批次调节至pH 5.8。每瓶(125ml锥形瓶)使用100g底物。按所示剂量加入酶。用0.2ml10％(w/v)Red Star Ethanol Red酵母(在DI水中预水化(prehydrate)～45分钟)接种发酵物。将瓶子在32℃下伴随320转/分搅拌孵育48小时发酵物。通过HPLC分析测量产生的乙醇量。在pH 4.3和pH 5.8下将截短AmyE(SEQ ID NO：2)的性能与
Figure BDA0000045914770001341
Xtra淀粉酶(SEQ ID NO：4)比较。按0.2mg/gDS的剂量加入截短AmyE和
Figure BDA0000045914770001342
Xtra淀粉酶。
如图11中所示，截短AmyE在pH 5.8下产生的最终乙醇产量是12.0％(v/v)。截短AmyE在pH 4.3下产生7.3％(v/v)的最终乙醇产量。
Figure BDA0000045914770001343
Xtra存在下的最终乙醇产量是：pH 4.3下为2.7％(v/v)，pH 5.8下为3.9％(v/v)。
实施例12
通过AmyE和其他α-淀粉酶的乙醇形成的比较
在此实施例中，用实施例11中所述的关于全研磨玉米测定的乙醇发酵进行实验，以比较全长AmyE(SEQ ID NO：1)和截短AmyE(SEQ ID NO：2)在pH 4.3和pH 5.8下将不可溶颗粒(未蒸煮)淀粉水解为乙醇的能力。
使用此测定，将全长和截短AmyE的乙醇形成性能与剂量为1.5SSU/g(一个酶活性单位-SSU可溶淀粉单位等于在pH 4.5和50℃下，每分钟从可溶马铃薯淀粉底物(4％ds)水解释放1mg葡萄糖的还原力)的A.kawachiiα-淀粉酶(AkAA，GC626)和剂量为0.5GAU/g(其中一个葡糖淀粉酶单位(GAU)是在pH 4.2和60℃下，每小时可从可溶淀粉底物(4％ds)产生1μM按葡萄糖计算的还原糖的酶量)的StargenTM 002(在里氏木霉中表达的Aspergillus kawachi α-淀粉酶和来自里氏木霉的葡糖淀粉酶，其协同作用来将颗粒淀粉水解为葡萄糖)比较。美国专利号7,037,704中更详细地描述了SSU和GAU的定义。AmyE全长和截短AmyE都按0.2mg/gDS的剂量加入。
图12显示在pH 4.3和5.8下比较这些酶的性能时观察到并报告为所产生的最终乙醇产量的结果。当在pH 5.8下测试时，全长和截短AmyE都表现得与StargenTM 002非常相似，而在pH 4.3下，全长AmyE实际上超过了所观察到的StargenTM 002的乙醇产量。当在pH 5.8下测试时，截短AmyE表现得与相同pH下测试的StargenTM 002非常相似。相比之下，A.kawachii α-淀粉酶在pH 4.2和pH 5.8下都表现得非常差。
实施例13
通过枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的葡萄糖形成
在此实施例中，用实施例2中所述的葡萄糖形成测定进行实验，以测定枯草芽孢杆菌α-淀粉酶在pH 4.5和5.6下将麦芽糖转化为葡萄糖的能力。2、5和8天后分析反应。
如图13中所示，枯草芽孢杆菌AmyE全长(SEQ ID NO：1)、AmyE截短(SEQ ID NO：2)和变体α-淀粉酶Amy 31A(SEQ ID NO：3)有效地将麦芽糖转化为葡萄糖，而截短嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶AmyS(SEQ ID NO：4)在这些条件下仅显示最小量的葡萄糖形成。
实施例14
AmyE作用于粗淀粉
在此实施例中，进行实验来测定全长AmyE(SEQ ID NO：1)水解不可溶颗粒(未蒸煮)淀粉的能力。用来检测从不可溶淀粉产生的糖的HPLC方法如下。
将纯化的AmyE(24.5g/L)在苹果酸缓冲液pH 5.6中稀释至终浓度为20.4ppm。然后将蛋白质加入苹果酸缓冲液pH 5.6中的5％玉米粉溶液中至终浓度为1ppm。然后将混合物于32℃下在摇床中孵育。定时取出样品并稀释于50mM NaOH中淬灭反应。然后将10μL样品注入能够进行电化学检测的HPLC系统(Agilent 1000)中。在25℃下以梯度NaOH和乙酸钠运行使用PA1柱。从之前运行的标准测定分布。
结果：粗淀粉与1ppm全长AmyE酶孵育导致大量寡糖(DP2、3、4、5、6、7)及葡萄糖(DP1)的时间依赖性释放。通过多个消化时间点的HPLC分析量化这些降解产物的出现。0、30和90分钟的样品的数据显示在图14中。对截短AmyE酶观察到了类似的结果(数据未显示)。
实施例15
全长AmyE中的位置文库
由Geneart(GeneartGmbH，Josef-Engert-strasse 11，D-93053Regensburg，德国)在全长AmyE(SEQ ID NO：1)中的295个位点产生位置文库。表3列出了针对其产生位置文库的每个残基。根据其在SEQ IDNO：1中的位置编码残基。
表3.在全长AmyE中产生的位置文库
Figure BDA0000045914770001371
Figure BDA0000045914770001381
Figure BDA0000045914770001391
Figure BDA0000045914770001401
在全长AmyE和AmyE-tr中都产生了位置27、30、45、52、75、88、89、126、131、167、184、223、238、241、260、307、312、344、380和402上的20个文库。按实施例8中所述培养含有全长AmyE取代变体的枯草芽孢杆菌转化体。将培养物上清用于测定。
实施例16
AmyE变体的性能
使用实施例8和9中所述的方法，将全长AmyE和截短AmyE的相对性能或活性与在全长AmyE和截短AmyE中产生的变体比较。表4总结了AmyE全长变体的位点评估筛查结果，表5总结了AmyE截短变体的位点评估筛查结果。列1显示野生型酶中的氨基酸。列2显示此研究中所考察的该位点上的变体。随后的列显示变体就所测试的特性而言的性能指数值。所测试的特性如下：通过Bradford测定的蛋白质测定(表达)；粘度降低速率(最大粘度)；液化后粘度的降低(最终粘度)；聚合度(碘)；所产生的还原端(还原端)；存在的总葡萄糖(葡萄糖)；pH 5.8下的麦芽七糖水解(DP7pH 5.8)；使用pH 5.8下的麦芽七糖水解的热稳定性(60℃下30分钟)(DP7pH 5.8加热)；pH 4下的麦芽七糖水解(DP7pH 4)；使用麦芽三糖，pH 5.8下水解的热稳定性(60℃下30分钟)(DP3HS)；30分钟的对玉米粉底物的比活(玉米粉30分钟)；pH 8下的稻淀粉污渍微样片测定(清洁pH 8)；和pH 10下的稻淀粉污渍微样片测定(清洁pH 10)。性能指数(PI)定义为变体与亲本蛋白质的性能比。
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Figure BDA0000045914770003421
Figure BDA0000045914770003441
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根据AmyE变体就表2、4和5中所述特性而言的相对性能数据，将AmyE全长和截短位置分类如下：
完全限制性位置：就所测试的任意特性而言无中性突变
非完全限制性位置：就所测试的特性之一而言具有至少一种中性突变
非限制性位置：就至少一种特性而言具有≥20％的中性突变
表6显示截短AmyE变体中的非完全限制性位置和每个位置上的野生型氨基酸残基的同一性，以及就每种特性而言的％中性突变。可以突变所列出的所有位置，以针对所测试的任意特性以希望的方式改变性能。表7显示全长AmyE变体中的非完全限制性位置和每个位置上的野生型氨基酸残基，以及就每种特性而言的％中性突变。同样，可以突变所列出的所有位置，以针对所测试的任意特性以希望的方式改变性能。
表6.截短AmyE中的非完全限制性位置
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表7.全长AmyE中的非完全限制性位置
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Figure BDA0000045914770003701
Figure BDA0000045914770003711
Figure BDA0000045914770003721
Figure BDA0000045914770003731
Figure BDA0000045914770003741
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如可从前面的描述明白，可以在AmyE多肽中突变某些位置来改变一种或多种特性而不实质上负面影响任意一种特性。这些突变共同称为表面特性的可组合突变。此类位置是产生单突变和突变组合的良好候选者，因为它们通常能耐受操作。另一方面，这些位置上的突变赋予所产生的AmyE变体可分辨的特性，这表明它们对酶结构和/或功能是重要的。可以类似地突变其他亲本淀粉酶(包含AmyE之外的α-淀粉酶)中的对应位置。在一些情况下，其他亲本淀粉酶中的对应位置包含不同的氨基酸残基时，可将其突变为包含见于野生型AmyE多肽中的氨基酸残基。这些位置如下：052D、052E、052I、052K、052L、052N、052Q、052R、052V、056D、056E、056I、056K、056L、056N、056Q、056R、056V、089D、089E、089I、089K、089L、089N、089Q、089R、089V、152D、152E、152I、152K、152L、152N、152Q、152R、152V、153D、153E、153I、153K、153L、153N、153Q、153R、153V、201D、201E、201I、201K、201L、201N、201Q、201R、201V、251D、251E、251I、251K、251L、251N、251Q、251R、251V、284D、284E、284I、284K、284L、284N、284Q、284R、284V、297D、297E、297I、297K、297L、297N、297Q、297R、297V、308D、308E、308I、308K、308L、308N、308Q、308R、308V、321D、321E、321I、321K、321L、321N、321Q、321R、321V、328D、328E、328I、328K、328L、328N、328Q、328R、328V、347D、347E、347I、347K、347L、347N、347Q、347R、347V、357D、357E、357I、357K、357L、357N、357Q、357R、357V、359D、359E、359I、359K、359L、359N、359Q、359R、359V、369D、369E、369I、369K、369L、369N、369Q、369R、369V、385D、385E、385I、385K、385L、385N、385Q、385R、385V、388D、388E、388I、388K、388L、388N、388Q、388R、388V、391D、391E、391I、391K、391L、391N、391Q、391R、391V、400D、400E、400I、400K、400L、400N、400Q、400R、400V、416D、416E、416I、416K、416L、416N、416Q、416R和416V。在所有这些位置上的突变就蛋白质和活性二者而言具有＞0.5的PI值，这表明可以突变这些位置而不破坏蛋白质的表达或性能。
实施例17
粘度计中的液化
用HAAKE Viscotester 550仪监测α-淀粉酶的作用引起的玉米粉粘度降低。每天以批次方式新鲜配制具有30％玉米粉干固体的底物浆液。用硫酸将pH调节至5.8。称量出50g浆液(15g干固体)，并伴随搅拌预孵育10分钟来预热至70℃。加入α-淀粉酶后，立即伴随75转/分的转速将温度从70℃升高至85℃。一旦浆液和酶混合物的温度达到85摄氏度，即保持其温度恒定，并监测粘度额外的30分钟。在整个运行中监测粘度并以μNm报告。
按约0.25至1.5mg/50g玉米粉浆液的剂量加入野生型AmyE(全长或截短)及其几种变体并记录粘度。
浆液粘度随时间变化的典型曲线图显示于图15中，其中比较了野生型全长AmyE及AmyE全长变体I100F和W60M。在其他情况下，仅列出最大粘度和最终粘度。野生型全长AmyE及在全长AmyE背景中产生的变体L142F、L142G、L142Q、L142S、L142W、L142Y、A214I、A214V、S245Y、Q126F、Q126L、Q126P、Q126V、S131L和S254I的结果显示于表8和9中。野生型截短AmyE及在截短AmyE背景中产生的变体W60L、W60M、W60N、I100F、I100M、S105M、S105W、G207A、T270A、T270E、T270L、T270N、T270V和T279A的结果显示于表10中。
表8.用截短野生型和变体AmyE获得的最大粘度和最终粘度(玉米粉包F)
  剂量(mg)   最大粘度   最终粘度
  WT   1.40   27300   1490
  L142F   0.60   26100   550
  L142G   0.30   29900   1925
  L142Q   0.30   31400   2800
  L142S   0.25   30000   2495
  L142W   1.40   33000   570
  L142Y   1.20   27800   1940
  A214I   1.40   24700   2330
  A214V   1.40   21700   560
  S245Y   1.40   25800   520
  Q126F   0.70   32300   2540
  Q126L   1.40   30900   400
  Q126P   1.40   25100   480
  Q126V   1.40   28300   520
  S131L   1.40   26100   450
表9.用截短野生型和变体AmyE获得的最大粘度和最终粘度(玉米粉包G)
  剂量(mg)   最大粘度   最终粘度
  WT   0.60   33600   890
  L142F   0.45   28000   700
  L142G   0.30   25300   2620
  L142Q   0.30   26300   4320
  L142S   0.25   31200   11200
  L142Y   0.60   28600   570
  A214I   0.60   25200   780
  Q126F   0.50   32400   2020
  S254I   0.60   32500   1320
表10.用截短野生型和变体AmyE获得的最大粘度和最终粘度(玉米粉包H)
Figure BDA0000045914770003781
可以用许多标准鉴定粘度计测定中改善的性能，即降低的最大粘度、降低的最终粘度或相对于参考(对照)酶所需的量产生相似的最大或最终粘度所需的降低的酶剂量。表8-10中以黑体突出显示的文字表示每个变体与各自的野生型对照相比显示改善的性能的标准。
实施例18使用差示扫描量热法的AmyE全长、AmyE-tr和AmyE变体的热稳定性
用超灵敏扫描高流通量微热量计VP-Capillary DSC(MicroCal，Inc.，Northampton，MA，USA)测量过量热容量曲线。之前发表了用于DSC测量的标准方法和技术原理(Freire，E.(1995)Differential ScanningCalorimetry Methods.Mol.Biol.41：191-218)。在30-120℃温度范围内扫描了约500μL 0.5mg/ml的AmyE-tr或截短AmyE变体。然后重新扫描同一样品以检验该过程的可逆性。所使用的缓冲液是10mM乙酸钠，pH 4.0或pH 5.8。使用200℃/小时的扫描速率以最小化聚集引起的任意假象。将DSC曲线的热中点(Tm)用作热稳定性的指示。图11显示在pH 4.0和pH5.8下测试的野生型截短AmyE和截短AmyE变体的Tm值。
表11.野生型截短AmyE和截短AmyE变体的Tm(℃)
  变体   pH 4.0下的Tm   pH 5.8下的Tm
  野生型AmyE截短   69.9   74.9
  Q126L   73   78.1
  Q126P   75   81
  Q126V   70   75.6
  L142F   74.2   79.1
  L142G   71   77.3
  L142Q   70.1   75.7
  L142W   74.1   79.6
  L142Y   74.3   79.5
  A214I   77.4   81.6
  A214V   78   83
  A214W   71   76.3
实施例19
面包陈化
以下实施例涉及AmyE多肽对降低面包陈化的用途。
A.用于烘焙试验的配方
用美国吐司的标准白面包发面(sponge)和面团配方进行烘焙试验。从1400g来自General Mills，USA的“Gold Medal”面粉、800g水、40克菜子油、7.5g GRINDSTEDTM SSL P55Veg、10g乳化剂DIMODANTMPH200和60g压缩的酵母制备发面团。将发面在Hobart螺旋混合器上低速混合1分钟，随后以速度2混合3分钟。然后在25℃、85％RH下发酵发面3小时。
此后，向发面加入600g“Gold Medal”面粉、18g压缩的酵母、5g丙酸钙、160g蔗糖、5g丙酸钙、432g水及抗坏血酸(60ppm终浓度)和ADA(偶氮双甲酰胺；40ppm终浓度)。将产生的面团在Diosna混合器上低速混合1分钟，然后高速混合2分钟。然后向面团加入30g盐。
将面团在室温下放置5分钟，然后称量550g的面团块，在Glimek压面机(sheeter)上以1∶4、2∶4、3∶15、4∶12和两侧宽度8的设置成型并转移至烘焙模(baking form)。在43℃、95％RH下醒发65分钟后，将面团在MIWE烤箱中于200℃烘焙26分钟。
B.评估硬度、弹性和粘结性(cohesiveness)的流程
使用来自Stable Micro Systems，UK的Texture Analyser，通过TextureProfile Analysis分析面包切片来测定硬度、弹性和粘结性。根据StableMicro System，UK提供的预设标准进行硬度和弹性的计算。所用的探针是周长50mm的铝。
按12.5mm的宽度对面包进行切片。将这些切片冲压为直径45mm的圆形块并单独测量。
使用以下设置：测试前速度：2mm/s，测试速度：2mm/s，测试后速度：10mm/s，破裂测试距离：1％，距离：40％，力：0.098N，时间：5.00秒，计数：5，负荷传感器：5kg，触发器类型：自动-0.01N。
压缩方式是标准方法AACC 74-09中所用方式的修改方式。在测试中压缩样品两次。
C.评估硬度的流程
在第一次压缩期间在40％压缩下测定硬度。数字是将切片压缩至总厚度的40％所需要的力。该值越低，面包越软。例如以hPa将硬度表示压力。
D.用AmyE变体多肽处理的食品的改善的处理特性
以0.4mg/kg的AmyE-tr烘焙面包，在烘焙后的多个时间点按上文所述流程测试面包的硬度。测试了面包的硬度。作为对照，还测量了无任何酶的情况下烘焙的面包的硬度。
图16显示烘焙试验的结果，其中将用AmyE-tr处理的面包的硬度与不含酶的面包的硬度进行比较。在用AmyE-tr烘焙的面包中，从第1天至第14天的硬度增加量减少，这表明该酶具有抗陈化作用，且可以改善面包的保鲜。

Claims (6)

1.变体多肽，其获自选自SEQ ID NO:1所示的AmyE或SEQ ID NO:2所示的AmyE的截短变体的亲本α-淀粉酶多肽，以及取代142F、142G、142Q、142S、142W或142Y，其中所述位置参照SEQ ID NO:1编号。
2.权利要求1的变体多肽，其中所述取代选自L142F、L142G或L142Q，且其中与SEQ ID NO:1的亲本多肽相比，所述取代改善了所述变体多肽的淀粉液化性能。
3.权利要求1的变体多肽，其中与亲本多肽相比，所述变体具有改善的酶性能特征，所述改善的酶性能特征选自提高的热稳定性或提高的比活。
4.洗涤剂组合物，其含有权利要求1-3中任一项的变体多肽。
5.淀粉转化组合物，其含有权利要求1-3中任一项的变体多肽。
6.权利要求5的淀粉转化组合物，其进一步包含具有葡糖淀粉酶活性的其他多肽。
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