JP2014168469A - バシラス・スブチリス由来のアルファ−アミラーゼ変異体とその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】α-アミラーゼ活性と、酵素の性能を向上させる少なくとも1の改変された性質とを備えるポリペプチド変異体であって、AmyEまたはAmyE切断変異体から選択される親α-アミラーゼに対し92%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、修飾により酵素の性能を向上させる少なくとも1の性質の性能指数(PI)が1より大きいポリペプチド変異体。このアミラーゼは、低pH、カルシウムの非存在下、および/または他のグルコアミラーゼの非存在下で使用することができる。
【選択図】図2
Description
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び425。
これにより、修飾によって、酵素活性を向上させる少なくとも1の性質の性能指数(PI)が1より大きいポリペプチド変異体が生じる。
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 121, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 140, 141, 142, 143, 144, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 179, 180, 181, 184, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び 425。
これにより、修飾によって、タンパク質発現に関する性能指数(PI)が0.5より大きく、酵素活性を向上させる少なくとも1の性質の性能指数(PI)が1.1より大きいポリペプチド変異体が生じる。
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び 425。
これらの位置は、全長親ポリペプチド、または切断親ポリペプチドの性能発現に関し不完全拘束である。
1A, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 10A, 10I, 10L, 10M, 10N, 10P, 10Q, 10S, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 11S, 11V, 11W, 11Y, 12I, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 13I, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 16I, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 17I, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 20I, 20K, 20L, 20M, 20P, 20Q, 20R, 20S, 20T, 20V, 20W, 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 21I, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 22I, 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 25I, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 26I, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30I, 30K, 30L, 30M, 30N, 30P, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33I, 33K, 33L, 33M, 33P, 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389V, 390F, 390I, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 399I, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403H, 403I, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 405S, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 409I, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 411S, 411Y, 412N, 412T, 413C, 413F, 413G, 413I, 413L, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414H, 414L, 414N, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415G, 415I, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 416Q, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417Q, 418D, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 419I, 419L, 419S, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420Q, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421C, 421L, 421M, 421S, 421T, 422F, 422I, 422S, 422W, 423D, 423I, 423Q, 423R, 423T, 424M, 424Q, 424R, 424V, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425V, 及び 425Y。
いくつかの実施形態では、酵素性能を向上させる性質は、向上した熱安定性、向上した比活性度、及び向上したタンパク質発現から成る群から選択される。
本願では以下の配列が参照される。
SEQ ID NO: 1: 全長バシラス・スブチリスAmyEのアミノ酸配列。天然シグナル配列は表示していない。
特に断りのない限り、本明細書にて用いるすべての技術及び科学用語及び略号、は当業者が通常理解している意味と同様の意味を有する。より明確にするために、次の用語及び略号の定義を以下に示す。
「澱粉」とは、アミロースとアミロペクチンから成り、化学式(C6H10O5)X (Xは任意の数)で表わされる植物性の複合多糖炭水化物を含有する物質を意味する。
特に、澱粉とは植物中に存在する天然の炭化水素を意味し、植物の非限定的例示として穀物、草、塊茎、根茎が挙げられ、より詳しくは、小麦、大麦、コーン、ライ麦、米、ソルガム、フスマ、キャッサバ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカが挙げられる。
<1.2 略号>
特に断りの無い限り、下記の略号を用いる。
AE:アルコールエトキシレート
AEO:アルコールエトキシレート
AEOS:アルコールエトキシサルフェート
AES:アルコールエトキシサルフェート
AGU:グルコアミラーゼ活性単位
AkAA:アスペルギルス・カワチイ(Aspergillus kawachii)αアミラーゼ
AmyE:バシラス・スブチリスαアミラーゼ
AmyS:ゲオバシラス・ステアロサーモフィリスαアミラーゼ
AS:アルコール硫酸塩
BAA:バクテリア性α―アミラーゼ
cDNA:相補的DNA
CMC:カルボキシメチルセルロース
DE:デキストロース当量
DI:蒸留された、脱イオン化した
DNA:デオキシリボ核酸
DP3:サブユニット3個の重合度
DPn:サブユニットn個の重合度
DSまたはds:乾燥固体成分
DTMPA:ジエチルトリアミノペンタ酢
EC:酵素分類のための酵素コミッション(enzyme commission for enzyme classification)
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
EDTMPA:エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸
EO:酸化エチレン
F&HC:織物及び家庭用品ケア用品
GAU:グルコアミラーゼ単位
HFCS:高フルクトースコーンシロップ
HFSS:高フルクトース澱粉ベースシロップ
IPTG:イソプロピルβ-D-チオガラクトシド
LA:ルリア寒天
LB:ルリアブロス
LU:リパーゼ単位
L1T:1位のロイシン(L)残基がスレオニン(T)残基で置換されていることを表し、ここで、公知の1文字略号で指定される。
MW:分子量
NCBI:全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)
nm:ナノメートル
NOBS:ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸
NTA:ニトリロ三酢酸
OD:光学密度
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
PEG:ポリエチレングリコール
pI:等電点
ppm:100万分の一
PVA:ポリ(ビニルアルコール)
PVP:ポリ(ビニルピロリドン)
RAU:参照アミラーゼ単位
RNA:リボ核酸
SAS:二次アルカンスルホン酸塩
1X SSC:0.15 M NaCl, 0.015 M クエン酸ナトリウ
SSF:同時糖化発酵
SSU:溶解性澱粉単位、1分間に放出される1 mgのグルコースの還元力に等しい
TAED:テトラアセチルエチレンジアミン
TNBS:トリニトロベンゼンスルホン酸
TrGA :トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)グルコアミラーゼ
w/v:重量/容積
w/w:重量/重量
wt:野生型
μL:マイクロリットル
μNm:マイクロニュートン×メートル
<2.1 親AmyEポリペプチド>
AmyEα−アミラーゼとは、SEQ ID NO: 1で例示されるB. スブチリス由来の天然α-アミラーゼ(EC 3.2.1.1; 1,4-α-D-グルカン・グルカノヒドロラーゼ)を意味する。関連するポリペプチドは天然AmyEとは異なるアミノ酸配列を有し、例えばマッチングパラメータが初期設定されたBLAST配列アライメントアルゴリズムで測定したとき、SEQ ID NO: 1に対し配列同一性を少なくとも約85%, 少なくとも約90%, 少なくとも約91%, 少なくとも約92%, 少なくとも約93%, 少なくとも約94%, 少なくとも約95%, 少なくとも約96%, 少なくとも約97%,少なくとも約98%, または少なくとも約99%有する。
AmyE変異体は、SEQ ID NO: 1の天然AmyEまたはSEQ ID NO: 2 (切断ポリペプチド)と比較して、少なくとも1のアミノ酸修飾を有する。従って、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2を、AmyE変異体が派生される「親ポリペプチド」、「親酵素」、または「親配列」と言うことができる。修飾されていないアミノ酸配列(すなわち、残りの隣接アミノ酸配列)は、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3、またはNCBI 信託番号ABW75769, ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841, 及びBAA31528のいずれかのアミノ酸配列と同一である。あるいは、残りのアミノ酸配列はこれらの配列に対し、例えばアライメントパラメータが初期設定されたタンパク質配列のBLASTアルゴリズムで評価したとき、特定の配列同一性を有する。例えば、 残りのアミノ酸配列はSEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2のAmyEに対し、配列同一性を少なくとも約85%, 少なくとも約90%, 少なくとも約91%, 少なくとも約92%, 少なくとも約93%, 少なくとも約94%, 少なくとも約95%, 少なくとも約96%, 少なくとも約97%, 少なくとも約98%, または少なくとも約99% 有する。
これらの位置のいずれかを修飾することにより、タンパク質の発現に関し性能指数(PI)が0.5より大きく、酵素の性能を向上させる少なくとも1の性質に関するPIが1より大きいポリペプチド変異体が得られる。
これらの位置のいずれかを修飾することにより、タンパク質の発現に関し性能指数(PI)が0.5より大きく、酵素の性能を向上させる少なくとも1の性質に関するPIが1.1より大きいポリペプチド変異体が得られる。
これらの位置は、全長または切断親ポリペプチドのいずれかにおいて、性能発現のために不完全に拘束されている。
また、いくつかの位置は、切断AmyE親ポリペプチドにおいて、性能発現のために不完全に拘束されている(すなわち、 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 48, 52, 53, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 74, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 110, 111, 113, 114, 117, 121, 122, 126, 128, 129, 130, 131, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 164, 165, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 186, 189, 191, 193, 194, 196, 197, 198, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 215, 216, 217, 220, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 242, 244, 246, 249, 256, 258, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 278, 279, 280, 281, 285, 286, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 312, 315, 316, 322, 326, 329, 330, 332, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 348, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 387, 389, 391, 392, 394, 396, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425)。
1A, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 10A, 10I, 10L, 10M, 10N, 10P, 10Q, 10S, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 11S, 11V, 11W, 11Y, 12I, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 13I, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 16I, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 17I, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 20I, 20K, 20L, 20M, 20P, 20Q, 20R, 20S, 20T, 20V, 20W, 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 21I, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 22I, 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 25I, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 26I, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30I, 30K, 30L, 30M, 30N, 30P, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33I, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 34I, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 36I, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 39I, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 40A, 40D, 40M, 40N, 40P, 40Q, 40T, 40V, 40W, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 45I, 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 46I, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 48I, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 49I, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 50I, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 53I, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 54I, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 55I, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 57I, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 60A, 60C, 60D, 60E, 60G, 60I, 60K, 60L, 60M, 60N, 60Q, 60R, 60T, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 62I, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 64I, 64L, 64M, 64N, 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052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, 及び 416V。
これらの突然変異体は、タンパク質発現及び活性のPI値が>0.5である。
052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, 及び416V。
適切なプロモータ、オペレータ、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び、任意にリプレッサー遺伝子、または種々のアクティベータ遺伝子をコードする制御配列を有する発現ベクターを用いて、AmyEポリペプチドをコードするDNA配列を酵素の形態で発現させることができる
この発明の組成物及び方法の一態様には、AmyEポリペプチドをコードするポリヌクレオチドだけでなく、このポリヌクレオチドに基づくAmyEポリペプチドの発現に有用なベクターや宿主細胞が含まれる。AmyEポリペプチドをコードする核酸の非限定的例示として、SEQ ID NO: 1のAmyE及びAmyE-tr (SEQ ID NO: 2)のそれぞれをコードするSEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 6のポリヌクレオチド、及びこれらの変異体が挙げられる。別の代表的ポリヌクレオチドとして、Amy31A (SEQ ID NO: 3)をコードするSEQ ID NO: 7のポリヌクレオチドが挙げられる。NCBI 信託番号ABK54355, AAF14358, AAT01440, AAZ30064, NP_388186, AAQ83841, 及びBAA31528に開示されたAmyEも公知のデータベースに開示されたポリヌクレオチドによコードされ、これらの配列を本願に参照として組み込む。核酸は、DNA, mRNA, またはcDNA等である。核酸にはさらに上記の核酸のいずれかに対応する縮重配列も含まれる。縮重配列は、特定の宿主有機体に適したコドンを用いた発現に適合するように設計されている。
パストリス(Pichia pastoris)のAOX1又はAOX2プロモータが挙げられる。
AmyEポリペプチドを宿主細胞中で発現させたとき、培地中に分泌されることが好ましい。このため、AmyEポリペプチドには、発現された酵素を倍地中に分泌させることができるシグナル配列が含まれている。シグナル配列はAmyEと同じ遺伝子でコードされる。例えばSEQ ID NO: 1に示すAmyEは、シグナル配列、及び付随するN-末端アミノ酸を有する配列であるMFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE (SEQ ID NO: 9)によって自然に発現される。あるいは、シグナル配列は、別のAmyEまたは別のタンパク質に由来するB. スブチリス属のシグナル配列でもよい。さらに、B. リケニホルミス等の別の種に由来するシグナル配列でもよい。シグナル配列は、例えば特定の宿主細胞中でAmyEまたはその変異体の最適な発現が得られるように選択することができる。成熟AmyEは、N-末端に付随するシグナル配列ではない配列のタンパク質分解切断の結果得られる。例えば、B. リケニホルミス由来の31-アミノ酸残基シグナル配列(LATリーダー配列)をAmyE配列の骨格に融合させることができる。例えば、AmyEをコードする核酸を、図2に示す発現ベクター中のB. リケニホルミスシグナル配列に作動可能に結合させる。
公知の方法を用いて、精製されたAmyEポリペプチドを調製することができる。培地で宿主有機体を培養した後、成長(または発酵)ブロスが得られ、このブロスから微生物細胞、種々の懸濁固形分、及び発酵用原料の残渣を公知の分離方法で除去することにより、アミラーゼ含有液が得られる。一般に、濾過、遠心分離、精密濾過、回転ドラム式真空濾過の後、限外濾過、抽出またはクロマトグラフィー等が用いられる。
<5.1 澱粉加工用組成物とその使用>
<概要>
AmyEポリペプチドは、甘味料の生産、燃料又は飲料用(すなわち、飲用アルコール)アルコールの生産、飲料の生産、甘蔗糖の生産、又は、例えば、クエン酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、ケトン、アミノ酸、抗生物質、酵素、ビタミン、及びホルモン等の所望の有機化合物の生産において重要な、澱粉の液化及び/又は糖化に用いることが出来る。澱粉の転化では通常、糊化または顆粒状澱粉のスラリーを加水分解して溶解性澱粉加水分解物にする。澱粉の転換は通常、3つの連続した酵素工程から成る。すなわち、液化工程、糖化工程、及びグルコースから所望の製品を製造する追加工程である。追加工程では、所望の製品に応じて異性化、発酵等を行う。澱粉をフラクトースシロップに転換するプロセスでは、追加工程は異性化である。
原料の澱粉は、塊茎、根茎、茎、マメ科植物、穀類、または全粒分から得られる。より詳しくは、粒状澱粉はコーン、穂軸、小麦、大麦、ライ麦、マイロ、サゴ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウ豆、豆類、バナナ、またはイモ類から得られる。特にワックス状及び非ワックス状のコーン及び大麦が好ましい。澱粉は高度に精製されていてもよく、例えば純度が少なくとも90%, 少なくとも95%, 少なくとも97%, または少なくとも99.5%である。あるいは、澱粉は胚芽残留物及び繊維等の非澱粉成分を含む製粉された全粒分から成る粗製澱粉であってもよい。全粒分等の原料は製粉により粉砕して更に加工することができる。
液化工程では、α-アミラーゼによって、澱粉スラリー中の長鎖の澱粉分子が短鎖分岐または直鎖分子(マルトデキストリン)に分解される。SPEZYMETM Xtra (Genencor社)やLIQUOZYMETM (Novozymes社)等の、多数のα-アミラーゼが市販されている。
糖化工程の後、固定化グルコースイソメラーゼ(例えばSWEETZYMETM)デキストロースシロップを高フルクトースシロップに転換することができる。一態様では、本願のプロセスで得られる水溶性の澱粉加水分解物は、高フルクトースコーンシロップ(HFCS)等の、高フルクトース澱粉ベースシロップ(HFSS)に転換される。この転換反応は、グルコースイソメラーゼ、特に固体担体に固定化したグルコースイソメラーゼを用いて行なうことができる。イソメラーゼには、SweetzymeTM, IT (Novozymes AJS社); G-zymeTM IMGI, 及び G-zymeTM G993, KetomaxTM, G-zymeTM G993, G- zymeTM G993 liquid, 及び GenSweetTM IGI等の市販品を用いることができる。Ca2+は公知のα-アミラーゼの安定性を向上させるが、グルコースイソメラーゼの活性を低下させる。このため、通常は異性化の前に例えばイオン交換によりCa2+を除去し、Ca2+濃度を3-5ppm未満にする。このプロセスは時間がかかり、高価である。
AmyEポリペプチドを澱粉の加水分解に使用したとき、他のα-アミラーゼには無いいくつかの利点が得られ、これにより澱粉加水分解法を合理化することができる。第1に、AmyEポリペプチドを用いれば、グルコアミラーゼに適した反応条件下で、デキストリンをデキストロースに転換することができる。これにより、反応混合物(例えばスラリー)をα-アミラーゼに適したpH及び温度に合わせる必要が無くなり、例えばpHおよび/または温度を下げて、反応条件をグルコアミラーゼに適合するように調整すればよい。このように、AmyEポリペプチドを澱粉の加水分解に使用することにより、液化と糖化を同一のスラリー条件下で行うことが可能になり、澱粉加水分解の工程の1つを省略することができる。
AmyEポリペプチドは、(例えば澱粉加工における唯一の澱粉分解酵素として)単独で用いることもできるし、他のα-またはβ-アミラーゼ、あるいは別の酵素と組み合わせて様々な活性を有する「カクテル」とすることもできる。例えば、澱粉を 菌類α-アミラーゼ(EC 3.2.1.1), バクテリア性α-アミラーゼ、例えばバシラスαアミラーゼまたは非バシラスαアミラーゼ、またはβ-アミラーゼ(EC 3.2.1.2)から成る群から選択される1以上の酵素と接触させることができる。AmyEポリペプチドを、イソメラーゼ(EC 3.2.1.68)またはプルラナーゼ(EC 3.2.1.41)等の、その他の澱粉分解酵素と組み合わせることもできる。イソアミラーゼはアミロペクチン及びβ-リミットデキストリン中のα-1,6-D-グルコシド分岐結合を加水分解し、イソアミラーゼはプルランを分解できない点、及びイソアミラーゼはα-リミットデキストリンに対する作用が限定的である点で、プルラナーゼとは異なる。
AmyEポリペプチドを、食器洗浄用、または他の硬質表面洗浄用の洗剤組成物に調合することができる。洗剤組成物は、ゲル状、粉末状又は液体状にすることができる。この組成物には、AmyEポリペプチドが唯一の澱粉分解酵素として含まれている。あるいは、洗剤組成物に、他の追加の澱粉分解酵素、他の洗浄酵素、及び洗浄剤組成物に一般的に用いられている他の成分が含まれていてもよい。衣類用洗剤組成物には、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、および/またはラッカーゼ、またはこれらの組み合わせの内の1以上の追加の酵素が含有されている。
AmyEポリペプチドを、非粉塵性顆粒、安定な液体、又は保護された酵素等の形態で、洗剤組成物の一成分として用いることができる。非粉塵性顆粒は例えば米国特許第4,106,991号と4,661,452号に開示された方法で製造することができ、任意に、公知の方法により被覆することもできる。ワックス状の被覆原料の例は、例えば、平均分子量が1,000から20,000の(ポリエチレングリコール、PEG);エチレンオキシドユニット数が16から50のエトキシル化ノニルフェノール;アルコールの炭素数が12から20で、エチレンオキシドユニット数が15から80のエトキシル化脂肪族アルコール;脂肪族アルコール;脂肪酸;脂肪酸のモノ-及びジ-及びトリグリセリド等の、ポリ(エチレンオキシド)製品である。流動床法に適した皮膜形成物質の例は、例えばGB Patent No. 1,483,591に開示されている。
上記のように、AmyEポリペプチド含有洗浄組成物には、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ、および/またはペルオキシダーゼ、2,6-β-D-フルクタンヒドロラーゼ、追加のα-アミラーゼ酵素、および/またはこれらの組合せ等の、1以上の追加の酵素が含まれていてもよい。一般に、選択した酵素の性質は、選択した洗剤に適合しなければならず(例.最適pH、他の酵素成分又は非酵素成分との適合性)、酵素は有効量で含まれていなければならない。酵素の例を下記に示す。これらの酵素の大部分は、洗浄用組成物以外の組成物中のAmyEポリペプチドと組み合わせて用いることができる。
AmyE ポリペプチドの洗浄性能の評価方法の例を、下記と実施例に示す。AmyE ポリペプチドを含有する組成物の洗浄効率を試験する標準的な方法のひとつは試験見本テストである。種々の材料に既知の「強度」の汚れを付着させた試験見本が市販されている(EMPA, St. Gallen, Switzerland; wfk--Testgewebe GmbH, Krefeld Germany; またはCenter for Test Materials, Vlaardingen, The Netherlands参照)、及び/又は技術者が作ることができる(Morris and Prato, Textile Research Journal 52(4): 280-286 (1982))。試験見本は、例えば、血液/牛乳/インク(BMI)、ホウレン草、草又はチョコレート/牛乳/すすから作られた汚れが付着された、木綿を含有する布地から成る。BMI汚れは、例えば0.0003%から0.3%の過酸化水素で木綿に固定することができる。別の組み合わせは、0.001%から1%のグルタルアルデヒドで固定された草またはホウレン草、0.001%から1%のグルタルアルデヒドで固定されたゼラチンとクーマシー(Coomassie)の汚れ、又は0.001%から1%グルタルアルデヒドで固定されたチョコレート、牛乳及びスス等である。
本願はまた、1以上のAmyEポリペプチドを用いた織物の処理用組成物、及び織物の処理方法(例えば布のデサイジング)に関する。AmyEポリペプチドは、公知のあらゆる織物処理方法において用いることができる(例えばU.S. Patent No. 6,077,316参照)。例えば、溶液中でAmyEポリペプチドを織物と接触させることにより、織物の手触りと外観を改良することができる。織物を加圧下の溶液中で処理することもできる。
AmyEポリペプチドを、ベーキング及び食品配合用の組成物と方法において用いることができる。産業用及び家庭用のベーキング及び食品生産用の穀粉の場合、穀粉中でα-アミラーゼ活性の適正な水準を維持することが重要である。活性水準が高すぎると粘りがあり、及び/又は生焼けであり、市販できない製品となる。しかし穀粉のα-アミラーゼ活性が不足していると、酵母に適切な機能を発揮させるのための糖が不足し、乾燥したもろいパンとなる。従って、穀粉中の内在的なα-アミラーゼ活性のレベルを増加させるために、AmyEポリペプチドを単独、または別のα-アミラーゼと組み合わせて、穀粉に添加することができる。本願に開示するように、AmyEポリペプチドの最適温度は30-90℃、50-80℃、55℃-75℃、または60-70℃の範囲であるため、ベーキング及び食品生産での使用に適している。異なるAmyEポリペプチドの最適温度は、pH5.5の可溶性デンプン1%溶液、または本願に開示する方法、あるいは公知の方法を用いて測定することができる。
下記の記載及び実施例では次の略語を用いる。wt%(重量パーセント)、℃(摂氏)、H2O(水)、 dH2O(脱イオン水)、dIH2O(脱イオン水、Milli-Qろ過)、g又はgm(グラム)、μg(マイクログラム)、mg(ミリグラム)、kg(キログラム)、μL及びμl(マイクロリットル)、ml及びmL(ミリリットル)、mm(ミリメートル)、μm(マイクロメートル)、M(モル)、mM(ミリモル)、μM(マイクロモル)、U(単位)、MW(分子量)、sec(秒)、min(分)、hr(時間)、DO(溶存酸素)、W/V(体積当たりの重量)、W/W(重量当たりの重量)、V/V(体積当たりの体積)、IKA (IKA Works Inc社 2635 North Chase Parkway SE, Wilmington, NC)、Genencor (Danisco US Inc社 Genencor Division, Palo Alto, CA)、Ncm (ニュートン・センチメートル)、 ETOH (エタノール)、eq (等量)、N (規定)、dsまたはDS (乾燥固体成分)、SAPU (分光分析による酸プロテアーゼ単位、ここでSAPUの1単位は、試験条件下でカゼイン基質から1分間に1マイクロモルのチロシンを遊離させるプロテアーゼ酵素活性である)、及び GAU(グルコアミラーゼ単位、pH4.2及び60℃の溶解性澱粉基質から還元糖をグルコース換算で1時間当り1g産出させる酵素の量と定義される)。
<プラスミドの構築とタンパク質の発現>
プラスミドの構築とタンパク質の発現には、以下の方法を用いた。
SEQ ID NO: 1のAmyE、またはC末端切断AmyE変異体をコードする核酸を、U.S. Patent No. 5,024,943に開示されたB.スブチリスpHPLT発現ベクター中にクローン化した。図2にAmyE-trをコードする核酸を含むベクターを示す。
全長AmyEをコードする構造体、及び切断ポリペプチドをコードする構造体を有するバクテリア性形質転換体を、10 μg/mLのネオマイシンと1%の不溶性澱粉を含むルリア寒天(LA)上で選択し、37℃で一夜培養した。コロニーの周りに透明部(またはハロー)が認められた形質転換を選択し、更に分析した。各形質転換体のそれぞれの前培養物を、10 μg/mLのネオマイシンを含むLB中で8時間成長させた。10 μg/mLのネオマイシン及び5 mMのCaCl2を添加した培養液(下記参照)30 mLを入れた250 mLフラスコ中に、各前培養物30 μLを添加した。用いた培養液はMOP緩衝液をベースとし、主要な窒素源としての尿素と、主要な炭素源としてのグルコースとを含み、健全な細胞を成長させるためにソイトンを1%添加した栄養分強化半合成培地であった。振蕩フラスコを37℃において250 rpmで撹拌しながら、60-65時間インキュベートした。培養物は、コニカルチューブを用い、5,000 rpmで20分間遠心分離して集菌した。全長AmyEタンパク質と切断AmyEタンパク質の両者とも高濃度で発現されたため、培養物の上清を精製せずにその後の分析に用いた。
<共通のアッセイ方法>
下記の実施例では、以下説明するアッセイを用いた。下記に示す方法と異なる点は、各実施例において表示する。これらの実験では、反応完了後に、生成した産品の吸光度を分光光度計により測定した。
アミラーゼ活性は分光光度計を用いて測定した。基質には、Remazol Brilliant Blue R (“RBB-コーンスターチ,” Sigma S7776)標識に共有結合させた不溶性コーンスターチを用いた。pH 4.5, 5.0または5.6の50 mM酢酸ナトリウム溶液中にRBB-コーンスターチを含む2% (wt ds)スラリー75μLを、100 μg/mLの酵素溶液10 μLに添加して十分撹拌した。この混合物を50℃で30分間インキュベートした。次に、サンプルを氷上に置き、卓上遠心分離機を用いて4,100 rpmで20分間遠心分離することにより基質を除去した。生成物の量は、澱粉から放出された青色色素の量を測定することにより求めた。色素の光学密度(OD)は、595 nmで3回測定した。
粘度計を用いて、アミラーゼの存在下のコーンスターチ基質の粘度をpH 4.5及び5.8で測定した。30% dsのコーンスターチ基質のスラリーを新たに調製し、硫酸によりpHを4.5または5.8まで下げた。各反応のつど、スラリー50g(15 g ds)を秤り取り70℃で10分間暖めた。α-アミラーゼを添加した後、直ちに温度を70℃から85℃に上げ、反応液を75 rpmで撹拌した。スラリーと酵素の混合物のスラリーの温度が85℃に達した後、粘度を30分間測定した。
2mM塩化カルシウムの存在下または非存在下におけるAmyEまたはその変異体の過剰熱容量を、超高感度高速示差走査熱量計(VP-Capillary DSC; MicroCal, Inc., Northampton, MA, USA)を用いて測定した。0.5 mg/mLのAmyEまたはその変異体溶液500μLを30-120℃の温度範囲で走査した。コントロールには、切断ゲオバシラス・ステアロサーモフィリスのα-アミラーゼ(AmyS)を用いた。34アミノ酸残基のシグナル配列を有するAmySのアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 4に示す。同じサンプルについて再走査して、可逆性をチェックした。使用した緩衝液は、pH 5.5の10 mM酢酸ナトリウムであった。凝集に起因するアーチファクトを最小限にするため、走査速度は200℃/hrとした。DSC曲線の熱中点(thermal midpoint (Tm))を、熱安定性の指標として用いた。全てのTm測定の標準誤差は1%未満であった。
上清サンプル中のタンパク質濃度をBradford QUICKSTARTTM 染色試薬 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いて測定した。サンプルは、37℃の加湿空気下において280rpmで振蕩しながら3日間マイクロタイタープレート (MTP)を用いて培養した培養物のブロスを濾過して調製した。別のMTPのウエル中で、培養物の濾液10μLにBradford QUICKSTARTTM染色試薬200μLを添加した。十分撹拌した後、室温で少なくとも10分間MTPをインキュベートした。気泡を除去し、595 nmのOD (光学密度)を測定した。各サンプルの測定からバックグラウンド(植菌していないウエル)の値を差し引いてタンパク質濃度を求めた。
<マルトース及びマルトヘプタオースの加水分解>
各実験例に示してあるように、pH 4.5または5.6の50 mM酢酸ナトリウム溶液中、またはpH 5.6の50 mMマレイン酸溶液中に、マルトースまたはマルトヘプタオースが0.5%含まれる溶液を調製した。まず全酵素溶液を希釈して、1 mg/mLとした。適切な濃度の基質溶液を用いて、最終酵素濃度が1 ppmになるようにして酵素を希釈することにより反応溶液を調製し、次にサンプル200 μLを採取して滅菌したスクリューキャップ付チューブに入れ、37℃のインキュベータに取り付けた。所与の各時間において、10 mM水酸化ナトリウム溶液を用いて10倍に希釈することにより、反応を停止させた。
不溶性粒状澱粉の加水分解を測定するために、pH 5.6のマレイン酸緩衝液により、精製したAmy Eまたはその変異体(24.5g/L)を最終濃度が20.4 ppmになるように希釈した。このタンパク質溶液を、コーン粉5%を含むpH 5.6のマレイン酸緩衝液に添加して最終濃度を1 ppmとし、この混合液をシェーカにより32℃でインキュベートした。サンプルを定期的に採取して50 mM水酸化ナトリウム溶液で10倍に希釈することにより反応を停止させた。
グルコースの生成及びその他の基質分解物を、Dionex PA-1カラムと電気化学的検出器を備えるAgilent 1100 LCシステムを用いて、HPLCにより分析した。サンプル10 μLを注入し、NaOHと酢酸ナトリウムのグラディエントを25℃において1.0 mL/分で流通させた。単糖類の分布を、予め測定しておいた標準サンプルにより求めた。溶出液のデータを45分以上採取した。産出されたグルコースの定量値(g/Lで表示)は、認証されたグルコース標準サンプル(Sigma, MO, USA)を用いて、糖類のピーク面積を実際の各糖の濃度に換算することにより求めた。
マルトースまたはマルトヘプタオースのグルコースへの分解を、HPLCにより測定した。pH 4.5または5.6の50 mM酢酸ナトリウム溶液中に、マルトースまたはマルトヘプタオースが0.5%含まれる溶液を調製した。各酵素サンプルの精製ストック溶液を希釈して、1 mg/mLとした。1 mg/mLの酵素のサンプルをさらにマルトース溶液で希釈して、最終酵素濃度を1 ppmにした。次にサンプル200 μLを採取して滅菌したスクリューキャップ付チューブに入れ、37℃のインキュベータに取り付けた。2, 5, 及び8日経過後に、水酸化ナトリウム溶液を添加して反応を停止させた。実施例2.5に記載した方法を用いて、グルコースとマルトース分解物の生成を、認証標準サンプルに対するHPLCにより分析した。
標準的な全還元糖、グルコース、及びヨウ素のアッセイを個別に行い、アミロペクチン消化生成物の特性を分析した。2.2% (w/w)のコーンアミロペクチン基質の溶液を、pH 5.8の55 mM酢酸ナトリウム緩衝液を用い、混合物を撹拌しながら30分間撹拌した後、室温まで冷却して調製した。基質溶液100μlを96ウエル培地結合ポリスチレン製マイクロタイタープレートに入れ、さらに希釈したAmyE変異体の培養液の上清10 μlを添加した。マイクロタイタープレートをシール(Nunc, cat. # 236366) した後、直ちにiEMS振蕩インキュベータに移し、50℃において1150 rpmで10分間インキュベートした。アミラーゼの反応は、20 μl の0.5 N NaOHを添加して撹拌することにより停止させた。
市販の分子ロータCCVJ (9-(2-カルボキシ-2-シアノビニル) ジュロリジン)を用いて高速粘度計アッセイを開発した。分子ロータは、量子収量(放出されたフォトンの数を吸収されたフォトンの数で割った値)がミクロ環境の自由体積、ひいては粘度に依存する蛍光性物質である。このような分子は、分子内回転により励起状態から緩和する。分子内回転はミクロ分子環境の粘度に比例して抑制され、残余のエネルギーは放射緩和(蛍光発光)により消失する。
酵素活性による液化後の粘度低下を測定するために、次のようにしてコーン粉の緩衝化スラリー中に分子ロータCCVJを添加した。凍結乾燥されたCCVJ (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis, MO)5 mgを入れたバイアルにジメチルスルホキシド186μlを添加して、100 mMのCCVJのストック溶液を調製した。CCVJストック溶液を室温で暗所に貯蔵し、使用前に沈殿の有無をチェックした。有機栽培コーン粉(Azure Farm, Dufur, OR)を600-マイクロメータの篩に通し、95℃で16時間ベーキングした後、室温に戻した。
蒸留水1520g、pH 5.6の1M酢酸ナトリウム緩衝液80 mL (予め1モルの酢酸ナトリウムに1 M酢酸を滴下して調製しておいた)、80 μlのTween-80 (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis, MO)、80μlの100 mM CCVJストック溶液、及び篩にかけた有機栽培コーン粉400gを混合して、1バッチが2-kgの、pH5.8でコーン粉20% (重量/重量)のスラリーを調製した。このスラリーを、磁性撹拌子を用いて30分間激しく撹拌した後、pHが5.8であることを確認した。スラリーを継続して激しく撹拌してコーン粉を均一に分散させながら、先端を細くして内径を約2.3ミリメートルにすることにより200-μlに調整したマルチチャンネルピペットを用いて、スラリー90μlをポリスチレン製黒色未処理96-ウエルマイクロタイタープレート(Corning Incorporated, Corning, NY)の各ウエルに入れた。マルチチャンネルピペットの先端の内径はノギス(Mitutoyo Corporation, Kure, Hiroshima, Japan)で測定した。
マイクロタイタープレートの各ウエルのコーン粉のスラリー上に、酵素のサンプル10 μlを滴下した。その後、マイクロタイタープレートを粘着性シーラー(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)でシールし、80℃の高温オーブンで予熱した金属板の間に緊密に挟み込んだ。このプレートを1時間インキュベートした後、室温に戻して、室温で一夜放置した。翌日、プレートのシーラーを取り除き、次のように設定したSpectramax M2e蛍光測定装置(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)で測定した:トップ-リード(top-read)蛍光モード;励起波長435ナノメータ(nm);蛍光発光波長495 nm;遮断波長455 nm。このアッセイでは、蛍光強度の低下は糊化したコーン粉の密度の低下に比例し、従って酵素活性による液化の進行に相当する。
<比活性度と最適pH>
全長AmyE (SEQ ID NO: 1), AmyE-tr (SEQ ID NO: 2)、及びその変異体の比活性度と最適pHを実施例2.1に記載した方法により測定した。比活性度は、50℃、pH 4.5, 5.0, 及び5.6において30分間にRBB-コーン澱粉基質から放出される染料の量を分光分析で測定して求めた。図3は、AmyE-tr及びAmy31Aは、pH 5または5.6との比較において、pH4.5のとき最も高い比活性度を示す。AmyEはpH5.6よりもpH5のときより高い比活性度を示す。
<コーンスターチ基質の粘度低下>
AmyE, AmyE-tr、及びその変異体のコーンスターチ基質の粘度を低下させる能力を、実施例2.2に記載した方法を用いて測定した。各酵素について、pH 4.5及び5.8において粘度の経時変化を測定した。図4A及び4Bはそれぞれ、AmyE-tr及びAmyEはpH 4.5及び5.8の双方において基質の粘度を低下させることを示している。図4C及び4Dはそれぞれ、Amy31AはpH 4.5及び5.8において性能が優れていることを示している。
<熱安定性>
AmyE, AmyE-tr,及びその変異体の熱安定性を、実施例2.3に記載した示差走査熱量測定法(DSC)を用いてCa2+の存在下または非存在下で測定し、Ca2+が酵素の熱安定性に影響するか否かを検討した。DSCにより、アンフォールディング過程は不可逆であることが明らかになった。図5Aは、2 mM Ca2+の存在下または非存在下でのAmyE及びAmyE-trのDSC法で測定したアンフォールディング曲線を表す。図5Bは、全長Amy31A変異体のDSC法で測定したアンフォールディング曲線を表す。カルシウムの熱融点に対する影響は全く見られないことから、AmyE, AmyE-tr, 及びAmy31AのいずれもCa2+と結合しないか、またはmMオーダーのCa2+濃度では安定化されないことが示唆される。図5Cに示すように、G. ステアロサーモフィリスα-アミラーゼ(AmyS)では対照的な結果が得られた。Table 1に試験した各酵素の融点を示す。AmyE, AmyE-tr, またはAmy31Aの熱安定性はCa2+を添加しても殆ど変化しなかったが、AmySの熱安定性はCa2+の添加により顕著に増加した。
<マルトース及びマルトヘプタオースのグルコースへの転換>
実施例2.3に記載したグルコース生成アッセイを用いて、AmyE-tr (SEQ ID NO: 2) 及びAmyE-trの6種のQ153位 (C, F, I, K, N, 及びV)AmyE変異体について、pH 5.6におけるマルトース基質及びマルトヘプタオース基質をグルコースへ転換する能力を分析した。生成したグルコースは1, 2, 及び3日経過後に測定した。AmyE-tr 及びAmyE変異体の濃度は1 ppmであった。比較として、同一添加処方の切断AmyS (SEQ ID NO: 4)を用いた。
<マルトヘプタオースのグルコースへの転換>
AmyE-tr (SEQ ID NO: 2), AmyS, 及び AmyE変異体 Q153Kのマルトヘプタオース(DP7)のグルコース(DP1)への転換能力を分析した。反応液中の生成物の分析は、実施例2.2に示したHPLC法により行った。図8〜10に代表的溶出曲線を示す。
<位置変異体の創出と発現>
この実施例は、位置変異体のライブラリの創出と発現に関する。
プラスミドpME630.7 (図2, 実施例1)を用いて、AmyE-trの異なる150アミノ酸残基における位置変異体ライブラリを創出した。Table 1に位置変異体ライブラリの創出に用いた各残基を示す。残基の位置の番号付与は、SEQ ID NO: 2における位置に基づいて行った。各位置について示したアミノ酸は、SEQ ID NO: 2 に示すAmyEに見られる残基(すなわち、野生型の残基)である。
置換AmyE変異体を含むB. スブチリス形質転換体を、ネオマイシン10μg/mlを含有するLB (ルリアブロス)を入れた96ウエルプレート中で8時間培養し、この予備培養液30μl を、25 ppmのクロラムフェニコール及び5 mMのCaCl2を添加した培養培地(下記参照)30 mLを入れた250 mLのフラスコに入れた。このフラスコを、250 rpmの一定速度で撹拌しながら、37℃で60-65時間インキュベートした。コニカルチューブを用いて5,000 rpmで20分間遠心分離することにより、培養物を集菌した。培養液の上清を分析に供した。使用した培養培地は、MOP緩衝液をベースとし、主な窒素源が尿素、主な炭素源がグルコースで、健全な細胞を培養するためのソイトン1%が添加された栄誉強化半合成培地であった。
<比活性度及び熱安定性を測定するための澱粉加水分解アッセイ>
澱粉加水分解アッセイにより、AmyE位置変異体の比活性度及び熱安定性を測定した。また、クリーニング試験見本アッセイにより、AmyE変異体の汚れ除去性能を測定した。AmyE変異体のpH安定性は、マルトヘプタオース基質上でのアミラーゼ活性を測定することにより評価した。各AmyE変異体の熱安定性は、熱ストレス前後におけるマルトトリオース基質上でのアミラーゼ活性を測定することにより評価した。
澱粉加水分解アッセイにより、AmyE及びAmyE変異体の比活性度及び熱安定性を測定した。実際のクリーニング及び穀物加工の条件に近い条件を用いた。活性は、コーン粉の酵素的分解により生じた還元末端の量と定義される。還元末端は、下記に示すPAHBAH (p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド)アッセイにより測定した。安定性は、80℃において維持された活性と定義される。
Azure Farms 有機コーン粉(Norco, CA, USA)を篩にかけ、<600ミクロンの粉を採取し、80℃で4時間ベーキングし、室温で一晩放置し温度を下げた。調製した乾燥コーン粉を、VP722Bユニットをパウダーフリップディスペンサーとして用いてAxygen PCRプレートに移した。各ウエルに入れたコーン粉の量は、約5mgであった。pH 5.6(最終懸濁液のpHは~5.8)の50 mM酢酸ナトリウム溶液100 μLを各ウエルに入れて撹拌した。AmyE及びAmyE変異体の培養液上清を、希釈緩衝液(水+ 0.005% Tween-80)により約20 μg/mLに希釈した。希釈した上清10 μLを8分間反応用プレート及び30分間反応用プレートに移し、サンプルを上下に一回ピペッティングして撹拌した。軽油50 μLを各ウエルに入れた。次に、プレートを、80℃に予熱したInheco装置に移した。インキュベート開始から所定時間が経過した後、各ウエルに10 μLの4N NaOHを添加して澱粉加水分解反応を停止させた。澱粉加水分解反応の生成物をPAHBAHアッセイにより分析した。
80 μLの0.5N NaOHを空のPCRプレート(PAHBAH反応プレート)の全てのウエルに入れ、次に、20 μLのPAHBAH試薬 (5% w/v p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド (Sigma # H9882, St. Luois, MO, USA), 0.5N HCl中に溶解)を入れた。溶液を上下にピペッティングして撹拌した。PAHBAH反応プレートの各ウエルに澱粉加水分解反応上清10 μLを添加した。プレートをシールし、95℃で2分加熱後20℃に冷却するようプログラムしたサーモサイクラーに入れた。PAHBAH反応混合液のサンプル80μLを新しいプレートに移し、分光光度計で405 nmの吸光度を測定した。
CS-28米澱粉汚染小試験見本を用いて、AmyE及びAmyE変異体の汚れ除去性能を評価した。CFT Vlaardingen (Netherlands)社製の、直径1/4インチの円形小試験見本を用いた。96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに2つの小試験見本を入れた。
得られた吸光度の値を、ブランクコントロールの値で補正した。得られた吸光度「ΔOD488」を、アミラーゼ活性の指標とした。各AmyE及びAmyE変異体について、変異体の活性値を野生型酵素の活性値で割ることにより、性能指数を求めた。すなわち性能指数は、同じタンパク質濃度における変異体の性能(実際の値)と標準AmyE参照酵素の性能(理論値)との比較を表す。また、理論値は標準AmyE酵素のラングミュア式のパラメータから計算した。
マルトヘプタオースを基質に用いたアミラーゼ活性アッセイにより、AmyE及びAmyE変異体のpH安定性を評価した。アルファ-アミラーゼ活性を、酵素共役比色動力学アッセイを用いてpH 5.8及びpH 4におけるグルコースの生成を計測することにより測定した。酵素反応は、平底のポリスチレン製96-ウエルマイクロタイタープレートを用いて室温で行った。pH 5.8で行ったアッセイでは、AmyEまたはAmyE変異体の5x希釈培養液上清を含む0.005% (w/v) Tween-20水溶液5μlを、酢酸ナトリウム, CaCl2, Tween-20, ホースラディッシュ・ペルオキダーゼ(Sigma-Aldrich, cat. # 8375)及びグルコースオキシダーゼ(OXYGOTM; Genencor Division, Danisco US Inc.)を含むpH 5.8の緩衝液と混合した。最終容積50μl中には各成分がそれぞれ50 mM, 2.6 mM, 0.005% (w/v), 20 U/ml及び50 U/ml含まれていた。50 mM 酢酸ナトリウム, 5.4 mg/ml 2,2′-アジオ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩(Sigma-Aldrich, cat. # A1888) 及び10 mMマルトヘプタオース(Sigma-Aldrich, cat. # M7753)を含むpH 5.8の緩衝液を添加して反応を開始させ、5秒間撹拌した。反応液の405 nmの発色を、SpectraMAX 250 分光光度計(Molecular Devices, Union City, CA)を用いて9秒間隔で240秒間計測した。酵素活性は、計測中の120-240秒の間の発色速度として測定した。pH4.0のアッセイでは、pH 4.0の緩衝液と、20μlの希釈したAmyEまたはAmyE変異体のサンプルと、及び、ペルオキシダーゼ/グルコースオキシダーゼ30μlとを、各成分の濃度を適切な値にして用いた点を除き、上記の方法を繰り返した。
AmyE及びAmyE変異体の熱安定性の測定は、pH 5.8におけるマルトトリオース基質に対するアミラーゼ活性を、酵素共役比色動力学アッセイを用いてグルコースの生成を計測することにより行った。ここで用いたアッセイ方法では、マルトトリオース基質を用いて上記の手順で行った。AmyEまたはAmyE変異体の希釈培養液上清のサンプル20μlを使用し、発色は反応の60-180秒の間計測した。また、希釈培養液のサンプル80μlを新しいプレートに移し、プレートシーラーで覆い、iEMS装置 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA)により650rpmでシェーキングしながら60℃で30分間インキュベートした。プレートを氷上で4分間冷却し、20 μlのサンプルについて、上記のようにしてマルトトリオース基質に対する活性を測定した。前記の分析のように、各AmyEまたはAmyE変異体について変異体の活性値を野生型酵素の活性値で割ることにより性能指数を算出した。性能指数により、同一タンパク質濃度における変異体の性能(実際の値)と標準AmyE参照酵素(理論値)とを比較した。
<AmyE位置変異体の相対性能>
実施例9に示した方法により、AmyE-trの相対性能または相対活性を、実施例6に示した方法で生成させたAmyE変異体と比較した。それぞれに6種以上のメンバーが含まれる全142種類の位置変異体を評価した。
次の定義が適用される。
性能指数 (PI): 変異体の親タンパク質に対する性能の比
上昇突然変異: PI > 1
中性突然変異: PI > 0.5
非有害突然変異: PI > 0.05
有害突然変異: PI ≦ 0.05
完全拘束位置: タンパク質及び活性の中立突然変異無し
不完全拘束位置: 試験した1の性質について少なくとも1の中立突然変異有り
非拘束位置: 少なくとも1の性質について≧ 20% の中立突然変異有り
<AmyEによるエタノール生成>
この実施例では、従来のエタノール発酵アッセイを用いて、llinois River EnerIgy (IRE) 液化物(31% DS)の従来のエタノール発酵における切断AmyEの性能を試験する実験を行った。尿素を400 ppm含む31% DS Illinois River Energy (IRE)液化物の調合液を複数調製し、5N H2SO4を用いて1つの調合液のpH を4.3に調整し、別の調合液のpHを5.8に調整した。1つのフラスコ(125 ml エルレンマイヤー)について基質100gを用いた。記載した量の酵素を添加した。発酵物に0.2 mlの10% (w/v) Red Star Ethanol Red 酵母(DI水で約45分間予備水和させた)を植菌した。フラスコを撹拌棒により320 rpmで撹拌しながら32℃でインキュベートし、48時間発酵させた。生成したエタノールの量をHPLCで測定した。pH 4.3及びpH 5.8において、切断AmyE(SEQ ID NO: 2)の性能をSPEZYMETM Xtraアミラーゼ(SEQ ID NO: 4)と比較した。切断AmyE及びSPEZYMETM Xtraアミラーゼの添加量は0.2 mg/gDSであった。
<AmyEと他のα-アミラーゼとの、エタノール生成の比較>
この実施例では、pH 4.3及びpH 5.8において、実施例11に記載した全粒コーン粉のエタノール発酵アッセイを用いて、全長AmyE(SEQ ID NO: 1)及び切断AmyE(SEQ ID NO: 2)が不溶性粒状デンプン(非加熱)を加水分解してエタノールを生成する能力を比較する実験を行った。
<バシラス・スブチリスアルファアミラーゼによるグルコース生成>
この実施例では、実施例2に示したグルコース生成アッセイを用いて、pH4.5及び5.6におけるバシラス・スブチリスのマルトースをグルコースに転換する能力を測定する実験を行った。反応液を2, 5,及び8日経過後に分析した。
<生澱粉に対するAmyEの作用>
この実施例では、全長AmyE (SEQ ID NO: 1)が不溶性澱粉(非加熱)を加水分解する能力を測定する実験を行った。不溶性澱粉から生成したサッカライドの検出に用いたHPLC測定方法は次の通りである。
<全長AmyEの位置変異体ライブラリ>
全長AmyE(SEQ ID NO: 1)の295の部位について、Geneart (Geneart GmbH, Josef-Engert-strasse 11, D-93053 Regensburg, Germany)によって位置変異体ライブラリが構築された。Table 3に位置変異体ライブラリの構築に使用した残基の一覧を示す。各残基の位置番号は、SEQ ID NO: 1の位置に基づいて付与した。
<AmyE変異体の性能>
実施例8及び9に記載した方法により、全長AmyE及び切断AmyEの性能及び活性を、構築した全長AmyE及び切断AmyEの変異体と比較した。Table 4に全長AmyE変異体の部位評価スクリーニング結果を示し、Table 5に切断AmyEの部位評価スクリーニング結果を示す。第1列に野生型酵素のアミノ酸を示す。第2列に、この実施例で評価した位置における変異体を示す。これ以降の列には、評価した性質毎の各変異体の性能指数の値を示す。評価した性質は次の通りである:ブラッドフォードアッセイによるタンパク質の同定(発現)、粘度低下速度(ピーク粘度)、液化後の粘度低下(最終粘度)、重合度(ヨウ素)、生成還元末端(還元末端)、全グルコース量(グルコース)、pH 5.8におけるマルトヘプタオースの加水分解(DP7 pH 5.8)、pH 5.8におけるマルトヘプタオースの加水分解(DP7 pH 5.8、加熱)による熱安定性(60℃において30分)、pH 4でのマルトヘプタオース加水分解(DP7 pH 4)、pH 5.8でのマルトトリオース加水分解(DP3 HS)を用いた熱安定性(60℃において30分)、コーン粉基質に対する30分間の比活性度(コーン粉30分)、pH8での米澱粉汚染小試験見本アッセイ(Cleaning pH 8)、及びpH10での米澱粉汚染小試験見本アッセイ(Cleaning pH10)。性能指数(Pi)は、変異体性能の親タンパク質の性能に対する比と定義される。
完全拘束位置: 試験した性質の中立突然変異無し
不完全拘束位置: 試験した1の性質について少なくとも1の中立突然変異有り
非拘束位置: 少なくとも1の性質について≧ 20% の中立突然変異有り
<粘度計中での液化>
α-アミラーゼの作用によるコーン粉の粘度低下を、HAAKE Viscotester 550装置を用いて測定した。硫酸を用いてpHを5.8に調整した。スラリー(乾燥固形成分15 g)50gを秤量し、撹拌しながら10分間予備インキュベートして温度を70℃まで上げた。α-アミラーゼを添加し、75 rpmで撹拌しながら温度を直ちに70℃から85℃まで上げた。スラリーと酵素の混合物の温度が85℃に達した後、温度を一定に保ちながら粘度を30分間測定した。粘度は継続的に測定した。粘度の単位はμNmで表示する。
<示差走査熱量測定による全長AmyE、AmyE-tr、及びAmyE変異体の熱安定性>
超高感度走査型高速微少熱量計VP-Cap DSC (MicroCal, Inc., Northampton, MA, USA)を用いて、過剰熱容量曲線を測定した。DSC測定の標準的方法と、この測定法の原理は公知である(Freire, E. (1995) Differential Scanning Calorimetry Methods. Mol. Biol. 41:191-218)。0.5 mg/mlのAmyE-trまたは切断AmyE変異体500μLを30-120℃の温度範囲で走査した。同一のサンプルを再走査して、可逆性をチェックした。使用した緩衝液は、pH 4.0またはpH 5.8の10mM酢酸ナトリウムであった。凝集に起因するアーチファクトを最小限にするために、走査速度を200℃/hrとした。DSC曲線の熱中点(Tm)を、熱安定性の指標として用いた。Table 11に、pH 4.0 及びpH 5.8で測定した切断野生型AmyE、及び切断AmyE変異体のTm値を示す。
<パンの劣化>
以下の実施例は、AmyEポリペプチドを使用してパンの劣化を低減させる方法に関する。
標準的な精白パン生地及びUSトースト用パン生地のレシピにより、ベーキング試験を行った。General Mills社の"Gold Medal"小麦粉1400g、水800g、菜種油40g、 7,5 g GRINDSTEDTM SSL P55 Veg、10 gの乳化剤DIMODANTM PH200、及び圧搾酵母60 gを用いて、パン生地を調製した。このパン生地をHobartスパイラルミキサーにより低速で1分間混合し、次にスピード目盛2で3分間混合した。次に、このパン生地を25℃、85% RHで3時間発酵させた。
Stable Micro Systems社, (UK)のTexture Analyserを用いたTexture Profile Analysisにより、スライスしたパンの硬さ、弾力性、及び粘りを評価した。硬さ及び弾力性は、Stable Micro System社, (UK)の装置に予め設定されていた標準法に従って計算した。使用したプローブは、50mmの球状のアルミニウム製のものであった。
硬さは、最初に圧縮しているときの40%圧縮時において評価した。この値は、最初の厚みを40%まで圧縮するために必要な力である。この値が小さい程、柔らかいパンである。硬さは、例えばhPaのように圧力で表される。
AmyEtrを0.4 mg/kg添加したパンをベーキングした後、異なる経過時間後に上記の方法に従って硬さを測定した。パンの硬さを測定した。コントロールとして、酵素無添加のパンの硬さも測定した。
Claims (20)
- α-アミラーゼ活性と、酵素の性能を向上させる少なくとも1の改変された性質とを備えるポリペプチド変異体であって、AmyE (SEQ ID NO: 1)または AmyE切断変異体 (SEQ ID NO: 2)から選択される親α-アミラーゼに対し少なくとも60%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、下記群から選択される1以上の位置が修飾されており、修飾により酵素の性能を向上させる少なくとも1の性質の性能指数(PI)が1より大きいポリペプチド変異体とされている、ポリペプチド変異体:
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び 425。 - 下記群から選択される1以上の位置が修飾されており、修飾によりタンパク質発現の性能指数(PI)が0.5より大きく、酵素の性能を向上させる少なくとも1の性質の性能指数(PI)が1.1より大きいポリペプチド変異体とされている、請求項1に記載のポリペプチド変異体:
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 118, 119, 121, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 140, 141, 142, 143, 144, 147, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 175, 179, 180, 181, 184, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 214, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 324, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び425。 - 前記1以上の位置が下記群から選択され、これらの位置が全長または切断親ポリペプチドのいずれかの性能に関して不完全拘束である、請求項1に記載のポリペプチド変異体:
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 及び425。 - 前記修飾が、次の群から選択される1以上の位置における親ポリペプチド中の1以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基へ置換するものである、請求項1に記載のポリペプチド変異体:
1A, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2K, 2L, 2M, 2N, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2V, 2W, 2Y, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 4H, 4I, 4K, 4L, 4M, 4N, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 4Y, 5A, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H, 5I, 5K, 5L, 5N, 5R, 5V, 5W, 5Y, 6C, 6D, 6E, 6H, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 7A, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I, 7L, 7M, 7N, 7P, 7Q, 7R, 7S, 7T, 7W, 7Y, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8M, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y, 9A, 9C, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9S, 9T, 9V, 9W, 9Y, 10A, 10I, 10L, 10M, 10N, 10P, 10Q, 10S, 10V, 11A, 11F, 11G, 11H, 11M, 11S, 11V, 11W, 11Y, 12I, 12M, 12V, 13A, 13C, 13D, 13E, 13F, 13G, 13I, 13L, 13M, 13Q, 13T, 13V, 13W, 13Y, 14C, 14F, 14G, 14M, 14N, 14S, 14T, 14V, 15A, 15F, 16A, 16D, 16E, 16F, 16G, 16H, 16I, 16L, 16M, 16Q, 16S, 16T, 16V, 17A, 17F, 17I, 17M, 17Q, 17Y, 18A, 18C, 18D, 18E, 18G, 18H, 18M, 18N, 18Q, 18R, 18T, 19A, 19C, 19H, 19L, 19M, 19N, 19S, 19W, 19Y, 20A, 20C, 20D, 20F, 20G, 20H, 20I, 20K, 20L, 20M, 20P, 20Q, 20R, 20S, 20T, 20V, 20W, 20Y, 21A, 21C, 21D, 21E, 21H, 21I, 21K, 21L, 21M, 21N, 21Q, 21R, 21S, 21V, 22I, 22M, 22Q, 22S, 22T, 22V, 23A, 23C, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24D, 24F, 24G, 24L, 24N, 24P, 24Q, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25A, 25C, 25D, 25E, 25F, 25G, 25H, 25I, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26A, 26F, 26I, 26L, 26V, 27A, 27C, 27D, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27M, 27N, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28F, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28T, 28V, 28W, 28Y, 29A, 29C, 29F, 29L, 29M, 29T, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30I, 30K, 30L, 30M, 30N, 30P, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31C, 31E, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31W, 31Y, 32D, 32F, 32G, 32H, 32K, 32L, 32M, 32Q, 32S, 32T, 32V, 32Y, 33A, 33C, 33D, 33E, 33F, 33H, 33I, 33K, 33L, 33M, 33P, 33Q, 33S, 33T, 33W, 33Y, 34A, 34F, 34I, 34P, 34W, 35A, 35C, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35P, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 35Y, 36C, 36D, 36E, 36F, 36H, 36I, 36K, 36L, 36M, 36N, 36Q, 36R, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37M, 37N, 37V, 38A, 38C, 38D, 38E, 38H, 38L, 38M, 38N, 38P, 38V, 39A, 39C, 39I, 39L, 39M, 39N, 39P, 39S, 39V, 40A, 40D, 40M, 40N, 40P, 40Q, 40T, 40V, 40W, 41A, 41C, 41E, 41G, 41N, 41S, 41V, 42A, 42L, 42M, 42P, 42V, 43A, 43G, 43H, 43L, 43M, 43Q, 43S, 43T, 43V, 44A, 44C, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44L, 44M, 44N, 44P, 44R, 44S, 44T, 44V, 44W, 44Y, 45A, 45C, 45F, 45G, 45H, 45I, 45L, 45M, 45N, 45P, 45Q, 45S, 45T, 45Y, 46A, 46C, 46D, 46E, 46F, 46H, 46I, 46L, 46M, 46N, 46Q, 46R, 46S, 46T, 46V, 46W, 46Y, 47A, 47C, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48C, 48D, 48E, 48F, 48H, 48I, 48K, 48L, 48N, 48P, 48S, 48T, 48V, 48W, 49A, 49C, 49D, 49F, 49G, 49H, 49I, 49K, 49L, 49P, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50A, 50C, 50E, 50F, 50G, 50H, 50I, 50K, 50L, 50M, 50N, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51A, 51C, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51M, 51N, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52A, 52C, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52P, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53C, 53E, 53F, 53G, 53H, 53I, 53L, 53N, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 53W, 53Y, 54A, 54C, 54D, 54F, 54G, 54H, 54I, 54L, 54M, 54N, 54P, 54Q, 54R, 54T, 54V, 54W, 54Y, 55A, 55C, 55D, 55E, 55F, 55G, 55H, 55I, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56A, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56M, 56N, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57C, 57D, 57E, 57F, 57H, 57I, 57K, 57L, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57T, 57V, 57W, 57Y, 58A, 58F, 58H, 59A, 59C, 59D, 59E, 59F, 59G, 59H, 59K, 59L, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59V, 59W, 60A, 60C, 60D, 60E, 60G, 60I, 60K, 60L, 60M, 60N, 60Q, 60R, 60T, 60V, 61C, 61D, 61E, 61F, 61M, 61S, 61T, 61V, 62A, 62C, 62D, 62F, 62G, 62H, 62I, 62K, 62L, 62Q, 62S, 62T, 62V, 63A, 63C, 63D, 63F, 63G, 63H, 63K, 63M, 63N, 63R, 63S, 64A, 64G, 64H, 64I, 64L, 64M, 64N, 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417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417P, 417Q, 417S, 417W, 417Y, 418C, 418D, 418E, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418Q, 418R, 418T, 418W, 418Y, 419C, 419D, 419E, 419F, 419G, 419H, 419I, 419L, 419P, 419Q, 419S, 419T, 419Y, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420M, 420N, 420Q, 420R, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421A, 421C, 421G, 421I, 421L, 421M, 421S, 421T, 422A, 422F, 422G, 422H, 422I, 422M, 422N, 422Q, 422S, 422V, 422W, 422Y, 423A, 423D, 423G, 423H, 423I, 423K, 423P, 423Q, 423R, 423T, 423V, 423W, 424D, 424E, 424G, 424I, 424K, 424M, 424N, 424Q, 424R, 424S, 424T, 424V, 424W, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425M, 425S, 425T, 425V, 425W, 及び425Y。 - 前記修飾が、次の群から選択される1以上の位置における親ポリペプチド中の1以上のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基へ置換するものである、請求項1に記載のポリペプチド変異体:
1A, 1D, 1F, 1G, 1H, 1K, 1M, 1N, 1Q, 1R, 1S, 1T, 1V, 1W, 1Y, 2A, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2W, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H, 3I, 3K, 3L, 3M, 3N, 3P, 3Q, 3R, 3S, 3V, 3W, 3Y, 4D, 4E, 4F, 4G, 4I, 4K, 4L, 4Q, 4S, 4T, 4V, 4W, 5A, 5D, 5E, 5F, 5G, 5K, 5L, 5V, 5W, 6D, 6H, 6K, 6L, 6P, 6Q, 6S, 6V, 6W, 7A, 7D, 7E, 7H, 7N, 7Q, 7R, 7S, 8A, 8C, 8E, 8F, 8G, 8H, 8I, 8K, 8L, 8N, 8P, 8Q, 8R, 8T, 8V, 8W, 8Y,9A, 9D, 9E, 9F, 9H, 9I, 9K, 9M, 9N, 9P, 9R, 9V, 9W, 9Y, 10I, 10L, 10M, 10P, 10S, 10V, 11A, 11F, 11M, 11V, 12I, 12M, 13A, 13D, 13Q, 14G, 14S, 14T, 14V, 15F, 16M, 16Q, 18G, 18N, 18R, 19H, 19W, 20A, 20D, 20F, 20G, 20H, 20I, 20K, 20M, 20R, 20S, 20V, 20W, 20Y, 21E, 21I, 21M, 21Q, 21S, 21V, 22I, 22T, 22V, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23L, 23M, 23N, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 24A, 24C, 24F, 24G, 24R, 24S, 24T, 24V, 24Y, 25E, 25F, 25K, 25L, 25R, 25S, 25T, 25V, 25W, 25Y, 26I, 26L, 27A, 27E, 27F, 27G, 27H, 27I, 27L, 27P, 27Q, 27R, 27S, 27T, 27V, 27W, 27Y, 28A, 28C, 28G, 28H, 28I, 28K, 28L, 28M, 28N, 28P, 28Q, 28R, 28S, 28V, 28W, 28Y, 29F, 29L, 29V, 30A, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30L, 30M, 30N, 30Q, 30R, 30S, 30T, 30V, 30W, 30Y, 31A, 31F, 31G, 31H, 31I, 31K, 31L, 31M, 31N, 31Q, 31S, 31T, 31V, 31Y, 32G, 32S, 33A, 33D, 33E, 33H, 33Q, 33S, 34W, 35A, 35F, 35G, 35H, 35I, 35L, 35M, 35N, 35Q, 35R, 35S, 35V, 35W, 36F, 36H, 36I, 36L, 36S, 36T, 36Y, 37L, 37V, 39A, 39P, 39S, 39V, 42V, 43A, 43S, 43T, 43V, 44A, 44D, 44E, 44F, 44G, 44H, 44I, 44K, 44N, 44R, 44S, 44T, 44Y, 45F, 45H, 45I, 45L, 45M, 45S, 45T, 46A, 46D, 46F, 46H, 46L, 46M, 46N, 46R, 47A, 47D, 47F, 47G, 47H, 47I, 47K, 47L, 47N, 47P, 47R, 47S, 47T, 47V, 47Y, 48A, 48E, 48F, 48H, 48N, 48P, 48W, 49A, 49F, 49G, 49H, 49K, 49L, 49Q, 49R, 49S, 49T, 49V, 49W, 49Y, 50E, 50F, 50H, 50I, 50K, 50L, 50M, 50P, 50R, 50S, 50T, 50V, 50W, 50Y, 51D, 51E, 51F, 51H, 51I, 51K, 51L, 51P, 51Q, 51R, 51S, 51T, 51V, 51W, 52E, 52F, 52G, 52H, 52I, 52K, 52L, 52M, 52N, 52Q, 52R, 52S, 52T, 52V, 52W, 52Y, 53A, 53E, 53F, 53H, 53I, 53L, 53P, 53R, 53S, 53T, 53V, 54A, 54C, 54F, 54G, 54H, 54L, 54N, 54P, 54R, 54T, 54W, 54Y, 55A, 55F, 55H, 55N, 55P, 55Q, 55S, 55T, 55Y, 56D, 56E, 56F, 56G, 56I, 56K, 56L, 56P, 56Q, 56R, 56T, 56V, 56W, 56Y, 57A, 57E, 57H, 57M, 57Q, 57R, 57S, 57Y, 58F, 59A, 59C, 59F, 59H, 59N, 59P, 59R, 59S, 59T, 59W, 60L, 60N, 63H, 63N, 64A, 64S, 65A, 65I, 65R, 66D, 66E, 66G, 66M, 66N, 66Q, 66R, 67A, 67F, 67G, 67I, 67L, 67N, 67Q, 67T, 67W, 68D, 68F, 68H, 68I, 68L, 68N, 68R, 68S, 68T, 68V, 68W, 69M, 69V, 72E, 72F, 72G, 72H, 72I, 72K, 72Q, 72S, 72T, 72V, 72W, 72Y, 73F, 73M, 73W, 74M, 74T, 76A, 76L, 76M, 76P, 76Q, 76R, 76Y, 77A, 77D, 77K, 77L, 77R, 77Y, 78D, 78E, 78F, 78G, 78H, 78I, 78K, 78L, 78P, 78R, 78S, 78T, 78W, 78Y, 79A, 79M, 79Q, 79S, 80M, 81E, 81G, 81H, 81L, 81M, 81N, 81Q, 81R, 81S, 81T, 81V, 81Y, 82D, 82F, 82G, 82I, 82K, 82L, 82M, 82Q, 82R, 82S, 82T, 82Y, 83A, 83F, 83L, 84A, 84N, 84S, 84T, 85D, 85E, 85F, 85G, 85I, 85K, 85R, 85S, 85T, 85V, 85W, 86D, 86E, 86F, 86G, 86I, 86K, 86L, 86M, 86N, 86Q, 86R, 86S, 86V, 86W, 86Y, 87G, 88A, 88D, 88F, 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116R, 116T, 116V, 116W, 116Y, 118D, 118F, 118G, 118H, 118K, 118L, 118M, 118N, 118Q, 118R, 118S, 118T, 118V, 118W, 118Y, 119E, 119F, 119I, 119K, 119L, 119M, 119Q, 119S, 119T, 119Y, 121S, 124A, 124K, 124Q, 124R, 124S, 124T, 125A, 125D, 125F, 125I, 125K, 125Q, 125R, 125V, 125Y, 126A, 126C, 126D, 126F, 126G, 126H, 126I, 126K, 126L, 126N, 126P, 126R, 126S, 126T, 126V, 126W, 126Y, 128A, 128C, 128E, 128F, 128G, 128H, 128I, 128L, 128M, 128N, 128Q, 128R, 128S, 128T, 128V, 129C, 129D, 129E, 130A, 130F, 130L, 130T, 130Y, 131A, 131C, 131D, 131F, 131G, 131H, 131I, 131K, 131L, 131N, 131Q, 131T, 131V, 131W, 131Y, 132I, 132N, 132S, 132W, 134E, 134F, 134L, 134M, 134R, 134Y, 135E, 136L, 140A, 141F, 141H, 142C, 142D, 142F, 142G, 142H, 142I, 142K, 142M, 142Q, 142R, 142S, 142T, 142W, 142Y, 143C, 143D, 143K, 143L, 143N, 143Q, 143S, 144T, 147F, 147L, 150H, 151C, 151D, 151E, 151G, 151H, 151K, 151L, 151M, 151Q, 151S, 151T, 152A, 152C, 152E, 152F, 152G, 152H, 152I, 152K, 152L, 152M, 152N, 152P, 152Q, 152R, 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8W, 308Y, 309D, 309E, 309F, 309H, 309K, 309R, 309S, 310A, 311A, 311H, 311K, 311R, 312D, 312F, 312G, 312H, 312I, 312K, 312L, 312M, 312P, 312Q, 312R, 312S, 312T, 312V, 312W, 312Y, 313A, 313D, 313E, 313F, 313K, 313L, 313N, 313Q, 313R, 313S, 313W, 313Y, 314A, 314F, 314H, 314K, 314L, 314M, 314Q, 314R, 314S, 314T, 314W, 314Y, 315K, 315N, 315P, 315T, 316Y, 317A, 317C, 317E, 317F, 317H, 317K, 317L, 317R, 317S, 317T, 317V, 317W, 317Y, 318D, 318F, 318H, 318I, 318K, 318L, 318M, 318N, 318R, 318S, 318T, 318V, 318W, 318Y, 319G, 319L, 319N, 319Q, 319V, 319W, 320C, 320F, 320G, 320I, 320K, 320L, 320M, 320P, 320Q, 320T, 320V, 320Y, 321C, 321D, 321E, 321F, 321G, 321H, 321I, 321K, 321L, 321R, 321S, 321T, 321V, 321W, 322L, 322M, 322V, 324A, 324F, 324G, 324H, 324I, 324K, 324L, 324M, 324N, 324Q, 324R, 324S, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325C, 325D, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325N, 325P, 325T, 325V, 327C, 327D, 327G, 327H, 327N, 327T, 328D, 328E, 328F, 328L, 328N, 328Q, 328Y, 329F, 329H, 329Q, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331G, 331I, 331L, 331Q, 331S, 331T, 331V, 331Y, 332A, 332C, 332G, 332Q, 332S, 333C, 333G, 333H, 333K, 333L, 333M, 333R, 333S, 333W, 333Y, 334D, 334H, 334I, 334L, 334M, 334N, 334R, 334T, 335V, 336A, 336C, 336F, 336G, 336I, 336M, 336N, 336Q, 336R, 336V, 336W, 336Y, 337H, 337N, 337S, 337V, 337W, 337Y, 338G, 338I, 338L, 338M, 338S, 338T, 339C, 340F, 340H, 340K, 340L, 340M, 340N, 340S, 340T, 340V, 340W, 341A, 341L, 341Y, 342A, 342K, 342N, 342R, 342Y, 343A, 343D, 343E, 343F, 343H, 343K, 343L, 343M, 343Q, 343S, 343T, 343W, 343Y, 344A, 344D, 344E, 344F, 344G, 344I, 344K, 344L, 344M, 344N, 344Q, 344R, 344S, 344T, 344W, 344Y, 345C, 345E, 345F, 345G, 345H, 345I, 345N, 345Q, 345S, 345T, 345V, 346C, 346D, 346E, 346I, 346K, 346L, 346M, 346N, 346S, 346T, 346V, 346Y, 347D, 347F, 347H, 347I, 347K, 347L, 347M, 347Q, 347R, 347S, 347T, 347V, 347W, 348F, 348H, 348I, 348K, 348R, 348S, 348T, 348V, 348W, 348Y, 349A, 349F, 349G, 349I, 349K, 349M, 349N, 349R, 349S, 349V, 349W, 349Y, 350D, 351A, 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371I, 371L, 371M, 371N, 371S, 371T, 371Y, 372A, 372C, 372I, 372L, 372N, 372S, 372T, 373A, 373C, 373F, 373I, 373M, 373T, 373V, 374C, 374G, 374I, 374M, 374S, 374T, 374V, 375A, 375C, 375D, 375F, 375H, 375L, 375M, 375Q, 375S, 375T, 375Y, 376G, 376I, 376S, 376T, 376V, 377F, 377H, 377L, 377T, 377W, 377Y, 378C, 378E, 378F, 378G, 378H, 378I, 378K, 378L, 378M, 378N, 378Q, 378R, 378T, 378V, 378W, 378Y, 379A, 379G, 379H, 379I, 379K, 379L, 379Q, 379T, 379Y, 380C, 380E, 380F, 380G, 380H, 380L, 380M, 380N, 380P, 380Q, 380R, 380T, 380V, 380W, 380Y, 381G, 381I, 381Q, 381R, 381S, 381T, 381W, 381Y, 382A, 382C, 382F, 382I, 382K, 382Q, 382R, 382T, 382W, 382Y, 383A, 383F, 383L, 383P, 383Q, 383V, 384A, 384G, 384H, 384I, 384K, 384P, 384Q, 384V, 384W, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385N, 385P, 385Q, 385R, 385S, 385V, 385W, 385Y, 386D, 386F, 386G, 386H, 386L, 386N, 386R, 386S, 386T, 386V, 386W, 386Y, 387I, 387L, 388A, 388C, 388G, 388H, 388L, 388P, 388S, 388T, 388W, 388Y, 389C, 389F, 389I, 389M, 389Q, 389V, 390F, 390I, 390K, 390L, 390N, 390R, 390S, 390T, 390V, 390W, 390Y, 391F, 391K, 391N, 391P, 391R, 391T, 391W, 391Y, 392A, 392C, 392D, 392E, 392F, 392H, 392K, 392L, 392N, 392Q, 392R, 392S, 392V, 392Y, 393A, 393C, 393D, 393F, 393G, 393H, 393I, 393L, 393Q, 393S, 393T, 393V, 393W, 393Y, 394A, 394C, 394F, 394H, 394I, 394K, 394L, 394Q, 394V, 394W, 395F, 395G, 395H, 395K, 395L, 395Q, 395R, 395S, 395T, 395V, 395W, 395Y, 396C, 396D, 396S, 397C, 397D, 397F, 397G, 397H, 397I, 397L, 397P, 397S, 397T, 397V, 397W, 398C, 398G, 398N, 398S, 398T, 398V, 399C, 399F, 399I, 399K, 399L, 399R, 399S, 399T, 399V, 399W, 399Y, 400C, 400D, 400E, 400F, 400G, 400H, 400I, 400K, 400L, 400M, 400Q, 400R, 400S, 400T, 400V, 400W, 400Y, 401A, 401C, 401D, 401E, 401F, 401I, 401K, 401L, 401M, 401N, 401Q, 401R, 401S, 401T, 401V, 401W, 401Y, 402A, 402C, 402D, 402E, 402F, 402G, 402H, 402I, 402K, 402L, 402M, 402N, 402P, 402Q, 402R, 402T, 402V, 402W, 402Y, 403A, 403C, 403H, 403I, 403M, 403V, 403W, 403Y, 404F, 404H, 404M, 404R, 404T, 404V, 404W, 404Y, 405G, 405Q, 405S, 405T, 406L, 406T, 407F, 407G, 407H, 407I, 407K, 407M, 407Q, 407R, 407S, 407T, 407V, 407W, 407Y, 408D, 408E, 408F, 408N, 408V, 409C, 409F, 409I, 409L, 409R, 409T, 409V, 409W, 409Y, 410V, 411E, 411F, 411M, 411Q, 411R, 411S, 411Y, 412N, 412T, 413C, 413F, 413G, 413I, 413L, 413P, 413R, 413S, 413V, 413W, 413Y, 414H, 414L, 414N, 414Q, 414T, 414V, 414W, 415D, 415E, 415G, 415I, 415R, 415V, 415W, 416F, 416L, 416Q, 416Y, 417A, 417C, 417D, 417F, 417G, 417H, 417I, 417K, 417M, 417N, 417Q, 418D, 418F, 418H, 418I, 418K, 418N, 418W, 418Y, 419E, 419F, 419H, 419I, 419L, 419S, 419T, 420D, 420E, 420F, 420G, 420H, 420I, 420K, 420L, 420Q, 420S, 420T, 420V, 420W, 420Y, 421C, 421L, 421M, 421S, 421T, 422F, 422I, 422S, 422W, 423D, 423I, 423Q, 423R, 423T, 424M, 424Q, 424R, 424V, 424Y, 425A, 425I, 425K, 425L, 425V, 及び425Y。 - 置換により位置153のアミノ酸残基がN, KまたはFに変更され、得られたポリペプチド変異体が、親ポリペプチドよりも高いマルトース及びマルトヘプタオース基質からグルコースへの転換能力を示す、請求項4に記載のポリペプチド変異体。
- 置換により位置153のアミノ酸残基がKに変更され、得られたポリペプチド変異体が、親ポリペプチドよりも高いDP7基質からグルコースへの転換能力を示す、請求項4に記載のポリペプチド変異体。
- 前記置換がL142F, L142G, L142Q, L142S, L142W, L142Y, A214I, A214V, S245Y, Q126F, Q126L, Q126P, Q126V, S131L, 及びS254Iから成る群から選択され、置換により得られるポリペプチド変異体が、SEQ ID NO: 1の親ポリペプチドより高い澱粉液化能力を示す、請求項4に記載のポリペプチド変異体。
- 前記置換がW60L, W60M, W60N, I100F, I100M, S105M, S105W, G207A, T270A, T270E, T270L, T270N, T270V, 及びT279Aから成る群から選択され、置換により得られるポリペプチド変異体がSEQ ID NO: 2の親ポリペプチドより高い澱粉液化能力を示す、請求項4に記載のポリペプチド変異体。
- 前記置換が下記群から選択され、この突然変異誘発により、タンパク質と活性の双方のPI値が>0.5になる、請求項4に記載のポリペプチド変異体:
052D, 052E, 052I, 052K, 052L, 052N, 052Q, 052R, 052V, 056D, 056E, 056I, 056K, 056L, 056N, 056Q, 056R, 056V, 089D, 089E, 089I, 089K, 089L, 089N, 089Q, 089R, 089V, 152D, 152E, 152I, 152K, 152L, 152N, 152Q, 152R, 152V, 153D, 153E, 153I, 153K, 153L, 153N, 153Q, 153R, 153V, 201D, 201E, 201I, 201K, 201L, 201N, 201Q, 201R, 201V, 251D, 251E, 251I, 251K, 251L, 251N, 251Q, 251R, 251V, 284D, 284E, 284I, 284K, 284L, 284N, 284Q, 284R, 284V, 297D, 297E, 297I, 297K, 297L, 297N, 297Q, 297R, 297V, 308D, 308E, 308I, 308K, 308L, 308N, 308Q, 308R, 308V, 321D, 321E, 321I, 321K, 321L, 321N, 321Q, 321R, 321V, 328D, 328E, 328I, 328K, 328L, 328N, 328Q, 328R, 328V, 347D, 347E, 347I, 347K, 347L, 347N, 347Q, 347R, 347V, 357D, 357E, 357I, 357K, 357L, 357N, 357Q, 357R, 357V, 359D, 359E, 359I, 359K, 359L, 359N, 359Q, 359R, 359V, 369D, 369E, 369I, 369K, 369L, 369N, 369Q, 369R, 369V, 385D, 385E, 385I, 385K, 385L, 385N, 385Q, 385R, 385V, 388D, 388E, 388I, 388K, 388L, 388N, 388Q, 388R, 388V, 391D, 391E, 391I, 391K, 391L, 391N, 391Q, 391R, 391V, 400D, 400E, 400I, 400K, 400L, 400N, 400Q, 400R, 400V, 416D, 416E, 416I, 416K, 416L, 416N, 416Q, 416R, 及び416V。 - 前記ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドの75, 97, 101, 102, 120, 123, 133, 137, 182, 266, 及び306から成る群から選択される1の位置のアミノ酸残基が修飾されていない、請求項1に記載のポリペプチド変異体。
- 前記ポリペプチド変異体は、切断親ポリペプチドの性能発現のために完全に拘束された位置である75及び123から成る群から選択される1の位置のアミノ酸残基が修飾されていない、請求項1に記載のポリペプチド変異体。
- 前記ポリペプチド変異体は、全長親ポリペプチドの性能発現のために完全に拘束された位置である75, 97, 101, 102, 120, 133, 137, 182, 266,及び306から成る群から選択される1の位置のアミノ酸残基が修飾されていない、請求項1に記載のポリペプチド変異体。
- 前記親ポリペプチドが、SEQ ID NO: 1または2のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性を少なくとも80%有する、請求項1に記載のポリペプチド変異体。
- 前記親ポリペプチドが、SEQ ID NO: 1または2のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性を少なくとも90%有する、請求項1に記載のポリペプチド変異体。
- 前記親ポリペプチドが、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性を少なくとも90%有する、請求項1に記載のポリペプチド変異体。
- 前記酵素性能を向上させる性質が、向上した熱安定性、向上した比活性度、及び向上したタンパク質発現から成る群から選択される、請求項1に記載のポリペプチド変異体。
- 請求項1に記載のポリペプチド変異体を含む洗剤組成物。
- 請求項1に記載のポリペプチド変異体を含む澱粉転換用組成物。
- さらにグルコアミラーゼ活性を有する別のポリペプチドを含有する、請求項19に記載の澱粉転換用組成物。
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