CN102131924A - 来自枯草芽孢杆菌的变体α-淀粉酶及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyE)、其变体、编码其的核酸、和包括该核酸的宿主细胞。公开使用AmyE或其变体的方法，包括淀粉的液化和/或糖化。这些方法可以产生对于乙醇生产或高果糖玉米糖浆生产有用的糖。在某些情况下，该淀粉酶可以在低pH、在缺乏钙的情况下和/或在缺乏葡糖淀粉酶的情况下使用。

Description

来自枯草芽孢杆菌的变体α-淀粉酶及其使用方法
优先权
本申请要求美国临时专利申请61/059,513和61/059,618的优先权，所述美国临时专利申请于2008年6月6日提交，并且整体引入本文作为参考。
发明领域
本发明提供来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的α-淀粉酶(AmyE)、其变体、编码其的核酸、和包括该核酸的宿主细胞。公开了使用AmyE或其变体的方法，包括淀粉的液化和/或糖化。此种方法可以产生对于乙醇生产或高果糖玉米糖浆生产有用的糖。在某些情况下，所述淀粉酶可以在低pH下、在不存在钙的情况下和/或在不存在葡糖淀粉酶的情况下使用。
背景技术
谷物、谷类和蔬菜淀粉例如玉米淀粉广泛用于产品例如糖浆和生物燃料的工业制造中。例如，高果糖玉米糖浆(HFCS)是玉米糖浆的加工形式，具有高果糖含量和与糖相当的甜度，这使得HFCS可以作为代糖在软饮料和其他加工食品中使用。HFCS生产目前是十亿美元的工业。乙醇作为生物燃料的生产也是增长中的工业。
糖浆和生物燃料可以通过催化淀粉分解成葡萄糖的酶促过程由淀粉生产。这种酶促过程一般涉及一系列酶催化的反应：
(1)液化：α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)首先催化淀粉悬浮液降解为麦芽糖糊精，所述淀粉悬浮液可以包含30-40％w/w干固形物(ds)。α-淀粉酶是内切水解酶，催化内部α-1，4-D-糖苷键的随机断裂。因为液化一般在高温例如90-100℃进行，所以热稳定的α-淀粉酶例如来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的α-淀粉酶优选用于这个步骤。目前用于这个步骤的α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的α-淀粉酶(AmyS)，不产生显著量的葡萄糖。相反，所得到的液化物(liquefact)具有低葡萄糖当量(DE)，并且包含麦芽糖和具有高聚合度(DPn)的糖。
(2)糖化：葡糖淀粉酶和/或生麦芽糖α-淀粉酶催化在液化后形成的麦芽糖糊精的非还原末端的水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。糖化作用产生富含葡萄糖或高麦芽糖的糖浆。在前面一种情况下，葡糖淀粉酶一般在酸性条件下在升高的温度，例如60℃，pH 4.3催化糖化。在这个过程中使用的葡糖淀粉酶一般得自真菌，例如在
Figure BDA0000046157560000021
L400中使用的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶或灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶。脱支酶例如支链淀粉酶可以帮助糖化作用。
生麦芽糖α-淀粉酶可替代地可以催化糖化作用，以形成高麦芽糖糖浆。生麦芽糖α-淀粉酶一般具有比葡糖淀粉酶更高的最适pH和更低的最适温度，并且生麦芽糖淀粉酶一般需要Ca2+。目前用于这种应用的生麦芽糖α-淀粉酶包括枯草芽孢杆菌α-淀粉酶、植物淀粉酶和来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α-淀粉酶，
Figure BDA0000046157560000022
L的活性组分。用于产生各种产物的示例性糖化反应描述如下：
Figure BDA0000046157560000023
(3)进一步加工：所述过程的分支点发生在富含葡萄糖的糖浆产生后，在上文反应途径左侧显示。如果最终所需产物是生物燃料，那么酵母可以将富含葡萄糖的糖浆发酵为乙醇。另一方面，如果最终所需产物是富含果糖的糖浆，那么葡萄糖异构酶可以催化富含葡萄糖的糖浆转换为果糖。
糖化是富含葡萄糖的糖浆生产中的限速步骤。糖化一般进行48-72小时，经过所述时间许多真菌葡糖淀粉酶丧失显著活性。此外，尽管生麦芽糖α-淀粉酶和葡糖淀粉酶两者都可以催化糖化作用，但如上所示，这些酶一般在不同最适pH和温度操作。如果2种酶顺次使用，那么2种酶之间在反应条件上的差异将使调节pH和温度成为必要，这减慢总体过程且可能引起不溶性直链淀粉聚集物的形成。
因此，本领域需要由淀粉制备工业产品的改良方法。尤其是，存在改善糖化步骤的效率的需要。
发明概述
本发明描述涉及来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyE)以及相关多肽的组合物和方法。AmyEα-淀粉酶是独特的，因为它在低于pH 5.0，并且甚至在约pH 4-4.5显示出高比活性。此外，Ca2+不影响AmyE的热稳定性，避免了将外源Ca2+加入淀粉液化或糖化反应中的需要。AmyE多肽的这些特征允许液化和糖化在相同反应混合物(和任选地在相同反应容器中)进行，而无需在液化和糖化之间调整反应混合物的pH。特别地，当使用AmyE和葡糖淀粉酶时，无需调整反应条件，从而避免液化和糖化之间的步骤和时间延迟、以及不溶性直链淀粉聚集物的潜在形成。AmyE因此可以与葡糖淀粉酶顺次或同时使用，在对于葡糖淀粉酶最适的pH和Ca2+浓度下，液化和/或糖化淀粉。AmyE还显示葡糖淀粉酶活性，从而减少或消除对具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽执行糖化作用的需要。
在一个方面，提供了用于在淀粉转化过程中液化和糖化淀粉的方法，其包括使淀粉底物与AmyE多肽接触，形成反应混合物用于液化和糖化反应混合物中的该淀粉底物，以产生葡萄糖，其中液化和糖化在相同反应混合物中执行而无需pH调整。
在某些实施方案中，糖化(即，糖化作用)在不存在具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽的情况下执行。在某些实施方案中，液化(即，液化作用)在适合于葡糖淀粉酶多肽活性的pH执行。在某些实施方案中，pH是5.0或更低。在某些实施方案中，pH是4.5或更低。在特定实施方案中，pH是4.0或更低。在某些实施方案中，外源钙不加入反应混合物中。在某些实施方案中，反应混合物中的钙浓度小于约8ppm。
在某些实施方案中，在淀粉底物与AmyE多肽接触前，将具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽加入反应混合物中。在某些实施方案中，在淀粉底物与AmyE多肽接触后，将具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽加入反应混合物中。在某些实施方案中，在淀粉底物与AmyE多肽接触同时，将具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽加入反应混合物中。
在某些实施方案中，该方法进一步包括发酵通过液化和糖化产生的葡萄糖，以产生生物燃料例如醇。在某些实施方案中，醇是乙醇。在某些实施方案中，醇是丁醇。在某些实施方案中，糖化和发酵的至少一部分在相同反应混合物中同时发生，如在SSF的情况下。
在某些实施方案中，在封闭系统中使用分批发酵方法，其中在发酵开始时选择反应混合物的组成(包括pH)，并且在发酵过程中不改变。在另一个实施方案中，使用“补料分批发酵，，系统，其中淀粉底物随发酵进展而增量地加入。在另外一个实施方案中，使用连续发酵系统，其中确定的发酵培养基被连续加入生物反应器中，并且等量的条件反应混合物被取出用于加工。
在某些实施方案中，糖化后的淀粉溶液被转化成基于果糖-淀粉的糖浆(HFSS)，例如HFCS。至HFSS的转化可以在约6.0-约8.0的pH，例如pH 7.5催化，并且产物可以包含约40-45％果糖。在某些实施方案中，该方法进一步包括使通过液化和糖化产生的葡萄糖与葡萄糖异构酶接触，以产生果糖(例如，以HFCS的形式)。在某些实施方案中，外源钙不加入反应混合物中。在某些实施方案中，反应混合物中的钙浓度小于约8ppm。在某些实施方案中，该方法进一步包括在不减少反应混合物中的钙量的情况下，使通过液化和糖化产生的葡萄糖与葡萄糖异构酶接触以产生果糖。
在某些实施方案中，AmyE多肽以约0.03-1kg/公吨干固形物(ds)的量加入反应混合物中。在某些实施方案中，反应混合物是具有约20-35％ds(w/w)的淀粉浆。糖化反应可以在约60℃-约90℃的温度，例如70℃-85℃，或甚至低于淀粉糊化温度10、12、14、16、18、或甚至20℃(即，约75℃)的温度，和约4.0-约6.0的pH，例如pH约4.2-约4.8，执行。在某些实施方案中，糖化反应的产物是富含葡萄糖的糖浆。葡萄糖浓度可以达到至少约95％w/w ds。
在某些实施方案中，AmyE多肽是任何天然存在的AmyE多肽，例如具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的AmyE多肽，或与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，例如用BLAST序列比对算法测量的。在特定实施方案中，在方法中使用的AmyE多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在特定实施方案中，在方法中使用的AmyE多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
在某些实施方案中，在方法中使用的AmyE多肽包括C末端淀粉结合结构域的缺失。在特定实施方案中，具有C末端缺失的AmyE多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在特定实施方案中，AmyE多肽从残基D425截短(参考SEQ ID NO：1)。
在另一个方面，提供具有有利性质的AmyE变体。与野生型AmyE多肽比较，AmyE变体可以具有一种或多种改变的性质，例如在对淀粉、麦芽七糖和/或麦芽三糖底物的比活性，底物特异性，热稳定性，最适温度，最适pH，pH和/或温度范围，氧化稳定性，减少淀粉组合物粘度的能力等方面的改变性质。在某些情况下，AmyE变体的改变性质涉及在特定pH(例如，4或5.8)对特定玉米面粉、麦芽三糖、麦芽七糖底物的比活性，在特定温度(例如，60℃)的热稳定性，或在特定pH(例如，8或pH 10)的清洁性能。改变的性质可以由性能指数(PI)表征，其中PI是AmyE变体与野生型AmyE的性能比。在某些实施方案中，PI大于约0.5，而在其他实施方案中，PI是约1或大于1。
在一个方面，变体多肽具有α-淀粉酶活性和改善酶性能的至少一种改变的特征，该变体多肽包括：
与选自AmyE(SEQ ID NO：1)或AmyE截短变体(SEQ ID NO：2)的亲本α-淀粉酶多肽具有至少60％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，和
在选自1，2，3，4，5，
6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417、418、419、420、421、422、423、424和425的一个或多个位置上的修饰。
其中所述修饰产生对于改善酶性能的至少一种特征具有大于1.0的性能指数(PI)的变体多肽。
在某些实施方案中，变体多肽包括在选自：
1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，39，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，63，64，65，66，67，68，69，72，73，74，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，98，99，100，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，118，119，121，124，125，126，128，129，130，131，132，134，135，136，140，141，142，143，144，147，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，170，171，172，175，179，180，181，184，186，187，188，189，190，192，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，207，209，211，212，213，214，217，218，219，221，222，223，224，225，226，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，267，268，270，271，272，273，274，275，276，277，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，324，325，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424和425的一个或多个位置上的修饰，
其中所述修饰产生对于蛋白质表达具有大于0.5的性能指数(PI)、且对于改善酶性能的至少一种特征具有大于1.1的PI的变体多肽。
在某些实施方案中，该一个或多个位置选自：
1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，98，99，100，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，121，122，124，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419、420、421、422、423、424和425，所述位置在全长或截短亲本多肽中就性能而言不是完全限制性的。
在某些实施方案中，修饰是选自如下的在一个或多个位置上亲本多肽中存在的一个或多个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基：
1A，1C，1D，1E，1F，1G，1H，1K，1M，1N，1Q，1R，1S，1T，1V，1W，1Y，2A，2C，2D，2E，2F，2G，2H，2I，2K，2L，2M，2N，2P，2Q，2R，2S，2V，2W，2Y，3C，3D，3E，3F，3G，3H，3I，3K，3L，3M，3N，3P，3Q，3R，3S，3V，3W，3Y，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4K，4L，4M，4N，4Q，4S，4T，4V，4W，4Y，5A，5C，5D，5E，5F，5G，5H，5I，5K，5L，5N，5R5V，5W，5Y，6C，6D，6E，6H，6K，6L，6M，6N，6P，6Q，6R，6S，6T，6V，6W，7A，7C，7D，7E，7F，7G，7H，7I，7L，7M，7N，7P，7Q，7R，7S，7T，7W，7Y，8A，8C，8E，8F，8G，8H，8I，8K，8L8M，8N，8P，8Q，8R，8T，8V，8W，8Y，9A，9C，9D，9E，9F，9H，9I，9K，9M，9N，9P，9R，9S，9T，9V，9W，9Y，10A，10I，10L，10M，10N，10P，10Q，10S，10V，11A，11F，11G，11H，11M，11S，11V，11W，11Y，12I，12M，12V，13A，13C，13D，13E，13F，13G，13I，13L，13M，13Q，13T，13V，13W，13Y，14C，14F，14G，14M，14N，14S，14T，14V，15A，15F，16A，16D，16E，16F，16G，16H，16I，16L，16M，16Q，16S，16T，16V，17A，17F，17I，17M，17Q，17Y，18A，18C，18D，18E，18G，18H，18M，18N，18Q，18R，18T，19A，19C，19H，19L，19M，19N，19S，19W，19Y，20A，20C，20D，20F，20G，20H，20I，20K，20L，20M，20P，20Q，20R，20S，20T，20V，20W，20Y，21A，21C，21D，21E，21H，21I，21K，21L，21M，21N，21Q，21R，21S，21V，22I，22M，22Q，22S，22T，22V，23A，23C，23D，23E，23F，23G，23H，23I，23L，23M，23N，23R，23S，23T，23V，23W，23Y，24A，24C，24D，24F，24G，24L，24N，24P，24Q，24R，24S，24T，24V，24Y，25A，25C，25D，25E，25F，25G，25H，25I，25K，25L，25R，25S，25T，25V，25W，25Y，26A，26F，26I，26L，26V，27A，27C，27D，27E，27F，27G，27H，27I，27L，27M，27N，27P，27Q，27R，27S，27T，27V，27W，27Y，28A，28C，28F，28G，28H，28I，28K，28L，28M，28N，28P，28Q，28R，28S，28T，28V，28W，28Y，29A，29C，29F，29L，29M，29T，29V，30A，30C，30D，30E，30F，30G，30I，30K，30L，30M，30N，30P，30Q，30R，30S，30T，30V，30W，30Y，31A，31C，31E，31F，31G，31H，31I，31K，31L，31M，31N，31Q，31S，31T，31V，31W，31Y，32D，32F，32G，32H，32K，32L，32M，32Q，32S，32T，32V，32Y，33A，33C，33D，33E，33F，33H，33I，33K，33L，33M，33P，33Q，33S，33T，33W，33Y，34A，34F，34I，34P，34W，35A，35C，35F，35G，35H，35I，35L，35M，35N，35P，35Q，35R，35S，35V，35W，35Y，36C，36D，36E，36F，36H，36I，36K，36L，36M，36N，36Q，36R，36S，36T，36Y，37L，37M，37N，37V，38A，38C，38D，38E，38H，38L，38M，38N，38P，38V，39A，39C，39I，39L，39M，39N，39P，39S，39V，40A，40D，40M，40N，40P，40Q，40T，40V，40W，41A，41C，41E，41G，41N，41S，41V，42A，42L，42M，42P，42V，43A，43G，43H，43L，43M，43Q，43S，43T，43V，44A，44C，44D，44E，44F，44G，44H，44I，44K，44L，44M，44N，44P，44R，44S，44T，44V，44W，44Y，45A，45C，45F，45G，45H，45I，45L，45M，45N，45P，45Q，45S，45T，45Y，46A，46C，46D，46E，46F，46H，46I，46L，46M，46N，46Q，46R，46S，46T，46V，46W，46Y，47A，47C，47D，47F，47G，47H，47I，47K，47L，47N，47P，47R，47S，47T，47V，47Y，48A，48C，48D，48E，48F，48H，48I，48K，48L，48N，48P，48S，48T，48V，48W，49A，49C，49D，49F，49G，49H，49I，49K，49L，49P，49Q，49R，49S，49T，49V，49W，49Y，50A，50C，50E，50F，50G，50H，50I，50K，50L，50M，50N，50P，50R，50S，50T，50V，50W，50Y，51A，51C，51D，51E，51F，51H，51I，51K，51L，51M，51N，51P，51Q，51R，51S，51T，51V，51W，52A，52C，52E，52F，52G，52H，52I，52K，52L，52M，52N，52P，52Q，52R，52S，52T，52V，52W，52Y，53A，53C，53E，53F，53G，53H，53I，53L，53N，53P，53R，53S，53T，53V，53W，53Y，54A，54C，54D，54F，54G，54H，54I，54L，54M，54N，54P，54Q，54R，54T，54V，54W，54Y，55A，55C，55D，55E，55F，55G，55H，55I，55N，55P，55Q，55S，55T，55Y，56A，56D，56E，56F，56G，56I，56K，56L，56M，56N，56P，56Q，56R，56T，56V，56W，56Y，57A，57C，57D，57E，57F，57H，57I，57K，57L，57M，57Q，57R，57S，57T，57V，57W，57Y，58A，58F，58H，59A，59C，59D，59E，59F，59G，59H，59K，59L，59N，59P，59R，59S，59T，59V，59W，60A，60C，60D，60E，60G，60I，60K，60L，60M，60N，60Q，60R，60T，60V，61C，61D，61E，61F，61M，61S，61T，61V，62A，62C，62D，62F，62G，62H，62I，62K，62L，62Q，62S，62T，62V，63A，63C，63D，63F，63G，63H，63K，63M，63N，63R，63S，64A，64G，64H，64I，64L，64M，64N，64S，64V，64Y，65A，65C，65E，65H，65I，65K，65L，65M，65Q，65R，65S，66D，66E，66F，66G，66H，66I，66K，66L，66M，66N，66Q，66R，66T，66V，66W，66Y，67A，67C，67D，67E，67F，67G，67I，67K，67L，67N，67P，67Q，67S，67T，67W，68A，68C，68D，68E，68F，68G，68H，68I，68L，68M，68N，68P，68R，68S，68T，68V，68W，68Y，69A，69C，69M，69P，69T，69V，70A，70E，70H，70N，70S，71S，72C，72D，72E，72F，72G，72H，72I，72K，72L，72P，72Q，72S，72T，72V，72W，72Y，73A，73C，73E，73F，73H，73I，73K，73L，73M，73P，73S，73T，73V，73W，74A，74E，74F，74M，74S，74T，74Y，75A，75C，75D，75E，75P，76A，76D，76E，76F，76G，76I，76L，76M，76P，76Q，76R，76S，76V，76Y，77A，77C，77D，77G，77H，77I，77K，77L，77R，77S，77T，77V，77W，77Y，78A，78C，78D，78E，78F，78G，78H，78I，78K，78L，78M，78N，78P，78R，78S，78T，78V，78W，78Y，79A，79G，79L，79M，79N，79Q，79S，79T，80A，80L，80M，80W，80Y，81A，81C，81D，81E，81G，81H，81I，81L，81M，81N，81Q，81R，81S，81T，81V，81W，81Y，82A，82D，82F，82G，82I，82K，82L，82M，82Q，82R，82S，82T，82V，82W，82Y，83A，83F，83I，83L，83T，83V，84A，84D，84E，84G，84I，84K，84M，84N，84Q，84S，84T，84V，85D，85E，85F，85G，85I，85K，85L，85M，85N，85R，85S，85T，85V，85W，86C，86D，86E，86F，86G，86I，86K，86L，86M，86N，86Q，86R，86S，86V，86W，86Y，87F，87G，87T，88A，88C，88D，88F，88G，88H，88I，88K，88L，88M，88N，88Q，88R，88S，88T，88V，88W，88Y，89A，89C，89D，89F，89G，89H，89I，89K，89L，89M，89N，89P，89Q，89R，89S，89T，89V，89W，89Y，90C，90D，90E，90F，90G，90H，90I，90K，90L，90M，90N，90Q，90R，90S，90T，90V，90W，91A，91C，91D，91E，91F，91H，91K，91L，91M，91N，91P，91Q，91R，91S，91T，91W，91Y，92L，92N，92T，92V，93A，93C，93D，93E，93F，93G，93I，93L，93M，93N，93P，93Q，93R，93S，93T，93V，93W，93Y，94A，94C，94I，94M，94T，95A，95F，95L，95M，95V，95Y，96A，96C，96I，96L，96M，96P，96T，97A，97E，97M，97W，98C，98G，98I，98L，98M，98T，98V，99A，99C，99E，99F，99G，99I，99L，99M，99N，99P，99S，99T，100A，100C，100F，100M，100N，100P，100T，100V，100Y，101A，102A，102G，102Q，102S，102W，102Y，103A，103C，103I，103M，103N，103S，103V，104A，104C，104S，105C，105D，105E，105F，105G，105H，105K，105L，105M，105Q，105R，105T，105V，105W，105Y，106A，106C，106E，106F，106H，106I，106K，106L，106M，106N，1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在某些实施方案中，修饰是选自如下的在一个或多个位置上亲本多肽中存在的一个或多个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基：
1A、1D、1F、1G、1H、1K、1M、1N、1Q、1R、1S、1T、1V、1W、1Y，2A，2E，2F，2G，2H，2I，2P，2Q，2R，2S，2W，3D，3E，3F，3G，3H，3I，3K，3L，3M，3N，3P，3Q，3R，3S，3V，3W，3Y，4D，4E，4F，4G，4I，4K，4L，4Q，4S，4T，4V，4W，5A，5D，5E，5F，5G，5K，5L，5V，5W，6D，6H，6K，6L，6P，6Q，6S，6V，6W，7A，7D，7E，7H，7N，7Q，7R，7S，8A，8C，8E，8F，8G，8H，8I，8K，8L，8N，8P，8Q，8R，8T，8V，8W，8Y，9A，9D，9E，9F，9H，9I，9K，9M，9N，9P，9R，9V，9W，9Y，10I，10L，10M，10P，10S，10V，11A，11F，11M，11V，12I，12M，13A，13D，13Q，14G，14S，14T，14V，15F，16M，16Q，18G，18N，18R，19H，19W，20A，20D，20F，20G，20H，20I，20K，20M，20R，20S，20V，20W，20Y，21E，21I，21M，21Q，21S，21V，22I，22T，22V，23A，23D，23E，23F，23G，23H，23I，23L，23M，23N，23R，23S，23T，23V，23W，23Y，24A，24C，24F，24G，24R，24S，24T，24V，24Y，25E，25F，25K，25L，25R，25S，25T，25V，25W，25Y，26I，26L，27A，27E，27F，27G，27H，27I，27L，27P，27Q，27R，27S，27T，27V，27W，27Y，28A，28C，28G，28H，28I，28K，28L，28M，28N，28P，28Q，28R，28S，28V，28W，28Y，29F，29L，29V，30A，30C，30D，30E，30F，30G，30L，30M，30N，30Q，30R，30S，30T，30V，30W，30Y，31A，31F，31G，31H，31I，31K，31L，31M，31N，31Q，31S，31T，31V，31Y，32G，32S，33A，33D，33E，33H，33Q，33S，34W，35A，35F，35G，35H，35I，35L，35M，35N，35Q，35R，35S，35V，35W，36F，36H，36I，36L，36S，36T，36Y，37L，37V，39A，39P，39S，39V，42V，43A，43S，43T，43V，44A，44D，44E，44F，44G，44H，44I，44K，44N，44R，44S，44T，44Y，45F，45H，45I，45L，45M，45S，45T，46A，46D，46F，46H，46L，46M，46N，46R，47A，47D，47F，47G，47H，47I，47K，47L，47N，47P，47R，47S，47T，47V，47Y，48A，48E，48F，48H，48N，48P，48W，49A，49F，49G，49H，49K，49L，49Q，49R，49S，49T，49V，49W，49Y，50E，50F，50H，50I，50K，50L，50M，50P，50R，50S，50T，50V，50W，50Y，51D，51E，51F，51H，51I，51K，51L，51P，51Q，51R，51S，51T，51V，51W，52E，52F，52G，52H，52I，52K，52L，52M，52N，52Q，52R，52S，52T，52V，52W，52Y，53A，53E，53F，53H，53I，53L，53P，53R，53S，53T，53V，54A，540，54F，54G，54H，54L，54N，54P，54R，54T，54W，54Y，55A，55F，55H，55N，55P，55Q，55S，55T，55Y，56D，56E，56F，56G，56I，56K，56L，56P，56Q，56R，56T，56V，56W，56Y，57A，57E，57H，57M，57Q，57R，57S，57Y，58F，59A，59C，59F，59H，59N，59P，59R，59S，59T，59W，60L，60N，63H，63N，64A，64S，65A，65I，65R，66D，66E，66G，66M，66N，66Q，66R，67A，67F，67G，67I，67L，67N，67Q，67T，67W，68D，68F，68H，68I，68L，68N，68R，68S，68T，68V，68W，69M，69V，72E，72F，72G，72H，72I，72K，72Q，72S，72T，72V，72W，72Y，73F，73M，73W，74M，74T，76A，76L，76M，76P，76Q，76R，76Y，77A，77D，77K，77L，77R，77Y，78D，78E，78F，78G，78H，78I，78K，78L，78P，78R，78S，78T，78W，78Y，79A，79M，79Q，79S，80M，81E，81G，81H，81L，81M，81N，81Q，81R，81S，81T，81V，81Y，82D，82F，82G，82I，82K，82L，82M，82Q，82R，82S，82T，82Y，83A，83F，83L，84A，84N，84S，84T，85D，85E，85F，85G，85I，85K，85R，85S，85T，85V，85W，86D，86E，86F，86G，86I，86K，86L，86M，86N，86Q，86R，86S，86V，86W，86Y，87G，88A，88D，88F，88G，88H，88K，88L，88M，88N，88Q，88R，88S，88T，88W，88Y，89D，89F，89G，89H，89I，89K，89L，89M，89N，89P，89Q，89R，89S，89T，89V，89W，89Y，90D，90E，90F，90H，90I，90K，90M，90N，90R，90S，90T，90V，90W，91D，91E，91H，91K，91N，91Q，91R，91S，92L，92V，93A，93D，93G，93M，93N，93R，93S，93Y，94I，95F，95M，96I，98C，99I，100C，100F，100M，100V，103A，103C，103V，104A，104S，105C，105D，105E，105F，105G，105M，105W，105Y，106E，106H，106N，106Q，106S，106T，106Y，107A，107C，107E，107F，107G，107H，107I，107K，107L，107M，107N，107P，107Q，107R，107S，107T，107V，107W，108C，108D，108E，108F，108G，108H，108I，108K，108L，108N，108P，108R，108S，108T，108V，108W，108Y，109D，109H，109I，109K，109L，109N，109R，109S，109V，109W，109Y，110V，111C，111E，111F，111G，111H，111K，111L，111M，111N，111Q，111R，111T，112A，112D，112E，112H，112K，112L，112R，112S，112T，112W，112Y，113A，114L，115A，115H，115I，115L，115R，115V，115Y，116A，116F，116G，116H，116I，116L，116N，116Q，116R，116T，116V，116W，116Y，118D，118F，118G，118H，118K，118L，118M，118N，118Q，118R，118S，118T，118V，118W，118Y，119E，119F，119I，119K，119L，119M，119Q，119S，119T，119Y，121S，124A，124K，124Q，124R，124S，124T，125A，125D，125F，125I，125K，125Q，125R，125V，125Y，126A，126C，126D，126F，126G，126H，126I，126K，126L，126N，126P，126R，126S，126T，126V，126W，126Y，128A，128C，128E，128F，128G，128H，128I，128L，128M，128N，128Q，128R，128S，128T，128V，1290，129D，129E，130A，130F，130L，130T，130Y，131A，131C，131D，131F，131G，131H，131I，131K，131L，131N，131Q，131T，131V，131W，131Y，132I，132N，132S，132W，134E，134F，134L，134M，134R，134Y，135E，136L，140A，141F，141H，142C，142D，142F，142G，142H，142I，142K，142M，142Q，142R，142S，142T，142W，142Y，143C，143D，143K，143L，143N，143Q，143S，144T，147F，147L，150H，151C，151D，151E，151G，151H，151K，151L，151M，151Q，151S，151T，152A，152C，152E，152F，152G，152H，152I，152K，152L，152M，152N，152P，152Q，152R，152S，152V，152W，152Y，153E，153F，153H，153K，153L，153N，153R，153T，153V，153W，153Y，154A，155M，156A，156F，156G，156K，156L，156Q，156R，156V，156Y，157F，157H，158A，158I，158M，158T，158V，159H，159I，159L，159M，160A，160C，160D，160E，160F，160G，160H，160I，160K，160L，160M，160Q，160S，160T，160V，162I，162M，163A，163E，163F，163G，163H，163I，163K，163L，163N，163Q，163R，163S，163T，163V，163W，163Y，164G，164H，164L，164N，164S，164T，164V，164W，164Y，165C，165I，165L，165M，165T，165V，166C，166I，166M，166V，167A，167C，167E，167F，167G，167I，167K，167L，167M，167Q，167R，167S，167T，167V，167W，167Y，1680，168E，168F，168G，168K，168L，168M，168N，168S，168T，168V，168W，168Y，170C，171E，171H，171I，171M，171N，171Q，171R，172A，175Y，179A，179C，179G，179H，179S，179W，180M，181V，184D，186E，187E，187F，187H，1871，187K，187M，187Q，187S，187V，187W，188A，188D，188F，188G，188I，188K，188L，188M，188P，188Q，188R，188T，188V，189F，189W，190H，190K，190Q，190R，190S，192G，192K，192L，192P，192S，192V，195D，195F，195G，195H，195K，195M，195R，195V，195W，196A，196C，196E，196F，196H，196I，196K，196L，196M，196Q，196R，196S，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349F，349G，349I，349K，349M，349N，349R，349S，349V，349W，349Y，350D，351A，351D，351G，351H，351K，351L，351M，351P，351Q，351R，351T，351V，351W，351Y，352A，352H，352Q，352T，352Y，353A，353D，353E，353G，353I，353K，353L，353M，353Q，353V，353W，353Y，355C，355F，355I，355L，355M，355V，355Y，356D，356F，356G，356I，356K，356L，356P，356Q，356T，356W，356Y，357A，357H，357I，357K，357L，357N，357Q，357R，357S，357T，357V，357W，357Y，358C，358D，358F，358G，358H，358I，358K，358L，358M，358Q，358R，358S，358T，358V，358Y，359D，359E，359H，359L，359M，359P，359Q，359R，359T，359V，359W，360F，360P，360T，361C，361L，361M，361N，361Q，361S，361T，361V，362A，362C，362I，362L，362V，362Y，363D，363G，363H，363Q，363R，363S，363V，363W，363Y，364A，364C，364G，364I，364L，364M，364Q，364S，364T，364V，365C，365I，365K，365L，365N，365R，365S，365V，366A，366K，367L，367M，367N，367R，367S，367T，367W，367Y，368G，368I，368K，368L，368R，368T，368V，368W，369C，369D，369E，369F，369G，369I，369K，369L，369N，369Q，369S，369T，369V，369Y，371A，371C，371F，371I，371L，371M，371N，371S，371T，371Y，372A，372C，372I，372L，372N，372S，372T，373A，373C，373F，373I，373M，373T，373V，374C，374G，374I，374M，374S，374T，374V，375A，375C，375D，375F，375H，375L，375M，375Q，375S，375T，375Y，376G，376I，376S，376T，376V，377F，377H，377L，377T，377W，377Y，378C，378E，378F，378G，378H，378I，378K，378L，378M，378N，378Q，378R，378T，378V，378W，378Y，379A，379G，379H，379I，379K，379L，379Q，379T，379Y，380C，380E，380F，380G，380H，380L，380M，380N，380P，380Q，380R，380T，380V，380W，380Y，381G，381I，381Q，381R，381S，381T，381W，381Y，382A，382C，382F，382I，382K，382Q，382R，382T，382W，382Y，383A，383F，383L，383P，383Q，383V，384A，384G，384H，384I，384K，384P，384Q，384V，384W，385C，385F，385H，385I，385K，385L，385N，385P，385Q，385R，385S，385V，385W，385Y，386D，386F，386G，386H，386L，386N，386R，386S，386T，386V，386W，386Y，387I，387L，388A，388C，388G，388H，388L，388P，388S，388T，388W，388Y，389C，389F，389I，389M，389Q，389V，390F，390I，390K，390L，390N，390R，390S，390T，390V，390W，390Y，391F，391K，391N，39IP，391R，391T，391W，391Y，392A，392C，392D，392E，392F，392H，392K，392L，392N，392Q，392R，392S，392V，392Y，393A，393C，393D，393F，393G，393H，393I，393L，393Q，393S，393T，393V，393W，393Y，394A，394C，394F，394H，394I，394K，394L，394Q，394V，394W，395F，395G，395H，395K，395L，395Q，395R，395S，395T，395V，395W，395Y，396C，396D，396S，397C，397D，397F，397G，397H，397I，397L，397P，397S，397T，397V，397W，398C，398G，398N，398S，398T，398V，399C，399F，399I，399K，399L，399R，399S，399T，399V，399W，399Y，400C，400D，400E，400F，400G，400H，400I，400K，400L，400M，400Q，400R，400S，400T，400V，400W，400Y，401A，401C，401D，401E，401F，401I，401K，401L，401M，401N，401Q，401R，401S，401T，401V，401W，401Y，402A，402C，402D，402E，402F，402G，402H，402I，402K，402L，402M，402N，402P，402Q，402R，402T，402V，402W，402Y，403A，403C，403H，403I，403M，403V，403W，403Y，404F，404H，404M，404R，404T，404V，404W，404Y，405G，405Q，405S，405T，406L，406T，407F，407G，407H，407I，407K，407M，407Q，407R，407S，407T，407V，407W，407Y，408D，408E，408F，408N，408V，409C，409F，409I，409L，409R，409T，409V，409W，409Y，410V，411E，411F，411M，411Q，411R，411S，411Y，412N，412T，413C，413F，413G，413I，413L，413P，413R，413S，413V，413W，413Y，414H，414L，414N，414Q，414T，414V，414W，415D，415E，415G，415I，415R，415V，415W，416F，416L，416Q，416Y，417A，417C，417D，417F，417G，417H，417I，417K，417M，417N，417Q，418D，418F，418H，418I，418K，418N，418W，418Y，419E，419F，419H，419I，419L，419S，419T，420D，420E，420F，420G，420H，420I，420K，420L，420Q，420S，420T，420V，420W，420Y，421C，421L，421M，421S，421T，422F，422I，422S，422W，423D，423I，423Q，423R，423T，424M、424Q、424R、424V、424Y、425A、425I、425K、425L、425V和425Y。
在某些实施方案中，置换使在位置153上存在的氨基酸残基改变为N、K或F，并且与亲本多肽比较，变体多肽显示将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力增加。在某些实施方案中，置换使在位置153上存在的氨基酸残基改变为K，并且与亲本多肽比较，变体多肽显示将DP7底物转化为葡萄糖的能力增加。
在某些实施方案中，置换选自L142F、L142G、L142Q、L142S、L142W、L142Y、A214I、A214V、S245Y、Q126F、Q126L、Q126P、Q126V、S131L和S254I，并且其中与SEQ ID NO：1的亲本多肽比较，置换改善变体多肽的淀粉液化性能。在某些实施方案中，置换选自W60L、W60M、W60N、I100F、I100M、S105M、S105W、G207A、T270A、T270E、T270L、T270N、T270V和T279A，并且其中与SEQ ID NO：2的亲本多肽比较，置换改善变体多肽的淀粉液化性能。
在某些实施方案中，置换选自：052D，052E，052I，052K，052L，052N，052Q，052R，052V，056D，056E，056I，056K，056L，056N，056Q，056R，056V，089D，089E，089I，089K，089L，089N，089Q，089R，089V，152D，152E，152I，152K，152L，152N，152Q，152R，152V，153D，153E，153I，153K，153L，153N，153Q，153R，153V，201D，201E，201I，201K，201L，201N，201Q，201R，201V，251D，251E，251I，251K，251L，251N，251Q，251R，251V，284D，284E，284I，284K，284L，284N，284Q，284R，284V，297D，297E，297I，297K，297L，297N，297Q，297R，297V，308D，308E，308I，308K，308L，308N，308Q，308R，308V，321D，321E，321I，321K，321L，321N，321Q，321R，321V，328D，328E，328I，328K，328L，328N，328Q，328R，328V，347D，347E，347I，347K，347L，347N，347Q，347R，347V，357D，357E，357I，357K，357L，357N，357Q，357R，357V，359D，359E，359I，359K，359L，359N，359Q，359R，359V，369D，369E，369I，369K，369L，369N，369Q，369R，369V，385D，385E，385I，385K，385L，385N，385Q，385R，385V，388D，388E，388I，388K，388L，388N，388Q，388R，388V，391D，391E，391I，391K，391L，391N，391Q，391R、391V、400D、400E、400I、400K、400L、400N、400Q、400R、400V、416D、416E、416I、416K、416L、416N、416Q、416R和416V，所述突变对于蛋白质和活性两者具有＞0.5的PI值。
在某些实施方案中，变体多肽不包括在选自亲本多肽的75、97、101、102、120、123、133、137、182、266和306的位置上的氨基酸残基修饰。在某些实施方案中，变体多肽不包括在选自75和123的位置上的氨基酸残基修饰，所述位置被确定为在截短亲本多肽中是对于性能而言完全限制性的。在某些实施方案中，变体多肽不包括在选自75、97、101、102、120、133、137、182、266和306的位置上的氨基酸残基修饰，所述位置被确定为在全长亲本多肽中是对于性能而言完全限制性的。
在某些实施方案中，亲本多肽与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，亲本多肽与SEQ IDNO：1或2的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，亲本多肽与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，改善酶性能的特征选自增加的热稳定性、增加的比活性和增加的蛋白质表达。
在某些实施方案中，改善酶性能的特征选自增加的热稳定性、增加的比活性和增加的蛋白质表达。
本发明还提供包括AmyE多肽(包括变体)和任选地下述酶的淀粉加工组合物：葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、异淀粉酶或其组合。在特定实施方案中，组合物包括具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽。
本发明还提供在溶液或凝胶中包括AmyE多肽(包括变体)的烘焙组合物。烘焙方法包括将烘焙组合物加入待烘焙的物质中，和烘焙该物质。在一个相关方面，用于减少面包陈化的方法包括将足以与用缺乏AmyE多肽的等价面包面团观察到的陈化量比较减少陈化的AmyE多肽量，加入面包面团中。
在另一个方面，提供了清洁组合物，其包括在水溶液中的AmyE多肽(包括变体)和任选地另外的酶、洗涤剂和/或漂白试剂。清洁溶液可以用于洗衣、洗餐具或清洁其他表面。在相关方法中，使餐具、衣物或其他表面与清洁组合物接触足以使物品清洁的时间。
在另一个方面，提供纺织品退浆组合物，其包括在水溶液中的AmyE多肽(包括变体)和任选地另外的酶。在相关方法中，使纺织品与退浆组合物接触足以使纺织品退浆的时间。
在另一个方面，提供编码AmyE变体的核酸、包括此种多核苷酸的表达载体和表达AmyE变体的宿主细胞。在另外一个方面，提供与编码本文所述任何AmyE变体的核酸互补的核酸。此外，提供能够与编码本文所述任何AmyE变体的核酸杂交的核酸，或其互补体。在另一个方面，提供涉及编码本文所述任何AmyE变体的合成核酸的组合物和方法，其中密码子任选地就在特定宿主生物中的表达进行了优化。
组合物和方法的这些和其他方面和实施方案由于以下描述和附图将是显而易见的。
附图简述
图1描述了在具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的AmyE(本文称为“AmyE全长”)和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的AmyE(本文称为“Amy31A”)之间的序列比对。氨基酸序列中的差异以粗体显示。残基从成熟形式酶的第一个氨基酸开始编号。
图2描述了质粒pME630-7，其包括编码AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的多核苷酸(标记为“SAMY 425aa”)。该质粒包括与SAMY基因符合读框的编码来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号序列的多核苷酸(标记为“pre LAT”)。
图3描述了AmyE(SEQ ID NO：1；“AmyE全长”)、AmyE-tr(SEQID NO：2；“AmyE截短”)、和Amy31A(SEQ ID NO：3)针对用RemazolBrilliant Blue(RBB)标记的不溶性玉米淀粉底物的相对比活性。底物的水解在50℃和pH 4.5、5.0或5.6催化30分钟。通过释放的RBB标记物在595nm的吸光度测定酶活性。
图4A描述了在pH 4.5或5.8在0.7mg AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的存在下作为时间(分钟)的函数测量的15g ds淀粉底物的粘度(μNm)。图4B描述了在pH 4.5或5.8在2.2mg AmyE(SEQ ID NO：1)的存在下作为时间的函数的底物粘度。图4C描述了在pH 4.5或5.8在1.4mgAmy31A(SEQ ID NO：3)的存在下作为时间的函数的底物粘度。图4D描述了在pH 4.5或5.8在4.1mg Amy31A的存在下作为时间的函数的底物粘度。
图5A描述了在2mM Ca2+的存在或不存在下AmyE(SEQ ID NO：1；“AmyE全长”)和AmyE-tr(SEQ ID NO：2；AmyE截短”)的过剩热容量函数的差示扫描量热(DSC)分析。图5B描述了在2mM Ca2+的存在或不存在下Amy31A(SEQ ID NO：3)的DSC分析。图5C描述了在2mMCa2+的存在或不存在下嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)α-淀粉酶(AmyS)的DSC分析。
图6描述了与AmyE位置Q153变体和截短AmyS(SEQ ID NO：4)比较，通过AmyE-tr(SEQ ID NO：2)自麦芽糖底物的葡萄糖生产结果。
图7描述了与AmyE位置Q153变体和截短AmyS(SEQ ID NO：4)比较，通过AmyE-tr(SEQ ID NO：2)自麦芽七糖底物的葡萄糖生产结果。
图8描述了在AmyE-tr与麦芽七糖(DP7)温育0小时(顶图)和72小时(底图)后，通过HPLC检测的分解产物。
图9描述了AmyS与DP7底物温育0小时、2小时、4小时和24小时(从顶部到底部的图)后，通过HPLC检测的分解产物。
图10描述了通过使AmyE-tr Q153K变体与麦芽七糖(DP7)温育形成的产物。从顶部到底部显示的HPLC描记线与时间0小时、1小时、2小时、3小时和24小时对应。
图11显示了在pH 4.3和5.8在常规发酵中通过截短AmyE和Xtra淀粉酶的乙醇形成。
图12显示了在pH 4.3和pH 5.8，与单独的AkAA或StargenTM 002比较，不溶性颗粒(未蒸煮的)淀粉通过全长(FL)和截短(tr)AmyE至乙醇的水解。
图13显示了在pH 4.5和5.6，与AmyS比较，通过枯草芽孢杆菌AmyE全长、AmyE截短和Amy 31A的葡萄糖形成。
图14显示了全长AmyE与生淀粉(玉米面粉)温育和通过HPLC检测法检测随着时间(0、30、90分钟)产生的寡糖的结果。
图15显示了使用AmyE多肽在淀粉水解测定试验中获得的峰和最终粘度值。
图16显示了使用AmyE多肽的面包陈化测定结果。
序列简述
下述序列在本申请中提及：
SEQ ID NO：1：全长枯草芽孢杆菌AmyE氨基酸序列。天然信号序列未显示。
1 LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ
51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI
101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ
151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPNITNT
201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS
251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST
301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE
351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA
401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPDDIAKA PHVFLENYKT GVTHSFNDQL
451 TITLRADANT TKAVYQINNG PETAFKDGDQ FTIGKGDPFG KTYTIMLKGT
501 NSDGVTRTEK YSFVKRDPAS AKTIGYQNPN HWSQVNAYIY KHDGSRVIEL
551 TGSWPGKPMT KNADGIYTLT LPADTDTTNA KVIFNNGSAQ VPGQNQPGFD
601 YVLNGLYNDS GLSGSLPH
SEQ ID NO：2：截短的枯草芽孢杆菌AmyE(AmyE-tr)氨基酸序列。天然信号序列未显示。
1 LTAPSIKSGT ILHAWNWSFN TLKHNMKDIH DAGYTAIQTS PINQVKEGNQ
51 GDKSMSNWYW LYQPTSYQIG NRYLGTEQEF KEMCAAAEEY GIKVIVDAVI
101 NHTTSDYAAI SNEVKSIPNW THGNTQIKNW SDRWDVTQNS LLGLYDWNTQ
151 NTQVQSYLKR FLDRALNDGA DGFRFDAAKH IELPDDGSYG SQFWPMITNT
201 SAEFQYGEIL QDSASRDAAY ANYMDVTASN YGHSIRSALK NRNLGVSNIS
251 HYASDVSADK LVTWVESHDT YANDDEESTW MSDDDIRLGW AVIASRSGST
301 PLFFSRPEGG GNGVRFPGKS QIGDRGSALF EDQAITAVNR FHNVMAGQPE
351 ELSNPNGNNQ IFMNQRGSHG VVLANAGSSS VSINTATKLP DGRYDNKAGA
401 GSFQVNDGKL TGTINARSVA VLYPD
SEQ ID NO：3：枯草芽孢杆菌α-淀粉酶变体Amy31A氨基酸序列(UniProtKB/TrEMBL登记号O82953)。天然信号序列以粗体显示。
1 MFEKRFKTSL LPLFAGFLLL FHLVLSGPAA ANAETANKSN KVTASSVKNG
51 TILHAWNWSF NTLTQNMKDI RDAGYAAIQT SPINQVKEGN QGDKSMSNWY
101 WLYQPTSYQI GNRYLGTEQE FKDMCAAAEK YGVKVIVDAV VNHTTSDYGA
151 ISDEIKRIPN WTHGNTQIKN WSDRWDITQN ALLGLYDWNT QNTEVQAYLK
201 GFLERALNDG ADGFRYDAAK HIELPDDGNY GSQFWPNITN TSAEFQYGEI
251 LQDSASRDTA YANYMNVTAS NYGHSIRSAL KNRILSVSNI SHYASDVSAD
301 KLVTWVESHD TYANDDEEST WMSDDDIRLG WAVIGSRSGS TPLFFSRPEG
351 GGNGVRFPGK SQIGDRGSAL FKDQAITAVN QFHNEMAGQP EELSNPNGNN
401 QIFMNQRGSK GVVLANAGSS SVTINTSTKL PDGRYDNRAG AGSFQVANGK
451 LTGTINARSA AVLYPDDIGN APHVFLENYQ TEAVHSFNDQ LTVTLRANAK
501 TTKAVYQINN GQETAFKDGD RLTIGKEDPI GTTYNVKLTG TNGEGASRTQ
551 EYTFVKKDPS QTNIIGYQNP DHWGNVNAYI YKHDGGGAIE LTGSWPGKAM
601 TKNADGIYTL TLPANADTAD AKVIFNNGSA QVPGQNRPGF DYVQNGLYNN
651 SGLNGYLPH
SEQ ID NO：4：截短的嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)蛋白质序列(
Figure BDA0000046157560000301
Xtra淀粉酶)。天然信号序列以粗体显示。
1 MLTFHRIIRK GWMFLLAFLL TASLFCPTGQ HAKAAAPFNG TMMQYFEWYL
51 PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVG YGVYDLYDLG
101 EFNQKGTVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADVVFDH KGGADGTEWV
151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKW RWYHFDGVDW
201 DESRKLSRIY KFIGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADLDMDH PEVVTELKNW
251 GKWYVNTTNI DGFRLDAVKH IKFSFFPDWL SYVRSQTGKP LFTVGEYWSY
301 DINKLHNYIT KTNGTMSLFD APLHNKFYTA SKSGGAFDMR TLMTNTLMKD
351 QPTLAVTFVD NHDTEPGQAL QSWVDPWFKP LAYAFILTRQ EGYPCVFYGD
401 YYGIPQYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDHSDI IGWTREGVTE
451 KPGSGLAALI TDGPGGSKWM YVGKQHAGKV FYDLTGNRSD TVTINSDGWG
501 EFKVNGGSVS VWVPRKTT
SEQ ID NO：5：编码SEQ ID NO：1的AmyE的核苷酸序列。
CTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGTTAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAACCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCGACATCGTATCAAATTGCCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAGCCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTATGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACACAAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGACGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAATTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCATAAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTGTCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGTCGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAGTACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGCCAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTCACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTATGAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAATACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGAACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGATGATATTGCAAAAGCGCCTCATGTTTTCCTTGAGAATTACAAAACAGGTGTAACACATTCTTTCAATGATCAACTGACGATTACCTTGCGTGCAGATGCGAATACAACAAAAGCCGTTTATCAAATCAATAATGGACCAGAGACGGCGTTTAAGGATGGAGATCAATTCACAATCGGAAAAGGAGATCCATTTGGCAAAACATACACCATCATGTTAAAAGGAACGAACAGTGATGGTGTAACGAGGACCGAGAAATACAGTTTTGTTAAAAGAGATCCAGCGTCGGCCAAAACCATCGGCTATCAAAATCCGAATCATTGGAGCCAGGTAAATGCTTATATCTATAAACATGATGGGAGCCGAGTAATTGAATTGACCGGATCTTGGCCTGGAAAACCAATGACTAAAAATGCAGACGGAATTTACACGCTGACGCTGCCTGCGGACACGGATACAACCAACGCAAAAGTGATTTTTAATATGGCAGCGCCCAAGTGCCCGGTCAGGAATCAGCCTGGCTTTGATTACGTGCTAAATGGTTTATATAATGACTCGGGCTTAAGCGGTTCTCTTCCCCAT
SEQ ID NO：6：编码AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列。
CTTACAGCACCGTCGATCAAAAAGCGGAACCATTCTTCATGCATGGAATTGGTCGTTCAATACGTTAAAACACAATATGAAGGATATTCATGATGCAGGATATACAGCCATTCAGACATCTCCGATTAACCAAGTAAAGGAAGGGAATCAAGGAGATAAAAGCATGTCGAACTGGTACTGGCTGTATCAGCCGACATCGTATCAAATTGGCAACCGTTACTTAGGTACTGAACAAGAATTTAAAGAAATGTGTGCAGCCGCTGAAGAATATGGCATAAAGGTCATTGTTGACGCGGTCATCAATCATACCACCAGTGATTATGCCGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGTATTCCAAACTGGACACATGGAAACACACAAATTAAAAACTGGTCTGATCGATGGGATGTCACGCAGAATTCATTGCTCGGGCTGTATGACTGGAATACACAAAATACACAAGTACAGTCCTATCTGAAACGGTTCTTAGACAGGGCATTGAATGACGGGGCAGACGGTTTTCGATTTGATGCCGCCAAACATATAGAGCTTCCAGATGATGGCAGTTACGGCAGTCAATTTTGGCCGAATATCACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAGAGATGCTGCATATGCGAATTATATGGATGTGACAGCGTCTAACTATGGGCATTCCATAAGGTCCGCTTTAAAGAATCGTAATCTGGGCGTGTCGAATATCTCCCACTATGCATCTGATGTGTCTGCGGACAAGCTAGTGACATGGGTAGAGTCGCATGATACGTATGCCAATGATGATGAAGAGTCGACATGGATGAGCGATGATGATATCCGTTTAGGCTGGGCGGTGATAGCTTCTCGTTCAGGCAGTACGCCTCTTTTCTTTTCCAGACCTGAGGGAGGCGGAAATGGTGTGAGGTTCCCGGGGAAAAGCCAAATAGGCGATCGCGGGAGTGCTTTATTTGAAGATCAGGCTATCACTGCGGTCAATAGATTTCACAATGTGATGGCTGGACAGCCTGAGGAACTCTCGAACCCGAATGGAAACAACCAGATATTTATGAATCAGCGCGGCTCACATGGCGTTGTGCTGGCAAATGCAGGTTCATCCTCTGTCTCTATCAATACGGCAACAAAATTGCCTGATGGCAGGTATGACAATAAAGCTGGAGCGGGTTCATTTCAAGTGAACGATGGTAAACTGACAGGCACGATCAATGCCAGGTCTGTAGCTGTGCTTTATCCTGAT
SEQ ID NO：7：编码枯草芽孢杆菌Amy31A(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列。
TCTGTTAAAAAACGGCACTATTCTGCATGCATGGAACTGGAGCTTTAAACACGCTGACCCAGAACATGAAAGATATTCGTGACGCGGGCTATGCTGCGATCCAAACCAGCCCTATCAACCAGGTCAAAGAAGGCAACCAAGGCGACAAAATCCATGTCCAACTGGTACTGGCTGTATCAACCGACGTCCTATCAGATTGGCAACCGTTATCTGGGCACGGAGCAAGAGTTCAAAGACATGTGTGCTGCGGCTGAGAAATATGGTGTGAAAGTTATCGTGGACGCTGTGGTAAACCACACGACCTCTGATTATGGTGCTATTAGCGACGAGATTAAACGTATTCCAAATTGGACCCATGGTAATACCCAGATCAAAAATTGGAGCGACCGCTGGGACATTACCCAGAATGCGCTGCTGGGTCTGTATGACTGGAACACGCAAAACACCGAAGTACAGGCATATCTGAAGGGCTTCCTGGAACGCGCTCTGAACGATGGTGCTGATGGTTTTCGCTACGACGCCGCAAAGCATATTGAGCTGCCGGATGACGGCAACTACGGTTCCCAATTCTGGCCGAACATCACCAACACCTCTGCCGAATTCCAGTACGGCGAGATCCTGCAAGACTCCGCGAGCCGTGACACCGCTTATGCCAACTATATGAACGTAACTGCCTCTAACTATGGCCATTCCATTCGTTCTGCGCTGAAAAATCGTATCCTGTCCGTGTCCAATATCTCCCACTATGCATCCGACGTTTCTGCTGACAAACTGGTAACTTGGGTCGAGTCTCACGACACCTATGCAAATGATGACGAGGAGAGCACCTGGATGAGCGATGATGATATTCGTCTGGGTTGGGCGGTTATTGGTTCTCGCTCTGGTTCTACTCCGCTGTTCTTTAGCCGTCCGGAAGGTGGCGGCAATGGCGTTCGTTTCCCGGGTAAATCTCAAATTGGTGATCGTGGCTCTGCACTGTTTAAAGATCAAGCTATTACGGCGGTGAATCAGTTCCATAATGAGATGGCAGGTCAACCTGAAGAACTGTCCAATCCAAACGGTAACAACCAAATCTTCATGAACCAGCGTGGCAGCAAAGGCGTCGTCCTGGCGAACGCCGGTAGCTCTTCTGTTACCATCAACACGTCTACCAAACTGCCAGACGGCCGCTATGATAACCGTGCGGGTGCTGGTTCCTTTCAGGTAGCCAACGGCAAGCTGACGGGCACCATCAACGCTCGTTCTGCTGCTGTTCTGTACCCGGACGACATTGGCAACGCTCCGCACGTGTTCCTGGAGAATTACCAGACCGAAGCGGTACATAGCTTTAATGACCAGCTGACCGTCACTCTGCGTGCCAACGCAAAAACCACGAAAGCAGTCTATCAGATCAATAATGGTCAAGAAACTGCTTTCAAGGATGGCGACCGTCTGACTATTGGTAAGGAGGACCCGATTGGCACCACTTATAACGTTAAACTGACTGGCACCAATGGCGAGGGCGCTAGCCGCACTCAAGAGTATACGTTCGTAAAGAAAGACCCGTCTCAAACCAACATCATCGGTTACCAGAATCCTGACCACTGGGGTAATGTGAACGCTTACATCTATAAACATGATGGTGGCGGTGCTATCGAACTGACCGGCTCTTGGCCAGGTAAAGCCATGACGAAAAACGCGGATGGCATCTATACCCTGACCCTGCCGGCCAATGCGGATACCGCAGATGCGAAGGTTATCTTCAATAACGGCTCCGCGCAGGTTCCGGGCCAAAACCATCCGGGCTTTGACTACGTACAAAATGGTCTGTATAACAACTCTGGCCTGAACGGTTACCTGCCGCAC
SEQ ID NO：8：编码嗜热脂肪地芽孢杆菌AmyS(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列。GCCGCACCGTTTAACGGTACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACGTTATGGACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCTTTGGCTGCCGCCCGCTTACAAAGGAACAAGCCGCAGGGACGTAGGGTACGGAGTATACGACTTGTATGACCTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCCGCACAAAATATGGAACAAAAGCTCAATATCTTCAAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGATGTCGTGTTCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAATCCGTCCGACCGCAACCAAGAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATTTGATTTTCCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTTAAGTGGCGCTGGTACCATTTTGACGGCGTTGACTGGGACGAAAGCCGAAAATTAAGCCGCATTTACAAATTCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACAGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTATGCCGACCTTGATATGGATCATCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGAAAAACTGGGGGAAATGGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATGCCGTCAAGCATATTAAGTTCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTTACCGTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAACAAACGGAACGATGTCTTTGTTTGATGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTCCAAATCAGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTCTCATGAAAGATCAACCGACATTGGCCGTCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAACCCGGCCAAGCGCTGCAGTCATGGGTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGGCAGGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGACTATTATGGCATTCCACAATATAACATTCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCGCTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATGCTTACGGAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACATCATCGGGTGGACAAGGGAAGGGGTCACTGAAAAACCAGGATCCGGGCTGGCCGCACTGATCACCGATGGGCCGGGAGGAAGCAAATGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGTGTTCTATGACCTTACCGGCAACCGGAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGAATTCAAAGTCAATGGCGGTTCGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACC
SEQ ID NO：9：SEQ ID NO：1的AmyE的天然信号序列。
MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE
SEQ ID NO：10：引物PSTAMYE-F 5′
CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTTACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC
SEQ ID NO：11：引物AMYENOPST-R 5′
CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTGGAACTCTGCTGATGTATTTGTG
SEQ ID NO：12：引物AMYENOPST-F 5′
CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAATCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG
SEQ ID NO：13：引物HPAIAMYE-R 5′
CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAGCCCGAGTC
SEQ ID NO：14：引物HPAIAMYE466-R 5′
CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAAAGCACAGCTACAGACCTGG
SEQ ID NO：15：引物AMYE SEQ-F15′
TACACAGTACGTCCTATCTG
SEQ ID NO：16：引物AMYE SEQ-F25′
CATCCTCTGTCTCTATCAATAC
SEQ ID NO：17：Buttiauxiella植酸酶的BP-17变体
NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP EWPVKLGYIT
PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD VDQRTLKTGE
AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT QVQQAVEKEA
QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD LGLSMPSKLS
IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI HSEQEWASLL
KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK LPDISPDNKI
LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER LADKSGKQYV
SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE GYCPLSTFTR
VVSQSVEPGC QLQ
发明详述
本发明组合物和方法涉及来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(AmyE)及其变体(统称为AmyE多肽)，与其他α-淀粉酶比较，其提供了某些优点。例如，AmyE多肽显示在酸性pH对于淀粉底物的高比活性，允许AmyE多肽在也适于糖化的条件下用于淀粉液化。这消除了在液化和糖化之间调节淀粉浆pH的需要。AmyE多肽也具有葡糖淀粉酶活性，从而消除或减少对于使用分开的葡糖淀粉酶执行糖化的需要。此外，AmyE多肽需要很少的钙或不需要钙用于热稳定性，消除后续在执行异构化前去除加入的钙的需要，从而消除用于生产高果糖玉米糖浆所需的至少一个步骤。
组合物和方法的这些和另外特征在下文更详细描述。
1.定义和缩写
除非另有定义，所有技术和科学术语和缩写应符合本领域普通技术人员理解的通常含义。为了清楚起见，定义了下述术语和缩写。
1.1.定义
如本文使用的，术语“淀粉”指包含植物的复杂多糖碳水化合物、包含具有式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉的任何物质，其中X可以是任何数。特别地，该术语指任何基于植物的材料，包括但不限于籽粒、草、块茎和根，更特别地小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、糠、木薯、粟、马铃薯、甘薯和木薯。
如本文使用的，术语“寡糖”指由3-20个单糖组成的碳水化合物分子。
如本文使用的，“淀粉酶”指能够催化淀粉降解的酶。一般地，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)是以随机方式切割在淀粉分子内的α-D-(1→4)O-糖苷键的内切作用酶。相比之下，外切作用酶例如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和某些产物特异性淀粉酶如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)从底物的非还原末端开始切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)、和产物特异性淀粉酶可以由淀粉产生特定长度的麦芽寡糖。如本文使用的，淀粉酶包括任何/所有淀粉酶，包括葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和野生型α-淀粉酶，例如芽孢杆菌属物种，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的那些，而α-淀粉酶包括上述的这些酶的子集。
如本文使用的，“α-淀粉酶变体”和类似短语指参照α-淀粉酶的变体/突变体，其包括就参照α-淀粉酶的亲本(野生型；参照)氨基酸序列而言的氨基酸置换、插入和/或缺失。术语“变体”可与术语“突变体”互换使用。变体α-淀粉酶可以包括就亲本信号序列而言在信号序列中的突变。此外，变体α-淀粉酶可以为融合蛋白的形式，所述融合蛋白包含异源α-淀粉酶信号序列例如来自地衣芽孢杆菌的(LAT)。
“亲本核酸/多核苷酸”、“野生型核酸/多核苷酸”、或“参照核酸/多核苷酸”指编码亲本多肽的核酸序列和与之互补的核酸。
“变体核酸/多核苷酸”指编码变体多肽的核酸序列或与之互补的核酸，或相对于亲本多核苷酸序列而言具有至少一个碱基置换、插入或缺失的多核苷酸序列或与之互补的核酸。详细地，此种核酸可以包括与参照序列具有所指的同源程度的那些、或能够与参照序列杂交的那些，例如在严格条件[例如，50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M Na3柠檬酸盐，pH 7.0)]或高度严格条件[例如，65℃和0.1X SSC(1X SSC＝0.15MNaCl，0.015M Na3柠檬酸盐，pH 7.0)]下。变体核酸可以优化，以反映特定宿主生物的偏好密码子使用，例如甲基营养酵母(例如，毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)等)或丝状真菌(例如，木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉(T.reesei)等)或其他表达宿主(例如，芽孢杆菌属、链霉菌属(Streptomyces)等)。
“信号序列”是与蛋白质的N末端部分附着的氨基酸序列，其促进蛋白质分泌到细胞外。“信号序列”还可以被称为“前导序列”或“前序列”。
如本文使用的，“未成熟”或“全长(FL)”形式的淀粉酶包括信号肽。未成熟形式可以包括其他翻译后修饰。
如本文使用的，“成熟”形式的细胞外蛋白质(例如淀粉酶)缺乏信号序列。信号序列可以在分泌过程期间被切割掉。可替代地，多肽可以以其成熟形式例如作为细胞内蛋白质表达，或以其成熟形式合成。
如本文使用的，“截短”形式AmyE(即，“AmyE-tr”)指具有C末端淀粉结合结构域的全部或部分缺失的AmyE多肽。例如，在SEQ ID NO：2的AmyE-tr中，SEQ ID NO：1的AmyE在残基D425被截短。这种AmyE-tr的2.5分辨率晶体结构在蛋白质数据库登记号1BAG处可获得，其公开于Fujimoto等人，“Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from B.subtilis complexed with maltopentaose，”J.Mol.Biol.277：393-407(1998)中。AmyE-tr可以在SEQ ID NO：1的AmyE的其他位置例如Y423、P424、D426或I427截短，条件是C末端淀粉结合结构域的全部或部分被去除。
术语“重组体”当与主题细胞、核酸、蛋白质或载体相关使用时，指主题已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质进行了修饰，或该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因，或表达原本是异常表达的、不足表达的或完全不表达的天然基因。
术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指，化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从天然存在的与其天然相伴的至少一个成分中被取出。
如本文使用的，术语“纯化的”指物质(例如，分离的多肽或多核苷酸)处于相对纯的状态，例如至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、或甚至至少约99％纯。
术语“热稳定的”和“热稳定性”指，酶在暴露于升高温度后保留活性的能力。酶例如α-淀粉酶的热稳定性通过以分钟、小时或天给出的其半衰期(t1/2)测量，在所述半衰期期间半数酶活性在指定的条件下丧失。半衰期可以通过测量在暴露于(即，运用)升高温度后残留的α-淀粉酶活性而计算。
“pH范围”指pH值的范围，其中在所述pH值，酶显示催化活性。
如本文使用的，术语“pH稳定的”和“pH稳定性”指，酶在宽pH值范围保留活性预定时间段(例如，15分钟、30分钟、1小时等)的能力。
如本文使用的，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换使用。当氨基酸序列显示活性时，它们可以被称为“酶”。在本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。
术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、杂合双链体和合成分子。核酸可以是单链或双链的，并且可以具有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。因为遗传密码的简并性，所以可以使用一个以上密码子编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法包括编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，否则分别地，核酸以5′至3′方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。
术语“同源物”指与参照氨基酸或核苷酸序列或另一指定的常见结构或功能特征具有某个相同程度的氨基酸或核苷酸序列。同源序列意欲包括使用常规序列比对工具(例如，Clustal、BLAST等)，与主题序列至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％相同的氨基酸序列。一般地，同源物将包括与主题氨基酸序列相同的活性位点残基，除非另有说明。
如本文使用的，“杂交”指，如在印迹杂交技术和PCR技术中发生的，一条核酸链与互补链碱基配对的过程。
如本文使用的，核酸的“简并序列”指，多个核苷酸序列编码相同密码子，即由于遗传密码的简并性。可以选择简并序列以便在特定宿主生物中，例如由于密码子偏好的原因，最佳表达编码的多肽。
如本文使用的，“合成”分子通过体外化学或酶促合成而不是通过生物产生。
如本文使用的，就细胞而言使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”意指，细胞具有整合到其基因组内或作为附加型质粒携带的非天然(例如，异源)核酸序列，所述核酸序列被多代维持。
在将核酸序列插入细胞内的上下文中术语“引入”意指如本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。
“宿主株”或“宿主细胞”是其中已经引入了包括编码目的多肽(例如，变体α-淀粉酶)的多核苷酸的表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体的生物。示例性宿主株是细菌细胞。术语“宿主细胞”包括由细胞例如芽孢杆菌属物种的那些制备的原生质体。
就多核苷酸或蛋白质而言的术语“异源的”指在宿主细胞中不天然存在的多核苷酸或蛋白质。
就多核苷酸或蛋白质而言的术语“内源的”指在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。
如本文使用的，术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
“选择标记”或“可选标记”指能够在宿主中表达以利于选择携带其的宿主细胞的基因。可选标记的例子包括但不限于抗微生物剂(例如，潮霉素、博来霉素或新霉素)和/或赋予代谢优点的基因，例如赋予宿主细胞营养优势的基因。
“培养”指在合适条件下在液体或固体培养基中生长微生物细胞群体。培养包括包含颗粒淀粉的淀粉底物发酵性生物转化为最终产物(一般在容器或反应器中)。
“发酵”是通过微生物酶促分解有机物质以产生更简单的有机化合物。尽管发酵一般在厌氧条件下进行，但该术语不旨在仅限于严格厌氧条件，因为发酵也可以在氧的存在下发生。
“基因”指参与生产多肽的DNA区段，包括编码区、在编码区前和后的区域、和在个体编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
“载体”指设计为将核酸引入一个或多个细胞类型内的多核苷酸序列。载体包括编码载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。
“表达载体”指包括编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，其中该DNA序列与能够实现该DNA在合适宿主中表达的合适控制序列可操作地连接。此种控制序列可以包括启动子以实现转录，任选的操纵子序列以控制转录，在mRNA上编码合适核糖体结合位点的序列，增强子以及控制转录和翻译终止的序列。
“启动子”是参与结合RNA聚合酶以起始基因转录的调节序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。示例性启动子是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyL)启动子。
术语“可操作地连接”意指所述及的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并置)中。例如调节序列与编码序列可操作地连接，从而使得编码序列的表达在调节序列的控制下。
术语“在转录控制下”意指多核苷酸序列，通常为DNA序列，的转录依赖于其与元件可操作地连接，所述元件促成转录起始或促进转录。
术语“在翻译控制下”意指多核苷酸序列，通常是为RNA序列，翻译成多肽依赖于其与元件可操作地连接，所述元件促成翻译起始或促进翻译。
如本文使用的，“生物活性的”指具有所述及的生物活性例如酶促活性的序列。在本发明淀粉酶的情况下，该活性是α-淀粉酶活性。
“水硬度”是水中存在的矿物质(例如，钙和镁)的量度。
“糊化”指淀粉分子通过蒸煮溶解以形成粘性悬浮液。
如本文使用的，术语“液化作用”或“液化”意指将淀粉转变成更低分子量(即，更短)糊精(其一般比起始淀粉材料更可溶和粘性更低)的过程。这个过程涉及在AmyE或其变体添加同时或在AmyE或其变体添加后淀粉的糊化。
如本文使用的，术语“初级液化”指当浆的温度升高至或接近其糊化温度时的液化步骤。在该温度升高后，浆被送送通过热交换器或喷嘴至约90-150℃的温度，例如100-110℃(200-300°F，例如220-235°F)。在施予热交换器或喷嘴温度后，使浆在那个温度保持3-10分钟的时期。保持浆在90-150℃(200-300°F)的这个步骤被称为初级液化。
如本文使用的，术语“次级液化”指在初级液化(加热至90-150℃(200-300°F))后的液化步骤，此时浆被允许冷却至室温。这个冷却步骤可以是30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。
如本文使用的，术语“次级液化的分钟数”指，从次级液化作用开始到测量DE时已经经过的时间。
“糖化”一般指将在液化作用后形成的麦芽糖糊精酶促转化为葡萄糖。
术语“聚合度(DP)”指在给定糖中脱水吡喃葡萄糖单位的数目(n)。DP1的例子是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP＞3指具有大于3的聚合度的聚合物。
就淀粉转化而言，术语“最终产物”或“所需最终产物”指由淀粉底物酶促转化的指定碳源衍生分子。
如本文使用的，术语“干固形物含量(ds)”指以干重％表示的在浆中的总固体。
术语“浆”(slurry)指包含不溶性固体的水性混合物。
术语“残留淀粉”指在包含淀粉的底物发酵或酶促水解后在组合物中的残留淀粉(可溶或不溶的)。
如本文使用的，“再循环步骤”指醪液组分的再循环，所述醪液组分可以包括残留淀粉、酶和/或微生物以发酵包括淀粉的底物。
术语“醪液”(mash)指包括可发酵碳源(例如，碳水化合物)的水性混合物，其可以用于产生发酵产物，例如醇。术语“发酵醪”(beer)和“醪液”可以互换使用。
术语“釜馏物”(stillage)指非发酵固体和水的混合物，其是在从发酵醪液中去除醇后的残余物。
术语“干酒糟(distillers dried grain，DDG)”和“干酒糟及可溶物(distillers dried grain with solubles，DDGS)”指谷类发酵的有用副产物。
如本文使用的，“产乙醇微生物”指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。产乙醇微生物由于其表达一种或多种如下酶的能力而产乙醇，所述一种或多种酶各自或一起可以将糖转化为乙醇。
如本文使用的，术语“乙醇生产者”或“乙醇生产微生物”指能够由己糖或戊糖生产乙醇的任何生物或细胞。一般地，乙醇生产细胞包含醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。乙醇生产微生物的例子包括真菌微生物例如酵母。优选酵母包括酵母菌属(Sacchromyces)，特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。
就淀粉酶及其底物而言，术语“接触”指，将酶置于与底物足够紧密接近，以使得酶能够将底物转化为最终产物。接触可以包括混合。
术语“衍生自/源自”取决于上下文意指“源于”、“基于”、“得自”、“可得自”或“分离自”。
术语“酶促转化”一般指底物(例如，淀粉)通过酶作用(例如，淀粉酶)的修饰。
如本文使用的，术语“崩解”指，在生物膜中将微生物细胞个体连接和结合在一起的生物膜基质中的多糖的水解，由此微生物细胞可以从生物膜中释放和除去。
“样片”是可以在其上施加污物用于评估组合物的清洁效率的材料，例如织物块。
如本文使用的，术语“比活性”指在特定条件下每单位时间被酶制品转化为产物的底物摩尔数。比活性以单位(U)/mg蛋白质表示。
如本文使用的，术语“生物活性的”指分子显示预选的生物功能。
术语“产率”指通过方法产生的最终产物量，例如以起始材料的百分率、浓度、体积、或量表示。
“ATCC”指位于Manassas，Va.20108的美国典型培养物中心(ATCC)。
如本文使用的，用于纯化目的的“沉淀剂”指从溶液中有效沉淀多肽例如AmyE或其变体的化合物。沉淀物的形式可以是例如结晶、无定形的或其混合物。
“NRRL”指美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection)，美国国家农业应用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research)(以前称为USDA北方地方研究实验室(Northern Regional Research Laboratory))，Peoria，IL。
如本文使用的，“样片”是其上可以施加污物、或其上已经施加了污物的材料，例如织物块。该材料可以是例如由棉、聚酯或天然和合成纤维的混合物制成的织物。可替代地，该材料可以是纸，例如滤纸或硝酸纤维素，或硬材料块，例如陶瓷、金属或玻璃。示例性污物包括血、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、干酪、粘土、色素、油或其组合。
如本文使用的，“小样片”是已用单孔打孔装置、或定制的96孔打孔装置或等价物切割(其中多孔打孔模式与标准96孔微量滴定板匹配)，或已以其他方式从样片上取下的样片块。该样片可以是纺织品、纸、金属或其他合适材料。小样片可以在被置于24、48或96孔微量滴定板的孔内之前或之后附着污物。
如本文使用的，术语“食品”涵盖已制成的食品、和用于食品的成分例如面粉，其能够对消费者的食品制备者提供益处。食品成分包括为了例如酸化或乳化目的可以加入食品或食物中的制剂。食品成分可以为溶液或固体的形式，取决于应用的用途和/或方式和/或施用方式。
如本文使用的，术语“面粉”指研磨或磨碎的谷物或已磨碎或捣碎的西米或块茎产品。在某些实施方案中，面粉还可以包含除研磨或捣碎的谷物或植物物质外的组分，例如膨松剂。谷物包括小麦、燕麦、黑麦和大麦。块茎产品包括木薯粉、木薯面粉和卡士达粉(custard powder)。面粉还包括磨碎的玉米粉、玉米面、米粉(rice flour)、全麦面粉、自发面粉、木薯粉、木薯面粉、米粉(ground rice)、强化面粉和卡士达粉。
如本文使用的，术语“原料”(stock)指被粉碎或破碎的谷物和植物组分。例如，在发酵醪生产中使用的大麦是已粗磨过的或粉碎的谷物，以得到适合于生产用于发酵的醪液的稠度。原料可以包括上述任何类型的植物和谷物的粉碎或粗磨形式。
如本文使用的，术语“性能指数(PI)”指对于特定性能特征，变体多肽与亲本多肽的性能比。在本上下文中，“增进性突变”(up mutations)指具有PI＞1的突变；“中性突变”指具有PI＞0.5的突变；“非有害突变”指具有PI＞0.05的突变；和“有害突变”指具有PI≤0.05的突变。
如本文使用的，术语“额外的(或另外的)葡糖淀粉酶(或葡糖淀粉酶多肽)”或“具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽”指，与AmyE不同的葡糖淀粉酶多肽。
单数形式“a”、“an”和“the”涵盖对复数的提及，除非上下文明确指出并非如此。因此，例如提及“酶”包括多个此类酶，提及“该制剂”包括提及一个或多个制剂及本领域技术人员已知的其等价物，等等。
数值范围涵盖限定范围的数值。标题是描述性的并且不旨在构成限制。本文引用的所有参照文献并入作为参照。
1.2.缩写
除非另有说明，否则下述缩写适用：
AE     醇乙氧基化物
AEO    醇乙氧基化物
AEOS   醇乙氧基硫酸盐
AES    醇乙氧基硫酸盐
AGU    葡糖淀粉酶活性单位
AkAA   河内曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶
AmyE    枯草芽孢杆菌α-淀粉酶
AmyS    嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶
AS      醇硫酸盐
BAA     细菌α-淀粉酶
cDNA    互补DNA
CMC     羧甲基纤维素
DE      葡萄糖当量
DI      蒸馏的，去离子的
DNA     脱氧核糖核酸
DP3     具有3个亚单位的聚合度
DPn     具有n个亚单位的聚合度
DS或ds  干固形物
DTMPA   二乙基三胺五乙酸
EC      酶学委员会的酶分类
EDTA    乙二胺四乙酸
EDTMPA  乙二胺四甲叉膦酸
EO      环氧乙烷
F&HC    织物及家居护理
GAU     葡糖淀粉酶单位
HFCS    高果糖玉米糖浆
HFSS    高果糖淀粉基糖浆
IPTG    异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
LA      Luria琼脂
LB      Luria肉汤
LU      脂肪酶单位
L1T     在位置1上的亮氨酸(L)残基用苏氨酸(T)残基替换，
其中氨基酸使用本领域通常已知的单字母缩写代表。
MW      分子量
NCBI    美国国家生物技术信息中心
nm      纳米
NOBS    壬酰基氧基苯磺酸盐
NTA     次氮基三乙酸
OD      光密度
PCR     聚合酶链反应
PEG     聚乙二醇
pI      等电点
ppm     百万分之一
PVA     聚(乙烯醇)
PVP     聚(乙烯吡咯烷酮)
RAU     参照淀粉酶单位
RNA     核糖核酸
SAS     仲烷基磺酸盐
1X SSC  0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0
SSF     同时糖化和发酵
SSU     可溶性淀粉单位，等价于每分钟释放的1mg葡萄糖的还原
力
TAED    四乙酰基乙二胺
TNBS    三硝基苯磺酸
TrGA    里氏木霉葡糖淀粉酶
w/v     重量/体积
w/w     重量/重量
wt      野生型
μL     微升
μNm    微牛顿×米
2.AmyE多肽
2.1.亲本AmyE多肽
AmyEα-淀粉酶指来自枯草芽孢杆菌的天然存在的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶)，如由SEQ ID NO：1例示的。相关多肽具有与天然存在的AmyE的序列不同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：1具有至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％序列同一性的氨基酸序列，如用BLAST序列比对算法用缺省匹配参数测量的。
另一种示例性AmyE多肽是具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的Amy31A(Amy31A)。Amy31A在Ohdan等人，“Characteristics of two forms of alpha-amylases and structural implication，”Appl.Environ.Microbiol.65(10)：4652-58(1999)和UniProtKB/TrEMBL登记号O82953(SEQ ID NO：3)中描述。使用BLAST算法，Amy31A与SEQ ID NO：1的AmyE具有约86％序列同一性。另外的AmyE多肽包括但不限于，具有NCBI登记号ABW75769、ABK54355、AAF14358、AAT01440、AAZ30064、NP_388186、AAQ83841和BAA31528中所述氨基酸序列的AmyE，其内容在此引入作为参照。
SEQ ID NO：1中所示的代表性AmyE氨基酸序列是成熟形式的，其缺乏天然信号序列。该成熟形式的AmyE在其他地方被称为“AmyE全长”。一般地，成熟形式的AmyE作为酶是最有利的，但可能希望表达未成熟形式(具有信号序列)以实现从宿主细胞中的分泌。此AmyE的天然信号序列为41个氨基酸残基长度，并且显示为SEQ ID NO：9。SEQ ID NO：3的N末端45个氨基酸残基是Amy31A的信号序列。AmyE(SEQ ID NO：1)和Amy31A(无信号序列)之间的序列比对在图1中描述。
AmyE多肽可以具有C末端淀粉结合结构域的缺失，如由具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的截短AmyE多肽(AmyE-tr)例示的。这种多肽从残基D425(参照SEQ ID NO：1)截短。AmyE-tr的2.5
Figure BDA0000046157560000461
分辨率晶体结构在蛋白质数据库登记号1BAG处可获得，其公开于Fujimoto等人(1998)“Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from B.subtiliscomplexed with maltopentaose，”J.Mol.Biol.277：393-407中。AmyE可以在其他位置，例如SEQ ID NO：1的AmyE的Y423、P424、D426或I427，截短，条件是C末端淀粉结合结构域的全部或部分被去除。相似的截短可以对Amy31A和其他AmyE多肽进行。
2.2.AmyE变体
与SEQ ID NO：1的天然存在AmyE比较，或与SEQ ID NO：2(截短多肽)比较，AmyE变体包括至少一个氨基酸修饰。因此，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的AmyE多肽可以被称为“亲本多肽”、“亲本酶”或“亲本序列”，AmyE变体可以由其衍生。未修饰的氨基酸残基(即，剩余的连续氨基酸序列)可以与SEQ ID NOs：1或2的那些相同，与SEQ ID NO：3的那些相同，或与NCBI登记号ABW75769、ABK54355、AAF14358、AAT01440、AAZ30064、NP_388186、AAQ83841和BAA31528的那些相同。可替代地，剩余氨基酸序列可以与这些序列中的一个或多个具有特定的序列同一性程度，如使用例如蛋白质序列的BLAST比对用缺省比对参数测量的。例如，剩余序列可以与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的AmyE具有至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％序列同一性。
与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列比较，AmyE变体可以具有单个氨基酸修饰，或可以具有例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸修饰。修饰包括置换、插入、缺失或其组合。在某些情况下，修饰针对生物功能非必需的氨基酸残基。可以通过AmyE序列之间的序列同源性，指导对待修饰的氨基酸残基的选择。一般地，在AmyE序列中十分保守的氨基酸更可能是生物活性所必需的。相反，在AmyE序列之间变化的氨基酸位置较不可能是生物活性所必需的。例如，在比对中在AmyE和Amy31A之间不同的氨基酸残基(在图1中以粗体字体显示)可能可以在AmyE变体中修饰而不丧失生物活性。
优选的AmyE变体具有与天然存在的AmyE比较至少部分的1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶活性，和与天然存在的AmyE比较至少一种改变的性质。改变的性质可以涉及针对淀粉、麦芽七糖和/或麦芽三糖底物的比活性，底物特异性，热稳定性，最适温度，最适pH，pH和/或温度范围，氧化稳定性，或减少淀粉组合物的粘度的能力等。在某些情况下，AmyE变体的改变性质涉及在特定pH(例如，4或5.8)对特定玉米面粉、麦芽三糖、麦芽七糖底物的比活性，在特定温度(例如，60℃)的热稳定性，或在特定pH(例如，8或pH 10)的清洁性能。改变的性质可以由性能指数(PI)表征，其中PI是AmyE变体与野生型AmyE的性能比。在某些实施方案中，PI大于约0.5，而在其他实施方案中，PI是约1或大于1。
可以置换以对所得到的AmyE变体赋予有利性质的具体残基包括下述中的一个或多个：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424和425。在这些位置的任何上的修饰可以产生对于蛋白质表达具有大于0.5的性能指数(PI)、和对于改善酶性能的至少一种特征具有大于1的PI的变体多肽。
可以置换以对所得到的AmyE变体赋予有利性质的残基的一个子集包括下述中的一个或多个：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，39，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，63，64，65，66，67，68，69，72，73，74，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，98，99，100，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，118，119，121，124，125，126，128，129，130，131，132，134，135，136，140，141，142，143，144，147，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，168，170，171，172，175，179，180，181，184，186，187，188，189，190，192，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，207，209，211，212，213，214，217，218，219，221，222，223，224，225，226，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，267，268，270，271，272，273，274，275，276，277，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，324，325，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424和425。在这些位置的任何上的修饰产生对于蛋白质表达具有大于0.5的性能指数(PI)、和对于改善酶性能的至少一种特征具有大于1.1的PI的变体多肽。
在某些情况下，一个或多个位置选自；1、2、3、4、5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，98，99，100，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，121，122，124，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，310，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422、423、424和425，所述位置在全长或截短亲本多肽中对于性能而言是非完全限制性的。
某些位置已经被确定为在截短AmyE亲本多肽中对于性能而言是非完全限制性的(即，1，2，3，4，5，8，18，20，23，24，25，27，28，30，35，44，45，47，49，50，51，52，54，56，59，68，73，76，78，85，88，89，90，91，106，107，108，109，112，115，116，118，119，124，125，126，127，131，132，134，142，143，152，153，156，160，163，166，167，184，185，187，188，190，192，195，199，200，201，202，203，212，213，214，218，219，221，222，223，233，234，238，240，241，243，245，247，248，250，251，252，253，254，255，257，259，260，274，275，276，277，282，283，284，287，307，308，309，310，311，312，313，314，317，318，319，320，321，323，324，325，327，328，331，333，344，346，347，349，357，358，359，367、368、369、378、380、382、385、386、388、390、393、395、400、401、402和406)，并且某些位置已经被确定在全长AmyE亲本多肽中对于性能而言是非完全限制性的(即，6，7，9，10，11，12，13，14，15，16，17，19，21，22，26，27，29，30，31，32，33，34，36，37，38，39，40，41，42，43，45，46，48，52，53，55，57，58，60，61，62，63，64，65，66，67，69，70，71，72，74，77，79，80，81，82，83，84，86，87，88，89，92，93，94，95，96，98，99，100，103，104，105，110，111，113，114，117，121，122，126，128，129，130，131，135，136，138，139，140，141，144，145，146，147，148，149，150，151，154，155，157，158，159，161，162，164，165，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，183，184，186，189，191，193，194，196，197，198，204，205，206，207，208，209，210，211，215，216，217，220，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，235，236，237，238，239，241，242，244，246，249，256，258，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273，278，279，280，281，285，286，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，312，315，316，322，326，329，330，332，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，348，350，351，352，353，354，355，356，360，361，362，363，364，365，366，370，371，372，373，374，375，376，377，379，380，381，383，384，387，389，391，392，394，396，397，398，399，402，403，404，405，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425).
在某些情况下，修饰是亲本多肽中存在的一个或多个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基，例如：1A、1C、1D、1E、1F、1G，1H，1K，1M，1N，1Q，1R，1S，1T，1V，1W，1Y，2A，2C，2D，2E，2F，2G，2H，2I，2K，2L，2M，2N，2P，2Q，2R，2S，2V，2W，2Y，3C，3D，3E，3F，3G，3H，3I，3K，3L ，3M，3N，3P，3Q，3R，3S，3V，3W，3Y，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4K，4L，4M，4N，4Q，4S，4T，4V，4W，4Y，5A，5C，5D，5E，5F，5G，5H，5I，5K，5L，5N，5R，5V，5W，5Y，6C，6D，6E，6H，6K，6L，6M，6N，6P，6Q，6R，6S，6T，6V，6W，7A，7C，7D，7E，7F，7G，7H，7I，7L，7M，7N，7P，7Q，7R，7S，7T，7W，7Y，8A，8C，8E，8F，8G，8H，8I，8K，8L，8M，8N，8P，8Q，8R，8T，8V，8W，8Y，9A，9C，9D，9E，9F，9H，9I，9K，9M，9N，9P，9R，9S，9T，9V，9W，9Y，10A，10I，10L，10M，10N，10P，10Q，10S，10V，11A，11F，11G，11H，11M，11S，11V，11W，11Y，12I，12M，12V，13A，13C，13D，13E，13F，13G，13I，13L，13M，13Q，13T，13V，13W，13Y，14C，14F，14G，14M，14N，14S，14T，14V，15A，15F，16A，16D，16E，16F，16G，16H，16I，16L，16M，16Q，16S，16T，16V，17A，17F，17I，17M，17Q，17Y，18A，18C，18D，18E，18G，18H，18M，18N，18Q，18R，18T，19A，19C，19H，19L，19M，19N，19S，19W，19Y，20A，20C，20D，20F，20G，20H，20I，20K，20L，20M，20P，20Q，20R，20S，20T，20V，20W，20Y，21A，21C，21D，21E，21H，21I，21K，21L，21M，21N，21Q，21R，21S，21V，22I，22M，22Q，22S，22T，22V，23A，23C，23D，23E，23F，23G，23H，23I，23L，23M，23N，23R，23S，23T，23V，23W，23Y，24A，24C，24D，24F，24G，24L，24N，24P，24Q，24R，24S，24T，24V，24Y，25A，25C，25D，25E，25F，25G，25H，25I，25K，25L，25R，25S，25T，25V，25W，25Y，26A，26F，26I，26L，26V，27A，27C，27D，27E，27F，27G，27H，27I，27L，27M，27N，27P，27Q，27R，27S，27T，27V，27W，27Y，28A，28C，28F，28G，28H，28I，28K，28L，28M，28N，28P，28Q，28R，28S，28T，28V，28W，28Y，29A，29C，29F，29L，29M，29T，29V，30A，30C，30D，30E，30F，30G，30I，30K，30L，30M，30N，30P，30Q，30R，30S，30T，30V，30W，30Y，31A，31C，31E，31F，31G，31H，31I，31K，31L，31M，31N，31Q，31S，31T，31V，31W，31Y，32D，32F，32G，32H，32K，32L，32M，32Q，32S，32T，32V，32Y，33A，33C，33D，33E，33F，33H，33I，33K，33L，33M，33P，33Q，33S，33T，33W，33Y，34A，34F，34I，34P，34W，35A，35C，35F，35G，35H，35I，35L，35M，35N，35P，35Q，35R，35S，35V，35W，35Y，36C，36D，36E，36F，36H，36I，36K，36L，36M，36N，36Q，36R，36S，36T，36Y，37L，37M，37N，37V，38A，38C，38D，38E，38H，38L，38M，38N，38P，38V，39A，39C，39I，39L，39M，39N，39P，39S，39V，40A，40D，40M，40N，40P，40Q，40T，40V，40W，41A，41C，41E，41G，41N，41S，41V，42A，42L，42M，42P，42V，43A，43G，43H，43L，43M，43Q，43S，43T，43V，44A，44C，44D，44E，44F，44G，44H，44I，44K，44L，44M，44N，44P，44R，44S，44T，44V，44W，44Y，45A，45C，45F，45G，45H，45I，45L，45M，45N，45P，45Q，45S，45T，45Y，46A，46C，46D，46E，46F，46H，46I，46L，46M，46N，46Q，46R，46S，46T，46V，46W，46Y，47A，47C，47D，47F，47G，47H，47I，47K，47L，47N，47P，47R，47S，47T，47V，47Y，48A，48C，48D，48E，48F，48H，48I，48K，48L，48N，48P，48S，48T，48V，48W，49A，49C，49D，49F，49G，49H，49I，49K，49L，49P，49Q，49R，49S，49T，49V，49W，49Y，50A，50C，50E，50F，50G，50H，50I，50K，50L，50M，50N，50P，50R，50S，50T，50V，50W，50Y，51A，51C，51D，51E，51F，51H，51I，51K，51L，51M，51N，51P，51Q，51R，51S，51T，51V，51W，52A，52C，52E，52F，52G，52H，52I，52K，52L，52M，52N，52P，52Q，52R，52S，52T，52V，52W，52Y，53A，53C，53E，53F，53G，53H，53I，53L，53N，53P，53R，53S，53T，53V，53W，53Y，54A，54C，54D，54F，54G，54H，54I，54L，54M，54N，54P，54Q，54R，54T，54V，54W，54Y，55A，55C，55D，55E，55F，55G，55H，55I，55N，55P，55Q，55S，55T，55Y，56A，56D，56E，56F，56G，56I，56K，56L，56M，56N，56P，56Q，56R，56T，56V，56W，56Y，57A，57C，57D，57E，57F，57H，57I，57K，57L，57M，57Q，57R，57S，57T，57V，57W，57Y，58A，58F，58H，59A，59C，59D，59E，59F，59G，59H，59K，59L，59N，59P，59R，59S，59T，59V，59W，60A，60C，60D，60E，60G，60I，60K，60L，60M，60N，60Q，60R，60T，60V，61C，61D，61E，61F，61M，61S，61T，61V，62A，62C，62D，62F，62G，62H，621，62K，62L，62Q，62S，62T，62V，63A，63C，63D，63F，63G，63H，63K，63M，63N，63R，63S，64A，64G，64H，64I，64L，64M，64N，64S，64V，64Y，65A，65C，65E，65H，65I，65K，65L，65M，65Q，65R，65S，66D，66E，66F，66G，66H，66I，66K，66L，66M，66N，66Q，66R，66T，66V，66W，66Y，67A，67C，67D，67E，67F，67G，67I，67K，67L，67N，67P，67Q，67S，67T，67W，68A，68C，68D，68E，68F，68G，68H，68I，68L，68M，68N，68P，68R，68S，68T，68V，68W，68Y，69A，69C，69M，69P，69T，69V，70A，70E，70H，70N，70S，71S，72C，72D，72E，72F，72G，72H，72I，72K，72L，72P，72Q，72S，72T，72V，72W，72Y，73A，73C，73E，73F，73H，73I，73K，73L，73M，73P，73S，73T，73V，73W，74A，74E，74F，74M，74S，74T，74Y，75A，75C，75D，75E，75P，76A，76D，76E，76F，76G，76I，76L，76M，76P，76Q，76R，76S，76V，76Y，77A，77C，77D，77G，77H，77I，77K，77L，77R，77S，77T，77V，77W，77Y，78A，78C，78D，78E，78F，78G，78H，78I，78K，78L，78M，78N，78P，78R，78S，78T，78V，78W，78Y，79A，79G，79L，79M，79N，79Q，79S，79T，80A，80L，80M，80W，80Y，81A，81C，81D，81E，81G，81H，81I，81L，81M，81N，81Q，81R，81S，81T，81V，81W，81Y，82A，82D，82F，82G，82I，82K，82L，82M，82Q，82R，82S，82T，82V，82W，82Y，83A，83F，83I，83L，83T，83V，84A，84D，84E，84G，84I，84K，84M，84N，84Q，84S，84T，84V，85D，85E，85F，85G，85I，85K，85L，85M，85N，85R，85S，85T，85V，85W，86C，86D，86E，86F，86C，86I，86K，86L，86M，86N，86Q，86R，86S，86V，86W，86Y，87F，87G，87T，88A，88C，88D，88F，88G，88H，88I，88K，88L，88M，88N，88Q，88R，88S，88T，88V，88W，88Y，89A，89C，89D，89F，89G，89H，89I，89K，89L，89M，89N，89P，89Q，89R，89S，89T，89V，89W，89Y，90C，90D，90E，90F，90G，90H，90I，90K，90L，90M，90N，90Q，90R，90S，90T，90V，90W，91A，91C，91D，91E，91F，91H，91K，91L，91M，91N，91P，91Q，91R，91S，91T，91W，91Y，92L，92N，92T，92V，93A，93C，93D，93E，93F，93G，93I，93L，93M，93N，93P，93Q，93R，93S，93T，93V，93W，93Y，94A，94C，94I，94M，94T，95A，95F，95L，95M，95V，95Y，96A，96C，96I，96L，96M，96P，96T，97A，97E，97M，97W，98C，98G，98I，98L，98M，98T，98V，99A，99C，99E，99F，99G，99I，99L，99M，99N，99P，99S，99T，100A，100C，100F，100M，100N，100P，100T，100V，100Y，101A，102A，102G，102Q，102S，102W，102Y，103A，103C，103I，103M，103N，103S，103V，104A，104C，104S，105C，105D，105E，105F，105G，105H，105K，105L，105M，105Q，105R，105T，105V，105W，105Y，106A，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在某些情况下，修饰是亲本多肽中存在的一个或多个氨基酸残基对于不同氨基酸残基的置换，如由下述例示的：1A、1D、1F、1G、1H，1K，1M，1N，1Q，1R，1S，1T，1V，1W，1Y，2A，2E，2F，2G，2H，2I，2P，2Q，2R，2S，2W，3D，3E，3F，30，3H，3I，3K，3L，3M，3N，3P，3Q，3R，3S，3V，3W，3Y，4D，4E，4F，4G，4I，4K，4L，4Q，4S，4T，4V，4W，5A，5D，5E，5F，5G，5K，5L，5V，5W，6D，6H，6K，6L，6P，6Q，6S，6V，6W，7A，7D，7E，7H，7N，7Q，7R，7S，8A，8C，8E，8F，8G，8H，8I，8K，8L，8N，8P，8Q，8R，8T，8V，8W，8Y，9A，9D，9E，9F，9H，9I，9K，9M，9N，9P，9R，9V，9W，9Y，10I，10L，10M，10P，10S，10V，11A，11F，11M，11V，12I，12M，13A，13D，13Q，14G，14S，14T，14V，15F，16M，16Q，18G，18N，18R，19H，19W，20A，20D，20F，20G，20H，20I，20K，20M，20R，20S，20V，20W，20Y，21E，21I，21M，21Q，21S，21V，22I，22T，22V，23A，23D，23E，23F，23G，23H，23I，23L，23M，23N，23R，23S，23T，23V，23W，23Y，24A，24C，24F，24G，24R，24S，24T，24V，24Y，25E，25F，25K，25L，25R，25S，25T，25V，25W，25Y，26I，26L，27A，27E，27F，27G，27H，27I，27L，27P，27Q，27R，27S，27T，27V，27W，27Y，28A，28C，28G，28H，28I，28K，28L，28M，28N，28P，28Q，28R，28S，28V，28W，28Y，29F，29L，29V，30A，30C，30D，30E，30F，30G，30L，30M，30N，30Q，30R，30S，30T，30V，30W，30Y，31A，31F，31G，31H，31I，31K，31L，31M，31N，31Q，31S，31T，31V，31Y，32G，32S，33A，33D，33E，33H，33Q，33S，34W，35A，35F，35G，35H，35I，35L，35M，35N，35Q，35R，35S，35V，35W，36F，36H，36I，36L，36S，36T，36Y，37L，37V，39A，39P，39S，39V，42V，43A，43S，43T，43V，44A，44D，44E，44F，44G，44H，44I，44K，44N，44R，44S，44T，44Y，45F，45H，45I，45L，45M，45S，45T，46A，46D，46F，46H，46L46M，46N，46R，47A，47D，47F，47G，47H，47I，47K，47L，47N，47P，47R，47S，47T，47V，47Y，48A，48E，48F，48H，48N，48P，48W，49A，49F，49G，49H，49K，49L，49Q，49R，49S，49T，49V，49W，49Y，50E，50F，50H，50I，50K，50L，50M，50P，50R，50S，50T，50V，50W，50Y，51D，51E，51F，51H，51I，51K，51L，51P，51Q，51R，51S，51T，51V，51W，52E，52F，52G，52H，52I，52K，52L，52M，52N，52Q，52R，52S，52T，52V，52W，52Y，53A，53E，53F，53H，53I，53L，53P，53R，53S，53T，53V，54A，54C，54F，54G，54H，54L，54N，54P，54R，54T，54W，54Y，55A，55F，55H，55N，55P，55Q，55S，55T，55Y，56D，56E，56F，56G，56I，56K，56L，56P，56Q，56R，56T，56V，56W，56Y，57A，57E，57H，57M，57Q，57R，57S，57Y，58F，59A，59C，59F，59H，59N，59P，59R，59S，59T，59W，60L，60N，63H，63N，64A，64S，65A，65I，65R，66D，66E，66G，66M，66N，66Q，66R，67A，67F，67G，67I，67L，67N，67Q，67T，67W，68D，68F，68H，68I，68L，68N，68R，68S，68T，68V，68W，69M，69V，72E，72F，72G，72H，72I，72K，72Q，72S，72T，72V，72W，72Y，73F，73M，73W，74M，74T，76A，76L，76M，76P，76Q，76R，76Y，77A，77D，77K，77L，77R，77Y，78D，78E，78F，78G，78H，78I，78K，78L，78P，78R，78S，78T，78W，78Y，79A，79M，79Q，79S，80M，81E，81G，81H，81L，81M，81N，81Q，81R，81S，81T，81V，81Y，82D，82F，82G，82I，82K，82L，82M，82Q，82R，82S，82T，82Y，83A，83F，83L，84A，84N，84S，84T，85D，85E，85F，85G，85I，85K，85R，85S，85T，85V，85W，86D，86E，86F，86G，86I，86K，86L，86M，86N，86Q，86R，86S，86V，86W，86Y，87G，88A，88D，88F，88G，88H，88K，88L，88M，88N，88Q，88R，88S，88T，88W，88Y，89D，89F，89G，89H，89I，89K，89L，89M，89N，89P，89Q，89R，89S，89T，89V，89W，89Y，90D，90E，90F，90H，90I，90K，90M，90N，90R，90S，90T，90V，90W，91D，91E，91H，91K，91N，91Q，91R，91S，92L，92V，93A，93D，93G，93M，93N，93R，93S，93Y，94I，95F，95M，96I，98C，99I，100C，100F，100M，100V，103A，103C，103V，104A，104S，105C，105D，105E，105F，105G，105M，105W，105Y，106E，106H，106N，106Q，106S，106T，106Y，107A，107C，107E，107F，107G，107H，107I，107K，107L，107M，107N，107P，107Q，107R，107S，107T，107V，107W，108C，108D，108E，108F，108G，108H，108I，108K，108L，108N，108P，108R，108S，108T，108V，108W，108Y，109D，109H，109I，109K，109L，109N，109R，109S，109V，109W，109Y，110V，111C，111E，111F，111G，111H，111K，111L，111M，111N，111Q，111R，111T，112A，112D，112E，112H，112K，112L，112R，112S，112T，112W，112Y，113A，114L，115A，115H，115I，115L，115R，115V，115Y，116A，116F，116G，116H，116I，116L，116N，116Q，116R，116T，116V，116W，116Y，118D，118F，118G，118H，118K，118L，118M，118N，118Q，118R，118S，118T，118V，118W，118Y，119E，119F，119I，119K，119L，119M，119Q，119S，119T，119Y，121S，124A，124K，124Q，124R，124S，124T，125A，125D，125F，125I，125K，125Q，125R，125V，125Y，126A，126C，126D，126F，126G，126H，126I，126K，126L，126N，126P，126R，126S，126T，126V，126W，126Y，128A，128C，128E，128F，128G，128H，128I，128L，128M，128N，128Q，128R，128S，128T，128V，129C，129D，129E，130A，130F，130L，130T，130Y，131A，131C，131D，131F，131G，131H，131I，131K，131L，131N，131Q，131T，131V，131W，131Y，132I，132N，132S，132W，134E，134F，134L，134M，134R，134Y，135E，136L，140A，141F，141H，142C，142D，142F，142G，142H，142I，142K，142M，142Q，142R，142S，142T，142W，142Y，143C，143D，143K，143L，143N，143Q，143S，144T，147F，147L，150H，151C，151D，151E，151G，151H，151K，151L，151M，151Q，151S，151T，152A，152C，152E，152F，152G，152H，152I，152K，152L，152M，152N，152P，152Q，152R，152S，152V，152W，152Y，153E，153F，153H，153K，153L，153N，153R，153T，153V，153W，153Y，154A，155M，156A，156F，156G，156K，156L，156Q，156R，156V，156Y，157F，157H，158A，158I，158M，158T，158V，159H，159I，159L，159M，160A，160C，160D，160E，160F，160G，160H，1601，160K，160L，160M，160Q，160S，160T，160V，162I，162M，163A，163E，163F，163G，163H，163I，163K，163L，163N，163Q，163R，163S，163T，163V，163W，163Y，164G，164H，164L，164N，164S，164T，164V，164W，164Y，165C，165I，165L，165M，165T，165V，166C，166I，166M，166V，167A，167C，167E，167F，167G，167I，167K，167L，167M，167Q，167R，167S，167T，167V，167W，167Y，168C，168E，168F，168G，168K，168L，168M，168N，168S，168T，168V，168W，168Y，170C，171E，171H，171I，171M，171N，171Q，171R，172A，175Y，179A，179C，179G，179H，179S，179W，180M，181V，184D，186E，187E，187F，187H，187I，187K，187M，187Q，187S，187V，187W，188A，188D，188F，188G，188I，188K，188L，188M，188P，188Q，188R，188T，188V，189F，189W，190H，190K，190Q，190R，190S，192G，192K，192L，192P，192S，192V，195D，195F，195G，195H，195K，195M，195R，195V，195W，196A，196C，19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8H，348I，348K，348R，348S，348T，348V，348W，348Y，349A，349F，349G，349I，349K，349M，349N，349R，349S，349V，349W，349Y，350D，351A，351D，351G，351H，351K，351L，351M，351P，351Q，351R，351T，351V，351W，351Y，352A，352H，352Q，352T，352Y，353A，353D，353E，353G，353I，353K，353L，353M，353Q，353V，353W，353Y，355C，355F，355I，355L，355M，355V，355Y，356D，356F，356G，356I，356K，356L，356P，356Q，356T，356W，356Y，357A，357H，357I，357K，357L，357N，357Q，357R，357S，357T，357V，357W，357Y，358C，358D，358F，358G，358H，358I，358K，358L，358M，358Q，358R，358S，358T，358V，358Y，359D，359E，359H，359L，359M，359P，359Q，359R，359T，359V，359W，360F，360P，360T，361C，361L，361M，361N，361Q，361S，361T，361V，362A，362C，362I，362L，362V，362Y，363D，363G，363H，363Q，363R，363S，363V，363W，363Y，364A，364C，364G，364I，364L，364M，364Q，364S，364T，364V，365C，365I，365K，365L，365N，365R，365S，365V，366A，366K，367L，367M，367N，367R，367S，367T，367W，367Y，368G，368I，368K，368L，368R，368T，368V，368W，369C，369D，369E，369F，369G，369I，369K，369L，369N，369Q，369S，369T，369V，369Y，371A，371C，371F，371I，371L，371M，371N，371S，371T，371Y，372A，372C，372I，372L，372N，372S，372T，373A，373C，373F，373I，373M，373T，373V，374C，374G，374I，374M，374S，374T，374V，375A，375C，375D，375F，375H，375L，375M，375Q，375S，375T，375Y，376G，376I，376S，376T，376V，377F，377H，377L，377T，377W，377Y，378C，378E，378F，378G，378H，378I，378K，378L，378M，378N，378Q，378R，378T，378V，378W，378Y，379A，379G，379H，379I，379K，379L，379Q，379T，379Y，380C，380E，380F，380G，380H，380L，380M，380N，380P，380Q，380R，380T，380V，380W，380Y，381G，381I，381Q，381R，381S，381T，381W，381Y，382A，382C，382F，382I，382K，382Q，382R，382T382W，382Y，383A，383F，383L，383P，383Q，383V，384A，384G，384H，384I，384K，384P，384Q，384V，384W，385C，385F，385H，385I，385K，385L，385N，385P，385Q，385R，385S，385V，385W，385Y，386D，386F，386G，386H，386L，386N，386R，386S，386T，386V，386W，386Y，387I，387L，388A，388C，388G，388H，388L，388P，388S，388T，388W，388Y，389C，389F，389I，389M，389Q，389V，390F，390I，390K，390L，390N，390R，390S，390T，390V，390W，390Y，391F，391K，391N，391P，391R，391T，391W，391Y，392A，392C，392D，392E，392F，392H，392K，392L，392N，392Q，392R，392S，392V，392Y，393A，393C，393D，393F，393G，393H，393I，393L，393Q，393S，393T，393V，393W，393Y，394A，394C，394F，394H，394I，394K，394L，394Q，394V，394W，395F，395G，395H，395K，395L，395Q，395R，395S，395T，395V，395W，395Y，396C，396D，396S，397C，397D，397F，397G，397H，397I，397L，397P，397S，397T，397V，397W，398C，398G，398N，398S，398T，398V，399C，399F，399I，399K，399L，399R，399S，399T，399V，399W，399Y，400C，400D，400E，400F，400G，400H，400I，400K，400L，400M，400Q，400R，400S，400T，400V，400W，400Y，401A，401C，401D，401E，401F，401I，401K，401L，401M，401N，401Q，401R，401S，401T，401V，401W，401Y，402A，402C，402D，402E，402F，402G，402H，402I，402K，402L，402M，402N，402P，402Q，402R，402T，402V，402W，402Y，403A，403C，403H，403I，403M，403V，403W，403Y，404F，404H，404M，404R，404T，404V，404W，404Y，405G，405Q，405S，405T，406L，406T，407F，407G，407H，407I，407K，407M，407Q，407R，407S，407T，407V，407W，407Y，408D，408E，408F，408N，408V，409C，409F，409I，409L，409R，409T，409V，409W，409Y，410V，411E，411F，411M，411Q，411R，411S，411Y，412N，412T，413C，413F，413G，413I，413L，413P，413R，413S，413V，413W，413Y，414H，414L，414N，414Q，414T，414V，414W，415D，415E，415G，415I，415R，415V，415W，416F，416L，416Q，416Y，417A，417C，417D，417F，417G，417H，417I，417K，417M，417N，417Q，418D，418F，418H，418I，418K，418N，418W，418Y，419E，419F，419H，419I，419L，419S，419T，420D，420E，420F，420G，420H，420I，420K，420L，420Q，420S，420T，420V，420W，420Y，421C，421L，421M，421S，421T，422F，422I，422S，422W，423D，423I，423Q，423R，423T，424M，424Q，424R，424V，424Y，425A，425I，425K，425L、425V和425Y。
在某些情况下，置换选自：052D、052E、052I、052K、052L、052N、052Q，052R，052V，056D，056E，056I，056K，056L，056N，056Q，056R，056V，089D，089E，089I，089K，089L，089N，089Q，089R，089V，152D，152E，152I，152K，152L，152N，152Q，152R，152V，153D，153E，153I，153K，153L，153N，153Q，153R，153V，201D，201E，201I，201K，201L，201N，201Q，201R，201V，251D，251E，251I，251K，251L，251N，251Q，251R，251V，284D，284E，284I，284K，284L，284N，284Q，284R，284V，297D，297E，297I，297K，297L，297N，297Q，297R，297V，308D，308E，308I，308K，308L，308N，308Q，308R，308V，321D，321E，321I，321K，321L，321N，321Q，321R，321V，328D，328E，328I，328K，328L，328N，328Q，328R，328V，347D，347E，347I，347K，347L，347N，347Q，347R，347V，357D，357E，357I，357K，357L，357N，357Q，357R，357V，359D，359E，359I，359K，359L，359N，359Q，359R，359V，369D，369E，369I，369K，369L，369N，369Q，369R，369V，385D，385E，385I，385K，385L，385N，385Q，385R，385V，388D，388E，388I，388K，388L，388N，388Q，388R，388V，391D，391E，391I，391K，391L，391N，391Q，391R，391V，400D，400E，400I，400K，400L，400N，400Q，400R，400V，416D，416E，416I，416K，416L，416N，416Q，416R，和416V，所述突变对于蛋白质和活性两者均具有＞0.5的PI值。
使亲本AmyE多肽位置153上存在的氨基酸残基改变为N、K或F的置换显示出了将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力增加。使在亲本AmyE多肽的位置153上存在的氨基酸残基改变为K的置换显示出了将DP7底物转化为葡萄糖的能力增加。
在全长AmyE多肽的背景中，置换L142F、L142G、L142Q、L142S、L142W、L142Y、A214I、A214V、S245Y、Q126F、Q126L、Q126P、Q126V、S131L和S254I改善了淀粉液化性能。在截短AmyE多肽的背景中，置换W60L、W60M、W60N、I100F、I100M、S105M、S105W、G207A、T270A、T270E、T270L、T270N、T270V和T279A改善了淀粉液化性能。
诸如以下一个或多个位置的置换对于蛋白质和活性两者均具有＞0.5的PI值，并且预期可组合用于影响AmyE多肽的各种性质：
052D，052E，052I，052K，052L，052N，052Q，052R，052V，056D，056E，056I，056K，056L，056N，056Q，056R，056V，089D，089E，089I，089K，089L，089N，089Q，089R，089V，152D，152E，152I，152K，152L，152N，152Q，152R，152V，153D，153E，153I，153K，153L，153N，153Q，153R，153V，201D，201E，201I，201K，201L，201N，201Q，201R，201V，251D，251E，251I，251K，251L，251N，251Q，251R，251V，284D，284E，284I，284K，284L，284N，284Q，284R，284V，297D，297E，297I，297K，297L，297N，297Q，297R，297V，308D，308E，308I，308K，308L，308N，308Q，308R，308V，321D，321E，321I，321K，321L，321N，321Q，321R，321V，328D，328E，328I，328K，328L，328N，328Q，328R，328V，347D，347E，347I，347K，347L，347N，347Q，347R，347V，357D，357E，357I，357K，357L，357N，357Q，357R，357V，359D，359E，359I，359K，359L，359N，359Q，359R，359V，369D，369E，369I，369K，369L，369N，369Q，369R，369V，385D，385E，385I，385K，385L，385N，385Q，385R，385V，388D，388E，388I，388K，388L，388N，388Q，388R，388V，391D，391E，391I，391K，391L，391N，391Q，391R，391V，400D，400E，400I，400K，400L，400N，400Q，400R，400V，416D，416E，416I，416K，416L，416N，416Q，416R，和416V，
尽管AmyE多肽的许多位置可以进行突变，但在如下意义上AmyE多肽的位置75、97、101、102、120、123、133、137、182、266和306是限制性的，即，在这些位置上的突变一般降低性能。特别地位置75和123已经被确定在亲本多肽的截短形式中对于性能是完全限制性的，而位置75、97、101、102、120、133、137、182、266和306已经被确定为在亲本多肽的全长形式中对于性能是完全限制性的。
应当注意，尽管在大组和亚组中列出了许多突变，但每个突变是分开的实体，并且所鉴定突变中的任何一个或多个都可以纳入或排除出进一步的突变亚组中。因此，本发明的组合物和方法包括具有本文描述的任何一个或多个变体或其组合的AmyE变体。
3.AmyE多肽的生产
编码AmyE多肽的DNA序列可以使用表达载体以酶形式表达，其中表达载体一般包括编码合适启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏基因或各种激活基因的控制序列。
本发明提供包括编码AmyE或其变体的核酸的载体。提供包括载体的宿主细胞。宿主细胞可以表达编码AmyE变体的多核苷酸。宿主可以是芽孢杆菌属物种，例如枯草芽孢杆菌。
3.1多核苷酸和载体
本发明组合物和方法的一个方面包括编码AmyE多肽的多核苷酸，以及基于此多核苷酸可以用于表达AmyE多肽的载体和宿主细胞。编码AmyE多肽的核酸包括但不限于SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的多核苷酸(其分别编码SEQ ID NO：1的AmyE和AmyE-tr(SEQ ID NO：2))、及其变体。其它代表性多核苷酸包括SEQ ID NO：7的多核苷酸，其编码Amy31A(SEQ ID NO：3)。NCBI登记号ABK54355、AAF14358、AAT01440、AAZ30064、NP_388186、AAQ83841和BAA31528中公开的AmyE类似地由在公众可获得的数据库中公开的多核苷酸编码，所述序列引入本文作为参考。核酸可以是DNA、mRNA或cDNA序列。核酸还可以包括与上述任何核酸相对应的简并序列。通过使用特定宿主生物所偏好的密码子，可以设计简并序列用于最佳表达。
携带编码AmyE多肽(包括变体)的DNA序列的重组表达载体可以是任何可以方便地实施重组DNA操作的载体，并且载体的选择通常将依赖于它待引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。可替代地，载体可以是当引入宿主细胞内时整合到宿主细胞基因组内且与整合其的染色体(一个或多个)一起复制的载体。通过使用可扩增构建体，也可以使整合的基因扩增以在染色体中产生该基因的多个拷贝，所述可扩增构建体通过抗生素选择或其他选择性压力(例如必需调节基因)来驱动或通过对必需代谢途径基因的互补来驱动。
表达载体一般包括克隆载体的组分，例如允许载体在所选择的宿主生物中自主复制的元件和用于选择目的的一种或多种表型可检测标记。表达载体通常包括编码启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏基因或一个或多个激活基因的控制性核苷酸序列。在一个方面，所使用的所有信号序列将物质靶向细胞培养基，以便更容易的酶收集和任选地纯化。用于分别地连接编码AmyE或其变体的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件、和将它们插入包含复制所需信息的合适载体内的操作，是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Sambrook等人，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版，Cold Spring Harbor，1989和第3版，2001)。
载体中，该DNA序列应与适宜的启动子序列有效连接。启动子可以是任何在所选宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，并且可源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。可用于指导编码AmyE或其变体的DNA序列转录(尤其在细菌宿主中)的适宜启动子包括各种芽孢杆菌来源的启动子，例如源自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子，大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA或celA启动子、以及枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的那些启动子。当在诸如大肠杆菌的细菌物种中表达编码AmyE或其变体的基因时，可以例如从噬菌体启动子(包括T7启动子和λ噬菌体启动子)选择适宜的启动子。适于在酵母物种中表达的适宜启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的AOX1或AOX2启动子。
表达载体还可以包括适宜转录终止子以及，在真核生物中，多腺苷酸化序列，与编码α-淀粉酶变体的DNA序列可操作地连接。终止序列和多腺苷酸化序列可以适宜地源自与启动子相同的来源。载体可以进一步包括使得载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此种序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pICatH和pIJ702的复制起点。
载体也可包括选择标记，例如其产物能弥补宿主细胞中的缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包括曲霉属(Aspergillus)选择标记，例如amdS、argB、niaD和xxsC，产生潮霉素抗性的标记，或者可通过诸如本领域已知的共转化实现选择。参见例如，WO 91/17243。
3.2AmyE多肽表达和宿主生物
一般有利的是，AmyE多肽在宿主细胞中表达后被分泌到培养基中。为此，AmyE多肽可以包括允许所表达的酶分泌到培养基的信号序列。信号序列可以与AmyE由相同的基因编码。例如，SEQ ID NO：1中所示的AmyE天然地与信号序列以及具有序列MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAETANKSNE(SEQ ID NO：9)的额外N末端氨基酸一起表达。信号序列可替代地可以是来自不同AmyE或甚至不同蛋白质的枯草芽孢杆菌物种信号序列。进一步地，信号序列可以来自不同物种，例如地衣芽孢杆菌。可以选择信号序列，以例如提供AmyE或其变体在特定宿主细胞中的最佳表达。可以通过自N末端蛋白酶解断裂非信号序列的额外序列，而产生成熟AmyE。例如，来自地衣芽孢杆菌的31-氨基酸残基信号序列(“LAT前导序列)可以与AmyE序列在框内融合。例如，如图2中所示的，编码AmyE的核酸在表达载体中与地衣芽孢杆菌信号序列可操作地连接。
有益地，将含有DNA构建体或表达载体的分离的细胞用作重组生产AmyE或其变体的宿主细胞。可用编码AmyE或其变体的DNA构建体，任选地通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中，而转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。可以根据常规方法，例如通过同源或异源重组，实现DNA构建体向宿主染色体的整合。或者，可以用上述与不同类型宿主细胞有关的表达载体转化细胞。
适宜的细菌宿主生物的实例为革兰氏阳性细菌物种，例如芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)；链霉菌属物种如鼠灰链霉菌(S.murinus)；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种(Lactococcus spp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)；明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)，片球菌属物种(Pediococcus spp.)和链球菌属物种(Streptococcus spp.)。或者，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或者属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物。
适宜的酵母宿主生物可以选自生物技术相关酵母物种，例如但不限于毕赤酵母属物种、汉逊酵母属物种、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种、耶氏酵母属(Yarrowinia)物种，或酵母菌属(Saccharomyces)物种，包括酿酒酵母；或属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养酵母物种巴斯德毕赤酵母的菌株可以用作宿主生物。或者，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适宜的宿主生物包括曲霉属物种，例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉。或者，镰孢霉属(Fusarium)物种，如尖镰孢(Fusarium oxysporum)或根毛霉属(Rhizomucor)物种，如米黑根毛霉，可以用作宿主生物。其他适宜的菌株包括嗜热丝孢菌属(Thermomyces)和毛霉属(Mucor)物种。真菌细胞可以通过包括原生质体形成、原生质体转化、接着再生细胞壁的方法以本领域已知的方式进行转化。转化曲霉属宿主细胞的适宜操作包括例如EP238023中所述的那些。
本发明组合物和方法的一个方面是产生AmyE变体的方法，所述方法包括在有利于变体生产的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基中回收变体。用于培养细胞的培养基可以是任何适于生长所讨论宿主细胞和获得AmyE变体表达的常规培养基。适宜的培养基和培养基组分可获自商品供应商或可根据公开的配方(例如在美国典型培养物保藏中心(ATCC)的目录中所述的配方)制备。示例培养基包括但不限于用于在三千升(3,000L)搅拌式发酵罐中进行补料分批发酵的那些培养基。在该情况下生长培养基可以包括玉米浆固形物和大豆粉作为有机化合物的来源，连同无机盐作为钠、钾、磷酸、镁和硫酸的来源，以及微量元素。通常，碳水化合物来源如葡萄糖也是初始培养基的一部分。一旦培养物自身已经建立并开始生长，则可以如本领域已知的那样向罐中定量供应碳水化合物，以便维持培养物。定期从发酵罐中取样，以便利用例如比色测定法来测量酶滴度。根据测量，当酶生产速率停止增加时，终止发酵过程。
可通过公知的方法从培养基中方便地回收自宿主细胞分泌的AmyE多肽，包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换色谱、亲和色谱等的色谱方法。
可在允许AmyE多肽表达的适宜条件下培养宿主细胞。蛋白质的表达可以是组成型的，从而它们可以连续生产，或可以是诱导型的，从而需要刺激来起始表达。在诱导型表达的情况下，可以在需要时通过例如向培养基中加入诱导物(例如地塞米松或IPTG或Sepharose)来起始蛋白质生产。也可以在体外无细胞体系(例如TNTTM(Promega)兔网织红细胞体系)中重组生产多肽。
也可以在有氧条件下，于对宿主合适的培养基中培养表达AmyE多肽的宿主。可以提供振荡或搅拌及通风的组合，在对于该宿主适合的温度例如约30℃至约75℃进行生产，这取决于宿主的需要以及生产期望α-淀粉酶变体的需要。可以培养约12至约100小时或更长时间(以及其间的任何时间值)或更特别地是24-72小时。通常，培养物肉汤在约5.5至约8.0的pH，这也取决于相对于AmyE变体的生产，宿主细胞所需的培养条件。
所表达酶的淀粉分解活性可以使用例如马铃薯淀粉作为底物进行测定。这种方法基于酶对改性马铃薯淀粉的分解，反应后将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合。最初，形成黑蓝色，但在淀粉分解过程中，蓝色变淡，并且逐步变成赤褐色(与有色玻璃标准相比)。
AmyE多肽可以作为融合蛋白表达，所述融合蛋白在AmyE成熟形式的N和/或C末端包括促进表达、检测和/或纯化的序列，例如信号序列或His标签。此类序列包括促进AmyE在宿主生物中分泌和表达的信号序列。在信号序列切割后，可以从AmyE的N末端切除额外的氨基酸残基，如Yang等人，“Nucleotide sequence of the amylase gene from Bacillus subtilis，”Nucleic Acids Res.11：237-49(1983)中讨论的。
4.AmyE多肽的纯化
在一些情况下，可以使用常规方法制备纯化的AmyE多肽。在培养生长宿主生物后，获得生长(“发酵”)肉汤，可以通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮的固形物(包括残留的发酵原料)以便获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微量过滤、转鼓真空过滤、随后超滤、提取或色谱法等。
因为使用未浓缩的溶液需要增加的孵育时间来收集含纯化的酶的沉淀物，故为优化回收，浓缩含表达的AmyE或其变体的溶液一般是期望的。可以使用常规技术将溶液浓缩，直到获得期望的酶水平。可通过上文讨论的任何技术实现含酶溶液的浓缩。在一个实施方案中，使用转鼓真空蒸发和/或超滤。或者，可以应用超滤。
可以使用例如金属卤化物沉淀剂进行沉淀。金属卤化物沉淀剂包括：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。金属卤化物可以选自氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。适宜的金属卤化物包括氯化钠和氯化钾，尤其是是氯化钠(其还可以用作防腐剂)。在常规试验后，本领域普通技术人员可以容易地选择出实现最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和AmyE或其变体的浓度。
通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，且通常是至少8％w/v。通常，向浓缩的酶变体溶液中加入不超过约25％w/v的金属卤化物，且通常是不超过20％w/v。金属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于例如具体的AmyE或其变体的性质以及其在溶液中的浓度等。
另一可选的实现酶沉淀的方法是应用有机化合物，其可以添加到浓缩的酶变体溶液中。有机化合物沉淀剂可以包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在金属卤化物沉淀剂的添加之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加都可顺序进行或同时进行。对于进一步的描述，参见例如Danisco A/S的US专利号5,281,526。
通常，有机化合物沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(例如钠或钾盐)，以及4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-12个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-10个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。适宜的有机化合物包括4-羟基苯甲酸的线性烷基酯(其中烷基含有1-6个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲基酯、4-羟基苯甲酸的丙基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。其它有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(甲基PARABEN)、4-羟基苯甲酸丙酯(丙基PARABEN)，它们也是淀粉酶防腐剂。所述有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件高度灵活性的优势(就pH、温度、酶浓度、沉淀剂浓度和孵育时间而言)。通常，向浓缩的酶变体溶液中加入至少0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常至少0.02％w/v。通常向浓缩的酶变体溶液中加入不多于0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常不多于0.2％w/v。
可以调整含有金属卤化物沉淀剂和，在一个方面，有机化合物沉淀剂的浓缩酶溶液的pH，该pH必然地将取决于待纯化的酶变体。通常，将pH调整至淀粉酶等电点(pI)的附近。例如，可以将pH调整至位于如下范围内：低于等电点(pI)大约2.5个pH单位至高于等电点约2.5个pH单位。当变体的pI与野生型pI不同时，可以相应地调整该pH。
获得纯化的酶沉淀物所需的孵育时间取决于具体酶的性质、酶浓度、以及具体的沉淀剂(一种或多种)及其浓度。通常，有效沉淀酶变体的时间为约1至约30小时；通常不超过约25小时。在有机化合物沉淀剂存在下，孵育时间还可以减至小于约10小时，且在大多数情况下甚至是约6小时。
通常，孵育期间的温度为约4℃至约50℃。通常，在约10℃至约45℃，尤其是约20℃至约40℃的温度进行所述方法。用于引起沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶或所用沉淀剂而变化。
可以通过搅拌包括酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液，提高纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。可以在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的孵育期均进行搅拌步骤。适宜的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强有力的通风或任何类似的技术。
纯化的酶可以通过常规分离技术，例如过滤、离心、微量过滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微量过滤(cross membrane microfiltration)、交叉流膜微量过滤等进一步纯化，交叉膜微量过滤可以是一种应用方法。可以通过用水洗涤沉淀物对纯化的酶沉淀物进一步纯化。例如，可以用含有金属卤化物沉淀剂的水，例如用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水，洗涤该纯化的酶沉淀物。
培养期间，所表达的酶可以累积在培养物肉汤中。为了分离和纯化该表达的酶，可以离心或过滤培养物肉汤以除去细胞，并可以利用所得的无细胞液体进行酶纯化。在一个实施方案中，使用约70％饱和度的硫酸铵对无细胞肉汤进行盐析；然后将该70％饱和度-沉淀级分溶解在缓冲液中并施加到诸如Sephadex G-100柱等柱中，然后洗脱以回收酶活性级分。为了进一步的纯化，可使用诸如离子交换色谱等常规方法。
纯化的酶可用于通常利用该酶的所有应用中。例如，它们可以用于洗衣洗涤剂和除斑剂，用于食品工业，用于淀粉加工和烘焙，且可作为消化助剂用于药物组合物。可以将它们制成液体(溶液，浆液)或固体(颗粒，粉末)终产物。
可选地，可以回收酶产物，并向培养基中加入絮凝剂，以通过过滤或离心除去细胞和细胞碎片而无需进一步纯化酶。
通过上述方法产生且纯化的AmyE多肽可以在各种有用的工业应用中使用。这些酶具有促进与织物和家居护理(F&HC)有关的应用的有价值性质。例如，AmyE多肽可以用作洗涤、餐具洗涤和硬表面清洁洗涤剂组合物中的组分。AmyE多肽还可以用于由淀粉生产甜味剂和乙醇和/或用于纺织品退浆。AmyE多肽在淀粉转化工艺中特别有用，包括淀粉液化和/或糖化工艺，如在例如WO 2005/111203和美国公开申请号2006/0014265(Danisco A/S)中所述。AmyE多肽的这些用途在下文更详细描述。
5.AmyE多肽的组合物和使用方法
5.1.淀粉加工组合物和方法
5.1.1.概述
AmyE多肽可以用于淀粉加工/转化，这对于生产甜味剂、生产醇用于燃料或饮用(即，可饮用醇)、生产饮料、加工甘蔗糖或生产所需有机化合物是关键的，所述有机化合物例如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、酮、氨基酸、抗生素、酶、维生素、激素等。淀粉转化一般涉及将糊化的淀粉或颗粒淀粉的浆水解成可溶性淀粉水解物。常规淀粉转化涉及3个连续酶促步骤：液化步骤、糖化步骤、和由葡萄糖产生所需产物的其它步骤。取决于所需产物，该其它步骤可以是异构化、发酵等。在将淀粉转化为果糖糖浆的方法中，该其它步骤是异构化。
5.1.2.淀粉组合物
待加工的淀粉可以得自块茎、根、茎、豆科植物、谷物或全谷粒。更具体而言，颗粒淀粉可以得自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。特别考虑的是蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。淀粉可以是高度精制的淀粉质量，例如至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯。可替代地，淀粉可以是更为粗糙的含淀粉物质，包括碾碎的全谷粒，包括非淀粉的级分例如胚芽残留物和纤维。可以研磨原料例如全谷粒，以打开结构和允许进一步加工。
两种研磨方法是合适的：湿磨法和干磨法(干磨)。在干磨法中，研磨且使用整个籽粒。除淀粉外，干磨后的谷粒还可以包括显著量的非淀粉碳水化合物化合物。当此非均质材料通过喷射蒸煮加工时，常仅实现淀粉的部分糊化。湿磨法获得胚芽和粗磨粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并且通常在糖浆生产中使用。该方法可以在超滤系统中进行，其中在酶、生淀粉和水的存在下保持保留物再循环，其中渗透物是可溶性淀粉水解物。该方法还可以在连续膜反应器中用超滤膜进行，其中保留物在酶、生淀粉和水的存在下维持再循环，并且其中渗透物是可溶性淀粉水解物。该方法还可以在连续膜反应器中用微量过滤膜进行，其中保留物在酶、生淀粉和水的存在下维持再循环，并且其中渗透物是可溶性淀粉水解物。
在上述任何方面中使用的淀粉浆可以具有约20％-约55％干固形物颗粒淀粉，约25％-约40％干固形物颗粒淀粉，或约30％-约35％干固形物颗粒淀粉。酶变体可以以至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的量将颗粒淀粉中的可溶性淀粉转化为可溶性淀粉水解物。
5.1.3.液化和糖化
在液化步骤过程中，淀粉浆中存在的长链淀粉分子通过α-淀粉酶降解成较短的分支和线性分子(麦芽糖糊精)。众多α-淀粉酶是商购可得的，包括
Figure BDA0000046157560000781
Xtra(Genencor)和(Novozymes)。
液化过程一般在约105-110℃执行约5-10分钟，随后为在95℃进行1-2小时。液化的pH一般是约5.0-约6.2，并且通常高于5.5。为了促进在这些条件下的α-淀粉酶稳定性，一般加入1mM钙(40ppm游离钙离子)。在此处理后，液化的淀粉组合物将主要包含糊精，并且将具有约10-15的“葡萄糖当量”(DE)。
在液化过程后，一般通过加入葡糖淀粉酶(例如，AMGTM)，将糊精在分开的糖化步骤中转化成葡萄糖。也可以加入脱支酶例如异淀粉酶或支链淀粉酶(例如，)。为了准备用于糖化步骤，浆的pH一般减少至低于约4.5的值，而温度维持在95℃或更高，从而使得液化α-淀粉酶变性。温度随后降低至约60℃，并且加入葡糖淀粉酶和脱支酶，以实现自糊精的葡萄糖生产。糖化步骤一般进行约24-约72小时。
5.1.4.通过糖化作用产生的葡萄糖的进一步加工
在糖化步骤后，葡萄糖糖浆可以例如使用固定化葡萄糖异构酶(例如
Figure BDA0000046157560000792
)转化成高果糖糖浆。在一个方面，将该步骤的可溶性淀粉水解物转化为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。这种转化可以使用葡萄糖异构酶达到，特别是在固相载体上固定的葡萄糖异构酶。可以考虑的异构酶包括商业产品
Figure BDA0000046157560000793
，IT(Novozymes A/S)；G-
Figure BDA0000046157560000794
IMGI和G-
Figure BDA0000046157560000795
G993、
Figure BDA0000046157560000796
、G-
Figure BDA0000046157560000797
G993、G-G993液体和
Figure BDA0000046157560000799
IGI。尽管Ca2+增加常规α-淀粉酶的稳定性，但它强烈抑制葡萄糖异构酶的活性。因此，Ca2+一般在异构化前例如通过离子交换去除，从而使得Ca2+的水平低于3-5ppm。这个过程是耗时且昂贵的。
可替代地，通过糖化作用产生的葡萄糖可以用于发酵以产生发酵产物，例如乙醇、丁醇和本文描述和本领域已知的其他化合物。用于通过发酵由含淀粉材料生产乙醇的一般完全过程包括：(i)用AmyE或其变体使含淀粉物质液化；(ii)使获得的液化醪液糖化；和(iii)在发酵生物的存在下使步骤(ii)中获得的物质发酵。任选地该方法进一步包括回收乙醇。在发酵过程中，乙醇含量可以达到至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％，例如至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少15％或至少16％乙醇。
可以以同时糖化和发酵(SSF)工艺，执行糖化和发酵步骤。当发酵与水解同时执行时，温度可以是30℃-35℃，特别是31℃-34℃。该过程可以在超滤系统中进行，其中保留物在酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下维持再循环，并且其中渗透物是含乙醇液体。还考虑的是在连续膜反应器中用超滤膜进行该过程，其中保留物在酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水的存在下维持再循环，并且其中渗透物是含乙醇液体。
通过糖化作用产生的葡萄糖还可以用于生产发酵产物，例如乙醇、丁醇、柠檬酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡糖酸δ-内酯或异抗坏血酸钠。
5.1.5.AmyEα-淀粉酶的优点
当在淀粉水解中使用时，AmyE多肽提供了几个优点，这使其与其他α-淀粉酶相区分，并且允许淀粉水解方法的流水线化。首先，糊精可以通过AmyE多肽在适于葡糖淀粉酶的相同反应条件下转化成葡萄糖。这排除了下述需要：就α-淀粉酶对反应混合物(例如，浆)的pH和温度进行优化，和随后例如通过减少浆的pH和/或温度，调整反应条件以适应葡糖淀粉酶。由此，在淀粉水解中使用AmyE将允许液化和糖化在相同浆条件下执行，从而消除淀粉水解中的步骤。
在某些情况下，液化作用和糖化作用两者可以在约4-7，例如约4-5、约4-6、约5-6、约5-7和约6-7之间的单一pH进行。注意，该单一pH标准忽略了在液化或糖化过程中发生的反应混合物pH的任何微小改变，但该改变不涉及加入酸或碱以有意地改变反应混合物的pH。在某些情况下，液化作用和糖化作用两者可以在低于常规液化过程的执行pH的pH进行，例如小于约5.0、小于约4.8、小于约4.6、小于约4.4、小于约4.2的pH，或甚至约4.0的pH。AmyE用于液化的用途还允许在用于液化的淀粉组合物中包括更高百分比的稀酒糟(thin stillage)，例如＞50％或甚至＞60％的反应混合物。在某些情况下，液化和糖化两者可以在约20-105℃的温度执行，例如60-85℃，或低于淀粉糊化温度(即，约75℃)约10、12、14、16、18或甚至20℃。重要的是，液化作用和糖化作用可以完全地执行而无需居间进行pH调整。可替代地，当在液化作用和糖化作用之间仍希望pH调整时，与常规工艺中使用的量比较，可以使用减少量的酸或碱进行，从而有较少的盐被引入到反应混合物内。
此外，AmyE多肽可以催化复杂糖例如麦芽糖、麦芽三糖和麦芽七糖分解成葡萄糖。此种酶促活性常规地与葡糖淀粉酶而不是α-淀粉酶相关。AmyE多肽的这种活性使得可以在不存在分开的单独葡糖淀粉酶的情况下或在存在减少量的葡糖淀粉酶(与使用常规α-淀粉酶时所需的量比较)的情况下将淀粉水解为葡萄糖。以这种方式，AmyE多肽在淀粉水解中的使用允许液化作用和糖化作用同时进行，使用单一酶既作为α-淀粉酶也作为葡糖淀粉酶发挥作用，从而消除或减少对分开的酶的需要。
AmyE多肽还需要很少的Ca2+或不需要Ca2+用于稳定性，从而减少或消除将Ca2+加入液化反应中的需要。除避免加入Ca2+的步骤外，这也避免了后续在浆与Ca2+敏感性酶例如葡萄糖异构酶接触之前从浆中去除(例如，通过离子交换)Ca2+的需要。避免Ca2+的去除节省了时间和成本并且增加生产高果糖糖浆的效率。
最后，AmyE多肽对未糊化的淀粉具有高活性，该未糊化淀粉可能在常规α-淀粉酶的酶促活性下是顽固的。这使得可以在一般优选湿磨的淀粉以改善转化效率的情况下使用喷射蒸煮的干磨淀粉用于液化作用和糖化作用。
可以明了，AmyE适用于液化/糖化过程，该液化/糖化过程可以与发酵、异构化或任何其他后续加工，包括SSF，相连。
5.1.6.AmyE与葡糖淀粉酶和其他酶的组合
AmyE多肽可以单独使用(例如，作为淀粉加工中的唯一淀粉分解酶)或可以与其他α-或β-淀粉酶或其他酶组合，以提供具有广谱活性的“鸡尾酒混合物”。例如，淀粉可以与选自真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、细菌α-淀粉酶例如芽孢杆菌α-淀粉酶或非芽孢杆菌α-淀粉酶、或β-淀粉酶(EC3.2.1.2)的一种或多种酶接触。另一种淀粉分解酶或脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)可以与AmyE多肽组合。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1，6-D-糖苷分支键，并且可以由于异淀粉酶无法攻击支链淀粉和通过异淀粉酶对α-极限糊精的有限作用而与支链淀粉酶区分。
β-淀粉酶是产麦芽糖的外切作用淀粉酶，其催化1，4-α-糖苷键水解成直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物从而释放麦芽糖。β-淀粉酶已从各种植物和微生物中分离(Fogarty等人，PROGRESS IN INDUSTRIALMICROBIOLOGY，第15卷，第112-115页，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有在40℃-65℃的范围中的最适温度、和在约4.5-约7.0的范围中的最适pH。考虑的β-淀粉酶包括但不限于，来自大麦的β-淀粉酶
Figure BDA0000046157560000821
BBA 1500、
Figure BDA0000046157560000822
DBA、OPTIMALTTM ME、OPTIMALTTM BBA(Danisco A/S)；和N OVOZYMTM WBA(NovozymesA/S)。
如本文所述，AmyE多肽具有葡糖淀粉酶活性，并且可以在不存在分开的单独葡糖淀粉酶的情况下使用。可替代地，可以以与常规淀粉水解方法所需的量相比为减少的量，加入葡糖淀粉酶。优选地，葡糖淀粉酶以不超过(即，小于)0.5葡糖淀粉酶活性单位(AGU)/g DS(即，葡糖淀粉酶活性单位/克干固形物)的量存在，例如不超过0.4AGU/g DS、不超过0.3AGU/gDS、不超过0.2AGU/g DS、或甚至不超过0.1AGU/g DS。更一般地，葡糖淀粉酶可以以0.02-2.0AGU/g DS或0.1-1.0AGU/g DS的量加入，尽管这些范围考虑使用比与AmyE组合时所需的量更多的葡糖淀粉酶。因为AmyE多肽在与葡糖淀粉酶相同的pH和温度下是活性的，所以AmyE多肽可以在葡糖淀粉酶加入之前或之后加入，或与葡糖淀粉酶同时加入，例如借助于包括AmyE和葡糖淀粉酶两者的鸡尾酒混合物。因此，α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的添加次序和方式不再关键，从而允许淀粉水解过程的灵活性增加。
葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)可以源自微生物或植物。存在真菌和细菌来源的各种已知葡糖淀粉酶。示例性细菌葡糖淀粉酶有曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)，EMBO J.3(5)：1097-1102)或其变体，例如WO 92/00381和WO 00/04136中所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)：941-949)或其变体或片段。曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996)，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995)，Prot.Eng.8：575-582)；N182(Chen等人(1994)，Biochem.J.301：275-281)；二硫键A246C(Fierobe等人(1996)，Biochemistry，35：8698-8704)；以及在A435和S436位置中引入Pro残基(Li等人(1997)Protein Eng.10：1199-1204)。其他葡糖淀粉酶包括里氏木霉葡糖淀粉酶(例如，WO 2006/060062的SEQ ID NO：3；TrGA)、踝节菌属属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森踝节菌属(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利No.RE 32,153)、杜邦踝节菌属(Talaromyces duponti)、嗜热踝节菌属(Talaromyces thermophilics)(美国专利No.4,587,215)的葡糖淀粉酶。细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。其它适宜的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，例如与WO 00/04136中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的葡糖淀粉酶。还适宜的是商业葡糖淀粉酶，例如AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER和AMGTM E(来自Novozymes)；
Figure BDA0000046157560000831
300(Genencor Division，Danisco US Inc.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-
Figure BDA0000046157560000832
G900(来自EnzymeBio-Systems)；G-G990ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶且低蛋白酶含量)。
植酸酶是能够分解谷类和油料种子中的植酸(植酸盐)的酶。植酸以及其降解中间产物被认为失稳或以其他方式不利地影响α-淀粉酶，从而降低其效率。可以与变体α-淀粉酶组合使用的植酸酶能够在温育和液化步骤的限定条件下水解植酸。在某些实施方案中，植酸酶能够从肌醇六磷酸(植酸)中释放至少一个无机磷酸。根据植酸酶对植酸分子上起始水解的磷酸酯基团的特定位置的偏好性，可以将植酸酶分类(例如，3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。植酸酶的一个典型例子是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶。
植酸酶可以得自微生物例如真菌和细菌生物。这些微生物中的一些包括例如曲霉属(例如，黑曲霉、土曲霉(A.terreus)、无花果曲霉(A.ficum)和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉属(Myceliophthora)(嗜热毁丝霉(M.thermophila))、踝节菌属(嗜热踝节菌)、木霉属物种(里氏木霉)和嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(WO 99/49740)。植酸酶也可从青霉属(Penicillium)物种获得，例如P.hordei(ATCC号22053)、桧状青霉(P.piceum)(ATCC号10519)、或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC号48944)。参见例如，USP6,475,762。此外，植酸酶可从芽孢杆菌属(例如，枯草芽孢杆菌)、假单胞菌属、Peniophora、大肠杆菌、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterbacter)和布丘氏菌属(Buttiauxella)获得(参见WO2006/043178)。
商业植酸酶是可获得的，例如
Figure BDA0000046157560000841
(BASF)、
Figure BDA0000046157560000842
P(Novozymes A/S)、
Figure BDA0000046157560000843
(Danisco A/S，Diversa)和
Figure BDA0000046157560000844
(ABEnzymes)。用于测定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义已由Engelen等人(1994)J.AOAC Int.77：760-764公开。植酸酶可以是野生型植酸酶、其变体或片段。
示例性植酸酶源自细菌布丘氏菌属物种。布丘氏菌属物种包括乡间布丘氏菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerae)、B.ferragutiase、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)和瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。布丘氏菌属物种菌株可从DSMZ，German National Resource Center for Biological Material(Inhoffenstrabe 7B，38124 Braunschweig，DE)获得。在登记号NCIMB 41248下保藏的布丘氏菌属物种菌株P1-29是可以从其中获得植酸酶的特别有用的菌株例子。植酸酶可以是BP-野生型、其变体(例如BP-11)(在WO 06/043178中描述)、或如在2007年3月6日提交的美国专利公开号US20080220498中描述的变体(参见例如，表1和SEQ ID NO：3)。
植酸酶也可以是具有下文显示的SEQ ID NO：17的氨基酸序列的布丘氏菌属植酸酶的BP-17变体，或与SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％序列同一性的植酸酶。
在温育和/或液化过程中使用的植酸酶量(剂量)可以在约0.001-50FTU/g ds范围中(例如，在约0.01-25FTU/g ds范围中、约0.01-15FTU/gds、约0.01-10FTU/g ds、约0.05-15FTU/g ds、和约0.05-5.0FTU/g。
可以与AmyE多肽组合使用的其他酶包括脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶/半纤维素酶、过氧化物酶、果胶酶、果胶裂解酶、漆酶或其组合。在某些情况下，可以使用WO 98/22613中公开的类型的碳水化合物结合结构域。
5.2.清洁和餐具洗涤组合物及方法
可以将AmyE多肽配制在洗涤剂组合物中用于清洁餐具或其它硬表面。这些组合物可以是凝胶、粉末或液体。组合物可以包括AmyE多肽作为组合物中唯一的淀粉分解酶。或者，组合物可以包含其他/另外的淀粉分解酶、其它清洁酶、以及其他组分，其中的许多是清洁组合物共同的。洗衣洗涤剂组合物可以另外包括一种或多种其他酶，例如脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、果胶酶、果胶裂解酶和/或漆酶、或其组合。
餐具洗涤洗涤剂组合物一般包括一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是阴离子型、非离子型、阳离子型、两性离子型或这些类型的混合。洗涤剂可以含有按重量计0％至约90％的非离子表面活性剂，例如低至无泡沫乙氧基化丙氧基化直链醇。
液体洗涤剂组合物可以包括丙二醇。可以例如通过在含有10％氯化钙的25％体积/体积丙二醇溶液中循环，使AmyE多肽溶解于丙二醇。
餐具洗涤洗涤剂组合物可含有无机和/或有机类型的洗涤剂助剂盐。洗涤剂助剂可细分为含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1％至约90％的洗涤剂助剂。含磷的无机碱性洗涤剂助剂的实例包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和聚磷酸盐。含磷的有机碱性洗涤剂助剂的实例包括水溶性膦酸盐。不含磷的无机助剂的实例包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及多种类型的水不溶性晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。
适宜的有机助剂的实例包括碱金属；铵和取代的铵；柠檬酸盐；琥珀酸盐；丙二酸盐；脂肪酸磺酸盐；羧基甲氧基琥珀酸盐；聚乙酸铵；羧酸盐；聚羧酸盐；氨基聚羧酸盐；聚乙酰基羧酸盐；和多羟基磺酸盐(polyhydroxsulphonates)。其它适宜的有机助剂包括已知具有助剂性能的较高分子量的聚合物和共聚物，例如适当的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，及它们的盐。
清洁组合物可含有漂白剂，例如氯/溴类型或氧类型的漂白剂。无机氯/溴类型漂白剂的实例是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴类型漂白剂的实例是杂环N-溴和N-氯酰亚胺类，如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸、和二氯异氰脲酸，及其与水增溶性阳离子(如钾和钠)的盐。乙内酰脲化合物也是适宜的。
清洁组合物可含有氧漂白剂，例如以无机过酸盐的形式，任选地与漂白前体一起，或以过氧酸化合物的形式。适宜的过氧漂白化合物的典型实例是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物)，碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和过磷酸盐。适宜的活性剂材料是四乙酰基乙二胺(TAED)和三乙酸甘油酯。酶促漂白活化体系也可以存在，例如过硼酸盐或过碳酸盐、三乙酸甘油酯和过水解酶(perhydrolase)，如WO 2005/056783中所公开的那样。
可使用常规用于酶的稳定剂来稳定清洁组合物，该稳定剂例如多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳族硼酸酯)。清洁组合物也可含有其它常规洗涤剂成分，例如反絮凝剂材料、填充剂材料、消泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、多价螯合剂、防污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。
最后，AmyE多肽可用于常规餐具洗涤洗涤剂中，例如用于任何如下专利公开中描述的任何洗涤剂中，可以理解该AmyE多肽可以替代如下专利和公布的专利申请中的α-淀粉酶或于这些α-淀粉酶之外额外地使用：CA2006687、GB 2200132、GB 2234980、GB 2228945、DE 3741617、DE3727911、DE 4212166、DE 4137470、DE 3833047、DE 4205071、WO93/25651、WO 93/18129、WO 93/04153、WO 92/06157、WO 92/08777、WO 93/21299、WO 93/17089、WO 93/03129、EP 481547、EP 530870、EP 533239、EP 554943、EP 429124、EP 346137、EP 561452、EP 318204、EP 318279、EP 271155、EP 271156、EP 346136、EP 518719、EP 518720、EP 518721、EP 516553、EP 561446、EP 516554、EP 516555、EP 530635、EP 414197、美国专利No.5,112,518、美国专利No.5,141,664和美国专利No.5,240,632。
含AmyE多肽的洗涤剂组合物可以配制用于餐具的人洗或机洗操作。
5.3.洗衣洗涤剂组合物及方法
AmyE多肽可为洗衣洗涤剂组合物的组分，例如以无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式。无粉尘颗粒可以例如，按美国专利No.4,106,991和4,661,452所公开的那样来生产，并且可任选地由本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12-20个碳原子，且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如英国专利No.1483591给出了适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。
可例如通过加入多元醇诸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，按照已建立的方法来稳定液态酶制品。其它酶稳定剂是本领域公知的。可按照例如US 5,879,920(Danisco A/S)或EP 238,216公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，和用于提高蛋白质的溶解性，参见例如，J.K.Kaushik等人，J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)以及其中引用的参考文献；和M.Conti等人J.Chromatography 757：237-245(1997)。
洗衣洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如凝胶、粉末、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂，其也可以是只含有约30％水的压缩凝胶(compact gel)类型的形式。
洗衣洗涤剂组合物典型地包括一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是阴离子型、非离子型(包括半极性的)、阳离子型或两性离子型、或其组合。表面活性剂典型地以0.1％至60％重量的水平存在。在一些情况下，洗涤剂将通常包含0％至约40％或至约50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。组合物也可包含0％至约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如在WO92/06154中所述)、或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
洗衣洗涤剂组合物可另外包括一种或多种其他酶，例如脂肪酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶、果胶酶、果胶裂解酶、漆酶和/或另外的淀粉分解酶(例如另外的α-淀粉酶)、或其组合。在某些情况下，2，6-β-D-果聚糖水解酶可以掺入洗衣洗涤剂组合物中，并且用于去除/清洁家居和/或工业纺织品/衣物上存在的生物膜。
洗衣洗涤剂可含有约1％到约65％的洗涤剂助剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是未加强的，即基本上不含洗涤剂助剂。可以在与酶的稳定性兼容的任何组合物中使用酶。可以用已知的包囊化形式(例如通过造粒或隔离在水凝胶中)来保护酶免于遭遇通常有害组分。酶且尤其是α-淀粉酶(具有或不具有淀粉结合结构域)不局限于洗衣和餐具洗涤应用，而是可以用于表面清洁剂以及用于由淀粉或生物质(biomass)生产乙醇。
洗衣洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗衣洗涤剂可含有漂白体系，其可以包括H2O2来源(例如过硼酸盐或过碳酸盐)，任选地与形成过酸的漂白活性剂，如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用。或者，漂白体系可包括过氧酸(例如酰胺、亚胺或砜类过氧酸)。漂白体系也可以是酶促漂白体系，其中过水解酶活化过氧化物，例如WO 2005/056783中所述的那些。
可使用常规稳定剂来稳定洗衣洗涤剂组合物中的酶，包括AmyE多肽，稳定剂例如多元醇如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳香酯；并且可按例如WO 92/19709和WO 92/19708所述配制组合物。
洗衣洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、荧光增白剂或香料。pH(在使用浓度下于水性溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0，但AmyE多肽也可以在低pH条件下工作，如在淀粉水解的情况下。
一种或多种AmyE多肽可以存在于衣物清洁组合物中，以常规用于此类组合物中的浓度存在，例如每升洗液0.00001-1.0mg(按纯酶蛋白质计算)AmyE多肽。示例性洗涤剂组合物包括：
1)配制为具有至少600g/L堆密度(bulk density)的颗粒剂的洗涤剂组合物，包括约7％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约2％至约6％的可溶性硅酸盐；约15％至约22％的沸石(例如NaAlSiO4)；0％至约6％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na3O7/C6H8O7)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(按纯酶计算)；和0-5％次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂)。
2)配制为具有至少600g/L堆密度的颗粒剂的洗涤剂组合物，包括约6％至约11％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐；约24％至约34％的沸石(例如NaAlSiO4)；约4％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如C6H5Na3O7/C6H8O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
3)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约9％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO)；约1％至约3％的皂如脂肪酸(例如C16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na2CO3)；约3％至约9％的可溶性硅酸盐；约23％至约33％的沸石(如NaAlSiO4)；0％至约4％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约8％TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
4)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na2CO3)；约1％至约5％的可溶性硅酸盐；约25％至约35％的沸石(例如NaAlSiO4)；0％至约10％的硫酸钠(例如Na2SO4)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
5)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
6)水性结构型液体洗涤剂组合物，包括约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；3-9％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaAlSiO4)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如PEG，PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(anchoring polymer)(例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。
7)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐；约20％至约40％的沸石(例如NaAlSiO4)；约2％至约8％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂，抑泡剂、香料)。
8)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约8％至约14％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐；约30％至约50％的沸石(例如NaAlSiO4)；约3％至约11％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如C6H5Na3O7)；约1％至约5％的聚合物(例如PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如抑泡剂、香料)。
9)颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约6％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约18％至约32％的沸石(例如，NaAlSiO4)；约5％至约20％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如C6H5Na3O7)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如NaBO3H2O)；约1％至约5％的漂白活性剂(例如NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯或PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、香料)。
10)水性液体洗涤剂组合物，包括约15％至约23％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如C12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的助水溶物(例如甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。
11)水性液体洗涤剂组合物，包括约20％至约32％的线性烷基苯磺酸盐(按酸计算)；6-12％的醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如B4O7)；0％至约3％的聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物例如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如助水溶物、分散剂、香料、荧光增白剂)。
12)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如Na2CO3)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐；0％至约5％的硫酸钠(例如Na2SO4)；约15％至约28％的沸石(NaAlSiO4)；0％至约20％的过硼酸钠(例如NaBO3·4H2O)；约0％至约5％的漂白活性剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-3％的次要成分(例如香料、荧光增白剂)。
13)如上面组合物1)-12)所述的洗涤剂组合物，其中所有或者部分的线性烷基苯磺酸盐被(C12-C18)烷基硫酸盐代替。
14)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约9％至约15％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如NaAlSiO4)；约10％至约20％的层状焦硅酸盐(例如来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如Na2CO3)；0％至约6％的可溶性硅酸盐；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如荧光增白剂、光漂白剂、香料、抑泡剂)。
15)具有堆密度为至少600g/L的颗粒剂形式的洗涤剂组合物，包括约4％至约8％的(C12-C18)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na2CO3)；0％至约4％的可溶性硅酸盐；约13％至约22％的过碳酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-3％的次要成分(例如荧光增白剂、膦酸盐、香料)。
16)上面1)-15)所述的洗涤剂制剂，其含有被稳定化的或包囊化的过酸作为额外组分或者作为已经述及的漂白体系的替代物。
17)上面1)、3)、7)、9)和12)所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。
18)上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的洗涤剂组合物，还含有锰催化剂。
19)配制成非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，包括液态非离子表面活性剂，例如，线性烷氧基化伯醇、助洗剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。该洗涤剂也可包括阴离子表面活性剂和/或漂白体系。
含AmyE多肽的洗衣洗涤剂组合物可以配制成手洗或机洗的洗衣洗涤剂组合物，包括适于预处理污染的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者可以配制成用于一般的家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物。
洗涤剂组合物可以包括2，6-β-D-果聚糖水解酶，一种或多种另外的α-淀粉酶，和一种或多种其它清洁酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且所述酶应以有效量存在。
洗涤添加剂，即分开的单个添加剂或组合的添加剂，可以配制为颗粒剂、液体、浆等。合适的颗粒洗涤添加剂制剂包括无粉尘颗粒剂。
考虑在洗涤剂组合物中，AmyE多肽可以以相应于约0.01-约100mg酶蛋白质/升洗液的量加入，特别是约0.05-约5.0mg酶蛋白质/升洗液，或甚至更特别地0.1-约1.0mg酶蛋白质/升洗液。
5.4.用于与AmyE多肽组合使用的酶
如上所述，含AmyE多肽的清洁组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶、2，6-β-D-果聚糖水解酶、另外的α-淀粉酶及其组合。通常，所选酶的特性应与选择的洗涤剂兼容(例如最适pH、与其他酶和非酶成分的兼容性等)，且所述酶应以有效量存在。示例性酶在下文描述。这些酶中的许多也可以与AmyE多肽组合在除清洁组合物外的组合物中使用。
蛋白酶：适宜的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。经化学修饰或蛋白质工程化的突变体也是适宜的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(参见例如美国专利号6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如源于猪或牛)和镰孢霉属蛋白酶(参见例如，WO 89/06270和WO 94/25583)。有用的蛋白酶的实例也包括但不限于WO 92/19729和WO 98/20115中所述的变体。适宜的市售可得的蛋白酶包括
Figure BDA0000046157560000951
PrimaseTM、DuralaseTM、和KannaseTM(Novo Nordisk A/S)；
Figure BDA0000046157560000953
、MaxacalTM、MaxapemTM、
Figure BDA0000046157560000954
、PurafectOxPTM、FN2TM和FN3TM(Danisco A/S)。
脂肪酶：适宜的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质改造的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质霉属(Humicola)(与嗜热丝孢菌属同义)的脂肪酶，例如来自疏毛腐质霉(H.lanuginose)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见例如，EP 258068和EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如，WO 96/13580)；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)；参见例如EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331 376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(参见例如，WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(参见例如WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌；参见例如Dartois等人，Biochemica et Biophysica Acta，1131：253-360(1993))，嗜热脂肪芽孢杆菌(参见例如JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如WO 91/16422)的脂肪酶。其它可以考虑在制剂中使用的脂肪酶变体包括例如在WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些。一些市售可得的脂肪酶包括
Figure BDA0000046157560000955
和
Figure BDA0000046157560000956
Ultra(Novo Nordisk A/S)。
聚酯酶：适宜的聚酯酶包括但不限于在WO 01/34899(Danisco A/S)和WO 01/14629(Danisco A/S)中描述的那些，并且可以与本文描述的其他酶以任意组合包括在组合物中。
淀粉酶：组合物可以与其它α-淀粉酶，例如非变体α-淀粉酶组合。这些可以包括市售可得的淀粉酶，例如但不限于
Figure BDA0000046157560000961
和BANTM(Novo Nordisk A/S)；
Figure BDA0000046157560000963
和
Figure BDA0000046157560000964
(Damsco A/S)。
纤维素酶：可以向组合物中加入纤维素酶。适宜的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。适宜的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如如美国专利No.4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757和WO 89/09259公开的自特异腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。可以考虑使用的示例性纤维素酶为对于纺织品具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的实例是例如EP 0495257；EP 531 372；WO 99/25846(Danisco A/S)、WO 96/34108(Danisco A/S)、WO 96/11262；WO 96/29397；和WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如WO94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK98/00299；EP 531315；美国专利No.5,457,046；5,686,593和5,763,254中描述的那些。市售可得的纤维素酶包括
Figure BDA0000046157560000965
和
Figure BDA0000046157560000966
(Novo Nordisk A/S)；ClazinaseTM和
Figure BDA0000046157560000967
HA(Danisco A/S)；以及KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。
过氧化物酶/氧化酶：考虑用于组合物中的适宜过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质改造的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶，及其变体如在WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所述的那些。市售可得的过氧化物酶包括例如GuardzymeTM(Novo Nordisk A/S)。
5.5.用于测量AmyE多肽清洁性能的测定法
用于测量AmyE多肽清洁性能的示例性测定法在下文和所附实施例中描述。可以用于测试包括AmyE多肽的清洁组合物的功效的一种标准测定法涉及样片试验。在各种材料类型上具有已知“强度”的污渍的样片是市售可得的(EMPA，St.Gallen，Switzerland；wfk-Testgewebe GmbH，Krefeld Germany；或Center for Test Materials，Vlaardingen，The Netherlands)和/或可以由从业者制得(Morris和Prato，Textile Research Journal 52(4)：280286(1982))。样片可以包括，例如，包含由血/乳/墨(BMI)、菠菜、草、或巧克力/乳/烟灰造成的污渍的含棉织物。可以用0.0003％至0.3％的过氧化氢将BMI污渍固着在棉上。其他组合包括用0.001％-1％戊二醛固着的草或菠菜、用0.001％-1％戊二醛固着的明胶和考马斯染料、或用0.001％-1％戊二醛固着的巧克力、乳和烟灰。
也可以在用AmyE多肽和/或洗涤剂制剂孵育期间搅拌样片。洗涤性能数据取决于孔中，尤其是在96孔板中的样片的取向(水平对垂直)。这表明在孵育期间混合是不充分的。尽管存在许多方式来保证孵育期间充分的搅拌，但可以构建将微滴定板夹在两个铝板之间的板夹。这可以简单地实现，例如在孔上方放置粘性板密封物，然后用任何类型的合适的、市售可得的夹子将两个铝板与96孔板夹紧。然后可以将它放到商品化的孵育摇床中。将摇床设定为约400rpm可以导致非常有效的混合，而板夹有效地阻止了泄漏或交叉污染。
可以使用三硝基苯磺酸(TNBS)来量化洗液中的氨基基团浓度。这可以用作从样片中去除的蛋白质量的量度(参见例如Cayot和Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200(1997))。然而，如果洗涤剂或酶样品导致异乎寻常小的肽片段的形成(例如，因样品中存在肽酶所致)，那么将获得较大的TNBS信号，即更多“噪音”。
另一用于测量对血/乳/墨的洗涤性能的手段是基于墨水的释放，这可以通过测量洗液的吸光度而量化。可以在350和800nm之间的任何波长，例如410nm或620nm，测量吸光度。也可以检查洗液以确定对于含有草、菠菜、明胶或考马斯染料的污渍的洗涤性能。对于这些污渍，适宜的波长包括对于菠菜或草的670nm和对于明胶或考马斯染料的620nm。例如，移出等份试样的洗液(例如，通常来自96孔微板的100-150μL)并放到小杯或多孔微板中。然后将它放到分光光度计中并在适当的波长读取吸光度。也可以使用该体系，例如通过使用在诸如布、塑料或陶瓷的适宜载污体上的血/乳/墨污渍，来测定适宜用于餐具洗涤的酶和/或洗涤剂组合物。
一个实例中，可以通过在25℃将0.3％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟或通过在60℃将0.03％过氧化氢施加到BMI/棉样片上30分钟，在棉上固着BMI污渍。从BMI/棉样片上切下约0.25″的小样片并放入96孔微滴定板的孔中。向各孔中放入已知的洗涤剂组合物和酶如变体蛋白质的混合物。向微滴定板顶部放置粘性板密封物后，将微滴定板与铝板夹在一起，并在定轨摇床上以约250rpm搅拌约10-60分钟。这个时间结束后，将上清液转移到新的微滴定板的孔中并测量620nm的墨水吸光度。这可以类似地用于检测通过在25℃向菠菜/棉样片或草/棉样片施加0.01％戊二醛30分钟而固着在棉上的菠菜污渍或草污渍。这也可以用于巧克力、乳和/或烟灰污渍。
5.6.纺织品退浆组合物和方法
还考虑使用一种或多种AmyE多肽处理织物(例如，使纺织品退浆)的组合物和方法。AmyE多肽可以用于本领域众所周知的任何织物处理方法(参见例如美国专利No.6,077,316)中。例如，可以通过涉及将织物与AmyE多肽溶液接触(任选地在压力下)的方法，改善该织物的触感和外观。
AmyE多肽可以在纺织品纺织期间或之后、或在退浆阶段或者一个或多个其他织物加工步骤的过程中施用。在纺织品纺织期间，纺线暴露于相当大的机械张力。在机械织机上纺织之前，径纱通常涂上淀粉或淀粉衍生物浆料，以增加其抗张强度并防止断裂。可以施加AmyE多肽以除去这些淀粉或淀粉衍生物浆料。在纺织品织成之后，织物可以进入退浆阶段。这之后可接着一个或多个其他织物加工步骤。退浆是从纺织品中除去浆料的行为。纺织后必须除去浆料涂层，之后再进一步加工织物，以确保均一和耐洗效果。AmyE多肽然后可以用于织物退浆方法中，包括通过AmyE多肽的作用来酶促水解上浆料。
AmyE多肽可以单独或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起用于使织物(包括含棉织物)退浆。AmyE多肽也可用于在靛蓝染色的粗斜棉布织物和衣服上产生石洗外观的组合物和方法中。为生产衣服，织物可以剪裁并缝纫成衣服或衣物，之后进行整理(finish)。特别是，为生产粗斜棉布牛仔服，已研发了不同的酶促整理方法。粗斜棉布衣服的整理通常始于酶促退浆步骤，在此期间淀粉分解酶作用于衣服，以使织物柔软，并使该棉布更易于接受随后的酶促整理步骤。AmyE多肽可用于整理粗斜棉布衣服(例如“生物打磨法”(bio-stoning))、酶促退浆及为织物提供柔软度的方法，和/或整理操作中。
5.7.用于烘焙和食品制备的组合物和方法
AmyE多肽可以在用于烘焙和食品制备的组合物和方法中使用。对于商业和家庭使用面粉用于烘焙和食品生产，重要的是维持面粉中α-淀粉酶活性的合适水平。太高的活性水平可能导致粘的和/或面团状的不能出售的产品。相反，具有不足α-淀粉酶活性的面粉可能不包含足够的糖用于合适的酵母作用，导致干的易碎面包。因此，单独或与另一种或多种α-淀粉酶组合的AmyE多肽可以加入面粉中，以增加面粉中内源α-淀粉酶活性的水平。如本文所述，AmyE多肽具有在30-90℃、50-80℃、55-75℃、或甚至60-70℃范围中的最适温度，这使得其非常适合于烘焙和食品制备应用。不同AmyE变体的最适温度可以例如在可溶性淀粉的1％溶液中在pH 5.5测量，或使用本文描述或本领域已知的其他方法测量。
除在烘焙中使用谷类和其他植物产物外，谷类例如大麦、燕麦和小麦，以及植物组分例如玉米、啤酒花和稻还用于商业和家庭酿造。在酿造中使用的组分可以未发芽的或可以是发芽的，即部分萌芽的，导致酶包括α-淀粉酶水平的增加。对于成功酿造，需要足够水平的α-淀粉酶酶活性，以确保合适水平的糖用于发酵。单独或与另一种或多种α-淀粉酶组合的AmyE多肽可以加入糖化醪(wort)或醪液中，以改善淀粉转化。如本文其他地方所述，AmyE多肽显示葡糖淀粉酶活性，从而允许不使用另外的葡糖淀粉酶或使用减少量的葡糖淀粉酶(与使用其他α-淀粉酶时所需要的量比较)而由含淀粉谷类产生葡萄糖。
还可以单独或与其他淀粉酶组合加入AmyE多肽，以阻止或延缓烘焙食品产品的陈化，即，面包瓤紧硬。用于抗陈化的AmyE多肽量一般在0.01-10mg酶蛋白质/kg面粉的范围中，例如1-10mg/kg。可以与AmyE多肽组合使用的另外抗陈化淀粉酶包括内切淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属的细菌内切淀粉酶。该另外的淀粉酶也可以是，例如来自芽孢杆菌属的，生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)。是来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的合适生麦芽糖α-淀粉酶，并且在Christophersen等人(1997)Starch，50：39-45中描述。抗陈化内切淀粉酶的其他例子包括源自芽孢杆菌属例如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶，和外切淀粉酶例如β-淀粉酶，例如来自植物来源例如大豆或来自微生物来源例如芽孢杆菌的。
包括AmyE多肽的烘焙组合物可以进一步包括磷脂酶。磷脂酶可以具有A1或A2活性，以自磷脂除去脂肪酸形成溶血磷脂。磷脂酶可以具有或不具有脂肪酶活性，即对甘油三酯的活性。它一般具有在30-90℃范围中的最适温度，例如30-70℃。加入的磷脂酶可以为动物来源的，例如来自胰腺例如牛或猪胰腺、蛇毒液或蜂毒液。可替代地，磷脂酶可以来自微生物源，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如如下属或物种：曲霉属，黑曲霉；网柄菌属(Dictyostelium)，盘基网柄菌(D.discoideum)；毛霉属(Mucor)，爪哇毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)、细孢毛霉(M.subtilissimus)；脉孢霉属(Neurospora)，粗糙脉孢霉(N.crassa)；根毛霉属，微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)，少根根霉(R.arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)、匍枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)，大豆核盘菌(S.libertiana)；发癣菌属(Trichophyton)，红色发癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，W.sclerotiorum；芽孢杆菌属，巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；柠檬酸杆菌属，弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)；肠杆菌属，产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)，迟缓爱德华氏菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Etwinia)，草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，大肠杆菌；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形杆菌属(Proteus)，普通变形杆菌)P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属(Salmonella)，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，福氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属，紫红链霉菌(S.violeceoruber)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)；镰孢霉属，尖孢镰孢，菌株DSM 2672)。
磷脂酶可以以改善面包柔软性的量在烘焙后的初始时期加入，特别是前24小时。磷脂酶的量一般将在0.01-10mg酶蛋白质/kg面粉的范围中，例如0.1-5mg/kg。磷脂酶活性一般将在20-1,000脂肪酶单位(LU)/kg面粉的范围中，其中脂肪酶单位定义为：用阿拉伯树胶作为乳化剂和三丁酸甘油酯作为底物，在30℃和pH 7.0，每分钟释放1μmol丁酸所需的酶量。
面团的组成一般包括小麦粉或小麦面粉和/或其他类型的粗粉、面粉或淀粉，例如玉米面粉、玉米淀粉、黑麦粗粉、黑麦面粉、燕麦面粉、燕麦粗粉、大豆面粉、高粱粗粉、高粱面粉、马铃薯粗粉、马铃薯面粉或马铃薯淀粉。面团可以是新鲜、冷冻或预烘焙(par-baked)的。面团可以是膨发后的面团或待实施膨发的面团。面团可以以各种方法进行膨发，例如通过加入化学膨松剂例如碳酸氢钠或通过加入膨发剂即发酵面团。面团还可以通过加入合适酵母培养物例如酿酒酵母(面包酵母)培养物，例如商购可得的酿酒酵母菌株，进行膨发。
面团可以进一步包括其他常规面团成分，例如蛋白质，例如奶粉、面筋和大豆；蛋(整蛋、蛋黄或蛋白)、氧化剂例如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸例如L-半胱氨酸；糖；或盐，例如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。面团可以进一步包括脂肪，例如甘油三酯，例如颗粒脂肪或起酥，和/或乳化剂例如甘油单酯或二酯、甘油单酯或二酯的双乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖脂、脂肪酸的聚甘油酯、甘油单酯的乳酸酯、甘油单酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或溶血卵磷脂。还可以制备不添加乳化剂的面团。
任选地，另外的酶可以与抗陈化淀粉酶和磷脂酶一起使用。该另外的酶可以是第二(即，额外的)淀粉酶，例如淀粉葡糖苷酶、β-淀粉酶、环糊精葡聚糖基转移酶；肽酶，特别是外肽酶；转谷氨酰胺酶；脂肪酶；纤维素酶；半纤维素酶，特别是戊聚糖酶例如木聚糖酶；蛋白酶；蛋白质二硫键异构酶，例如WO 95/00636中所述的蛋白质二硫键异构酶；葡聚糖转移酶；分支酶(1，4-α-葡聚糖分支酶)；4-α-葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)；或氧化还原酶例如过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶、L-氨基酸氧化酶或碳水化合物氧化酶。该另外的酶可以具有任何起源，包括哺乳动物和植物，且特别具有微生物(细菌、酵母或真菌)起源，并且可以通过本领域照常规使用的技术获得。
木聚糖酶一般源自微生物，例如细菌或真菌，例如来自曲霉属菌株，特别是棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉(例如，WO 91/19782)、盛泡曲霉(例如，WO 91/18977)或塔宾曲霉(例如，WO 92/01793)；来自木霉属菌株，例如里氏木霉，或来自腐质霉属菌株，例如特异腐质霉(例如，WO92/17573)。
Figure BDA0000046157560001021
和NOVOZYM
Figure BDA0000046157560001022
是商购可得的由里氏木霉产生的木聚糖酶制剂。淀粉葡糖苷酶可以是黑曲霉淀粉葡糖苷酶(例如
Figure BDA0000046157560001023
)。其他有用的淀粉酶产品包括A 1000或A 5000(可从Grindsted Products，Denmark获得)和
Figure BDA0000046157560001025
H或
Figure BDA0000046157560001026
P(可从Gist-Brocades，The Netherlands获得)。葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，特别是黑曲霉葡萄糖氧化酶(例如)。示例性蛋白酶是
Figure BDA0000046157560001028
。示例性脂肪酶可以源自嗜热丝孢菌属(腐质霉属)、根毛霉属、假丝酵母属(Candida)、曲霉属、根霉属或假单胞菌属菌株，特别来自疏棉状嗜热丝孢菌(疏棉状腐质霉)、米黑根毛霉、南极假丝酵母(Candida antarctica)、黑曲霉、Rhizopus delemar或少根根霉或洋葱假单胞菌。脂肪酶可以是例如WO 88/02775中所述源自南极假丝酵母的脂肪酶A或脂肪酶B，或脂肪酶可以例如，如EP 238,023中所述源自米黑根毛霉，或如EP 305,216中所述源自疏棉状腐质霉，或例如如EP 214,761和WO89/01032中所述源自洋葱假单胞菌。
含AmyE多肽的酶制剂可以任选为颗粒或团聚粉(agglomeratedpowder)的形式。制剂可以具有窄的粒径分布，大于95％(重量)颗粒在25-500μm范围中。颗粒和团聚粉可以通过常规方法进行制备，例如通过在流化床制粒机中将AmyE多肽喷到载体上。载体可以由具有合适颗粒大小的微粒核芯组成。载体可以是可溶或不可溶的，例如盐(例如NaCl或硫酸钠)、糖(例如蔗糖或乳糖)、糖醇(例如山梨糖醇)、淀粉、稻、玉米渣或大豆。
包括AmyE多肽的颗粒也可以使用食品级脂质包封，所述脂质可以是在水中不溶但在非极性有机溶剂例如烃或乙醚中可溶的任何天然有机化合物。合适的食品级脂质包括但不限于，脂肪或油形式的甘油三酯，其可以是饱和或不饱和的。构成饱和甘油三酯的脂肪酸及其组合的例子包括但不限于，丁酸(源自乳脂)、棕榈酸(源自动物和植物脂肪)和/或硬脂酸(源自动物和植物脂肪)。构成不饱和甘油三酯的脂肪酸及其组合的例子包括但不限于，棕榈油酸(源自动物和植物脂肪)、油酸(源自动物和植物脂肪)、亚油酸(源自植物脂肪)和/或亚麻酸(源自亚麻子油)。其他合适的食品级脂肪包括但不限于，源自上文讨论的甘油三酯的甘油单酯和甘油二酯、磷脂和糖脂。
食品级脂质(特别是液体形式)与粉末形式的AmyE多肽以这样的方式接触，该方式使得脂质材料覆盖(包封)至少大多数例如100％的AmyE多肽颗粒的至少部分表面。包封AmyE多肽颗粒的优点是双重的。首先，对于热不稳定的那些酶，食品级脂质可以保护酶不受烘焙过程期间的热变性作用。因此，虽然AmyE多肽在面团发酵和烘焙阶段过程中是稳定且受保护的，但在最终的烘焙食物产品中它们从保护性包衣中释放，在所述烘焙食品中它们水解多葡聚糖(polyglucans)中的糖苷键。装载了酶的递送媒介物也提供活性酶持续释放到烘焙食品内。即，在烘焙过程后，活性AmyE多肽从保护性包衣中连续释放，释放速率可以抵消且因此减少陈化速率。
一般而言，施加于AmyE多肽颗粒的脂质量可以从α-淀粉酶总重量的数个百分比到数倍于该重量，这取决于脂质性质、脂质应用于颗粒的方式、待处理的面团混合物的组成、和所涉及的面团混合操作的严苛性。
以有效延长烘焙食品保存期的量，将脂质包封的酶加入用于制备烘焙食品的成分中。面包师可以计算为达到所需抗陈化效果而需要的包封的α-淀粉酶(如上所述制备)的量。所需的包封α-淀粉酶量基于包封酶的浓度和具体的α-淀粉酶与面粉的比例。已发现宽范围的浓度是有效的，但如已讨论的，可以观察到的抗陈化作用改善与α-淀粉酶浓度并非线性对应，而是在某些最低水平之上，α-淀粉酶浓度的大增加导致很少的额外改善。在具体的烘焙生产中实际使用的α-淀粉酶浓度可能比该最低水平高得多，以便提供面包师一些保险以抵抗面包师的无意低估错误。酶浓度的下限可以由面包师希望达到的最低限度抗陈化效果决定。
制备烘焙食品的方法可以包括：(a)制备脂质包被的AmyE多肽颗粒，其中基本上100％的颗粒被包被；(b)混合含面粉的面团；(c)在混合完全前将脂质包被的α-淀粉酶加入面团中，并且在脂质包衣从α-淀粉酶中去除前终止混合；(d)醒发面团；和(e)烘焙面团以提供烘焙食品，其中α-淀粉酶在混合、醒发和烘焙阶段过程中是无活性的，而在烘焙食品中是活性的。包封的AmyE多肽可以在混合周期中加入面团中，例如接近混合周期末，以允许遍及面团的充分分布；然而，混合阶段在保护性包衣从颗粒上剥离之间终止。
在某些情况下，细菌α-淀粉酶(BAA)可以加入该脂质包被的含AmyE多肽颗粒中。BAA由于其过量的热稳定性以及在完全烘焙的面包块中保留的活性，会将面包还原成粘性团块；然而，当BAA掺入脂质包被的颗粒内时，将导致实质性的额外抗陈化保护作用，即使在极低BAA用量水平下。
可以对本发明组合物和方法进行各种修饰和变动。本文引用的所有参考文献为了所有目的整体引入作为参考。
实施例
在前述说明书和下述实施例中，应用下述缩写：wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μL和μl(微升)；mL和ml(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；DO(溶解氧)；W/V(重量比体积)；W/W(重量比重量)；V/V(体积比体积)；IKA(IKAWorks Inc.2635North Chase Parkway SE，Wilmington，NC)；Genencor(Danisco US Inc，Genencor Division，Palo Alto，CA)；Ncm(牛顿厘米)和ETOH(乙醇)，eq(当量)；N(标准)；ds或DS(干固形物含量)，SAPU(分光光度计量的酸性蛋白酶单位，其中1SAPU是在测定条件下每分钟从酪蛋白底物释放1微摩尔酪氨酸的蛋白酶酶活性量)和GAU(葡糖淀粉酶单位，定义为在pH 4.2和60℃每小时从可溶性淀粉底物产生1g还原糖(作为葡萄糖计算)的酶量)。
实施例1
质粒构建和蛋白质表达
下述一般方法被用于质粒构建和蛋白质表达。
1.1.质粒构建
将编码SEQ ID NO：1的AmyE或C末端截短的AmyE变体AmyE-tr(SEQ ID NO：2)的核酸克隆到美国专利号5,024,943中描述的枯草芽孢杆菌pHPLT表达载体内。图2描述了包括编码AmyE-tr的核酸的载体。
pHPLT载体包含地衣芽孢杆菌LAT启动子(“Plat”)、编码LAT信号肽的序列(“preLAT”)、随后为用于克隆的PstI和HpaI限制位点。“ori-pUB”是来自pUB110的复制起点；“reppUB”是来自pUB110的复制酶基因，“neo”是来自pUB110的新霉素/卡那霉素抗性基因；“bleo”是博来霉素抗性标记，“Tlat”是来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的转录终止子。质粒pUB110的这些和其他特征在McKenzie等人，Plasmid 15(2)：93-103(1986)中描述。
使用由Yang等人，“Nucleotide sequence of the amylase gene from Bacillus subtilis，”Nucl.Acids Res.11(2)：237-49(1983)描述的AmyE编码序列，装配用于表达AmyE和AmyE-tr的质粒构建体。质粒pME629.5包含编码SEQ ID NO：1的全长AmyE的核酸。与由Yang等人描述的序列比较，该基因具有在编码淀粉结合结构域的序列中的3碱基缺失。
图2中显示的质粒pME630.7包含截短的AmyE序列(即AmyE-tr)。AmyE-tr在SEQ ID NO：1的位置D425截短。AmyE-tr基于缺乏淀粉结合结构域的AmyE变体的晶体结构设计，如Fujimoto等人，“Crystal structure of a catalytic-site mutant alpha-amylase from Bacillus subtilis complexed with maltopentaose，”J.Mol.Biol.277：393-407(1998)中所述。还参见，RCSB Protein Data
Figure BDA0000046157560001051
登记号1BAG，“Alpha-AmylaseFrom Bacillus Subtilis Complexed With Maltopentaose”。
对于表达质粒构建体，使用
Figure BDA0000046157560001052
(Stratagene，La Jolla，CA，USA)PCR扩增编码AmyE多肽的核酸，并且使用QiagenQIAQUIKTM PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)中提供的柱纯化，并且重悬浮于50μL MILLI-QTM纯化水中。用HpaI(Roche)和PstI(Roche)顺次消化50μL纯化DNA，并且使所得到的DNA片段重悬浮于30μL MILLI-QTM纯化水中。使用PstI和HpaI克隆位点，将10-20ng/μL DNA克隆到质粒pHPLT内。将连接混合物直接转化到感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型：ΔaprE，ΔnprE，degUHy32oppA，ΔspoIIE3501，amyE::xylRPxylAcomK-phleo)内。这些枯草芽孢杆菌细胞具有置于木糖诱导型启动子控制下的感受态基因(comK)。通过添加木糖诱导关于DNA结合和摄取的感受态。因为亲本质粒中的amyE基因具有2个PstI位点，执行PCR融合反应以在克隆前去除这些位点。在2个分开PCR反应后执行PCR融合。使用HpaI和PstI位点，下述引物用于制备pHPLT构建体：
SEQ IN NO：10：引物PSTAMYE-F
5′-CTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCACTT-
ACAGCACCGTCGATCAAAAGCGGAAC-3
SEQ ID NO：11：引物AMYENOPST-R′
5′-CTGGAGGCACTATCCTGAAGGATTTCTCCGTATTG-
GAACTCTGCTGATGTATTTGTG3′
SEQ ID NO：12：引物AMYENOPST-F
5′-CACAAATACATCAGCAGAGTTCCAATACGGAGAAA-
TCCTTCAGGATAGTGCCTCCAG-3′
SEQ ID NO：13：引物HPAIAMYE-R
5′-CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATGGGGAAGA-
GAACCGCTTAAGCCCGAGTC-3′
SEQ ID NO：14：引物HPAIAMYE-R
5′-CAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTCAATCAGGATAA-
AGCACAGCTACAGACCTGG-3′
SEQ ID NO：15：引物AMYE SEQ-F
5′-TACACAAGTACAGTCCTATCTG-3
SEQ ID NO：16：引物AMYESEQ-F
5′-CATCCTCTGTCTCTATCAATAC-3
质粒pME629.5和pME630.7表达具有翻译后切割的31残基信号序列的AmyE。如由Yang等人(1983)提议的，分开加工后续10个N末端氨基酸。pME629.5编码“全长”AmyE，并且pME630.7编码“截短”AmyE。
1.2.蛋白质表达
在具有10μg/mL新霉素、1％不溶性淀粉的Luria琼脂(LA)上选择具有编码AmyE全长和截短多肽的构建体的细菌转化体，并且在37℃下温育过夜。选择在菌落周围显示透明(或晕圈)的转化体用于进一步研究。每种转化体的预培养在具有10μg/mL新霉素的LB中生长8小时。30μL每种预培养物加入装有30mL培养基(下文描述)的250mL烧瓶内，所述培养基补充有10μg/mL新霉素和5mM CaCl2。培养基是基于MOPs缓冲液的富集半成分确定培养基，具有尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆胨用于强壮细胞生长。摇瓶在37℃和250rpm混合下温育60-65小时。通过在5,000rpm离心20分钟，在锥形管中收获培养物。因为AmyE全长和AmyE截短蛋白质两者都以高水平表达，所以培养上清液用于后续测定而无进一步纯化。
实施例2
常见测定法
下述测定法用于下文描述的实施例中。与下文提供的方案的偏差在单独的实施例中指出。在这些实验中，分光光度计用于测量在反应完成后形成的产物的吸光度。
2.1.淀粉酶活性测定
分光光度计测量淀粉酶活性。与标记Remazol Brilliant Blue R共价连接的不溶性玉米淀粉(“RBB-玉米淀粉，”Sigma S7776)用作底物。将在50mM乙酸钠，pH 4.5、5.0或5.6中的75μL 2％(wt ds)RBB-玉米淀粉浆加入10μL 100μg/mL酶中，并且充分混合。随后使混合物在50℃下温育30分钟。随后将样品置于冰上，并且使用台式离心机通过在4,100rpm下离心20分钟去除底物。通过测量从淀粉中释放的蓝色染料量测定产物量。在595nm下一式三份地测量染料的光密度(OD)。
2.2.粘度测量测定
粘度计用于测量在淀粉酶的存在下在pH 4.5和5.8下玉米淀粉底物的粘度。新鲜制备一批30％ds玉米淀粉底物浆，使用硫酸以使pH降低至4.5或5.8。对于每次反应，称出50g浆(15g ds)，并且加温至70℃10分钟。在加入α-淀粉酶后，温度从70℃立即增加到85℃，并且使反应在75rpm下搅动。浆和酶混合物的温度达到85℃后，监控粘度另外30分钟。
2.3.测量热稳定性的差示扫描量热法(DSC)
使用超灵敏扫描高流通量微量热计(VP-Capillary DSC；MicroCal，Inc.，Northampton，MA，USA)，在2mM氯化钙的存在或不存在下测量AmyE或其变体的过剩热容量函数。在30-120℃温度范围上扫描约500μL 0.5mg/mL AmyE或其变体。截短的嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)用作对照。AmyS的氨基酸序列(包括34氨基酸信号序列)在SEQID NO：4中显示。随后再次扫描相同样品，以检查过程的可逆性。使用的缓冲液是10mM乙酸钠，pH 5.5。200℃/小时扫描速率用于使起因于聚集的任何假象降到最低。DSC曲线的热中点(Tm)用作热稳定性的指示。所有Tm测量中的标准误小于1％。
2.4.96孔微量滴定板中的Bradford测定
使用Bradford QUICKSTARTTM Dye Reagent(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测定样品上清液中的蛋白质浓度。通过过滤来自培养物的肉汤获得样品，所述培养物在280rpm振荡和增湿通气下在37℃在微量滴定板(MTPs)中生长3天。使10μL培养物滤液与200μL Bradford QUICKSTARTTM Dye Reagent在第二块MTP的孔中组合。在充分混合后，MTP在室温下温育至少10分钟。去除气泡并且在595nm下测量OD(光密度)。为了测定蛋白质浓度，从样品读数中扣除本底读数(来自未接种的孔)。
2.5.通过HPLC测量葡萄糖的形成
麦芽糖和麦芽七糖的水解
如对于每个实验指定的，在50mM乙酸钠pH 4.5或5.6，或在50mM苹果酸pH 5.6中，制备0.5％麦芽糖或麦芽七糖溶液。所有酶样品最初稀释至1mg/mL。通过使用合适底物溶液稀释酶制备反应混合物，以获得1ppm的最终酶浓度，并且随后将200μL等分试样转移至无菌螺旋盖管，并且置于37℃温箱中。通过在10mM氢氧化钠内稀释10倍在所述的时间终止反应。
不溶性淀粉的水解
为了测量不溶性颗粒淀粉的水解，在苹果酸缓冲液，pH 5.6中使纯化AmyE或其变体(24.5g/L)稀释至20.4ppm的终浓度。随后将蛋白质加入在苹果酸缓冲液，pH 5.6中制备的5％玉米面粉溶液中，至1ppm的终浓度，并且使混合物在振荡器中在32℃下温育。定期取出样品，并且在50mM NaOH内稀释10倍，以猝灭反应。
HPLC检测法
使用配备Dionex PA-1柱和电化学检测器的Agilent 1100LC系统，通过HPLC分析葡萄糖和底物的其他分解产物的形成。注射10μL样品，并且在25℃以1.0mL/分钟施加NaOH和乙酸钠的梯度。由先运行的标准确定糖的分布。经过45分钟获得洗脱曲线。使用经鉴定的葡萄糖参考标准(Sigma，MO，USA)获得所产生的葡萄糖的定量(报告为g/L)，以将关于糖的峰面积转换为实际糖浓度。
2.6.使用麦芽糖和麦芽七糖底物的葡萄糖形成
通过HPLC测定麦芽糖或麦芽七糖至葡萄糖的分解。在pH 4.5和pH5.6的50mM乙酸钠缓冲液中制备0.5％麦芽糖和麦芽七糖溶液。所有酶样品由纯化的原液稀释至1mg/mL。1mg/mL酶样品进一步稀释到麦芽糖溶液内，以获得1μg/mL酶的终浓度。随后将200μL等分试样加入无菌螺旋盖管，并且置于37℃温箱中。在2、5和8天后通过加入氢氧化钠终止反应。通过HPLC，使用实施例2.5中描述的方法，相对于真实标准品，分析葡萄糖的形成和麦芽糖的分解。
2.7三重测定
分开执行标准总还原糖、葡萄糖和碘测定，以表征支链淀粉消化的产物。通过如下方式，制备在55mM乙酸钠缓冲液pH 5.8中的2.2％(w/w)玉米支链淀粉底物：伴随搅动，煮沸该混合物30分钟，且随后冷却至室温。将100μl底物置于96孔中度结合聚苯乙烯微量滴定板的孔中，并且将10μl稀释的AmyE变体培养物上清液加入其中。将板密封(Nunc，目录#236366)并且立即置于iEMS振荡温箱中，并且在50℃、1150rpm温育10分钟。经由加入20μl 0.5N NaOH伴随混合而终止淀粉酶反应。
通过使20μl 5％w/v 4-羟基苯酰肼(Sigma H9882，在0.5N HCl中制备)与80μl 0.5N NaOH以及随后与20μl淀粉酶反应物混合，在全裙边PCR板(Axygen PCR-96-FS-C)中，测定总还原糖。使板密封(MicrosealB粘性密封器，BioRad MSB-1001)并且在95℃温育2分钟，随后立即在PCR式热循环加热装置上冷却至25℃。将80μl反应样品转移至聚苯乙烯96孔微量滴定板，并且使用Spectramax板阅读器在440nm测量光密度。
通过如下方式在微量滴定板中测定淀粉酶反应中存在的总葡萄糖：使20μl反应样品与50μl 5.8mg/ml 2，2′-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(Sigma，A1888)在包含0.005％v/v Tween 80的50mM磷酸钾缓冲液pH 6.8中混合，随后加入在相同缓冲液中制备的包含0.33U/ml辣根过氧化物酶vI型(Sigma，P8375)、3.33U/ml OxyGo(葡萄糖氧化酶，Genencor)的30μl溶液。立即将微量滴定板置于Spectramax板阅读器中，振荡5秒，并且以9秒间隔在405nm监控光密度60-180秒的时间。
对淀粉酶反应的碘分析如下进行：使淀粉酶反应样品的1：4稀释物(在水中)与在水中1：20稀释的80μl Lugols试剂(5g碘，在100ml水中溶解的10g碘化钾)在聚苯乙烯微量滴定板中混合。使用Spectramax板阅读器测定在580nm的光密度。Microsoft Excel用于汇集从Softmax Pro软件(板阅读器)获得的数据。
碘结果报告为总OD580；链长/残留直链淀粉是总OD的函数，因此淀粉酶活性与总OD成反比。总还原糖报告为总OD440并且与OD成比例，因此淀粉酶活性与OD成正比。总葡萄糖报告为葡萄糖测定中的动态速率，并且成正比。报告OD和速率，代替使用由葡萄糖构建的标准曲线转换为已知量。使用原始数据报告比率，并且因此是无单位的。将3类数据组合在图形上，作为碘除以总还原糖与葡萄糖的比的比率。
2.8用于粘度降低速率测定的高流通量粘度测定试验
使用商购可得的分子转子(molecular rotor)CCVJ(9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)久洛尼定(julolidine))开发了高流通量粘度测定试验。分子转子是其量子产率(发射的光子数目除以吸收的光子数目)取决于微环境的自由体积(而这又与粘度相关)的荧光物类。对于此种分子，分子内的旋转是自激发态的优选驰豫方式。分子内旋转以与微环境粘度成比例的方式被抑制，能量的平衡通过辐射驰豫耗散掉(荧光发射)。
为了测量由于酶促活性的粘度降低速率，如下，将分子转子CCVJ掺入玉米支链淀粉的缓冲悬浮液内。通过将186μl二甲基亚砜加入包含5mg冻干CCVJ(Sigma Aldrich Corporation，St.Louis，MO)的小瓶中，制备CCVJ的100mM贮存液。将CCVJ贮存液室温贮存于黑暗中，并且在使用前检查沉淀。90g来自玉米的支链淀粉(MP Biomedicals LLC，Solon，OH)加入2,850mL蒸馏水中。持续搅动下将其加热至煮沸，在所述条件下支链淀粉逐步糊化且溶解。从该热源取出所得到的凝胶样支链淀粉的均一粘稠悬浮液，并且连续搅动同时使其回到室温，在该点加入150mL 1M乙酸钠缓冲液pH 5.8(通过用1M乙酸滴定1摩尔乙酸钠预先制备)，随后加入150μl Tween-80(Sigma Aldrich Corporation，St.Louis，MO)。当Tween-80完全溶解时，加入150μl 100mM CCVJ贮存液并使之溶解，在此点，支链淀粉/CCVJ试剂完成且立即可用。在完成粘度测定检查所需的三天时间，该试剂室温贮存于透明玻璃中并持续搅拌。
对于所述测定试验，通过配备多路吸头的Biomek FXP机器人执行所有的液体处理任务，所述多路吸头使得能够同时吸取96孔微量滴定板的所有96个孔。将60μl支链淀粉/CCVJ试剂加入黑色未处理聚苯乙烯96孔微量滴定板(Corning Incorporated，Corning，NY)的每个孔中。吸取30μl酶样品于其上，立即在如下设置的Spectramax M2e荧光计(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)上读数微量滴定板：顶部读数荧光模式；激发波长435纳米(nm)；发射波长495nm；截止波长455nm；具有24秒读数间隔的动态读数模式；在开始读数前15秒振荡，两读数之间3秒振荡；具有20秒迟滞期的192秒总读数时间(从每个动态速率计算中清除收集的9个数据点的第一个)。
在该测定试验中，就荧光信号的下降速率，测量粘度降低速率。通过Softmax Pro(与Spectramax仪器包装在一起的软件)，将荧光信号降低的动态速率自动计算为“Vmax(毫单位/分钟)”。
2.9用于液化后粘度测定的高流通量粘度测定试验
为了测量由于酶促活性导致的液化后粘度下降，如下所述，将分子转子CCVJ掺入缓冲的玉米面粉浆内。通过将186μl二甲基亚砜加入包含5mg冻干CCVJ(Sigma Aldrich Corporation，St.Louis，MO)的小瓶中，制备CCVJ的100mM贮存液。将CCVJ贮存液贮存于室温黑暗中，并且在使用前检查沉淀。使有机玉米面粉(Azure Farm，Dufur，OR)通过600微米筛，随后在95℃烘烤16小时，然后回到室温。将1520g蒸馏水、80mL 1M乙酸钠缓冲液pH 5.6(通过用1摩尔乙酸滴定1摩尔乙酸钠预先制备)、80μl Tween-80(Sigma Aldrich Corporation，St.Louis，MO)、80μl 100mM CCVJ贮存液和400g筛过的有机玉米面粉混合，以2-kg的批量，制备20％(重量/重量)pH 5.8玉米面粉浆。使用磁力搅动棒，剧烈且连续搅动浆半小时，在这个点检查pH并且证实为5.8。剧烈且连续搅动浆以保持玉米面粉均匀分散，同时使用具有修剪至约2.3毫米内直径(通过游标卡尺(Mitutoyo Corporation，Kure，Hiroshima，Japan)测定)的200-μl吸头的多通道吸管，将90μl浆加入黑色未处理聚苯乙烯96孔微量滴定板(Corning Incorporated，Corning，NY)的每个孔中。对于每个微量滴定板孔，吸取10μl酶样品于玉米面粉浆之上，这之后用粘性密封器(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)将板密封，并且紧紧夹在预平衡的金属板之间放在设为80℃的高温烘箱中。板温育1小时，这之后取出板至室温，并且在室温留置过夜。第二天，去除板密封器，并且在如下设置的Spectramax M2e荧光计(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)上进行板读数：顶部读数荧光模式；激发波长435纳米(nm)；发射波长495nm；截止波长455nm。在这个测定中，荧光信号的下降与糊化的玉米面粉的密度下降对应，这又与由于酶促活性导致的液化作用增加相对应。
实施例3
比活性和最适pH
使用实施例2.1中描述的测定试验，测量了全长AmyE(SEQ ID NO：1)、AmyE-tr(SEQ ID NO：2)及其变体的比活性和最适pH。通过分光光度计测量法测定在50℃和pH 4.5、5.0和5.6经过30分钟从RBB-玉米淀粉底物中释放的染料量，测定了比活性。图3显示与pH 5或5.6比较，AmyE-tr和Amy31A在pH 4.5具有最高比活性。AmyE显示在pH 5比在pH 5.6具有更高的比活性。
实施例4
玉米淀粉底物的粘度降低
使用实施例2.2中描述的测定法，测定了AmyE、AmyE-tr及其变体减少玉米淀粉底物粘度的能力。对于每种酶，在pH 4.5和5.8测定了粘度(作为时间的函数)。图4A和4B分别显示AmyE-tr和AmyE在pH 4.5和5.8均减少底物粘度。峰粘度是相同的，但在pH 5.8观察到更低的最终粘度。图4C和4D分别显示Amy31A在pH 4.5具有比pH 5.8更佳的性能。
实施例5
热稳定性
在Ca2+的存在和不存在下测量了AmyE、AmyE-tr及其变体的热稳定性，以确定Ca2+是否促成酶的稳定性，其中使用如实施例2.3中所述的差示扫描量热法(DSC)。DSC揭示热解折叠过程是不可逆的。图5A显示加和不加2mM Ca2+时的AmyE和AmyE-tr的DSC解折叠图。图5B显示全长Amy31A变体的DSC解折叠图。钙对热熔点无任何影响，提示AmyE、AmyE-tr和Amy31A都不结合Ca2+，或mM浓度范围的Ca2+对它们均不具有稳定作用。如图5C中所示，对于嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)获得了迥异的结果。表1概括了所测试的酶的熔解温度。Ca2+的添加不显著改变AmyE、AmyE-tr和Amy31A的热稳定性，而Ca2+显著增加了AmyS的稳定性。
表1.DSC Tm测量结果的总结
实施例6
麦芽糖和麦芽七糖转化为葡萄糖
使用实施例2.3中所述的葡萄糖形成测定试验，测试了在pH 5.6AmyE-tr(SEQ ID NO：2)和AmyE-tr位置Q153的6种AmyE变体(C、F、I、K、N和V)将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力。在1、2和3天后测量产生的葡萄糖。AmyE-tr和AmyE变体以1ppm使用。截短的AmyS(SEQ ID NO：4)以相似剂量用于比较。
图6描述了来自麦芽糖底物的葡萄糖生产结果。通过AmyS的葡萄糖生产是最低的，而AmyE-tr和Q153位置变体产生了显著量的葡萄糖。变体Q153N是在这些条件下最佳的葡萄糖生产者。这些结果证实AmyE和AmyE的变体可以由麦芽糖有效产生葡萄糖。
图7描述了来自麦芽七糖底物的葡萄糖生产结果。与用麦芽糖作为底物的情况一样，AmyS低效地将麦芽七糖转化为葡萄糖。相比之下，AmyE-tr和Q153位置变体非常有效地将麦芽七糖转化为葡萄糖，其中第3天时Q153K和F变体显示了最大的转化。这个实施例证实AmyE和AmyE的变体可以由复杂寡糖有效产生葡萄糖。
实施例7
麦芽七糖转化为葡萄糖
测试了AmyE-tr(SEQ ID NO：2)、AmyS和AmyE变体Q153K将麦芽七糖(DP7)转化为葡萄糖(DP1)的能力。使用实施例2.2中所述的HPLC法分析反应产物。代表性洗脱曲线显示于图8-10中。
图8显示在72小时温育后，AmyE-tr将DP7大部分地转化为DP1和残留量的麦芽糖(DP2)。相比之下，图9显示AmyS随着时间过去将DP7转化为较小的寡糖，产生DP5、DP4、DP3、DP2和DP1寡糖的混合物。图10描述了在AmyE变体Q153K的存在下DP7转化至较小寡糖的时间过程。在少至1小时内检测出显著水平的DP1、DP2和DP3。到3小时时，Q153K变体将DP7占优势地转化为DP1。这些结果显示AmyE及其变体可以由DP7底物有效产生葡萄糖(DP1)。
实施例8
位置变体的产生和表达
这个实施例涉及位置变体文库的产生和表达。
8.1.位置文库的产生
质粒pME630.7(图2，实施例1)用于在AmyE-tr的150个不同氨基酸残基上产生位置文库。表1列出了针对其制备了位置文库的每个残基。残基基于其在SEQ ID NO：2中的位置编号。在每个位置上列出的氨基酸是在SEQ ID NO：2的AmyE中出现的残基(即，野生型残基)。
表1
Figure BDA0000046157560001151
Figure BDA0000046157560001161
针对表1所列150个残基之每个的位置文库包含了约16种氨基酸置换变体。文库由包含表达质粒的转化枯草芽孢杆菌细胞组成，所述表达质粒编码在所述150个位置上的AmyE变体序列。每个变体在蛋白质活性评估前通过DNA测序分析验证。各单个克隆如下所述培养，以获得不同AmyE变体用于功能表征。
8.2.蛋白质表达
包含AmyE置换变体的枯草芽孢杆菌转化体在96孔板中在具有10μg/ml新霉素的LB(Luria肉汤)中培养8小时，并且将30μl这种预培养物加入装有30mL培养基(下文描述)的250mL烧瓶内，所述培养基补充有25ppm氯霉素和5mM CaCl2。烧瓶在37℃温育60-65小时，期间250rpm持续旋转混合。通过在5,000rpm离心20分钟在锥形管中收获培养物。培养上清液用于测定。所述培养基是基于MOPs缓冲液的富集半成分确定培养基，具有尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆胨用于强壮细胞生长。
实施例9
测量比活性和热稳定性的淀粉水解测定试验
使用淀粉水解测定试验评估了AmyE位置变体，以测量比活性和热稳定性。AmyE变体还使用清洁样片测定试验进行了测定，以测量污渍去除性能。通过测量对于麦芽七糖底物的淀粉酶活性，评估了AmyE变体的pH稳定性。通过在热应激前和后测量对麦芽三糖底物的淀粉酶活性，测定了AmyE变体各自的热稳定性。
9.1.比活性和热稳定性的测定
淀粉水解测定试验用于测量AmyE和AmyE变体的比活性和稳定性。使用的条件紧密模拟在清洁和谷类加工中的真实世界应用。活性定义为玉米面粉通过酶促分解产生的还原末端。使用下文描述的PAHBAH(对羟基苯甲酸酰肼)测定试验，测定还原末端。稳定性定义为在80℃维持的活性。
硬件：具有PCR板适配器的Inheco Variomag Teleshake 95加热振荡器(Hamilton Company，Reno NV)；Thermo Electron Multidrop自动分配器(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)；iEMS温箱(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)；V&P Scientific搅动盘分配器(型号VP722B)；Axygen PCR-96-FS-C全裙边PCR板(Axygen Scientific，Inc.，Union City，CA)；Tetrad热循环仪(MJ Research，Waltham，MA)，
Figure BDA0000046157560001171
FX液体处理器(Beckman Coulter，Fullerton，CA)。
淀粉水解：使Azure Farms有机玉米面粉(Norco，CA，USA)过筛，以获得＜600微米级分，在80℃烘烤4小时，随后允许在室温平衡过夜。使用VP722B部件作为粉末Flip Dispenser，将制备的干玉米面粉递送到Axygen PCR板内。递送至每个孔的面粉量被确定为约5mg。将100μL 50mM乙酸钠pH 5.6(对于最终悬浮液，pH～5.8)加入每个孔中且混合。AmyE和AmyE变体的培养上清液在稀释缓冲液(水+0.005％Tween-80)中稀释至约20μg/mL。将10μL稀释的上清液转移至8分钟和30分钟反应板，并且通过上下吸取样品，混合1次。将50μL轻质矿物油等分试样转移至每个孔。将板转移至预热至80℃的Inheco部件。在温育后的各个时间点，通过将10μL 4N NaOH加入每个孔中终止淀粉水解反应。通过PAHBAH测定试验，分析淀粉水解反应产物。
PAHBAH测定试验：将80μL 0.5N NaOH等分试样加入空PCR板(“PAHBAH反应板”)的所有孔中，随后加入20μL PAHBAH试剂(5％w/v对羟基苯甲酸酰肼(Sigma # H9882，St.Luois，MO，USA)，溶解于0.5N HCl中)。溶液通过上下吸取进行混合。将10μL淀粉水解反应上清液加入PAHBAH反应板的每个孔。使板密封且置于热循环仪中，编程在95℃运行2分钟，并且随后冷却至20℃。将80μL显色的PAHBAH反应混合物样品转移至新鲜板，并且在分光光度计中在405nm测量吸光度。
9.2.污渍去除性能的测定
使用CS-28米淀粉污渍微小样片测定了AmyE和AmyE变体的污渍去除性能。1/4-英寸圆形直径的微小样片得自CFT Vlaardingen(Netherlands)。将2个微小样片置于96孔微量滴定板的每个孔内。
在性能测试中，通过用10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005％Tween-80的混合物稀释过滤的培养肉汤样品至20×所需终浓度，而以合适浓度测试所述样品。酶的终浓度是约0.025-0.10ppm。在pH 8和pH 10测量淀粉酶性能。
190μl(A)包含25mM HEPES(Sigma，H7523)、2mM CaCl2、0.005％Tween-80，pH 8.0的缓冲溶液，或(B)包含25mM CAPS(Sigma，C2632)、2mM CaCl2、0.005％Tween-80，pH 10.0的缓冲溶液，加入包含微小样片的各板孔中。每个孔加入10μl稀释的淀粉酶样品，以提供200μl/孔的总体积。板用板密封器覆盖且置于iEMS温箱中在40℃放置60分钟，期间伴随1,150rpm的搅拌。在该合适条件下温育后，从每个孔中取出100μl溶液，并且置于新鲜微量滴定板内，并且在分光光度计中在488nm测量吸光度。包含2个微小样片/孔和洗涤剂但无淀粉酶样品的“空白对照”也包括在测试中。
CS-28米淀粉水解性能的计算：获得的吸光度值就空白对照值进行校正。所得到的吸光度“ΔOD488”是淀粉酶活性的量度。对于各AmyE或AmyE变体，通过变体活性除以野生型酶活性计算性能指数。性能指数因此为在相同蛋白质浓度下变体(实际值)和标准AmyE参照酶(理论值)的性能比较。此外，使用标准AmyE酶的朗缪尔(Langmuir)方程参数，计算了理论值。
通过性能指数(PI)表征与野生型酶具有性能差异的变体。PI大于1(PI＞1)鉴定与标准例如野生型比较更佳的变体，而PI等于1(PI＝1)鉴定与标准表现相同的变体。PI小于1(PI＜1)鉴定比标准表现差的变体。
9.3.pH稳定性的测定
使用麦芽七糖作为底物的淀粉酶活性测定试验被用于测定AmyE和AmyE变体的pH稳定性。使用酶偶联比色动态测定试验，通过监控在pH5.8和pH 4下的葡萄糖生产，测量α淀粉酶活性。在平底聚苯乙烯96孔微量滴定板中在室温执行酶反应。对于在pH 5.8进行的测定试验，将5μl5x稀释的AmyE或AmyE变体培养上清液(在于水中的0.005％(w/v)Tween-20中)与45μl含乙酸钠pH 5.8、CaCl2、Tween-20、辣根过氧化物酶(Sigma-Aldrich，目录#8375)和葡萄糖氧化酶(OXYGOTM；Genencor Division，Danisco US Inc.)的缓冲液混合。最终50μl体积分别包含50mM、2.6mM、0.005％(w/v)、20U/ml和50U/ml的各组分。通过添加50μl含50mM乙酸钠pH 5.8、5.4mg/ml 2，2′-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(Sigma-Aldrich，目录#A1888)和10mM麦芽七糖(Sigma-Aldrich，目录#M7753)的缓冲液，随后进行5秒混合来起始反应。使用SpectraMAX 250分光光度计(Molecular Devices，Union City，CA)，在405nm每隔9秒监控反应中的颜色形成，共240秒。酶活性报告为在监控的第120秒-240秒的时间间隔过程中颜色形成的速率。对于在pH 4.0进行的测定，除使用pH 4.0的缓冲液和20μl稀释的AmyE或AmyE变体样品以及30μl含过氧化物酶/葡萄糖氧化酶的缓冲液(适当地调整组分浓度)，完全重复如上所述的方法。
9.4.热稳定性的测定
通过测定在pH 5.8对麦芽三糖底物的淀粉酶活性，使用酶偶联的比色动态测定试验监控葡萄糖的生产，测量了AmyE和AmyE变体的热稳定性。此处使用的测定法与上文使用麦芽七糖底物描述的相同。使用20μl稀释的AmyE或AmyE变体培养上清液样品，并在反应的第60-180秒时间间隔过程中监控颜色形成。此外，随后将80μl稀释的培养物样品转移至新鲜板，装上板密封器，在60℃伴随650rpm振荡在iEMS装置(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)上温育30分钟。使板在冰上冷却4分钟，随后如上所述在20μl样品上测定对麦芽三糖底物的活性。如先前测定中一样，对于每种AmyE或AmyE变体，通过变体的活性除以野生型酶的活性计算性能指数。该性能指数比较了在相同蛋白质浓度下变体(实际值)和标准AmyE参照酶(理论值)的性能。
实施例10
AmyE位置变体的相对性能
使用实施例9中的操作，将AmyE-tr的相对性能或活性与实施例6中所述产生的AmyE变体进行比较。对总共142个位置变体(具有6个或更多个成员)进行了评估。
定义：应用下述定义。
性能指数(PI)：变体与亲本蛋白质的性能比
增强性突变：PI＞1
中性突变：PI＞0.5
非有害突变：PI＞0.05
有害突变：PI≤0.05
完全限制性位置：没有关于蛋白质和活性的中性突变
非完全限制性位置：对于测试的性质之一具有至少一个中性突变
非限制性位置：对于至少一种性质具有≥20％中性突变
表2总结了AmyE-tr和AmyE变体的位点评估筛选结果。在表2中，列1指出研究的氨基酸位置。列2显示在野生型酶中在该位置上的氨基酸。列3指出在这项研究中所调查的该位置上的变体的数目。后续列提供变体数目，随后为通过执行的每种测定试验鉴定到的中性突变的百分比(％)。测试的性质如下：列4和5(玉米面粉ddG)，对玉米面粉底物的比活性；列6和7(DP3ddG)，在pH 5.8的麦芽三糖水解；列8和9(DP7pH 4ddG)，在pH 4的麦芽七糖水解；列10和11(DP7pH 5.8ddG)，在pH 5.8的麦芽七糖水解；列12和13(DP3HS ddG)，使用麦芽三糖水解测定试验的热稳定性(在60℃，30分钟)；列14和15(清洁pH 8ddG)，在pH8的米淀粉污渍微小样片测定；列16和17(清洁pH 10ddG)，在pH 10的米淀粉污渍微小样片测定。在截短AmyE中评估的150个位点中包含2个完全限制性位置，即75和123。在全长AmyE中评估的295个位点中包含10个完全限制性位置，即75、97、101、102、120、133、137、182、266和306。
Figure BDA0000046157560001221
Figure BDA0000046157560001241
Figure BDA0000046157560001251
Figure BDA0000046157560001261
实施例11
通过AmyE的乙醇形成
在这个实施例中，使用常规乙醇发酵测定试验进行实验，以测试截短AmyE在常规乙醇发酵中对Illinois River Energy(IRE)liquefact(31％DS)的性能。简言之，制备两批具有400ppm尿素的31％DS Illinois River Energy(IRE)liquefact，并且用5N H2SO4将一批的pH调整至4.3，而将另一批调整至pH 5.8。使用100g底物/烧瓶(125ml锥形瓶)。酶用量如所示。用0.2ml 10％(w/v)Red Star Ethanol Red酵母(在DI水中预水合～45分钟)接种发酵。烧瓶在32℃用搅动棒以320rpm温育48小时发酵。通过HPLC分析测量所产生的乙醇量。在pH 4.3和pH 5.8，比较截短AmyE(SEQ ID NO：2)与Xtra淀粉酶(SEQ ID NO：4)的性能。截短AmyE和
Figure BDA0000046157560001272
Xtra淀粉酶以0.2mg/gDS使用。
如图11中所示，通过截短AmyE在pH 5.8产生的最终乙醇产率是12.0％(v/v)。截短AmyE在pH 4.3产生7.3％(v/v)的最终乙醇产率。在
Figure BDA0000046157560001273
Xtra淀粉酶存在下的最终乙醇产率在pH 4.3是2.7％(v/v)，并且在pH 5.8是3.9％(v/v)。
实施例12
比较通过AmyE和其他α-淀粉酶的乙醇形成
在这个实施例中，使用实施例11中所述的对全玉米粉的乙醇发酵，进行实验，以比较在pH 4.3和pH 5.8全长AmyE(SEQ ID NO：1)和截短AmyE(SEQ ID NO：2)将不溶性颗粒(未蒸煮的)淀粉水解成乙醇的能力。
使用此测定试验，全长和截短AmyE的乙醇形成性能与以剂量1.5SSU/g(1个酶活性-SSU可溶性淀粉单位等于在pH 4.5和50℃每分钟从可溶性马铃薯淀粉底物(4％ds)水解释放1mg葡萄糖的还原力)施用的河内曲霉α-淀粉酶(AkAA，GC626)、以及以剂量0.5GAU/g施用的STARGENTM 002(在里氏木霉中表达的河内曲霉α-淀粉酶和来自里氏木霉的葡糖淀粉酶，其协同作用以使颗粒淀粉底物水解为葡萄糖)比较，其中1个葡糖淀粉酶单位(GAU)是在pH 4.2和60℃每小时自可溶性淀粉底物(4％ds)产生1μM还原糖(作为葡萄糖计算)的酶量。SSU和GAU的定义在美国专利号7,037,704中更详细地描述。AmyE全长和截短AmyE都以0.2mg/gDS剂量使用。
图12显示观察到的结果，其中在pH 4.3和5.8比较了这些酶的性能，报告为产生的最终乙醇产率。当在pH 5.8测试时，全长和截短AmyE均表现出与STARGENTM 002非常相当的性能，其中在pH 4.3全长AmyE实际上超过了就StargenTM 002观察到的乙醇产率。当在pH 5.8测试时，截短AmyE表现出与在相同pH测试的STARGENTM 002非常相当的性能。相比之下，河内曲霉α淀粉酶在pH 4.2和pH 5.8均表现极差。
实施例13
通过枯草芽孢杆菌α淀粉酶的葡萄糖形成
在这个实施例中，使用实施例2中所述的葡萄糖形成测定试验进行实验，以测定在pH 4.5和5.6枯草芽孢杆菌α淀粉酶将麦芽糖转换为葡萄糖的能力。在2、5和8天后分析反应物。
如图13中所示，枯草芽孢杆菌AmyE全长(SEQ ID NO：1)、AmyE截短(SEQ ID NO：2)和变体α-淀粉酶Amy31A(SEQ ID NO：3)将麦芽糖有效转化为葡萄糖，而截短嗜热脂肪地芽孢杆菌α-淀粉酶AmyS(SEQID NO：4)仅显示在这些条件下极小量的葡萄糖形成。
实施例14
AmyE对生淀粉的作用
在这个实施例中，进行实验以测定全长AmyE(SEQ ID NO：1)水解不溶性颗粒(未蒸煮的)淀粉的能力。用于检测由不溶性淀粉产生的糖的HPLC方法如下进行。
将纯化的Amy E(24.5g/L)在苹果酸缓冲液pH 5.6中稀释至20.4ppm的终浓度。随后将蛋白质加入在苹果酸缓冲液pH 5.6中的5％玉米面粉溶液中至1ppm的终浓度。随后混合物在振荡器中在32℃温育。定期取出样品，并且稀释在50mM NaOH中以猝灭反应。随后将10μL样品注入能够进行电化学检测的HPLC系统(Agilent 1000)。使用PA1柱与NaOH和乙酸钠的梯度在25℃运行。根据之前运行的标准，确定分布。
结果：生淀粉与1ppm全长AmyE酶温育导致众多寡糖(DP2，3，4，5，6，7)以及葡萄糖(DP1)的时间依赖性释放。通过消化时间点的HPLC分析，定量这些降解产物的出现。关于0、30和90分钟样品的数据显示于图14中。对于截短AmyE酶，观察到可比的结果(数据未显示)。
实施例15
全长AmyE中的位置文库
通过Geneart(Geneart GmbH，Josef-Engert-strasse 11，D-93053Regensburg，Germany)在全长AmyE(SEQ ID NO：1)的295个位点上产生了位置文库。表3列出了针对其制备了位置文库的各残基。残基基于其在SEQ ID NO：1中的位置编号。
表3.全长AmyE中产生的位置文库
Figure BDA0000046157560001301
Figure BDA0000046157560001311
Figure BDA0000046157560001321
在全长AmyE和AmyE-tr中均产生了在位置27、30、45、52、75、88、89、126、131、167、184、223、238、241、260、307、312、344、380和402上的20个文库。如实施例8中所述培养包含全长AmyE置换变体的枯草芽孢杆菌转化体。培养上清液用于测定。
实施例16
AmyE变体的性能
使用实施例8和9中所述的操作，将全长AmyE和截短AmyE的相对性能或活性与在全长AmyE和截短AmyE中产生的变体比较。表4概括了AmyE全长变体的位点评估筛选结果，表5概括了AmyE截短变体的位点评估筛选结果。列1显示野生型酶中的氨基酸。列2指出在这项研究中研究的在那个位置上的变体。后续列显示对于测试的性质，变体的性能指数值。测试的性质如下：通过Bradford测定法进行的蛋白质测定(表达)、粘度降低速率(峰粘度)、液化后粘度的减少(最终粘度)、聚合度(碘)、所产生的还原末端(还原末端)、存在的总葡萄糖(葡萄糖)、在pH 5.8的麦芽七糖水解(DP7pH 5.8)、使用在pH 5.8的麦芽七糖水解的热稳定性(60℃，30分钟)(DP7pH 5.8加热的)、在pH 4的麦芽七糖水解(DP7pH 4)、使用在pH 5.8的麦芽三糖水解的热稳定性(60℃，30分钟)(DP3HS)、对玉米面粉底物30分钟的比活性(玉米面粉30分钟)、在pH 8的米淀粉污渍微小样片测定(清洁pH 8)、和在pH 10的米淀粉污渍微小样片测定(清洁pH 10)。性能指数(PI)定义为变体与亲本蛋白质的性能比。
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实施例17
在粘度计中的液化
使用HAAKE Viscotester 550仪器监控由于α-淀粉酶的作用而导致的玉米面粉的粘度降低。底物浆以批模式每天新鲜制备，具有30％玉米面粉干固形物。使用硫酸将pH调整至5.8。称出50g浆(15g干固形物)，并且伴随搅拌预温育10分钟以加温直至70℃。在α淀粉酶添加后，温度立即从70℃急剧上升到85℃，同时伴随75rpm的转速。浆和酶混合物的温度达到85℃后，使它的温度保持恒定，并且监控粘度另外30分钟。在整个运行过程中测量粘度，并且以μNm报告。
野生型AmyE(全长或截短)及其几种变体以约0.25-1.5mg/50g玉米面粉浆的剂量使用，并且记录粘度。
图15显示了浆粘度随时间的典型曲线，其中比较野生型全长AmyE与AmyE全长变体1100F和W60M。在其他情况下，仅浆的峰粘度和最终粘度被制表。关于野生型全长AmyE以及在全长AmyE背景中制备的变体L142F、L142G、L142Q、L142S、L142W、L142Y、A214I、A214V、S245Y、Q126F、Q126L、Q126P、Q126V、S131L和S254I的结果显示于表8和9中。关于野生型截短AmyE以及在截短AmyE背景中制备的变体W60L、W60M、W60N、1100F、I100M、S105M、S105W、G207A、T270A、T270E、T270L、T270N、T270V和T279A的结果显示于表10中。
表8.使用截短野生型和变体AmyE获得的峰粘度和终粘度(玉米面粉袋F)
  剂量(mg)   峰粘度   终粘度
  WT   1.40   27300   1490
  L142F   0.60   26100   550
  L142G   0.30   29900   1925
  L142Q   0.30   31400   2800
  L142S   0.25   30000   2495
  L142W   1.40   33000   570
  L142Y   1.20   27800   1940
  A214I   1.40   24700   2330
  A214V   1.40   21700   560
  S245Y   1.40   25800   520
  Q126F   0.70   32300   2540
  Q126L   1.40   30900   400
  Q126P   1.40   25100   480
  Q126V   1.40   28300   520
  S131L   1.40   26100   450
表9.使用截短野生型和变体AmyE获得的峰粘度和终粘度(玉米面粉袋G)
Figure BDA0000046157560003761
表10.使用截短野生型和变体AmyE获得的峰粘度和终粘度(玉米面粉袋H)
Figure BDA0000046157560003762
粘度计测定中改善的性能可以使用许多标准进行鉴定，即，相对于参照(对照)酶，峰粘度降低、终粘度降低、或产生相似峰或终粘度所需的酶剂量的降低。表9-10中粗体指示与相应的野生型对照比较，每种变体表现改善的性能的标准。
实施例18
使用差示扫描量热法AmyE全长、AmyE-tr和AmyE变体的热稳定性
使用超灵敏扫描高流通量微热量计VP-Cap DSC(MicroCal，Inc.，Northampton，MA，USA)，测量过剩热容量曲线。先前公开了用于DSC测量的标准操作和技术理论(Freire，E.(1995)Differential Scanning Calorimetry Methods.Mol.Biol.41：191-218)。在30-120℃温度范围，扫描了约500μL 0.5mg/mL AmyE-tr或截短AmyE变体。随后再次扫描相同样品，以检查过程的可逆性。使用的缓冲液是10mM乙酸钠，pH 4.0或pH 5.8。200℃/小时扫描速率用于使可起因于聚集的任何假象减到最低。DSC曲线的热中点(Tm)用于指示热稳定性。表11显示了在pH 4.0和pH 5.8测试的野生型截短AmyE和截短AmyE变体的Tm值。
Figure BDA0000046157560003771
实施例19
面包陈化
下述实施例涉及AmyE多肽减少面包陈化的用途。
A.用于烘焙试验的配方
用US吐司的标准白面包发面团和面团配方，执行烘焙试验。由来自General Mills的1400g面粉″Gold Medal″、800g水、40g菜籽油、7,5gGRINDSTEDTM SSL P55Veg、10g乳化剂DIMODANTM PH200和60g压榨酵母，制备发面团。在Hobart螺旋混合器上，发面团以低速混合1分钟，随后在速度2混合3分钟。发面团随后在25℃，85％RH发酵3小时。
其后，将600g“Gold Medal”面粉、18g压榨酵母、5g丙酸钙、160g蔗糖、5g丙酸钙、432g水和抗坏血酸(60ppm终浓度)和ADA(偶氮二甲酰胺；40ppm终浓度)加入发面团中。在Diosna混合器上，所得到的面团以低速混合1分钟，并且随后在高速混合2分钟。随后将30g盐加入面团中。
使面团在环境温度静置5分钟，随后分割550g面团块，在Glimek轧面机上模制(设置1∶4、2∶4、3∶15、4∶12和宽度8在两边)，并且转移至烘焙形式。在43℃在95％RH醒发65分钟后，面团在200℃在MIWE烘箱中烘焙26分钟。
B.用于评估硬度、弹性和粘聚性的方法
通过质地曲线分析(Texture Profile Analysis)使用Stable MicroSystems，UK的质地分析仪(Texture Analyser)，通过分析面包切片，确定硬度、弹性和粘聚性。根据由Stable Micro System，UK提供的预设标准，计算硬度和弹性。使用的探头是铝50mm圆形。
面包切成12.5mm宽度的切片。自切片切割出具有45mm直径的圆片并分别地测量。
使用下述设置：测试前速度：2mm/s，测试速度：2mm/s，测试后速度：10mm/s，断裂测试距离(Rupture Test Distance)：1％，距离：40％，力：0.098N，时间：5.00秒，计数，5，测压元件(Load Cell)：5kg，触发型：自动-0.01N。
该下压模式是对标准方法AACC 74-09中使用的模式的改良。样品在测试中下压2次。
C用于评估硬度的方法
在第一次下压过程中，以40％压缩度，测定了硬度。数字是将切片压缩至总厚度的40％所需的力。该值越低，面包越柔软。硬度表示为压力，例如以hPa。
D.用AmyE变体多肽处理的食物产品的改善的操作性质
烘焙具有0.4mg/kg AmyE tr的面包，并且在烘焙后在多个时间根据上文阐述的方案测试面包的硬度。测试了面包的硬度。作为对照，还测试不含任何酶而烘焙的面包的硬度。
图16显示烘焙试验结果，其中用AmyE tr处理的面包的硬度与不含酶的面包的硬度比较。在烘焙的具有AmyE tr的面包中从第1天到第14天硬度增加的减少，说明该酶具有抗陈化效应，并且可以提高面包的保鲜。

Claims (25)

1.用于在淀粉转化工艺中液化和糖化淀粉的方法，其包括
使淀粉底物与AmyE多肽接触，以形成反应混合物用于液化和糖化该反应混合物中的淀粉底物以产生葡萄糖，
其中所述液化和糖化在相同反应混合物中进行，无需pH调整。
2.权利要求1的方法，其中所述糖化在缺乏具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽的情况下执行。
3.权利要求1的方法，其中所述液化在适于葡糖淀粉酶多肽的活性的pH执行。
4.权利要求3的方法，其中所述pH是5.0或更低。
5.权利要求3的方法，其中所述pH是4.5或更低。
6.权利要求3的方法，其中所述pH是4.0或更低。
7.权利要求1的方法，其中在所述淀粉底物与所述AmyE多肽接触前，将具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽加入所述反应混合物中。
8.权利要求1的方法，其中在所述淀粉底物与所述AmyE多肽接触后，将具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽加入所述反应混合物中。
9.权利要求1的方法，其中在所述淀粉底物与所述AmyE多肽接触的同时，将具有葡糖淀粉酶活性的另外多肽加入所述反应混合物中。
10.权利要求1的方法，其进一步包括使通过液化和糖化产生的葡萄糖发酵以生产醇。
11.权利要求1的方法，其中所述醇是乙醇。
12.权利要求11的方法，其中所述糖化和发酵的至少部分在相同反应混合物中同时发生。
13.权利要求1的方法，其进一步包括使通过液化和糖化产生的葡萄糖与葡萄糖异构酶接触以生产果糖。
14.权利要求1的方法，其中外源钙不加入所述反应混合物中。
15.权利要求1的方法，其中所述反应混合物中的钙浓度小于约8ppm。
16.权利要求14的方法，其进一步包括在不减少反应混合物中的钙量的情况下使通过液化和糖化产生的葡萄糖与葡萄糖异构酶接触以产生果糖。
17.权利要求1的方法，其中所述AmyE多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
18.权利要求1的方法，其中所述AmyE多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
19.权利要求1的方法，其中所述AmyE多肽包括C末端淀粉结合结构域的缺失。
20.权利要求1的方法，其中所述AmyE多肽是具有α-淀粉酶活性和改善酶性能的至少一种改变的特性的变体多肽，所述变体多肽包括：
与选自AmyE(SEQ ID NO：1)或AmyE截短变体(SEQ ID NO：2)的亲本α-淀粉酶多肽具有至少60％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，和
在选自下组的一个或多个位置的修饰：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，和425，
其中所述修饰产生对于改善酶性能的至少一种特性具有大于1.0的性能指数(PI)的变体多肽。
21.权利要求20的方法，其中所述修饰是选自以下的在一个或多个位置处亲本多肽中存在的一个或多个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基：
1A，1C，1D，1E，1F，1G，1H，1K，1M，1N，1Q，1R，1S，1T，1V，1W，1Y，2A，2C，2D，2E，2F，2G，2H，2I，2K，2L，2M，2N，2P，2Q，2R，2S，2V，2W，2Y，3C，3D，3E，3F，3G，3H，3I，3K，3L，3M，3N，3P，3Q，3R，3S，3V，3W，3Y，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4K，4L，4M，4N，4Q，4S，4T，4V，4W，4Y，5A，5C，5D，5E，5F，5G，5H，5I，5K，5L，5N，5R，5V，5W，5Y，6C，6D，6E，6H，6K，6L，6M，6N，6P，6Q，6R，6S，6T，6V，6W，7A，7C，7D，7E，7F，7G，7H，7I，7L，7M，7N，7P，7Q，7R，7S，7T，7W，7Y，8A，8C，8E，8F，8G，8H，8I，8K，8L，8M，8N，8P，8Q，8R，8T，8V，8W，8Y，9A，9C，9D，9E，9F，9H，9I，9K，9M，9N，9P，9R，9S，9T，9V，9W，9Y，10A，10I，10L，10M，10N，10P，10Q，10S，10V，11A，11F，11G，11H，11M，11S，11V，11W，11Y，12I，12M，12V，13A，13C，13D，13E，13F，13G，13I，13L，13M，13Q，13T，13V，13W，13Y，14C，14F，14G，14M，14N，14S，14T，14V，15A，15F，16A，16D，16E，16F，16G，16H，16I，16L，16M，16Q，16S，16T，16V，17A，17F，17I，17M，17Q，17Y，18A，18C，18D，18E，18G，18H，18M，18N，18Q，18R，18T，19A，19C，19H，19L，19M，19N，19S，19W，19Y，20A，20C，20D，20F，20G，20H，20I，20K，20L，20M，20P，20Q，20R，20S，20T，20V，20W，20Y，21A，21C，21D，21E，21H，21I，21K，21L，21M，21N，21Q，21R，21S，21V，22I，22M，22Q，22S，22T，22V，23A，23C，23D，23E，23F，23G，23H，23I，23L，23M，23N，23R，23S，23T，23V，23W，23Y，24A，24C，24D，24F，24G，24L，4N，24P，24Q，24R，24S，24T，24V，24Y，25A，25C，25D，25E，25F，25G，25H，25I，25K，25L，25R，25S，25T，25V，25W，25Y，26A，26F，26I，26L，26V，27A，27C，27D，27E，27F，27G，27H，27I，27L，27M，27N，27P，27Q，27R，27S，27T，27V，27W，27Y，28A，28C，28F，28G，28H，28I，28K，28L，28M，28N，28P，28Q，28R，28S，28T，28V，28W，28Y，29A，29C，29F，29L，29M，29T，29V，30A，30C，30D，30E，30F，30G，30I，30K，30L，30M，30N，30P，30Q，30R，30S，30T，30V，30W，30Y，31A，31C，31E，31F，31G，31H，31I，31K，31L，31M，31N，31Q，31S，31T，31V，31W，31Y，32D，32F，32G，32H，32K，32L，32M，32Q，32S，32T，32V，32Y，33A，33C，33D，33E，33F，33H，33I，33K，33L，33M，33P，33Q，33S，33T，33W，33Y，34A，34F，34I，34P，34W，35A，35C，35F，35G，35H，35I，35L，35M，35N，35P，35Q，35R，35S，35V，35W，35Y，36C，36D，36E，36F，36H，36I，36K，36L36M，36N，36Q，36R，36S，36T，36Y，37L，37M，37N，37V，38A，38C，38D，38E，38H，38L，38M，38N，38P，38V，39A，39C，39I，39L，39M，39N，39P，39S，39V，40A，40D，40M，40N，40P，40Q，40T，40V，40W，41A，41C，41E，41G，41N，41S，41V，42A，42L，42M，42P，42V，43A，43G，43H，43L，43M，43Q，43S，43T，43V，44A，44C，44D，44E，44F，44G，44H，44I，44K，44L，44M，44N，44P，44R，44S，44T，44V，44W，44Y，45A，45C，45F，45G，45H，45I，45L，45M，45N，45P，45Q，45S，45T，45Y，46A，46C，46D，46E，46F，46H，46I，46L，46M，46N，46Q，46R，46S，46T，46V，46W，46Y，47A，47C，47D，47F，47G，47H，47I，47K，47L，47N，47P，47R，47S，47T，47V，47Y，48A，48C，48D，48E，48F，48H，48I，48K，48L，48N，48P，48S，48T，48V，48W，49A，49C，49D，49F，49G，49H，49I，49K，49L，49P，49Q，49R，49S，49T，49V，49W，49Y，50A，50C，50E，50F，50G，50H，50I，50K，50L，50M，50N，50P，50R，50S，50T，50V，50W，50Y，51A，51C，51D，51E，51F，51H，51I，51K，51L，51M，51N，51P，51Q，51R，51S，51T，51V，51W，52A，52C，52E，52F，52G，52H，52I，52K，52L，52M，52N，52P，52Q，52R，52S，52T，52V，52W，52Y，53A，53C，53E，53F，53G，53H，53I，53L，53N，53P，53R，53S，53T，53V，53W，53Y，54A，54C，54D，54F，54G，54H，54I，54L，54M，54N，54P，54Q，54R，54T，54V，54W，54Y，55A，55C，55D，55E，55F，55G，55H，55I，55N，55P，55Q，55S，55T，55Y，56A，56D，56E，56F，56G，56I，56K，56L，56M，56N，56P，56Q，56R，56T，56V，56W，56Y，57A，57C，57D，57E，57F，57H，57I，57K，57L，57M，57Q，57R，57S，57T，57V，57W，57Y，58A，58F，58H，59A，59C，59D，59E，59F，59G，59H，59K，59L，59N，59P，59R，59S，59T，59V，59W，60A，60C，60D，60E，60G，60I，60K，60L，60M，60N，60Q，60R，60T，60V，61C，61D，61E，61F，61M，61S，61T，61V，62A，62C，62D，62F，62G，62H，62I，62K，62L，62Q，62S，62T，62V，63A，63C，63D，63F，63G，63H，63K，63M，63N，63R，63S，64A，64G，64H，64I，64L，64M，64N，64S，64V，64Y，65A，65C，65E，65H，65I，65K，65L，65M，65Q，65R，65S，66D，66E，66F，66G，66H，66I，66K，66L，66M，66N，66Q，66R，66T，66V，66W，66Y，67A，67C，67D，67E，67F，67G，67I，67K，67L，67N，67P，67Q，67S，67T，67W，68A，68C，68D，68E，68F，68G，68H，68I，68L，68M，68N，68P，68R，68S，68T，68V，68W，68Y，69A，69C，69M，69P，69T，69V，70A，70E，70H，70N，70S，71S，72C，72D，72E，72F，72G，72H，72I，72K，72L，72P，72Q，72S，72T，72V，72W，72Y，73A，73C，73E，73F，73H，73I，73K，73L，73M，73P，73S，73T，73V，73W，74A，74E，74F，74M，74S，74T，74Y，75A，75C，75D，75E，75P，76A，76D，76E，76F，76G，76I，76L，76M，76P，76Q，76R，76S，76V，76Y，77A，77C，77D，77G，77H，77I，77K，77L，77R，77S，77T，77V，77W，77Y，78A，78C，78D，78E，78F，78G，78H，78I，78K，78L，78M，78N，78P，78R，78S，78T，78V，78W，78Y，79A，79G，79L，79M，79N，79Q，79S，79T，80A，80L，80M，80W，80Y，81A，81C，81D，81E，81G，81H，81I，81L，81M，81N，81Q，81R，81S，81T，81V，81W，81Y，82A，82D，82F，82G，82I，82K，82L，82M，82Q，82R，82S，82T，82V，82W，82Y，83A，83F，83I，83L，83T，83V，84A，84D，84E，84G，84I，84K，84M，84N，84Q，84S，84T，84V，85D，85E，85F，85G，85I，85K，85L，85M，85N，85R，85S，85T，85V，85W，86C，86D，86E，86F，86G，86I，86K，86L，86M，86N，86Q，86R，86S，86V，86W，86Y，87F，87G，87T，88A，88C，88D，88F，88G，88H，88I，88K，88L，88M，88N，88Q，88R，88S，88T，88V，88W，88Y，89A，89C，89D，89F，89G，89H，89I，89K，89L，89M，89N，89P，89Q，89R，89S，89T，89V，89W，89Y，90C，90D，90E，90F，90G，90H，90I，90K，90L，90M，90N，90Q，90R，90S，90T，90V，90W，91A，91C，91D，91E，91F，91H，91K，91L，91M，91N，91P，91Q，91R，91S，91T，91W，91Y，92L，92N，92T，92V，93A，93C，93D，93E，93F，93G，93I，93L，93M，93N，93P，93Q，93R，93S，93T，93V，93W，93Y，94A，94C，94I，94M，94T，95A，95F，95L，95M，95V，95Y，96A，96C，96I，96L，96M，96P，96T，97A，97E，97M，97W，98C，98G，98I，98L，98M，98T，98V，99A，99C，99E，99F，99G，99I，99L，99M，99N，99P，99S，99T，100A，100C，100F，100M，100N，100P，100T，100V，100Y，101A，102A，102G，102Q，102S，102W，102Y，103A，103C，103I，103M，103N，103S，103V，104A，104C，104S，105C，105D，105E，105F，105G，105H，105K，105L，105M，105Q，105R，105T，105V，105W，105Y，106A，106C，106E，106F，106H，106I，106K，106L，106M，106N，1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22.权利要求20的方法，其中所述修饰为位置153上存在的氨基酸残基置换为N、K或F，并且与所述亲本多肽比较，所述变体多肽显示将麦芽糖和麦芽七糖底物转化为葡萄糖的能力增加。
23.权利要求20的方法，其中所述修饰是选自L142F、L142G、L142Q、L142S、L142W、L142Y、A214I、A214V、S245Y、Q126F、Q126L、Q126P、Q126V、S131L和S254I的置换。
24.权利要求20的方法，其中所述修饰是选自W60L、W60M、W60N、I100F、I100M、S105M、S105W、G207A、T270A、T270E、T270L、T270N、T270V和T279A的置换。
25.用于减少面包陈化的方法，其包括将足以减少陈化的AmyE多肽量加入面包面团中，其中所述减少的陈化是相对于在用缺乏AmyE多肽的等价面包面团时观察到的陈化量而言的。
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