JPH05508319A

JPH05508319A - キシラナーゼ生産法

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Publication number: JPH05508319A
Application number: JP3510717A
Authority: JP
Inventors: バン・ゴルコム、ロベルト・エフ・エム; ヘシング、ヨハンナ・ジー・エム; マット、ヤン; ローザ、マルチヌス; バルバケル、ヨハネス・マリア・エイ
Original assignee: クエスト・インターナショナル・ビー・ブイ
Priority date: 1990-06-19
Filing date: 1991-06-18
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: FI925730A0; EP0600865A1; CA2085232C; DK0600865T3; FI925730A; ES2152217T3; ES2152217T5; NL9001388A; CA2085232A1; FI111549B; DE69132422T3; AU689436B2; EP0600865B1; US6586209B1; DE69132422T2; ATE196501T1; ZA914714B; AU689436C; WO1991019782A1; DK0600865T4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３、請求項１又は請求項２記載の細胞において、該細胞が多機能性となるプロセスが発酵に関するものであることを特徴とする細胞。

４、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の細胞において、該細胞が多機能性となるプロセスがベイカリイ製品の製造に関するものであることを特徴とする細胞。

５、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の細胞において、該細胞が、細菌細胞、カビの細胞、酵母細胞及び植物細胞からなる群から選択されることを特徴とする細胞。

６、請求項５記載の細胞において、上記カビの細胞がＡｓｐｅｒｇｉＪＪｕｓ属及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属から選択されることを特徴とする細胞。

７、請求項６記載の細胞において、上記カビの細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｖａｔｘｏｒｉＳＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、ｎｉｇｅｒ、　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ及びＡｓｐｅｒｇｉＪＪｕｓ　ｏｒｙｚａｅからなる覆から選択されることを特徴とする細胞。

８、請求項５記載の細胞において、上記植物細胞が、小麦、大麦、燕麦、トウモロコシ、エントウ、ジャガイモ及びタバコからなる群から選択される植物から選択されることを特徴とする細胞。

９、請求項５記載の細胞において、上記細菌細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属及び５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属から選択されることを特徴とする細胞。

１０、請求項５記載の細胞において、該細胞が酵母細胞であることを特徴とする細胞。

１１、請求項１０記載の細胞において、上記酵母細胞が、５ａｃｃｈａｒｏｔｎｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｘｉｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属及びＰｉｃｈｉａ属から選択されることを特徴とする細胞。

１２、請求項１１記載の細胞において、上記酵母細胞が、Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、　ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓＳＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ。

Ｋｌｕｙｖｅｒｏｒｎｙｃｅｓ　ｘｒａｒｘｉａｎｕｓ、　Ｈａｎｓｅｒｔｕｌａ　ｐｏｌｙＩＩｏｒｐｈａ及びＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓからなる種から選択されることを特徴とする細胞。

１３、カビ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ材料。

１４、請求項１３記載の組換えＤＮＡ材料において、Ａｓｐｅｒｇｉｌ　Ｉｕｓ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなることを特徴とする組換えＤＮＡ材料。

１５、請求項１３又は請求項１４記載の組換えＤＮＡ材料において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなることを特徴とする組換えＤＮＡ材料。

１６、請求項１３乃至請求項１５のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｖａｒｎｏｒｉ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなることを特徴とする組換えＤＮＡ材料。

１７、請求項１３乃至請求項１６のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料において、図１に示す少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列又は図１の塩基配列と比較して欠失、挿入又は改変部位の存在する均等な塩基配列をもつＤＮＡを含んでなり、上記欠失、挿入又は改変部位をもつ塩基配列が図１に示すアミノ酸配列と対応するものか又は成熟キシラナーゼもしくは活性なプレ（プロ）キシラナーゼなどの活性な成熟過程型キシラナーゼに必須なアミノ酸配列部分と対応するようなものであるか、或いは上記欠失、挿入又は改変部位をもつ塩基配列がハイブリッド形成条件下で図１の塩基配列とハイブリダイズし得る相補鎖を有するようなものであることを特徴とする組換えＤＮＡ材料。

１８、請求項１３乃至請求項１７のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料において、該組換えＤＮＡが少なくとも１種類の他の酵素もコードしていて、該他の酵素がアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有するものであることを特徴とする組換えＤＮＡ材料。

１９、請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料から得られる遺伝物質を含む細胞。

２０、請求項１９記載の細胞において、少なくとも上記組換えＤＮＡ材料にコードされた成熟過程型キシラナーゼを発現する能力を有することを特徴とする細胞。

２１、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の細胞において、該細胞中に含まれる組換えＤＮＡに、アミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される少なくとも１種類の酵素がコードされていることを特徴とする細胞。

２２、請求項２２記載の細胞において、該細胞が請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料から得られる遺伝物質を含んでいることを特徴とする細胞。

２３、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項又は請求項２１又は請求項２２記載の細胞において、該細胞が、細胞中に含まれる上記組換えＤＮＡ材料にコードされた少なくとも１種類の酵素を発現する能力を有していることを特徴とする細胞。

２４、請求項２３記載のｍｍにおいて、該細胞が、少なくとも上記組換えＤＮＡ材料にコードされた酵素を分泌する能力を有していることを特徴とする細胞。

２５、請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料の発現によって得られる、カビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌ　ｌｕｓ由来のある成熟過程型キシラナーゼ。

２６、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項又は請求項２１又は請求項２２記載の細胞から得られる、カビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のある成熟過程型キシラナーゼ。

２７、図１に示すアミノ酸配列又はキシラナーゼ活性に不可欠な図１の配列のアミノ酸を含んでなるキシラナーゼの活性均等物のアミノ酸配列を有する成熟型キシラナーゼ。

２８、図１に示すアミノ酸配列又はキシラナーゼ活性に不可欠な図１の配列のアミノ酸を含んでなるキシラナーゼの活性均等物のアミノ酸配列を有するプレ（プロ）キシラナーゼ。

２９、少なくとも１種類の酵素の生産方法にして、請求項１乃至請求項１２又は請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞を好適な栄養培地中で培養し、かつ所望により、得られる酵素の成熟過程型を単離することを含んでなる方法。

３０、請求項２９記載の方法において、上記酵素がアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択されることを特徴とする方法。

３１、請求項２９又は請求項３０記載の方法において、上記酵素が、カビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉ　１１ｕｓ由来のある成熟過程型キシラナーゼであることを特徴とする方法。

３２、請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞から又は請求項２９乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法で得ることのできるアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される酵素を含んでなるパン改良剤。

３３、請求項３２記載のパン改良剤において、上記酵素が請求項２５乃至請求項２８のいずれか１項記載のキシラナーゼであることを特徴とするパン改良剤。

３４、請求項３２又は請求項３３記載のパン改良剤において、上記酵素がカビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の成熟型キシラナーゼであることを特徴とするパン改良剤。

３５、請求項２１乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞を含んでなるパン改良剤。

３６、請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞から又は請求項２９乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法で得ることのできるアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される酵素を含んでなる穀粉組成物。

３７、請求項３６記載の穀粉組成物において、上記酵素が請求項２５乃至請求項２８のいずれか１項記載のキシラナーゼであることを特徴とする穀粉組成物。

３８、請求項３６又は請求項３７記載の穀粉組成物において、上記酵素がカビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の成熟型キシラナーゼであることを特徴とする穀粉組成物。

３９、請求項２１乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞を含んでなる穀粉組成物。

４０、請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞から又は請求項２９乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法で得ることのできるアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される酵素を含んでなる生地組成物。

４１、請求項４０記載の生地組成物において、上記酵素が請求項２５乃至請求項２８のいずれか１項記載のキシラナーゼであることを特徴とする穀粉組成物。

４２、請求項４０又は請求項４１記載の生地組成物において、上記酵素がカビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉ　１１　ｕｓ由来の成熟型キシラナーゼであることを特徴とする生地組成物。

４３、　請求項２１乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞を含んでなる生地組成物。

４４、請求項３６乃至請求項３９のいずれか１項記載の穀粉組成物又は請求項４０乃至請求項４３のいずれか１項記載の生地組成物を用いて得られるベイカリイ製品。

４５、ベイカリイ製品の製造方法にして、請求項３６乃至請求項３９のいずれか１項記載の穀粉組成物又は請求項４０乃至請求項４３のいずれか１項記載の生地組成物を用いることを特徴とする方法。

４６、請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞から又は請求項２９乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法で得ることのできるアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される酵素の、ビール醸造や製紙やデンプン及びグルテンなどの製造プロセスのようにセルロース含有原料を使用するプロセス並びに農業廃棄物や製紙工場廃棄物などのセルロース含有廃棄物の分解プロセスにおける用途。

４７、請求項４６記載の用途において、上記酵素が請求項２５乃至請求項２８のいずれか１項記載のキシラナーゼであることを特徴とする用途。

４８、請求項４６又は請求項４７記載の用途において、上記酵素がカビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の成熟型キシラナーゼであることを特徴とする用途。

４９、請求項２１乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞の、ビール醸造や製紙やデンプン及びグルテンなどの製造プロセスのようにセルロース含有原料を使用するプロセス並びに農業廃棄物や製紙工場廃棄物などのセルロース含有廃棄物の分解プロセスにおける用途。

明　ｍｙロセスに何等かの機能を有する細胞にして少なくとも１種類の酵素をコードする組換えＤＮＡを含有する細胞に関する。本発明は具体的には食品加工の分野に機能を有する細胞、並びにビール醸造や製紙やデンプン及びグルテ用するプロセス及び農業廃棄物や製紙工場などからの廃棄物のようなセルロース含有廃棄物の分解プロセスにある機能を有する細胞に関する。

本発明は特に発酵プロセスにある機能を有する細胞に関し、詳細にはベイカリイ製品（ｂａｋｅｒｙ　ｐｒｏｄｕｃｔ）の製造プロセスにある機能を有する細胞に関する。

本発明に係る細胞は、少なくとも１種類の酵素をコードする組換えＤＮＡの発現によって、その機能を有するプロセスに対して多機能性を発揮するような細胞であることを特徴とする。例えばパン製造のような発酵プロセスの場合、かかるプロセスに特定の機能を有する細胞として酵母が用いられる。本発明に係る酵母細胞は通常の機能（即ち、組換えＤＮＡをもたない酵母も発揮し得る機能）だけでなく、パンの製造プロセスにおけるその他の機能をも有する。かかる付加的機能の具体例としてはパン改良酵素の発現と分泌が挙げられる。

本発明は特にベイカリイ製品の製造に機能を有する細胞に関する。アミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される酵素をコードする組換えＤＮＡを含有する細胞が好ましい。

本発明は、また、上述の多機能細胞による少なくとも１種類の酵素の生産方法にして、好適な栄養培地中でかかる多機能細胞を培養し、所望により、得られる酵素型法において、酵素はアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される。

本発明に係る方法を行なうのに好適な培地は、細胞が多機能性を発揮するような方法を行なう媒質から成るものであってもよい。例えばベイカリイ製品の製造方法においては、培地はベーキング（焙焼）すべき生地（ドウ）であってもよい。

無論、その他の通常の細胞培養用培地も使用できる。培地の選択は、酵素をインシトウＣｉｎ　５ｉｔｕ）で使用するか或いは単離するかによって異なる。酵素を含有する培地を使用すれば足りる場合もあれば、培地から酵素を単離する必要が生ずる場合もあるであろう。

本発明は、また、上記多機能細胞中の組換えＤＮＡによってコードされた酵素にも関係しているが、かかる酵素は上述の酵素生産方法によって上記多機能細胞から得ることができる。本発明は、さらに、上述の食品加工プロセスやセルロース含有原料を使用するプロセスなどの方法、好ましくはベイカリイ製品の製造方法に、かかる多機能細胞又は酵素を使用することにも関係する。

穀粉、酵母、水及び塩がパンその他のベイカリイ製品の基本成分である。何世紀もの間、パンや類似のベイヵリイ製品の製造に際して、製パンとも呼ばれる過程の便宜を図るため、生地の取扱い性や焙焼製品の品質に好影響を与える物質が添加されてきた。このような「パン数階、即ち、パン用バッター（ｂａｔｔｅｒ）の調製、発酵、ベーキング及びパン製品の貯蔵に重要な役割を果たす麦芽又は微生物由来の諸酵素が含まれる。

特定酵素の添加によって影響を受けるパンの性質の一つにいわゆるパン容積がある。高いパン容積を得るために、セルロース加水分解酵素、ヘミセルロース加水分解酵素及び／又はアミロース加水分解酵素を含有する組成物が実際に添加されている。微生物由来の市販組成物は、カビのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の一種に由来する場合が殆どであるが、種々の酵素活性を有する実質的に未精製の複合混合物であり、どんな酵素が組成物中に存在していてどの酵素がパン改良活性を有するかについては正確には分かっていない。かかる知識に欠けるため、パンのいっそうの改良が妨げられており、特に異なる生地の加工処理及びパン容積などのパンの性質の調整の障害となっている。

ベイカリイ製品の製造方法に関してさらに検討を加えた結果、ａ−アミラーゼの他にも、少なくともキシラナーゼ酵素がパン容積に重要であることが判明した。

キシラナーゼは、デンプン「テーリング」のベントサン部分に存在するキシランの分解を触媒する酵素である。「テーリング（ｔａｉ　Ｉ　ｉｎｇ）　Ｊという用語は、例えば水に不溶性のヘミセルロース（ベントサン及びアラビノキシラン）や損傷デンプンなどの画分を指す。この画分は、グルテン画分除去のための生地の洗浄によって得られるドウ懸濁液を遠心したときにデンプンペレットの中間層又は上層として生ずる。

Ｅａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ　（Ｐａｎｂａｎｇｒｅｄ他、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１９２゜３３５−３４１　（１９８３）並びにＦｕｋｕｓａｋｉ他、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１７１゜１９７−２０１　（１９８４））　、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　（Ｐａｎｂａｎｇｒｅｄ他。

５ｕｂｔｉｌｉｓ　（（Ｐａｉｃｅ他、Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１４４．２０１−２０６（１９８６））及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　（Ｙａｎｇ他、　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６．７１８７　（１９８８））などの種の細菌のキシラナーゼ、酵母Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　（Ｌｅａｔｈｅｒｓ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ。

Ｌｅｔｔ、　１０．７７５−７８０　（１９８８））のキシラナーゼ並びにカビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｆｎｇ　２７．５３９−５４６　（１９８５ン）のキシラナーゼを含め、様々なキシラナーゼが文献に記載されている。

欧州特許出願公開第０３３８４５２号の記載から、ヘミセルロース分解活性又はキシラナーゼ活性を有する酵素組成物を含め、種々の酵素組成物を生地に添加することによって生地の性質及びパンの品質を改良できることが知られているが、ヘミセルロース分解活性又−キシラナーゼ活性を有する上記酵素組成物の由来に関してはそれ以上特定されていない。かかるヘミセルロース分解酵素組成物はあまり同定のなされていない酵素混合物であり、生地及びパンの性質に様々な効果を有する種々のヘミセル改良作用の程度に大小の差のある複数のキシラナーゼが存在するのは、パン改良剤としての酵素組成物を得たときの方法の偶然の産物である。しかし、パン改良剤を制御しながらよりいっそう最適化するのは、必要な知識が不足していて、しかもパン改良活性をもつキシラナーゼをコードする組換えＤＮＡ構築体であってかかるキシラナーゼの高率生産に使用できるような好適な組換えＤＮＡ構築体にも欠けているために不可能である。

本発明の目的に関し、「パン改良活性」とは製造したベイカリイ製品（パンなど）又はベイカリイもしくはパン製品の製造原料たる生地の何等かの性質に対する好ましい影響を一般に意味するものであり、特にパン容積に対する好ましい影響を意味するものである。

本発明の基礎となった研究は、カビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ種の変種ａｗａｒｎｏｒｉ由来の酵素であるパン改良活性を有するキシラナーゼをコードする遺伝子（ｘｙｌＡ）の同定及びクローニングに止まるものではなく、上記遺伝子が宿主細胞中で実際に発現されるか或いは発現され得るように種々の宿主細胞を形質転換することにまで及んだ。ただし、本発明はカビ、特に同じ属に属す２菌株のカビに由来するあらゆるキシラナーゼ遺伝子を包含するものであって、本発明は実際にクローン化された遺伝子だけに限定されるものではない。

本発明は、従って、カビ由来の少なくとも一つの成熟含んでなる組換えＤＮＡ材料にも関する。

「成熟過程型（ｒｉｐｅｎｉｎｇ　ｆｏｒｍ）Ｊという用語は、上記の関連遺伝子の発現後に上記酵素が取り得る様々な形態を意味するものである。より詳細には、この用語は、天然に存在するものと天然には存在しないものとの別を問わず、プレプロ型、プレ型及びプロ型のみならず、「リーダーペプチド」の切断後に得られる酵素の最終的な成熟型をも意味するものである。

より詳細には、本発明は、Ａｓｐｅｒｇｉ　１１　ｕｓ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ材料にも関する。

好ましくは、本発明のこの態様は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ由来のキシラナーゼ、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ａｗａｒｎｏｒｉ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ材料にも関するものである。

本発明のこの態様の好ましい具体的態様は、図１に示すアミノ酸配列を有する少な（とも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ材料であり、より詳細には、−図１に示す少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ材料である。本発明は、また、図１の塩基配列と比較した場合に欠失、挿入又は改変部位の存在する図１の塩基配列と均等な塩基配列をもつような少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ材料にも関するが、上記の欠失、挿入又は改変部の存在する塩基配列は、図１に示すアミノ酸配列と対応又は成熟キシラナーゼもしくは活性なプレ（プロ）キシラナーゼなどのキシラナーゼの活性な成熟過程型に必須なアミノ酸配列部分と対応するようなものであるが、或いはハイブリッド形成条件下で図１の塩基配列とハイブリダイズし得る相補鎖を有するようなものである。

本発明に係る組換えＤＮＡは、カビ、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のキシラナーゼ成熟過程型をコードする塩基配列を最低限含んでいる。この組換えＤＮＡはさらに、調節配列（特に転写プロモーター）及び通常は１種類又はそれ以上のマーカー遺伝子によって与えられるベクタ一部分などの、多数の他の種類の情報を含んでいてもよい。これらの他の種類の情報は、選択される宿主と関連する場合が多い。従って、例えばベクター、マーカー遺伝子及び調節配列などは選択に係る宿主によって左右されるであろう。

ただし、カビ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする組換えＤＮＡは、選択した宿主中で発現されるような他の遺伝子をさらに含んでいてもよい。

かかる遺伝子は好適には少なくとも１種類の他の酵素でアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有するものをコードする。

本発明の別の態様は、上述の本発明に係る組換えＤＮＡ材料に由来する遺伝物質を含有する細胞であり、より詳細には、上記組換えＤＮＡ材料にコードされた少なくとも成熟過程型キシラナーゼを発現し得るような細胞である。本発明においては多機能細胞でもあるような細胞、特にベイカリイ製品製造の際の原料中での条件下でカビ由来の成熟過程型キシラナーゼをコードする組換えＤＮＡ材料を発現し得るような多機能細胞が好ましい。

本発明に係る少なくとも１種類の酵素をコードする組換えＤＮＡ材料を含有する多機能細胞並びに本発明に係るカビ由来の成熟過程型のキシラナーゼをコードする組換えＤＮＡ材料を含有する多機能細胞（並びにこれらの組合せ）はいずれも、それ自体が遺伝子操作の直接産物である細胞であっても、かかる遺伝子操作によって形質転換された細胞から何等かの手法で得られた細胞であってもよい。本発明の範囲は生きた細胞にも死んだ細胞にも及ぶ。

原則として本発明には上記細胞の種類に関して何ら特別な限定はなく、カビ由来の成熟過程型キシラナーゼを発現し得る細胞であればよい。ただし、細胞は好ましくは細菌細胞、カビ細胞、酵母細胞及び植物細胞からなる群から選択される。

特に好適な宿主細胞の好ましい具体例としては、以下のものが挙げられる。

のカビ細胞、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉ　１１　ｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ、　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｉｓｅｉ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ種のいずれか一種のカビ細胞、（ｂ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｔｎｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属及びＰｉｃｈｉａ属のいずれか一種の酵母細胞、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳＳａｃｃｈａｒｏｔｒｒｙｃｅｓｃａｒＪｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、　Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ。

Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ、　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｘｒｏｒｐｂａ及びＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓの菌種のいずれか一種の酵母細胞、（Ｃ）小麦、大麦、燕麦、トウモロコシ、エントウ、ジャガイモ及びタバコからなる群から選択される属の植物細胞、例えば５ｏｌａｎｕｘｉ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｘｒ種及びｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ種のいずれか一種の植物細胞、並びにＣｄ）Ｅａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ種の細菌のような、Ｅａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属及び５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のいずれか一種の細菌細胞上述の本発明に係る細胞（多機能細胞及び／又は単にカビ由来のある成熟過程型キシラナーゼをコードする組換えＤＮＡを含有する細胞）は、組換えＤＮＡの増殖のための作用物質として、或いは成熟過程型キシラナーゼのような上記組換えＤＮＡにコードされる少なくともＩＷ類の酵素を生産するための作用物質として重要である。

酵素を生産する場合、上記細胞を酵素の生産に使用し有培地をそのまま使用してもよく、多機能細胞についてはそれらが多機能性を発揮するようなプロセスのその場Ｃｉｎ　ｓｉｔ■）でかかる細胞自体を酵素の生産に使用することもできる。

例えば宿主株が各種カビ、酵母、植物及び細菌の種である場合のように食品製造に問題なく許可される場合には、細胞それ自体を直接使用することも可能である。製パンに関しては、本発明に従って遺伝子操作した酵母株を直接使用することもできる。

選択に係る宿主によっである程度左右されるが、キシラナーゼをコードする遺伝子はその遺伝子内にイントロンが存在していてもいなくてもよく、また、それ自身又は他の遺伝子に由来する転写終結シグナルを有していてもよいし、さらには、それ自身のリーダー配列又は他の遺伝子に由来するシグナル配列を有していてもよい。

５ａｃｃｈａｒｏｔｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母）のような酵母の形質転換に関しては、成熟タンパク質のプロセッシング及び分泌が正確に行なわれるようにイントロンを除去し、かつまた、それ自身のリーダー配列を例えばインベルターゼ遺伝子のシグナル配列のような酵母辷適したシグナル配列で置換したほうが好ましい。

Ｅａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓなどのｔｍｍの形質転換においては、イントロンの除去が不可欠である。かかる場合、例えばと−アミラーゼのシグナル配列をシグナル配列として用いることができる。

好適な形質転換法、並びに例えば適当な転写プロモーター、適当な転写終結シグナル及び形質転換細胞の選別のための適当なマーカー遺伝子を供えたベクターの好適な発現法については、各種の細菌、酵母、カビ及び植物の種を含め、多数の生物について既に知られている。例えば酵母については、ガラクトースで誘導可能なＧＡＬ　７プロモーターの調節を受ける酵母中での外来遺伝子の発現について記載したＴａｊｆｍａ他、　Ｙｅａｓｔ　Ｌ、　６フー７７　（１９８５）を、また、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓニツイ７：　Ｉｔ、発現ベクターとして５ＰＯ２プロモーターを含有するプラスミドｐＭ８４８について記載した欧州特許出願公開第０１５７４４１号を参考文献として挙げることができる。これらの生物及び他の生物におけるその他の可能性については一般書を参考文献として挙げることができる。

本発明の別の態様は、上述の本発明に係る組換えＤＮＡ材料の発現によって得られるカビのキシラナーゼ、特にＡ　ｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　Ｊ　ｕｓ由来のある成熟過程型キシラナーゼに存する。本発明においては、図１に示すアミノ酸配列を有する成熟型キシラナーゼのみならず、図１に示すアミノ酸配列を有するプレ（プロ）キシラナーゼ、並びにキシラナーゼ活性に不可欠な図１の配列の複数のアミノ酸を含んでなるキシラナーゼの活性均等物のアミノ酸配列が特に好ましい。本発明は、従って、図１の配列の酵素と同じ酵素活性を有する酵素三次構造を与えるようなアミノ酸構造体に関する。

本発明のまた別の態様は、カビ、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のある成熟過程型のキシラナーゼを生産する方法にして、ある成熟過程型キシラナーゼを発現し得る多機能細胞及び／又はカビ由来のある成熟過程型キシラナーゼをコードする本発明に係る組換えＤＮＡ材料を発現し得る細胞を適当な栄養培地中で培養し、かつ、所望により、得られるキシラナーゼ成熟過程型を単離することを含んでなる方法に存する。「得られるキシラナーゼ成熟過程型を単離する」という用語は、かかるキシラナーゼを含んでなる酵素組成物が回収されるような部分精製をも包含するものである。

本発明のさらに別の諸態様には以下のものがある。

−ある成熟過程型のキシラナーゼ、特にカビ、とりわけＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の成熟型キシラナーゼのような、アミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される酵素（ここで、上記酵素は本発明に係る多機能細胞から及び／又はカビ由来のある成熟過程型キシラナーゼをコードする本発明に係る組換えＤＮＡの発現により得ることができる）を含んでなるパン改良組成物、及び本発明に係る多機能細胞を含んでなるパン改良組成物； −ある成熟過程型のキシラナーゼ、特にカビ、とりわけＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の成熟型キシラナーゼのような、アミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される酵素（ここで、上記酵素は本発明に係る多機能細胞から及び／又はカビ由来のある成熟過程型キシラナーゼをコードする本発明に係る組換えＤＮＡの発現により得ることができる）を含んでなる穀粉及び生地組成物；一本発明に係る多機能細胞を含んでなる穀粉及び生地組成物； −かかる穀粉又は生地組成物を用いて得られたベイカリイ製品；並びに −かかる穀粉又は生地組成物、特にカビ、とりわけＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の成熟型キシラナーゼの入った穀粉又は生地組成物を使用して、ベイカリイ製品を製造する方法。

ただし、本発明はカビのキシラナーゼのその他の用途にも及ぶものであり、例えば、ビール醸造の領域、特に小麦を原料とするビールの製造における濾過性を改善するための用途、製紙業における紙材の吸水性を低下させるための用途、農業廃棄物の処理における用途などが挙げられる。

以下、パン改良剤として好適なキシラナーゼの同定、クローニング及び発現について詳述することによって本発明をさらに説明する。実施例に記載の実験作業において、キシラナーゼ源としてカビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ種の変種ａｖｔａｍｏｒｉ　ＣＢＳ　１１５．５２　（ＡＴＣＣ１１３５ｇ）を使用した。本発明者等の行なった研究によれば、上記菌株は小麦のフスマによる誘導後にパン改良特性をもつキシラナーゼを産生ずる能力を有するものであり、一方、かかる誘導条件下で培地はα−アミラーゼ活性、低グルカナーゼ活性及び低プロテアーゼ活性を示す。なお、野生株のキシラナーゼ産生量は工業的プロセスに使用するには低すぎる。

このため、本発明は工業規模でのキシラナーゼの生物工学的生産を可能にする遺伝子操作法をも提供する。

実施した実験作業には、２ベクター中で作成したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｒｎｏｒｉの染色体ＤＮＡの遺伝子ライブラリーからキシラナーゼ酵素をコードする遺伝子（ｘｙｌＡ遺伝子）を単離することも含まる。かかる単離のため、本発明者等の決定した精製成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に由来する組成のプローブを作成した。このプローブを用いて、上記遺伝子を含む可能性のある多数のλクローンを単離した。これらの陽性λクローンからＤＮＡ断片をサブクローニングした。続いて、かかるクローン化染色体ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を部分的に決定した。これらの結果及び＋ｎＲＮＡ分析の結果から、ｘｙｌＡ遺伝子の長さ、ｍＲＮＡの長さ並びにイントロンの存在及び位遭を決定した。

ｘｙｌＡ遺伝子が２１１残基のアミノ酸からなるタンパク質（プレ（プロ）型）をコードしていて、このタンパク質には１８４残基のアミノ酸からなる成熟型タンパク質の前に２７残基の「リーダー」ペプチドが存在するというデータｘｙｌＡターミネータ−の存在するキシラナーゼ遺伝子を含有する３種類の発現ベクターを構築した。これらのベクターの一つには、ｘｙｌＡ遺伝子の前にｘｙｌＡ自身の発現シグナルが存在する。二番目のベクターには、ｘｙｌＡ発現シグナル（ＡＴＧ　コドンまで）がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（、ｇｐｄＡ）遺伝子由来の構成的発現シグナル（Ｐｕｎｔ他、　Ｇｅｎｅ　６９．４９−５７　（１９８８）参照）で置換されており、三番目のベクターには、ｘｙｌＡ遺伝子の前にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ。

ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子由来の誘導的発現シグナルが存在する。これらの発現ベクターはすべてに、Ｖｅｒｎａｒｓの＝ＤＮＡ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　ｆｕｎｇｕｓ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ’と題する学位請求論文（ヴアーケニンゲン農業大学（ＬａｎｄｂｏｕｗＨｏｇｅｓｃｈｏｏｌ　Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ）、　１９８６）に記載されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓのアセトアミダーゼ（ａＩｊｌｄＳ）遺伝子を選択マーカーとして含んでいる。この選択マーカーを用いることによって、ゲノム中に多数のコピー数のベクター及びその帰結としてｘｙｌＡ遺伝子の組込まれた形質転換体を得ることができる。

上記の発現ベクターを用いて、ＡＳｐｅｒｇｉｌｈＪＳ種の菌株であるＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ及びＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ。

ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２から多重コピー形質転換体が得られた。振盪フラスコ内での実験において、得られた形質転換体を様々な培地中で培養したところキシラナーゼの産生がみられた。結果（最大産生量）を以下の表Ａに示す。この表で、キシラナーゼ活性は１ｍｌ当りの１０３活性単位（υ）で表した。１活性単位は、キシランから毎分１ｍｇのキシロースに相当する量の還元基を放出するキシラナーゼの量であると定義される。

キシランによる誘導後、Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ及びＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２のｘｙｌＡプロモーターを有するＩｘｙｌＡＪ多重コピー形質転換体は、Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｗａｍｏｒｉ及びＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒの野生型菌株よりもはるかに多量のキシラナーゼを産生ずる。かかる結果並びに上記遺伝子の分子レベルでの分析で得られたデータから、クローン化された遺伝子に機能的キシラナーゼがコードされていることが分かる。さらに、上述の結果から、多重コピー形質転換体が活性型酵素を過剰産生ずる能力を有することは明らかである。ベーキング試験でもこの酵素組成物は所望の性質を有している。

異種ｇｐｄＡ又はｇｌａＡプロモーターを有する宿主菌株多重コピー形質転換体も活性型キシラナーゼを多量に産生ずる能力がある。ｒｇｐｄＡｊ形質転換体は強化培地中で野生型Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖｔａｒｎｏｒｉ株よりも明らかに多量のキシラナーゼを産生ずる。ただし、実際の試験で観察されたその産生量はｒｘｙｌＡＪ多重コピー形質転換体で得られた産生量よりも相当低い。

デンプンによる誘導後のｒｇｌａＡＪ多重コピー形質転換体の産生量はキシラン培地中のｒｘｙｌＡＪ多重コピー形質転換体のものと同程度であった。

小麦フスマ培地中では、最良のＡ、ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｖａｘｏｒｉ　ｒｘｙｌＡＪ多重コピー形質転換体はキシラン培地中におけるよりも格段に多量のキシラナーゼを産生ずる。

この小麦フスマ培地中では、最良のＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２　ｒｘｙｌＡＪ多重コピー形質転換体のキシラナーゼ産生量は極めて高くなる。Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ及びＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２の産生量の最も高いｒｄｐｄＡＪ多重コピー形質転換体は小麦フスマ培地中で強化培地中と同程度のキシラナーゼを産生ずる。ただし、Ａ、　ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２のｒｇｌａＡノ形質転換体はかかる小麦フスマ培地中でデンプン培地中よりも多量のキシラナーゼを産生ずる。

成される産生量はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｒｔｒｏｒｉ形質転換体のものよりも高い。しかし、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ形質転換体の産生量はＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ。

ａｗａｍｏｒｉの好適な変異株を用いることによつてさらに増大させることができる。かかる好適な変異株の例として、Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ　＃４０が挙げられるが、この変異株は野生株よりも明らかに多量のキシラナーゼを産生ずる。変異株Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ　＃４０は、Ａ、　ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ胞子に突然変異を誘発し、キシラナーゼ産生能に関して選択することによって得られたものである。

［ｘｙｌＡＪ型のＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ　＃４０形質転換体は小麦フスマ培地中で１９００００υのキシラナーゼを産生ずるが、この量は最も産生量の高いＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ形質転換体のものよりも格段に高い。

さらに実験を行なったが、これらの実験はこのようにして生産したキシラナーゼの単離並びにパン改良剤（実施例２参照）並びに酵母菌株及び細菌中での発現実験（それぞれ、実施例３及び４）に関するものである。実施例５は本発明に係る多機能性酵母のパン改良剤における用途を実証したものであり、上記酵母は低栄養六ン生地の発酵時にキシラナーゼを産生ずる。

図面の説明図１は、プラスミドＩ）Ａ１１４Ｂ中に存在するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ由来の約２．１ｋｂ　Ｐｓｔｌ−Ｐｓｔｌ断片の一部分のＤＮＡ配列を示すものであり、この断片はｘｙｌＡ遺伝子と表記したキシラナーゼをコードする遺伝子を含んでいる。翻訳開始コドン及び翻訳終結コドンは二重下線で示す。４９ｂｐのイントロンは下線で示す。成熟型タンパク質の開始位置を示す。タンパク質（ブレ（プロ）型及び成熟型双方）のアミノ酸配列も一文字表記を用いて図１に載せた。

図２は、ト１及びｚ−１４フアージ中でクローニングしたＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｖａｍｏｒｉのゲノムＤＮＡ領域の制限地図を示したものである。略号は次の通りである。Ｓ：　５ａ７１部位、Ｅ：　Ｅｃｏ８１部位、Ｈ：　Ｈｉｎｄｍ部位、Ｐ：　Ｐｓｔ１部位、Ｂ：　Ｂａｍ旧部位、Ｓ＃：λ−ＥＭＢＬ３のポリリンカーに由来する５ａ１１部位、Ｄ：　５ａｕ３Ａ部位。太い棒線部分は、Ｘｙ１０６とハイブリダイズする１、２ｋｂ　ＰｓｔＩ”−Ｂａｍ旧断片を示す。

図３は、Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｗａｍｏｒｉの５．３ｋｂの５ａｌＩ断片をｐＵｃ１９に挿入して得られたプラスミドｐＡＷ１４Ｂを示す。

図４は、ｘｙｌＡ遺伝子を自身のプロモーター及びａｍｄｓ選択マーカーと共に含むプラスミドｐＡＷ１４ｓを示す。

図５は、ｘｙｌＡ遺伝子のＡ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　ｇｐｄＡプロモーターとの翻訳融合系を含むプラスミドｐＡＷ１４ｓ−２を示す。

図６は、ｘｙｌＡ遺伝子のＡ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　ｇｐｄＡプロモーター及びａｍｄｓ選択マーカーとの翻訳融合系を含むプラスミドｐＡＷ１４ｓ−２を示す。

図７は、ｘｙｌＡ遺伝子のＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｇｌａＡプロモーター及びａｍｄｓ選択マーカーとの翻訳融合系を含むプラスミド図８は、ＤＮＡ断片ＢＡＫＩの塩基配列並びにこの断片の作成に用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

図９は、プラスミドｐＢＡＫ１の構築を図説したものである。

図１０は、ＤＮＡ断片ＢＡＫ２の塩基配列並びにこの断片の作成に用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

図１１は、プラスミドｐＢＡＫ２１の構築を図説したものである。

図１２は、プラスミドｐＵＲ２９０１の構築を図説したものである。

図１３は、プラスミドｐＵＲ２９０４の構築を図説したものである。

図１４は、プラスミドｐＵＲ２９２１の構築を図説したものである。

図１５は、ＤＮＡ断片ＢＡＫ４の塩基配列並びにこの断片の作成に用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

図１６は、プラスミドｐＵＲ２９５０の構築を図説したものである。

図１７は、プラスミドｐＵＲ２９５１の構築を図説したものでｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＰＧＫプロモーターの塩基配列を示す。二本鎖型配列において、プライマーは太字で、ＡＴＧ開始コドンは地の部分を点刻して示し、制限酵素部位ＥｃｏＲＩＳＥｇｌＴ１、ＥｓｐＭＩ及びＨ釉ｄＩ［［を示した。

図２０は、ＤＮＡ断片ＢＡＩＣ５の塩基配列並びにこの断片の作成に用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

図２１は、プラスミドｐＬＩＲ２９２０の構築を図説したものである。

図２２は、プラスミドｐＵＲ２９２２の構築を図説したものである。

図２３は、プラスミドｐＵＲ２９２３の構築を図説したものでＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉのキシラナーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）のクローニング及び特徴１、Ｉ　Ａｓｐｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｒｎｏｒｉ　ｘｙｌＡ遺伝子の単竺Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｔｔｚｏｒｉの染色体ＤＮＡからｘｙｌＡ遺伝子を単離するため、オリゴヌクレオチド混合物からなる様々なプローブを合成した（表Ｂ）。これらの混合物の組成は精製キシラナーゼタンパク質のＮ末端アミノ酸配列から導出した。

表Ｂキシラナーゼタンパク質のＮ末端アミノ酸配列から導出したプローブキシラナーゼタンパク質のＮ末端アミノ酸配列Ｓｅ　ｒＡ　１ａＧ　ｌｙ　ｒ　ｌｅＡ　５ｎＴｙ　ｒＶａ　ＩＧ　ｌｎＡ　５ｎＴｙ　ｒＡ　ｓｎＧ　１ｙＡｓｎＬｅ　ｕＧ　１ｙＡｓｐoｈｅプローブ　塩基配列３’−５’ Ｘｙｌｏｌ　ＴＴＡＡＴＡＣＡＸＧＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＣＣＧＧ　ＣＧＧＧＸｙ１０４　ＣＧＧＣＣＧＴＡＧＴＴ石ＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＧＣＣＧＴＴＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡｘｙｉｏｓ　ＡＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＡＡＡＸＣＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧＸ＝ＡＳＧＳＣ又はＴＸｙｌＯｌ　二アミノ酸５〜１２をコードするコード鎖部分に相補的な配列の２３残基のデオキシヌクレオチドからなる２５６種類のオリゴヌクレオチドの混合物。

ｘｙ１０４二アミノ酸２〜１７をコードするコード鎖部分に相補的な配列の４７残基のデオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド。

ｘｙｉｏｓ　二アミノ酸１０〜１７をコードするコード鎖部分に相補的な配列の２３残基のデオキシヌクレオチドからなる１４４種類のオリゴヌクレオチドの混合物。

ｘｙｉｏａ　二アミノ酸２〜１７をコードするコード鎖部分に相補的な配列の４７残基のデオキシヌクレオチドからなる２５６種類のオリゴヌクレオチドの混合物。

ｘｙｉｏｓ及びｘｙｔｏａにおいては、混合物中のオリゴヌクレオチドの種類を２５６種以下とするために、コドンの３番目の塩基として存在し得るすべての塩基を導入してはいない。

サザンブロツティング分析では、染色体ＤＮＡを緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下で消化すると、たった一本のバンドだけが使用プローブとハイブリダイズす名ことが確認された。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ　ＤＮＡをＡ：ｃｏＲＩ。

Ｓａ月及びＥａｍＨＩで消化すると、それぞれ４．４ｋｂ、　５．３ｋｂ及ヒ９．５．ｋｔ＋ノー　本（Ｄ　ハン）’　カＸｙｌＯ１、Ｘｙ１０４及びｘｙｉｏｅとハイブリダイズする。ｘｙｌｏｓを用いた場合、４１℃では明瞭なシグナルはみれなかった。この結果に基づいて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ　ＤＮＡのλ遺伝子ライブラリーとオリゴヌクレオチドＸ７１０６プローブとのハイブリダイゼーションを６５℃で行なった。試験した６５０００個のプラーク（ゲノムの３２倍に相当）のうちの３個のプラーク（ λ−Ｌ　２−１４及びλ−６３）が上記プローブとハイブリダイズした。λ−１及びト１４消化物とｘｙｘｏａとのハイブリダイゼーションを行なったところ、 λ−１のＥｃｏＲＩ消化物中に１．０ｋｂより大きなハイブリッド形成バンドが見付かった。

λ−１４及び染色体のＥｃｏＲＩ消化物におけるハイブリッド形成バンドの大きさは４．４ｋｂであった。λ−１のＳａ月消化物では４．６ｋｂのバンドがハイブリダイズし、ト１４の５ａｌＩ消化物では染色体ＤＮＡと同様に５．３ｋｂのバンドがハイブリダイズした。１．２ｋｂのＰｓｔＩ−Ｂａｍ旧断片（図２）もｘｙｉｏｅとハイブリダイズした。λ−１及びλ−１４消化物の様々な制限酵素パターン並びにこれらとλ−１４の５．３ｋｂ　５ａｉｌ断片とのクロスハイブリダイゼーションから、これらのλファージがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗｔａｍｏｒｉのゲノムの重複する断片を含んでいることが確認できた。各々λ−１、λ−１４及びλ−１４の５Ｊｋｂ　５ａｌＩ断片と全誘導１１１ＮＡの同種／’％イブリダイゼーシジンから、これらのλフアージ中にｊｙ　Ｉ　Ａ配列が存在していることが確認できた。約１ｋｂのキシラン誘導ｍＲＮＡでハイブリッド形成がみられた。その大きさはＸｙ１０６とハイブリダイズするｍＲＮＡ分子の大きさに対応しｘｙｌｏｓと各々ハイブリダイズする２ −１の５ａｌＩ断片（４，６ｋｂ）及びλ−１４の５ａｌＩ断片（５，３ｋｂ）をｐｔｌｃ１９の５ａ１１部位に二通りの方向でクローン化して、それぞれ、プラスミドｐＡ１ｆｌ　（Ａ及びＢ）とプラスミドｐＡＷ１４　（Ａ及び８１図３参照）を得た。りＡＷ１４Ａ及びｐＡｆｌＡからそれぞれ得られる、Ｘ）１１０６とハイブリダイズする１、２ｋｂ　ＰｓｔＩ−Ｅａｒｔ＋旧断片及び隣接１．Ｏｋｂ　Ｂａｍ旧−ＰＳｔＩ断片を、Ｂａｍ旧及びＰｓｔＩで切断したＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９中にサブクローニングして、表Ｃに示すｍ１８／ｍ１９Ａ１１系ベクタ一群を得た。

ｐＡＷ　１４Ａ　ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ’　（１，２ｋｂ）　ｍ１８ＡＷ１４Ａ −１／ｍ１９ＡＷ１４Ａ−１ｐＡＷ　ＩＡ　ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ　（１，０ｋｂ）　ｍ１８ＡＷＩＡ−２／ｍ１ＱＡＷＩＡ−２ｐＡＷ　１４Ａ　ＰｓｔＩ−ＥａｍＨＩ　（１，０ｋｂ）　ａ＋１８Ａ！１４Ａ−２／ｍ１９ＡＷ１４＾−２１．３　ｘｙｌＡ遺伝子の転写方向の決定ｍ１８ＡＷ１４Ａ−１及びｍ１９ＡＷ１４Ａ−１の各々の一本鎖ＤＮＡとＸｙ１０６とのスポットブロットハイブリダ！ゼーション法でｘｙｌＡ遺伝子の転写方向を確定した。このプローブとはｍ１９Ａ１１４Ａ−１の一本鎖ＤＮＡ　（５’　”ＰｓｔＩ−ＢａｘｒＨＩ　３’）がハイブリダイズした。Ｘｙ１０６の配列は非コード鎖の配列と同一であるので、ｍ１９ＡＷ１４Ａ−１がコード鎖を含んでいる。この方向はプライマー伸長実験の結果からも確認された。

１．４　ｘｙｌＡ遺伝子の同定Ｘｙ１０６をプライマー（遺伝子の５′部分）としてＩ）Ａｌｌ＋１４の配列を解析し、プロモーター領域の一部のＤＮＡ配列を決定した。この領域で５’　− ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＧＡＴ　ＴＡＡ　ＧＣＴ　ＧＣ−３’という配列を有するプライマーｘｙｌｌｌを選択し、このプライマーを用いてｍ１３ＡＷ１４Ａ−１及びｍ１８＾Ｗ１＾−１の相補鎖のＤＮＡ配列を決定した。得られた結果は、これらのベクターがＸｙ１０６のＤＮＡ配列と実質的に同一のＤＮＡ配列を含んでいることを示しており、これらの塩基対から導かれるアミノ酸配列は成熟型キシラナーゼタンパク質のＮ末端アミノ酸配列と同一であった。従って、ｘｙｌＡ遺伝子の少なくとも５′末端がクローニングされていることが実証された。

Ｓａ月断片（図２）における当該遺伝子の５′末端の位置並びにｘｙｌＡ　ｍＲＮＡの大きさく約１ｋｂ）からすると、ｐＡＷｌ４及びｐＡｖ１ベクター中にｘｙｌＡ遺伝子全体が存在することはほぼ確実であると考えられる。

１．５配列解析サンガーのジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ他、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７　（１９’７−７））により、ｍ１３ＡＷ１４及びｍ１３ＡＷｌサブクローンにおける二通りの方向でｘｙｌＡ遺伝子の塩基配列を決定した。ＰｓｔＶ部位（図２）の下流に位置するＢａＩ２旧部位付近の配列をｐＡ１１１４及びｐＡＷｌの二本鎖ＤＮＡの配列解析によって決定した。二次構造形成（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）の問題はｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰを使用することによって解決した。別々のクローンλ− １及びλ−１４について、同一のｘｙｌＡ配列が確認された。プレ（プロ）キシラナーゼ遺伝子の完全な（コード）配列を図１に示す。成熟型キシラナーゼタンパク質の前に、２７残基のアミノ酸からなるリーダーペプチドが存在する。１６番目のアラニンと１７７番目アラニンの間にシグナルペプチダーゼによる切断部位が存在しているものと考えられる。リーダーペプチドの長さからすると、このタンパク質には第二のプロセッシング部位が存在すると思われる。Ａｒｇ（２７）と５ｅｔ（２８）の間で、ＫＥＸ２様のプロテアーゼによる切断が起こるものと思われる。

１．６イントロンの位置決定Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ属のイントロンの「供与部位」及び「受容部位」に相当する配列が存在していることから、ｘｙｌＡ遺伝子に４６又は７６ｂｐ　（塩基番号２３１〜２７９又は２３１〜３０６、図１参照）のイントロンが存在すると予想された。Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ・・・という配列のキシラナーゼのペプチドが単離されたことによって、７６ｂｐのイントロンは存在していないという確かな証拠が得られた。かかるペプチドはキシラナーゼタンパク質においては１基番号３０２から始まる位置にしか存在し得ない（図１参照）。

１．７　ｘｙｌＡ遺伝子の３′末端の決定ＤＮＡ配列データから、ｘｙｌＡ遺伝子の終結コドンの位置（図１の塩基番号６８３）が判明した。この終結コドンは、塩基番号６４１〜６８２）から導出されたＣ末端アミノ酸配列と同一であることからも確認された。

１、．８ＤＮＡ及びタンパク質データの評価上記のデータからすると、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｗａｍｏｒｉのキシラナーゼをコードする遺伝子は５．３ｋｂＳａ月断片にクローニングされている。この遺伝子のＤＮＡ配列、イントロンの位置並びにｍＲＮＡの長さが判明した。成熟型タンパク質について判明したＮ末端アミノ酸配列は、ＤＮＡ配列によって完全に実証された。上記のデータからすると、ｘｙｌＡ遺伝子は２１１残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしており、最初の２７残基のアミノ酸が翻訳後に除去されると結論付けることができる。

ｘｙｌＡ遺伝子のＤＮＡ配列から導出されるアミノ酸配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓのキシラナーゼ（２０１残基のアミノ酸からなる）及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　（２１３残基のアミノ酸からなる）と高い相同性を示すことが分かる。

２発現ベクタ一群ゲノムｘｙｌＡ遺伝子の翻訳開始部位からｘｙｌＡターミネータ−までを含む３種類の発現ベクターを構築した。これらのベクターはｐＡＷ１４Ｂ　（図３）に由来するものである。

２、Ｉ　Ａｓｐｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ由来のｘｙｌＡプロモーターを有するベクター＾「１４Ｓベクター１）ＡＷ１４Ｓ　（図４）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｖａｍｏｒｉ由来の５．３ｋｂ染色体ＤＮＡ断片を含んでいるが、この断片にはｘｙＪＡ遺伝子がそれ自身の発現シグナルと共に位置している。このプラスミドにはさらにアセトアミダーゼ（ａｍｄｓ）遺伝子の位置するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ由来の５．３ｋｂ断片が存在している。ｐＡＷ１４ｓにおけるａｍｄｓ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子の転写方向は同一である。

２．２　Ａｓ　ｅｒｇｉｌｌｕｓ酊ｄｕｌａｎｓ由来のｇｄＡプロモーターを有するベクターＡＷ１４Ｓ−２プラスミドｐＡ１１１１４３−２（図６）は、ｘｙｌＡ遺伝子のＡＴＧ　）トンの上流に位置する。’ｉｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｒｒｒｏｒｉ断片がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＣｇｐｄＡ）遺伝子の構成的発現シグナル（ＡＴＧ）リプレットまで）で置換されている点でｐＡｆ１４ｓとは異なる。このプラスミドにおけるａｍｄｓ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子の転写方向は同一である。ｇｐｄＡプロモーターとｘｙｌＡ遺伝子のＡＴＧコドンの間は合成りＮＡ断片を用いて正確に連結した。構築に際してａコｄＳ選択マーカーの存在しないプラスミドｐＡＷ１４ｓ−２も同時に得たく図５）。

するベクターＡＷ１４Ｓ−３プラスミドｐＡｆ１４ｓ−２３（図７）は、ＡＴＧコドンに至るまでのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｆｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼＣｇｌ　ａＡ）遺伝子の誘導的発現シグナルと、ｘｙｌＡ遺伝子のＡＴＧ）リブレットから始まるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｖａｍｏｒｉ由来の配列とを含んでなる。このプラスミドはさらに選択マーカーとしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ由来のａｒｔｒｄｓ遺伝子を含んでいる。ａｍｄｓ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子は同一の配向をしている。

ａｍｄｓ選択マーカーにより上記３種類のプラスミドを有する形質転換体を得ることができるが、かかる形質転換体においてはゲノムにベクターが組込まれ、また、その当然の帰結としてキシラナーゼタンパク質の産生量を増大させるための（所望によりハイブリッド型の）　ｘｙｌＡ遺伝子が多コピー数組込まれている。

３　Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓの形質転換Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｘｏｒｉの形質転換頻度はベクターＤＮＡ　１μｇ当り０，０３〜０．２３個の（ＡＶ型）形質転換体であった。この結果、全体として５種類のＡＷ１４Ｓ　ＣｘｙｌＡプロモーター）型、４０種類のＡＷ１４Ｓ−２ＣｇｐｄＡプロモーター）型及び８種類のＡＷ１４Ｓ−３ＣｇｌａＡプロモーター）型の形質転換体が得られた。さらに研究を続けた結果、種々の形質転換体が様々な変わった増殖挙動を取ることが判明した。

それらの一つとして、ＡＷ１４Ｓ　＃１から適当に胞子を形成するコロニー（ＡＩＩ１１４Ｓ　＃ＩＡ）と胞子を殆ど形成しないコロニー（Ａ１１４３　＃ＩＢ）とが得られる。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２の形質転換は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｗａｘｒｏｒｉの形質転換よりも効率的に起こる。ｐＡＷ１４ｓＳｐＡＷ１４ｓ−２及びｐＡｆ１４ｓ−３を用いたとき、それぞれ、ＤＮＡ　ＩＢ当り０．３．０．３及び１個の（ＡＢ型）形質転換体が見出だされた。２０種類のｐＡＢ１４ｓ　（Ｘ）’ＩＡプロモーター）型、３０種類のＡＢ１４Ｓ−２ＣｇｐｄＡプロモーター）型及び１６種類のＡＢ１４Ｓ−３ＣｇｌａＡプロモーター）型の形質転換体を画線培養した。

ｐＡＷ１４ｓ及びｐＡＢ４．１中のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ｎｉｇｅｒ　ｐｙｒＧ遺伝子でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒｐｙｒＧ　Ａｇ３．１を同時形質転換したところ、両方のマーカーで選択したときにはｐＡＷ１４ｓ　ＤＮＡ　１μｇ当り０．２個の形質転換体が得られた。最初にａｍｄｓで選択するとＤＮＡ　１μｇ当り２個の形質転換体が見出だされたが、最初にｐｙｒＧで選択したときの頻度は約２０ｘｇ　ｐＡｆ１４ｓ　ＤＮＡであった。同時形質転換体（Ａｇ３．１−１４８）　ノ約３０％が両方ツマ−カーを有していた。これらのうちの６種類をさらに解析した。

４多重コピー形質転換体の解析４．１誘導物質としてキシランを用いた培地中で培養した後のＡｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ　ｒｘｙｌＡＪ型形質転換体（Ａｆ１４Ｓ）の解析誘導物質としてキシランを用いてＡＷ１４Ｓ形質転換体を培養したとき、１０日後に得られた培地中でのキシラナーゼ産生量は野生型Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｘｒｏｒｉ株の場合よりも著しく高かった。培養液を４℃で保存したところ、酵素は完全に安定であった。キシラン培地中における産生量を次の表りに示す。

勲キシラン培地中２５℃で培養したときの各時間におけるＡＷ１４Ｓ形質転換体のキシラナーゼ産生量（１０３Ｕ／ｍｌ）番号　３日後　１０日後ＩＡ　２８　５８３　’　２０　３１ｗｔ　５　１３４．２誘導物質としてキシランを用いた培地中で培養した後のＡｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉ　ｅｒ　Ｎ４０２　ｒｘｙｌＡＪ型（同時）形質転換体（Ａｇ３．１−１４３）の解析キシラン培地中で各々４８時間及び７２時間培養したときの、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　ｐｙｒＧ　Ａｇ３．１宿主株及び７種類のＡＢ１４Ｓ−ｉ　Ｐｙｒ” ″同時形質転換体のキシラナーゼ活性を測定した（表Ｅ参照）　、　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　ｐｙｒＧ　Ａｇ３．１株はキシラナーゼを殆ど産生じなかった（約５０００１１）。７種類の同時形質転換体のうちの４種類について、約３０００００という高いキシラナーゼ活性がみられた。残りの同時形質転換体のキシラナーゼ産生量は幾分低かった。

担キシラン培地中２５℃で培養したときの各時間におけるＡｇ３．１−１４Ｓ及びＡＢ１４Ｓ形質転換体のキシラナーゼ産生量（１０３Ｕ／ｍ１）Ａｇ３．１−１４８　４８時間　７８時間＃１　３６　３６＃６　３１　２０＃１２　２９　２３＃２３　１０　６＄４２　１５　１０＃４４　２１　３０＃４５　ｐｙｒＧ　２２　１８Ａｆ、ｗｔ　３　７Ｎ４０２　３　５ＡＢ４．１　４　５４．３過剰生産されたキシラナーゼ酵素の特徴Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、ａｖａｍｏｒｉのｒｘｙｌＡＪ型多重コピー形質転換体及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ｎｉｇｅｒＮ４０２のｒｘｙｌＡＪ型多重コピー形質転換体の培地中でのキシラナーゼ活性が増大することから、クローニングされた遺伝子がＡＳｐｅｒｇｉｌｌｕＳ　ｎｉｇｅｒ　Ｗａｒ、　ａＷａｍｏｒｉ由来のキシラナーゼをコードしていて、これらの形質転換体が活性型キシラナーゼを過剰産生する能力を有していることが分かる。所望の生成物が存在していることはＡ１１４Ｓ　＃ＩＡの培地のタンパク−化学分析によって明らかとなった。培地中には主として１種類のタンパク質が存在していた。

この主成分の等電点（ｐＩ）及びＮ末端アミノ酸配列は、野生型Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｘｒｏｒｉ株から精製したキシラナーゼのものと同一であった。得られたｐＩ値は、ＤＮＡ配列から導出された組成の１８４残基のアミノ酸からなる成熟型タンパク質について算出されたーと一致していた。ベーキング試験でも、生産されたキシラナーゼは所望の性質を有していることが明らかとなった。

４．４強化培地中で培養した後のＡｓ　ｅｒ　１Ｈｕｓ　ｎｉ　ｅｒｖａｒ、　ａｗｓｍｏｒｉ　（Ａ１１４Ｓ−２）　ｒｇ　ｄＡＪ型形質転換体及びＡｓｐｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　（ＡＢ１４Ｓ−２）　ｒ　ｄＡＪ型形質転換体の解析６種類のＡＢ１４Ｓ−２形質転換体を強化培地中で培養した（表Ｆ）。二三日後に、３種類の形質転換体の培地中で１５０００〜２０００００のキシラナーゼ活性がみられ、残りの３種類の形質転換体では上記活性の半分未満の活性がみられた。野生株は強化培地中ではキシラナーゼを全く産生じなかった。さらに１０種類のＡＢ１４Ｓ−２形質転換体について試験した。そのうちの３種類は４０時間後に約１１０００Ｈのキシラナーゼを産生じたが、この産生量は少なくとも７２時間まで保たれた。他の５種類の形質転換体はこれより少量のキシラナーゼ酵素しか産生ぜず、しかも培地中での＃２１Ｂ株の活性は２４時間以内に９０００１１から００に落ちた。

最高度生能を有するＡＷ１４Ｓ−２及びＡＢ１４Ｓ−２形質転換体の最大産生量が一般に再現性を有することが判明した。ただし、菌糸体が大きな球状で増殖するときには最大値に達しないが、それでも重複型ＡＢ１４Ｓ−２＃５の培養においてはさらに高い最大値がみられた（　１１０００ｔｌではなく１９０００Ｕ）。産生量を表Ｆに示す。

これらの結果から、ｇｐｄＡプロモーターとｘｙｌＡ遺伝子との翻訳融合系を用いると活性型キシラー！２ニゼを生産することができることが分かる。ただし、ｇｐｄＡプロモーターの調節を受けるＡＶｌ、４８−２及びＡＢ１４Ｓ−２形質転換体の強化培地中での産生量は、ＩｘｙＪＡＪ型形質転換体のキシラン添加培地中でのキシラナーゼ産生量よりも低い。

表Ｆ強化培地中２５℃で培養したときの各時間における人Ｗ１４Ｓ−２及びＡＢ１４Ｓ−２形質転換体のキシラナーゼ産生量−（１０’υ／ｍ１）ＡＩＦ１４Ｓ−２２４時間　４８時間　７８時間＃２２Δ零　４　２０　２０＃３６　３　７　７＃３９　本　１０　１６　１２ＡＢ１４Ｓ−２２４時間　４０時間　４８時間　６６時間　７８時間＃２　４　４　９＃５　Δ　３　１１　１．１　１１　１２重復　１５　１６　１９＃１６Δ　３　１０　Ｉｏ　１１　１０＃１７Δ　３　１０　１１　１０　１０＃１８　１　５　８　１０　８＃２１Ｂ　４．　８　９　００ Δ培養を繰返したときに観察された最大；重複型ＡＢ１４Ｓ−２＃５はさらに高い最大値を与える。Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｖａｍｏｒｉ及び形質転換体＾Ｗ１４Ｓ　１４は強化培地中ではキシラナーゼを全く産生しなかつた。

４．５デンプンを誘導物質として用いた培地中での培養後のＡｓｐｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ　（ＡＩＩＬ４Ｓ−３）　ｒｇｌａＡＪ型形質転換体及び、４ｓｐｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ（ＡＢＩ４Ｓ−３）　ｒ　Ｉ　ＡＪ型形質転換体の解析数種のＡＷ１４Ｓ−３型形質転換体と野生型Ａｓｐｅｒｇｉ　１１　ｕｓｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ株をデンプン培地中で培養した（表Ｇ）。９０時間の培養後、ＩＮ類の形質転換体では培地中に６７０００ＬＩ／ｍｌのキシラナーゼ活性がみられ、残る２種類の形質転換体では３６ＱＯＯＵ／ｍｌに達する活性がみられた。分析した６種類のＡＢ１４Ｓ−３型形質転換体の最大産生値はＡ、Ｗ１４Ｓ− ３型形質転換体よりも１日早くみられた。６３時間培養後、１種類の形質転換体の培地中には５１０００Ｕ／ｍｌの活性がみられ、残る２種類の形質転換体は約４３０００υ／ｌｌ＋１の活性がみられた。これらの結果は、ｇｌａＡプロモーターとｘｙｌＡ遺伝子との翻訳融合がうまくいったことを示している。ｇｌａＡプロモーターの調節下のＡＷ１４Ｓ−３及びＡＢ１４Ｓ−３形質転換体は共に強化培地中で、キシラン添加培地中のｒｘｙｌＡＪ型形質転換体とほぼ同じ量のキシラナーゼを産生ずる。

嚢匹デンプン培地中２５℃で培養したときの各時間における［ｇｌａＡＪ型形質転換体ＡＷ１４Ｓ−３及びＡＢ１４Ｓ−３のキシラナーゼ産生量（１，０３Ｕ／ｍ１）４０時間　６３時間　９０時間ＡＷ１４Ｓ−３＃４　８　３１　３６＃７　１６　４９　６７ＡＢ１４Ｓ−３＃　４．　２３　５１　２９＃５　１９　３７　２１＃？　２３　４４　１８＃８１７２８３２＃１４　２１　４３　１９＃１６　６　２１　１０４．６小麦フスマ添加培地中で培養した後の［ｘＩＡＪ型形質転換体の解析得られた結果（表Ｈ及び表工）から、小麦フスマ添加培地中で培養したときのＡＷ１４Ｓ　＃４で観察される産生量がキシラン培地における場合よりも高いことは明らかである。

ＡＢ４．１−１４Ｓ型（＃１及び＃４４）及びＡＢ１４Ｓ型（＃５及び＃１４）の形質転換体で高い産生量が得られた。これらの形質転換体で得られたキシラナーゼ活性は１４００００Ｕ／ｍｌと高かった。

これから、キシラン培地中での産生量（３０００００／ｍｌ）　ｌこ比べると格段に増大していることが分かる。さらに、前述のキシラン培地中のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉのｒｘｙｌＡＪ形質転換体でも観察されたように、培養時間を延ばしてもこれらのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ形質転換体の産生量が維持されるということＬ判明した。

４．７小麦フスマ添加培地中で培養した後の［ｄＡｊ型形質転換体の解析ＡＷ１４Ｓ−２＃２２及び＃３９は２８０００１Ｊ／ｍｌに達するキシラナーゼを産生じた。ＡＢ１４Ｓ−２１５及び＃１７は小麦フスマ添加培地中では、強化培地でみられたのと同様に、比較的少量のキシラナーゼ（最大で１５００００／ｍｌの活性）しか産生じなかった。産生量を表■及び表■に示す。

４．８小麦フスマ添加培地中で培養した後の［１ａＡ］型形質転換体の解析試験したＡＷ１４Ｓ−３形質転換体（＃１及び＃７）は小麦フスマ添加培地中でそれぞれ２５００００／ｍｌ及び４５０００Ｕ／ｍｌに達するキシラナーゼを産生じたが、これらの値は共にデンプン中で観察された値の約６０〜６５％である。しかし、ＡＢ１４Ｓ−３形質転換体（＃４及び＃１４）では、デンプン培地中よりも高い産生量が小麦フスマ添加培地中でみられた。

測定産生量はデンプン中よりも１．５倍高かった。ＡＢ１４Ｓ−３では７２０００Ｕ／ｍｌの産生量が得られた。ＡＢ１４Ｓ−３＃１４では６６０００Ｕ／ｍｌという値が観察された（表工）。

老」小麦フスマ添加培地中２５℃で培養したときの各時間における数種のＡＶ及びＡＢ　ｒｘｙｌＡＪ及びｒｇｐｄＡＪ型形質転換体のキシラナーゼ産生量（１０’ Ｕ／ｍ１）４０時間　６３時間　４日　７日　１２日Ａ１ｗｔ　１　２　１６　１７ＡＷ１４Ｓ＃４　８　２０　２７　６１　８０ＡＢ１４Ｓ＃１４　６　７４　１１４　１２６　１２２ＡＢ４．１−１４Ｓ＃１　１７　８７　１２３　１３５　１４５ＡＷ１４Ｓ−２＃２２　１，７　２２　２２　３４　３３１Ｗ１４ｓ−２＃３９　１８　２２　２１　２４　２０ＡＢ１４Ｓ−２＃５　１３　１５　１１　８　８ＡＢ１４Ｓ−２＃１７　９　１３　１１　７　７表工小麦フスマ添加培地中２５℃で培養したときの各時間における各種Ａｔ及びＡＢ型形質転換体のキシラナーゼ産生量（１０’Ｕ／ｍ１）２日　３日　４日　７日　９日　１４日Ａｆｗｔ　２　８　１０　１１Ｎ４０２ｖｔ　４　２　１１ｆ１４Ｓ＃ＩＡ　１８　３９　５１＃４　３４　６７　７６　７６Ｂ１４Ｓ＃５　４５　８０　１００　１１１　１０９　１１８＃１４　４５　７７　７９　１００　９２ＡＢ４．１−１４Ｓ＃１　９５　９０　７３＃４４　１２１　１４４　１４８　１４５ＡＷ１４Ｓ−２＃２２　２２　２９　２９＃３９　１７　１６　２８ＡＢ１４Ｓ−２＃５　１５　１４　１２　− Ａｆ１４Ｓ−３＃１　１８　２６　２５＃７　３７　４５　４５　４１ＡＥ１４Ｓ−３＃４　７２　５４　４４　２３　１７＃１４　６４　６６　６９　５５　５５　５５４．９結果の評価表Ａにまとめた結果は、キシラン及び小麦フスマを誘導物質としてそれ自身のｘｙｌＡプロモータニーを誘導すれば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉの多重コピー形質転換体（Ａｆ１４Ｓ）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒの多重コピー形質転換体（ＡＢ１４Ｓ）が活性型キシラナーゼを過剰産生じ得ることを示している。ｘｙｌＡ遺伝子がｇｐｄＡブロモ−の多重コピー形質転換体（Ａｆ１４Ｓ−２）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２株の多重コピー形質転換体（ＡＢ１４Ｓ−２）並びにｘｙｌＡ遺伝子がｇｌ　ａＡプロモーターの調節下にあるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ株の多重コピー形質転換体（Ａｆ１４Ｓ−３）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２株の多重コピー形質転換体（ＡＢ１４Ｓ−３）によるキシラナーゼの発現実験は広範な基質の下でキシラナーゼが産生され得ることを示している。種々の形質転換体でその産生能に違いがみられるのは、コピー数の差及び／又はゲノムへの組込み部位の差に起因するものと考えられる。熱論、実験条件もキシラナーゼ産生量にかなりの影響を与えるであろう。しかし、産生量を最適化するためには、比較的産生力の高い菌株のほうが好ましい。

５材料及び方法５．１菌株及びプラスミド上記実験には下記の菌株及びプラスミドを使用した。

−ＡｓｐｅｒｇｉｌＪｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、ａｗａｍｏｒｉ　ＣＢＳ　１１５．５２株、ＡＴＣＣ１１３５８； −Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２株、これはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、ｎｉｇｅｒ−ＡＴＣＣ９０２９のｃｓｐＡｌ　（短分生子柄）変異株である、ＣＢＳ　１２０．４９　； −Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　ＡＢ４．１、これはＶａｎＨａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ他、　１ｄｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０６．　７ｌ−７５（１９８７）に記載されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒＮ４０２株のｐｙｒＧ変異株である； −大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（プラスミドの単離に使用、Ｙａｎｉｓｃｂ−Ｐｅｒｒｏｎ他、　Ｇｅｎｅ　３３．１０３−１１９（１９１１ｉ５）参照）；一大膓菌（Ｅｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＮＭ５３９株（ｌ遺伝子ライブラリーの構築及び増幅に使用）；一プラスミドｐＧＷ３２５、これはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓのａｍｄｓ遺伝子を含有する、Ｋ、　１ｅｒｎａｒｓの“ＤＮＡｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｕｓ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ″と題する学位請求論文（ヴアーケニンゲン農業大学（１９８６））参照；−プラスミドｐＡＢ４．１、これはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２株のｐｙｒＧ遺伝子を含有する、ＶａｎＢａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ他、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ−２０６，７ｌ−７５（１９８７）参照；一プラスミドｐＡＮ５２−１、Ｐｕｎｔ他、　Ｇｅｎｅ　５６．　１１７−１２４（１９８７）に記載；及び一プラスミドｐＡＮ−５２−６、Ｐ、Ｊ、　Ｐｕｎｔ他、Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、１ｎｐｒｅｓｓに記載ニーベクターλ−ＥＭＢＬ３　ＣＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａ　ｖａｍｏｒｉ遺伝子ライブラリーの構麹に使用）、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、社から入手可能。

プラスミドルＡ１１４Ｂ保有大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉａ　ｃｏｌｉ）Ｊ輩１０９株は、１９９０年５月３１日に受託番号ＣＢＳ　２３７．９０として、オランダ国バーン（Ｂａａｒｎ）のＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒＳｃＭｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ　（ＣＢＳ）に寄託された。

５．２　Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒの形質転換Ｎｏｖｏｚｙｍ　２３４（Ｎｏｖｏ社）を用いてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉの菌糸体からプロトプラストを調製した。

プロトプラストの収率は菌糸体１ｇ当り１〜５Ｘ１０’個であり、生存率は３〜８Ｘであつた。形質転換については、３〜８ｘ１０５＠の生存能力を有するプロトプラストを、ＣｓＣ１で２度精製しておいたプラスミドＤＮＡ　５ｍｇ、　１０ｍｇ又は２０ｍｇとインキュベートした。形質転換したプロトプラストを、浸透性に関して安定化した選択プレート（窒素源としてアセトアミドを用いる）上に接種して、２５℃でインキュベートした。６〜１０日後にコロニーが視認できた。

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２及びＡ、ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　ＡＢ４．１の各々の形質転換は原則的に上記と同様に行なった。ただし、Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　ｐｙｒＧＡＢ４．１の場合には、培地中にウリジンを添加した。Ａ。

ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　Ａ８４．１の同時形質転換においては、ｐＡＷ１４ｓ及びｐＡＢ４．１のＤＮＡを重量比４：工の割合で混合し、各々、ウリジン添加アセトアミドプレート（ａｍｄＳ選択）、ウリジン無添加アセトアミドプレート（ａｍｄｓ及びｐｙｒＧ選択）及び硝酸塩添加最小培地プレート（ｐｙｒ（Ｊｊ択）上で形質転換株を選択した。４〜５日後にコロニーが視認できた。

（同時）形質転換株はアセトアミドプレート上に２度画線接種（ｓｔｒｅａｋ）　Ｌ、た。大量の胞子を得るため、２度目の画線接種で得られた胞子を強化培地プレート上に画線接種して２５〜２８℃で５〜６日間インキュベートした。得られた胞子は、胞子が長期間保存できるように懸濁液中に保存（１０８〜１０９１１Ｎの胞子／ｍｌ）又はシリカゲルに吸着させた。

５．３　Ａ、　ｎｉ　ｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ遺伝子ライブラリーの構築ＡｓｐｅｒｇｉＪ１ｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉの菌糸体から染色体ＤＮＡを単離した。この高分子ＤＮＡを５ａｕａＡ］で部分的に切断し、０．４％アガロースゲル電気泳動を行なった後、１３〜１７ｋｂの断片を単離した。これらの断片の０．４ｍｇを、ＥａｍＨｌ及びＥｃｏＲＩで切断しておいたλ−ＥＭＢＬ３　ＤＮＡ　１．２ｍｇと連結した。インビトロパッケージングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いてこの連結混合液にファージコートを与えた。大腸菌、ＮＭ５３９に形質導入することによって、約１５４０００個のプラークからなる遺伝子ライブラリーが得られた。これらは、Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉのゲノムの約７５倍に相当する。６５０００個のプラークをニトロセルロースフィルターにトランスファーした（重複実験）。

５．４ハイブリダイゼ一シヨン実験サザンブロツテイング分析：Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ染色体ＤＮＡの消化物と放射性標識オリゴヌクレオチド混合物Ｘｙ１０４及びＸｙ１０６　（４７ｍａｒ）とのハイブリダイゼーションは、５ＸＳＳＣ中、−６８℃、６２℃及び５６℃の各温度で行なった。ただし、ＸｙｌＯｌ及びｘｙｉｏｓ（５５ｍｅｒ）についてのハイブリダイゼーション温度としては４１℃を用いた。選択したハイブリダイゼーション温度は計算上の融解温度よりも少なくとも５℃低い。プロットは各々５ＸＳＳＣ及び３ＸＳＳＣを用いてハイブリダイゼーション温度で洗浄した。ハイブリダイゼーションは５ＸＳＳＣ中６８℃で行なったが、最終洗浄段階は同じ温度で各々２ｘＳＳＣ及び０．４ＸＳＳＣを用いて行なった。

ノーザンブロツティング分析；強化培地で培養（２５℃で３日間培養）したＡ、　ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉの菌糸体から、該菌株の非誘導的ＲＮＡ全体を単離した。誘導的ＲＮＡは、１％キシラン又は４％小麦フスマを誘導物質として用いた培養液から得た。

異なる培養時点でこの培養液から菌糸体を回収した。小麦フスマ培地から３日及び６日後にそれぞれ菌糸体を単離した。キシラン培地の菌糸体は培養６日及び１１日目に回収した。ハイブリダイゼーションの条件はサザンブロッティング分析で用いた条件と同一であった。

５．５培養条件培地：キシラン培地は、１％のキシラン、０．６７％のアミノ酸入り酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）及び約０．１％のアミノ酸を含んでいる。小麦フスマ添加培地は、５０ｍ１の水道水に４ｇの小麦フスマを溶解して、これに、最終濃度が０．５％（ＮＨ４）２ｓｏ４．０．１５％　Ｋｆｌ、ＰＯ４，０，０２５％　ＭｇＳＯ４及びｏＴｏ２ｓ％ＫＣ１，！＝ｌｊるように５０ｍ１の塩溶液を添加したものである。発現試験用の強化培地は、最小培地（０，０５％ＩＩＩｇＳ０４．０．６％ＮａＮＯ３，０，０５％ＫＣＩ、０．１５％ＫＨ２ＰＯ４及び微量元素）と、１駕のグルコース、０．２％のトリブチカーゼ（ＢＢＬ社）、０．５％の酵母エン培地は最小培地中に５％のデンプン及び０．１％のグルコースを含んでいる。これらの培地は１２０℃で３０分間滅菌した。培地（５００ｍｌフラスコ中の１０ｈｌ）に２Ｘ１０’個／ｍｌの胞子を接種し、２５℃の通気式培養装置（３００ｒｐｍ）中で培養時間を変えて培養した。誘導物質として小麦フスマを用いる培養（表工）では４Ｘ１０５個／ｍｌの胞子を接種した。

５．６　Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ培養液の培地中のキシラナーゼ活性の測定キシラナーゼ活性は還元性の糖の生成を定量することによってめた。

手順：（稀釈）培地試料を４０℃で２％キシラン（Ｓｉｇｍａ社）の０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）溶液１２５ｘｌに加え、続いてこの反応混合物を４０℃で３０分間インキュベートする。

０、５ｍｌの２−ヒドロキシ−３，５−ジニトロ安息香酸（ＤＮＳ）試薬で反応を瞬時に停止し、水を加えて容積を１ｍｌとする。

この反応混合物を１００℃で５分間加熱して室温まで冷却する。ブランクと対照して５３４ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）をめる。キシラナーゼ活性の測定は一つの試料について少なくとも２回行なった。稀釈用溶液と口では０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＥＩ　５．０）を使用した。

５．７形質転換体の選択数多くの形質転換体の分析には、宿主株並びに一系統から得られた形質転換体約６種を強化培地又は選択培地中・で培養して、キシラナーゼ産生量の測定を行なった。

各系統から得られた形質転換体のうち最高キシラナーゼ産生量を示す形質転換体２種類については、同じ培地中で再度分析した。さらに、これらの形質転換体の小麦フスマ添加培地中における産生量も測定した。

５．８発現ベクターの構築ｐＡＷ１４ｓ　（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ｎｉｇｅｒ　ｘｙｌＡプロモーター付）：発現ベクターｐＡＷ１４ｓ（図４）は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓａＩＩｄｓ遺伝子が位置しているプラスミドｐＧ１３２５の５．０ｋｂＥｃｏＲＩ断片を、ｐＡＷ１４Ｂ　（図３）のポリリンカーのＥｃｏＲ１部位に挿入することによって構築した。ｐＡｎ４ｓにおいてはａｍｄｓ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子は同じ転写方向を有する。

ｐＡ１１４８−２　（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　ｇｐｄＡプロモーター付）：ｐＡＷ１４ＢをＮｃｏ　Ｉで部分消化し５ｚａｌで完全に消化して得たｐＡｆ１４Ｂの７．２ｋｂ　Ｎｃｏビー５ｒｎａ　Ｉ断片に、Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　ｇｐｄＡプロモーター（ＡＴＧトリブレットまで）が位置しているｐＡＮ５２−１の線状１．８ｋｂ　５ｔｕＩ−Ｎｃｏｌ断片を連結した。大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した結果、プラスミドｐＡＷ１４Ｂ−１（９，０ｋｂ）が単離された。

ｐＡｆ１４Ｂ−１をＮｃｏｒで部分消化しＮｒｕ　Ｉで完全に消化して得られたｐＡｆ１４Ｂ−１のＮｒｕＩ”−ＮｃｏＩ”を、ＡＴＧトリプレットから始まるｘｙｌＡ配列からなる合成断片（７９ｂｐ、コード鎖のヌクレオチド１〜７８及び鋳型鎖のヌクレオチド４〜７８）に連結してｐＡ１１４Ｂ−２（図５）を得た。

ｐＧｆ３２５の５．Ｏｋｂ　ＥｃｏＲ１断片（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｒ；　ｎ１ｄｕｌａｎｓａｘｔｄｓ遺伝子）をｐＡｆ１４Ｂ−２のユニークＥｃｏ８１部位に導入してｐＡ１１４ｓ−２（図６）を得た。このプラスミドではａｍｄｓ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子は同じ転写方向を有する。ｇｐｄＡブロモ・−ターのｘｙｌＡ遺伝子のＡＴＧコドンとの接続並びに合成断片の配列は、ＤＮＡ配列解析によって照合した。

ｐＡ１１４ｓ−３（Ａ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２　ｇｌａＡプロモーター付）：ｐＡＮ５２−６をＸｍｎ　Ｉで部分切断した（３部位）　。Ａ、　ｎｉｇｅｒｗａｒ、　ｎｉｇｅｒ　Ｎ４０２　ｇｌａＡプロモーターが位置する線状７、５ｋｂＩＦｒ片を単離した。この断片をＥｓ５ＦｉＴ１で切断した後、７、３５ｋｂ　Ｂｓ５Ｈｎ−ＸｘｒｎＩ断片を、ｇｌａＡプロモーターノ３′末端（ＡＴＧトリブレットに至るまで）及びそれに続＜　ｘｙｌＡ遺伝子のＡＴＧ　トリプレットからＮｒｕ１部位までを含んでいてその後にＥｓ５ＦｉＴ１末端を有する合成りＮＡ断片（約１５０ｂｐ）と連結した。このようにして得られたプラスミドｐＡＮ５２−６、ＵＲＬをＮｃｏ　Ｉ及びＮｒｕ　ｌで切断し、Ｎｃｏ１部位の突出部分を埋めた（平滑化）。ｐＡＮ５２−６．　ＵＲＬ中の合成断片のＤＮＡ配列をチェックした。ｐＡＮ５２−６．　ｔｌＲＬ由来の２．５ｋｂ　ｒ平滑化ＮｃｏＩＪ−ＮｒｕＩ断片とｐＡＩＩ＋１４ｓの約１０ｋｂ　Ｎｒｕｌ断片との連結によッテ、ｇｌａＡプロモーターをｘｙｌＡ遺伝子の前に置いた。この断片を正しい方向で挿入することによってｐ″Ａ？１４　Ｓ　−３を得た（図７）。

発酵培地から単離して得たキシラナーゼのパン改良活性は、添加量を種々増加させながら酵素を生地に添加してベーキングしたベルギーロールパンの体積の増加を測定することによって試験した。キシラナーゼは次のようにして単離した。

稼働容積８リツトルの発酵槽内で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ形質転換体Ａｆ１４Ｓ、　ＩＡを４％小麦添加培地中で７日間培養した。キシラナーゼ産生量は約８５０００υ／ｍｌでありた。布で濾過して菌体を除去した。６リツトルの濾液に撹拌しながら硫酸アンモニウムを５０重量％となるまで添加した。沈殿を５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳＡローターを用いて２０分間１１００００Ｘで遠心した。ペレットを５００ｍ１の蒸留水に懸濁して、再度１１００００Ｘで遠心した。この上清を、Ａｍ１ｃｏｎ　ｐＭ１０限外濾過膜による限外濾過によって容積が６０ｍ１となるまで濃縮した。硫酸アンモニウムを取り除くため、蒸留水で２度それぞれ３００ＩＩｌｌ及び６００ｍ１まで稀釈して限外濾過を繰返した。最終的に得られた容積５０ｍ１の標品を凍結乾燥した。収量は４．８ｇで比活性は６００００Ｕ／ｍｇであった（全体の５６％）。ベーキング試験に使用するため、このキシラナーゼをデンプンと混合して濃度２４００／ｍｇとした。

ｘｏｏｏｇの小麦粉Ｂａｎｋｅｔ　Ｅｘｔｒａ　（Ｗｅｓｓａｎｅｎ社製）に、水６００ｍ１．食塩２０ｇ１砂糖（スクロース）　２０ｇ、酵母（ＧｉｓｔＢｒｏｃａｄｅｓ社のＫｏｎｉｎｇｓｇｉｓｔ）　５０ｇ及びキシラナーゼ（２４０Ｕ／ｍｇ）を０．５０．１００又は２００ｍｇ／ｋｇ添加した。これらの生地を、Ｅｂｅｒｈａｒｄｔニーグー中で生地温度を２４℃とを混捏し、約５０ｇの小さな生地に分割し、３５℃〜３８℃の膨化室中で６０分間再発酵させた。次いで、それぞれの生地を２３０℃で２０分間ベーキングした。比容積（ｍ１７ｇ）は、容積（ｍｌ）を重量（ｇ）で割ってめた。

１０個のロールパンを平均した結果を以下に示す。

酵素量　０　５０りｐ１１１　１０ｈｌ）ｍ　２００ｐｐｍ比容積　６．８７．９　ｇ、７　８．９ビタミンＣ１脂肪、乳化剤及びα−アミラーゼなどの他の改良成分をさらに添加しても同じ傾向がみられる。キシラナーゼ酵素の添加により、生地の加工性やスダチなどの他の性質も好影響を受ける。

実施例３Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるＡｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ由来キシラナーゼの生産微生物によるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉのキシラナーゼの異種生産の一興体例として、誘導的ＧＡＬ　７プロモーター（Ｎｏｇｉ及びＦｕｋａｓａｖａ　（１９８３））の調節によるキシラナーゼのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での発現のための各種発現ベクターを構築した。ＧＡＬ７プロモーターは誘導的条件下、即ち、ガラクトースを唯一の炭素源とする培地中での増殖（Ｈｏｐｐｅｒ及びＲｏｖｅ　（１９８５））で、酵素の産生をもたらす。このプロモーターを異種タンパク質の誘導的産生に用いることについては文献に既に記載されている（Ｔａｊｉｍａ他（１９８５））　、まず最初に、合成りＮＡ断片を用いてイントロン（非コード配列）を除去することによって、キシラナーゼのコードされたカビ遺伝子をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での発現に適したものとした。同じ手法を用いて、キシラナーゼ遺伝子をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＧＡＬ７プロモーターに正確に接続した。任意段階ではあるが、カビ由来酵素であるキシラナーゼの酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる分泌を実現するため、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのシグナル配列であるインベルターゼシグナル配列も導入した。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉキシラナーゼの生産には、自律複製ベクターのみならず（多重コピー）組込みベクターも使用した。

すべてのクローニング操作は大腸菌ＪＭ１０９　（Ｊａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他（１９８５））の中で行ない、すべての方法及び手法はＭａｎｉａｔｉｓ他　（１９＆２）に従った。

ベクターＵＲ２９０１の構築最初の中間体の構築はキシラナーゼ遺伝子からイントロンを正確に、即ち、コード配列を変化させたり乱すことな（、除去することに関するものであった。図８に示す合成りＮＡオリゴヌクレオチド（ＢＡＮ　０２．０３．０４．０５．０６．０７．０８．０９．１０．２３及び２４）をアニニルして一緒に連結して断片ＢＡＩＬを得た。断片ＢＡＫＩは２０５ｂｐで、５ａｃｌ−Ｋｐｎ　Ｉキシラナーゼ断片（ｂｐ　１．！１５〜ｂｐ　４２７）を含んでおり、これからはイントロンが除去されている。合成りＮＡオリゴヌクレオチドは、イントロンの除去に際して上記諸断片が正しく接続して（キシラナーゼをコードする）読み取り枠に乱れが生じないように設計されたものである。

その後の構築を簡単にするため、５ａｃｌ部位をＸｈｏ１部位に変えた。断片の５′側にはＥｃｏＲ１部位が与えられている。

連結混合物を制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、断片分離のためのアガロースゲル電気泳動及びアガロースゲルからの断片単離のためのゲル溶離によって適正な２０５ｂｐ断片を単離した。このＫｐｎＩ−ＥｃｏＦＩＴ　ＢＡＩＬ断片をｐＴ２１９Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から入手）のＫｐｎＩ及びＥｃｏＲ１部位にクローニングして、ｐＢＡＫｌ　（図９参照）を得た。このようにして構築したプラスミドｐＢＡＫ１に挿入された断片は配列解析によってチェックした。

これに続く構築は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｗａｍａｒｉキシラナーゼ遺伝子を５ａｃｃｂａｒｏｎｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＧＡＬ７プロモーターに適切に接続することに関するものであった。

このため、図１０に示す合成りＮＡオリゴヌクレオチド（ＢＡＫ１３．１４．１５．１８．１９．２０．２１．２５．２６．２７及び２８）をアニールして連結し、断片ＢＡＫ２を得た。この断片ＢＡＫ２は２０２Ｊｌで、５ａｃｌ部位から始まるＧＡＬ７の合成変異、インベルターゼのシグナル配列を経て、５ａｃｌ　（ｂｐ　１８５）部位に至るまでの成熟型キシラナーゼ遺伝子を含んでいる。その後の構築を簡単にするため、ｐＢＡＫｌの構築に用いたのと同じ手法で５ａｃｌ部位をＸｈａ１部位に変えた。断片の５′側にはＥｃｏＲ１部位が追加されている。連結混合物をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化して、適正なびＸｈｏＴで消化して、これと同じ末端を有するＢＡＫ２断片をこのベクター断片にクローニングして、プラスミドによりチェックした。プラスミドｐＢＡＫ２１において、断片ＢＡＫＩ及びＢＡＫ２のＸｈｏ１部位への接続はキシラナーゼをコードする読み取り枠が正確に保たれるように行なわれた。

従って、プラスミドｐＢＡＫ２１は、５ａｃｌ部位から始まるＳａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＧＡＬ７プロモーター変異、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼシグナル配列（ＡＴＧ開始コドンを含む）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ。

Ｂｖｔａｍｏｒｉキシラナーゼ遺伝子（成熟型キシラナーゼをコードするもの）を含んでおり、このプラスミドからはカビ由来イントロン（非コード配列）がＫｐｎ１部位（キシラナーゼ遺伝子の５′側部分）まで適正に取り除かれている。

プラスミドｐＡＷ１４ＢをＫｐｒｔＩ及びＲａｍ旧で消化して、キシラナーゼ遺伝子の３′側部分を含む３２７ｂｐ　Ｋｐｎｌ−Ｅａｍ旧断片を単離した。プラスミドｐＢＡＩ［２１をＫｐｎ　ｌ及びＢａｔｔｔＨＩで同様に消化してベクター断片を単離した。単離された上記３２７ｂｐ断片とベクター断片を連結してプラスミドｐＵＲ２９０１を得た（図１２）。プラスミドｐｕｉｉ９ｏｔを制限酵素分析でチェックした。プラスミドｐＵＲ２９０１は、５ａｃｌ部位のＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＧＡＬ７プロモーター融合部位、Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼ配列（ＡＴＧ開始コドンを含む）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉキシラナーゼ含んでおり、これからはカビ由来のイントロン（非コード配列）が正確に取り除かれている。

Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターＵＲ２９０４の構築発現ベクターｐＵＲ２９０４の構築はプラスミドｐＵＲ２７４０から出発した。プラスミドｐＵＲ２７４０はＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でのα−ガラクトシダーゼの産主に使用されたｐＵＲ２７３０（Ｏｖｅｒｂｅｅｋｅ　（１９８７））から誘導されたプラスミドである。

プラスミドｐＵ！？２７４０はｐＵＲ２７３０と基本的には異なるものでなく、ベクターの非機能的部分の若干の余分な配列が取り除かれたものである。プラスミド゛ｐＵＲ２７４０は大腸菌／Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクターである。２ｊｍ複製起点を用い、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＬＥＵ２ｄ遺伝子をＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での選択遺伝子として用いた。プラスミドｐＵＲ２７４０を５ａｃｌ及びＨｉｎｄｍで消化して、ベクター断片を単離した。

この消化の結果としてα−ガラクトシダーゼ遺伝子が除去された。プラスミドｐＵＲ２９０１も同様に５ａｃｌ及びＨｉｎｄＭ　ｔ’消化して、５ａｃｌ部位のＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＧＡＬ７プロモーター融合部位、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼ配列（ＡＴＧ開始コドンを含む）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ。

ａｖａｍｏｒｉキシラナーゼ遺伝子（成熟型キシラナーゼをコードするもの）全体を含む７３０ｂｐの断片を単離した。

ｐＵＩ？２７４０ベクター断片とｐＵＲ２９０１の７３０ｂｐ断片を連結してｐＵＲ２９０４（図１３）を得た。プラスミドｐＵＲ２９０４は制限酵素分析でチェックした。プラスミドｐＵＲ２９０４は、酵母Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによってＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉキシラナーゼを生産するための発現ベクターである。プラスミドｐＵＲ２９０４は大腸菌／Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉ　５ｉａｅシヤトルベクターである。このプラスミドは、キシラナーゼをコードするＤＮＡ配列及びこのＤＮＡ配列と融合したインベルターゼシグナル配列を含んでおり、インベルターゼシグナル配列はキシラナーゼの分泌をもたらす。ｐＬＩＲ２９０４に存在する上記ＤＮＡ配列は、野生型Ａ。

ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ株と全く同じキシラナーゼをコードする。得られた融合タンパク質は分泌時に原則的にＳａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのシグナルペプチダーゼによるプロセッシングを受けて、分泌後、成熟型キシラナーゼ酵素となるものと考えられる。キシラナーゼの発現はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのガラクトース誘導的ＧＡＬ７プロモーターによる調節を受ける。

Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるＡ、　ｎｉ　ｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｒｎｏｒｉキシラナーゼの生産の解析スフ　エ０プラスト法（Ｂｅｇｇｓ　（１９７８））を用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　５ＬＩＩＯ株（ａ、１ｅｕ２．　ｕｒａ３．　ｈｉｓ３．　ｃｉｒ”；受託番号ＣＢＳ　３２３．８７としてＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（オランダ国、ＡＧ　３７４０バーンＰ、０゜Ｂｏｘ　２７３）に寄託）をプラスミドｐＵＲ２９０４で形質転換した。

得られたｌｅｕ＋形質転換酵母をキシラナーゼの存在について分析した。この酵母細胞をウラシル及びヒスチジンを添加したｌ［Ｍ培地（０，６７％酵母窒素ベースＷ１０アミノ酸、胞を容積が１０倍のＹＰＧ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、５％グルコース）に移植し、定常期に達するまで増殖させた。酵母細胞は３０℃で振盪培養した。遠心で菌体を培地から分離した。実施例１に記載の酵素アッセイ法でキシラナーゼの存在を調べた。キシラナーゼの発現量は培地１ｍｌ当り約１００００Ｕであった。等電点電気泳動（実施例１参照）によって、５ａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの産生するキシラナーゼが野生型Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｖｔａｍｏｒｉの産生するキシラナーゼと同一であることが判明した。５ａｃｃｈａｒｏｘｒｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによって産生ｅ分泌されたキシラナーゼが機能的であることは、実施例２に記載した通りのベーキング試験で明らかとなった。上記の結果は５ａｃｃｂａｒｏｘｒｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉのキシラナーゼを効率的に産生じかつ分泌する能力を有することを示している。

Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクター０Ｒ２９２１の構築（多重コピー組込みベクター系を用いて、５ａｃｃｈａｒｏｔｒｈｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉキシラナーゼ遺伝子の発現をさらに研究した。このため、高コピー数組込み系を使用した（Ｌｏｐｅｓ　（１９８９））。

発現ベクターｐＵＲ２９２Ｌの構築はプラスミドｐＵＲ２７７Ｂから出発した。

プラスミドｐｔ！Ｒ２７７８はＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのリポソームＲＮＡ座に組込まれる多重組込みプラスミドである。

これをＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のα−ガラクトシダーゼ発現カセットの安定な多重コピー組込みに用いた。このプラスミドは大腸菌内での複製及び選択のためのベクター配列及び酵母選択のためのＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＬＥＵ２ｄ遺伝子も含んでいる。プラスミドｐＬＩＲ２７７８はｐＭＩＲＹ２　（Ｌｏｐｅｓ　（１９８９））から誘導されたプラスミドであり、ＳｐｉｒｏｄｅｌｌａｏＪｉｇｏｒｈｉｚａ　ＤＮＡを含有するＳｍａＩ−Ｂｇ１ｍ断片が取り除かれており、ｒＤＮ＾配列の一部を含有するＢａｘｉ旧−Ｈｉｎｄｍ断片がｐＵＲ２７３０（Ｏｖｅｒｂｅｅｋｅ　（１９８７））　（７）ＩＩ−ガラクトシターセ発現カセットを含有するＢｇｌ　ＩＦ−Ｈｉｎｄｍ断片で置換されている。プラスミドｐＵＲ２７７８を５ａｃｌ及びＨｉｎｄｍで消化し、アガロースゲルからベクター断片を単離した。この消化により、インベルターゼシグナル配列を含有するａ−ガラクトシダーゼコード配列が除去された。このベクター断片を、ｐＵＲ２９０４の構築にも使用したｐＵＲ２９０１由来の７３０ｂｐＳａｃＩ−Ｈｉｎｄｍ断片と連結して、プラスミドｐＵＲ２９２１（図１４）を得た。ｐＵＲ２９０１の７３０ｂｐ　ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＭ断片は、５ａｃｌ部位のＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＧＡＬ７プロモーター融合部位、Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼ配列（ＡＴＧ開始コドンを含む）及びＡ、　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉキシラナーゼ遺伝子（成熟型キシラナーゼをコードするもの）全体を含んでおり、カビ由来のイントロン（非コード鎖）が適正に取り除かれている。プラスミドｐｔｌＲ２９２１は制限酵素分析でチェックした。プラスミドｐＵＲ２９２１は、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｖａｍｏｒｉキシラナーゼを生産するための発現ベクターである。プラスミドｐＵＲ２９２１は、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体ＤＮＡのリポソームＤＮＡ座の配列を含んでいる。このプラスミドは酵母の複製起点を全く含んでいないので、ベクターはＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換したときにリポソームＤＮＡ座に組込まれるものと思われる。

プラスミドｐＵＲ２９２１でＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｌｅｕ２株を形質転換すると、選択的条件下ではプラスミドｐＵＲ２９２１のＬＥＵ２マーカー遺伝子の発現レベルが低いために多コピー数のベクターが組込まれる。このプロセスの結果、酵母染色体に多コピー数のキシラナーゼ発現カセットが存在するものと思われる。キシラナーゼ発現カセットはｐＵＲ２９０４プラスミドにおけるものと全く同一であるので、このＳ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株はｐＵＲ２９０４プラスミドを保有するＳ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株と同様に成熟型キシラナーゼを分泌するものと思われる。

Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによるＡ、ｎｉ　ｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉキシラナーゼの生産の解析スフェロプラスト法を用い、ＨｐａＩで線状化したプラスミドｐｔｌＲ２９２１でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　５Ｌ１５０株　（ＹＴ６−２−１．　ａ。

１ｅｕ２．　ｂｉｓ４．　ｃａｎｌ、ｃｉｒｏ；　Ｅｒｈａｒｔ及びＢｏｌｌｅｎｂｅｒｇ（１９８１））の酵母菌を形質転換した。５ＵＩＯ株の酵母菌について述べた方法で、得られたｌｅｕ“形質転換酵母をキシラナーゼの存在について分析した。これらの酵母菌に対しては、■培地にはヒスチジンしか添加しなかった。キシラナーゼの発現量は、培地１ｍｌ当りの分泌量として約６００００Ｕであった。

引用文献Ｂｅｇｇｓ、Ｊ、Ｄ、（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２７５．１０４−１０９　（１９７８）Ｅｒｈａｒｔ、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ　（１９８１）　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　旦、　８３−８９Ｈｏｐｐｅｒ、　Ｊ、Ｂ、及びＲｏｖｅ、　Ｌ、Ｂ、（１９７８）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５３、７５６６−７５６９Ｌｏｐｅｓ、　Ｔ、Ｓ、、　Ｋｌｏｏｔｗｉｊｋ、　Ｊ、、　Ｖｅｅｎｓｔｒａ、　Ａ、Ｅ、、　ｖａｎｄｅｒ　Ａａｒ、　Ｐ、Ｃ，、ｖａｎ　Ｈｅｅｒｉｋｈｕｉｚｅｎ、　Ｂ、、　Ｒａｕｓ、　Ｈ，Ａ、及びＰｌａｎｔａ、　Ｒ，Ｊ、（１９Ｈ）　Ｇｅｎｅ　７９．　１９９−２０６Ｍｌ９９−２Ｏ６，Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ。

（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行）Ｎｏｇｉ、　Ｙ、及びＦｕｋａｓａｖａ、　Ｔ、（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１１．８５５５−８５６８０ｖｅｒｂｅｅｋｅ、　Ｎ、、　Ｆｅｌｌｉｎｇｅｒ、　Ａ、Ｊ、及びＨｕｇｈｅｓ、　Ｓ、Ｇ。

（１９８７）　ＰＣＴ国際公開ｖｏ８７１０７６４１Ｔａｊｉｍａ、　Ｍ、、　Ｎｏｇｉ、　Ｙ、及びＦｕｋａｓａｗａ、　Ｔ、　（１９８５）　ＹｅａｓｔＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｒａ、　Ｊ、及びＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ。

（１９８５）　Ｇｅｎｅ　３３．　１０３−１０９実施例４Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓによるＡｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎｉ　ｅｒ　ｖａｒ。

ａｖａｍｏｒｉキシラナーゼの生産原核生物によるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｗａｘｏｒｉのキシラナーゼの異種生産の一興体例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓによるキシラナーゼの生産のための各種発現ベクターを構築した。異種タンパク質の生産のための、各種ベクター系、プロモーター及びシグナル配列は公知である。この実施例では、キシラナーゼ酵素の発現のため５ＰＯ２プロモーター及びα−アミラーゼシグナル配列を使用した。この手段は、Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ中での植物ａ−アミラーゼの発現で成功を収めている（Ｏｖｅｒｂｅｅｋｅ　（１９９０））。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓによるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｖａｘｔｏｒｉキシラナーゼの発現用ベクターを構築するためにの出発点として、５ａｃｃｈａｒｏｔｔｘｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でのキシラナーゼ発現のために構築したプラスミドでキシラナーゼ遺伝子のイントロン（非コード配列）が適正に除去されているプラスミド（実施例３参照）を使用した。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓのような原核生物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｗａｍｏｒｉのような真核生物とは異なり、スプライシングと呼ばれるイントロンの除去能力に欠けているため、イントロンの除去は不可欠である。。

ベクターＵＲ２９５０の構築図１５に示す合成りＮＡオリゴヌクレオチド（ＢＡＮ　１５．１８．２６．２７．４１及び４２）をアニールしてこれらを連結して断片ＢＡＫ４を得た。断片ＢＡＫ４は長さ１０７ｂｐで、成熟型キシラナーゼをコードするＤＮＡ配列のＳａｃ１部位（図１のｂｐ１８５）までを含んでいる。その後の構築を簡単にするためにＳａｃ１部位をＸｈｏ１部位に変えたが、得られるアミノ酸配列には変化がない。さらに、その後の構築で成熟型キシラナーゼとａ−アミラーゼシグナル配列とが正しく接続するように、アラニンをコードする成熟型キシラナーゼの最初のコドンを変えた。コドンＧＣＴを、同じくアラニンをコードするＧＣＣに変えた。このようにして、５ａｃＴ１部位がＢＡＫ４断片の５′側に生じる。この５ａｃＴ１部位の作成に続き、ＢＡＫ４断片にＥｃｏＲ１部位を与えた。この連結混合物をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化して、アガロースゲルからＥｃｏＲ１− Ｉｈｏｌ断片を単離した。プラスミドｐＵＲ２９０１（実施例３参照）をＥｃｏＲＩ及びＸｂｏｌで消化し、同一の制限酵素末端を有するこのベクター断片にＢＡＫ４断片をクローニングして、ｐＵＲ２９５０（図１６参照）を得た。ｐＵＩｌ！２９５０に挿入された断片ＢＡＫ４は配列分析によってチェックした。プラスミドｐＬＩＲ２９５０において、Ｘｈｏ　１部位での断片ＢＡＫ４とＢＡＩＬの接続はキシラナーゼの５′部分をコードする読み取り枠が正しく保たれるように行なわれた。さらに、実施例３で述べたように、キシラナーゼ遺伝子のイントロンが正確に除去されている。従って、プラスミドｐＵＲ２９５０は、成熟型キシラナーゼの最初のアラニンコドン（この位置にＳａｃ　ＩＩ部位が作成された）から始まるＤＮＡ配列及び成熟型キシラナーゼをコードするＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ。

ａｗａｍｏｒｉキシラナーゼ遺伝子を含んでおり、遺伝子カビのイントロン（非コード配列）は適正に除去されている。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ発現ベクターＵＲ２９５１の構築プラスミドｐＨＲ２６０１（Ｏｖｅｒｂｅｅｋｅ　（１９９０））を構築ベースとして使用し、ｐＵＲ２９５０中に存在するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉ成熟型キシラナーゼ遺伝子を、生産すべき酵素の分泌のためのα−アミラーゼシグナル配列と融合させた。この融合遺伝子は５ＰＯ２プロモーターの調節を受ける。プラスミドｐＵＲ２６０１を５ａｃＴ１及びＨｉｎｄＴｎで消化して、５ＰＯ２プロモーター及びａ−アミラーゼシグナル配列を有するベクター断片を単離した。成熟キシラナーゼ遺伝子を含むｐＵＲ２９５０のＳａｃＴｌ−Ｈｉｎｄｍ断片を単離し、上記ｐＵＩ１２６０１ベクター断片と連結してプラスミドｐ［１Ｒ２９５１（図１７）を得た。プラスミドｐＵＲ２９５１では、α−アミラーゼシグナル配列が成熟型キシラナーゼ遺伝子と丁度ぴったりと融合していた。プロトプラスト／ＰＥＧ法（Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ　（１９７９））を用いて、連結混合物でＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　０８１０４株（Ｋａｗａｍｕｒｉ及びＤｏｉ　（１９８４））を形質転換し、カナマイシンで選択した。プラスミドｐＵＲ２９５１は制限酵素分析によってチェックした。

０８１０４株は若干の残留プロテアーゼ活性を有しているので、分泌された酵素のタンパク加水分解を防ぐためにｐＵＲ２９５１を有する０８１０４株の培養は制御された条件下で行なう必要がある。Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓで植物α−アミラーゼの生産を行なうための０ｖｅｒｂｅｅｋｅ他（１９９０）の方法を、Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓによるＡｓｐｅｒｇｉＪｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉキシラナーゼの生産の出発点として用いることができる。この発酵においては、発酵時のグルコース及びアンモニウム濃度に格別の注意が払われている。

引用文献Ｃｈａｎｇ、　Ｓ、　及びＣｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、　（１９７９）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｔ。

１８２、７７−８７７−８１Ｋａｖａ、　Ｆ、及びＤｏｉ、　Ｒ，Ｈ，（１９８４）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１６０、４４２−４４４０ｖｅｒｂｅｅｋｅ、　Ｎ、、　Ｔｅｒｍｏｒｓｈｕｉｚｅｎ、　Ｇ、Ｈ，Ｍ、、　Ｇｉｕｓｅｐｐｉｎ。

舅ル、Ｆ、、　Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ、　Ｄ、Ｒ，及びＶｅｒｒｉｐｓ、　Ｃ，Ｔ、（１９９０）よるＡｓ　ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉキシラナーゼの生産食材中でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｒ、　ａｖａｍｏｒｉキシラナーゼ産生菌を直接使用した一具体例として、低栄養パン生地の発酵時にキシラナーゼを産生ずるＳａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を構築した。この目的のためには、Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は小麦粉生地の発酵時の条件下でキシラナーゼを分泌するものでなければならない。低栄養パン（ｌｅａｎ　ｂｒｅａｄ）生地には砂糖は加えておらず、従ってパン酵母を発酵させる際の主な炭素源はグルコースとマルトースである。従って、キシラナーゼ遺伝子は、グルコース抑制による影響を受けないプロモーターによって調節されるべきである。この目的には酵母のグルコース分解経路の遺伝子群（ＧＡＰＤＨＳＰＧＫ、　ＡＤＨＩ、ＰＹＫ等）のプロモーターが非常に適している。単なる例示のために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターを使用した。このプロモーターは、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる多数の異種タンパク質の発現、例えばヒトインターフェロン−ａの生産（Ｔｕｉｔｅ他（１９８２））　、に用いられている。

パンの製造時に酵素を発現させる好ましい方法は組込みベクター（単コピー又は多重コピー組込み）を使用することであるが、自律複製ベクターを使用することもできる。

Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒｖａｒ、　ａｖａｍｏｒｉキシラナーゼの発現に使用したｐＵＲ２９２１プラスミドのＧＡＬ７プロモーター（実施例３参照）をＰＧＫプロモーターで置換した。この新たなベクターで形質転換したＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株はグルコース含有培地中でキシラナーゼ酵素を分泌するが、かかる形質転換株をパン製造に使用することができた。この酵母を混合前に生地に添加するとパン製造時にキシラナーゼ酵素が分泌され、それに伴ってかかるパン改良酵素の好影響がみられるようになり、結果的にパンの比容積が増大する。

プラスミドｌＪＲ２９１ｇの構築Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＧＫプロモーター配列とＡ　ｓｐｅｒｇｉ　１１　ｕ　ｓ酊ｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉキシラナーゼ遺伝子との融合には幾通りかの方法が考えられる。なかでも、部位特異変異導入方法によってプロモーターの最後に適当な制限エンドヌクレアーゼ部位を作成する方法があるが、これによって得られたＤＮＡ分子は、例えばＧＡＬ　７プロモーターとｐＵＲ２９０４のインベルターゼシグナル配列の間の５ａｃｌｉ位に融合させることができた。ｐＵＲ２９０４はＳａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる成熟型キシラナーゼの発現に用いたプラスミドである。ＤＮＡ分子の最後に適当な制限酵素部位を生じさせるその他の方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として知られるＤＮＡのインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）増幅法によるものがある。ＰＣＲ法を用いて、Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（＾ＴＧ開始コドンまで）の重要な配列すべてを含んでいて、その５′末端にＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＴ１部位及びＡＴＧ開始コドンの３′側にＢｓｐＭＩ認識配列及びＨｉｎｄｍ部位を有するＤＮＡ分子を得た（図１８参照）。この増幅に用いたプライマーは、ＰＧＰＯＩ　：　５’　−ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＡＴＣＴＴＧＡＡＴ　ＴＧＡ　ＴＧＴ　ＴＡＣＣＣＴ　ＣＡＴ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＣＧＴ　Ｇ−３’、及びＰＧＰＯ２：　５’　−ＣＣＣＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＡ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＴＡＴＡＴＴ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＴＡＧ　ＡＴＡ　ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＴＣＣ〜３′であった。

鋳型ＤＮＡは、５ａｃｃｈａｒｏｒｒｔｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＰＧＫプロモーター全体を含む酵母発現ベクターであるｐＵＲ２８０１であった。

反応混合液（全容積１０ｈｌ）は、次の成分：Ｓ８月で切断したｐＵＲ２８０１約１ｎｇ、　１００１００ｐのＰＧＰＯＩ及びＩＱＯｐｍｏｌのＰＧＰＯ２、ＩＵのＡａ＋ｐｌｉｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）、０、２ｍｍｏｌ／ｌの各ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、１．５ｍｍｏｌ／１のｌｌｇｃ　１．．１０ｍｍｏｌ／１のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ８，３（２５℃）、０．００１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン、から成るものであった。９５℃で２分間インキュベートした後、次の温度処理＝９５℃で１分、５２ ℃で１分４５秒、７２℃で２分、を２５サイクル行なった。２５サイクル後、反応混合物を７２℃に５分間保った後、４℃に冷却した。上記温度処理はすべてＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社のＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ中で行なった。反応混合物から６０ａ　ｌをエタノールで沈殿させ、アガロースゲルから約６００ｂｐのバンドを単離した。単離ＤＮＡをＥｃｏＦＩ　Ｉ及びＨｉｎｄｍで切断し、再度アガロースゲルから単離した。このＤＮＡ断片はＥｃｏＲ１付着末端から始まり、その後に、ＢｇｌＴ１部位、及びＡＴＧコドンに対する−５６８の位置からＡＴＧコドンまでのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターの配列が続く。ＡＴＧコドンの後には、ＥｓｐＭ１部位及びＨｉｎｄｍ付着末端が続く。多目的クローニングプラスミドｐＴＺ１９Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から入手）をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｍで切断し、上記ＰＧＫプロモーター断片と連結してｐｔｌＲ２９１８を得た（図１９）。このプラスミドは配列解析によってチェックした。

プラスミドＵＲ２９２０の構築ｐＵＲ２９１８のＰＧＫプロモーターをキシラナーゼ遺伝子と融合するため、図２０に示す合成りＮＡオリゴヌクレオチド（ＢＡＫ１４．１５．１８．１９．２０．２１．５１．５２及び５３）をアニールして連結して、断片ＢＡＫ５を得た。オリゴヌクレオチドＢＩＫ５１及びＢＡＫ５３は生成断片の自己連結を防ぐためにリン酸化されていない。上記断片をアガロースゲルから単離した。断片ＢＡＫ５は１６９ｂｐの長さで、インベルターゼシグナル配列及び断片ＢＡＫ５と適性に融合するような成熟型キシラナーゼ遺伝子のＸｈｏｆ部位までを含んでいる（実施例３参照）。この断片は前述の断片ＢＡＫ２　（実施例３）とは両端が異なる。この断片の５′末端側には、インベルターゼシグナル配列の二番目のコドンの直前に、ｐＵＲ２９１８のＰＧＫプロモーター配列と正確に融合させるための付着末端が含まれてる。この断片のＸｈｏ　Ｉ　ｆＩＢ位の３′側には付加的Ｈｉｎｄｍが含まれている。プラスミドｐＵＲ２９１８をＢｓｐＭＩ及びＨｉｎｄｍで切断し、断片ＢＡＫ５と連結してプラスミドｐＵＲ２９２０を得た（図２１参照）。挿入された断片ＢＡＫ５は配列解析によってチェックした。プラスミドｐＵＲ２９２０は、＾ＴＧコドンに対する−５６８の位置から＾ＴＧコドンまでの５ａｃｃｈａｒｏｒｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、このＡＴＧコドンに正確に融合した５ａｃｃｂａｒｏｔｔｒｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼシグナル配列、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｎｏｒｉキシラナーゼ遺伝子のＳａｃ１部位までを含んでいる。その後の構築を簡単にするため、実施例３に記載した通り、Ｓａｃ　１部位をＸｈｏｆ部位に変えた。

プラスミドＬＩＲ２９２２及び！ＪＲ２９２３の構築２ミクロンベースのエビソーム発現ベクターｐＵＲ２９０４（実施例３）を用いて、ＰＧＫプロモーターの調節下でＳ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でキシラナーゼ遺伝子を発現させるためのプラスミドを構築した。プラスミドｐＵＲ２９２０をＥｇｌｍ及びＸｈｏＩで切断し、アガロースゲルから、ＰＧＫプロモーター、インベルターゼシグナル配列及びキシラナーゼ遺伝子のＸｂｏ１部位までを含む７３５ｂｐ断片を単離した。プラスミドｐＵＲ２９０４も同様にＥｇｌｒｌ及びＸｈｏｌで切断して、大ベクター断片を単離した。この消化の結果、ＧＡＬ７プロモーター及びインベルターゼ遺伝子が除去された。このｐＵＲ２９０４ベクターをｐＵＩ！２９２０のＢｇｌＴｌ−ＸｈｏＩ断片と連結シテ、ｐＵＲ２９２２を得た（図２２参照）。プラスミドｐＵＲ２９２２は、ＧＡＬ７プロモーターの代りに５ａｃｃｈａｒｏｘｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターをインベルターゼシグナル配列の前に含んでいるという点で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＵＲ２９０４（実施例３）とは異なっている。

ＰＧＭ−キシラナーゼ発現カセットを有する多重コピー組込みベクターを構築するため、プラスミドｐＵＲ２７９２を出発点として用いた。プラスミドｐＵＲ２７９２はｐｉ［ＩＲＹ２（Ｌｏｐｅｓ　（１９８９））から誘導されたものである。このプラスミドは、Ｓ、　ｏｌｉｇｏｒｈｉｚａ　ＤＮＡを含むＢｇｌＴｌ −Ｈｉｎｄｍ部分の代りにＢｇＪ　ＩＩ−Ｈｉｎｄｍポリリンカ一部分を含んでおり、ｐＡＴ１５３配列中のＢａ１１部位からｒＤＮ＾配列中のＨｉｎｄＴ１１部位までの部分が欠失している。プラスミドｐｔｌＲ２７９２をＥｇ１ｍ及ヒｆｆ１ｎｄＩ［［で切断して、アガロースゲルからベクターバンドを単離した。ＰＧＫの調節を受けるキシラナーゼ発現カセットを含有するＥｇｌＴｌ−Ｈｉｎｄｍ断片をプラスミドｐＵＲ２９２２から単離し、ＢｇｌＴｌ−Ｈｉｎｄｍで切断しておいたｐＵＲ２７９２ベクターと連結した。得られたプラスミドｐＵＲ２９２３（図２３）は５ａｃｃｈａｒｏｔｒｒｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ多重コピー組込みプラスミドであり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＡＴＧ開始コドンまで）、このプロモーターと融合したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼシグナル配列、及びインベルターゼシグナル配列と同一枠内で融合したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ成熟型キシラナーゼ遺伝子を含んでいる。イントロン（非コード配列）はこのキシラナーゼ遺伝子からは正確に除去されている。

スフェロプラスト法を用いて、ＨｐａＩで線状化したプラスミドｐＵＲ２９２３で酵母＠　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳＵ５０株を形質転換した（実施例３）。最後の培養段階でＹＰＧ培地の代りにＹＰＤ培地（１９４酵母エキス、２％バクトペプトン、２Ｘグルコース）を用いたこと以外はプラスミドｐｌＪＲ２９２１で形質転換した酵母５ＬＩ５０株に関して述べた通りに、得られたｌｅｕ”形質転換酵母株をキシラナーゼ産生能について分析した。

発現量は、培地１ｍｌ当りの分泌量として約１０００００であった。

ｐｔｌＲ２９２３含有酵母による生地中でのキシラナーゼの生産酵母染色体に多コピー数のプラスミドｐｌＪＲ２９２３が組込まれた５ａｃｃｈａｒｏｒａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　５Ｕ５０菌を用いて、次のベーキング試験を行なった。キシラナーゼの添加によるパン容積の増大は、デンプンテーリングが酵素的変換を受けることによって、生地が生地中の酵母の気体発生作用をもっと受けられるようになることに起因する。従って、キシラナーゼ酵素添加の効果を十分に得るためには、高い気体発生力をもつ酵母が必要とされる。５０５０株は研究用の菌株であるため、気体発生力が余り高くない。

キシラナーゼ産生酵母５ｔ１５０株でベーキング試験を行なうには、良好な気体発生力をもつ酵母株を補充することが必要である。次のベーキング試験は、１０ｇマイクロローフ試験（Ｓｈｏｇｒｅｎ及びＦｉｎｎｅｙ　（１９８４））に基づいている。

生地の配合は、１０ｇの小麦粉（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ：　ＭＥＮＥＢＡ、オランダ国）、０゜１５ｇ　ＮａＣ１，５，９ｍｌの水、０．２ｇの圧搾酵母（Ｋｏｎｉｎｇｓｇｉｓｔ　；　Ｇ１５ｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社、オランダ国）であった。

この配合への補充成分（キシラナーゼ産生酵母、キシラナーゼ非産生酵母、キシラナーゼ酵素）は生地に混合する直前に水に溶解した。混合はＮａｔｉｏｎａｌｌｉａｎｕｆａｅｔｕｒｉｎｇ　Ｃｏ、　（ネブラスカ州すンカーン）製の１０ｇミキソグラフ（ｍｉｘｏｇｒａｐｈ）中で５分間行なった。混合後、生地を３０℃で８０分間発酵させ、その間、４０分後と８０分後に一度ずつ計２回のパンチを行なった。パンチ用の圧延ロールの間隔は２．０ｍｍであった。発酵後、生地を竪型して３０℃で７０分間寝かしてから、ベーキングを行なった。ベーキングは２４０℃で１２分間行なった。秤量後、各ローフの容積を矯菜種置換量（ｄｗａｒｆ　ｒａｐｅｓｅｅｄｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）で定量した。

補充成分は、ｐＵＲ２９９３含有５ａｃｃｈａｒｏｔｎｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳｔ１５０（キシラナーゼ産生酵母）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　５ＩＪ５０（親株）及び精製キシラナーゼ酵素であった。

使用した酵母５Ｕ５０株は最初に選択培地、即ち、ＹＮＢ　ｗ、ｏ、アミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）及び２０ｇ／ｌのグルコースに６０ｍｇ／ｍｌのロイシン（親株に対してのみ）及び２０ｍｇ／ｍｌのヒスチジンを添加した培地中で培養した。

これらの培養液は３０℃で４０時間培養し、その５ｍｌを取って４５ｍ１のＹＰＤ培地（上記参照）に接種して３０℃で１６時間増殖させた。酵母菌を遠心で回収し、新鮮ＹＰＤ培地で洗浄して、再度遠心した。種々の量の（湿潤）ペレットを、生地と混合する直前に５．９ｍｌの水に再懸濁した。精製キシラナーゼを用いる場合、その添加量は４０Ｕ／μｍ溶液を５μｌであった（２００Ｕ）。各種補充成分のパンの比容積（Ｓ、　Ｖ、　）に及ぼす効果を以下の表に示す。

補充成分　Ｓ、■、（ｍｌ／）５ｍｇ　Ｓ［Ｉ５０　３．４０１５ｍｇ　５Ｕ５０　３．３９５０ｍｇ　５Ｕ５０　３．６６５ｍｇ　５Ｕ５０；　２００υキシラナーゼ　３．７８］、５ｍｇ　Ｓυ５０ｉ　２０００キシラナーゼ　３．９７５０ｍｇ　５ＩＪ５０；　２００１Ｊキシラナーゼ　４．０１５ｍｇ　５Ｕ５０：　ｐＵＲ２９２３３，８８１５ｍｇ　５Ｕ５０：　ｐＵＲ２９２３４、Ｏ３５Ｑｍｇ　５Ｕ５０：　ｐＬＩＲ２９２３４，３１この表に示す結果から、キシラナーゼ産生酵母株（ＳＵ５０：　ｐｌＪＲ２９２３）が精製キシラナーゼ酵素の添加の場合と同様にパンの比容積に対して良好な効果を発揮することが分かる。同量を添加しても、親株にはかかる効果はみられない。熱論、この効果は良好な気体発生力を有するパン酵母を遺伝子操作実験酵母と配合した場合に発揮されるものである。ただし、良好な気体発生力を有するパン酵母を同様に遺伝子操作してカビキシラナーゼを産生ずるようにしたときにも同様の好影響を得ることができる。さらに、これらの酵母株は、パン改良能を有する他の酵素（α−アミラーゼ、ヘミセルラーゼなど）を産生ずるように遺伝子操作することもできる。

引用文献Ｌｏｐｅｓ、　Ｔ、Ｓ、、　Ｋｌｏｏｔｗｉｊｋ、　Ｊ、、　Ｖｅｅｎｓｔｒａ、　Ａ、Ｅ、、　ｖａｎｄｅｒ　Ａａｒ、　Ｐ、Ｃ，、ｖａｎ　Ｂｅｅｒｉｋｈｕｉｚｅｎ、　Ｈ，、Ｒａｕ！、　Ｈ，Ａ、及びＰｌａｎｔａ、　ＲＪ、（１９８９）　Ｇｅｎｅ　７９．１９９−ｌ９９−２０６Ｓｈｏ、　Ｍ、Ｄ、及びＦｉｎｎｅｙ、　Ｋ、Ｆ、（１９８４）　Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｗ。

６１、４１８−４２３Ｔｕｉｔｅ、　Ｍ、Ｆ、、　Ｄｏｂｓｏｎ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｎ、Ａ、、　Ｋｉｎｇ。

Ｒ，Ｍ、、　Ｂｕｒｋｅ、　Ｄ、Ｃ，、Ｋｆｎｇｓｍａｎ、　Ｓ、Ｍ、及びＫｉｎｇｓｍａｎ。

コード　鎖長　５・（−配列　−・・〉３−　＾０ＣＴＢＡＫ　２５　＾Ｍ　（５２）　ＡＡＴ　ＴＣＣＡＧＣＴＣＡ　丁ＣＡ　ＣＡＣＡＡＡ　Ｃ＾＾　＾Ｃ＾　＾ＡＡＣ＾＾　ＡＡＴ　ＣＡＴ　Ｃ；ＣＴ　丁ＴＴ　ＧＣＡ　＾ＧＣＣ２３６１３１０＠ＡＫ　１３　ＪＶ　（３６）　ＴＴＣＣＴＴ　ＴＴＣＣＴＴ　ＴＴＧ　ＣＣＴ　００丁　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＧＣＣ８＾Ｋ　１５　ＪＶ　（３６）　ＡＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＴ　Ｇｆｌ：Ｔ　ＧＡＴ　ＴＴＣＡｃｅ　ＴＡＴ　（ａＡＣＧＡＧＡＧＴ　１０　９　８　９ｗ　Ｃｏ　か　０＋　−いＮ盲ロ　ロ　ロ　ロ　ロロ　Ｃｏ　Ｎ＜ｌ　い　リ（）−−Ｎｌ’ｌ　＋Ｊ　ｌ／１＞　唖　Ｎ　ぐ　ｌ／１　リ・ −〜　哨　４　１／１肖禮コード鎖長　５＋　＜−配列　−・＞３−　＾ＧＣＴＢＩＬＫ　５１　ＡＭ　（５５）　ＡＡＴ　ＣＡＴ　ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＡＣＣＣＴＴ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　Ｃ（ＴＴＴＴ　ＣＣＣＴＣＧ　ＴＴＴ　ＴＧＣＡＧＣＣＡＡ　ＡＡＴ　Ａ　１１　１０１２２２ＢＡＫ　１５　ＡＭ　（３６）　ＡＡＣ（ｉＧＣＡＡＣＣＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣＡＣＣτ＾丁　ＧＡＣＧＡＣＡＣ７１０９８９ＢｈＫ　５２　ＡＭ　（４２）　Ｇｅｅ　ＧＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＴ　ＴＣＣＡＴＩＩ：　ＴＡＣＴＧＧ　ｃＡＡ　ＧＡＴＧＣＡ　（ｉＴＣＴＣＧ　ＡＣＡ　１１　１３　８１０ＢＡＫ　２１　ＡＭ　（３３）　ＡＧＣＣＡＡ　ＡＡＧ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＣＡＡ　ＧＧＣＴＴＧ　ＣＡＡ　ＡＡＣＣＡＴ　１６　９　５　３ＩＡ（２０ＡＭ　（３６）　ＡＡＴ　ＡＣＣＡＣＣＡＣＴ　ＣＣＣＡＧＡ　ＴＡＴ　１丁丁　Ｇｃｃ　ＴＣＣんμ＾ＣＣＩ２６１０５ＩＡＫ　１９　ＡＭ　（３３）　ＡＣＣＡＡＧ　０７丁　ＧＣＣＧＴＴ　ＧＴＡ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＣＡＣＧＴＡＧＴＴ　６９６１２１１ＡＫ　１８　ＡＭ　ｃ３６）　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＴＧＴτＣＣＧｃｃ　ＡＣＴ　ＣＴＣにｉＴＣＡＴＡ　ＧＧＴＧＡＡＡＴＣ１０９８９＠Ａ（５３ＡＭ　（３１）　ＡＣＣＴＴＣＴＣＧ　Ａｌｌ；Ａ　ＣＴＣＣＡＴ　ＣＴＴ　ＣＣＣＡにＴ　ＡＣＡＴ　７４１１９冊要約あるプロセスにある特定の機能を有する細胞にして、少なくとも１種類の酵素をコードする組換えＤＮＡを含有しており、上記の少なくと１種類の酵素をコードする組換えＤＮＡの発現に際して該細胞が上記プロセスに関して多機能性となる細胞。かかる多機能細胞及び／又はかかる細胞から得られる酵素の、例えばベイカリイ製品の製造のような食品加工プロセスにおける用途。カビ由来の少なくともある成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ材料。

補正音の写しく翻訳文）提ａ書（特許法第１８４条の８）平成４年１２月２１日

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくとも１種類の酵素をコードする組換えＤＮＡを含有していてあるプロセスにある特定の機能を有する細胞にして、上記の少なくとも１種類の酸素をコードする組換えＤＮＡの発現により該細胞が上記プロセスに関して多機能性となる細胞。
２．請求項１記載の細胞において、該細胞が多機能性となるプロセスが食品加工の分野にあることを特徴とする細胞。
３．請求項１又は請求項２記載の細胞において、該細胞が多機能性となるプロセスが発酵に関するものであることを特徴とする細胞。
４．請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の細胞において、該細胞が多機能性となるプロセスがベイカリイ製品の製造に関するものであることを特徴とする細胞。
５．請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の細胞において、該細胞が、細菌細胞、カビの細胞、酵母細胞及び植物細胞からなる群から選択されることを特徴とする細胞。
６．請求項５記載の細胞において、上記カビの細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属から選択されることを特徴とする細胞。
７．請求項６記載の細胞において、上記カビの細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ５及びＡｓｐｅｒｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅからなる種から選択されることを特徴とする細胞。
８．請求項５記載の細胞において、上記植物細胞が、小麦、大麦、燕麦、トウモロコシ、エンドウ、ジャガイモ及びタバコからなる群から選択される植物から選択されることを特徴とする細胞。
９．請求項５記載の細胞において、上記細菌細胞が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属から選択されることを特徴とする細胞。
１０．請求項５記載の細胞において、該細胞が酵母細胞であることを特徴とする細胞。
１１．請求項１０記載の細胞において、上記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属及びＰｉｃｈｉａ属から選択されることを特徴とする細胞。
１２．請求項１１記載の細胞において、上記酵母細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓからなる種から選択されることを特徴とする細胞。
１３．カビ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ材料。
１４．請求項１３記載の組換えＤＭＡ材料において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなることを特徴とする組換えＤＮＡ材料。
１５．請求項１３又は請求項１４記載の組換えＤＮＡ材料において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなることを特徴とする粗換えＤＮＡ材料。
１６．請求項１３乃至請求項１５のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、ａｗａｍｏｒｉ由来の少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列をもつＤＮＡを含んでなることを特徴とする組換えＤＮＡ材料。
１７．請求項１３乃至請求項１６のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料において、図１に示す少なくとも一つの成熟過程型キシラナーゼをコードする塩基配列又は図１の塩基配列と比較して欠失、挿入又は改変部位の存在する均等な塩基配列をもつＤＮＡを含んでなり、上記欠失、挿入又は改変部位をもつ塩基配列が図１に示すアミノ酸配列と対応するものか又は成熟キシラナーゼもしくは活性なプレ（プロ）キシラナーゼなどの活性な成熟過程型キシラナーゼに必須なアミノ酸配列部分と対応するようなものであるか、或いは上記欠失、挿入又は改変部位をもつ塩基配列がハイブリッド形成条件下で図１の塩基配列とハイブリダイズし得る相補鎖を有するようなものであることを特徴とする組換えＤＮＡ材料。
１８．請求項１３乃至請求項１７のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料において、該組換えＤＮＡが少なくとも１種類の他の酵素もコードしていて、該他の酵素がアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有するものであることを特徴とする組換えＤＮＡ材料。
１９．請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料から得られる遺伝物質を含む細胞。
２０．請求項１９記載の細胞において、少なくとも上記組換えＤＮＡ材料にコードされた成熟過程型キシラナーゼを発現する能力を有することを特徴とする細胞。
２１．請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の細胞において、該細胞中に含まれる組長えＤＮＡに、アミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される少なくとも１種類の酵素がコードされていることを特徴とする細胞。
２２．請求項２２記載の細胞において、該細胞が請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料から得られる遺伝物質を含んでいることを特徴とする細胞。
２３．請求項１乃至請求項１２のいずれか１項又は請求項２１又は請求項２２記載の細胞において、該細胞が、細胞中に含まれる上記組換えＤＮＡ材料にコードされた少なくとも１種類の酵素を発現する能力を有していることを特徴とする細胞。
２４．請求項２３記載の細胞において、該細胞が、少なくとも上記組換えＤＮＡ材料にコードされた酵素を分泌する能力を有していることを特徴とする細胞。
２５．請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載の組換えＤＨＡ材料の発現によって得られる、カビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のある成熟過程型キシラナーゼ。
２６．請求項１乃至請求項１２のいずれか１項又は請求項２１又は請求項２２記載の細胞から得られる、カビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のある成熟過程型キシラナーゼ。
２７．図１に示すアミノ酸配列又はキシラナーゼ活性に不可欠な図１の配列のアミノ酸を含んでなるキシラナーゼの活性均等物のアミノ酸配列を有する成熟型キシラナーゼ。
２８．図１に示すアミノ酸配列又はキシラナーゼ活性に不可欠な図１の配列のアミノ酸を含んでなるキシラナーゼの活性均等物のアミノ酸配列を有するプレ（プロ）キシラナーゼ。
２９．少なくとも１種類の酵素の生産方法にして、請求項１乃至請求項１２又は請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞を好適な栄養培地中で培養し、かつ所望により、得られる酵素の成熟過程型を単離することを含んでなる方法。
３０．請求項２９記載の方法において、上記酵素がアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択されることを特徴とする方法。
３１．請求項２９又は請求項３０記載の方法において、上記酵素が、カビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来のある成熟過程型キシラナーゼであることを特徴とする方法。
３２．請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞から又は請求項２９乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法で得ることのできるアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酸素の群から選択される酵素を含んでなるパン改良剤。
３３．請求項３２記載のパン改良剤において、上記酵素が請求項２５乃至請求項２８のいずれか１項記載のキシラナーゼであることを特徴とするパン改良剤。
３４．請求項３２又は請求項３３記載のパン改良剤において、上記酵素がカビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の成熟型キシラナーゼであることを特徴とするパン改良剤。
３５．請求項２１乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞を含んでなるパン改良剤。
３６．請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞から又は請求項２９乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法で得ることのできるアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される酵素を含んでなる穀粉組成物。
３７．請求項３６記載の穀粉組成物において、上記酵素が請求項２５乃至請求項２８のいずれか１項記載のキシラナーゼであることを特徴とする穀粉組成物。
３８．請求項３６又は請求項３７記載の穀粉組成物において、上記酵素がカビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の成熟型キシラナーゼであることを特徴とする穀粉組成物。
３９．請求項２１乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞を含んでなる穀粉組成物。
４０．請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞から又は請求項２９乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法で得ることのできるアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される酵素を含んでなる生地組成物。
４１．請求項４０記載の生地組成物において、上記酵素が請求項２５乃至請求項２８のいずれか１項記載のキシラナーゼであることを特徴とする穀粉組成物。
４２．請求項４０又は請求項４１記載の生地組成物において、上記酵素がカビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の成熟型キシラナーぜであることを特徴とする生地組成物。
４３．請求項２１乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞を含んでなる生地組成物。
４４．請求項３６乃至請求項３９のいずれか１項記載の穀粉組成物又は請求項４０乃至請求項４３のいずれか１項記載の生地組成物を用いて得られるベイカリイ製品。
４５．ベイカリイ製品の製造方法にして、請求項３６乃至請求項３９のいずれか１項記載の穀粉組成物又は請求項４０乃至請求項４３のいずれか１項記載の生地組成物を用いることを特徴とする方法。
４６．請求項１９乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞から又は請求項２９乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法で得ることのできるアミロース加水分解活性及び／又はヘミセルロース加水分解活性及び／又はセルロース加水分解活性を有する酵素の群から選択される酵素の、ビール醸造や製紙やデンプン及びグルテンなどの製造プロセスのようにセルロース含有原料を使用するプロセス並びに農業廃棄物や製紙工場廃棄物などのセルロース含有廃棄物の分解プロセスにおける用途。
４７．請求項４６記載の用途において、上記酵素が請求項２５乃至請求項２８のいずれか１項記載のキシラナーゼであることを特徴とする用途。
４８．請求項４６又は請求項４７記載の用途において、上記酵素がカビ由来の、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の成熟型キシラナーゼであることを特徴とする用途。
４９．請求項２１乃至請求項２４のいずれか１項記載の細胞の、ビール醸造や製紙やデンプン及びグルテンなどの製造プロセスのようにセルロース含有原料を使用するプロセス並びに農業廃棄物や製紙工場廃棄物などのセルロース含有廃棄物の分解プロセスにおける用途。