FI108944B - Sieniperäisten ksylanaasigeenien kloonaus ja ilmentäminen - Google Patents

Sieniperäisten ksylanaasigeenien kloonaus ja ilmentäminen Download PDF

Info

Publication number
FI108944B
FI108944B FI921231A FI921231A FI108944B FI 108944 B FI108944 B FI 108944B FI 921231 A FI921231 A FI 921231A FI 921231 A FI921231 A FI 921231A FI 108944 B FI108944 B FI 108944B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
dna sequence
xylanase
dna
gene
expression
Prior art date
Application number
FI921231A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI921231A0 (fi
FI921231A (fi
Inventor
Ooyen Albert Johannes Jose Van
Graaff Leendert Hendrik De
Jacob Visser
Den Broeck Henriette Catha Van
Abraham Harder
Jan Dirk Rene Hille
Original Assignee
Dsm Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8205086&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI108944(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Dsm Nv filed Critical Dsm Nv
Publication of FI921231A0 publication Critical patent/FI921231A0/fi
Publication of FI921231A publication Critical patent/FI921231A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI108944B publication Critical patent/FI108944B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
    • A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
    • A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
    • A23K30/18—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Treatment Of Sludge (AREA)
  • Professional, Industrial, Or Sporting Protective Garments (AREA)
  • Auxiliary Devices For And Details Of Packaging Control (AREA)
  • Earth Drilling (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Secondary Cells (AREA)

Description

108944
Sieniperäisten ksylanaasigeenien kloonaus ja ilmentäminen 5 Tämä keksintö koskee molekyylibiologian alaa. Erityisesti tämä keksintö koskee ksylanaasiaktiivisuuden omaavaa proteiinia koodaavan sieni-DNA:n kloonausta ja yliekspressio-ta. Tämä keksintö tarjoaa myös käyttöön menetelmiä yksittäisen ksylanaasin tuottamiseksi ja käyttämiseksi, jolloin 10 ksylanaasi on saatavana muodossa, joka on puhdas muista ksylanaaseista, ja yleensäkin muista entsyymeistä.
Keksinnön tausta 15 Kasvien soluseinän rakenne on monimutkainen ja vaihteleva. Polysakkaridit esiintyvät pääasiassa pitkäketjuisen selluloosan, (soluseinän päärakenneosa), hemiselluloosan (käsittää erilaisia β-ksylaaniketjuja) ja pektiinin muodossa. Kasvin soluseinien polysakkaridien esiintyminen, jakautu-20 minen ja rakenteelliset piirteet määräytyvät seuraavien seikkojen mukaan (1) kasvilajin, (2) lajikkeen, (3) soluk-kotyypin, (4) kasvuolosuhteiden, (5) vanhenemisen ja (6) kasvimateriaalin käsittelyn ennen rehustamista.
25 Yksisirkkaisten (esim. viljat ja heinät) ja kaksisirk-:"i kaisten (esim. apila, rapsi ja soija) sekä kasvin siemenen ja vegetatiivisten osien välillä on perustavaa laatua ole- • · j via eroja (Chesson, 1987; Carr6 ja Brillouet, 1986). Yk- sisirkkaisia luonnehtii arabinoksylaanikompleksi pääasial- • · ,·, ; 30 lisena hemiselluloosan runkona. Hemiselluloosan päärakenne
• I I
kaksisirkkaisilla on ksyloglukaanikompleksi. Sen lisäksi * » · * kaksisirkkaisissa voidaan havaita korkeampia pektiinikon- sentraatioita kuin yksisirkkaisissa. Siemenissä on yleensä ’·’ hyvin runsaasti pektiiniaineita, mutta suhteellisen vähän ·. ’ 35 selluloosaa sisältävää materiaalia.
> * · « I » · I 1
• » I
• « I
I | I
! 2 108944 ί {
Kuvassa 1 esitetään kaavio kasvisolun poikkileikkauksesta. Soluseinässä voidaan erottaa kolme enemmän tai vähemmän vuorovaikutuksessa olevaa polysakkaridirakennetta: 5 (1) Keskilevy muodostaa soluseinän uloimman osan. Se toi mii myös yksittäisten solujen kiinnityskohtana toisiinsa kasvisolukon matriisissa. Keskilevy koostuu pääasiassa voimakkaasti esteröityneiden pektiinien kalsiumsuoloista; 10 (2) Primaarinen soluseinä sijaitsee aivan keskilevyn si säpuolella. Se on hyvin järjestynyt rakenne, jossa sellu-loosamikrofibrillit ovat uponneena amorfiseen pektiinin, hemiselluloosan, fenoliestereiden ja proteiinien muodostamaan matriisiin; 15 I (3) Sekundäärinen soluseinä muodostuu kasvin vanhetessa.
Kasvin kasvu- ja vanhenemisvaiheessa kertyy selluloosamik-rofibrillejä, hemiselluloosaa ja ligniiniä.
20 Erilaistuneiden, metabolisesti aktiivisten kasvisolujen (esim. mesofyllin ja epidermin) primaarinen soluseinä on alttiimpi entsymaattiselle hydrolyysille kuin sekundäärinen soluseinä, johon tässä vaiheessa on keräytynyt runsaasti ligniiniä.
;7 25 : .· Selluloosan, hemiselluloosan ja pektiinin välillä on pal- ·.'·· jon vuorovaikutusta. Näiden melko paljon ristisidoksia sisältävien polysakkaridirakenteiden entsymaattinen hajo-tus ei ole yksinkertainen prosessi. Esimerkiksi arabino-:‘i*: 30 ksylaanin täydelliseen hajotukseen tarvitaan vähintään viisi erilaista entsyymiä. Sisältäpäin tapahtuvaa pilkko-: mistä tehostetaan käyttämällä endop( l-»4)-D-ksylanaasia.
Ekso-( l-»4)-D-ksylanaasi vapauttaa ksyloosiyksikköjä polysakkaridin ei-pelkistävästä päästä. Kolmea muuta entsyymiä : 35 (a-glukuronidaasi, α-L-arabinofuranosidaasi ja asetyylies- : terääsi) käytetään ksylaanirungon osien hajottamiseen.
» » · » I » ♦ » « » • t j 3 I 08944
Spesifisen entsyymin valinta riippuu luonnollisesti hajotettavasta spesifisestä hemiselluloosasta (McCleary ja Matheson, 1986).
5 Tiettyjä sovellutuksia varten ei koko hemiselluloosan täydellinen pilkkominen monomeereiksi ole välttämätöntä tai toivottavaa. Esimerkiksi arabinoksylaanin nesteytyksessä täytyy yksinkertaisesti pilkkoa pääksylaaniranka lyhyemmiksi yksiköiksi. Tämä voidaan saavuttaa endoksylanaasin 10 toiminnalla, joka lopulta johtaa seokseen, joka sisältää j ksyloosimonomeeriyksikköjä ja oligomeerejä, kuten ksylobi- oosi ja ksylotrioosi. Nämä lyhyemmät alayksiköt ovat sitten riittävän liukoisia haluttua käyttöä varten.
15 Rihmasienet tunnetaan laajalti niiden kyvystä erittää suuria määriä erilaisia hydrolyyttisiä entsyymejä, kuten a-amylaaseja, proteaaseja ja amyloglukosidaaseja, ja erilaisia kasvien soluseinää hajottavia entsyymejä, kuten sellu-laaseja, hemisellulaaseja ja pektinaaseja. Näiden joukosta 20 on tunnistettu useita ksylaania pilkkovia entsyymejä, joilla on osoitettu olevan erilaisia biokemiallisia ja fysikaalisia ominaisuuksia. Tämä ksylanaasitoiminnon heterogeenisyys antaa mahdollisuudet kiinnostavan ksylanaasin valitsemiseen, joka soveltuu parhaiten haluttuun käyttöön 25 (katso Wong et ai. (1988), Woodward (1984) ja Dekker ja i \: Richards (1977)).
• ·
Mikro-organismien, kuten Aspergillus niger, Clostridium thermocellum. Trichoderma reesei, Penicillium lanthinel-30 lum. samoin kuin Bacillus- ja Streptomvces-laiien tiedetään tuottavan suuren joukon ksylanaaseja, joiden molekyy-,·. : lipainot ovat erilaiset.
» « f » · *
Sitä vastoin hiivasta ei ole havaittu ksylanaasien mo-·,: · 35 ninaisuutta. Kolmessa hiivasuvussa, Trichosporon. Crypto- { 4 108944 coccus ja Aureobasidium. voitiin osoittaa vain yksi ksy-lanaasi.
Luonnossa mikrobiksylanaaseja tuotetaan aina yhdessä mui-5 den entsyymien, kuten eksoarabinaasin, asetyyliesteraasin ja sellulaasien kanssa, joilla on polysakkarideja pilkkovaa aktiivisuutta. Joissain käyttötarkoituksissa ei tarvita näitä entsyymiaktiivisuuksia, tai ne ovat ei-toivot-tuja.
10
On tunnettua, että fermentointiolosuhteita voidaan muunnella, jotta edistetään kiinnostuksen kohteena olevan entsyymin tuotantoa. On myöskin tunnettua, että toivottua entsyymiä koodaavan geenin kloonaus ja yliekspressio sen 15 luontaisessa isännässä, tai muussa soveltuvassa ekspres-sioisännässä edistää spesifisesti kiinnostuksen kohteena olevan entsyymin tuotantoa. Tämä jälkimmäinen menetelmä on erityisen käyttökelpoinen, jos kiinnostuksen kohteena oleva entsyymi tulee saada muodossa, joka on puhdas ei-toivo-20 tusta entsyymiaktiivisuudesta.
Bakteerien rekombinantti-ksylanaasin ekspressio on kuvattu aikaisemmin EP-patenttihakemuksessa 121.138. Bakteeriksy-lanaasia koodaava geeni oli eristetty Bacilluksen kro-
«MM
25 mosomaalisesta DNA:sta ja ilmennetty E. coli -isännässä.
: E.coli -ekspressioisäntiä ei pidetä kuitenkaan kaikissa tapauksissa turvallisina proteiinien tuottamisessa rekom-’"*! binantti-DNA-menetelmillä, koska ne tuottavat ei-hyväksyt- täviä sivutuotteita, kuten toksiineja.
30
Koska bakteerigeeneissä ei ole introneita, kohdataan har-; voja ongelmia kloonattaessa ja ilmennettäessä tällaisia geenejä prokaryootti-isännissä. Toisaalta eukaryoottigee-nien ekspressio ei aina ole niin yksinkertaista. On hyvin · 35 tunnettua, että eukaryoottikannoista eristetyt geenit si-: sältävät introneita. Tämä tuo luontaisesti hankaluuksia f • · * näiden geenien kloonaukseen ja ekspressioon, jos halutaan käyttää prokaryootti-isäntää.
5 108944
Sitä paitsi on olemassa tiettyjä yleisiä eroja sienialku-5 perää ja bakteerialkuperää olevien ksylanaasien fysikaalisissa ominaisuuksissa. Yleisesti ottaen sieniksy-lanaaseilla on pH-optimi alueella pH 3,5 - 5,5, verrattuna bakteeriksylanaaseihin, joiden pH-optimi on yleensä alueella pH 5,0 - 7,0. Sieniksylanaaseilla on myös yleensä 10 laajempi pH:n stabiilisuusalue (pH 3 - 10) , kuin niihin verrattavilla bakteereilla (pH 5,0 - 7,5). Sieniksylanaa-sien lämpötilaoptimi on yleensä noin 50 °C. Bakteeriksy-lanaasien lämpötilaoptimi on yleensä välillä 50 °C ja 70 °C. Lisätietoja ksylanaasien fysikaalisista ominaisuuk-15 sista on esitetty julkaisuissa Wong et ai. (1988), Woodward (1984) ja Dekker ja Richards (1977).
Siten on selvää, että bakteeriksylanaasit ovat vähemmän sopivia käytettäväksi esimerkiksi prosesseissa, jotka 20 edellyttävät alhaisempia pH-oloja. Toisissa tapauksissa bakteeriksylanaasit ovat liian termostabiileja tiettyjä ·"· sovellutuksia varten, kuten oluenvalmistuksessa (katso EP- ; patentti nro 227.159).
·;··· 25 Niinpä olisi hyvin tärkeää saada sienialkuperää olevia : ksylaania pilkkovia entsyymejä koodaavia geenejä, jotka voitaisiin saattaa ekspressoitaviksi muissa, tuottoisissa * * · ekspressioisännissä, jotka ovat mikrobeja.
30 Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö tarjoaa käyttöön puhdistetun ja eristetyn, * I · sienialkuperää olevan DNA-sekvenssin, joka koodaa ksylaania pilkkovaa aktiivisuutta omaavaa proteiinia. Tämä DNA-··· · 35 sekvenssi sisältää ksylanaasia koodaavan sekvenssin ja edullisesti myös viereiset 5'- ja 3 1-säätelyalueet.
6 i 0 8^44 Tämän keksinnön tarkoituksena on myös tarjota käyttöön rakenteet ksylanaasia koodaavien sekvenssien yliekspres-siota varten mikrobeissa, käyttäen joko niiden luonnollisia säätelysekvenssejä tai vaihtoehtoisessa suoritusmuo-5 dossa ksylanaasia koodaavaa sekvenssiä, joka on liitetty toiminnallisesti valittuihin säätelysekvensseihin, kuten promoottori, erityksen johtosekvenssi ja lopetussignaali, jotka kykenevät ohjaamaan ksylanaasiproteiinin ylieks-pression sopivassa ekspressioisännässä.
10 Tämän keksinnön tarkoitus on edelleen tarjota käyttöön mikrobeja ekspressioisäntinä, transformoituna tämän keksinnön mukaisilla ekspressiorakenteilla, jotka kykenevät yliekspressioon ja, jos halutaan, sienialkuperää olevan 15 ksylanaasin eritykseen.
Vielä eräs tämän keksinnön tarkoitus on tarjota käyttöön menetelmiä kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin 20 tuottamiseksi, jota ksylanaasia voidaan vuorostaan edul lisesti käyttää teollisuuden prosesseissa. Tavallisesti ·"' tällainen teollisuusprosessi vaatii ksylanaasiaktiivi- suutta alemmassa pH:ssa kuin bakteerialkuperää olevat ksy-lanaasit optimaalisesti toimivat.
25 : Lyhyt esitys kuvista ' Kuva 1: Kaavio kasvisolun poikkileikkauksesta.
30 Kuva 2: HPLC-eluutioprofiili viljelmäsuodoksesta, joka on saatu Aspergillus nigeristä DS16813 (CBS 323.90). Tämä kanta luokiteltiin myöhemmin uudelleen kuuluvaksi toden-näköisemmin lajiin Aspergillus tubigensis.
I I · I I » « > » * » 7 108944
Kuva 3: Oligonukleotidikoettimet AB801 - AB806, tehty As-pergi 1Tus tubigensiksen XYL A -proteiinin N-terminaalisen aminohapposekvenssin mukaan (kaava 1).
5 Kuva 4: Oligonukleotidikoetin AB1255, tehty Aspergillus i tubigensiksen XYL A -proteiinin sisäisen 10 kDa:n fragmen tin N-terminaalisen aminohapposekvenssin mukaan, fragmentti pilkottu s. aureuksen V8-endopeptidaasilla (kaava 2).
10 Kuva 5: Restriktiokartta genomisesta alueesta, joka sisältää xln A geenin, saatu bakteriofagi lambdaxln3:n Southern blot -analyysistä. Merkittyinä ovat hybridisoituvat fragmentit ja niiden vastaavat pituudet.
15 Kuva 6: Menettelytapa, jota käytettiin sekvensoimaan As-pergi Uus tubigensiksen xln A geeni. Nuolet osoittavat sekvensoitujen emäsparien suunnan ja määrän.
Kuva 7: Restriktiokartta pIM100:sta sisältäen 6,9 ke:n j 20 Sali-fragmentin, joka sisältää Aspergi Uus tubigensiksen xln A geenin. Kahden merkityn HinDIII-kohdan lisäksi plasmidi-insertissä on kaksi HinDIII-kohtaa lisää.
Kuva 8: Aspergillus tubigensiksen xln A geenin nukleoti-25 disekvenssi. Intronin ja propeptidin asemat ovat oletet-, ·, : tuj a.
Kuva 9: Tsymogrammiesitys, joka kuvaa XYL A -proteiinin ekspressoituna transformanteissa TrX2 ja TrX9.
30
Kuva 10: SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi, joka esittää XYL A -proteiinin ekspression L·._niger -kannassa CBS 513.88 (A) ja A. niger -kannassa N593 (B) .
·- : 35 Kuva 11: Natiivi gradientti-PAGE, joka esittää XYL A -pro- teiinin ekspressoituna A.niger CBS 513.88 -transforman- 8 108944 teissä numerot 10, 29 ja 1.1, värjättynä CBB:llä (A) ja RBB-ksylaanikerroksella (B).
Kuva 12: Fysikaalinen kartta pXYLl:stä, joka sisältää xln 5 A geenin 2,1 kep:n Estl-fragmentissa pTZ18R:ssä. [Lyhenteet: H = HindiII; P = Esti; B = BamHI; K = Kpnl; E = Eco-RI; X = XhoT ja S = Sali]
Kuva 13: Fysikaalinen kartta pAB 6-l:stä. 14,5 ke:n Hin-10 dlll-DNA-liitännäinen pUC19:ssä sisältää koko amyloglu-kosidaasi- (AG) lokuksen A.nigeristä.
Kuva 14: Kaaviokuva AG promoottori/ksylanaasi geeni- fuusioiden luomisesta toteutettuna polymeraasiketjureak-15 tion avulla.
Kuva 15: Väliplasmidin pXYL2AG konstruktioreitti [Lyhenteet: katso kuva 12] 20 Kuva 16: Väliplasmidin pXYL2 konstruktioreitti [Lyhenteet: katso kuva 12] : Kuva 17: Väliplasmidin pXYL3AG konstruktioreitti [Lyhen- teet: katso kuva 12] f i 25 : Kuva 18: Väliplasmidin pXYL3 konstruktioreitti [Lyhenteet: katso kuva 12]
Kuva 19: Osittainen restriktiokartta 6,5 ke:n BglTT/sali-' ’ 30 fragmentista T.reeseistä, kloonattuna pEMBL18:aan (pl- M030). Viivoitettu laatikko edustaa hybridisoituvaa frag-menttia liitännäisen sisällä.
Kuva 20: Osittainen restriktiokartta 7,5 ke:n BamHT/Bglli-: 35 fragmentista T.reeseistä, kloonattuna PUC9:ään (pIM041).
9 ί ϋ ϋ ? 4 4
Viivoitettu laatikko edustaa hybridisoituvaa fragmenttia liitännäisen sisällä.
Kuva 21: Kaaviokuva rakenteista, jotka on tehty luomalla 5 deleetioita xln A promoottorialueeseen. Orientaatiota varten, A.nigerin pyr A geenin kloonauksessa käytetty XhaI alue on merkitty.
Yksi tyi sVolvha i npn laivaus keksinnöstä 10 Tässä keksinnössä kuvataan sienialkuperää oleva puhdistettu ja eristetty DNA-sekvenssi, joka koodaa ksylanaasia. DNA-sekvenssi sisältää edullisesti ksylanaasia koodaavan sekvenssin ja viereiset 5'- ja 3'-säätelysekvenssit. Ge-15 neettisiin muunnoksiin kuuluvat hybridi-DNA-sekvenssit, ' jotka sisältävät ksylanaasia koodaavan sekvenssin liitet tynä säätelyalueisiin, kuten promoottori, eritys- ja lope-tussignaalit, jotka ovat peräisin homologisista tai hete-rologisista organismeista. Geneettisiin muunnoksin kuulu-20 vat myös DNA-sekvenssit, jotka koodaavat mutanttiksylanaa-siproteiineja ja degeneroituneita DNA-sekvenssejä, joissa ksylaanin pilkkomisaktiivisuus on säilynyt.
* · '•j Tämä keksintö sisältää myös DNA-sekvenssit, jotka kykene-
A A
25 vät hybridisoitumaan ksylanaasia koodaavaan DNA-sekvens-,·. ; siin, ja sen geneettiset muunnokset, kuten edellä on esi- tetty, mutta jotka voivat erota kodonisekvenssiltään geneettisen koodin degeneroitumisen vuoksi, tai lajienväli-sen muuntelun vuoksi.
30 ’...· Tämä keksintö tarjoaa käyttöön myös DNA-rakenteet kiinnos- tuksen kohteena olevan ksylanaasin ilmentämiseksi halutus-sa ekspressioisännässä. Näihin ekspressiorakenteisiin kuu- » · luvat hybridi-DNA-sekvenssit, jotka sisältävät ksylanaasia : 35 koodaavan alueen liitettynä toiminnallisesti säätelyaluei- ·...· siin, kuten promoottori, eritys- ja lopetussignaalit, jot- 10 108944 ka ovat peräisin homologisista tai heterologisista organismeista, näiden säätelyalueiden kyetessä ohjaamaan ksylanaasia koodaavan DNA-sekvenssin koodaaman entsyymin yliekspression sopivassa isännässä. Edullisesti ekspres-5 siorakenne liitetään valitun ekspressioisännän genomiin.
Tämä keksintö tarjoaa käyttöön edelleen vektoreita, edullisesti plasmideita, kloonausta ja/tai transformaatiota varten mikrobi-isännissä, viemällä mikrobi-isäntään DNA-10 rakenteet kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin ekspressiota varten.
Lisäksi tämä keksintö koskee homologisia tai heterologisia isäntiä, jotka on transformoitu edellä kuvatuilla DNA-ra-15 kenteilla. Ekspressioisäntinä käytettävät mikrobit voidaan valita bakteereista, hiivoista tai sienistä.
Tämän keksinnön yhteydessä määritelmän "homologinen" ymmärretään tarkoittavan kaikkea sellaista, mikä on luon-20 täistä kiinnostuksen kohteena olevaa ksylanaasia koodaa-valle DNA-sekvenssille, mukaanluettuna sen säätelyalueet. Homologinen isäntä on määritelty lajiksi, josta tällainen '· > DNA-sekvenssi voidaan eristää.
• * » • · : 25 Määritelmä "heterologinen" tarkoittaa siten kaikkea sel- !..* laista, mikä ei ole luontaista itse kiinnostuksen kohteena »t · ‘ olevaa ksylanaasia koodaavalle DNA-sekvenssille, mukaan luettuna säätelyalueet. "Heterologinen" isäntä määritel-’ ' lään miksi tahansa mikrobilajiksi, joka on muu kuin sel- 30 lainen, josta ksylanaasia koodaava geeni on eristetty.
•
I I t » I
Tämän keksinnön piiriin kuuluvana, kiinnostuksen kohteena
• I
* olevan ksylanaasin ymmärretään kattavan ksylaania pilkko- :· > van entsyymin, jota luonnossa tuottaa rihmasieni. Erityi- 35 sen kiinnostuksen kohteena olevat ksylanaasit ovat niitä, joita tuottavat luonnossa seuraaviin sukuihin kuuluvat 11 108944 rihmasienet: Aspergillus ja Triohodp-rma. Erityisen edullisia ksylanaaseja ovat ne, jotka ovat peräisin Aspergil-lus nigeristä, Aspergillus awamorista, Aspergillus aculea-tuksesta, Aspergillus tubigensiksestä ja Trichoderma ree-5 seistä. Edullisimpia ovat ksylanaasit, jotka ovat peräisin Aspergillus tubigensiksestä ja Tri choderma reeseistä.
Kiinnostuksen kohteena oleva endoksylanaasi voidaan tun nistaa analyysimenetelmillä, jotka eivät ole olennaisia 10 tälle keksinnölle, kuten täplätestianalyysillä. Tämän menetelmän mukaisesti suodos, joka on saatu kasvattamalla endoksylanaasia tuottamaan indusoitua (esim. kaura-spelt-tiksylaanilla) mikro-organismia, voidaan testata endoksy-lanaasiaktiivisuuden suhteen. Pisarat eluutiofraktioista 15 laitetaan erikseen agarkalvolle, joka sisältää sitraatti-fosfaattipuskuria (katso esimerkki 1.1, jäljempänä) ja kaura-spelttiksylaania. Tämän jälken kalvoa inkuboidaan. Jos endoksylanaasia on läsnä, yksittäisten pisaroiden kohdat agarkalvolla ovat silmin havaittavasti kirkkaat.
20 :*! Kun kiinnostuksen kohteena oleva ksylanaasi on tunnistet- ·’·*: tu, tällaista ksy lanaasia koodaava DNA-sekvenssi voidaan » * *.: saada rihmasienestä, joka tuottaa sitä luontaisesti, vil- jelemällä sientä ksylaania sisältävällä alustalla, eris-. 25 tämällä haluttu ksylanaasi käyttämällä tunnettuja menetel- miä, kuten pylväskromatografiaa (esim. HPLC:tä - katso I · · *' ' kuva 2) ja määrittämällä vähintään osa puhdistetun prote iinin aminohapposekvenssistä.
» * · · * » * 30 DNA-koettimet voidaan sen jälkeen valmistaa syntetisoimal- ,·. la oligonukleotidisekvenssit, jotka perustuvat osittaiseen aminohapposekvenssiin. Aminohapposekvenssit voidaan mää-. rittää kokonaisen proteiinin N-päästä ja/tai sisäisten : peptidifragmenttien N-päästä, jotka sisäiset fragmentit on 35 saatu kokonaisen proteiinin proteolyyttisellä tai kemiallisella pilkkomisella. Kun DNA-koetin (koettimet) on saa- 12 108944 tu, niitä käytetään genomisen tai cDNA-kirjaston seulomiseen.
Mikäli tämä menetelmä ei ole menestyksekäs, genominen kir-5 jasto voidaan seuloa erottaen cDNA-koettimilla, jotka on saatu mRNA:sta ei-indusoiduista ja indusoiduista soluista. Indusoitu mRNA valmistetaan soluista, jotka on kasvatettu alustalla, joka sisältää ksylaania hiilenlähteenä, kun taas ei-indusoitu mRNA tulee eristää soluista, jotka on 10 kasvatettu muulla hiilenlähteellä kuin ksylaani, esim. glukoosilla. Niiden kloonien joukossa, jotka hybridisoitu-vat vain indusoidun cDNA-koettimen kanssa, voidaan ottaa talteen klooni, joka sisältää halutun ksylanaasigeenin. Vaihtoehtoisesti ksylanaasigeeni voidaan identifioida ris-15 tihybridisaatiolla läheisen ksylanaasisekvenssin kanssa (katso esimerkki 7, jäljempänä).
Genominen kirjasto voidaan valmistaa pilkkomalla osittain sienen kromosomaalinen DNA sopivalla restriktioentsyymil- 20 lä, esim. Sau3A:11a, ja kloonaamalla tuloksena saadut fragmentit sopivassa plasmidi- tai lambdafaagivektorissa, esim. lambda EMBL 3:ssa. Seuraavaksi, sopivan määrän pe- : säkkeitä tai plakkeja maljäämisen jälkeen, genominen tai • * cDNA-kir jasto voidaan seuloa sopivalla DNA-koettimella.
.·. : 25
Vaihtoehtoisesti cDNA-kir jasto voidaan valmistaa kloonaamalla cDNA, syntetoitu mRNAista, joka on eristetty ksyla-naasin synteesiin indusoiduista sienisoluista, soveltuvaan 1 ' faagivektoriin, esim. lambda gt 10:een tai lambda gt 30 ll:een. cDNA-kir jasto voidaan sitten seuloa DNA-koettimel- .*··. la, tai vaihtoehtoisesti käyttämällä immunologisia tapoja, tai malja-analyysillä.
» » : Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa, oligonukle- 35 otidikoettimet valmistetaan Aspergillus tubi gens iksen vil-jelmäsuodoksesta puhdistetun, todennäköisesti 25 kDa:n 13 108944 ksylanaasin mukaisen N-terminaalisen aminohapposekvenssin mukaan (katso kuva 3, kaava 1) ja/tai Staphylonoccus au-reuksen endoproteaasi V8:lla pilkotusta ksylanaasista saadun sisäisen peptidifragmentin aminohapposekvenssin mukaan 5 (katso kuva 4, kaava 2). Kuvissa 3 ja 4 esitetyt oligonuk-leotidiseokset ovat komplementaariset vastaavalle johdetulle ksylanaasi-mRNA:lie. Neljä positiivista faagikloonia saatiin lambda EMBL-kirjaston seulonnasta, valmistettu Sau3A;11a osittain pilkotusta, Aspergillus niger 10 DS16813:sta eristetystä DNArsta, N-terminaalisella oligo- seoksella AB 800 (seoksessa samat määrät AB801 - AB806, katso kuva 3). Aspergi Uus niger DS16813, myöhemmin luokiteltu uudelleen kuuluvaksi todennäköisemmin sukuun Aspergillus tubigensis (Kusters-van Someren et ai. (1991)), 15 talletettiin kokoelmaan Centraal Bureau voor Schimmelcul-tures, Baarn, Alankomaat, 20.7.1990, ja sille annettiin talletustunnus CBS 323.90.
Neljästä faagikloonista eristetty DNA hybridisoitui N-ter-20 minaalisen oligoseoksen kanssa, samoin kuin oligoseoksen kanssa, joka oli johdettu sisäisen fragmentin aminohappo-:V; johdannaisesta (katso kuva 4). Restriktioentsyymianalyysi
t I
; osoitti, että kaikki neljä kloonia sisälsivät DNA:ta sa- masta A.tubigensiksen genomisesta alueesta.
. . 25 l * % I < i
Noin 2,1 ke:n alue, joka hybridisoitui kummankin oli- f * · i * · ' goseoksen kanssa, on sekvensoitu. Nukleotidisekvenssi, esitetty kuvassa 8, käsittää 681 ep:n ksylanaasia koodaa- i * * * * · ' ’ van sekvenssin (jonka katkaisee yksi pieni 49 ep:n introni 30 asemasta 1179 asemaan 1230) , samoin kuin 949 ja 423 nukle- t ,··. otidin sekvenssit 5'- ja vastaavasti 3 '-reunustavista alu- I » eista.
; ! i On osoitettu, että ksylanaaseissa on kolme erilaista N- 1 » · 35 päätä, mahdollisesti fermentaatio-olosuhteiden seurauksena. Noin kolmanneksella näistä ksylanaaseista on seriini 14 108944 N-terminaalisena aminohappona (kuva 8, asema 1), toisella noin kolmanneksella on alaniini N-terminaalisena aminohappona (kuva 8, asema 2) ja lopuilla proteiineista on gly-siini N-terminaalisena aminohappona (kuva 8, asema 3).
5
Ksylanaasiproteiinia koodaavan DNA-sekvenssin saatavuus tekee mahdolliseksi mutanttiksylanaasien rakentamisen paikkasuunnatulla mutageneesilla. Jos ksylanaasin terti-äärirakenne tunnetaan, ja sen katalyyttiset ja substraatit) tiin sitoutuvat osat paikallistetaan, voidaan valita mu-tageneesiä varten aminohapot (esimerkiksi tietokonemallituksen avulla), jotka todennäköisimmin vaikuttavat katalyyttisiin ja/tai substraatin sitomistoimintoihin. Jos proteiinin tertiääristä rakennetta ei ole saatavilla, voi-15 daan joko tuottaa satunnaismutantteja kokonaisen koodaavan sekvenssin ohella, tai proteiinin tertiäärinen rakenne voidaan ennustaa vertaamalla muista mikro-organismeista eristettyjen samanlaisten tunnettujen ksylanaasien kanssa.
20 Jotta edistetään ksylanaasia koodaavan sekvenssin sisäl-tävän DNA-fragmentin liittymistä ekspressiorakenteisiin, jotka käsittävät yhden tai useamman heterologisen sääte- • » : lyalueen, voidaan käyttää polymeraasiketjureaktiota (PCR) , ! (Ehrlich, H. A. (toim.), 1989) sopivien restriktioentsyy- r ; 25 mikohtien tuottamiseen ksylanaasia koodaavan sekvenssin 5'- ja 3'-päihin. Restriktiokohtien valinta riippuu eks-pressiovektorin DNA-sekvenssistä, se on, muiden restriktiokohtien olemassaolosta DNA-molekyylissä.
,,· 30 Jotta saavutetaan ksylanaasiproteiinin yliekspressio al- kuperäisessä (homologisessa) tuotantolajissa, tai vaihto-,,,,i ehtoisesti toisessa sienilajissa, 6,9 ke:n Sali-fragmentti (katso kuva 5), joka käsittää koko geenin sen 5'- ja 3'-! säätelyalueiden kera, tai vaihtoehtoisesti koko geenin 35 liitettynä toisten geenien säätelyalueisiin, viedään va- 15 108944 littuun ekspressioisäntään, jotta lisätään geenin ko-piomäärää ja vastaavasti proteiinin ekspressiota.
Jos halutaan käyttää heterologista ekspressioisäntää, ja 5 valitaan hiiva- tai bakteerikanta, käytetään keskeytymätöntä (intronitonta) DNA-sekvenssiä heterologisen eks-pressiovektorin rakentamiseen, jotta vältetään mahdollisuus, ettei heterologinen isäntä tunnista genomisessa fragmentissa olevia liitossignaaleja. Tämä keskeytymätön 10 DNA-sekvenssi voidaan saada cDNA-kirjastosta, joka on rakennettu ksylanaasien synteesiin indusoiduista soluista eristetyn mRNA:n mukaan. Tämä kirjasto voidaan seuloa oli-gonukleotidillä tai cDNA-koettimella, jotka on saatu edellä kuvatulla tavalla. Vaihtoehtoisesti keskeytymätön DNA-15 sekvenssi voidaan saada käyttämällä polymeraasiketjureaktiota ja soveltuvia 5'- ja 3'-oligonukleotideja ensimmäiseen cDNA-ketjuun, joka on syntetoitu ksylaanilla indusoitujen solujen RNArsta.
20 Tämän keksinnön yhteydessä, yliekspressio määritellään kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin ekspressiona tasoilla, jotka ovat yli sen, mitä yleensä tavataan homo- :1· logisilta villityyppisiltä organismeilta. Samassa yh- teydessä, yliekspressiolla tarkoitetaan myös kiinnostuksen 25 kohteena olevan ksylanaasin ekspressiota heterologisessa organismissa joka ei normaalisti tuota tällaista ksylanaa- . , siä, paitsi saatettaessa kiinnostuksen kohteena olevaa » < » ksylanaasia koodaava DNA-sekvenssi heterologiseen ekspres-‘ sioisäntään. Näiden ekspressioisäntien jälkeläisten tulee 30 luonnollisesti ymmärtää kuuluvan myöskin tämän keksinnön : · piiriin.
Kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin yliekspressio ‘‘\ voidaan saavuttaa myös heterologisten säteilyalueiden va- * ♦ 35 linnalla, esim. promoottorin, erityksen johto- ja lopetus- * * * sekvenssin valinnalla, mikä palvelee ekspressiota lisäävä- 16 108944 nä ja, jos on toivottua, kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin erityksen määrää lisäävänä valitusta ekspres-sioisännästä ja/tai huolehtimaan kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin ekspression indusoituvasta kontrollis-5 ta.
Paitsi kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin luontaista promoottoria, muita promoottoreita voidaan käyttää ohjaamaan sen ekspressiota. Promoottori voidaan valita 10 tehokkuutensa perusteella ohjaamaan kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin ekspressiota halutussa ekspressioisän-nässä.
Toisessa suoritusmuodossa voidaan valita konstitutiivinen 15 promoottori ohjaamaan halutun ksylanaasin ekspressiota suhteellisen puhtaana muista ksylanaaseista. Tällainen ekspressiorakenne on sitä paitsi edullinen, sillä se kiertää tarpeen viljellä ekspressioisäntää alustalla, joka sisältää kiinteitä ksylaaneja indusoivana substraattina.
20
Esimerkkejä voimakkaista konstitutiivisista ja/tai indusoituvista promoottoreista, jotka ovat edullisia käytet-täviksi ekspressioisännissä, jotka ovat sieniä, ovat ATP-syntetaasi-, alayksikkö 9- (oliC) , trioosifosfaatti-isome- * » >, : 25 raasi- (tpi), alkoholidehydrogenaasi- (adhA), a-amylaasi- ' (amy) , amyloglukosidaasi- (AG) , asetamidaasi- (amdS) ja , . glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (gpd) -promootto- ; / rit.
30 Esimerkkejä voimakkaista hiivapromoottoreista ovat alko- holidehydrogenaasi-, laktaasi-, 3-fosfoglyseraattikinaasi-‘ ja trioosifosfaatti-isomeraasipromoottorit.
Esimerkkejä voimakkaista bakteeripromoottoreista ovat a-35 amylaasi- ja Spo2-promoottorit, samoin kuin promoottorit :,· · ekstrasellulaaristen proteaasien geeneistä.
17 108944
Hybridipromoottoreita voidaan myös edullisesti käyttää lisäämään ekspressiorakenteen indusoituvaa säätelyä.
Tämän keksinnön mukaiset edulliset promoottorit ovat nii-5 tä, jotka ovat alkuperältään amyloglukosidaasigeenin (AG) promoottoreita ja luontaisia ksylanaasigeenin promoottoreita.
On usein toivottavaa, että kiinnostuksen kohteena oleva 10 ksylanaasi eritetään ekspressioisännästä kasvatusalustaan, josta ksylanaasi voidaan ottaa talteen helpommin.
Tämän keksinnön mukaisesti, kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin luontaista erityksen johtosekvenssiä voidaan 15 käyttää tehostamaan ekspressoidun ksylanaasin eritystä.
Kuitenkin ksylanaasin ekspression nostaminen johtaa toisinaan proteiinin tuottamiseen tasoina, jotka ovat alle sen, mitä ekspressioisäntä pystyy käsittelemään ja erit-20 tämään, saaden aikaan proteiinituotteen rakentumisen solun sisään, johtuen pullonkaulasta proteiinin kuljetuksessa soluseinän läpi. Vastaavasti tämä keksintö tarjoaa käyt-;··· töön myös heterologisia johtosekvenssejä, saamaan aikaan tehokkain mahdollinen ksylanaasin eritys valitusta eks-·. : 25 pressioisännästä.
. . Tämän keksinnön mukaisesti johtosekvenssi voidaan valita halutun ekspressioisännän mukaan. Voidaan valita hetero-" loginen eritysjohtosekvenssi, joka on homologinen muille 30 ekspressiorakenteen säätelyalueille. Esimerkiksi voidaan ”· käyttää voimakkaasti erittyvän amyloglukosidaasiproteiinin johtosekvenssiä yhdessä amyloglukosidaasipromoottorin it-sensä kanssa, samoin kuin yhdessä muiden promoottoreiden kanssa. Hybridisignaalisekvenssejä voidaan myös käyttää 35 edullisesti tämän keksinnön yhteydessä.
18 108944
Esimerkkejä edullisista heterologisista erityksen joh-tosekvensseistä ovat ne, jotka ovat peräisin amyloglu-kosidaasigeenistä (sienet), α-faktorin geenistä (hiivat) tai α-amylaasin geenistä (Bacillus).
5 Tämän keksinnön mukaisesti edullisimmat erityksen joh-tosekvenssit ovat ne, jotka ovat peräisin amyloglu-kosidaasigeenin (AG) ja luontaisesta ksylanaasin joh-tosekvenssistä.
10
Yleensä lopetussekvenssejä ei pidetä ratkaisevina elementteinä geenien yliekspression kannalta. Jos halutaan, lopetussekvenssi voidaan valita samoista geeneistä kuin promoottorit, tai vaihtoehtoisesti voidaan käyttää homo-15 logista lopetussignaalia.
Yllä mainitun genomisen fragmentin lisäksi transformoitava DNA voi sisältää selektiomerkin erottamaan solut, jotka sisältävät halutun geenin, joukosta transformoitumattomia i 20 soluja. Tämä selektiomerkki, varustettuna soveltuvilla 5'-ja 3'-säätelysekvensseillä, voi olla samassa DNA-molekyy-lissä, joka sisältää halutun geenin, tai se voi olla eril-:*·· lisenä molekyylinä. Jälkimmäisessä tapauksessa tulee suo- rittaa ko-transformaatio. Ekspressiovektorin/selektiovek-·, : 25 torin suhde tulee säätää siten, että prosentuaalisesti suuri määrä valittuja transformantteja on ottanut sisäänsä . . myös vektorin, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin sisältävän ekspressiovektorin.
30 Sopivimmat valintajärjestelmät teollisille mikro-organis-meille ovat ne, jotka muodostuvat joukosta selektiomerk-',(t: kejä, jotka eivät edellytä mutaatiota isäntäorganismissa.
,·*·. Esimerkkejä sienten selektiomerkeistä ovat asetamidaasin (amdS) , ATP-syntetaasin, alayksikkö 9:n (oliC) ja benomyy-35 liresistenssin (benA) geenit. Esimerkkejä ei-sienialkupe-: rää olevista selektiomerkeistä ovat G418 resistenssigeeni 1 08944 19 (hiiva), ampisilliiniresistenssigeeni (E. cnl i) ja neo-mysiiniresistenssigeeni (Bacillus).
Kun haluttu ekspressiorakenne on valmistettu, se transfor-5 moidaan sopivaan kloonausisäntään, kuten E. coliin, rakenteen lisäämiseksi. Jälkeenpäin ekspressiorakenne saatetaan sopivaan ekspressioisäntään, jossa ekspressiorakenne liitetään edullisesti genomiin. Tiettyjä isäntiä, kuten Ba-cillus-lajit, voidaan käyttää sekä kloonaus- että ekspres-10 sioisäntinä, välttäen siten ylimääräiset transformaatio-! vaiheet.
Tämän keksinnön mukaisesti voidaan käyttää joukkoa eks-pressioisäntiä kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin 15 yliekspressioon. Eräässä suoritusmuodossa voidaan käyttää homologista ekspressioisäntää. Tämä käsittää halutun eks-pressiorakenteen saattamisen takaisin kantaan, josta ksy-lanaasia koodaava DNA-sekvenssi eristettiin, joko niin, että geenien kopiomäärää on lisätty, tai heterologisten 20 säätelyalueiden kontrollin alaisena, kuten edellä on kuvattu, tai sekä että.
Toisessa suoritusmuodossa kiinnostuksen kohteena oleva ksylanaasi voidaan yliekspressoida saattamalla kiinnostuk-·. : 25 sen kohteena olevaa ksylanaasia koodaava DNA-rakenne sopi- vien säätelysekvenssien kontrollin alaisena heterologisiin • · (.# . isäntiin, kuten bakteereihin, hiivoihin tai sieniin, ja !..* ekspressoimalla niissä. Tätä tarkoitusta varten kiinnos- '·’ tuksen kohteena olevaa ksylanaasia koodaava DNA-sekvenssi 30 ekspressoidaan edullisesti sellaisten promoottori- ja ter-minaattorisekvenssien kontrollin alaisena, jotka ovat pe- i · · räisin heterologisesta isännästä. Lisäksi voi olla väittä- » mätöntä korvata kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin luontainen erityksen johtosekvenssi toisella, joka on ho- • · . 35 mologinen ekspressioisännälle, jotta saavutetaan tuotteen : tehokkain ekspressio ja eritys.
20 108944
Tekijät, kuten koko (molekyylipaino), mahdollinen gly-kosylaation tarve tai kiinnostuksen kohteena olevan ksy-lanaasin ekstrasellulaarisen erityksen toivottavuus, näyttelevät tärkeää roolia ekspressioisännän erityksessä.
5
Gram-negatiivista bakteeria E. coli käytetään laajalti isäntänä heterologiselle geeniekspressiolle, mutta se pää-! asiassa kerää suuria määriä heterologista proteiinia solun sisälle. Tästä johtuva halutun proteiinin puhdistus jou-10 kosta E. colin intrasellulaarisia proteiineja, voi toisinaan olla vaikeaa.
Päinvastoin kuin E. coli, bakteerit suvusta Baoillus ovat erittäin sopivia heterologisina isäntinä, sen vuoksi, että 15 niillä on kyky erittää proteiineja kasvatusalustaan.
Vaihtoehtoisesti heterologinen isäntä, joka valitaan ryhmästä hiivoja tai sieniä voi olla edullinen. Yleensä hiivasolut ovat edullisia verrattuna sienisoluihin, koska ne 20 ovat helpompia manipuloida. Jotkin proteiinit kuitenkin joko erittyvät huonosti hiivasolusta, tai joissain tapauksissa niitä ei prosessoida oikein (esim. hypergly-: * ·: kosylaatio hiivassa). Näissä tapauksissa tulisi valita sieni-isäntäorganismi.
/·,: 25
Heterologinen isäntä voidaan myös valita ekspressoimaan
* I
·,; kiinnostuksen kohteena oleva ksylanaasi, joka on olennai- • * · sesti puhdas muista polysakkarideja hajottavista entsyy- * meistä, valitsemalla isäntä, joka ei normaalisti tuota 30 tällaisia entsyymejä, kuten Klnyveromyces lactis.
Esimerkkejä edullisista ekspressioisännistä tämän keksin-·. non puitteissa ovat sienet, kuten Aspergillus-lajit (ku- vattu EP-patenttihakemuksissa 184.438 ja 284.603) ja * 35 Trichoderma-la j i h, bakteerit, kuten Bacillus-lajit (kuvat- i tu EP-patenttihakemuksessa 134,048) ja hiivat, kuten Klu- 21 108944 yveromycp.s-1a j i t (kuvattu EP-patenttihakemuksessa 96.430 ja 301.670) ja Saccharomyces-Ίaj it.
Erityisen edullisia ekspressioisäntiä voidaan valita seu-5 raavista: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Asper gillus aculeatus, Aspergi1 Tus tnbigensis, Trichoderma ree-sei, Bacillus subtil isf Bacillus Ίicheniformisf Kluyvero-mycea lactis ja Saccharomyces cerevisiae.
10 Kiinnostuksen kohteena olevan ksylanaasin yliekspressiota tehostetaan kasvattamalla ekspressioisäntiä, jotka on transformoitu ksylanaasi-ekspressiorakenteella, tavanomaisessa fermentointiravintoalustassa.
15 Fermentointialusta käsittää tavallisen kasvatusalustan, joka sisältää hiilenlähteen (esim. glukoosi, maltoosi, melassit jne.), typenlähteen (esim. ammoniumsulfaatti, ammoniumnitraatti, ammoniumkloridi, jne.), orgaanisen typenlähteen (esim. hiivauute, mallasuute, peptoni jne.) ja 20 epäorgaaniset ravinnelähteet (esim. fosfaatti, magnesium, kalium, sinkki, rauta, jne.). Valinnaisesti voidaan lisätä indusoija (esim. kaura-spelttiksylaani).
Sopivan ravintoalustan valinta voi perustua ekspressi- • ; 25 oisännän valintaan ja/tai ekspressiorakenteen säätelyvaa- ", timuksiin. Tällaiset alustat ovat hyvin tunnettuja alaan « · perehtyneille. Ravintoalusta voi haluttaessa sisältää li-säaineosia, jotka suosivat transformoituja ekspressioisän-V · tiä muiden mahdollisesti kontaminoivien mikro-organismien 30 kustannuksella.
i * » * ♦ I > • Fermentointi suoritetaan edullisesti ajanjaksolla 0,5 - 20 vuorokautta, panos- tai fed-batch -menetelmällä lämpöti-lassa alueella 0-45 °C, ja pH:ssa välillä 2 - 10. Edul- , 35 liset fermentointiolosuhteet ovat lämpötila-alueella 20 - » * * • » * » · 22 1 08944 37 °C ja pH- välillä 3-9. Sopivat olosuhteet valitaan ekspressioisännän valinnan mukaan.
Fermentoinnin jälkeen solut poistetaan fermentointines-5 teestä sentrifugoimalla tai suodattamalla. Solujen poistamisen jälkeen kiinnostuksen kohteena oleva ksylanaasi voidaan sitten ottaa talteen ja, jos toivotaan, puhdistaa ja eristää tavanomaisilla menetelmillä.
10 Tuote formuloidaan pysyvästi joko nesteenä tai kuivassa muodossa. Tiettyjä sovellutuksia varten voi olla edullista immobilisoida entsyymi kiinteään kantajaan.
Kiinnostuksen kohteena olevat ksylanaasit, jotka on tuo-15 tettu tämän keksinnön mukaisella tavalla, voidaan annostella joko yksin, tai yhdessä muiden valittujen entsyymien kanssa joukkoon prosesseja, jotka edellyttävät ksylaania hajottavan entsyymin aktiivisuutta. Sen lisäksi tämän keksinnön mukaiset sieniksylanaasit, joiden pH-optimi on 20 yleensä alhaisempi kuin bakteerialkuperää olevien ksy-lanaasien, soveltuvat erityisen hyvin käytettäviksi teollisuusprosesseissa, jotka toteutetaan alhaisessa pHrssa.
Tämän keksinnön mukaisesti on havaittu, että tämän keksin- * ; 25 nön mukaisesti tuotettuja ksylanaaseja voidaan käyttää ! leivän leipomisessa. Pienien ksylanaasimäärien lisääminen * * · * ♦ jauhoihin antaa edullisia ominaisuuksia taikinalle, ja * « · " siten leivälle itselleen, kuten lisääntynyt leivän tila- V · vuus ja paremmat rakenteelliset ominaisuudet, kuten murtu- 30 mis- ja repimisominaisuudet ja murentumisominaisuus.
: Ksylanaaseja voidaan myös lisätä eläinten rehukoostumuk- ·. siin, joissa on runsaasti arabinoksylaaneja ja glukoksy- laaneja. Lisättynä yksimahaisten eläinten (esim. siipi-35 karja tai siat) rehuihin (mukaanluettuna siilorehu), jotka ; ; sisältävät viljoja, kuten ohra, vehnä, maissi, ruis tai 23 108944 kaura, tai viljojen sivutuotteisiin, kuten vehnäleseet tai maissileseet, entsyymi parantaa huomattavasti kasvisolujen seinien hajoamista, mikä johtaa siihen, että eläimet käyttävät kasviravinteet paremmin hyödyksi. Tämän seurauksena 5 kasvunopeus ja/tai rehun sulaminen parantuvat. Sen lisäksi ksylanaaseja voidaan käyttää vähentämään ksyläänejä sisältävien rehujen viskoosisuutta.
Ksylanaasia voidaan lisätä etukäteen rehuun tai siilore-10 huun, jos pidetään esiliotusta tai märkäruokavaliota toivottavana. Edullisempaa kuitenkin on, jos tämän keksinnön mukaiset ksylanaasit lisättynä rehuun jatkavat ksylaanien hydrolysointia in vivo. Sieniksylanaasit, joilla yleensä on alhainen pH-optimi, kykenevät vapauttamaan tärkeitä 15 ravinteita sellaisiin happamiin ympäristöihin, kuten tällaisella ksylanaasilisäyksellä varustettua rehua syövän eläimen mahaan.
Tämän keksinnön mukaisesti tuotetut ksylanaasit ovat myös 20 tehokkaita parantamaan suodatusta, ja poistamaan liuenneita orgaanisia aineita nesteistä prosesseissa, joissa omenan tislausjätettä muunnetaan biologisesti mikrobi-biomassaksi. Rihmasienten tuottamia ksylanaaseja voidaan käyttää edullisesti tässä prosessissa.
·. : 25 ! Myöskin tämän keksinnön mukaisesti, glukoosisiirappeja, joilla on parantunut suodattuvuus ja/tai alempi vis-kositeetti, tuotetaan epäpuhtaasta viljatärkkelyksestä * altistamalla epäpuhdas tärkkelys ensin a-amylaasin toimin-30 nalle, sitten sieniksylanaaseille, jotka on tuotettu tämän * keksinnön mukaisesti, ja lopulta hydrolyysille. Tämän kek-; sinnön mukaisia ksylanaaseja voidaan samoin käyttää oluen ·, panossa, parantamaan vierteen suodattuvuutta.
35 Ksylanaaseja voidaan käyttää myös poistamaan ligniinejä : : kraft-massasta ja siten edistämään valkaisua vähentämällä i ? 1 * ^ 24 108944 tarvittavan kloorin määrää paperituotteiden valmistuksessa.
Lisäksi tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja ksy-5 lanaaseja voidaan käyttää muissa prosesseissa, kuten lisäämään saantoa hedelmä- tai vihannesmehujen valmistuksessa, sokerijuurikasmassan entsymaattisessa hydrolyysissä, saadun hydrolysoidun fraktion ollessa käytettävissä mikro-organismien kasvatusalustoissa; maatalouden jätteissä, 10 kuten maissintähkissä, vehnänoljissa ja jauhetuissa pähkinänkuorissa; ja tietyissä kierrätettävissä materiaaleissa, kuten jätepaperissa.
Seuraavat esimerkit tarjotaan antamaan alan keskitason 15 ammattilaisille täydellinen selostus ja kuvaus keksinnön valmistuksesta ja käytöstä; esimerkkien ei ole tarkoitus rajoittaa sitä alaa, mitä keksijät pitävät keksintönään.
On tehty ponnistuksia, jotta varmistettaisiin täsmällisyys, mitä tulee käytettyihin lukuihin (esim. määrät, läm-20 pötila, pH, jne.), mutta joitain koevirheitä ja poikkeamia tulisi ottaa lukuun. Jollei toisin mainita, lämpötila on esitetty Celsius-asteina ja paine on ilmakehän paine tai ·.: lähellä sitä.
» · 4 »
» I
i * * t * i * «* I ^ · *(· I I | * J t > s ' » ·- I > 25 108944
Esimerkki 1
Aspergillus tubioensiksen endoksylanaasin XYL A puhdistus ja karakterisointi 5 Esimerkki 1.1 I Aspergillus tubigensiksen endo-ksylanaasin XYL A puhdistus i
Viljelmäsuodos saatiin kasvattamalla Aspergillus nigeriä DS16813 (CBS 323.90 - myöhemmin luokiteltu uudelleen kuu-10 luvaksi todennäköisemmin lajiin A. tubioensis; Kusters-van Someren et ai. (1991)) kasvualustassa, joka sisälsi (litraa kohti): 30 g kaura-spelttiksylaania (Sigma); 7,5 g NH4N03, 0,5 g KC1, 0,5 g MgS04, 15 g KH2P04 ja 0,5 g hiiva-uutetta (pH 6,0). Viljelmäsuodos konsentroitiin tilavuu-15 teen noin 35 ml ja ultrasuodatettiin sitten Diaflo PM 10 suodattimena 50 ml Amicon moduulissa suolojen poistamiseksi .
Supernatantti konsentroitiin sitten tilavuuteen 10 ml ja 20 retentaatti pestiin kahdesti 25 ml:11a 25 mM Tris-HCl-pus-kuria (pH 7,0). Pesun jälkeen retentaatin tilavuus saatettiin 25 ml:ksi.
:··: Tämä retentaatti injektoitiin 1 ml annoksina Syn Chropak 25 AX 300 -pylvääseen (mitat 10 x 250 mm) ja eluoitiin seu- : raavalla HPLC-järjestelmällä: ♦ » eluutionopeus: 2 ml/min.
• » ,·. ; eluutiopuskuri A: 25 mM Tris-HCl pH 7,0 eluutiopuskuri B: 25 mM Tris-HCl pH 7,0 + 1 M NaCl « I · » * * f » » 26 1 08944 eluutiogradientti: aika
(min) % A % B
0 99 1 12 97 3 5 30 80 20 50 50 50 70 0 100 90 0 100 95 99 1 10 Kerättiin 1 ml fraktiot. Eluoidun proteiinin osoitus tehtiin jatkuvalla UV-absorptiomittauksella 280 nm:ssa. Eluu-tioprofiili on esitetty kuvassa 2.
Fraktioiden endoglukanaasiaktiivisuus tutkittiin täplätes-15 tiliä. Tässä täplätestissä lisätään 12 ml sitraatti-fos-faattipuskuria (valmistettu sekoittamalla 900 ml 0,2 M Na2HP04 ja 125 ml 0,5 M sitruunahappoa, mitä seurasi liuoksen pH:n säätö pH 5,6reen käyttämällä 0,5 M sitruunahappoa tai 0,2 M Na2HP04), joka sisältää 0,5 % kaura- 20 spelttiksylaania (Sigma), 180 mg:aan agaria (Difco) ja kuumentamalla seos 100 °C:seen agarin liuottamiseksi. Kun agarseos on jäähdytetty 60 °C:seen, se kaadetaan tasaisesti agaroosigeelikalvolle. Eluointifraktiopisarat asetetaan "·1” yksittäin kalvolle ja inkuboidaan 30 minuuttia 30 °C:ssa.
25 Jos endoksylanaasiaktiivisuutta on läsnä, yksittäisten pisaroiden paikka agarkalvolla on kirkas.
• 1 : Kokonaisksylanaasiaktiivisuus määritettiin kerätyistä
* » I
fraktioista kvantitatiivisesti, määrittämällä pelkistävien ' 30 sokereiden määrä, joka tuotettiin ennalta määrättynä ajan jaksona, Leathersin et ai. (1984) kuvaamalla mikroanalyy- >it '· ‘1 sillä, käyttämällä kaura-spelttiksylaania 50 mM nat- V 1 riumasetaatissa pHrssa 5,0 substraattina. Aktiivisuusyksi- j köt ovat myös, kuten Leathers (supra) on määritellyt.
35 t t i · » » · » · 1 27 108944
Eksoksylanaasiaktiivisuus eluoiduissa fraktioissa määritettiin menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Poutanen ja Puis (1988), käyttämällä p-nitro-fenyyli-p-D-ksylopyrano-sidia (0,3 mM, Sigma) substraattina pH:ssa 5,0 ja 30 5 °C:ssa.
Täplätesti osoitti, että huippuja B, F ja K vastaavat elu-ointifraktiot (katso kuva 2) sisälsivät endoksylanaasiak-tiivisuutta. Kokonaisksylanaasimääritys osoitti aktiivi-10 suutta huippujen B, F, H ja K eluointifraktioissa. Huippujen B ja H eluointifraktioiden määritettiin sisältävän eksoksylanaasiaktiivisuutta.
Huippujen F (XYL2-proteiini) ja K (XYL A -proteiini) elu-15 ointifraktiot puhdistettiin edelleen toistetulla ionin-vaihtokromatografiällä. Niiden sisältämät endoksylanaasit karakterisoitiin SDS/PAGE:lla (Moonen et ai., 1982) ja isoelektrisellä fokusoinnilla (3,5 < pH< 9,5) LKB-vä-lineistöllä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Endoksy-20 lanaasi F:n ilmeinen molekyylipaino, määritettynä SDS-PA-GErlla, oli noin 22 kDa; endoksylanaasi K:n ilmeinen molekyylipaino oli noin 24 kDa. Endoksylanaasi F:n isoelektri-nen piste (IEP) oli noin pH 4,0, kun taas endoksylanaasi K:n IEP määritettiin alhaisemmaksi kuin 3,5.
ΐ V 25
Esimerkki 1.2 ....: Aspergillus tubiaensiksen endoksylanaasin XYL A N-pään . ·. ; aminohapposekvensointi • · * « · • * · 30 Noin 5 pg endoksylanaasia, puhdistettu, kuten esimerkissä 1.1 on esitetty, saatettiin elektroforeesiin 12 % SDS-po- ' lyakryyliamidigeelissä, mitä seurasi elektroblottaus Immo- • ! » v * bilon-P-membraanille (millipore), Matsudairan (1987) esit- tämän menetelmän mukaisesti. Päävyöhykkeen, jonka ilmeinen 35 molekyylipaino (SDS-PAGE) on 25 kDa, sisältävä membraani-fragmentti saatetaan sekvenssianalyysiin kaasufaasisekven- 28 108944 soijaan (Eurosequence, Groningen). Seuraava N-terminaali-nen aminohapposekvenssi on määritetty: 15 10
Ala-Gly-Ile-Asn-Tyr-Val-Gln-Asn-Tyr-Asn 5 (Kuva 3, kaava 1)
Kuitenkin havaittiin suunnilleen samat määrät kahta muuta varianttia, joiden N-terminaaliseksi aminohapoksi määritettiin joko seriini (kuva 8, asema 1) tai glysiini (kuva 10 8, asema 3).
Esimerkki 1.3
Endoproteinaasi Glu-C:llä irrotettujen endoksylanaasi XYL A:n peptidien aminohappomääritys 15
Noin 260 pg endoksylanaasia, puhdistettu kuten esimerkissä 1.1 on esitetty, liuotettiin 110 pl:aan liuosta, joka sisälsi 50 μΜ ammoniumbikarbonaattipuskuria, pH 7,5 ja 2 mg/ml SDS. Kun liuosta oli kuumennettu kolme minuuttia 20 100 °C:ssa, ja se oli jäähdytetty huoneenlämpöön, lisät tiin endoproteinaasi Glu-C:tä (Staphylococcus aureus pro-teaasi V8) 18-kertaisena molaarisena ylimääränä. Proteiinien pilkkominen suoritettiin 20 minuutissa huoneeniämmös-sä, minkä jälkeen reaktioseosta kuumennettiin kolme mi-25 nuuttia 100 °C:ssa.
* ♦ ·
Noin viidennes reaktioseoksesta saatettiin elektroforee-.·, : siin 15-prosenttiseen SDS-polyakryyliamidigeeliin, mitä seurasi blottaus Immobilon-P-membraanille (Millipore) Mat-30 sudairan (1987) esittämän menetelmän mukaisesti. Havait tiin kolme fragmenttia, joiden molekyylimassat olivat 19, 16 ja vastaavasti 4 kDa. Kaksi suurinta fragmenttia (19 ja ’ 16 kDa) käytettiin kaasufaasisekvensointiin (Applied Bio- • systems, malli 470A proteiinisekvensoija, Eurosequence, 35 Groningen). 2-3 nmol erityistä peptidiä sisältävät frag- % · t 29 108944 mentit pestiin ja saatettiin sekvenssianalyysiin Amonsin (1987) esittämän menetelmän mukaisesti.
Seuraava N-terminaalinen aminohapposekvenssi on määritetty 5 19 kDa:n fragmentista: 15 10 14
Tyr-Tyr-Ile-Val-Glu-Asp-Tyr-Gly-X-Tyr-Asn-Pro-Cys-(Ser) (Kuva 4, kaava 2) 10 Asemassa 9 (X) olevaa aminohappoa ei pystytty määrittämään. Asemassa 14 havaittiin vain pieni määrä seriiniä, kuten sulut osoittavat.
Seuraava aminohapposekvenssi on määritetty 16 kDa:n frag-15 mentin N-päästä: 15 10 14
Tyr-Tyr-Ile-Val-Glu-Asp-Tyr-Gly-(Ser)-X-Asn-Pro-Cys-Ser (Kuva 4, kaava 3) 20 Aminohappoa (X) asemassa 10 ei voitu määrittää. Tästä fragmentista havaittu sekvenssi on melkein identtinen 19 kDa:n fragmentin sekvenssin kanssa. Kummallakin peptidillä on sama N-terminaalinen sekvenssi, joka ei ole identtinen intaktille proteiinille määritetyn N-terminaaliselle ami-: 1 : 25 nohapposekvenssille (esimerkki 1.2, kaava 1). On määritet-ty, että nämä kaksi sisäistä fragmenttia vastaavat sek-·;1·;' venssiä, joka alkaa asemasta 79, kuten kuvassa 8 on esi- : tetty.
» # » • · · • ( »
· I
30 108944
Esimerkki 2
Aspergillus niqer -kannan DS16813 (CBS 323.90; myöhemmin luokiteltu uudelleen A. tubigensikseksi) genomisen kirjaston rakentaminen 5
Esimerkki 2.1 DNA:n eristys Aspergillus nigeristä DS16813 (CBS 323.90; myöhemmin luokiteltu uudelleen A. tubigensikseksi) 10 Sieni-DNA eristettiin de Graaffin et ai. (1988) esittämällä menetelmällä. Rihmasto, joka oli kasvatettu yli yön nestemäisessä minimialustassa (1000 ml kohti: 6,0 g NaN03; 1,5 g KH2P04; 0,5 g MgS04x7H20; 0,5 g KC1, 1 ml visniac-li-uosta (Visniac ja Santer, 1957: 10 g EDTA; 4,4 g 15 ZnS04x7H20; 1,0 g MnCl2x4H20; 0,32 g CoCl2x6H20; 0,32 g Cu- S04x5H20; 0,22 g (NH4)6Mo7024x4H20; 1,47 g CaCl2x2H20; 1,0 g FeS04x7H20; pH 4,0]; pH 6,0), johon oli lisätty 0,2 % kasa-minohappoja ja 0,5 % hiivauutetta, kerättiin, pestiin kylmällä suolaliuoksella, jäädytettiin nestemäiseen typpeen 20 ja varastoitiin -80 °C:seen. Nukleiinihapot eristettiin hajottamalla 0,5 g jäädytettyä rihmastoa, käyttämällä mik-rodismembratoria (Braun). Saatu rihmastojauhe uutettiin vasta valmistetulla uuttopuskurilla.
« jV; 25 Uuttopuskuri valmistettiin seuraavasti: 1 ml tri-isopro- : pyylinaftaleenisulfonihappoa (TNS) (20 mg/ml) sekoitettiin • · huolellisesti 1 ml:n p-aminosalisyylihappoa (PAS) kanssa ,·, ; (120 mg/ml) ja lisätiin 0,5 ml 5 x RNB-puskuria (1000 ml kohti: 121,10 g Tris; 73,04 g NaCl; 95,10 g EGTA; pH sää- * 30 detty 8,5:een HCl:llä). 1,5 ml fenolilisäyksen jälkeen uuttopuskuria tasapainotettiin 10 minuuttia 55 °C:ssa.
* * * Lämmin puskuri lisättiin sitten rihmastojauheeseen ja sus-V · pensiota sekoitettiin huolellisesti 1 minuutin ajan käyt- : tämällä vortex-sekoittajaa. Kun oli lisätty 1 ml klorofor- ,··, 35 mia, suspensiota sekoitettiin uudelleen 1 minuutin ajan.
’·’ Sentrifugoinnin jälkeen 104 x g 10 min käyttäen Sorvali • * * a i 31 108944 high speed sentrifugia, vesifaasi uutettiin vielä kerran samalla määrällä fenoli/kloroformia (1:1) ja sen jälkeen kahdesti kloroformilla. DNA eristettiin vesifaasista käyttämällä seuraavaa menettelytapaa; DNA saostettiin välittö- 5 mästi kahdella tilavuudella etanolia huoneenlämmössä, ja kerättiin sen jälkeen sentrifugoimalla Sorvali high speed sentrifugilla 10* x g 10 min, pestiin kahdesti liuottamalla DNA uudelleen tislattuun steriiliin veteen ja seostamalla ! se taas etanolilla. RNA poistettiin lisäämällä RNaasi Aita 10 (20 pg/ml) lopulliseen liuokseen.
1 Esimerkki 2.2
Aspergillus tubiaensiksen DNA:n osittainen pikkominen Sau-3A:lla ja DNA-fragmenttien eristys agaroosigeelielektrofo-15 reesin jälkeen
Aspergillus nigeristä DS16813 (myöhemmin luokiteltu uudelleen A. tubigensikseksi) esimerkissä 2.1 esitetyllä tavalla eristetty DNA (30 pg) pikottiin osittain inkuboimalla 20 DNA:ta 0,1 U:n kanssa Sau3A:ta 30 minuuttia 37 °C:ssa. Saadut fragmentit kokofraktioitiin elektroforeesilla 0,4-prosenttisella agaroosilla TAE-puskurissa, joka sisälsi 0,5 pg/ml etidiumbromidia. Kooltaan 14 - 22 ke:n fragmen-;·'· tit, verrattuna bakteriofagin lambda DNA ihan pilkottuna 25 Bglll: 11a (22,0, 13,3, 9,7, 2,4, 0,65 ja 0,44 ke) koko- , , : markkereina, otettiin talteen leikkaamalla sopiva alue * · geelistä.
» » I ·
» » I
Nämä fragmentit otettiin talteen agaroosikappaleesta * 30 elektroeluutiolla käyttämällä ISCO-kuppeja. Dialyysimem- braani asetettiin sekä tämän kupin suuriin että pieniin säiliöihin, kuppi täytettiin 0,005 x TAE:11a (laimennettu 50 x TAE-kantaliuoksesta (1000 ml kohti): 242,0 g Tris; 57,1 ml jääetikkahappoa; 100 ml 0,5 M EDTA; pH säädetty , , 35 8,0:aan HCl:lla) ja agaroosipala asetettiin suureen säi liöön kuppiin. Tämän jälkeen kuppi asetettiin elekt- » t 32 108944 roeluutiolaitteeseen, suuri säiliö katodikammioon, joka sisälsi TAE:ta ja pieni säiliö anodikammioon, joka sisälsi TAE/3 M NaClria. Fragmentteja elektroeluoitiin 100 V 2 tunnin ajan. Jälkeenpäin kuppi otettiin elektroeluu-5 tiolaitteesta ja puskuri poistettiin suuresta säiliöstä, kun taas puskuri poistettiin vain pienen säiliön yläosasta. Jäljelle jäänyttä, DNA-fragmentit sisältävää puskuria (200 μΐ) dialysoitiin kupissa tislattua vettä vastaan 30 minuutin ajan. Lopulta DNA saostettiin lisäämällä 0,1 10 tilavuutta 3 M NaAc, pH 5,6 ja 2 tilavuutta kylmää (-20 °C) etanolia. DNA kerättiin sentrifugoimalla (Eppen-dorf) 30 minuuttia 14,000 x g, 4 °C:ssa. Supernatantin poistamisen jälkeen DNA-pelletti kuivattiin käyttämällä Savant Speedvac tyhjiösentrifugia. Etanolisaostuksen jäl-15 keen DNA liuotettiin 10 plraan TE-puskuria (10 mM Tris-HC1, pH 8,0; 1 mM EDTA; pH 8,0) ja konsentraatio määritettiin agaroosielektroforeesilla käyttäen tunnettuja kon-sentraatioita lambda DNA:ta vertailuna, ja etidiumbromidi-värjäystä DNA:n havaitsemiseen.
20
Esimerkki 2.3
Aspergillus tubiaensiksen DNA-fragmenttien kloonaus bakteriofagi lambdaan EMBL 3 . < i 1 » ·1'1: 25 Genomisen DNA:n esimerkissä 2.2 esitetyllä osittaisella pilkkomisella saadut fragmentit ligatoitiin bakteriofagi t · lambdan EMBL 3 BamHI käsivarsiin, saatu Promegalta, seu-; raavalla menettelytavalla: 4 ui (2 ug) EMBL 3 DNA:ta, 1 μΐ * I t (50 ng) genomisia DNA-fragmentteja, 0,75 μΐ 10 x ligaa- i » · 30 tiopuskuria (Maniatis et ai., 1982, s. 474: 660 mM Tris- , , HC1; 50 mM MgCl2; 50 mM ditiotreitolia; 10 mM ATP; pH 7,6), * · / 0,75 μΐ 10 mM ATP ja 2 μΐ (1,5 U/μΙ) T4 DNA-ligaasia (BRL) i i » pipetoitiin, sekoitettiin huolella ja inkuboitiin 6 tuntia i 14 °C:ssa. Tämän inkubaatioajan jälkeen reaktioseokseen
ill I
35 lisättiin 1 μΐ T4 DNA-ligaasia, ja reaktiota jatkettiin i i f ,’ , vielä 4 tuntia huoneenlämmössä.
* i < * I I i » I tl» * I » » · 33 108944
Ligatoitu DNA pakattiin in vitro käyttäen Gigapak II Gold pakkausuutetta (Stratagene) ja maljättiin E. colille LE392 (Murray, 1977) käyttämällä NZYCM-alustaa (1000 ml kohti: 10 g NZ-amiinia; 5 g NaCl; 5 g hiivauutetta; 1 g kas-5 aminohappoja; 2 g MgS04x7H20; pH 7,5; 12 g agaria lisättiin maljoille) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Yllä kuvattu täydellinen reaktio toistettiin kerran käyttäen 3 μΐ genomisia DNA-fragmentteja lopullisessa tilavuu-10 dessa 10 μΐ.
Esimerkki 2.4
Aspergillus tubiaensiksen genomisen kirjaston titraus ja amplifikaatio 15
Primaarisen genomisen kirjaston laimennokset tehtiin SM-puskuriin (1000 ml kohti: 5,8 g NaCl; 2,0 g MgS04x7H20; 50 mlTris-HCl; pH 7,5; 5 ml 20 % gelatiinia) ja mal jättiin E. coli- LE392 isännälle, kuten Maniatis et ai. (1982, s. 64) 20 ovat kuvanneet, käyttäen NZYM-alustaa. Inkubaation jälkeen yli yön 37 °C:ssa, saadut plakit ja faagien määrä laskettiin. Ensimmäinen ligaatio ja pakkaaminen tuotti noin 7 x 104 pfu (plakkeja muodostavaa yksikköä), toinen noin 4 x 105 pfu, yhteensä noin 5 x 105 pfu.
25 *:·*: Näin saatua genomista kirjastoa lisättiin mal jäämällä 5 x 103 pfu:ia läpimitaltaan 85 mm maljalle (yhteensä viisi j maljaa) NZYM-alustalle, kuten Maniatis et ai. (1982, s.
293 - 294) ovat kuvanneet. Yli yön inkubaation 37 °C:ssa * · : 30 jälkeen faagit eluoitiin saaduilta lisämaljoilta lisäämäl-lä 5 ml SM-puskuria. Maljat pidettiin 4 °C:ssa 2 tuntia jaksottaisessa ravistelussa. Supernatantin poistamisen jälkeen bakteerit poistettiin liuoksesta sentrifugoimalla ’· ’· 4 000 g 10 min 4 °C:ssa. Supernatanttiin lisättiin 0,3 % *.· : 35 kloroformia ja pfu:ien määrä määritettiin. Tämä faagiva-: rasto sisälsi noin 1010 pfu/ml.
• · ·
t I
• · · 34 108944
Esimerkki 3
Aspergillus tubiqensiksen genomisen kirjaston seulonta endoksylanaasi A-geenin suhteen (xln A) ja geenin eristys 5 Esimerkki 3.1
Synteettisten oligonukleotidien 32P-leimaus i i j Esimerkistä 1.2 saatua aminohapposekvenssiä (kaava 1) käy tettiin N-terminaalista aminohapposekvenssiä vastaavien 10 oligonukleotidiseosten syntetoimiseen. Oligonukleotidit syntetoitiin käyttämällä Applied Biosystems oligonukleoti-disyntetoij aa.
Samat määrät oligonukleotidiseoksia AB801 - AB806 (kuva 3) 15 sekoitettiin, seos nimettiin oligonukleotidiseokseksi AB800, jotta saatiin lopullinen konsentraatio 37 pmol oli-gonukleotidiä pl:aa kohti. Tämä oligonukleotidiseos leimattiin reaktioseoksessa, jolla oli seuraava koostumus: 37 pmol oligonukleotidiseosta, 66 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM 20 ATP, 1 mM spermidiiniä, 10 mM MgCl2, 15 mM ditiotreitolia, 200 pg/ml BSA, 34 pmol gamma-32P ATP (NEN, 6000 Ci/mmol) ja 30 U T4-polynukleotidikinaasia (BRL) lopullisessa tilavuudessa 50 μΐ. Reaktioseosta inkuboitiin 60 min 37 °C:ssa, minkä jälkeen reaktio lopetettiin lisäämällä 4 μΐ 0,5 M 25 EDTA; pH 8,0.
« · : · : Oligonukleotidiseos AB1255, johdettu esimerkissä 1.3 saa- dusta aminohapposekvenssistä (kaavat 2 ja 3) (kuva 4) lei-mattiin samalla mentelmällä kuin edellä on kuvattu. Oli- • · : 30 gonukleotidiseoksia käytettiin genomisen kirjaston seulo- miseen (esimerkki 3.4 ja 3.5) puhdistamatta edelleen.
• · ·
« S I
I » I * 35 108944
Esimerkki 3.2
Aspergillus tubigensiksen genomisen kirjaston seulonta xln A-geenin suhteen 5 Xln A-geenin seulomiseksi Aspergillus tubigensiksen geno-misesta kirjastosta, 3 x 103 pfu maljaa kohti maljättiin NZYCM-top-agaroosille, joka sisälsi 0,7 % agaroosia (NZYCM-alusta plus 7 g agaroosia), neljälle 85 mm läpimittaiselle NZYCM (2,1-prosenttinen agar) -maljalle, kuten 10 Maniatis et ai. (1982, s. 64) ovat kuvanneet. E. colia LE392 käytettiin maljausbakteerina.
Kun maljoja oli inkuboitu yli yön 37 °C:ssa, kustakin maljasta tehtiin kaksi replikaa nitrolselluloosafilttereille 15 (Schleicher ja Schuell BA85), kuten Maniatis et ai. (1982, s. 320 - 321) ovat kuvanneet.
Kun suodattimia oli paistettu 2 tuntia 80 °C:ssa suodattimet kostutettiin ja niitä pestiin 60 minuuttia huoneen-20 lämmössä 3 x SSCrssä (laimennettu 20 x SSC-kantaliuoksesta (1000 ml kohti): 175,3 g NaCl; 107,1 g natriumsitraat- ti x 5,5 H20; pH 7,0). Suodattimia esihybridisoitiin 65 °C:ssa kaksi tuntia esihybridisaatiopuskurissa, joka sisälsi: 6 x SSC (laimennettu 20 x SSC kantaliuoksesta 25 (katso edeltä)), 0,5 % SDS, 10 x Denhardtin liuosta (5000 '·**· ml kohti: 10 g Ficoll-400; 10 g polyvinyylipyrrolidonia; • · · • *,· 10 g naudan seerumin albumiinia (Pentax Fraction V)) ja : 100 pg/ml kuumadenaturoitua lohen sperman DNA:ta (Boehrin- •:*·: ger Mannheim). Kahden tunnin esihybridisaation jälkeen ;\j 30 esihybridisaatiopuskuri korvattiin hybridisaatiopuskuril- la, joka oli samaa kuin esihybridisaatiopuskuri, paitsi * t » että tämä puskuri ei sisältänyt lohen sperman DNA:ta, vaan . , 32P-leimattua oligonukleotidiseosta AB800, valmistettu ku- ten esimerkissä 3.1 on kuvattu. Suodattimia hybridisoitiin ’*! ’ 35 18 tuntia lopullisessa lämpötilassa 38 °C, joka saavutet- 36 108944 tiin hitaalla, kontrolloidulla jäähdytyksellä alkuperäisestä lämpötilasta 65 °C.
Hybridisaation jälkeen suodattimet pestiin ensin 2 x 5 SSC:llä, minkä jälkeen suodattimet pestiin esilämmitetyssä hybridisaatiopuskurissa 38 °C:ssa sama ajanjakso. Lopulta suodattimia pestiin 30 minuuttia 38 °C:ssa 6 x SSC:ssä, 0,5-prosenttisessa natriumpyrofosfaatissa. Ilmakuivatut suodattimet teipattiin arkille Whatman 3MM paperia, avain-10 nusmerkit tehtiin radioaktiivisella musteella ja Whatman-paperi ja suodattimet peitettiin Saran Wrap'illa™. Hybri-disoituvat plakit tunnistettiin altistamalla Kodak XAR röntgenfilmi 72 tunniksi -70 °C:seen käyttäen vahvistavaa levyä.
15
Neljä oligonukleotidiseoksen hybridisoituvista plakeista, jotka esiintyivät duplikaatteina replikasuodattimilla, tunnistettiin ja nimettiin seuraavasti: lambdaxlnl - lambdaxln4. Kukin positiivinen plakki poistettiin maljalta 20 käyttäen Pasteur-pipettiä, ja faagit eluoitiin agartapista 1 ml:11a SM-puskuria, joka sisälsi 20 μΐ kloroformia, kuten Maniatis et ai. (1982, s. 64) ovat kuvanneet. Saadut faagit puhdistettiin toistamalla edellä kuvattu menettely käyttäen maljoilta otettuja suodatinreplikoita, jotka si-25 sälsivät 50 - 100 plakkia eristettyjä faageja.
| Puhdistuksen jälkeen faageja lisättiin maljäämällä 5 x 103 faagia NZYCM-alustalle. Yli yön kestävän inkubaation ·;··· 37 °C:ssa jälkeen saatiin maljoja, joilla plakit olivat : 30 yhteenkasvaneet; näistä maljoista eluoitiin faagit lisää- I · mällä 5 ml SM-puskuria ja pitämällä maljoja 2 tuntia 4 °C:ssa jaksoittaisessa ravistelussa. Supernatantin . . poistamisen jälkeen bakteerit poistettiin liuoksesta » · · sentrifugoimalla 4000 x g 10 minuuttia 4 °C:ssa. Superna-* 35 tenttiin lisättiin kloroformia (0,3 %) ja pfu-määrä mää-i ritettiin. Nämä faagivarastot sisälsivät noin 1010 pfu/ml.
t * » 37 1 08944
Esimerkki 3.3 DNA-eristys bakteriofagi lambdasta
Kutakin eristetyistä faageista lambdaxlnl - lambdaxln4 lisät-5 tiin, kuten esimerkissä 3.2 on kuvattu, käyttäen viisi maljaa kutakin faagia kohti. Faagit saostettiin näin saadusta supernatantista (25 ml) lisäämällä sama tilavuus liuosta, joka sisälsi 20 % PEG-6000:ta (w/v) ja 2 M NaCl, mitä seurasi huolellinen sekoitus ja inkubaatio jäissä 60 10 minuuttia. Saostuneet faagit kerättiin sentrifugoimalla 14 000 x g 4 °C:ssa 20 minuuttia. Supernatantti imettiin pois, ja viimeiset jäännökset nesteestä poistettiin pape-ripyyhkeellä. Faagit suspendoitiin uudelleen huolellisesti 4 ml:aan SM-puskuria ja uutettiin kerran kloroformilla.
15
Ennen DNA:n uuttoa faagipartikkeleista, liuenneista bakteereista peräisin oleva DNA ja RNA poistettiin inkuboi-malla faagisuspensiota DNaasi I:n ja RNaasi A:n kanssa (kumpaakin 100 pg/ml) 30 minuuttia 37 °C:ssa. Faagi-DNA 20 vapautettiin sen jälkeen faageista lisäämällä SDS:ia ja EDTA:ia lopulliseen konsentraatioon 0,1 % ja vastaavasti 20 mM, mitä seurasi inkubaatio 65 °C:ssa 10 minuuttia. Proteiini poistettiin liuoksesta uuttamalla kahdesti samalla tilavuudella fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholia 25 (25:24:1). Faasien erottamisen jälkeen sentrifugoimalla f! Eppendorf-sentrifugissa (14 000 x g, 10 min), vesifaasi uutettiin kerran samalla määrällä kloroformi/isoamyylial-;‘. j koholia (24:1). Faasit erotettiin sentrifugoimalla (Eppen-
dorf-sentrifugi, 14 000 x g, 10 minuuttia), minkä jälkeen : 30 DNA saostettiin vesifaasista lisäämällä 0,1 tilavuutta 5 M
I · t natriumperkloraattia ja 0,1 tilavuutta isopropanolia ja i * · ‘ inkuboimalla jäissä 30 minuuttia. DNA otettiin talteen sentrifugoimalla 10 minuuttia 4 eC:ssa (14 000 x g). Su-'· ': pernatantti poistettiin imulla, minkä jälkeen DNA suspen-
I t I
V : 35 doitiin uudelleen 400 pl:aan TE-puskuria. DNA saostettiin : vielä kerran etanolilla. DNA kerättiin sentrifugoimalla 10
tl* I
» » » » » t < » t » • » * » « » > · t 38 108944 minuuttia 4 °C:ssa (14 000 x g). Supernatantti poistettiin imulla, jäljelle jäänyt pelletti kuivattiin lyhyesti tyhjiössä, minkä jälkeen DNA suspendoitiin uudelleen 125 pilaan TE-puskuria, joka sisälsi 0,1 pg/ml RNaasi A:ta. Tällä 5 puhdistusmenettelyllä saatiin eristettyä noin 40 - 50 pg DNA:ta kustakin faagista.
Esimerkki 3.4
Xln A:n sisältävien faagien restriktioanalyysi 10
Faagien lambdaxlnl - lambdaxln4 eristetty DNA analysoitiin Southern-analyysillä käyttäen seuraavia restriktioentsyy-mejä; BamHI: Bglll; EcoRI; HinDIII; Kpnl; Sali: SstI;
Xbal; ja XhoI. DNA:ta pilkottiin 3 tuntia 37 °C:ssa, kah-15 tena näytteenä, reaktioseoksessa, joka koostui seuraavista liuoksista; 3 pl DNA-liuosta; 1 pl 0,5 M spermidiiniä; 5 pl soveltuvaa 10 x reaktiopuskuria (BRL); 20 U restriktio-entsyymiä (BRL) ja steriiliä tislattua vettä, lopulliseen tilavuuteen 50 pl. Pilkkomisen jälkeen DNA saostettiin 20 lisäämällä 0,1 tilavuutta 3 M NaAc ja 2 tilavuutta etanolia. DNA kerättiin sentrifugoimalla 10 minuuttia huoneenlämmössä (14 000 x g). Supernatantti poistettiin imulla. Jäljelle jäänyt pelletti kuivattiin lyhyesti tyhjiössä ja suspendoitiin uudelleen steriiliin tislattuun veteen. Kun 25 oli lisätty 4 pl DNA-pipetointipuskuria (0,25 % (w/v) bro-mofenolisini; 0,25 % (w/v) ksyleenisyanolia; 15 % (w/v) * ‘ : Ficollia tyyppi 400 H20:ssa), näytteitä inkuboitiin 10 mi- ·,· nuuttia 65 °C:ssa ja jäähytettiin nopeasti jäissä. Näyt- teet pipetoitiin sitten 0,6 % agaroosi geeli in 1 x TAE-pus-
: 30 kurissa. DNA-fragmentit erotettiin elektroforeesilla 25 V
,15-18 tuntia.
I I f , , Elektroforeesin jälkeen DNA denaturoitiin ja siirrettiin 1 « f / nitroselluloosamembraanille, kuten Maniatis et ai. (1982, ’ 35 s. 383 - 386) ovat kuvanneet, mitä seurasi esihybridisaa- « tio ja hybridisaatio käyttäen leimattuja oligonukleotidi-
I I
t I
* I » > I » i *
» I
» I » 39 108944 seoksia AB800 ja AB1255, kuten esimerkissä 3.1 on kuvattu, ja hybridisaatio-olosuhteita, kuten esimerkissä 3.2 on kuvattu. Hybridisaatiomalli kullekin oligonukleotidiseok-selle saatiin altistamalla Kodak XAR-5 röntgenfilmi 18 5 tunniksi -70 °C:seen käyttäen vahvistuslevyä.
j
Tuloksista pääteltiin, että kaikkien neljän eristetyn kloonin DNA hybridisoitui N-terminaalisesta aminohapposekvenssistä johdetun oiigonukleotidiseoksen kanssa 10 (seos AB800), samoin kuin oiigonukleotidiseoksen kanssa, joka saatiin S.aureuksen V8-pilkkomisen jälkeen eristetystä peptidistä johdetusta aminohapposekvenssistä (AB1255). Kaikista neljästä kloonista löydettiin samasta genomin alueesta peräisin olevat fragmentit.
15
Restriktiofragmenttimalleja ja hybridisaatiomalleja käytettiin sen genomisen alueen, johon xln A-geeni sijoittuu, likimääräisen restriktiokartan laatimiseen (kuva 5).
20 Esimerkki 3.5
Xln A-geenin alakloonaus.
6,9 kiloemäksen Sali-fragmentti eristettiin faagista lambdaxln3, kuten esimerkissä 2.2 on kuvattu. Tämä fragment-25 ti ligatoitiin vektoriin pUC9, joka oli pilkottu Sällillä ...j ja defosforyloitu seuraavasti valmistetulla alkalisella fosfataasilla: 1 μΐ (1 pg/μΐ) pUC9 sekoitettiin 2 μ1:η 10 x React 10 (BRL), 1 μ1:η (1 U/μΙ) Sali ja 16 μ1:η ste-
• M
! riiliä tislattua vettä kanssa. DNA:ta pilkottiin 1 tunti ,30 37 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 0,5 μΐ alkalista fosfa- ; taasia (1 U/μΙ) (Pharmacia), mitä seurasi inkubaatio edel- '·* * leen 37 °C:ssa vielä 30 minuuttia. Linearisoitu vektori eristettiin 0,6-prosenttisesta agaroosigeelistä, kuten esimerkissä 2.2 on kuvattu.
/:’: 35 40 108944 6,9 ke:n Sali-fragmentti ligatoitiin Sällillä pilkottuun, defosforyloituun pUC-vektoriin seuraavalla menettelytavalla: 100 ng pUC-fragmenttia sekoitettiin 100 ng:aan 6,9
ke:een Sali-fragmenttia ja 4 pl:aan 5 x ligaatiopuskuria 5 (500 mM Tris-HCl, pH 7,6; 100 mM MgCl2; 10 mM ATP; 10 mM
ditiotreitolia; 25 % PEG-600) ja tähän seokseen lisättiin 1 μΐ (1,2 U/μΙ) DNA-ligaasia (BRL), mistä saatiin lopulliseksi tilavuudeksi 20 μΐ. Saatu plasmidi nimettiin pIM100:ksi. 16 tunnin inkubaation jälkeen 14 °C:ssa seos 10 laimennettiin 100 piiksi steriilillä vedellä. 10 μΐ laimennettua seosta käytettiin transformoimaan E. coli kannan JM101 (Yanisch-Perron et ai., 1985) vastaanottavat solut, valmistettu CM1, CM2 -menetelmällä, kuten julkaisussa Pharmacia Manual on kuvattu M13-kloonaus/sekvensointijär-15 jestelmälle. E. coli JM101, joka sisälsi plasmidin pIMlOO, talletettiin kokoelmaan Centraal Bureau voor Schimmelcul-tures, Baarn, Alankomaat, 19.7.1990, ja sille annettiin talletusnumero CBS 322.90.
20 Saaduista pesäkkeistä kasvatettiin valittuja kuutta yli yön LB-alustalla (1000 ml kohti: 10 g trypticase-peptonia (BBL); 5 g hiivauutetta (BBL); 10 g NaCl; 0,5 mM Tris-HCl; pH 7,5), joka sisälsi 100 pg/ml ampisilliinia.
25 Plasmidi-DNA eristettiin viljelmistä alkalisella liuotus-menetelmällä, kuten Maniatis et ai. (1982, s. 368 - 369) ovat kuvanneet. Tätä plasmidi-DNA:ta käytettiin restrik-tioanalyysissä kuten esimerkissä 3.4 on kuvattu, valikoi-maan halutun plasmidin sisältävä klooni. Plasmidi-DNA . . 30 eristettiin suuressa mittakaavassa 500 ml viljelmissä E.coli JMlOlitä, joka sisälsi plasmidin pIMlOO, kasvatettu ’ 100 pg/ml ampisilliiniä sisältävällä LB-alustalla (Mania tis et ai., 1982, s. 86). Plasmidi puhdistettiin CsCl- '· sentrifugoinnilla, fenolisoitiin, sakattiin etanolilla ja • * · V : 35 liuotettiin 400 pl:aan TE. Saanto oli noin 500 pg.
i · « · » I · I · I · I ·
» · I
1 08944 41
Plasmidi ρΙΜΙΟΟ analysoitiin edelleen restriktioentsyy-meillä, ja saatiin restriktiokartta, joka on esitetty kuvassa 7. Geenin orientaatio, kuten on merkitty, määritettiin hybridisaatiokokeilla olosuhteissa, jotka on kuvattu 5 esimerkissä 3.2, käyttäen oligonukleotidiseoksia AB800 ja AB1255 koettimina.
Esimerkki 4
Aspergillus tubiaensiksen xln A-geenin karakterisointi.
10
Esimerkki 4.1 A. tubiaensiksen xln A-geenin sekvenssin määrittäminen
Aspergillus tubiaensiksen xln A-geenin sekvenssi, johon 15 kuuluu sen promoottori/säätelyalue,, rakennegeeni ja lo-petusalue, määritettiin alakloonaamalla fragmentit pIM100:sta M13mpl8/mpl9:ssä, ja käyttämällä spesifisiä oligonukleotidejä alukkeina sekvensointireaktioissa.
i i 20 Nukleotidisekvenssianalyysiä varten eristettiin restrik- ' tiofragmentit esimerkissä 2.2 kuvatulla tavalla ja kloo nattiin bakteriofagi M13 mpl8/mpl9 RF DNA -vektoreihin (Messing, 1983; Norrander et ai., 1983), jotka oli pilkottu sopivilla restriktioentsyymeillä. Nukleotidisekvenssit 25 määritettiin dideoksinukleotidi-ketjunlopetusmenetelmällä (Sanger et ai., 1977), käyttäen Pharmacia T7 DNA-polymeraa-si-sekvensointipakkausta. Xln A-geenin sekvensoinnissa ;\j käytetty menettelytapa on esitetty kuvassa 6. Saatujen tulosten tietokoneanalyysi tehtiin käyttäen PC/GENE-ohjel-,·, : 30 maa (Intelligenentics, Inc., Madison WI). Määritetty sek- !..* venssi on esitetty kuvassa 8.
42 1 08944
Esimerkki 4.2 A. tubiaensiksen xln A-geeni
Saatu sekvenssi käsittää 2054 ep, 949 ep 5’-ei-koodaavalla 5 alueella ja 420 ep 3'-ei-koodaavalla alueella. 5'-alueella ylävirtaan, oletettu TATA-box (TATAAAT) havaittiin asemas-I ta 848 asemaan 854, ennen translaation aloitusaluetta | (asema 950). Kolmesti toistuva sekvenssi I (5'GTCCATTTAGCCA3’) havaittiin alueella 190 - 350 ep 10 translaation aloituskohdasta (asemat: 618 - 632; 636 - 650; 656 - 670).
Xln A-geenin rakennealue on 681 ep pitkä ja sen keskeyttää yksi oletettu 48 ep pitkä introni. Sekvenssistä johdettu i 15 polypeptidi on 211 ah:n pituinen. 17 ah:n pituinen hydrofobinen signaalisekvenssi havaitaan tämän polypeptidin N-päässä, mitä seuraa propeptidi, joka on 12 tähdettä pitkä.
Kypsä proteiinin on kooltaan 184 ah, ja sen oletettu mole-kyylipaino on 19 kDa, ja teoreettinen IEP 3.6.
20
Esimerkki 5
Xln A-geenin ekspressio Aspergillus niaer kannassa N593. Esimerkki 5.1 25 Xln A-geenin saattaminen Aspergillus niger kantaan N593 ko-transformaatiolla.
*. Plasmidi pIMlOO, saatu esimerkissä 3.5 saatettiin Asper- ‘ ; oillus nigeriin ko-transformoimalla Aspergillus niger kan- ’ 30 ta N593 (A.niger N402:n pyr~-mutantti; Goosen et ai., 1987) '· · käyttämällä Aspergillus nigerin pyr A -geeniä selektii- v ·’ visenä markkerina plasmidissa pGW635 (Goosen et ai., 1989) ja plasmidia pIMlOO ko-transformaatioplasmidina.
35 Protoplastit valmistettiin rihmastosta kasvattamalla As- . \ pergillus niger kantaa N593 minimaalialustalla, johon oli 43 108944 lisätty 0,5 % hiivauutetta, 0,2 % kasaminohappoja, 50 mM glukoosia ja 10 mM uridiinia, 20 tuntia, 30 °C. Proto-plastien valmistus Aspergillus niqer N593:sta ja transfor-maatiomenettely tehtiin, kuten Goosen et ai. (1987) ovat 5 kuvanneet. Saadut PYR+-transformantit analysoitiin xln A -geenin ekspression suhteen.
Esimerkki 5.2
Transformanttien seulonta xln A -geenin ekspression suh-10 teen.
Esimerkissä 5.1 saadut transformantit analysoitiin xln A-geenituotteen, XYL A -proteiinin muodostumisen suhteen. Kaksikymmentä transformanttia valittiin, ja niitä kasva-j 15 tettiin 72 tuntia alustalla, joka sisälsi (litraa kohti): 30 g kaura-spelttiksylaania (Sigma), 7,5 g NH4N03, 0,5 f KC1, 0,5 g MgS04, 15 g KH2P04 ja 0,5 g hiivauutetta (pH 6,0). Kasvatuksen jälkeen rihmasto poistettiin suodattamalla ja viljelmäsuodos analysoitiin SDS-polyakryyliami-20 digeelielektroforeesilla käyttäen geeliä, joka sisälsi 12 % akryyliamidia. XYL A -proteiini osoitettiin nitrosellu-loosalta, kun oli tehty elektroblottaus ja inkubointi po-lyklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka oli nostettu esimerkissä 1.1 esitetyllä tavalla puhdistettua XYL A pro-25 teiinia vastaan. Sitoutunut vasta-aine osoitettiin inku- baation jälkeen vuohi-ant ikäni ini-vasta-aineen kanssa, :’·*: joka oli sidottu alkaliseen fosfataasiin, Bioradin ohje- kirjan mukaisesti.
• > ,·, ; 30 Kuusitoista kahdestakymmenestä analysoidusta transforman- tista tuotti XYL A -proteiinia tällä menettelyllä määritettynä. Proteiini erittyi alustaan. Analysoiduista transformanteista transformantti TrX9 valittiin I.E.F.- • I » analyysiin, käyttäen pH-gradienttia pH 3 - 7 ja sen jäl-·.' : 35 keen transformanttien TrX2 ja TrX9 laimennussarjojen vär- 44 108944 jäystä käyttäen Bielyn et ai. (1985 a ja b) kuvaamaa menetelmää .
Kuva 9 on tsymogrammi, joka esittää transformanttien TrX2 5 ja TrX9 ilmentämän XYL A -proteiinin.
SDS-PAGE-analyysi tehtiin käyttämällä 4 μΐ supernatantti-näytteitä yksittäisistä transformanteista ja A.niqer kont-rollikantaa, pH säädettynä ensin pH 7:ään 3 N NaOH:lla ja ^ 10 sen jälkeen tuotuna lopulliseen tilavuuteen 20 μΐ 1 x SB- puskurilla, kuten Laemmli (1970) on kuvannut. 5 minuutin kuumentamisen jälkeen 100 °C:ssa, kokonaisseokset saatettiin SDS/12,5-prosenttiseen polyakryyliamidigeelielktrofo-reesiin ja sen jälkeen värjättiin Coomassie brilliant 15 blue'11a. Kuten kuvassa 10B on esitetty, proteiinivyöhyke, jonka ilmeinen molekyylipaino on 25 kDa (verrattavissa puhdistettuun ksylanaasiin, kaista 2), voitiin osoittaa transformanteista TrX2 (kaista 4) ja TrX9 (kaista 5); se puuttuu kontrollikannan supernatantista (kaista 3). Mole-20 kyylipainomerkit (kaista 1), edustavat 92, 68, 46 ja 30 kDa:ia.
Esimerkki 5.3
Xln A -promoottorialueen deleetioanalyysi 25 Säätelyalueet A. tubiqensiksen xln A -promoottorissa tut-·*·*: kittiin promoottorin deleetioanalyysillä. Tehtiin viiden : rakenteen sarja xln A -geenistä, ja kloonattiin yhdessä A.niqer in pyr A -geenin kanssa. Pvr A -geeni tekee mahdol-,·, ; 30 liseksi valinnan transformaatiokokeissa, kuten esimerkissä i * » !..* 5.1 on esitetty. Lisäksi pyr A -geeni sallii sellaisten * · » * transformanttien valinnan, joilla on yksi kopio plasmidis-ta liittyneenä pyr A-lokukseen.
> » t V *35 4,5 ke:n SaiI/Xbal-fragmentti (kuva 7) eristettiin ja li- : gatoitiin vektoriin pEMBL18, kuten esimerkissä 3.5 on ku- * * • · • «i ί i k 45 i ϋ 8 y 4 4 vattu, johtaen väliplasmidiin ρΙΜΙΟΙ. Plasmidin pIMlOl lisäksi pEMBL18:aan ligatoitiin seuraavat fragmentit, jotka sisälsivät xln A -geenin: 3,5 ke:n HindiII/Xbal-fragmentti (jolloin saatiin pIM102), 2,0 ke:n Pstl-fragmentti 5 (jolloin saatiin pIM103), 1,98 ke:n XhoI/Xbal-fragmentti (jolloin saatiin pIM104) ja 1,97 ke:n Nsil/Xbal-fragmentti (jolloin saatiin pIM105). Saadut plasmidit pilkottiin käyttämällä Xbal:tä ja ligatoitiin 3,8 ke:n Xbal-fragmenttiin, joka käsitti toiminnallisen A.niuerin pyrA-geenin.
10 jolloin saatiin plasmidit pIM112, pIM113, pIM114, pIM116 ja pIM117 (kuva 21).
Plasmideja pIM112, plmll3, pIM114, pIMH6 ja pIM117 käytettiin transformoimaan A. niger N593, kuten esimerkissä 15 5.1 on esitetty. Kunkin plasmidin saatuja PYR+-transfor- mantteja kasvatettiin, ja DNA eristettiin, kuten esimerkissä 2.1 on esitetty. Saatu DNA pilkottiin Hpal:11a ja yksikopioliitännäiset valittiin Southern-analyysillä käyttäen 32P:llä leimattua 3,8 kb:n Xbal-fragmenttia 20 (leimattu, kuten esimerkissä 7,2 on kuvattu), joka sisälsi pyr A-geenin koettimena. Transformantit, joilla oli hybri-disoituva Hpal-fragmentti (jonka koko oli lisääntynyt yhdellä plasmidipituusyksiköllä verrattuna Hpal-fragmentin kokoon A. niger N953:ssa), valittiin yksikopioliitännäi-25 siksi pyr A -lokuksessa.
« * I M I r « ;1 1'; Kunkin plasmidin yksikopiotransformantteja, valittu edellä 4 ;\j kuvatulla tavalla, kasvatettiin 36 tuntia, kuten esimer- t · ,,..j kissä 5.2 on kuvattu. Xln A -geenin ekspressio analysoi- ; 30 tiin IEF-analyysillä, kuten esimerkissä 5.2 on esitetty, !,.1 ja Northern-analyysillä kokonais-RNA:n eristyksen jälkeen, ’ kuten de Graaff et ai. (1988) ovat kuvanneet, käyttäen 32P- leimattua 900 ep:n XhoI/BamHI-fragmenttia xln A -geenistä
* t I
• ·1 koettimena.
V : 35
I I I
? » > t i ‘ 1 t » » · I 1 1 » » 46 108944
Plasmideihin pIM112, pIM113 ja pIM114 perustuvissa trans-formanteissa havaittiin xln A -geenin ekspressio, osoitettuna IEFtllä ja Northern-analyysillä. Plasmideihin pIM116 ja pIM117 perustuvat transformantit eivät kuitenkaan il-5 mentäneet xln A -geeniä, sillä XYL A -proteiinia tai hyb-ridisoituvaa RNArta ei löydetty. Näistä tuloksista pääteltiin, että 158 ep:n Pstl/Xhol-fragmentti, olennainen ero pIMH4:n ja pIM116:n välillä, sisältää rakenteen, joka on vältäämätön xln A -geenin induktiolle A.nigerissä. jota on 10 kasvatettu ravintoalustalla käyttäen ksylaania hiilenläh-teenä.
Esimerkki 6 A.nigerin amyloglukosidaasigeenin (AG) promoottoriin 15 ja/tai signaalisekvenssiin liitetyn xln A -geenin ekspressio A.nigerissä.
Esimerkki 6.1
Ksylanaasin ekspressiovektorit 20
Jotta saavutettaisiin ksylanaasin ekspressio kannassa A. niger CBS 513.88, luotiin lisää ekspressiokasetteja (pXYL3 ja pXYL3AG), joissa xln A -geeni on A.nigerin amyloglu-kosidaasi (AG) -promoottorin, yhdessä eri sig- 25 naasisekvenssien kanssa, kontrollin alaisena.
Ekspressiokasetissa pXYL3AG, AG-promoottorisekvenssi lii-: tettiin xln A:ta koodaavaan sekvenssiin, mukaanluettuna • I » ! ksylanaasin johtosekvenssi.
: 30
Ekspressiokasetissa pYL3AG, AG-promoottorisekvenssi, sa-'·' ‘ moin kuin AG-geenin 18 aminohapon (ah) johtosekvenssi, liitettiin xln A-geenifragmenttiin, joka koodasi ainoas-taan kypsää proteiinia.
:T: 35 I · · 1 » t 47 1 0 8 9 4 4
Esimerkki 6.2 Väliplasmidien kokoaminen.
a) Xln A-lokuksen alakloonaus.
5 Jotta pienennettäisiin genomisen xln A -lokuksen pituutta, pIM100:n 2 ke:n PstI-fragmentti (kuvattu esimerkissä 3.5), joka käsitti koko xln A -geenin, mukaanluettuna 5'- ja 3'-reunustavat alueet, alakloonattiin pTZ18R:n (Promega)
PstI-kohtaan. Xln A - geenin oikeassa orientaatiossa si-10 sältävä plasmidi (esitetty kuvassa 12) nimettiin pXYLl:ksi.
b) Perusselektiovektori pAmdSH
Toimiakseen selektiomerkkinä Asperailluksen transformaa-15 tiossa, plasmidin pGW325 (Wernars, K. (1986)) EcoRI/Kpnl DNA-fragmentti, joka sisälsi homologisen Aspergillus ni-dulansin amdS-geenin, liitettiin pTZ18R:n (Promega) Eco-RI/Kpnl -kohtiin. Saatuun vektoriin (pAmdS) tehtiin Hin-dlll-restriktiokohta lisää liittämällä synteettinen frag-20 mentti: 5'AATTCAAGCTTG 3' 3' GTTCGAACTTAA5'
EcoRI-kohtaan. Näin saatu plasmidi nimettiin pAmdSH:ksi. AG/ksylanaasi -fuusio-DNA-fragmentit liitetään tähän pe-25 rusvektoriin.
· · · c) Genomisen AG-lokuksen eristys: pAB6-l:n rakentaminen.
» * ♦ ' ! Plasmidi pAB6-l sisältää koko AG-lokuksen A. nigeristä.
» * , , 30 eristetty A.nigerin plasmidikirjastosta joka sisälsi 13 -• 15 ke:n HindiII-fragmentit, liitettynä pUC19:ään.
Tätä eristystä varten käytettiin seuraavia AG-spesifisiä
I I
oligonukleotidejä: 35 AG-1: 5 '-GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC-3 ' ; X AG-2: 5'-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3' 48 108944 joista kumpikin perustuu nukleotidisekvenssiin, joka on julkaistu A. nigerille (Boel et ai. (1984a); Boel et ai. (1984b)). Oligonukleotidikoettimet johdettiin sekvenssistä, joka ympäröi intronia 2; oligo AG-1 sijaitsee alavir-5 taan tästä intronista, ja sen polaarisuus on samanlainen kuin AGmRNA:n; oligo AG-2 on ylävirtaan intronista 2, ja se on valittu vastakkaissuuntaiseksi AGmRNA:lie. Plasmidi ! pAB6-l sisältää koko AG-lokuksen 14,5 kb:n Hindlll-fraq- | mentissa (katso kuva 13).
i 10 d) Väliplasmidit pXYLAG ia PXYL2AG.
AG-promoottorin ja 18 ah:n AG-johtosekvenssin fuusio xln A-geeniin, joka koodaa kypsää proteiinia (josta puuttuu 15 seriini asemasta 1), valmistettiin polymeraasiketjureak-tiomenetelmällä (PCR).
PCR-reaktioissa käytettiin kahta templaattia: pXYLl, joka I sisälsi xln A -geenin ja pAB6-l, joka sisälsi koko AG-ge- 20 nomisen lokuksen.
Alukkeiksi PCR-DNA-amplifikaatioihin suunniteltiin neljä synteettistä oligonukleotidia, joilla on seuraavat sekvenssit: 25 Oligo AB 1771:5'-CTCTGCAGGAATTCAAGCTAG-3' ‘ 1 (AG-spesifinen sekvenssi EcoRI-kohdan ympärillä ♦ 1 · : ".· noin 250 bp ylävirtaan ATG-aloituskodonista).
:/·: Oligo AB 1985:5'-GTAGTTGATACCGGCACTTGCCAACCCTGTGCAGAC-3' :··: kypsä ksylanaasi---------18 ah:n AG-joh- 30 tosekv.
.·:·. Oligo AB 1986:5’ -GTCTGCACAGGGTTGGCAAGTGCCGGTATCAACTAC-3' 18 ah:n AG-johtosekv.-------kypsä ksy- . . lanaasi i · » t · • · · I · » » · 1 0 8 94 4 49
Oligo AB 1984;5'-CCGGGATCCGATCATCACACC-3' (xln A -spesifinen sekvenssi, joka sijaitsee Bam-HI-kohdassa asemassa 1701, kuten kuvassa 8 on esitetty) .
5 PCR toteutettiin, kuten Saiki et ai. (1988) ovat kuvanneet, sekä TAQ-polyraeraasin tuottajan (Cetus) ohjeiden mukaisesti. Kaksikymmentäviisi amplifikaatiokierrosta (ku-j kin: 2 minuuttia 55 °C:ssa; 3 minuuttia 72 °C:ssa; 1 mi nuutti 94 °C:ssa) toteutettiin DNA-amplifioijassa (Perkin-10 Elmer/Cetus).
AG-sekvenssin fuusioimiseksi xln A:ta koodaavaan sekvenssiin, kaksi polymeraasiketjureaktiota toteutettiin: ensimmäinen reaktio pAB6-l templaattina ja oligonukleotidit AB 15 1771 ja AB 1985 alukkeina, monistamaan 300 ep:n DNA-frag- mentti, joka sisälsi AG-promoottorin 3'-osan ja 18 ah:n AG-johtosekvenssin reunustettuna 3'-päästä xln A:n koodaa-van sekvenssin ensimmäisillä 18 nukleotidilla, ja toinen reaktio pXYLl templaattina, ja oligonukleotidit AB 1986 ja 20 1984 alukkeina, jotta lisättiin xln A:n DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat kypsää ksylanaasiproteiinia, reunustettuna 5'-päästä AG-signaalipeptidin viimeisillä 18 nukleotidilla. Kaaviokuva näistä amplifikaatioista on esitetty kuvassa 14.
25 ; J Luodut kaksi DNA-fragmenttia puhdistettiin agaroosigeeli- elektroforeesilla ja etanolisaostuksella, ja sen jälkeen .·, : niitä käytettiin templaatteina kolmannessa PCR:ssä oli- • » « gonukleotidit AB 1771 ja 1984 alukkeina, jotta luotiin AF- . . 30 ksylanaasifuusio. Näin saatu DNA-fragmentti pilkottiin
t « I
!EcoRI:llä ja BamHI:llä ja alakloonattiin sopiviin kohtiin pTZ18R:ssä. Tästä seurannut fuusio sekvensoitiin ja nimettiin pXYLAG:ksi (katso kuvat 14 ja 15). 1 35 Jäljelle jäänyt (3,5 ke:n) ylävirran alue AG-promoottoris-: ,·, ta saatiin pilkkomalla pAB6-l Kpn-1:llä ja osittain Eco- 50 108944 RI:llä, ja puhdistamalla agaroosigeelielektroforeesilla ja etanolisaostuksella. Tämä 3,5 ke:n AG-DNA-promoottorifrag-mentti ligatoitiin ensin pXYLAG;n EcoRI/BamHI AG/ksylanaa-si-fuusiofragmenttiin ja sen jälkeen kloonattiin E. colis-5 sa ligaation jälkeen vektoriin pXYLl, joka pilkottiin Kpnl/BamHI:llä ja josta poistettiin Kpnl/BamHI-fragmentti, joka sisälsi 5'- ja koodavan xln A -sekvenssit. Näin saatu | plasmidi pXYL2AG on esitetty kuvassa 15.
10 e) Väliplasmidit pXYL 1a PXYL2.
AG-promoottorisekvenssin fuusio xln A -geeniin, joka sisälsi ksylanaasin johtosekvenssin, toteutettiin, kuten osassa d) edellä on kuvattu. Alukkeiksi tehtiin lisää kak-15 si oligonukleotidia, joilla oli seuraavat sekvenssit:
Oligo AB 1982: 5'-AGCCGCAGTGACCTTCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3' ksylanaasigeeni---------AG-promoottori
Oligo AB 1983: 5'-CATCATTACACCTCAGCAATGAAGGTCACTGCGGCT-3' AG-promoottori---------ksylanaasigeeni 20 AG-promoottorisekvenssin fuusioimiseksi ksylanaasigeeniin (mukaanluettuna ksylanaasin signaalisekvenssi), toteutettiin kaksi erillistä polymeraasiketjureaktiota: ensimmäinen reaktio pAB6-l templaattina, ja oligonukleotidit AB 1771 ja AB 1982 alukkeina, amplifioimaan 282 ep:n frag-25 mentti, joka sisälsi 3'-osan AG-promoottorista reunustet-""· tuna 3'-päästä ksylanaasijohtosekvenssin 18 nukleotidilla, * i « ' ‘ja toisen reaktion pXYLl templaattina, ja oligonukleotidit ;'\i AB 1983 ja AB 1984 alukkeina, amplifioimaan DNA-fragment- <;·’· ti, joka sisälsi koko ksylanaasigeenin (mukaanluettuna ; 30 ksylanaasin johtosekvenssi), ja reunustettuna 5'-päästä » t AG-promoottorin 18 nukleotidilla.
* 1 t * , , Luodut kaksi DNA-fragmenttia puhdistettiin agaroosigeeli- < 1 i ’^9 elektroforeesilla ja etanolisaostuksella, ja niitä käytet- i » » '·' ‘ 35 tiin sen jälkeen templaatteina kolmannessa PCR:ssä, oli-
I I
I 1 < t > 1 • > t » t
> I
» I 1 » t »
» t I
< t ( > >
I I
'"108944 51 gonukleotidien AB 1771 ja 1984 toimiessa alukkeina, tuottamaan AG-ksylanaasifuusio. Näin saatu DNA-fragmentti pilkottiin EcoRI;llä ja BAMHI:llä ja alakloonattiin sopiviin kohtiin pTZ18R:ää. Tästä seurannut fuusio sekvensoi-5 tiin ja nimettiin pXYL:ksi (katso kuvat 14 ja 16).
Jäljelle jäänyt AG-promoottorin (3,5 kb:n) ylävirran alue | liitettiin pXYLl:een, kuten osassa d) edellä on kuvattu.
Näin saatu plasmidi nimettiin pXYL2:ksi.
10
Esimerkki 6.3
Ksylanaasin ekspressiokasettien pXYL3AG ja pXYL3 valmistaminen.
15 Kumpikin ekspressiokasetti luotiin liittämällä pXYL2AG:n tai pXYL2:n AG/ksylanaasifuusiot A. niqerin perusvektoriin pAmdSH. Tätä lopullista rakennetta varten pAmdSH pilkottiin Kpnl:llä ja Hindlll:11a (osittain) ja pXYL2AG ja pXYL2 Hindlll:11a ja osittain Kpnl:llä. Kaikki fragmentit 20 eristettiin ja puhdistettiin geelielektroforeesilla ja etanolisaostuksella. pAmdSH:n 6,8 ke:n Kpnl/HindiII-DNA-fragmenttiin lisättiin joko pXYL2AG:n tai pXYL2:n 5,3 ke:n Kpnl/HindiII-DNA-fragmentti. ligatoitiin ja sen jälkeen molekyylikloonattiin siirrostamalla kumpikin ligaatioseos 25 E. coliin. Näin saadut ekspressiokasetit nimettiin pXYL3AG:ksi (sisälsi AG-johtosekvenssin) ja pXYL3:ksi (si-sälsi ksylanaasijohtosekvenssin), kuten kuvissa 17 ja vas-taavasti 18 on esitetty.
• I ·
• I
• ( t 1 > · * · · 108944 j 2
Esimerkki 6.4
Xln A -geenin ekspressio AG-promoottorin alaisena A. ni-gerissä.
5 a) A. niqerin transformaatio (CBS 513.88).
Ennen kummankin ekspressiokasetin pXYL3AG ja pXYL3 siirtämistä A. nigeriin. E. coli -sekvenssit poistettiin Hin-dlll-pilkonnalla, geelielektroforeesilla ja etanolisaotuk-10 sella. Kannan A. niger (CBS 513.88, talletettu 10.10.1988) transformaatio toteutettiin 10 pg:lla linearisoitua DNA-fragmenttia menettelyillä, jotka ovat kuvanneet Tilburn, J. et ai. (1983) ja Kelly ja Hynes (1985), seuraavin muunnelmin: 15 - rihmasto kasvatettiin Asperqi1luksen minimaalialustalla (Cove, D (1966)), jota oli täydennetty 10 mM:lla arginii-nia ja 10 mM:lla proliinia, 16 tuntia 30 °C:ssa pyörö-haihduttajassa, 300 rpm.
20 - vain Novozym 234:ää, eikä lainkaan helikaasia, käytettiin protoplastien muodostamiseen.
- kun 90 minuuttia protoplastien muodostusta oli kulunut,
25 lisättiin 1 tilavuus STC-puskuria (1,2 M sorbitolia, 10 mM
*:·1: Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2) protoplastisuspensioon ja sentrifugoitiin 2500 rpm 4 °C:ssa 10 minuuttia riippuva-: putkisessa (swinging-bucket) -roottorissa. Protoplastit pestiin ja suspendoitiin uudelleen STC-puskuriin konsent- . . 30 raationa 108 solua/ml.
> 1 1 • - plasmidi-DNA:ta lisättiin tilavuutena 10 μΐ TE-puskuris-sa (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA) 100 pl:aan proto- ’. ‘: plastisuspensiota.
0’: 35 I » 1 • » » » ♦ > · · • · 1 08944 53 - DNA-protoplastisuspension inkubaation jälkeen 0 °C:ssa
25 minuuttia, 200 μΐ PEG-liuosta lisättiin pisaroittain (25 % PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM
CaCl2)· Sen jälkeen lisättiin hitaasti 1 ml PEG-liuosta (60 5 % PEG 4000 10 mM:ssa Tris-HCl pH 7,5, 50 mM:ssa CaCl2), ja putkia sekoitettiin toistuvasti. Inkubaation jälkeen huoneenlämmössä, suspensiot laimennettiin STC-puskurilla, sekoitettiin kääntämällä ylösalaisin ja sentrifugoitiin 2000 rpm 4 °C:ssa 10 minuuttia. Protoplastit suspendoitiin 10 uudelleen 200 pl:aan STC-puskuria, ja maljättiin Aspergil-luksen minimaalialustalle, jossa oli 10 mM asetamidia ainoana typenlähteenä, 15 mM CsCl:ia, 1 M sakkaroosia, kiinteytetty 0,75-prosenttisella bakteriologisella agarilla nro 1 (Oxoid). Kasvatus tapahtui 33 °C:ssa 6-10 vuoro-15 kaudessa.
b) Transformanttien kasvatus ravistelupulloissa
Yksittäiset A. niaer-transformantit kustakin ekspres-20 siokasetista eristettiin, ja itiöt viirutettiin selektii visille asetamidi-agarmaljoille. Kunkin transformantin itiöt kerättiin 3 vuorokautta 37 °C:ssa 0,4 % perunadeks-troosi- (Oxoid, Englanti) agarmaljoilla kasvatetuista soluista. Ksylanaasin tuotto testattiin ravistelupulloissa 25 seuraavissa kasvuoloissa: • '/· - noin 1,108 itiötä siirrostettiin 100 ml esiviljelyalus- talle, joka sisälsi (litraa kohti): 1 g kaseiinihydro- ·;··· lysaattia; 0,5 g MgS04x7H20 ja 3 g Tween 80. pH säädettiin : 30 5,5:een.
- Yli yön kasvatuksen jälkeen 34 °C:ssa pyöröravistelijas- . , sa, 1 ml kasvavaa viljelmää siirrostettiin 100 ml päävil- ;§#· jelmään, joka sisälsi (litraa kohti): 2 g KH2P04; 70 g mal- ' 35 todekstriiniä (Maldex MD03, Amylum); 12,5 g hiivauutetta; : 25 g kaseiinihydrolysaattia; 2 g K2S04; 0,5 g MgS04x7H20, 1 » t t 54 ! ϋ 8 9 4 4 0,03 g ZnCl2; 0,02 g CaCl2; 0,05 g MnS04x4H20 ja FeS04. pH säädettiin 5,6:een. Rihmastoa kasvatettiin vähintään 140 tuntia.
5 c) Transformanttien analyysit
Yksittäisten transformanttien ksylanaasianalyysit toteutettiin määrittämällä ksylanaasiaktiivisuus SDS-poly-akryyliamidigeelielektroforeesilla, värjäys Coomassie 10 brilliant blue'11a ja tsymogrammilla, värjäys ksylaani-
Remazol brilliant blue R:llä.
Ksylanaasiaktiivisuudet määritettiin, kuten Leathers et ai. (1984) ovat kuvanneet, joillain muutoksilla. Subst-15 raattikonsentraatiota nostettiin 1 prosentista 5 prosent tiin kauran ksylaania, liuotettuna 100 mM NaAc pH:ssa 3,5 ja kuumenettu 100 °C:seen 10 minuutiksi. Lisäksi entsyy-mireaktiot toteutettiin 39 °C:ssa 30 °C:een asemesta.
20 Ksylanaasin tuottotasot määritettiin useiden satunnaisesti valittujen, kustakin ekspressiokasetista saatujen transformanttien 6 vuorokauden ravistelupullofermentaati-oiden supernatantista. Tulokset on esitetty taulukossa 1.
$ * · 55 108944
Taulukko 1
Useiden A. nicrer CBS 513.88 -kantojen ksvlanaasin tuotto, kannat on transformoitu plasmideilla. 1otka sisältävät xln A -geenin A. niaerln AG-promoottorln kontrollin alaisena.
5 yhdessä eri lohtosekvenssien kanssa.
ekspressio- transformantin ksvlanaasiakt♦ kasetti nro (U/ml) 10 1,1 2400 pXYL3 1,2 1700 (AG-promoottori/ 10 3600 xln-johtosekv.) 29 3500
15 pXYL3AG
(AG-promoottori/ 3,1 2400 AG-johtosekv.) A. niger CBS 513.88 20 (kontrollikanta) - 0 SDS-PAGE -analyysi toteutettiin seuraavasti: 6 kasvatus-vuorokauden, kuten osassa b) edellä on kuvattu, jälkeen 4 25 μΐ supernatanttinäytteet yksittäisistä transformanteista ja A. niger -kontrollikannasta säädettiin ensin pH 7:ään 3 N NaOH:lla, ja sen jälkeen saatettiin lopulliseen tilavuuteen 20 μΐ 1 x SB-puskurilla, kuten Laemmli (1970) on kuvannut. Kuumennuksen jälkeen 5 minuuttia 100 °C:ssa koko-30 naisseokset saatettiin SDS/12,5-prosenttiseen polyakryy- ·:«·· liamidigeelielektroforeesiin ja värjättiin sen jälkeen
Coomassie brilliant blue'lla. Kuten kuvassa 10 A on esi- • * ; tetty, proteiinivyöhyke, jonka molekyylipaino on 25 kDa
« I I
(verrattu puhdistettuun ksylanaasiin (kaista 1)) voitiin • · , . 35 osoittaa transformanteista 10 (kaista 4), 29 (kaista 5) ja t · » 1.1 (kaista 6). Tämä proteiinivyöhyke puuttui kontrolli- * · » ’·' kannan supernatantista (kaista 3). Molekyylipainomerkit (kaista 2) ovat 94, 67, 43, 30, 20 ja 14,5 kDa.
’· ’ 40 Tsymogrammianalyysi tehtiin seuraavasti. Samat näytteet : [·. kuin edellä annosteltiin myös kaksi kertaa natiiviin 8 - » » I » * 56 108944 25-prosenttiseen PAA faasijärjestelmägeeliin (BRL). Elektroforeesin jälkeen geeli A värjättiin Coomassie brilliant blue'lla (katso kuva 11A) ja geeli B Remazol brilliant blue-ksylaani- (Megazyme) kerroksella pH:ssa 3,5, kuten 5 Biely et ai. (1985a) ovat kuvanneet (katso kuva HB), ksy-lanaasiaktiivisuuden visualisoimiseksi. Tähän RBB-ksy-laanikerrosgeeliin käytetyt näytteet sisälsivät 5 kertaa vähemmän proteiinia verrattuna näytteisiin, jotka annosteltiin kuvissa 10 ja 11A esitettyihin geeleihin. Kaistat 10 kuvissa 11A ja B ovat samat kuin kuvissa 10 A ja B.
Nämä analyysit osoittavat selvästi aktiivisen endoksy-lanaasin ekspression ja erityksen A. niqer kannasta CBS 513.88, joka on transformoitu ekspressiokasetilla, jossa 15 xln A -geeni on A. niqerin amyloglukosidaasipromoottorin kontrollin alaisena. Ekspressio ja eritys havaittiin myös eri A. niqer -signaalisekvensseillä. Edelleen, proteiinissa, jolta puuttui seriinijäännös asemasta 1, säilyi kuitenkin ksylaania hajottava aktiivisuus.
20
Esimerkki 7 * Xln A -geenille läheisten geenien seulonta Trichoderma reesei kannasta QM9414 25 Esimerkki 7.1 • * DNA-fragmenttien 32P-leimaus :*·.! 25 ng plasmidista pIMlOO esimerkissä 2.2 kuvatulla tavalla *·,··· eristettyä 900 ep:n XhoI/BamHI-fragmenttia leimattiin sa- j 30 tunnaisalukkeistuksella käyttäen oligonukleotidileimaus- • * pakkausta (Pharmacia) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Liittymättömän a-32P-dATP:n poistamiseksi seoksesta tila-, , vuutta lisättiin 100 plraan TE-puskurilla, minkä jälkeen ; / a-32P-dATP poistettiin fraktioimalla Sephadex G50-pylvääs- * 35 sä. Radioaktiivisesti leimatun DNA:n sisältävät fraktiot ’ ; , denaturoitiin inkuboimalla kolme minuuttia 100 °C:ssa, ja 57 108944 pidettiin yksiketjuisina nopealla jäähdytyksellä jäissä ennen kuin lisättiin hybridisaatiopuskuri, joka sisälsi 6 x SSC; 5 x Denhardt’in liuosta; 0,1 % natriumpyrofos-faattia ja 100 pg/ml lämpödenaturoitua lohen sperman DNA:-5 ta.
Esimerkki 7.2 ! T. reesei kannan QM9414 DNA:n genominen hybridisaatio 10 Suurimolekyylipainoista T. Teeseistä esimerkissä 2.1 kuvatulla tavalla eristettyä DNA:ta pilkottiin BamHI:llä. Balll:11a. EcoRI:llä ja Sali:llä. Saadut fragmentit eroteltiin agaroosigeelielektroforeesilla ja siirrettiin nit-roselluloosamembraanille, kuten Maniatis et ai. (1982, s.
15 383 - 389) ovat kuvanneet. Nitroselluloosamembraaneja esi- hybridisoitiin 57 °C:ssa kaksi tuntia hybridisaatiopusku-rissa (kuten esimerkissä 7.1 edellä on kuvattu). Tämän esihybridisaatioprosessin jälkeen radioaktiivisesti leimattu fragmentti, kuvattu esimerkissä 7.1, lisättiin hyb-20 ridisaatiopuskuriin, ja hybridisaatiota jatkettiin 44 tuntia. Hybridisaation jälkeen suodattimia pestiin 90 minuuttia 57 °C:ssa 4 x SSC:ssä; 0,1 % SDS; 0,1 % natriumpyro-fosfaatti, mitä seurasi lopullinen pesu käyttäen 2 x SSC:tä samassa lämpötilassa. Membraanien teippaamisen jäl-25 keen Whatman 3MM-paperille, ja huolellisen merkitsemisen i radioaktiivisella musteella jälkeen, suodattimet peitet-’ *,·’ tiin Saran Wrap™:illa ja niitä autoradiografioitiin 72 tuntia -70 °C:ssa käyttäen Kodak XAR-5 röntgenfilmiä ja ·;··; Kodak X-Omatic kasetteja tavanomaisten vahvistuslevyjen ; 30 kanssa.
* - » t I
Yhteenveto havaituista hybridisaatiofragmenteista on esi- , , tetty taulukossa 2.
; * 1 i ) 58 108944
Taulukko 2
Trlchoderma reesein aenomisesta DNA:sta A. tubicrensiksen xln A -geenin fragmenttia koettimena käyttäen havaitut hvbridisoituvat fragmentit ia niiden pituudet (kbp) 5
BamHI Bglll EcoRI Sali 16 18* 18* 6,8*1 I 13* 9,4 4,2 3,8 4,0 (7,3) 10 4,2 = voimakkaimmin hybridisoituva fragmentti 1 = kaksoisvyöhykkeet ()= hyvin heikko signaali 15
Esimerkki 7.3
Trlchoderma reesein genomisen kirjaston seulonta xln A:lie läheisten geenien suhteen.
20 Trichoderma reesein genomisen kirjaston seulontaa varten xln A:lie läheisten geenien suhteen valitut hybridisaatio- olosuhteet, käyttäen 32P-leimattua 900 bp:n XhoI/BamHI - fragmenttia, joka sisälsi xln A -geenin koettimena, kuten esimerkeissä 6.1 ja 6.2 on kuvattu, olivat: esihybridisaa- . 25 tio 6 x SSC:ssä, 0,1-prosenttinen SDS, 0,05-prosenttinen . natriumpyrofosfaatti ja 100 pg/ml denaturoitua lohen sper- :m ·* man DNA:ta, 60 °C:ssa 3-5 tuntia; tätä seurasi hybri- *· "· disaatio 6 x SSC:ssä, 0,1-prosenttinen SDS, 0,05-prosent- '*"· tinen natriumpyrofosfaatti ja 100 pg/ml denaturoitua lohen • · :/·· 30 sperman DNA:ta, 57 °C:ssa 44 tuntia; tätä seurasi kaksi : : : pesua 5 x SSC:ssä, 0,1-prosenttinen SDS, 60 °C:ssa ja kak si pesua 3 x SSC:ssä 60 °C:ssa. Suodattimien siirron 3 MM : paperille ja huolellisen merkinnän radioleimatulla mus- /;. teella jälkeen, suodattimet peitettiin Saran Wrap'illa ja * 35 Kodak XAR-5 röntgenfilmi altistettiin 72 tunniksi : 70 °C:ssa käyttäen Kodak X-Omatic kasetteja tavallisten • · I * · * * 59 108944 vahvistuslevyjen kanssa. Näissä olosuhteissa löydettiin noin 50 positiivista signaalia.
Esimerkki 7.4 5 T. reesein xln A:lie läheiset sekvenssit sisältävien faa-gien analyysi
Hybridisoituvista bakteriofagiklooneista 18 puhdistettiin, kuten esimerkissä 3.2 on kuvattu, ja valittiin 9 faagia, 10 joista eristettiin DNA, kuten esimerkissä 3.3 on esitetty. Faagit analysoitiin pilkkomalla DNA Hindi:11a ja Hinfl:-11a. Southern-analyysistä havaittuihin hybridisaatiomal-leihin perustuen (käyttäen 32P-leimattua 900 ep:n XHoI/BAM-HI-fragmenttia koettimena, kuten esimerkissä 7.1 on kuvat-15 tu), nämä faagit määriteltiin kahteen luokkaan: ana lysoiduista faageista viisi luokkaan A (faagit 1, nro 3, nro 4, 20, nro 22), ja neljä luokkaan B (faagit nro 10, nro 16, nro X2 ja nro X3). Kummastakin luokasta valittiin yksi faagi seuravaan restriktioanalyysiin: faagi nro 1 20 luokasta A ja faagi nro 10 luokasta B.
Faagien nro 1 ja nro 10 DNA saatettiin restriktioanalyysiin pilkkomalla BamHI:11a. Balll:11a. EcoRI:11a. Bqlll:-11a ja näiden yhdistelmällä, ja pilkkomalla yksittäin . 25 Kpnl:11a. Smal:11a. XhoI:11a. Xbal:11a. SstI:11a. HindiI-I:lla ja PstI:11a. Sen jälkeen tehtiin Southern-analyysi * * · * ·’ käyttäen 900 ep:n XhoI/BamHI-fragmenttia koettimena. Saa- '· tujen kuvioiden perusteella, noin 6,5 ke:n Vqlll/Sall- * · fragmentti luokan A faagista nro 1 ja noin 7,5 ke:n Bam- 30 HI/BglII-fragmentti luokan B faagista 10 valittiin ala-: : : kloonausta varten.
; . : 6,5 kb:n BglII/Sali-fragmentti eristettiin ja ligatoitiin, kuten esimerkissä 3.5 on kuvattu, BamHI/Sali: 11a pilkot- 35 tuun vektoriin pEMBL18, ja saatiin plasmidi pIM030. Plas- midin pIM030 sisältävä E.coli JL109 talletettiin talletus- 60 108944 laitokseen Centraal Bureau voor Schimmelkultures, Barn, alankomaat, 11.7.1991, ja sille annettiin talletusnumero CBS 420.91.
5 7,5 ke:n BamHI/Bglll-fragmentti eristettiin ja ligatoi- tiin, pilkottiin BamHI:11a ja liitettiin defosforyloituun vektoriin pUC9, ja saatiin plasmidi pIM041. Plasmidin pl-M041 sisältävä E.coli JM109 talletettiin talletuslaitokseen Centraal Bureau voor Schimmelkultures, Barn, alanko-10 maat, 11.7.1991, ja sille annettiin talletusnumero CBS 421.91.
Sekä plasmidille pIM030 että pIM041 tehtiin vielä restrik-tioanalyysi, joka tuotti kuvissa 19 ja vastaavasti 20 esi-15 tetyt restriktiokartat.
Esimerkki 8 j XYL A -proteiinin lisäys eläinten rehukoostumuksiin.
20 Endoksylanaasin tehokkuus lisättynä ruokavalioon, jossa on paljon vehnän sivutuotteita, mitattuna ravinteiden sulavuudella ja eläinteknisellä teholla, osoitetaan käyttämällä seuraavaa koemenettelyä.
. 25 Yhden vuorokauden ikäisiä naaraspuolisia kananpoikia kas-, , vatettiin kennostohäkeissä, joissa oli verkkolattiat, ja 4 1 » • 1’ ruokittiin kaupallisella alkuruokavaliolla, kunnes koeaika i « · alkoi. 13. vuorokautena linnut jaettiin satunnaisesti sa-·'"· mankokoisiin elopainon käsittelykokeisiin. Kolmea erilais- '·,1·· 30 ta koeruokavaliota annettiin 18 ryhmälle lintuja; kussakin : ryhmässä oli 8 lintua. Ruokavaliot oli pelletoitu hyvin lievissä olosuhteissa ja kananpoikia ruokittiin ad libitum : vuorokausina 13 - 34 (kuoriutumisen jälkeen).
’· 35 Ruoan kulutusta ja kasvua tarkkailtiin viikoittain kusta- > 1 f : kin häkistä. Sulavuutta mitattiin 3 vuorokauden ajan erit- · a 61 1 08944 teiden keruulla. Suoritettiin jätösten semi-kvantitatiivi-nen keruu. Käyttäen merkkiä (HCl:oon liukenematon tuhka), laskettiin yksittäiset sulavuuskertoimet proteiinille, rasvalle, raakakuidulle ja typettömälle uutteelle. Kunkin 5 ruokavalion ilmeinen aineenvaihdunnassa käytettävä enrgia (AME) laskettiin seuraavasta yhtälöstä: AME (MJ/kg D.M. ) = 17,46 + 38,81 a2 + 8,0 a3 + 16,5 a4 ai = raakaproteiini (grammaa kiloa kohti D.M.) x d.c.1’ 10 a2 = raakarasva (grammaa kiloa kohti D.M.) x d.c. a3 = raakakuitu (grammaa kiloa kohti D.M.) x d.c. a< = typetön uute (grammaa kiloa kohti D.M.) x d.c.
1} d.c. = sulavuuskerroin 15 Perusruokavalio perustui vehnäleseisiin, maissitärkkelyk- seen ja runsasproteiinisiin eläinten sivutuotteisiin (taulukko 3). Tähän ruokavalioon lisättiin endoksylanaasia kahtena eri tasona, 36 000 U/kg ja 174 000 U/kg puhdistettua endoksylanaasia (spesifinen aktiivisuus 300 000 U/g).
20 ' 1 » 1 1 « k
· I
t · » i t
• f I
» f 62 1 08944
Taulukko 3 perusruokavalion koostumus Aineosa % vehnänleseet 40 5 maissitärkkelys 30 maissi 4,4 eläinten sivutuotteet (lihajauhe, I kalajauhe, höyhenjauhe) 9,7 soijauute (81 % cp) 6,0 10 soijaöljy 6,0 rasvasekoite 0,7 jauhettu kalkkikivi 0,32 monokalsiumfosfaatti 0,13 premix (sisältö DL-metioniini & 15 lysiini - HC1) 1,35
Si02-merkki (Diamol®) 1,4
Laskettu sisältö AME (MJ/kg) 12,66 20 raakaproteiini, % 18,0 lysiini, % 1,2 metioniini + kystiini, % 0,9
Analysoitu sisältö 25 raakaproteiini, % 18,2 . raakarasva, % 9,7 .. , raakakuitu, % 4,1 • » » \ ·’ Si02 - merkki, % 1,07
Ca, % 0,8 30 P, % 0,85 ·.*·: tuhka, % 5,9 • I * Tärkeimmät tulokset on koottu taulukkoon 4 (kehitystulok-;'.fj set) ja taulukkoon 5 (sulavuustulokset). Kehitystulokset ,•*.*.35 on koottu koko koeajalta, vuorokausilta 13 - 34 (kuoriutu- t misen jälkeen), kun taas sulavuustulokset ovat keskimää- ti» t 108944 räiset arvot, jotka on saatu analysoimalla vuorokausina 21 - 24 ja 28 - 31 kerätyt eritteet.
Taulukko 4 5 Endoksylanaasilisäyksen vaikutus kananpoikien kehitykseen iässä 13 - 34 vuorokautta jj··-· II. —ga—g n . .. -1 -i. —-J || ruokavalio 1 ruokavalio 2 ruokavalio 3 | 36 000 U/kg 174 000 U/kg 10 Parametri perus- endoksyla- endoksy- naasi lanaasi kasvu (g 50,5 50,8 51,9 vuorokaudessa) ravinnon 95,6 89,7 92,6 15 kulutus (g/-lintu/vrk) rehu: tuotto 1,89 1,77 1,79 (g*-g) • » » > * *
• I I M
♦ I « I » 64 1 0 8 9 4 4
Taulukko 5
Endoksvlanaasilisävksen vaikutus orgaanisten ravinteiden sulavuuskertoimiin (d.c.) ia ruokavalion laskettuun energia-arvoon 5 sulavuus ruokavalio 1 ruokavalio 2 ruokavalio 3 36 000 174 000
perus- U/kg XYL A U/kg XYL A
raakaprote- 79 82 82 iini1 % raakarasva % 85 91 82 raakakuitu % 0 11 11 10 typetön uute % 73 75 75 AME (MJ/kg D.M.) 13,81 14,28 14,28 15 1 eritteistä määritetty typpi korjattiin virtsahappomääräk- si virtsassa.
Tämä tutkimus osoittaa endoksylanaasilisäyksen tehon broilerien rehukoostumuksiin, jotka sisältävät suuren määrän 20 vehnäleseitä. Positiivinen vaikutus kohdistui sekä kananpoikien kehitykseen että ruokavalion energia-arvoon.
1 » » ’.· Mitä tulee rehun kulutukseen, tehokkuus oli herkin para- '·'·· metri, joka kuvasi entsyymilisäyksen vaikutusta. Havait- ·:··! 25 tiin, että entsyymillä täydennettyä rehua nauttivissa ryh-missä oli taipumus hieman pienentyneeseen rehun kulutuk- seen, mikä liittyi samanlaisena pysyneeseen tai parantu- neeseen kasvuun. Vastaavasti rehu:tuotto -suhde pieneni . . olennaisesti.
30 65 108944
Kehityksen parantuminen voidaan selittää entsyymi lisäyksen vaikutuksilla sulavuuskertoimiin. Vaikutus oli positiivinen kaikkiin ravinteiden sulavuusarvoihin, vaikka rasvan sulavuuden lisääntyminen oli huomattavin, ja johti entsyy-5 millä täydennettyjen ruokavalioiden energia-arvon lisäykseen 3,5-prosentilla.
Annos-vaste -suhdetta ei havaittu näillä entsyymilisäys-tasoilla.
10
Esimerkki 9
Endoksylanaasin käyttö leivänteossa.
Leivottiin pieniä leipiä 150 g taikina-annoksista, jotka 15 tehtiin sekoittamalla 200 g vehnäjauhoja (100 %), 106 ml vettä (53 %), 1,2 g kuivattua käyttövalmista leivinhiivaa (0,6 %: Gist-Brocades N. V., Delft, Alankomaat), 4 g NaCl (2 %), 400 mg CaCl2x2H20 (0,2 %), 10 mg sienialkuperää olevaa a-amylaasia P200 (Gist-Brocades, 2250 SKB/kg jauhoja) ja I 20 eri yksikkömäärät endoksylanaasi (xyl A) aktiivisuutta.
Kun oli sekoitettu 6 min ja 15 s 52 rpm sekoittimessa, taikina jaettiin, nostatettiin 45 minuuttia 31 °C:ssa, vaivattiin, nostatettiin vielä 25 minuuttia, vaivattiin ja pantiin vuokaan. Lopullisen nostatuksen jälkeen, 70 mi-25 nuuttia 31 °C:ssa, taikinaa paistettiin 20 minuuttia uu-.t i nissa 250 °C:ssa. Limpun tilavuus määritettiin rapsin- . siementen siirtymistestillä (rapeseed displacement met- I · · *, hod). Tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 6, al- '· ’· la.
« * » ♦ 66 ^ 08944
Taulukko 6
Eri määrien endoksvlanaasiaktiivisuutta (xvl A) kanssa valmistetun leivän ominaisuudet endoksyla- 5 naasi-aktii- leivän visuus (yk- tilavuus murtuminen/ Crumb sikköjä) (ml) repeytyminen rakenne*
0 546 6 6I
32 560 7 6 10 128 579 7,5 7 320 609 8 6,5 640 621 7,5 6,5 960 624 7,5 7 2560 618 7,5 7,5 = pisteet l:stä (huonoin laatu) 10:een (paras laatu).
Näistä tuloksista on selvää, että lisääntynyt määrä endo-ksylanaasiaktiivisuutta lisättynä taikinaan, johtaa leivän 20 tilavuuden lisääntymiseen ja leivän laadun parantumiseen, määritettynä murtumisella ja repeytymisellä sekä murura-kenteella.
• · f » i · * ( « • · * · • · • » * * »
I I I » I
I I i 1 I I
» • I t I I » » ♦ • » . I * » » » 1*1 * » * 67 1 0 8 9 4 4
Viitteet
Amons, R. (1987) FEBS Lett., 212, 68 - 72.
Biely, P., Mislovicova, D. ja Toman, R. (1985a) Anal. Biochem., 144, 142 - 146.
5 Biely, P., Markovic, O. ja Mislovicova, D. (1985b) Anal. Biochem., 144, 147 - 151.
Boel, E. et ai. (1984a) EMBO J., 3, 1097 - 1102.
Boel, E., et ai. (1984b) Mol. Cell. Biol., 4, 2306 - 2315. Carre, B. ja Brillouet, J. M. (1986) J. Science and Food j 10 Agric., 37, 341 - 351.
Chesson, A. (1987) Recent Advances in Animal Food Nutriti-I on, Haresign, W. ja Cole, D. J. A., toim., But- terworth, Lontoo, 71 - 89.
Cove, D. (1966) Biochem. Biophys. Acta 113, 51 - 56.
15 Dekker, R. F. A. ja Richards, G. M. (1977) Adv. Carb.
Chem. and Biochem., 32, 278 - 353.
Ehrlich, H. A., toim. (1989) PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification. Stockton Press, New York.
20 Goosen, T., Bloemheuvel, G., Gysler, C., de Bie, D. A., van den Broek, H. W. J. ja Swart, K. (1987) Curr. Genet., 11, 499 - 503.
Goosen, T., van Engelenburg, F., Debets, F., Swart, K.,
Bos, K. ja van den Broek, H. W. J. (1989) Mol.-25 Gen.Genet., 219, 282-288.
, de Graaff, L. H., van den Broek, H. W. J. ja Visser, J.
.] (1988) Curr. Genet., 13, 315 - 321.
•t ·| Kelly, J. ja Hynes, M. (1985) EMBO J. 4, 475 - 479.
'! Kusters-van Someren, M. A., Samson. R. A. ja Visser, J.
*·' · 30 (1991) Curr. Genet., 19, 21.
·,’ > Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680 - 685.
; i : Leathers, T. D., Kurtzman, C. P., Detroy, R. W. (1984)
Biotechnol. Bioeng. Symp., 14, 225.
: Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1982) Molecu- 35 lar Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, New York.
ί t I
ill I
t » 4 »
« · I
I »I Ψ * 68 108944
Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem., 262, 10035 - 10038.
McCleary, B. V. ja Matheson, N. K. (1986) Adv. Carb. Chem. and Biochem., 44, 147 - 276.
Messing, J. (1983) Methods in Enzymology, 101C, 20 - 78.
5 Moonen, J. H. E., Scheepstra, A., Graveland, A. (1982)
Euphitica, 31, 677.
Murray, N. (1977) Mol. Gen. Genet., 150, 53 - 58.
Norrander, J., Kempe, T. ja Messing, J. (1983) Gene, 26, 101 - 106.
10 Poutanen, K. ja Puls, J. (1988) Appi. Microbiol. Biotech-nol., 28, 425.
Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487 - 491.
Sanger, F., Nickelen, S. ja Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 - 5467.
15 Tilburn, J. et al. (1983) Gene 26, 205 - 221.
Vieirra, J. ja Messing, J. (1982) Gene, 19, 259 - 268.
Visniac, W. ja Santer, M. (1957) Bact. Rev., 21, 195 - 213.
! Wernars, K. (1986) Thesis, Agricultural University, Wa- ί 20 geningen, Alankomaat.
Wong, K. K. Y., et al. (1988) Microbiol. Rev., 52, 305 -317.
Woodward, G. (1984) Topics in Enzyme Ferment. Biotechnol., 8, 9 - 30.
25 Yanisch-Perron, C., Viera, J. ja Messing, J. (1985) Gene, 33, 103 - 109.

Claims (15)

  1. 69 108944
  2. 1. Puhdistettu ja eristetty DNA-sekvenssi, joka koodaa ksylanaasiaktiivisuutta omaavaa polypeptidiä, tunnettu 5 siitä, että DNA-sekvenssi on a) kuvan 8 asemasta 1030 asemaan 1634 ulottuva sieniperäinen DNA-sekvenssi, b) DNA-sekvenssi, joka kykenee hybridisoitumaan edellä esitetyn kohdan a) DNA-sekvenssin kanssa tai koettimen j 10 kanssa, joka sisältää nukleotidit asemasta 749 asemaan 1706 kuvan 8 mukaisessa DNA-sekvenssissä, hybridisointi-olosuhteissa, jotka vastaavat olosuhteita, joissa suoritetaan kaksi pesua 5 x SSC, 0,1% SDS 60 °C:ssa ja kaksi pesua 3 x SSC, 60 °C:ssa, tai 15 c) DNA-sekvenssi, joka eroaa kohdan a) tai b) mukaisesta DNA-sekvenssistä ainoastaan geneettisen koodin degeneroitumisen vuoksi; ja edelleen siitä, että DNA-sekvenssi ei ole seuraava patenttihakemuksessa FI 92 5730 esitetty DNA-sekvenssi: 20 ATGAAGGTCA CTGCGGCTTT TGCAGGTCTT TTGGTCACGG CATTCGCCGC TCCTGTGCCG GAACCTGTTC TGGTGTCGCG AAGTGCTGGT ATTAACTACG TGCAAAACTA CAACGGCAAC CTTGGTGATT TCACCTATGA CGAGAGTGCC GGAACATTTT CCATGTACTG GGAAGATGGA GTGAGCTCCG ACTTTGTCGT
  3. 25 TGGTCTGGGC TGGACCACTG GTTCTTCTAA GTGAGTGACT GTATTCTTTA ACCAAAGTCT AGGATCTAAC GTTTTCTAGC GCTATCACCT ACTCTGCCGA ATACAGTGCT TCTGGCTCCT CTTCCTACCT CGCTGTGTAC GGCTGGGTCA ACTATCCTCA GGCTGAATAC TACATCGTCG AGGATTACGG TGATTACAAC .·;·! CCTTGCAGCT CGGCCACAAG CCTTGGTACC GTGTACTCTG ATGGAAGCAC ’ CTACCAAGTC TGCACCGACA CTCGAACTAA CGAACCGTCC ATCACGGGAA
  4. 30 CAAGCACGTT CACGCAGTAC TTCTCCGTTC GAGAGAGCAC GCGCACATCT ·:·'! GGAACGGTGA CTGTTGCCAA CCATTTCAAC TTCTGGGCGC AGCATGGGTT .·*·. CGGAAATAGC GACTTGAATT ATCAGGTCAT GGCAGTGGAA GCATGGAGCG ‘i·’ GTGCTGGCAG CGCCAGTGTC ACGATCTCCT CTTAA. 35 : 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu » · · .*··, siitä, että se on peräisin Aspergill us-suvun sienestä. * * ♦ 70 1 08944
  5. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on peräisin Trichoderma suvun sienestä.
  6. 54. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on peräisin lajeista Aspergillus tubigensis, Aspergillus niger, Aspergillus awamori tai Aspergillus aculeatus.
  7. 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi on peräisin Trichoderma reesei -laj ista.
  8. 6. DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin 15 patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen DNA-sekvenssin liitettynä toiminnallisesti säätelyalueisiin, jotka kykenevät ohjaamaan ksylanaasiaktiivisuutta omaavan polypeptidin yliekspression sopivassa ekspressioisännässä.
  9. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen DNA-rakenne, tunnettu edelleen siitä, että säätelyalue sisältää promoottorin, joka on amyloglukosidaasigeenistä peräisin oleva promoot-:··· tori tai ksylanaasigeenille luontainen promoottori. ·, ; 25 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen DNA-rakenne, tunnettu edelleen siitä, että säätelyalue sisältää erityksen joh-. , tosekvenssin, joka on amyloglukosidaasigeenistä peräisin ;,** oleva erityksen johtosekvenssi tai ksylanaasigeenille » I I ’·* luontainen erityksen johtosekvenssi. 30 ·”’· 9. Transformoitu mikrobi-isäntä, joka kykenee tuottamaan polypeptidiä, jolla on ksylanaasiaktiivisuutta, tunnettu ,···. siitä, että mikrobi-isäntä sisältää minkä tahansa patent- ,tivaatimuksista 6-8 mukaisen ekspressiorakenteen. 35 : 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen transformoitu mikrobi- :t><: isäntä, tunnettu siitä, että mikrobi-isäntä kuuluu sukuun 71 1 08944 Aspergillus, Kluyveromyces, Trichoderma, Saccharomyces tai Bacillus.
  10. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen transformoitu mikro-5 bi-isäntä, tunnettu edelleen siitä, että mikrobi-isäntä kuuluu lajiin Aspergillus tubigensis, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus ' licheniformis, Kluyveromyces lactis tai Saccharomyces ce- 10 revisiae.
  11. 12. Menetelmä ksylanaasiaktiivisuutta omaavan polypepti-din tuottamiseksi, tunnettu siitä, että a) kasvatetaan jonkin patenttivaatimuksista 9-11 mukaista 15 mikrobi-isäntää olosuhteissa, jotka edistävät ksylanaasiaktiivisuutta omaavaa polypeptidiä koodaavan geenin ekspressiota; ja b) otetaan talteen polypeptidi, jolla on ksylanaasiaktiivisuutta . 20
  12. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu ! edelleen siitä, että . c) ksylanaasiaktiivisuutta omaava polypeptidi sekoitetaan .. . muiden valittujen entsyymien kanssa. » 1 · : ·1 25 • » '· 14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen menetelmä, * 1 tunnettu edelleen siitä, että • · ·.'·· d) ksylanaasiaktiivisuutta omaava polypeptidi formuloisi daan stabiiliksi nestemuotoon tai kuivamuotoon. 30 ;1· 15. Patenttivaatimuksessa 1 määritellyn DNA-sekvenssin .···. koodaaman, ksylanaasiaktiivisuutta omaavan polypeptidin ; käyttö eläinten rehujen valmistuksessa, tunnettu siitä, '···’ että polypeptidi on ainoa ksylaania hajottava entsyymi, : ’ 35 joka lisätään eläinrehukoostumukseen. ,·1·, 16. Patenttivaatimuksessa 1 määritellyn DNA-sekvenssin 72 108944 koodaaman, ksylanaasiaktiivisuutta omaavan polypeptidin käyttö taikinassa leivän valmistamiseksi, tunnettu siitä, että polypeptidi on ainoa ksylaania hajottava entsyymi, joka lisätään taikinaan leivän valmistamiseksi. 5
  13. 17. Patenttivaatimuksessa 1 määritellyn DNA-sekvenssin ! koodaaman, ksylanaasiaktiivisuutta omaavan polypeptidin käyttö ligniinien poistamisessa kraft-massasta paperituotteiden valmistuksessa, tunnettu siitä, että polypep-10 tidi on ainoa ksylaania hajottava entsyymi, joka lisätään kraft-massaan ligniinien poistamiseksi siitä.
  14. 18. Ksylanaasigeenin ekspression ja transkription säätelyalueet sisältävä DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että
  15. 15 DNA-sekvenssi on a) sieniperäinen DNA-sekvenssi, joka sisältää Aspergillus tubigensiksen ksylanaasi A-geenin ekspression ja transkription säätelyalueet, kuten kuvassa 8 on esitetty, tai b) DNA-sekvenssi, joka kykenee hybridisoitumaan edellä 20 esitetyn kohdan a) DNA-sekvenssin kanssa hybridisointi- olosuhteissa, jotka vastaavat olosuhteita, joissa suoritetaan kaksi pesua 5 x SSC, 0,1% SDS 60 °C:ssa ja kaksi ;.·· pesua 3 x SSC, 60 °C:ssa, ja edelleen siitä, että mainittu DNA-sekvenssi ei ole DNA- > · •t ; 25 sekvenssi, joka sisältyy plasmidiin pAW14B, joka sisältyy * · kantaan CBS 237.90, joka on talletettu 31.5.1990 CBS-tal- • · , . letuslaitokseen, kuten on kuvattu patenttihakemuksessa FI i · · 92 5730. i t I » t I · · • · * · a • · · * · • I · » » · ♦ » i a 1 · 108944 73
FI921231A 1990-07-24 1992-03-20 Sieniperäisten ksylanaasigeenien kloonaus ja ilmentäminen FI108944B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP90202020 1990-07-24
EP90202020 1990-07-24
NL9100137 1991-01-28
PCT/NL1991/000137 WO1992001793A1 (en) 1990-07-24 1991-07-24 Cloning and expression of xylanase genes from fungal origin

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI921231A0 FI921231A0 (fi) 1992-03-20
FI921231A FI921231A (fi) 1992-03-20
FI108944B true FI108944B (fi) 2002-04-30

Family

ID=8205086

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI921232A FI921232A0 (fi) 1990-07-24 1992-03-20 Enzymatisk behandling av ensilage.
FI921231A FI108944B (fi) 1990-07-24 1992-03-20 Sieniperäisten ksylanaasigeenien kloonaus ja ilmentäminen

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI921232A FI921232A0 (fi) 1990-07-24 1992-03-20 Enzymatisk behandling av ensilage.

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5358864A (fi)
EP (3) EP0463706B2 (fi)
JP (2) JPH05500907A (fi)
KR (1) KR100212232B1 (fi)
AT (2) ATE124844T1 (fi)
AU (2) AU654147B2 (fi)
CA (2) CA2067329A1 (fi)
DE (3) DE69133201T2 (fi)
DK (2) DK0463706T3 (fi)
ES (1) ES2086267T3 (fi)
FI (2) FI921232A0 (fi)
HU (2) HUT60606A (fi)
IE (3) IE912582A1 (fi)
IL (1) IL98941A (fi)
NO (2) NO921133D0 (fi)
NZ (2) NZ239085A (fi)
PL (2) PL171271B1 (fi)
PT (1) PT98419B (fi)
WO (2) WO1992001389A1 (fi)

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837515A (en) * 1990-05-16 1998-11-17 Alko-Yhtiot Oy Enzyme preparations and methods for their production
NL9001388A (nl) 1990-06-19 1992-01-16 Unilever Nv Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
PT98419B (pt) * 1990-07-24 1999-01-29 Gist Brocades Nv Processo para a preparacao de sequencias de adn que codificam para xilanases, de construcoes de adn que contem essas sequencias, paraa transformacao de hospedeiros microbianos com essas construcoes, para a preparacao de xilanases por expressao nesses hospedeiros e para a degradacao de xilano por accao dessas xilanases
GB9027303D0 (en) * 1990-12-17 1991-02-06 Enzymatix Ltd Enzyme formulation
US5863783A (en) * 1991-03-27 1999-01-26 Gist-Brocades, N.V. Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
EP0672149B1 (en) * 1991-12-09 2001-08-08 Unilever Plc PROCESS FOR PRODUCING/SECRETING A PROTEIN BY A TRANSFORMED MOULD USING EXPRESSION/SECRETION REGULATING REGIONS DERIVED FROM AN $i(ASPERGILLUS) ENDOXYLANASE II GENE
NZ253280A (en) * 1992-06-17 1997-09-22 Univ Newcastle Recombinant truncated xylanases derived from anaerobic fungi
CA2138399A1 (en) * 1992-06-17 1993-12-23 Gang P. Xue Recombinant xylanase
IL108175A0 (en) * 1992-12-24 1994-04-12 Gist Brocades Nv Cloning and expression of xylanase B
ATE412048T1 (de) * 1993-03-10 2008-11-15 Novozymes As Enzyme mit xylanaseaktivität aus aspergillus aculeatus
GB2279955B (en) * 1993-07-15 1998-02-18 Solvay Xylanase derived from a Bacillus species, expression vectors for such xylanase and other proteins, host organisms therefor and use thereof
FR2715802B1 (fr) * 1994-02-04 1996-03-15 Rhone Poulenc Nutrition Animal Utilisation d'enzymes dans l'alimentation des animaux pour réduire les rejets azotés.
US5448645A (en) * 1994-02-28 1995-09-05 Raymond Guerci International, Inc. Active fan blade noise cancellation system
WO1995023514A1 (en) * 1994-03-02 1995-09-08 Novo Nordisk A/S Processing plant material with xylanase
WO1995023515A1 (en) * 1994-03-02 1995-09-08 Novo Nordisk A/S Use of xylanase in baking
GB9406317D0 (en) * 1994-03-30 1994-05-25 Finnfeeds Int Ltd Use of an enzyme for assisting an animal to digest protein
US6051431A (en) * 1994-07-22 2000-04-18 Dsm N.V. Selection marker gene free recombinant strains: a method for obtaining them and the use of these strains
US7816129B2 (en) 1994-07-29 2010-10-19 Ab Enzymes Gmbh Production and secretion of proteins of bacterial origin in filamentous fungi
US5935836A (en) * 1994-07-29 1999-08-10 Rohm Enzyme Finland Oy Actinomadura xylanase sequences and methods of use
US6300114B1 (en) 1994-07-29 2001-10-09 Rohm Enzyme Finland Oy Sequences of xylanase and xylanase expression vectors
US5871730A (en) * 1994-07-29 1999-02-16 Universite De Sherbrooke Thermostable xylanase DNA, protein and methods of use
GB9416841D0 (en) * 1994-08-19 1994-10-12 Finnfeeds Int Ltd An enzyme feed additive and animal feed including it
ES2204963T3 (es) * 1994-08-26 2004-05-01 Dsm Ip Assets B.V. Enzimas degradadoras de arabinoxilano.
ATE210180T1 (de) 1995-01-26 2001-12-15 Novozymes As Xylanase beinhaltende futterzusätze für tiere
GB9505479D0 (en) * 1995-03-17 1995-05-03 Danisco Enzyme
NZ311180A (en) 1995-06-23 2000-01-28 Danisco Ingredients As Nucleotide sequence encoding a peptide having beta-xylosidase activity and use thereof
US5720971A (en) * 1995-07-05 1998-02-24 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Department Of Agriculture And Agri-Food Canada Enzyme additives for ruminant feeds
AU7294396A (en) * 1995-10-13 1997-04-30 Gist-Brocades B.V. Protein detection
US5902581A (en) * 1995-12-04 1999-05-11 Genencor International, Inc. Xylanase from acidothermus cellulolyticus
US6635464B1 (en) 1995-12-18 2003-10-21 Rohm Enzyme Finland Oy Xylanases, genes encoding them, and uses thereof
AU1437597A (en) * 1996-01-22 1997-08-20 Novo Nordisk A/S An enzyme with xylanase activity
ES2111495B1 (es) * 1996-07-19 1998-11-01 Consejo Superior Investigacion Cepa de levadura de panaderia cect10868 y cepa de panaderia cect10869. su metodo de obtencion por tecnicas de adn recombinante y su aplicacion como levaduras de panaderia.
GB9704157D0 (en) * 1997-02-28 1997-04-16 Danisco Expression element
US6140097A (en) * 1997-03-04 2000-10-31 Meiji Seika Kaisha Ltd. Mesophilic xylanases
WO1999006574A1 (en) 1997-07-31 1999-02-11 Dsm N.V. Cellulose degrading enzymes of aspergillus
US7220542B2 (en) 2000-07-17 2007-05-22 Van Den Brink Johannes Maarten Expression cloning in filamentous fungi
DK1141254T3 (da) * 1998-12-23 2006-07-17 Danisco Anvendelse af xylanase til fremstilling af en födevare
WO2002003805A1 (en) 2000-07-06 2002-01-17 Novozymes A/S Method of preparing a dough or a baked product made from a dough, with addition of lipolytic enzymes
EP1301618A1 (en) 2000-07-13 2003-04-16 Danisco Sweeteners Oy Method for the production of xylitol
NZ524814A (en) 2000-09-21 2004-08-27 Basf Ag Talaromyces xylanases
AU2002331469B2 (en) * 2001-08-20 2008-04-24 Cargill, Incorporated Non-starch-polysaccharides
US8022170B2 (en) 2002-12-17 2011-09-20 Ems-Chemie Ag Copolyamides
DK1625216T3 (da) 2003-05-09 2013-03-18 Novozymes As Lipolytiske enzymvarianter
EP1482050A1 (en) * 2003-05-28 2004-12-01 Facultés Universitaires Notre-Dame de la Paix Enzyme with xylanase activity at acidic ph
CN101389645B (zh) 2004-02-12 2016-08-03 诺维信股份有限公司 具有木聚糖酶活性的多肽和编码它的多核苷酸
JP2006219767A (ja) * 2005-02-08 2006-08-24 Univ Of Tsukuba 製紙用化学パルプ中の不飽和ウロン酸の除去方法
EA200870001A1 (ru) 2005-05-12 2009-10-30 Мартек Байосайенсиз Корпорейшн Гидролизат биомассы, его применение и производство
US8268956B2 (en) 2006-12-08 2012-09-18 Ems-Chemie Ag Transparent mold made of a polyamide molding material
ES2834477T3 (es) 2007-01-16 2021-06-17 Puratos Nv Pan con contenido de oligosacáridos de arabinoxilo aumentado
US7850382B2 (en) 2007-01-18 2010-12-14 Sanford, L.P. Valve made from two materials and writing utensil with retractable tip incorporating same
US7488130B2 (en) 2007-02-01 2009-02-10 Sanford, L.P. Seal assembly for retractable instrument
CN101679987A (zh) 2007-03-09 2010-03-24 丹尼斯科美国公司 嗜碱芽孢杆菌物种α-淀粉酶变体、包括α-淀粉酶变体的组合物以及使用方法
CN101636490B (zh) 2007-03-14 2012-05-16 丹尼斯科美国公司 里氏木霉α-淀粉酶是一种生麦芽糖酶
KR20130020842A (ko) 2007-06-01 2013-02-28 더 스크립스 리서치 인스티튜트 유전적으로 변형된 광합성 생물들의 고처리량 스크리닝
GB0718974D0 (en) 2007-09-28 2007-11-07 Univ Leuven Kath oligosaccharides derived from arabinoxylan for prevention of gastrointestinal infection
EP2060607B2 (de) 2007-11-16 2019-11-27 Ems-Patent Ag Gefüllte Polyamidformmassen
EP2546338A1 (en) 2008-01-02 2013-01-16 Danisco US Inc. A process of obtaining ethanol without glucoamylase using pseudomonas saccharophila g4-amylase and variants thereof
GB0805360D0 (en) 2008-03-25 2008-04-30 Univ Leuven Kath Arabinoxylan oligosaccharide preparation
US8226312B2 (en) 2008-03-28 2012-07-24 Sanford, L.P. Valve door having a force directing component and retractable instruments comprising same
MX2010011721A (es) 2008-04-30 2010-11-30 Danisco Inc Nuevas variantes de alfa-amilasa quimericas.
EP2291526B1 (en) 2008-06-06 2014-08-13 Danisco US Inc. Saccharification enzyme composition with Bacillus subtilis alpha-amylase
US9040278B2 (en) 2008-06-06 2015-05-26 Danisco Us Inc. Production of glucose from starch using alpha-amylases from Bacillus subtilis
DK2297312T3 (da) 2008-06-06 2013-12-16 Danisco Us Inc Alpha-amylasevarianter af Bacillus subtilis og fremgangsmåder til anvendelse heraf
US8221012B2 (en) 2008-11-07 2012-07-17 Sanford, L.P. Retractable instruments comprising a one-piece valve door actuating assembly
MX363668B (es) 2009-01-16 2019-03-29 Dupont Nutrition Biosci Aps Generacion enzimatica de lipidos funcionales a partir de cereales o bi-corrientes de cereal.
CA2749190C (en) 2009-01-16 2017-10-24 Danisco A/S Enzymatic generation of oligasaccharides from cereals or cereal bi-streams
US8393814B2 (en) 2009-01-30 2013-03-12 Sanford, L.P. Retractable instrument having a two stage protraction/retraction sequence
JP5528535B2 (ja) 2009-03-31 2014-06-25 ダニスコ・アクティーゼルスカブ 植物細胞壁材料の可溶化の際の抽出物の暗色化および悪臭形成の防止
DK3591046T3 (da) 2009-05-19 2021-07-26 Dupont Nutrition Biosci Aps Amylasepolypeptide
PL2365033T3 (pl) 2010-03-12 2013-12-31 Ems Patent Ag Poliamidowa masa do formowania o modyfikowanej udarności oraz wytworzony z niej zbiornik
FR2959515A1 (fr) 2010-05-03 2011-11-04 Puratos Compositions riches en oligosaccharides d'arabinoxylane
EP2412757B1 (de) 2010-07-30 2013-11-13 Ems-Patent Ag Polyamidformmasse zur Herstellung von Formkörpern mit einer Weichgriffoberfläche sowie entsprechende Formkörper
WO2012130969A1 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Novozymes A/S Process for production of a baked product
SI2535365T1 (sl) 2011-06-17 2014-02-28 Ems-Patent Ag Delno aromatične oblikovalne mase in njihova uporaba
EP2666803B1 (de) 2012-05-23 2018-09-05 Ems-Patent Ag Kratzfeste, transparente und zähe Copolyamidformmassen, hieraus hergestellte Formkörper und deren Verwendung
EP2716716B1 (de) 2012-10-02 2018-04-18 Ems-Patent Ag Polyamid-Formmassen und deren Verwendung bei der Herstellung von Formkörpern
ES2527403T3 (es) 2012-12-18 2015-01-23 Ems-Patent Ag Masa para moldeo de poliamida y cuerpos moldeados producidos a partir de ella
US8759041B1 (en) * 2013-02-12 2014-06-24 Novozymes Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP2778190B1 (de) 2013-03-15 2015-07-15 Ems-Patent Ag Polyamidformmasse sowie hieraus hergestellter Formkörper
EP3126509A1 (en) 2014-04-01 2017-02-08 DuPont Nutrition Biosciences ApS Method for increasing crude palm oil yields
BR112017013040A2 (pt) 2014-12-19 2018-01-09 Dupont Nutrition Biosci Aps método para aprimorar rendimentos de óleo de palma a partir de fruto de palma ou líquido de fruto de palma
CN107404915A (zh) 2015-03-04 2017-11-28 杜邦营养生物科学有限公司 谷粒加工
GB201522603D0 (en) 2015-12-22 2016-02-03 Dupont Nutrition Biosci Aps Composition
JP7094652B2 (ja) * 2016-03-31 2022-07-04 日油株式会社 製パン用油脂組成物および製パン用穀粉生地
KR101898246B1 (ko) * 2016-11-18 2018-09-13 전북대학교 산학협력단 케나프 사일리지의 제조방법 및 이에 따른 케나프 사일리지
JP7491542B2 (ja) * 2019-09-09 2024-05-28 株式会社フジワラテクノアート 基質培養物の製造方法及び基質培養物
JP7160071B2 (ja) * 2020-08-17 2022-10-25 日油株式会社 製パン用油脂組成物および製パン用穀粉生地
WO2024019057A1 (ja) * 2022-07-20 2024-01-25 天野エンザイム株式会社 腸内菌叢改善剤
EP4389906A1 (en) 2022-12-21 2024-06-26 Basf Se Methods for the enzymatic treatment of whole stillage

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1109471B (it) * 1976-08-17 1985-12-16 Deral Sa Procedimento e prodotto per la conservazione e la valorizzazione di vegetali a verde e dei sotto prodotti umidi delle industrie agro alimentari
US4212420A (en) * 1979-06-18 1980-07-15 International Business Machines Corporation Ribbon storage device
CA1280704C (en) * 1985-12-03 1991-02-26 Paul Ducroo Production of beer
FI84970C (fi) * 1988-04-22 1992-02-25 Suomen Sokeri Oy Foerfarande foer foerbaettring av degens egenskaper och broedets kvalitet.
FI881962A (fi) * 1988-04-26 1989-10-27 Cultor Oy Foerfarande foer foerbaettring av fodrets smaeltbarhet och med foerfarandet framstaellt foder.
CA1341226C (en) * 1988-08-16 2001-05-01 Wim Van Hartingsveldt Gene replacement as a tool for the construction of aspergillus strains
FI884668A (fi) * 1988-10-11 1990-04-12 Suomen Sokeri Oy Foerfarande foer foerbaettrande av framstaellningsprocessen hos torra saedesprodukter med hjaelp av enzymbehandling.
US5179021A (en) * 1989-02-10 1993-01-12 Gil Inc. (Now Ici Canada Inc.) Pulp bleaching process comprising oxygen delignification and xylanase enzyme treatment
WO1991015966A1 (en) * 1990-04-18 1991-10-31 Ssv-Development Oy Enzyme treated forage for silage
NL9001388A (nl) * 1990-06-19 1992-01-16 Unilever Nv Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
PT98419B (pt) * 1990-07-24 1999-01-29 Gist Brocades Nv Processo para a preparacao de sequencias de adn que codificam para xilanases, de construcoes de adn que contem essas sequencias, paraa transformacao de hospedeiros microbianos com essas construcoes, para a preparacao de xilanases por expressao nesses hospedeiros e para a degradacao de xilano por accao dessas xilanases

Also Published As

Publication number Publication date
HUT60606A (en) 1992-10-28
IE912582A1 (en) 1992-01-29
NO307347B1 (no) 2000-03-20
AU8320591A (en) 1992-02-18
JPH05501657A (ja) 1993-04-02
PT98419A (pt) 1992-06-30
EP0463706B2 (en) 2010-01-27
ES2086267T1 (es) 1996-07-01
WO1992001389A1 (en) 1992-02-06
EP0463706B1 (en) 2003-03-05
JPH05500907A (ja) 1993-02-25
NZ239083A (en) 1993-08-26
ATE124844T1 (de) 1995-07-15
EP0463706A1 (en) 1992-01-02
IL98941A0 (en) 1992-07-15
ATE233818T1 (de) 2003-03-15
DE69111148T2 (de) 1996-01-04
DK0463706T3 (da) 2003-06-23
PL291226A1 (en) 1992-09-07
FI921232A (fi) 1992-03-20
HU215234B (hu) 1998-11-30
NO921133L (no) 1992-03-23
DE463706T1 (de) 1996-10-24
DK0468596T3 (da) 1995-11-20
FI921231A0 (fi) 1992-03-20
DE69111148D1 (de) 1995-08-17
NO921134D0 (no) 1992-03-23
DE69133201D1 (de) 2003-04-10
PL291225A1 (en) 1992-09-21
HUT63881A (en) 1993-10-28
FI921231A (fi) 1992-03-20
HU9200960D0 (en) 1992-06-29
AU647170B2 (en) 1994-03-17
PL171271B1 (pl) 1997-03-28
CA2067329A1 (en) 1992-01-25
DE69133201T2 (de) 2003-12-11
EP0892065A1 (en) 1999-01-20
AU8318691A (en) 1992-02-18
IE68859B1 (en) 1996-07-24
US5358864A (en) 1994-10-25
IE912583A1 (en) 1992-01-29
EP0468596B1 (en) 1995-07-12
IL98941A (en) 2000-12-06
KR920702421A (ko) 1992-09-04
WO1992001793A1 (en) 1992-02-06
NO921133D0 (no) 1992-03-23
KR100212232B1 (ko) 1999-08-02
PT98419B (pt) 1999-01-29
IE20040144A1 (en) 2004-05-19
NZ239085A (en) 1993-08-26
AU654147B2 (en) 1994-10-27
CA2066734A1 (en) 1992-01-25
FI921232A0 (fi) 1992-03-20
HU9200961D0 (en) 1992-06-29
ES2086267T3 (es) 2003-10-01
EP0468596A1 (en) 1992-01-29
NO921134L (no) 1992-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI108944B (fi) Sieniperäisten ksylanaasigeenien kloonaus ja ilmentäminen
IE84033B1 (en) Cloning and expression of xylanase genes from fungal origin
FI111549B (fi) Rekombinantti-DNA-materiaali, joka koodaa ksylanaasin kypsyvää muotoa, ja isäntäsolu
US6143543A (en) Enzyme system comprising ferulic acid esterase from Aspergillus
CA2042054C (en) Cloning and expression of microbial phytase
JP4795604B2 (ja) キシラナーゼインヒビターに対する感受性を変化させたキシラナーゼ改変体
AU692595B2 (en) Arabinoxylan degrading enzymes
CA2298885A1 (en) Cellulose degrading enzymes of aspergillus
AU671710B2 (en) Cloning And Expression Of Xylanase B
JPH11137265A (ja) 新規なパン用食品添加組成物
EP0565172A1 (en) Cloning and expression of DNA encoding a ripening form of a polypeptide having sulfhydryl oxidase activity
US6228629B1 (en) Xylanases, genes encoding them, and uses thereof
NZ303969A (en) Endo beta 1,4-glucanase from aspergillus
NZ303970A (en) (1,4) beta d arabinoxylan arabinofuranohydrolase (axh) from aspergillus cleaves arabinose from cereal arabinoxylans
EP0870015B1 (en) Novel xylanases, genes encoding them, and uses thereof
WO1998006858A1 (en) BETA-1,4-ENDOGLUCANASE FROM $i(ASPERGILLUS NIGER)
US6635464B1 (en) Xylanases, genes encoding them, and uses thereof
EP1130102A1 (en) Enzyme with xylanase activity
CA2579789A1 (en) Overexpressed and purified aspergillus ficuum oxidase and nucleic acid encoding the same

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: DSM N.V.

FG Patent granted

Ref document number: 108944

Country of ref document: FI

Effective date: 20020430

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: DSM IP ASSETS B.V.

Free format text: DSM IP ASSETS B.V.