PL171271B1 - Sposób wytwarzania polipeptydu grzybowego o aktywnosci ksylanazy PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wytwarzania polipeptydu grzybowego o ak- tywnosci ksylanazy wykazujacej aktywnosc endo-B(1-4)- D-ksylanazy przy optymalnym pH 3,5-5,5, znamienny tym, ze. a) przeszukuje sie grzybowa biblioteke genomowa sonda hybrydyzacyjna zawierajaca sekwencje nukleotydowe zdefin- iowane na fig 8 w ostrych warunkach hybrydyzacji od- powiadajacych dwu przemywaniom w 5 x standardowego roztworu soli cytrynianu (5 x SSC), 0,1% roztworze siarczanu dodecyl sodu (SDS) w temperaturze 60°C, a nastepnie dwu przemywaniom 3 x SSC w temperaturze 60°C, b) hoduje sie zidentyfikowane klony, c) wyizolowuje sie klonowane sekwencje DNA kodujace polipeptyd o aktywnosci ksylanazy, d) sporzadza sie konstrukt ekspresji, w którym sklonowana sekwencja DNA jest operacyjnie zwiazana z conajmniej sekwencja promotora i ewentualnie sekwencja liderowa wydzielania, e) przygotowuje sie transformowana komórke gospodarza zawierajaca konstrukt ekspresji, przy czym komórke gospodarza wybiera sie z grupy obejmujacej drozdze, grzyby i bakterie, f) hoduje sie transformowana komórke gospodarza w temperaturze 0-45°C i przy pH 2-10, g) odzyskuje sie polipeptyd o aktywnosci ksylanazy przez wyizolowanie polipeptydu z komórek gospodarza F ig . 8 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynblbyku jest sposób wytubrybnib polipeptydu grzybowego o aktywności ksylanazy. Sposób ten nbleży do dziedziny biologii molekulbrnej a w szczególności klonowbnib i nbdekspresji sekwencji DNA pochodzącego z grzybów, która to sekwencjb koduje biblko o aktywnkści ksalanayy. Sposobem wedlug wynalazku wytwarza się polipeptyd o bktywności ksalanbya pozbbwiony innych ksylanów i jbkichkolwiek innych enzymów.

Budowb roślinnej ścibny komórkowej jest skomplikowbnb i zróżnicowanb. Obecne są w niej polilacharady, głównie występujące w postaci długich Ibńcuchów celulozy (glówny składnik budulcowy roślinnej ścibny komórkowej), hemiceluloya (zbwierbjącb różne łbńcuchy β-ksylbnowe) i pektyna. Wastępowanie, rozklbd i cechy budowy polisacharydów roślinnej ścibny komórkowej są zdeterminowbne przez: gbtunek rośliny, odmibnę, rodząj tkbnki, wbrunki wzrostu, wiek oraz przez obróbkę mbteribłu roślinnego przed zaltolkwaniem go jbko pbszy. Istnieją yaladnicze różnice pomiędzy roślinbmi jednoliściennymi (zbożu, trbwb) i dwuliściennymi (koniczyna, rzepbk i sojb) oraz pomiędzy nbsionbmi i częścibmi wegetbtywnymi rośliny (Chessan, 1987: Carre i Brilleuet, 1986). Rośliny jednoliścienne charakteryzują się obecnością kompleksu arbdinoklylbzowegk jbko głównego szkieletu hemicelulozy. Hemicelulozb w roślinach dwuliściennych zbudoubnajest głównie w postaci kompleksu ksyloglukbnowego. Ponbdto w roślinbch dwuliściennych obserwuje się wyższe stężenie pektyny niż w jednoli.ściennych. W nbliknach natomiast występuje więcej substancji pektynowych, a stosunkowo mbło celulozy.

Nb rysunku, fig. 1 przedstawiono przekrój poprzeczny komórki roślinnej. W ścianie komórkowej można wyróżnić mniej więcej trzy wzajemnie oddziaływujące na siebie .strukturą, polisacharydowe a mianowicie:

1. Błona środkowa tworzy zewnętrzna ścianę komórkową, służy ona również jako miejsce stykania się pojedynczych komórek w obrębie tkanki roślinnej. Błona środkowa składa się głównie z soli wapniowych wysoko estryfikowanych pektyn;

2. Ściana pierwotna usytuowana jest tuż za błoną środkową. Stanowi ją dobrze zorganizowana struktura mikrowłókienek celulozy osadzonych w amorficznym podłożu pektynowym hemicelulozouam, estrów fenolowych i białek;

3. Ściana wtórna tworzy się wtedy, gdy roślina dojrzewa. W fazie wzrostu i starzenia się rośliny odkładają mikrowłókienka celulozowe, hemicelulozę i drzewnik.

Pierwotna ściana komórkowa dojrzałych, czynnych metabolicznie komórek roślinnych (na przykład liści i nabłonka) jest wrażliwsza na hydrolizę enzymatyczną niż ściana wtórna, która na tym etapie jest zdrewniała.

Celuloza, hemiceluloza i pektyna zawarte w ścianie komórkowej oddziaływują na siebie w wysokim stopniu. Enzymatyczna degradacja tych raczej silnie usieciowanych struktur polisacharydowych nie jest prostym procesem. Przykładowo do całkowitego rozkładu aoadinoksalanu potrzebnych jest co najmniej pięć różnych enzymów. Rozszczepianie wiązań wewnątrz cząsteczki zachodzi pod wpływem endo β-/1 -> 4/-D-klylanaya. Egzo-/1 -> 4/-D-ksylanaya uwalnia jednostki ksylanowe z nieredukującego końca polisacharydu. Trzy inne enzymy (α-glukuronidaza, α-k-aradinofuranoyadaya i acetyloesteoaya) atakują podstawniki szkieletu ksylanowego. Wybór specyficznych enzymów zależy od hemicelulozy, która ma ulec degradacji (McCleary i Mathesen, 1986).

Jednakże, w wielu przypadkach całkowita degradacja całej hemicelulkza do monomerów nie jest konieczna, albo nie jest pożądana. Przykładowo, w przypadku przeprowadzania arabinoksylanu w postać płynną zachodzi potrzeba zwykłego rozszczepiania głównego szkieletu

171 271 ksylanowego na krótsze jednostki. Osiąga się to poprzez działanie endoksylanazy, w wyniku którego podjednostki sąjuż w wystarczającym stopniu rozpuszczalne.

Grzyby nitkowane znane sąz ich zdolności do wydzielania dużych ilości szeregu enzymów hydrolitycznych takich jak α-amylazy, proteazy i amyloglukozydazy oraz szeregu enzymów degradujących roślinną ściankę komórkową, takich jak celulozy, hemicelulozy i pektynazy. Wśród nich rozpoznano szereg enyzmów o zróżnicowanych własnościach biochemicznych i fizycznych degradujących ksylazy. Ta niejednolitość w fukcjach ksylanazy pozwala na wyselekejonowanie ksylanazy będącej przedmiotem zainteresowania i najodpowiedniejszej do pożądanego zastosowania (Wong i wsp. (1988), Weedward (1984) oraz Dekker i Richards (1977)).

Drobnoustroje, takie jak Aspergillus niger, Clostridium thermocellus, Trichoderma reesei, Penicillium janthinellum, jak również gatunki Bacillus i Streptomyces wytwarzają szereg ksylanaz o różnych ciężarach cząsteczkowych.

W przeciwieństwie do nich, u drożdży nie obserwuje się takiej różnorodności wydzielanych ksylanaz. Trzy rodzaje drożdży, a mianowicie Trichosporon, Cryptoceccus i aureobasidium wydzielają pojedynczą ksylanazę.

W warunkach naturalnych ksylanazy pochodzenia mikrobiologicznego wytwarzane są wraz z innymi enzymami degradującymi polisacharydy, takimi jak acetyloesteraza i celulazy. W niektórych przypadkach działanie takich enzymów nie jest potrzebne albo jest zbędne.

Wiadomo, że można zmieniać warunki fermentacji na korzyść wytwarzania pożądanego enzymu. Wiadomo również, ze przez klonowanie genu kodującego pożądany enzym i przez jego nadekspresję w naturalnym gospodarzu lub innym kompatybilnym gospodarzu ekspresyjnym można zwiększyć produkcję enzymu będącego przedmiotem zainteresowrańa Ten ostatni sposóbjest szczególnie użyteczny, jeśli pożądany enzym ma być wytwarzany w postaci pozbawionej niepożądanej aktywności.

Ekspresję ksylanazy bakteryjnej na drodze rekombinacji ujawniono w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 121 138. Według tego opisu, gen kodujący bakteryjną ksylanazę wyizolowano z chromosomalnego DNA z Bacillus i przeniesiono w celu ekspresji do gospodarza w postaci E.coli. Jednakże, stosowanie do wytwarzania białek metodami rekombinacji DNA E.coli jako gospodarza ekspresyjnego jest w wielu przypadkach niebezpieczne, ponieważ bakterie E.coli wytwarzają niepożądane produkty uboczne, takie jak toksyny.

Ponieważ geny bakteryjne nie zawierająintronów, pojawia się szereg problemów związanych z klonowaniem i ekspresją takich genów w organizmach prokariotycznych. Z drugiej strony, proces ekspresji eukariotycznych genów nie zawsze jest prosty. Wiadomo, że geny wyizolowane ze szczepów eukariotycznych zawieraj ąintrony. Z tego powodu poj awiaj ą się kombinacj e w klonowaniu i ekspresji tych genów w przypadku wyboru gospodarza prokariotycznego.

Ponadto na ogół ksylanazy pochodzenia grzybowego różnią się własnościami fizycznymi od ksylanaz pochodzenia bakteryjnego. Zwykle ksylanazy grzybowe wykazują optymalne pH w zakresie 3,5-5,5, a ksylanazy bakteryjne w zakresie 5,0-7,0. Grzybowe ksylanazy są trwałe w szerszym zakresie pH - (3-10) niż ich odpowiedniki bakteryjne - (5,0-7,5). Temperatura optymalna grzybowych ksylanaz wynosi na ogół około 50°C, a bakteryjnych - od 50 do 70°C. Fizyczne własności ksylanaz omówili szerzej Wong i wsp. (1988), Woodward (1984) oraz Dekker i Richards (1977).

Tak więc jasne jest, że ksylanazy bakteryjne są mniej odpowiednie do zastosowania, przykładowo w procesach prowadzonych w warunkach niższego pH. Bakteryjne ksylanazy są również zbyt termostabilne dla niektórych zastosowań, na przykład do leżakowania piwa (patrz europejski opis patentowy nr 227 159). Zatem, bardzo ważne byłoby wytworzenie genów kodujących enzymy degradujące ksylany pochodzenia grzybowego, które można by było przenieść do innych gospodarzy ekspresyjnych pochodzenia mikrobiologicznego w celu uzyskania ekspresji o wysokiej wydajności.

Niniejszy wynalazek pokonuje wyżej wymienione trudności. Wykorzystując sekwencje DNA pochodzące z grzybów i kodujące białka degradujące ksylany oraz konstrukcje genetyczne do nadekspresji tych sekwencji w gospodarzu pochodzenia mikrobiologicznego wytworzono odpowiednio polipeptyd wykazujący aktywność ksylanazy.

171 271

Sposób wytwarzania polipeptydu grzybowego o aktywności ksylanazy według wynalazku polega na tym, ze przeszukuje się grzybową bibliotekę genomową sondą hybrydyzacyjną zawierającą sekwencje nukleotydowe zdefiniowane na fig. 8 w warunkach ostrości odpowiadającej dwu przemywaniom 5 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 60°C, a następnie dwu przemywaniom x SSC w temperaturze 60°C, po czym hoduje się te zidentyfikowane klony, a następnie wyizolowuje się sklonowane sekwencje DNA kodujące polipeptyd o aktywności ksylanazy, sporządza się konstrukt ekspresji, w którym sklonowana sekwencja DNA jest operacyjnie związana z co najmniej sekwencją promotora i ewentualnie sekwencją liderową wydzielania, przygotowuje się transformowaną komórkę gospodarza zawierającą konstrukt ekspresji, przy czym komórkę gospodarza wybiera się z grupy obejmującej drożdże, grzyby i bakterie, hoduje się tę transformowaną komórkę gospodarza w temperaturze 0-45°C i przy pH 2-10, i odzyskuje się polipeptyd o aktywności ksylanazy przez wyizolowanie polipeptydu z komórek gospodarza, przy czym polipeptyd grzybowy wykazuje aktywność ksylanazy i charakteryzuje się tym, że jest to aktywność endo-P(1-4)-D-ksylanazy w optymalnym pH 3,5-5,5.

Sposób według wynalazku, w przykładach wykonania jest przedstawiony na rysunku, na którym:

Figura 1 przedstawia przekrój poprzeczny komórki roślinnej.

Figura 2 przedstawia krzywą elucji HPLC przesączu z hodowli Aspergillus niger DG 16813 (CBS 323.90). Szczep ten został później ponownie zaklasyfikowany, jako należący z większym prawdopodobieństwem do gatunku Aspergillus tubigensis. HPLC oznacza wysokosprawną chromatografię cieczową

Figura 3 przedstawia sondy oligonukleotydowe AB801 - AB806, zaprojektowane w oparciu o N-terminalną sekwencję aminokwasową białka XYL A Aspergillus tubigensis, która to sekwencja przedstawiona jest na fig. 3 jako wzór 1. Oligonukleotydy wyprowadzono od reszty (Asn) do reszty 10 (Asn) jako komplementarne do odpowiadającego mRNA.

Figura 4 przedstawia sondę nukleotydowąAB 1255 zaprojektowaną w oparciu o N-kodową sekwencję aminokwasową wewnętrznego fragmentu białka XYL A Aspergillus tubigensis o wielkości fragmentu 19 kDa, trawionego endoptydazą V S S.aureus. ta sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest na fig. 4 jako wzór 2. Oligonukleotydy wyprowadzono od reszty 2 (Tyr) do reszty 7 (Tyr), jako komplementarne do odpowiadającego mRNA.

Figura 5 przedstawia mapę restrykcyjną regionu genomu zawierającego gen xln A wykonaną na podstawie analizy metodą Seuthern blot bakteriofaga lambda_Xl_l3. Wskazane są fragmenty hybrydyzujące i ich długości.

Figura 6 przedstawia strategię stosowaną do sekwencjonowania genu xln A Aspergillus tubigensis. Strzałki wskazują kierunek i liczbę zsekwencjonowanych par zasad.

Figura 7 przedstawia mapę restrykcyjną plM 100 zawierającego fragment Sali o długości 6,9 kb zawierającego gen xln A Aspergillus tubigensis. Poza dwoma wskazanymi miejscami restrykcyjnymi Hind III, we wstawce w plazmidzie obecne sąjeszcze dwa miejsca restrykcyjne Hind III.

Figura 8 przedstawia sekwencję nukleotydowągenu xln A Aspergillus tubigensis. (Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1). Pozycje intronu i propeptydu są próbne.

Opis sekwencji:

Typ sekwencji: nukleotydowa wraz z odpowiednim polipeptydem

Długość sekwencji: 2054 bp

Budowa łańcucha: podwójny

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: DNA genomowy

Pochodzenie: Aspergillus tubigensis

Doświadczalne źródło pośrednie: pIM100 w E.coli, JM101 (CBS 322.90)

Cechy:

od 843 do 854 bp - potencjalny sygnał TATA od 950 do 1652 bp - sekwencja kodująca

171 271 od 1179 do 1230 -intron 1 od 950 do 1031 - propropeptyd od 1031 do 1632 - dojrzały peptyd od 594 do 748 - region włączony w przypadku indukcji od 618 do 632, od 638 do 651 i od 656 do 672 - powtórzenia.

Własności: gen xln A endoksylanazy A Aspergillus niger.

Figura 9 przedstawia obraz zymogranu przedstawiającego białko XYL A eksprymowane przez transformanty TrX2 i TrX9, na którym ścieżka 1 i 14 odpowiadąjąoczyszczonej ksylanazie A (XYL A), ścieżka2 i 13 odpowiadąjąniestransfonnowiaiemuszczepowi A.nigerDS 16813, ścieżki 3-7 odpowiadąiąprzesączowi z hodowli transformiaiitaTrX2 A.nigerDS 16813 rozcieńczonemu jak następuje: nierozcieńczony, rozcieńczony w stosunku 1:1, 1:4,1:16,1:32, odpowiednio.

Figura 10 przedstawia elektroforezę w żelu SDS-poliakrylamidowym wykazującą ekspresję białka xYl w A.niger CBS 513.88 (A) i w A.niger N593 (B).

Figura 11 przedstawia natywny gradient PAGE wykazujący białko XYL A eksprymowane przez transformanty A.niger CBS 513.88 o numerach 10,29 i 1.1, barwione za pomocą nałożonej warstwy CBB(A) i RBB-ksylanu (B).

Figura 12 przedstawia mapę fizyczną plazmidu pXYLl zawierającego gen xln A we fragmencie Pstl o długości 2.1 kbp w pTZ18R. Skróty oznaczają: H = hind III, P = Pstl, B = BamHI, K = KpnI, E = EcoRI, X = XhoI, a S = Sali.

Figura 13 przedstawia mapę fizyczną pAB 6-1. Warstwa HindIII o długości 14,5 kbp w pUC19 zawiera całe locus amyloglukozydazy(AG) z A.niger.

Figura 14 przedstawia schemat wytwarzania łączeń promotor AG/gen ksylanazy na drodze szczepienia łańcuchów za pomocą polimerazy (PCR).

Figura 15 przedstawia kolejne etapy konstruowania plazmidu przejściowego pXYL2AG.

Figura 16 przedstawia kolejne etapy konstruowania plazmidu przejściowego pXYL2.

Figura 17 przedstawia kolejne etapy konstruowania plazmidu przejściowego pXYL3AG.

Figura 18 przedstawia kolejne etapy konstruowania plazmidu przejściowego pXYL3. (Wszystkie skróty stosowane na fig. 15-18 mająznaczenia takie, jak podano wyżej w objaśnieniu do fig. 12).

Figura 19 przedstawia częściowąmapę restrykcyjną fragmentu BglII/SalI o długości 6,5 kb z T.reesei klonowanego w pEMBL18 (pIM030). Zakreskowany prostokąt wskazuje fragmenty hybrydyzujące w obrębie wstawki.

Figura 20 przedstawia częściową mapę restrykcyjną fragmentu BamHI/BglII o długości 7,5 kb z T.reesei klonowanego w PUC9 (p.IM041).

Figura 21 przedstawia schematycznie konstrukcje wytworzone na drodze delecji w regionie promotora xln A. Dla orientacji wskazano miejsce restrykcyjne Xbal stosowane podczas klonowania genu pyr A z A.niger.

Oczyszczone i wyizolowane sekwencje DNA pochodzące z grzybów, stosowane w sposobie według wynalazku, kodujące ksylanazy oraz ich genetyczne warianty korzystnie obejmują sekwencję kodującą ksylanazę oraz sąsiadujące od strony 5' i 3Ż sekwencje regulatorowe. Genetyczne warianty tych sekwencji obejmują hybrydowe sekwencje DNA zawierające sekwencję kodującą ksylanazę sprężoną z regionami regulatorowymi takimi jak promotor, sygnały sekrecji i terminacji, pochodzącymi z organizmów homologicznych lub heterologicznych. Genetyczne warianty również obejmują sekwencje DNA kodujące zmutowane białka ksylanazy oraz zdegenerowane sekwencje DNA, w przypadku których aktywność wytwarzanego enzymu ksylanazy (zdolność degradacji ksylanów) zostaje zachowana. W sposobie według wynalazku stosuje się także sekwencje DNA zdolne do hybrydyzowania z sekwencjami DNA kodującymi ksylanazę i z ich genetycznymi wariantami opisanymi wyżej, które to sekwencje mogą różnić się w sekwencjach kodonów z uwagi na degenerację kodu genetycznego lub na krzyżowanie gatunków-.

W sposobie według wynalazku konstrukcję DNA do ekspresji ksylanazy umieszcza się w pożądanym gospodarzu ekspresyjnym. Te konstrukcje ekspresyjne obejmująhybrydowe sekwencje DNA zawierające region kodujący ksylanazę funkcjonalnie połączony z regionami regulatorowymi,

171 271 takimi jak promotor, sygnały terminacji o sekrecji, pochodzącymi od organizmów homologicznych lub heterologicznych, które to regiony regulatorowe są zdolne do kierowania nadekspresją enzymu kodującego przez sekwencję DNA kodującą ksylanazę w odpowiednim gospodarzu. Konstrukcja ekspersyjna integruje się w genomie wybranego gospodarza ekspresyjnego. W sposobie według wynalazku stosuje się również wektory, korzystnie plazmidy, do klonowania i/lub transformowania gospodarzy pochodzenia mikrobiologicznego na drodze wprowadzania do takiego gospodarza konstrukcji DNA w celu uzyskania ekspresji pożądanej ksylanazy. Korzystnie jako plazmid w sposobie według wynalazku stosuje się plazmid pIM100 (CBS 322.90) lub plazmid pIM 30 (CBS 420.91) lub plazmid pIM 41 (CBS 421.91). Jako transformowanego gospodarza pochodzenia mikrobiologicznego stosuje się gospodarzy wybranych spośród bakterii, drożdży lub grzybów^;.

W niniejszym opisie termin “homologiczny” rozumiany jest jako dotyczący wszystkiego, co jest natywne w stosunku do sekwencji DNA kodującej ksylanazę, włącznie z regionami regulatorowymi. Gospodarz homologiczny określony jestjako gatunek, z którego taka sekwencja DNA może być wyizolowana.

Termin “heterologiczny” rozumiany jest jako dotyczący wszystkiego, co nie jest natywne w stosunku do sekwencji DNA kodującej ksylanazę. Gospodarz heterologiczny określony jest jako gatunek pochodzenia mikrobiologicznego inny, niż ten, z którego wyizolowano gen kodujący ksylanazę.

Jako ksylanazę rozumie się jakikolwiek enzym degradujący ksylany, który w sposób naturalny wytwarzany jest przez grzyby nitkowate. Ksylanazy obejmują zatem wszystkie takie enzymy wytwarzane w sposób naturalny przez grzyby nitkowate z rodzajów Aspergillus, Disporotrichum, Penicillinum, Neurospera, Fusarium i Trichoderma. Szczególnie korzystne są ksylanazy pochodzące od Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatur, Aspergillus tubigensis, Disporotrichum dimorphosporum oraz Trichoderma reesci. Najkorzystniejsze są ksylanazy pochodzące od Aspergillus tubigensis i Trichoderma reesci.

Endoksylanazę identyfikuje się metodami, które nie są istotne dla niniejszego wynalazku, takimi jak analiza kroplowa (spot test). Według tej metody, przesącz otrzymany z hodowli drobnoustroju indukowanego do wytwarzania endoksylanazy (na przykład za pomocą ksylanu z płatków owsianych) bada się na obecność aktywności enoksylanazy. Krople z eluowanych frakcji umieszcza się osobno na płytce agarowej zawierającej bufor cytrynianowo-fosforanowy (patrz przykład IA niżej) oraz ksylan z płatków owsianych. Następnie płytkę tę inkubuje się.W przypadku obecności aktywności endoksylanazy, miejsca poszczególnych kropli na płytce agarowej są dostrzegalnie przezroczyste.

Sekwencję DNA kodującą określoną ksylanazę otrzymuje się z grzybów nitkowatych wytwarzających ją w sposób naturalny, na drodze hodowania ich w pożywce zawierającej ksylan, izolowania pożądanej ksylanazy przy użyciu znanych metod, takich jak chromatografia kolumnowa (przykładowo HPLC - patrz fig. 2) i określania co najmniej części sekwencji aminokwasowej oczyszczonego białka.

Następnie wykonuje się sondy oligonukleotydowe na drodze syntetyzowania sekwencji oligonukleotydowych w oparciu o częściową sekwencję aminokwasową. Sekwencje aminokwasowe określa się od N-końca całego białka i lub od N-końców wewnętrznych fragmentów peptydowych otrzymanych na drodze trawienia protoelitycznego lub chemicznego całego białka. Tak otrzymane sondy DNA stosuje się do przeszukiwania biblioteki genomowej lub biblioteki cDNA.

W przypadku, gdy ten sposóbjest nieskuteczny, genomowąbibliotekę przeszukuje się różnicowo za pomocą sond cDNA otrzymanych z mRNA z nieindukowanych i z indukowanych komórek. Indukowany mRNA otrzymuje się z komórek hodowanych na pożywkach zawierających ksylan jako źródło węgla, podczas gdy nieindukowany mRNA izoluje się z komórek hodowanych na źródle węgla innym niż ksylan, na przykład na glukozie. Spośród klonów, które hybrydyzują tylko z indukowaną sondą uzyskuje się klon zawierający gen pożądanej ksylanazy. Alternatywnie gen ksylanazy identyfikuje się przez hybrydyzację krzyżową/, odpowiedniąsekwenęjąksylanazy (patrz przykład VII niżej).

171 271

Bibliotekę genomową wytwarza się przez częściowe trawienie chromosomalnego DNA grzybów odpowiednim enzymem restrykcyjnym, na przykład Sau 3 A i klonowanie otrzymanych fragmentów w odpowiednim plazmidzie lub w wektorze faga lambda, na przykład EMBL 3. Następnie po wysianiu na płytkę wystarczającej ilości kolonii lub łysinek, bibliotekę genomową lub bibiotekę cDNA przeszukuje się za pomocą odpowiedniej sondy DNA.

Alternatywnie, bibliotekę cDNA wytwarza się przez klonowanie cDNA zsyntetyzowanego z mRNA wyizolowanego z komórek grzybowych indukowanych do syntezy ksylanazy, w odpowiednim wektorze fagowym, na przykład lambda gt 10 lub lambda gt 11. Następnie bibiotekę cDNA przeszukuje się za pomocą sondy DNA, lub alternatywnie przy użyciu prób immunologicznych lub płytkowych, Takie sondy oligonukleotydowe projektuje się w oparciu o N-końcową sekwencję aminokwasową (patrz fig. 3 wzór 1) ksylanazy o pozornej masie cząsteczkowej wynoszącej 25 ka, otrzymanej w wyniku oczyszczenia przesączu z hodowli Aspergillus tubigensis lub w oparciu o sekwencję aminokwasową wewnętrznego fragmentu peptydowego (patrz fig. 4, wzór 2) otrzymanego przez trawienie ksylanazy endoproteazą V8 Staphylocecous aureus. Mieszaniny oligonukleotydów jak przedstawiono na fig. 3 i fig. 4 są komplementarne do odpowiadającego wydedukowanego mRNA dla ksylanazy. W wyniku przeszukiwania biblioteki lambda EMBL 3 za pomocą mieszaniny N-terminalnych oligonukleotydów A 800 (mieszanina równych ilości AB 801 do AB 806, patrz fig. 3), otrzymano cztery pozytywne klony faga. Bibliotekę tę wytworzono z DNA wyizolowanego z Aspergillus niger DS 16813 trawionego częściowo za pomocą restryktazy Sau 3A. Aspergillus niger DS 16813, później przeklasyfikowany jako należący z większym prawdopodobieństwem do gatunku Aspergillus tubigensis (Kusters-van Someren i wsp. 1991), zdeponowano w Central Bureau voor Schimmelcultures, Baam, Holandia, w dniu 20 lipca 1990 r. i oznaczono CBS 323.90.

DNA wyizolowany z czterech klonów faga hybrydyzowano z mieszaniną N-końcowych oligonukleotydów jak również z mieszaniną oligonukleotydów wyprowadzanych z sekwencji aminokwasowej wewnętrznego fragmentu (patrz fig. 4). Analiza za pomocą enzymów restrykcyjnych wykazała, że wszystkie cztery klasy zawierały DNA z tego samego regionu genomu A.tubigensis.

Region o długości około 2,1 kb hybrydyzujący z dwiema mieszaninami oligonukleotydów zsekwencjonowano. Sekwencja nukleotydowa, jak pokazano na fig. 8, zawiera sekwencję kodującą ksylanazę o długości 681 bp (która przerwana jest jednym małym intronem o długości 49 bp od pozycji 1179 do 1230), jak również sekwencje regionów flankujących po stronie 5' i 3' o 949 i 423 nukleotydach, odpowiednio.

Wśród oczyszczonych białek ksylanazy odkryto również jej warianty. Odpowiednie ksylanazy mają trzy różne N-końce, co prawdopodobnie jest wynikiem warunków fermentacji. Około jedna trzecia część tych ksylanaz ma jako N-końcowy aminokwas serynę (fig. 8, pozycja 1), jedna trzecia część - alaninę (fig. 8, pozycja 2), a pozostałe białka mają na N-końcu glicynę (fig. 8, pozycja 3).

Dostępność sekwencji DNA kodującej białko ksylanazę umożliwia skonstruowanie mutanowych ksylanaz przez mutagenezę miejscową. Jeśli znana jest trzeciorzędowa struktura ksylanazy i zlokalizowane są domeny katalityczne i wiążące substrat, możliwe jest wybranie aminokwasów do takiej mutacji (na przykład za pomocą modelowania komputerowego), która najprawdopodobniej wpływa na funkcje katalityczne i/lub wiążące substrat. Jeśli nieznana jest struktura trzeciorzędowa białka, można tworzyć albo przypadkowe mutacje wzdłuż całej sekwencji kodującej, albo strukturę trzeciorzędową białka można przewidzieć przez porównanie z podobnymi znanymi ksylanazami wyizolowanymi z innego drobnoustroju.

Aby ułatwić wstawienie fragmentu DNA zawierającego sekwencję kodującą ksylanazę do konstrukcji ekspresyjnych zawierających jeden lub większą liczbę heterologicznych regionów regulatorowych do wprowadzania odpowiednich miejsc restrykcyjnych na końcach 5' i 3' sekwencji kodującej ksylanazę, stosuje się reakcję szczepianiałańcuchów zapomocąpolimerazy (PCR) (Ehrlich, H.A. (wyd) 1989). Wybór miejsc restrykcyjnych zależy od sekwencji DNA wektora ekspresyjnego, to jest od obecności innych miejsc restrykcyjnych w cząsteczce DNA.

171 271

Aby osiągnąć nadekspresję białka ksylanazy w gatunkach (homologicznych) naturalnie wytwarzających ją, lub alternatywnie, w innym szczepie grzybowym, fragment Sali o długości 6,9 kb (patrz fig. 5) zawierający cały gen wraz z regionami regulatorowymi 5' i 3' lub alternatywnie, cały gen połączony z regionami regulatorowymi innych genów, wprowadza się do wybranego gospodarza ekspresyjnego w celu zwiększenia liczby kopii genu, a co za tym idzie, podwyższenie ekspresji białka.

Jeżeli stosuje się heteoklogicynego gospodarza ekspresyjnego wybranego spośród szczepów drożdży lub bakterii, to do konstruowania heterologicznego wektora ekspresyjnego używa się sekwencji DNA pozbawionej intronów (nie przerywanej) w celu uniknięcia sytuacji, w której dołączone sygnały znajdujące się we fragmencie genomu nie będą rozpoznawane przez heteoklkgicznego gospodarza. Taką nieprzeiywaną sekwencję DNA otrzymuje się z biblioteki cDNA skonstruowanej z mRNA wyizolowanego z komórek indukowanych do syntetyzowania ksylanaz. Tę bibliotekę przeszukuje się za pomocą sondy oligonukleotydowej wytworzonej jak opisano wyżej. Alternatywnie, nieprzerywaną sekwencję DNA otrzymuje się stosując reakcję szczepiania łańcuchów za pomot^tąpolimerazy przy użyciu odpowiednich 5' i 3' oligonukleotydóu na pierwszej nici cDNA zsyntetayouanego z DNA pochodzącego z komórek indukowanych ksylanem.

Wyrażenie “nadekspresja” stosowane w niniejszym opisie oznacza ekspresję ksylanazy na poziomach wyższych, niż te, które zazwyczaj są osiągane przez homologiczny organizm typu dzikiego. Wyrażenie to dotyczy również ekspresji ksylanazy przez organizm heteoologicyna, który na ogół nie wytwarza takiej ksylanazy, chyba że nastąpi wprowadzenie do takiego heteoklogicynego gospodarza sekwencji DNA kodującej ksylanazę.

Nadekspresję ksylanazy można osiągnąć również na drodze selekcji heterologicznych regionów regulatorowych, na przykład regionów promotora, lidera sekcji i terminacyjnych służących do wzmagania ekspresji i, jeśli jest to pożądane, do podwyższania poziomów sekrecji białka będącego przedmiotem zainteresowania, z wybranego gospodarza ekspresyjnego i/lub służących do kontrolowania ekspresji pożądanej ksylanazy poprzez indukcję.

Oprócz natywnego promotora pożądanej ksylanazy można również stosować inne promotory kierujące ekspresją wyboru promotora dokonuje się biorąc pod uwagę jego zdolność kierowania ekspresją pożądanej ksylanazy w pożądanym gospodarzu ekspresyjnym.

Do kierowania ekspresją pożądanej ksylanazy zasadniczo wolnej od innych ksylanaz, można skutecznie stosować promotor konstytutywny. Taka konstrukcja eklprelyjnajelt korzystniejsza, ponieważ w przypadku jej stosowania nie zachodzi potrzeba hodowania gospodarzy ekspresyjnych w pożywkach zawierających stałe ksylany jako środki indukujące.

Przykłady silnych konstytutywnych i/lub indukowalnych promotorów, które preferuje się do stosowania w grzybowych gospodarzach ekspresyjnych kdejmująpromktooy syntetazy ATP, podjednostki 9 (oli C), izomerazy triozofklforankwej (tpi), dehydrogenazy alkoholowej (adh A), α-aylazy (amy), amyloglukozydazy (AG), acetamidazy (emd S) i dehydrogenazy gliceraldehadk-3-fosfkrankwej (gpd).

Przykładami silnych promotorów drożdżowych są promotory dehydrogenazy alkoholowej, laktazy, kinazy 3-fksίkgliceoanianowej i izomerazy triozofosforanowej.

Przykładowe silne promotory bakteryjne to promotory α-amylazy i Spe2 jak również promotory pochodzące z genów pkyakomerkowej proteazy.

W celu polepszenia indukowalnej regulacji ekspresji konstrukcji ekspresyjnej w sposobie według wynalazku stosuje się również z powodzeniem promotory hybrydowe.

Korzystnie stosuje się promotory pochodzące z genu amuloglukozydazy (AG) i natywne promotory ksylanazy.

Często pożądane jest, aby polipeptyd o aktywności ksylanazy był wydzielany z gospodarza ekspresyjnego do środowiska hodowli, z którego można go łatwo odzyskiwać.

W sposobie według wynalazku stosuje się zatem natywnąsekwencję lidera sekrecji w celu uzyskania wydzielania eksprymowanej ksylanazy.

171 271

Jednakże, w wyniku wzrostu ekspresji polipeptydu o aktywności ksylanazy białko wytwarzane jest w ilościach przewyższających zdolność gospodarza ekspresyjnego do jego przetworzenia i sekrecji, przez co powstaje nadwyżka produktu białkowego wewnątrz komórki spowodowana “wąskim gardłem” w transporcie białka przez błonę komórkową. Tak więc w sposobie według wynalazku stosuje się również heterologiczne sekwencje liderowe zapewniające jak najwygodniejszą sekrecję ksylanazy z wybranego gospodarza ekspresyjnego.

W sposobie według wynalazku stosuje się lider sekrecji wybrany w zależności od pożądanego gospodarza ekspresyjnego. Stosuje się zatem lidera heterologicznego, który jest homologiczny do innych regionów regulatorowych konstrukcji ekspresyjnej. Korzystnie stosuje się lidera białkowego amyloglukozydazy, które wydzielane jest z wysoką wydajnością w połączeniu z promotorem amyloglukozydazy, ale również w połączeniu z innymi promotorami. Można również z powodzeniem stosować hybrydowe sekwencje sygnałowe.

Przykłady korzystnie stosowanych heterologicznych sekwencji liderowych sekrecji obejmują sekwencje pochodzące z genu amyloglukozydazy (grzyby), z genu czynnika a (drożdże) lub w genu α-amylazy (Bacillus).

W sposobie według wynalazku, najkorzystniej stosuje się sekwencje liderowe sekrecji pochodzące w genu amyloglukozydazy (AG) oraz natywną sekwencję liderową ksylanazy.

Terminatory, nie są istotne dla nadekspresji genów. Jeśli jest to pożądane, stosuje się terminator z tych samych genów, z których pochodzą promotory, lub alternatywnie, można stosować terminator homologiczny.

Poza fragmentem genomu opisanym wyżej, transformujący DNA może zawierać marker selekcyjny służący do odróżniania komórek z włączonym pożądanym genem od dużej liczby komórek niestransformowanych. Taki marker selekcyjny zaopatrzony w odpowiednie sekwencje regulatorowe na swych końcach 5' i 3' może znajdować się w tej samej cząsteczce DNA zawierającej pożądany gen, albo w oddzielnej cząsteczce. W tym ostatnim przypadku musi zachodzić kontransformacja. Stosunek wektor ekspresyjny/wektor selekcyjny dobiera się tak, aby duża liczba (procentowa) selekcjonowanych transformantów posiadała również wektor zawierający konstrukcję ekspresyjną ksylanazy będącej przedmiotem zainteresowania.

Najodpowiedniejszymi systemami selekcji przemysłowych drobnoustrojów są te, w których stosuje się markery selekcyjne nie wymagające mutacji w organiźmie gospodarza. Przykłady grzybowych markerów selekcyjnych obejmują geny acetamidazy (amidS), syntetazy ATP, podjednostki 9 (oliC) i gen oporności na benozyl (benA). Przykładowe niegrzybowe markery selekcyjne obejmują gen oporności G418 (drożdże), gen oporności na ampicylinę (E.coli), gen oporności na neomycynę (Bacillus).

Po skonstruowaniu pożądanej konstrukcji ekspresyjnej, przenosi się ją do odpowiedniego gospodarza klonującego, takiego jak E.coli w celu namnożenia tej konstrukcji. Następnie konstrukcję ekspresyjnąwprowadza się do odpowiedniego gospodarza ekspresyjnego, w którym korzystnie konstrukcja ta integruje się w genomie. Niektórych gospodarzy, takich jak gatunki Bacillus, można używać zarówno w charakterze gospodarzy klonujących, jak i ekspresyjnych, unikając w ten sposób etapu dodatkowej transformacji.

Można także stosować szereg gospodarzy ekspresyjnych do nadekspresji pożądanej ksylanazy. Między innymi stosuje się homologicznego gospodarza ekspresyjnego. To oznacza, że pożądaną konstrukcję ekspresyjną wprowadza się z powrotem do szczepu, z którego wyizolowano sekwencję DNA kodującą ksylanazę, albo w zwiększonej liczbie kopii genu, albo pod kontrolą heterologicznych regionów regulatorowych, jak opisano wyżej, albo stosując obie te możliwości.

Ekspresję pożądanej ksylanazy uzyskuje się przez wprowadzenie do heterologicznych gospodarzy i wywołanie ekspresji konstrukcji kodującej pożądaną ksylanazę pod kontrolą odpowiednich regionów regulatorowych w tych heterologicznych gospodarzach, takich jak bakterie, drożdże lub grzyby. W tym celu sekwencja DNA kodująca ksylanazę korzystnie ulega ekspresji pod kontrolą sekwencji promotorowych i terminacyjnych pochodzących z heterologicznego gospodarza. Ponadto, może być konieczne zastąpienie natywnej sekwencji

171 271 liderowej sekrecji ksylanazy sekwencją liderową homologiczną w stosunku do gospodarza ekspresyjnego, w celu osiągnięcia wydajniejszej ekspresji i sekrecji produktu.

W wyborze gospodarza ekspresyjnego ważną rolę odgrywają takie czynniki jak wielkość (ciężar cząsteczkowy), ewentualna potrzeba glikozylacji lub potrzeba uzyskania pozakomórkowej sekrecji ksylanazy.

Gram-dodatnia bakteria E.coli jest szeroko stosowanym gospodarzem do ekspresji heterologicznego genu, lecz akumuluje ona wewnątrz komórki duże ilości białka heterologicznego. Następujące po sobie oczyszczanie pożądanego białka od dużej liczby wewnątrzkomórkowych białek E.coli bywa trudne.

W przeciwieństwie do E.coli, bakterie rodzaju Bacillus są odpowiednimi heterologicznymi gospodarzami, z uwagi na ich zdolność do wydzielania białek do podłoża hodowlanego.

Alternatywnie, można stosować heterologicznego gospodarza wybranego z grupy drożdży lub grzybów. Zwykle preferuje się komórki drożdżowe nad komórkami grzybowymi, ponieważ łatwiej nimi manipulować. Jednakże, drożdżowe komórki wydzielają niektóre białka z niską wydajnościią lub w niektórych przypadkach wydzielająbiałka nieodpowiednio procesowane (na przykład nadmierna glikozylacja w drożdżach). W takich przypadkach wybiera się organizm gospodarza spośród grzybów. Stosuje się również wybór takiego heterologicznego gospodarza do ekspresji ksylanazy zasadniczo pozbawionej innych enzymów degradujących polisacharydy, który zwykle nie wytwarza takich enzymów, na przykład Kluyveromyces lactis.

Przykłady korzystnych gospodarzy ekspresyjnych stosowanych w sposobie według wynalazku obejmują grzyby, takie jak Aspergillus (opisane w europejskich opisach patentowych nr 184 438 i 284 603) oraz Trichoderma, bakterie, takie jak Bacillus (opisane w europejskim opisie patentowym nr 134 048), drożdże, takie jak Kluyveromyces (opisane w europejskich opisach patentowych nr 06430 i 301 670) oraz Saccharomyces.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się gospodarzy ekspresyjnych wybranych z grupy obejmującej aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licehnifermis, Kluyveromyces lactis i Saccharomyces cerevisiae.

Nadekspresję ksylanazy osiąga się przez hodowanie gospodarzy ekspresyjnych, których stransformowano konstrukcją ekspresyjną, ksylanazy w znanym fermentacyjnym podłożu odżywczym.

Środowisko fermentacji jest zwykłą pożywką hodowlaną zawierającą źródło węgla (na przykład glukozę, maltozę, melasę i podobne), źródło azotu (na przykład ekstrakt drożdżowy, ekstrakt słodowy, peptan i podobne), nieorganiczne składniki odżywcze (na przykład fosforany, magnez, potas, cynk, żelazo i podobne). Ewentualnie środowisko fermentacji zawiera czynnik wzbudzający (na przykład ksylan z płatków owsianych).

Wybór odpowiedniego środowiska zależy do wyboru gospodarzy ekspresyjnych i/lub od warunków regulacji ekspresji zastosowanej w konstrukcji ekspresyjnej. Takie podłoża są znane fachowcom. Jeśli jest to pożądane, podłoże może zawierać dodatkowe składniki sprzyjające gospodarzom ekspresyjnym, a nie sprzyjające potencjalnym drobnoustrojom zanieczyszczającym.

Fermentację prowadzi się w ciągu 0,5 do 20 dni wprocesie periodycznym lub periodycznie dodając składniki pokarmowe, w temperaturze 0-45°C i przy pH 2-10. Korzystnie fermentację prowadzi się w temperaturze 20-37°C i przy pH 3-9. Odpowiednie warunki dobiera się według stosowanego gospodarza ekspresyjnego.

Po zakończeniu fermentacji komórki usuwa się z bulionu fermentacyjnego przez odwirowanie lub sączenie. Następnie odzyskuje się ksylanazę będącą przedmiotem zainteresowania i jeśli jest to pożądane, oczyszcza się ją i izoluje znanymi metodami.

Produkt doprowadza się do trwałej postaci płynnej lub suchej. W niektórych przypadkach pożądane jest unieruchomienie enzymu na stałym podłożu. ’

Polipeptyd o aktywności ksylanazy wytwarzany sposobem według wynalazku stosuje się oddzielnie, bądź razem z innymi wybranymi enzymami w wielu procesach, w których potrzebne jest działanie enzymu degradującego ksylany. Ponadto, polipeptydy o aktywności ksylanazy pochodzenia grzybowego wytworzone sposobem według wynalazku, charakteryzujące się niższym optymalnym pH niż ksylanazy bakteryjne, są szczególnie odpowiednie do stosowania w procesach przemysłowych prowadzonych przy niższym pH.

Okazało się również, że polipeptydy o aktywności ksylanazy wytworzone sposobem według wynalazku mogą być stosowane do wypieku pieczywa. Dodanie do mąki małej ilości ksylanazy nadaje ciastu, a zarazem pieczywu wyższą jakość jeśli chodzi o własności tekstury, takie jak łamliwość i kruchość, jak również powoduje zwiększoną objętość bochenka.

Polipeptydy o aktywności ksylanazy dodaje się również do pasz zwierzęcych bogatych w arabinoksylany i glukoksylany. Enzym dodany do pasz (włącznie z kiszonkami) dla zwierząt jednożołądkowych (drób, trzoda chlewna) zawierających rośliny zbożowe, takie jak jęczmień, pszenica, kukurydza, żyto albo płatki lub odpady zbożowe, takie jak otręby pszenne lub kukurydziane, znacznie poprawia rozpad roślinnych ścian komórkowych, co prowadzi do lepszego wykorzystania roślinnych składników pokarmowych przez zwierzęta. W konsekwencji osiąga się zwiększenie szybkości wzrostu i/lub szybsze przyswajanie paszy. Ponadto ksylanazy stosuje się do zmniejszenia lepkości pasz zawierających ksylany.

W przypadku, gdy paszę lub kiszonkę poddaje się wstępnemu zwilżaniu lub gdy stosuje się paszę rozmieszaną z wodą, ksylanazę dodaje się przedtem. Korzystniej jednak dodawać polipeptyd o aktywności ksylanazy wytworzony sposobem według wynalazku tak, aby hydroliza ksylanów w paszy zachodziła in vivo. Ksylanazy grzybowe wykazujące na ogół niższą wartość optymalnego pH, zdolne są do uwalniania ważnych składników pokarmowych w tak kwaśnym środowisku, jakie panuje w żołądku zwierzęcia połykającego paszę z dodatkiem ksylanazy.

Polipeptyd o aktywności ksylanazy wytwarzany sposobem według wynalazku skutecznie ułatwia sączenie i usuwanie substancji organicznych z bulionu w procesach, w których odpady z zacieru jabłkowego przetwarza się metodami biologicznymi w biomasę pochodzenia mikrobiologicznego. W takich procesach korzystnie stosuje się ksylanazy pochodzące od grzybów nitkowatych.

Z zanieczyszczonej skrobi zbożowej wytwarza się syropy glukozowe o lepszej przesączalności i/lub niższej lepkości przez poddanie zanieczyszczonej skrobi najpierw działaniu α-amylazy, potem polipeptydu o aktywności ksylanazy grzybowej wytworzonego sposobem według wynalazku, a w końcu hydrolizie. Podobnie, polipeptydy te stosuje się w browarnictwie piwa w celu polepszenia przesączalności brzeczki piwnej.

Polipeptyd o aktywności ksylanazy stosuje się także do usuwania drzewników z masy celulozowej w przemyśle papierniczym, a tym samym w celu ułatwienia bieleniaprzez zmniej szenie ilości potrzebnego chloru. Ponadto, wytwarzany sposobem według wynalazku polipeptyd o aktywności ksylanazy stosuje się w różnych innych procesach w celu zwiększenia wydajności wytwarzania soków owocowych lub warzywnych, do enzymatycznego hydrolizowania pulpy z buraków cukrowych, przy czym hydrolizowane frakcje można użyć do wytwarzania pożywek hodowlanych dla drobnoustrojów, do hydrolizowania odpadków produkcji rolnej, takich jak kaczany kukurydzy, słoma z pszenicy i łupiny orzeszków ziemnych i do hydrolizowania surowców wtórnych takich jak odpady papierowe.

Poniżej przedstawiono szereg przykładów objaśniających fachowcom powyższy opis i wskazujących, jak wykonywać i stosować wynalazek, przy czym przykłady nie ograniczają zakresu ochrony. We wszystkich przykładach stosowano ciśnienie atmosferyczne lub niewiele różniącą się od ciśnienia atmosferycznego.

Przykład I. Oczyszczanie i charakteryzowanie endoksylanazy XYL A Aspergillus tubigensis.

1. (Oczyszczanie endoksylannzy XYL A Aspaagillus tubigensis

Aspargillus niger DS 16813 /CBS 323.90 - później przeklasyfikowany jako należący z większym prawdopodobieństwem do gatunku A.tubigensiy; Kuytnry-vnd Someren i wsp. /1991// hodowano na pożywce zawieraj ącej /w 1 litrze/ 30 g ksylanu z płatków owsianych /firmy Sigma/, 7,5 g NH4NO3, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO^ 15 g KH2PO4 i 0,5 g ekstraktu droż.dżowego /pH 6,0/. Przesącz otrzymany z tej hodowli zwężono do objętości wynoszącej około 35 ml, a następnie poddawano ulUgnfiltrncji na sączku Diaflo PM 10 w 50 ml Amickd w celu usunięcia soli.

171 271

Supernatant zatężono do objętości 10 ml i pozostałość przemyto dwukrotnie 25 ml 25 mM buforu Tris-HCl /pH 7,0/. Po przemyciu objętość wynosiła 25 ml. Tę pozostałość wstrzyknięto w ilościach po 1 ml na kolumnę Syn Chropak AX 300 /wymiary: 10 x 250 mm/ i eluowano w następujących warunkach HPLC:

szybkość elucji: bufor elucyjny A: bufor elucyjny B: gradient elucji:

ml/minutę mM Tris-HCl , pH 7,0;

mM Tris-HC, pH 7,0+114 NaCL wedhig poniższej (abcii.

czas /minuty/	% A	% B
0	99	1
12	97	3
30	80	20
50	50	50
70	0	100
90	0	100
95	99	l

Zbierano frakcje o objętości 1 ml każda. Eluowane białko wykrywano na drodze ciągłego pomiaru absorpcji UV przy 280 nm. Krzywą elucji przedstawiono na rysunku, fig. 2. Frakcje badano na obecność aktywności endoksylanazy metodą analizy kroplowej. 12 ml buforu cytrynianowo fosforanowego /otrzymanego przez zmieszanie 900 ml, 0,2 M Na₂HPO₄ ze 125 ml 0,5 M kwasu cytrynowego i doprowadzenie pH roztworu do 5,6 przy użyciu 0,5 M kwasu cytrynowego lub 0,2 M N^HPOy zawierającego 0,5% ksylanu z płatków owsianych /firmy Sigma/ dodano do 180 mg agaru /firmy Difco/ i mieszaninę ogrzewano do temperatury 100°C w celu rozpuszczenia agaru. Po oziębieniu do temperatury 60°C mieszaninę agarową rozprowadzono równą warstwą na warstewkę żelu agarozowego. Poszczególne kropelki eluowanych frakcji umieszczono oddzielnie na warstewce i inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze 30°C. W przypadku obecności aktywności endoksylanazy, miejsca, w których znajdowały się poszczególne krople wykazujące aktywność endoksylanazy były przezroczyste. Całkowitą aktywność ksylanazy w zebranych frakcjach oznaczono ilościowo przez zmierzenie ilości redukujących cukrów wytworzonych w określonym okresie czasu z zastosowaniem mikroanalizy opisanej przez Leathers’a i wsp. /1984/ przy użyciu jako substratu ksylanu z płatków owsianych w 50 mM octanu sodowego, przy pH 5,0. Jednostkę aktywności również zdefiniował Leathers /supra/.

Aktywność egzoksylanazy w eluowanych frakcjach oznaczono metodą opisaną przez Poutanen’a i Puls’a /1988/ przy użyciu jako substratu p-nItro-fenylo-P-ksylopiranozydu /0,3 mM, firmy Sigma/ przy pH 5,0 iw temperaturze 30°C.

Analiza kroplowa wykazała, że eluowane frakcje odpowiadające pikom B, F i K /fig. 2/ zawierały aktywność endoksylanazy. Pełna analiza wykazała aktywność ksylanazy w eluowanych frakcjach odpowiadających pikom B, F, H i K. Aktywność egzoksylanazy wykazały frakcje odpowiadające pikom B i H.

Eluowane frakcje odpowiadające pikom F /białko XYL 2/ i K /białko XYL AJ oczyszczano dalej kilkakrotnie metodą chromatografii ijouowym.iennej. Zawarte w nich endoksylanazy oznaczono przy użyciu SDS/PAGE/Moonen i wsp. 1982/ i Iso Electric Focussing /3,5 < pH < 9,5/, /sprzęt firmy LKB/ zgodnie z instrukcjąproducenta. /Ogniskowanie w punkcie izoelektrycznym/. Pozorny ciężar cząsteczkowy endoksylanazy F, jak określono przy użyciu SDS-PAGE, wynosił około 22 kDa, pozorny ciężar cząsteczkowy endoksylanazy K wynosił około 24 kDa. Punkt izoelektryczny /JEP/ endoksylanazy F obserwowano przy pH około 4,0, podczas gdy JEP endoksylanazy K obserwowano przy pH mniejszym niż 3,5.

2. Sekwencjonowanie N-końcowych aminokwasów endoksylanazy XYL A Aspargillus tubigensis.

Około 5 Lig endoksylanazy oczyszczonej jak opisano w punkcie 1 poddano elektroforezie w 12% żelu poliakrylamidowym z dodatkiem SDS, po czym analizowano przy użyciu techniki elektroblottingu na błonie Immobilon-P /firmy Millipore/, stosując metodę opisaną przez Matsudaira'ę/1987/. Fragment błony zawierającej główne pasmo odpowiadające pozornemu ciężarowi cząsteczkowemu 25 kDa /SDS-PAGE/poddano analizie sekwencjonowania w sekwenatorze gazowym /firmy Eurosequence, Groningen/. Oznaczoną N-końcową sekwencję aminokwasową przedstawiono na rysunku, fig. 3, wzór 1. Jednakże wykryto również prawie takie same ilości dwóch innych wariantów, w których jako aminokwas N-końcowy występuje jako aminokwas N-końcowy glicyna /fig. 8, pozycja 3/.

3. Oznaczenie sekwencji aminokwasowej peptydów endoksylanazy XYL A uwolnionych przez endoproteinazę Glu-C.

Około 260 pn endoksylanazy oczyszczonej jak opisano w punkcie 1 rozpuszczono w 110 pl roztworu zawierającego 50 mM buforu wdorowęglanoamonowego o pH 7,5 i 2 mg/ml SDS. Po ogrzaniu roztworu w ciągu 3 minut do temperatury 100°C i ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano 18-krotny nadmiar molowy endoproteinazy Glu-C /proteaza V8 Staphylococcus aureus/. Białko trawiono w pokojowej temperaturze w ciągu 20 minut, po czym mieszaninę reakcyjnąogrzano do temperatury 100°C na okres 3 minut. Około 1/5 mieszaniny reakcyjnej poddano elektroforezie na 15% żelu poliakryloamidowym z dodatkiem SDS, po czym przeprowadzono elektroblotting na błonie Immobilon-P /firmy Millipore/, stosując metodę opisaną przez Matsudaira’ę /1987/. Zaobserwowano trzy fragmenty o masach cząsteczkowych wynoszących odpowiednio 19, 16 i 4 kDa. Dwa większe fragmenty /19 i 16 kDa/ poddano analizie sekwencyjnej w sekwenatorze gazowym /model sekwenatora białko 470 A Applied Biosystems, Eurosequence, Groningen/. Części błony zawierające 2-3 nmol peptydu przemyto i poddano analizie sekwencyjnej według programu opisanego przez Amons’a/1987/.Oznaczono N-końcową sekwencję aminokwasową fragmentu o wielkości 19 kDa. Sekwencję tę przedstawiono na rysunku, fig. 4, wzór 2. Nie można było określić aminokwasu w pozycji 9 /X/. W pozycji 14 znaleziono jedynie ślad seryny, co wskazano przy użyciu nawiasów. Oznaczono także N-końcową sekwencję aminokwasową fragmentu o wielkości 16 kDa. Sekwencję tę przedstawiono na rysunku, fig. 4. wzór 3.

Nie można było określić aminokwasu w pozycji 10 ΓΧ!. Znaleziona sekwencja tego fragmentu jest niemal identyczna, jak sekwencja tego fragmentu o wielkości 19 kDa. Oba peptydy maj ątaką samą sekwencj ę N-końcową, która niejest identyczna z N -końcową sekwencj ą aminokwasową białka nietrawionego /punkt 2, fig. 3. wzór 1/. Ustalono, że te dwa wewnętrzne fragmenty odpowiadają sekwencji zaczynającej się od pozycji 79, jak zilustrowano na rysunku, fig. 8.

Przykład II. Konstrukcja biblioteki genomowej szczepu DS 16813 Aspergillus niger /CBS 323.90; później przeklasyfikowanego jako A.tubigensis/.

1. IzolacjaDNAz AspergillusnigerDS ir813 /CBS 323.S0później pźzeklasyfikawfnego jako A.tubigensis/.

DNA pochodzenia grzybowego wyizolowano jak opisał de Graaf i wsp. /1988/. Zebrano grzybnię hodowaną w ciągu nocy na minimalnej pożywce płynnej /zawierającej w 1000 ml: 6,0 g NaNO₃, 1,5 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4 x 7H₂O, 0,5 g KCl, 1 ml roztworu Visniac’a [Visniac i Santer, 1957: 10 g EDTA, 4,4 g ZnSO4 x 7H₂O, 1,0 g MnCl₂ x 4H₂O, 0,32 g CoCl₂ x 6H₂O, 0,32 g CuSO4 x 5H2O, 0,22 g /NH4/₆Mo₇₌24 x 4H₂O, 1,47 g CaCl₂ 2 2H₂0,1,0 g FsSO4 x 7H₂O, pH 4,0], pH 6,0/ wzbogaconej w 0,2% aminokwasów seryny i 0,5% ekstraktu drożdzowego. Następnie przemyto zimną solą fizjologiczną, zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C. Kwasy nukleinowe wyizolowano przez rozrywanie 0,5 g zamrożonej grzybni przy użyciu urządzenia do mekroroybijania /firmy Braun/. Tak otrzymany proszek grzybni ekstrahowano świeżo przygotowanym buforem ekstrakcyjnym.

171 271

Bufor ekstrakcyjny przygotowano następująco: 1 ml kwasu trój-izopropylonaftalenosulfonowego /TNS/ dokładnie zmieszano z 1 ml kwasu p-aminosalicylowego /PAS/ /120 mg/ml/ i dodano 0,5 ml buforu RNB x 5 /zawierającego w 1000 ml: 121,10 g Tris, 73,04 g NaCl, 95,10 g EDTA, pH doprowadzono do 8,5 za pomocą HCl/. Po dodaniu 1,5 ml fenolu, bufor ekstrakcyjny równoważono w ciągu 10 minut w temperaturze 55°C. Następnie ciepły bufor dodano do proszku grzybni i zawiesinę dokładnie mieszano w ciągu 1 minuty przy użyciu mieszadła wirowego. Po dodaniu 1 ml chloroformu zawiesinę ponownie mieszano w ciągu 1 minuty. Po odwirowaniu /10⁴ x g/, w ciągu 10 minut, w szybkoobrotowej wirówce Sorvall, wodną fazę ekstrahowano jeszcze raz taką samą objętością fenolu i chloroformu /1:1/, a potem dwukrotnie ekstrahowano chloroformem. DNA wyizolowano z fazy wodnej stosując następującą procedurę: DNA doraźnie wytrącono za pomocą dwóch objętości etanolu w pokojowej temperaturze, a następnie zebrano przez odwirowanie przy użyciu szybkoobrotowej wirówki Sorvall /10⁴ x g/, w trwaj ące 10 minut, przemyto dwukrotnie przez ponowne rozpuszczenie DNA w destylowanej, wyjałowionej wodzie i ponowne wytrącenie etanolem. RNA usunięto przez dodanie do końcowego roztworu RNA-azy A /20 g pg/ml/.

2. Częściowe trawienie DNA Aspergillus tubigensis za pomocąSau 3A i izolacja fragmentów DNA po elektroforezie w żelu agarozowym.

DNA /30 pg/ wyizolowany z Aspergillus niger DS 16813 /ostatnio przeklasyfikowany jako A.tubigensis/ jak opisano w punkcie 1, trawiono częściowo przez inkubację DNA z 0,1 jednostki /U/ Sau 3A w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. Otrzymane fragmenty frakcjonowano pod względem wielkości przez elektroforezę w 0,4% żelu agarozowym w buforze TAE zawierającym 0,5 pg/ml bromku etydyniowego /bromek 3,8-dwuamino-5-etylo-6-fenylofenantrydyniowy/. Fragmenty o długości od 14 kb do 22 kb, porównywano z fragmentami DNA bakteriofaga lambda trawionego BglII /22,0,13,3, 9,7,2,4, 0,65 i 0,44 kb/ służącymi jako wzorce wielkości, odzyskano z żelu przez wycięcie odpowiedniego obszaru.

Fragmenty te odzyskano z kawałka agarozy przez elektroelucję przy użyciu miseczek ISCO. Błonę dializującą zawieszono zarówno na dużych, jak i na małych pojemnikach miseczki, którą napełniono TAE x 0,005 /rozcieńczony roztwór podstawowy TAE x 50, zawierający w 1000 ml: 242,0 g Tris, 57,1 ml lodowatego kwasu octowego, 100 ml 0,5 M EDTA, pH doprowadzono do 8,0 przy użyciu HCl/, a kawałki agarozy umieszczono w dużym pojemniku miseczki. Miseczkę umieszczano w urządzeniu do elektroelucji tak, że duży pojemnik znajdował się w obszarze katody zawierającym TAE, a mały pojemnik w obszarze anody zawierającym TAE/3M NaCl. Prowadzono elektroelucję przy napięciu 100 V w ciągu 2 godzin. Następnie miseczkę usunięto z urządzenia, usunięto bufor z dużego pojemnika i z górnej części małego pojemnika. Pozostały bufor /200 μΐ/ zawierający fragmenty DNA dializowano w miseczce przy użyciu wody destylowanej w ciągu 30 minut. Wreszcie DNA wytrącono przez dodanie 0,1 objętości 3M NaAc, pH 5,6 i 2 objętości zimnego /-20°C/ etanolu. DNA zebrano przez odwirowanie /wirówka Eppendorf/ w ciągu 30 minut, w temperaturze 4°C /14, 000 x g/. Po usunięciu suparnatantu peletki DNA wysuszono przy użyciu wirówki próżniowej /Savant Speedvac/. Po wytrąceniu etanolem, DNA rozpuszczono w 10 pl buforu TE /10 mM Tris-HCl, pH 8,0,1 mM EDTA, pH 8,0/ i oznaczono stężenie przez elektroforezę w agarozie stosując jako wzorzec DNA lambda o znanym stężeniu oraz bromek etydyniowy jako wskaźnik barwny.

3. Klonowanie fragmentów DNA Aspergillus tubigensis w bakteriofagu lambda EMBL3.

Fragmenty otrzymane w wyniku częściowego trawienia genomowego DNA, jak opisano w punkcie A ligowano z ramionami BamHI bakteriofaga lambda EMBL 3 otrzymanych z Promega w następujący sposób: Odmierzono pipetą 4 μΐ /2 pg/DNA EMBL 3,1 pl /50 pg/ fragmentów genomowego DNA, 0,75 pk buforu do ligowania x 10 /Maniatis i wsp., 1982, str. 474: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl₂, 50 mM ditiotreitolu, 10 mM ATP, pH 7,6/, 0,75 pl 10 mM ATP i 2 pl /1,5 jednostki/ml ligazy T4 DNA /BRL/, ostrożnie zmieszano i inkubowano w ciągu 6 godzin w temperaturze 14°C. Po zakończeniu tej inkubacji do mieszaniny reakcyjnej dodano 1 pl ligazy T4 DNA i kontynuowano reakcję jeszcze przez 4 godziny w pokojowej temperaturze. Zligowanym DNA wypełniono in vitro wirusy /tworzenie funkcjonalnych cząstek

171 271 wirusa/ przy użyciu ekstraktu Gigapack II Gold i posiano na E.coli LE 392 /Murray 1977/ na pożywce NZyCm/ zawierającej w 1000 ml: 10 g aminy NZ, 5 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdzowego, 1 g aminokwasów kazeiny, 2 g MgSO4 x 7H₂O. pH 7,5 do posiewów dodano 12 g agaru/ według instrukcji producenta. Reakcję opisaną wyżej powtórzono jeszcze raz, stosując 3 μ łragmentów ggnomowegg DNA w kokcowei oojętooci i1 μΐ.

4. Miareczkowanie i amplifikacja biblioteki genomowej Aspergillus tudign'nsis.

Pierwotną bibiotekę genomową rozcieńczono w buforze SM /zawierającym w 1000 ml: 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO₄ x 7H₂O, 50 ml Tris-HCl, pH 7,5, 5 ml 20% żelatyny/ i posiano na gospodarza E.coli LE 392, jak opisał Maniatis i wsp. /1982, str. 64/ na pożywce NZYCM. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C policzono powstałe łysinki i obliczono liczbę fagów. W wyniku pierwszej operacji ligacji i tworzenia wirusów powstało około 7 x 10⁴ pfu /jednostek tworzących łysinki/, g w wyniku drugiej około 4 x 10⁵ pfu, razem powstało 5 x 10⁵ pfu. Tak otrzymaną bibliotekę genomową amplifikowano przez wykonanie posiewów o średnicy 85 mm, z których każdy zawierał 5 x 10³ pfu /razem 5 posiewów/ na pożywce NZYCM, jak opisał Maniatis i wsp. /1982, str. 293-294/. Po inkubacji w ciągu nocy w temperaturze 37°C z otrzymanych zlanych posiewów, wypłukano fagi dodając 5 ml buforu SM. Posiewy poddano nieciągłemu wytrząsaniu w temperaturze 4°C w ciągu 2 godzin. Po usunięciu supernatantu, bakterie usunięto z roztworu przez odwirowanie /4000 x g w temperaturze 4°C, trwające 10 minut. Do supernatantu dodano 0,3% chloroformu i oznaczono ilość pfu. Podstawowa substancja fagowa zawierała około 1O¹⁰ pfu/ml.

Przykład III. Przeszukiwanie biblioteki genomowej Aspergillus tudignnsis pod kątem genu A endoksylanazy /xlu AJ i izolacja tego genu

1. Znakowanie syntetycznych oligknuklnotydew zg pomocą P¹².

Sekwencję gminokwgsową wyprowadzoną jak opisano w przykładzie I, punkt 2 zastosowano do wytworzenia mieszanin oligonukleotydów odpowiadającej N-końcowej sekwencji aminokwasowej. Oligonukleotydy ysantetazkuank przy użyciu syntetyzatora oligonukleotydów firmy Applied Biosystem metodą fosforoamidynową. Oligonukleotydy AB801 - AB806 /fig. 3/ zmieszano w równych ilościach - mieszaninę tę dalej nazywa się AB800 - otrzymując końcowe stężenie kligonuklektadów równe 37 pmol/ μΐ. Tę mieszaninę kligknuklnotydów znakowano w mieszaninie reakcyjnej o następującym składzie: 37 pmol oligonukleotydów, 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM ATP, 1 mM spermidyny, 10 mM MgCf, 15 mM ditiotreitolu, 200 ig/ml BSA, 34 pmole gammg-P³² ATP /NEN, 6000 Ci/mMol/ i 30 jednostek kinazy polinukleotydowej T₄ /BRL/, o objętości równej 50 μΐ. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w ciągu 60 minut, w temperaturze 37°C, po czym reakcję zakończono przez dodanie 4 μΐ EDTA, pH 8,0. Mieszanina oligonukleotydów AB 125 pochodząca od sekwencji aminokwasowej otrzymanej w przykładzie I, punkt 3 /fig. 4, wzory 2 i 3/ znakowano tak, jak opisano wyżej. Mieszanin oligknuklnktydów użyto do przeszukiwania biblioteki genomowej /przykład III, punkt 2/ i w analizie dlottingkwej Southem’a /przykład III, punkt 4 i 5/ bez dalszego oczyszczania.

2. Przeszukiwanie biblioteki genomowej Aspergillus tubigensis pod kątem genu xln A.

W celu przeszukania genomowej biblioteki Aspergillus tubigensis pod kątem genu xln A wykonano cztery posiewy o średnicy pożywki wynoszącej 85 mm /1,2% agaru/ na pożywce NZYM umieszczonej na agarozie zawierającej 0,7% agarozy /pożywka NZYM + 7 g agarozy/, jak opisał Maniatis i wsp. /1982, str. 64/. Jako bakterie do posiewu użyto E. coli LE 392. Po całonocnej inkubacji posiewów w temperaturze 37°C, wykonano dwie kopie każdego posiewu na filtrach nitrocelulozowych /Schleicher i Schull BA85/, jak opisał Maniatis i wsp./ 1982, str. 320 - 321/. Po dwugodzinnym wyżarzeniu filtrów w temperaturze 80°C, filtry zwilżono i przemyto w ciągu 60 minut w pokojowej temperaturze w SSC x 3 /rozcieńczonym z podstawowego roztworu SSC x 20, zawierającym w 1000 ml: 175,3 g NaCl, 107,1 g cytrynianu sodowego x 5,5 H^O, pH 7,0/. Filtry haboadyyougnk wstępnie w ciągu 2 godzin w temperaturze 65°C w buforze do hybrydyzacji wstępnej zawierającym: SSC x 6 /rozcieńczony zpodstawowego roztworu SSC x 20 /patrz wyżej//, 0,5% SDS, roztwór Denhardt’a x 10 /zawierający w 5000 ml: 10 g Ficoll-400, 10 g poliwinylopirolidonu, 10 g albuminy surowicy bydlęcej /Pentgx Fraction

171 271

U// i 100 pg/ml DNA plemników śledzia denaturowanych termicznie /Boerhinger Mannheim/. Po dwóch godzinach hybrydyzacj i wstępnej, bufor do hybrydyzacji wstępnej zastąpiono buforem do hybrydyzacji, identycznym jak bufor do hybrydyzacji wstępnej, lecz nie zawierającym DNA plemników śledzia, a zawierającym mieszaninę oligonukleotydową AB800 znakowaną P³², wytworzonąjak opisano w punkcie 1. Filtry poddano hybrydyzacji w ciągu 18 godzin w temperaturze końcowej wynoszącej 38°C osiągniętej przez kontrolowane chłodzenie od początkowej temperatury wynoszącej 65°C. Po zakończeniu hybrydyzacji filtry przemyto najpierw za pomocą SSC x 2, po czym przemyto je przegrzanym buforem hybrydyżującym o temperaturze 38°C, w ciągu takiego samego czasu. W końcu filtry przemyto w ciągu 30 minut, w temperaturze 38°C w SSC x 6 i 0,05% pirofosforanu sodowego. Wysuszone na powietrzu filtry nałożono na arkusz papieru Whatman 3MM, radioaktywnym atramentem wykonano znaczki kluczowe i papier z filtrami pokryto Saran Wrap™. Hybrydyzujące lysinki zidentyfikowano przez naświetlanie filmu do promieni X Kodak XAR w ciągu 72 godzin w temperaturze -70°C stosując ekran wzmacniający. Zidentyfikowano cztery z hybrydyzujących łysinek mieszaniny oligonukleotydowej, które pojawiły się w dwóch powtórzeniach na kopii filtrów i oznaczono je lambdax_nl do lambda*^

Każdą pozytywną łysinkę usunięto z płytki przy użyciu pipety Pasteur’a i z agarowego czopu eluowano fagi 1 ml buforu SM zawierającego 20 pl chloroformu, jak opisał Maniatis i wsp. /1982, str. 64/. Otrzymane fagi oczyszczono powtarzając procedurę opisaną wyżej stosując kopie filtrów uzyskane z posiewów zawierających 50-100 łysinek izolowanych fagów. Po oczyszczeniu, fagi namnożono przez wysianie 5 x 10³ fagów na pożywkę NZYCM. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C otrzymano zlewające się posiewy, z których eluowano fagi przez dodanie 5 ml buforu SM i nieciągłe wytrząsanie posiewu w czasie 2 godzin w temperaturze 4°C. Po usunięciu supernatantu z roztworu usunięto bakterie przez odwirowanie /4.000 x g w· ciągu 10 minut w temperaturze 4°C. Do supernatantu dodano chloroform /0,3%/ i określono ilość pfu. Ta podstawowa substancja fagowa zawierała około 10¹⁰ pfu/ml.

3. Izolowanie DNA z bakteriofaga lambda.

Wyizolowanie fagi lambda^ do lambda _xln4 namnożono jak opisano w punkcie 2 stosując 5 posiewów dla każdego z fagów. Fagi wytrącono z tak otrzymanego supernatantu /25 ml/ przez dodanie takiej samej objętości roztworu zawierającego 20% PEG-6000 /wag/obj./ i 2M NaCl, po czym ostrożnie mieszano i inkubowano na łodzie w ciągu 60 minut. Wytrącone fagi zebrano przez odwirowanie /14000 x g w temperaturze 4°C w ciągu 20 minut. Supernatant usunięto przez zasysanie, a pozostałe ślady płynu usunięto przy użyciu papieru ręcznikowego. Fagi ostrożnie zawieszono ponownie w 4 ml buforu SM i ekstrahowano jeden raz chloroformem.

Przed wyekstrahowaniem DNA z cząstek fagów, DNA i RNA pochodzące z bakterii, które uległy lizie, usunięto przez inkubację zawiesiny fagów z DNA-azą I i RNA-azą A. /każda w ilości 100 pg/ml/ w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C/. Następnie z fagów uwolniono fagowy DNA przez dodanie SDS i EDTA do końcowego stężenia 0,1%, i 20 mM odpowiednio, po czym inkubowano go w temperaturze 65°C w ciągu 10 minut. Z roztworu usunięto białko na drodze dwukrotnej ekstrakcji taką samą objętością mieszaniny fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego /25:24:1/. Po rozdzieleniu faz przez odwirowanie w wirówce Eppendorf /14000 x g, 10 minut/, wodną fazę ekstrahowano jeden raz taką samą objętością mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego /24:1/. Fazy rozdzielono przez odwirowanie /wirówka Eppendorf, 14000 x g, 10 minut/, po czym z wodnej fazy wytrącono DNA przez dodanie 0,1 objętości 5M nadchloranu sodowego i 0,1 objętości izopropanolu i przez inkubację na lodzie w ciągu 30 minut. DNA odzyskano prze odwirowanie w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C /14000 x g/. Supernatant usunięto przez zasysanie, po czym DNA ponownie zawieszono w 40 ul buforze TE. DNA wytrącono jeszcze raz etanolem. Następnie DNA zebrano przez odwirowanie w ciągu 10 minut w temp. 4°C /14000 x g/. Supernatant usunięto przez zasysanie, a paletkę DNA krótko suszono pod próżnią, po czym DNA zawieszono ponownie w 125 ml buforu TE zawierającego, 0,1 pg/ml RNA-azy A. W wyniku takiego oczyszczania wyizolowano około 40-50pg DNA z każdego faga.

171 271

4. Analiza restrykcyjna fagów zawierających xln A.

DNA wyizolowany z fagów lambda*^ do lambda^ analizowano mntodąSkuthem’n przy użyciu następujących enzymów restrykcyjnych: BamHI, Bgl II, EcoRI, HSsOIII, KpnI, SalI, SstI. XbaI i XhaI. DNA trawiono w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C /dwie próbki/ w mieszaninie reakcyjnej składającej się z następujących roztworów: 3 pl roztworu DNA, 1 μΐ 0,5M spermidydy, 5 μΐ odpowiedniego buforu React x 10 /BRL/, 20 jednostek enzymu Restriction /BRL/ i z wyjałowionej wody destylowanej, która to mieszanina reakcyjna miała końcową objętość wynoszącą 50 μΐ. Po zakończeniu trawienia, DNA wytrącono przez dodanie 0,1 objętości 3M NaAc i 2 objętości etanolu. DNA zebrano przez odwirowanie w ciągu 10 minut, w pokojowej temperaturze /14000 x g/. Supernata^ usunięto przez znyysndSn. Pozostałe paletki DNA krótko suszono pod próżnią i ponownie ynwinyyknk w wyjałowionej wodzie destylowanej. Po dodaniu 4 p bufoni obciąąająąego DNA /0,25%/ wag-obj./, bił^^ciSul bromofenolowcgo, 0,25% /wag.obj./ cyjanoksylanu, 15% /wag./obj./ Ficoll w H₂O/, próbki idkubowndo w ciągu 10 minut w temperaturze 65°C i gwałtownie ochłodzono na lodzie. Następnie próbki przeniesiono na 0,6% żel agarozowy w buforze TAE x 1. Fragmenty DNA rozdzielono na drodze elektroforezy przy napięciu 25 V w ciągu 15-18 godzin.

Po zakończeniu elektroforezy DNA adedntsgownnn i przeniesiono na błonę nitrocelulozową, jak opisał MndinUSy i wsp. /1982, str. 383-386/, po czym kolejno przeprowadzono hybrydyzację wstępnąi hybrydyzację ynynddiccąpgyy użyciu minsandid znakowanych oligodukleotydów AB800 i AB1255, jak opisano w punkcie 1, stosując warunki hybrydyzacji oaisadn w punkcie 2. Obraz hybrydyzncyJdy dla każdej mieszaniny oligonukΐnktydowej otrzymano przez naświetlanie filmu do promieni X Kodak XAR-5 w ciągu 18 godzin, w temperaturze -70°C przy użyciu ekranu wzmacniającego.

Z uzyskanych wyników wywnioskowano, że DNA wszystkich czterech wyizolowanych klonów hybrydyzował z mieszaniną kligoduklekty0ów wyprowadzoną z N-końcowej sekwencji nmidokwniowej /minszndidn AB800/, jak również z minyynnidą kligknuklnkty0ów wyprowadzoną z sekwencji aminokwasowej peptydu wyizolowanego po trawieniu proteazą V8

S.aureus /AB 1255/. We wszystkich czterech klonach znaleziono fragmenty pochodzące z tego samego regionu genomu. Obrazy fragmentów restrykcyjnych i obrazy hybrydyancyJde stosowano do skonstruowania przybliżonej mapy restrykcyjnej regionu genomu, w którym znajdują się gen xlnA /fig. 5/.

5. SubklonownnSn genu xlnA.

Fragment SalI o długości 6,9 kb wyizolowano z faga lambda^ jak opisano w przykładzie II, punkt 2. Ten fragment ligowano do wektora pUC9 trawionym SalI i zdefkyfogyyowndym alkaliczną fosfatazą wytworzoną następująco: 1 μΐ /1 pg/ μΐ/ pUC9 yminyyndk z 2 pl React 10 x10 /BRL/, 1 μΐ/ 1 U/ μΐ/ SalI i 16 μΐ wyjałowionej wody destylowanej. DNA trawiono w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C, po czym dodano 0,5 μΐ alkalicznej fosfatazy /1 U/ μl/Phnrmncin/ i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu dalszych 30 minut. Wektor w postaci liniowej wyizolowano na 0,6% żelu agarozowym, jak opisano w przykładzie II, punkt 2. Fragment SalI o długości 6,9 kb ligowano do wektora pUC trawionego Sali z0nfksfkryzowndngo w następujący sposób: 100 ęrg fragmentu pUC zmieszano z 100 grg fragmentu SalI o długości 6,9 kb i z 4 ul buforu ligncyjnegk x 5 /500 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM MgCl₂, 10 mM ATP, 10 mM Oitiotrnitolu, 25% PEG-6000/ i do tej mieszaniny dodano 1 μΐ /1,2 U/ μΐ/ ligazy DNA /BRL/, uzyskując końcową objętość równą 20 μΐ. Utworzony plazmid oznaczono pIM 100. Po 16 godzinach inkubacji w temperaturze 14°C mieszaninę rozcieńczono do objętości 100 μΐ za pomocą wyjałowionej wody. 10 μΐ rozcieńczonej minszadidy użyto do transformowania kompetentnych komórek E.coli JM101 /Yanish-Perron i wsp. 1985/, otrzymanych sposobami CM1, CM2 opisanymi w Phngmncin Manual. E.coli zawierającą plazmid pIM100 zdeponowano w Centgnnΐ Bureau Voor Schimmelcultures, Baam, Holandia w dniu 19 lipca 1990 r, pod numerem CBS 322.90. Wybrano 6 z otrzymanych hodowli i hodowano je w ciągu nocy na pożywce LB /zawierającej w 1000 ml: 10 g peptonu tgypyynkwego /BBL/, 5 g ekstraktu drożdżowego /BBL/, 10 g NaCl, 0,5 mM Tris-HCl, pH 7,5/ z dodatkiem 100 μ^/ητΐ ampicyliny Z hodowli izolowano

171 271 plazmidowy DNA metodąalkallicznej lizy, opisanąprzez Maniatis’a i wsp. /1982, str. 368-369/. Ten plazmidowy DNA stosowano w analizie restrykcyjnej, jak opisano w punkcie 4 w celu wyselekcjonowania klonu posiadającego pożądany plazmid. Na dużą skalę wyizolowano plazmidowy DNA z 500 ml hodowli E.coli JM 101 zawierających plazmid plM 100 wzrastających na pożywce LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny, /Maniatis i wsp. 1986, str. 86/. Plazmid oczyszczono przez odwirowanie z CsCl, fenolizowano, wytrącono etanolem i rozpuszczono w 400 μΐ TE. Wydajność wynosiła około 500 pg. Następnie plazmid analizowano za pomocą enzymów restrykcyjnych i opracowano mapę restrykcyjną przedstawioną na fig. 7. Ułożenie genu, jak wskazano, określono przy zastosowaniu hybrydyzacji w warunkach opisanych w punkcie 2, przy użyciu w charakterze sond mieszanin oligonukleotydowych AB800 i AB 1255.

Przykład IV. Charakteryzowanie genu xln A Aspergillus tubigensis.

1. Określenie sekwencji genu xlnA A. tubigensis.

Sekwencję genu xlnA Aspergillus tubigensis zawierającego swój region promotora i regulatorowy, gen strukturalny i region terminacji określono przez subklonowanie fragmentów pochodzących z pIM100 w M13mp18/mp19 w połączeniu z użyciem specyficznych oligonukleotydów w charakterze primerów w reakcjach przeprowadzonych celem zsekwencjonowania. W celu zanalizowania sekwencji nukleotydowej wyizolowano fragmenty restrykcyjne jak opisano w przykładzie II, punkt 2 i klonowano je w zdolnych do replikacji wektorach DNA mpl8/19 bakteriofaga M13 trawionych odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Sekwencje nukleotydowe określono metodą zakończenia łańcucha dwudezoksynukleotydowego /Sanger i wsp., 1977/, przy użyciu zestawu do sekwencjonowania z polimeraząT- DNA firmy Pharmacia. Strategię zastosowaną do sekwencjonowania genu xlnA zilustrowano na fig. 6. Przeprowadzono komputerową analizę uzyskanych danych przy zastosowaniu programu PC/GENE. /Intelligenetics, Int., Madison WI/. Sekwencję genu przedstawiono na fig. 8.

2. Gen xlnA A. tubigensis.

Sekwencja zawiera 2054 bp; 949 bp w regionie niekodującym 5' i 420 bp w regionie dekodującym 3'. W regionie położonym w kierunku 5' w górę znaleziono przypuszczalny obszar TATA /TATAAAT/ rozciągający się od pozycji 848 do 854 i znajdujący się przed miejscem inicjacji translacji /pozycja 950/. W odległości 190 do 350 bp od miejsca inicjacji translacji znaleziono sekwencję /5'GTCCATTTAGCCA3'/ powtarzającą się trójkrotnie /pozycje: 618632, 636-650, 656-670/.

Strukturalna część genu xlnA ma długość 681 bp i jest przerywana pojedynczym przypuszczalnym intronem o długości 48 bp. Polipeptyd wyprowadzony z tej sekwencji ma długość 211 aminokwasów. Na N-końcu tego polipeptydu znaleziono hydrofobową sekwencję sygnalną o długości 17 aminokwasów, po której następuje propeptyd o długości 12 reszt. Dojrzałe białko ma długość 184 aminokwasów, przewidywany ciężar cząsteczkowy wynoszący 19 kDa i teoretyczny punkt izoelektryczny /JEP/ 3,6.

Przykład V. Ekspresja genu xlnA w Aspergillus niger N593.

1. Wprowadzenie genu xlnA do Aspergillus niger N593 przez kotransformację.

Plazmid pIM100 wytworzony jak opisano w przykładzie III punkt 5 wprowadzono do

Aspergillus niger przez kotransformację Aspergillus niger N593 /mutant pyr A.niger N402; Goosen i wsp., 1987/ przy użyciu w charakterze markera selekcyjnego genu pyr A Aspergillus niger umieszczonego w plazmidzie pGW635/Goosen i wsp., 1989/ i w charakterze plazmidu kotransformującego plazmidu pIM100. Wytworzono protoplasty z grzybni przez hodowanie Aspergillus niger N593 na pożywce minimalnej wzbogaconej w 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,2% aminokwasów kazeiny, 50 mM glukozy i 10 mM urydyny, w ciągu 20 godzin w temperaturze 30°C. Protoplasty Aspergillus niger N593 przygotowano i transformację przeprowadzono tak, jak opisał Goosen i wsp. /1987/. Otrzymane transformanty PYR+ badano pod kątem ekspresji genu xlnA.

2. Wyszukiwanie transformantów do ekspresji genu xln A.

Transformanty wytworzone jak opisano w punkcie 1 badano pod kątem wytwarzania produktu genu xln A - białka XYL A. Wybrano 20 transformantów i hodowano je w ciągu

171 271 godzin na pożywce zawierającej /w 1 litrze/: 30 g ksylanu z płatków owsianych /Sigma/, 7,5 g NH4NO3, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO₄, 15 g KH₂PO₄ i 0,5 g ekstraktu drożdzowego /pH 6,0/. Po wyhodowaniu grzybnię usunięto na drodze sączenia i przesącz hodowli analizowano metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodatkiem SDS, przy użyciu żelu zawierającego 12% akryloamidu. Białko xYl A wykrywano na nitrocelulozie po przeprowadzeniu elektroblottingu i inkubacji z przeciwciałami poliklonalnymi skierowanymi przeciwko białku XYL A, które oczyszczono, jak opisano w przykładzie 1, punkt 1. Wiązanie przeciwciała wykrywano po inkubacji z kozim przeciwciałem przeciwkróliczym sprzężonym z alkaliczną fosfatazą, zgodnie z instnikc^jjąBioard. Szesnaście spośród 20 badanych transformantów wytwarzało białko XYL A wykryte tym sposobem. Białko wydzielane było do pożywki. Spośród badanych transformantów, transformant TRX9 wybrano metodą ogniskowania izoelektrycznego, przy użyciu gradientu pH od 3 do 7 i kolejnego barwienia serii rozcieńczeń transformantów TrX2 i TrX9 sposobem opisanym przez Biely i wsp. /1985 a i b/. Figura 9 obrazuje zymogram przedstawiający białko XYL A eksprymowane przez transformanty TrX2 i TrX9. Wykonano analizę SDS-PAGE przy użyciu próbek supernatantu o objętości 4 μΐ z poszczególnych transformantów i ze szczepu A.niger w charakterze kontroli; najpierw doprowadzono pH do 7 za pomocą3N NaOH i kolejno dopełniano do końcowej objętości wynoszącej 20 μΐ za pomocą buforu SB x 1, jak opisał Laemmli /1970/. Po ogrzaniu w ciągu 5 minut do temperatury 100°C wszystkie mieszaniny poddano elektroforezie w żelu SDS /12,5% poliakryloamid i kolejno barwiono za pomocą odczynnika Coomassie Brillant Blue. Jak widać na fig. 10B, ścieżkę białka o pozornym ciężarze cząsteczkowym 25 kDa porównywalnąz oczyszczonaksylanazą/ścieżka 2/ można było wykryć dla transformantów TrX2 /ścieżka 4/ i TrX9 /ścieżka 5/, a była ona nieobecna w przypadku supernatantu szczepu kontrolnego /ścieżka 3/. Wzorce masy cząsteczkowej reprezentowały 92, 68, 46 i 30 kDa.

3. Analiza delecyjna regionu promotora xln A.

Elementy regulatorowe w promotorze xln A A. tubigensis badano metodą delecji promotora. Wykonano serie 5-ciu konstrukcji genu xln A i klonowano je w połączeniu z genem pyr A A.niger. Obecność genupyr A umożliwia selekcję, jak to opisano w punkcie 1. Ponadto, obecność genu pyr A pozwala na selekcję transformantów posiadających pojedynczą kopię plazmidu zintegrowaną w locus pyr A. Wyizolowano fragment SalI/XbaI o długości 4,5 kb /fig. 7/ i ligowano do wektora pEMBL 18, jak opisano w przykładzie III, punkt 5, otrzymując przejściowy plazmid pIM101. Do wektora pEMBL 18 ligowano poza plazmidem pIM101 następujące fragmenty zawierające gen xln A: fragment HindIII/XbaI o długości 3,5 kb /otrzymując pIM102/, fragment PstI o długości 2,0 kb /otrzymując pIM103/, fragment XhoI/XbaI o długości 1,98 kb /otrzymując pIM104/ i fragment NsiI/XbaI o długości 1,97 kb /otrzymując pIM105/. Tak wytworzone plazmidy trawiono przy użyciu XbaI i ligowano z fragmentem XbaI o długości 3,8 kb zawierającym funkcjonalny gen pyr A A.niger otrzymując plazmidy pIMl 1.2. pIMlll 3, pIM114, pIM116 i pIM117 /fig. 21/. Plazmidy pIM112, pIM113, pIM114, pIM116 i pIM117 stosowano do transformacji A.niger N593, jak opisano w punkcie 1. Transformanty PYR+ hodowano i wyizolowano z nich DNA, jak opisano w przykładzie II, punkt 1. Otrzymany DNA trawiono HpaI i wyselekcjonowano pojedyncze kopie genów zintegrowanych metodą Southern’a przy użyciu fragmentu XbaI o długości 3,8 kb znakowanego P³² /znakowano, jak opisano w przykładzie VII, punkt 2/, zawierającego gen pyr A jako sondę. Transformanty posiadające hybrydyzujący fragment HpaI /którego długość zwiększyła się o jednostkę długości plazmidu w porównaniu z długością fragmentu HpaI w A.niger N593/ wyselekcjonowano, jako zintegrowane w pojedynczej kopii w locus pyr A. Wyselekcjonowano pojedyncze kopie transformantów każdego z plazmidów, jak opisano wyżej i hodowano je w ciągu 36 godzin, jak opisano w punkcie 2. Ekspresję genu xln A badano przy użyciu analizy JEF, jak opisano w punkcie 2 i metodą Northern, po wyizolowaniu całego RNA, jak opisał Graaf i wsp. /1988/ przy użyciu fragmentu XhaI/BamHI o długości 900 bp genu xln A w charakterze sondy. W transformantach pochodzących od plazmidów pIM112, pIM113 i pIM114 wykryto ekspresję genu xln A przy użyciu JEF i analizy Northern. Jednakże transformanty pochodzące od plazmidów pIM116 i

171 271 pIMU? nie eksprymowały genu xln A, ponieważ nie wykryto ani białka XYL A, ani hybrydyzującego RnA. Wywnioskowano zatem, że fragment PstI/XhoI o długości 158 bp, zasadniczo różniący się od pIM114 i pIM116 zawiera element konieczny do indukcji genu xln A w A.niger, hodowanego na pożywce z ksylanem w charakterze źródła węgla.

Przykład VI. Ekspresja w A.niger genu xln A połączonego z promotorem i/lub z sekwencją sygnalną genu amyloglukozydazy /AG/ A.niger.

1. Wektory ekspresyjne ksylanazy.

W celu uzyskania ekspresji ksylanazy w szczepie A.niger CBS 513.88 zbudowano dodatkowe kasety ekspresyjne /pXYL3 i pXYL3AG/, w których gen xln A znajduje się pod kontrolą promotora aG A.niger połączonego z różnymi sekwencjami sygnalnymi.

W kasecie ekspresyjnej pXYL3 sekwencję promotora AG połączono z sekwencją kodującą xln A obejmującą sekwencję liderową ksylanazy. W kasecie ekspresyjnej pXYL3 AG sekwencję promotora AG, jak również sekwencję liderową genu AG kodującą 18 aminokwasów połączono z fragmentem genu xln A kodującym jedynie dojrzałe białko.

2. Konstrukcja plazmidów przejściowych a/ subklonowanie locus xln A.

W celu skrócenia długości genomowego locus xln A, fragment Pstl o długości 2 kb plazmidu pIM100 /jak opisano w przykładzie III, punkt 5/ zawierający cały gen xln A włącznie z sekwencjami flankującymi od strony 5' i 3', subklonowano w miejscu PstI plazmidu pTZ18R /Promega/. Plazmid zawierający gen xln A w odpowiednim ułożeniu /wskazanym na fig. 12/ nazywano pXYL 1.

b. Podstawowy wektor selekcyjny pAmdSH.

Fragment DNA EcoRI/KpnI plazmidu pGW325/Wemars, K./1986// zawierający homologiczny gen amdS Aspergillus nidulans wstawiono do miejsc AcoRI/KpnI plazmidu pTZ18R /Promega/, aby służył jako marker selekcyjny do transformacji Aspergillus. Do tak otrzymanego wektora /pAmdS/ wprowadzono w miejscu EcoRI dodatkowe miejsce restrykcyjne HindIII, przez wstawienie następującego syntetycznego fragmentu:

5' AATTCAAGCTTG 3'

3' GTTCGAACTTAA 5'

Tak otrzymany plazmid nazwano pAmdSH. Do tego podstawowego wektora wstawione zostaną fragmenty połączenia DNA AG/ksylanaza.

c. Izolacja genomowego locus AG: konstrukcja pAB6-1

Plazmid pAB6-1 zawiera całe locus AG z A.niger wyizolowane z biblioteki plazmidowej A.niger zawierającej fragmenty HindIII o długości 13-15 kb wstawione do pUCm. Do izolowania stosowano oligonukleotydy specyficzne AG.

AG-1: 5'-GACAATGGCTACA2CAGCACCGCAA2GGACATTGTTTGGCCC-3'

AG-2: 5'-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3', oparte o sekwencje nukleotydowe opublikowane dla A.niger /Boel i wsp./ 1984a/; Boel i wsp. /1984b/. Sondy oligonuklsotydows pochodziły z sekwencji otaczających intron 2: oligo AG-1 zlokalizowany jest w kierunku w dół od tego intronu i ma identyczną biegunowość, jak mRNA AG, oligo AG-2 położony jest w kierunku w górę od intronu 2 i ma kierunek przeciwny do mRNA AG. Plazmid uAB6-1 zawiera całe locus AG we fragmencie HindIII o długości 14,5 kb /fig. 13/.

d/ Plazmidy przejściowe pXYLAG i pXYL2AG

Dokonano fuzji promotora AG i sekwencji liderowej AG kodującej 18 aminokwasów z genem xlnA kodującym dojrzałe białko /bez seryny w pozycji 1/ na drodze reakcji szczepienia łańcuchów za pomocą po^erazy /PCR/. W reakcjach PCR stosunkowo dwie matryce: pXYlL1 zawierający gen xlnA i pAB6-1 zawierający całe locus genomowe AG. Zaprojektowano cztery syntetyczne oligonukleotydy służące jako primery w amulikacjach DNA z PCR o następującej sekwencji:

oligo AB 1771: 5' -CTCTGCAGGAATTCAAGGTAG-3'

Sekwencja specyficzna AG wokół miejsca EcoRI, około 250 bp, w kierunku w górę od kodonu inicjacji ATG.

171 271 oligo AB 1985: 5'-GTAGTTGATACCGGCACTTGCCAACCCTGTGCAGAC-3' dojrzała ksylanaza_L_ lider AG-18 aminokwasów oligo AB 1986: 5'-GTCTGCACAGGCTTGGCAAGTGGCGGTATCAACRAC-3' lider AG-18 aminokwasów-1— dojrzała ksylanaza oligo AB 1984: 5'-CCGGGATCCGATCATCACACC-3' /Sekwencja specyficzna xln A umieszczona jest w miejscu BamHI w pozycji 1701, jak pokazano na fig. 8/.

Reakcję PCR prowadzono, jak opisał Saiki i wsp. /1988/ i zgodnie z instrukcją dostawcy polimerazy TAQ /Cetus/. W amplifikatorze DNA /Perkin-Elmer/Cetus/ przeprowadzono 25 cykli amplifikacyjnych /każdy: 2 minuty w temperaturze 55°C, 3 minuty w temperaturze 72°C i 1 minuta w temperaturze 94°C/. Aby dokonać fdzji sekwencji AG z kodującą sekwenciąxln A, przeprowadzono dwie osobne reakcje PCR: pierwszą w celu zamplifikowania fragmentu DNA o długości 300 bp zawierający część 3' promotora AG i sekwencję liderową AG osiemnastoaminokwasową, sąsiadującą od strony 3' z pierwszymi osiemnastoma nukleotydami sekwencji kodującej xln A, przy czym jako matrycę w tej reakcji stosowano pAB6-1, a jako primery oligonukleotydy AB 1771 i AB 1985, a drugą w celu zapmlifikowania sekwencji DNA xln A kodującej dojrzałe białko ksylanazę, sąsiadującej od strony 5' z osiemnastoma ostatnimi nukleotydami peptydu sygnalnego AG, przy czym jako matryca w tej drugiej reakcji służył pXYL1. Amplifikacje te przedstawiono schematycznie na fig. 14. Utworzone dwa fragmenty DNA oczyszczono na drodze elektroforezy w żelu agarozowym i przez wytrącanie etanolem, a następnie stosowano je jako matryce w trzeciej reakcji PCR prowadzącej do utworzenia fuzji AG/ksylanaza, przy czymjako primery w tej reakcji stosowano oligonukleotydy AB 1771 i 1984.

Tak otrzymany fragment DNA trawiono EcoRI i BamHI i subklonowano w odpowiednich miejscach plazmidu pTZ18R. Otrzymaną fuzję zsekwencjonowano i nazwano pXYLAG /fig. 14 i 15/. Pozostały region o długości 3,5 kb znajdujący się w kierunku w górę od promotora AG wytworzono przez trawienie pAB6-1 za pomocą KpnI i częściowo przez EcoRI i oczyszczono na drodze elekroforezy w żelu agarozowym i przez wytrącanie etanolem. Fragment promotora DNA AG o długości 3,5 kb najpierw ligowano z fragmentem EcoRI/BamHI fuzji AG/ksylanaza plazmidu pXYLAG, a następnie klonowano w E.coli po przeprowadzeniu ligacji do wektora pXYL1, który trawiono kpnI/BamHI, i z którego usunięto fragment KpnI/BamHI, zawierający sekwencje 5' — i sekwencje kodujące xln A. Tak wytworzony plazmid pokazano na fig. 15.

e. Plazmidy przejściowe pXYL i pXYL2

Dokonano fuzji sekwencji promotora AG z genem xln A obejmującym sekwencję liderową ksylanazy, jak opisano wyżej w podpunkcie d. Jako primery zaprojektowano dwa dodatkowe oligonukleotydy o następujących sekwencjach:

oligo AB 1982: 5'-AGCCGCAGTGACCTTCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3' gen ksylanazy-1-Promotor AG oligo AB 1983: 5' -CATCATTACACCTCAGCAATGAAGGTCACTGCGGCT-3' promotor AG_I_Gen ksylanazy

W celu dokonania fuzji sekwencji promotora AG z genem ksylanazy /zawierającym sekwencję sygnalną ksylanazy/ przeprowadzono dwie reakcje PCR: pierwszą z zastosowaniem jako matrycy pAB6-l, a jako primerów - oligonukleotydów AB 1771 i AB 1982, prowadzącą do amplifikacji fragmentu o długości 282 bp zawierającego część 3' - 3' - przez 18 nukleotydów sekwencji liderowej ksylanazy, a drugą reakcję PCR z zastosowaniem jako matrycy pXYL1, a jako primerów - oligonukleotydów AB 1983 i AB 1984, prowadzącą do amplifikacji fragmentu DNA zawierającego cały gen ksylanazy /zawierający sekwencję lidera ksylanazy/, flankowanego od strony 5' — przez 18 nukleotydów promotora AG.

Tak utworzone dwa fragmenty DNA oczyszczono na drodze elektroforezy na żelu agarozowym i przez wytrącanie etanolem i zastosowano je jako matryce w trzeciej reakcji PCR, w której w charakterze primerów użyto oligonukleotydy AB 1771 i 1984, wytwarzając połączenie AG-ksylanaza. Tak wytworzony fragment DNA trawiono za pomocą EcoRI i BamHI i sub171271 klonowano w odpowiednich miejscach plazmidu pTZ18R. Wytworzone połączenie zsekwencjonowano i nazwano pXYL /fig. 14 i 16/.

Pozostały region o długości 3,5 kb znajdujący się w kierunku w górę od promotora AG wstawiono do pxYL1, jak to opisano wyżej w podpunkcie d. Tak otrzymany plazmid nazwano pXYL2.

3. Konstrukcja kaset ekspresyjnych ksylanazy pXYL3AG i pXYL3.

Obie kasety ekspresyjne wytworzono przez wstawienie połączeń AG/ksylanaza z plazmidu pXYL2AG lub pXYL2 do podstawowego wektora A.niger pAmdSH. W celu utworzenia tej ostatecznej konstrukcji, pAmdSH trawiono za pomocą KpnI i Hindlll /częściowo/, a pXYL2 przy pomocy Hindlll i częściowo KpnI. Wszystkie fragmenty wyizolowano i oczyszczono na drodze elektroforezy w żelu i przez wytrącanie etanolem. Do fragmentu DNA KpnI/Hindlll plazmidu pAmdSH dodano albo fragment DNA KpnI/Hindlll plazmidu pXYL2AG o długości 5,3 kb, albo taki sam fragment plazmidu pXYL2, ligowano, a następnie cząsteczki klonowano przez przeniesienie obu mieszanin ligacyjnych do E.coli. Pochodzące z E.coli kasety ekspresyjne oznaczono pXYL3AG /zawierająca sekwencję lidera AG/ i pXYL3 /zawierająca sekwencję lidera ksylanazy/, które pokazano na fig. 17 i 18, odpowiednio.

4. Ekspresja genu xln A w A.niger pod kontrolą promotora AG a/ Transformacja A.niger /CBS 513.88/

Przed przeniesieniem obu kaset ekspresyjnych pXYL3AG i pXYL3 do A.niger, usunięto sekwencje E.coli przez trawienie za pomocąHindIII, elektroforezę w żelu i wytrącanie etanolem. Transformacji szczepu A.niger /CBS 513.88/, zdeponowanego 10 października 1988/dokonano za pomocą 10 pg fragmentu DNA w postaci liniowej, tak jak to opisał Tilburn, J. i wsp. /1983/ oraz Kelly i Hynes /1985/ z następującymi modyfikacjami:

- Grzybnię hodowano na minimalnej pożywce dla Aspergillus/Cove, D. /1966// wzbogaconej w 10 mM argininy i 10 mM proliny w ciągu 16 godzin, w temperaturze 3 0°C w wytrząsarce obrotowej z prędkością 300 obrotów/minutę,

- Do wytworzenia protoplastów zastosowano jedynie Novozym 234 bez helikazy,

- Po 90 minutach tworzenia się protoplastów do zawiesiny protoplastów dodano 1 objętość buforu STC/1,2M sorbitolu, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,50 mM CaC^/ i odwirowano z szybkością 2500 obrotów/minutę w temperaturze 4°C w ciągu 10 minut w wirówce obrotowej. Protoplasty przemyto i ponownie zawieszono w buforze STC w stężeniu 10⁸ komórek/ml,

- Plazmidowy DNA dodano w ilości 10 pl w buforze TE /10 mM Tris-HCl, pH 7,5,0,1 mM EDTA/ do 100 pl zawiesiny protoplastów,

- Po inkubacji zawiesiny DNA - protoplasty w temperaturze 0°C, trwającej 25 minut, dodano do niej kroplami 200 pl roztworu pEg /25% PeG 4000 /Merck/, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,50 mM CaC^/. Następnie dodano powoli 1 ml roztworu PEG /60% PEG 4000 ~ 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,50 mM CaCf/, z powtarzającym się mieszaniem. Po inkubacji w temperaturze pokojowej zawiesiny rozcieńczono buforem STC, zmieszano przez odwrócenie i wirowano z szybkością 2000 obrotów/minutę w temperaturze 4°C w ciągu 10 minut. Protoplasty ponownie zawieszono łagodnie w 200 pl buforu STC, wysiano na minimalną pożywkę Aspergillus z 10 mM acetamidu w charakterze jednego źródła azotu, 15 mM CsCl i 1M sacharozy, po czym zestalono za pomocą 0,75% bakteriologicznego agaru # 1 /Oxoid/. Hodowano przez 6 do 10 dni w temperaturze 33°C.

b/ Hodowla transformantów w wytrząsarkach.

Wyizolowano pojedyncze transformanty pochodzące od każdej z kaset ekspresyjnych i selektywne płytki agarowo-acetamidowe pokryto zarodnikami. Zarodniki każdego transformanta zbierano z komórek hodowanych przez 3 dni w temperaturze 3 7°C na płytkach agarowych z pożywką ziemniaczano-glukozową /Oxoid,' Anglia/. Wytwarzanie ksylanazy badano w wytrząsarkach w następujących warunkach wzrostu:

- około 1 x 10⁸ zarodników zaszczepiono w 100 ml pożywki do hodowli wstępnej zawierającej /w 1 litrze/: 1 g KH2PO4,30 g maltozy, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g hydrolizatu kazeiny, 0,5 g MgSO4 x 7H2O i 3 g Tween 80. Doprowadzono pH do 5,5.

171 271

- Po całooocnej oodowli w eemueramono 34¹^ w vctezusatcy ogrotowro, 1 ml ie1 mo dej w li zaszczepiono w 100 ml pożywki do hodowli zasadniczej zawierającej /w 1 litrze/: 2 g KIItIO...,, 70 g maltozo-glukozy /Maldex MDO3, Amylum/, 12,5 g ekstraktu drożdzowego, 25 g hydrolizatu kazeiny, 2 g K₂SO₄, 0,5 g MgSO₄ x 7H₂O, 0,03 g ZnCU 0,02 g CaCU 0,05 g MnSO₄ x 4H2O u FeSO₄. Doprowadzono pH do 5,6. Grzybnię hodowano przez co najmniej 140 godzin.

c/ Badania tobnlformbntew.

ToαnlfkI'manty badano pod kątem wytwarzania ksylanazy przez mierzenie aktywności ksyla^zy, a także z zastosowaniem elektroforezy w żelu poliakryloamidowym barwionym zg pomocą Coomassie Brillant Blue i wykonano zymogram barwiony za pomocą ksylano-Remazoldrillant Blue R. Aktywności ksylanazy oznaczano, jak opisał Leathers i wsp. /1984/ z pewną modyfikacją. Stężenie substratu zwiększono od 1% do 5% ksylanu owsianego, rozpuszczono w 100 mM NaAc przy pH 3,5 i ogrzewano do 100°C w ciągu 10 minut. Ponadto, reakcje z enzymem przeprowadzono w temperaturze 39°C zamiast 30°C. Ilości wytwarzanej ksylanazy mierzono w supernatantach z sześciodniowej fermentacji kilku, przypadkowo wybranych z każdej kasety ekspresyjnej. Wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1.

Wytwarzanie ksylgnazy przez kilka szczepów A niger CBS 513.88 stognsfkomougnach plazmidami zawierającymi gen xln A pod kontrolą promotora AG A.niger w połączeniu z różnymi sekwencjami lideoouyml.

Kaseta ekspresyjna	Transformant#	Aktywność ksylanazy /U/ml/
	1.1	2400
pXYL3	1.2	1700
promotor AG/	10	3600
lider xln/	29	3500
pXYL3AG /promotor AG/lider AG/	3.1	2400
A.niger CBS 513.88 /szczep kontrolny/	-	0

Analizę SDS-PAGE wykonano jak następuje: Po sześciu dniach hodowli, jak opisano wyżej, w podpunkcie b, próbki lupernatαnteu z poszczególnych tobnsfoombntew o objętości 4 μ, i zz szcąenpk0rltrrkoeno A-rugge dokrowugzyko do pH 7 zz pomooą3N NaOH i 1135^™!: dopełniono buforem SB x 1 do końcowej objętości 20 il, jak opisał Laemmli /1970/. Po trwającym 5 minut ogrzewaniu w temperaturze 100°C wszystkie mieszaniny poddano elektroforezie na SDS/12,5% żel poliαkoylkbmiOouy i barwiono za pomocą Coomblsin Brillant Blue. Jak pokazano na fig. 10A, pasma białka o pozornym ciężarze cząsteczkowym równym 25 kDa /porównywalne z oczyszczoną ksylanazą/ścieżka 1/ wykryto w przypadku trbnsfoombntóu: 10 /ścieżka 4/, 29 /ścieżka 5/ i 1.1 /ścieżka 6/. Tych pasm nie było w przypadku supernatantu ze szczepu kontrolnego /ścieżka 3/.

Wzorce ciężaru cząsteczkowego /ścieżka 2/ reprezentują ciężary: 94, 67, 43, 30, 20 i 14,5 kDa. Zymootomy we'yoo.ano nasOtpoljąco: PPobbi /te somei o kkóeychmowa ywyż^-j owano dwukrotnie do analizy przy użyciu elektroforezy w żelu 8-25% PAA /BRL/. Po przeprowadzeniu elektroforezy żel A barwiono warstwą Coomallin Brillant Blue /fig. 11A/, a żel B za pkmocąDnmbyol Brillant Blue z ksylanem REB-ksylan /Megazyme/, pH 3,5 jak opisał Biely i wsp. /1985a/ /fig. 11B/ w celu uwidocznienia aktywności ksylanazy. Próbki dostarczone na żel pokryty warstwą RBB z ksylanem wykazywały zawartość białka 5 razy mniejszą niż próbki dostarczone na żele, jak pokazano na fig. 10 i 11 A.

Numeracja ścieżek na fig. 11A i 11B jest taka sama, jak na fig. 10A i B.

Wyżej opisane bbdbniblasnk uykbzująnklornlję i snkoeąję aktywnej endo-klylαngya przez A.niger CBS 513.88 stransformowany kasetą ekspresyjną, w której gen xln A jest pod kontrolą promotora bmalkglukozydαyy A.niger. Ekspresję i sekrecję obserwowano również przy różnych

171 271 sekwencjach sygnalnych A.niger. Ponadto okazało się, że białko pozbawione reszty serynowej w pozycji 1 zachowuje swoją aktywność, to jest działanie degradujące ksylany.

Przykład VII. Przeszukiwanie genów Trichoderma reesei QM9414 pod kątem genów spokrewionych z genem xln A.

1. Znakowanie fragmentów DNA za pomocą P³² pg fragmentu Xho/BamHI o długości 900 bp wyizolowanego z plazmidu pIM100, jak opisano w przykładzie II, punkt 2 znakowano przypadkowo przy użyciu zestawu do znakowania oligonukleotydów /Pharmacia/ zgodnie z instrukcją producenta. W celu usunięcia z mieszaniny nie włączonego α-P³²-dATP, zwiększono jej objętość przez dopełnienie buforem TE do 100 μΐ, po czym α-P³²-dATP usunięto przez frakcjonowanie na kolumnie Sephadex 650. Frakcje zawierające znakowany radiologicznie DNA zdenaturowano przez inkubację w ciągu 3 minut w temperaturze 100°C i utrzymywano w postaci j ednoniciowej przez gwałtowne ochłodzenie na lodzie, przed dodaniem ich do buforu do hybrydyzacji zawierającego SSC x 6, roztwór Denhardta x 5, 0,1% pirofosforanu sodowego i 100 pg/ml zdenaturowanego termicznie DNA z plemników śledzia.

2. Hybrydyzacja genomowego DNA T.reesei QM9414.

DNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym wyizolowany z T.reesei, jak opisano w przykładzie II, punkt 1 trawiono przy użyciu BamHI, BgIII, EcoRI i SalI. Otrzymane fragmenty rozdzielono przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym i przeniesiono na bibułę nitrocelulozową jak opisał Maniatis i wsp. /1982, str. 383-389/. Nitrocelulozowe bibuły poddano wstępnej hybrydyzacji trwającej 2 godziny, w temperaturze 57°C w buforze do hybrydyzacji /jak opisano wyżej, punkt 1 /. Po zakończeniu tego procesu do buforu dodano fragment znakowany radiologicznie opisany w punkcie 1 i kontynuowano hybrydyzację przez 44 godziny. Po jej zakończeniu bibuły przemywano w ciągu 90 minut w temperaturze 57°C za pomocą SSC x 4, 0,1% SDS, i 0,1% pirofosforanu sodowego, po czym przemyto ostatecznie przy użyciu SSC x 2 w tej samej temperaturze. Po naklejeniu bibuł na papier Whatman 3MM i po odpowiednim zaznaczeniu znakowanym atramentem, bibuły pokryto Saran Wrap™ i poddano autoradiografii w ciągu 72 godzin w temperaturze -70°C przy użyciu filmów do promieni X Kodak XAR-5 i kaset X-Omatic /Kodak/ z zastosowaniem ekranów wzmacniających. Znalezione hybrydyzujące fragmenty zestawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Fragmenty hybrydyzujące i ich długość /kbp/ znalezione w genomowym DNA T.reesei przy użyciu fragmentu genu xln A A.tubigensis w charakterze sondy

BamHI	BgIII	EcoRI	SalI
16	18*	18*	6,8*'
13 4,0	9,4 /7,3/ 4,2	4,2	3,8

* - fragmenty hybrydyzujące najsilniej 1 - podwójne pasma // - bardzo słaby sygnał

3. Przeszukewimie bibli obebi genomowej Trichoderma reesei pod kotem genó w spok rewnionych w genem xln A.

Warunki hybrydyzacji wybrane do przeszukania biblioteki genomowej Trichoderma reesei pod kątem genów spokrewnionych z xln A przy użyciu w charakterze sondy fragmentu XhoI/BamHI o długości 900 bp zawierającego gen xln A, jak opisano w przykładzie VI punkty 1 i 2 były następujące· hybr^dyzacj wstępna w SSC x 6, 0,1% SDS, 0,05% pirofosforanu sodowego i 100 pg/ml zdenaturowanego DNA plemników śledzia, temperatura 60°C, 3-5 godzin; następna hybrydyzacja w SSC x 6, 0,1% SDS, 0,05% pirofosforanu sodowego i 100 pg/ml zdenaturowanego DNA plemników śledzia, 57°C, 44 godziny. Następnie stosowano

171 271

2-krotne przemywanie za pomocą SSC x 5 i 0,1% SDS w temperaturze 60°C i dwukrotne przemywanie w SSC x 3 w temperaturze 60°C. Po naniesieniu bibuł na papier i odpowiednim zaznaczeniu znakowanym, radiologicznie atramentem, bibuły pokryto Saran Wrap i naświetlano nimi film do promieni X Kodak XAR-5 w temperaturze 70°C przy użyciu kasety /Kodak/ X-Omatic z zastosowaniem ekranów wzmacniających. Znaleziono około 50 dodatnich sygnałów.

4. Badanie fagów zawierających sekwencje T.reesei spokrewnione z xln A.

z hybrydyzujących klonów bakteriofagowych oczyszczono, jak opisano w przykładzie III, punkt 2 i z wybranych dziewięciu klonów wyizolowano DNA, jak opisano w przykładzie III punkt 3. Fagi badano przez trawienie DNA za pomocą iHincII i HinfI. W oparciu o obrazy hybrydyzacji z analizy Southem’a /przy użyciu w charakterze sondy fragmentu XhoI/BamHI o długości 900 bp znakowanego P³², jak opisano w punkcie 1/ fagi te podzielono na dwie klasy: pięć z badanych fagów - klasa A /fagi #1, #3, #4, #20 i #22, a cztery z nich - klasa B /fagi #10, #16, #X2 i #X3/. Z każdej klasy wybrano jednego faga do dalszej analizy restrykcyjnej: faga # 1 z klasy A i faga # 10 z klasy B. DNA fagów # 1 i # 10 poddano analizie restrykcyjnej przez trawienie BamHI, BglII, EcoRI, i ich kombinacjami i przez pojedyncze trawienie KpnI, SmaI, XhoI, XbaI, SstI, HindIII i PstI. Następnie przeprowadzono analizę Southern’a przy użyciu w charakterze sondy fragmentu XhoI/BamHI o długości 900 bp. Na podstawie obrazów hybrydyzacyjnych do subklonowania wybrano BglII/SalI o długości około 6,5 kb z faga # 1 klasy A i fragment BamHI/BglII o długości około 7,5 kb z faga # 10 klasy B. Fragment Bglll/Sall o długości 6,5 kb wyizolowano i poddano ligacji, jak opisano w przykładzie III, punkt 5 w wektorze pEMBL 18 trawionym BamHI/SalI, otrzymując plazmid pIMO30. E.coli JM 109 zawierającą plazmid pIM030 zdeponowano w Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holandia w dniu 11 lipca 1991 r. pod numerem CBS 420.91.

Fragment BamHI/BglII o długości 7,5 kb wyizolowano i poddano ligacji, trawiono BamHI i wstawiono do zdefosforylo wanego wektora pUC9, otrzymuj ąc pl jaam id oIMO4 1. E.coli JIM 109 zawierającą plazmid pIMO41 zdeponowano w Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holandia w dniu 11 lipca 1991 r.pod numerem CBS 421.91.

Obaplazmidy pIMO30 ipIMO41 poddano dalszej analizie restrykcyjnej w wyniku których opracowano mapy restrykcyjne przedstawione na fig. 19 i 20, odpowiednio.

Zastosowanie białka XYLA w paszach zwierzęcych.

Poniższe dane doświadczalne wykazują wpływ dodatku endoksylanazy w pożywieniu bogatym w odpadki pszenne na zdolność trawienia składników pokarmowych i na wyniki w hodowli. Jednodniowe pisklęta żeńskie hodowano w kurnikach z drucianymi podłogami i karmiono dostępną w handlu paszą dla piskląt, aż do rozpoczęcia doświadczenia. W trzynastym dniu ptaki podzielono losowo na grupy o takiej samej wadze - 18 grup po 8 ptaków w grupie. Zastosowano trzy różne diety doświadczalne. Pożywieniu nadano w bardzo łagodnych warunkach postać ziarenkową i karmiono nim kurczaki w okresie czasu od dnia 13 do 34 /po wylęgnięciu/. W każdej klatce monitorowano co tydzień zużycie paszy i wzrost. Zdolność trawienia mierzono w trzydniowych wydalinach. Stosowano półilościowe zbieranie wydalin. Poszczególne współczynniki zdolności trawienia obliczono dla białka, tłuszczu, surowych włókien i bezazotowych związków wyciągowych przy użyciu wskaźnika /składniki mineralne - popiół - nierozpuszczalne w HCl/. Pozorną energię możliwą do metabolizacji /AME/ każdej diety obliczono według następującego równania:

AME /MJ/kg/ = 17,46(1 + 38,81(2 + 8,0(3 + 16,5a₄ a, = surowe białko gram/kg suchej masy/ x d.c. a2 = surowy tłuszcz /gram/kg suchej masy/ x d.c.

(3 = surowe włókna /gram/kg suchej masy/ x d.c.

(4 = bezazotowe związki wyciągowe /gram/kg suchej masy/ x d.c. d.c. = współczynnik zdolności trawienia.

171 271

Dieta podstawowa oparta była na otrębach pszennych, skrobi kukugydyindęj i na produktach pochodzenia zwierzęcego bogatych w białko. Tę dietę wzbogacono w ndOkksylndnyę w ilościach 36.000 U/kg i 174.000 U/kg oczyszczonej ndokyyΐnnacy /aktywność właściwa: 300.000 U/g/.

Tabela 3

Skład diety podstawowej

Składnik	%
otręby pszenne	40
skrobia kukurydziana	30
kukurydza	4,4
produkty zwierzęce /mączka mięsna, mączka rybna, mączka z piór/	9,7
izolat sojowy /czystość chemiczna 81%/	6,0
olej sojowy	6,0
tłuszcze	0,7
wapień	0,32
orUofosfkgan Jednkwnpdiowy	0,13
aremix /zawierający DL-metioninę i lizynę -HCl/	1,35
wskaźnik-S^/Diamol/	1,4
Obliczona zawartość
AME /MJ/kg/	12,66
surowe białko, %	18,0
lizyna, %	1,2
metionina + cysteina, %	0,9
Zbadana zawartość
surowe białko, %	18,2
surowy tłuszcz, %	9,7
surowe włókna, %	4,1
wskaźnik -S1O2, %	1,07
Ca, %	0,8
P,%	0,85
popiół, %	5,9

Tabela 4

Wpływ dodatku e^oksy^^zy na wyniki hodowli kurcząt 13 do S-t-dniowych

Parametr	Dieta 1 podstawowa	Dieta 2 36.000 U/kg endoksyladnyy	Dieta 3 174.000 U/kg endkkyylannyy
wzrost /g/dyień/50,5 zużycie anyyy	50,5	50,8	51,9
/g/atnk/0yień/	95,6	89,7	92,6
anyzn: przyrost /g/g/	1,89	1,77	1,79

171 271

Tabela 5

Wpływ dodatku endoksylanazy na współczynniki zdolności trawienia /d c./ składników organicznych i obliczone wartości energetyczne diet

Współczynnik zdolności trawienia	Dieta 1 podstawowa jednostek/kg XYL A	Dieta 2 36 000 jednostek/kg XYL A	Dieta 3 174 000 jednostek/kg XYL A
surowe białko, %*	79	82	82
surowy tłuszcz, %	85	91	82
surowe włókna, %	0	11	11
bezazotowe związki wyciągowe, %	73	75	75
AME /MJ/kg/	13,81	14,28	14,28

* ilość azotu w wydalinach została skorygowana biorąc pod uwagę zawartość kwasu moczowego w moczu.

Doświadczenie to obrazuje wpływ dodatku endoksylanazy do pasz dla brojlerów zawierających duże ilości otrębów pszennych. Dodatek ten działał na korzyść, zarówno w wynikach hodowli kurcząt, jak i w wartości energetycznej. Osiągi w zmianie wydajności pasz najwyraźniej odzwierciedlały wpływ dodatku enzymu. Obserwowano tendencję do lekkiego zmniejszenia zużycia paszy w przypadku dodatku enzymu, co było jednocześnie związane z podobnym lub szybszym wzrostem. Tak więc stosunek pasza/przyrost zmniejszył się zasadniczo. Polepszenie wyników hodowlanych wyjaśnia się wpływem dodatku enzymu na współczynniki zdolności trawienia. Wszystkie te współczynniki zmieniały się na korzyść, jednak wzrost zdolności trawienia tłuszczu był najwyraźniejszy, co prowadziło do 3,5% wzrostu wartości energetycznej paszy z dodatkiem enzymu. Nie zaobserwowano żadnej reakcji na dawkę enzymu dla wyżej wymienionych zawartości enzymu w paszy.

Zastosowanie endoksylanazy do wypieku pieczywa.

Upieczono bochenki ze 150 g kawałków ciasta otrzymanego przez zmieszanie 200 g mąki pszennej /100%/, 106 ml wody /53%/, 1,2 g suchych drożdży piekarniczych /0,6%, Gist-brocades N.V., Delft, Holandia/, 4 g NaCl /2%/, 400 mg CaCL₂ x 2H₂O /0,2%/, 10 mg α-amylazy P₂₀₀ pochodzenia grzybowego /Gist-brocades, 2250 SKB/kg mączki/ i różnej liczby jednostek aktywności andoksylanazy /XYL AJ. Po zmieszaniu w ciągu 6 minut i 15 sekund z szybkością 52 obroty/minutę w mikserze, ciasto rozdzielono, odstawiono do wyrośnięcia na 45 minut w temperaturze 31°C, uderzano, odstawiono do rośnięcia na dalsze 25 minut, uformowano i rozwałkowano. Po zakończeniu ostatniego rośnięcia w temperaturze 31°C w ciągu 70 minut, ciasto pieczono przez 20 minut w temperaturze przewyższającej 250°C. Objętość bochenka określono metodą wypierania nasion rzepaku. Wyniki przedstawiono w tabeli 6.

Tabela 6

Cechy pieczywa z dodatkiem różnych ilości endoksylanazy /XYL A/

Aktywność endoksylanazy /jednostki/	Objętość bochenka /ml/	Łamliwość /Rozdrabnialność*	Kruchość*
0	546	6	6
32	560	7	6
128	579	7,5	7
320	609	8	6,5
640	621	7,5	6,5
960	624	7,5	7
2560	618	7,5	7,5

* skala od 1 /najniższa jakość/ do 10 /najwyższa jakość/.

171 271

Z powyższych danychjasno wynika, że wzrost liczby jednostek aktywności endoksylanazy dodanej do ciasta prowadzi do wzrostu objętości bochenków i podwyższenia jakości, jeśli chodzi o takie cechy jak łamliwość i rozdrabnialność oraz kruchość.

Literatura:

Amons, R. /1987/ FEBS Lett., 212, 68 - 72.

Biely, P., Mislovicova, D. i Toman, R. /1985s/ Anal. Biochem, 144, 142 - 146.

Biely, P., Markovic, O i Mislovicova, D. /1985b/ Anal.

Biochem, 144, 147 -151.

Boel, E. i wsp. /1984a/ EMBO J., 3, 1097 - 1102.

Boel, E i wsp. /1984b/ Mol.Cell.Biol., 4, 2306 -2315.

Carre, B. i Brillouet, J.M. /1986/J.Science and Food Agric., 37, 341 - 351.

Chesson, A. /1987/ Recent Advances in Animal Food Nutrition,

Haresign, W. i Cole, D.J.A. wyd. Butterworth. Londyn, 71-89

Cove, D. /1966/ Biochem.Biouhys.Acta 113, 51-56.

Dekker, R.F.A. i Richards, G.M. /1977/ Adv.2arb.2hem. and Biochem, 32, 278 - 353.

Ehrlich, H.A. wyd. /1989/ PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Prews, Nowy Jork

Goosen, T., Blosmhsuvsl, G., Gysler, C., de Bie, D.A., van den Broek, H. W. J., i Swart, K /1987/ 2urr.Gsnet.11, 499 - 503.

Goosen, T., van Engelenburg, F., Debets, F., Swart, K., Bos, K. i van den Broek, H.W.J., /1989/ Mol.Gen.Genet. 219, 282 - 288.

De Graaff, L.H., van den Broek, H.W.J. i Viser, J. /1988/ Curr.Genet., 13, 315 - 321.

Kelly, J. i Hynes M. /1985/ EMBO J. 4, 475 - 479.

Kusters-van Someren, M.A., Samson, R.A. i Visser, J. /1991/ U.K. Curr.Gent. 19, 21.

Laemmli, U.K. /1970/ Nature 227, 680 - 685.

Leathers, T.D., Kurtzman, C.P., Detroy, R.W. /1984/ Biotechnol.Bioeng.Symu., 14, 225.

Maniatis T., E.F. Fritsch, J. Sambrook /1982/ Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nowy Jork.

Matsudaira, P. /1987/ J.Biol.Chem., 262, 10035 - 10038.

McCleary, B.V. i Matheson, N.K. /1986/ Adv.2arb.2hsm. and Biochem., 44, 147 - 276. Messin, J. /1983/ Methods in Enzymology, 10^, 20 - 78.

Moonen, J.H.E., Scheepstra, A., Graveland, A. /1982/ Euphitica, 31, 677.

Mrray, N. /1977/ Mol.Gen.Genet. 150, 53 - 58.

Norrander. J., Kempe, T, i Messing, J. /1983/ Gene, 26,101 - 106.

Poutanen, K. i Puls, J. /1988/ Appl.Microbiol.Biotschnol., 28, 425.

Saiki, R.K. i wsp. /1988/ Science, 239, 487 - 491.

Sanger. F., Nickelen, S. i Coulson, A.R. /1977/ Proc.Natl.

Acad.Sci.USA, 74, 5463 - 5467.

Tilbum, J. i wsp. /1983/ Gene 26,205 - 221.

Vieirra, J. i Messing, J. ?1982? Gene, 19, 259 - 268.

171 271

Visniac, W. i Santer, M. /1957/ Bact.Rev., 21, 195 - 213.

Wemars, K. /1986/ Thesis, Agricultural Umversity Wageningen, Holandia Wong. K.K.Y.i wsp. /1988/Microbiol.Rev.52, 305 - 317.

Woodward, G /1984/ Topics in Enzyme Ferment, Biotechnol. 8, 9 - 30. Yanish-Perron, C., Viera, J. i Messing, J. /1985/ Gene, 33, 103 - 109.

171 271

171 271

BTono środkowa Ściana pierwotna Ściana wtórna

Celuloza Pektyna d-10%) Hemfoeluloza 110-40%) iDrzewnik (5-10%) BiaTko

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania polipeptydu grzybowego o aktywności ksylanazy wykazującej aktywność endo-B(1-4)-D-ksylanazy przy optymalnym pH 3,5-5,5, znamienny tym, ze:

   a) przeszukuje się grzybową bibliotekę genomową sondą hybrydyzacyjną zawierającą sekwencje nukleotydowe zdefiniowane na fig. 8 w ostrych warunkach hybrydyzacji odpowiadających dwu przemywaniom w 5 x standardowego roztworu soli cytrynianu (5 x SSC), 0,1% roztworze siarczanu dodecyl sodu (SDS) w temperaturze 60°C, a następnie dwu przemywaniom 3 x SSC w temperaturze 60°C,

   b) hoduje się zidentyfikowane klony,

   c) wyizolowuje się klonowane sekwencje DNA kodujące polipeptyd o aktywności ksylanazy,

   d) sporządza się konstrukt ekspresji, w którym sklonowana sekwencja DNA jest operacyjnie związana z co najmniej sekwencją promotora i ewentualnie sekwencją liderową wydzielania,

   e) przygotowuje się transformowaną komórkę gospodarza zawierającąkonstrukt ekspresji, przy czym komórkę gospodarza wybiera się z grupy obejmującej drożdże, grzyby i bakterie,

   f) hoduje się transformowaną komórkę gospodarza w temperaturze 0-45°C i przy pH 2-10,

   g) odzyskuje się polipeptyd o aktywności ksylanazy przez wyizolowanie polipeptydu z komórek gospodarza.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się klonowaną sekwencję DNA kodującą polipeptyd o aktywności ksylanazy pochodzącą z rodzaju grzyba wybranego z grupy obejmującej Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora, Fusarium i Trichoderma.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się klonowaną sekwencję DNA kodującą polipeptyd o aktywności ksylanazy pochodzącą z rodzaju grzyba wybranego z grupy obejmującej Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Disporotrichum dimorphosporum i Trichoderma reesei.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się klonowaną sekwencję DNA kodującą polipeptyd o aktywności ksylanazy pochodzącej z grupy obejmującej:

   a) sekwencję zdefiniowaną na fig. 8,

   b) warianty genetyczne sekwencji z punktu a),

   c) sekwencje DNA zdolne do hybrydyzacji z jedną z sekwencji z punktu a) i b) wyżej.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję promotora wybraną z grupy obejmującej sekwencję promotora pochodzącą z genu amyloglukozydazy i sekwencji promotora rodzimej dla genu ksylanazy.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję liderowąwydzielania wybraną z grupy obejmującej sekwencję liderową wydzielania pochodzącą z genu amyloglukozydazy i sekwencji liderowej wydzielania rodzimej dla genu ksylanazy.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako konstrukt ekspresji stosuje się pIM 100 (CBS 322.90).
8. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako konstrukt ekspresji stosuje się pIM 30 (CBS 420.91).
9. 9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako konstrukt ekspresji stosuje się pIM 41 (CBS 421.91).
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się się komórkę gospodarza wybraną spośród rodzajów Aspergillus, Kluyveromyces, Trichoderma, Saccharomyces i Bacillus.

    171 271
11. 11. Sposób według złutrz. 10, znamienny tym, ze komórkę gospodarza wybiera się z grupy odejmującej Aspergillus tudigeniii, Aspergillus nigeo, Aspergillus bwbmaoi, Aspergillus bculeatui, Aspergillus aryybe, Trichoderma reesei, Bacillus sudtilis, Bacillus licheniformis, Kluyveramyces lbctis i Sbccharomyces cerevisiae.