JPH05500907A - 菌類由来のキシラナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、分子生物学の分野に属する。特に、本発明は、キシラナーゼ活性を有 する蛋白質をコードする菌類ＤＮＡ配列のクローニングおよび過剰発現に関する 。また、本発明は、一般に他のキシラナーゼおよび実質的に他の酵素を含まない 形で得られる単一のキシラナーゼの生産方法および使用方法を提供する。

（関連技術） 植物細胞壁の組成は複雑で変化に富んでいる。長鎖のセルロース（植物細胞壁の 主な構造成分）、ヘミセルロース（種々のβ−キシラン鎖を含む）およびペクチ ンの形で主に多糖類が存在する。植物細胞壁の多糖類の発生、分布および構造は 、（１）植物種、（２）変種、（３）組織、（４）成長条件、（５）年齢および （６）成育させる前の植物の処理に依存する。

単子葉植物（たとえば、穀類および草類）および双子葉植物（たとえば、クロー バ−、ナタネおよび大豆）または、植物の種子および成長部分などによって基本 的な差がある（チェソン（Ｃｈｅｓｓｏｎ）１９８７　；カレ（Ｃａｒｒｅ）お よびブリロー）　（Ｂｒｉｌｌｏｕｅｔ）１９８６）。単子葉植物は、主要ヘミ セルロース骨格としてアラビノキシラン複合体を有する。双子葉植物のヘミセル ロースの主な構造は、キシログルカン複合体である。さらに、単子葉植物に比べ て、双子葉植物には高濃度のペクチンが存在する。一般に種子には、ペクチン物 質が豊富にあり、セルロース物質は比較的少ない。

植物細胞の断面図を第１図に示す。細胞壁には、三個はどの相互作用する多糖類 が分布している。

（１）中間ラメラが、外側の細胞壁を形成している。また、これは、植物組織マ トリクス内の個々の細胞の接着点の働きをしている。この中間ラメラは、主に高 度にエステル化したペクチンのカルシウム塩を含んでいる。

（２）第−壁は、中間ラメラの丁度内側に位置している。これは、ペクチン、ヘ ミセルロース、フェノールエステルおよび蛋白質からなるアモルファスマトリク スに埋まった非常に組織化されたセルロースマイクロフィブリルの構造体である 。

（３）第二壁は、植物が成長するに連れて形成する。植物の成長および停滞期に 、セルロースマイクロフィブリル、ヘミセルロースおよびリグニンは、堆積され る。

成熟した代謝的に活発な植物細胞（メソフィルやエビデルミスなど）の第一細胞 壁は、非常にリグニン化の進んだ第二細胞壁よりも酵素的な加水分解を受けやす い。

細胞壁内では、セルロース、ヘミセルロースおよびペクチンが非常に密接に相互 作用している。非常にクロスリンクした多糖類構造よりもむしろこれらの酵素的 分解のほうが複雑な過程である。たとえば、アラビノキシランの完全な分解には 、少なくとも三種類の酵素が必要である。内部の切断は、エンド−β（Ｌ−４） −Ｄ−キシラナーゼで行われる。エフソー（１−４）−Ｄ−キシラナーゼは、多 糖類の非還元末端にあるキシロース単位を放出する。キシラン骨格上の置換物の 攻撃には、他の三個の酵素（α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシ ダーゼおよびアセチルエステラーゼ）が使用される。もちろん、特定の酵素の選 択は、分解する特定のヘミセルロースに依存する（マクレーリ（ＭｃＣｌｅａｒ ｙ）およびマセソン（Ｍａｔｈｅｓｏｎ）、１９８６）。

しかし、使用目的によっては、全ヘミセルロースをモノマーに完全に分解する必 要はない。たとえば、アラビノキシランの液化では、単にキシラン主骨格を短い 単位に切断すればよい。このことはエンドキシラナーゼの作用で行われ、最終的 にキシロースモノマーやキシロビオースおよびキシロトリオースなどのオリゴマ ーの混合物が生成される。これらのより短いサブユニットは、可溶性でこの目的 に十分使用できる。

繊維状菌類が、α−アミラーゼ、プロテアーゼおよびアミログルコシダーゼなど の加水分解酵素およびセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼなどの植 物細胞壁分解酵素を多種多様に分泌することはよく知られている。これらの中に 多（のキシラン分解酵素が確認されており、これらは非常に多くの生化学的およ び物理的特性を有していることが示されてきた。キシラナーゼ機能におけるこの ような不均一性が、目的に適したキシラナーゼの選択を可能にしている（ウオン （Ｗｏｎｇ）等、（１９８８）、ウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ）（１９８４ ）およびデツカ−（Ｄｅｋｋｅｒ）およびリチャーズ（ＲｉｃｈａｒｄｓＸ１９ ７７））。

種々の分子量のキシラナーゼが、アスペルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌ± ｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、クロストリジウム　サーモセラム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉれ ることが知られている。

これとは反対に、イーストではキシラナーゼの多様性が見られない。三種のイー スト　トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、クリプトコツカス（ｐｒ ｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびオレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓ　ｉｄｉｕ ｍ）において、わずか１種のキシラナーゼが検出されている。

自然界では、微生物のキシラナーゼは、通常、エクソアラビナナーゼ、アセチル エステラーゼおよびセルラーゼなどの多糖類分解活性を持つ他の酵素とともに生 産される。目的によっては、これらの酵素は必要ではないか、または、無いほう がよい。

目的の酵素生産に適した醒酵条件は、様々である事が知られている。また、目的 酵素をコードする遺伝子のクローニングおよび天然の宿主または他の適合宿主に おけるその過剰生産で、目的の酵素生産を特に増加させることができることが知 られている。もしも、目的の酵素が、不都合な他の酵素を含まない形で得られる なら、後者の方法は特に有用である。

細菌性の組み換えキシラナーゼの発現は、ヨーロッパ特許出願１２１，１３８に 報告されている。細菌性キシラナーゼをコードする遺伝子をバチルス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ）の染色体から単離し、大腸菌宿主内で発現させる。しかし、大腸菌発 現宿主は、トキシンなどの許容できない副産物の生産ために、組み換えＤＮＡ法 で蛋白質を生産するのは安全ではないと考えられている。

バクテリアの遺伝子には、イントロンが含まれていないので、原核性宿主におけ るこれらの遺伝子のクローニングおよび発現にはほとんど問題がない。一方、真 核性遺伝子の発現はいつも簡単に行くとは限らない。真核生物から単離した遺伝 子には、イントロンが含まれていることが知られている。基本的にこの事が、こ れらの遺伝子のクローニングおよび発現を複雑にしているので、原核性宿主を使 用することが好ましい。

さらに、一般に菌類のキシラナーゼとバクテリアのキシラナーゼの物理的性質は 異なる。一般に、菌類のキシラナーゼの至適ｐＨは、３．　５−５．　５の範囲 にあり、バクテリアのキシラナーゼの至適ｐＨは、５．　０−７．　０の範囲に ある。

また、一般に菌類のｐＨ安定性の範囲は（ｐＨ３−１０）　、バクテリアのもの に比べて（ｐＨ５，０−７，５）広い。一般に、菌類のキシラナーゼの至適温度 は、５０℃である。バクテリアのキシラナーゼは、一般に５０−７０℃の至適温 度範囲を有する。キシラナーゼの詳細な物理的性質については、ウオン（Ｗｏｎ ｇ）等（１９８８）　、ウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ）（１９８４）および リチアーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）（１９７７）参照。

このように、たとえば、より低いｐＨ条件が要求されるプロセスに使用するには 、バクテリアのキシラナーゼは適さないことは明らかである。別に、バクテリア のキシラナーゼは、ビールの貯蔵などの用途に関しては熱的に不安定である（ヨ ーロッパ特許Ｎｏ、２２７，１５９）。

従って、菌類由来のキシラン分解酵素をコードする遺伝子を単離し、別の高生産 微生物発現宿主に導入して発現させることが重要となる。

（発明の概要） 本発明は、キシラン分解活性を有する蛋白質をコードする菌類から精製単離した ＤＮＡ配列を提供する。これらのＤＮＡ配列には、キシラナーゼコード配列およ び好ましくはその５°および３′側の調節配列が含まれる。

また、本来の調節配列、または別の態様では適当な発現宿主中でキシラナーゼ蛋 白質の過剰発現を指令しうる、プロモーター、分泌用リーダーシグナルおよびタ ーミネータ−シグナルなどの選択された調節領域と機能的に結合したキシラナー ゼコード配列を用いた微生物におけるキシラナーゼコード配列の過剰発現用の構 築物を提供することも本発明の目的である。

さらに、菌類由来のキシラナーゼの過剰発現、および望ましい場合はその分泌を 行いつる本発明の発現構築物でトランスホームした微生物発現宿主を提供するこ とも本発明の目的である。

また、工業プロセスでもうまく使用できる目的のキシラナーゼの生産方法を提供 することも、本発明の目的である。一般に、これらの工業で必要とされるのは、 バクテリア由来のキシラナーゼがうま（働＜ｐＨ範囲よりも低いｐＨ条件でのキ シラナーゼ活性である。

（図面の簡単な説明） 第１図：植物細胞の断面図。

第２図：アスペルギラスニガ−（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）ＤＳ１ ６８１３　（ＣＢＳ３２３．９０）由来の培養濾液のＨＰＬＣ溶出パターン。こ 第３図：アスペルギラス　ッピゲンシスＸＹＬ　Ａタンパク質のＮ末端アミノ酸 配列から設計したオリゴヌクレオチドプローブＡＢ８０１−ＡＢ８０６　（配列 式第４図：Ｓ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８エンドペプチダーゼによる切断 で生じるアスペルギラス　ッピゲンシスＸＹＬ　Ａタンパク質の内部の１９ｋＤ ａフラグメントのＮ末端アミノ酸配列から設計したオリゴヌクレオチドプローブ ＡＢ１２５５　（配列式２）。

第５図：バクテリオファージラムダｘｌｎ３のサザンプロット分析から誘導した ｘｌｎ　Ａ遺伝子を含むゲノム領域の制限地図。そのハイブリダイズフラグメン トと長さが示しである。

第６図：アスペルギラス　ツビゲンシスｘｌｎ　Ａ遺伝子をシーケンシングする 戦略。矢印は、シーケンシングの方向と数を示している。

第８図：アスペルギラス　ツビゲンシスｘｌｎ　Ａ遺伝子のヌクレオチド配列。

イントロンおよびプロペプチドの位置は、推定したものである。

第９図ニドランスホーマントＴｒｘ２およびＴｒＸ９により発現されるＸＹＬＡ タンパク質を示すザイモグラム。

第１０図：アスペルギラス　ニガーＣＢ５５１３．　８８　（Ａ）およびアスペ ルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ　１ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）Ｎ５９　（Ｂ）に おけるＸＹＬ　Ａタンパク質の発現を示す５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動。

第１１図：ＣＢＢ（Ａ）およびＲＢＢ−キシラン重層（Ｂ）で染色したアスペル ギラス　ニガーＣＢ５５１３．８８トランスホーマントナンバー１Ｏ１２９およ び１．　１によって発現されたＸＹＬ　Ａタンパク質を示す非変性勾配ＰＡＧＥ 。

ＤＮＡ挿入物は、アスペルギラス　ニガー由来の全アミログルコシダーゼ（ＡＧ ）遺伝子を含む。

第１４図：ボリメラーゼチェーソリアクションで行うＡＧプロモーター／キシラ ナーゼ遺伝子融合の模式図。

第１５図：中間プラスミドｐＸＹＬ２ＡＧの構築経路。（略号：第１２図参照） 第１６図：中間プラスミドｐＸＹＬ２の構築経路。（略号：第１２図参照）第１ ７図：中間プラスミドｐＸＹＬ３ＡＧの構築経路。（略号：第１２図参照）第１ ８図：中間プラスミドｐＸＹＬ２の構築経路。（略号：第１２図参照）第１９図 ：　ｐＥＭＢＬｌ　８　（ｐＩＭＯ３０）にクローン化したトリコデルマ　リダ イズフラグメントを示す。

第２０図：　ｐＵＣ９（ｐ　ＩＭＯ４１）にクローン化したトリコデルマ　リー セイ由来の７．５ｋｂＢａｍＨＩ／Ｂｇｌｌ　！フラグメンの部分制限地図。斜 線ボックスは、挿入物内のハイブリダイズフラグメントを示す。

（発明の詳細な説明） 本発明は、キシラナーゼ及びその遺伝的変異体をコードする菌類から精製単離し たＤＮＡ配列について述べている。このＤＮＡ配列は、キシラナーゼコード配列 およびその隣接する５°および３゛側調配列を含むことか望ましい。遺伝的変異 体には、同種または異種の生物に由来するプロモーター、分泌シグナルおよびタ ーミネータ−シグナルなどの調節領域とカップルしたキシラナーゼコート１列を 含むハイブリッドＤＮＡが含まれる。また、遺伝的変異体には、キシラナーゼの キシラン分解活性を維持する変異キシラナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配 列および縮退ＤＮＡ配列が含まれる。また、本発明には、キシラナーゼコードＤ ＮＡ配列および先に述べた遺伝的変異体にハイブリダイズしうるが、遺伝子コー ドの縮退、または種交差変異によりコドン配列が異なるＤＮＡ配列も含まれる。

また、本発明は、望ましい発現宿主において目的のキシラナーゼを発現させるＤ ＮＡ構築物を提供する。この発現構築物には、同種または異種の生物由来のプロ モーター、分泌シグナルおよびターミネータ−シグナルなどの調節領域で、適当 な宿主中そのキシラナーゼコードＤＮＡ配列がコードする酵素を過剰生産させつ る領域と機能的に結合したキシラナーゼコード領域を含む／シブリッドＤＮＡ配 列が含まれる。この発現構築物は、選択された発現宿主のゲノム中に組み込まれ ることが望ましい。

さらに、本発明は、目的のキシラナーゼを発現するためのＤＮＡ構築物を微生物 宿主へ導入することによる微生物宿主のクローニングおよび、またはトランスホ ーメーションを目的としたベクター、好ましくはプラスミドを提供する。

さらに、本発明は、先に述べたＤＮＡ構築物でトランスホームした同種または異 種の宿主に関する。微生物発現宿主は、バクテリア、イーストまたは菌類から選 択される。

本発明においてご同種（ｈｏｍｏ　ｌｏｇｏｕｓ　）”という言葉は、調節領域 も含めて目的のキシラナーゼをコードするＤＮＡ配列を本来持っているもの全て を意味する。

同種宿主は、このようなりＮＡ配列を単離できる種と定義する。

従ってご異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｓ）”という言葉は、調節領域を含めてそ れ自体目的のキシラナーゼをコードするＤＮＡ配列を本来有していないもの全て を意味する。”異種”宿主とは、キシラナーゼコード遺伝子を単離するものとは 異なる微生物種と定義する。

本発明の範囲内で、目的のキシラナーゼには、繊維状菌類によって天然に生産さ れる全てのキシラン分解酵素が含まれる。特に興味深いキシラナーゼは、アスペ ルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ジスボロトリカム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒ ｉｃｈｕｍＬペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅ ｕｒｏｓｐｏｒａ）　、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）およびトリコデルマ（ Ｔｒｉ　ｃｈｏｄｅｒｍａ）属に属する繊維状菌類によって生産されるものであ る。また、アスペルギラス　ニガー、アスペルギラス　アワモリ（Ａｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉＬアスペルギラス　アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉ 　１１ｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギラス　ツビゲンシス、ジスボロ トリカム　ジモルフォスポラム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｄｉｍｏｒｐ ｈｏｓｐｏｒｕｍ）およびトリコデルマ　リーセイ由来のキシラナーゼは、特に 好ましい。さらに、アスペルギラス　ツビゲンシスおよびトリコデルマ　リーセ イ由来のキシラナーゼは、もっとも好ましい。

本発明には本質的ではないスポットテスト検定法などの検定法で、目的のエンド キシラナーゼが同定できる。この方法にしたがってエンドキシラナーゼを生産す るよう誘導された（たとえば、オートスベルトキシランを用いて）微生物の培養 物の濾液のエンドキシラナーゼ活性を検定する。溶出フラクションの液適を、ク エン酸−燐酸バッファ（実施例１．　１参照）およびオートスベルトキシランを 含む寒天フィルター状に滴下する。このフィルターをインキュベーションしたの ち、もしキシラナーゼ活性があるなら、寒天フィルター状の各液適の位置が透明 に見える。

一度目的のキシラナーゼが同定されれば、そのキシラナーゼをコードするＤＮＡ 配列は、その菌類をキシラン含有培地中で培養し、カラムクロマトグラフィーな どの従来法で目的のキシラナーゼを単離しくたとえば、ＨＰＬＣ−第２図参照） 、その精製したタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を決定することによ り、天然でその酵素を生産する繊維状菌類から得ることが出来る。

その後、その部分的アミノ酸配列に基づき、オリゴヌクレオチドを合成してＤＮ Ａプローブを調製する。アミノ酸配列は、完全なタンパク質のＮ末端および、ま たは完全なタンパク質のプロテアーゼまたは化学的分解により生じたペプチドフ ラグメントのＮ末端から決定する。一度ＤＮＡプローブが出来れば、これを用い てゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。

もし、この方法がうま（行かないなら、非誘導および誘導細胞由来のｍＲＮＡか ら得られるｃＤＮＡプローブを用いて、ゲノムライブラリーをスクリーニングす る。誘導性ｍＲＮＡは、炭素源としてキシランを含む培地で増殖した細胞から調 製する。一方、非誘導性ｍＲＮＡは、たしえば、グルコースなどキシラン以外の 炭素源で増殖した細胞から調製しなければならない。誘導性ｃＤＮＡプローブと ハイブリダイズするクローンのうち、目的のキシラナーゼを含むクローンを回収 する。別に、関連するキシラナーゼ配列とクロスハイブリダイゼーションさせる ことにより、キシラナーゼ遺伝子を同定する（実施例７参照）。

菌類の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えば５ａｕ３Ａで部分消化し、そのフ ラグメントを適当なプラスミド、またはラムダファージベクター、たとえばラム ダＥＭＢＬ３にクローニングする事によりゲノムライブラリーを調製する。続い て十分な量のコロニー、またはプラークをブレーティングしてから適当なりＮＡ プローブでこのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。

あるいは、適当なファージベクター、たとえばラムダｇｔｌＯまたはラムダｇｔ ｌｌにキシラナーゼ合成を誘導した菌類細胞から単離したｍＲＮＡから合成した ｃＤＮＡをクローニングする事によってもｃＤＮＡライブラリーが調製できる。

このｃＤＮＡライブラリーは、ＤＮＡプローブを用いて、又は、免疫学的手段や プレート検定法によってスクリーニングする。

本発明の好ましい態様では、アスペルギラス　ツビゲンシス培養濾液から精製し た見かけの分子量２５ｋＤａのキシラナーゼのＮ末端アミノ酸配列（第３図、配 列式ｌ参照）、および、または、スタフィロコッカス　オーレウス（Ｓ　ｔ　ａ 　ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のエンドプロテアーゼＶ８によるキ シラナーゼの消化で得られる内部ペプチドフラグメントのアミノ酸配列（第４図 、配列式２参照）からオリゴヌクレオチドプローブを設計する。第３図および第 ４図に示したオリゴヌクレオチド混合物は、対応する誘導キシラナーゼｍＲＮＡ に相補的である。アスペルギラス　ニガーＤＳ１６８１３から単離したＤＮＡの 旦且ｕ３Ａ部分消化物から調製したラムダＥＭＢＬ３ライブラリーの、Ｎ末端オ リゴ混合物ＡＢ８００　（ＡＢ８０１乃至ＡＢ８０６の等量混合物（第３図参照 ）によるスクリーニングから、四個のポジティブクローンが得られた。後に、ア スペルギラス　ツビゲンシスに再分類された（クスタースーバン　ソメレン（Ｋ ｕｓｔｅｒｓ−ｖａｎ　Ｓｏｍｅｒｅｎ）等、（１９９１）　）アスペルギラス 　ニガーＤ８１６８１３は、１９９０年７月２０日、オランダ、バーン、セント ラル　ビューロー　ボア　シメルカルチャーに、ＣＢ５３２３．９０として登録 した。

四個のファージクローンから単離したＤＮＡは、Ｎ末端オリゴ混合物とも内部フ ラグメントのアミノ酸配列由来のオリゴ混合物ともハイブリダイズした（第４図 参照）。制限酵素分析により、これら全てのクローンはアスペルギラス　ツビゲ ンシスの同じゲノム領域由来のＤＮＡを含んでいることが分かった。

両方のオリゴ混合物とハイブリダイズする約２．ｌｋｂの領域の配列を決定した 。第８図に示したこのヌクレオチド配列には、６８１ｂｐのキシラナーゼコード 配列（部位１１７９乃至１２３０の４９ｂｐ小さなイントロンにより分断されて いる）および各々９４９および４２３ヌクレオチドの５′および３′隣接領域の 配列が含まれている。

また、精製したキシラナーゼタンパク質のなかに変異体も発見された。これらの キシラナーゼのＮ末端には、三種類のバラエティ−があることが分かりた。これ は、おそらく培養条件の違いによるものであろう。これらのキシラナーゼの約三 分の−は、Ｎ末端アミノ酸がセリンであり（第８図、部位ｌ）、別の三分の−は 、Ｎ末端アミノ酸がアラニンであり（第８図、部位２）、残りのタンパク質のＮ 末端アミノ酸は、グリシンである０１図、部位３）。

キシラナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列が手に入ったことで、部位特異 的突然変異誘発を用いて変異キシラナーゼの構築が可能になった。もし、キシラ ナーゼの三次元構造が分かれば、そして、その触媒ドメインおよび基質結合ドメ インの位置が分かれば、もっとも触媒活性や基質結合性に影響するアミノ酸に突 然変異を起こすことが出来る（たとえば、コンピュータモデルの助けを借りて） 。

もしも、このタンパク質の三次構造が分からない場合は、全コード配列に渡った ランダム変異体を生成することもできるし、また、他の微生物から単離した同様 のキシラナーゼとの比較から、このタンパク質の三次元構造を予測することもで きる。

一つ以上の異種調節領域を含む発現構築物に、キシラナーゼコード配列を含むＤ ＮＡフラグメントを挿入するために、キシラナーゼコード配列の５′および３′ 末端に適当な制限部位を導入するポリメラーゼチェーソリアクション（ＰＣＲ） （アーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）、Ｈ，Ａ、（編）、１９８９）を行う。制限部位 の選択は、発現ベクター、すなわち、そのＤＮＡ分子中の他の制限部位の存在に 依存する。

本来（同種）の生産種、または、他の菌類株中でキシラナーゼタンパク質を過剰 発現させるために、その５′および３′調製領域を含む完全な遺伝子を含む６． ９ｋｂ　Ｓａ±Ｉフラグメント（第５図参照）、または他の遺伝子の調節領域に 融合した完全な遺伝子を選択した発現宿主に導入し、その遺伝子のコピー数、結 果的にタンパク質発現を増加させる。

もし、異種発現宿主が好ましく、イーストやバクテリアを選択する場合は、ゲノ ムフラグメント上に存在するスプライスシグナルが、異種宿主に認識されない可 能性を回避するために、異種発現ベクターの構築には介在配列のない（イントロ ンのない）ＤＮＡ配列を用いる。この介在配列のないＤＮＡ配列は、キシラナー ゼの合成のため誘導した細胞から単離されるｍＲＮＡから構築されたｃＤＮＡラ イブラリーから得られる。このライブラリーを先に述べたオリゴヌクレオチドま たはｃＤＮＡプローブでスクリーニングする。それとは別に、介在配列のないＤ ＮＡ配列は、キシラン誘導細胞のＲＮＡから合成した第−鎖のｃＤＮＡに関する 適当な５′および３′オリゴヌクレオチドを用いたポリメレースチェーソリアク ションで得られる。

本発明における過剰発現とは、通常の同種野生型生物以上のレベルの目的キシラ ナーゼの発現と定義する。同様に、過剰発現とは、目的のキシラナーゼをコード するＤＮＡ配列を異種発現宿主に導入しないかぎり通常そのようなキシラナーゼ を発現しない異種生物における目的のキシラナーゼの発現も含まれる。また、も ちろんこれら発現宿主の子孫も本発明の範囲に含まれる。

また、目的のキシラナーゼの過剰発現は、発現増加および望ましい場合は選択さ れた宿主からの蛋白質の分泌レベルの増加を促進する、および、または目的のキ シラナーゼの発現の誘導可能なコントロールを提供する異種調節領域、たとえば 、プロモーター、分泌リーダーおよびターミネータ−領域の選択によっても達成 される。

目的のキシラナーゼ本来のプロモーターとは別に、他のプロモーターを用いてそ の発現を行うこともできる。プロモーターは、望ましい宿主における目的キシラ ナーゼの発現の効率から選択する。

別の態様では、構成的プロモーターを選んで、比較的他のキシラナーゼを含まな いキシラナーゼを発現させた。このような構築物は、誘導基質として固体のキシ ランを含む培地で発現宿主は培養する必要がないことから有利である。

菌類発現宿主で用いるのに好ましい強力な、および、または誘導可能なプロモー ターの例には、ＡＴＰ−シンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉｃ）、トリオー スホスフェートイソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ Ａ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）　、アミログルコシダーゼ（ＡＧ）　、アセト アミダーゼ（ａｍｄｓ）およびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロ ゲナーゼ（ｇ　ｐ　ｄ）プロモーターがある。

強力なイーストプロモーターの例には、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクター ゼ、３−ホスホグリセレート　キナーゼおよびトリセホスフエート　イソメラー ゼ　プロモーターがある。

強力なバクテリアプロモーターの例には、α−アミラーゼおよび５ｐｏ２プロモ ーターおよび細胞外プロテアーゼ遺伝子のプロモーターがある。

また、うまいことにハイブリッドプロモーターを用いて、発現構築物の誘導調節 を改善することが出来る。

本発明のプロモーターには、アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子由来のプロモ ーターおよび本来のキシラナーゼプロモーターを使用することが好ましい。

しばしば、目的のキシラナーゼは、発現宿主からこれを簡単に回収できる培養培 地に分泌されることが望ましい。

本発明にしたがい、目的のキシラナーゼの本来のリーダー配列を用いて、発現さ れるキシラナーゼを分泌させることが出来る。

しかし、しばしばキシラナーゼの発現の増加は、発現宿主がプロセシングおよび 分泌しうる量を凌駕し、細胞壁を通過する蛋白質の通過が遅れることから細胞中 に蛋白質産物が蓄積してしまう。したがって、本発明は選択した発現宿主からの キシラナーゼの十分な分泌を提供する異種リーダー配列も提供する。

本発明にしたがい、望ましい発現宿主に基づいて分泌リーダーを選択する。その 発現構築物の他の調節領域と同じ異種分泌リーダーも選択しつる。例えば、非常 に分泌性の高いアミログルコシダーゼ蛋白質のリーダーはアミログルコシダーセ プロモーターと組み合わせて、また、同様に他のプロモーターと組み合わせて使 用することが出来る。また、ハイブリッドシグナルも本発明に使用するのに適し ている。

好ましい異種分泌リーダー配列の例には、アミログルコシダーゼ遺伝子（菌類） 、α−因子遺伝子（イースト）またはα−アミラーゼ遺伝子（バチルス）由来の ものがある。

本発明に関してもっとも好ましい分泌リーダー配列は、アミログルコシダーゼ（ ＡＧ）遺伝子および天然のキシラナーゼリーダー配列由来のものである。

一般に、遺伝子の過剰発現に関してターミネータ−は重要な因子ではないと考え られている。望ましい場合は、ターミネータ−は、プロモーターと同じ遺伝子か ら選択するか、または、同種のターミネータ−を使用する。

先に述べたゲノムフラグメントに加えて、トランスホームＤＮＡには、非トラン スホーム細胞から目的遺伝子を組み込んだ細胞を区別する選択マーカーが含まれ る。適当な５′および３′側調節配列とともに、この選択マーカーは、目的の遺 伝子を含む同じＤＮＡ上にあるか、もしくは別の分子上に存在する。後者の場合 、コトランスホーメーションを行わなければならない。この発現ベクター／選択 ベクターの比は、目的のキシラナーゼの発現構築物を含むベクターを組み込んだ トランスホーマントが、高効率で選択されるように調整しなければならない。

工業用微生物にもっとも適した選択システムは、宿主に突然変異を必要としない 選択マーカ一群から形成されるものである。菌類選択マーカーの例には、アセト アミダーゼ（ａｍｄＳ）　、ＡＴＰシンセターゼ、サブユニット９（ｏｌｉｃ） およびベノミル耐性（ｂｅｎＡ）の遺伝子がある。非菌類選択マーカーの例には 、Ｇ４１８耐性遺伝子（イースト）、アンピシリン耐性遺伝子０届菌）およびネ オマイシン耐性遺伝子（Ｂａｃ　ｉ　１１ｕｓ）がある。

一度望ましい発現構築物が出来れば、それを大腸菌などの適当なりローニング宿 主にトランスホームして、その構築物を増幅する。その後、この発現構築物を、 好ましくはそれがゲノムに組み込まれる適当な発現構築物に導入する。バチルス 種などの特定の宿主をクローニングおよび発現宿主として用いて、余計なトラン スホーメーションステップを回避することもできる。

本発明にしたがい、種々の発現宿主を用い目的のキシラナーゼを過剰発現するこ とが出来る。ある態様では、同種の発現宿主が用いられている。これには、キシ ラナーゼコードＤＮＡ配列を単離した株に、遺伝子コピー数が多いか、または先 に述べた異種調節領域のコントロール下の、またはその両方の望ましい発現構築 物を導入する。

別の態様では、目的のキシラナーゼは、バクテリア、イーストまたは菌類などの 異種宿主中に適当な調節領域のコントロール化の目的キシラナーゼをコードする ＤＮＡ構築物を導入および発現させることにより過剰発現させる。この目的のた め、目的のキシラナーゼをコードするＤＮＡ配列は、異種宿主由来のプロモータ ーおよびターミネータ−配列のコントロール下で発現させることが望ましい。

さらに、産物を十分に発現および分泌させるために、発現宿主と同種のリーダー 配列で、目的のキシラナーゼの天然の分泌リーダー配列を置き換えることが必要 である。

目的のキシラナーゼの大きさＣト子量）、グリコジル化の必要性または細胞外へ の分泌の必要性などの因子は、発現宿主の選択に重要である。

異種遺伝子発現用の宿主として、ゲノム陰性菌の大腸菌が広く使用されているが 、細胞の内部に大量の異種蛋白質を蓄積してしまう。大腸菌の内部から目的の蛋 白質を精製するのは困難な場合がある。

大腸菌とは異なり、培地中に蛋白質を分泌できる異種宿主として、バチルス属の バクテリアが適している。

これとは別に、イーストまたは菌類から選択した異種宿主も好ましい。一般に、 イーストは、取扱が簡単なことから菌類よりも好ましい。しかし、イーストから は蛋白質が分泌されに（いか、もしくは、プロセシングされないこともある（イ ーストのハイパーグリコジル化など）。このような場合、菌類宿主を選択する。

また、クルイベロミセス　ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉ ｓ）などの通常このような蛋白質を生産しない宿主を選択することにより、実質 的に他の多糖類分解酵素を含まない目的のキシラナーゼを生産する異種宿主を選 択する。

本発明に範囲内にある好ましい発現宿主の例には、アスペルギラス種（ＥＰ１８ ４．４３８およびＥＰ２８４．６０３）およびトリコデルマ種などの菌類、クル イベロミセス種（ＥＰ９６．４３０およびＥＰ３０１．６７０）およびサツカロ ミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種などのイーストがある。

特に、アスペルギラス　ニガー、アスベルギラス　アワモリ、アスペルギラスア クリータス、アスペルギラス　ツビゲンシス、アスペルギラス　オリザエ（Ａｓ ｐｅｒｇｉ　１ｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ　リーセイ、枯草菌セス 　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択 することが望ましい。

目的のキシラナーゼの過剰発現は、キシラナーゼ発現構築物でトランスホームし た発現宿主を従来の醒酵栄養培地中で培養することにより行う。醗酵培地は、炭 素源（たとえば、グルコース、マルトース、糖蜜など）、窒素源（たとえば、硫 酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど）、有機窒素源（た とえば、イーストイクストラクト、モルトイクストラクト、ペプトンなど）およ び無機栄養源（たとえば、燐酸、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、など）を 含む通常の培養培地である。場合によっては、インジューサー（たとえば、オー トスベルトキシランなど）を含める。

適当な培地の選択は、発現宿主の選択、および、または発現構築物の調節に必要 な条件に基づく。このような培地は、当分野でよく知られているものである。

必要ならば、この培地に、他の潜在的な混入微生物よりもトランスホームした発 現宿主を優先する付加的成分を含める。

醗酵は、温度範囲０−４５℃、ｐＨ範囲２−ＩＯ、バッチまたはフエドーバッｐ Ｈ３−９である。適当な条件は、発現宿主に基づいて選択する。

醗酵後、遠心または濾過に寄って醗酵培地から細胞を除去する。その後、目的の キシラナーゼを回収するが、望ましい場合は、従来法でこれを精製単離する。

この産物を液体、または乾燥状態で成形する。使用法によっては、この酵素を固 体マトリクスに固定する。

本発明にしたがって生産した目的のキシラナーゼは、単独または他の酵素と組み 合わせてキシラン分解酵素の作用を必要とするいろいろなプロセスに使用する。

さらに、本発明の菌類キシラナーゼは、一般にバクテリア由来のキシラナーゼよ りも低い至適ｐＨ値を持っており、低いｐＨで行われる工業プロセスで使用する のに適している。

本発明にしたがって生産したキシラナーゼは、製パンに使用できることが分かっ た。小麦に小量のキシラナーゼを添加することにより、生パンおよびパン自体に パン容積の増加や切れおよび内部の品質など構造上の優れた特性を与える。

また、アラビノキシランやグルコキシランに富む動物飼料組成物にキシラナーゼ を添加する。大麦、小麦、トウモロコシ、ライ麦またはオーツ麦などの穀物また は小麦のふすままたはトウモロコシのふすまなどの穀物副産物を含む単胃動物（ たとえば、ブタや家禽）用の飼料（牧草も含む）にこの酵素を添加したとき、有 意に植物細胞壁の分解が促進され、これらの植物性栄養がより効率よく利用され るようになる。結果として、成長速度、および、または飼料転換率が向上する。

さらに、キシラナーゼを用いてキシランを含む飼料の粘土を低下することが出来 る。

もし、ブレソーキング、または湿潤飼料が好ましい場合は、予めキシラナーゼを 飼料または牧草に添加する。しかし、本発明を用いて生成したキシラナーゼを飼 料に添加したとき、これは飼料中のキシランを加水分解しつづける。一般に低い 至適ｐＨ値を有する菌類キシラナーゼは、キシラナーゼ補填飼料を摂取する動物 の胃などの酸性環境において重要な栄養物を放出しうる。

本発明にしたがって生成したキシラナーゼは、林檎蒸留廃棄物を微生物バイオマ スに生転換するプロセスにおいて濾過効率を改善したり、また培地から溶解して いる有機物を除去するのに有効である。繊維状菌類由来のキシラナーゼもこのプ ロセスでうまく働（。　また、本発明にしたがい、まず粗穀物澱粉にα−アミラ ーゼを作用させ、ついで本発明にしたがって生成した菌類キシラナーゼに作用さ せ、最後に加水分解することにより、粗穀物澱粉から濾過性が向上し、および、 または粘性が低下したグルコースシロップが生成される。同様に、ビール醸造に 本発明のキシラナーゼを使用して、ウォルトの濾過性が改善される。

また、キシラナーゼを使用してクラフトバルブからリグニンを除き、紙製品に必 要な塩素の量を減らすことにより漂白が可能となる。

さらに、本発明にしたがって生成したキシラナーゼは、フルーツまたは野菜ジュ ースの製造における収量の増加、微生物の培養培地に使用しうる分解物を生む糖 ビートパルプの酵素的分解、コーンコブス、小麦の藁、粉末のナツツの殻などの 農業残査の酵素的分解、および廃棄紙などのリサイクル出来る物質の酵素的分解 などの別のプロセスにも使用できる。

以下の実施例は、本発明の完全な公開とその実施および利用法を当業者に提供す るものであり、本発明の範囲を制限するものではない。ここで使用する数字（た とえば、量、温度、ｐＨなど）の正確性には細心の注意を払ったが、いくらかの 実験誤差や揺らぎを考慮しなければならない。特筆しないかぎり、温度は℃で示 し、圧力は大気圧付近とする。（実施例１）アスペルギラス　ツビゲンシスエン ドキシラナーゼＸＹＬ　Ａの精製と特性（実施例１．Ｉ）アスペルギラス　ツビ ゲンシス　エンドキシラナーゼＸＹＬＡの精製 アスペルギラス　ニガーＤＳＩ６８１３　（ＣＢＳ３２３．９０−後に、アスペ ルギラス　ツビゲンシス種に再分類された。クスタースーバン　ソメレン（Ｋｕ ｓｔｅｒｓ−ｖａｎ　Ｓｏｍｅｒｅｎ）等、　（１９９１）　）を、■リットル 当たり３０ｇのオートスベルトキシラン（シグマ）　；７．　５　ｇ　Ｎ８４　 ＮＯｓ　。

０．５ｇ　ＫＣＩ、０．５ｇ　Ｍｇ５Ｏａ、１５ｇ　ＫＨｚＰＯ４，および０． ５ｇ　イーストイクストラクトを含む培地（ｐＨ６，０）中で培養することによ り、培養濾液を得た。この培養濾液を約３５ｍ１にまで濃縮し、ついでこれを５ ０ｍ１アミコンモジユール中のシアフロＰＭＩＯフィルターで限外濾過して脱塩 した。

この上清を１０ｍ１まで濃縮し、２５ｍＭ）リス−ＨＣｌバッファ（ｐＨ７，０ ）２５ｍｌで二回洗浄した。洗浄後、その溶液の容積を２５ｍ１とした。

この溶液１ｍｌを、シンクロバクＡＸ３００カラム（１０Ｘ２５０ｍｍ）にかけ 、以下のＨＰＬＣ条件で溶出した。

溶出速度：２ｍｌ／ｍｉｎ。

溶出バッフ＝Ａ：２５ｍＭトリス−ＨＣｌ　Ｉ）Ｈ７，０溶出バツフｙＢ　：　 ２５ｍＭ）リス−ＭＣＩ　ｐＨ７，０＋１Ｍ　ＮａＣ１溶出勾配：　時間　％Ａ 　％Ｂ 各１ｍｌのフラクションを回収した。溶出蛋白質の検出は、２８０　ｎｍのＵＶ 吸収の連続測定で行った。溶出パターンを第２図に示す。

スポットテストにより各フラクションのエンドキシラナーゼ活性を検定した。

このスポットテストでは、まず、１８０ｍｇの寒天（Ｄｉｒｃｏ）に０．５％オ ートスベルトキシラン（Ｓｉｇｍａ）を含む１２ｍ１のクエン酸−燐酸バッファ （９００ｍｌの０．２Ｍ　Ｎａｔ　ＨＰＯａと１２５ｍ１の０．５Ｍ　クエン酸 を混合し、０゜５Ｍ　クエン酸または０．２Ｍ　ＮａｔＨＰＯ＋を用いて、その 溶液のｐＨを５．６に調整することによって調製する）を加え、１００℃に加熱 した寒天を完全に溶かす。６０℃に冷却後、その寒天混合物をアガロースゲルボ ンドフィルムに均等に注ぐ。溶出フラクションの液滴をそのフィルム上に置き、 ３０℃で３０分インキュベートする。もし、エンドキシラナーゼ活性が存在する なら、寒天フィルム上の液滴の位置が透明になる。

回収したフラクション中の全キシラナーゼ活性は、基質としてオートスベルトキ シランの５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５，０）を用いたレザース（Ｌｅａ ｔｈｅｒｓ、１９８４）等のマイクロアッセイにより、所定の時間内に生産され る還元糖の量を測定することで定量した。また、活性単位は、レザース化ｅａｔ ｈｅｒｓ）の定義にしたがった。

溶出フラクション中のエキソキシラナーゼ活性は、ｐＨ５，０，３０’Ｃ１基質 としてｐ−ニトロ−フェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（０，３ｍＭ、　シグ マ）を用いたポータネン（Ｐｏｕｔａｍｅｎ）およびパルス（ＰｕｌＳＸ１９８ ｇ）の方法で測定した。

スポットテストで、ピークＢ、ＦおよびＫに対応する溶出フラクションにエンド キシラナーゼ活性が含まれていることが明らかになった（第２図参照）。トータ ルキシラナーゼ検定では、ピークＢ、Ｆ、　ＨおよびＫのフラクションに活性が 示された。ピークＢおよびＨの溶出フラクションに、エキソキシラナーゼ活性が 含まれていることが分かった。

さらに、イオン交換クロマトグラフィーを繰り返して、ピークＦ（ＸＹＬ２蛋白 質）およびＫ（ＸＹＬＡ蛋白質）を精製した。そこに含まれているエンドキシラ ナーゼの特性をＳＤＳ／ＰＡＧＥ　（モーネン（Ｍｏｏｎｅｎ）等、１９８２） およびＬＫＢ装置を用いたアイソエレクトリックフォーカシング（３，５＜ｐＨ ＜９．　５）で調べた。ＳＤＳ／ＰＡＧＥで測定したエンドキシラナーゼＦの見 かけの分子量は、約２２ｋＤａであった。また、エンドキシラナーゼにの見かけ の分子量は、約２４ｋＤａであった。エンドキシラナーゼＦの等電点（ＩＥＰ） は、約１）Ｈ４，Ｏであり、一方エンドキシラナーゼにのＩＥＰは、ｐＨ３，５ 以下と測定された。

（実施例１゜２）アスベルギラス　ツビゲンシスのエンドキシラナーゼＸＹＬＡ のＮ末端のアミノ酸シーケンシング 実施例１．１にしたがって精製した約５μｇのエンドキシラナーゼを１２％ＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、マツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ） （１９８７）の方法にしたがってイモピロン−Ｐメンブレンにエレクトロブロッ ティングした。見かけの分子量（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）２５ｋＤａの主バンドを含 むメンブレンフラグメントを気相シーケンサ−（ユーロシーケンス、グロニンゲ ン）で配列決定した。以下のＮ末端配列が、決定された。

Ａｌａ−Ｇｌｙ（ｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａ ｓｎ　（第３図、配列式ｌ）しかし、Ｎ末端アミノ酸が、セリン（第８図、部位 １）またはグリシン（第８図、部位３）と決定されたほぼ同量の別の二つの変異 体も発見された。

（実施例１．３）エンドキシラナーゼＸＹＬ　ＡのエンドプロテアーゼＧｌｕ− Ｃ放出ペプチドのアミノ酸配列決定 実施例１．　１で述べたように精製した約２６０μｇのエンドキシラナーゼを、 ５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッフｙ　（ｐＨ７，５）および２ｍｇ／ｍｌ　Ｓ ＤＳを含む１１０μｌの溶液に溶解した。この溶液を１００℃で３分加熱し、室 温まで冷却したのち、１８倍モル量のエンドキシラナーゼＧｌｕ−Ｃ（スタフィ ロコッカス　オーレウス　プロテアーゼＶ８）を加えた。室温、２０分間の蛋白 質消化の後、反応混合物を１００℃で３分間加熱した。

約五分の−の反応混合物を、１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動 し、マツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）（１９８７）の方法にしたがってイモ ピロン−Ｐメンブレン（ミリポア）にブロッティングした。各々分子量１９゜１ ６および４ｋＤａの三個のフラグメントが観測された。大きい二つのフラグメン ト（１９および１６ｋＤａ）を、気相シーケンシングに用いた（アブライドバイ オシステムズ、モデル４７０Ａ蛋白質シーケンサ−、ユーロシーケンス、グロニ ンゲン）。特定のペプチド２−３２−３ｎを含むメンブレンフラグメントを洗浄 し、アモンズ（Ａｍｏｎｓ）（１９８７）のプログラムにしたがって、配列分析 した。

１９ｋＤａのフラグメントから以下のＮ末端アミノ酸配列が決定された。

Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｘ　−Ｔ ｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−（Ｓｅｔ）（第４図、配列■Q） 部位９（Ｘ）のアミノ酸は同定できなかった。括弧で括っているように、部位１ ４のセリンは痕跡量しか示されなかった。

１６ｋＤａのフラグメントからは、以下のアミノ酸配列が決定された。

Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−（Ｓｅｒ ）−Ｘ　−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−３ｅｔ　（第４図、配■■R） 部位１０のアミノ酸（Ｘ）は、同定できなかった。このフラグメントの配列は、 はとんど１９ｋＤａフラグメントの配列と同じであった。両ペプチドは、本来の 蛋白質で決定されたＮ末端アミノ酸配列とは異なるＮ末端配列を共有している（ 実施例１．　２、配列式１）。これら二つの同一のフラグメントは、第８図に示 した部位７９で始まる配列に相当していることが分かった。

（実施例２）アスペルギラス　ニガーＤＳ１６８１３　（ＣＢＳ３２３．９０； 後に、アスペルギラス　ツビゲンシスに再分類された）のゲノムライブラリーの 構築 （実施例２．１）アスペルギラス　ニガーＤＳ１６８１３　（ＣＢＳ３２３．９ ０；後に、アスペルギラス　ツビゲンシスに再分類された）のＤＮＡの単離デグ ラフ（ｄｅ　Ｇｒａａｆｆ）（１９８８）等の操作で菌類ＤＮＡを単離した。０ ．２％カザミノ酸および０．５％イーストイクストラクトを補填した液体最小培 地（１リツトル当たり：　６．Ｏｇ　ＮａＮＯｓ；　１．５ｇ　ＫＨｚＰＯ４； ０．５ｇ　ＭｇＳＯ４”７ＨｚＯ；０．５ｇ　ＫＣＩ；１ｍｌ　ビスニアツク液 （ビスニアツク（Ｖｉｓｎｉａｃ）およびサンター（Ｓａｎｔｅｒ）、１９５７ ）；１０ｇ　ＥＤＴＡ；４．４ｇ　ＺｎＳＯ４・７ＨｚＯ；１．ｏｇ　ＭｎＣＬ −４ＨｔＯ；０．３２ｇ　ＣａＣＬ、−６Ｈ，Ｏ；０．３２ｇ　Ｃｕ５Ｏ，−５ Ｈ，０；　０．２２ｇ　（ＮＨ４）ａＭＯ□ｏｚａ・４ＨｔＯ；　１．４７ｇ　 ＣａＣＬ”２ＨｔＯ；１．ｏｇ　ＦｅＳＯ４−７ＨｉＯ；ｐＨ４，０）で−晩増 殖した菌糸体を収穫し、冷食塩水で洗浄したのち、液体窒素中で凍結させてから 一８０℃で保存した。ミクロジスメンブレーク−（ブラウン）を用いて凍結した 菌糸体０．５ｇを破壊し、核酸を単離した。得られた菌糸体粉末を新たに調製し た抽出バッファで抽出した。

抽出バッファは以下のように調製する。１ｍｌのトリーイソプロピルナフタレン スルホン酸（ＴＮＳ）（２０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌのｐ−アミノサリチル酸（Ｐ ＡＳ）（１２０ｍｇ／ｍｌ）と完全に混合し、０．５ｍｌの５ＸＰＮＢバツフア （１リツトル当たり、１２１．１０ｇ）リス；７：３．０４ｇＮａＣ１；９５． １０ｇＥＧＴＡ；ＨＣＩでｐＨを８．５に調整する。）を混合する。１゜５ｍｌ のフェノールの添加後、抽出バッファを５５℃、１０分間かけて平衡化する。つ いで、温かいバッファを菌糸体粉末に添加し、その溶液をポルテックスミキサー を用い１分間かけて混合した。クロロホルム１ｍｌ添加後、このサスペンション をさらに１分間攪拌する。ツルパル高速遠心機を用いた１　０’Ｘｇ、　Ｉ　０ 分間の遠心の後、水相をもう一度等容量のフェノール／クロロホルム（１：　１ ）で抽出し、ついでクロロホルムで抽出する。この水相から以下の手順でＤＮＡ を単離した。室温で、２倍容のエタノールを用いてＤＮＡを沈殿させ、ツルパル 高速遠心機による１０’Ｘｇ、１０分間の遠心で回収した後、無菌蒸留水へのＤ ＮＡの溶解およびエタノール沈殿により、二面洗浄する。ＲＮＡは、最終溶液に ＲＮａｓｅＡ　（２０ｇｇ／ｍｌ）を添加して除去した。

（実施例２．２）アスペルギラス　ッピゲンシスＤＮＡの５ａｕ３Ａによる部分 分解およびアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡフラグメントの単離実施例２． 　１に述べられているアスペルギラス　ニガーＤＳ１６８１３（最近、アスペル ギラス　ッピゲンシスに再分類された）から単離したＤＮＡ　（３０ｇｇ）を、 ０．　１ユニツトの５ａｕ３Ａで、３７℃、３０分間処理することで部分消化し た。生成したフラグメントを、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む ＴＡＥバッファ中の０．４％アガロースゲル電気泳動でサイズ分画した。サイズ マーカーとして用いたバクテリオファージラムダＤＮＡのＢｇｌｌＩ消化フラグ メント（２２，０，１３，３，９，７，２，４，０，６５および０．４４ｋｂ） との比較による１４乃至２２ｋｂのフラグメントを、ゲルの適当な領域を切りだ すことで回収した。

これらのフラグメントは、ｌ５ＣＯカツプを用いた電気溶出でアガロース断片か ら回収した。このカップの大小両容器に透析膜を付け、カップに０．００５ＸＴ ＡＥ　（５０ＸＴＡＥ　（１リツトル当たり、２４２．０ｇ）リス；５７．１ｍ ｌ氷酢酸；１００ｍ１　Ｏ，５Ｍ　ＥＤＴＡ；ＨＣＩでｐＨを８．０ニ調整）ス トック溶液を希釈したもの）を満たし、カップの大容器にアガロース片を入れる 。

つづいて、このカップを、大容器がＴＡＥを含むカソードチャンバー、小容器を ＴＡＥ／３Ｍ　ＮａＣ１を含むアノードチャンバーに納まるように電気溶出装置 にセットする。１００Ｖ、２時間かけて、フラグメントを電気溶出させる。その 後、カップを大容器から取り出し、また小容器の上部からバッファを取り除く。

ＤＮＡフラグメントを含む残存バッファをカップ内で蒸留水に対し、３０分間透 析した。最後に、０．１倍容の３Ｍ　ＮａＡｃ　（ｐＨ５，６）および２倍容の 冷（−２０℃）エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。このＤＮＡを、４℃、 １４．０００ｘｇ、３０分間の遠心（エッペノドルフ）で回収した。上清除去後 、サバントスピードバク真空遠心機を用いて、ＤＮＡペレットを乾燥した。エタ ノール沈殿後、１０μＩＴＥバツフｙ（１０ｍＭ）リス−ＨＣ１，ｐＨ８，０； 　１ｍＭ　ＥＤＴＡ；　Ｉ）Ｈ８，０）中にＤＮＡを溶かし、レファレンスとし て既知濃度のラムダＤＮＡを用いたアガロース電気泳動およびエチジウムブロマ イドによるＤＮＡ染色でその濃度を測定した。

（実施例２．３）アスペルギラス　ツビゲンシスＤＮＡフラグメントのバクテリ オファージラムダＥＭＢＬ３へのクローニング実施例２．２に述べられているゲ ノムＤＮＡの部分分解によって得られるフラグメントを、以下の操作にしたがっ て、プロメガから市販されているバクテリオファージラムダＥＭＢＬ３ＢａｍＨ Ｉアームにライゲーションした。４μｍ　（２μｇ）ＥＭＢＬ３ＤＮＡ、Ｉｇｌ 　（５０ｎｇ）ゲノムＤＮＡフラグメント、０゜７５μｌ　１０×ライゲーシヨ ンバツフア（マニアチス（Ｍａｎ　ｉａ　ｔ　ｉ　ｓ）等、１９８２、ｐｐ、４ ７４：６６０ｍＭトリス−ＨＣｌ　；　５０ｍＭＭｇＣＩｔ；５０ｍＭジチオス レイトール；　１０ｍＭ　ＡＴＰ　；　ｐＨ７，６）、０１７５μ１１０ｍＭＡ ＴＰおよび２μｔ　（１，５Ｕ／μｍ）Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を注意 深く混ぜ、１４℃で６時間インキュベートした。その後、この反応混合物に、１ μｌＴ４　ＤＮＡリガーゼを添加し、室温でさらに４時間インキュベーションを 続けた。

ライゲートしたＤＮＡを、インビトロでギガパックＩＩゴールドパッキングイク ストラクト（ストラタジーン）を用いてバッキングし、説明書にしたがい、ＮＺ ＹＣＭ培地（１リツトル当たり＋ｌＯｇＮＺアミン；５ｇイーストイクストラク ト；１ｇカザミノ酸；２ｇ　ＭｇＳＯ４・７ＨｔＯ；　ｐＨ７，５；プレート用 には更に寒天１２ｇを添加する）を用いて大腸菌ＬＥ３９２（ムレ−（Ｍｕｒｒ ａｙ）、１９７７）にブレーティングした。

最終容積１０μｌ中３μｌのゲノムＤＮＡフラグメントを用い、先に述べた完全 な反応をもう一度繰り返した。

（実施例２．４）アスペルギラス　ツビゲンシス　ゲノムライブラリーのタイタ ー測定と増幅 ８Ｍバッファ（１リツトル当たり：　５．８ｇ　ＮａＣ１；　２．Ｏｇ　ＭｇＳ Ｏ４・７ＨｔＯ；　５０ｍｌ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）；５ｍｌ　２０ ％ゼラチン）で、−次ゲツムライブラリーを希釈し、マニアチス（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ）等、（１９８２，ｐｐ、６４）に述べられているように、ＭＺＹＣＭ培地 を用い、宿主としての大腸菌にブレーティングした。３７℃、−晩のインキュベ ーションの後、生成したプラークを計数し、ファージの量を計算した。最初のラ イゲーションおよびバッキングでは、約７Ｘ１０＊４ｐｆｕ　（プラーク形成単 位）、二回目には、約４Ｘ１０’ｐｆｕ、全体では約５Ｘ１０”ｐｆｕが生成し た。

マニアチス（Ｍａｎ　ｉａ　ｔ　ｉ　ｓ）等（１９８２，ｐｐ、２９３−２９４ ）に述べられているようにＮＺＹＣＭ培地に直径８５ｍｍプレートあたり（総計 三枚）５Ｘ１０”ｐｆｕをブレーティングして、このようにして得たゲノムライ ブラリーを増幅した。３７℃で、−晩のインキュベーション後、５ｍｌの８Ｍバ ッファを加えることにより生成した集電化プレートからファージを溶出した。こ のプレートを振とうしながら４℃に工時間維持した。上清除去後、０．３％クロ ロホルムを加え、ｐｆｕ数を測定した。このファージストックは、約１０”　ｐ ｆｕ／ｍｌの濃度である。

（実施例３）エンドキシラナーゼＡ遺伝子（ｘｌｎＡ）に関するアスペルギラス ツビゲンシス　ゲノムライブラリーのスクリーニングおよび該遺伝子の単離（実 施例３．１）合成オリゴヌクレオチドの３！Ｐ−ラベリング実施例１．２で誘導 されたアミノ酸配列（配列式１）を用いて、そのＮ末端アミノ酸配列に対応する オリゴヌクレオチドミックスを合成した。オリゴヌクレオチドは、アブライドバ イオシステムズのオリゴヌクレオチド合成機を用い、ホスホアミダイト法で合成 した。

オリゴヌクレオチドミックスＡＢ８０１乃至ＡＢ８０６（第３図）の等量混合物 オリゴヌクレオチドミックスＡＢ８００を、μｌ当たりオリゴヌクレオチド３７ ｐｍｏｌとなるように調製した。以下の反応組成物中で、このオリゴヌクレオチ ド混合物をラベル化した＋３７ｐｍｏｌオリゴヌクレオチド混合物、６６ｍＭト リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，６，１ｍＭ、ＡＴＰ、１ｍＭ　スペルミジン、１０ｍＭ 　ＭｇＣｌ！＋　１５ｍＭ　ジチオスレイトール、２００μｌ／ｍｌ　ＢＳＡ。

３４　ｐｍｏ　１　ガン？−”Ｆ　ＡＴＰ　（ＮＥＮ、６００ＱＣｉ／ｍｍｏ１ ）および３０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ）（、最終容積５０μ ｌ）。この反応混合物を、３７℃で一時間インキユベートし、その後、４μｌの ０．５ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）を加えることによって反応を停止した。

実施例１．３で得られたアミノ酸配列から誘導したオリゴヌクレオチド混合物Ａ Ｂ１２５５（配列式２および３）（第４図）を先に述べた方法でラベル化した。

このオリゴヌクレオチド混合物は、精製せずにゲノムライブラリーのスクリーニ ング（実施例３．２）およびサザンプロット（実施例３．４および３．５）に使 ツムライブラリーのスクリーニング アスペルギラス　ツビゲンシス　ゲノムライブラリーからｘｌｎ　Ａ遺伝子をス クリーニングするために、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、（１９８２゜ｐ ｐ、６４）によって報告されているように４個の直径８５ｍｍＮＺＹＣＭ（１， ２％寒天）プレート上の０．７％寒天を服務ＮｚＹＣＭトップアガロース（ＮＸ ＹＣＭ培地＋７ｇ寒天）にプレート当たり３Ｘ１０”ｐｆｕをブレーティングし た。ブレーティングバクテリアとして、大腸菌ＬＥ３９２を用いた。

３７℃、−晩のインキュベーションの後、マニアチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ 　ｓ）等、（１９８２，ｐｐ、３２０−３２１）に述べられているようにニトロ セルロースフィルター（シュレイチ＋　（Ｓｃｈｌｅｃｈｅｒ）およびシャル（ Ｓｃｈｕｌｌ）。

ＢＡ８５）上に各プレートについて二個のレプリカを作った。

このフィルターを、８０℃で二時間焼いた後、室温で６０分間かけ、３ｘＳＳＣ （２０ｘＳＳＣストツク溶液を希釈した、１リツトル当たり；１７５．３ｇＮａ Ｃ１；１０７．Ｉｇ　クエン酸ナトリウム−５，５ＨｔＯ；ｐＨ７，０）中で湿 潤させ洗浄した。このフィルターを、６ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣストツ″り溶液 を希釈した。上述）、０．５％ＳＤＳ、１０かけるデン／Ｘ−ド液（５リツトル 当たり：１０ｇ　フィコール４００．１Ｏｇ　ポリビニルピロリドン；１０ｇウ シ血清アルブミン（ペンタックス、フラクションＶ）および１００μｇ／ｍｌ熱 変性ニシン精子ＤＮＡ　（ベーリンガーマン１１イム）を含むプレハイブリダイ ゼーションバッファ中、６５℃で二時間ブレＩ＼イブリダイズした。工時間のブ レ７＼イブリダイゼーシコン後、プレハイブリダイゼーションノくツファを、ニ シン精子ＤＮＡは含まず、実施例３．１で述べたように調製した５ｔｐ−ラベル 化オリゴヌクレオチドミックスＡ３８０００を含むこと以外は、ブレノーイブリ ダイゼーションバッファと同じハイブリダイゼーションバッファと置き換えた。

初期温度６５℃からゆっくりコントロールしながら最終温度３８℃まで１８時間 かけて冷却することでこのフィルターの／Ａイブリダイズを行った。

ハイブリダイゼーション後、まず、このフィルターを２ＸＳＳＣで洗浄し、つい で、同じ時間かけて３８℃に温めたハイブリダイゼーションバツファで洗浄した 。最後に、このフィルターを、６ｘＳＳＣ，０，ｏ５％ピロ燐酸ナトリウム中、 ３８℃で３０分間洗浄する。空気乾燥したフィルターをワットマン３ＭＭペー、 ＜−上にテープで止め、放射性インクでマークを付けた後、ワットマンペーｌく −およびフィルターをサランラップで覆った。増感スクリーンを用い、−７０℃ で７２時間かけてコダックＸＡＲＸ線フィルムを感光させて／１イブリダイジン グプラークを同定した。

レプリカフィルターに二度出現するオリゴヌクレオチド混合物ハイブリダイズブ ラーク四個が同定され、ラムダｘｌｎｌ乃至ラムダｘｌｎ４と命名した。、＜ス ツールピペットを用いて、各ポジティブプラークをプレートから取り出し、マニ アチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）等、（１９８２，ｐ、６４）に示されて いるように、２０μｌクロロホルムを含む１ｍ１５Ｍバッファ中寒天断片からフ ァージを溶出した。得られたファージは、単離したファージ５０−１００個のプ ラークを含むプレートからのフィルターレプリカを用いた上述の操作を繰り返す ことによって精製した。

精製後、ＮＺＹＣＭ培地に５ｘｉｏ”個のファージをブレーティングすることに より、ファージを増幅した。３７℃、−晩のインキュベーション後、集密化プレ ートが得られ、それに、５ｍｌのＳＭバッファを加え、振とうしながら４℃で二 時間プレートをインキュベーションすることにより、ファージを溶出した。上清 を取り出し、この溶液を４℃、１０分間、４０００％ｇの遠心してバクテリアを 除去した。上清にクロロホルム（０，３％）を加え、ｐｆｕ数を測定した。これ らのファージストックの濃度は、約１０　”ｐ　ｆ　ｕ／ｍ　１であった。

（実施例３．３）バクテリオファージラムダからのＤＮＡの単離各ファージにつ いて三枚のプレートを用い、実施例３．２の操作にしたがって単離ファージラム ダｘｌｎｌ−ラムダｘｌｎ４各々を増殖した。得られた上清（２５ｍｌ）に２０ ％ＰＥＧ−６０００（Ｗ／Ｖ）および２Ｍ　ＮａＣ１を含む等容量の溶液を加え 、よく混合してから氷水中で一時間インキユベーションして、ファージを沈殿さ せた。沈殿したファージは、４℃、１４０００％ｇ、２０分間の遠心で回収した 。上清をアスピレータ−で除去し、最後の液体はペーパータオルで吸い取った。

注意深くファージを４ｍ１５Ｍバッファに懸濁し、一度クロロホルムで抽出した 。

ファージ粒子からＤＮＡを抽出する前に、ファージサスペンションをＤＮａｓｅ ＩおよびＲＮａｓｅＡ（いずれも１００μｇ／ｍｌ）で、３７℃、３０分間処理 することにより、分解したバクテリア由来のＤＮＡおよびＲＮＡを除去した。

つづいて、最終濃度が、各々０．　１％および２０ｍＭとなるようにＳＤＳおよ びＥＤＴＡを加え、６５℃、１０分間インキュベーションすることにより、ファ ージからＤＮＡを放出させた。この溶液を、等容量のフェノール／クロロホルム ／イソアミルアルコール（２５：２４：ｌ）で二回抽出して、蛋白質を除去した 。

エッペノドルフ遠心（１４０００％ｇ、１０分間）による相分離の後、水相を等 容量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で一度抽出した。遠心 で相分離しくエツペノドルフ遠心、１４０００％ｇ、１０分間）、水相に０．１ 倍容の５Ｍ過塩素酸ナトリウムおよび０．　１倍容のイソプロピルアルコールを 加え、氷水中で３０分間インキュベートすることにより、ＤＮＡを沈殿させた。

４℃、１０分間（１４０００％ｇ）の遠心でＤＮＡを回収した。アスピレータ− で上清を除き、ＤＮＡを４００μｍのＴＥバッファに溶かした。このＤＮＡは、 もう一度エタノールで沈殿させたのち、４℃、１０分間の遠心（１４０００％ｇ ）で回収した。アスピレータ−で上清を除いた後、残ったＤＮＡを減圧下で簡単 に乾燥させ、０．１μｌ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含む１２５μｌのＴＥバッファ に溶かす。この精製操作で、各ファージから約４０−５０μｇのＤＮＡが単離さ れた。

（実施例３．４）ｘｌｎＡを含むファージの制限分析ファージラムダｘｌｎｌ− ラムダｘｌｎ４の単離ＤＮＡを以下の制限酵素：坦徂ＨＩ；シｒｌｌＩ；旦立立 Ｒ■；旦圭ユｄＩＩ１．に臼す：旦見土Ｉ；５ｓｔｌ；ＸｂａｌおよびＸｈｏｌ を用いたサザンブロッティングで分析した。

ＤＮＡを二度、以下に示す反応溶液中で３７℃、三時間消化した。３μｌのＤＮ Ａ溶液、ｌμｌの０．５Ｍスペルミジン、５μｌの約１０Ｘ反応バッファ（ＢＲ Ｌ）、２０Ｕ制限酵素（ＢＲＬ）および蒸留水で、５０μｌとする。消化後、０ ．１倍容の３Ｍ　ＮａＡｃおよび２倍容のエタノールを加えてＤＮＡを沈殿した 。室温、１０分間の遠心（１４０００％ｇ）で、ＤＮＡを回収する。上滑を、ア スピレータ−で除き、残ったペレットを減圧下で簡単に乾燥し、無菌蒸留水に溶 解する。４μｍのＤＮＡローディングバッファ（０，２５％（Ｗ／Ｖ）ブロモフ ェノールブルー、０．２５％（ｗ／　ｖ　）キシレンシアツール、１５％（ｗ／ 　ｖ　）フィコールタイプ４００水溶液）の添加後、試料を６５℃３０分間イン キュベーションしてから、氷水中で急速に冷却する。この試料をＩＸＴＡＥバッ ファ中０．６％アガロースゲルにロードする。このＤＮＡフラグメントを２５Ｖ 、１５−１８時間の電気泳動で分離する。

電気泳動後、ＤＮＡを変性し、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法（１９ ８２，ｐｐ、３８３−３８６）でニトロセルロースメンブレンに移し取り、実施 例３．　１で述べたラベル化オリゴヌクレオチドミックスＡＢ８００およびＡＢ １２５５および実施例３．２で述べたハイブリダイーション条件を用いてプレハ イブリダイゼーションおよびハイブリダゼーションを行った。コダックＸＡＲ− ５Ｘ線フィルムを増感スクリーンを用い一７０℃、１８時間感光させることによ り、各オリゴヌクレオチドミックスのハイブリダイゼーションパターンを得た。

この結果から、四個すべての単離クローンのＤＮＡは、Ｎ末端アミノ酸配列から 誘導したオリゴヌクレオチド混合物（ミックスＡＢ８ｏｏ）およびＳ、オーレウ ス（ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８消化後に単離されるペプチドから得られるアミノ酸配列 から誘導したオリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイズする事が分かった。

四個すべてのクローンに、同じゲノム領域由来のフラグメントが見いだされた。

制限フラグメントパターンおよびハイブリダゼーションパターンを用いて、ＸＩ ｎ　Ａ遺伝子が存在するゲノム領域の適当な制限地図を構築した（第５図）。

（実施例３．５）ｘｌｎ　Ａ遺伝子のサブクローニング６．９ｋｂ　５ａｌＩフ ラグメントを、実施例２．２に述べたようにファージラムダｘｌｎ３から単離し た。以下のように、５ａｉｌで消化し、アルカリホスファターゼで脱燐酸化した ベクターｐＵＣ９に、このフラグメントをライゲージｇンした。ｌμｌ　（ｌμ ｇ／μ１．）ｃ７）ｐＵＣ９を、２μｌのｌＯ×リアクトｌ。

（ＢＲＬ）、１ｕｌ　（ＩＵ／μ１）ＳａｌＩおよび１６μｌの無菌蒸留水と混 合した。このＤＮＡを３７℃、１時間消化した後、０．５μＩのアルカリホスフ ァターゼ（ＩＵ／μｌ）（ファルマシア）を添加し、さらに３７℃で３０分間イ ンキュベートした。線状化したベクターを実施例２．２に示したように０．　６ ％アガロースゲルから単離した。

−ＨＣｌ、ｐＨ７，６；　１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２　；　ｌ　ＯｍＭ　ジチオス レイトール；２５％ＰＥＧ−６０００）と混合し、この混合物に１μｌのＤＮＡ リガーゼ（１，２Ｕ／μ］）（ＢＲＬ）を添加して、２０μｌとした。このプラ スミドを、ｐ　ＩＭＩ　００とした。１４℃、１６時間のインキュベーションの 後、この混合物を無菌水で１００μｍに希釈した。この希釈混合物ｌＯμｍを用 い、Ｍ１３クローニング／シーケンシングシステムに関するファルマシアのマニ ュアルに述べられているＣＭＩ、ＣＭ２法で調製した大腸菌ＪＭＩＯＩ（ヤニシ ーシラン（Ｙａｎ　ｉ　ｓ　ｃｈ−Ｐｅ　ｒ　ｒｏｎ）等、１９８５）コンピテ ント細胞をトランスホームした。プラスミドｐＩＭＩ　ＯＯを含む大腸菌ＪＭＩ ＯＩは、１９９０年７月１９日、ＣＢ５３２２．９０としてオランダ、バーンの セントラルビューローボアシメルカルチャーに登録した。

生成した６個の選択コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地 （１リツトル当たり；ｌＯｇトリブチカーセペプトン（ＢＲＬ）；５ｇイースト イクストラクト（ＢＲＬ）；　１０ｇ　ＮａＣ１；　０．５ｍＭトリス−ＨＣｌ ；ｐＨ７，５）で−晩培養した。

マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、（１９８２，ｐｐ、３６８−３６９）に述 べられているアルカリ分解法で、培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。実施 例３．４に述べたように、このプラスミドＤＮＡを制限分析に用い、目的のプラ スミドを有するクローンを選択した。アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ 培地で増殖したプラスミドｐ　ＩＭｌ　００を含む大腸菌ＪＭＩＯＩ培養物５０ ０ｍ１から、プラスミドＤＮＡを大量に単離した。このプラスミドをＣｓＣ１遠 心、フェノール処理、エタノール沈殿で精製し、４００μｍのＴＨに溶解した。

収率は、約５００μｇであった。

さらに、このプラスミドｐ　ＩＭＩ　００を、制限酵素で分析し、第７図に示し た制限地図を作製した。示した遺伝子の方向は、プローブとしてオリゴヌクレオ チドミックスＡＢ８００およびＡＢ１２５５を用いた、実施例３．２に述べた条 件下でのハイブリダイーション実験から決定した。

（実施例４）アスペルギラス　ツビゲンシスｘｌｎ　Ａ遺伝子の特性（実施例４ ．１）アスペルギラス　ツビゲンシスｘｌｎ　Ａ遺伝子の配列決定プロモーター ／調節領域、構造遺伝子および停止領域を含むアスペルギラスツビゲンシスｘｌ ｎ　Ａ遺伝子の配列は、ｐ　ＩＭＩ　００由来のフラグメントのＭｌ　３ｍｐ　 ｌ　８／ｍｐ　１９へのサブクローニングとシーケンシング反応のプライマーと しての特定のオリゴヌクレチドの使用により決定した。

ヌクレオチド配列分析のために、実施例２．２に述べたように制限フラグメント を単離し、適当な制限酵素で消化したバクテリオフージＭｌ　３ｍｐｌ　８／ｍ ｐ１９ＲＦ　ＤＮＡベクター（フラツグ（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、１９８３；フラツ グ−（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）等、１９８３）にクローニングした。ヌクレオチド 配列は、ファルマシアＴ７　ＤＮＡポリメレースシーケンシングキットを用いた グイデオキシチェーンターミネーション法（サンガー（Ｓａｎｇｅ　ｒ）　、１ ９７７）で決定した。ｘｌｎ　Ａ遺伝子のシーケンシングを行う戦略は、第６図 に示した。

得られたデータのコンピュータ解析は、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（インテリジ エネティクス、マジソン　ＷＩ）で行った。シーケンスデータを第８図に示す。

（実施例４．２）アスペルギラス　ツビゲンシスｘ１．ｎＡ遺伝子得られたデー タには、５′側ノンコーデイング領域の２０５４ｂｐ、９４９ｂｐおよび３′側 ノンコーデイング領域の４２０ｂｐが含まれている。５°上流領域の推定上のＴ ＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡＴ）は、翻訳開始部位（部位９５０）の前の部位 ８４８−８５４にある。三回反復配列（５°ＧＴＣＣＡＴＴＴＡＧＣＣＡ３’　 ）は、翻訳開始部位から１９０−３５０ｂｐの領域（部位６１８−６３２；６３ ６−６５０；６５６−６７０）に存在した。

ｘｌｎ　Ａ遺伝子の構造部分は、６８１ｂｐ長で、単一の推定上のイントロン４ ８ｂｐで切断されている。この配列から誘導されるペリペプチドは、２１１ＡＡ 長である。このポリポブチドのＮ末端には、１７ＡＡ長の疎水性シグナル配列が あり、その次に１２残基長のプロペプチドが続いている。成熟蛋白質のサイズは １８４ＡＡであり、分子量は１９ｋＤａ、また理論的ＩＥＰは３．６と予想され る。

（実施例５）アスペルギラス　ニガーＮ５９３におけるｘｌｎ　Ａ遺伝子の発現 （実施例５．１）コトランスホーメーションによるアスペルギラス　ニガーＮ５ ９３へのｘｌｎ　Ａ遺伝子の導入 実施例３．５で得られたプラスミドを、プラスミドｐＧＷ６３５上の選択マーカ ーといてアスペルギラス　ニガーｐｙｒ−Ａ遺伝子およびコトランスホーメーシ ョンプラスミドとしてプラスミドｐＩＭ１００を用いたアスペルギラス　ニガー Ｎ５９３（アスペルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）Ｎ ４０２のｐｙｒ−変異体、グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等、１９８７）のコトラン スホーメーションによりアスペルギラス　ニガーへ導入した。

０．５％イーストイクストラクト、０．２％カザミノ酸、５０ｍＭグルコースお よび１０ｍＭウリジンを補った最小培地で、３０℃、２０時間アスペルギラスニ ガーＮ５９３を増殖して得られる菌糸体から、プロトプラストを調製した。

アスペルギラス　ニガーＮ５９３のプロトプラストの調製およびトランスホーメ ーション操作は、グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）等（１９８７）の方法にしたがった 。

Ａ蛋白質の生成能力を分析した。２０個のトランスホーマントを選択し、（１リ ツトル当たり、３０ｇ　オートスベルトキシラン（シグマ）　；７．　５ｇ　Ｎ Ｈ４ＮＯｘ：　０．５ｇ　ＫＣＩ　；　０．５ｇ　ＭｇＳＯ４；ｌ　５ｇ　ＫＨ ２ＰＯ４；および０．５ｇ　イーストイクストラクト（ｐＨ６，０）を含む培地 中、７２時間培養した。増殖後、濾過して菌糸体を除去し、その培養濾液を１２ ％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。ＸＹＬ　Ａ蛋白質は、 ニトロセルロースへのエレクトロブロッティングおよび実施例１．１の方法で精 製したＸＹＬＡ蛋白質に対して生成したポリクローナル抗体とのインキュベーシ ョンで検出した。結合した抗体は、バイオラドの説明書にしたがってアルカリホ スファターゼに結合したヤギー抗−ウサギ抗体とのインキュベーションで検出し た。

分析した２０個のトランスホーマントのうちの１６個が、ＸＹＬ　Ａ蛋白質を生 成していることが、この操作で分かった。この蛋白質は、培地中に分泌されてい た。ｐＨ３−７のｐＨ勾配を用いた１、　Ｅ、　Ｆ分析とビーリー（Ｂ　ｉ　ｅ 　Ｉ　ｙ）等（１９８５ａおよびｂ）の方法を用いたトランスホーマントＴｒＸ ２およびＴｒＸ９の一連の希釈物の染色により、分析したしトランス−マントの なかからトランスホーマントＴｒＸ９を選択した。

第９図は、トランスホーマントＴｒＸ２およびＴｒＸ９により発現されたＸＹＬ Ａ蛋白質を示すザイモグラムである。各トランスホーマントおよびアスペルギラ ス　ニガーコントロール株の４μｌ上清試料を用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行 った。レムリ（Ｌａｅｍｍｌ　１）（１９７０）の方法にしたがい、まず、菌株 を３Ｎ　ＮａＯＨでＩ）　Ｉ−（７に調製し、続いてＩＸ’ｓＢバッファで容積 を２０μｌとした。１００℃で５分間加熱した後、この混合物をＳＤＳ／１２． ５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、クーマシーブリリアントブルー で染色した。第１０Ｂ図に示したように、トランスホーマントＴｒＸ２　（レー ン４）およびＴｒＸ９　（レーン５）に見かけの分子量２５ｋＤａの蛋白質バン ド（精製したキシラナーゼに相当する）が検出され、一方、コントロール株には 、これは検出されなかった（レーン３）。分子量マーカーは、９２，６８．４６ および３０ｋＤａを示している。

−のプラスミドを有するトランスホーマントの選択も可能にする。

実施例３．５で述べたように、４．５ｋｂＳａ　Ｉ　Ｉ／ＸｂａＩフラグメント （第７図）を単離し、ベクターｐＥＭＢＬ１８にライゲーションして、中間ブラ をｐＥＭＢＬ１８にライゲーションした。得られたプラスミドを、ＸｂａＩで消 ｐ１Ｍ１１４．ｐＩＭ１１６およびＩ）　ＩＭＩ　１７を生成した（第２１図） 。

実施例５．１で述べたように、プラスミドｐＩＭ１１２．ｐＩＭ１１３．ｐＩＭ １１４．ｐＩＭ１１６およびｐＩＭＩ　ｌ　７を用いてアスペルギラス　ニガー Ｍ５９３をトランスホームした。生成した各プラスミドのＰＹＲ”　）ランスホ ーマリダイジングフラグメント有するトランスホーマント（アスペルギラス　ニ ガーＮ５９３のＨｐａｌルミｌフラグメントプラスミド−個分だけサイズカ吠き い）を、ｐｙｒ　Ａ遺伝子座における単一コピー組み込み体として選択した。

先に述べたように選択した各プラスミドの単一コピートランスホーマントを、実 施例５．２で述べたように３６時間増殖した。玉±ｎＡ遺伝子の発現は、実施例 ５．２で述べたＩＥＦ分析および全ＲＮＡ単離後の、プローブとして五エユＡ遺 伝子のｓｘｐラベルした９００ｂｐＸｈ旦Ｉ／旦旦ｍＨＩフラグメントを用いた グラフ（Ｇｒａａｆｆ）等（１９８ｇ）によって報告されているノーサン法によ り分析した。

プラスミドｐ１Ｍ１１２．ｐＩＭ１１３およびｐ　ＩＭＩ　１３由来のトランス ホーマントでは、ＩＥＦおよびノーサン法によりｘｌｎ　Ａ遺伝子の発現が確認 された。しかし、ＸＹＬ　Ａ蛋白質およびハイブリダイジングＲＮＡのいずれも 存在しなかったことから、プラスミドｐ　ＩＭＩ　１６およびｐ　ＩＭＩ　１　 ？由来のトランスホーマントは、ｘｌｎ　Ａ遺伝子を発現していない。これらの 結果から、ｐＩＭＩ　１４とｐ　ＩＭｌ　１　Ｂの基本的な違いである１５８ｂ ｐ　ヱ互ｔｌ／里■フラグメントが、炭素源としてキシランを含む培地で増殖す るアスペルギラスニガーにｘｌｎ　Ａ遺伝子を誘導するのに必要な要素を含んで いると結論付けることができる。

（実施例６）アスペルギラス　ニガー　アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子の プロモーターおよび／またはシグナル配列と融合したｘｌｎ　Ａ遺伝子のアスペ ルギラス　ニガーにおける発現 （実施例６．１）キシラナーゼ発現ベクターアスペルギラス　ニガーＣＢ５５１ ３．８８においてキシラナーゼを発現させるだめに、ｘｌｎ　Ａ遺伝子が、別の シグナル配列とともにアスペルギラス　ニガーのアミログルコシダーゼ（ＡＧ） プロモーターのコントロール化にある発現カセット（ｐＸＹＬ３及びＩ）ＸＹＬ ３ＡＧ）を生成した。

発現カセットｐＸＹＬ３では、ＡＧプロモーターがキシラナーゼリーダーを含む ｘｌｎ　Ａコード配列に融合している。

発現カセットｐＸＹＬ３ＡＧでは、ＡＧ遺伝子の１８アミノ酸（ａ　ａ）リーグ （実施例６．２）中間プラスミドの構築ている）をｐＸＹＬｌと命名した。

ｂ）基本的選択ベクターｐＡｍｄＳＨ アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｊ　ｆｌｕｓ）のトランスホーメーション用の選 択マーカーとして用いるために、同種のアスペルギラス　ニドランス（Ａｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子を含むプラスミドｐＧＷ３ 挿入しな。生成したベクター（ｐＡｍｄＳ）では、合成フラグメント：このプラ スミドは、ｐＡｍｄＳＨと命名した。この基本的ベクターには、ＡＧ／キシラナ ーゼ融合ＤＮＡフラグメントが挿入される。

Ｃ）ゲノムのＡＧ遺伝子座の単離：ｐＡＢ６−１の構築ＩＩＩフラグメントを含 むアスペルギラス　ニガー　プラスミドライブラリーから単離したアスペルギラ ス　ニガー由来の全ＡＧ遺伝子座を含んでいる。

この単離のために、以下のＡＧ特異的オリゴヌクレオチドを使用した：これらは 、いずれもアスペルギラス　ニガーに関して報告されたヌクレオチド配列に基づ く（ボール（Ｂｏｅｌ）等、（１９８４ａ）；ポール（Ｂｏｅｌ）等、（１９８ ４ｂ））。オリゴヌクレオチドプローブは、隣接するイントロン２の配列に由来 する。オリゴＡＧ−１は、このイントロンの下流に位置し、ＡＧｍＲＮＡと同じ 方向である。オリゴＡＧ−２は、イントロンの上流に位置し、ＡＧｍＲＮＡと逆 移行となるように選択された。プラスミドｐＡＢ６−１は、１４．５ｋｂ　Ｈｉ ｎｄｌｌＩフラグメント上に全ＡＧ遺伝子座を有している（第１３図）。

ｄ）中間プラスミドｐＸＹＬＡＧおよびｐＸＹＬ２ＡＧＡＧプロモーターおよび １８ａａＡＧリーダー配列の、成熟蛋白質をコードするｘｌｎ　Ａ遺伝子（部位 ｌのセリンを欠いている）への融合は、ポリメレースチェーソリアクションリア クション法（ＰＣＲ）で行った。

ＰＣＲ反応では、二つのテンプレートを用いた：ｘｌｎ　Ａ遺伝子を含むｐＸＹ ＬＩおよび全ＡＧゲノム遺伝子座を含むｐＡＧ６−１゜ＰＣＲによるＤＮＡ増幅 用のプライマーとして、以下の配列を有する四個の合成オリゴヌクレオチドを設 計した。

オリゴＡ　Ｂ　１７７１　：　５　’　−ｃＴｃ’ｒＧｃＡＧΩ囚＝Ｑ野Ｇｃｒ ＡＧ−３’（ＡＴＧ開始コドンの上流約２５０ｂｐの所にあるＥｃｏＲＩ部位付 近のＡＧ特異的配列） オリゴＡＢ”　８６ｍ　１−ＧＴＣＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＴＧＧＣＡＡＧＴＧＣ ＣＧＧＴＡＴＣＡＡＣＴＡＣ−：ｌ・１８ａａＡＧリーダーｆ−成熟キシラナー ゼオリゴＡＢ　１９８４　：　ｓ＋−ＣＣＧＱｚじｘ二ＧＡＴｃＡＴｃＡｃＡｃ ｃ−３１ＰＣＲは、サイキ（Ｓａｉｋｉ）等、（１９８８）の方法およびＴＡＱ ポリメラーゼの使用説明書（シータス）にしたがって行った。ＤＮＡ増幅機（パ ーキンエルマー／シータス）で２５サイクル増幅した（各々：５５℃、２分間； ７２℃、３分間；９４℃、１分間）。

ＡＧ配列をｘｌｎＡコード配列に融合するために、二つのポリメレースチェーソ リアクションリアクション反応を行った。最初の反応は、テンプレートとしてｐ ＡＢ６−１およびプライマーとしてＡＢ１７７１およびＡＢ１９８５を用い、ｘ ｌｎ　Ａのコード配列のはじめの１８ヌクレオチドが３°側に隣接する、ＡＧプ ロモーターの３°側部分と１８８ＨのＡＧリーダー配列を含む３００ｂｐのＤＮ Ａフラグメントを増幅した。第二の反応は、テンプレートとしてｐＸＹＬｌおよ びプライマーとしてオリゴヌクレオチドＡＢ１９８６および１９８４を用い、Ａ Ｇシグナルペプチドの最後の１８ヌクレオチドが５°側に隣接する、成熟キシラ ナーゼ蛋白質をコードするｘｌｎ　Ａ　ＤＮＡ配列を増幅した。これらの増幅を 、第１４図に模式的に示した。

生成した二つのＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動およびエタノー ル沈殿で精製し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＡＢ１７７１および１９ ８４を用いた第三のＰＣＲに使用してＡＧ−キシラナーゼ融合物を作製した。

このようにして得たＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化 し、ｐＴｚｌ　８Ｒの適当な部位にサブクローンした。生成した融合物をシーケ ンシングし、ｐＸＹＬＡＧと命名した（第１４および１５図参照）。

びエタノール沈殿による精製で得た。この３．５ｋｂ　ＡＧ　ＤＮＡプロモータ ーフラグメントを、まずｐＸＹＬＡＧのＥｃ旦Ｒ１／旦ａｍＨＩ　ＡＧ／キシラ ナーゼ融合フラグメントにライゲーションし、つづいてＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩで 消化し、５°　−およびコーディング玉±ｎＡ配列を含む尽■旦■／旦且ｍＨＩ フラグメントを除いたベクターｐＸＹＬｌにライゲーションした後、大腸菌中で 分子クローニングした。このようにして得たプラスミドｐＸＹＬ２ＡＧを第１５ 図に示す。

図に示す。

ｅ）中間プラスミドｐＸＹＬおよびｐＸＹＬ２ＡＧプロモーター配列の、キシラ ナーゼリーダーを含むｘｌｎ　Ａ遺伝子への融合は、先のｄ）に示したように行 った。プライマーとして、以下の配列の二個のオリゴヌクレオチドを設計した。

ＡＧプロモーター配列をキシラナーゼ遺伝子（キシラナーゼシグナル配列を含む ）に融合するために、二つのポリメレースチェーソリアクションリアクションを 行った。始めの反応は、テンプレートとしてｐＡＢ６−１およびプライマーとし てオリゴヌクレオチドＡＢ１７７１およびＡＢ１９８２を用いて、キシラナーゼ リーダーの１８ヌクレオチドを３′側に隣接するＡＧプロモーターの３°部分を 含む２８２ｂｐフラグメントを増幅した。第二の反応は、テンプレートとしてｐ ＸＹＬｌおよびプライマーとしてオリゴヌクレオチドＡＢ１９８３およびＡＢ１ ９８４を用いて、全キシラナーゼ遺伝子（キシラナーゼリーダーを含む）を含み 、かつＡＧプロモーターの１８ヌクレオチドに５°側が隣接するＤＮＡフラグメ ントを増幅した。

生成した二つのフラグメントは、アガロースゲル電気泳動およびエタノール沈殿 で精製し、つづいて、これをテンプレートとし、プライマーとしてオリゴヌクレ オチドＡＢ１７７１および１９８４を用いた第三のＰＣＲによりＡＧ−キシラナ ーゼ融合物を生成した。このようにして得たＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩ およびＢａｍＨＩで消化し、ｐＴＺ］８Ｒの適当な部位にサブクローニングした 。この融合物をシーケンシングし、ｐＸＹＬと命名した憧１４および１６図参照 ）。

ＡＧプロモーターの残りの（３，５ｋｂ）上流領域を、先のｄ）に示したように ｐＸＹＬｌに挿入した。このプラスミドは、ｐＸＹＬ２と命名した。

（実施例６．３）キシラナーゼ発現カセットｐＸＹＬ３ＡＧおよびｐＸＹＬ３の 構築 両発現カセットは、ｐＸＹＬ２ＡＧまたはｐＸＹＬ２のＡＧ／キシラナーセ゛融 合物をアスペルギラス　ニガー　ベクターｐＡｍｄＳＨに挿入することにより作 よびＫｐｎｌ（部分的）で消化した。すべてのフラグメントは、ゲル電気泳動お よびエタノール沈殿で生成した。ｐＡｍｄＳＨの６．８ｋｂ　Ｋｐｎｌ／Ｈｉｎ ｄｌｌｌＤＮＡフラグメントに、ｐＸＹＬ２ＡＧまたはｐＸＹＬ２の５．３ｋｂ 　Ｋｐｎｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ　ＤＮＡフラグメントを加え、ライゲーションし、 つづいて大腸菌に両ライゲーション混合物を移行させることにより分子クローニ ングした。これらの発現力セラ）・を、ｐＸＹＬ３ＡＧ　（ＡＧリーダーを含む ）およびｐＸＹＬ３　（キシラナーゼリーダーを含む）と命名し、第１７図およ び第１８図に示した。

（実施例６．４）アスペルギラス　ニガーにおけるＡＧプロモーターコントロー ル化でのｘｌｎ　Ａ遺伝子の発現 ａ）アスペルギラス　ニガー（ＣＢ８５１３．　８８）のトランスホーメーショ ン両発現カセットｐＸＹＬ３ＡＧおよびｐＸＹＬ３をアスペルギラス　ニガーに 移す前に、大腸菌の配列をＨｉｎｄＩＩＩ消化、ゲル電気泳動およびエタノール 沈殿で除去した。アスベルギラス　ニガー（ＣＢＳ５１３．８８．１９８８年１ ０月１０８寄託）のトランスホーメーションは、以下に示すチルバーン（ＴｉＩ ｂｕｒｎ）、Ｊ、等（１９８３）およびケリー（Ｋｅｌｌｙ）およびハインズ（ Ｈｙｎｅｓ）（１９８５）の方法の修正法によりｌ　ｏμｇの線状化ＤＮＡフラ グメントを用いて行った。

−３００ｒｐｍのロータリーシェーカー中、３０℃、１６時間、１０ｍＭアルギ ニンおよび１０ｍＭプロリンを補ったアスペルギラス最小培地（コープ（Ｃｏｖ ｅ）、Ｄ、（１９６６））で菌糸体を増殖した。

−プロトプラストの生成には、ノボザイム２３４のみを使用し、ヘリカーゼは用 いなかった。

−プロトプラスト生成から９０分後、プロトプラストサスペンションに１倍容の ＳＴＣバッフｙ（１，２Ｍソルビトール、１０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（１）Ｈ７， ５）および５０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ）を加え、２５００ｒｐｍ、４℃、１０分間の スイングローターでの遠心を行った。このプロトプラストを洗浄し、１０’細胞 ／ｍｌの濃度となる　ようにＳＴＣバッファに懸濁した。

−ＴＥバッフｙ　（１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、０５１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ）１０μｌ中のプラスミドＤＮＡを１００μｌのプロトプラストサスペン ションに加えた。

−０℃、２５分間のＤＮＡ−プロトプラストサスペンションのインキュベーショ ン後、２００μｌのＰＥＧ溶液（２５％ＰＥＧ４０００（メルク）、１０ｍＭト リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、５０ｍＭＣａＣ１ｚ）を滴下した。つづいて 、試験管を混ぜながら、１ｍｌのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４　Ｑ　００（メル ク）、１０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）　、５０ｍＭＣａＣＩｔ）をゆっ くりと加えた。室温でのインキュベーション後、このサスペンションをＳＴＣバ ッファで希釈し、倒立により混合してから２０００ｒｐｍ、４℃、１０分間の遠 心を行った２００μｍのＳＴＣバッファにプロトプラストを穏やかに懸濁し、唯 一の窒素源としての１０ｍＭアセトアミド、１５ｍＭＣｓＣ１，１Ｍスクロース 、０．７５％の微生物学用寒天（オクソイド）を含むアスペルギラス最小培地に ブレーティングした。増殖は３３℃で６−１０日間行った。

ｂ）振盪フラスコでのトランスホーマントの増殖各発現カセットから単一のアス ペルギラス　ニガー　トランスホーマントを単離し、その胞子を選択的アセトア ミド−寒天プレートにストリークした。０．４％ポテト−デキストロース（オク ソイド、イギリス）寒天プレートで３７℃、３日間増殖した細胞から胞子を回収 した。以下の増殖条件で、キシラナーゼ生産を振盪フラスコ中でテストした。

−１リツトル中、Ｉｇ　ＫＨｔＰＯ４；３０ｇ　マルトース：５ｇ　イーストイ クストラクト；ｌＯｇ　カゼイン加水分解物；　０．５ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ， Ｏおよび３ｇ　トウィーン８０を含む１００ｍ１前培養培地に、約ｌ×１０８個 の胞子をイノキュレーションする。ｐＨは、５．５に調整した。

−ロータリーシェーカー中、３４°Ｃ５−晩培養後、増殖培地１ｍｌを、１リツ トル中、２ｇ　ＫＨ，ＰＯ２；７０ｇ　マルト−デキストリン（マルデックス　 ＭＤＯｓ　、アミラム）：１２．５ｇ　イーストイタストラクト２５ｇカゼイン 加水分解物；２ｇ　ＣａＣ１ｔ；０．０５ｇ　ＭｎＳＯ４”４ＨｔＯおよびＦｅ ＳＯ４を含む本培養培地１００ｍ１にイノキュレーションした。

ｐＨは、５．６に調整した。菌糸体は、少なくとも１４０時間増殖させた。

ｃ）トランスホーマントの分析 各トランスホーマントのキシラナーゼ分析は、５ＤＳ−ポリアクリノげミドゲル 電気泳動およびコマージブリリアントブルー染色、およびキシラン−レマゾール ブリリアントブルーＲで染色したザイモグラムによるキシラナーゼ活性測定で行 った。

キシラナーゼ活性は、レザース（Ｌｅａｔｈｅｒｓ）等、（１９８４）の方法の 修正法で測定した。基質は、１００ｍＭ　ＮａＡｃ　（ｐＨ３，５）に溶がし、 １００℃で１０分間加熱したオートキシラン、１％乃至５％溶液を使用した。さ らに、酵素反応は、３０℃の代わりに３９℃で行った。

各発現カセットから得られたトランスホーマントからランダムに選んだ数個の６ 日間振盪フラスコ醒酵上清のキシラナーゼ産生レベルを測定した。この結果を、 第１表に示す。

第１表 種々のリーダーとともにアスペルギラス　ニガーＡＧ−プロモーターのコントロ ール化にあ３ｘｌｎ　Ａ遺伝子を含むプラスミドでトランスホームしたい（っか のアスペルギラス　ニガーＣＢ５５１３．８８株のキシラナーゼ生産発現カセッ ト　トランスホーマント＃　キシラナーゼ活性（Ｕ／ｍ１） ｐｘｙＩ、ａ　１゜１　２４００ （ＡＧプロモーター／　１．２　１７００ｘｌｎリーダー）　１０　３６００ ｐＸＹＬ３ＡＧ （ＡＧプロモーター／　３．　１　２４０ＯＡ、ニが−ＣＢＳ５１３．８８ （コントロール株）　０ ３ＤＳ−ＰＡＧＥは、以下のように行った。先のｂ）で述べた増殖６日後、まず 、各トランスホーマントおよびアスペルギラス　ニガーコントロール株の４μｌ の上清を３ＭＮａＯＨでｐＨ７に調整し、レムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉＸｌ　９７ ０）に述べられているように、ｌＸ５Ｂバツフアで２０μｌとする。１００℃、 ５分間加熱後、この混合物をＳＯＳ／１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳 動で分画し、コマージブリリアントブルーで染色した。第１０Ａ図に示したよう 、見かけの分子量２５ｋＤａのタンパク質バンド（精製したキシラナーゼ（レー ン１）に相当する）が、トランスホーマント１０（レーン４）、２９（レーン５ ）および１．１（レーン６）に検出された。コントロール株（レーン２）には、 このタンパク質バンドはなかった。分子量マーカー（レーン２）は、９４．６７ ．４３．３０．２０および１４．５ｋＤａを示している。

以下に示すように、ザイモグラム分析を行った。先に使用した同じ試料を、非変 性の８−２５％ＦＡＡファーストシステムゲル（ＢＲＬ）で二度分画した。電気 泳動に続いて、ビーリー（Ｂｉｅｌｙ）等、（１９８５ａ）によって述べられて いるように、クーマシーブリリアントブルーで染色したゲルＡとレマゾールブリ リアントブルー−キシラン（メガザイム）で染色したゲルＢをｐＨ３，５で重ね 合わせ（第１１Ｂ図参照）、キシラナーゼ活性を観測した。このＲＢＢ−キシラ ンオバーレイゲルに乗せた試料は、第１Ｏ図および第１１Ａ図に示したゲルに乗 せた試料の５分の１である。第１１Ａ図および第１１Ｂ図のレーンは、第１０Ａ 図および第１０Ｂ図と同じである。

シダーゼプロモーターのコントロール下にある発現カセットでトランスホームし たアスペルギラス　ニガーＣＢ５５１３．８８中で、活性のあるエンドキシラナ ーゼが、発現および分泌されていることを示している。この発現および分泌は、 種々のアスペルギラス　ニガー　シグナル配列で観察された。さらに、部位１の セリン残基を欠くタンパク質も、キシラン分解活性を維持していた。

（実施例７）トリコデルマ　リーセイＱＭ９４１４におけるｘｌｎ　Ａ遺伝子に 関連する遺伝子のスクリーニング （実施例７．１）ＤＮＡフラグメントの３２Ｐラベリングト（ファルマシア）を 説明書にしたがって用いて、ランダムブライミングによりラベル化した。混合物 から未反応のび−”Ｐ−ｄＡＴＰを除くため、ＴＥバッファで容積を１００μｌ とし、セファデックスＧ５０カラムによる分画でα−″Ｐ−ｄＡＴＰを除去した 。放射能ラベルしたＤＮＡを含むフラクションを、１００℃、３分間の加熱で変 性し、氷水中で急冷することにより一本鎖を維持させた。

その後、６ＸＳＳＣ；　５Ｘデンハード液：０．１％ピロ燐酸ナトリウムおよび １００μｌ／ｍ、１熱変性ニシン精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーションバッ ファを加えた。

（実施例７．２）　トリコデルマ　リーセイＱＭ９４１４ＤＮＡのゲノムハイブ リダイゼーション 実施例２．１で述べたようにトリコデルマ　リーセイから単離した高分子量ＤＮ ＡをＢａｍＨＩ、Ｂｇｌ　ＩＩ、ＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩで消化した。生成し たフラグメントは、アガロースゲル電気泳動で分画し、マニアチス（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ）等（１９ｇ２．　ｐｐ、３８３−３８９）の方法でニトロセルロースメ ンブレンに移し取った。このニトロセルロースメンブレンを、ハイブリダイゼー ションバッファ（実施例７．１参照）中、５７℃、２時間かけてブレハイブリダ イズした。その後、実施例７．　１で述べた放射能ラベルしたフラグメントをハ イブリダイゼーションバッファに加え、ハイブリダイゼーションを４４時間続け た。

その後、フィルターをｌＸ５ＳＣ；０．１％ＳＤＳ；０．１％ピロ燐酸ナトリウ ム溶液中、５７℃、９０分間かけて洗浄し、最後に同温度の２ＸＳＳＣを用いて 洗浄した。メンブレンをワットマン３ＭＭペーパーにテープで貼り、放射能ラベ ルインクで正しくマークを付けてから、このフィルターをサランラップで包み、 コダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルムと規定の増感スクリーンを付けたコダックＸ− オマチックカセットを用いて一７０℃、７２時間のオートラジオグラフを行った 。

観察されたハイブリダイゼーションフラグメントを、第２表にまとめた。

第２表 プローブとしてアスペルギラス　ツビゲンシスｘｌｎ　Ａ遺伝子の７ラグメント を用いてトリコデルマ　リーセイ　ゲノムＤＮＡ中に観測されたハイブリダイジ ングフラグメントおよびその長さくｋ　ｂ　ｐ）ＢａｍＨＩ　ＢｇｌＩＩ　Ｅｃ ｏＲＩ　５ａ１１１６　１８°　１８”　６．８” １３”　９．４　４．２　３．８ ４、　０　（７，３） ４．２ ・＝最強のハイブリダイジングフラグメント（実施例７゜３）ｘｌｎＡ関連遺伝 子に関するトリコデルマ　リーセイ　ゲノムライブラリーのスクリーニング 関連遺伝子に関するトリコデルマ　リーセイ　ゲノムライブラリーのスクリーニ ングに選んだハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである。

６０℃、３−５時間の、６ＸＳＳＣ，０，ｔ％ＳＤＳ、０．　’０５％ピロ燐酸 ナトリウムおよび１００μｌ／ｍｌ熱変性ニシン精子ＤＮＡ溶液中でのプレハイ ブリダイゼーション；５７℃、４４時間の、ｅｘｓｓｃ、ｏ、ｉ％ＳＤＳ。

０．０５％ピロ燐酸ナトリウムおよび１００μｌ／ｍｌ熱変性ニシン精子ＤＮＡ 溶液中でのハイブリダイゼーション；６０℃、５ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ溶液 中での二回の洗浄；６０℃、ａＸＳＳＣ中での二回の洗浄。フィルターの３ＭＭ ペーパーへの張りつけおよび放射能ラベルインクによる正しいマーキングの後、 そのフィルターをサランラップで包み、規定の増感スクリーンを付けたコダック Ｘ−オマチックカセットを用い、−７０℃、７２時間かけてコダックＸＡＲ−５ Ｘ線フィルムを感光させた。この条件で、約５０個のポジティブシグナルが得ら れた。

（実施例７．　４）　トリコデルマ　リーセイｘｌｎ　Ａ関連配列を含むファー ジの分析 ハイブレダイジングバクテリオファージクローン１８個を実施例３．２に述べた ように精製し、そのうち９個のファージを選択して、実施例３．３に従ってこれ らのＤＮＡを単離した。このファージのＤＮＡをＨｉｎｃＩＩおよびＨｉｎｆ工 で消化して解析した。サザン分析（実施例７．１に述べられているように、ブい た）のハイブリダイゼーションパターンに基づいて、これらのファージを二つの クラスに分類した。分析したファージの内の５個をクラスＡ（ファージ＃１゜＃ ３．　＃４．　＃２０および＃２２）、４個をクラスＢ（ファージ＃ｌＯ，＃１ ６゜＃Ｘ、および＃Ｘ、）に分類した。各クラスから一つのファージを選択して 制限分析した（クラスＡのファージ＃ｌおよびクラスＢのファージ＃１０）。

Ｈｌフラグメントを用いたサザン分析を行った。得られたパターンに基づき、ク サブクローニング用に選択した。

ンして、プラスミドｐ　ＩＭＯ３０を作製した。プラスミドｐ　ＩＭＯ３０を含 む大腸菌ＪＭ１０９は、ＣＢ５４２０．９１として、オランダ、バーンの、セン トラルビューローボアシメルカルチａｒ　−（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　 ｖｏｏｒ　５ｃｈｉａｎｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）に登録した。

７．５ｋｂ　ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントを単離し、ついで、ライゲー ション、ＢａｍＨＩによる消化および脱リン酸化したベクターｐＵＣ９への挿入 によりプラスミドｐ１ＭＯ４１を生成した。プラスミドｐ　ＩＭＯ４１を含む大 腸菌ＪＭ１０９は、１９９１年７月１１日、ＣＢＳ　４２１．９１としてオラン ダ、バーンのセントラルビューローボアシメルカルチャーに登録した。

両プラスミドｐ　ＩＭＯ３０およびｐ　ＩＭＯ４１をさらに制限分析し、第１９ 図および第２０図に示した制限地図を作製した。

（実施例８）動物飼料組成物へのＸＹＬ　Ａ蛋白質の応用栄養消化性および家畜 生産性に関する小麦副産物に富む飼料へのエンドキシラナーゼ補填の効果は、以 下の実験で示した。

日令１才の雌のニワトリを、細末のケージに入れ、実験を開始するまで市販の離 乳食で飼った。１３日ｌ１ニワトリをランダムに配置し、グループ間の体重を等 しくした。グループ当たり８匹の１８グループのニワトリに三種の実験飼料を与 えた。飼料は、非常に柔らかいペレットで、１３−３４日間Ｃ」ヒ後）ニワトリ に適宜与えられた。

各ケージの飼料消費および成育を毎週モニターした。消化性は、３日間の排泄物 回収時に測定した。排泄物は、半定量的に回収した。マーカーを用い（ＨＣＩ不 溶性アッシュ）、蛋白質、脂肪、粗繊維および無窒素抽出物の各消化性係数を計 算した。各飼料の見かけの代謝二車ルギー（ＡＭＥ）は、以下の式から計算した 。

ＡＭＥ　（ＭＪ／ｋｇＤ、Ｍ、　） ＝１７．４６ａｌ＋３８．８１ａ２＋８．Ｏａ３＋１６．５ａ４ ａｌ＝粗蛋白質（グラム／ｋｇＤ、　Ｍ、　）　Ｘｄ、ｃ、　”ａ２＝粗脂肪（ グラム／ｋｇＤ、Ｍ、）ｘｄ、ｃ。

ａ３＝粗繊維（グラム／ｋｇＤ、Ｍ、）Ｘｄ、ｃ。

ａ４＝無窒素抽出物（グラム／ｋｇＤ、　Ｍ、　）　Ｘｄ、ｃ。

１）ｄ、ｃ、＝消化性係数 基本的飼料は、小麦のふすま、トウモロコシ澱粉および蛋白質に富む動物副産物 （第３表）。この飼料に、２種のレベル、３６０００Ｕ／ｋｇおよび１７４００ ０Ｕ／ｋｇで精製エンドキシラナーゼエンドキシラナーゼ（比活性３００，０ｏ ＯＵ／ｇ）を補った。

第３表 基礎飼料の組成 成分　％ 小麦ふすま　４０ トウモロコシ澱粉　３０ トウモロコシ　４．４ 動物副産物（ミートミール、フィツシュミール、フェザ−ミール）９．７大豆単 離物（８１％ｃｐ）　６．　０ 大豆オイル　６．０ 脂肪ブレンド　０．７ 石灰石粉末　０．３２ 燐酸−カルシウム　０．１３ プレミツクス（ＤＬ−メチオニンおよびリジン−ＨＣｌ含有）１．３５ＳｉＯｚ −マーカー（ダイヤモル）１．４理論的含量 ＡＭＥ　（ＭＪ／ｋｇ）　１２．６　ｓ粗蛋白質、％　１８．０ リジン、％　１．　２ メチオニン＋システイン、％　Ｏ１９ 分析含量 粗蛋白質、％　１８．２ 社■旨肪、％　９．７ 粗繊維、％　４．Ｉ Ｓｉｎｇ−マーカー、％　１．０７ 最も重要な結果を、第４表（性能データ）および第５表（消化性データ）にまと めた。性能データは、全実験期間１３−３４日間清化機）の結果であり、消化性 の数字は、２１−２４日および２８−３１日に回収した排泄物の分析結果の平均 値である。

第４表 日令１３−３４才のニワトリの性能に関するエンドキシラナーセ゛添加の効果飼 料ｌ　飼料２　飼料３ ３ｅｋＵ／ｋｇ　１７４ｋＵ／ｋｇ 飼料消費（ｇ／羽／日）９５．６　８９．７　９２．６第５表 有機栄養の消化性に関するエンドキシラナーゼの効果および飼料のエネルギー計 算値 粗脂肪、％　８５　９１　８２ 粗繊維、％　０　１１　１１ した。

性能の改善は、消化性係数に関する酵素添加の効果で説明される。すべての栄養 素の消化性が向上したが、脂肪消化性の増加がもっとも顕著であり、酵素添加飼 料のエネルギー価は、３．５％増加した。

これらの酵素含有レベルでは、投与一応答関係は確認されなかった。

（実施例９）製パンにおけるエンドキシラナーゼの使用２００ｇ小麦粉（１００ ％）、１０６ｍ１水（５３％）、１．２ｇインスタントドライベーカーズイース ト（０，６％ニギストブロケーズＮ、　Ｖ、　、デルフト、オランダ）、４ｇ　 ＮａＣ１（２％）、４００ｍｇ　ＣａＣ１ｔ・２Ｈ２０（０，２％）、１０ｍｇ 　菌類α−アミラーゼＰ２Ｏ０（ギストブロケーズ、２２５０ＳＫＢ／ｋｇ小麦 粉）および種々のユニットのエンドキシラナーゼ（ｘｙｌＡ）活性を混合して作 った１５０ｇの生パンからパブルーフを焼いた。ピンミキサー中、５２ｒｐｍで ６分１５秒混合したのち、生パンを分け、３１℃で７０分間ブルーフし、パンチ し、さらに２５分間ブルーフし、型に入れてから馴染ませた。最後に、３１’Ｃ で７０分間ブルーフした後、この生パンを２５０℃のオーブンで２０分分間−た 。パン容積は、ナタネ置換法で測定した。この結果を第６表に示す。

第６表 種々のエンドキシラナーゼ（ｘｙｌ　Ａ）活性を用いて調製したパンの特性エン ドキシラナーゼ　パン容積　パンの切れ＊　パン中身の構造＊活性（ユニット） 　（ｍｌ） １２８　５７９　７．５　７ ３２０　６０９　８　６．５ ６４０　６２１　７．５　６．５ ９６０　６２４　７．５　７ ２５６０　６１８　７．５　７．５ ＊＝１　（最低品質）から１０（ｆｉ高品質）までのスコアこれらの結果から、 生パンに添加したエンドキシラナーゼの量が多ければ、パン容積の増加、および パンの切れや中身の構造で表されるパンの品質の向上が得られることは明白であ る。

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Ｗｏｎｇ、　Ｋ、に、Ｙ、、　拡１４．　（１９８８）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｒｅｖ、、　５２．３０５−３１７゜Ｗｏｏｄｗａｒｄ、　Ｇ、（１９８４）　 Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍａ　Ｆａｒｍａｎｔ、　Ｂｉｏｔａｃｈｎｏｌ ＋。

８．９−３０゜ Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐａｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉａｒａ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｍａｓ ｓｉｎｇ、　：ｆ、（１９８５）　Ｇｅｎｅ。

３３．１０３−１０９゜ ＮａＣ１勾配　（〜０← Ｆｉｇｕｒｅ　３ アスペルギラスツビゲンシスＸＹＬ　Ａ　たんばく質のＮ末端アミノ酸蚤ｊリ オリゴヌクレオチドは対応するｍＲＮＡに相補的な残基４（Ａｓｎ）から残基１ ０（Ａｓｎ）までのＥＪＩＪに由来するＡＢ８０２　５１　ＴＴ　ＴＡ　ＴＴ　 ＴＧＧＡＣＴＭＴＴ　３嘗ＡＧＣＡ ＧＡＴ　Ｇ ＡＢ８０３　５’　ＴＴ　ＴＡ　ＴＴ　ＴＧＣＡＣＴＡＡＴＴ　３’ＡＢ８０４ 　５１　ＴＴ　ＴＡ　ＴＴ　ＴＧＡＡＣＴＡＧＴＴ　３１ＡＧＣＡ ＧＡＴ　Ｇ ＡＢ８０５　５’　ＴＴ　ＴＡ　ＴＴ　ＴＧＧＡＣＴＡＧＴＴ　３１ＡＢ８０６ ５嘗ＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＣＴＡＧＴＴ３’ＡＧＣ，Ａ Ｆｉｇｕｒｅ　４ （配列式　２） （Ｓり式　３） オリゴヌクレオチドは対応するｍＲＮＡに相補的な残基２（Ｔｙｒ）から残基７ （Ｔｙｒ）までの翫ｊすに由来するＦｉｇｕｒｅ　８ 翫ソリリスト シリタイプ　：対応するポリペプチドを持つクレオチド正ツリ長　：　２０５４ 　塩基対 組型　： トポロジｍ： 分子型　：ＯＮ＾ ＪＨ＋Ｏ１（ＣＢＳ　３２２．９０１ 特徴　Ｅ！：　８４Ｂ　−＋１５４　ｂｐ潜在的ＴＡＴＡシグナル９５０−１６ ３２コード１翫ジクリ ＋１７９−　１２３０イン即）１ ９５０−１０３１プレプロペプチド ＋０３１−１６３２成熟ペプチド ５９４−　７４Ｂ誘導に関する領域 ６１１１−　６３２　、　６３７−６５１ノ　６５６−６７２反止１ 特性　：（アスペルギラスニガー）エンドキシラナーゼ＾（ｘｌｎ＾）遺伝子Ｇ ＴＴＴＡＴＧＣＴＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣ丁ＧＧＧＴ＾ＡＧＴＴＧＡＴ ＣＧＣＴＣＣＴＧＣＡ丁ＴＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴ２４０ＧＣＡＡＡＡＴＧＣＡ 　ＴＡＴＧＡＣＴ（ｉＡＧ　ＴｉＣＣＴＴＣＡＡＣＧＴ（ｉｃＡＧＧＧｃＡ　Ａ ＡＧＧＧＡＴＡＡＡ　ＴＡＧＴＣＴＴsＴＴ　＋１４０ ＣＧＣＡＣＡ＾ＴＡＴＡＡ＾丁＾ＣＡＧＧＴＡｌａＡＧＣＧＧＧＣＴＣＣＩＣＡ ＣＩｃ＾ＡＴ＾τＴＣ＾ＣＣＡＧＣＡＣＡＩ：ＧＧＣＴＴＣs９００ ＴＴＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＴＡＣＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＡＴＴＣＡＧＣＴ ＴＴＣＴ１ＣＡＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣ９５８ｓｅｔ　ｔｙｓ　Ｖａｔ Ｆｉｇｕｒｅ　８　（Ｓｈｅａｔ　２　ｏｆ　３）Ｔｈｒ＾ｌａ＾覧ａＰｈｅＡ ｌａＧｌｙＬｅｕＬｅｕＶａＬＴｈｒ＾ＬａＰｈｅＡｌａＡｌｉρ「０＾（ａＣ ＣＡ　ＧＡＡ　ＣＣＴ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＴＣＧ　ＣＯ＾＾ＧＴ　ＧＣ ＣＧＧＴ　ＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＴＧ　ＣＡＡ　１０５４Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒ ｏ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ＾ｒｇ　Ｓｅｒ＾１ｍ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　 Ａｉｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　ＧＩｎＭＣＴＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴτＧＧＴＧ ＡＴＴＴＣＡＣＣＴＡ（ＧＡＣＧＡＧＡＧＴＧＣＣＧＣ＾１１０２＾ｓｎ　Ｔｙ ｒ＾ｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ 　Ａｓｐ　Ｇ［ｕ　Ｓｅｒ　ＡＬａ　ＧｌｙＡＣＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧＴＡＣＴ ＣＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＣＴＣＣＱ＾Ｃ丁ＴＴＧ丁ＣＧＴＴ１＋５０ Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　＋４ａｔ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ 　ＶａＬ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ＾ｓｐ　Ｐｈｅ　ＶａＬ　ＶａＬ２５　’＋０　３５ 　４０ Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ＾ ｓｎ＾Ｌａ　ｌｉｅ　Ｔｈｒτｙｒ　Ｓｅｒ＾ｌａ　ＧｌｕＴｙｒ　Ｓｅｒ＾【 ａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｉｍ　ＶａＬ 　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　ＶａｌＡｓｎＴｙｒＰｒｏＧｉｎ＾１ａＧｌｕＴｙ ｒＴｙｒＨ＋ＩＶａＬＧｌｕＡｓｐＴｙｒＧｌｙＡｓｐＴｙｒＡＡＣＣＣＴ　Ｔ ｏｅ　ＡＧＴ　ＴＣＧ　ＧＣＣＡＣＡ　ＡＧＣＣＴＴ　ＧＧＴ　ＡＣＣＧＴＧ　 ＴＡＣＴＣＴ　ＣＡＴ　ＧにＡ　１３９５Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｃｙａ　Ｓｅｒ　Ｓ ｅｒ＾ｌａτｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ ＾５ｐＧＬｙ９０　９５　ｔｏｏ　１０５ ＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＡＡＧＴＣＴＧＣＡＣＣＧＡＣＡＣ丁ＣＧＡＡＣＡＡＡＣ ＧＭＣＣＧＴＣＣ＾ＴＣ＋４／、２Ｓｅｒ丁ｈｒＴｙｒＧｌｎＶａＬＣｙｓＴｈ ｒ＾５ｐＴｈｒ＾ｒｇ１ｈｒＡｓｎＧｌｕＰｒｏＳａｒＩｌｅＦｉｇｕｒｅ　８ 　（Ｓｈｅｅｔ　３　ｏｆ　３）ＡｅＧ　ＧＩＪ　ＡＧＡ　ＡＧＣＡＣＧ　ＴＴ ＣＡＣＣＣＡＧ　ＴＡ（：　ＴＴＣＴＣＣＧＴＴ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＧＣＡＣ （ｉ　＋４９O Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　 Ｐｈｅ　Ｓ＠ｒ　ＶａＬ＾ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ１２５、　１３０　１ ３５ ＧＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣ＾＾ＣＧＧＴＧＡＣ丁（ｉＴＴＧＣＣＡＡＣＣ＾ＴＴＴ ＣＡＡＣＴＴＣＴＧＧにＣ（ｉ１５３Ｂ＾ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈ ｒ　Ｖａｋ　Ｔｈｒ　Ｖｓｌ　ＡｌａＡｓｎ　Ｊｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　 Ｔｒｐ　Ａ１ｍ＋４０　１４５　１５０ ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＧＧＯＴＴＣ（ＧＣＡＡＴ　ＡＣＧ　ＧＡＣＴＴＣＡＡＴ　Ｔ ＡτＣＡＧ　ＧＴＣＧＴＧ　ＧＣＧ　ＧＴＣ１５ａ６Ｉｔｉｓ　ＩＮｓ　ＧＬｙ 　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ 　Ｖａ（Ｖａｌ＾ｌａ　Ｖａｔ＋５５　４６０　１６５ ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＴＧＧ　ＡＣＣＣ１ＧＴ　（ＩｃＴ　ＧＧＣＡＧＣ（Ｉｃτ＾ ＧＴ　ＧＴＣＡＣＡ＾ＴＣＴＣＴ　ＴＣＴ　ＴＧ＾　１６３S Ｇｌｕ　ＡｌａＴｒｐ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　Ａｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ｓｅ ｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ＋７０　４７５　１８０ ＴＧＴＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＧＴＴＴＴＣＡＣＣＴＴＧＣＡＣＡＧＡＴ＾ＡＴＣ ＡＡＣＴＣＴＣＧ丁ＴＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＧＣＩ：４８P４ ＣＴＴＡＧＧＡＣＴＯＣＧＧＧ丁ＡＡＴＡＴＡＧＡ（ｉＡｃｃＧＡ＾ＡＴＴＴＣ ＴＡＣＡＧＴＴＣＧＡＴＩ：ｉＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＣＧＡQ０５４ Ｆｉｇｕｒｅ　９ 、、、〜９−−ｑ−−−！ −−一　へ Ｌａｎｅｓ　１および１４：　精製キシラナーゼＡ　（ＸＹＬ　Ａ）Ｌａｎｅｓ 　２および１：ｌ：ン、＝Ｊｆ−Ｎ５９３　非形質転換株Ｌａｎｅｓ　３−７： 　Ｎ２−三ｊ辷二　Ｎ５９３　１−ランスホーマント　ＴｒＸ２培養戸培養粗液 希釈物　：Ｗ訳、１：１゜１：４．　１：１Ｇ、１：３２　） Ｌａｎｅｓ　８−４２：　Ｎ２−三４Ｌ二　Ｎ５９３　）う：／Ｘホーマント　 ＴｒＸ９培衡戸液希釈物　：　０希釈・　１２１１１：４．　１：１６．　１： ３２　） へ ＡＧ／キシラナーゼ融合 用ブライｖ　１７７１　１９８０　１９８６　１９８４Ｆｉｇｕｒｅ　１５ ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｋｐｎｌ　＜ｓ分分ｍ　ＫｐｎＴ／ＨｉｎｄＩＩＩ　（部分分 解＞（ＡＧ／キシラナーゼフラグメント　）（全プラスミド　）Ｆｉｇｕｒｅ　 １Ｂ 要約書 国際調査報告　ＰＣＴ／ＮＬ　９１１００１３７キシラナーゼ活性を有するポリ ペプチドをコードする菌類由来の遺伝子のりｌ−ニングおよび選択された微生物 宿主における該遺伝子の過剰発現を目的とし１方法および発現構築物が提供され る。一般に、菌類由来のキシラナーゼの至ｊ［）Ｈ値は低く、この酵素は、バク テリア由来のキシラナーゼに比べてより広（ｐＨ範囲で安定である。本発明は、 低いＩ）Ｈ条件でキシラナーゼ活性を必要とる種々の工業的用途に使用しうる菌 類キシラナーゼの高レベルの生産を提供す。

、、、　Ａ＋ｌｌ＋Ｍ＋Ｎ＋　ＰＣＴ／ＮＬ　９１１００１３７Ｉ＠電−暴＾− ，，＝、、ＰＣＴ／ＮＬ９１１００１３７国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡ配列が、 ａ）キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする菌類由来のＤＮＡ配列 、 ｂ）ａ）の配列の遺伝的変異体、 ｃ）ａ）およびｂ）のいずれかの配列にハイブリダイズしうるＤＮＡ配列、以上 ａ）乃至ｃ）からなる群から選択されることを特徴とするキシラナーゼ活性を有 するポリペプチドをコードする精製単離されたＤＮＡ配列。
2. ２．ＤＮＡ配列が、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ジスポロトリ カム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ ｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ ｍ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる属から選択される 菌類に由来することを特徴とする請求項１記載の精製単離されたＤＮＡ配列。
3. ３．ＤＮＡ配列が、アスペルギラス　ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔ ｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉ ｇｅｒ）、アスペルギラス　アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒ ｉ）、アスペルギラス　アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａ ｔｕｓ）、ジスポロトリカム　ジモルフォスポラム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈ ｕｍ　ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｍ）およびトリコデルマ　リーセイ（Ｔｒｉ ｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）からなる群から選択される菌類に由来するこ とを特徴とする請求項２記載の精製単離され　たＤＮＡ配列。
4. ４．ＤＮＡ配列が、 ａ）第８図に示したＤＮＡ配列、 ｂ）ａ）の配列の遺伝的変異体、 ｃ）ａ）およびｂ）のいずれかの配列にハイブリダイズしうるＤＮＡ配列、以上 ａ）乃至ｃ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の精製単 離されたＤＮＡ配列。
5. ５．適当な発現宿主内でのキシラナーゼ活性を有するポリペプチドの過剰発現を 指令しうる調節領域と機能的に結合した、請求項１記載のＤＮＡ配列を含むこと を特徴とするＤＮＡ構築物。
6. ６．キシラナーゼコード遺伝子が、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ） 、ジスポロトリカム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎ ｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フサリウム（ Ｆｕｓａｒｉｕｍ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる属 から選択されることを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ構築物。
7. ７．菌類キシラナーゼをコードする遺伝子が、アスペルギラス　ツビゲンシス（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギラス　ニガ−（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギラス　アワモリ（Ａｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギラス　アクリータス（Ａｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、ジスポロトリカム　ジモルフォスポラ ム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｍ）およびト リコデルマ　リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）からなる群か ら選択される菌類に由来することを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ構築物。
8. ８．調節領域が、アミログルコシダーゼ遺伝子由来のプロモーターおよびキシラ ナーゼ本来のプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含むことを 特徴とする請求項５記載のＤＮＡ構築物。
9. ９．調節領域が、アミログルコシダーゼ遺伝子由来の分泌リーダー配列およびキ シラナーゼ遺伝子本来の分泌リーダー配列からなる群から選択される分泌リーダ ー配列を含むことを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ構築物。
10. １０．微生物宿主が、請求項５乃至９のいずれか１項記載の発現構築物を含むこ とを特徴とする菌類キシラナーゼを過剰発現しうる形質転換微生物宿主。
11. １１．微生物宿主が、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クルイベロ ミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ ａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ）からなる属から選択されることを特徴とする請求項１０記載の形質 転換微生物宿主。
12. １２．微生物宿主が、アスペルギラス　ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂ　ｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ 　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギラス　アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａ ｍｏｒｉ）、アスペルギラス　アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌ ｅａｔｕｓ）、アスペルギラス　オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａ ｅ）、トリコデルマ　リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）、枯 草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス　リチェニムルミス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス　ラクチ ス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）およびサッカロミセス　セレ ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる属から 選択されることを特徴とする請求項１０記載の形質転換微生物宿主。
13. １３．キシラナーゼ活性を有するポリペプチドを過剰発現させる方法で、ａ）キ シラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導する条件 下で、請求項１０記載の微生物宿主を培養する、ｂ）キシラナーゼ活性を有する ポリペプチドを回収する、以上ａ）およびｂ）のステップを含むことを特徴とす る方法。
14. １４．請求項１３記載の方法で生産されることを特徴とするキシラナーゼ活性を 有するポリペプチド。
15. １５．キシラン含有基質を分解することを目的とした請求項１４記載のキシラナ ーゼ活性を有するポリペプチドの使用。
16. １６．動物の飼料を調製することを目的とした請求項１４記載のキシラナーゼ活 性を有するポリペプチドの使用。
17. １７．請求項１４記載のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特 徴とする動物飼料組成物。
18. １８．パンの製造用のパン生地への、請求項１４記載のキシラナーゼ活性を有す るポリペプチドの使用。
19. １９．請求項１４記載のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドを含むことを特 徴とするパン製造用のパン生地。
20. ２０．紙製品製造におけるクラフトパルプからリグニンを除去することを目的と した請求項１４記載のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドの使用。
21. ２１．請求項１４記載のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドで処理したこと を特徴とするクラフトパルプ。
22. ２２．ｐＩＭ１００（ＣＢＳ３２２．９０）。
23. ２３．ｐＩＭ０３０（ＣＢＳ４２０．９１）。
24. ２４．ｐＩＭ０４１（ＣＢＳ４２１．９１）。
25. ２５．アスペルギラス　ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｕｂｉｇｅ ｎｓｉｓ）ｘｌｎ　Ａ遺伝子の５′ノンコーディング領域に存在する、精製単離 された発現および転写調節領域。