JP2002533121A - タンパク質 - Google Patents

タンパク質

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JP2002533121A JP2000591181A JP2000591181A JP2002533121A JP 2002533121 A JP2002533121 A JP 2002533121A JP 2000591181 A JP2000591181 A JP 2000591181A JP 2000591181 A JP2000591181 A JP 2000591181A JP 2002533121 A JP2002533121 A JP 2002533121A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、種々のキシラナーゼ同様にエンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤を開示するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質に関する。特に本発明は、小麦粉に含まれる内因性エン
ド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤の単離に関し、また該阻害剤が種々のキシ
ラナーゼに及ぼす効果を特徴化することに関する。本発明はさらに、該阻害剤を
用いたスクリーニングにより同定されたキシラナーゼ、及びかかるスクリーニン
グにより同定された新規のキシラナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
キシラナーゼは、ここ数年製パンに使用されてきた。このことに関しては、小
麦粉には内胚乳細胞壁由来のアラビノキシランが含まれていることが知られてい
る。小麦粉に含まれるアラビノキシランの量は小麦粉の種類によって異なり、Ro
uau et al, Journal of Cereal Science, (1994), 19, 259-272, Effect of an
Enzyme Preparation Containing Pentosanases on the Bread-making Quality o
f Flour in Relation to Changes in Pentosan Properties、Fincher and Stone
, (1986) Advances in Cereal Technology, Vol. VIII (Why Pomeranz, Ed.) AA
CC, St.Paul, Minnesota, 207-295、及びMeuser and Suckow (1986), Chemistry
and Physics of Baking (J.M.V. Blanchard, P J Frasier and T Gillard, Eds
.) Royal Society of Chemistry, London, 42-61が、文献例として挙げられる。
一般的にアラビノキシラン量は、２〜５％（小麦粉乾燥量に基づく（ｗ／ｗ））
である。
【０００３】 Fincher and Stone(1986)は、内胚乳細胞壁における多糖類の７０％はアラビ
ノキシランであると報告している。アラビノキシランの特徴は、水への結合力で
ある。アラビノキシランの一部分は不溶性ペントサン（ＷＩＰ）であり、また一
部分は水溶性ペントサン（ＷＳＰ）である。ＷＩＰの高分子量（ＨＭＷ）水溶性
重合体への分解と、パン嵩との間に相関関係があることが実験結果から明らかに
されている。
【０００４】 パン製品の製造過程で、適正量のキシラナーゼを使用することにより、生地系
（通常、塩、小麦粉、酵母、及び水からなる）がより安定することが知られてお
り、例えばパン嵩が増したふっくらとしたパンを製造することができる。 この点に関し、パン嵩を増すために良好なキシラナーゼとは、ＷＩＰを可溶化
し、ＷＳＰをキシロースオリゴマーまで分解することなく生地液の粘度を増加さ
せるものをいう。ＷＩＰが低分子量（ＬＭＷ）ＷＳＰに分解されると、生地が損
なわれ、粘度増加につながると考えられている（Rouau et al and McCleary (19
86) International Journal of Biological Macro Molecules, 8, 349-354）。
【０００５】 米国特許５３０６６３３号明細書には、Bacillus subtilis株から得たキシラ
ナーゼが開示されている。かかるキシラナーゼは、該キシラナーゼを含むパン及
び焼き製品のコンシステンシーを改良し、嵩の増量に寄与すると考えられている
。 Bacillus subtilisからはこの他にもキシラナーゼが単離され、配列決定がな
されている（Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M., Jurasek, L. an
d Yaguchi, M. A xylanasse gene from Bacillus subtilis: nucleotide sequen
ce and comparison with B. pumilus gene, Arch. Microbiol. 144, 201-206 (1
986)を参照のこと）。 細菌性キシラナーゼを使用すると、非常に粘度の高い生地になると考えられて
きた。そのため、Bacillus subtilis由来のキシラナーゼ（例えば米国特許５３
０６６３３号明細書に開示された）を用いると非常に粘度の高い生地になると考
えられていた。
【０００６】 粘度増加の原因となる先行技術における酵素は、粘度が逆に効率的大量生産上
の取扱いを困難にさせることがないように、その使用量を注意深く調整する必要
がある。しかし使用量を注意深く調整しなければならないということは、生地製
造の前にキシラナーゼを直接小麦粉に加えることができないことを意味する。従
って、先行技術によるシステムでは、生地製造過程において極めて注意深くキシ
ラナーゼを加えなければならなかった。
【０００７】 真菌性キシラナーゼは、今日に至るまでベーキングに一般的に用いられてきた
。例えばJ Maat et al.（Xylans and xylanases, J Visser et al著, 349-360,
Xylanases and their application in bakery）は、Aspergillus niger var. aw
armori株から産生されるβ−１，４−キシラナーゼについて教示している。J Ma
at et al.らによると、かかる真菌性キシラナーゼは、明らかにパン嵩増量に効
果的であり、他の種類の真菌、又は細菌由来のキシラナーゼを用いるときにみら
れるような生地取扱い上の不利益（生地の粘度）を生じることなく、パン嵩を増
量できると述べている。
【０００８】 W Debyser et al.,（J. Am. Soc. Brew. Chem. 55(4), 153-156, 1997, Arabi
noxylan Solubilization and Inhibition of the Barely Malt Xylanolytic Sys
tem by Wheat During Mashing with Wheat Wholemeal Adjunt: Evidence for a
New Class of Enzyme Inhibitors in Wheat）は、キシラナーゼ阻害剤が小麦粉
に含まれている可能性について言及している。W Debyser et al.が論じている該
阻害剤は単離されていない。さらにW Debyser et al.は、該阻害剤が内因性であ
るか又は微生物由来であるかについても言及していない上に、かかる阻害剤に関
する化学的データも全く提示していない。
【０００９】 キシラナーゼ阻害剤の小麦粉における存在については近年X Rouau and A Surg
et, （Journal of Cereal Science, 28 (1998) 63-70, Evidence for the Prese
nce of a Pentosanase Inhibitor in Wheat Flours）も論じている。Debyser et al.,と同様に、Rouau and Surgetも、小麦粉の水溶性画分における、添加ペン
トサナーゼ活性を抑制する熱不安定性成分の存在を同定したと考察しているが、
Debyser et al.,と同様に、阻害剤を単離しておらず、該阻害剤が内因性である
かあるいは細菌由来であるかについての結論を導き得なかった。かかる阻害剤に
関する化学的データを提示していない点についてもDebyser et al.,と同様であ
る。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、当該技術が抱える課題は、取扱い上の不利な性質を有さない生地から
の焼き製品の生産方法に関するものであり、より詳細には、低粘度の生地（取扱
い及び製造過程において問題となるほど粘度が高くない生地）をいかに提供する
かということにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、かかる課題を解決する目的でなされたものであり、本発明の内容は
請求項及び以下の記述に示される。簡潔に述べると本発明は、 １．内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤、該阻害剤をコードする
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びにそれらの変異体、相同物又は断片 ２．β−１，４−キシラナーゼ阻害剤が、種々のキシラナーゼにもたらす効果
を測定するアッセイ方法 ３．種々のキシラナーゼが、生地にもたらす効果を測定するアッセイ方法 ４．グルカナーゼ（類）が、種々のキシラナーゼ含有生地にもたらす効果を測
定するアッセイ方法 ５．新規のキシラナーゼ類、該新規キシラナーゼ類をコードするヌクレオチド
及びアミノ酸配列、並びにそれらの変異体、相同物又は断片。 ６．キシラナーゼの新規な使用法 ７．種々のキシラナーゼを用いて生産した食品 に関するものである。
【００１２】 ［発明の詳細な説明］ 本発明のアミノ酸配列及び／又は本発明のヌクレオチド配列には、本発明の配
列を含むか若しくは発現し得る構築物、本発明の配列を含むか若しくは発現し得
るベクター、本発明の配列を含むか若しくは発現し得るプラスミド、本発明の配
列を含むか若しくは発現し得る組織、本発明の配列を含むか若しくは発現し得る
器官、本発明の配列を含むか若しくは発現し得る形質転換宿主、及び本発明の配
列を含むか若しくは発現し得る形質転換生物が含まれる。本発明はまた、本発明
のアミノ酸配列及び／又は本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法、例えば
、上記配列を転移させる方法を含め、微生物において発現させる方法に関する。
【００１３】 本発明はＷＯ−Ａ−９８／４９２７８の教示とは異なる。なぜならかかるＰＣ
Ｔ特許出願においては、開示しているタンパク性阻害剤の配列に関する情報が最
小限のものでしかないからである。 本発明の詳細について、以下に適当な見出しをつけて説明する。便宜上本発明
に関し、一般的に応用可能な教示については、「一般的定義」及び「一般的教示
」としたセクションにおいて述べたが、各セクションにおける教示は必ずしもそ
のセクションの内容に限定されるものではない。
【００１４】 （一般的定義） ここで使用する「小麦粉」なる用語は、小麦を細かくひいた粗挽き粉と同義語
である。しかし好ましくは、該用語は、小麦自体から得た小麦粉を意味し、他種
の穀類から得たものを意味しない。よって、特に限定しないときには、ここで使
う「小麦粉」とは、生地等の媒体中に含まれる小麦粉同様、小麦粉自体を意味す
ることが好ましい。 「キシラナーゼ」なる用語は、その通常の意味で使われる。すなわち、小麦に
含まれると考えられるアラビノキシランの脱重合をそれ自体で触媒し得る酵素（
すなわち、該酵素自体がＷＩＰの可溶化の触媒能を有し、小麦に含まれるＷＳＰ
の脱重合の触媒能を有する酵素）のことである。 エンド−β−１，４−キシラナーゼ活性を測定するアッセイに関しては後述す
る。便宜上かかるアッセイを「キシラナーゼアッセイ」と呼ぶ。
【００１５】 本発明において、「ヌクレオチド配列」なる用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ
、組換えＤＮＡ（すなわち、組換えＤＮＡ技術により調製したＤＮＡ）、合成Ｄ
ＮＡ、及びＲＮＡ、さらにこれらの組み合わせを含む。 好ましくは「ヌクレオチド配列」なる用語はＤＮＡを意味する。 本発明のヌクレオチド配列は、一本鎖又は二本鎖のどちらでもよい。 本発明のヌクレオチド配列には、合成又は修飾ヌクレオチドを含んでいてもよ
い。当該技術分野において、オリゴヌクレオチドに対する修飾方法は、数多く知
られている。かかる修飾方法には、分子の３'及び／又は５'側においてアクリジ
ン又はポリリジン鎖を付加するメチルホスホネート(methylphosphonate)及びホ
スホロチオエート(phosphorothioate)をバックボーンとするものが含まれる。本
発明の目的に鑑みて、本発明におけるヌクレオチド配列は当該技術分野のいかな
る手法によって修飾してもよいと理解すべきである。本発明のヌクレオチド配列
のインビボでの活性増強又は長期生存をはかるために、このような修飾が行われ
るのである。
【００１６】 本発明のヌクレオチド配列及び本発明のアミノ酸配列について、「変異体」又
は「相同物」なる用語は、それら配列の対立変異と同義語である。 特に、ここで使われる「相同性（homology）」とは「同一性（identity）」と
同じ意味と解釈してよい。ここにいう本発明のヌクレオチド配列及び本発明のア
ミノ酸配列における配列の相同性は、１又は２以上の配列を別の配列と比較して
、その別の配列が、元の配列と少なくとも７５％一致しているかどうかをみると
いう、単に「目測（eyeball）」による比較（厳密な比較のこと）を行うことに
よって決定できる。相対的な配列の相同性（すなわち配列の同一性）は、２又は
３以上の配列間における相同性割合（％）を計算する市販のコンピュータープロ
グラムを用いて決定することも可能である。かかるコンピュータープログラムの
主な例としてCLUSTALが挙げられる。
【００１７】 相同性は、目視により比較可能である。しかし、容易に入手できる配列比較プ
ログラムによる比較が、より一般的である。かかる市販のコンピュータープログ
ラムにより、２又は３以上の配列間における相同割合が計算できる。 近接した配列間の相同割合を計算することもできる。すなわち、ある配列が別
の配列と一直線上に並び、そのある配列における各アミノ酸と、もう一方の配列
においてそれぞれ対応しているアミノ酸とを一残基毎に直接比較することもでき
る。これを「アンギャップ」アラインメント（alignment）と呼ばれ、このよう
なアンギャップアラインメントは、残基数が比較的少ない場合に行われる（例え
ば５０個未満の近接したアミノ酸）。
【００１８】 かかる方法は、極めて簡便かつ堅実な方法ではあるが、例えば、本来は互いに
同一な配列であっても、挿入又は欠失が１個でも生じれば、以下に続くアミノ酸
残基がアラインメントからはみ出すことになり、従ってこの方法をアラインメン
ト全体に行うときには相同割合が大きく低下する可能性があることを考慮する必
要がある。そのため殆どの配列比較法は、全体としての相同割合を過度に損なわ
ない程度の挿入及び欠失を考慮した最適アラインメントを作出するようにデザイ
ンされている。このことは、局所的相同性を最大化するために、配列アラインメ
ントに「ギャップ」を挿入することにより達成できる。
【００１９】 しかしながら、上述のより複雑な方法では、アラインメントに生じるギャップ
の各々に「ギャップペナルティー」を割り当てており、そのため同一アミノ酸の
数が同じ場合には、できるだけギャップが少ない配列アラインメントの方が（比
較する二配列間の高い相関性を反映して）、ギャップが多い配列アラインメント
よりも高いスコアが得られる。ギャップの存在には比較的高コストを課し、該ギ
ャップにおいて次に現れる各残基には少ないペナルティーを課す「アフィンギャ
ップコスト」が一般的に用いられている。これは、最もよく使用されるギャップ
評価システムである。ギャップの高ペナルティーにより、少ないギャップで最適
なアラインメントを作製できることはいうまでもない。殆どのアラインメントプ
ログラムでは、ギャップペナルティーの修飾が可能である。しかし、配列比較の
ためにこのようなソフトウエアを使用する際には、デフォールト値を用いること
が好ましい。例えば、後述するGCG Wisconsin Bestfit packageを使用するとき
、アミノ酸配列に対するデフォールトギャップペナルティーは、ギャップについ
て−１２で、各伸張部分について−４である。
【００２０】 従って、相同性の最大値（％）を算出するには、ギャップペナルティーを考慮
しつつ、先ず最適アラインメントを作出することが必要とされる。かかるアライ
ンメントを実行するのに適したコンピュータープログラムは、GCG Wisconsin Be
stfit package（University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, N
ucleic Acids Research 12:387）である。配列比較を実施できるソフトウエアと
しては、この他に、例えば、BLAST package（Ausubel et al., 1999 (Chapter 1
8)を参照のこと）、FASTA（Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410）
、及びGENEWORKS suite of comparison toolsを挙げることができるが、これら
に限定されるものではない。BLAST及びFASTAでは、オフライン及びオンラインに
よるサーチが可能である（Ausubel et al., 1999, 7-58〜7-60頁を参照のこと）
。しかし、GCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい。
【００２１】 相同性の最終的な割合（％）は、同一性の観点から測定できるが、アラインメ
ントプロセス自体は通常、オールオアナッシング式の二者比較に基づくものでは
ない。その代わりに、化学的類似性又は進化論的距離に基づく各ペアの比較評価
を行う目盛りのついた類似性評価マトリックスが一般的に用いられる。かような
マトリックスのうち汎用されているものの一例としては、プログラムのBLAST su
iteのデフォールトマトリックスであるBLOSUM62マトリックスが挙げられる。GCG
Wisconsinプログラムでは、公知のデフォールト値、又は、もし供給されていれ
ば特別仕様のシンボル比較表のどちらかを使用するのが一般的である（詳細につ
いてはユーザーマニュアルを参照されたい）。GCGパッケージには公知のデフォ
ールト値、その他のソフトウエアにはBLOSUM62等のデフォールトマトリックスを
使用することが好ましい。一旦ソフトウエアが最適アラインメントを作出すると
、相同割合（％）、好ましくは配列の同一割合（％）の計算が可能になる。ソフ
トウエアは通常、配列比較の一端としてかかる計算をし、数字で結果が出る。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTで入手でき、デフォールトパラメーター
を使う簡便なBLASTサーチアルゴリズムによって配列比較を行うことが好ましい
。
【００２２】 また本発明には、本発明のヌクレオチド配列の相補配列、その派生物、断片又
はその派生物も含まれる。配列が、その断片と相補的であれば、他の生物等にお
ける類似のコード配列を同定するプローブとして、該配列を用いることができる
。本発明にはまた、本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ
るヌクレオチド配列、並びにその派生物、断片又はその派生物も含まれる。本発
明のヌクレオチド配列の相補配列、その派生物、断片又はその派生物とハイブリ
ダイズすることができるヌクレオチド配列、並びにその派生物、断片又はその派
生物も本発明に含まれる。「相補」なる用語は、コード配列のヌクレオチド配列
とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列も包含している。
【００２３】 「変異体」なる用語は、ここに示すヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な
配列の相補配列も包含している。「変異体」なる用語は、ストリンジェントな条
件（６５℃で０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５
Ｎａ3クエン酸塩ｐＨ７．０｝）において、ここに示すヌクレオチド配列とのハ
イブリダイズ能を有する配列の相補配列を包含している。
【００２４】 本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（相補配列を含む）とハイブリダイ
ズすることができるヌクレオチド配列や、本発明のヌクレオチド配列（ここに示
す相補配列を含む）とハイブリダイズ可能な配列の相補ヌクレオチド配列に関す
る。ここで「ハイブリダイゼーション」なる用語は、Dieffenbach CW and GS Dv
eksler （1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press
, Plainview NY）記載のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術により行う増幅プロ
セス同様、「核酸の鎖が、塩基ペアリングにより相補鎖と結合するプロセス」（
Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY
）を含む。
【００２５】 本発明の範囲には、中程度ないし最大限のストリンジェンシーにおいて、ここ
に示すヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有するポリヌクレオチド配列も
また含まれる。Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techni
ques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)が教
示しているように、ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体の溶解温度
（Ｔｍ）に基づいており、それにより後述の明確な「ストリンジェンシー」が決
まる。
【００２６】 最高にストリンジェントな条件は、Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い
）で生じる。Ｔｍ−５℃〜１０℃で高度のストリンジェンシーが生じる。Ｔｍ−
１０℃〜２０℃で中間ストリンジェンシーが生じる。Ｔｍ−２０℃〜２５℃で緩
やかなストリンジェンシーが生じる。当該技術の専門家であれば理解するところ
であるが、最高にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、同
一ポリヌクレオチド配列を同定、若しくは検出するときに行い、一方、中間（又
は緩やかな）ストリンジェンシーによるハイブリダイゼーションは、類似、若し
くは関連ポリヌクレオチド配列を同定、若しくは検出するときに行う。 本発明は、好ましくは、本発明のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件
下（６５℃で０．１×ＳＳＣ）でハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含ん
でいる。
【００２７】 （内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤） 本発明の目的の一つは、小麦粉から得られる内因性エンド−β−１，４−キシ
ラナーゼ阻害剤を提供することであり、本発明者らの研究の結果、かかる阻害剤
は分子量約４０ｋＤａ（ＳＤＳ又はＭＳで測定）のジ−ペプチド（di-peptide）
であり、そのｐｌは、約８〜約９．５であることを見い出した。本発明において
該阻害剤は、単離した形態及び／又は実質的に純粋な形態にあるものをいい、こ
こで「単離した」とは、該阻害剤が天然の環境下にはないことを意味する。
【００２８】 現在までの配列解析によって、上記阻害剤が、配列番号１３、配列番号１４、
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番
号１９の内、少なくとも１又は２以上の配列をもつことが解明されている。この
ように本発明は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、
配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９、並びにそれらの変異体
、相同物、又は断片の内、少なくとも１又は２以上の配列をもつエンド−β−１
，４−キシラナーゼ阻害剤を包含している。
【００２９】 本発明の阻害剤に関して、「変異体」、「相同物」、又は「断片」なる用語は
、配列に対する１（又は２以上）個のアミノ酸のいかなる置換、変異、修飾、代
替、欠失、又は付加をも含み、その結果生じたアミノ酸配列が、配列番号１３、
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、及
び／又は配列番号１９の内少なくとも１又は２以上の配列を含む阻害剤と、好ま
しくは少なくとも同程度の活性を有するキシラナーゼ阻害活性を示すものをいう
。特に「相同性」なる用語は、結果として得られる阻害剤にキシラナーゼ阻害活
性が、好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、
配列番号１７、配列番号１８、及び／又は配列番号１９の内少なくとも１又は２
以上の配列を有する阻害剤と少なくとも同程度の活性を示すような構造及び／又
は機能に関する相同性を意味する。配列の相同性（配列の類似性又は配列の同一
性）に関しては、添付の配列リストに示される配列と、好ましくは少なくとも７
５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、
特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有することが望ましい。とりわけ、
添付の配列リストに示される配列と、より好ましくは少なくとも９５％、一層好
ましくは少なくとも９８％の相同性を有することが望ましい。阻害剤の想定され
る変異体としては、現在のところ、配列番号１及び配列番号２として示される少
なくとも１以上の配列を有するものを例示することができる。
【００３０】 本発明の阻害剤は、多くの理由から有用である。例えば、内因性エンド−β−
１，４−キシラナーゼ阻害剤の化学的な同定が公知である今日においては、研究
者らは、例えば小麦に存在する該阻害剤を定量できるのである。便宜上、この方
法を「阻害剤含有量測定法（Inhibitor Amount Determination Method）」と呼
ぶことにする。かかる阻害剤含有量測定法により研究者らは、小麦に添加するの
に適したキシラナーゼを１又は２種以上選択できるようになり、及び／又は小麦
に添加する１又は２以上のキシラナーゼ類の適量を選択できるようになった。
【００３１】 すなわち本発明は、（ａ）小麦粉における阻害剤の含有量又は種類を決定し、
（ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼを選択し、及び／又は小麦粉に
添加するキシラナーゼの適量を選択し、また（ｃ）適正なキシラナーゼ、及び／
又は適量のキシラナーゼを小麦粉に添加する方法を提供するものである。
【００３２】 また本発明は、（ａ）小麦粉における阻害剤の含有量又は種類を決定し、（ｂ
）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼ阻害剤を選択し、及び／又は小麦粉
に添加するキシラナーゼ阻害剤の適量を選択し、また（ｃ）適正なキシラナーゼ
阻害剤、及び／又は適量のキシラナーゼ阻害剤を小麦粉に添加する方法を提供す
るものである。
【００３３】 本発明はまた、（ａ）小麦粉に含まれる阻害剤の含有量又は種類を決定し、（
ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼ、及び適したキシラナーゼ阻害剤
を選択し、及び／又は小麦粉に添加するキシラナーゼ阻害剤の適量を選択し、ま
た（ｃ）適正なキシラナーゼ及び適正なキシラナーゼ阻害剤、及び／又は適量の
キシラナーゼ阻害剤を小麦粉に添加する方法を提供するものである。
【００３４】 阻害剤の含有量は、固体状態のＮＭＲ分光分析等の標準的な化学的な手法によ
り測定できる。阻害剤の含有量は、該阻害剤が有害作用をもたらすことが知られ
ているキシラナーゼ酵素を使っても測定できる。かかる方法では、小麦粉を試料
とし、かかるキシラナーゼの所定量を添加することも可能である。一定時間後に
キシラナーゼ活性を測定し、その活性測定結果と小麦粉の阻害剤含有量との相関
関係から含有量を決定できる。よって本発明はまた、小麦粉試料中に含まれる阻
害剤の量をキャリブレーションし、及び／又は測定する手段として、キシラナー
ゼとその阻害剤を組み合わせて使用することも含むものである。
【００３５】 本発明の阻害剤の存在を確認するために、かかる阻害剤に対する抗体を用いて
小麦粉試料のスクリーニングを行うことができる。かかる抗体は、小麦粉試料に
含まれる阻害剤を単離することにも利用できる。
【００３６】 （種々のキシラナーゼ類に対しβ−１，４−キシラナーゼ阻害剤が及ぼす効果を
測定するアッセイ方法） 本発明の阻害剤にはさらに有用な使用法がある。この点に関し、阻害剤によっ
て損なわれるキシラナーゼを同定するアッセイ／スクリーニングにおいて、阻害
剤を用いることができる。例えばある条件下では、阻害剤に対して低耐性（つま
り、あまり耐性のない）を有するキシラナーゼをスクリーニングすることが好ま
しく、ある場合においては、阻害剤に対して、並（中程度）の耐性（つまり、程
々に耐性のある）を有するキシラナーゼを同定するためのアッセイ／スクリーニ
ングにおいて、阻害剤を用いることができ、また他の場合においては、阻害剤に
対して高耐性を示すキシラナーゼを同定するためのアッセイ／スクリーニングに
おいて、阻害剤を用いることができる。阻害剤による阻害の程度を測定するのに
適したプロトコールについては後述するが、便宜上、かかるプロトコールを「阻
害剤アッセイプロトコール」と呼ぶこととする。
【００３７】 このように本発明は、キシラナーゼ阻害剤に対し、キシラナーゼが示す耐性の
程度の測定方法を提供するものであって、かかる方法には、（ａ）目的のキシラ
ナーゼをその阻害剤と接触せしめ、（ｂ）かかる阻害剤が、目的のキシラナーゼ
活性を阻害するか否かを測定することが含まれる。便宜上、かかる方法を「阻害
剤アッセイ方法」と呼ぶこととする。
【００３８】 ここで「耐性」なる用語は、阻害剤によって、キシラナーゼ活性が完全には阻
害されないことを意味する。換言すれば、阻害剤によって損なわれることのない
キシラナーゼ類を同定するアッセイ／スクリーニングに、阻害剤を用いることが
可能となるのである。よって、キシラナーゼ阻害剤に対応するキシラナーゼに関
し、「耐性の程度」なる用語が意味するところは、キシラナーゼ阻害剤によるキ
シラナーゼ活性の非阻害の程度と同じ意味である。従って、キシラナーゼ阻害剤
に高い耐性を示すキシラナーゼは、かかるキシラナーゼ阻害剤に対し、高度の非
阻害を示すキシラナーゼと類似しているのである。
【００３９】 本発明はまた、（ａ）阻害剤アッセイ方法を行い、（ｂ）阻害剤に対し高度（
又は中程度、又は低度）の耐性をもつキシラナーゼを１又は２種以上同定し、（
ｃ）同定された１種以上のキシラナーゼを一定量調製するステップを含むプロセ
スを包含するものである。相応であると同定されたキシラナーゼは、食品製造、
特に焼き製品製造用の生地に使用することができる。さらに、阻害剤に対しある
程度の耐性をもつキシラナーゼ（他種のキシラナーゼに比べ阻害を受けにくいキ
シラナーゼ）を同定することにより、実用に際し、かかる同定されたキシラナー
ゼを、培地に少量添加するだけでこと足りるようになる。キシラナーゼの最終使
用には、食品、タンパク質、及び澱粉製品、紙製品、及びパルププロセシング等
のいずれかの１又は２以上の調製が含まれる。
【００４０】 従って、本発明にはさらに、（ａ）阻害剤アッセイ方法を実施し、（ｂ）阻害
剤に対して高度（又は中程度、又は低度）の耐性をもつキシラナーゼを１種以上
同定し、さらに（ｃ）同定されたキシラナーゼを１種以上含む生地を調製するス
テップを含むプロセスが包含される。 本発明に関する実験の過程において、バクテリア由来キシラナーゼの活性が完
全には損なわれなかったという意味において、かかるキシラナーゼが阻害剤に対
し耐性を示すことを見い出したのは驚くべきことである。
【００４１】 （種々のキシラナーゼが生地に及ぼす効果を測定するアッセイ方法） 阻害剤アッセイ方法によって適していると同定された細菌性キシラナーゼ類が
、生地混合物に含まれていると、意外なことにその生地は、真菌性キシラナーゼ
を含む生地に比べ粘度が低くなることを見い出した。これらの結果は、先行文献
の教示からは全く予想されなかったことである。よって本発明はさらに、焼き食
品調製に用いるのに適した細菌性キシラナーゼ又はそれらの変異体を同定する方
法を提供するものである。かかる方法には、（ａ）目的の細菌性キシラナーゼを
、生地混合物に取り入れ、また真菌性キシラナーゼを含む類似の生地混合物に比
べて該生地混合物の粘度が低い場合には、かかる細菌性キシラナーゼ又はそれら
の変異体が焼き食品調製に用いるのに適していることになるので、（ｂ）該生地
混合物の粘度を測定することが含まれる。便宜上、かかる方法を「粘度アッセイ
方法」と呼ぶこととする。
【００４２】 本発明はさらに、（ａ）粘度アッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に用
いるのに適した１種以上のキシラナーゼを同定し、（ｃ）同定された１種以上の
キシラナーゼを一定量調製するステップを含むプロセスを提供するものである。
生地の粘度を測定するのに適したプロトコールについては後述するが、便宜上、
かかるプロトコールを「粘度プロトコール」と呼ぶこととする。本発明のキシラ
ナーゼを含み、真菌性キシラナーゼを含む生地より粘度の低い生地を、本発明で
は必要に応じて「非粘着性生地」と呼ぶこととする。
【００４３】 細菌性キシラナーゼを用いると、真菌性キシラナーゼを含む生地のように粘度
のある生地にはならないという好ましい性質を有するとき、かかるキシラナーゼ
を、焼き製品を調製する生地等の食品の調製に用いることができる。このように
本発明は、（ａ）粘度アッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に用いるのに
適した１種以上のキシラナーゼを同定し、さらに（ｃ）同定されたキシラナーゼ
を１種以上含む生地を調製するステップを含むプロセスを提供するものである。
【００４４】 （キシラナーゼを含む生地の生地特性に対してグルカナーゼ（類）が及ぼす効果
を測定するアッセイ方法） 本発明に関する実験の過程において、本発明者らは、グルカナーゼ酵素がある
程度存在するときにキシラナーゼ類が有害な影響を受けることも見い出した。よ
って、キシラナーゼ酵素を調製又は抽出するのに用いる培地等のキシラナーゼ調
製物に、有害レベルのグルカナーゼ酵素が含まれないようにすることが大切であ
る。さらに、キシラナーゼを含む食品を調製する際に使用する培地に、有害レベ
ルのグルカナーゼ酵素が含まれないことが大切である。ここにいう「有害レベル
」とは、グルカナーゼ酵素の有害な作用によってキシラナーゼの効果が相殺され
てしまう程のグルカナーゼ量を意味する。
【００４５】 従って本発明はさらに、キシラナーゼ組成物（キシラナーゼ調製物等）、キシ
ラナーゼを調製する培地、又は焼き食品調製に用いるのに適したキシラナーゼを
添加する培地を同定するアッセイ方法を提供するものであり、かかる方法には、
（ａ）目的のキシラナーゼを含む組成物、該キシラナーゼを調製する培地、又は
該キシラナーゼを添加する培地を提供し、また、組成物又は培地に存在する活性
グルカナーゼ酵素（類）が低レベルであれば、かかる組成物又は培地は焼き食品
の調製に適していることになるので、（ｂ）かかる組成物又は培地に活性グルカ
ナーゼ酵素（類）の存在を確認することを含む。便宜上、かかる方法を「グルカ
ナーゼアッセイ方法」と呼ぶこととする。
【００４６】 本発明はさらに、（ａ）グルカナーゼアッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品
調製に用いるのに適した１種以上の組成物又は培地を同定し、また（ｃ）それら
１種以上の同定された組成物又は培地を一定量調製するステップを含むプロセス
を提供するものである。グルカナーゼ活性を測定するのに適したプロトコールに
ついては後述するが、便宜上、かかるプロトコールを「グルカナーゼプロトコー
ル」と呼ぶ。
【００４７】 キシラナーゼがもつ有用な効果が、好ましくない量のグルカナーゼ酵素の存在
によって完全に損なわれることがないという意味において、かかる組成物又は培
地が好ましい性質をもつとき、かかる組成物又は培地を、食品、好ましくは焼き
製品製造用の生地の調製に用いることができる。よって本発明はさらに、（ａ）
グルカナーゼアッセイ方法を実施し、（ｂ）焼き食品調製に適した１種以上の組
成物又は培地を同定し、さらに（ｃ）１種以上の同定された組成物又は培地を含
む生地を調製するステップを含むプロセスを包含するものである。このように本
発明は、キシラナーゼ調製法を包含するものであって、かかるキシラナーゼ調製
法は、実質的にグルカナーゼ酵素（類）非存在下にて行われる。
【００４８】 すなわちキシラナーゼ調製法は、存在すると考えられる少なくとも実質的に全
てのグルカナーゼ酵素（類）を先ず除去し、ひいてはグルカナーゼ酵素（類）活
性を抑制若しくは消失せしめる初期調製を行うことから始められる。これを達成
する技術には、グルカナーゼ酵素（類）を認識し結合する抗体を用いることも含
まれ、その場合はグルカナーゼ酵素（類）活性が不活化される。グルカナーゼ酵
素（類）特異的抗体を支持体に結合することにより、初期調製物のパッセージが
その結合抗体を通過し、その結果グルカナーゼ酵素（類）が上記初期調製物から
除去され、実質的にグルカナーゼ酵素（類）を含まないキシラナーゼ調製物を得
ることができる。別の実施例、さらには追加の実施例においても、グルカナーゼ
酵素活性が最低限であるか、若しくは全くない宿主生物から キシラナーゼ
調製物を得ることができることが示されている。この点で、宿主生物に存在する
グルカナーゼ酵素活性は不活化されるといえる。他にも、グルカナーゼ遺伝子の
発現が抑制され、及び／又は消失する例もある。これを達成する技術には、グル
カナーゼコード配列のアンチセンス配列を使用することも含まれる。さらなる実
施例においては、グルカナーゼ酵素の発現が全くみられないか若しくは極微量発
現される宿主生物を使用している。
【００４９】 （Ｋiアッセイ） キシラナーゼのＫi値測定（ここでは「Ｋiアッセイ」という）が有用な場合も
ある。適用例（applications）によっては、Ｋi値がときにキシラナーゼ適性の
指標足り得ることを見いだした。Ｋi値の知見自体が有用である。
【００５０】 （コンビネーションアッセイ） 本発明はまた、本発明のアッセイ類を適正に組み合わせることを含むものであ
る。本発明は、阻害剤含有量測定方法を含むステップ、阻害剤アッセイ方法を含
むステップ、粘度アッセイ方法を含むステップ、グルカナーゼアッセイ方法を含
むステップ、及びＫiアッセイを含むステップの内２又は３以上のステップを含
む組み合わせを包含している。かかる組み合わせにおいては、ステップの組み合
わせはどの順番でもよく、また必ずしも同時に若しくは続けて行う必要はない。
【００５１】 （新規のキシラナーゼ類） 上述したように本発明は、食品、特に焼き製品調製に用いる生地の調製に使用
可能なキシラナーゼを同定するのに適したアッセイを提供するものである。そこ
で本発明者らは、食品、特に焼き製品調製に用いる生地の調製に適した新規のキ
シラナーゼ３種を同定した。すなわち本発明はさらに、配列番号７、配列番号９
、配列番号１１、又はそれらの変異体、相同物、並びに断片として示されるアミ
ノ酸配列のいずれかを含むアミノ酸配列を包含している。
【００５２】 本発明のキシラナーゼに関連して、「変異体」、「相同物」、又は「断片」な
る用語は、配列に対する１（又は２以上）個のアミノ酸のいかなる置換、変異、
修飾、代替、欠失、又は付加をも含み、その結果できたアミノ酸配列が、配列番
号７、配列番号９、配列番号１１のいずれかの配列を含むキシラナーゼ活性と、
好ましくは少なくとも同程度の活性を示すものをいう。特に「相同性」なる用語
は、結果として得られるタンパク質にキシラナーゼ活性が、好ましくは配列番号
７、配列番号９、配列番号１１のいずれかの配列と少なくとも同程度の活性を示
すような構造及び／又は機能に関する相同性を意味する。配列相同性（配列類似
性又は配列同一性）に関しては、添付の配列リストに示される配列と、好ましく
は少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは
少なくとも９０％の相同性がある。さらに、添付の配列リストに示される配列と
、より好ましくは少なくとも９５％、さらに少なくとも９８％の相同性があるこ
とがより好ましい。 キシラナーゼが、配列番号７若しくは配列番号１１、又はそれらの変異体、相
同物若しくはその断片の配列を含むことが好ましい。
【００５３】 本発明はさらに、本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む
ものである。本発明のヌクレオチド配列は次のものから選択することが好ましい
。 （ａ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はそれらの変異体、相同
物、並びに断片として示されるヌクレオチド配列のいずれかを含むヌクレオチド
配列 （ｂ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はその相補配列の内いず
れか１つのヌクレオチド配列、 （ｃ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はその断片として示され
るヌクレオチド配列のいずれかとのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列
、 （ｄ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又はその断片として示され
るヌクレオチド配列のいずれかの相補配列とのハイブリダイズ能を有するヌクレ
オチド配列、及び （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示したヌクレオチドに対する遺伝
コードの結果、変性したヌクレオチド配列。
【００５４】 本発明のヌクレオチド配列に関連して、「変異体」、「相同物」、又は「断片
」なる用語は、配列に対する１（又は２以上）個のアミノ酸のいかなる置換、変
異、修飾、代替、欠失、又は付加をも含み、その結果できたアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１のいずれか
のアミノ酸配列を含む活性と、好ましくは少なくとも同程度のキシラナーゼ活性
を示すものをいう。特に「相同性」なる用語は、結果として得られる発現タンパ
ク質にキシラナーゼ活性が、好ましくは配列番号７、配列番号９、配列番号１１
のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも同程度の活性を示すような構造及び／又
は機能に関する相同性を意味する。配列相同性（配列類似性又は配列同一性）に
関しては、添付の配列リストに配列番号８、配列番号１０、配列番号１２として
示される配列と、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５
％、さらにより好ましくは少なくとも９０％の相同性があるものが望ましく、さ
らに、添付の配列リストに示される配列と、より好ましくは少なくとも９５％、
より好ましくは少なくとも９８％の相同性があるものが望ましい。 本発明のヌクレオチド配列が、配列番号８、配列番号１２、又はそれらの変異
体、相同物、若しくは断片として示される配列を含むことが好ましい。
【００５５】 （キシラナーゼ類の新規の使用方法） 上述したように本発明はまた、焼き製品の調製に用いる非粘着性生地（本記載
中にて定義）を調製する際に使用できるキシラナーゼの同定に適したアッセイを
提供するものである。 我々は、食品、特に焼き製品調製に用いる生地、の調製に適した公知及び新規
の細菌性キシラナーゼ数種を同定した。 よって本発明は、本発明のアッセイにより同定し得るキシラナーゼを含む非粘
着性生地（本記載中にて定義）を包含するものである。かかるキシラナーゼが、
配列番号３、５、７、９、１１、又はそれらの変異体、派生物、若しくは相同物
として示されるアミノ酸配列のいずれかを有することが好ましい。より好ましく
は、かかるキシラナーゼが、配列番号５、７、９、１１、又はそれらの変異体、
派生物、若しくは相同物として示されるアミノ酸配列のいずれかを有することが
好ましい。
【００５６】 先行技術によるシステムとは対照的に本発明は、生地を製造する前にキシラナ
ーゼを小麦粉に直接添加し得る方法を提供する。従って、シングルバッチの小麦
粉／キシラナーゼ混合物を生地製造器に投入する。さらに、取扱い容易な生地を
得るために使う投入装置が生地製造器に必要でなくなる。
【００５７】 （キシラナーゼ類を用いて調製した食品） 本発明は、食品製造に用いるのに適したキシラナーゼの同定手法を提供するも
のである。動物用飼料も含む食品の代表例としては、日常食品、食肉製品、禽肉
製品、魚肉製品、及び焼き製品が挙げられるが、かかる食品が焼き製品であるこ
とが好ましい。本発明の技術範囲に含まれる焼き製品の代表例としては、食パン
、ロールパン、バーガー用パン、ピザ台等のパン類、プレッツェル、トルティヤ
、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカー等が挙げられる。
【００５８】 （一般的な教示） 以下に述べる「本発明のヌクレオチド配列」及び「本発明のアミノ酸配列」な
る語句は、ここに挙げるヌクレオチド配列のいずれか１つ若しくは２以上、また
ここに挙げるアミノ酸配列のいずれか１つ若しくは２以上について言及するもの
である。
【００５９】 （アミノ酸配列／ポリペプチド配列） 「本発明のアミノ酸配列」なる用語は、「本発明のポリペプチド配列」と同義
語である。ここでかかるアミノ酸配列は、キシラナーゼ又はキシラナーゼ阻害剤
のアミノ酸配列を意味すると考えてよい。 本発明のポリペプチドには、ここに示すアミノ酸配列の断片、及びその変異体
も含まれる。断片の長さとして適正なのは、少なくとも５、又は少なくとも１０
、１２、１５、さらには２０個のアミノ酸で構成される断片である。 本発明のポリペプチドは、保存的置換を含む、１又は２個以上（例えば少なく
とも２、３、５、又は１０個）の置換、欠失、又は挿入を有するように修飾され
ていてもよい。保存的置換は、保存置換を示す次の表によって作製できる。次の
表には、２列目の同じブロックと、３列目の同じ行にあるアミノ酸を相互置換す
ることが好ましい。
【００６０】
【表１】
【００６１】 本発明のポリペプチドは実質的に単離されているものである。かかるポリペプ
チドは、意図するポリペプチドの目的を損なわないように、担体又は希釈剤と混
合してもよく、その場合も依然として実質的に単離されていると考えられる。本
発明のポリペプチドはまた実質的に精製されており、そのとき該ポリペプチドは
、調製過程におけるポリペプチドを含み、かかる調製過程におけるポリペプチド
の９０％以上、例えば９５％、９８％、又は９９％以上は、本発明のポリペプチ
ドである。本発明のポリペプチドは後述するように例えば、その精製を容易とす
るためヒスチジン残基を付加し、又は細胞からの分泌を促進すべくシグナル配列
を付加することにより修飾してもよい。本発明のポリペプチドは、後述するよう
に合成法（例：Geysen et al., 1996記載の方法）、又は組換え法により作出で
きる。
【００６２】 酵母、真菌、又は植物宿主細胞等の適正な宿主細胞を用いることにより、本発
明の組換え発現産物が最適な生物活性を備えるために必要とされる翻訳後修飾（
例えばミリストイル化、グリコシル化、Ｎ−末端切断化（truncation）、ラピデ
ーション（lapidation）、及びチロシン、セリン、又はトレオニンの燐酸化）が
可能になる。
【００６３】truncation lapidation （ヌクレオチド配列／ポリヌクレオチド配列） 「本発明のヌクレオチド配列」なる用語は、「本発明のポリヌクレオチド配列
」なる用語と同義である。本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド酸配列が含まれる。遺伝的コードが縮重することに
より、種々のポリヌクレオチド領域が、所定のアミノ酸配列をコードすることが
わかる。
【００６４】 ここに詳述するアミノ酸配列に関する知識をもってすれば、本発明のポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡ及び／又はゲノムクローン等の部分及び完全長核酸配
列の作製が可能である。例えば、ここに挙げるアミノ酸配列をコードする配列を
標的とするよう設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いることにより
、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。かかるプライマーには通常複
数の縮重部分が含まれる。しかし縮重を最小化するために、ここで述べるアミノ
酸配列において１コドンにのみ対応してコードされるメチオニン等のアミノ酸を
含む領域をコードする配列が選択される。さらにＰＣＲ法を実施するときに鋳型
ＤＮＡとして用いる核酸をもつ生物におけるコドンの使われ方を考慮した上で配
列を選択する。公知の配列に対する一本鎖配列（非縮重）プライマーを用いて配
列クローニングを行うときのストリンジェンシーより緩やかなストリンジェンシ
ー条件下にて、ＰＣＲを行う。
【００６５】 ＰＣＲで得られた本発明のポリペプチド断片をコードする核酸配列を使用して
、ハイブリダイゼーションライブラリースクリーニング技術によって、より長い
配列を得ることができる。例えばＰＣＲクローンを放射性原子によって標識し、
又は他種、好ましくは他種の植物又は菌種のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーを
スクリーニングするのに用いる。ハイブリダイゼーション条件は、通常よりスト
リンジェントな条件下（例えば０．０３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０３Ｍのク
エン酸ナトリウム、約５０℃〜約６０℃）の培地条件である。アミノ酸配列の全
体又は部分をコードする縮重核酸プローブは、他種、好ましくは他種の植物又は
菌種のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをプローブするのに用いられる。
しかしＰＣＲは本来、一本鎖配列を得てさらにスクリーニングを行うために行う
ことが好ましい。
【００６６】 上記の技術により得られた本発明のポリヌクレオチド配列は、上述の技術を用
いて、さらなる相同配列及び変異体を得るために用いることができる。また、か
かるポリヌクレオチド配列は、使用に際し、種々の宿主細胞系において本発明の
ポリペプチドを発現せしめるために修飾される。例えば、ポリヌクレオチド配列
が発現される特定の宿主細胞に対するコドン選択性向を最適化するよう修飾され
る。その他、制限酵素認識部位を導入すべく、またかかるポリヌクレオチドがコ
ードするポリペプチドの機能若しくは特性を変えるべく、配列を変化させること
が考えられる。
【００６７】 本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲプライマー、代替的増幅反応におけるプ
ライマー等のプライマー、放射活性若しくは非放射活性標識を用いる慣用手法に
よる顕現（revealing）標識等により標識されたプローブを作出するのに用いら
れる。またかかるポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングされる。かかる
プライマー、プローブ、及び他の断片は、その長さが少なくとも１５、好ましく
は少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチドであって
、これらはまた本発明のポリヌクレオチドなる用語に包含される。 本発明のポリヌクレオチド又はプライマーは、顕現標識を有する。標識として
適しているものとしては、32Ｐ又は35Ｓ等の放射性同位元素、酵素標識、並びに
ビオチン等の他のタンパク質標識が挙げられる。かかる標識により、本発明のポ
リヌクレオチド又はプライマーを標識化し、公知の技術により検出を行うことが
できる。
【００６８】 ＤＮＡポリヌクレオチド等のポリヌクレオチド、及び本発明によるプライマー
は、組換え、合成、又は当該技術の専門家が実施可能ないかなる手法によって作
出してもよい。標準技術によってクローニングしてもよい。 一般的にはプライマーは、所望の核酸配列を１ヌクレオチド毎に作製していく
段階的製法を含む合成法により作出される。かかる作出を自動方式で行う技術は
、先行文献に既にみられる。
【００６９】 長いポリヌクレオチドは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術
等の組換え法により作出されるのが一般的である。かかる方法には、クローニン
グの対象であるエンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害遺伝子の領域において一
対のプライマー（約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、かかるプライマーを、
真菌、植物、又は原核細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触せしめ、所
望の領域の増幅、増幅断片の単離（反応混合物をアガロースゲル上にて精製する
ことによる）、及び増幅ＤＮＡの回収が実施可能な条件下にてＰＣＲ法を行うこ
とが含まれる。適正なクローニングベクターに増幅ＤＮＡをクローニングできる
よう、かかるプライマーは、適当な制限酵素認識部位を含むように設計されてい
る。
【００７０】 （調節配列） 本発明のポリヌクレオチドは、選択された宿主細胞等により、コード配列の発
現能を有する調節配列とオペラブル（operable）に結合していることが好ましい
。例えば本発明は、かかる調節配列にオペラブルに結合した本発明のポリヌクレ
オチドを含むベクター、すなわち発現ベクターを包含するものである。 「オペラブルに結合」なる用語は、ここに記載する各成分が、その意図どおり
に機能し得る関係にあり、互いに並列関係にあることを意味する。コード配列に
「オペラブルに結合」した調節配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列
が発現されるように連結される。 「調節配列」なる用語には、プロモーター、エンハンサー、及びその他の発現
調節シグナルが含まれる。ここにいう「プロモーター」なる用語は、ＲＮＡポリ
メラーゼ結合部位等、当該技術分野にて通常使われる意味で使用される。
【００７１】 発現の、また必要とあれば選択した発現宿主からの目的タンパク質の分泌量の
増強、及び／又は本発明のポリペプチド発現の誘導制御を行う異種構造の調節領
域、例えばプロモーター、分泌リーダー、及び末端領域等を選択することにより
、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現が増強される。本
発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターにオペラブルに結合してい
ることが好ましい。 本発明のポリペプチドをコードする遺伝子由来のプロモーター以外にも、本発
明のポリペプチドを発現させるプロモーターを用いることができる。かかるプロ
モーターは、所望の発現宿主において本発明のポリペプチドを発現させる上での
効率性を考慮して選択される。
【００７２】 実施例において、本発明における所望のポリペプチドを発現させるため、構成
プロモーターが選択される。誘導基質含有培地において発現宿主を培養させるこ
とが不要になるので、かかる発現構成物は非常に好都合である。 真菌発現宿主に対して用いるのに適した強力な構成及び／又は誘導プロモータ
ーとしては、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンテターゼ、
サブユニット９（ＯｌｉＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、アル
コールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログル
コシダーゼ（ｇｌａＡ遺伝子からのＡＧ）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、及
びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーターに
おける真菌性遺伝子から得られるものが挙げられる。強力な酵母プロモーターと
しては、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼ、及びトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものが挙げら
れる。また、強力な細菌性プロモーターとしては、細胞外プロテアーゼ遺伝子由
来のプロモーターの他に、α−アミラーゼ及びＳＰ０２プロモーターが挙げられ
る。ハイブリッドプロモーターもまた、発現構成の誘導調節を改良するために用
いられる。
【００７３】 プロモーターはさらに、適合した宿主における発現を確実にし、又は増強させ
るという特徴を備えている。例えばかかる特徴としては、Pribnow Box又はＴＡ
ＴＡbox等の保存領域が考えられる。それ以外にもプロモーターはさらに、本発
明のヌクレオチド配列の発現レベルに影響（保持、増強、減少等の）を及ぼす配
列をもつ場合もある。それらプロモーターの適正例としては、Ｓｈ１イントロン
又はＡＤＨイントロンが挙げられる。その他の配列には、温度、化学物質、光、
又はストレス誘導エレメント等の誘導エレメントが含まれる。また、転写又は翻
訳を増強するのに適したエレメントも存在する。かようなエレメントの例として
は、ＴＭＶ５'シグナル配列（Sleat Gene 217 [1987] 217-225; 及びDawson Pla
nt Mol. Biol. 23 [1993] 97を参照のこと）が挙げられる。
【００７４】 （分泌） 本発明のポリペプチドは、宿主細胞から、本発明のポリペプチドがより簡便に
回収できる培養培地へ分泌されることが望ましい。本発明においては、分泌リー
ダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択される。ハイブリッドシグナル配列
もまた本発明において用いられる。 異種構造分泌リーダー配列の一般的な例としては、真菌アミログリコシダーゼ
（ＡＧ）遺伝子（例えばｇｌａＡ；Aspergillus由来で、１８及び２４アミノ酸
の二形態）、ａ−ファクター遺伝子（Saccharomyces及びKluyveromyces等の酵母
）、又はα−アミラーゼ遺伝子（Bacillus）由来のものが挙げられる。
【００７５】 （構築物） 「共役物（conjugate）」、「カセット」、及び「ハイブリッド」なる用語と
同義である「構築物（construct）」なる用語には、直接又は間接にプロモータ
ーと接合する本発明におけるヌクレオチド配列が含まれる。本発明のプロモータ
ー及びヌクレオチド配列を仲介するＳｈ１−イントロンやＡＤＨイントロン等の
イントロン配列などの適正なスペーサーグループを供給することが間接接合の例
として挙げられる。 直接又は間接接合を意味する本発明における「融合」なる用語に関しても「構築
」と同じことがいえる。それぞれの場合において各用語は、元来野生型遺伝子プ
ロモーター、及び通常会合するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の組合
わせにおいて、かかるプロモーター及びヌクレオチド配列がその自然環境下にあ
るときに、それらの自然組合わせを意味するものではない。
【００７６】 構築物が、その転移先である好ましくはBacillus subtillis等のBacillus属の
細菌など、又はジャガイモ、サトウキビ等の植物における遺伝子構築の選択を可
能にするマーカーを有していたり、発現させる場合もある。例えばマンノース−
６−リン酸イソメラーゼ（特に植物における）をコードするマーカー、又はＧ４
１８、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、及びゲンタマイシン等
に耐性を示す抗生物質耐性を供するマーカー等、実際に使用できる種々のマーカ
ーが存在する。 本発明の構築物は、少なくともプロモーターにオペラブルに結合した本発明の
ヌクレオチド配列を含んでいることが好ましい。
【００７７】 （ベクター） 「ベクター」なる用語には、発現ベクター、形質転換ベクター、及びシャトル
ベクターが含まれる。 「発現ベクター」なる用語は、インビボで、又はインビトロでの発現能を有す
る構築物を意味する。 「形質転換ベクター」なる用語は、ある物からある物へ、同種の場合もあれば
他種間の場合もあるが、転移できる構築物を意味する。構築物がある種から別の
種へ、例えば大腸菌プラスミドから細菌、好ましくはBacillus属の細菌へ、転移
できるとき、かかる形質転換ベクターを「シャトルベクター」と呼ぶことがある
。大腸菌プラスミドから植物に存在するアグロバクテリア菌へと転移できる構築
物の場合もある。
【００７８】 本発明のポリペプチドを発現させるため、後述するように本発明のベクターで
適当な宿主細胞を形質転換させることができる。よって本発明はさらに、後述す
るように発現ベクターにより形質転換若しくはトランスフェクトした宿主細胞を
、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現条件下で培養し、
また発現したポリペプチドを回収することからなる本発明のポリペプチドを調製
するプロセスを提供するものである。 かかるベクターの例としては、複製によるプラスミド、ウイルス、又はファー
ジベクターが挙げられ、また、かかるポリヌクレオチドの発現プロモーター、及
びそのプロモーターの調節因子（regulator）も適宜に例として挙げられる。
【００７９】 本発明のベクターには、１又は２以上の選択マーカー遺伝子も含まれる。工業
用微生物に対する選択系として最も適しているのは、宿主生物において変異を必
要としない選択マーカー集団によって形成されるものである。真菌性選択マーカ
ーの例としては、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、ＡＴＰシンテターゼ、サブユ
ニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−リン酸−脱カルボキシル酵素（ｐｖ
ｒＡ）、ファレオマイシン、及びベノミル耐性（ｂｅｎＡ）遺伝子がある。非真
菌性選択マーカーの例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする
細菌由来Ｇ４１８耐性遺伝子（これは酵母でも用いられるが、真菌では用いない
）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌）、ネオマイシン耐性遺伝子（Bacillus）
、及び大腸菌ｕｉｄＡ遺伝子がある。 ＲＮＡ作製、並びに宿主細胞のトランスフェクト又は形質転換を行うときなど
は、ベクターをインビトロで用いることもできる。
【００８０】 このように本発明のポリヌクレオチドを、クローニング又は発現ベクター等の
組換えベクター（通常複製ベクター）に取り込むことも可能である。かかるベク
ターを、和合性宿主細胞における核酸の複製に用いることができる。そこで実施
例において、本発明のポリヌクレオチドを複製ベクターに導入し、かかるベクタ
ーを和合性宿主細胞に導入し、そしてベクター複製が可能となる条件下にてかか
る宿主細胞を培養することにより、本発明のポリヌクレオチドを作出する方法を
提供する。上記ベクターは宿主細胞から回収する。この方法に適した宿主細胞に
ついては、発現ベクターとの関連において後述する。
【００８１】 （組織） ここにいう「組織」なる用語は、組織それ自体、及び器官を意味する。 （宿主細胞） 本発明における「宿主細胞」なる用語は、本発明の組換えタンパク質をコード
するヌクレオチド配列及び／又はその産物を含むことができるいかなる細胞をも
包含し、かかる宿主細胞にプロモーターが存在するときには、該プロモーターが
本発明のヌクレオチド配列を発現させることが可能な宿主細胞を意味するもので
ある。 本発明の実施例においては、本発明のポリヌクレオチドを形質転換した又はト
ランスフェクトした宿主細胞が提供される。かかるポリヌクレオチドを複製及び
発現せしめるために、該ポリヌクレオチドがベクターに取り込まれていることが
好ましい。かかるベクターと適合する細胞、例えば原核生物（例として細菌）、
真菌、酵母、又は植物細胞を選択する。
【００８２】 グラム陰性の細菌である大腸菌は、異種遺伝子を発現させるときの宿主として
広く使用されている。しかし、大量の異種タンパク質は、細胞内に蓄積する傾向
がある。大量の大腸菌細胞質内タンパク質から所望のタンパク質をその状態から
精製することはときに困難である。大腸菌とは対照的に、培地へのタンパク質分
泌能を有することからバチルス属の細菌は、異種宿主として非常に適している。
宿主として適した細菌には、ストレプトミセス属及びシュードモナス属の細菌が
知られている。
【００８３】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの特質から、及び／又は
発現タンパク質のさらなるプロセシングが望まれることから、酵母又は真菌等の
原核生物宿主が好ましい。酵母細胞の方が容易に操作できるため、真菌細胞より
酵母細胞が一般的に好まれる。しかしタンパク質の中には、酵母細胞からはあま
り分泌されなかったり、正しくプロセシングされない（例えば酵母の高グリコシ
ル化）ものがある。かかる場合には真菌宿主生物を選択すべきである。
【００８４】 本発明の技術範囲にある発現宿主の好適例としては、Aspergillus種（ヨーロ
ッパ特許Ａ０１８４４３８号及びＡ０２８４６０３号）、及びTrichoderma種等
の真菌類、Bacillus種（ヨーロッパ特許Ａ０１３４０４８号及びＡ０２５３４５
５号に記載があるものなど）、Streptomyces種、及びPseudomonas種等の細菌類
、並びにKluyveromyces種（ヨーロッパ特許Ａ００９６４３０号及びＡ０３０１
６７０号に記載があるものなど）、及びSaccharomyces種等の酵母類がある。 典型的な発現宿主は、Aspergillus niger、Aspergillus niger var. tubigeni
s、Aspergillus niger var. awamori、Aspergillus aculeatis、Aspergillus ni
dulans、Aspergillus orvzae、Trichoderma reesei、Bacillus subtilis、Bacil
lus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Kluyveromyces lactis、及
びSaccharomyces cerevisiaeから選択できる。
【００８５】 （生物） 本発明の「生物」なる用語は、本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列及び／又はその産物を含むことができるいかなる生物をも包含し、か
かる生物にプロモーターが存在するときには、該プロモーターが本発明のヌクレ
オチド配列を発現させることが可能な生物を意味するものである。本発明のキシ
ラナーゼの観点から適当な生物としては、好ましくはBacillus属、より好ましく
はBacillus subtilis属の細菌が挙げられる。
【００８６】 本発明における「トランスジェニック生物」なる用語は、本発明の組換えタン
パク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はその産物を含むことができるい
かなる生物をも包含し、そのプロモーターが、かかる生物内に本発明のヌクレオ
チド配列を発現させることが可能な生物を意味するものである。かかるヌクレオ
チド配列が、該生物のゲノムに取り込まれていることが好ましい。「トランスジ
ェニック生物」なる用語は、本発明の無処理（native）のヌクレオチドコード配
列がその自然環境下にあり、やはり自然環境下にある無処理のプロモーターのコ
ントロール下にあるときには、かかるコード配列を含まない。さらに本発明には
、本発明の無処理のタンパク質がその自然環境下にあり、やはりその自然環境下
にある無処理のヌクレオチドコード配列により発現され、かかるヌクレオチド配
列が、その自然環境下にある無処理のプロモーターのコントロール下にあるとき
には、かかるコード配列を含まない。
【００８７】 従って本発明のトランスジェニック生物は、本発明のアミノ酸配列をコードす
るヌクレオチド配列のいずれか１つ又はそれらの組合せ、本発明の構築物（その
組合せを含む）、本発明のベクター、本発明のプラスミド、本発明の細胞、本発
明の組織、並びにそれらの産物を含む。形質転換した細胞又は組織を用いて、か
かる細胞又は組織から所望の成分の必要量を容易に回収し、調製することができ
るのである。
【００８８】 （宿主細胞／宿主生物の形質転換） 前述したように、宿主生物としては原核又は真核生物を挙げることができ、原
核生物宿主の好適例としては、大腸菌及びBacillus subtilisがある。原核生物
宿主の形質転換に関する詳しい教示例としては、Sambrook et al（Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Labora
tory Press）、及びAusubel et al., Current Protocles in Molecular Biology
(1995), John Wiley & Sons, Inc.等の文献がある。原核生物宿主を用いる際に
は、形質転換の前にそのヌクレオチド配列を、イントロン除去等により適当に修
飾することが必要になる。そして、上述したように宿主生物として適しているの
は、Bacillus subtilis等のBacillus属の細菌である。
【００８９】 他の実施例として、トランスジェニック生物として酵母を用いることもできる
。酵母は、異種遺伝子発現のビヒクル（vehicle）として広く使われている。Sac
charomyces cerevisiaeは、異種遺伝子発現への使用も含め、かなり以前から工
業用に使用されている。Saccharomyces cerevisiaeにおける異種遺伝子発現に関
しては、Goodey et al（1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al., eds,
pp 401-429, Allen and Unwin, London）、及びKing et al.,（1989, Molecular
and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, pp 107-1
33, Blackie, Glasgow）が報告している。
【００９０】 いくつかの点から、Saccharomyces cerevisiaeは異種遺伝子発現に適している
。第１に、Saccharomyces cerevisiaeはヒトに対し非病原性であり、特定のエン
ドトキシンの産生能をもたない。第２に、Saccharomyces cerevisiaeは、何世紀
にもわたり多様な目的のために、商業目的に安全に利用されてきた歴史がある。
その結果、広く世間に認知されている。第３に、広く商業目的に使用され、また
研究も数多くされてきているため、その大規模な発酵特性とともに、Saccharomy
ces cerevisiaeの発生学的及び生理学的特質に関する豊富な知識が蓄積されてい
る。 E Hinchcliffe E Kenny（1993, "Yeast as a vehicle for the expression of
heterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H Rose and J Stuart Harris
on, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.）は、Saccharomyces cerevisiae
における異種遺伝子発現及び遺伝子産物の分泌の原理について報告している。
【００９１】 使用できる酵母ベクターは、その保持のために宿主ゲノムとの組換えを必要と
し、プラスミドベクターを自律的に複製する組込み（integrative）ベクターを
含む数種類ある。 トランスジェニックSaccharomycesを調製するため、酵母での発現を目的とし
て設計した構築物に、本発明のヌクレオチド配列を挿入して発現構築物を調製し
た。今までに数種類、異種発現に用いる構築物が作製されている。かかる構築物
には、本発明のヌクレオチド配列に融合された酵母において活性を示すプロモー
ターが含まれ、ＧＡＬ１プロモーター等の酵母由来のプロモーターが用いられる
。ＳＵＣ２シグナルペプチドをコードする配列等の酵母由来のシグナル配列が用
いられる。酵母において活性を示すターミネーターが発現系を終了させる。
【００９２】 酵母の形質転換を行うための形質転換プロトコールがいくつか見いだされてい
る。例えば本発明のトランスジェニックSaccharomycesは、Hinnen et al（1978,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929）、
Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104)、及びIto, H et al（1983, J B
acteriology 153, 13-168）の教示によって調製できる。形質転換した酵母細胞
は、種々の選択マーカーを使って選択でき、形質転換に用いるマーカーには、Ｌ
ＥＵ２、ＨＩＳ４、及びＴＲＰ１等の数多くの栄養要求性マーカー、及びアミノ
グリコシド抗生物質マーカー（Ｇ４１８等）などのドミナント抗生物質耐性マー
カーがある。
【００９３】 宿主生物としては他にも植物を挙げることができる。遺伝子改変植物を構築す
る際の基本原理は、挿入された遺伝物質が安定的に保持されるような形で、ゲノ
ム情報を植物ゲノムに挿入することであり、ゲノム情報を挿入する技術はいくつ
かあるが、主な２つの原理は、ゲノム情報の直接導入、及びベクター系を用いた
ゲノム情報の導入である。かかる一般的な技術は、Potrykus（Annu Rev Plant P
hysiol Plant Mol Biol ［1991］ 42:205-225）、及びChristou（Agro-Food-Ind
ustry Hi-Tech March/April 1994 17-27）に記載されている。
【００９４】 さらに、本発明は、本発明のヌクレオチド配列又は構築物を運び、また該ヌク
レオチド配列又は構築物を、植物等の生物ゲノムに導入し得るベクター系に関す
る。かかるベクター系は、１つのベクターを含むことができるが、２つのベクタ
ーをもつこともできる。ベクターを２つ有する場合、かかるベクター系は通常二
元ベクター系と呼ばれる。二元ベクター系については、Gynheung An et al.（19
80）、Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19に、より詳
細な記載がある。
【００９５】 所定のヌクレオチド配列を用いた植物細胞の形質転換に広く使用されるシステ
ムは、Agrobacterium tumefaciens由来のＴｉプラスミド、又はAgrobacterium r
hizogenes An et al.（1986）, Plant Physiol. 81, 301-305、及びButcher D.N
. et al.(1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.:D.S.
Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208由来のＲｉプラスミドを使用することを
基本にしている。上述した植物又は植物細胞構築物の構築に適したＴｉ及びＲｉ
プラスミドを数種類構築した。かかるＴｉプラスミドの非限定例としては、ｐGV
3850がある。
【００９６】 本発明のヌクレオチド配列又は構築物は、Ｔ−ＤＮＡボーダーを直接取り囲む
配列が分裂しないよう、またこれら領域の内少なくとも１領域が修飾Ｔ−ＤＮＡ
を植物ゲノムに挿入する際に重要となるように、Ｔ−ＤＮＡの末端配列間に存在
する、又はＴ−ＤＮＡ配列に隣接するＴｉプラスミドに挿入されることが好まし
い。上述した説明から理解されるように、生物が植物の場合には、本発明のベク
ター系は、植物を感染させるのに必要な配列（vir領域等）、またＴ−ＤＮＡ配
列の少なくともボーダー部分を１つ有していることが好ましい。ここにいうボー
ダー部分は、遺伝子構築物と同一ベクター上に位置するものである。かかるベク
ター系は、Agrobacterium tumefaciensＴｉプラスミド、若しくはAgrobacterium
rhizogenesＲｉプラスミド、又はその派生物であることが好ましい。なぜなら
これらのプラスミドは公知であり、トランスジェニック植物の構築に広く使用さ
れており、これらのプラスミド又はその派生物に基づくベクター系は数多く存在
しているからである。
【００９７】 トランスジェニック植物を構築するにあたっては、本発明のヌクレオチド配列
又は構築物を植物に挿入する前に、ベクターが複製可能かつ操作が容易な微生物
内に先ず構築する。有用な微生物としては大腸菌があるが、上述の特質をもつ微
生物であれば他の微生物も使用できる。上記に定義したベクター系のベクターを
大腸菌において構築した後、必要とあれば該ベクターを、Agrobacterium tumefa
ciens等の適当なアグロバクテリア株に転移させる。このように、本発明のヌク
レオチド配列又は構築物をハーバリングするアグロバクテリア細胞を得るため、
本発明のヌクレオチド配列又は構築物をハーバリングするＴｉプラスミドを、Ag
robacterium tumefaciens等の適当なアグロバクテリア株に転移させることが好
ましい。次に、かかるアグロバクテリア細胞のＤＮＡを、修飾する予定の植物細
胞に転移させる。
【００９８】 かかる方法により、本発明のヌクレオチド又は構築物をベクターにおける適当
な制限部位（position）に導入し得る。そこに含まれるプラスミドを用いて大腸
菌の形質転換を行う。かかる大腸菌細胞を適した栄養培地で培養した後、回収し
溶解させる。かかるプラスミドはこのようにして回収される。分析方法としては
、配列分析、制限分析、電気泳動、またさらに生化学−分子生物学的方法が通常
実施される。操作を行う毎に使用したＤＮＡ配列は制限され、隣接するＤＮＡ配
列に結合される。各配列は、同じ又は別のプラスミド内にてクローニングされる
。
【００９９】 所望の本発明のヌクレオチド配列を植物へ導入する各種導入方法を行った後、
さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要となる。例えば植物細胞のＴｉ
−又はＲｉ−プラスミドを用いて形質転換を行うときには、導入遺伝子のフラン
キング領域としてのＴｉ−及びＲｉ−プラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右の境
界、またはしばしば左右の境界が結合される。植物細胞の形質転換にＴ−ＤＮＡ
を用いることについては鋭意研究がなされており、ヨーロッパ特許Ａ１２０５１
６号、Hoekema（The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B
.B., Alblasserdam, 1985, Chapter V）、Fraley, et al.（Crit. Rev. Plant S
ci., 4:1-46）、及びAn et al.（EMBO J. 1985, 4:277-284）に報告されている
。また、植物組織を直接アグロバクテリアに感染させることは、広く行われてい
る簡便な方法であり、Butcher D.N. et al.（1980, Tissue Culture Methods fo
r Plant Pathologists, eds.:D.S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208）にそ
の記載がみられる。この方法に関しては、Potrykus（Annu Rev Plant Physiol P
lant Mol Biol[1991] 42:205-225）、及びChristou（Agro-Food-Industry Hi-Te
ch March/April 1994 17-27）に教示されている。かかる方法により、葉、根、
茎、又は植物の他の部分等の植物組織における特定部位において植物を感染させ
ることができる。
【０１００】 植物を、ヌクレオチド配列をもつアグロバクテリウムに直接感染させると、通
常感染させる植物は、剃刀による切開、針による穿孔、研磨用具による摩擦など
で損傷する。かかる損傷部分にアグロバクテリウムを接種するのである。そして
接種された植物又は植物の部分を適当な培養培地で生育させ、成熟植物とするの
である。植物細胞が構築されると、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等の成長
必須因子を含む適当な培養培地で細胞を培養する方法等の公知の組織培養方法に
よって、かかる細胞は生育し、かつ保持される。細胞又は組織培養物から植物を
再生させる公知の方法により、形質転換細胞を、遺伝子修飾植物において再生さ
せることができる。かかる公知の方法としては例えば、抗生物質を使って形質転
換した芽を選択し、その選択した芽を適正な栄養分や植物ホルモン等を含む培地
で、継代培養する方法がある。植物の形質転換については、ヨーロッパ特許Ａ０
４４９３７５号にも教示されている。
【０１０１】 （ポリペプチドの作出） 本発明においては、従来公知の栄養発酵培地における１又は２以上の本発明の
ポリヌクレオチドを形質転換された微生物発現宿主等の培養により、本発明のポ
リペプチドの産生が影響される。発現宿主の選択に基づき、及び／又は発現構築
物における調節の必要性に基づいて適当な培地を選択する。当該技術の専門家で
あれば、かような培地を熟知している。必要とあれば培地は、汚染の可能性があ
る他の微生物よりも形質転換された発現宿主が好む成分をさらに含有させること
ができる。
【０１０２】 （抗体） 本発明のアミノ酸配列を、かかるアミノ酸配列に対する抗体を標準的な手法に
より作製するために用いることができる。抗体を作製するために、ヤギ、ウサギ
、ラット、マウス等の種々の宿主を、その阻害剤、何らかのタンパク質、変異体
、相同物、又はその断片や派生物、並びに免疫原性特質を維持しているオリゴペ
プチドを投与することにより免疫する。免疫応答を強化するために種々のアジュ
バントを、宿主種依存で用いる。かかるアジュバントには、フロイントアジュバ
ント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニッ
ク（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、ＫＬ
Ｈ（keyhole limpet hemocyanin：スカシガイのヘモシアニン）、及びジニトロ
フェノール等の界面活性物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
ＢＣＧ（Bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvumも使用が考え
られる有用なヒトアジュバントである。
【０１０３】 アミノ酸配列に対するモノクローナル抗体は、培地における連続細胞株による
抗体分子の作製方法のいずれによっても調製し得る。かかる方法には、Koehier
及びMilstein（1975 Nature 256:495-497）が最初に報告したハイブリドーマ技
術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72
; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）及びＥＢＶ−ハイブ
リドーマ技術（Cole et al (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy
, Alan R Liss Inc, pp77-96）が含まれるが、これらに限定されるものではない
。さらに適当な抗原特異性及び生物活性を得るためにマウス抗体遺伝子をヒト抗
体遺伝子にスプライシングする「キメラ抗体」の作製方法（Morrison et al (19
84) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al (1984) Nature 312:6
04-608; Takeda et al (1985) Nature 314:452-454）も用いることができる。そ
の他にも一本鎖抗体（米国特許Ａ４９４６７７９号）の作製技術を、阻害剤特異
的一本鎖抗体の作製に用いることができる。
【０１０４】 Orlandi et al（1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837）、並びにWinter
G及びMilstein C（1991; Nature 349: 293-299）が開示しているように、インビ
ボでの産物をリンパ球集団に誘導することにより、又は組換え免疫グロブリンラ
イブラリー若しくは高度に特異的な結合試薬パネルのスクリーニングにより、抗
体を作製することもできる。
【０１０５】 プロトコール プロトコール１；キシラナーゼアッセイ（エンド−β−１，４−キシラナーゼ活
性） クエン酸（０．１Ｍ）−リン酸水素二ナトリウム（０．２Ｍ）緩衝液（ｐＨ５
．０）でキシラナーゼ試料を希釈し、最終アッセイにおいてＯＤ（光学密度）が
約０．７となるようにした。該試料の希釈液３種類、及び既知活性の内部標準液
を、４０℃で５分間サーモスタットで調節した。反応開始５分後に、１個のXyla
zyme剤（架橋結合され、染色されたキシラン基質）を上記酵素溶液に加えた。反
応開始１５分後に、１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを添加して反応を終了させた。該反
応混合液を遠心分離にかけ、上清のＯＤを５９０ｎｍにて測定した。希釈液及び
キシラナーゼ量を考慮しつつ、試料の活性（ＴＸＵ：Total-Xylanase-Units）が
標準と相対的に算出された。
【０１０６】 プロトコール２；粘度プロトコール（粘度測定） 生地の粘度を、SMS Dough Stickness Cellを用い、ＴＡ−ＸＴ２システム（St
able Micro Systems社製）により測定した。本プロトコールは、Chen及びHosene
y（1995）が報告したプロトコールに修正を加えたものである。生地は、Farinog
raph（ＡＡＣＣ法54-21）を用いて、小麦粉、２％のＮａＣｌ及び水４００ＢＵ
（Brabender Units）で作製した。小麦粉とＮａＣｌを１分間乾燥状態で混合し
た。そこに水を加え、さらに５分間生地を混ぜる。できあがった生地を密封容器
において３０℃で、１０、３０又は４５分間寝かせる。
【０１０７】 約４ｇの生地をDough Stickness Cellに積載する。均一に押し出すように、該
生地を４ｍｍ押し出す。その後Stable Micro Systems protocol（生地の粘度を
測定するＴＡ−ＸＴ２のアプリケーション研究）に従って５回測定を行った。簡
潔に述べると、１ｍｍの生地が押し出される。ＴＡ−ＸＴ２システムに接合した
プローブ（２５ｍｍのパースペクスシリンダープローブ）を用い、設定した力で
生地を押圧する。そのプローブを持ち上げ、生地とプローブが粘着する度合を記
録する。以下のＴＡ−ＸＴ２の設定を用いた。 科目： 粘着テスト テスト前速度： ２．０ｍｍ／ｓ テスト速度： ２．０ｍｍ／ｓ テスト後速度： １０．０ｍｍ／ｓ 距離： １５ｍｍ 力： ４０ｇ 時間： ０．１ｓ トリガータイプ 自動−５ｇ データ収集率 ４００ｐｐｓ このテストで記録した結果はピーク時の力であり、これは押し出した生地から
プローブを持ち上げるのに必要な力を意味する。距離は、プローブに付着してい
る距離を意味する。範囲は、得られた曲線の下の部分を意味する。
【０１０８】 生地の粘度は、使用する小麦粉の品質及びレシピに依存している。従って低粘
度の生地とは、参考生地と比べて粘度が１００％から２００％（相対的）と幅が
あり、キシラナーゼを含まない生地、若しくは焼きテストにおいて同程度の嵩増
量が得られるように市販の真菌性キシラナーゼ（Pentopan mono BG, Novo Nordi
sk社製）を添加したときの粘度に対し、その粘度が好ましくは７０％（相対的）
未満である生地をいう。
【０１０９】 プロトコール３；阻害剤アッセイプロトコール（阻害剤アッセイ） 単離及び特徴化の過程で阻害剤を検出するには、以下のアッセイを用いる。１
００μｌの阻害剤画分、２５０μｌのキシラナーゼ溶液（１２ＴＸＵ／ｍｌを含
む）、及び６５０μｌの緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナト
リウム緩衝液、ｐＨ５．０）を混合する。この混合液を４０．０℃で５分間サー
モスタットで調節する。反応開始５分後にXylazyme剤１個を加える。反応開始１
５分後に１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを添加して、反応を終了させた。かかる反応混
合液を遠心分離（３５００ｇ、１０分間、室温）にかけ、上清を５９０ｎｍで測
定した。阻害剤は、残留活性としてブランクとの比較において測定した。ブラン
クも同様にして調製するが、１００μｌの阻害剤は１００μｌの緩衝液（０．１
Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０）と置き換え
た。例えばＸＭ−１は、阻害剤に対し高耐性を示すと考えられる（図２０参照）
。ＸＭ−２及びＸＭ−３は、阻害剤に対し中程度の耐性を示すと考えられる（図
２０参照）。
【０１１０】 プロトコール４；グルカナーゼプロトコールＩ（エンド−β−１，４−グルカナ
ーゼ活性 ０．１Ｍ酢酸ナトリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）でグルカナーゼ試料
を希釈し、最終アッセイにおいてＯＤが約０．７となるようにした。該試料の希
釈液３種類、及び既知活性の内部標準を、４０℃で５分間サーモスタットで調節
した。反応開始５分後に、Xylazyme剤１個を上記酵素溶液に加えた。反応開始１
５分後に、１０ｍｌの２％ＴＲＩＳを添加して反応を終了させた。該反応混合液
を遠心分離にかけ、上清のＯＤを５９０ｎｍにて測定した。希釈液及びグルカナ
ーゼ量を考慮しつつ、試料の活性（ＢＧＵ：Beta-Glucanase-Units）の標準との
相対算出を行った。
【０１１１】 プロトコール５；阻害剤アッセイプロトコールII（阻害剤キネティックスアッセ
イ） 阻害剤のキネティックスを考察するために水溶性基質（Azo-xylan、Megazyme
社製）を用いた。製造者のプロトコールに従い、２０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ６．
０）において、基質の２％（ｗ／ｖ）溶液を調製した。このアッセイは、基質、
キシラナーゼ、及び阻害剤を４０℃で５分間予熱して行った。 阻害剤の予備的な特徴化を行うために、用いたキシラナーゼを４０ＴＸＵ／ｍ
ｌまで希釈した。Ｋ1測定を行うために、キシラナーゼを約４０ＴＸＵ／ｍｌま
で希釈した。 反応開始後０分時に、０．５ｍｌの基質、０．１ｍｌのキシラナーゼ及び０．
１ｍｌの阻害剤を４０℃で混合し、反応開始１２５分後に、２ｍｌのエタノール
（９５％）を添加して反応を終了させ、続いて１０秒間渦動した。加水分解され
ずに沈殿した基質を遠心分離（３５００×ｇ、１０分間、室温）にかけて除去し
た。上清のＯＤを５９０ｎｍにて測定した。
【０１１２】 ブランクも同様にして調製した。変更を加えた点は、阻害剤を２０ｍＭのＮａ
Ｐｉ（ｐＨ６．０）に置き換えたことだけである。 基質濃度を順次減少させてキネティック実験を行うために、２０ｍＭのＮａＰ
ｉ（ｐＨ６．０）で希釈して、２％、１％、０．５％、及び０．２５％可溶性ア
ゾキシラン（ｗ／ｖ）の基質濃度をそれぞれ用意した。 上記のキシラナーゼ及び基質濃度を用いてＫ1測定を行った。かかる測定アッ
セイを行うにあたり、この双方を以下の各濃度、すなわち０、２、５、１０、２
５、５０、及び１００μｌ、の阻害剤抽出物と組み合わせた。阻害剤のモル濃度
ではなく、μｌ阻害剤を用いることから、Ｋ1は、μｌ阻害剤として表される。
【０１１３】 要約すると本発明は以下のことを提供する。 ａ．小麦粉から内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤を単離するこ
と。 ｂ．小麦粉から単離した内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤を特
徴化すること。 ｃ．内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤がキシラナーゼ類に及ぼ
す効果を特徴化すること。 ｄ．内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受
けないキシラナーゼ類を選択する方法。 ｅ．エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受けない
キシラナーゼ類を選択する方法。 ｆ．真菌性キシラナーゼを含む生地に比べて、好ましい嵩及び適度な粘度を備
えた生地を提供するキシラナーゼ。 ｇ．内因性エンド−β−１、４−キシラナーゼ阻害剤を用いたキシラナーゼ類
のスクリーニング方法及び／又は該キシラナーゼ類を変異させる方法、並びに該
キシラナーゼ類又はそれらの変異体を生地製造に使用すること。 ｈ．本発明のキシラナーゼ類を用いた食品の調製。
【０１１４】 以下の試料はブダペスト条約に基づき、公認の寄託機関であり、英国ＡＢ２
１ＲＹ、スコットランド、アバディーン、マーチャードライブ、２３Ｓｔ．に所
在するThe National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited
(NCIMB)に１９９８年１２月に寄託された。 DH5α::pCR2.1#BSキシラナーゼ ＮＣＩＭＢ番号NCIMB ４０９９９ BL21(DE3)::pET24A#XM1 ＮＣＩＭＢ番号NCIMB ４１０００ BL21(DE3)::pET24A#XM3 ＮＣＩＭＢ番号NCIMB ４１００１ DH5α::pCR2.1#BSキシラナーゼには、野生型キシラナーゼが含まれる。 BL21(DE3)::pET24A#XM1には、XM1キシラナーゼが含まれる。 BL21(DE3)::pET24A#XM3には、XM3キシラナーゼが含まれる。 本発明はまた、これらの寄託物に由来し、及び／又はこれらの寄託物から発現
される配列、並びにそれらの配列を含む実施例を包含するものである。 次に図面を参照しながら、例を挙げるだけではあるが、本発明を説明する。 図１〜図１０、図１２〜図１６及び図１８〜図３１はグラフであり、図１１はＳ
ＤＳ ＰＡＧＥ実験の結果を示す画像であり、図１７はＩＥＦ実験の結果を示す
画像である。
【０１１５】
【実施例】
実施例１（異なる種類のキシラナーゼを用い、添加量及び寝かせ時間を変えて作
製した生地の粘度） 生地に粘度を与える以下のキシラナーゼ能をテストした。（W.Z. and Hoseney
, R.C. (1995). Development of an objective method for dough stickiness.
Lebensmittel Wiss u.-Technol., 28, 467-473も参照されたい） （酵素） 「Ｘ１」は、Aspergillus niger由来のエンド−β−１，４−キシラナーゼを
精製した試料のことである。このキシラナーゼは、８４００ＴＸＵ（１５０００
ＴＸＵ／ｍｇ）の活性をもつ。 「Novo」は、Thermomyces由来のNovo Nordisk's Pentopan Mono BGのことであ
る。このキシラナーゼは、３５００００ＴＸＵ（５６０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活
性をもつ。 「ＢＸ」は、新規の細菌性キシラナーゼを精製した試料のことである。この試
料は、２０００ＴＸＵ（２５０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活性をもつ。 「R▲o▼hm」は、R▲o▼hm GmbH社製の細菌性キシラナーゼであるVeron Speciel
のことである。この試料は、１０５００ＴＸＵ（２５０００ＴＸＵ／ｍｇ）の活
性をもつ。
【０１１６】 （キシラナーゼアッセイ） キシラナーゼアッセイは、プロトコール１に従って行った。 （小麦粉） この実験においては、デンマーク産小麦粉（バッチ番号９８０２２）及びドイ
ツ産小麦粉（バッチ番号９８０４８）の２種類の小麦粉を使用した。４００ＢＵ
における上記２種類の小麦粉の水分吸収率は、それぞれ５８％及び６０％であっ
た。 （生地の調製） 生地は、プロトコール２に従って調製した。生地を混合した後、密封容器にお
いて３０℃で、それぞれ１０分間及び４５分間寝かせた （粘度測定） 粘度は、プロトコール２に従って測定した。 （真菌性キシラナーゼと新規細菌性キシラナーゼの比較） 以下の生地を作り、１０分後及び４５分後における小麦粉９８０４８の生地の
粘度を測定した。２種類の真菌性キシラナーゼ、及び１種類の細菌性キシラナー
ゼの添加量を変えて（表２参照）、生地を作製した（分量は小麦粉１ｋｇに対す
るもの）。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】 表２における生地から、表３及び図１に示す生地の粘度に関する結果が導きだ
される。種々のキシラナーゼを、その分量を様々に変えて添加し、生地を製造し
てブランクと比較した製造した生地は、それぞれ１０分間及び４５分間寝かせた
。表３には、粘度がｇ×ｓとして表わされ、粘度の測定結果は、５回測定を行っ
た平均値で示されている。上記表３のデータは、図１に示されている。表３及び
図１から、真菌性キシラナーゼＸ１及びNovo生成物中に含まれるキシラナーゼが
生地の粘度を上昇させていることがわかる。新規細菌性キシラナーゼを加えたと
きには、Ｘ１及びNovoと同様の粘度にはならず、さらにコントロールと比較して
も該新規キシラナーゼの粘度は減少していた。
【０１１９】
【表３】
【０１２０】 （新規細菌性キシラナーゼとR▲o▼hm細菌性キシラナーゼの比較） 新規細菌性キシラナーゼの機能を、R▲o▼hm製品の細菌性キシラナーゼである
Veron Specialとの比較において考察するために、小麦粉９８０２２を使用して
以下の生地を製造した。２種類の細菌性キシラナーゼの添加量を変えて（表４参
照）、生地を作製した（分量は小麦粉１ｋｇに対するもの）。表４に示す生地か
ら、表５及び図２に示す生地粘度の結果を得た。表５には、粘度がｇ×ｓとして
表わされ、粘度の測定結果は、５回測定を行った平均値で示されている。表５に
示すデータを、図２に図示した。この結果から、ＢＸ（新規の細菌性キシラナー
ゼ）を加えた生地の粘度は、テストした真菌性キシラナーゼの粘度に比べ、非常
に低いことが明らかになった。さらに新規の細菌性キシラナーゼを加えると、R
▲o▼hm細菌性キシラナーゼとの比較において生地の粘度が減少することもわか
った。
【０１２１】
【表４】
【０１２２】
【表５】
【０１２３】 実施例２（阻害剤の精製、特徴化、及びキシラナーゼに与える効果） （小麦粉） 種類の異なる３種類の小麦粉（バッチ番号９８００２、９８０２６、及び９８
０５８）を使用して以下の実験を行った。小麦粉バッチ番号９８００２及び９８
０５８はデンマーク産の小麦粉である。小麦粉バッチ番号９８０２６はドイツ産
の小麦粉である。 （阻害剤抽出） 氷温の蒸留水を用いた撹拌により、阻害剤を小麦粉から抽出した。小麦粉１に
対し、２の氷温蒸留水を加えた。この混合物に磁気バーを加え、氷浴させて２０
分間撹拌した。小麦粉を撹拌した後、スラリーを遠心分離器のバイアルに入れ、
遠心分離（１００００ｇ、４℃で１０分間）にかけた。上清にはキシラナーゼ阻
害剤が含まれていた。 （阻害剤アッセイ） プロトコール３に従って阻害剤アッセイを行った。
【０１２４】 （阻害剤の単離） １００ｇの小麦粉試料（９８０２６）を抽出した後、クロマトグラフィー法に
よりキシラナーゼ阻害剤の精製を行った。 （ゲル濾過クロマトグラフィー（２回実施）） ７５ｍｌの抽出物を、５００ｍｌSupredex G-25F（スウェーデン、Pharmacia
社製）カラムに１０ｍｌ／分の割合で投入し、２０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．
２５）でキャリブレートした。溶離液を同一フローにおいて、３０ｍｌ画分とし
て回収した。これら全ての画分において阻害活性が認められた。
【０１２５】 （陽イオン交換クロマトグラフィー（２回実施）） ゲル濾過のランから回収された阻害剤のピーク（２４０ｍｌ）を５０ｍｌSP S
epharose（スウェーデン、Pharmacia社製）カラムに５ｍｌ／分の割合で投入し
た。阻害剤投入後、Ａ緩衝液（２０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．２５）を用いて
、このカラムをベースラインまで洗浄した。同じフローにおいて、１０カラムボ
リュームを超えるＡ緩衝液からＢ緩衝液（Ｂ：Ａ＋３５０ｍＭのＮａＣｌ）に至
るリニアグラディエントによって阻害剤を溶離させた。この溶離液を１０ｍｌ画
分として回収した。１秒毎の画分がキシラナーゼ阻害剤の存在を示していた。
【０１２６】 （疎水性相互作用クロマトグラフィー（２回実施）） 陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られた阻害剤のピーク（１１０ｍ
ｌ）に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を加えて１．０Ｍとし、１０ｍｌPhenyl Sepharose HI
C（スウェーデン、Pharmacia社製）カラムに２ｍｌ／分の割合で投入した。Ａ（
２０ｍＭのＮａＰｉ、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）からＢ（２０ｍＭ
のＮａＰｉ、ｐＨ６．０）緩衝液に至る１２カラムボリュームのリニアグラディ
エントによって、阻害剤をカラムから溶離させた。かかる溶離液を２．５ｍｌ画
分として回収した。１秒毎の画分がキシラナーゼ阻害剤の存在を示していた。（
この実験は２回実施した）
【０１２７】 （分取ゲル濾過クロマトグラフィー） 回転式蒸発装置を使って、ＨＩＣランで得られた５ｍｌの阻害剤ピークを２ｍ
ｌに濃縮した。この試料を３３０ｍｌSuperdex 75PG（スウェーデン、Pharmacia
社製）カラムに１ｍｌ／分の割合で投入した。５０ｍＭのＮａＯＡｃ及び０．２
ＭのＮａＣｌからなる緩衝液系（ｐＨ５．０）を用いた。溶離液は５．５ｍｌ画
分として回収した。１秒毎の画分がキシラナーゼ阻害剤の存在を示していた。
【０１２８】 （プロテアーゼ活性分析） 見いだされた阻害剤効果が、阻害剤によるものか、或いはキシラナーゼを加水
分解するプロテアーゼによるものかを確認するために以下の実験を実施した。 （インキュベーションテスト） ２ｍｌの精製キシラナーゼである９８０６０１（エンド−β１，４−キシラナ
ーゼを参照のこと）を、０．２５ｍｌの阻害剤抽出物共存下において４０℃で３
時間インキュベーションした。コントロールとして、煮沸（５分間）した阻害剤
抽出物を同様にインキュベーションした。インキュベーション後、各試料に５０
ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）を加え２．５ｍｌとし、PD-10カラム（スウェ
ーデン、Pharmacia社製）を使ったゲル濾過によって脱塩し、５０ｍＭのＮａＯ
Ａｃ（ｐＨ４．５）において３．５ｍｌの試料を得た。
【０１２９】 （加水分解分析） インキュベーションで得られた精製キシラナーゼ２種類の試料を、SOURCE 15
Sカラムを使って分析した。ゲル濾過した試料１ｍｌを上記カラム（Ａ緩衝液（
５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５）でキャリブレートした）に２ｍｌ／分の割
合で投入した。２０カラムボリュームを超えるＡからＢ（Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣ
ｌ）のリニアグラディエントによって試料を溶離させ、２ｍｌ画分として回収し
た。ＯＤ２８０ｎｍでキシラナーゼが検出され、得られた画分（１００μｌ画分
＋９００μｌ緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝
液、ｐＨ５．０）＋１Xylazyme剤、１０分間、４０℃。１０ｍｌの２％ＴＲＩＳ
を加え反応を終了した。青色＝キシラナーゼ活性）の中にキシラナーゼ活性がみ
られた。
【０１３０】 （阻害剤の特徴化） （分析用ゲル濾過クロマトグラフィー） ＨＩＣランで得られた阻害剤ピーク１００μｌ（回転式蒸発装置を用いて２回
濃縮）を、２４ｍｌSuperdex 75 10/30（スウェーデン、Pharmacia社製）に０．
５ｍｌ／分の割合で投入した。５０ｍＭのＮａＯＡｃ及び０．１ＭのＮａＣｌか
らなる緩衝液（ｐＨ５．０）をランニング緩衝液として用いた。溶離液は、２ｍ
ｌ画分として回収した。これらの画分全てにおいて阻害剤が認められた。 かかる阻害剤の大きさを測定するため、２４ｍｌSuperdex 75 10/30カラムに
、公知のタンパク質を連続して投入した。このランを実行するときの条件は上述
のとおりである。使用した標準タンパク質は以下のとおりである。 タンパク質 大きさ（ＫＤａ） ＢＳＡ ６７ オバルブミン ４３ キモトリプシン ２５ リボ核酸Ａ １３．７ 上記タンパク質は、２８０ｎｍにて測定した。
【０１３１】 （ＳＤＳ ＰＡＧＥ） 調製ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分に、ＳＤＳ試料緩衝液（NOVE
X社のプロトコールによって調製）を加え３分間煮沸し、８−１６％ＰＡＧＥゲ
ル（NOVEX社製）にかけた。このゲルを、NOVEX社のシルバー染色プロトコールに
従って染色した。分子量マーカーとしてPharmacia社のLMWマーカーを使用した。
【０１３２】 （Ｉｓｏエレクトリックフォーカシング（ＩＥＦ）） 無処理の阻害剤のｐｌを測定するため、精製阻害剤試料（３３０ｍｌSuperdex
75 PGによる画分３３）を、pH3-10 IEF GEL（NOVEX）にかけた。ゲルに対する
ランは、製造者のプロトコールに従って実行した。標準として、Pharmacia社（
スウェーデン）のBroad Pl kit, 3.5-9.3を用いた。ゲルは、製造者のプロトコ
ールに従って、クマシブリリアントブルーに染色した。
【０１３３】 （クロマトフォーカシングクロマトグラフィー） 調製ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分３３の試料を、水に対してゲ
ル濾過した。１００μｌの脱塩した試料を、Mono P HR 5/5（Pharmacia社製、ス
ウェーデン）にかけた。２５ｍＭのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ９．４）に
より、開始条件を設定した。このカラムをPoly緩衝液９６と水との割合が、１：
１０において溶離した。ｐＨは６．０に調整した（フロー：０．５ｍｌ／分、画
分サイズ：０．５ｍｌ）。Poly緩衝液９６による溶離後、Poly緩衝液７４と水と
の割合が１：１０において、該カラムをさらに溶離させた。 プロトコール３により、全画分のｐＨを測定し、キシラナーゼ阻害剤を示した
。
【０１３４】 （アミノ酸配列） 調製精製法によって得られた精製阻害剤の試料（３３０ｍｌSuperdex 75 PGに
よる画分３３から得た）が用いられた。該試料２００μｌを、C4 Reverse Phase
column（Applied Biosystems）にかけた。Ａ：水に０．１％ＴＦＡを添加した
もの、及びＢ：１００％アセトニトリルに０．１％ＴＦＡを添加したものを緩衝
液系として用いた。このランによる阻害剤ピークを、カルボキシメチル化して、
Ｃ４カラムにて再度ランを実行した。かかる方法によって、目的とする阻害剤ペ
プチド２種を得た。これらのペプチドのＮ末端における配列決定を行った。さら
に上記ペプチド２種をLys-Cによって消化した。逆相クロマトグラフィーにより
、得られたペプチドを回収してアミノ酸配列決定した。アミノ酸配列決定により
得られた配列を確認するため、目的試料の小断片をＭＳ（Voyager社製）を用い
て分析した。
【０１３５】 （阻害剤キネティックス） プロトコール５に従って、阻害剤アッセイを行った。この点に関し、阻害剤に
対する予備的な特徴化を行うために用いたキシラナーゼは９８０６０１であり、
このキシラナーゼを４０ＴＸＵ／ｍｌまで希釈し、小麦粉９８００２から阻害剤
を抽出した。Ｋ1測定を行うために用いたキシラナーゼは、９８０６０１、９８
０６０３、９８０８０１、９８０９０１、９８０９０３、９８０９０６、及び９
８０９０７であり、これらのキシラナーゼを約４０ＴＸＵ／ｍｌに希釈して用い
た。Ｋ1測定に用いた阻害剤は、小麦粉９８０５８から抽出した。
【０１３６】 （ｐＨとの関連における阻害剤の測定） プロトコール３に以下の修正を加えて実験を行った。６５０μｌ、ｐＨ５．０
の緩衝液（０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム）を本アッセイ
で使用するが、これ以外にもｐＨが４、６、及び７である同じ緩衝液系も本アッ
セイに使用できる。
【０１３７】 （エンド−β−１，４−キシラナーゼ類） 以下のキシラナーゼ調製物を使用した。 ９８０６０１（ＢＸ）：大腸菌において発現されるDaniscoの新規細菌性キシラ
ナーゼの精製調製物（１２２５ＴＸＵ／ｍｌ） ９８０６０３（R▲o▼hm）：Frimond's Belaseキシラナーゼ（R▲o▼hmのものと
同一）の精製調製物（１０５０ＴＸＵ／ｍｌ） ９８０８０１（Ｘ１）：Aspergillus niger由来の精製Ｘ１（８４００ＴＸＵ／
ｇ） ９８０８０２（R▲o▼hm）：Frimond's Belaseキシラナーゼ（R▲o▼hmのものと
同一）の精製調製物（２６５ＴＸＵ／ｍｌ） ９８０９０１（Novo）：Novo's Pentopan mono BG由来のThermomycesキシラナー
ゼの精製調製物（２９００ＴＸＵ／ｍｌ） ９８０９０３（ＸＭ１）：大腸菌において発現される野生型キシラナーゼである
Bacillus sub.の精製変異体（１３７５ＴＸＵ／ｍｌ） ９８０９０６（ＸＭ３）：大腸菌において発現される野生型キシラナーゼである
Bacillus sub.の精製変異体（１７７５ＴＸＵ／ｍｌ） ９８０９０７（ＸＭ２）：大腸菌において発現される野生型キシラナーゼである
Bacillus sub.の精製変異体（１００ＴＸＵ／ｍｌ） ９５３５（Ｘ３）：Aspergillus niger由来の精製キシラナーゼＸ３（６４９０
ＴＸＵ／ｍｌ）
【０１３８】 （単離及び特徴化のための阻害剤抽出） 小麦粉（９８０２６）１００ｇを抽出した。遠心分離にかけた後、１５０ｍｌ
の上清を得た。この抽出物における阻害剤の存在を調べたところ（表６）、その
結果はポジティブだった。表６には、キシラナーゼ９８０６０１を使用し、小麦
粉（９８０２６）阻害剤抽出物の＋／−添加による残存活性の結果が示されてい
る。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】 （阻害剤単離） 阻害剤抽出物７５ｍｌを５００ｍｌゲル濾過カラムにかけた（図３）。阻害剤
を検出したところ、画分［４〜１１］において阻害剤が認められた。７５ｍｌの
阻害剤抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーにかけて得られた画分のキシラナー
ゼ阻害剤アッセイを行った。ＯＤラン１及び２は、同じカラムで実行した２回の
ランに相当する。表７に示されるように、画分［４〜１１］において阻害剤が認
められた。かかる阻害剤をそれぞれのランでプールし、プールした量は２回分で
２４０ｍｌだった。
【０１４１】
【表７】
【０１４２】 ゲル濾過カラムの両ランにおける阻害剤ピークのプールは、約２４０ｍｌだっ
た。ゲル濾過で得た２４０ｍｌのプールを陽イオン交換器を用いて２回処理した
。フロースルーの結果は阻害剤ネガティブだった。図４及び表８から明らかなよ
うに、約７５０ｍＭのＮａＣｌにおいて阻害剤はカラムに結合し、溶離した。 ゲル濾過した阻害剤抽出物２４０ｍｌを陽イオン交換クロマトグラフィーにか
けて得られた画分のアッセイを行って、キシラナーゼ阻害剤の存在を確認した。
ＯＤラン１及び２は、同じカラムで実行した２回のランに相当する。画分［４４
〜５４］において阻害剤が存在していた。
【０１４３】
【表８】
【０１４４】 陽イオン交換のランで得られた阻害剤のプールは、１ランにつき１１０ｍｌだ
った。これらプールした２画分に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を加えて１．０Ｍにし、２
回のランでＨＩＣカラムにかけた。フロースルーで阻害剤を検出したところ、ネ
ガティブだった。図５及び表９から明らかなように、全ての阻害剤がカラムに結
合し、好ましい分離を得ることができた。ＨＩＣクロマトグラフィーによる画分
分析の結果が表９に示されている。 １４７ｍｌの阻害剤抽出物をＨＩＣクロマトグラフィーにかけて得られた画分
のキシラナーゼ阻害剤のアッセイを行った。ＯＤラン１及び２は、同じカラムで
実行した２回のランに相当する。画分［１５〜２３］に阻害剤が存在していた。
ＨＩＣクロマトグラフィーで得られた画分１７及び１８を２回程度濃縮し、分取
ゲル濾過カラムにかけた（図６）。
【０１４５】
【表９】
【０１４６】 かかる予備的濾過カラムにおける画分の分析結果を表１０に示す。表１０には
、濃縮阻害剤試料２ｍｌを分取ゲル濾過クロマトグラフィーにかけて得られた画
分におけるキシラナーゼ阻害剤の存在を確認するアッセイの結果が示されている
。画分［３１〜３３］において阻害剤が存在していた。
【０１４７】
【表１０】
【０１４８】 （プロテアーゼ活性分析） キシラナーゼ阻害剤に関する上記のアッセイからは、小麦粉抽出物と混合した
ときのキシラナーゼ活性低下が、キシラナーゼのタンパク質分解性加水分解に依
るものではない可能性を除外することはできない。そこで精製キシラナーゼを「
阻害剤」抽出物共存下でインキュベートした。図７及び８から明らかなように、
加水分解は生じなかったと考えられる。活性阻害剤のクロマトグラムの方が、少
しではあるが、バックグラウンドが大きかった（図８）。しかし、このバックグ
ラウンドは阻害剤のみのクロマトグラムに相当している（阻害剤のクロマトグラ
ムは示さず）。バックグラウンドの差は、煮沸した阻害剤試料の沈殿によるもの
である。
【０１４９】 （阻害剤の特徴化） （分析用ゲル濾過クロマトグラフィー） ２回目のＨＩＣランの画分１８における２回濃縮した阻害剤試料１００μｌを
、２４ｍｌ分析用Superdex 75 10/30（Pharmacia社製、スウェーデン）にかけた
（図９）。溶離液を２ｍｌ画分として回収した。これらの画分のキシラナーゼ阻
害剤アッセイを行った。濃縮阻害剤試料１００μｌを分析用ゲル濾過クロマトグ
ラフィーにかけて得られた画分におけるキシラナーゼ阻害剤の存在をみるために
アッセイを行った結果が表１１に示されている。画分［６〜７］において阻害剤
が認められた。
【０１５０】
【表１１】
【０１５１】 濃縮した（up-concentrated）阻害剤試料をゲル濾過した後、４種類の標準分
子量タンパク質を、全く同じ手順でカラムにかけた（クロマトグラフは示さず）
。表１２に、上記タンパク質の分子量及び溶離時間をまとめた。標準タンパク質
を阻害剤の分子量（ＭＷ）測定のために用い、表１２中の略語及び数式は表下に
示した。
【０１５２】
【表１２】
【０１５３】 Ｋａｖの作用としてｌｏｇ（ＭＷ）をプロットする。公式化ができることから
、未知分子の分子量を推定できる（図１０）。図１０から導き出された公式、及
び阻害剤の保持時間から、阻害剤の分子量の算出が可能になる。 ＭＷ、ｋＤａ＝１０(-2.4485×Kav+1.9602) ＝１０(-2.4485×0.173559+1.9602) ＝１０1.5352 ＝３４．２９
【０１５４】 計算した阻害剤の分子量は、本発明者らがRouau及びSurget（1988, Evidence
for the presence of a Pentosanase Inhibitor in Wheat Flour. Journal of C
ereal Science. 28:63-70）の報告をもとに予想していたより高く、そのＭＷ（
分子量）は約８ＫＤａだった。ゲル濾過により算出されるＭＷは、阻害剤分子数
種が集合することから説明し得る。詳細を知るために、分取ゲル濾過クロマトグ
ラフィーで得た画分３１、３２、及び３３に対して、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルのラ
ンを実行した（図１１）。上記ゲルに示されるように、精製した阻害剤試料と共
に処理したレーンに３つのバンドが現れた。これらのバンドは分子量が約４０、
３０、及び１０ｋＤａであるタンパク質に相当する。
【０１５５】 （ＭＳを用いた分子量測定） 分取ゲル濾過クロマトグラフィーで得た阻害剤の画分３３を、Presorbシステ
ム及び５容量の２０ｍＭ酢酸により脱塩した。脱塩処理した画分２００μｌを、
C4 Reverse Phase column（Applied Biosystems）にかけた。このランにおいて
はピークが３つ認められた。これらピークの内の１つ（ピーク３）が明らかに優
勢であり、阻害剤であると考えられた（図１２）。このランで認められた他の２
つのピークについても配列決定した。得られた配列から、これらは全て同じ小麦
粉タンパク質Serpin由来であり、阻害剤（ピーク３）と同一ではなかった。よっ
てピーク３が目的とするキシラナーゼ阻害剤であるとの結論が得られた。ＭＳ(V
oyager社製)を用いて、ピーク３の特徴化をさらに行った。シナピン酸をマトリ
ックスとして用いたＭＳ分光分析により、３９５０３Ｄａのタンパク質に相当す
るシグナルが認められた（図１３）。
【０１５６】 上述したように、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルからは３つのバンドが認められた。１
０ｋＤａ近辺、３０ｋＤａ近辺、及び４０ｋＤａ近辺にそれぞれ１つのバンドが
みられた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を説明するために、上述の条件と同一条件下
で、精製したドミナント画分を回収し、減圧凍結乾燥し、カルボキシメチル化し
た後、Ｃ４カラムに戻した。カラムに戻したことにより得られた画分（図１４）
をＭＳにより分析した。図１５、１６から明らかなように、これらのポリペプチ
ドの分子量（ＭＷ）は、１２１０４及び２８２２２Ｄａだった。かかるキシラナ
ーゼ阻害剤は、元々ジ−ペプチド（ＭＷ３９５０３Ｄａ）であったか、或いは分
析過程において変性及び還元（ＭＷがそれぞれ１２１０４及び２８２２２Ｄａで
ある２つのペプチド）されたかのどちらかであると考えられる。
【０１５７】 （ＩＥＦ及びクロマトフォーカシングクロマトグラフィーによるキシラナーゼ阻
害剤のｐｌ測定） ＩＥＦゲルにおいては、アルカリ性領域に３つのバンド（それぞれ約９．３、
８．６、及び８．２）が認められ、酸性領域に３つのバンド（それぞれ５．１、
５．３、及び５．５）が認められた（図１７）。この結果からだけでは、無処理
のキシラナーゼ阻害剤のｐｌを決定するのは無理であると考えられる。この点に
関しては、かかる試料にはキシラナーゼ阻害剤及び約４５００ＤａのSerpinの３
断片だけが含まれていることが、配列決定から明らかになっている。Serpinのｐ
ｌを理論的に計算した結果は５．５８であり、配列決定により得られた断片によ
り計算したｐｌは５．４６（Swiss Prot programmesを使用した）だった。この
ことから、上記ゲルにみられた３つの酸性バンドは、逆相クロマトグラフィー（
図１２）で認められたSerpinの３つのピークであり、また３つのアルカリ性バン
ドは、キシラナーゼ阻害剤の異なる３形態（天然のジ−ペプチド形態、及び２つ
のペプチド）であることが示唆される（配列決定から示唆される）。
【０１５８】 図１８に示すクロマトフォーカシングクロマトグラフィーの結果から明らかな
ように、キシラナーゼ阻害剤は所定の条件下ではカラムに結合しない。これは天
然のキシラナーゼ阻害剤のｐｌは８．５若しくはそれ以上であることを意味する
。よって上述の推定、つまりＩＥＦゲル上に３つのアルカリ性バンドがあること
から３種類のキシラナーゼ阻害剤の形態が考え得るという推定は正しいと思われ
る。 天然のキシラナーゼ阻害剤のｐｌは、８．０〜９．５の間であると結論づけら
れる。かかる幅内に３つのバンドがある。かかる３バンドは恐らく３形態で存在
していると考えられるキシラナーゼ阻害剤に相当している（ＩＥＦによる結果を
参照されたい）。この点に関して、ＩＥＦを用いるときには、タンパク質は天然
のタンパク質のままランを行うが、ジ−ペプチドタンパク質の中にはＩＥＦ法に
より部分的に損傷を受けるものがあり、その結果１以上のバンドが出現すること
がある。
【０１５９】 （配列データ） 阻害剤を形成する２つのペプチドは配列決定され、Ｎ末端及び内在配列が決定
された。配列決定の結果は、添付の配列表に配列番号１３〜１９として示した。 第１鎖（Ａ鎖）を形成する配列を、配列番号１３及び１４として示した。第２
鎖（Ｂ鎖）を形成する配列を配列番号１５〜１９として示した。配列決定したポ
リペプチドと相同性を有するポリペプチドをデータベース上で検索したが、その
結果はネガティブだった。いずれのポリペプチドも、かつて配列決定されたこと
も記載されたこともなかった。
【０１６０】 （種類の異なるキシラナーゼ類に対する阻害剤の効果） 種々のキシラナーゼの阻害を考察する目的でいくつかの実験を行った。先ず本
発明者らは、キシラナーゼ活性の低下は、抽出物におけるタンパク質分解作用に
よるものであると考えた。そこで「阻害剤」抽出物の分量を様々に変えて、種々
のキシラナーゼをインキュベートした（図１９）。かかるキシラナーゼ類は、程
度の差はあれ阻害を受けていた。「阻害剤」濃度条件により、阻害活性が上昇す
ることも見いだした。図１９に示す結果から、タンパク質分解作用又は阻害剤に
よりキシラナーゼ活性が低下することが示された。しかし一定のキシラナーゼ及
び一定濃度の阻害剤による経時実験の結果、並びに「プロテアーゼ活性分析」に
基づく上述の結果からは、活性低下が時間の経過に伴って生じることを明らかに
できなかった。プロテアーゼと阻害剤を識別するために正式なキネティックスを
行った（「阻害剤キネティックス」を参照のこと）。
【０１６１】 Bacillus subtillisキシラナーゼ２種を、そのベーキングに及ぼす効果に着目
して詳細に研究した。これらのキシラナーゼは機能的に若干違いがみられ、同量
を添加して焼いたときに１種類のキシラナーゼを添加した製品の嵩が幾分大きか
った。その理由の１つとして、小麦粉において上記キシラナーゼ類の活性が阻害
される程度が異なることが挙げられる。このことを確認するために実験を行った
。阻害剤の供給源として小麦粉を２種類用い、かかる実験を２回繰り返して行っ
た。表１３には、種類の小麦粉（９８００２及び９８０２６）から抽出した阻害
剤により、２種類のキシラナーゼ（９８０６０１及び９８０６０３）が受ける阻
害の結果が示されている。阻害は、％阻害及び％残存活性として算出し、ブラン
クと比較した。かかる実験からこれら２種類のキシラナーゼは、阻害剤によって
程度の差はあるが阻害されることがわかる。上記キシラナーゼ２種は、６アミノ
酸が異なるだけである。
【０１６２】
【表１３】
【０１６３】 ９８０６０１を基礎として３種のキシラナーゼ変異体を作出した（ＸＭ１、Ｘ
Ｍ２、及びＸＭ３）。これらの変異体を分析して阻害を調べた（図２０）。図２
０から明らかなように、上記変異体３種における残存活性は異なるが、これはキ
シラナーゼ阻害剤により異なる程度の阻害を受けていることを意味している。５
種類のキシラナーゼの内４種類（ＢＸ、R▲o▼hm、ＸＭ１、及びＸＭ３）のキシ
ラナーゼが同じ特異的活性（約２５０００ＴＸＵ／ｍｇのタンパク質）を備えて
いる。ＸＭ２は同様の特異的活性を有していると予想される。ＸＭ１とＸＭ２に
おける阻害の差は、約２５０％である（ＸＭ１の残存活性は、ＸＭ２の静止活性
の２．５倍と高い）。この差は１個のアミノ酸に起因する。ＸＭ２のアミノ酸１
２２は、アルギニンからアスパラギンに変化し、活性部位近辺で陽電荷の減少を
もたらす。
【０１６４】 （阻害剤キネティックス） 阻害剤が拮抗阻害剤であるか非拮抗阻害剤であるかを決定することだけを対象
として、簡便な予備的キネティックスを行った。一定のキシラナーゼ及び一定の
阻害濃度条件下で、基質の量を様々に変化させてインキュベートした（図２１）
。図２１からわかるように、阻害剤存在下のキシラナーゼ及び阻害剤非存在下の
キシラナーゼ双方のＶmaxは、約１．１９だった。このことからこの阻害が拮抗
阻害であることが示唆される。 上述の予備的阻害実験では、検討したキシラナーゼ類の間でＫ1値が異なるこ
とを示していたため、キシラナーゼ数種の正式なＫ1値を測定した。図２２のデ
ータが示すように、キシラナーゼ種間におけるＫ1値には有意の差がみられた。
簡単な予備的阻害の特徴化により示された結果が、このことから確認された。
【０１６５】 （ｐＨと阻害との関係） 異なるｐＨにおいてキシラナーゼ阻害剤の存在が容易に認められることから、
キシラナーゼ阻害にｐＨが何らかの影響を及ぼしていると考えられる。そこでか
かる影響を調べるために実験を行った。図２３から明らかなように、キシラナー
ゼ阻害はｐＨの影響を受ける。図２４には、キシラナーゼに対する最適ｐＨが示
されている。これらの２曲線を比較すると、Novoキシラナーゼ（９８０９０１）
のｐＨ４での測定を別にすれば、キシラナーゼにとっての最適ｐＨにおいて最大
阻害が生じることがわかる。
【０１６６】 本発明のアッセイにより測定した阻害率が、生地と関連性を有しているかを調
べるために計算を行った。 阻害剤抽出 小麦粉（グラム）： ６ 水（ｍｌ）： １２ 小麦粉ｇ／ｍｌ： ０．５ アッセイにおける小麦粉（ｇ）： ０．０５ キシラナーゼ溶液 ＴＸＵ／ｍｌ： １２ アッセイでのＴＸＵ／ｍｌ： ３ 阻害剤：キシラナーゼの割合 小麦粉ＴＸＵ／ｋｇ：６００００（阻害剤アッセイ時） 小麦粉ＴＸＵ／ｋｇ：３０００（ベーカリーへの使用時） 上記の計算から、アッセイにおける阻害剤：キシラナーゼの割合は、生地に含
まれるときの割合よりも、アッセイにおける割合の方が２０分の１と低い結果に
なった。これはキシラナーゼが生地に含まれるときに、より顕著に阻害されるこ
とを意味している。しかしながら、移動度及び水分活性は生地における方が低く
、このことが阻害に影響を及ぼしているとも考えられる。
【０１６７】 小麦粉には、内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤が存在している
。かかる阻害剤は、水を用いた簡便な抽出法により小麦粉から抽出でき、この阻
害剤が水溶性であることを示している。阻害剤はゲル濾過、イオン交換、及び疎
水性相互作用クロマトグラフィー技術により精製される。 分析用ゲル濾過クロマトグラフィー、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、逆相クロマトグラフ
ィー、及びＭＳを用いた精製阻害剤の特徴化により、約４０ｋＤａのポリペプチ
ドが見いだされた。このポリペプチドは、分子量がそれぞれ１２１０４及び２８
２２２Ｄａである２つのペプチドを含むジ−ペプチドであることが判明した。上
記精製阻害剤（厳密には２つのペプチド）は、Ｎ末端で配列決定され、次に、得
られたペプチドの消化及び配列決定を行った。
【０１６８】 阻害剤を用いた予備実験は、キシラナーゼ活性の低下は、タンパク質分解作用
に起因することを示している。しかし、インキュベーション（キシラナーゼ＋阻
害剤）の分析結果及び阻害剤のキネティックスは、観察されたキシラナーゼ活性
の低下は、拮抗阻害によるものであることを示している。 キシラナーゼ数種類を用いた阻害剤実験からは、阻害剤に対する感受性の違い
が見受けられる。キシラナーゼの中には、阻害剤によってほぼ１００％阻害され
るものも数種類ある（小麦粉においてよりも、低い阻害剤：キシラナーゼの割合
）。ｐＨを様々に変化させて阻害剤アッセイを行ったところ、阻害剤はアッセイ
においては、高度にｐＨ依存性であることが判明した。キシラナーゼ変異体を調
べたところ、アミノ酸を１個換えることは、阻害を２５０％減少させることを意
味した。
【０１６９】 上述の結果を確認するために、キシラナーゼ数種のＫ1値を測定した。その結
果から、使用したキシラナーゼの種類によってＫ1値が異なることが判明し、予
備結果においてみられたキシラナーゼと阻害剤に対する耐性の違いとの相関関係
が確認された。
【０１７０】 実施例３（ベーキングテスト） 以下のデータは、ＸＭ１変異体を使ったベーキング実験から得たものである。
かかる新規のキシラナーゼ変異体が、嵩の点において明らかにＢＸ（Bacillus s
ubtilis野生型）に勝っていることが、このデータから読みとれる。粘度測定結
果からは、上記２種のキシラナーゼ間に有意の差は認められなかった。 （酵素） ９８０９０２（ＢＸ）：大腸菌において発現され、精製したBacillus sub.野
生型キシラナーゼ（２０００ＴＸＵ／ｍｌ） ９８０９０３（ＸＭ１）：大腸菌において発現され、精製したBacillus sub.
野生型キシラナーゼ変異体（１３７５ＴＸＵ／ｍｌ） （小麦粉） デンマーク産小麦粉、バッチ番号９８０２２
【０１７１】 （ベーキングテスト：ハードクラストロール） 小麦粉２０００ｇ、乾燥酵母４０ｇ、砂糖３２ｇ、塩３２ｇ、GRINDSTEDTMPan
odanA2020 ４ｇ、水４００Brabender Units＋４％を、Hobartミキサーを用い、
ロースピードで２分間、ハイスピードで９分間のフックで捏和した。生地の温度
は２６℃だった。生地を１３５０ｇ計量し、３０℃で１０分間寝かせて、次にFo
rtunaモールドに流し込んだ。３４℃、８５％ＲＨで４５分間プルーフした後、B
agoオーブンで２２０℃で１８分間焼成し、１２秒間蒸らした。 荒熱をとった後、ロールパンを計量し、パンの容積をrape seed deplacement
法により測定した。 比容積＝ パンの容積（ｍｌ）／パンの重さ（ｇ）
【０１７２】 （粘度測定） 粘度測定は、プロトコール２に従って行った。 表１４から明らかなように、新規のキシラナーゼ変異体（ＸＭ１）を添加する
と、ＢＸを添加したときに比べ、パン嵩が顕著に増した。表１４には、２種類の
キシラナーゼ（ＢＸ及びＸＭ１）の分量を様々に変えて添加したときのパン嵩増
量分（ｍｌ／ｇ）及び粘度（ｇ×ｓ）が示されている。また、表１４のデータは
、図２５、２６、及び２７に示されている。
【０１７３】
【表１４】
【０１７４】 実施例４（ＸＭ１、R▲o▼hm Veron specialキシラナーゼ、及びR▲o▼hm Veron
Specialキシラナーゼの精製物と生地の粘度との関係） 新規キシラナーゼのＸＭ１添加により、R▲o▼hm's Veron Specialキシラナー
ゼ（さらに該キシラナーゼを精製したもの）を添加したときよりも、生地の粘度
が増減するか否かを調べるために生地を調製し、キシラナーゼの作用結果として
の粘度を測定した。 （小麦粉） デンマーク産小麦粉、バッチ番号９８０２２を使用した。 （生地の調製） 生地は、プロトコール２に従って調製した。生地を混合し、粘度測定を行う前
に密封容器において、それぞれ１０分間及び４５分間寝かせた。 （粘度測定） 粘度測定は、プロトコール２に従って行った。 （酵素） ９８０９０３（ＸＭ１）：大腸菌において発現されるBacillus sub.野生型の精
製変異体（１３７５ＴＸＵ／ｍｌ） ＃２１９９：R▲o▼hm Veron Specialキシラナーゼ（１０５００ＴＸＵ／ｇ） ９８０６０３（R▲o▼hm）：Frimond's Belaseキシラナーゼ（R▲o▼hm'sと同じ
）の精製調製物（１０５０ＴＸＵ／ｍｌ） 粘度測定を行うために以下の生地を作製した（表１５）。
【０１７５】
【表１５】
【０１７６】 表１５に示される生地を用いて、表１６の粘度測定結果が得られた。表１６に
は、精製R▲o▼hmキシラナーゼ、コントロール、ＸＭ１、及びR▲o▼hm's Veron
Specialキシラナーゼを使用して調製した生地の粘度測定結果が示されている。
上記データは、図２８、２９、及び３０に示されている。 ＸＭ１を使用したときの粘度増加量は、精製R▲o▼hmキシラナーゼを使用した
ときの粘度増加量より少なかった。未精製のR▲o▼hmキシラナーゼを使用したと
きの粘度増加量は、それと比べかなり多かった。
【０１７７】
【表１６】
【０１７８】 実施例５（細菌性エンド−β−１，４−グルカナーゼと生地の粘度との関係） 以下の結果は、細菌性エンド−β−１，４−グルカナーゼが粘度に与える影響
を調べるために行った実験から得られたものである。 （酵素） ９８１１０２−１（Xyl）：Veron Special製品のR▲o▼hm細菌性キシラナーゼの
精製調製物に相当する。かかる調製物は精製キシラナーゼであり、エンド−β−
１，４−グルカナーゼを全く含まない（３５０ＴＸＵ／ｍｌ）。 ９８１１０２−２（Xyl＋Gluc）：Veron Special製品のR▲o▼hm細菌性キシラナ
ーゼの精製調製物に相当し、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（９００ＴＸＵ
／ｍｌ＋１９ＢＧＵ／ｍｌ）を含む。
【０１７９】 （キシラナーゼアッセイ） プロトコール１に従ってキシラナーゼアッセイを行った。 （グルカナーゼアッセイ） プロトコール４に従ってグルカナーゼアッセイを行った。 （小麦粉） デンマーク産小麦粉バッチ番号９８０５８を使用した。４００ＢＵにおける水
分吸収率は６０％だった。 （生地の調製） 生地はプロトコール２に従って調製した。生地を混合した後、密封容器にて３
０℃でそれぞれ１０分間及び４５分間寝かせた。 （粘度測定） 粘度測定はプロトコール２に従って行った。表１７に示した生地を作製し、粘
度測定を行った。
【０１８０】
【表１７】
【０１８１】 表１７に示した生地により、表１８に示される粘度測定の結果が得られた。表
１８には、キシラナーゼを添加した生地、並びにキシラナーゼ及びグルカナーゼ
を添加した生地の粘度測定の結果が示され、表１８中の生地番号は、表１７の生
地番号に対応している。表１８中、Stik#１０は、生地を１０分寝かせた後に粘
度測定を行った結果を、Stik#４５は、４５分寝かせた後に粘度測定を行った結
果をそれぞれ示す。表１８から明らかなように、生地にエンド−β−１，４−グ
ルカナーゼを添加すると、生地の粘度は増す。表１８に示した結果を図３１に図
示した。
【０１８２】
【表１８】
【０１８３】 要約すると本発明は、実施例に示しながら、以下のものを提供するものである
。 ａ．小麦粉から内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤を単離するこ
と。 ｂ．小麦粉から単離した内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤の特
徴化を行うこと。 ｃ．種類の異なるキシラナーゼ類に対し内因性エンド−β−１，４−キシラナ
ーゼ阻害剤が及ぼす効果の特徴化。 ｄ．内因性エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受
けないキシラナーゼ類の選択方法。 ｅ．エンド−β−１，４−キシラナーゼ阻害剤によって有害な影響を受けない
キシラナーゼ類の選択方法。 ｆ．真菌性キシラナーゼ類を含む生地に比べ、好ましい嵩と程良い粘度を備え
た生地を提供するキシラナーゼ類。 ｇ．キシラナーゼ類のスクリーニング方法及び／又は内因性エンド−β−１，
４−キシラナーゼ阻害剤を用いて該キシラナーゼを変異させる方法、並びに該キ
シラナーゼ類又は変異体を生地製造に用いる方法。 ｈ．本発明のキシラナーゼ類を用いて調製した食品。
【０１８４】 本明細書において引用した全ての刊行物は、参考として引用した。当該技術の
専門家であれば、本発明の範囲及びその精神から逸脱することなく、本発明にお
いて説明した方法及びシステムに様々な修正及び変更を加えることが可能である
のは明白である。特に好ましい実施例を用いて本発明の説明を行ったが、ここに
クレームした発明は、これらの実施例に限定されるべきではない。実際、ここに
述べた本発明の実施形態に対し、生化学及びバイオテクノロジー又はその関連分
野の専門家が充分考慮し得る種々の変更は、本発明のクレームの範囲内でなけれ
ばならない。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 キシラナーゼの種類、添加量、及び寝かせた時間と粘度の関係を示す図である
。
【図２】 キシラナーゼの種類、添加量、及び寝かせた時間と粘度の関係を示す図である
。
【図３】 ７５ｍｌの阻害剤抽出試料をゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結果を示す
図である。カラム：５００ｍｌSuperdex G-25 F、フロー：１０ｍｌ／分、画分
サイズ：３０ｍｌ
【図４】 ゲル濾過にかけた２４０ｍｌの阻害剤抽出試料を陽イオン交換クロマトグラフ
ィーにかけた結果を示す図である。カラム：５０ｍｌSepharose SP、フロー：５
．０ｍｌ／分、画分サイズ１０ｍｌ
【図５】 １４７ｍｌのイオン交換阻害剤抽出試料に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を加え１．０Ｍ
にしたものをＨＩＣクロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。カラム：
１０ｍｌPhenyl ＨＩＣ、フロー：２．０ｍｌ／分、画分サイズ：２．５ｍｌ
【図６】 ２ｍｌの濃縮阻害剤試料を分取ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結果を示
す図である。阻害剤は１７６ｍｌで溶離した。カラム：３３０ｍｌ Superdex 75
PG （Pharmacia社製)、溶離液：５０ｍＭのＮａＯＡｃ、２００ｍＭのＮａＣｌ
、ｐＨ５．０。フロー：１ｍｌ／分、画分サイズ：５．５ｍｌ
【図７】 純粋キシラナーゼ＋煮沸阻害剤抽出物の陽イオン交換クロマトグラムを示す図
である。試料：１ｍｌの脱塩９８０６０１＋煮沸阻害剤抽出物。カラム：１ｍｌ
Source S 15、緩衝液系：Ａ：５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５、Ｂ：Ａ＋１
Ｍ ＮａＣｌ。フロー：２ｍｌ／分
【図８】 阻害剤抽出物共存下での３時間にわたるインキュベーション後の純粋キシラナ
ーゼの陽イオン交換クロマトグラムを示す図である。試料：１ｍｌの脱塩９８０
６０１＋阻害剤。カラム：１ｍｌ Source S15、緩衝液系：Ａ：５０ｍＭ ＮａＯ
Ａｃ、ｐＨ４．５、Ｂ：Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ。フロー：２ｍｌ／分
【図９】 １００μｌの濃縮阻害剤試料を分析用ゲル濾過クロマトグラフィーにかけた結
果を示す図である。阻害剤は１０．８１ｍｌで溶離した。カラム：２４ｍｌ Sup
erdex 75 10/30（Pharmacia社製、スウェーデン）、溶離液：５０ｍＭ ＮａＯＡ
ｃ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、フロー：０．５ｍｌ／分、画分サイズ
：２．０ｍｌ
【図１０】 Superdex 75 10/30でランにかけて標準タンパク質のＫａｖとＬｏｇ（ＭＷ）
との関係を調べた結果を示す図である。
【図１１】 分取ゲル濾過により得られた画分３１、３２及び３３のＳＤＳ ＰＡＧＥの結
果を示す図である。１列目及び３列目は、ＭＷマーカーである（Pharmacia's LM
W markers,スウェーデン）。２列目及び４列目は、それぞれ１０μｌ及び２５μ
ｌを投入した画分３２である。６列目及び８列目は、それぞれ１０μｌ及び２５
μｌを投入した画分３１である。７列目及び９列目は、それぞれ１０μｌ及び２
５μｌを投入した画分３３である。
【図１２】 ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分３３の逆相クロマトグラムを示す
図である。クロマトグラムでは４つのピークが明確に示されている。ピーク３は
キシラナーゼ阻害剤である。ピーク４、５、及び６の配列決定を行ったところ、
小麦タンパク質であるSerpinと高度な相同性を示した。
【図１３】 逆相クロマトグラフィーで得られた画分３のＭＳの結果を示す図である。分光
分析から、分子量３９５０３Ｄａの分子が一個見いだされた。
【図１４】 画分３３を逆相クロマトグラムにかけて得られたカルボキシメチル化された画
分３（図１２参照）を逆相クロマトグラフィーにかけた結果を示す図である。か
かるクロマトグラムでは、ジ−ペプチドを示唆する２個の明確なピークが明らか
になった。
【図１５】 カルボキシメチル化逆相クロマトグラフィー（図１４参照）で得られた画分２
をＭＳにかけた結果を示す図である。分光分析から分子量１２１０４Ｄａのペプ
チドが明らかになった。
【図１６】 カルボキシメチル化逆相クロマトグラフィー（図１４参照）で得られた画分３
をＭＳにかけた結果を示す図である。分光分析から分子量２８２２２Ｄａのペプ
チドが明らかになった。
【図１７】 分取ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた画分３３及び３４をＩＥＦにかけ
た結果を示す図である。２列目はｐｌ３〜１０標準、３列目はｐｌ２．５〜６．
５標準、４列目及び５列目はそれぞれ画分３３及び画分３４、６列目はトリシン
阻害剤（ｐｌ４．５５）、７列目はβ−ラクトグロブリン（ｐｌ５．２０）、ま
た８列目及び９列目はそれぞれ画分３３及び３４である。矢印は、認められた画
分３３のバンドを示す。
【図１８】 キシラナーゼ阻害剤のクロマトフォーカシングクロマトグラフィーから明らか
になった、ｐＨ及び相対的ＯＤ（阻害剤アッセイより）と画分との関係を示す図
である。図からわかるように画分７においてＯＤが相対的に減少しているが、こ
れは阻害剤活性によるものである。このときのｐＨは９．４である。
【図１９】 キシラナーゼ４種類の残存活性％と、阻害剤濃度との関係を示す図である。用
いたキシラナーゼ４種は、◆＝Ｘ１、■＝Ｘ３、×＝ＢＸ、▲＝Novoである。
【図２０】 小麦粉抽出物共存下でのインキュベーション後における９８０６０１（coli-1
）、９８０６０３（Belase）、及び９８０６０１の変異体３種（ＸＭ１、ＸＭ２
、及びＸＭ３）の残存活性を示す図である。
【図２１】 キシラナーゼ（９８０６０１）＋／−阻害剤のラインウィーバー・バークプロ
ット（二重逆数プロット）を示す図である。基質濃度は％アゾキシランである。
Ｖは、アッセイにおける相対的ＯＤ５９０である（１００がＳ＝２％のとき）。
【図２２】 種々のキシラナーゼのＫ1値をμｌ阻害剤として示した図である。
【図２３】 ３種類のキシラナーゼ（９８０６０１＝Bac. Sub. wt、９８０８０１＝Ｘ１、
及び９８０９０１＝Thermomyces）の阻害とｐＨとの関係を示す図である。関連
のブランクを基質にしてデータを得た。
【図２４】 ３種類のキシラナーゼ（９８０６０１＝ＢＸ、９８０８０１＝Ｘ１、及び９８
０９０１＝Novo）の最適ｐＨ条件を示す図である。
【図２５】 比容積＝ｆ（キシラナーゼ×添加量）を示す図である。
【図２６】 比容積増加量＝ｆ（キシラナーゼ×添加量）を示す図である。
【図２７】 粘度＝ｆ（キシラナーゼ×添加量）を示す図である。
【図２８】 １０分間（#１０）及び４５分間（#４５）寝かせた後で測定した粘度と種々の
キシラナーゼ調製物及びコントロールとの関係を示す図である。９８０６０３は
精製したR▲o▼hmキシラナーゼを、ＸＭ１はキシラナーゼ変異体１を、また＃２
１９９はR▲o▼hm's Veron Special productを示している。
【図２９】 １０分間（#１０）及び４５分間（#４５）寝かせた後の、粘度の増加と３種類
のキシラナーゼ調製物の関係を示す図である。９８０６０３は精製したR▲o▼hm
キシラナーゼを、ＸＭ１はキシラナーゼ変異体１を、また＃２１９９はR▲o▼hm
's Veron Special productを示している。
【図３０】 １０分間（#１０）及び４５分間（#４５）寝かせた後の、粘度の増加と２種類
のキシラナーゼ調製物の関係を示す図である。ＸＭ１はキシラナーゼ変異体１を
、また＃２１９９はR▲o▼hm's Veron Special productを示している。
【図３１】 粘度の増加とエンド−β−１，４−グルカナーゼ添加との関係を示す図である
。１：キシラナーゼ無添加のコントロール生地、２：７５００ＴＸＵ純粋R▲o▼
hmキシラナーゼ／ｋｇ小麦粉、３：７５００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキシラナーゼ／
ｋｇ小麦粉＋１５８ＢＧＵ／ｋｇ小麦粉、４：１５０００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキ
シラナーゼ／ｋｇ小麦粉、５：１５０００ＴＸＵ純粋R▲o▼hmキシラナーゼ／ｋ
ｇ小麦粉＋３１６ＢＧＵ／ｋｇ小麦粉を示している。１０分（Stik#１０）及び
４５分（Stick#４５）後に生地の測定を行った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｂ０６５ 1/21 9/42 ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9/42 Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/34 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ９９０８６４５．６ (32)優先日 平成11年４月15日(1999．4．15) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 HA14 4B032 DB01 DK51 4B050 CC01 DD02 LL02 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR15 4B064 AG21 CA19 CC24 4B065 AA01X AA57X AA87X AA88Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA41 4H045 AA10 AA20 BA10 CA30 DA55 EA01 FA72 FA74 HA05 HA18 HA19

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号７、配列番号９、若しくは配列番号１１に示される
    アミノ酸配列、又はそれらの変異体、相同物、若しくは断片のいずれかを含むア
    ミノ酸配列。
  2. 【請求項２】 請求項１記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
    。
  3. 【請求項３】 以下から選択されるヌクレオチド配列。 （ａ）配列番号８、配列番号１０、若しくは配列番号１２として示されるヌクレ
    オチド配列、又はそれらの変異体、相同物、若しくは断片のいずれかを含むヌク
    レオチド配列； （ｂ）配列番号８、配列番号１０、若しくは配列番号１２として示されるヌクレ
    オチド配列、又はそれらの相補配列； （ｃ）配列番号８、配列番号１０、若しくは配列番号１２として示されるヌクレ
    オチド配列又はそれらの断片のいずれかとのハイブリダイズすることができるヌ
    クレオチド配列； （ｄ）配列番号８、配列番号１０、若しくは配列番号１２として示されるヌクレ
    オチド配列、又はそれらの断片のいずれかの相補配列とハイブリダイズすること
    ができるヌクレオチド配列；及び （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）に示されたヌクレオチドに対する遺
    伝的コードの結果として縮重するヌクレオチド配列
  4. 【請求項４】 プロモーターにオペラブル(operable)に結合した請求項２又
    は３記載のヌクレオチド配列。
  5. 【請求項５】 請求項２〜４のいずれか記載のヌクレオチド配列を含むベク
    ター。
  6. 【請求項６】 請求項２〜５のいずれか記載のヌクレオチド配列を含む形質
    転換宿主細胞。
  7. 【請求項７】 請求項２〜５のいずれか記載のヌクレオチド配列を含み、該
    ヌクレオチド配列が細胞のゲノムと異種である宿主細胞。
  8. 【請求項８】 請求項２〜４のいずれか記載の適正なヌクレオチド配列を発
    現させることを含む請求項１記載のアミノ酸の調製方法。
  9. 【請求項９】 配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１として示され
    るアミノ酸配列、又はそれらの変異体、派生物、若しくは相同物のいずれかを用
    いる、食品、好ましくは焼き製品、若しくは焼き製品製造用原料（例、生地）の
    調製方法。
  10. 【請求項１０】 配列番号５として示されるアミノ酸配列、又はその変異体
    、派生物、若しくは相同物のいずれかを用いる、食品又はその製造用原料（例、
    生地）の調製方法。
  11. 【請求項１１】 配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１に示される
    アミノ酸配列、又はそれらの変異体、派生物、若しくは相同物のいずれかを含む
    、或いはいずれかを用いて調製される、焼き製品又はその製造用原料（例、生地
    ）等の食品。
  12. 【請求項１２】 配列番号５として示されるアミノ酸配列、又はその変異体
    、派生物、若しくは相同物のいずれかを含む、或いはいずれかを用いて調製され
    る焼き製品又はその製造用原料（例、生地）。
  13. 【請求項１３】 配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９若しく
    は配列番号１１として示されるアミノ酸配列、又はそれらの変異体、派生物、若
    しくは相同物のいずれかを含むアミノ酸配列を用いる、真菌性キシラナーゼを含
    む生地との比較において低粘度の生地の調製方法。
  14. 【請求項１４】 バチラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来のキシ
    ラナーゼ又はその変異体で、非粘着性生地の調製に適したキシラナーゼ。
  15. 【請求項１５】 非粘着性生地の調製に適したキシラナーゼの産出能を有す
    るバチラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）株。
  16. 【請求項１６】 菌株が、１６８株である請求項１５記載のバチラス・ズブ
    チリス（Bacillus subtilis）。
  17. 【請求項１７】 バチラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）株由来の非
    粘着性生地の調製に適したキシラナーゼ。
  18. 【請求項１８】 バチラス・ズブチリス（Bacillus subtilis）株が、１６
    ８株である請求項１７記載のキシラナーゼ。
  19. 【請求項１９】 グルカナーゼ酵素（類）を実質的に含まないキシラナーゼ
    の調製方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１〜１９のいずれか記載の発明により調製された焼
    き製品。
  21. 【請求項２１】 小麦粉から得られるエンド−β−１，４−キシラナーゼ阻
    害剤。
  22. 【請求項２２】 分子量が約４０ｋＤａ（ＭＳ又はＳＤＳ ＰＡＧＥで測定
    ）である請求項２１記載の阻害剤。
  23. 【請求項２３】 約８〜約９．５のｐｌを有する請求項２１又は２２記載の
    阻害剤。
  24. 【請求項２４】 配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１
    ６、配列番号１７、配列番号１８、及び／若しくは配列番号１９として示される
    アミノ酸配列、又はそれらの変異体、相同物、若しくは断片の１又は２以上を含
    む請求項２１〜２３のいずれか記載の阻害剤。
  25. 【請求項２５】 請求項２１〜２４のいずれか記載の単離された形態の阻害
    剤。
  26. 【請求項２６】 キシラナーゼ阻害剤に対するキシラナーゼの耐性の程度を
    測定する方法であって、 （ａ）目的のキシラナーゼを、請求項２１〜２５のいずれか記載の阻害剤に接触
    せしめ、また （ｂ）該阻害剤が、目的のキシラナーゼの活性を阻害する（もし阻害するのであ
    れば）程度を測定する ことを含む方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２６記載の方法により同定され、阻害剤に対し高度
    の耐性を有するキシラナーゼ。
  28. 【請求項２８】 請求項２７記載のキシラナーゼを含み、好ましくは焼き製
    品である食品。
  29. 【請求項２９】 （ａ）請求項２６記載の方法を実施し、 （ｂ）阻害剤に対し高度（又は中程度、若しくは低度）の耐性を有する１又は２
    以上のキシラナーゼを同定し、 （ｃ）上記１又は２以上の同定したキシラナーゼ類の一定量を調製する ステップを含むプロセス。
  30. 【請求項３０】 以下のステップを含む方法。 （ａ）請求項２６記載の方法を実施し、 （ｂ）阻害剤に対し高度（又は中程度、若しくは低度）の耐性を有する１又は２
    以上のキシラナーゼを同定し、また （ｃ）上記１又は２以上の同定したキシラナーゼ類を含む生地を調製する
  31. 【請求項３１】 焼き食品の調製に用いるのに適した細菌性キシラナーゼ又
    はその変異体を同定する方法であって、 （ａ）目的の細菌性キシラナーゼを生地混合物に取り込み、また できあがった生地の粘度が、真菌性キシラナーゼを含む同様な生地の粘度より低
    いとき、該細菌性キシラナーゼ又はその変異体は、焼き食品調製への使用に適し
    ていることになるので、 （ｂ）できあがった生地混合物の粘度を測定する ことを含む方法。
  32. 【請求項３２】 請求項３１記載の方法により同定された適した細菌性キシ
    ラナーゼ又はその変異体を含み、好ましくは焼き製品である食品。
  33. 【請求項３３】 以下のステップを含む方法。 （ａ）請求項３１の方法を実施し、 （ｂ）焼き食品の調製に用いるのに適した１又は２以上のキシラナーゼ類を同定
    し、 （ｃ）上記１又は２以上の同定したキシラナーゼ類の定量を調製する
  34. 【請求項３４】 以下のステップを含む方法。 （ａ）請求項３１の方法を実施し、 （ｂ）焼き食品の調製に用いるのに適した１又は２以上のキシラナーゼ類を同定
    し、また （ｃ）上記１又は２以上の同定したキシラナーゼ類を含む生地を調製する
  35. 【請求項３５】 請求項３１記載の方法により非粘着性生地の調製に適して
    いると同定され得る細菌性キシラナーゼ又はその変異体を使用する方法。
  36. 【請求項３６】 キシラナーゼ組成物、キシラナーゼの調製を行う培地、又
    はキシラナーゼが添加される培地が、焼き食品調製への使用に適しているかを同
    定する方法であって、 （ａ）目的のキシラナーゼを含む組成物、該キシラナーゼが調製される培地、又
    は該キシラナーゼが添加される培地を供給し、また 組成物又は培地における活性グルカナーゼ酵素（類）の存在が最低レベルである
    とき、かかる組成物又は培地は、焼き食品の調製に適していることになるので、 （ｂ）該組成物又は該培地における活性グルカナーゼ酵素（類）の存在を測定す
    る ことを含む方法。
  37. 【請求項３７】 請求項３６記載の方法により同定された適した組成物又は
    培地を含む、好ましくは焼き製品である食品。
  38. 【請求項３８】 以下のステップを含む方法。 （ａ）請求項３６記載の方法を実施し、 （ｂ）焼き食品の調製への使用に適した１又は２以上の組成物又は培地を同定し
    、 （ｃ）上記１又は２以上の同定された組成物又は培地の一定量を調製する
  39. 【請求項３９】 以下のステップを含む方法。 （ａ）請求項３６記載の方法を実施し、 （ｂ）焼き食品の調製への使用に適した１又は２以上の組成物又は培地を同定し
    、また （ｃ）上記１又は２以上の同定された組成物又は培地を含む生地を調製する
  40. 【請求項４０】 請求項３６記載の方法により非粘着性生地の調製に適して
    いると同定され得る組成物又は培地の使用方法。
  41. 【請求項４１】 以下のステップを含む方法。 （ａ）小麦粉自体における、又は小麦粉含有培地に存在する小麦粉における、請
    求項２１〜２４のいずれか記載の阻害剤の含有量を測定し、 （ｂ）小麦粉に添加するのに適したキシラナーゼを選択し、及び／又は小麦粉に
    添加するキシラナーゼの適量を選択し、また （ｃ）適したキシラナーゼ及び／又はキシラナーゼの適量を小麦粉に添加する
  42. 【請求項４２】 請求項２６記載の方法からなる第１ステップと、請求項３
    １記載の方法からなる第２ステップを含む組合せ方法。
  43. 【請求項４３】 請求項２６記載の方法からなる第１ステップ、請求項３１
    記載の方法からなる第２ステップ、請求項３６記載の方法からなる第３ステップ
    、及び請求項４１記載の方法からなる第４ステップのいずれかのステップを２又
    は３以上含む組合せ方法。
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