EA008607B1 - Полинуклеотид, кодирующий фосфолипазу aspergillus niger, фосфолипаза aspergillus niger и способы получения и применения полинуклеотида и фосфолипазы - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к новой идентифицированной полинуклеотидной последовательности, включающей ген, который кодирует новую фосфолипазу, выделенную из Aspergillus niger. Настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности нового гена полной длины, последовательности кДНК, включающей полную длину кодирующей последовательности для новой фосфолипазы, а также к аминокислотной последовательности функционального белка полной длины и ее функциональных эквивалентов. Изобретение также относится к способам применения ферментов в промышленных процессах и к способам диагностики грибных инфекций. В настоящее изобретение также включаются клетки, трансформированные полинуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, и клетки, в которых фосфолипаза по настоящему изобретению была генетически модифицирована с целью повышения или снижения ее активности и/или уровня экспрессии.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым идентифицированным полинуклеотидным последовательностям, включающим гены, которые кодируют новую фосфолипазу, выделенную из АзрегдШиз шдег. В изобретении описаны нуклеотидная последовательность новых генов полной длины, последовательность кДНК, включающая полную длину кодирующей последовательности для новой фосфолипазы, а также аминокислотная последовательность функционального белка полной длины и его функциональных эквивалентов. Изобретение также относится к способам применения указанных ферментов в промышленных процессах и к способам диагностики грибковых инфекций. В изобретение также включены клетки, трансформированные полинуклеотидом по настоящему изобретению, и клетки, в которых фосфолипаза по настоящему изобретению генетически модифицирована для усиления или снижения ее активности и/или уровня экспрессии.

Предпосылки создания изобретения

Фосфолипиды состоят из глицеринового скелета с двумя этерифицированными жирными кислотами во внешнем (зп-1) и внутреннем (зп-2) положениях, тогда как третья гидроксильная группа глицерина этерифицирована фосфорной кислотой. Фосфорная кислота может быть, в свою очередь, этерифицирована, например, аминоспиртом типа этаноламина (фосфатидилэтаноламина), холина (фосфатидилхолина). Третья гидроксильная группа может быть также, вместо этерификации фосфорной кислотой, связана с сахарными остатками, такими как галактоза или ее димер, такой как дигалактозилдиглицерид.

Фосфолипазы определяются в настоящем изобретении как ферменты, которые участвуют в гидролизе одной или более связей в фосфолипидах, включая указанный выше дигалактозилдиглицерид.

Может быть выделено несколько типов фосфолипазной активности, которые приводят к гидролизу эфирной(ых) связи(ей), которая(ые) соединяет(ют) фрагменты жирного ацила с глицероловым скелетом.

Фосфолипаза А₁ (ЕС 3.1.1.32) и А₂ (ЕС 3.1.1.4) катализируют деацилирование одной жирной ацильной группы в положениях зп-1 и 5п-2. соответственно, в диацилглицерофосфолипиде с образованием лизофосфолипида.

Лизофосфолипаза (ЕС 3.1.1.5, также называемая фосфолипазой В в соответствии с номенклатурой Комитета Международного Союза по биохимии и молекулярной биологии (Ишоп οί Вюсйет1зйу апб Мо1еси1аг Вю1о§у; Епхуте Мотепс1а1иге, Асабешю Ргезз, Ыете Уогк, 1992)) катализирует гидролиз оставшейся жирно-ацильной группы в лизофосфолипиде. Фосфолипаза В была открыта в РешсШшш по1а1пт (8айо е! а1., 1991, МеШобз ίη Епхуто1оду 197: 446-456), которая катализирует деацилирование обеих жирных кислот в диацилглицерофосфолипиде и по своей природе обладает лизофосфолипазной активностью.

Галактолипаза (ЕС 3.1.4.3) катализирует гидролиз одной или обеих жирно-ацильных групп в положениях зп-1 и зп-2, соответственно, в дигалактозилдиглицериде.

Фосфолипаза С (ЕС 3.1.4.3) гидролизует сложноэфирную фосфатную связь между глицериновым скелетом и фосфатной группой, например:

фосфатадилхолин + Н₂О = 1,2-диацилглицерин + холинфосфат.

Фосфолипаза Ό (ЕС 3.1.4.4) гидролизует сложноэфирную фосфатную связь между фосфатной группой и аминоспиртом, например:

фосфатидилхолин + Н2О = холин + фосфатидная кислота.

Фосфолипазы могут быть получены с использованием микроорганизмов. Микробные фосфолипазы доступны из множества источников; виды ВасШпз представляют собой основной источник бактериальных ферментов, тогда как грибные ферменты обычно получают из клеток видов АзретдШиз.

Грибные ферменты с фосфолипазной активностью были описаны в различных источниках, включая Сгур1ососси5 пеоГогтапз (Сйеп е! а1., 1997, 1пГес!юп апб йппшпйу 6: 405-411); Еи8оЬас1егшт песгорйошт (ЕШз е! а1., 1996, УеЮгшагу МютоЬю1о§у 49: 219-233), РешсШшш по1аШт (также известный как РешсШшш сйтузодепит; Катазакц 1975, 1оитпа1 оГ Вюсйет1з!гу 77: 1233-1244; Мазиба е! а1., 1991, Еигореап 1оитпа1 оГ Вюсйепиз1гу 202: 783-787), РешаШит сус1оршт (Мпз1гап1а е! а1., 1995, Ргосезз Вюсйет1з!ту 30: 393401), 8ассйаготусез сетеу131ае (1сШтаза е! а1., 1985, Адпс. Вю1. Сйет. 49: 1083-1089; РаиЙаиГ е! а1., 1994, ί. Вю1. Сйет. 269: 19725-19730), То1игазрога бе1Ьтиески (старое название 8ассйаготусез гозе1, Ки^аЬага, 1988, Адпс. Вю1. СНет. 52: 2451-2458; \Уа1апаЬе е! а1., 1994, ЕЕМ8 М1сгоЫо1ощса1 Ье!!егз 124: 29-34), Иеигозрога сгазза (Сйактауатй е! а1., 1981, АтсШуез оГ Вюсйепиз1гу апб Вюрйузкз 206: 393-402), АзретдШиз шдет (Тесйшса1 Ви11е!ш, С-хуте'™ С6999, Епхуте Вю8уз1етз Ь!б.; Миз!тап!а е! а1., 1995, зирга), Согбсшт сеп1пГищ.пп (Иейата е! а1., 1979, Адпс. Вю1. СНет. 43: 517-525), Ризалит охузрогит (ГУО 98/26057) и Ризалит зо1аш (Тзипд-Сйе е! а1., 1968, Рйу!ораШо1о§1са1 Ио!ез 58: 1437-38).

Фосфолипазные гены грибов были клонированы из нескольких источников, включая РсшсШиш по1аШт (Мазиба е! а1., 1991, зирга), Тоги1азрога бе1Ьгиески (\Уа1апаЬе е! а1., 1994, ЕЕМ8 МютоЬю1о§у Ьейетз 124: 29-34), 8ассйаготусез сетеу1з1ае (Ьее е! а1., 1994, 1оитпа1 оГ Вю1одка1 Сйет1з!гу 269: 19725-19730), АзретдШиз (6Р 10155493), Ыеигозроза сгазза (ЕМВЬ 042791) и 8с1пхозассйаготусез ротЬе (ЕМВЬ 013857).

Фосфолипазы могут использоваться во множестве промышленных процессов, включая модификацию фосфолипидных эмульгаторов. Примером фосфолипидного эмульгатора является лецитин, который представляет смесь полярных и нейтральных липидов, где содержание полярных липидов составляет по

- 1 008607 меньшей мере 60%. Фосфолипидные эмульгаторы применяются во многих отраслях пищевой и непищевой промышленности, в частности яичный лецитин используется как эмульгатор, например, в молочных продуктах, в особенности в майонезе, заправках, мучных кондитерских изделиях и т.п., соевый лецитин используется, например, в качестве эмульгатора в (низкокалорийных) соусах, хлебе, маргарине, косметических продуктах и т.п., тогда как другие лецитины используются, например, в шоколаде, в корме для выпаивания телят. Модификация фосфолипидных эмульгаторов фосфолипазами может привести к повышению степени эмульгирования смеси масло/вода. Модификация фосфолипидных эмульгаторов фосфолипазами может повысить стабильность эмульсий, образуемых при добавлении модифицированных фосфолипидных эмульгаторов, включая стабильность в более широком диапазоне рН или при других значениях рН и/или в более широком диапазоне температур. Модификация фосфолипидных эмульгаторов фосфолипазами может повысить стабильность эмульсий, образуемых при добавлении модифицированных фосфолипидных эмульгаторов, в присутствии ионов Са²⁺ или Мд²'.

Другой пример промышленного применения фосфолипаз связан с тем, что они могут использоваться для дегумирования растительных масел при обработке таких масел. В типичном процессе дегумирования лецитины удаляют из растительных масел, например соевых масел, рапсовых масел (масла канолы), льняных масел, подсолнечных масел, с целью повышения, в числе других показателей, стабильности растительного масла, путем промывки масляной фазы водой, где смешивание воды и масла в условиях высокого сдвигающего усилия выталкивает лецитины в водную фазу, которую впоследствии удаляют с помощью сепаратора. В образованной так называемой фазе водного дегумирования удаляются только быстро гидратируемые фосфолипиды, например фосфатидилхолин, фосфатидилинозит и фосфатидилэтаноламин. Негидратируемые фосфолипиды/фосфатиды, прежде всего фосфолипиды, которые содержат до 50% магниевых и/или кальциевых солей, не поддаются легкому удалению на стадии водного дегумирования. Воздействие на негидратируемые фосфолипиды/фосфатиды фосфолипазой А₂ делает указанные фосфолипиды более растворимыми в воде и, в этой связи, легче экстрагируемыми на стадии водного дегумирования. Другой пример промышленного применения фосфолипаз относится к тому, что их используют для удаления осадка, который образуется при осахаривании (с использованием α-амилазы и глюкоамилазы) пшеничной клейковины или пшеничного крахмала для получения глюкозных сиропов. Удаление осадка существенно ускоряет последующее фильтрование полученных глюкозных сиропов.

Указанные выше направления промышленного применения фермента фосфолипазы охватывают лишь несколько примеров, и указанный перечень не является ограничивающим.

Еще один пример промышленного применения фосфолипаз в производстве пищевых продуктов заключается в том, что фосфолипазы используют, в частности, в хлебопечении для повышения качества теста или хлебобулочных продуктов. Пшеничная мука содержит примерно 2,2-2,9% липидов. Липиды муки можно классифицировать на липиды крахмала (0,8-0,9%) и некрахмальные липиды (1,4-2,0%). В то время как крахмальные липиды состоят, в основном, из полярных лизофосфолипидов, некрахмальные липиды состоят примерно на 40% из нейтральных триглицеридов и на 40% из полярных фосфо- и гликолипидов. Для оптимизации состава липидной фракции муки возможно использовать гидролиз фосфолипидов в тесте ίη зйи путем добавления фосфолипазы А.

Например, в документах ЕР-А-109244 и \УО 98/26057 описывается использование фосфолипазы А в хлебопечении. В патенте Чехословакии АО 190264 используют фосфатидную кислоту (продукт гидролиза фосфолипазы Ό) в качестве средства, улучшающего тесто и качество хлеба. В соответствии с ЕР-А075463 вносят сочетание фосфолипазы А и фосфолипазы Ό с получением лизофосфатидной кислоты как средства для кондиционирования теста.

В XV О 00/32758 описывается получение вариантов липолитического фермента путем внесения изменений в аминокислотную последовательность липолитического фермента с целью повышения уровня желательной активности. Было показано, в контексте применения в хлебопечении, что особенно полезным является вариант липолитического фермента, выделенный из представителей семейства Нит1си1а или семейства 2удотусе1ез, поскольку он, по всей видимости, обладает фосфолипазной и/или дигалактозилдиглицеридной активностью. В ХУО 98/45453 описывается полипептид, обладающий липазной активностью, полученный из АзрегдШиз 1иЬ1депз1з, который также демонстрирует высокую гидролитическую активность в отношении дигалактозилдиглицерида. Однако указанные ферменты имеют недостаток, связанный с их относительно низкой удельной активностью.

В указанных выше процессах использование фосфолипаз имеет ряд преимуществ, которые связаны с тем, что они могут быть получены методами рекомбинантной ДНК. Такие полученные рекомбинантными методами ферменты обладают множеством преимуществ в сравнении с их традиционными очищенными вариантами. Рекомбинантные ферменты могут быть получены с низкой стоимостью, высоким выходом, без загрязняющих компонентов, таких как бактерии или вирусы, и, кроме того, они не содержат бактериальных токсинов или не проявляют активностей других загрязняющих ферментов.

Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одной, если не ко всем указанным выше проблемам.

Объект настоящего изобретения

Объектом настоящего изобретения также является получение новых полинуклеотидов, кодирую

- 2 008607 щих новые фосфолипазы с улучшенными свойствами. Еще одним объектом является получение природных и рекомбинантных фосфолипаз, а также продуцирующих их рекомбинантных штаммов. Часть настоящего изобретения относится также к полипептидам слияния, а также к способам получения и использования полинуклеотидов и полипептидов по настоящему изобретению. Более конкретно, объектом настоящего изобретения является получение фосфолипаз, обладающих также галактолипазной активностью.

Объектом настоящего изобретения является получение новых фосфолипаз, которые позволяют решить по меньшей мере одну из указанных выше проблем, или получение новых фосфолипаз, которые обладают одним или более улучшенными свойствами в случае их использования при изготовлении теста и/или хлебобулочных изделий, выбранными из группы свойств, таких как повышенная всхожесть теста, повышенная эластичность теста, повышенная стабильность теста, сниженная липкость теста, повышенная растяжимость теста, усиление показателей теста, способствующих его машинной обработке, повышенный объем полученных хлебобулочных изделий, улучшенная консистенция хлебного мякиша, повышенная мягкость хлебобулочного изделия, улучшенный вкус хлебобулочного изделия, повышенная устойчивость против черствения, улучшенная корка хлебобулочного изделия, или фосфолипаз с более широкой субстратной специфичностью.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к новым полинуклеотидам, кодирующим новые фосфолипазы. Более конкретно, изобретение относится к полинуклеотидам, имеющим нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется предпочтительно в условиях высокой строгости с последовательностью, которую выбирают из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14. Следовательно, настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые более чем на 40%, в частности примерно на 60%, предпочтительно на 65%, более предпочтительно на 70% и еще более предпочтительно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, гомологичны одной или более последовательностям, выбранным из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14.

В более предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к такому выделенному полинуклеотиду, получаемому из нитчатого гриба, в частности предпочтительно из АкрегдШик шдег.

В одном варианте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов.

В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере один функциональный домен полипептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов.

В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к гену фосфолипазы с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 1, 4, 7, 10 и 13. В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, предпочтительно кДНК, кодирующему(ей) фосфолипазу из АкрегдШик шдег, которая имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15 или вариантов или фрагментов этого полипептида. В предпочтительном варианте кДНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 2, 5, 8, 11 или 14 или их функциональных эквивалентов.

Еще в одном предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, включающему кодирующую последовательность для полипептидов по настоящему изобретению, которая предпочтительно относится к полинуклеотидным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 2, 5, 8, 11 и 14.

Настоящее изобретение относится к векторам, включающим полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению, и к праймерам, зондам и фрагментам, которые могут использоваться для амплификации или обнаружения ДНК по настоящему изобретению.

Еще в одном предпочтительном варианте изобретения предлагается вектор, в котором полинуклеотидная последовательность по настоящему изобретению функционально связана с регуляторными последовательностями, подходящими для экспрессии кодируемой аминокислотной последовательности в соответствующей хозяйской клетке, такой как АкрегдШик шдег или А. огухеа. Настоящее изобретение также относится к способам получения полинуклеотидов и векторов по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к полученным рекомбинантными методами хозяйским клеткам, которые содержат гетерологичные или гомологичные полинуклеотиды по настоящему изобретению.

В другом варианте настоящее изобретение относится к рекомбинантным хозяйским клеткам, в которых экспрессия фосфолипазы по настоящему изобретению существенно повышена или в которых повышена активность фосфолипазы.

В другом варианте настоящее изобретение относится к полученным рекомбинантными методами хозяйским клеткам, которые содержат гетерологичный или гомологичный полинуклеотид по настоящему изобретению, где указанная клетка способна продуцировать функциональную фосфолипазу по на

- 3 008607 стоящему изобретению, предпочтительно относится к клетке, способной к суперэкспрессии фосфолипазы по настоящему изобретению, например к штамму АкрегдШик, содержащему увеличенное количество копий гена или кДНК по настоящему изобретению.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения предлагается очищенный полипептид. Полипептиды по настоящему изобретению включают полипептиды, кодируемые полинуклеотидами по настоящему изобретению. Особенно предпочтительным является полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов.

Белки слияния, включающие полипептид по настоящему изобретению, также входят в область настоящего изобретения. Изобретение также относится к способам получения полипептидов по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к использованию фосфолипазы по настоящему изобретению в любом промышленном процессе, описанном в настоящей заявке.

Подробное описание изобретения

Полинуклеотиды

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим фосфолипазы, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функционально эквивалентных последовательностей. Последовательности пяти генов, кодирующих фосфолипазы ФЛП03, ФЛП06, ФЛП15, ФЛП26 и ФЛП34, соответственно, были определены путем секвенирования соответствующих геномных клонов, полученных из АкрегдШик шдег. Изобретение относится к полинуклеотидным последовательностям, включающим гены, кодирующие фосфолипазы ФЛП03, ФЛП06, ФЛП15, ФЛП26 и ФЛП34, соответственно, а также к полной последовательности их кДНК и их кодирующей последовательности. Соответственно, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14 или их функциональных эквивалентов.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, гибридизируемому в строгих условиях, предпочтительно в условиях высокой строгости, с полинуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность, выбранную их группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14 или их функциональных эквивалентов.

Преимущественно такие полинуклеотиды могут быть получены из нитчатых грибов, в частности из АкрегдШик шдег. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную их группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14.

Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере один функциональный домен полипептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов.

В контексте настоящего описания термины ген и рекомбинантный ген относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК и которые включают открытую рамку считывания, кодирующую белок, например фосфолипазу из АкрегдШик шдег. Ген может включать кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, интроны и регуляторные последовательности. Термин ген также относится к выделенной молекуле. Кроме того, термин ген относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, определенной в настоящем описании.

Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, такая как молекула нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14 или ее функциональных эквивалентов, может быть выделена с использованием стандартных методик молекулярной биологии, и в настоящем описании приведена информация о полученных последовательностях. Например, с использованием части последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, в качестве зонда для гибридизации, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть выделены с использованием стандартных методик гибридизации и клонирования (см., например, в руководстве Самбрука (8атЬгоок, 1., Егбкк Е.Г., апб Машабк, Т. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2пб еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬогаЮгу, ИУ, 1989)).

Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты, включающая всю или часть последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, может быть выделена посредством полимеразной цепьевой реакции (ПЦР) с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров, разработанных на основе информации о последовательности молекул из группы, включающей 8ЕЦ ГО N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14.

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть амплифицирована с использованием кДНК, мРНК или, альтернативно, геномной ДНК в качестве матрицы и соответствующих олигонуклеотидных праймеров по стандартным методикам проведения ПЦР-амплификации. Нуклеиновая кислота, амплифицированная таким образом, может быть далее клонирована в соответствующем векторе и охарактеризована путем анализа последовательности ДНК.

- 4 008607

Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидным последовательностям по настоящему изобретению или гибридизуемые с ними, могут быть получены по стандартным методикам синтеза, например с использованием автоматизированного синтезатора ДНК.

В одном предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2. Последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 2 соответствует кодирующей области гена фосфолипазы ФЛП03 из АкрегдШик шдег, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. Такая кДНК включает последовательность, кодирующую ФЛП03 полипептид из АкрегдШик шдег, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3.

Во втором предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 5. Последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 5 соответствует кодирующей области гена фосфолипазы ФЛП06 из АкрегдШик шдег, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4. Такая кДНК включает последовательность, кодирующую полипептид ФЛП06 из АкрегдШик шдег, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 6.

В третьем предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 8. Последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 8 соответствует кодирующей области гена фосфолипазы ФЛП15 из АкрегдШик шдег, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 7. Такая кДНК включает последовательность, кодирующую полипептид ФЛП15 из АкрегдШик шдег, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 9.

В четвертом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 11. Последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 11 соответствует кодирующей области гена фосфолипазы ФЛП26 из АкрегдШик шдег, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 10. Такая кДНК включает последовательность, кодирующую полипептид ФЛП26 из АкрегдШик шдег, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 12.

В пятом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 14. Последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 14 соответствует кодирующей области гена фосфолипазы ФЛП34 из АкрегдШик шдег, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 13. Такая кДНК включает последовательность, кодирующую полипептид ФЛП34 из АкрегдШик шдег, показанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 15.

В другом предпочтительном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14 или функционального эквивалента указанных нуклеотидных последовательностей.

Молекула нуклеиновой кислоты, которая комплементарна к другой нуклеотидной последовательности, представляет собой такую молекулу, которая обладает достаточной комплементарностью к другой нуклеотидной последовательности, так что может гибридизоваться с другой нуклеотидной последовательностью, образуя при этом стабильный дуплекс.

Один аспект настоящего изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид по настоящему изобретению или его функциональный эквивалент, такой как биологически активный фрагмент или домен, а также к молекулам нуклеиновой кислоты, подходящим для использования в качестве гибридизирующего зонда для идентификации молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид по настоящему изобретению, и к фрагментам таких молекул нуклеиновой кислоты, которые пригодны для использования в качестве ПЦР-праймеров для амплификации или мутирования молекул нуклеиновой кислоты.

Термины выделенный полинуклеотид или выделенная нуклеиновая кислота обозначают ДНК или РНК, которые непосредственно не соприкасаются с обеими кодирующими последовательностями, с которыми в естественном геноме организма, из которого они были выделены, они непосредственно соприкасаются (одна на 5'-конце и одна на 3'-конце). Таким образом, в одном варианте выделенная нуклеиновая кислота включает несколько или все из 5'-некодирующих (например, промоторных) последовательностей, которые непосредственно примыкают к кодирующей последовательности. В этой связи, указанный термин включает, например, рекомбинантную ДНК, которая входит в состав вектора в автономно реплицирующихся плазмиде или вирусе или в состав геномной ДНК прокариота или эукариота или которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК или фрагмента геномной ДНК, получаемой путем ПЦР или обработки рестрикционной эндонуклеазой), независимо от других последовательностей. Указанный термин также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, который, по существу, не содержит клеточный материал, вирусный материал или культуральную среду (в случае получения по методикам рекомбинантной ДНК), или химические предшественники или другие химические вещества (в варианте химического синтеза). Кроме того, выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который в природе не встречается как фрагмент и не может быть обнаружен в естественном состоянии.

В контексте настоящего описания термины полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты используются для обозначения молекул ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) или молекул РНК

- 5 008607 (например, мРНК), а также аналогов ДНК и РНК, получаемых с использованием нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двуцепочечной, но предпочтительно является двуцепочечной. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием аналогов или производных олигонуклеотидов (например, инозиновых или фосфотиатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды могут использоваться, например, для получения нуклеиновых кислот, которые обладают измененными свойствами по спариванию оснований или повышенной устойчивостью к нуклеазам.

Другой вариант настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой относительно молекулы нуклеиновой кислоты, полученной по настоящему изобретению. В область настоящего изобретения также включаются комплементарные цепи молекул нуклеиновой кислоты, приведенные в настоящем описании.

Ошибки последовательности

Информация о последовательностях, приведенная в настоящем описании, не должна восприниматься в узком контексте как о последовательностях, в которые включаются ошибочно идентифицированные основания. Конкретные последовательности, раскрытые в настоящем описании, могут без труда использоваться для выделения полного гена из нитчатых грибов, в частности АвретдШив пфсг. которые, в свою очередь, могут быть далее проанализированы с идентификацией имеющихся в последовательности ошибок.

Если особо не оговорено иное, все нуклеотидные последовательности, определенные при секвенировании описанных в настоящей заявке молекул ДНК, анализируют с использованием автоматизированного секвенатора ДНК и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемые молекулами ДНК, определенными в настоящем изобретении, были прогнозированы как продукты трансляции последовательности ДНК, определенной выше. В этой связи, как известно в данной области, в любой последовательности ДНК, определенной с помощью такого автоматизированного подхода, могут содержаться некоторые ошибки нуклеотидной последовательности. Нуклеотидные последовательности, определенные путем автоматизированного секвенирования, в типичном случае по меньшей мере примерно на 90% идентичны, более типично от по меньшей мере примерно на 95% до по меньшей мере примерно на 99% идентичны фактической нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Фактическая последовательность может быть более точно определена с помощью других подходов, включающих способ ручного секвенирования ДНК, также известный в данной области. Как известно в данной области техники, единственная вставка или делеция в определенной нуклеотидной последовательности в сравнении с фактической последовательностью может вызвать сдвиг рамки считывания при трансляции нуклеотидной последовательности, так что предсказанная аминокислотная последовательность, кодируемая определенной нуклеотидной последовательностью, будет совершенно иной относительно аминокислотной последовательности, фактически кодируемой секвенированной молекулой ДНК, начиная с точки такой вставки или делеции.

Каждый специалист со средним уровнем знаний в данной области способен определить такие ошибочно идентифицированные основания и знает, как корректировать такие ошибки.

Фрагменты нуклеиновой кислоты, зонды и праймеры

Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может включать лишь часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из ЗЕф ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, например фрагмент, который может использоваться в качестве зонда, или праймера, или фрагмента, кодирующего часть белка по настоящему изобретению. Нуклеотидная последовательность, определенная при клонировании гена фосфолипазы и кДНК, позволяет получать зонды и праймеры, разработанные для целей использования при идентификации и/или клонировании других представителей семейства фосфолипаз, а также гомологов фосфолипазы из других видов. Зонд/праймер в типичном случае включает, по существу, очищенный олигонуклеотид, содержащий обычно область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется, предпочтительно в условиях высокой строгости, по меньшей мере, примерно на участке, включающем 12 или 15, предпочтительно примерно 18 или 20, предпочтительно примерно 22 или 25, более предпочтительно примерно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 75 или более идущих друг за другом нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ЗЕф ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14 или их функционального эквивалента.

Зонды, основанные на нуклеотидной последовательности, приведенной в настоящем описании, могут быть использованы для выявления транскриптов (в основном, мРНК) или геномных последовательностей, кодирующих такие же или гомологичные белки, например, из других организмов. В предпочтительных вариантах зонд также включает метящую группу, присоединенную к нему, например метящую группу, которая может представлять собой радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Такие зонды также могут использоваться в качестве составного компонента в диагностических наборах для анализа клеток, которые экспрессируют фосфолипазу.

Идентичность и гомология

Термины гомология или процент идентичности используются в настоящем описании взаимозаменяемо. В контексте настоящего изобретения принимается, что для выявления процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты проводят сопоставление указанных последовательностей с целью оптимального сравнения (например, могут

- 6 008607 быть введены гэпы в последовательность первой аминокислоты или в последовательность нуклеиновой кислоты для оптимального сопоставления со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислоты или в соответствующих положениях нуклеотидов. В том случае, когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы определяются как идентичные в данном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений в последовательностях (например, % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (то есть перекрывающихся положений) х 100). Предпочтительно обе последовательности имеют одинаковую длину.

Специалист в данной области понимает, что имеется несколько разных компьютерных программ, доступных для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено с использованием математического алгоритма. В предпочтительном варианте процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют по алгоритму Нидлмана и Вунша (№еб1етап апб ХУипксй; 1. Μοί. ΒίοΙ. (48): 444-453 (1970)), который включен в программу САР в составе пакета программного обеспечения ССС (доступен на веб-странице Ы1р://^тете.дсд.сот), с использованием матрицы В1оккот 62 или матрицы РАМ250, и гэпа с весовым значением 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и длины с весовым значением 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалист в данной области понимает, что все указанные различные параметры приведут к несколько измененным результатам, но что общий процент идентичности двух последовательностей не будет существенно изменен при использовании такого алгоритма.

Еще в одном варианте процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы САР, входящей в состав пакета программного обеспечения ССС (доступен на веб-странице 1и1р://\\л\лу.дс8.со1п). с использованием матрицы Ы^Здарбпа.СМР, и гэпа с весовым значением 40, 50, 60, 70 или 80, и длины с весовым значением 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом варианте процент идентичности между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями определяют по алгоритму Майерса и Миллера (Е. Меуегк апб V. МШет (САВЮ8, 4: 11-17, 1989)), который включен в программу АМСИ (версия 2.0) (доступен на веб-странице Ы1р://уеда.1дй.спгк.1г/Ьш/а11дп-диекк.сд1), с использованием таблицы весовых значений остатков в рамках РАМ120, при отклонении гэпа длиной 12 и гэпа с весовым значением 4.

Последовательности нуклеиновой кислоты и белковые последовательности по настоящему изобретению могут также использоваться в качестве запрашиваемой последовательности для проведения поиска в доступных базах данных для идентификации других представителей семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут проводиться с использованием программ ВЬАЗТЫ и ВЬА8ТХ (версия 2.0) (А11ксйи1, е! а1. (1990) 1. Мо1. Βίο1. 215:403-10). Поиски нуклеотидов в режиме ВЬА8Т могут проводиться с использованием программы ВЕА8ТЫ, где балльный показатель = 100, длина слова =12, с получением нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекуле нуклеиновой кислоты для ФЛП03 по настоящему изобретению. Поиски белковых последовательностей в режиме ВЬА8Т могут проводиться с использованием программы ВЬА8ТХ, где балльный показатель = 50, длина слова = 3, с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам ФЛП03 по настоящему изобретению. В варианте сопоставления с включением гэпов для целей сравнения может использоваться гэпированная версия программы Сарреб ВЬА8Т, описанная Е. Альтшулем с соавт. (А11ксйи1, е! а1. (1997) ЫисЩс Ас1бк Век. 25(17): 3389-3402). В случае программ ВЬА8Т и Сарреб ВЬА8Т может использоваться введение по умолчанию параметров соответствующих программ (то есть ВЬА8ТХ и ВЬА8ТН). (См. веб-страницу 1Шр://\\л\лу.псЫ.шт.ш11.доЬ.)

Гибридизация

В контексте настоящего описания термин гибридизация применяется для описания условий гибридизации и промывки, при которых нуклеотидные последовательности по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 85-90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% гомологичны друг другу и в типичном случае остаются в гибридизованном состоянии друг с другом.

Предпочтительные неограничивающие примеры таких условий гибридизации включают гибридизацию в 6х хлориде натрия/цитрате натрия (88С) при температуре примерно 45°С с последующей одной или более промывками в 1х 88С, 0,1% ДСН при температуре 50°С, предпочтительно при температуре 55°С, предпочтительно при температуре 60°С, еще более предпочтительно при температуре 65°С.

Условия высокой строгости включают, например, гибридизацию при температуре 68°С в 5х 88С/5х растворе Денхардта/1,0% ДСН и промывку в 0,2х 88С/0,1% ДСН при комнатной температуре. Альтернативно, промывка может проводиться при 42°С.

Для специалиста в данной области известно, какие условия применяются для гибридизации в условиях высокой строгости и очень высокой строгости. В данной области имеется руководство, описываю

- 7 008607 щее такие условия, доступное, например, в работах Самбрука с соавт. и Аусубеля с соавт. (БатЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬота1оту Мапиа1, Со1б 8ρτίη§ НагЬог Ргекк, Ν.Υ., апб АикиЬе1 е! а1. (ебк.), 1995, Сштеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, (1оЬп \УПеу & 8опк, Ν.Υ.)).

Разумеется, полинуклеотид, который гибридизуется только с поли-А последовательностью (такой как поли(А) тракт мРНК на З'-конце) или с комплементарной цепью из Т (или и) остатков, не включается в полинуклеотид по настоящему изобретению, предназначенный для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, поскольку такой полинуклеотид будет гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей цепь поли(А) или ее комплемент (например, практически с любым клоном двуцепочечной кДНК).

Получение ДНК полной длины из других организмов

В типичной процедуре описываемого подхода могут быть подвергнуты скринингу библиотеки кДНК, созданные на основе других организмов, например нитчатых грибов, в частности видов АкретдШик.

Например, штаммы АкретдШик могут быть подвергнуты скринингу для поиска гомологичных полинуклеотидов методом нозерн-блоттинга. При выявлении транскриптов, гомологичных к полинуклеотидам по настоящему изобретению, с использованием стандартных методик, известных специалистам в данной области, могут быть сконструированы библиотеки кДНК на основе РНК, выделенной из соответствующего штамма. Альтернативно, библиотека общей геномной ДНК может быть подвергнута скринингу с использованием зонда, гибридизуемого с полинуклеотидом по настоящему изобретению.

Гомологичные генные последовательности могут быть выделены при проведении ПЦР с использованием двух вырожденных олигонуклеотидных праймерных пулов, разработанных на основе нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению.

Матрица для реакции может представлять собой кДНК, полученную путем обратной транскрипции мРНК, полученных из штаммов, в отношении которых известно или предполагается, что они экспрессируют полинуклеотид по настоящему изобретению. Продукт ПЦР может быть подвергнут субклонированию и секвенированию для подтверждения того, что амплифицированные последовательности отражают последовательности новой последовательности нуклеиновой кислоты для ФЛП03 или ее функционального эквивалента.

ПЦР фрагмент может также использоваться для выделения клона кДНК полной длины с использованием множества известных способов. Так, например, амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга библиотеки кДНК бактериофагов или космид. Альтернативно, меченый фрагмент может использоваться для скрининга геномной библиотеки.

Методика ПЦР может также использоваться для выделения последовательности кДНК полной длины из других организмов. Например, РНК может быть выделена по стандартным процедурам из соответствующих клеточных или тканевых источников. Реакция обратной транскрипции может быть проведена на основе РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного, прежде всего, к 5'-концу амплифицированного фрагмента, для осуществления функции затравки в синтезе первой цепи.

К полученному РНК/ДНК гидриду может быть далее привешен фрагмент хвоста (например, с помощью гуанинов) по стандартной методике концевой трансферазной реакции, после чего гибрид может быть расщеплен РНК-азой Н, с осуществлением далее затравочной функции для синтеза второй цепи (например, с помощью поли-С праймера). Таким образом, могут быть без труда выделены последовательности кДНК амплифицированного фрагмента в направлении против хода транскрипции. Обзор используемых методик клонирования приведен, например, в работах Самбрука с соавт. и Аусубеля с соавт. (БатЬгоок е! а1., кирга; и АикиЬе1 е! а1., кирга).

Векторы

Другой аспект настоящего изобретения относится к векторам, предпочтительно векторам экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок по настоящему изобретению или его функциональный эквивалент. В контексте настоящего описания термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, к которой она присоединяется. Один тип векторов относится к плазмиде, которая представляет кольцевую двуцепочечную петлю ДНК, внутри которой могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип векторов представляет собой вирусный вектор, отличающийся тем, что в таком вирусном геноме могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Некоторые векторы способны к автономной репликации в хозяйской клетке, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном хозяйской клетки при их введении в хозяйскую клетку и таким образом реплицируются вместе с хозяйским геномом. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы обозначаются в настоящем описании как векторы экспрессии. В целом, векторы экспрессии, используемые в методиках рекомбинантной ДНК, обычно имеют форму плазмид. Термины плазмида и вектор используются взаимозаменяемо в настоящем описании, поскольку плазмида чаще всего представлена в форме вектора. Однако настоящее изобретение включает и другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, векторы ретровирусов с дефектами репликации, аденовирусов и аденоас

- 8 008607 социированных вирусов), которые выполняют эквивалентные функции.

Рекомбинантные векторы экспрессии по настоящему изобретению включают нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в хозяйской клетке, что означает, что рекомбинантный вектор экспрессии включает одну или более регуляторных последовательностей, выбранных с учетом хозяйских клеток, которые будут использоваться для экспрессии, которые оперативно связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей экспрессии. В контексте рекомбинантного вектора экспрессии термин оперативно связанный означает, что интересующая нуклеиновая последовательность соединена с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) таким способом, который позволяет осуществлять экспрессию нуклеотидной последовательности (например, транскрипцию/трансляцию ίη νίίτο или в хозяйской клетке, когда вектор вводится в хозяйскую клетку). Термин регуляторная последовательность обозначает промоторы, энхансеры и другие контрольные элементы экспрессии (например, сигнал полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны в литературе (см., например, Соеббе1; Сепе Ехртеккюп Тес1по1оду: Ме1йобк ίη Еп/уто1оду 185, Асабетк Ргекк, 8ап О|едо. СА (1990)). Регуляторные последовательности включают такие последовательности, которые направляют конститутивную или индуцибельную экспрессию нуклеотидной последовательности в хозяйских клетках многих типов, а также последовательности, которые направляют экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных хозяйских клетках (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Для специалистов в данной области очевидно, что разработка вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор хозяйской клетки, подлежащей трансформации, желательный уровень экспрессии белка и т.п. Векторы экспрессии по настоящему изобретению могут встраиваться в хозяйские клетки, за счет чего достигается продукция белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, раскрытыми в настоящем описании (например, фосфолипаз, мутантных фосфолипаз, их фрагментов, вариантов или функциональных эквивалентов, белков слияния и т.п.).

Рекомбинантные векторы экспрессии по настоящему изобретению могут быть созданы для экспрессии фосфолипаз в прокариотических или эукариотических клетках. Например, белок по настоящему изобретению может экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как Е. сой и виды Васб1ик, в клетках насекомых (включая вектор экспрессии бакуловируса), в дрожжевых клетках и в клетках млекопитающих. Подходящие хозяйские клетки описаны также в указанной выше работе (см. Соеббе1, Сепе Ехртеккюп Тесйпо1о§у: МеИобк ίη Епхуто1оду 185, Асабетк Ргекк, 8ап П1едо, СА (1990)). Альтернативно, рекомбинантный вектор экспрессии может транскрибироваться и транслироваться ш νιΙΐΌ, например, с использованием промоторных регуляторных последовательностей Т7 и Т7-полимеразы.

Используемые в настоящем изобретении векторы экспрессии включают векторы хромосомного, эписомального и вирусного происхождения, например вирусы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевых эписом, хромосомных элементов дрожжей, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы птичьей оспы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, а также векторы, полученные из их сочетаний, такие как векторы, полученные на основе плазмид и генетических элементов бактериофагов, такие как космиды и фагемиды.

Встраиваемая ДНК должна быть оперативно связана с соответствующим промотором, таким как РЬ промотор фага ламбда, 1ас, 1рт и 1ас промоторы Е. сой, ранний и поздний промоторы 8У40, а также промоторы длинных концевых повторов ретровирусов (ЬТК), если ограничиться указанием лишь нескольких наименований. Специалистам в данной области известны другие подходящие промоторы. В конкретном варианте предпочтительными являются промоторы, которые способны направлять высокий уровень экспрессии фосфолипаз в нитчатых грибах. Такие промоторы известны в данной области. Конструкции экспрессии могут содержать сайты инициации и терминации транскрипции, а в транскрибируемой области - сайт связывания рибосом для осуществления трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых такими конструкциями, включает кодон инициации трансляции АИС и кодон терминации транскрипции, расположенные, соответственно, в начале и в конце полипептида, подлежащего трансляции.

Векторная ДНК может быть введена в прокариотические или эукариотические клетки по традиционным методикам трансформации или трансфекции. В контексте настоящего описания термины трансформация и трансфекция используются для обозначения множества известных в данной области методик введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в хозяйскую клетку, включая метод с использованием соосаждения фосфатом кальция или хлоридом кальция, метод трансфекции с использованием ДЭАЭ-декстрана, метод трансдукции, инфекции, липофекции, катионной трансфекции с использованием липидов или электропорации. Подходящие способы трансформации или трансфекции хозяйских клеток описаны, например, в руководстве Самбрука с соавт. и Дэвиса с соавт. (8атЬтоок е! а1. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1оту Мапиа1, 2пб еб. Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1б 8ртшд НагЬог, ΝΥ, 1989; Ωηνίκ е! а1., Вакк МеИобк ш Мо1еси1аг Вю1оду (1986)) и в других лабораторных руководствах.

В попытках достичь стабильной трансфекции клеток млекопитающих было показано, что лишь небольшая фракция клеток, зависимая от используемого вектора экспрессии и методики трансфекции, мо

- 9 008607 жет интегрировать чужеродную ДНК в свой геном. Для идентификации и отбора таких интегрантов обычно в хозяйские клетки вместе с интересующим геном встраивают ген, который кодирует селектируемый маркер (например, устойчивость к антибиотикам). Предпочтительные селектируемые маркеры включают такие маркеры, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, таким как 0418, гигромицин и метотрексат. Нуклеиновую кислоту, кодирующую селектируемый маркер, предпочтительно вводят в хозяйскую клетку с тем же вектором, что и нуклеиновую кислоту, кодирующую белок по настоящему изобретению, или, альтернативно, она может вводиться на отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы путем селекции с лекарственным средством (например, клетки, которые включают селектируемый маркерный ген, будут выживать, тогда как другие клетки погибают).

Экспрессию белков в прокариотах зачастую проводят в клетках Е. сой с использованием векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, направляющие экспрессию либо белков слияния, либо неслитых белков. Слитые векторы добавляют множество аминокислот к кодируемому белку, например к аминоконцу рекомбинантного белка. Такие слитые векторы в типичном случае служат для достижения трех целей: 1) для повышения экспрессии рекомбинантного белка; 2) для повышения растворимости рекомбинантного белка; и 3) для помощи в очистке рекомбинантного белка за счет функционирования в качестве лиганда при аффинной очистке. Часто, в случае экспрессии слитых векторов, в месте соединения слитого фрагмента и рекомбинантного белка вводят сайт расщепления протеолитическим ферментом для того, чтобы способствовать отделению рекомбинантного белка от слитого фрагмента после очистки белка слияния. Такие ферменты и распознаваемые ими последовательности включают фактор Ха, тромбин и энтерокиназу.

Как отмечалось, вектор экспрессии предпочтительно содержит селектируемые маркеры. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу или устойчивость к неомицину, в случае культуры эукариотических клеток, и устойчивость к тетрациклину или ампициллину, в случае культивирования Е. сой и других бактерий. Репрезентативные примеры соответствующих хозяйских организмов включают бактериальные клетки, такие как Е. сой, 81тер!отусек и 8а1шоие11а !урЫтигшт; грибные клетки, такие как дрожжи; клетки насекомых, такие как Отокорййа 82 и 8робор!ета 8£9; клетки животных, такие как СНО, СО8 и меланома Вотек, а также растительные клетки. Соответствующие культуральные среды и условия выращивания указанных выше хозяйских клеток известны в данной области.

К числу векторов, предпочтительных для использования в бактериях, относятся рОЕ70. рЦЕ60 и РОЕ-9, доступные от 01адеп; рВ8 векторы, Рйадексйр! векторы, В1иекспр! векторы, рХН8Л, рХН16Л, рХН18Л, рХН46Л, доступные от 8!га!адепе; и р!гс99а, рКК223-3, рКК-233-3, рПК.540, рК1Т5, доступные от Рйаттааа. К числу векторов, предпочтительных для эукариотических клеток, относятся ΡΧΥΕΝΕΟ, р8У2САТ, рОО44, р2Т1 р80, доступные от 8!га!адепе; и р8УК3, рВРУ, рМ80 и р8УЪ, доступные от Рйаттааа. Специалистам в данной области известны также другие подходящие векторы.

Известные бактериальные промоторы, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают 1ас1 и 1ас2 промоторы Е. сой, Т3 и Т7 промоторы, др! промотор, РК, РЬ промоторы ламбда фага и !гр промотор, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промоторы 8У40, промоторы ретровирусных длинных концевых повторов (ЬТК), такие как длинные концевые повторы вируса саркомы Рауса (К8У), и промоторы металлотионеина, такие как мышиный промотор металлотионеина-1.

Встраивание энхансерной последовательности в вектор может повышать уровень транскрипции ДНК, кодирующей полипептиды по настоящему изобретению, у высших эукариотов. Энхансеры представляют собой цис-активные элементы ДНК, обычно включающие от 10 до 300 п.н., которые действуют в плане повышения активности транскрипции промотора в хозяйской клетке данного типа. Примеры энхансеров включают энхансер 8У40, который расположен на поздней стороне ориджина репликации, на участке от 100 до 270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне ориджина репликации и энхансеры аденовируса.

Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулюма, в периплазматическое пространство или во внеклеточное окружение в экспрессированный полипептид может быть включен соответствующий сигнал секреции. Такие сигналы могут быть эндогенными для полипептида или могут представлять собой гетерологичные сигналы.

Полипептиды могут экспрессироваться в модифицированной форме, такой как белок слияния, и они могут включать не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные участки. Так, например, участок, включающий дополнительные аминокислоты, в особенности заряженные аминокислоты, может быть добавлен к Ν-концу полипептида для повышения стабильности и персистенции в хозяйской клетке, а также стабильности в процессе очистки или впоследствии при работе и хранении. К полипептиду для облегчения очистки могут быть также добавлены пептидные группы.

Полипептиды по настоящему изобретению

Настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 3, 6, 9, 12, и 15, или аминокислотную последовательность, получаемую при экспрессии полинуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, в соответствующей хозяйской клетке.

- 10 008607

В настоящее изобретение входит также пептид или полипептид, включая функциональный эквивалент указанных полипептидов. Указанные выше полипептиды коллективно обозначаются термином полипептиды по настоящему изобретению.

Термины пептид и олигопептид рассматриваются как синонимы (как это обычно принято), и каждый термин может использоваться взаимозаменяемо, как того требует контекст, определяя цепь, состоящую по меньшей мере из двух аминокислот, соединенных пептидными связями. Слово полипептид используется в настоящем описании для обозначения цепей, содержащих более семи аминокислотных остатков. Все олигопептидные и полипептидные формулы или последовательности, приведенные в настоящем описании, написаны слева направо и в направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Используемый в описании однобуквенный код аминокислот широко применяется в данной области, расшифровку его можно найти, например, в руководстве Самбрука с соавт. (8ашЬтоок с( а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬотаГоту Мапиа1, 2пб еб., Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬотаГоту, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬотаГоту Ргезз, Со1б 8ртшд НагЬог, ΝΥ, 1989)).

Термин выделенный в отношении полипептида или белка означает полипептид или белок, отобранный из своего нативного окружения. Например, полученные рекомбинантными методами полипептиды и белки, экспрессируемые в хозяйских клетках, рассматриваются в контексте настоящего изобретения как выделенные нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были, по существу, очищены по соответствующей методике, такой как, например, одностадийный метод очистки, описанный Смитом и Джонсоном (8шИй аиб 1о1шзоп. Сепе 67:31-40 (1988)).

Фосфолипазы по настоящему изобретению могут быть восстановлены и очищены из культур рекомбинантных клеток известными способами, включающими осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на лектине. Наиболее предпочтительно для очистки используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).

Полипептиды по настоящему изобретению включают природные очищенные продукты, продукты, полученные по процедурам химического синтеза, и продукты, получаемые рекомбинантными методиками, из клеток прокариотических или эукариотических хозяйских организмов, включая, например, клетки бактерий, дрожжей, грибов, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от вида хозяйского организма, используемого в процедуре получения рекомбинантного продукта, полипептиды по настоящему изобретению могут быть гликозилированными или не гликозилированными. Кроме того, полипептиды по настоящему изобретению могут также включать исходный модифицированный остаток метионина, в некоторых случаях как результат процессов, определяемых хозяйским организмом.

Белковые фрагменты

Настоящее изобретение также относится к биологически активным фрагментам полипептидов по настоящему изобретению.

Биологически активные фрагменты полипептидов по настоящему изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, идентичные в достаточной мере аминокислотной последовательности фосфолипазы или полученные из нее (например, аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15), которые включают меньшее число аминокислот, чем белок полной длины, и проявляют по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего белка полной длины. В типичном случае биологически активные фрагменты включают домен или мотив по меньшей мере с одной активностью, свойственной соответствующему белку полной длины. Биологически активный фрагмент белка по настоящему изобретению может представлять собой полипептид, который включает, например, 10, 25, 50, 100 или более аминокислот в длину. Кроме того, рекомбинантными методиками могут быть получены другие биологически активные части, в которых делетированы другие области белка, и оценены на наличие одной или более биологических активностей, свойственных нативной форме полипептида по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к фрагментам нуклеиновой кислоты, которые кодируют указанные выше биологически активные фрагменты фосфолипазы.

Белки слияния

Белки по настоящему изобретению или их функциональные эквиваленты, например их биологически активные части, могут быть оперативно связаны с нефосфолипазным полипептидом (например, с гетерологичными аминокислотными последовательностями) с образованием белков слияния. В контексте настоящего описания термины химерный белок или белок слияния относительно фосфолипазы включают фосфолипазный полипептид, оперативно связанный с нефосфолипазным полипептидом.

В предпочтительном варианте белок слияния включает по меньшей мере один биологически активный фрагмент фосфолипазы по настоящему изобретению. В другом предпочтительном варианте белок слияния включает по меньшей мере две биологически активных части фосфолипазы по настоящему изобретению. В контексте белка слияния термин оперативно связанный обозначает, что фосфолипазный и нефосфолипазный полипептиды слиты в открытой рамке считывания друг с другом на Ν-конце или Сконце фосфолипазы.

- 11 008607

Например, в одном варианте настоящего изобретения белок слияния представляет собой белок слияния С8Т-фосфолипазы. в котором фосфолипазные последовательности слиты с С-концом С8Т последовательностей. Такие белки слияния могут облегчать очистку рекомбинантной фосфолипазы. В другом варианте настоящего изобретения белок слияния представляет собой фосфолипазный белок, содержащий гетерологичную сигнальную последовательность на своем Ν-конце. В некоторых хозяйских клетках (например, в хозяйских клетках млекопитающих и дрожжей) экспрессия и/или секреция фосфолипазы может быть повышена путем использовании гетерологичной сигнальной последовательности.

В другом варианте может использоваться секреторная последовательность др67 белка оболочки бакуловируса в качестве гетерологичной сигнальной последовательности (Сиггеп! Рго!осок ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. Аи8иЬе1 е! а1.. ебк.. ίοΐιη \УПеу & 8опк. 1992). Другие примеры гетерологичных сигнальных последовательностей эукариотов включают секреторные последовательности мелитина и щелочной фосфатазы человеческой плаценты (81та!адепе; Ьа 1о11а. Калифорния). Еще в одном примере используемые гетерологичные сигнальные последовательности включают сигнал секреции р1юЛ (8ашЬгоок е! а1.. кирга) и сигнал секреции белка А (Рйатшаша Вю!есй; Р18ка1а^ау. Нью-Джерси).

Сигнальная последовательность может использоваться для облегчения секреции и выделения белка или полипептида по настоящему изобретению. В типичном случае сигнальные последовательности характеризуются наличием ядра из гидрофобных аминокислот, который, в основном, выщепляется из зрелого белка в ходе одного или двух явлений расщепления. Такие сигнальные полипептиды содержат сайты процессинга, которые позволяют расщеплять сигнальную последовательность зрелых белков, когда они вступают в секреторный механизм. Сигнальная последовательность направляет секрецию белка, такого как белок из эукариотического хозяйского организма, который был трансформирован вектором экспрессии, и сигнальная последовательность впоследствии или одновременно подвергается расщеплению. Белок может быть затем легко выделен из внеклеточной среды и очищен известными способами. Альтернативно, сигнальная последовательность может быть связана с интересующим белком с использованием последовательности. которая облегчает очистку. такой как домен С8Т. Таким образом. например. последовательность, кодирующая полипептид, может быть слита с маркерной последовательностью, такой как последовательность. кодирующая пептид. который облегчает очистку слитого полипептида. В некоторых предпочтительных вариантах данного аспекта изобретения маркерная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид. такой как метка. имеющаяся в векторе рОЕ (01адеп. 1пс.). в числе других. многие из которых коммерчески доступны. Как описано в литературе (Сеп1х е! а1.. Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А 86:821-824 (1989)). например. гексагистидин обеспечивает осуществление удобных методик очистки. НА метка представляет собой другой используемый для очистки пептид. который соответствует эпитопу белка гемагглютинина вируса гриппа. описанного. например. Вильсоном с соавт. даюп е! а1.. Се11 37:767 (1984)).

Предпочтительно химерный белок или белок слияния получают по стандартным процедурам на основе рекомбинатной ДНК. Например. фрагменты ДНК. кодирующие разные полипептидные последовательности. лигируют вместе в открытой рамке считывания по традиционным методикам. например путем использования липких концов или ступенчатых разрывов для лигирования. расщепления рестрикционным ферментом с обеспечением соответствующих концов. фланкирования липких концов. где это приемлемо. обработки щелочной фосфатазой для избежания нежелательного связывания и знзиматического лигирования. В другом варианте ген слияния может быть синтезирован традиционными методиками. включающими использование автоматизированного синтезатора ДНК.

Альтернативно. амплификация методом ПЦР фрагментов гена может быть проведена с использованием якорных праймеров. которые дают возможность комплементарно объединить выступающие участки между двумя последовательными генными фрагментами. которые впоследствии могут быть подвергнуты отжигу и повторной амплификации для создания химерной генной последовательности (см.. например. Сиггеп! Рго!осо1§ ίη Мо1еси1аг Вю1оду. ебк.. Лп5иЬе1 е! а1.. 1оНп \УПеу & 8опк: 1992). Кроме того. коммерчески доступно множество векторов экспрессии. которые кодируют слитый фрагмент (например. полипептид С8Т). Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть клонирована в таком векторе экспрессии. так что слитый фрагмент связывается в открытой рамке считывания со слитым фрагментом для экспрессии белка слияния. включающего белок по настоящему изобретению.

Функциональные эквиваленты

Термины функциональные эквиваленты и функциональные варианты используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Функциональные эквиваленты ДНК. кодирующей фосфолипазу. представляют собой выделенные фрагменты ДНК. которые кодируют полипептид. демонстрирующий конкретную функцию фосфолипазы из ЛкрегдШпк шдег. определенной в настоящем описании. Функциональный эквивалент фосфолипазного полипептида по настоящему изобретению представляет собой полипептид. который демонстрирует по меньшей мере одну из функций фосфолипазы из ЛкрегдШпк шдег. определенной в настоящем описании. В этой связи. функциональные эквиваленты также охватывают биологически активные фрагменты.

Функциональные эквиваленты белка или полипептида могут содержать только консервативные замещения одной или более аминокислот в аминокислотных последовательностях. выбранных из группы.

- 12 008607 состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15, или замещения, вставки или делеции аминокислот, не относящихся к незаменимым. Соответственно, аминокислота, не относящаяся к группе незаменимых, представляет собой остаток, который может быть изменен в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15, без существенного изменения биологической функции. Так, например, можно полагать, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными для фосфолипазных белков по настоящему изобретению, в особенности не подлежат изменениям. Более того, аминокислоты, сохраняющиеся в фосфолипазных белках по настоящему изобретению и других фосфолипазах, также не подлежат изменениям.

Термин консервативное замещение указывает на замещение, при котором один аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим похожую боковую цепь. Такие семейства известны в данной области и включают аминокислоты с боковой цепью основной природы (например, лизин, аргинин и гистидин), боковой цепью кислотной природы (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), аминокислоты с незаряженной полярной боковой цепью (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярной боковой цепью (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленной боковой цепью (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматической боковой цепью (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

В типичном случае функциональные эквиваленты нуклеиновой кислоты могут содержать молчащие мутации, которые не изменяют биологической функции кодируемого полипептида. Соответственно, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим фосфолипазные белки, которые содержат изменения аминокислотных остатков, но которые не являются существенными для конкретной биологической активности. Такие белки отличаются по аминокислотной последовательности от последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15, но при этом они сохраняют по меньшей мере одну биологическую активность. В одном варианте выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, где указанный белок включает, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15.

Рекомендации по получению фенотипически молчащих аминокислотных замен приведены, например, в работе Боуи (Во\\зс. 1.И. е! а1., 8с1еисе 247: 1306-1310 (1990)), где авторы показывают, что имеется два основных подхода для определения толерантности аминокислотной последовательности к изменениям в ее составе. Первый метод основан на эволюционном принципе, когда мутации либо воспринимаются, либо отвергаются естественным отбором. Во втором подходе используется генно-инженерный метод для введения аминокислотных изменений в конкретное положение клонированного гена с проведением впоследствии отбора или скрининга с целью идентификации последовательностей, которые способствуют сохранению функциональной активности. Исследования вышеуказанных авторов показали, что исследованные белки отличаются удивительной толерантностью к аминокислотным заменам. Далее авторы определили, какие изменения являются, скорее всего, допустимыми в конкретном положении белка. Так, например, большая часть заменяемых аминокислотных остатков требует наличия неполярных боковых цепей, тогда как некоторые особенности поверхности боковых цепей, в целом, сохраняются. Другие такие фенотипические молчащие замены описаны, например, в работе Боуи с соавт. (Во\\1е е! а1., кирга) и в приведенных в ней ссылках.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, гомологичный белку, выбранному из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15, может быть получена при введении одной или более нуклеотидных замен, вставок или делеций в кодирующие нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 2, 4 и 5, 7 и 8, 10 и 11, 13 и 14, соответственно, так что одна или более аминокислотных замен, делеций или вставок вводится в кодируемый белок. Эти мутации могут быть введены с помощью стандартных методик, таких как сайт-направленный мутагенез и мутаганез посредством ПЦР.

Термин функциональные эквиваленты также относится к ортологам фосфолипаз из АкрегдШик шдег, приведенных в настоящем описании. Ортологи фосфолипаз из АкрегдШик шдег представляют собой белки, которые могут быть выделены из других штаммов или видов и которые обладают близкой или идентичной биологической активностью. Такие ортологи могут быть без проблем идентифицированы как молекулы, включающие аминокислотную последовательность, которая, по существу, гомологична к аминокислотным последовательностям, выбранным из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15.

В соответствии с определением по настоящему описанию термин по существу, гомологичные относится к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное число аминокислот или нуклеотидов, идентичных или эквивалентных (например, имеющих похожую боковую цепь) второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, так что первая и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют общий домен. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий домен, характеризуются примерно 60%, предпочтительно 65%, более предпочтительно 70%, еще более предпоч

- 13 008607 тительно 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% или более идентичностью и определяются в рамках настоящего описания как достаточно идентичные.

Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие другие представители семейства фосфолипаз, которые имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, также входят в область настоящего изобретения. Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие фосфолипазные белки из других видов, которые имеют нуклеотидную последовательность, отличающуюся от нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, также входят в область настоящего изобретения. Молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующие вариантам (например, природным аллельным вариантам) и гомологам ДНК по настоящему изобретению, могут быть выделены на основе их гомологии к нуклеиновым кислотам по настоящему изобретению с использованием раскрываемых в настоящем описании кДНК или их соответствующего фрагмента в качестве зонда для гибридизации по стандартным методикам гибридизации, предпочтительно в условиях высокой строгости гибридизации.

Специалисту в данной области понятно, что кроме природных аллельных вариантов последовательностей из АкрегдШик П1дсг. приведенных в настоящем описании, можно получить изменения за счет введения мутации в нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, с достижением изменений в аминокислотной последовательности фосфолипазного белка без существенного изменения функции белка.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагаются улучшенные варианты фосфолипазы. Улучшенные фосфолипазы представляют собой белки, в которых достигнуто улучшение по меньшей мере одной биологической активности. Такие белки могут быть получены при введении случайных мутаций по всей кодирующей последовательности или по ее части, таких как мутации, вводимые путем мутагенеза по механизму насыщения, при этом получаемые мутанты могут быть экспрессированы рекомбинантно и подвергнуты скринингу на биологическую активность. Например, в настоящей области имеются стандартные тесты для определения ферментативной активности фосфолипаз и таким образом быть отобраны улучшенные белковые варианты.

В предпочтительном варианте фосфолипаза имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15. В другом варианте фосфолипаза, по существу, гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15, и сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность фосфолипазы, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15, соответственно, но отличается по аминокислотной последовательности из-за наличия природных вариаций или за счет мутагенеза, описанного выше.

В другом предпочтительном варианте фосфолипаза имеет аминокислотную последовательность, кодируемую фрагментом выделенной нуклеиновой кислоты, способным гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, предпочтительно в условиях высокой строгости гибридизации. Соответственно, фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичностью к аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15.

В частности, фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере примерно на 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96,

97, 98, 99% или более гомологичностью к аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, или фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 6, или фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 9, или фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере примерно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичностью аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 12, или фосфолипаза представляет собой белок, который включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97,

98, 99% или более гомологична аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 15.

Функциональные эквиваленты белка по настоящему изобретению могут быть также идентифицированы, например, путем скрининга библиотек комбинаторных мутантов, например укороченных мутантов белка по настоящему изобретению на фосфолипазную активность. В одном варианте библиотеку мозаичных вариантов создают путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновой кислоты. Библиотека мозаичных вариантов может быть получена, например, путем энзиматического лигирования смеси синтетических олигонуклеотидов в генных последовательностях, так что множество потенциальных белковых последовательностей, определяемое вырожденностью кода, экспрессируется в виде отдельных полипептидов или, альтернативно, в виде набора более крупных белков слияния (например, для

- 14 008607 индикации фага). Имеется множество разнообразных способов, которые могут использоваться для создания библиотек возможных вариантов полипептидов по настоящему изобретению на основе вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Методы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны в данной области (см., например, №1гапд (1983) Те1гаИейгоп 39:3; Йакига е! а1. (1984) Аппи. Кеу. ВюсИет. 53: 323; Йакига е! а1. (1984) 8с1епсе 198: 1056; Ле е! а1. (1983) №.1с1е1с Ас1йк Век. 11:477).

Кроме того, библиотеки фрагментов кодирующей последовательности для полипептида по настоящему изобретению могут использоваться для создания мозаичной популяции полипептидов с целью скрининга путем отбора вариантов. Например, может быть создана библиотека фрагментов кодирующих последовательностей путем обработки нуклеазой двуцепочечного фрагмента интересующей кодирующей последовательности после ПЦР в условиях, когда одноцепочечные разрывы происходят только один раз на молекулу, с проведением впоследствии денатурации двуцепочечной ДНК, ренатурации ДНК с образованием двуцепочечной ДНК, которая может включать смысловые/антисмысловые пары из разных продуктов с ник-разрывами, удалением одноцепочечных частей из реформированных дуплексов путем обработки нуклеазой 81 и лигированием полученной библиотеки фрагментов в векторе экспрессии. С помощью этого способа может быть получена библиотека экспрессии, относящаяся к кодированию N концевых и внутренних фрагментов разного размера интересующего белка.

В данной области известно несколько методик скрининга генных продуктов в комбинаторных библиотеках, полученных путем точечных мутаций или процессирования, и скрининга библиотек кДНК для поиска генных продуктов, обладающих выбранным свойством. Наиболее часто используемые методики, которые позволяют осуществлять масштабный анализ при скрининге больших генных библиотек, включают в типичном случае клонирование генной библиотеки в реплицируемых векторах экспрессии, трансформацию подходящих клеток полученной библиотекой векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, при которых обнаружение желаемой активности облегчает выделение вектора, кодирующего ген, продукт которого был выявлен. Рекурсивный согласованный мутагенез (РСМ (КЕМ)) представляет собой методику, которая повышает частоту образования функциональных мутантов в библиотеке и которая может использоваться в сочетании с методами скрининга для идентификации белка по настоящему изобретению (Агкш апй Уоигуап (1992) Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 89: 7811-7815; Пе1дгауе е! а1. (1993) Рго!ет Епдшееппд 6(3): 327-331).

Для специалистов в данной области очевидно, что полиморфизм последовательности ДНК, ведущий к изменениям в аминокислотной последовательности фосфолипазы, может существовать только внутри данной конкретной популяции. Такой генетический полиморфизм может существовать в клетках из разных популяций или внутри отдельной популяции за счет наличия природных аллельных вариаций. Аллельные варианты могут также включать функциональные эквиваленты.

Фрагменты полинуклеотида по настоящему изобретению могут также включать полинуклеотиды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать в качестве зондов или праймеров для ПЦР.

Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, независимо от того, кодируют они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут использоваться в качестве зондов для гибридизации и в качестве праймеров для полимеразной цепьевой реакции (ПЦР). Использование молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которые не кодируют полипептид с фосфолипазной активностью, включает, в том числе, (1) выделение гена, кодирующего фосфолипазу по настоящему изобретению, или его аллельных вариантов из библиотеки кДНК, например из организмов, отличных от АкрегдШик шдег, (2) гибридизацию ΐπ кйи (например, по методике ΡΙ8Η) с метафазными хромосомными пластинками для обеспечения точной хромосомной локализации ФЛП03 гена, как описано в работе Верма с соавт. (Уегта е! а1., Нитап СИготокотек: а Мапиа1 о£ Вакю Тесйтдиек, Регдатоп Ргекк, №\ν Уогк (1988); (3) нозерн-блоттинговый анализ для выявления экспрессии мРНК фосфолипазы в специфических тканях и/или клетках и (4) использование зондов и праймеров в качестве диагностического инструмента для анализа наличия нуклеиновой кислоты, гибридизуемой с фосфолипазным зондом в данном биологическом образце (например, в ткани).

Настоящее изобретение также относится к способу получения функционального эквивалента гена или кДНК, кодирующих фосфолипазу. Такой способ связан с получением меченого зонда, который включает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полную последовательность или часть последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15 или ее варианта; с последующим скринингом библиотеки фрагментов нуклеиновой кислоты с меченым зондом в условиях, которые позволяют осуществлять гибридизацию зонда с фрагментами нуклеиновой кислоты из библиотеки с образованием дуплекса нуклеиновой кислоты и с образованием генной последовательности полной длины на основе фрагментов нуклеиновой кислоты от любого меченого дуплекса, что позволяет получить ген, родственный гену фосфолипазы.

В одном варианте нуклеиновая кислота по настоящему изобретению по меньшей мере на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14 или комплементарных последовательностей.

- 15 008607

В другом предпочтительном варианте полипептид по настоящему изобретению по меньшей мере на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичен аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15.

Хозяйские клетки

В другом варианте настоящее изобретение относится к клеткам, например трансформированным хозяйским клеткам или рекомбинантным хозяйским клеткам, которые содержат нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Термины трансформированная клетка или рекомбинантная клетка относятся к клетке, в которую (или в ее предшественник) была введена нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, например, по методике рекомбинантной ДНК. В область настоящего изобретения включаются и прокариотические, и эукариотические клетки, например бактерии, грибы, дрожжи и т.п., особенно предпочтительными клетками являются клетки нитчатых грибов, в частности АзрегдШиз шдег.

Может быть выбрана хозяйская клетка, которая модулирует экспрессию введенных последовательностей или модифицирует и процессирует генный продукт определенным, желательными образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессирование (например, расщепление) белковых продуктов могут способствовать оптимальному функционированию белка.

Различные клетки обладают характерными и специфическими механизмами для осуществления посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Могут быть выбраны соответствующие клеточные линии или системы хозяйских клеток, известные специалистам в области молекулярной биологии и/или микробиологии, которые обеспечивают желательную и корректную модификацию и процессинг экспрессированного чужеродного белка. Для указанных целей могут быть выбраны эукариотические хозяйские клетки, которые обладают клеточным механизмом для осуществления соответствующего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие хозяйские клетки известны в данной области.

Хозяйские клетки также включают, без ограничения, клеточные линии млекопитающих, такие как СНО, УЕКО, ВНК, НеЬа, СО8, МОСК, 293, 3Т3, ^138 и клеточные линии сосудистого сплетения (сйогсаб р1ехиз).

При необходимости, полипептиды по настоящему изобретению могут быть получены с помощью стабильно трансфицированной клеточной линии. Доступно множество векторов, пригодных для стабильной трансфекции клеток млекопитающих, и широко известны способы конструирования таких клеточных линий (см., например, АизиЬе1 е! а1., зирга).

Антитела

Настоящее изобретение также относится к антителам, таким как моноклональные или поликлональные антитела, которые специфически связаны с фосфолипазами по настоящему изобретению.

В контексте настоящего описания термины антитело (Ат) или моноклональное антитело (Мат) обозначают интактные молекулы, а также фрагменты антител (такие, как, например, ЕаЬ и Е(аЬ')₂ фрагменты), которые способны к специфическому связыванию с белком ФЛП03. ЕаЬ и Е(аЬ')₂ фрагменты утратили Ес-фрагмент интактного антитела, и, в этой связи, они быстрее удаляются из кровотока и характеризуются меньшей степенью неспецифического связывания с тканями, чем интактные антитела (\УаЫ е! а1., 1. №с1. Меб. 24: 316-325 (1983)). Таким образом, указанные фрагменты являются предпочтительными.

Антитела по настоящему изобретению могут быть получены с использованием множества способов. Например, клетки, экспрессирующие фосфолипазу и ее антигенный фрагмент, могут быть введены животному для индукции образования сыворотки, содержащей поликлональные антитела. В предпочтительном способе получают препарат фосфолипазы и очищают его с целью, по существу, полного освобождения от природных контаминантов. Такой препарат затем вводят в организм животного для образования поликлональной антисыворотки с большей удельной активностью.

В наиболее предпочтительном способе антитела по настоящему изобретению представляют собой моноклональные антитела (или их фрагменты, связывающиеся с фосфолипазой). Такие моноклональные антитела могут быть получены с использованием методики получения гибридом (КоШег е! а1., №-11иге 256:495 (1975); КоШег е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 6:511 (1976); НаттеШпд е! а1., Ιη: Мопос1опа1 АпйЬоб1ез апб Т-Се11 НуЬпботаз, Е1зеу1ег, Ν.Υ., рр. 563-681 (1981)). В целом, такие процедуры включают иммунизацию животного (предпочтительно мыши) белком по настоящему изобретению или клеткой, экспрессирующей белок по настоящему изобретению. Экстрагируют спленоциты из таких мышей и сливают их с соответствующей миеломной клеточной линией. В целях настоящего изобретения может использоваться любая подходящая миеломная клеточная линия, однако, предпочтительно использовать родительскую миеломную клеточную линию (8Р₂О), доступную из Американской Коллекции типовых культур (Атепсап Туре Си1Шге Со11есбоп, ВоскуШе, Магу1апб). После слияния полученные гибридомные клетки селективно поддерживают в среде НАТ и затем клонируют методом серийных разведений, как описано, например, в работе Вэндса с соавт. (ХУапбз е! а1. 6аз!го-еп!его1оду 80: 225-232 (1981)). Гибридомные клетки, полученные при таком отборе, затем анализируют для идентификации клонов, которые секретируют антитела, способные связывать белковый антиген ФЛП03. В основном, полипептиды могут быть связаны с белкомносителем, таким как КЕН, как описано в работе Аусубеля с соавт. (АизиЬе1 е! а1., зирга), в смеси с адъювантом и затем инъецированы в организм хозяина млекопитающего.

- 16 008607

В частности, различные животные-хозяева могут быть иммунизированы путем инъекции полипептида по настоящему изобретению. Примеры подходящих хозяйских организмов включают кроликов, мышей, морских свинок и крыс. Могут использоваться различные адъюванты для повышения иммунологического ответа, в зависимости от вида хозяйского организма, которые включают, без ограничения, адъювант Фрейнда (полный и неполный), адъюванты на основе минеральных гелей, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плуроновые полиоли, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол, вакцина БЦЖ (бацилла Кальмете-Герена) и СогупеЬас1егшт рагуцт. Поликлональные антитела представляют собой гетерогенную популяцию антительных молекул, получаемых из сыворотки иммунизированных животных.

Такие антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая 1дС, 1дМ, 1дЕ, 1дА, Ι§Ό и любой их подкласс. Гибридомы, продуцирующие Мат по настоящему изобретению, могут культивироваться ίη νίΐτο или ίη νίνο.

Поликлональные или моноклональные антитела после их получения тестируют на способность к специфическому распознаванию белка по настоящему изобретению или его функционального эквивалента в иммунологическом тесте, таком как вестерн-блоттинг или анализ на основе иммунопреципитации с использованием стандартных методик, описанных, например, в работе Аусубеля с соавт. (АикиЬе1 е1 а1., кирга). В настоящем изобретении используют антитела, которые специфически связываются с белком по настоящему изобретению или его функциональными эквивалентами. Например, такие антитела могут использоваться в иммунологическом анализе для выявления белка по настоящему изобретению в патогенных или непатогенных штаммах АкрегдШик (например, в экстрактах АкрегдШик).

Предпочтительно антитела по настоящему изобретению получают с использованием фрагментов белка по настоящему изобретению, которые могут обладать антигенностью, по таким критериям, как высокая частота встречаемости заряженных остатков. Например, такие фрагменты могут быть получены по стандартным методикам осуществления ПЦР и затем клонированы в векторе экспрессии рСЕХ (АикиЬе1 е1 а1., кирга). Белки слияния могут быть затем экспрессированы в Е.соБ и очищены с помощью аффинной матрицы на основе глютатионагарозы, как описано в работе Аусубеля с соавт. (АикиЬе1 е1 а1., кирга). При необходимости, для каждого белка может быть получено несколько слияний (например, два или три), и каждый такой белок слияния может быть инъецирован по меньшей мере двум кроликам. Образование антисыворотки может быть индуцировано серией инъекций, включающих в типичном случае три бустер-инъекции. В типичном случае антисыворотки тестируют на их способность к иммунопреципитации рекомбинантного полипептида ФЛП03 или его функциональных эквивалентов, тогда как неродственные белки могут служить контролем для оценки специфичности иммунной реакции.

Альтернативно, методики, описанные для получения одноцепочечных антител (патенты США №№ 4946778 и 4704692), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител к белку по настоящему изобретению или его функциональных вариантов. Наборы для создания и скрининга библиотек фаговой активности выпускаются, например, компанией Багтас1а.

Дополнительные примеры способов и реагентов, особенно пригодных для использования с целью создания и скрининга библиотеки антител, могут быть найдены в патентной литературе (патент США № 5223409; публикация РСТ Νο. νθ 92/18619; публикация РСТ Νο. νθ 91/17271; публикация РСТ Νο. \ν0 20791; публикация РСТ Νο. νθ 92/207 91; публикация РСТ Νο. νθ 92/15679; публикация РСТ Νο. νθ 93/01288; публикация РСТ Νο. νθ 92/01047; публикация РСТ Νο. νθ 92/09690; публикация РСТ Νο. νθ 90/02809; Бисйк е1 а1. (1991) Βΐο/ΤοΛηο^ 9: 1370-1372; Нау е1 а1. (1992) Нит. АпЙюб. ЩЬи^тав 3: 81-85; Нике е1 а1. (1989) Зс1епсе 246; 1275-1281; СгЖШк е1 а1. (1993) ЕМВ0 1. 12: 725-734).

Поликлональные и моноклональные антитела, которые специфически связываются с белком по настоящему изобретению или его функциональными эквивалентами, могут использоваться, например, для выявления экспрессии гена, кодирующего белок по настоящему изобретению или его функциональный эквивалент, например, в штамме, отличном от АкрегдШик. Например, белок по настоящему изобретению может быть без труда обнаружен методами традиционного иммунологического анализа клеток АкретдШик или их экстрактов. Примеры соответствующих методик включают, без ограничения, вестерн-блоттинг, ИФТФА, радиоиммуноанализ (РИА) и т.п.

Термин специфически связывается в контексте настоящего описания означает, что антитело распознает и связывается с конкретным антигеном, например белком по настоящему изобретению, но, по существу, не распознает и не связывается с другими неродственными молекулами в образце.

Антитела могут очищены, например, методами аффинной хроматографии, в которых полипептидный антиген иммобилизован на смоле.

Антитела (например, моноклональные антитела) к белку по настоящему изобретению могут использоваться для выделения белка стандартными методиками, такими как аффинная хроматография или иммунопреципитация. Кроме того, такие антитела могут использоваться для обнаружения белка (например, в клеточном лизате или супернатанте клеток) для оценки наличия и картины экспрессии белка. Антитела могут также использоваться в методах диагностики для оценки уровня белка в клетках или тканях как часть процедуры клинического тестирования, например для определения эффективности данного режима лечения или при диагностике аспергиллеза.

- 17 008607

Связывание антитела с выявляемым веществом может облегчать его обнаружение. Примеры выявляемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; примером люминесцентного материала является люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и акворин; примеры подходящих радиоактивных материалов включают ¹²⁵1, ¹³¹Ι, ³⁵§ или ³Н.

Предпочтительные эпитопы антигенного пептида представляют собой участки, которые расположены на поверхности белка, например гидрофильные участки. Для идентификации гидрофильных участков могут быть использованы карты гидрофобности белков.

Антигенный пептид или белок по настоящему изобретению включает по меньшей мере 7, предпочтительно 10, 15, 20 или 30 последовательных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15, и охватывают эпитоп белка, так что индуцированное против пептида антитело образует специфический иммунный комплекс с данным белком. Предпочтительные эпитопы, имеющиеся на антигенном пептиде, представляют собой участки белка по настоящему изобретению, которые расположены на поверхности белка, например гидрофильные участки, гидрофобные участки, участки, содержащие альфа-спирали, участки, содержащие бета-цепи или бета-складчатую конформацию, спиральные участки, участки с завитой структурой и гибкие участки.

Иммунологические анализы

Качественное или количественное определение белка по настоящему изобретению в биологическом образце может быть осуществлено с использованием любого известного в данной области метода. Методики, основанные на действии антител, имеют определенное преимущество при анализе уровня конкретного полипептида в биологическом образце. В таких процедурах специфическое распознавание обеспечивается первичным антителом (поликлональным или моноклональным), тогда как вторичная система обнаружения может использовать флуоресцентное антитело, энзимсвязанное антитело или другие конъюгированные вторичные антитела. В результате образуется иммунный комплекс.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу диагностики инфекции определенного организма АкрегдШик, включающего стадии:

выделения биологического образца из указанного организма, в отношении которого имеется подозрение на инфицирование АкрегдШик, проведения реакции указанного образца с антителом по настоящему изобретению, выявления наличия образованных иммунных комплексов.

Ткани могут быть также экстрагированы, например, с использованием мочевины и нейтрального детергента для высвобождения белка с целью использования в вестерн-блоттинге или дот/слот-анализе. Такие методики могут также применяться для анализа жидкостей организма.

Другие способы, основанные на использовании антител для выявления белка по настоящему изобретению, включают методы иммуноанализа, такие как иммуноферментный твердофазный анализ (ИФТФА) и радиоиммуноанализ (РИА). Например, моноклональные антитела к белку по настоящему изобретению могут использоваться как в качестве иммуносорбента, так и в качестве меченного ферментом зонда для обнаружения и количественного определения белка по настоящему изобретению. Количество конкретного белка, присутствующего в образце, может быть вычислено относительно его количества, присутствующего в стандартном препарате, с использованием компьютерного алгоритма линейной регрессии. В другом методе ИФТФА могут использоваться два разных специфических моноклональных антитела для выявления белка по настоящему изобретению в биологической жидкости. В рамках такого анализа одно из антител используют в качестве иммуносорбента, а второе - в качестве меченного ферментом зонда.

Указанные выше методики могут осуществляться, по существу, в режиме одностадийного или двустадийного анализа. Одностадийный анализ включает приведение в контакт белка по настоящему изобретению с иммобилизованным антителом с последующим приведением смеси, без промывки, в контакт с меченым антителом. Двустадийный анализ включает промывку перед осуществлением контакта смеси с меченым антителом. Другие традиционные способы также могут использоваться согласно потребности. Обычно бывает желательно иммобилизовать один компонент анализируемой системы на подложке, что позволяет привести другие компоненты системы в контакт с данным компонентом и затем легко удалить из образца.

Подходящие для мечения ферменты включают, например, ферменты оксидазной группы, которые катализируют образование перекиси водорода при взаимодействии с субстратом. Активность оксидазной метки может быть проанализирована путем измерения концентрации перекиси водорода, образуемого в реакции меченного ферментом антитела/субстрата.

Другие приемлемые метки, кроме ферментов, включают радиоактивные изотопы, такие как йод (¹²⁵Ι, ¹³¹Ι), углерод (¹⁴С), сера (³⁵8), тритий (³Н), индий (¹¹²1п) и технеций (^99тТс), а также флуоресцентные

- 18 008607 метки, такие как флуоресцеин и родамин, а также биотин.

Специфическое связывание исследуемого соединения с белком по настоящему изобретению может быть выявлено, например, ш νίΙΐΌ путем обратимой или необратимой иммобилизации белка по настоящему изобретению на субстрате, например на поверхности ячейки в 96-ячеечном полистироловом микротитрационном планшете. Способы иммобилизации полипептидов и других малых молекул известны в данной области техники. Например, микротитрационные планшеты могут быть покрыты белком по настоящему изобретению путем добавления к каждой ячейке белка в растворе (в типичном случае в концентрации 0,05-1 мг/мл в объеме 1-100 мкл) с последующей инкубацией планшетов при температуре от комнатной до 37°С в течение периода времени от 0,1 до 36 ч. Белки, которые не связываются с планшетом, могут быть удалены с избытком раствора из планшета путем встряхивания с последующей промывкой планшета (однократной или повторной) водой или буфером. В типичном случае полипептид содержится в воде или буфере. Затем планшет промывают буфером, который удаляет связанный полипептид. Для блокирования свободных сайтов связывания белка на планшетах на указанные планшеты вносят для блокирования белок, не родственный связанному полипептиду. Например, можно использовать 300 мкл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 2 мг/мл в Трис-НС1. Приемлемые субстраты включают такие субстраты, которые обладают определенной сшитой структурой (например, пластиковые субстраты, такие как полистироловые, стироловые или полипропиленовые субстраты, например, от компании Корнинг Костар (Согшпд Сок!аг Согр. (СатЬпбде, МА)). При желании, в качестве субстрата могут использоваться гранулярные частицы, например гранулярная агароза или гранулярная сефароза.

Связывание исследуемого соединения с белками по настоящему изобретению может быть обнаружено с помощью множества известных в технике способов. Так, например, в иммуноанализе может использоваться специфическое антитело. При необходимости, антитело может быть помечено (например, флуоресцентной или радиоизотопной меткой) и выявлено непосредственно (см., например, \Уек1 апб МсМаРоп, 1. Се11. Вю1. 74:264, 1977). Альтернативно, для выявления может использоваться второе антитело (например, меченое антитело, которое связывает Рс-часть антитела к А№7). В альтернативном способе обнаружения белок по настоящему изобретению метят (например, путем мечения белка по настоящему изобретению радиоактивным изотопом, флуорофором, хромофором и т.п.) и затем выявляют введенную метку. Еще в одном способе белок по настоящему изобретению получают в виде белка слияния с белком, который может быть выявлен оптическим методом, например с зеленым флуоресцентным белком (который может быть обнаружен в УФ-свете). В альтернативном методе белок по настоящему изобретению может быть ковалентно присоединен или слит с ферментом, обладающим выявляемой ферментативной активностью, таким как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, α-галактозидаза и глюкозооксидаза. Гены, кодирующие все такие ферменты, были клонированы и доступны специалистам в данной области для работы. При необходимости, белок слияния может включать антиген, и такой антиген может быть выявлен и количественно определен с помощью поликлонального или моноклонального антитела по традиционным методикам. Подходящие антигены включают ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, α-галактозидазу) и неферментативные полипептиды (например, сывороточные белки, такие как БСА и глобулины, а также белки молока, такие как казеины).

Эпитопы, антигены и иммуногены

В другом аспекте настоящее изобретение относится к пептиду или полипептиду, включающему эпитопсодержащую часть полипептида по настоящему изобретению. Эпитоп указанной части полипептида представляет собой иммуногенный или антигенный эпитоп полипептида по настоящему изобретению. Термин иммуногенный эпитоп определяется как часть белка, которая проявляет антительную реакцию, когда целый белок является иммуногеном. Считается, что указанные иммуногенные эпитопы ограничены несколькими локусами молекулы. С другой стороны, участок белковой молекулы, к которому может присоединяться антитело, определяется как антигенный эпитоп. Количество иммуногенных эпитопов в белке, в основном, меньше, чем количество антигенных эпитопов (см., например, Сеукеп, Н.М. е! а1., Ргос. №б. Асаб. 8сР И8А 81: 3998-4002 (1984)).

Что касается выбора пептидов или полипептидов, несущих антигенный эпитоп (то есть участок белковой молекулы, с которым может связаться антитело), то в данной области хорошо известно, что относительно короткие синтетические пептиды, которые имитируют часть белковой последовательности, обычно способны проявлять свойства антисыворотки, которая реагирует с частично имитированным белком (см., например, 8и!с11йе, РС. е! а1., 8с1епсе 219:660-666 (1984)). Пептиды, способные проявлять свойства сывороток, реактивных в отношении белка, которые зачастую отражаются в первичной последовательности белка, могут быть охарактеризованы набором простых химических правил, которые не ограничиваются ни иммунодоминантными участками интактных белков (например, иммуногенными эпитопами), ни амино- или карбоксильными концами. Пептиды, которые характеризуются чрезвычайной гидрофобностью, и пептиды, содержащие шесть или менее остатков, в основном, не эффективны с точки зрения индукции антител, которые связываются с имитированными белками; тогда как более длинные растворимые пептиды, особенно пептиды, содержащие пролиновые остатки, обычно эффективны (8и!с11йе е! а1., кирга, а! 661). Например, 18 из 20 пептидов, полученных в соответствии с методиками указанных

- 19 008607 руководств, которые содержат 8-39 остатков, охватывающих 75% последовательности полипептидной цепи гемагглютинина вируса гриппа НА1, индуцируют антитела, которые взаимодействуют с НА1 белком или интактным вирусом, и 12/12 пептидов на основе полимеразы МиЬУ и 18/18 на основе гликопротеина вируса бешенства индуцируют антитела, которые осаждают соответствующие белки.

В этой связи пептиды и полипептиды по настоящему изобретению, несущие антигенные эпитопы, могут использоваться для индукции антител, включая моноклональные антитела, которые специфически связываются с полипептидом по настоящему изобретению. Таким образом, высокая доля гибридом, получаемых при слиянии селезеночных клеток от доноров, иммунизированных пептидом с антигенным эпитопом, в основном, секретирует антитело, реактивное с нативным белком (§и!с11ГГе, е! а1., зирга, а! 663). Антитела, индуцированные пептидами или полипептидами, несущими антигенные эпитопы, используются для обнаружения имитированного белка, а антитела к различным пептидам могут использоваться для отслеживания метаболизма различных участков белкового предшественника, который подвергается посттрансляционному процессингу. Пептиды и непептидные антитела могут использоваться в различных качественных и количественных методах анализа имитированного белка, например в конкурентном анализе, поскольку было показано, что даже короткие пептиды (например, включающие около 9 аминокислот) могут связываться и замещать более крупные пептиды в тестах с иммунопреципитацией (см., например, ХСИзот Ι.Α., е! а1., Се11 37:767-778 а! 777 (1984)). Антитела к пептидам по настоящему изобретению также используются для очистки имитированного белка, например, с помощью абсорбционной хроматографии с использованием известных в данной области методов.

Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению, несущие антигенные эпитопы, разработанные в соответствии с указанными выше руководствами, предпочтительно содержат последовательность, включающую по меньшей мере 7, более предпочтительно по меньшей мере 9 и наиболее предпочтительно по меньшей мере от примерно 15 до примерно 30 аминокислот в составе аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению. Однако пептиды или полипептиды, включающие более крупный участок аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению, содержащие от примерно 30 до примерно 50 аминокислот, или участок любой другой длины, вплоть до полной аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению, также рассматриваются как пептиды или полипептиды по настоящему изобретению, несущие эпитопы, и также используются для индукции антител, которые взаимодействуют с имитированным белком. Предпочтительно аминокислотную последовательность пептида, несущего эпитопы, выбирают таким образом, чтобы обеспечить существенную растворимость в водных растворителях (например, последовательность включает относительно гидрофильные остатки, тогда как высоко гидрофобные последовательности предпочтительно не используются); и особенно предпочтительны последовательности, содержащие пролиновые остатки.

Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению, несущие эпитопы, могут быть получены традиционными способами получения пептидов или полипептидов, включая рекомбинантные способы с использованием молекул нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Например, короткая аминокислотная последовательность, несущая эпитоп, может быть слита с более крупным полипептидом, который действует как носитель в процессе рекомбинантного получения и очистки, а также в процессе иммунизации для индукции антител к пептиду.

Пептиды, несущие эпитоп, могут быть также синтезированы с использованием известных методов химического синтеза. Например, НоидЫеп описал простую методику синтеза большого числа пептидов, таких как по 10-20 мг 248 разных пептидов из 13 остатков, представляющих варианты сегмента НА1 полипептида по одной аминокислоте, который был получен и охарактеризован (в исследованиях по связыванию с использованием ИФТФА) менее чем за 4 недели (Ноидб!еп, К.А., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 82: 5131-5135 (1985)). Указанный процесс одновременного множественного пептидного синтеза (ОМПС) (81ти11апеоиз Ми1бр1е Рерббе 8уп!без1з (8МР8)) описан в патенте США № 4631211 (Ноидб!еп, е! а1. (1986)). В этой процедуре отдельные смолы для твердофазного синтеза различных пептидов содержатся в отдельных пакетах, проницаемых для растворителя, что позволяет оптимально использовать многие идентичные повторяющиеся стадии, входящие в методики твердофазного синтеза. Полностью ручная процедура позволяет осуществлять одновременно 500-1000 или более синтезов (Ноидб!еп, е! а1., зирга, а! 5134).

Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению, несущие эпитоп, могут использоваться для индукции антител по настоящему изобретению в соответствии с методиками, известными в данной области (см., например, 8и!сбГГе е! а1., зирга; ХУПзоп е! а1., зирга; Сботе, М. е! а1., Ргос. Ν;·ι11. Асаб. δα. И8А 82: 910-914; апб Вббе, Р.1. е! а1., 1. Сеп. Убо1. 66: 2347-2354 (1985)). В целом, в соответствии с указанными методиками животные могут быть иммунизированы свободным пептидом; однако, титр антител к пептиду может быть получен бустинг-инъекцией при связывании пептида с макромолекулярным носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (ГЛУ) или столбнячный токсин. Например, пептиды, содержащие цистеин, могут быть связаны с носителем с использованием линкера, такого как малеимидобензоил-№гидроксисукцинимидный эфир (МБС), тогда как другие пептиды могут быть связаны с носителем с использованием более универсального связывающего средства, такого как глутаральдегид. Животных, таких как кролики, крысы и мыши, иммунизируют либо свободным пептидом, либо связанным с носителем, например, путем внутрибрюшинной и/или внутрикожной инъекции эмульсий, содержащих пример- 20 008607 но 100 мкг пептидного или белкового носителя и адъюванта Фрейнда. Может потребоваться несколько бустинг-инъекций, например, с интервалами примерно 2 недели для достижения полезного титра антител к белку, который может быть обнаружен, например, методом ИФТФА с использованием свободного пептида, сорбированного на твердой поверхности. Титр антител к пептиду в сыворотке иммунизированного животного может быть повышен при отборе противопептидных антител путем сорбции пептида на твердой подложке и элюции выбранных антител по известным в технике методикам.

Пептиды по настоящему изобретению, несущие иммуногенный эпитоп, то есть те части белка, которые проявляют антительную реакцию, когда целый белок является иммуногеном, идентифицируют по известным в технике методикам. Например, Гейсен с соавт. (Сеукеп е1 а1., кирга 1984) описывает процедуру быстрого одновременного синтеза на твердых подложках сотен пептидов с достаточной степенью чистоты, способных демонстрировать реакцию в иммуноферментном твердофазном анализе. При этом взаимодействие синтезированных пептидов с антителами легче выявляется без удаления их с подложки. В таком варианте пептид, несущий иммуногенный эпитоп желаемого белка, может быть идентифицирован обычными способами специалистом со средним уровнем знаний в данной области. Например, Гейсен с соавт. (Сеукеп е1 а1.) локализовал иммунологически важный эпитоп в белке оболочки вируса ящура с разрешением 7 аминокислот путем синтеза перекрывающегося набора из всех 208 возможных гексапептидов, охватывающих полностью последовательность белка из 213 аминокислот. Затем был синтезирован полный набор замещающих пептидов, в котором все 20 аминокислот были, в свою очередь, замещены по каждому положению внутри эпитопа, и были определены конкретные аминокислоты, придающие специфичность реакции с антителом. Таким образом, этим способом были получены пептидные аналоги пептидов по настоящему изобретению, несущих эпитоп. В патенте США № 4708781 (Сеукеп (1987)) описан также способ идентификации пептида, несущего иммуногенный эпитоп желаемого белка.

Кроме того, в патенте США № 5194392 (Сеукеп (1990)) описывается общий способ выявления или определения последовательности мономеров (аминокислот или других соединений), которые топологически эквивалентны эпитопу (например, мимотопу), который комплементарен конкретному паратопу (антигенсвязывающему сайту) целевого антитела. В более общей форме в патенте США № 4433092 (Сеукеп (1989)) описывается способ выявления или определения последовательности мономеров, которая является топографическим эквивалентом лиганда, комплементарного к сайту связывания лиганда конкретного целевого рецептора. Аналогично в патенте США № 5480971 (НоидЫеи, КА. е1 а1. (1996) 0п Рега1ку1а1еБ 01щорерНБе М1х1игек) раскрываются линейные С1-С₇-алкильные пералкилированные олигопептиды, а также наборы и библиотеки таких пептидов и способы использования таких наборов и библиотек для определения последовательности пералкилированного пептида, который предпочтительно связывается с акцепторной целевой молекулой. Таким образом, с помощью указанных способов могут быть получены непептидные аналоги пептидов по настоящему изобретению, несущих эпитоп.

Применение фосфолипаз в промышленных процессах

Настоящее изобретение также относится к применению фосфолипазы по настоящему изобретению в ряде промышленных и фармацевтических способов. Хотя накоплен длительный опыт осуществления этих способов, фосфолипаза по настоящему изобретению, тем не менее, имеет множество существенных преимуществ в сравнении с ферментами, используемыми в настоящее время. В зависимости от конкретного варианта применения, такие преимущества могут включать аспекты, связанные с меньшими затратами на производство продукции, большей специфичностью к субстрату, меньшими антигенными свойствами, менее выраженными нежелательными явлениями, большим выходом при получении в соответствующем микроорганизме, более удобным диапазоном приемлемых рН и температуры, лучшим вкусом готового продукта, а также аспекты, связанные с качеством пищи и ее кошерными свойствами.

Важный аспект фосфолипаз по настоящему изобретению заключается в том, что они охватывают широкий диапазон оптимальных значений рН и температуры, которые идеально подходят для множества направлений их применения. Например, во многих крупномасштабных процессах выгодно использовать относительно высокие температуры: 50°С или выше, например, для снижения риска микробного заражения. Некоторые фосфолипазы по настоящему изобретению удовлетворяют такому требованию, но в то же время они не обладают достаточным уровнем термостабильности, чтобы противостоять последующей инактивации путем дополнительной тепловой обработки. Последняя особенность позволяет осуществлять режим производства, который приводит к получению готовых продуктов, таких как хлебобулочные изделия, не содержащих следов ферментативной активности. Кроме того, многие пищевые и кормовые продукты имеют слегка кислые значения рН, так что для их обработки предпочтительны фосфолипазы с кислым или почти нейтральным оптимумом рН. Фосфолипазы по настоящему изобретению соответствуют также и такой потребности.

Фосфолипазы по настоящему изобретению могут найти применение в любом практическом варианте, где желательно гидролизовать фосфолипид или получить специфические продукты его расщепления. Так, например, полипептиды по настоящему изобретению позволяют получать лизофосфолипиды, диацилглицерины, холин- или этаноламинфосфаты, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин и различные фосфатидаты. Фосфолипазы по настоящему изобретению предпочтительно используют при значении рН, оптимальном для их активности.

- 21 008607

Фосфолипазы по настоящему изобретению могут использоваться для дегумирования водного раствора или взвеси углеводов для улучшения свойств фильтруемости, в частности гидролизата крахмала и особенно гидролизата пшеничного крахмала, который трудно фильтруется и дает мутные фильтраты.

Обработка может проводиться с использованием известных в технике методов. См., например, ЕР-А219269 и ЕР-А-808903.

Фосфолипазы по настоящему изобретению могут использоваться в способе снижения содержания фосфолипидов в пищевом масле путем обработки масла полипептидом для гидролиза основной части фосфолипида и отделения водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид, от масла. Такой способ применим для очистки любого пищевого масла, которое содержит фосфолипид, например растительного масла, такого как соевое масло, рапсовое масло и подсолнечное масло. Перед обработкой фосфолипазой масло предпочтительно подвергают предварительной обработке для удаления слизи (растительного клея), например, путем влажного рафинирования. В типичном случае масло содержит 50-250 м.д. фосфора в виде фосфолипида в начале обработки фосфолипазой, тогда как обработка может снизить уровень фосфора до значений менее 5-10 м.д.

Обработку фосфолипазой проводят при диспергировании водного раствора фосфолипазы, предпочтительно в виде капелек со средним диаметром менее 10 мкм. Количество воды составляет предпочтительно 0,5-5 мас.% относительно масла. Может быть необязательно добавлен эмульгатор. Может быть также применено механическое перемешивание для поддержания эмульсии.

Фосфолипазную обработку проводят в диапазоне рН от примерно 3,5 до примерно 5 с целью максимизации действия фермента, или может использоваться рН в диапазоне от примерно 1,5 до примерно 3 (например, 2-3) для подавления щелочного гидролиза триглицеридов (сапонификации). Соответствующее значение рН может быть доведено при добавлении лимонной кислоты, цитратного буфера или хлористо-водородной кислоты. Приемлемая температура составляет, в основном, 30-70°С (в частности, 3045°С, например 35-40°С). Время реакции составляет в типичном случае 1-12 ч (например, 2-6 ч). Подходящая дозировка фермента составляет 0,1-10 мг на литр (например, 0,5-5 мг на литр). Фосфолипазная обработка может проводиться периодически в партиях, например, в чане при перемешивании или может осуществляться в непрерывном режиме, например, в серии реакторов при перемешивании. После фосфолипазной обработки проводят разделение водной фазы и масляной фазы. Разделение может осуществляться традиционными способами, например путем центрифугирования. Водная фаза будет содержать фосфолипазу, при этом фермент может повторно использоваться для повышения экономичности процесса. Обработка может проводится с использованием любой известной в технике методики. См., например, патент США № 5264367, ЕР-А-654527, 1Р-А-153997.

Хлебобулочные изделия получают из теста, которое обычно делают из базовых ингредиентов, включающих муку, воду и необязательно соль. В зависимости от вида хлебобулочных изделий, другими необязательными ингредиентами могут быть сахара, вкусовые вещества и т.п. Для получения продуктов из разрыхленного теста используют преимущественно пекарские дрожжи, а также химические разрыхляющие системы, такие как сочетание кислоты (выделяющее ее соединение) и бикарбонат. Для улучшения свойств теста, способствующих обработке и/или улучшающих качество готовых хлебобулочных изделий, предпринимаются непрерывные попытки по разработке процессов, способствующих улучшению таких свойств. Свойства теста, подлежащие улучшению, включают его податливость к машинной обработке, способность удерживать газ и т. п. Свойства хлебобулочных изделий, которые могут быть улучшены, включают объем батона, хрустящие свойства корочки, крошливую структуру и мягкость, вкус, запах и срок годности. Существующие в настоящее время вспомогательные средства для обработки могут быть разделены на две группы: химические добавки и ферменты.

Химические добавки, направленные на улучшение таких свойств, включают окислители, такие как аскорбиновая кислота, бромат и азодикарбонат, восстановители, такие как Ь-цистеин и глютатион, эмульгаторы, действующие в качестве кондиционеров теста, такие как диацетилвинные эфиры моно/диглицеридов (ДАВЭМ), стеароиллактилат натрия (СЛН) или стеароиллактилат кальция (СЛК), или действующие в качестве смягчителей мякиша, такие как моностеарат глицерина (МСГ), жирные материалы, такие как триглицериды (жир) или лецитин, и другие.

В настоящее время наблюдается тенденция к замене химических добавок ферментами. Последние рассматриваются как более натуральные соединения и, в этой связи, более приемлемые для потребителей. Подходящие ферменты могут быть выбраны из группы, состоящей из ферментов, разлагающих крахмал, ферментов, разлагающих арабиноксилан- и другие гемицеллюлозы, ферментов, разлагающих целлюлозу, окислительных ферментов, ферментов, расщепляющих жирный материал, и ферментов деградации белка.

Настоящее изобретение также относится к способам приготовления теста или хлебобулочного изделия, включающим введение в тесто эффективного количества фосфолипазы по настоящему изобретению, которое улучшает одно или более свойств теста или хлебобулочного изделия, получаемого из этого теста, в сравнении с тестом или хлебобулочным изделием без включения указанного полипептида.

Фраза введение в тесто в контексте настоящего описания означает добавление фосфолипазы по настоящему изобретению к тесту, любому ингредиенту, из которого может быть получено тесто, и/или

- 22 008607 любой смеси ингредиентов, из которой изготавливается тесто. Иными словами, фосфолипаза по настоящему изобретению может быть добавлена на любой стадии приготовления теста, причем она может быть добавлена на одной, двух или более стадиях. Фосфолипазу по настоящему изобретению добавляют к ингредиентам теста, которые замешиваются и используются для выпечки хлебобулочных изделий по известным в технике способам. См., например, патент США № 4567046, ЕР-А-426211, ДР-А-60-78529, ДРА-62-111629 и ДР-А-63-258528.

Термин эффективное количество в контексте настоящего описания обозначает количество фосфолипазы по настоящему изобретению, которого достаточно для появления измеряемого эффекта по меньшей мере одного требуемого свойства теста или хлебобулочного изделия.

Термин улучшенное свойство в контексте настоящего описания обозначает любое свойство теста и/или продукта, получаемого из теста, в частности хлебобулочного изделия, которое улучшается под действием фосфолипазы по настоящему изобретению в сравнении с тестом или продуктом, не содержащим фосфолипазу по настоящему изобретению. Улучшенное свойство может включать, без ограничения, повышенную силу теста, повышенную эластичность теста, повышенную стабильность теста, сниженную липкость теста, улучшенную растяжимость теста, улучшенный запах хлебобулочного продукта, повышенную устойчивость хлебобулочного изделия против черствения.

Улучшенное свойство может быть выявлено при сравнении теста и/или хлебобулочного изделия, приготовленного при добавлении или без добавления полипептида по настоящему изобретению в соответствии со способами согласно изобретению, которые описаны ниже в примерах. Органолептические показатели могут быть оценены с использованием процедур, известных в хлебобулочной промышленности, и могут включать, например, использование набора тестеров вкуса.

Термин повышенная сила теста в контексте настоящего описания обозначает свойство теста, которое имеет отношение к большей эластичности и/или определяет потребность в более сильном воздействии для формования теста.

Термин повышенная эластичность теста в контексте настоящего описания обозначает свойство теста, которое определяет повышенную тенденцию теста восстанавливать исходную форму после действия на него некоторого физического усилия.

Термин повышенная стабильность теста в контексте настоящего описания обозначает свойство теста, которое определяет меньшую чувствительность к механической деформации, что позволяет лучше поддерживать его форму и объем.

Термин сниженная липкость теста в контексте настоящего описания означает свойство теста, которое определяет меньшую тенденцию прилипать к поверхностям, например, при машинном замешивании теста, и эту способность либо оценивается эмпирически опытным пекарем, либо ее измеряют с помощью анализатора консистенции (например, ТАХТ2), известного в данной области техники.

Термин улучшенная растяжимость теста в контексте настоящего описания обозначает свойство теста, которое определяет его способность поддаваться усилию или растяжению без разрыва.

Термин улучшенная машинабельность теста в контексте настоящего описания обозначает свойство теста, которое определяет его меньшую липкость, и/или большую плотность, и/или большую эластичность.

Термин повышенный объем хлебобулочного изделия измеряется как удельный объем данной буханки хлеба (объем/вес), определяемый в типичном случае по традиционному способу смещения с использованием рапса.

Термин улучшенная консистенция мякиша хлебобулочного изделия в контексте настоящего описания обозначает свойство хлебобулочного изделия, определяющее наличие мелких и/или тонких ячеек в мякише и/или более однородное/гомогенное распределение таких ячеек в мякише, и обычно оценивается эмпирически опытным пекарем.

Термин улучшенная мягкость хлебобулочного изделия означает свойство, противоположное твердости, и определяется в контексте настоящего описания как способность хлебобулочного изделия поддаваться более легкому прессованию, которая оценивается либо эмпирически опытным пекарем, либо определяется при использовании анализатора консистенции (например, ТАХТ2), известного в данной области техники.

Термин улучшенный вкус хлебобулочного изделия определяется дегустационной комиссией.

Термин повышенная устойчивость хлебобулочного изделия против черствения определяется в контексте настоящего описания как свойство хлебобулочного изделия, которое определяет сниженную скорость ухудшения параметров его качества, таких как мягкость и/или эластичность, при хранении.

Термин тесто в контексте настоящего описания определяется как смесь муки и других ингредиентов, достаточно твердая для замешивания и раскатывания. Тесто может быть свежим, замороженным, подвергнутым предварительному осаждению и предварительной выпечке. Получение замороженного теста описано Кульпом и Лоренцом (Ки1р апб Боген/ ш Его/еп апб ВеГпдеШеб Иоидйк апб ВаБегк).

Термин хлебобулочное изделие в контексте настоящего описания определяется как любой продукт, полученный из теста, либо мягкого, либо хрустящего характера. Примеры хлебобулочных изделий белого, светлого или темного типа, которые могут с успехом быть получены по настоящему изобретению, включают хлеб (в частности, белый, на основе муки из цельного зерна или рисовый хлеб), обычно в

- 23 008607 форме буханок или булочек, батонов типа французского багета, изделий из макаронного теста, лаваша, плоских маисовых лепешек, маисовых лепешек с начинкой, кексов, блинов, бисквитов, печенья, пирогов, заварного хлеба, хрустящих хлебцев и т.п.

Фосфолипазы по настоящему изобретению и/или дополнительный фермент, используемые в способах настоящего изобретения, могут иметь любую форму, пригодную для данного направления использования, например могут иметь вид сухого порошка, агломерированного порошка или гранулята, в частности обеспыленного гранулята, жидкости, в частности стабилизированной жидкости, или защищенного фермента, такого как описан в XV0 01/11974 и XV0 02/26044. Грануляты и агломерированные порошки могут быть получены традиционными способами, например путем разбрызгивания фосфолипазы по настоящему изобретению на носитель в грануляторе с псевдоожиженным слоем. Носитель может состоять из ядра, включающего частицы соответствующего размера. Указанный носитель может быть растворимым или нерастворимым, представляя собой, например, соль (такую, как №1С1 или сульфат натрия), сахар (такой, как сахароза или лактоза), сахарный спирт (такой, как сорбит), крахмал, рис, кукурузную крупу или сою. Фосфолипаза по настоящему изобретению и/или дополнительные ферменты могут входить в состав композиции с медленным высвобождением. Способы получения композиции с медленным высвобождением известны в данной области техники. Добавление приемлемых для пищевых продуктов стабилизаторов, таких как сахар, сахарный спирт или другой полиол и/или молочная кислота или другая органическая кислота, в соответствии с известными способами могут, в частности, способствовать стабилизации препаратов жидкого фермента.

Фосфолипазы по настоящему изобретению могут быть также включены в дрожжевые композиции, как описано, например, в ЕР-А 0619947, ЕР-А-0659344 и Χν0 02/49441.

Для введения муки в предварительно приготовленную смесь предпочтительно, чтобы полипептид по настоящему изобретению имел вид сухого продукта, например обеспыленного гранулята, тогда как для введения ее вместе с жидкостью предпочтительно, чтобы он был в жидкой форме.

В тесто могут быть включены один или более дополнительных ферментов. Дополнительные ферменты могут быть любой природы, включая в качестве источника организм млекопитающего и растения, и предпочтительно микробного происхождения (из бактерий, дрожжей или грибов), которые могут быть получены по известным в данной области методикам.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительный фермент может представлять собой амилазу, такую как альфа-амилазу (используемую для получения сахаров, ферментируемых дрожжами, и замедления черствения) или бета-амилазу, циклодекстринглюканотрансферазу, пептидазу, в частности экзопептидазу (используемую для усиления вкуса), трансглутаминазу, липазу (используемую для модификации липидов, имеющихся в тесте или его компонентах, для смягчения теста), фосфолипазу, целлюлазу, гемицеллюлазу, в частности пентозаназу, такую как ксиланаза (используемую для частичного гидролиза пентозанов, что повышает растяжимость теста), протеазу (используемую для ослабления клейковины, в частности, в случае твердых сортов пшеницы), дисульфидизомеразу белка, например дисульфидизомеразу белка, описанную в XV0 95/00636, гликозилтрансферазу, пероксидазу (используемую для улучшения консистенции теста), лакказу или оксидазу, например глюкозооксидазу, гексозооксидазу, альдозооксидазу, пиранозооксидазу, липоксигеназу или оксидазу Ь-аминокислоты (используемую для улучшения консистенции теста).

В том случае, когда в соответствии со способами согласно изобретению добавляется одна или более дополнительных ферментативных активностей, указанные активности могут вводиться отдельно или вместе с полипептидом по настоящему изобретению, необязательно в качестве компонента(ов) композиции, улучшающего(их) качество хлебобулочных изделий и/или теста. Другие ферментативные активности могут представлять собой любую ферментативную активность из приведенного выше перечня и могут вводиться в дозе, установленной в хлебопекарной практике.

Настоящее изобретение также относится к способам получения хлебобулочного изделия, включающим выпечку теста, получаемого по способу согласно изобретению с получением хлебобулочного продукта. Выпечка теста с получением хлебобулочного изделия может проводиться с использованием известных в технике методов.

Настоящее изобретение также относится к тесту и хлебобулочным изделиям, соответственно, получаемым по способу согласно изобретению.

Настоящее изобретение также относится к предварительно приготовленной смеси, например к мучной смеси для приготовления теста и/или выпечки из теста хлебобулочных изделий, где указанная предварительно приготовленная смесь включает полипептид по настоящему изобретению. Термин предварительно приготовленная смесь в контексте настоящего описания понимается в традиционном значении, то есть как смесь хлебопекарных средств, включающих, в основном, муку, которая может использоваться не только на заводах/устройствах для крупномасштабной выпечки хлеба, но также в небольших пекарнях. Предварительно приготовленная смесь может быть получена при смешивании полипептида или композиции, улучшающей качество хлебобулочных изделий и/или теста по настоящему изобретению, которая включает полипептид в сочетании с соответствующим носителем, таким как мука, крахмал, сахар или соль. Предварительно приготовленная смесь может содержать другие добавки для улучшения

- 24 008607 качества теста и/или хлебобулочных изделий, например любые добавки из указанного выше перечня, включая ферменты.

Настоящее изобретение также относится к добавкам для выпечки хлебобулочных изделий в виде гранулята или агломерированного порошка, которые включают полипептид по настоящему изобретению. Добавки для выпечки хлебобулочных изделий предпочтительно характеризуются узким диапазоном распределения размера частиц, где более 95 мас.% частиц имеет размер в диапазоне от 25 до 500 мкм.

Способ согласно изобретению в аспекте изготовления теста и хлебобулочных изделий может использоваться в сочетании с указанными выше средствами, улучшающими обработку, такими как химические вспомогательные средства типа окислителей (например, аскорбиновая кислота), восстановители (например, Ь-цистеин), оксидоредуктазы (например, глюкозооксидаза) и/или другие ферменты, такие как ферменты модификации полисахаридов (например, α-амилаза, гемицеллюлаза, разветвляющие ферменты и т.п.) и/или ферменты модификации белка (эндопротеаза, экзопротеаза, разветвляющие ферменты и т.п.).

Пример 1. Ферментация АкретдШик пщег.

Фосфолипазы, кодируемые нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, получают путем конструирования плазмид экспрессии, содержащих последовательности ДНК, трансформации штамма А. шдет указанной плазмидой и выращивания штаммов АкрещШик шдет указанным ниже способом.

Свежие споры (10⁶-10⁷) штаммов А. шдет инокулируют в 20 мл С8Ь-среды (колба на 100 мл с отражательной перегородкой), выращивают в течение 20-24 ч при 34°С и скорости качания 170 об./мин. После инокуляции 5-10 мл С8Ь предкультуры в 100 мл среды С8М (колба на 500 мл с отражательной перегородкой) штаммы ферментируют при 34°С и скорости качания 170 об./мин в течение 3-5 дней.

Бесклеточные супернатанты получают при центрифугировании в пробирках Грейнера на 50 мл (30 мин, 5000 об./мин). Супернатанты подвергают предварительному фильтрованию через стеклянный микроволоконный фильтр СГ/А \У11а1тап (150 мм для удаления крупных частиц, доводят (при необходимости) значение рН до 5 с помощью 4н. КОН и подвергают стерильному фильтрованию через фильтр с размером пор 0,2 мкм (насаженный на верх бутыли) с отсосом для удаления грибного материала. Супернатант хранят при 4°С (или при -20°С).

С8Ь среда состоит из (в количестве на литр): 100 г твердой кукурузной замочной жидкости (Кодиейе), 1 г №1Н₂РО₄ х Н₂О, 0,5 г Мд8О₄ х 7Н₂О, 10 г глюкозы х Н₂О и 0,25 г пеногасителя Базилдон (Вакйбоп). Ингредиенты растворяют в деминерализованной воде и доводят значение рН до 5,8 с использованием №1ОН или Н₂8О₄; колбы на 100 мл с отражательной перегородкой и пенными шариками заполняют 20 мл ферментированного бульона и стерилизуют в течение 20 мин при 120°С, после чего к каждой колбе, охлажденной до комнатной температуры, добавляют 200 мкл раствора, содержащего 5000 МЕ/мл пенициллина и 5 мг/мл стрептомицина.

Среда С8М состоит из (в количестве на литр): 150 г мальтозы х Н₂О, 60 г пептона Сойтон (8оу!опе), 1 г NаН₂РО₄ х Н₂О, 15 г Мд8О₄ х 7Н₂О, 0,08 г Твина 80, 0,02 г пеногасителя Базилдон (Вакйбоп), 20 г МЕ8, 1 г Ь-аргинина. Ингредиенты растворят в деминерализованной воде и доводят значение рН до 6,2 с использованием №ЮН или Н₂8О₄; колбы на 500 мл с отражательной перегородкой и пенными шариками заполняют 100 мл ферментированного бульона и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120°С, после чего к каждой колбе, охлажденной до комнатной температуры, добавляют 1 мл раствора, содержащего 5000 МЕ/мл пенициллина и 5 мг/мл стрептомицина.

Пример 2. Очистка фосфолипаз по настоящему изобретению.

Стадия 1. Получение ультрафильтратов.

Супернатанты культур, полученных в примере 1, подвергают ультрафильтрации для удаления низкомолекулярных загрязняющих примесей, которые могут мешать проведению тестов для определения ферментативной активности и качества выпечной продукции. Ультрафильтрацию 30 мл супернатанта проводят в системе М1Шроте ЬаЬкса1е ТРР, снабженной фильтром для отсечения молекулярной массы от 10 кДа.

Образцы, в зависимости от их цвета, промывают 3-5 раз с использованием 40 мл охлажденного 100 мМ фосфатного буфера при рН 6,0, включающего 0,5 мМ СаС1₂. Конечный объем ферментного раствора, который далее фигурирует в описании как ультрафильтрат, составляет 30 мл.

Стадия 2. Определение концентрации фосфолипазы с использованием системы ВЭГФ по поглощению при длине волны А280.

Концентрацию фосфолипазы в ультрафильтрате вычисляют на основе величины экстинкции при 280 нм (А280), определяемой поглощением фосфолипазы, и далее вычисляют коэффициент молекулярной экстинкции фосфолипазы. Вычисление А280 проводят на спектрофотометре Ш1коп ХЬ 8есотат (Веип бе Копбе, АЬсоибе, Нидерланды).

Коэффициент молекулярной экстинкции может быть вычислен, исходя из количества остатков тирозина, триптофана и цистеина на молекулу фермента (8.С. СШ апб Р.Н. νοη Н1рре1, Апа1. Вюсйет. 182, 319-326 (1989)). Коэффициент молекулярной экстинкции указанных аминокислот составляет 1280, 5690 и 120 1/М х см, соответственно. Данные о количестве остатков тирозина, триптофана и цистеина в фосфолипазе по настоящему изобретению могут быть получены на основании белковых последовательностей, выбранных из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ NО: 3, 6, 9, 12 и 15. Ниже в табл. 1 приведены вычисленные коэффициенты молекулярной экстинкции фосфолипаз по настоящему изобретению.

- 25 008607

Таблица 1

Фосфолипаза	ЗЕО ΙΌ N0:	Аминокислоты	Вычисленный м. в. (Да)	Вычисленный коэффициент экстинкции при 280 нм
Тгр	Туг	Суз	М-1 х см-1	(1 мг/мл) -1х см’1
ФЛПОЗ	3	7	22	4	49683	165490	3,3
ФЛП06	6	6	10	7	31694	91880	2,9
ФЛП15	9	11	27	9	68440	217300	3,2
ФЛП26	12	16	23	8	68255	222870	3,3
ФЛП34	15	12	28	8	70320	228560	3,3

Экстинкция ультрафильтрата при длине волны 280 нм (А280), определяемая фосфолипазой, зависит от чистоты ферментного образца. Указанная чистота определяется с помощью ВЭГФ (НР8ЕС) (высокоэффективной гельпроникающей хроматографии) на колонке Т8К 8\\⁷-Х1. (300х7,8 мм; диапазон исключаемого размера 10-300 кДа). Элюирующий буфер состоит из 25 мМ натрийфосфатного буфера, рН 6,0, который пропускают через колонку со скоростью 1 мл/мин. Инъецируют образцы по 5-100 мкл. Далее измеряют поглощение при длине волны 280 нм.

Величину поглощения А280 в ультрафильтрате, определяемую фосфолипазой по настоящему изобретению, вычисляют на основе отношения площади пика, соответствующего пику фосфолипазы на хроматограмме, к общей площади пиков, поглощающих при 280 нм. Далее вычисляют концентрацию фосфолипазы, умножая величину А280 ультрафильтрата на коэффициент указанного выше отношения и деля на вычисленный коэффициент экстинции (1 мг/мл раствора значение в самой правой колонке табл. 1) для каждой фосфолипазы.

Пример 3. Измерение активности.

В ультрафильтратах, полученных по процедуре примера 2, измеряют активности следующих ферментов: фосфолипазы А1 или А2;

лизофосфолипазы;

фосфолипазы С; галактолипазы; грибной альфа-амилазы.

Активность фосфолипазы А определяют спектрофотометрически с использованием в качестве субстрата 1,2-дитиодиоктаноилфосфатидилхолина. Фосфолипаза А гидролизует сульфидную связь в положении 1 (ФЛА1) или в положении 2 (ФЛА2), высвобождая тем самым 4-тиооктановую кислоту, которая в следующей реакции вступает во взаимодействие с 4,4'-дитиопиридином с образованием 4-тиопиридона. Последнее соединение находится в таутомерном равновесии с 4-меркаптопиридином, который поглощает при длине волны 334 нм. Данную реакцию проводят в 0,1М ацетатном буфере при рН 4,0 с добавкой 0,2% Тритона-Х100 при температуре 37°С. 1 единицу активности фосфолипазы А (ФЛА) определяют как количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль 4-тиооктановой кислоты в минуту в указанных выше условиях реакции.

Активность лизофосфолипазы определяют методом ³¹Р-ЯМР спектроскопии с использованием в качестве субстрата лизофосфатидилхолина. Лизофосфолипаза гидролизует сложноэфирную связь, высвобождая тем самым жирную кислоту из глицеринового фрагмента. Полученный таким образом глицеринфосфохолин количественно определяют по методу ЯМР.

Реакцию проводят в 50 мМ ацетатном буфере при рН 4,5, который содержит также 1 мг/мл лизофосфатидилхолина и 5 мМ СаС1₂, в течение 30 мин при 55°С.

единицу активности лизофосфолипазы (РРС) определяют как количество фермента, которое в указанных условиях реакции образует 1 мкмоль 4-глицеролфосфохолина в минуту.

Активность фосфолипазы С определяют спектрофотометрически с использованием в качестве субстрата паранитрофенилфосфорилхолина. Фосфолипаза С гидролизует сложноэфирную связь, высвобождая паранитрофенол, который поглощает при длине волны 405 нм.

Указанную реакцию проводят в 100 мМ ацетатном буфере при рН 5,0, который содержит также 20 мМ СаС1₂, 0,25% Тритона-Х100 и 20 мМ паранитрофенилфосфорилхолина, при 37°С в течение 7 мин. Указанную реакцию останавливают и повышают рН добавлением к 1 объему реакционной смеси 0,75 объема 1М раствора Трис, после чего измеряют экстинкцию при длине волны 405 нм (ε_{405 нм}=18500 М^-1 х см^-1).

единицу активности фосфолипазы С определяют как количество фермента, которое в указанных условиях реакции образует 1 мкмоль паранитрофенола в минуту.

Активность галактолипазы определяют методом Н-ЯМР спектроскопии с использованием в качестве субстрата дигалактозилдиглицерида по методу, описанному Хираяма и Мацуда (Нпауаша апй Ма1§ийа (1972) Адпс. Вю1. СЪет. 36, 1831). Галактолипаза гидролизует сложноэфирную связь между жирно-кислотными остатками и глицериновым скелетом, высвобождая одну или более жирных кислот.

Указанную реакцию проводят в 50 мМ ацетатном буфере при рН 4,5, который содержит также 4 мМ СаС1₂,

- 26 008607

0.2% Тритона Х-100 и 1 мг/мл дигалактозилдиглицерида (липидный продукт). при 37°С в течение 30 мин.

единицу активности галактолипазы определяют в указанных условиях реакции как количество фермента. который образует 1 мкмоль жирной кислоты в минуту.

Активность грибной альфа-амилазы определяют с использованием тест-таблеток Фадебас-амилазы (Р1абеЬа8-Лту1а8е) (Рйагтас1а). Таблетки Фадебас содержат водонерастворимый крахмальный субстрат и синий краситель. связанный с субстратом. Субстрат гидролизуется грибной амилазой. высвобождая при этом в раствор окрашенные растворимые мальтодекстрины. Строят калибровочную кривую на основе раствора. содержащего грибную альфа-амилазу с эталонной активностью.

Из стандарта и исследуемых образцов делают соответствующие разведения 50 мМ буфером с яблочной кислотой. рН 5.5. Образцы по 5 мл инкубируют при 30°С в течение 5 мин. добавляют таблетки Фадебас и через 15 мин останавливают реакцию добавлением 1.0 мл 0.5н. гидроксида натрия. Смеси оставляют на 5 мин для охлаждения до комнатной температуры. после чего добавляют 4.0 мл воды. встряхивают вручную и через 15 мин центрифугируют образцы при 4700 об./мин в течение 10 мин. Измеряют экстинкцию верхних слоев при длине волны 620 нм. Поглощение (ОП) при 620 нм используют как меру активности грибной альфа-амилазы.

единицу активности грибной амилазы (ΡΑϋ) в контексте настоящего описания определяют как количество фермента. которое превращает 1 г крахмала (100% по сухому остатку) в течение часа в указанных условиях реакции в продукт. характеризующийся прозрачностью при длине волны 620 нм после реакции с раствором йода известной активности.

Таблица 2а

Активность фосфолипазы в ультрафильтратах. полученных по процедуре примера 2

Фосфолипаза	Белок (мг/мл)	Грибная амилаза	Фосфолипаза А	Фосфолипаза С	Лизофосфолипаза	Галактолипаза
Способ БСА	Анализ при 280 нм	РАи/мл	ФЛА/мл	Ед/мл	Ед/мл	Ед/мл
ФЛПОЗ	4,04	3,3	1,07	0,23	5,5	7	0,55
ФЛП06	2,51	0,4	2,14	26,9	0,01	20	49,8
ФЛП15	4,37	1,7	1,14	206	0,01	>1300	0,19
ФЛП26	2,21	1,4	3,24	0,24	0,01	67	0,21
ФЛП34	3,87	0,07	7,97	2,29	Не опред.	200	0,31

Таблица 2Ь Активность фосфолипазы в единицах на мг белка. определяемая при измерении показателя поглощения А280 нм в ультрафильтратах. полученных по процедуре примера 2

Фосфолипаза	Грибная амилаза	Фосфолипаза А	Фосфолипаза С	Лизофосфолипаза	Галактолипаза
РАЦ/мг	ФЛА/мг	Ед/мг	Ед/мг	Ед/мг
ФЛПОЗ	0,3	0,1	1,7	2,1	0,2
ФЛП06	5,4	67,3	0,0	50,0	124,5
ФЛП15	0,7	121,2	0,0	764,7	0,1
ФЛП26	2,3	0,2	0,0	47,9	0,2
ФЛП34	113,9	32,7	Не определяли	2857,1	4,4

В образцах. кроме указанной активности. присутствуют также минорные активности глюкоамилазы и ксиланазы. однако. в таких малых количествах. что указанные ферменты не влияют на эксперименты по выпечке. описанные в примере 4.

Пример 4. Эсперимент по выпечке 1 - булочки для хот-догов.

Булочки для хот-догов выпекают из кусочков теста по 150 г. получаемого при смешивании 200 г муки (Ко11Ьп™/1Ь18™. в соотношении 80/20). 1.4 г сухих пекарских дрожжей (Регт1рап®). 4 г соли. 3 г сахара. 10 мг аскорбиновой кислоты. 116 г воды и 3 г жира. После перемешивания в течение 6 мин и 15 с в тестомесильной машине шпилечного типа тесто разделяют на кусочки по 150 г и производят расстойку в течение 45 мин при 30°С. далее обминают. производят расстойку еще в течение 25 мин. формуют и кладут на противень. Расстойку производят при относительной влажности 90-100%. После завершения окончательной расстойки в течение 70 мин при температуре 30°С тесто выпекают в течение 20 мин при температуре 225°С.

Различные эффекты (табл. 3) разных фосфолипаз в экспериментах по выпечке сравнивают с контролем. содержащим такое же количество грибной амилазы. добавляемой в той же дозировке к ультрафильтрату (см. табл. 2 с данными по активности грибной амилазы в ультрафильтратах). Указанная обра

- 27 008607 ботка необходима, поскольку количества добавленной вместе с фосфолипазой грибной амилазы воздействуют преимущественно на объем булочек, а не на другие параметры. Объем изделий, получаемый с контрольным количеством грибной амилазы, берут за 100%.

Таблица 3

Эффект	Баллы
1	2	3	4	5
Тесто	Липкость теста	Слишком липкое	Липкое	Контрольный хлеб	Намного лучше	Очень сухое
Растяжимость теста	Слишком малая	Меньше, чем в контроле	Контрольный хлеб	Хорошая	Слишком большая
Хлеб после выпечки	Структура мякиша	Слабая	Неоднородная	Контрольный хлеб	Хорошая	Прекрасная
Цвет корки	Почти белый	Вполне светлый	Контроль ный хлеб	Прекрасный	Слишком темный
Цвет мякиша	Слишком желтый	Вполне желтый	Контрольный хлеб	Прекрасный	Абсолютно белый

Объем булочек определяют с помощью измерителя объема хлеба (Вгеай Уо1ите Меакигег ВУМ-3) (ΚΙ Сагйк ТпкйцтеПк АВ, У1кеп, Швеция). Принцип указанного метода основан на отражении ультразвука, который измеряется сенсором вокруг вращающегося хлеба. Время измерения составляет 45 с.

Липкость и растяжимость теста оцениваются квалифицированным пекарем с использованием шкалы, показанной в табл. 3. В среднем измеряют 2 булочки на каждый оцениваемый параметр.

После анализа указанные кусочки теста округляют и проводят первую расстойку в течение 45 мин при 30°С, после чего тесто обминают, формуют, кладут на противень и производят расстойку в течение 75 мин при 30°С. Относительную влажность в процессе расстойки поддерживают на уровне 85%.

Далее подтверждают стабильность теста после расстойки по наличию пузырей, разорванных участков на корке и неравномерно изогнутых поверхностей на корке. Сформованные кусочки теста выпекают в течение 25 мин при 225°С. Объем булочек определяют по методу ВУМ-3: в таблице представлено среднее значение показателя, измеряемого для двух хлебных изделий, которые выпекаются из одного и того же объекта.

Структуру мякиша оценивает квалифицированный пекарь с использованием шкалы, показанной в табл. 3. После хранения булочек в течение 3 дней в полиэтиленовых пакетах при комнатной температуре измеряют твердость корки с использованием анализатора структуры 81еуепк ТехШге Апа1укег. С помощью анализатора оценивают структуры двух срезов по 2 см толщиной, взятых из центра каждой булочки, с использованием пробоотборника с диаметром 1,5 дюйма, глубиной вдавливания 5 мм (25%) и скоростью прессования 0,5 мм/с. В таблице приведены средние значения показателей, полученные в двух измерениях.

Цвет корки оценивает квалифицированный пекарь по шкале, показанной в табл. 3. В качестве стандарта используют хлеб, выпеченный по стандартному рецепту голландского формового хлеба.

Цвет мякиша оценивает квалифицированный пекарь по шкале, показанной в табл. 3. Цвет мякиша контрольного хлеба оценивается как нормальный (3). В качестве позитивного контроля используют два объекта хлеба с тем же самым составом, что и контроль, плюс 0,5% соевой муки. Процедуру расстойки и выпечки производят, как и в контрольном варианте, без соевой муки. Последний показатель оценивают как превосходный.

Выступающую верхушку хлеба оценивают по уровню выступа верхней части в сравнении с формовым стандартом, чем ниже края верха, тем ниже балл при тестировании. Чем меньше выступ, тем лучший присваивается балл.

Таблица 4 Характеристика фосфолипаз по настоящему изобретению с точки зрения воздействия на качество выпечки

Параметр	Фосфолипаза
ФЛПОЗ	ФЛП06	ФЛП15	ФЛП26	ФЛП34
Объем (%)	100	108	112	110	107
Липкость теста	5	3	3	3	3
Растяжимость теста	2	3	3	2	3
Стабильность теста	4	5	4	4	4
	л	р.	л	л	л
^хруштура хлеипиги мякиша	*±	□
Цвет хлебной корки	4	4	4	4	4
Цвет хлебного мякиша	3	5	4	4	4
Выступающая верхушка хлеба	4	4	4	3	4

- 28 008607

Пример 5. Второй эксперимент по выпечке - батар.

Характеристики фосфолипаз по настоящему изобретению, определяемые их воздействием на вид выпечки, исследуют на примере хлеба типа французского батона, называемого батар. Батары изготавливают путем стандартного процесса выпечки при смешивании при температуре примерно 20°С 3000 г пшеничной муки, 70 г прессованных дрожжей, 60 г соли, 68 м.д. аскорбиновой кислоты, 17 м.д. препарата Фермизим® Р₂₀₀ (Еегт1/уте® Р_2Оо) (грибная α-амилаза), 30 м.д. препарата Фермизим® Н8₂₀₀₀ (Еегт1/уте® Н8_2Ооо) (грибная хемицеллюлаза), 7 м.д. препарата Бэйкзим® Р500 (Ваке/уте® Р500) и 1680 мл воды (810°С) в спиральном смесителе (Эюзпа: 2 мин со скоростью 1; 100 Вт/ч, ввод со скоростью 2). Температура теста составляет 27°С. Способность теста к машинной обработке анализирует вручную пекарь. Тесто отставляют для расстойки до нужного объема на 15 мин в расстойном шкафу при 32°С и 90% ОВ. Далее тесто разделяют на 6 кусочков по 350 г, округляют их и вновь производят расстойку в течение 15 мин при 32°С и 90% ОВ. В конце указанного периода времени формуют кусочки теста и производят окончательную расстойку в течение 90 мин при 32°С и 90% ОВ. Полностью расстойное тесто раскатывают в длину кусочка и выпекают в печи при 240°С в течение 30 мин при обработке вначале паром. После охлаждения до комнатной температуры определяют объем полученных булочек по методу с ипользованием анализатора ВУМ-3 (см. пример 4).

Полученный хлеб сразу после охлаждения до комнатной температуры анализирует пекарь на наличие трещин, разрывов корки и форму, ранжируя результаты по табл. 5. После выдерживания в течение 16 ч (в течение ночи) в закрытой коробке при комнатной температуре квалифицированный пекарь оценивает качество мякиша хлеба. Результат для каждого показателя получают из одного хлебного изделия в качестве объекта.

Таблица 5

Эффект	Баллы
1	2	3	4	5
Разлом и разрыв корки хлеба	Чересчур слабая и мягкая	Слабая и мягкая	Контрольный хлеб	Тонкая и хрустящая, разрез прочный на разлом	Слишком тонкая, слишком твердая
ххопк/ютспц/хл мякиша	Г* -г» Л /-Т кЛОЮС1Л	НсОДНОродная	Контроль ный хлеб	Хорошая	Прокрас- ная
Форма	Высота	Плоская	Средняя	Контрольный хлеб	Больше, чем (3)	Гораздо больше, чем (3)
Разрез	Закрытый разрез	Закрытый разрез	Контрольный хлеб	Полностью открытый	Полностью открытый

Таблица 6 Характеристики фосфолипаз по настоящему изобретению с точки зрения их эффекта на выпечку

Параметр	Фосфолипаза
Не добавляют	ФЛПОЗ	ФЛП06	ФЛП26	ФЛП34
Дозировка*	0	Не исследуют	10	20	21
Объем хлеба (%)	100	Не исследуют	109	105	109
Разлом и разрыв корки хлеба	3	Не исследуют	4	4	4
Форма	3	Не исследуют	4	4	4
Консистенция мякиша	3	Не исследуют	4	4	4

*В м.д. на основании веса муки и веса фермента, определяемых по методу измерения А280.

- 29 008607

Список последовательностей <110> ϋ3Μ Ν.ν.

<120> Новые фосфолипазы и их применение <130> 20950ΗΌ <160> 15 <170> Патентин, версия 3.1 <210> 1 <211> 3763 <212> ДНК <213> АЗ^АГтПид ΠΪίΐ^Γ <400> 1

ддРддаЬдаЬ	адсасасддд	сдасдсаада	РсдадаааЬа	асЬЬддЬсаЬ	саРЬаСЬЪсЬ	60
РдЬдддЬаад	саададЬсЬЪ	аСадддддСс	сЬдсЬдЬддР	сЬдсдасаЬс	ЪддЬддаЬдЬ	120
ддаЬддасда	ЬдаЬдаадаЬ	дддддаасЬа	ЬЬсссааЬдс	ддрдсдсддд	ЬдсдаЬддаа	180
Рддасаддаа	дадааЬЬЬРЬ	саЕсРсадда	ЬРддддаааЬ	ддРРдаасЬс	дассддСдЬд	240
ЬдЬдидссдЬ	идаадсадсь.	ддадидЬиаи	сЬдЬадиаис	иасддисЬаи	дсдсаЬсаис	300
РРсаасадаЬ	ссдассадад	ЬдЬдааадаР	дссаЬсдаад	ааадаааааЬ	аасЬааассс	360
ддЬсдддасЬ	дсЬаЬсдаса	дссЬдаддса	дЬааддсаде	даддсадЬда	ддсадЬдадд	420
садЬдаддса	дЬсаддСдаР	даЬсаддсаЬ	ссааРсаЬсР	сСдссЬсдсс	дссЬЬдссдс	480
сЬддддЬдРс	ааддсдаадд	ассадсЬсдР	саЬссдаРсд	адаЬссаЬсс	сдааЬааЬдЬ	540
ссаддсЪдЬЬ	сдсадЬдссЬ	ддЬдсЬадЬР	дЬадаЬаЬае	дддЬЬаЪдаЕ	аЬсЬсасЬдЬ	600
РсСсЬассаЬ	ссЬЬссЬдШ:	ссЬддсЬсЬс	РдсЬдРддЬд	РдСаЬссдад	сдддссддаа	660
дсЬассдаЬс	дссддаЬЬде	ЬссддсссЬЬ	ЬЬсЪЬаЬЬсс	аЬдддсЬдЬд	сссЬЬасЬсС	720
дссРсЬсЬЫ:	сЬаЬсЬЬЬсЬ	сЬсЬсЬсесЬ	сЬсЬсЬсЬда	ЬЬсдЬЬссса	аЬддадааЬЬ	780
саддЬасааа	дЬааЬЬсссС	сЬддсаЬдас	РдсЬЬдасар	дЬсдссаЪЬс	аасаЬсаЬда	840
адЬасЬаадЬ	адЬадЬадас	саасЬасЪсЬ	ддасддсЬда	Ьадсадссаа	Ьсасдддааа	900
дрддссасдс	асдддддсрд	ЬсдаСссссд	аЬдаЬсдРдс	аРЬддсадад	ссаЬдаадаа	960
адасддЬадд	асаадссЬсд	ассадЬсЬсЬ	дсЬасадЬдЬ	аЬссссЬссс	адаЬаСдддд	1020
ЬааасссЕса	ааЬассдЬсс	дасссддЬсс	сЬсдЬдсссс	РдсадаЬсда	ЪдссаЬЬдда	1080
дЬЬдсаЬссд	дссЪЬсдсдР	сЬссассдаЬ	ддадааддда	дддСдааСаа	ЬддсдЬссаЬ	1140
дсаааЬддсР	сдсЬЬдасРс	асаадаСдЬа	дРасЬЬдЬЕЬ	ааРдааааЬа	даРддЬдЬсЬ	1200
сдассасЪРд	асассассас	дрдсадассс	Ьдсаадддда	дадаСдадда	даааадсЬдЬ	1260
ссдадЬдаса	дсЬссаасЬс	сасссЬдасс	аЬддЬаЬаад	ааддсЬсссс	сЬсдассаЬс	1320
ЬСдС-сааЕдд	сЬаЬЬсЬсас	садддЬаЬсд	саЬЬсЬдссЬ	ссЬссаЬсЬд	ЬасЬасаааЬ	1380
Расаасадад	сЬсассаЬдс	аЬсссадРдс	дсЬддЬсддр	сЬдсЬддссЬ	ЬЬдсЬдссдс	1440
рдссЬсддсс	аЬссссдсса	ассссадсса	ЬааддсЬсас	ЬссдасЬсдд	ссдЬссадаа	1500

- 30 008607

БсБсаадБсд	аадаСсаада	аБдБсдЪсдЬ	ссБддЕсакд	дадааБсдЪБ	ссдкддасаа	1560
ссСдСБддда	ддЕсадасда	ЕсаадддсБС	ддадаасссс	аРсаасаасд	дссссБасБд	1620
саасссскас	аасаБсассд	ассБсБссса	дддсассдБс	ЕдсадЬдсдд	ссададаска	1680
сдасЪсддкс	ассдаЕдаЬс	ссдаСсасдс	сдксЕакддс	ааБаасаксд	адЕБсБасдд	1740
сассББсасс	сссдасааЬд	сддссаксдс	ссадддсаад	скдасссссБ	сссадсаддд	1800
дБксдСсасд	даасадсБдс	дссБдБасад	сдссдаЕдсс	аассдсассд	адсБдЕссдЕ	1860
дсаддЕсаГд	аасИаБЕаса	ссдадсадса	ддЬдсссдЬд	сксассЕсдс	БсдЕссаааа	1920
сБаСдБсдБк	кРсаассакк	ддсасСсдда	ЬдБдсскддк	дкасдаассс	сссссеесББ	1980
ссссББсссс	ассЕБксадс	ЕддсаасББд	сБаасксада	ЪЕсадсссас	саассссаас	2040
сдддсБдссс	БсассБсСдд	сасСЕсдБаЪ	ддБсасддаа	ссаасдакда	ддссБББдас	2100
аассасдссБ	Ссссссадсд	ЕБссаСсЕБс	садсадсЬда	ссдадассдд	ссасЕссБдд	2160
аБсаасБаск	дддасасддс	ЕддСддсасЁ	ддссссдакд	ссдадкБсБа	саасБддасБ	2220
ЬасассЬсса	асаасассда	сааддБсаад	дссскддаас	адЕБскасас	ддаБдссдса	2280
дссддЕдссс	ЬдссЪдааСР	садсБасдкс	аассссЕсдС	дсБдсддСдк	сддсассаас	2340
ЕсдаЬдсасс	ссадиддЬси	даисиссдас	ддсдадаадс	гдаисаадаа	сдисиасдас	2400
дсБскдсдсд	ссдддсссса	дБддаасдад	асссЕскЬса	ЕсскдадсББ	сдасдадасс	2460
ддкддсЬБсс	асдассаБдС	дсссссдссс	сЕсдсЕсссс	ддссддасаа	ссБсасББас	2520
асддссасса	ссссаадсдд	сдаддаскас	ассЪЕсаасЪ	БЕаассдБсБ	дддкддЬсде	2580
акссссасБс	БдскдаБсЪс	ссссЬдддСс	ддсаадддаЬ	аБдЪсдадса	ааадддсасс	2640
адсдксассд	дсдааассдЕ	дБсББасЕсс	дссЕссЕсда	кссЕдсдсас	сскдддсЪас	2700
сЬсЕдддасЕ	БЕдасссЕБЕ	сассссдсдд	дБсдадкаБд	сдссаЬссЪБ	БдадсаБсБд	2760
дБдсадасдс	дддсссдсда	Еаасассссд	асБдссЕЬдс	сдадЕссддБ	дсссРББсдд	2820
аадБаааСдд	садаБаСБда	аБдсддЬадЕ	ддааасдЕск	ааСдсаБааБ	даасддаддд	2880
ааадЬадаЕс	БдаааадсБд	адссдсдЬсс	дадаБасаса	ЪдЩЩддЕса	даБаЕББссБ	2940
дддсББадса	сддЕасадад	дакдаБадде	сакдБакЕаБ	БсаБдаБааа	дссааааЕаа	3000
аЪадЕаБББд	БааЕасакХд	аЪддссаЪсд	седдскдккд	ккддасаЬБс	сББаБдаЕсБ	3060
сБЕссасдас	БаСЪасБдаЬ	Ъддддсссаа	БаасаадсБд	сддаадааБа	ББссааБсас	3120
ааБкдасакд	БсЕЕдсддса	дБЪЪаЕадаа	аЕЕссдкада	БЕБсаддсББ	БдсасБссас	3180
сскдБаБаса	сакдасББББ	аЪаасдББсБ	Бсасдсаакс	БакаБасБдд	БсБасаБсаа	3240
сссаБссБдд	сБсксЪдааа	саБддСБдад	саддадсадс	БЪдсасБсБд	адГ-ссБасББ	3300
ЕаЪБББсааЕ	ссаЕБссБаа	аБассдЬдад	аааддсаддд	аасскассаС	ЕддссББдсс	3360
сассассЪБд	Ьсдаадаадд	БсБддсБсдд	ЕсдсЬБсскс	аасссассда	сдсскссЕсс	3420
сддЬассЪсс	адддБсдасБ	ддсссдассБ	ЕсРдсасааБ	адаЪЬдааСд	сдБдЕсаада	3480
адсссЕссдБ	сБсдадсЬдк	БссддБддсд	ЕаЕЕЕсдсад	сассРдсада	дБдассссад	3540
сдадсадсас	ЕсссБсдсда	сБссдРБсдБ	ааРдБЕсаад	сдасдсдадс	дссаЕсссда	3600
саддЕсБаБа	саБссаадсБ	сЕдаадссдс	ддаЬИасдад	сЕЕЕсссдад	аБдсЕЪаадд	3660
БдсЕасаада	БдсаРадЕЕа	сддБддаБаа	ЕкаБаддддЕ	ссЕадададс	адсаСЬсдса	3720
даададсаас	асРаЕадддс	сссББдддсс	аксЕББдада	ска		3763

<210> 2 <211> 1365 <212> ДНК <213> АзрегдШиз пддег

- 31 008607 <220>

<221> СЬЗ <222> (1)..(1365) <400> 2

аЕд

саЕ

ссс

адЕ

дед

сЕд

дЕс

ддЕ

сЕд

сЕд

дсс

ЕЕЕ

дсЕ

дсс

дсЕ

дсс

48

МеЕ

ΗΪ8

Рго

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

С1у

Ьеи

Ьеи

А1а

РЬе

А1а

А1а

А1а

А1а

1

5

10

15

Есд

дсс

аЕс

ссс

дсс

аас

ссс

аде

саЕ

аад

дсЕ

сас

Есс

дас

Есд

дсс

96

Зег

А1а

Не

Рго

А1а

Азп

Рго

Зег

Н13

Ьуз

А1а

Ηίβ

Зег

Азр

Зег

А1а

20

25

30

дЕс

сад

ааЕ

сЕс

аад

Есд

аад

аЕс

аад

ааЕ

дЕс

дЕс

дЕс

сЕд

дЕс

аЕд

144

Уа1

Θΐη

Азп

Ьеи

Ьуз

Зег

Ьуз

Не

Ьуз

Азп

Уа1

Уа1

Уа1

Ьеи

Уа1

МеЕ

35

40

45

дад

ааЕ

сдЕ

Есс

дЕд

дас

аас

сЕд

ЕЕд

дда

ддЕ

сад

асд

аЕс

аад

ддс

192

61и

Азп

Агд

Зег

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

Ьеи

С1у

61у

(31п

ТЬг

11е

Ьуз

О1у

50

55

60

ЕЕд

дад

аас

ссс

аЕс

аас

аас

ддс

ссс

Еас

Еде

аас

ссс

Еас

аас

аЕс

240

Ьеи

С1и

Азп

Рго

11е

Азп

Азп

С1у

Рго

Туг

Суз

Азп

Рго

Туг

Азп

11е

65

70

75

80

асе

дас

сЕс

Есс

сад

ддс

асе

дЕс

Еде

адЕ

дед

дсс

ада

дас

Еас

дас

288

ТЬг

Азр

Ьеи

Зег

<31п

О1у

ТЬг

Уа1

Суз

Зег

А1а

А1а

Агд

Азр

Туг

Азр

85

90

95

Есд

дЕс

асе

даЕ

даЕ

ссс

даЕ

сас

дсс

дЕс

ЕаЕ

ддс

ааЕ

аас

аЕс

дад

336

Зег

Уа1

ТЬг

Азр

Азр

Рго

Азр

ΗΪ8

А1а

Уа1

Туг

О1у

Азп

Азп

11е

О1и

100

105

110

ЕЕс

Еас

ддс

асе

ЕЕс

асе

ссс

дас

ааЕ

дед

дсс

аЕс

дсс

сад

ддс

аад

384

РЬе

Туг

С1у

ТЬг

РЬе

ТЬг

Рго

Азр

Азп

А1а

А1а

11е

А1а

61п

О1у

Ьуз

115

120

125

сЕд

асе

ссс

Есс

сад

сад

ддд

ЕЕс

дЕс

асд

даа

сад

сЕд

сдс

сЕд

Еас

432

Ьеи

ТЬг

Рго

Зег

С31п

Θΐη

СЛу

РЬе

Уа1

ТЬг

С1и

<31п

Ьеи

Агд

Ьеи

Туг

130

135

140

аде

дсс

даЕ

дсс

аас

сдс

асе

дад

сЕд

Есс

дЕд

сад

дЕс

аЕд

аас

ЕаЕ

480

Зег

А1а

Азр

А1а

Азп

Агд

ТЬг

С1и

Ьеи

Зег

Уа1

О1п

Уа1

МеЕ

Азп

Туг

145

150

155

160

ЕЭС

асе

дад

сад

сад

дЕд

ССС

дЕд

сЕс

асе

Есд

сЕс

дЕс

саа

аас

ЕаЕ

528

Туг

ТЬг

О1и

С1п

О1п

Уа1

Рго

Уа1

Ьеи

ТЬг

Зег

Ьеи

Уа1

О1п

Азп

Туг

165

170

175

дЕс

дЕЕ

ЕЕс

аас

саЕ

Едд

сас

Есд

даЕ

дЕд

ссЕ

ддЕ

ссс

асе

аас

ссс

576

Уа1

Уа1

РЬе

Азп

ΗΪ8

Тгр

Н18

Зег

Азр

Уа1

Рго

С1у

Рго

ТЬг

Азп

Рго

180

185

190

- 32 008607

аас

едд

дсЕ

дсс

сЕс

асе

ЕсЕ

дде

асЕ

Есд

ЕаЕ

ддЕ

сас

дда

асе

аас

624

Авп

Агд

А1а

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Туг

(31у

Ηϊβ

С1у

ТЬг

Авп

195

200

205

даЕ

дад

дсс

ЕЕЕ

дас

аас

сас

дсс

ЕЕС

ссс

сад

сдЕ

Есс

аЕс

ЕЕс

сад

672

Авр

С1и

А1а

РЬе

Авр

Авп

ΗΪ8

А1а

РЬе

Рго

О1п

Агд

Зег

Не

РЬе

<31п

210

215

220

сад

сЕд

асе

дад

асе

дде

сас

Есс

ьдд

аЕс

аас

Еас

Едд

дас

асд

дсЕ

720

С1п

Ьеи

ТЬг

СЯи

ТЬг

(31у

Ηϊβ

Зег

Тгр

11е

Азп

Туг

Тгр

Авр

ТЬг

А1а

225

230

235

240

ддЕ

дде

асЕ

дде

ссс

даЕ

дсс

дад

ЕЕс

Еас

аас

Едд

асЕ

Еас

асе

Есс

768

С1у

О1у

ТЬг

(31у

Рго

Авр

А1а

С1и

РЬе

Туг

Азп

Тгр

ТЬг

Туг

ТЬг

Зег

245

250

255

аас

аас

асе

дас

аад

дЕс

аад

дсс

сЕд

даа

сад

ЕЕс

Еас

асд

даЕ

дсс

816

Азп

Авп

ТЬг

Азр

Ьуз

Уа1

Ьув

А1а

Ьеи

О1и

С1п

РЬе

Туг

ТЬг

Азр

А1а

260

265

270

дса

дсс

ддЕ

дсс

сЕд

ссЕ

даа

ЕЕс

аде

Еас

дЕс

аас

ссс

Есд

Еде

Еде

864

А1а

А1а

С1у

А1а

Ьеи

Рго

С1и

РЬе

Зег

Туг

Уа1

Авп

Рго

Зег

Сув

Сув

275

280

285

ддЕ

дЕс

дде

асе

аас

Есд

аЕд

сас

ссс

адЕ

ддЕ

сЕд

аЕс

Есс

дас

дде

912

(31у

Уа1

С1у

ТЬг

Авп

Зег

МеЕ

Ηϊβ

Рго

Зег

С1у

Ьеи

11е

Зег

Авр

С1у

290

295

300

дад

аад

сЕд

аЕс

аад

аас

дЕс

Еас

дас

дсЕ

сЕд

сдс

дсс

ддд

ссс

сад

960

О1и

Ьув

Ьеи

Не

Ьув

Авп

Уа1

Туг

Азр

А1а

Ьеи

Агд

А1а

С1у

Рго

С1п

305

310

315

320

Едд

аас

дад

асе

сЕс

ЕЕс

аЕс

сЕд

аде

ЕЕс

дас

дад

асе

ддЕ

дде

ЕЕс

1008

Тгр

Авп

(31и

ТЬг

Ьеи

РЬе

Не

Ьеи

Зег

РЬе

Азр

С1и

ТЬг

С1у

С1у

РЬе

325

330

335

сас

дас

саЕ

дЕд

ссс

сед

ссс

сЕс

дсЕ

ссс

едд

сед

дас

аас

сЕс

асЕ

1056

ΗΪ8

Авр

Ηϊβ

Уа1

Рго

Рго

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Агд

Рго

Азр

Авп

Ьеи

ТЬг

340

345

350

Бас

асд

дсс

асе

асе

сса

аде

дде

дад

дас

Еас

асе

ЕЕс

аас

ЕЕЕ

аас

1104

Туг

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

Рго

Зег

С1у

С1и

Азр

Туг

ТЬг

РЬе

Азп

РЬе

Авп

355

360

365

сдЕ

сЕд

ддЕ

ддЕ

сдЕ

аЕс

ссс

асЕ

сЕд

сЕд

аЕс

Есс

ссс

Едд

дЕс

дде

1152

Агд

Ьеи

О1у

О1у

Агд

11е

Рго

ТЬг

Ьеи

Ьеи

11е

Зег

Рго

Тгр

Уа1

С1у

370

375

380

аад

дда

ЕаЕ

дЕс

дад

саа

аад

дде

асе

аде

дЕс

асе

дде

даа

асе

дкд

1200

Ьув

С1у

Туг

Уа1

С1и

С1п

Ьув

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

С1у

С1и

ТЬг

Уа1

385

390

395

400

ЕсЕ

Бас

ЕСС

дсс

Есс

Есд

аЕс

сЕд

сдс

асе

СЕд

дде

Еас

сЕс

ьдд

дас

1248

5ег

Туг

8ег

А1а

Зег

Зег

Не

Ьеи

Агд

ТЬг

Ьеи

С1у

Туг

Ьеи

Тгр

Азр

405 410 415

- 33 008607

1296

еье

дас

ссЬ

ЬЬс

асе

ссд

едд

дес

дад

еае

дед

сса

есс

еее

дад

сае

РЬе

Аар

Рго

РЬе

ТЬг

Рго

Агд

Уа1

С1и

Туг

А1а

Рго

Зег

РЬе

СЛи

НХЗ

420

425

430

сйд

дкд

сад

асд

едд

дсс

сдс

дае

аас

асе

ссд

асе

дсс

еед

ссд

аде

Ьеи

Уа1

С1п

ТЬг

Агд

А1а

Агд

Азр

Азп

ТЬг

Рго

ТЬг

А1а

Ьеи

Рго

Зег

435

440

445

ссд

дйд

ссс

ееъ

едд

аад

еаа

Рго

Уа1

Рго

РЬе

Агд

Ьуз

450

1344

1365 <210> 3 <211> 454 <212> РКТ <213> АзрегдШиз пхдег <400> 3

Мее

Нхз

Рго

Зег

А1а

Ьеи

Уа1

СЛу

Ьеи

Ьеи

А1а

РЬе

А1а

А1а

А1а

А1а

1

5

10

15

Зег

А1а

Не

Рго

А1а

Азп

Рго

Зег

Нхз

Ьуз

А1а

ΗΪ3

Зег

Азр

Зег

А1а

20

25

30

Уа1

С1п

Азп

Ьеи

Ьуз

Зег

Ьуз

Не

Ьуз

Азп

Уа1

Уа1

Уа1

Ьеи

Уа1

МеЕ

35

40

45

О1и

Азп

Агд

Зег

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

Ьеи

С1у

СЛу

С1п

ТЬг

Не

Ьуз

С1у

50

55

60

Ьеи

С1и

Азп

Рго

11е

Азп

Азп

СЛу

Рго

Туг

Суз

Азп

Рго

Туг

Азп

Не

65

70

75

80

ТЬг

Азр

Ьеи

Зег

Θΐη

СЛу

ТЬг

Уа1

Суз

Зег

А1а

А1а

Агд

Азр

Туг

Азр

85

90

95

Зег

Уа1

ТЬг

Азр

Азр

Рго

Азр

Нхз

А1а

Уа1

Туг

О1у

Азп

Азп

11е

О1и

100

105

110

РЬе

Туг

О1у

ТЬг

РЬе

ТЬг

Рго

Азр

Азп

А1а

А1а

Не

А1а

(31П

<31у

Ьуз

115

120

125

Ьеи

ТЬг

Рго

Зег

С1п

(31п

О1у

РЬе

Уа1

ТЬг

СЛи

СЛп

Ьеи

Агд

Ьеи

Туг

130

135

14 0

Зег

А1а

Азр

А1а

Азп

Агд

ТЬг

О1и

Ьеи

Зег

Уа1

01п

Уа1

МеЪ

Азп

Туг

145

150

155

160

Туг

ТЬг

(Э1и

СЛп

О1п

Уа1

Рго

Уа1

Ьеи

ТЬг

Зег

Ьеи

Уа1

С1п

Азп

Туг

165

170

175

Уа1

Уа1

РЬе

Азп

Нхз

Тгр

Нхз

Зег

Азр

Уа1

Рго

С1у

Рго

ТЬг

Азп

Рго

180

185

190

Азп

Агд

А1а

А1а

Ьеи

ТЬг

Зег

СЛу

ТЬг

Зег

Туг

С1у

Нхз

СЛу

ТЬг

Азп

195

200

205

- 34 008607

Азр

СЛи 210

А1а РЬе Азр Азп Ηϊβ 215

А1а

РЬе Рго

01п Агд Зег 220

Не

РЬе

С1п

ϋΐη

Ьеи

ТЬг

О1и

ТЬг

(31у

Н1з

Зег

Тгр

Не

Азп

Туг

Тгр

Азр

ТЬг

А1а

225

230

235

240

С1у

С1у

ТЬг

С1у

Рго

Азр

А1а

О1и

РЬе

Туг

Азп

Тгр

ТЬг

Туг

ТЬг

Зег

245

250

255

Азп

Азп

ТЬг

Азр

Ьуз

Уа1

Ьуз

А1а

Ьеи

С1и

О1п

РЬе

Туг

ТЬг

Азр

А1а

260

265

270

А1а

А1а

С1у

А1а

Ьеи

Рго

С1и

РЬе

Зег

Туг

Уа1

Азп

Рго

Зег

Суз

Суз

275

280

285

(31у

Уа1

С1у

ТЬг

Азп

Зег

МеЕ

ΗΪ3

Рго

Зег

О1у

Ьеи

Не

Зег

Азр

СЭ1у

290

295

300

<31и

Ьуз

Ьеи

Не

Ьуз

Азп

Уа1

Туг

Азр

А1а

Ьеи

Агд

А1а

С1у

Рго

С1п

305

310

315

320

Тгр

Азп

С1и

Тпг

Ьеи

РЬе

Не

Ьеи

Зег

РЬе

Азр

С1и

ТЬг

С1у

О1у

Рпе

325

330

335

ΗΪ3

Азр

ΗΪ8

Уа1

Рго

Рго

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Агд

Рго

Азр

Азп

Ьеи

ТЬг

340

345

350

Туг

ТЬг

А1а

ТЬг

ТЬг

Рго

Зег

С1у

С1и

Азр

Туг

ТЬг

РЬе

Азп

РЬе

Азп

355

360

365

Агд

Ьеи

С1у

С1у

Агд

Не

Рго

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Не

Зег

Рго

Тгр

Уа1

С1у

370

375

380

Ьуз

С1у

Туг

Уа1

О1и

О1п

Ьуз

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

С1у

С1и

ТЬг

Уа1

385

390

395

400

Зег

Туг

Зег

А1а

Зег

Зег

Не

Ьеи

Агд

ТЬг

Ьеи

С1у

Туг

Ьеи

Тгр

Азр

405

410

415

РЬе

Азр

Рго

РЬе

ТЬг

Рго

Агд

Уа1

О1и

Туг

А1а

Рго

Зег

РЬе

С1и

Ηίβ

420

425

430

Ьеи

Уа1

С1п

ТЬг

Агд

А1а

Агд

Азр

Азп

ТЬг

Рго

ТЬг

А1а

Ьеи

Рго

Зег

435

440

445

Рго

Уа1

Рго

РЬе

Агд

Ьуз

450 <210> 4 <211> 3692 <212> ДНК <213 > АзрегдШиз пддег <400> 4

ЕЕЕддддЕЕд дЕсдЕдЕдсд ЕссЕдЕдсЕд ЕссЕдЕсЕЕд аассдаасса дасЕддсадд60 дасЕаЕЕаЕЕ ссдадЕаЕЕс сссддсдаад даЕддсадЕд аЕдадасаЕЕ сддсЕддаЕЕ120 ддаЕсддасс ссЕдсЕдаЕс адсЕсдддда аЕЕсЕссЕаЕ ЕссдЕдддаЕ ЕдаЕЕсЕЕЕЕ180

- 35 008607

СГГЬЬГсЪГГ	ГсГаГГсГаГ	дсГаГдсааа	адасдЬдаСд	ЬдЬдГсГддЬ	ГддсдГСсса	240
ддадсдаада	ГГдсГГГГсб	ГасГабаЬГа	ГкссГГсГГс	ГабдГЬсГбд	ааГГадсбаб	300
дсаддбадсд	дГсааГабаЬ	ссГГГаадса	дабассЬГГа	сГсГГдсбаГ	ддабаГсаба	360
акссГадаад	дГасабссас	сабадасбас	сГадбссссд	дссасабсаГ	дааабабсас	420
ЬддбасаГГа	ГГсбссдада	ассасадаас	сасбссабад	сасаддсаса	ГааГддсасс	480
Гдсссасасс	сасасбсасд	дсГссбадба	сСаассссбс	дЬадбсссса	дбасбссаса	540
ддбассГааб	асасббдЬсс	сасасссЬса	ссаадассаа	скаассасса	аадсбасбсд	600
садаЬадсаа	даГадГсасс	Гдссасассд	саасГсасГа	асааасдсад	аЬсасаадсс	660
ГааабаГГсд	аассааассЬ	даадааГссб	ГГссаассаа	сасасасасд	дбаГдддГГд	720
дааддааддд	ааадааадбд	дддГЬаадса	аасГаасбаа	сааасЬсЬдс	ааддбадсаа	780
асдсбасасб	аассаассаа	асЬадГГааа	сГаабаГГаа	ЬааГаабааГ	аадаадаада	840
адабдаГдаб	дааддадбса	ГсдГГсГссс	дбссссддсб	ГабадГасдд	даГдсГаадд	900
сГдсассссд	садсасддда	адсссддасд	ГГддГддГСГ	дсдддГдддГ	дасбддаГГа	960
дасбадддда	сбсдбааддс	адсддасЬад	ЬГаааГГааб	ГдасЬадСад	ЪсГдГдсбдд	1020
ус'ЬуууссЬа	ЬсЬадЬасид	ЬдаадЬдссд	ддаидидссд	ддЬдадидаа	дадЬЬсаиЬа	χϋόϋ
аГдааЬдабб	даГГдаГГГд	сдддддГддГ	аддбдЬадсд	ГГаддбааГд	даассасббс	1140
ГЬабааГбдГ	аГГасбсбас	ГаасГдбааа	ГдГдГдЬдГЪ	Гбабддддас	аддадаадбб	1200
ааддГадЬаб	бдддддсддд	ааааддддаГ	ддГГдГсбаа	ГГсадГГГдб	ГбсааГадбб	1260
ЬдГГдаддба	ГГГГсГбдГс	ааадГГасбб	дГГсадаГГа	ЬдддсасдГд	ГасдГдсбба	1320
дГГГСсабад	аЪЪдбдГдба	ГдГдГдбдбд	Ьдсдсдбдсд	ГдсЬдассса	ГсГабадсаб	1380
дЬабсдсддГ	сГдааГдбдГ	аЬаадсдсбд	саадбдабсд	дсааадбдас	аадаадбсГЪ	1440
Ьсбасдассс	асГадГГаГЬ	ЬдсаЬдесас	даассасаас	ассдссадГс	асадсдасад	1500
сабдГдаада	адГсбсадаб	ГГсдГаасас	ГсГсссдбсб	асГдсГсбсс	ГасГГдабад	1560
асбдасЬбас	сбсддссЬдГ	дсасабдсса	ГдГсссбабс	ссаабсбасб	ддГссабдбд	1620
садассасдс	сбссасдГГГ	сГссдссадГ	адабссЬГса	асассдсГса	ГссГсадаса	1680
асаГсбасбЬ	ЪаГГбдасГГ	ГГсддадаад	ассабдсГГд	Гсбасддсса	дсЬабадсаЪ	1740
дсбаГадсад	Гссдббаабс	Гссассдддс	Гсссдсбссд	аасддадаГд	дддссааасб	1800
дссасбссад	ЪГдсдсаасд	дасаддсасс	даассддаас	аааддабдсд	даададдада	1860
сабддЬдссГ	даГХдсаГдЬ	дсГддсСГса	ГсбдсЬаГсд	ЬдадддЬдсЬ	дбдсбддада	1920
ааГГГдГбдб	сГдасббасс	ссдсГГсГГд	СГГЬГГ6Г.СС	сссГдабдсс	ссбдаГдддд	1980
ааббддддбд	ддбаабабда	ГасаддГаба	ааадддддсб	сддаддбдса	дЪГддабада	2040
адсаЬГдбдЬ	дГдсаббдса	дсадГссдГГ	ддГсбсасдб	сГсЬддббдс	сГсдаГГдба	2100
ЬаГабасбдс	аддабдГГсГ	сбддасддЬГ	ЪддадГдсЬГ	ГГдасддсдс	Гсдсбдсдсб	2160
дадбдсГдсд	дсассдасас	сасГГдабдб	дсддадбадд	ГдГдссбдаб	Гбдаадбддс	2220
Ьддабадсас	бдабдааддб	ГЬГдаабадд	ГдГсбсдасб	ГссасдГЬдд	абдадсбдса	2280
аЬГдГГсбсд	саабддГсбд	ссдсадсГГа	Гбдсбсдаас	аабабсдасГ	сддасдасбс	2340
Ьаасдбдаса	Гдсасддссд	асдссГдбсс	абсадбсдад	даддсдадса	ссаадабдсб	2400
дсГддадббб	дассГдГабд	ГЬдсЬссадГ	дааабддаба	даасасадсЬ	даГГдаабад	2460
дасаааГаас	бббддаддса	садссддГГГ	ссбддссдсд	дасаасасса	асаадсддсб	2520
сдГддбсдсс	ГХссдаддса	дбадсассаЬ	саадаасГдд	аГ-бдсбдаГс	ЬсдасГЪсаб	2580
ссбдсаадаб	аасдабдасс	ГсбдГасЬдд	сбдсааддГЪ	сасасбддаб	Гсбддааддс	2640
аГдддаадсс	дсбдсадаса	абсГдасдад	саадабсаад	ГссдсдаГда	дсасдбаббс	2700
дддсбаСасс	сГсбасГГса	ссдддсасад	сббдддсддс	дсаГСддсГа	сасГдддадс	2760

- 36 008607

аасддбсббд	сдааабдасд	дббабадсдб	бдаасбддбд	адбдсббсад	адддбдабса	2820
ббааасадсс	ддббсбдаса	дбсаабадба	сассбабдда	бдбссбсдад	бсддааасба	2880
бдсдсбддсс	дадсасабса	ссадссаддд	абсбддадсд	аасббссдсд	ббасасасбб	2940
даасдасабс	дбсссссддб	бдссасссаб	ддасбббдда	ббсадссадс	саадбссада	3000
абасбддабс	ассадбддса	ссддадссад	бдбсасддсд	бсддабаббд	аасбсабсда	3060
дддаабсааб	бсдасддсдд	ддаабдсадд	сдаадсаасд	дбддасдббб	бддсбсасбб	3120
дбддбасббб	ббсдсааббб	сададбдбсб	дсбабадсбд	дасадбссда	бдааабаадб	3180
дсддададаа	адбдбаааба	дбааббадба	бабаабсадд	сададаадса	дбддбддбса	3240
дадаадааад	адбдадабсс	саббасдбад	садабааасс	асдбдбддад	дсдсбдббсс	3300
бссасббдса	дббдсддсса	бсаабсабсб	бсббсбссбб	асбббсдбсс	ассабаасбс	3360
бсабссбдсс	адсбдбсдса	бссссдддбб	бсаасаасад	бсдссбссдд	дсссбссдбд	3420
дббсбссббб	аббаббссаб	ссдссддссд	асдбббсасс	сбсабссбдс	дссдссдсаа	3480
ббсбсбссдд	абсддбсаад	бсасбсдаас	сдссдсссдс	абсдассбса	ссдасссдас	3540
сдбсбдсдаб	сдсссабссд	бдсадссабд	ббсссбдссс	сдбсасбсбд	абббдасдсб	3600
сааббдасбб	ссдбддсаба	сабасабсса	дсадсабабд	абсасадсбс	ссссдссбсд	3660
бдссадбсбс	дссдссдссд	ссдббдссад	сс			3692

<210>

<211>

894 <212>

ДНК

<220>

<221> СОЗ <222> (1)..(894) <400> 5

л кет Меб 1

ύϋο РЬе

кеб Зег

егета □ Д' О1у

ГПП —ээ Агд 5

ббб РЬе

пета О1у

ст1-сг Уа1

ебб Ьеи

М-сг — Ьеи 10

ага апа

сбс Ьеи

аг! ϋ-- А1а

σπα А1а 15

сба --—* Ьеи

48

ТЬг

А1а

адб

дсб

дед

дса

ссд

аса

сса

ебб

даб

д+д

едд

адб

дбе

бед

асб

бсс

96

Зег

А1а

А1а

А1а

Рго

ТЬг

Рго

Ьеи

Азр

Уа1

Агд

Зег

Уа1

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

асд

ббд

даб

дад

ебд

саа

ббд

ббс

бед

саа

ьдд

бсб

дсс

дса

дсб

баб

144

ТЬг

Ьеи

Азр

С1и

Ьеи

ΘΙη

Ьеи

РЬе

Зег

ΘΙη

Тгр

Зег

А1а

А1а

А1а

Туг

35

40

45

бдс

бед

аас

ааб

абс

дас

бед

дас

дас

бсб

аас

дбд

аса

бде

асд

дсс

192

Суз

Зег

Азп

Азп

Не

Азр

Зег

Азр

Азр

Зег

Азп

Уа1

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

50

55

60

дас

дсс

бдб

сса

бса

дьс

дад

дад

дед

аде

асе

аад

абд

ебд

ебд

дад

240

Азр

А1а

Суз

Рго

Зег

Уа1

С1и

С1и

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

Меб

Ьеи

Ьеи

О1и

65

70

75

80

- 37 008607

ббб

дас

ебд

аса

ааб

аас

ббб

дда

ддс

аса

дсс

ддб

ббс

ебд

дсс

дед

288

РЬе

Азр

Ьеи

ТЬг

Азп

Азп

РЬе

С1у

С1у

ТЬг

А1а

С1у

РЬе

Ьеи

А1а

А1а

85

90

95

дас

аас

асе

аас

аад

едд

сбс

дбд

дбе

дсс

ббс

еда

ддс

адб

аде

асе

336

Азр

Азп

ТЬг

Азп

Ьуз

Агд

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

РЬе

Агд

С1у

Зег

Зег

ТЬг

100

105

110

абс

аад

аас

бдд

абб

дсб

даб

сбс

дас

ббс

абс

ебд

саа

даб

аас

даб

384

Не

Ьуз

Азп

Тгр

11е

А1а

Азр

Ьеи

Азр

РЬе

Не

Ьеи

ΘΙη

Азр

Азп

Азр

115

120

125

дас

сбс

бдб

асб

ддс

бде

аад

дбб

сас

аей

дда

ббс

бдд

аад

дса

бдд

432

Азр

Ьеи

Суз

ТЬг

С1у

Суз

Ьуз

Уа1

Н13

ТЬг

О1у

РЬе

Тгр

Ьуз

А1а

Тгр

130

135

140

даа

дсс

дсб

дса

дас

ааб

ебд

асд

аде

аад

абс

аад

бсс

дед

абд

аде

480

01и

А1а

А1а

А1а

Азр

Азп

Ьеи

ТЬг

Зег

Ьуз

Не

Ьуз

Зег

А1а

Меб

Зег

145

150

155

160

асд

баб

бед

ддс

баб

асе

сбс

бас

ббс

асе

ддд

сас

аде

ббд

ддс

ддс

528

ТЬг

Туг

Зег

С1у

Туг

ТЬг

Ьеи

Туг

РЬе

ТЬг

С1у

ΗΪ3

Зег

Ьеи

С1у

С1у

165

170

175

дса

ббд

дсб

аса

ебд

дда

дса

асд

дбе

ббд

еда

ааб

дас

ддб

баб

аде

576

А1а

Ьеи

А1а

ТЬг

Ьеи

С1у

А1а

ТЬг

Уа1

Ьеи

Агд

Азп

Азр

О1у

Туг

Зег

180

185

190

дбб

даа

ебд

бас

асе

баб

дда

бдб

ссб

еда

дбе

дда

аас

баб

дед

ебд

624

Уа1

О1и

Ьеи

Туг

ТЬг

Туг

О1у

Суз

Рго

Агд

Уа1

О1у

Азп

Туг

А1а

Ьеи

195

200

205

дсс

дад

сас

абс

асе

аде

сад

дда

бсб

дда

дед

аас

ббс

сдс

дбб

аса

672

А1а

(31и

ΗΪ3

11е

ТЬг

Зег

ΘΙη

С1у

Зег

О1у

А1а

Азп

РЬе

Агд

Уа1

ТЬг

210

215

220

сас

ббд

аас

дас

абс

дбе

ссс

едд

ббд

сса

ссс

абд

дас

ббб

дда

ббс

720

Нхз

Ьеи

Азп

Азр

11е

Уа1

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Рго

Меб

Азр

РЬе

С1у

РЬе

225

230

235

240

аде

сад

сса

адб

сса

даа

бас

едд

абс

асе

адб

ддс

асе

дда

дсс

адб

768

Зег

ΘΙη

Рго

Зег

Рго

О1и

Туг

Тгр

11е

ТЬг

Зег

С1у

ТЬг

С1у

А1а

Зег

245

250

255

дбе

асд

дед

бед

даб

абб

даа

сбс

абс

дад

дда

абс

ааб

бед

асд

дед

816

Уа1

ТЬг

А1а

Зег

Азр

11е

С1и

Ьеи

11е

О1и

С1у

Не

Азп

Зег

ТЬг

А1а

260

265

270

ддд

ааб

дса

ддс

даа

дса

асд

д^д

дас

дбб

ббд

дсб

сас

ббд

ьдд

бас

864

С1у

Азп

А1а

<31у

<31и

А1а

ТЬг

Уа1

Азр

Уа1

Ьеи

А1а

Ηίβ

Ьеи

Тгр

Туг

275

280

285

ббб

ббс

дса

абб

бса

дад

бдб

ебд

сба

бад

894

РЬе

РЬе

А1а

Пе

Зег

С1и

Суз

Ьеи

Ьеи

290

295

<210> б <211> 297 <212> РКТ <213> АзрегдШиз пхдег <400> 6

Мей

РЬе

5ег

С1у

Агд

РЬе

С1у

Уа1

Ьеи

Ьеи

ТЬг

А1а

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи

1

5

10

15

Οβν

Ά1

Ά Ί ->

7\ 1 ·=

Π·» V» -V-

Т.ап

Л Г-.-Г-Ч

и-з1

Τ7·= Ί

Οβν

гр 1-1 V.

ΧΆΑ. и

гххи

п± сд.

С

X Л ХД-

ГХ V

хдс и.

гъо

V СХХ

ьд<с;х

V О.Х

исх

X XXX

20

25

30

ТЬг

Ьеи

Азр

С1и

Ьеи

(31п

Ьеи

РЬе

Зег

(31п

Тгр

Зег

А1а

А1а

А1а

Туг

35

40

45

Суз

Зег

Азп

Азп

11е

Азр

Зег

Азр

Азр

Зег

Азп

Уа1

ТЬг

Суз

ТЬг

А1а

50

55

60

Авр

А1а

Суз

Рго

Зег

Уа1

О1и

С1и

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

Мек

Ьеи

Ьеи

С1и

65

70

75

80

РЬе

Азр

Ьеи

ТЬг

Азп

Азп

РЬе

О1у

О1у

ТЬг

А1а

(Э1у

РЬе

Ьеи

А1а

А1а

85

90

95

Азр

Азп

ТЬг

Азп

Ьуз

Агд

Ьеи

Уа1

Уа1

А1а

РЬе

Агд

С1у

Зег

Зег

ТЬг

100

105

110

Не

Ьуз

Азп

Тгр

11е

А1а

Азр

Ьеи

Азр

РЬе

11е

Ьеи

СЛп

Азр

Азп

Азр

115

12 0

125

Азр

Ьеи

Суз

ТЬг

О1у

Суз

Ьуз

Уа1

Н13

ТЬг

С1у

РЬе

Тгр

Ьуз

А1а

Тгр

130

135

140

С1и

А1а

А1а

А1а

Азр

Азп

Ьеи

ТЬг

Зег

Ьуз

11е

Ьуз

Зег

А1а

Мей

Зег

145

150

155

160

ТЬг

Туг

Зег

С1у

Туг

ТЬг

Ьеи

Туг

РЬе

ТЬг

С1у

Ηίβ

Зег

Ьеи

С1у

<31у

165

170

175

А1а

Ьеи

А1а

ТЬг

Ьеи

СЛу

А1а

ТЬг

Уа1

Ьеи

Агд

Азп

Азр

(31у

Туг

Зег

180

185

190

Уа1

С1и

Ьеи

Туг

ТЬг

Туг

О1у

Суз

РГО

Агд

Уа1

С1у

Азп

Туг

А1а

Ьеи

195

200

205

А1а

О1и

Н1з

11е

ТЬг

Зег

О1п

С1у

Зег

01у

А1а

Азп

РЬе

Агд

Уа1

ТЬг

210

215

220

ΗΪ3

Ьеи

Азп

Азр

11е

Уа1

Рго

Агд

Ьеи

Рго

Рго

Мек

Азр

РЬе

(31у

РЬе

225

230

235

240

8ег

<31п

Рго

Зег

Рго

С1и

Туг

Тгр

Не

ТЬг

Зег

С1у

ТЬг

О1у

А1а

Зег

245

250

255

Уа1

ТЬг

А1а

Зег

Азр

11е

С1и

Ьеи

Не

С1и

С1у

11е

Азп

Зег

ТЬг

А1а

260

265

270

О1у

Азп

А1а

С1у

С1и

А1а

ТЬг

Уа1

Азр

Уа1

Ьеи

А1а

Ηίβ

Ьеи

Тгр

Туг

275 280 285

- 39 008607

Рйе РЬе А1а Не Зег С1и Суз Ьеи Ьеи

290 295 <210> 7 <211> 3478 <212> ДНК <213> АзрегдШиз пгдег <400> 7

ЬЬдскдЬаСа	ЬЬЬддЪЕЬЪа	скадаадааа	дЕГЬааСйск	дСЕадЪСддЕ	дЪЪсЬЬдЬдЕ	60
дсЬсЬсаёдЬ	ддсбдасСЬд	адаадасЬса	аакдЬЕддаЬ	дЬсЬдЬсада	дЬаадсЪдас	120
дЬЬдЬЬЬссд	дсдаадкЬЬй	ссЬсЬадЬЬд	саСадСйасс	сйдсйсассс	даадЬЬааЬЬ	180
дсаЬЬадасс	адаадЬЪдда	сасдадсдаа	ссасадсада	дсЬдасЬдса	дсаадссЬЬЬ	240
дсЪдсдсасс	Ъсадссииси	ддисссдидд	асЕСсаиссд	ЪсадсЬссдд	асссасидаЁ	300
сдсЬдЬдаса	ЬсадддЕссЬ	ЬдЬдСдааСд	БаЬассаддд	сссЬЬдсддд	ЬсЬсЬЬаЬсс	360
сЬдадЪадЬЬ	дЬаасдЬааа	ЬдссйЬааЬд	сдЬЬсааадс	аааЬдаЬкса	сЬсасааЬЬд	420
дЬдадЬасса	саёдддадъе	ЪЬсадааЬсЬ	адсааааадс	скаасаадса	дЬдЬдЬсдсс	480
саадаЪсдаЬ	сссдкдбдаа	ссайсаЬсса	ЬдЬЬсддсйй	ассаасЫХа	аЪссЬсадсЬ	540
асЬасЬсЪсЬ	дасйдссадС	ЬсадсЬасдд	ааЬЬдссддЬ	ЬЬаааёсадс	сЬссасаЬдЬ	600
адЬдЬсссда	ассаЬддасЪ	дсааЬЬсаай	дссаЬсЬЬсд	сЬЬсадассс	ЬссааЬсакс	660
СаЬсааадаЬ	ссаЬддССсй	ссадассдса	адсаасдадд	СсасСаЬдаЪ	сассассаад	720
асЬЬсддЬас	сасесСбааС	дсЬЬдасаад	ЬааСддсаСа	ЬсЬасЬассд	аддсссЬсдд	780
седсдсадса	ассЬСддЬсд	ддЬЕддаааС	ЬсдаадСддй	сдсСсеСЕсЬ	СдсЬдЕдаад	840
асдЬсдддда	дадсбдкасе	есассакссс	аасссаССдд	сСЬссесСад	аааасадЬад	900
ссдбайаьеа	сЬбдсбадса	ЬдсадЬдсаС	адсадсбкйа	сЬЬдссЫЩд	саадсабабЬ	960
дЬсаддЬЬЬд	йсаййдРсаЬ	йЬссадйййс	ааЬЬСсасса	ЬйдсасссЬЬ	ссдсадсЬЬс	1020
сддадсйддЬ	сйаассдсад	адЫзссаЬад	дсдкаадЬдс	Ьадскксаас	аакдадЪасд	1080
дсадасасЬЬ	даЬдсадсад	сдсдсдсЬас	саааЕдсдсс	ЬдаЬддайаЬ	асассаасЬа	1140
сддЬсдддЬд	сЬсЬдсдадк	сдЬсссасЕд	ЬдсдсадЪдс	дасадсасЪс	ЬсдЪсдаасд	1200
ааЬсдЪсаЬд	дсЬааддасЬ	сддаддааса	айасасёдЬс	ддссакдада	дааЬЬсЬЬсд	1260
дЬсдсдЬсаа	саЬЬасадас	ЬЬЬдасдсЕд	ЬддддЬаЪаЪ	сааЬсдсаёс	ЬсЬадсааса	1320
ссЬссдаЬИЬ	дссдаакаЬЬ	ддсаёЬдсйд	ЬсЬсСддЬдд	адддкассдд	дсБсЬдакда	1380
асддбдсЬдд	ддсааЬсаад	дсЬСЬЬдаЬа	аСсдЬасадй	сааЬСсСаса	адсааЪддЪс	1440
адсСдддЬдд	асбдсЪдсаа	ЬсадсаасаЬ	айсЪддссдд	ссЬсадЬддЬ	ддддсаЬддй	1500
ЬддЪдддаСс	ЬаЬсЪасЬЬд	ааЪааЪЬЬсЬ	ссассаЪсйс	дбсдсЬЬсад	ассЪасдаЬс	1560
сЬддЬдаЬдЪ	сЬддсадЪЪс	садаасЬсда	ЪсСЬЬдаадд	ссссдасддд	даЬадЬаксс	1620
ааакСаЪада	ЪЪсйдсаасс	Ьасйасадад	абаёйЪайда	сдсадЬдксЬ	ддаааддаЪд	1680
аЬдсаддЬЬд	дсадасаЪсс	аЪсасЬдаЕЕ	асЬддЬаЕда	дЬссЪадссс	ааЬЬсЬсдсс	1740
садсадсдаЬ	асйдаёдссс	ассаддддсс	дсдсдсЬсЬс	аЪассадсЬс	дЬсаасдсса	1800
ссдссддадд	ааксаасйас	ассЬддЬсаЪ	ссайадсйсй	дассдасЕсс	ЬЬсаддаддд	1860
садаааЬдсс	ааЬдсссдйд	скадЪсдсад	асддссдаСа	сссадасдад	сЬссЬадйса	1920
дсадсааёдс	сасадЬскас	дааЬЪсаасс	ссйдддааЪЪ	сддсассЬЬЬ	дасссаасдд	1980

- 40 008607

ЕасасддсЕЕ	сдЕдсссдЕЕ	садЕаЕсЕдд	дсЕсасдсЕЕ	сдЕадссдда	ЕсссЕЕссса	2040
дсаасдааад	сЕдсдЕссдс	дддЕЕЕдаса	аЕддсддсЕЕ	ЕаЕЕаЕддда	ассЕсаЕсса	2100
ссЕЕаЕЕсаа	ссааЕЕссЕЕ	сЕЕсаааЕса	асасаасЕад	ссЕссссадс	ЕЕссЕдааад	2160
асдсаЕЕЕас	аадсаЕссЕа	даадаЕсЕсд	дсдаааасад	ссаадасаЕа	дсадЕЕЕаса	2220
сссссаассс	дЕЕсЕаЕсЕс	ЕдддссааЕЕ	ссассЕсссс	аЕссдсаадс	сааасадЕсс	2280
ЕсдассЕсдЕ	ддаЕддсддс	даадассЕсс	аааасаЕссс	сЕЕасаЕсса	сЕсаЕссадс	2340
сададсдсса	ЕдЕддасдЕс	аЕсЕЕЕдссд	ЕддасЕссЕс	сдсадасасд	садЕаЕаасЕ	2400
ддсссаасдд	сассдсаЕЕа	дЕсдссассЕ	асдадсдсад	ссЕааасЕсЕ	асдддсаЕсд	2460
дсааЕдддас	адсЕЕЕсссЕ	дсЕаЕссссд	ассааааЕас	ЕЕЕЕдЕсааЕ	дадддЕсЕса	2520
аЕасдсдасс	аасдЕЕсЕЕс	дддЕдсаасЕ	саЕсдааЕас	сасЕдддсса	дсассдЕЕад	2580
ЕЕдЕЕЕассЕ	ЕссЕаасЕЕЕ	ссдЕаЕдЕда	сЕЕЕЕЕсдаа	сдЕдЕсдасд	ЕЕЕдаЕссда	2640
дЕЕасЕсдда	дЕсдсададд	даЕадЕаЕЕа	ЕссЕЕааЕдд	дЕаЕдаЕдЕд	дссасдаЕдд	2700
ддааЕааЕад	ЕсдсдаЕддд	дааЕддЕсЕЕ	сЕЕдЕдЕЕдс	дЕдЕдсЕдЕЕ	ЕЕдадЕсддЕ	2760
сЕЕЕЕдаасд	дасЕаасасЕ	асддЕдссдд	аЕсадЕдЕад	ссддЕдсЕЕЕ	дададдЕасЕ	2820
дсЕддуаЕдд	ЕасЕасдааЕ	адЕЕсдасЕс	СуууЕасЕЕа	ЕдадсссадЕ	асддЕаЕЕЕд	2880
аЕааЕдсЕдд	дЕаЕдсЕдЕа	аЕдссЕдсЕд	ЕЕЕЕсдсдас	ЕасдаЕддсЕ	дсЕдсдасЕд	2940
ЕЕЕсддсдЕЕ	ЕаЕдЕаддас	аЕЕЕЕссдсЕ	дЕЕсадддЕд	ЕаЕдЕаЕадЕ	дадаЕЕдаЕа	3000
ддаасадааа	адЕсааЕдса	ЕадЕаддЕЕЕ	аЕаЕдаадаа	адЕаЕаЕааЕ	ЕдЕдсааЕЕс	3060
ааддсаЕЕсс	аЕдаааЕдса	ддадЕдаЕЕд	асдЕдсЕсда	сЕссддаЕда	ддсадсссас	3120
ЕЕсссЕсасд	ЕдЕсдсдЕЕа	ссаддддаас	сассдсссда	Есдсссааас	аадсаадсдд	3180
сасааасадд	адсдЕссасЕ	сдддсдасЕЕ	сдаЕдаЕсдд	ссЕссасЕдс	ЕаасЕадЕса	3240
асаассасдс	саасЕсдасс	ассассаЕсс	ссЕдсЕЕасЕ	ЕЕаасссЕдс	аЕасаадсЕЕ	3300
ссддддЕЕаа	адсаадЕдаЕ	ЕдЕЕсасЕЕа	ЕсдссадЕдд	асдсасааЕд	адсасддсаа	3360
ЕЕсадЕасЕд	адЕссссдсЕ	дссассдаса	сассасааса	даадсдддас	аЕсаасааса	3420
ссассЕссда	ссЕсссдсдс	ддЕадсаЕЕЕ	ассдасЕссд	ааЕаЕЕдаЕс	адсасаса	3478

<210> 8 <211> 1902 <212> ДНК <213 > АзрегдШиз пддег <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(1902) <400> 8

аЕд

сад

Еде

аЕа

дса

дсЕ

ЕЕа

сЕЕ

дсс

ЕЕЕ

дса

аде

аЕа

ЕЕд

Еса

ддс

48

МеЕ

(31п

Суз

Не

А1а

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

РЬе

А1а

Зег

11е

Ьеи

Зег

(31у

1

5

10

15

дЕа

адЕ

дсЕ

аде

ЕЕс

аас

ааЕ

дад

Еас

ддс

ада

сас

ЕЕд

аЕд

сад

сад

96

Уа1

Зег

А1а

Зег

РЬе

Азп

Азп

С1и

Туг

(31у

Агд

ΗΪ3

Ьеи

МеЕ

С1п

О1п

25 30

- 41 008607

сдс

дед

сЕа

сса

ааЕ

дед

ССЕ

даЕ

дда

ЕаЕ

аса

сса

асЕ

асд

дЕс

ддд

144

Агд

А1а

Ьеи

Рго

Азп

А1а

Рго

Азр

О1у

Туг

ТЬг

Рго

ТЬг

ТЬг

Уа1

О1у

35

40

45

Еде

ЕсЕ

дед

адЕ

сдЕ

ссс

асЕ

дьд

сдс

адЕ

дед

аса

дса

сЕс

Есд

Есд

192

Суз

Зег

А1а

Зег

Агд

Рго

ТЬг

Уа1

Агд

Зег

А1а

ТЬг

А1а

Ьеи

Зег

Зег

50

55

60

аас

даа

Есд

Еса

Едд

сЕа

адд

асЕ

едд

адд

аас

ааЕ

аса

сЕд

Есд

дсс

240

Азп

(31и

Зег

Зег

Тгр

Ьеи

Агд

ТЬг

Агд

Агд

Азп

Азп

ТЬг

Ьеи

Зег

А1а

65

70

75

80

аЕд

ада

даа

ЕЕС

ЕЕс

ддЕ

сдс

дЕс

аас

аЕЕ

аса

дас

ЕЕЕ

дас

дсЕ

дед

288

МеЕ

Агд

С1и

РЬе

РЬе

(31у

Агд

Уа1

Азп

11е

ТЬг

Азр

РЬе

Азр

А1а

Уа1

85

90

95

ддд

ЕаЕ

аЕс

ааЕ

сдс

аЕс

ЕсЕ

аде

аас

асе

Есс

даЕ

ЕЕд

сед

ааЕ

аЕЕ

336

С1у

Туг

Не

Азп

Агд

11е

Зег

Зег

Азп

ТЬг

Зег

Азр

Ьеи

Рго

Азп

11е

100

105

110

ддс

аЕЕ

дсЕ

дЕс

ЕсЕ

ддЕ

дда

ддд

Еас

едд

дсЕ

сЕд

аЕд

аас

дде

дсЕ

384

С1у

Не

А1а

Уа1

Зег

<Э1у О1у

С1у

Туг

Агд

А1а

Ьеи

МеЕ

Азп

С1у

А1а

115

120

125

ддд

дса

аЕс

аад

дсЕ

ЕЕЕ

даЕ

ааЕ

сдЕ

аса

дЕс

ааЕ

ЕсЕ

аса

аде

ааЕ

432

О1у

А1а

11е

Ьуз

А1а

РЬе

Азр

Азп

Агд

ТЬг

Уа1

Азп

Зег

ТЬг

Зег

Азп

130

135

140

ддЕ

сад

сЕд

ддЕ

дда

сЕд

сЕд

саа

Еса

дса

аса

ЕаЕ

сЕд

дсс

ддс

сЕс

480

С1у

(31п

Ьеи

О1у

О1у

Ьеи

Ьеи

О1п

Зег

А1а

ТЬг

Туг

Ьеи

А1а

(31у

Ьеи

145

150

155

160

адЕ

ддЕ

ддд

дса

Едд

ЕЕд

дед

дда

ЕсЕ

аЕс

Еас

ЬЕд

ааЕ

ааЕ

ЕЕс

Есс

528

Зег

<31у

О1у

А1а

Тгр

Ьеи

Уа1

О1у

Зег

11е

Туг

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Зег

165

170

175

асе

аЕс

Есд

Есд

СЕЕ

сад

асе

Еас

даЕ

ссЕ

дде

даЕ

дЕс

Едд

сад

ЕЕс

576

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

С1п

ТЬг

Туг

Азр

Рго

(Э1у

Азр

Уа1

Тгр

С1п

РЬе

180

185

190

сад

аас

Есд

аЕс

ЕЕЕ

даа

ддс

ссс

дас

ддд

даЕ

адЕ

аЕс

саа

аЕЕ

аЕа

624

С1п

Авп

Зег

11е

РЬе

О1и

О1у

Рго

Азр

С1у

Азр

Зег

Не

(31п

Не

11е

195

200

205

даЕ

ЕсЕ

дса

асе

Еас

Еас

ада

даЕ

аЕЕ

ЕаЕ

дас

дса

дЕд

ЕсЕ

дда

аад

672

Азр

Зег

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Агд

Азр

Не

Туг

Азр

А1а

Уа1

Зег

<31у

Ьуз

210

215

220

даЕ

даЕ

дса

ддЕ

Едд

сад

аса

Есс

аЕс

асЕ

даЕ

Еас

едд

ддс

сдс

дед

720

Азр

Азр

А1а

<31у

Тгр

<31п

ТЬг

Зег

11е

ТЬг

Азр

Туг

Тгр

С1у Агд

А1а

225

230

235

240

СЕС

Еса

Еас

сад

СЕС

дЕс

аас

дсс

асе

дсс

дда

дда

аЕс

аас

Еас

асе

768

Ьеи

Зег

Туг

(31η

Ьеи

Уа1

Азп

А1а

ТЬг

А1а

61у

С1у

11е

Азп

Туг

ТЬг

245 250 255

- 42 008607

Едд

еса

есс

аеа

дсе

сед

асе

дас

есс

еее

адд

адд

дса

даа

аед

сса

816

Тгр

Зег

Зег

Не

А1а

Ьеи

ТЬг

Азр

Зег

РЬе

Агд

Агд

А1а

С1и

Мее

Рго

260

265

270

аед

ссс

дед

сеа

дес

дса

дас

ддс

еда

еас

сса

дас

дад

сес

сеа

дес

864

Мее

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Азр

С1у

Агд

Туг

Рго

Азр

О1и

Ьеи

Ьеи

Уа1

275

280

285

аде

аде

аае

дсс

аса

дес

еас

даа

еее

аас

ссс

едд

даа

еее

ддс

асе

912

Зег

Зег

Азп

А1а

ТЬг

Уа1

Туг

С!1и

РЬе

Азп

Рго

Тгр

С1и

РЬе

О1у

ТЬг

290

295

300

еее

дас

сса

асд

деа

сас

ддс

еее

дкд

ссс

дее

сад

еае

сед

ддс

еса

960

РЬе

Азр

Рго

ТЬг

Уа1

ΗΪ5

О1у

РЬе

Уа1

Рго

Уа1

С1п

Туг

Ьеи

О1у

Зег

305

310

315

320

сдс

еее

деа

дсс

дда

есс

сее

ссс

аде

аас

даа

аде

еде

дес

сдс

ддд

1008

Агд

РЬе

Уа1

А1а

О1у

Зег

Ьеи

Рго

Зег

Азп

О1и

Зег

Суз

Уа1

Агд

С1у

325

330

335

нее

дас

аае

ддс

ддс

еее

аее

аед

дда

асе

еса

есс

асе

ееа

еее

аас

1056

РЬе

Азр

Азп

(31у

С1у

РЬе

Не

Мее

С1у

ТЬг

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

РЬе

Азп

340

345

350

саа

еее

сее

сее

саа

аес

аас

аса

асе

аде

сес

ссс

аде

еее

сед

ааа

1104

61п

РЬе

Ьеи

Ьеи

Θΐη

Не

Азп

ТЬг

ТЬг

Зег

Ьеи

Рго

Зег

РЬе

Ьеи

Ьуз

355

360

365

дас

дса

еее

аса

аде

аес

сеа

даа

дае

сес

ддс

даа

аас

аде

саа

дас

1152

Азр

А1а

РЬе

ТЬг

Зег

Не

Ьеи

О1и

Азр

Ьеи

(31у

С1и

Азп

Зег

(31п

Азр

370

375

380

аеа

дса

дьь

еас

асе

ссс

аас

ссд

еее

еае

сес

едд

дсс

аае

есс

асе

1200

Не

А1а

Уа1

Туг

ТЬг

Рго

Азп

Рго

РЬе

Туг

Ьеи

Тгр

А1а

Азп

Зег

ТЬг

385

390

395

400

есс

сса

есс

дса

аде

саа

аса

дес

сес

дас

сес

дед

дае

ддс

ддс

даа

1248

Зег

Рго

Зег

А1а

Зег

О1п

ТЬг

Уа1

Ьеи

Азр

Ьеи

Уа1

Азр

О1у

С1у

61и

405

410

415

дас

сес

саа

аас

аес

ссс

ееа

сае

сса

сес

аес

сад

сса

дад

сдс

сае

1296

Азр

Ьеи

Θΐη

Азп

Не

Рго

Ьеи

ΗΪ8

Рго

Ьеи

Не

С1п

Рго

(Э1и

Агд

ΗΪ8

420

425

430

дьд

дас

дес

аес

еее

дсс

дьд

дас

есс

есс

дса

дас

асд

сад

еае

аас

1344

Уа1

Азр

Уа1

Не

РЬе

А1а

Уа1

Азр

Зег

Зег

А1а

Азр

ТЬг

С1п

Туг

Азп

435

440

445

Сдд

ссс

аас

ддс

асе

дса

ееа

дес

дсс

асе

еас

дад

сдс

аде

сеа

аас

1392

Тгр

Рго

Азп

(31у

ТЬг

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

ТЬг

Туг

С1и

Агд

Зег

Ьеи

Азп

450

455

460

ЬсЬ

асд

ддс

аес

ддс

аае

ддд

аса

дсе

еее

ссе

дсе

аес

ссс

дас

саа

1440

Зег

ТЬг

С1у

Не

О1у

Азп

С1у

ТЬг

А1а

РЬе

Рго

А1а

Не

Рго

Азр

(31п

465

470

475

480

- 43 008607

ааЕ

асЕ

ЕЕЕ

дЕс

ааЕ

дад

ддЕ

сЕс

ааЕ

асд

еда

сса

асд

ЕЕс

ЕЕс

ддд

1488

Азп

ТЬг

РЬе

Уа1

Азп

С1и

О1у

Ьеи

Азп

ТЬг

Агд

Рго

ТЬг

РЬе

РЬе

О1у

485

490

495

Еде

аас

Еса

Есд

ааЕ

асе

асЕ

ддд

сса

дса

ссд

ЕЕа

дЕЕ

дЕЕ

Еас

сЕЕ

1536

Суз

Азп

Зег

Зег

Азп

ТЬг

ТЬг

С1у

Рго

А1а

Рго

Ьеи

Уа1

Уа1

Туг

Ьеи

500

505

510

ссЕ

аас

ЕЕЕ

ссд

ЕаЕ

дЕд

асЕ

ЕЕЕ

Есд

аас

дЕд

Есд

асд

ЕЕЕ

даЕ

ссд

1584

Рго

Азп

РЬе

Рго

Туг

Уа1

ТЬг

РЬе

Зег

Азп

Уа1

Зег

ТЬг

РЬе

Азр

Рго

515

520

525

адЕ

Еас

Есд

дад

Есд

сад

адд

даЕ

адЕ

аЕЕ

аЕс

сЕЕ

ааЕ

ддд

ЕаЕ

даЕ

1632

8ег

Туг

Зег

СЯи

Зег

С1п

Агд

Азр

Зег

11е

11е

Ьеи

Азп

С1у

Туг

Азр

530

535

540

дЕд

дсс

асд

аЕд

ддд

ааЕ

ааЕ

адЕ

сдс

даЕ

ддд

даа

Едд

ЕсЕ

ЕсЕ

ЕдЕ

1680

Уа1

А1а

ТЬг

МеЕ

С1у

Азп

Азп

Зег

Агд

Азр

С1у

<31и

Тгр

Зег

Зег

Суз

545

550

555

560

дЕЕ

дед

ЕдЕ

дсЕ

дЕЕ

ЕЕд

адЕ

сдд

ЕсЕ

ЕЕЕ

даа

сдд

асЕ

аас

асЕ

асд

1728

Уа1

А1а

Суз

А1а

Уа1

Ьеи

Зег

Агд

Зег

РЬе

С1и

Агд

ТЬг

Азп

ТЬг

ТЬг

565

570

575

дЕд

ссд

даЕ

сад

ЕдЕ

аде

сдд

Еде

ЕЕЕ

дад

адд

Еас

Еде

Едд

даЕ

ддЕ

1776

Уа1

Рго

Азр

С1п

Суз

Зег

Агд

Суз

РЬе

С1и

Агд

Туг

Суз

Тгр

Азр

О1у

580

585

590

асЕ

асд

ааЕ

адЕ

Есд

асЕ

ссд

ддЕ

асЕ

ЕаЕ

дад

ссс

адЕ

асд

дЕа

ЕЕЕ

1824

ТЬг

ТЬг

Азп

Зег

Зег

ТЬг

Рго

С1у

ТЬг

Туг

С1и

Рго

Зег

ТЬг

Уа1

РЬе

595

600

605

даЕ

ааЕ

дсЕ

ддд

ЕаЕ

дсЕ

дЕа

аЕд

ссЕ

дсЕ

дЕЕ

ЕЕс

дед

асЕ

асд

аЕд

1872

Азр

Азп

А1а

О1у

Туг

А1а

Уа1

МеЕ

Рго

А1а

Уа1

РЬе

А1а

ТЬг

ТЬг

МеЕ

610

615

620

дсЕ

дсЕ

дед

асЕ

дЕЕ

Есд

дед

ЕЕЕ

аЕд

Еад

1902

А1а

А1а

А1а

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

РЬе

МеЕ

625

630

<210>

9

<211>

633

<212>

РКТ

<213>

АзрегдШиз пхдег

<400>

9

МеЕ Θΐη

Суз

Не

А1а А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

РЬе

А1а

Зег

11е

Ьеи

Зег

С1у

1

5

10

15

Уа1 Зег

А1а

Зег

РЬе Азп

Азп

О1и

Туг

СНу

Агд

ΗΪ3

Ьеи

МеЕ

С1п

С1п

20

25

30

- 44 008607

Агд А1а Ьеи Рго Азп

А1а

Рго

Азр С1у Туг ТЬг 40

Рго ТЬг ТЬг 45

Уа1

СЛу

35

Суз

Зег

А1а

Зег

Агд

Рго

ТЬг

Уа1

Агд

Зег

А1а

ТЬг

А1а

Ьеи

Зег

Зег

50

55

60

Азп

СЛи

Зег

Зег

Тгр

Ьеи

Агд

ТЬг

Агд

Агд

Азп

Азп

ТЬг

Ьеи

Зег

А1а

65

70

75

80

Мей

Агд

СЛи

РЬе

РЬе

С1у

Агд

Уа1

Азп

Не

ТЬг

Азр

РЬе

Азр

А1а

Уа1

85

90

95

СЛу

Туг

Не

Азп

Агд

11е

Зег

Зег

Азп

ТЬг

Зег

Азр

Ьеи

Рго

Азп

Не

100

105

110

СЛу

Не

А1а

Уа1

Зег

СЛу

С1у

СЛу

Туг

Агд

А1а

Ьеи

МеС

Азп

<31у

А1а

115

120

125

СЛу

А1а

11е

Ьуз

А1а

РЬе

Азр

Азп

Агд

ТЬг

Уа1

Азп

Зег

ТЬг

Зег

Азп

130

135

140

С1у

СЛп

Ьеи

О1у

СЛу

Ьеи

Ьеи

СЛп

Зег

А1а

ТЬг

Туг

Ьеи

А1а

СЛу

Ьеи

145

150

155

160

Зег

СЛу

С1у

А1а

Тгр

Ьеи

Уа1

СЛу

Зег

Не

Туг

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Зег

165

170

175

ТЬг

11е

Зег

Зег

Ьеи

СЛп

ТЬг

Туг

Азр

Рго

С1у

Азр

Уа1

Тгр

СЛп

РЬе

180

185

190

(31п

Азп

Зег

11е

РЬе

СЛи

СЛу

Рго

Азр

СЛу

Азр

Зег

Не

СЛп

11е

Не

195

200

205

Азр

Зег

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Агд

Азр

11е

Туг

Азр

А1а

Уа1

Зег

(Лу

Ьуз

210

215

220

Азр

Азр

А1а

СЛу

Тгр

СЛп

ТЬг

Зег

11е

ТЬг

Азр

Туг

Тгр

СЛу

Агд

А1а

225

230

235

240

Ьеи

Зег

Туг

СЛп

Ьеи

Уа1

Азп

А1а

ТЬг

А1а

СЛу

СЛу

Не

Азп

Туг

ТЬг

245

250

255

Тгр

Зег

Зег

Пе

А1а

Ьеи

ТЬг

Азр

Зег

РЬе

Агд

Агд

А1а

СЛи

Меп

Рго

260

265

270

Мей

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

Азр

СЛу

Агд

Туг

Рго

Азр

С1и

Ьеи

Ьеи

Уа1

275

280

285

Зег

Зег

Азп

А1а

ТЬг

Уа1

Туг

СЛи

РЬе

Азп

Рго

Тгр

СЛи

РЬе

С1у

ТЬг

290

295

300

РЬе

Авр

Рго

ТЬг

Уа1

Нхз

СЛу

РЬе

Уа1

Рго

Уа1

СЛп

Туг

Ьеи

СЛу

Зег

305

310

315

320

Агд

РЬе

Уа1

А1а

СЛу

Зег

Ьеи

Рго

Зег

Азп

О1и

Зег

Суз

Уа1

Агд

СЛу

325

330

335

РЬе

Азр

Азп

СЛу

СЛу

РЬе

11е

МеЪ

С1у

ТЬг

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

РЬе

Азп

340

345

350

СЛп

РЬе

Ьеи

Ьеи

С31п

11е

Азп

ТЬг

ТЬг

Зег

Ьеи

Рго

Зег

РЬе

Ьеи

Ьуз

355

360

365

- 45 008607

Азр А1а 370

РЬе

ТЬг

Зег 11е Ьеи 375

<31и Азр

Ьеи

61у

<31и 380

Азп Зег СЛп

Азр

11е

А1а

Уа1

Туг

ТЬг

Рго

Азп

Рго

РЬе

Туг

Ьеи

Тгр

А1а

Азп

Зег

ТЬг

385

390

395

400

Зег

Рго

Зег

А1а

Зег

С1п

ТЬг

Уа1

Ьеи

Азр

Ьеи

Уа1

Азр

С1у

СЛу

СЛи

405

410

415

Азр

Ьеи

СЛп

Азп

11е

Рго

Ьеи

ΗΪ5

Рго

Ьеи

11е

СЛп

Рго

С1и

Агд

ΗΪ8

420

425

430

Уа1

Азр

Уа1

11е

РЬе

А1а

Уа1

Азр

Зег

Зег

А1а

Азр

ТЬг

СЛп

Туг

Азп

435

440

445

Тгр

Рго

Азп

С1у

ТЬг

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

ТЬг

Туг

О1и

Агд

Зег

Ьеи

Азп

450

455

460

Зег

ТЬг

С1у

11е

(31у

Азп

С1у

ТЬг

А1а

РЬе

Рго

А1а

11е

Рго

Азр

СЛп

465

470

475

480

Азп

Т11Г

РЬе

Уа1

Азп

С1и

С1у

Ьеи

Азп

ТЬг

Агд

Рго

ТЬг

РЬе

РЬе

СЛу

485

490

495

Суз

Азп

Зег

Зег

Азп

ТЬг

ТЬг

С1у

Рго

А1а

Рго

Ьеи

Х7а1

Уа1

Туг

Ьеи

500

505

510

Рго

Азп

РЬе

Рго

Туг

Уа1

ТЬг

РЬе

Зег

Азп

Уа1

Зег

ТЬг

РЬе

Азр

Рго

515

520

525

Зег

Туг

Зег

О1и

Зег

61п

Агд

Азр

Зег

Не

Не

Ьеи

Азп

С1у

Туг

Азр

530

535

540

Уа1

А1а

ТЬг

МеЕ

61у

Азп

Азп

Зег

Агд

Азр

СЛу

С1и

Тгр

Зег

Зег

Суз

545

550

555

560

Уа1

А1а

Суз

А1а

Уа1

Ьеи

Зег

Агд

Зег

РЬе

С1и

Агд

ТЬг

Азп

ТЬг

ТЬг

565

570

575

Уа1

Рго

Азр

С1п

Суз

Зег

Агд

Суз

РЬе

СЛи

Агд

Туг

Суз

Тгр

Азр

С1у

580

585

590

ТЬг

ТЬг

Азп

Зег

Зег

ТЬг

Рго

С1у

ТЬг

Туг

СЛи

Рго

Зег

ТЬг

Уа1

РЬе

595

600

605

Азр

Азп

А1а

01у

Туг

А1а

Уа1

МеЕ

Рго

А1а

Уа1

РЬе

А1а

ТЬг

ТЬг

МеЕ

610

615

620

А1а

А1а

А1а

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

РЬе

МеЕ

625 630 <210> 10 <211> 2292 <212> ДНК <213 > АзрегдШиз пддег <400> 10 сасадсЕдда садааЕддсЕ ддссЕЕдааЕ дсЕаЕаЕдса аЕасаддсаа саасассЕсд

- 46 008607

аЕсЕдааЕаЕ	адЕаЕссада	ддсЕЕдЕЕЕа	асдсаЕдаЕд	ЕсаЕаЕааЕЕ	аааЕаЕаЕаЕ	120
аЕаЕааЕдаЕ	сддЕассЕЕс	садссаЕаас	ассаасЕЕса	дсадсаасаа	ЕЕЕсааЕЕсЕ	180
сЕЕдсадЕсс	саааадЕсЕс	дЕЕдсааЕдс	ЕдЕсдсЕЕЕЕ	ааЕаЕсадса	дсадсЕдсса	240
сЕсЕсдсаЕс	ЕдсссЕддаа	сЕЕссссадд	дЕЕаЕЕсссс	ддаЕссЕдЕс	ЕсЕЕдсссаа	300
саааЕсЕЕЕс	аЕддаЕссда	ссддсадЕЕд	дасЕсадсад	адаЕдаадсд	сааЕдддЕЕд	360
аадддсддаа	дааЕдЕсаЕс	сЕдддсЕсаЕ	ЕадасдсаЕа	ЕЕЕдааасда	сЕсаассЕдд	420
асдасЕЕсда	сасадасдаа	ЕасаЕаЕсдс	дЕсЕсаасаа	сассадЕсад	ассссааЕса	480
ЕдддааЕддс	саЕсадЕдда	ддаддЕЕЕсд	даЕссдссЕа	сассдддасЕ	ддЕсЕааЕсс	540
дЕдсЕЕЕдда	ЕдассдЕсЕЕ	сссдсадсса	асдадсаасд	ЕассддЕдда	сЕЕсЕасааа	600
дсаЕдассЕа	ЕсЕдЕсЕддЕ	ЕЕдЕсЕддад	даЕссЕддсс	сдсадЕдЕсс	ЕЕсссаЕсаЕ	660
асаасЕЕЕсс	сассдсадас	дадаЕЕдЕсд	аЕЕасЕддаа	ассддадаЕЕ	дассдаЕЕсЕ	720
ЕсасддЕсас	даасассЕсЕ	дсЕдаадсЕд	сЕасЕддааа	ддссаЕсЕЕЕ	даасадаЕЕд	780
сЕасдаадЕа	ссЕддсЕддс	ЕЕсдаддЕад	сдсЕаадЕда	ЕЕаЕсЕадда	сдаддаЕЕЕд	840
сдЕасдадЕЕ	саЕЕсссдда	сааЕссддсд	дссЕааасас	сасдЕЕЕЕсд	дддаЕссдда	900
аЕсЕаадсаа	ЕЕЕЕаЕсааЕ	саЕсаааЕдс	сдаЕдссЕаЕ	саЕЕсаЕсЕд	дсЕЕсадЕЕд	960
аассддаада	ЕдсададЕас	ЕасдассЕЕЕ	ЕддЕдссдЕс	аЕсЕааЕдда	асдаЕЕдЕаа	1020
дЕадЕдсЕЕс	ЕЕсЕсдаЕаа	асЕассадсЕ	ссадсЕаасд	сддЕсЕадЕЕ	ЕдаЕЕЕдасЕ	1080
сссЕЕсдааЕ	ЕсддсдссЕд	ддасддадас	дЕдсаЕдсаЕ	ЕЕасасссас	ЕдадЕддсЕс	1140
ддааассаас	ЕаЕссаасдд	ЕаЕЕсссдЕа	аассададса	ааЕдсЕддаа	аддаЕЕЕдаЕ	1200
сдаЕссЕсдЕ	аадЕаасадЕ	аЕддссссад	ссЕсдсасдс	ЕЕсЕаасЕЕс	аЕсссадасЕ	1260
ЕдЕсаЕсддс	ассЕссдссд	асдссЕЕсаа	сЕЕсЕддЕас	сЕсдааадсд	ЕсЕссаасдд	1320
аасссЕЕддс	сааЕЕЕдсса	аасдсЕссас	сасЕсасдад	ЕссЕсЕсЕса	ссааасдаЕЕ	1380
дЕсссаассЕ	дссаассЕда	асдсасЕсдЕ	ЕдасдссЕЕс	саададассЕ	ЕЕдаЕсЕааа	1440
ссЕаасссаа	аЕсЕссЕасЕ	сдаааЕЕссс	саасссаЕЕс	ассаассЕаЕ	сссЕсЕсЕас	1500
сддЕааЕасс	сасаааЕссЕ	саасссЕааа	ссЕсдЕсдас	ддсадсдааа	саддссааас	1560
ааЕсссссЕс	Еддддссада	Ессадсссдс	дсдсаасдЕс	дасЕЕсаЕса	ЕадссЕддда	1620
сдасЕсссаа	дасдсадасс	ссЕасадсЕд	даасаасддс	асааассЕсЕ	асаасасдЕа	1680
ссЕсдссдсс	аасдсаасад	ддсЕЕсссЕЕ	ЕссдаЕааЕс	ссасссЕсса	даасааЕдаЕ	1740
даассЕдааЕ	ЕасасЕсЕсс	аЕссасааЕЕ	сЕЕсддсЕдс	дасдссаасс	Есассассас	1800
аддсдасдас	сдсдсассЕа	ЕсдЕдсЕдЕа	ЕаЕддсЕааЕ	дсдссдЕаЕа	дсдсаЕасас	1860
даасЕЕсЕсд	ЕЕсЕддсада	сддадасдад	Есддсадсаа	аЕдддддада	ЕаЕЕсдЕдаа	1920
ЕадЕЕЕЕдаЕ	аЕЕдЕЕасдс	аадсдааЕдд	дЕсдЕдддаЕ	ддддадЕддд	сддадЕдЕаЕ	1980
ддддЕдЕдсд	дсЕдЕддааа	даадЕЕЕддс	дсдсдЕдддс	аЕддададда	сдаддсадЕд	2040
ЕсадсддЕдс	ЕЕЕдададдЕ	аЕЕдЕЕддда	ЕдддасасЕЕ	даЕдададдд	аЕссЕддддЕ	2100
дЕЕддаЕссд	асдЕЕадЕЕЕ	ЕддаЕссддд	ддЕдаадЕЕЕ	дддЕЕдЕдда	аЕдсЕасдаа	2160
ЕссЕЕаЕЕда	ЕдсЕддЕЕЕЕ	ддадЕЕасад	ддддаддсЕд	дЕсЕдддаад	дЕаЕадЕасЕ	2220
ЕаддсЕЕЕдЕ	ддаЕдааада	ааЕаЕдЕдаЕ	аЕЕЕддсаад	ЕЕсасссЕаЕ	адасссаЕсЕ	2280
даЕсЕЕЕЕЕЕ	ьд					2292

<210> 11 <211> 1863 <212> ДНК

- 47 008607 <213 > АзрегдШиз пхдег <220>

<221> СЬЗ <222> (1).. (1863) <400> 11

абд

ебд

бед

ебб

бба

аба

бса

дса

дса

дсб

дсс

асб

сбс

дса

бсб

дсс

48

Меб

Ьеи

Зег

Ьеи

Ьеи

Не

Зег

А1а

А1а

А1а

А1а

ТЬг

Ьеи

А1а

Зег

А1а

1

5

10

15

ебд

даа

ебб

ссс

сад

ддб

баб

бсс

сед

даб

ссб

дбе

бсб

бде

сса

аса

96

Ьеи

С1и

Ьеи

Рго

ΘΙη

С1у

Туг

Зег

Рго

Азр

Рго

Уа1

Зег

Суз

Рго

ТЬг

20

25

30

ааб

ебб

бса

бдд

абс

еда

сед

дса

дбб

дда

сбс

аде

ада

даб

даа

дед

144

Азп

Ьеи

Зег

Тгр

Не

Агд

Рго

А1а

Уа1

С1у

Ьеи

Зег

Агд

Азр

С1и

А1а

35

40

45

саа

ьдд

дбб

даа

ддд

едд

аад

ааб

дбе

абс

ебд

ддс

бса

бба

дас

дса

192

ΘΙη

Тгр

Уа1

О1и

С1у

Агд

Ьуз

Азп

Уа1

11е

Ьеи

О1у

Зег

Ьеи

Азр

А1а

50

55

60

баб

ббд

ааа

еда

сбс

аас

ебд

дас

дас

ббс

дас

аса

дас

даа

бас

аба

240

Туг

Ьеи

Ьуз

Агд

Ьеи

Азп

Ьеи

Азр

Азр

РЬе

Азр

ТЬг

Азр

С1и

Туг

Не

ГЕ

•7 Λ

ТС

оп

и

1 V

/

и ν

бед

едб

сбс

аас

аас

асе

адб

сад

асе

сса

абс

абд

дда

абд

дсс

абс

288

Зег

Агд

Ьеи

Азп

Азп

ТЬг

Зег

ΘΙη

ТЬг

Рго

Не

Меб

О1у

Меб

А1а

Не

85

90

95

адб

дда

дда

ддь

ббс

дда

бсс

дсс

бас

асе

ддд

асб

ддь

сба

абс

едб

336

Зег

(31у

С1у

О1у

РЬе

С1у

Зег

А1а

Туг

ТЬг

С1у

ТЬг

О1у

Ьеи

11е

Агд

100

105

110

гггЧ·

Ма

аа1

ЛЯГ

паЧ

ебб

ссс

опа

пгг

аас

пяа

саа

на!·

асе

ασί

ааа

384

з--

— ”3

д’— —

3--

з —

з

3--

з—з

— 3 —

33 —

33 —

А1а

Ьеи

Азр

Азр

Агд

Ьеи

Рго

А1а

А1а

Азп

61и

ΘΙη

Агд

ТЬг

С1у

С1у

115

120

125

ебб

сба

саа

аде

абд

асе

баб

ебд

бсб

ддь

ббд

бсб

дда

дда

бсс

бдд

432

Ьеи

Ьеи

ΘΙη

Зег

Меб

ТЬг

Туг

Ьеи

Зег

О1у

Ьеи

Зег

О1у

О1у

Зег

Тгр

130

135

140

ссс

дса

дбд

бсс

ббс

сса

бса

бас

аас

ббб

ссс

асе

дса

дас

дад

абб

480

Рго

А1а

Уа1

Зег

РЬе

Рго

Зег

Туг

Азп

РЬе

Рго

ТЬг

А1а

Азр

С1и

11е

145

150

155

160

дбе

даб

бас

бдд

ааа

сед

дад

абб

дас

еда

ббс

ббс

асд

дбе

асд

аас

528

Уа1

Азр

Туг

Тгр

Ьуз

Рго

С1и

Не

Азр

Агд

РЬе

РЬе

ТЬг

Уа1

ТЬг

Азп

165

170

175

асе

бсб

дсб

даа

дсб

дсб

асб

дда

аад

дсс

абс

ббб

даа

сад

абб

дсб

576

ТЬг

Зег

А1а

(31и

А1а

А1а

ТЬг

С1у

Ьуз

А1а

Не

РЬе

С1и

ΘΙη

11е

А1а

180

185

190

- 48 008607

асд

аад

Еас

сЕд дсЕ

ддс

ЕЕс

дад

дЕа дед

сЕа

адЕ

даЕ

ЕаЕ

сЕа

дда

624

ТЬг

Ьуз

Туг

Ьеи

А1а

С1у

РЬе

С1и

Уа1

А1а

Ьеи

Зег

Азр

Туг

Ьеи

С1у

195

200

205

еда

дда

ЕЕЕ

дед

Еас

дад

ЕЕс

аЕЕ

ссс

дда

саа

Есс

ддс

ддс

сЕа

аас

672

Агд

С1у

РЬе

А1а

Туг

О1и

РЬе

Не

Рго

О1у

ΘΙη

Зег

С1у

С1у

Ьеи

Азп

210

215

220

асе

асд

ЕЕЕ

Есд

ддд

аЕс

едд

ааЕ

сЕа

аде

ааЕ

ЕЕЕ

аЕс

ааЕ

саЕ

саа

720

ТЬг

ТЬг

РЬе

Зег

О1у

11е

Агд

Азп

Ьеи

Зег

Азп

РЬе

Не

Азп

ΗΪ3

С1п

225

230

235

240

аЕд

ссд

аЕд

ССЕ

аЕс

аЕЕ

саЕ

сЕд

дсЕ

Еса

дЕЕ

даа

ссд

даа

даЕ

дса

768

МеЕ

Рго

МеЕ

Рго

11е

11е

ΗΪ3

Ьеи

А1а

Зег

Уа1

О1и

Рго

С1и

Азр

А1а

245

250

255

дад

Еас

Еас

дас

сЕЕ

ЕЕд

дьд

ссд

Еса

ЕсЕ

ааЕ

дда

асд

аЕЕ

ЕЕЕ

даЕ

816

Й1и

Туг

Туг

Азр

Ьеи

Ьеи

Уа1

Рго

Зег

Зег

Азп

О1у

ТЬг

Не

РЬе

Азр

260

265

270

ЕЕд

асЕ

ссс

ЕЕс

даа

ЕЕс

ддс

дсс

Едд

дас

дда

дас

дЕд

саЕ

дса

ЕЕЕ

864

Ьеи

ТЬг

Рго

РЬе

С1и

РЬе

С1у

А1а

Тгр

Азр

С1у

Авр

Уа1

ΗΪ8

А1а

РЬе

275

280

285

аса

ссс

асЕ

дад

Едд

сЕс

дда

аас

саа

сЕа

Есс

аас

ддЕ

аЕЕ

ссс

дЕа

912

ТЬг

Рго

ТЬг

О1и

Тгр

Ьеи

О1у

Азп

ΘΙη

Ьеи

Зег

Азп

С1у

Не

Рго

Уа1

290

295

300

аас

сад

аде

ааа

Еде

Едд

ааа

дда

ЕЕЕ

даЕ

еда

Есс

Еса

СЕЕ

дЕс

аЕс

960

Азп

ΘΙη

Зег

Ьуз

Суз

Тгр

Ьуз

С1у

РЬе

Азр

Агд

Зег

Зег

Ьеи

Уа1

Не

305

310

315

320

ддс

асе

Есс

дсс

дас

дсс

ЕЕс

аас

ЕЕс

Едд

Еас

сЕс

даа

аде

дЕс

Есс

1008

<31у

ТЬг

Зег

А1а

Азр

А1а

РЬе

Азп

РЬе

Тгр

Туг

Ьеи

С1и

Зег

Уа1

Зег

325

330

335

аас

дда

асе

СЕЕ

ддс

саа

ЕЕЕ

дсс

ааа

сдс

Есс

асе

асЕ

сас

дад

Есс

1056

Азп

О1у

ТЬг

Ьеи

О1у

ΘΙη

РЬе

А1а

Ьуз

Агд

Зег

ТЬг

ТЬг

Ηίβ

О1и

Зег

340

345

350

ЕсЕ

сЕс

асе

ааа

еда

ЕЕд

Есс

саа

ссЕ

дсс

аас

сЕд

аас

дса

сЕс

дЕЕ

1104

8ег

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Агд

Ьеи

Зег

ΘΙη

Рго

А1а

Азп

Ьеи

Азп

А1а

Ьеи

Уа1

355

360

365

дас

дсс

ЕЕС

саа

дад

асе

ЕЕЕ

даЕ

сЕа

аас

сЕа

асе

саа

аЕс

Есс

Еас

1152

Азр

А1а

РЬе

ΘΙη

С1и

ТЬг

РЬе

Азр

Ьеи

Азп

Ьеи

ТЬг

ΘΙη

Не

Зег

Туг

370

375

380

Есд

ааа

ЕЕс

ссс

аас

сса

ЕЕс

асе

аас

сЕа

Есс

сЕс

ЕсЕ

асе

ддЕ

ааЕ

1200

Зег

Ьуз

РЬе

Рго

Азп

Рго

РЬе

ТЬг

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

О1у

Азп

385

390

395

400

асе

сас

ааа

Есс

Еса

асе

сЕа

аас

сЕс

дЕс

дас

ддс

аде

даа

аса

ддс

1248

ТЬг

Ηίβ

Ьуз

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

Азп

Ьеи

Уа1

Азр

С1у

Зег

С1и

ТЬг

О1у

405

410

415

- 49 008607

саа

аса

аРс

ссс

сРс

Рдд

ддс

сад

аРс

сад

ссс

дед

сдс

аас

др с

дас

1296

Θΐη

ТЬг

Не

Рго

Ьеи

Тгр

С1у

С1п

Не

С1п

Рго

А1а

Агд

Азп

Уа1

Азр

420

425

430

РРс

аРс

аРа

дес

ьдд

дас

дас

Рсс

саа

дас

дса

дас

ссс

Рас

аде

Рдд

1344

РЬе

Не

Не

А1а

Тгр

Азр

Азр

Зег

С1п

Азр

А1а

Азр

Рго

Туг

Зег

Тгр

435

440

445

аас

аас

ддс

аса

аас

сРс

Рас

аас

асд

Рас

сРс

дсс

дсс

аас

дса

аса

1392

Азп

Азп

СЛу

ТЬг

Азп

Ьеи

Туг

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

А1а

А1а

Азп

А1а

ТЬг

450

455

460

ддд

срр

ссс

ррр

сед

аРа

аРс

сса

ссс

Рсс

ада

аса

аРд

аРд

аас

сРд

1440

С1у

Ьеи

Рго

РЬе

Рго

Не

Не

Рго

Рго

Зег

Агд

ТЬг

Мер

Мер

Азп

Ьеи

465

470

475

480

ааР

Рас

асР

сРс

саР

сса

саа

РРс

РРс

ддс

Рдс

дас

дсс

аас

сРс

асе

1488

Азп

Туг

ТЬг

Ьеи

НХЗ

Рго

Θΐη

РЬе

РЬе

С1у

Суз

Азр

А1а

Азп

Ьеи

ТЬг

485

490

495

асе

аса

ддс

дас

дас

еде

дса

ССР

аРс

дрд

сРд

РаР

аРд

дсР

ааР

дед

1536

ТЬг

ТЬг

С1у

Азр

Азр

Агд

А1а

Рго

Не

Уа1

Ьеи

Туг

Мер

А1а

Азп

А1а

500

505

510

сед

РаР

аде

дса

Рас

асд

аас

РРс

Рсд

РРс

Рдд

сад

асд

дад

асд

адР

1584

Рго

Туг

Зег

А1а

Туг

ТЬг

Азп

РЬе

Зег

РЬе

Тгр

О1п

ТЬг

О1и

ТЬг

Зег

515

520

525

г«гтгт

г»згг

СЗ-м.

βΊ-γύ

гтгтгт

гтагт

а

ύϋο

гтЬгт

за £

агтЬ

РРР

гт а Ъ

πύϋ

гт+“ к

агп

1632

332

Э'-Э

Э’-’-

э *-

’-'-’Э

Агд

(31п

СПп

Мер

<31у

<31и

Не

РЬе

Уа1

Азп

Зег

РЬе

Азр

Не

Уа1

ТЬг

530

535

540

саа

дед

ааР

ддд

Рсд

ьдд

даР

ддд

дад

Рдд

дед

дад

РдР

аРд

ддд

РдР

1680

С1п

А1а

Азп

С1у

Зег

Тгр

Азр

О1у

О1и

Тгр

А1а

С1и

Суз

Мер

(31у

Суз

545

550

555

560

дед

дек

дьд

даа

ада

адр

РРд

дед

сдс

дрд

ддс

ард

дад

адд

асд

адд

1728

А1а

А1а

Уа1

С1и

Ага ---—л

Зег

Ьеи

А1а

Агд

Уа1

<31у

Мер

(31и

Агд

ТЬг

Агд

565

570

575

сад

ЬдЬ

сад

едд

Рдс

РРР

дад

адд

РаР

РдР

Рдд

даР

ддд

аса

сРР

даР

1776

О1п

Суз

С1п

Агд

Суз

РЬе

О1и

Агд

Туг

Суз

Тгр

Азр

С1у

ТЬг

Ьеи

Азр

580

585

590

дад

адд

дар

ссР

ддд

дьд

РРд

даР

ссд

асд

РРа

дрр

РРд

даР

ссд

ддд

1824

С1и

Агд

Азр

Рго

С1у

Уа1

Ьеи

Азр

Рго

ТЬг

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азр

Рго

С1у

595

600

605

дЬд

аад

РРР

ддд

РРд

Рдд

ааР

дсР

асд

ааР

ссР

РаР

Рда

1863

Уа1

Ьуз

РЬе

С1у

Ьеи

Тгр

Азп

А1а

ТЬг

Азп

Рго

Туг

610

615

620

<210> 12 <211> 620

- 50 008607 <212> ΡΗΤ <213> АзрегдШиз пгдег <400> 12

Меб

Ьеи

Зег

Ьеи

Ьеи

11е

Зег

А1а

А1а

А1а

А1а

ТЬг

Ьеи

А1а

Зег

А1а

1

5

10

15

Ьеи

О1и

Ьеи

Рго

О1п

О1у

Туг

Зег

Рго

Азр

Рго

Уа1

Зег

Суз

Рго

ТЬг

20

25

30

Азп

Ьеи

Зег

Тгр

11е

Агд

Рго

А1а

Уа1

О1у

Ьеи

Зег

Агд

Азр

О1и

А1а

35

40

45

ΘΙη

Тгр

Уа1

О1и

О1у

Агд

Ьуз

Азп

Уа1

Х1е

Ьеи

О1у

Зег

Ьеи

Азр

А1а

50

55

60

Туг

Ьеи

Ьуз

Агд

Ьеи

Азп

Ьеи

Азр

Азр

РЬе

Азр

ТЬг

Азр

О1и

Туг

Х1е

65

70

75

80

Зег

Агд

Ьеи

Азп

Азп

ТЬг

Зег

О1п

ТЬг

Рго

Х1е

Меб

О1у

Меб

А1а

11е

85

90

95

Зег

О1у О1у

О1у

РЬе

О1у

Зег

А1а

Туг

ТЬг

О1у

ТЬг

О1у

Ьеи

11е

Агд

100

105

110

А1а

Ьеи

Азр

Азр

Агд

Ьеи

Рго

А1а

А1а

Азп

01и

О1п

Агд

ТЬг

О1у

О1у

115

120

125

Ьеи

Ьеи

О1п

Зег

Меб

ТЬг

Туг

Ьеи

Зег

О1у

Ьеи

Зег

О1у

О1у

Зег

Тгр

130

135

140

Рго

А1а

Уа1

Зег

РЬе

Рго

Зег

Туг

Азп

РЬе

Рго

ТЬг

А1а

Азр

О1и

11е

145

150

155

160

Уа1

Азр

Туг

Тгр

Ьуз

Рго

О1и

11е

Азр

Агд

РЬе

РЬе

ТЬг

Уа1

ТЬг

Азп

165

170

175

ТЬг

Зег

А1а

Θ1 и

А1а

А1а

ТЬг

О1у

Ьуз

А1а

11е

РЬе

О1и

О1п

11е

А1а

180

185

190

ТЬг

Ьуз

Туг

Ьеи

А1а

О1у

РЬе

О1и

Уа1

А1а

Ьеи

Зег

Азр

Туг

Ьеи

О1у

195

200

205

Агд

01у

РЬе

А1а

Туг

О1и

РЬе

11е

Рго

О1у

О1п

Зег

О1у

О1у

Ьеи

Азп

210

215

220

ТЬг

ТЬг

РЬе

Зег

О1у

Х1е

Агд

Азп

Ьеи

Зег

Азп

РЬе

11е

Азп

ΗΪ3

О1п

225

230

235

240

Меб

Рго

Меб

Рго

11е

11е

ΗΪ3

Ьеи

А1а

Зег

Уа1

О1и

Рго

О1и

Азр

А1а

245

250

255

01и

Туг

Туг

Азр

Ьеи

Ьеи

Уа1

Рго

Зег

Зег

Азп

О1у

ТЬг

11е

РЬе

Азр

260

265

270

Ьеи

ТЬг

Рго

РЬе

О1и

РЬе

О1у

А1а

Тгр

Азр

01у

Азр

Уа1

ΗΪ8

А1а

РЬе

275

280

285

ТЬг

Рго

ТЬг

О1и

Тгр

Ьеи

О1у

Азп

О1п

Ьеи

Зег

Азп

О1у

11е

Рго

Уа1

290

295

300

- 51 008607

Азп

О1п

Зег

Ьуз

Суз

Тгр

Ьуз

С1у

РЬе

Азр

Агд

Зег

Зег

Ьеи

Уа1

11е

305

310

315

320

СНу

ТЬг

Зег

А1а

Азр

А1а

РЬе

Азп

РЬе

Тгр

Туг

Ьеи

С1и

Зег

Уа1

Зег

325

330

335

Азп

О1у

ТЬг

Ьеи

О1у

О1п

РЬе

А1а

Ьуз

Агд

Зег

ТЬг

ТЬг

ΗΪ3

С1и

Зег

340

345

350

Зег

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Агд

Ьеи

Зег

О1п

Рго

А1а

Азп

Ьеи

Азп

А1а

Ьеи

Уа1

355

360

365

Азр

А1а

РЬе

О1п

О1и

ТЬг

РЬе

Азр

Ьеи

Азп

Ьеи

ТЬг

С1п

Не

Зег

Туг

370

375

380

Зег

Ьуз

РЬе

Рго

Азп

Рго

РЬе

ТЬг

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

С1у

Азп

385

390

395

400

ТЬг

ΗΪ3

Ьуз

Зег

Зег

ТЬг

Ьеи

Азп

Ьеи

Уа1

Азр

С1у

Зег

С1и

ТЬг

С1у

405

410

415

01 п

ТЬг

Не

Рго

Ьеи

Тгр

О1у

О1п

11е

С1п

Рго

А1а

Агд

Азп

Уа1

Азр

420

425

430

РЬе

11е

Не

А1а

Тгр

Азр

Азр

Зег

С1п

Азр

А1а

Азр

Рго

Туг

Зег

Тгр

435

440

445

Азп

Азп

О1у

ТЬг

Азп

Ьеи

Туг

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

А1а

А1а

Азп

А1а

ТЬг

450

455

460

О1у

Ьеи

Рго

РЬе

Рго

Не

11е

Рго

Рго

Зег

Агд

ТЬг

МеЪ

МеС

Азп

Ьеи

465

470

475

480

Азп

Туг

ТЬг

Ьеи

ΉΪ3

Рго

О1п

РЬе

РЬе

С1у

Суз

Азр

А1а

Азп

Ьеи

ТЬг

485

490

495

ТЬг

ТЬг

О1у

Азр

Азр

Агд

А1а

Рго

Не

Уа1

Ьеи

Туг

МеЬ

А1а

Азп

А1а

500

505

510

Рго

Туг

Зег

А1а

Туг

ТЬг

Азп

РЬе

Зег

РЬе

Тгр

(31п

ТЬг

С1и

ТЬг

Зег

515

520

525

Агд

О1п

О1п

Мее

О1у

О1и

11е

РЬе

Уа1

Азп

Зег

РЬе

Азр

Не

Уа1

ТЬг

530

535

540

<31п

А1а

Азп

О1у

Зег

Тгр

Азр

С1у

С1и

Тгр

А1а

О1и

Суз

МеЁ

С1у

Суз

545

550

555

560

А1а

А1а

Уа1

О1и

Агд

Зег

Ьеи

А1а

Агд

Уа1

О1у

МеС

С1и

Агд

ТЬг

Агд

565

570

575

С1п

Суз

О1п

Агд

Суз

РЬе

О1и

Агд

Туг

Суз

Тгр

Азр

С1у

Тпг

Ьеи

Авр

580

585

590

О1и

Агд

Азр

Рго

О1у

Уа1

Ьеи

Азр

РГО

ТЬг

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азр

Рго

С1у

595

600

605

Уа1

Ьуз

РЬе

О1у

Ьеи

Тгр

Азп

А1а

ТЬг

Азп

Рго

Туг

610 615 620 <210> 13

- 52 008607 <211> 3637 <212> ДНК <213 > АзрегдШиз пхдег <400> 13

ссддаРдааа	аРдадасаРд	дсРааддРда	РсддаРасаа	РаадаРРдаР	РдРддаддаа	60
адесдЬсдда	Ьсаеедсеед	аадссадааа	дссссддасР	сддсадааРс	Рдассдсссд	120
сдсРдсадсе	ссааРсдРад	еееесесаае	саРРдасадс	ессаеесаее	дсРРсРсРад	180
ссаРРасЬсс	РдРсасеесс	адаадРаРРс	асРРедаСдс	сСддРдРРса	аедаееееес	240
сеаСЬаееда	аЪсаааеаее	РРдедсеаРа	дсРаРаасаР	сдсРсаРаРР	РРсссддРад	300
даЪдееааРа	сассасаРса	дРссРсссаа	дРсдсСРсРд	сасааРРРса	рддсРааРда	360
саРдадсРдР	саРсРддасс	аРаасаРдсР	дсРРддсаас	РдРадаааРа	дсаРссаРсР	420
дасеесаСсе	сдсеесадсд	РдРадедаРР	сРаасРдеес	СсссддаРдс	саадРСРсРд	480
аседЬсддРа	дсдаассРаа	РссддРадсР	ееесссддсд	РдаадРсРде	едседъессе	540
асдссааСаа	сддсРаадРс	дсддссааРа	асеесседсе	адсддаРРРс	аеесдеесае	600
аРсасдсссд	асРаддддаа	аРдаассаРа	РРадаРааРР	ддаасРддРд	садРРдссРд	660
аЪедадддРс	Рссасессдд	ссРРдРРдае	даРдсаддсР	Сддсадссад	сааРссддсс	720
есдеедсРсс	дадаассссд	рддрердсдс	аддаРаРдсд	ардддрдааа	РаРРсадедд	780
сЪдРдсЪдда	ссаССаасде	сеедесаеае	РРссасссдд	ддссдРРдРа	даддРРдадР	840
Ьссдааддее	РассРаааса	дедееееесд	РРРдддаасд	сддаадддРс	РаадРРРсдд	900
дседссссае	адддсрдадс	сРаРдссаРР	ссадРРддаа	сссРдасСдс	асаддаддаР	960
асеаеееедд	аРсдссРсаа	еаееагесед	сРдссРддса	ссассСРсса	аРсдддРасс	1020
сссдееесае	адасссЬдас	кддддььесе	дсасРадсРР	адРРдаасда	дасасааРдс	1080
ааСсасааРа	дддЪссЬсаа	РааРаРсРса	ддсассасаа	асРсадддсс	даддаРдРсР	1140
асаЪдсЬдсд	ссеедсседд	сРРддсссРд	ссассРсада	еееедседед	сРссаРРРаР	1200
дсаеесддад	аееееддрас	дсаддааРса	дРаадсРсРа	аеадРдРдде	ссдсРсдРса	1260
аьеьсееаеа	ааСсасссЬд	дддсасссРс	асСсссааРд	сасСдадРсР	дрдееардсе	1320
адасдРдРса	сееддедсаа	сссааадсад	асаРдаадРР	сааРдсасРс	РРаасдассс	1380
Ъсдсддсдсе	ддддРаеаЬс	сааддРаРаР	еессдаесее	дааасРсаРс	аРдсадсасР	1440
аасесаСдсе	дасссдссса	Раддаддсдс	сдсддРРссР	асаассдРсд	ассРсасаРа	1500
СдсадасаРа	РсассРсдсд	сасРддаРаа	РдссссРдаР	ддРРаРассс	сдадсааРдР	1560
аЬссЬдессе	дсааасадас	сдасдаРРсд	садсдсдРса	асссРдРсаР	сдаасдадас	1620
ддсаедддед	дасдРссддс	драадсадас	РдРсРсадсд	аЪдааадасс	РГРГсддсса	1680
ЬаесаасаРд	адсСсаРСед	асдсРареес	дРасаРсаас	адссаРРсаР	саааРаРсас	1740
саасаЬассс	аасаРсддРа	РРдссдРдРс	сддсддрддс	Расададссс	Рдассаасдд	1800
сдсдддадса	сесааддсае	РсдасадСсд	аасддаааас	РсаасссаРа	аРддасадсР	1860
сддеддЬсРе	сРдсадРсад	ссасаРассе	дРссддРсРс	РссддаддРд	дсРддсРссР	1920
дддсРсааЬс	РасаРсааса	асРРсассас	сдРсРссааР	срдсааасср	асааададдд	1980
сдаадРсРдд	садРРссада	аресааРсас	даааддссса	аадассаасд	дсРРдсаадс	2040
еедддаеаса	дссаадРасР	ассдсдаРсР	ддссааддрд	дРсдсРддса	адааддасдс	2100
дддсЬРсаас	асРРссРРса	сддасРасРд	дддРсдсдса	сРсРссРасс	адсРдаРРаа	2160
сдсдассдас	ддаддсссад	дсРасассРд	дРсаРсдаРс	дсРРРаассс	аддасРРсаа	2220
даасддааас	аРдсссаРдс	сдсессееде	сдссдасддс	сдсаасссад	дсдадасссР	2280

- 53 008607

ааЕсддсадс	аасЕсдассд	ЕдЕаЕдадЕЕ	саассссЕдд	дааЕЕсддса	дЕЕЕЕдаЕсс	2340
дЕссаЕсЕЕс	ддсЕЕсдсЕс	сссЕсдааЕа	ссЕсддаЕсс	ЕасЕЕЕдада	асддсдаадЕ	2400
сссаЕссадс	сдаЕссЕдсд	ЕссдсддсЕЕ	сдаЕаасдса	ддсЕЕсдЕса	ЕдддаассЕс	2460
сЕссадЕсЕс	ЕЕсаассааЕ	ЕсаЕссЕдаа	дсЕсаасасс	ассдасаЕсс	саЕсаасссЕ	2520
саааасддЕс	аЕсдссадса	ЕссЕадаада	асЕаддсдас	сдсаасдасд	асаЕсдссаЕ	2580
сЕасЕсЕссс	аассссЕЕсЕ	асдддЕассд	саасдсдаса	дЕЕЕсаЕасд	аааадасссс	2640
ддассЕдаас	дЕсдЕсдасд	дЕддсдаада	сааасадаас	сЕсссссЕсс	аЕссЕсЕсаЕ	2700
ссаасссдсс	сдсаасдЕдд	асдЕсаЕсЕЕ	сдссдЕсдас	ЕссЕсадсса	дЕассЕсдда	2760
саасЕддссс	аасддаадЕс	сЕсЕсдЕсдс	дасЕЕасдаа	сдЕадЕсЕса	асЕсаассдд	2820
ЕаЕсддааас	ддсассдсдЕ	ЕсссЕадсаЕ	сссддасаад	адсассЕЕса	ЕЕаассЕддд	2880
сЕЕдаасасс	сдЕссдасЕЕ	ЕсЕЕсддсЕд	сааЕадЕЕсс	ааЕаЕсасад	дссаЕдсасс	2940
ссЕддЕЕдЕс	ЕассЕсссса	асЕассссЕа	сасаасссЕс	ЕссаасаадЕ	сдассЕЕсса	3000
дсЕсаадЕас	дадаЕсЕЕдд	адсдЕдаЕда	даЕдаЕсасс	ааЕддсЕдда	асдЕддЕЕас	3060
ЕаЕдддЕааЕ	ддаЕсаадда	адЕсЕЕасда	ддаЕЕддссд	асЕЕдЕдсдд	дсЕдсдсСаЕ	3120
ЕсЕдадЕсдс	ЕсдЕЕЕдаЕс	ддасЕааЕас	ссаддЕдссд	даЕаЕдЕдсЕ	сдсадЕдЕЕЕ	3180
ЕдасаадЕаЕ	ЕдсЕдддаЕд	даасдаддаа	ЕадЕасдасд	ссддсддсдЕ	аЕдадссдаа	3240
ддЕаЕЕдаЕд	дсЕадЕдсдд	дЕдЕдадддд	ЕаЕЕЕсдаЕд	ЕсдаддЕЕдд	ЕЕЕЕдддЕсЕ	3300
сЕЕЕссддЕд	дЕддЕЕдддд	ЕЕЕддаЕдаЕ	дЕдадЕддад	дЕЕдддаЕсЕ	дааЕдЕЕддд	3360
аЕдЕдЕакдс	ЕаддЕдаЕсЕ	ЕаЕдадааЕд	адЕЕЕасдас	адЕссЕдаЕа	ЕасЕЕсадаа	3420
дЕадаЕссад	ЕааадаЕдЕд	ЕЕасЕЕасаЕ	адааадсадд	ааЕддаЕЕдд	аЕдЕааЕдсЕ	3480
ЕаЕЕсадЕЕа	дасдЕаааад	даасЕсаадЕ	ссааЕасЕас	ЕдсддЕасад	саЕсассасс	3540
аааЕсссасЕ	дасаЕссааЕ	аааЕсаадЕд	саааасЕссЕ	ЕсЕЕЕсЕсаЕ	сссЕсЕссад	3600
ЕЕдаЕсЕссс	ЕддаадЕЕЕс	сЕЕсаЕаада	аасдсаЕ			3637

<210> 14 <211> 1923 <212> ДНК <213> АзрегдШиз пхдег <220>

<221> СЬЗ <222> (1) . . (1923) <400> 14

аЕд

аад

ЕЕс

ааЕ

дса

сЕс

ЕЕа

асд

асе

сЕс

дед

дед

сЕд

ддд

ЕаЕ

аЕс

48

МеЕ

Ьуз

РЬе

Азп

А1а

Ьеи

Ьеи

ТЬг

ТЬг

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи

С1у

Туг

11е

1

5

10

15

саа

дда

ддс

дсс

дед

дЕЕ

ссЕ

аса

асе

дЕс

дас

сЕс

аса

ЕаЕ

дса

дас

96

С1п

51у

С1у

А1а

А1а

Уа1

Рго

ТЬг

ТЬг

Уа1

Азр

Ьеи

ТЬг

Туг

А1а

Азр

20

25

30

- 54 008607

аЕа

Еса

ССЕ

сдс

дса

сЕд

даЕ

ааЕ

дсс

ссЕ

даЕ

ддЕ

ЕаЕ

асе

ссд

аде

144

11е

Зег

Рго

Агд

А1а

Ьеи

Азр

Азп

А1а

Рго

Азр

С31у

Туг

ТЬг

Рго

Зег

35

40

45

ааЕ

дЕа

Есс

ЕдЕ

ссЕ

дса

аас

ада

ссд

асд

аЕЕ

сдс

аде

дед

Еса

асе

192

Азп

Уа1

Зег

Суз

Рго

А1а

Азп

Агд

Рго

ТЬг

Не

Агд

Зег

А1а

Зег

ТЬг

50

55

60

сЕд

Еса

Есд

аас

дад

асд

дса

Едд

дЕд

дас

дЕс

сдд

сдЕ

аад

сад

асЕ

240

Ьеи

Зег

Зег

Азп

С1и

ТЬг

А1а

Тгр

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

Ьуз

С1п

ТЬг

65

70

75

80

дЕс

Еса

дед

аЕд

ааа

дас

сЕЕ

ЕЕс

ддс

саЕ

аЕс

аас

аЕд

аде

Еса

ЕЕЕ

288

Уа1

Зег

А1а

МеЕ

Ьуз

Азр

Ьеи

РЬе

С1у

ΗΪ3

Не

Азп

МеЕ

Зег

Зег

РЬе

85

90

95

дас

дсЕ

аЕЕ

Есд

Еас

аЕс

аас

аде

саЕ

Еса

Еса

ааЕ

аЕс

асе

аас

аЕа

336

Азр

А1а

Не

Зег

Туг

Не

Азп

Зег

Н18

Зег

Зег

Азп

Не

ТЬг

Азп

Не

100

105

110

ссс

аас

аЕс

ддЕ

аЕЕ

дсс

дЕд

Есс

ддс

ддЕ

ддс

Еас

ада

дсс

сЕд

асе

384

Рго

Азп

11е

О1у

11е

А1а

Уа1

Зег

О1у

О1у

СЯу

Туг

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

115

120

125

аас

ддс

дед

дда

дса

сЕс

аад

дса

ЕЕс

дас

адЕ

еда

асд

даа

аас

Еса

432

Азп

С1у

А1а

61у

А1а

Ьеи

Ьуз

А1а

РЬе

Азр

Зег

Агд

ТЬг

О1и

Азп

Зег

130

135

140

асе

саЕ

ааЕ

дда

сад

сЕс

ддЕ

ддЕ

сЕЕ

сЕд

сад

Еса

дсс

аса

Еас

сЕд

480

ТЬг

ΗΪ8

Азп

<31у

СЛп

Ьеи

(31у

С1у

Ьеи

Ьеи

С1п

Зег

А1а

ТЬг

Туг

Ьеи

145

150

155

160

Есс

ддЕ

сЕс

Есс

дда

ддЕ

ддс

Едд

сЕс

сЕд

ддс

Еса

аЕс

Еас

аЕс

аас

528

Зег

О1у

Ьеи

Зег

С1у

С1у

О1у

Тгр

Ьеи

Ьеи

<31у

Зег

Не

Туг

Не

Азп

165

170

175

аас

ЕЕс

асе

асе

дЕс

Есс

ааЕ

сЕд

саа

асе

Еас

ааа

дад

ддс

даа

дЕс

576

Азп

РЬе

ТЬг

ТЬг

Уа1

Зег

Азп

Ьеи

О1п

ТЬг

Туг

Ьуз

О1и

О1у

О1и

Уа1

180

185

190

Едд

сад

ЕЕс

сад

ааЕ

Еса

аЕс

асд

ааа

ддс

сса

аад

асе

аас

ддс

ЕЕд

624

Тгр

31п

РЬе

О1п

Азп

Зег

Не

ТЬг

Ьуз

<Э1у

Рго

Ьуз

ТЬг

Азп

О1у

Ьеи

195

200

205

саа

дсЕ

Едд

даЕ

аса

дсс

аад

Еас

Еас

сдс

даЕ

сЕд

дсс

аад

дЕд

дЕс

672

С1п

А1а

Тгр

Азр

ТЬг

А1а

Ьуз

Туг

Туг

Агд

Азр

Ьеи

А1а

Ьуз

Уа1

Уа1

210

215

220

дсЕ

ддс

аад

аад

дас

дед

ддс

ЕЕс

аас

асЕ

Есс

ЕЕс

асд

дас

Еас

Едд

720

А1а

(31у

Ьуз

Ьуз

Азр

А1а

О1у

РЬе

Азп

ТЬг

Зег

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

Тгр

225

230

235

240

ддЕ

сдс

дса

сЕс

ЕСС

Еас

сад

сЕд

аЕЕ

аас

дед

асе

дас

дда

ддс

сса

768

О1у

Агд

А1а

Ьеи

Зег

Туг

О1п

Ьеи

Не

Азп

А1а

ТЬг

Азр

СЯу

О1у

Рго

245 250 255

ддс

еас

асе

Сдд

еса

есд

аес

дсе

ееа

асе

сад

дас

еес

аад

аас

дда

816

С1у

Туг

ТЬг

Тгр

Зег

Зег

Не

А1а

Ьеи

ТЬг

Θΐη

Авр

РЬе

Ьув

Авп

С1у

260

265

270

аас

аед

ссс

аед

сед

сес

сее

дес

дсс

дас

ддс

сдс

аас

сса

ддс

дад

864

Азп

Мее

Рго

Мее

Рго

Ьеи

Ьеи

Уа1

А1а

Азр

О1у

Агд

Авп

Рго

С1у

С1и

275

280

285

асе

сеа

акс

ддс

аде

аас

есд

асе

дед

еае

дад

еес

аас

ссс

ьдд

даа

912

ТЬг

Ьеи

11е

С1у

Зег

Азп

Зег

ТЬг

Уа1

Туг

<31и

РЬе

Авп

Рго

Тгр

О1и

290

295

300

еес

ддс

аде

еее

дае

ссд

есс

аес

еес

ддс

еес

дсе

ссс

сес

даа

еас

960

РЬе

О1у

Зег

РЬе

Авр

Рго

Зег

Не

РЬе

С1у

РЬе

А1а

Рго

Ьеи

О1и

Туг

305

310

315

320

сес

дда

есс

еас

еее

дад

аас

ддс

даа

дес

сса

есс

аде

еда

есс

еде

1008

Ьеи

С1у

Зег

Туг

РЬе

С1и

Азп

<31у

С1и

Уа1

Рго

Зег

Зег

Агд

Зег

Сув

325

330

335

дес

еде

ддс

еес

дае

аас

дса

ддс

еес

дес

аед

дда

асе

есс

есс

аде

1056

Уа1

Агд

О1у

РИе

Авр

Авп

А1а

О1у

РЬе

Уа1

Мее

01у

ТЬг

Зег

Зег

Зег

340

345

350

сес

еес

аас

саа

еес

аес

сед

аад

сес

аас

асе

асе

дас

аес

сса

еса

1104

Ьеи

РЬ.е

Азп

О1п

РЬе

11е

Ьеи

Ьув

Ьеи

Авп

ТЬг

ТЬг

Авр

11е

Рго

Зег

355

360

365

асе

сес

ааа

асд

де с

аес

дсс

аде

аес

сеа

даа

даа

сеа

ддс

дас

сдс

1152

ТЬг

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Уа1

11е

А1а

Зег

11е

Ьеи

С1и

О1и

Ьеи

<31у

Азр

Агд

370

375

380

аас

дас

дас

аес

дсс

аес

еас

есе

ссс

аас

ссс

еес

еас

ддд

еас

сдс

1200

Азп

Азр

Азр

11е

А1а

11е

Туг

Зег

Рго

Авп

Рго

РЬе

Туг

С1у

Туг

Агд

385

390

395

400

аас

дед

аса

дее

еса

еас

даа

аад

асе

ссд

дас

сед

аас

дес

дес

дас

1248

Азп

А1а

ТЬг

Уа1

Зег

Туг

С1и

Ьув

ТЬг

Рго

Авр

Ьеи

Авп

Уа1

Уа1

Авр

405

410

415

ддк

ддс

даа

дас

ааа

сад

аас

сес

ссс

сес

сае

ссе

сес

аес

саа

ссс

1296

С1у

С1у

СПи

Авр

Ьув

О1п

Авп

Ьеи

Рго

Ьеи

Ηίβ

Рго

Ьеи

11е

СЯп

Рго

420

425

430

дес

еде

аас

дед

дас

дес

аес

еес

дсс

дес

дас

есс

еса

дсс

аде

асе

1344

А1а

Агд

Авп

Уа1

Авр

Уа1

11е

РЬе

А1а

Уа1

Азр

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

435

440

445

кед

дас

аас

Ъдд

ссс

аас

дда

аде

ссе

сес

дес

дед

асе

еас

даа

еде

1392

Зег

Авр

Авп

Тгр

Рго

Авп

С1у

Зег

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

ТЬг

Туг

С1и

Агд

450

455

460

аде

СЁ.С

аас

еса

асе

дде

аес

дда

аас

ддс

асе

дед

еес

ссе

аде

аес

1440

Зег

Ьеи

Авп

Зег

ТЬг

С1у

11е

СЛу

Авп

<31у

ТЬг

А1а

РЬе

Рго

Зег

11е

465

470

475

480

- 56 008607

ссд

дас

аад

аде

асе

ййс

айй

аас

ейд

ддс

ййд

аас

асе

сдй

ссд

аей

1488

Рго

Аар

Ьуа

Зег

ТЬг

РЬе

11е

Азп

Ьеи

О1у

Ьеи

Азп

ТЬг

Агд

Рго

ТЬг

485

490

495

ййс

ййс

ддс

йдс

аай

адй

йсс

аай

айс

аса

ддс

сай

дса

ссс

ейд

дйй

1536

РЬе

РЬе

(31у

Суз

Азп

Зег

Зег

Азп

Х1е

ТЬг

(31у

Ηίβ

А1а

Рго

Ьеи

Уа1

500

505

510

Эйс

йас

сйс

ссс

аас

йас

ссс

йас

аса

асе

сйс

йсс

аас

аад

йсд

асе

1584

Уа1

Туг

Ьеи

Рго

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

Ьуз

Зег

ТЬг

515

520

525

ййс

сад

сйс

аад

йас

дад

айс

ййд

дад

сдй

дай

дад

айд

айс

асе

аай

1632

РЬе

С1п

Ьеи

Ьуз

Туг

<31и

11е

Ьеи

С1и

Агд

Азр

С1и

Мей

11е

ТЬг

Азп

530

535

540

ддс

йдд

аас

дед

дйй

аей

айд

ддй

аай

дда

йса

адд

аад

йей

йас

дад

1680

С1у

Тгр

Азп

Уа1

Уа1

ТЬг

Мей

С1у

Азп

О1у

Зег

Агд

Ьуз

Зег

Туг

С1и

545

550

555

560

дай

йдд

ссд

аей

йдй

дед

ддс

йдс

дей

айй

ейд

адй

сдс

йсд

ййй

дай

1728

Аар

Тгр

Рго

ТЬг

Суз

А1а

С1у

Суз

А1а

11е

Ьеи

Зег

Агд

Зег

РЬе

Азр

565

570

575

едд

аей

аай

асе

сад

дйд

ссд

дай

айд

йдс

йсд

сад

йдй

ййй

дас

аад

1776

Агд

ТЬг

Азп

ТЬг

С1п

Уа1

Рго

Азр

Мей

Суз

Зег

О1п

Суз

РЬе

Азр

Ьуз

580

585

590

+- в 4-

+· /»/4

4—

—1 -л 4-

·—» 1

X “» ♦·

*1 опл

исг и.

1—V»

‘-дд

дда

ехСу

адд

αα и.

сху и

аСу

с1СС|

ССу

дед

дед

ио и

дад

х. и *х

Туг

Суэ

Тгр

Азр

С1у

ТЬг

Агд

Азп

Зег

ТЬг

ТЬг

Рго

А1а

А1а

Туг

(31и

595

600

605

ссд

аад

дйа

ййд

айд

дей

адй

дед

ддй

дйд

адд

ддй

айй

йсд

айд

йсд

1872

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

Мей

А1а

Зег

А1а

С1у

Уа1

Агд

С1у

11е

Зег

Мей

Зег

610

615

620

адд

ййд

дйй

ййд

ддй

сйс

ййй

ссд

дед

дйд

дйй

ддд

дйй

едд

айд

айд

1920

Агд

Ьеи

Уа1

Ьеи

О1у

Ьеи

РЬе

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

С1у

νβΐ

Тгр

Мей

Мей

625

630

635

640

йда

1923

<210>

15

<211>

640

<212>

РКТ

<213>

АзрегдШиз пгдег

<400>

15

Мей Ьуз РЬе

Азп

А1а Ьеи

Ьеи

ТЬг

ТЬг

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи

(31у

Туг

11е

1

5

10

15

С1п 61у О1у

А1а

А1а А7а1

Рго

ТЬг

ТЬг

Уа1

Азр

Ьеи

ТЬг

Туг

А1а

Азр

20

25

30

- 57 008607

11е Зег Рго Агд А1а

Ьеи

Азр

Азп А1а Рго Азр С1у Туг ТЬг Рго Зег

35

40

45

Азп

Уа1

Зег

Суз

Рго

А1а

Азп

Агд

Рго

ТЬг

Не

Агд

Зег

А1а

Зег

ТЬг

50

55

60

Ьеи

Зег

Зег

Азп

01и

ТЬг

А1а

Тгр

Уа1

Азр

Уа1

Агд

Агд

Ьуз

С1п

ТЬг

65

70

75

80

Уа1

Зег

А1а

Мер

Ьуз

Азр

Ьеи

РЬе

<31у

Нхз

Не

Азп

МеЕ

Зег

Зег

РЬе

85

90

95

Азр

и Ί «

τΉ

Зег

τΊ _

Зех

тт- ~

О 09 —

ГУ - —

•л

т Ί —

тХ

Т Ί 09

Λία

не

1ух

не

лап

П1Ь

ОС1

ОС!

лап

не

XXIX

лап

НС

100

105

но

Рго

Азп

Не

С1у

Не

А1а

Уа1

Зег

С1у

01у

<31у

Туг

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

115

120

125

Азп

С1у

А1а

С1у

А1а

Ьеи

Ьуз

А1а

РЬе

Азр

Зег

Агд

ТЬг

С1и

Азп

Зег

130

135

140

ТЬг

Нхз

Азп

С1у

01п

Ьеи

(31у

С1у

Ьеи

Ьеи

С1п

Зег

А1а

ТЬг

Туг

Ьеи

145

150

155

160

Зег

61у

Ьеи

Зег

61у

О1у

61у

Тгр

Ьеи

Ьеи

<31у

Зег

Не

Туг

Не

Азп

165

170

175

Азп

РЬе

ТЬг

ТЬг

Уа1

Зег

Азп

Ьеи

(31п

ТЬг

Туг

Ьуз

С1и

О1у

(31и

Уа1

180

185

190

Тгр

О1п

РЬе

С31п

Азп

Зег

Не

ТЬг

Ьуз

01у

Рго

Ьуз

ТЬг

Азп

(31у

Ьеи

195

200

205

С1п

А1а

Тгр

Азр

ТЬг

А1а

Ьуз

Туг

Туг

Агд

Азр

Ьеи

А1а

Ьуз

Уа1

Уа1

210

215

220

А1а

О1у

Ьуз

Ьуз

Азр

А1а

(31у

РЬе

Азп

ТЬг

Зег

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

Тгр

225

230

235

240

(31у

Агд

А1а

Ьеи

Зег

Туг

(31п

Ьеи

Не

Азп

А1а

ТЬг

Азр

О1у

О1у

Рго

245

250

255

О1у

Туг

ТЬг

Тгр

Зег

Зег

Не

А1а

Ьеи

ТЬг

С1п

Азр

РЬе

Ьуз

Азп

С1у

260

265

270

Азп

МеЬ

Рго

МеЪ

Рго

Ьеи

Ьеи

Уа1

А1а

Азр

<31у

Агд

Азп

РГО

О1у

(31и

275

280

285

ТЬг

Ьеи

Не

С1у

Зег

Азп

Зег

ТЬг

Уа1

Туг

С1и

РЬе

Азп

Рго

Тгр

(31и

290

295

300

РЬе

О1у

Зег

РЬе

Азр

Рго

Зег

Не

РЬе

С1у

РЬе

А1а

Рго

Ьеи

С1и

Туг

305

310

315

320

Ьеи

(31у

Зег

Туг

РЬе

О1и

Азп

(31у

С1и

Уа1

Рго

Зег

Зег

Агд

Зег

Суз

325

330

335

Уа1

Агд

С1у

РЬе

Азр

Азп

А1а

О1у

РЬе

Уа1

МеЕ

01у

ТЬг

Зег

Зег

Зег

340

345

350

Ьеи

РЬе

Азп

О1п

РЬе

Не

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Азп

ТЬг

ТЬг

Азр

Не

Рго

Зег

355 360 365

- 58 008607

ТЬг Ьеи

Ьуз

ТЬг

Уа1

11е

А1а Зег 11е Ьеи СЛи (Ли

Ьеи 61у

Азр

Агд

370

375

380

Азп

Азр

Азр

11е

А1а

11е

Туг

Зег

Рго

Азп

Рго

РЬе

Туг

С1у

Туг

Агд

385

390

395

400

Азп

А1а

ТЬг

Уа1

Зег

Туг

СЛи

Ьуз

ТЬг

Рго

Азр

Ьеи

Азп

Уа1

Уа1

Азр

405

410

415

СЛу

(Лу

СЛи

Азр

Ьуз

Θΐη

Азп

Ьеи

Рго

Ьеи

Н18

Рго

Ьеи

Не

(Лп

Рго

420

425

430

А1а

Агд

Азп

Уа1

Азр

Уа1

11е

РЬе

А1а

Уа1

Азр

Зег

Зег

А1а

Зег

ТЬг

435

440

445

Зег

Азр

Азп

Тгр

Рго

Азп

СЛу

Зег

Рго

Ьеи

Уа1

А1а

ТЬг

Туг

(Ли

Агд

450

455

460

Зег

Ьеи

Азп

Зег

ТЬг

СЛу

11е

СЛу

Азп

СЛу

ТЬг

А1а

РЬе

Рго

Зег

Пе

465

470

475

480

Рго

Азр

Ьуз

Зег

ТЬг

РЬе

Не

Азп

Ьеи

СЛу

Ьеи

Авп

ТЬг

Агд

Рго

ТЬг

485

490

495

РЬе

РЬе

СЛу

Суз

Азп

Зег

Зег

Азп

11е

ТЬг

СЛу

ΗΪ8

А1а

Рго

Ьеи

Уа1

500

505

510

Уа1

Туг

Ьеи

Рго

Азп

Туг

Рго

Туг

ТЬг

ТЬг

Ьеи

Зег

Азп

Ьуз

Зег

ТЬг

515

520

525

РЬе

СЛп

Ьеи

Ьуз

Туг

СЛи

11е

Ьеи

О1и

Агд

Азр

О1и

МеЕ

Не

ТЬг

Азп

530

535

540

СЛу

Тгр

Азп

Уа1

Уа1

ТЬг

МеС

СЛу

Азп

СЛу

Зег

Агд

Ьуз

Зег

Туг

(Ли

545

550

555

560

Азр

Тгр

Рго

ТЬг

Суз

А1а

СЛу

Суз

А1а

Пе

Ьеи

Зег

Агд

Зег

РЬе

Азр

565

570

575

Агд

ТЬг

Азп

ТЬг

СЛп

Уа1

Рго

Азр

МеС

Суз

Зег

СЛп

Суз

РЬе

Азр

Ьуз

580

585

590

Туг

Суз

Тгр

Азр

СЛу

ТЬг

Агд

Азп

Зег

ТЬг

ТЬг

Рго

А1а

А1а

Туг

О1и

595

600

605

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

МеЕ

А1а

Зег

А1а

(Лу

Уа1

Агд

СЛу

Не

Зег

МеС

Зег

610

615

620

Агд

Ьеи

Уа1

Ьеи

СЛу

Ьеи

РЬе

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

61у

Уа1

Тгр

МеС

МеС

625

630

635

640

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (20)

1. Выделенный полинуклеотид, кодирующий фосфолипазу АкрегдШик шдег, имеющий нуклеотидные последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13 и 14, а также полинуклеотид, гибридизуемый с указанным в условиях высокой жесткости, раскрытых в описании.

2. Выделенный полинуклеотид, кодирующий фосфолипазу АкрегдШик шдег, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов.

3. Выделенный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один функциональный домен фосфолипазы АкрегдШик шдег, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов.

- 59 008607

4. Вектор, включающий выделенный полинуклеотид по любому из пп.1-3.

5. Вектор по п.4, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид функционально связан с регуляторными последовательностями, обеспечивающими его экспрессию в подходящей клетке-хозяине.

6. Вектор по п.5, отличающийся тем, что указанная подходящая клетка-хозяин представляет собой клетку нитевидного гриба.

7. Способ получения полинуклеотида по любому из пп.1-3, включающий культивирование клеткихозяина, трансформированной указанным полинуклеотидом, и выделение указанного полинуклеотида из указанной клетки-хозяина.

8. Способ размножения вектора по любому из пп.4-6, включающий культивирование клеткихозяина, трансформированной указанным вектором, и выделение указанного вектора из указанной клетки-хозяина.

9. Выделенная фосфолипаза АкрегдШик шдет, имеющая аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ Ν0: 3, 6, 9, 12 и 15 или их функциональных эквивалентов.

10. Выделенная фосфолипаза, полученная путем экспрессии полинуклеотида по любому из пп.1-3 или вектора по любому из пп.4-6 в соответствующей клетке-хозяине, например клетке АкрегдШик шдег.

11. Рекомбинантная фосфолипаза, включающая функциональный домен фосфолипазы по любому из пп.9-10.

12. Способ получения фосфолипазы по любому из пп.9-11, включающий трансформацию подходящей клетки-хозяина выделенным полинуклеотидом по любому из пп.1-3 или вектором по любому из пп.4-6, культивирование указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полинуклеотида, и, при необходимости, очистку фосфолипазы из указанной клетки или культуральной среды.

13. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по любому из пп.1-3 или вектор по любому из пп.4-6.

14. Рекомбинантная клетка-хозяин, экспрессирующая фосфолипазу по любому из пп.9-11.

15. Очищенное антитело, взаимодействующее с фосфолипазой по любому из пп.9-11.

16. Белок слияния, включающий фосфолипазу по любому из пп.9-11.

17. Способ получения теста, включающий добавление к муке фосфолипазы по любому из пп.9-11 и других агентов для улучшения свойств хлебобулочного изделия или теста и формирование теста.

18. Способ получения хлебобулочного изделия, отличающийся тем, что используют тесто, полученное согласно способу по п.17.

19. Применение фосфолипазы по любому из пп.9-11 для получения теста.

20. Применение фосфолипазы по любому из пп.9-11 для получения хлебобулочных продуктов из теста, полученного по п.17.