ES2347550T3 - Nuevas fosfolipasas y usos de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado - que tiene más de 75% de homología con una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 ó 2 o - que codifica una fosfolipasa que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
Description
Nuevas fosfolipasas y usos de las mismas.
La invención se refiere a secuencias de
polinucleótidos de nueva identificación que comprenden genes que
codifican una nueva fosfolipasa aislada de Aspergillus
niger. La invención caracteriza la secuencia de nucleótidos de
longitud total de los nuevos genes, comprendiendo la secuencia de
cDNA la secuencia codificante de longitud total de la nueva
fosfolipasa así como la secuencia de aminoácidos de la proteína
funcional de longitud total y equivalentes funcionales de la misma.
La invención se refiere también a métodos de utilización de estas
enzimas en procesos industriales y métodos de diagnóstico de
infecciones fúngicas. Se incluyen también en la invención células
transformadas con un polinucleótido de acuerdo con la invención y
células en las cuales una fosfolipasa de acuerdo con la invención
está modificada genéticamente para aumentar o reducir su actividad
y/o nivel de expresión.
Los fosfolípidos están constituidos por una
cadena principal de glicerol con dos ácidos grasos especificados en
una posición exterior (sn-1) y en posición
intermedia (sn-2), mientras que el tercer grupo
hidroxilo del glicerol está esterificado con ácido fosfórico. El
ácido fosfórico puede, a su vez, estar esterificado a por ejemplo
un aminoalcohol como etanolamina (fosfatidiletanolamina), colina
(fosfatidilcolina). El tercer grupo hidroxilo puede también, en
lugar de estar esterificado con ácido fosfórico, estar unido a
restos azúcar tales como una galactosa o un dímero de la misma tal
como en digalactosildiglicérido.
Las fosfolipasas se definen aquí como enzimas
que participan en la hidrólisis de uno o más enlaces en los
fosfolípidos que incluyen digalactosildiglicérido descrito
arriba.
Pueden distinguirse varios tipos de actividad de
fosfolipasa, que hidrolizan el o los enlaces éster que enlazan los
restos acilo grasos a la cadena principal del glicerol.
- \circ
- La fosfolipasa A_{1} (EC 3.1.1.32) y A_{2} (EC 3.1.1.4) catalizan la desacilación de un grupo acilo graso en las posiciones sn-1 y sn-2 respectivamente, de un diacilglicerofosfolípido para producir un lisofosfolípido.
- \circ
- La lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5 - llamada también fosfolipasa B por el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (Enzyme Nomenclature, Academic Press, Nueva York, 1992))
- \circ
- cataliza la hidrólisis del grupo acilo graso restante en un lisofosfolípido. Ha sido dada a conocer una fosfolipasa B de Penicillium notatum (Saito et al., 1991, Methods in Enzymology 197:446-456), que cataliza la desacilación de ambos ácidos grasos de un diacilglicerofosfolípido y posee intrínsecamente actividad de lisofosfolipasa.
- \circ
- La galactolipasa (EC 3.1.4.3) cataliza la hidrólisis de uno o los dos grupos acilo grasos en las posiciones sn-1 y sn-2 respectivamente, de un digalactosildiglicérido.
La fosfolipasa C (EC 3.1.4.3) hidroliza el
enlace éster fosfato entre la cadena principal de glicerol y el
grupo fosfato, por ejemplo:
Fosfatidilcolina + H_{2}O =
1,2-diacilglicerol + fosfato de colina.
La fosfolipasa D (EC 3.1.4.4) hidroliza el
enlace éster fosfato entre el grupo fosfato y el aminoalcohol, por
ejemplo: fosfatidilcolina + H_{2}O = colina + ácido
fosfatídico.
Las fosfolipasas pueden producirse
convenientemente en microorganismos. Las fosfolipasas microbianas
están disponibles de una diversidad de fuentes; las especies
Bacillus son una fuente común de enzimas bacterianas, en
tanto que las enzimas fúngicas se producen comúnmente en especies de
Aspergillus.
Se han publicado enzimas fúngicas con actividad
de fosfolipasa procedentes de diversas fuentes, que incluyen
Cryptococcus neoformans (Chen et al, 1997, Infection
and Immunity 65:405-411), Fusobacterium
necrophorum (Fifis et al, 1996, Veterinary Microbiology
49:219-233), Penicillium notatum (conocido
también como Penicillium chrysogenum; Kawasaki, 1975,
Journal of Biochemistry 77:1233-1244; Masuda et
al., 1991, European Journal of Biochemistry
202:783-787), Penicillium cyclopium
(Mustranta et al, 1995, Process Biochemistry
30:393-401), Saccharomyces cerevisiae
(Ichimasa et al, 1985, Agric. Biol. Chem.
49:1083-1089; Paultauf et al, 1994, J. Biol.
Chem. 269:19725-19730), Torulaspora
delbrueckii (conocido anteriormente como Saccharomyces
rosei, Kuwabara, 1988, Agric. Biol. Chem.
52:2451-2458; Watanabe et al, 1994, REMS
Microbiological Letters 124:29-34), Neurospora
crassa (Chakravarti et al, 1981, Archives of Biochemistry
and Biophysics 206:393-402), Aspergillus
niger (Technical Bulletin, G-zyme^{TM} G6999,
Enzyme BioSystems Ltd.; Mustranta et al., 1995,
supra), Corticium centrifugum (Uehara et al,
1979, Agric. Biol. Chem. 43:517-525), Fusarium
oxysporum (WO 98/26057), y Fusarium solani
(Tsung-Che et al., 1968, Phytopathological
Notes 58:1437-38).
Genes de fosfolipasas fúngicas han sido clonados
de varias fuentes que incluyen Penicillum notatum (Masuda
et al., 1991, supra), Torulaspora delbrueckii
(Watanabe et al., 1994, FEMS Microbiology Letters 124:
29-34), Saccharomyces cerevisiae (Lee et
al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269:
19725-19730), Aspergillus (JP 10155493),
Neurospora crassa (EMBL 042791), y Schizosaccharomyces
pombe (EMBL O13857).
Las fosfolipasas pueden utilizarse en una
multiplicidad de aplicaciones industriales, que incluyen la
modificación de emulsionantes fosfolipídicos. Un ejemplo de un
emulsionante fosfolipídico es la lecitina, que es una mezcla de
lípidos polares y neutros en la cual el contenido de lípidos polares
es al menos 60%. Los emulsionantes fosfolipídicos tienen muchas
aplicaciones alimentarias y no alimentarias; por ejemplo la lecitina
de huevo se utiliza como emulsionante, verbigracia en productos
lácteos, específicamente mayonesa, aderezos, repostería, etc.; la
lecitina de soja, por ejemplo, se utiliza v.g. como emulsionante en
salsas (bajas en calorías), pan, margarina, cosméticos etc., y
otras lecitinas se utilizan por ejemplo en bombones, y en piensos de
terneros. La modificación de emulsionantes fosfolipídicos por
fosfolipasas puede causar una emulsificación incrementada de la
mezcla aceite/agua. La modificación de los emulsionantes
fosfolipídicos por las fosfolipasas puede aumentar la estabilidad
de las emulsiones que resultan de la adición de los emulsionantes
fosfolipídicos modificados en un intervalo de pH y/o temperatura
más amplio o diferente. La modificación de los emulsionantes
fosfolipídicos por las fosfolipasas puede aumentar la estabilidad
de las emulsiones resultantes de la adición de emulsionantes
fosfolipídicos modificados, en presencia de iones Ca^{2+} o
Mg^{2+}.
Otro ejemplo de aplicación industrial de las
fosfolipasas es que las mismas pueden utilizarse para el desgomado
de aceites vegetales en el procesamiento de estos aceites. En un
proceso de desgomado típico, las lecitinas se eliminan de los
aceites vegetales, por ejemplo aceites de soja, aceites de colza
(canola), aceites de linaza, aceites de girasol, para aumentar
entre otras cosas la estabilidad del aceite vegetal, por lavado de
la fase de aceite con agua, en donde la mezcladura del agua y el
aceite en condiciones de cizallamiento alto fuerza la mayor parte
de las lecitinas a pasar a la fase acuosa, que se elimina
subsiguientemente en un separador. En esta denominada fase de
desgomado con agua, únicamente se eliminan con facilidad los
fosfolípidos que se hidratan rápidamente, por ejemplo
fosfatidilcolina, fosfatidilinositol y fosfatidiletanolamina. Los
fosfolípidos/fosfátidos no hidratables, principalmente los
fosfolípidos, que están constituidos por hasta 50% de sales de
magnesio y/o calcio, no pueden separarse fácilmente en el paso de
desgomado con agua. La exposición de los fosfolípidos/fosfátidos no
hidratables a fosfolipasa A_{2} hace que estos fosfolípidos se
vuelvan más solubles en agua y por consiguiente más fáciles de
extraer en una fase de desgomado con agua. Otro ejemplo de
aplicación industrial de las fosfolipasas es la utilización de las
mismas para separar el precipitado que se produce durante la
sacarificación (con ayuda de \alpha-amilasa y
glucoamilasa) del gluten del trigo o almidón del trigo para producir
jarabes de glucosa. La separación del precipitado acelera
considerablemente la filtración subsiguiente de los jarabes de
glucosa resultantes. Las aplicaciones industriales arriba
mencionadas de la enzima fosfolipasa son sólo unos pocos ejemplos,
y esta enumeración no tiene por objeto ser restrictiva.
Otro ejemplo adicional de una aplicación
industrial de las fosfolipasas en alimentación es que las
fosfolipasas son particularmente útiles en aplicaciones de
panadería para aumentar la calidad de la masa o el producto
horneado. La harina de trigo contiene aproximadamente
2,2-2,9% de lípidos. Los lípidos de la harina pueden
dividirse en lípidos con almidón (0,8-0,9%) y
lípidos sin almidón (1,4-2,0%). Mientras que los
lípidos con almidón están constituidos principalmente por
lisofosfolípidos polares, los lípidos sin almidón están constituidos
por aproximadamente 40% de triglicéridos neutros y 40% de fosfo- y
glicolípidos polares. Para optimización de la fracción de lípidos
de la harina es posible hidrolizar los fosfolípidos in situ
en la masa por adición de fosfolipasa A.
Por ejemplo,
EP-A-109244 y WO 98/26057 describen
este uso de fosfolipasa A en la fabricación del pan. En la patente
de Checoslovaquia AO 190264, se aplica ácido fosfatídico (producto
de la hidrólisis de fosfolipasa D) como agente mejorador de la masa
y del pan. En EP-A-075463 se aplica
la combinación de fosfolipasa A y fosfolipasa D para producir ácido
lisofosfatídico como agente de acondicionamiento de la masa.
WO 00/32758 describe la producción de variantes
de enzimas lipolíticas por realización de alteraciones en la
secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica a fin de aumentar
el nivel de actividad deseada. Para aplicaciones de panadería, se
encontró que la variante de la enzima lipolítica de la familia
Humicula o la familia Zygomycetes era particularmente
útil debido a que parecía tener actividad de fosfolipasa y/o
digalactosildiglicérido. WO 98/45453 describe un polipéptido que
tiene actividad de lipasa derivable de Aspergillus
tubigensis que muestra también alta actividad hidrolítica sobre
digalactosildiglicérido. Estas enzimas, sin embargo, adolecen de
una actividad específica relativamente baja.
En los procesos anteriores, es ventajoso
utilizar fosfolipasas obtenibles por técnicas de DNA recombinante.
Tales enzimas recombinantes presentan varias ventajas sobre sus
contrapartidas purificadas tradicionalmente. Las enzimas
recombinantes pueden producirse a un precio de coste bajo, con
rendimiento alto, exentas de agentes contaminantes como bacterias o
virus, pero exentas también de toxinas bacterianas o que contaminan
otras actividades enzimáticas.
US 6.146.869 describe una secuencia de ácido
nucleico y el polipéptido correspondiente que presentan 62,9% de
identidad y 51,9% de identidad con SEQ ID NO: 1-2 y
3, respectivamente.
El acceso a la base de datos No. AAF12231 (base
de datos EMBL; Berka RM et al., Aspergillus oryzae EST
SEQ ID NO: 4754) describe una secuencia de ácido nucleico que
presenta 64,1% de identidad con las secuencias de SEQ ID NO:
1-2 con un solapamiento de 496 nucleótidos.
La presente invención aborda al menos uno si no
la totalidad de los problemas anteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
Es un objeto de la invención proporcionar nuevos
polinucleótidos que codifican nuevas fosfolipasas con propiedades
mejoradas. Un objeto adicional es proporcionar fosfolipasas
producidas natural y recombinantemente así como cepas recombinantes
que producen éstas. Asimismo, forman parte de la invención
polipéptidos de fusión así como métodos de fabricación y
utilización de los polinucleótidos y polipéptidos de acuerdo con la
invención. De modo más particular, es un objeto de la presente
invención proporcionar una fosfolipasa que tiene también actividad
de galactolipasa.
Es también un objeto de la invención
proporcionar nuevas fosfolipasas, que resuelven al menos uno de los
problemas arriba mencionados o proporcionar nuevas fosfolipasas,
que tienen una o más propiedades mejoradas si se utilizan en
productos de masa y/u horneados, seleccionadas del grupo de solidez
incrementada de la masa, elasticidad incrementada de la masa,
estabilidad incrementada de la masa, pegajosidad reducida de la
masa, extensibilidad mejorada de la masa, trabajabilidad mejorada
de la masa, volumen incrementado del producto horneado, estructura
mejorada de la miga del producto horneado, suavidad incrementada del
producto horneado, sabor mejorado del producto horneado,
anti-enranciamiento mejorado del producto horneado,
color mejorado del producto horneado, corteza mejorada del producto
horneado o que tienen una especificidad de sustrato amplia.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona nuevos polinucleótidos
que codifican nuevas fosfolipasas. De modo más particular, la
invención describe polinucleótidos que tienen una secuencia de
nucleótidos que se hibrida preferiblemente en condiciones de
severidad alta a una secuencia que se selecciona del grupo
constituido por SEQ ID NO: 1 y 2. Como consecuencia, la invención
proporciona ácidos nucleicos que son más de 75%, tal como
aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homólogos a
una o más secuencias seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID
NO: 1 y 2.
En una realización más preferida, la invención
proporciona un polinucleótido aislado de este tipo obtenible a
partir de un hongo filamentoso, prefiriéndose en particular
Aspergillus niger.
En una realización, la invención proporciona un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico
que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 3.
En una realización preferida, la invención
proporciona un gen de fosfolipasa con una secuencia de nucleótidos
de SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la invención proporciona un
polinucleótido, preferiblemente un cDNA que codifica una
fosfolipasa de Aspergillus niger con la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, el cDNA
tiene una secuencia SEQ ID NO: 2.
En una realización aún más preferida, la
invención proporciona un polinucleótido que comprende la secuencia
codificante de los polipéptidos de acuerdo con la invención,
prefiriéndose la secuencia de polinucleótidos SEQ ID NO: 2.
La invención se refiere también a vectores que
comprenden una secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la
invención e iniciadores, sondas y fragmentos que pueden utilizarse
para amplificar o delecionar el DNA de acuerdo con la
invención.
En una realización preferida adicional, se
proporciona un vector en el que la secuencia de polinucleótidos de
acuerdo con la invención está enlazada funcionalmente con secuencias
reguladoras adecuadas para expresión de la secuencia de aminoácidos
codificada en una célula hospedadora adecuada, tal como
Aspergillus niger o A. oryzae. La invención
proporciona también métodos para preparar polinucleótidos y vectores
de acuerdo con la invención.
La invención se refiere también a células
hospedadoras producidas recombinantemente que contienen
polinucleótidos heterólogos u homólogos de acuerdo con la
invención.
En otra realización, la invención proporciona
células hospedadoras recombinantes en donde la expresión de una
fosfolipasa de acuerdo con la invención está incrementada
significativamente o en donde la actividad de la fosfolipasa está
incrementada.
En otra realización, la invención proporciona
una célula hospedadora producida recombinantemente que contiene
polinucleótidos heterólogos u homólogos de acuerdo con la invención
y en donde la célula es capaz de producir una fosfolipasa funcional
de acuerdo con la invención, preferiblemente una célula capaz de
sobreexpresar la fosfolipasa de acuerdo con la invención, por
ejemplo una cepa de Aspergillus que comprende un número de
copias incrementado de un gen o cDNA de acuerdo con la
invención.
En otro aspecto adicional de la invención, se
proporciona un polipéptido purificado. El polipéptido de acuerdo
con la invención incluye los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos de acuerdo con la invención. Se prefiere
especialmente un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
SEQ ID NO: 3.
Proteínas de fusión que comprenden un
polipéptido de acuerdo con la invención están también dentro del
alcance de la invención. La invención proporciona también métodos
de fabricación de los polipéptidos de acuerdo con la invención.
La invención se refiere también al uso de la
fosfolipasa de acuerdo con la invención en muchos procesos
industriales descritos en esta memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona
polinucleótidos que codifican una fosfolipasa que tiene una
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3. La secuencia del gen que
codifica la fosfolipasa PLP03 se determinó por secuenciación del
clon genómico correspondiente obtenido de Aspergillus niger.
La invención proporciona secuencias de polinucleótidos que
comprenden el gen que codifica la fosfolipasa PLP03 así como la
secuencia completa de cDNA y la secuencia codificante. De acuerdo
con ello, la invención se refiere a un polinucleótidos aislado que
comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 y 2.
De modo más particular, la invención se refiere
a un polinucleótido aislado hibridable en condiciones severas,
preferiblemente en condiciones muy severas, a un polinucleótido que
comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo
constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.
Ventajosamente, tales polinucleótidos pueden
obtenerse de hongos filamentosos, en particular de Aspergillus
niger. Más específicamente, la invención se refiere a un
polinucleótido aislado que tiene una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.
Como se utilizan en esta memoria, los términos
"gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de
ácido nucleico que pueden aislarse de DNA cromosómico, que incluyen
un marco de lectura abierto que codifica una proteína, v.g. una
fosfolipasa de Aspergillus niger. Un gen puede incluir
secuencias codificantes, secuencias no codificantes, intrones y
secuencias reguladoras. Además, un gen hace referencia a una
molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria.
Una molécula de ácido nucleico de la presente
invención, tal como una molécula de ácido nucleico que tiene la
secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ
ID NO: 1 y 2, puede aislarse utilizando técnicas estándar de
biología molecular y la información de secuencia proporcionada en
esta memoria. Por ejemplo, utilizando la totalidad o una porción de
la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido
por SEQ ID NO: 1 y 2 como sonda de hibridación, pueden aislarse
moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención utilizando
técnicas estándar de hibridación y clonación (v.g., como se describe
en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Además, una molécula de ácido nucleico que
abarca la totalidad o una porción de la secuencia de ácido nucleico
seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2 puede
aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizando iniciadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados
sobre la base de la información de secuencia contenida en el grupo
constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.
Un ácido nucleico de la invención puede
amplificarse utilizando cDNA, mRNA o alternativamente DNA genómico,
como molde e iniciadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo
con técnicas estándar de amplificación por PCR. El ácido nucleico
así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y
caracterizarse por análisis de la secuencia de DNA.
Adicionalmente, pueden prepararse
oligonucleótidos correspondientes a o hibridables a secuencias de
ácido nucleico de acuerdo con la invención por técnicas de síntesis
estándar, v.g., utilizando un sintetizador de DNA automático.
En una realización preferida, una molécula de
ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de
nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2. La secuencia de SEQ ID
NO: 2 corresponde a la región codificante del gen de fosfolipasa
PLP03 de Aspergillus niger proporcionado en SEQ ID NO: 1.
Este cDNA comprende la secuencia que codifica el polipéptido PLP03
de Aspergillus niger de acuerdo con SEQ ID NO: 3.
En otra realización preferida, una molécula de
ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de
ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.
Una molécula de ácido nucleico que es
complementaria a otra secuencia de nucleótidos es una que es
suficientemente complementaria a la otra secuencia de nucleótidos
de tal modo que la misma puede hibridarse a la otra secuencia de
nucleótidos formando con ello un dúplex estable.
Un aspecto de la invención se refiere a
moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido
de la invención o un equivalente funcional del mismo tal como un
fragmento o dominio biológicamente activo, así como moléculas de
ácido nucleico suficientes para uso como sondas de hibridación a fin
de identificar moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido de la invención y fragmentos de tales moléculas de
ácido nucleico adecuados para uso como iniciadores PCR para la
amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.
Un "polinucleótido aislado" o "ácido
nucleico aislado" es un DNA o RNA que no está inmediatamente
contiguo a ambas secuencias codificantes a las cuales está
inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y otra en el extremo
3') en el genoma existente naturalmente del organismo del que se
deriva. Así, en una realización, un ácido nucleico aislado incluye
algunas o la totalidad de las secuencias 5' no codificantes (v.g.,
promotoras) que son inmediatamente contiguas a la secuencia
codificante. El término incluye por tanto, por ejemplo, un DNA
recombinante que está incorporado en un vector, en un plásmido o
virus que se replica autónomamente, o en el DNA genómico de un
procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada
(v.g. un cDNA o un fragmento de DNA genómico producido por PCR o
tratamiento con endonucleasas de restricción) con independencia de
otras secuencias. El mismo incluye también un DNA recombinante que
es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional
que está sustancialmente exento de material celular, material viral,
o medio de cultivo (cuando se produce por técnicas de DNA
recombinante), o precursores químicos u otros productos químicos
(cuando se sintetiza químicamente). Además, un "fragmento de
ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no
existe naturalmente como fragmento y no podría encontrarse en el
estado natural.
Como se utilizan en esta memoria, los términos
"polinucleótido" o "molécula de ácido nucleico" tienen por
objeto incluir moléculas de DNA (v.g., cDNA o DNA genómico) y
moléculas de RNA (v.g., mRNA) y análogos del DNA o RNA generado
utilizando análogos nucleotídicos. La molécula de ácido nucleico
puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es DNA
bicatenario. El ácido nucleico puede sintetizarse utilizando
análogos o derivados oligonucleotídicos (v.g., nucleótidos de
inosina o fosforotioato). Tales oligonucleótidos pueden utilizarse,
por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen capacidades
alteradas de apareamiento de bases o resistencia incrementada a las
nucleasas.
Otra realización de la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico aislada que es antisentido respecto a
una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se
incluyen también dentro del alcance de la invención las cadenas de
complemento de las moléculas de ácido nucleico descritas en esta
memoria.
La información de secuencias que se proporciona
en esta memoria no debe interpretarse tan estrechamente que
requiera la inclusión de bases identificadas erróneamente. Las
secuencias específicas descritas en esta memoria pueden utilizarse
fácilmente para aislar el gen completo de hongos filamentosos, en
particular Aspergillus niger que, a su vez, pueden someterse
fácilmente a análisis de secuencia ulteriores identificando con ello
los errores de secuenciación.
A no ser que se indique otra cosa, todas las
secuencias de nucleótidos determinadas por secuenciación de una
molécula de DNA en esta memoria se determinaron utilizando un
secuenciador automático de DNA y todas las secuencias de
aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de DNA
determinadas en esta memoria fueron predichas por traducción de una
secuencia de DNA determinada como anteriormente. Por esta razón,
como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de DNA
determinada por este método automático, cualquier secuencia de
nucleótidos determinada en esta memoria puede contener algunos
errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por medios
automáticos son típicamente idénticas al menos aproximadamente en un
90%, de manera más general al menos aproximadamente en un 95% hasta
al menos aproximadamente 99,9% idénticas a la secuencia nucleotídica
real de la molécula de DNA secuenciada. La secuencia real puede ser
determinada con mayor precisión por otros métodos que incluyen
métodos manuales de secuenciación de DNA bien conocidos en la
técnica. Como se conoce también en la técnica, una sola inserción o
deleción en una secuencia de nucleótidos determinada comparada con
la secuencia real causará un desplazamiento del marco en la
traducción de la secuencia de nucleótidos de tal modo que la
secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de
nucleótidos determinada será complementa diferente de la secuencia
de aminoácidos codificada realmente por la molécula de DNA
secuenciada, comenzando en el punto de dicha inserción o
deleción.
La persona experta en la técnica es capaz de
identificar tales bases identificadas erróneamente y conoce el modo
de corregir dichos errores.
Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
invención puede comprender sólo una porción o un fragmento de la
secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por
SEQ ID NO: 1 y 2, por ejemplo un fragmento que puede utilizarse
como sonda o iniciador o un fragmento codificante de una porción de
una proteína de acuerdo con la invención. La secuencia de
nucleótidos determinada por la clonación del gen de fosfolipasa y
cDNA permite la generación de sondas e iniciadores diseñados para
uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la
familia de las fosfolipasas, así como homólogos de fosfolipasa de
otras especies. La sonda/iniciador comprende por regla general un
oligonucleótido sustancialmente purificado que comprende
típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que se hibrida
preferiblemente en condiciones de alta severidad a al menos
aproximadamente 12 ó 15, con preferencia aproximadamente 18 ó 20,
con preferencia aproximadamente 22 ó 25, con más preferencia
aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ó 75 o más
nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.
Sondas basadas en las secuencias de nucleótidos
proporcionadas en esta memoria pueden utilizarse para detectar
transcritos (en su mayoría mRNA) o secuencias genómicas que
codifican las mismas proteínas o proteínas homólogas, por ejemplo
en otros organismos. En realizaciones preferidas, la sonda comprende
adicionalmente un grupo marcador unido a ella, v.g., el grupo
marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una
enzima, o un cofactor enzimático. Tales sondas pueden utilizarse
también como parte de un kit de test de diagnóstico para
identificación de células que expresan una fosfolipasa.
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Los términos "homología" o "identidad
porcentual" se utilizan intercambiablemente en esta memoria. Para
el propósito de esta invención, se define aquí que, para determinar
la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos
secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para
propósitos de comparación óptimos (v.g., pueden introducirse
lagunas en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de
ácido nucleico para alineación óptima con una segunda secuencia de
aminoácidos o de ácido nucleico). Se comparan luego los residuos de
aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones
de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera
secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o el mismo
nucleótidos que la posición correspondiente en la segunda
secuencia, entonces las moléculas son idénticas en dicha posición.
El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del
número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es
decir, % identidad = número de posiciones idénticas/número total de
posiciones (es decir posiciones solapantes) x 100).
Preferiblemente, las dos secuencias tienen la misma longitud.
La persona experta será conocedora del hecho de
que están disponibles varios programas de computadora diferentes
para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, una
comparación de secuencias y determinación del porcentaje de
identidad entre dos secuencias puede realizarse utilizando un
algoritmo matemático. En una realización preferida, la identidad
porcentual entre dos secuencias de aminoácidos se determina
utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol.
(48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el
programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una
matriz PAM250, y un peso de laguna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y un
peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. La persona experta
apreciará que estos parámetros diferentes producirán resultados
ligeramente diferentes, pero que el porcentaje global de identidad
de dos secuencias no se ve alterado significativamente cuando se
utilizan algoritmos diferentes.
En otra realización adicional, el porcentaje de
identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina
utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible
en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP
y un peso por laguna de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso por longitud
de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6. En otra realización, el porcentaje de
identidad de dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se
determina utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS,
4:11-17 (1989) que se ha incorporado en el programa
ALIGN (versión 2.0) (disponible en:
http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)
utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por
longitud de laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4.
Las secuencias de ácido nucleico y proteínas de
la presente invención pueden utilizarse adicionalmente como una
"secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases
de datos públicas a fin de, por ejemplo, identificar otros miembros
de la familia o secuencias afines. Tales búsquedas pueden realizarse
utilizando los programas BLASTN y BLASTX (versión 2.0) de Altschul,
et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. La
búsqueda de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa
BLASTN, registro = 100, longitud de palabra = 12 para obtener
secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido
nucleico PLP03 de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST
pueden realizarse con el programa BLASTX, registro = 50, longitud de
palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las
moléculas de proteína PLP03 de la invención. Para obtener
alineaciones con lagunas para propósitos de comparación, puede
utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997)
Nucleic Acids Res. 25 (97):3389-3402. Cuando se
utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los
parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., BLASTX y
BLASTN). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se utiliza en esta memoria, el término
"hibridación" debe entenderse que describe condiciones para
hibridación y lavado en las cuales secuencias de nucleótidos que
son al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al
menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos
aproximadamente 80%, aún más preferiblemente al menos
aproximadamente 85% a 90%, más preferiblemente al menos
aproximadamente 95% homólogas unas a otras se mantienen típicamente
hibridadas unas a otras.
Un ejemplo preferido y no limitante de tales
condiciones de hibridación son hibridación en 6 x cloruro de
sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por uno
o más lavados en 1 x SSC, 0,1% SDS a 50ºC, preferiblemente a 55ºC,
preferiblemente a 60ºC y aún más preferiblemente a 65ºC.
Condiciones de alta severidad incluyen, por
ejemplo, hibridación a 68ºC en 5 x SSC/5 x solución de Denhardt/1,0%
SDS y lavado en 0,2 x SSC/0,1% SDS a la temperatura ambiente.
Alternativamente, el lavado puede realizarse a 42ºC.
El profesional experto conocerá qué condiciones
deben aplicarse como condiciones de hibridación severa y muy
severa. Orientaciones adicionales concernientes a dichas condiciones
están disponibles fácilmente en la técnica, por ejemplo, en
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al.
(eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley
& Sons, N.Y.).
Por supuesto, un polinucleótido que se hibrida
sólo a una secuencia poliA (tal como la región
3'-terminal poli(A) de mRNAs), o a un tramo
complementario de residuos T (o U), no debería incluirse en un
polinucleótido de la invención utilizado para hibridarse
específicamente a una porción de un ácido nucleico de la invención,
dado que un polinucleótido de este tipo se hibridaría a cualquier
molécula de ácido nucleico que contenga un tramo poli(A) o
el complemento del mismo (v.g. prácticamente cualquier clon de cDNA
bicatenario).
En un enfoque típico, pueden cribarse
bibliotecas de cDNA construidas a partir de otros organismos, v.g.
hongos filamentosos, en particular de las especies
Aspergillus.
Por ejemplo, pueden cribarse cepas de
Aspergillus respecto a polinucleótidos homólogos por análisis
mediante transferencia Northern. Después de la detección de
transcritos homólogos a los polinucleótidos de acuerdo con la
invención, pueden construirse bibliotecas de cDNA a partir de RNA
aislado de la cepa apropiada, utilizando métodos estándar bien
conocidos por los expertos en la técnica. Alternativamente, puede
cribarse una biblioteca de DNA genómico total utilizando una sonda
hibridable a un polinucleótido de acuerdo con la invención.
Pueden aislarse secuencias de genes homólogas,
por ejemplo, por realización de PCR utilizando dos agrupaciones de
iniciadores oligonucleotídicos degenerados diseñadas sobre la base
de secuencias de nucleótidos como las expuestas en esta
memoria.
El molde para la reacción puede ser cDNA
obtenido por transcripción inversa de mRNA preparado a partir de
cepas que se sabe o se sospecha expresan un polinucleótido de
acuerdo con la invención. El producto PCR puede subclonarse y
secuenciarse para asegurar que las secuencias amplificadas
representan las secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico
PLP03, o un equivalente funcional de la misma.
El fragmento PCR puede utilizarse luego para
aislar un clon de cDNA de longitud total por una diversidad de
métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado puede
marcarse y utilizarse para cribar una biblioteca de cDNA de
bacteriófago o cósmido. Alternativamente, el fragmento marcado puede
utilizarse para cribado de una biblioteca genómica.
Puede utilizarse también la tecnología PCR para
aislar secuencias de cDNA de longitud total de otros organismos.
Por ejemplo, puede aislarse RNA, siguiendo procedimientos estándar,
a partir de una fuente celular o tisular apropiada. Puede
realizarse una reacción de transcripción inversa sobre el RNA
utilizando un iniciador oligonucleotídico específico para el
extremo más próximo a 5' del fragmento amplificado para la
iniciación de la síntesis de la primera cadena.
El híbrido RNA/DNA resultante puede entonces
"adicionarse de colas" (v.g., con guaninas) utilizando una
reacción estándar de transferasa terminal, después de lo cual el
híbrido puede digerirse con RNasa H, y puede iniciarse luego la
síntesis de la primera cadena (v.g., con un iniciador
poli-C). Así, pueden aislarse fácilmente secuencias
de cDNA situadas aguas arriba del fragmento amplificado. Para una
revisión de estrategias de clonación útiles, véanse v.g., Sambrook
et al., supra; y Ausubel et al.,
supra.
Otro aspecto de la invención se refiere a
vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un
ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la invención
o un equivalente funcional de la misma. Como se utiliza en esta
memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido
nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha
enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a
un bucle de DNA bicatenario circular al cual pueden ligarse
segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector
viral, en el cual pueden estar ligados segmentos adicionales de DNA
al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación
autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (v.g.,
vectores bacterianos que tengan un origen de replicación bacteriano
y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (v.g., vectores
de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula
hospedadora por introducción en la célula hospedadora, y se
replican con ello junto con el genoma del hospedador. Además,
ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los
cuales están enlazados operativamente. A dichos vectores se hace
referencia en esta memoria como "vectores de expresión". En
general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de
DNA recombinante se encuentran a menudo en la forma de plásmidos.
Los términos "plásmido" y "vector" pueden utilizarse
intercambiablemente en esta memoria dado que el plásmido es la forma
más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención tiene
por objeto incluir dichas otras formas de vectores de expresión,
tales como vectores virales (v.g., retrovirus deficientes en
replicación, adenovirus y virus adeno-asociados),
que atienden funciones equivalentes.
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma
adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula
hospedadora, lo que significa que el vector de expresión
recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas
sobre la base de las células hospedadoras a utilizar para
expresión, que está enlazada operativamente a la secuencia de ácido
nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante,
"enlazado operativamente" tiene por objeto significar que la
secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la o las
secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la
secuencia nucleotídica (v.g., en un sistema de
transcripción/traducción in vitro o en una célula
hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora).
El término "secuencia reguladora" tiene por objeto incluir
promotores, intensificadores y otros elementos de control de la
expresión (v.g., señal de poliadenilación). Tales secuencias
reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel: Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen
aquéllas que dirigen expresión constitutiva o inducible de una
secuencia nucleotídica en muchos tipos de células hospedadoras y
aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia nucleotídica
únicamente en una determinada célula hospedadora (v.g. secuencias
reguladoras específicas de tejido). Será apreciado por los expertos
en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender
de factores tales como la elección de la célula hospedadora a
transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los
vectores de expresión de la invención pueden introducirse en
células hospedadoras para producir de este modo proteínas o
péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describen en
esta memoria (v.g. fosfolipasas, fosfolipasas mutantes, fragmentos
de las mismas, variantes o equivalentes funcionales de las mismas,
proteínas de fusión, etc.).
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención pueden diseñarse para expresión de fosfolipasas en
células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, una proteína de
acuerdo con la invención puede expresarse en células bacterianas
tales como E. coli y especies de Bacillus, células de
insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células
de levadura o células de mamífero. Células hospedadoras adecuadas se
exponen adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA
(1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede
transcribirse o traducirse in vitro, utilizando por ejemplo
secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.
Vectores de expresión útiles en la presente
invención incluyen vectores derivados de cromosomas, episomas y
virus, v.g., vectores derivados de plásmidos bacterianos,
bacteriófago, episoma de levadura, elementos cromosómicos de
levadura, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus vaccinia,
adenovirus, poxvirus de aves, virus de la pseudorrabia y
retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos,
tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y
bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos.
La inserción de DNA debería estar enlazada
operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del
fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los
promotores temprano y tardío de SV40 y promotores de LTRs de
retrovirus, para citar unos cuantos. La persona experta conocerá
otros promotores adecuados. En una realización específica, se
prefieren promotores que sean capaces de dirigir un nivel alto de
expresión de fosfolipasas en hongos filamentosos. Tales promotores
son conocidos en la técnica. Los constructos de expresión pueden
contener sitios para iniciación y terminación de la transcripción,
y, en la región transcrita, un sitio de fijación de ribosoma para
traducción. La porción codificante de los transcritos maduros
expresados por los constructos incluirá un AUG de comienzo de la
traducción al principio y un codón de terminación posicionado
adecuadamente al final de polipéptido a traducir.
Puede introducirse DNA vector en células
procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de
transformación o transfección. Como se utiliza en esta memoria,
debe entenderse que los términos "transformación" y
"transfección" se refieren a una diversidad de métodos
reconocidos en la técnica para introducir ácido nucleico extraño
(v.g., DNA) en una célula hospedadora, con inclusión de
co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de
calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano,
transducción, infección, lipofección, transfección mediada por
lípidos catiónicos o electroporación. Métodos adecuados para
transformación o transfección de células hospedadoras pueden
encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2^{nd} ed. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989),
Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology
(1986) y otros manuales de laboratorio.
La transfección estable de células de mamífero,
es sabido que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de
transfección utilizada, únicamente una pequeña fracción de células
pueden integrar el DNA extraño en su genoma. Con objeto de
identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un
marcador seleccionable (v.g., resistencia a antibióticos) se
introduce generalmente en las células hospedadoras junto con el gen
de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos
que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina
y metatrexato. Un ácido nucleico que codifica un marcador
seleccionable se introduce preferiblemente en una célula
hospedadora en el mismo vector que aquél que codifica una proteína
de acuerdo con la invención o puede introducirse en un vector
separado. Células transfectadas de manera estable con el ácido
nucleico introducido pueden identificarse por selección de fármaco
(v.g. las células que han incorporado el gen marcador seleccionable
sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).
La expresión de proteínas en procariotas se
lleva a cabo a menudo en E. coli con vectores que contienen
promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de
cualesquiera proteínas sean o no de fusión. Los vectores de fusión
añaden cierto número de aminoácidos a una proteína codificada en
ellos, v.g., al término amino de la proteína recombinante. Tales
vectores de fusión sirven típicamente para tres propósitos: 1) para
aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) para aumentar
la solubilidad de la proteína recombínate; y 3) para ayudar a la
purificación de la proteína recombinante por actuar como ligando en
la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de fusión
de expresión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la
unión del resto de fusión y la proteína recombinante a fin de
permitir la separación de la proteína recombinante del resto de
fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Tales
enzimas, y sus secuencias cognadas de recognación, incluyen Factor
Xa, trombina y enteroquinasa.
Como se ha indicado, los vectores de expresión
contendrán preferiblemente marcadores seleccionables. Tales
marcadores incluyen resistencia a
dihidrofolato-reductasa o neomicina para cultivo en
células eucariotas y resistencia a tetraciclina o ampicilina para
cultivo en E. coli y otras bacterias. Ejemplos
representativos de hospedadores apropiados incluyen células
bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces y
Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como
levadura; células de insecto tales como Drosophila S2 y
Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS y
melanoma de Bowes; y células de plantas. Medios y condiciones de
cultivo apropiados(as) para las células hospedadoras arriba
descritas se conocen en la técnica.
Entre los vectores preferidos para uso en
bacterias se encuentran pQE70, pQE60 and PQE-9,
disponibles de Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores
Bluescript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, disponibles de
Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia.
Entre los vectores eucariotas preferidos se encuentran PWLNEO,
pSV2CAT, pOG44, pZT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV,
pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados
serán inmediatamente evidentes para el profesional experto.
Promotores bacterianos conocidos para uso en la
presente invención incluyen los promotores lacI y lacZ de E.
coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores
lambda PR, PL y el promotor trp, el promotor HSV de
timidina-quinasa; los promotores temprano y tardío
de SV40, los promotores de LTRs retrovíricas, tales como los del
virus del sarcoma de Rous ("RSV"), y los promotores de
metalotioneína, tales como el promotor de
metalotioneína-I de ratón.
La inserción de una secuencia intensificadora en
el vector puede aumentar la transcripción del DNA codificante de
los polipéptidos de la presente invención por los eucariotas
superiores. Los intensificadores son elementos de acción cis de
DNA, por lo general de aproximadamente 10 a 300 pb que actúan para
aumentar la actividad de transcripción de un promotor en un tipo de
célula hospedadora dado. Ejemplos de intensificadores incluyen el
intensificador SV40, que está localizado en el lado tardío del
origen de replicación en pb 100 a 270, el intensificador del
promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador de polioma
en el lado tardío del origen de replicación, e intensificadores de
adenovirus.
Para secreción de la proteína traducida en el
lumen del retículo endoplasmático, en el espacio periplásmico o en
el ambiente extracelular, puede incorporarse una señal de secreción
apropiada en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser
endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
El polipéptido puede expresarse en una forma
modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no
sólo señales de secreción sino también regiones funcionales
heterólogas adicionales. Así, por ejemplo, una región de
aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, puede
añadirse al término N del polipéptido a fin de aumentar la
estabilidad y persistencia en la célula hospedadora, durante la
purificación o durante la manipulación y almacenamiento
subsiguientes. Asimismo, pueden añadirse al polipéptido restos de
péptidos para facilitar la purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona un polipéptido aislado
que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o una
secuencia de aminoácidos que puede obtenerse por expresión de las
secuencias de polinucleótidos seleccionadas del grupo constituido
por SEQ ID NO: 1 y 2 en un hospedador apropiado. Asimismo, está
comprendido dentro de la presente invención un péptido o
polipéptido que comprende equivalente funcional de los polipéptidos
anteriores. Los polipéptidos anteriores están comprendidos
colectivamente en el término "polipéptidos de acuerdo con la
invención".
Los términos "péptido" y
"oligopéptido" se consideran sinónimos (como está reconocido
comúnmente), y cada término puede utilizarse intercambiablemente a
medida que lo requiera el contexto indicando una cadena de al menos
dos aminoácidos reforzados por enlaces peptidílicos. El término
"polipéptido" se utiliza en esta memoria para cadenas largas
que contienen más de 7 residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas o
secuencias de oligopéptidos y polipéptidos de esta memoria están
descritas de izquierda a derecha y en la dirección del término
amino al término carboxilo. El código de aminoácidos de una sola
letra utilizado es de conocimiento común en la técnica y puede
encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2^{nd} ed. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
1989).
Por polipéptido o proteína "aislado" se
entiende un polipéptido o proteína separado(a) de su entorno
nativo. Por ejemplo, los polipéptidos producidos recombinantemente
y proteínas expresadas en células hospedadoras se consideran
aislados para el propósito de la invención al igual que los
polipéptidos nativos o recombinantes que han sido purificados
sustancialmente por cualquier técnica adecuada tal como, por
ejemplo, el método de purificación en un solo paso descrito en
Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
La fosfolipasa de acuerdo con la invención puede
recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células
recombinantes por métodos bien conocidos que incluyen precipitación
con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía
de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de
fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba,
cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito y
cromatografía de lectinas. Muy preferiblemente, se emplea para la
purificación cromatografía líquida de alta resolución
("HPLC").
Los polipéptidos de la presente invención
incluyen productos purificados naturalmente, productos de
procedimientos de síntesis química, y productos producidos por
técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o
eucariota, con inclusión, por ejemplo, de células bacterianas, de
levadura, de hongos, de plantas superiores, de insectos y de
mamíferos. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento
de producción recombinante, los polipéptidos de la presente
invención pueden estar glicosilados o no glicosilados.
Adicionalmente, los polipéptidos de la invención pueden incluir
también un residuo metionina inicial modificado, en algunos casos
como resultado de procesos mediados por hospedador.
Las proteínas de la presente invención pueden
enlazarse operativamente a un polipéptido distinto de fosfolipasa
(v.g., secuencias de aminoácidos heterólogos) a fin de formar
proteínas de fusión. Como se utiliza en esta memoria, una
"proteína quimérica" de fosfolipasa o "proteína de fusión"
comprende un polipéptido de fosfolipasa enlazado operativamente a
un polipéptido distinto de fosfolipasa.
Dentro de la proteína de fusión, el término
"enlazado operativamente" tiene por objeto indicar que el
polipéptido de fosfolipasa y el polipéptido distinto de fosfolipasa
están fusionados en marco uno a otro sea al término N o al término
C de la fosfolipasa.
Por ejemplo, en una realización, la proteína de
fusión es una proteína de fusión GST-fosfolipasa en
la cual las secuencias de fosfolipasa están fusionadas al término C
de las secuencias GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar
la purificación de fosfolipasa recombinante. En otra realización, la
proteína de fusión es una proteína fosfolipasa que contiene una
secuencia señal heteróloga en su término N. En ciertas células
hospedadoras, (v.g., células hospedadoras de mamífero y de
levadura), la expresión y/o secreción de fosfolipasa puede
aumentarse mediante el uso de una secuencia señal heteróloga.
En otro ejemplo, puede utilizarse la secuencia
secretora gp67 de la proteína de la envoltura del baculovirus como
secuencia señal heteróloga (Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons,
1992). Otras enzimas de secuencias señal heterólogas eucariotas
incluyen las secuencias secretoras de melitina y fosfatasa alcalina
placentaria humana (Stratagene, La Jolla, California). En otro
ejemplo adicional, secuencias señal heterólogas procariotas útiles
incluyen la señal secretora phoA (Sambrook et al.,
supra) y la señal secretora de la proteína A (Pharmacia
Biotech; Piscataway, Nueva Jersey).
Una secuencia señal puede utilizarse para
facilitar la secreción y aislamiento de una proteína o polipéptido
de la invención. Las secuencias señal se caracterizan típicamente
por un núcleo de aminoácidos hidrófobos que se escinden
generalmente de la proteína madura durante la secreción en uno o más
sucesos de escisión. Tales péptidos señal contienen sitios de
procesamiento que permiten la escisión de la secuencia señal de las
proteínas maduras a medida que pasan a través del camino secretor.
La secuencia señal dirige la secreción de la proteína, por ejemplo
desde un hospedador eucariota en el cual se transforma el vector de
expresión, y la secuencia señal se escinde subsiguiente o
concurrentemente. La proteína puede purificarse luego fácilmente
del medio extracelular por métodos reconocidos en la técnica.
Alternativamente, la secuencia señal puede estar enlazada a la
proteína de interés utilizando una secuencia que facilita la
purificación, tal como con un dominio GST. Así, por ejemplo, la
secuencia que codifica el polipéptido puede fusionarse a una
secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un
péptido, que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En
ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la
secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la
etiqueta proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otras,
muchas de las cuales están disponibles comercialmente. Como se
describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86: 821-824 (1989), por ejemplo, la
hexa-histidina proporciona una purificación
conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta HA es otro
péptido útil para purificación que corresponde a un epítope derivado
de la proteína de hemaglutinina de la gripe, que ha sido descrita
por Wilson et al., Cell 37:767 (1984), por ejemplo.
Preferiblemente, una proteína quimérica o de
fusión de la invención se produce por técnicas estándar de DNA
recombinante. Por ejemplo, fragmentos de DNA que codifican las
diferentes secuencias polipeptídicas se ligan en marco unos a otros
de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando
términos de extremos romos o extremos escalonados para ligación,
digestión con enzimas de restricción para proporcionar términos
apropiados, rellenado de extremos cohesivos en caso apropiado,
tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables,
y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede
sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen
sintetizadores de DNA automáticos. Alternativamente, puede llevarse
a cabo una amplificación por PCR de fragmentos de genes utilizando
iniciadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios
entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden reasociarse
subsiguientemente y reamplificarse para generar una secuencia de
gen quimérica (véase, por ejemplo, en Current Protocols in
Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley &
Sons, 1992). Además, están disponibles comercialmente muchos
vectores de expresión que codifican ya un resto de fusión (v.g., un
polipéptido GST). Un ácido nucleico de acuerdo con la invención
puede clonarse en un vector de expresión de este tipo de tal modo
que el resto de fusión está enlazado en marco al resto de fusión
con objeto de expresar una proteína de fusión que comprende una
proteína de acuerdo con la invención.
Los términos "equivalentes funcionales" y
"variantes funcionales" se utilizan intercambiablemente en esta
memoria. Equivalentes funcionales de DNA codificante de fosfolipasa
son fragmentos de DNA aislados que codifican un polipéptido que
exhibe una función particular de la fosfolipasa de Aspergillus
niger como se define en esta memoria. Un equivalente funcional
de un polipéptido de fosfolipasa de acuerdo con la invención es un
polipéptido que exhibe al menos una función de una fosfolipasa de
Aspergillus niger como se define en esta memoria. Los
equivalentes funcionales abarcan también por tanto fragmentos
biológicamente activos.
Los equivalentes funcionales de proteínas o
polipéptidos pueden contener únicamente sustituciones conservadoras
de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 3 o sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos no
esenciales. De acuerdo con ello, un aminoácido no esencial es un
residuo que puede alterarse en la secuencia de aminoácidos SEQ ID
NO: 3 sin alterar sustancialmente la función biológica. Por ejemplo,
se ha predicho que los residuos de aminoácidos que se conservan
entre las proteínas de fosfolipasa de la presente invención son
particularmente reacios a alteración. Adicionalmente los aminoácidos
conservados entre las proteínas de fosfolipasa de acuerdo con la
presente invención y otras fosfolipasas no son probablemente
susceptibles de alteración.
Debe entenderse que el término "sustitución
conservadora" significa una sustitución en la cual el residuo de
aminoácido está reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene
una cadena lateral similar. Estas familias son conocidas en la
técnica e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.g.,
lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (v.g.,
ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin
carga (v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina,
tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (v.g., alanina,
valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina,
triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (v.g., treonina,
valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.g., tirosina,
fenilalanina, triptófano, histidina).
Los equivalentes funcionales de ácido nucleico
pueden contener típicamente mutaciones silenciosas o mutaciones que
no alteran la función biológica del polipéptido codificado. De
acuerdo con ello, la invención proporciona moléculas de ácido
nucleico que codifican proteínas fosfolipasa que contienen cambios
en los residuos de aminoácidos que no son esenciales para una
actividad biológica particular. Tales proteínas difieren en la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, pero retienen todavía al
menos una actividad biológica. En una realización, la molécula de
ácido nucleico aislada comprende una secuencia nucleotídica que
codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia
de aminoácidos sustancialmente homóloga que tiene una homología de
al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
Por ejemplo, líneas orientativas concernientes
al modo de realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente
silenciosas se proporcionan en Bowie, J.U. et al., Science
247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican
que existen dos enfoques principales para estudiar la tolerancia al
cambio de una secuencia de aminoácidos. El primer método está
basado en el proceso de la evolución, en el cual las mutaciones son
aceptadas o rechazadas por selección natural. El segundo enfoque
utiliza ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos
en posiciones específicas de un gen clonado y selecciona o criba a
fin de identificar secuencias que mantienen la funcionalidad. Como
afirman los autores, estos estudios han revelado que las proteínas
son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de
aminoácidos. Los autores indican adicionalmente que los cambios son
probablemente permisivos en una determinada posición de la
proteína. Por ejemplo, la mayoría de los residuos de aminoácidos
ocultos requieren cadenas laterales no polares, mientras que
generalmente se conservan pocas características de cadenas
laterales superficiales. Otras sustituciones fenotípicamente
silenciosas de este tipo se describen en Bowie et al.,
supra, y las referencias citadas en dicho lugar.
Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una proteína homóloga a la proteína de SEQ ID NO: 3 puede
crearse por introducción de una o más sustituciones, adiciones o
deleciones de nucleótidos en las secuencias de nucleótidos
codificantes seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y
2, de tal modo que se introducen una o más sustituciones,
deleciones o inserciones de aminoácidos en la proteína codificada.
Tales mutaciones pueden introducirse por técnicas estándar, tales
como mutagénesis orientada y mutagénesis mediada por PCR.
El término "equivalentes funcionales"
abarca también ortólogos de las fosfolipasas de Aspergillus
niger proporcionadas en esta memoria. Los ortólogos de las
fosfolipasas de Aspergillus niger son proteínas que pueden
aislarse de otras cepas o especies y poseen una actividad biológica
similar o idéntica. Tales ortólogos son identificados fácilmente
porque comprenden una secuencia de aminoácidos que es
sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 3.
Como se define en esta memoria, el término
"sustancialmente homóloga" se refiere a una primera secuencia
de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número suficiente o
mínimo de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (v.g.
con cadenas laterales similares) a una segunda secuencia de
aminoácidos o nucleótidos, tal que las secuencias primera y segunda
de aminoácidos o nucleótidos tienen un dominio común. Por ejemplo,
las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que contienen un dominio
común que tiene aproximadamente 75%, preferiblemente 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad o más se definen en esta
memoria como suficientemente idénticas.
Asimismo, los ácidos nucleicos que codifican
otros miembros de la familia de las fosfolipasas, que tienen por
tanto una secuencia de nucleótidos que difiere de una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2
están dentro del alcance de la invención. Además, los ácidos
nucleicos que codifican proteínas fosfolipasa de diferentes
especies que tienen por tanto una secuencia de nucleótidos que
difiere de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo
constituido por SEQ ID NO: 1 y 2 están dentro del alcance de la
invención. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a
variantes (v.g. variantes alélicas naturales) y homólogos del DNA
de acuerdo con la invención pueden aislarse basándose en su
homología con los ácidos nucleicos descritos en esta memoria
utilizando los cDNAs descritos en esta memoria o un fragmento
adecuado de los mismos, como una sonda de hibridación de acuerdo con
técnicas estándar de hibridación, preferiblemente en condiciones de
hibridación muy severas.
Además de las variantes alélicas existentes
naturalmente de las secuencias de Aspergillus niger
proporcionadas en esta memoria, las personas expertas reconocerán
que pueden introducirse cambios por mutación en las secuencias de
nucleótidos seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y
2, conduciendo con ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de
la proteína fosfolipasa sin alterar sustancialmente la función de la
proteína.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan
fosfolipasas mejoradas. Las fosfolipasas mejoradas son proteínas en
las cuales al menos una actividad biológica está mejorada. Tales
proteínas pueden obtenerse por introducción aleatoria de mutaciones
a lo largo de la totalidad o una parte de la secuencia codificante,
por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los mutantes
resultantes pueden expresarse recombinantemente y cribarse respecto
a actividad biológica. Por ejemplo, la técnica proporciona ensayos
estándar para medir la actividad enzimática de las fosfolipasas y
por consiguiente pueden seleccionarse fácilmente proteínas
mejoradas.
En una realización preferida, la fosfolipasa
tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otra
realización, la fosfolipasa es sustancialmente homóloga a la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y retiene al menos una
actividad biológica de una fosfolipasa de SEQ ID NO: 3, pero difiere
en secuencia de aminoácidos debido a variación natural o
mutagénesis como se ha descrito arriba.
En una realización preferida adicional, la
fosfolipasa tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un
fragmento de ácido nucleico aislado capaz de hibridarse a un ácido
nucleico seleccionado del grupo constituido por SEQ ID NO: 1, y 2,
preferiblemente en condiciones de hibridación muy severas. De
acuerdo con ello, la fosfolipasa es una proteína que comprende una
secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%,
90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En particular, la fosfolipasa es una proteína
que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos
aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más
homóloga a la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:
3.
Equivalentes funcionales de una proteína de
acuerdo con la invención pueden identificarse también, v.g., por
cribado de bibliotecas combinatorias de mutantes, v.g. mutantes de
truncación de la proteína de la invención respecto a actividad de
fosfolipasa. En una realización, se genera una biblioteca
diversificada de variantes por mutagénesis combinatoria al nivel
del ácido nucleico. Una biblioteca diversificada de variantes puede
producirse, por ejemplo, por ligación enzimática de una mezcla de
oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de tal modo que
una serie degenerada de secuencias potenciales de proteína pueden
expresarse como polipéptidos individuales, o alternativamente, como
un conjunto de proteínas de fusión mayores (v.g. para presentación
de fago). Existe una diversidad de métodos que pueden utilizarse
para producir bibliotecas de variantes potenciales de los
polipéptidos de la invención a partir de una secuencia degenerada de
oligonucleótidos. Métodos para sintetizar oligonucleótidos
degenerados se conocen en la técnica (véase, v.g., Narang (1983)
Tetrahedron 39:3; ltakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem.
53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et
al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477).
Adicionalmente, pueden utilizarse bibliotecas de
fragmentos de la secuencia codificante de un polipéptido de la
invención para generar una población diversificada de polipéptidos
para cribado de una sección de variantes subsiguiente. Por ejemplo,
puede generarse una biblioteca de fragmentos de secuencia
codificante por tratamiento de un fragmento PCR bicatenario de la
secuencia codificante de interés con una nucleasa en condiciones en
las cuales el desplazamiento de la mella ocurre sólo aproximadamente
una vez por molécula, desnaturalización del DNA bicatenario,
renaturalización del DNA para formar DNA bicatenario que puede
incluir pares sentido/antisentido de productos mellados diferentes,
retirar porciones monocatenarias de los dúplex nuevamente formados
por tratamiento con nucleasa S1, y ligar la biblioteca de
fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este método,
puede derivarse una biblioteca de expresión que codifica fragmentos
N-terminales e internos de diversos tamaños de la
proteína de
interés.
interés.
Se conocen en la técnica varios métodos para el
cribado de productos génicos de bibliotecas combinatorias
fabricadas por mutaciones puntuales o truncación, y para cribado de
bibliotecas de cDNA respecto a productos génicos que tienen una
propiedad seleccionada. Las técnicas utilizadas más extensamente,
que son susceptibles de análisis con alta capacidad, para cribado
de grandes bibliotecas de genes, incluyen típicamente clonación de
la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables,
transformación de células apropiadas con la biblioteca de vectores
resultante, y expresión de los genes combinatorios en condiciones en
las cuales la detección de una actividad deseada facilita el
aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se ha
detectado. La mutagénesis recursiva de conjunto (REM), una técnica
que mejora la frecuencia de los mutantes funcionales en las
bibliotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de
cribado a fin de identificar variantes de una proteína de la
invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:7811-7815; Delgrave et al., (1993)
Protein Engineering 6 (3):327-331).
Será evidente para las personas expertas en la
técnica que pueden existir dentro de una población dada
polimorfismos de secuencia de DNA que pueden conducir a cambios en
la secuencia de aminoácidos de la fosfolipasa. Tales polimorfismos
genéticos pueden existir en células de poblaciones diferentes o
dentro de una población debido a la variación alélica natural. Las
variantes alélicas pueden incluir también equivalentes
funcionales.
Fragmentos de un polinucleótido de acuerdo con
la invención pueden comprender también polinucleótidos que no
codifican polipéptidos funcionales. Tales polinucleótidos pueden
funcionar como sondas o iniciadores para una reacción PCR.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la
invención, con indiferencia de si codifican polipéptidos funcionales
o no funcionales, pueden utilizarse como sondas de hibridación o
sondas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Usos de
las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no
codifican un polipéptido que tenga una actividad de fosfolipasa
incluyen, entre otros, (1) aislamiento del gen codificante de la
fosfolipasa de la invención, o variantes alélicas del mismo de una
biblioteca de cDNA, v.g. de otros organismos distintos de
Aspergillus niger, (2) hibridación in situ (v.g. FISH)
a extensiones cromosómicas en metafase a fin de proporcionar
localización cromosómica precisa del gen PLP03 como se describe en
Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic
Techniques, Pergamon Press, Nueva York, (1988); (3) análisis por
transferencia Northern para detectar la expresión del mRNA de
fosfolipasa en tejidos o células específicos, y 4) sondas e
iniciadores que pueden utilizarse como herramienta de diagnóstico
para analizar la presencia de un ácido nucleico hibridable a la
sonda de fosfolipasa en una muestra biológica (p.ej. tejido)
dada.
La invención abarca también un método de
obtención de un equivalente funcional de un gen o cDNA que codifica
una fosfolipasa. Dicho método implica la obtención de una sonda
marcada que incluye un ácido nucleico aislado que codifica la
totalidad o una porción de la secuencia seleccionada del grupo
constituido por SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 y 15 o una variante de los
mismos; cribado de una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico
con la sonda marcada en condiciones que permitan la hibridación de
la sonda a los fragmentos de ácido nucleico en la biblioteca,
formando con ello uno o más dúplex de ácido nucleico, y preparación
de una secuencia de gen de longitud total a partir de los
fragmentos de ácido nucleico en cualquier dúplex marcado para
obtener un gen relacionado con el gen de
fosfolipasa.
fosfolipasa.
En una realización, un ácido nucleico de acuerdo
con la invención es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,
94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más homólogo a una secuencia de
ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1
y 2 o el complemento de la misma.
En otra realización preferida, un polipéptido de
la invención es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más homólogo a la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En otra realización, la invención caracteriza
células, v.g., células hospedadoras transformadas o células
hospedadoras recombinantes que contienen un ácido nucleico abarcado
por la invención. Una "célula transformada" o "célula
recombinante" es una célula en la cual (o en un antepasado de la
cual) se ha introducido, por medio de técnicas de DNA recombinante,
un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se incluyen tanto
células procariotas como eucariotas, v.g. bacterias, hongos,
levaduras, y análogos, siendo especialmente preferidas las células
de hongos filamentosos, en particular Aspergillus niger.
Puede seleccionarse una célula hospedadora que
modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y
procesa el producto génico de una manera específica deseada. Tales
modificaciones (v.g., glicosilación) y procesamiento (v.g.,
escisión) de productos proteínicos pueden facilitar el
funcionamiento óptimo de la proteína.
Diversas células hospedadoras tienen mecanismos
característicos y específicos para procesamiento y modificación
posteriores a la traducción de proteínas y productos génicos. Pueden
seleccionarse líneas apropiadas de células o sistemas hospedadores
familiares para los expertos en la técnica de biología molecular y/o
microbiología para asegurar la modificación y el procesamiento
deseados y correctos de la proteína extraña expresada. A este fin,
pueden utilizarse células hospedadoras eucariotas que poseen la
maquinaria celular para procesamiento apropiado del transcrito
primario, glicosilación, y fosforilación del producto génico. Tales
células hospedadoras son bien conocidas en la técnica.
Las células hospedadoras incluyen también, pero
sin carácter modificante, líneas de células de mamífero tales como
CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, y líneas de células
del plexo coroideo.
En caso deseado, los polipéptidos de acuerdo con
la invención pueden ser producidos por una línea de células
transfectada establemente. Varios vectores adecuados para
transfección estable de células de mamífero están disponibles al
público, y métodos para construcción de tales líneas de células son
también de conocimiento público, v.g. en Ausubel et al.
(supra).
La invención caracteriza adicionalmente
anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales que
se fijan específicamente a fosfolipasas de acuerdo con la
invención.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Fab) debe
entenderse que incluye moléculas intactas así como fragmentos de
anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y
F(ab')_{2}) que son capaces de fijarse específicamente a la
proteína PLP03. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen
del fragmento Fc de anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente
de la circulación, y pueden tener menos fijación inespecífica de
tejido de un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med.
24: 316-325 (1983)). Por ello, se prefieren
estos fragmentos.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
prepararse por cualquiera de una diversidad de métodos. Por
ejemplo, pueden administrarse a un animal células que expresan la
fosfolipasa o un fragmento antigénico de la misma a fin de inducir
la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales. En
un método preferido, se prepara una preparación de fosfolipasa y se
purifica para dejarla sustancialmente exenta de contaminantes
naturales. Una preparación de este tipo se introduce luego en un
animal a fin de producir antisueros policlonales de mayor actividad
específica.
En el método más preferido, los anticuerpos de
la presente invención son anticuerpos monoclonales (o fragmentos de
fijación de fosfolipasa de los mismos). Tales anticuerpos
monoclonales pueden prepararse utilizando tecnología de hibridoma
(Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur.
J. Immunol. 6:511 (1976); Hammerling et al., en:
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,
Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)). En general,
tales procedimientos implican inmunizar un animal (preferiblemente
un ratón) con una proteína de acuerdo con la invención, o con una
célula que expresa una proteína de acuerdo con la invención. Se
extraen los esplenocitos de tales ratones y se fusionan con una
línea de células de mieloma adecuada. Puede emplearse cualquier
línea de células de mieloma adecuada de acuerdo con la presente
invención; sin embargo, es preferible emplear la línea de células
de mieloma parental (SP_{2}O), disponible de la American Type
Culture Collection, Rockville, Maryland. Después de la fusión, las
células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en
medio HAT, y se clonan luego por dilución limitante como se describe
por Wands et al. (Gastro-Enterology 80:
225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas
por dicha selección se ensayan luego para identificar clones, que
secreten anticuerpos capaces de fijar el antígeno de la proteína
PLP03. En general, los polipéptidos pueden acoplarse a una proteína
portadora, tal como KLH, como se describe en Ausubel et al.,
supra, mezclarse con un adyuvante, e inyectarse en un
mamífero hospedador.
En particular, pueden inmunizarse diversos
animales hospedadores por inyección de un polipéptido de interés.
Ejemplos de animales hospedadores adecuados incluyen conejos,
ratones, cobayos, y ratas. Pueden utilizarse diversos adyuvantes
para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie
hospedadora, con inclusión, pero sin carácter limitante, de
adyuvante de Freund's (completo e incompleto), geles minerales
adyuvantes tales como hidróxido de aluminio, sustancias
tensioactivas tales como lisolecitina, polioles Pluronic,
polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa
perforada, dinitrofenol, BCG (bacilo
Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de
moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de los animales
inmunizados.
Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase
de inmunoglobulina con inclusión de IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y
cualquier subclase de los mismos. Los hibridomas que producen los
mAbs de esta invención pueden cultivarse in vitro o in
vivo.
Una vez producidos, los anticuerpos policlonales
o monoclonales se testan respecto a reconocimiento específico de
una proteína de acuerdo con la invención o un equivalente funcional
de la misma en un inmunoensayo, tal como una transferencia Western
o análisis por inmunoprecipitación utilizando técnicas estándar
v.g., como se describe en Ausubel et al., supra. Los
anticuerpos que se fijan específicamente a una proteína de acuerdo
con la invención o equivalentes funcionales de la misma son útiles
en la invención. Por ejemplo, tales anticuerpos pueden utilizarse
en un inmunoensayo para detectar una proteína de acuerdo con la
invención en cepas patógenas o no patógenas de Aspergillus
(v.g., en extractos de Aspergillus).
Preferiblemente, los anticuerpos de la invención
se producen utilizando fragmentos de la proteína de acuerdo con la
invención que parece probable sean antigénicos, por criterios tales
como frecuencia alta de residuos cargados. Por ejemplo, dichos
fragmentos pueden generarse por técnicas estándar de PCR, y clonarse
luego en el vector de expresión pGEX (Ausubel et al.,
supra). Las proteínas de fusión pueden expresarse luego en
E. coli y purificarse utilizando una matriz de afinidad de
glutatión-agarosa como se describe en Ausubel, et
al., supra. Si se desea, pueden generarse varias (v.g.,
dos o tres) fusiones para cada proteína, y cada fusión puede
inyectarse en al menos dos conejos. Pueden generarse anticuerpos por
inyecciones en una serie, que incluirá típicamente al menos tres
inyecciones de refuerzo. Típicamente, los anticuerpos se comprueban
en cuanto a su capacidad para inmunoprecipitar un polipéptido PLP03
recombinante o equivalentes funcionales del mismo, en tanto que
proteínas no afines pueden servir como control para la especificidad
de la reacción inmune.
Alternativamente, técnicas descritas para
producción de anticuerpos monocatenarios (Patente U.S. 4.946.778 y
4.704.692) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios
contra una proteína de acuerdo con la invención o equivalentes
funcionales de la misma. Kits para generación y cribado de
bibliotecas de presentación de fago están disponibles
comercialmente, v.g. de Pharmacia.
Adicionalmente, ejemplos de métodos y reactivos
particularmente adecuados para uso en la generación y cribado de
bibliotecas de presentación de anticuerpos pueden encontrarse en,
por ejemplo, Patente U.S. No. 5.223.409; Publicación PCT No. WO
92/18619; Publicación PCT No. WO 91/17271; Publicación PCT No. WO
20791; Publicación PCT No. WO 92/20791; Publicación PCT No. WO
92/15679; Publicación PCT No. WO 93/01288; Publicación PCT No. WO
92/01047; Publicación PCT No. WO 92/09690; Publicación PCT No. WO
90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology
9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum.
Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al.
(1989) Science 246;1275-1281; Griffiths
et al. (1993) EMBO J. 12:725-734.
Anticuerpos policlonales y monoclonales que
fijan específicamente una proteína de acuerdo con la invención o
equivalentes funcionales de la misma pueden utilizarse, por ejemplo,
para detectar la expresión de un gen que codifica una proteína de
acuerdo con la invención o un equivalente funcional de la misma v.g.
en otra cepa de Aspergillus. Por ejemplo, una proteína de
acuerdo con la invención puede detectarse fácilmente en
inmunoensayos convencionales de células o extractos de
Aspergillus. Ejemplos de ensayos adecuados incluyen, sin
limitación, transferencia Western, ELISA's, radioinmunoensayos
(RIA's), y análogos.
Por "se fija específicamente" se entiende
que un anticuerpo reconoce y se fija a un antígeno particular, v.g.,
una proteína de acuerdo con la invención, pero no reconoce y se
fija sustancialmente a otras moléculas no afines en una
muestra.
Los anticuerpos pueden purificarse, por ejemplo,
por métodos de cromatografía de afinidad en los cuales el antígeno
polipeptídico está inmovilizado en una resina.
Un anticuerpo (v.g., un anticuerpo monoclonal)
dirigido contra una proteína de acuerdo con la invención puede
utilizarse para aislar la proteína por técnicas estándar, tales como
cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, un
anticuerpo de este tipo puede utilizarse para detectar la proteína
(v.g., en un lisado de células o sobrenadante de células) a fin de
evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína. Los
anticuerpos pueden utilizarse también en diagnóstico para
monitorizar niveles de proteínas en células o tejidos como parte de
un procedimiento de test clínico, v.g., a fin de, por ejemplo,
determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado o en el
diagnóstico de la Aspergillosis.
El acoplamiento del anticuerpo a una sustancia
detectable puede facilitar la detección. Ejemplos de sustancias
detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos,
materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales
bioluminiscentes, y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas
adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa
alcalina, \beta-galactosidasa, o
acetilcolinesterasa. Ejemplos de materiales fluorescentes adecuados
incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína,
rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína,
cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material
luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales
bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y equorina,
ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen ^{125}I,
^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.
Epítopes preferidos abarcados por el péptido
antigénico son regiones que están localizadas en la superficie de
la proteína, v.g., regiones hidrófilas. Pueden utilizarse gráficas
de hidrofobicidad de proteínas para identificar regiones
hidrófilas.
El péptido antigénico de una proteína de acuerdo
con la invención comprende al menos 7, preferiblemente 10, 15, 20,
ó 30 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y abarca un epítope de la proteína de
tal modo que un anticuerpo generado contra el péptido forma un
complejo inmune específico con la proteína. Epítopes preferidos
abarcados por el péptido antigénico son regiones de la proteína de
acuerdo con la invención que están localizadas en la superficie de
la proteína, v.g., regiones hidrófilas, regiones hidrófobas,
regiones que contienen hélices alfa, regiones que contienen cadena u
hoja beta, regiones en espiral, regiones de vuelta y regiones
flexibles.
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La determinación cualitativa o cuantitativa de
una proteína de acuerdo con la presente invención en una muestra
biológica puede realizarse utilizando cualquier método conocido en
la técnica. Las técnicas basadas en anticuerpos proporcionan
ventajas especiales para ensayar niveles específicos de polipéptidos
en una muestra biológica. En éstas, el reconocimiento específico es
proporcionado por el anticuerpo primario (policlonal o monoclonal)
pero el sistema de detección secundario puede utilizar anticuerpos
fluorescentes, enzimas, u otros anticuerpos secundarios conjugados.
Como resultado, se obtiene un inmunocomplejo.
De acuerdo con ello, la invención proporciona un
método para diagnosticar si un determinado organismo está infectado
con Aspergillus, que comprende los pasos de:
- \bullet
- aislar una muestra biológica de dicho organismo sospechoso de estar infectado con Aspergillus,
- \bullet
- hacer reaccionar dicha muestra biológica con un anticuerpo de acuerdo con la invención,
- \bullet
- determinar si se forman inmunocomplejos.
Los tejidos pueden extraerse también, v.g., con
urea y detergente neutro, para la liberación de proteína para el
ensayo de transferencia Western o el ensayo "dot/slot". Esta
técnica puede aplicarse también a fluidos corporales.
Otros métodos basados en anticuerpos útiles para
detectar una proteína de acuerdo con la invención incluyen
inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunosorbente unido a enzima
(ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Por ejemplo, pueden
utilizarse anticuerpos monoclonales contra una proteína de acuerdo
con la invención a la vez como inmunoabsorbente y como sonda
marcada enzimáticamente para detectar y cuantificar la proteína de
acuerdo con la invención. La cantidad de proteína específica
presente en la muestra puede calcularse por referencia a la
cantidad presente en una preparación estándar utilizando un
algoritmo de regresión lineal por computadora. En otro ensayo
ELISA, pueden utilizarse dos anticuerpos monoclonales específicos
distintos para detectar una proteína de acuerdo con la invención en
un fluido biológico. En este ensayo, uno de los anticuerpos se
utiliza como el inmuno-absorbente y el otro como la
sonda marcada con enzima.
Las técnicas anteriores pueden conducirse
esencialmente como un ensayo de "un solo paso" o "de dos
pasos". El ensayo "de un solo paso" indica poner en
contacto una proteína de acuerdo con la invención con anticuerpo
inmovilizado y, sin lavar, poner en contacto la mezcla con el
anticuerpo marcado. El ensayo de "dos pasos" implica lavado
antes de poner en contacto la mezcla con el anticuerpo marcado.
Pueden emplearse también en caso adecuado otros métodos
convencionales. Usualmente es deseable inmovilizar un componente del
sistema de ensayo sobre un soporte, permitiendo con ello que otros
componentes del sistema se pongan en contacto con el componente y
se separen fácilmente de la muestra.
Marcadores enzimáticos adecuados incluyen, por
ejemplo, los del grupo de las oxidasas, que catalizan la producción
de peróxido de hidrógeno por reacción con un sustrato. La actividad
de un marcador oxidasa puede ensayarse por medición de la
concentración de peróxido de hidrógeno formada por la reacción
enzima-anticuerpo marcado/sustrato.
Además de enzimas, otros marcadores adecuados
incluyen radioisótopos, tales como yodo (^{125}I, ^{131}I)
carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio
(^{111}In) y tecnecio (^{99m}Tc), y marcadores fluorescentes,
tales como fluoresceína y rodamina, así como biotina.
La fijación específica de un compuesto de test a
una proteína de acuerdo con la invención puede detectarse, por
ejemplo, in vitro por inmovilización reversible o
irreversible de la proteína de acuerdo con la invención sobre un
sustrato, v.g., la superficie de un pocillo de una placa de
microtitulación de poliestireno con 96 pocillos. Métodos para
inmovilización de polipéptidos y otras moléculas pequeñas son bien
conocidos en la técnica. Por ejemplo, las placas de microtitulación
pueden revestirse con una proteína de acuerdo con la invención por
adición de una proteína en solución (típicamente, a una
concentración de 0,05 a 1 mg/ml en un volumen de
1-100 \mul) a cada pocillo, e incubación de las
placas a la temperatura ambiente hasta 37ºC durante 0,1 a 36 horas.
Las proteínas que no se fijan a la placa pueden retirarse de la
placa por agitación mediante sacudidas del exceso de solución y
lavado posterior de la placa (una o varias veces) con agua o un
tampón. Típicamente, el polipéptido está contenido en agua o en un
tampón. La placa se lava luego con un tampón que carece del
polipéptido fijado. Para bloquear los sitios de fijación de proteína
libres en las placas, se bloquean las placas con una proteína que
no es afín al polipéptido fijado. Por ejemplo, son adecuados 300
\mul de seroalbúmina bovina (BSA) a una concentración de 2 mg/ml
en Tris-HCl. Sustratos adecuados incluyen aquellos
sustratos que contienen una química de reticulación definida (v.g.,
sustratos de plástico, tales como sustratos de poliestireno,
estireno, o polipropileno de Corning Costar Corp. (Cambridge, MA),
por ejemplo). Si se desea, puede utilizarse como sustrato una
partícula en forma de cuenta, v.g., agarosa en cuentas o sefarosa en
cuentas.
La fijación del compuesto de test a las
proteínas de acuerdo con la invención puede ser detectada por
cualquiera de una diversidad de métodos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, puede utilizarse un anticuerpo específico en un
inmunoensayo. Si se desea, el anticuerpo puede estar marcado (v.g.,
fluorescentemente o con un radioisótopo) y detectarse directamente
(véase, v.g., West y McMahon, J. Cell Biol. 74:264, 1977).
Alternativamente, puede utilizarse para detección un segundo
anticuerpo (v.g., un anticuerpo marcado que fija la porción Fc de un
anticuerpo anti-AN97). En un método de detección
alternativo, se marca la proteína de acuerdo con la invención, y se
detecta el marcador (v.g., por marcación de una proteína de acuerdo
con la invención con un radioisótopo, fluoróforo, cromóforo o
análogos). En otro método adicional, la proteína de acuerdo con la
invención se produce como una proteína de fusión que puede
detectarse ópticamente, v.g. proteína verde fluorescente (que puede
ser detectada bajo luz UV). En un método alternativo, la proteína de
acuerdo con la invención puede unirse covalentemente a o fusionarse
con una enzima que tiene una actividad enzimática detectable, tal
como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina,
\alpha-galactosidasa o
glucosa-oxidasa. Genes que codifican todas estas
enzimas han sido clonados y están fácilmente disponibles para uso
por los expertos en la técnica. Si se desea, la proteína de fusión
puede incluir un antígeno, y dicho antígeno puede ser detectado y
medido con un anticuerpo policlonal o monoclonal utilizando métodos
convencionales. Antígenos adecuados incluyen enzimas (v.g.,
peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, y
\alpha-galactosidasa) y polipéptidos no
enzimáticos (v.g., proteínas de suero, tales como BSA y globulinas,
y proteínas de leche, tales como caseínas).
En otro aspecto, la invención proporciona un
péptido o polipéptido que comprende una porción portadora de
epítope de un polipéptido de la invención. El epítope de esta
porción polipeptídica es un epítope inmunógeno o antigénico de un
polipéptido de la invención. Un "epítope inmunógeno" se define
como parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpos
cuando la proteína entera es el inmunógeno. Se cree que estos
epítopes inmunógenos están confinados a un pequeño número de loci
en la molécula. Por otra parte, una reacción de una molécula de
proteína a la cual puede fijarse un anticuerpo se define como un
"epítope antigénico". El número de epítopes inmunógenos de una
proteína es generalmente menor que el número de epítopes
antigénicos. Véase, por ejemplo, Geysen, H.M. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984).
En cuanto a la selección de péptidos o
polipéptidos que llevan un epítope antigénico (es decir, que
contienen una región de una molécula de proteína a la cual puede
fijarse un anticuerpo), es bien sabido en la técnica que los
péptidos sintéticos relativamente cortos que mimetizan parte de una
secuencia de proteína son capaces rutinariamente de generar un
antisuero que reacciona con la proteína parcialmente mimetizada.
Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J.G. et al., Science
219:660-666 (1984). Péptidos capaces de producir
sueros reactivos con proteínas se representan frecuentemente en la
secuencia primaria de una proteína, pueden caracterizarse por una
serie de reglas químicas simples, y no están confinados a regiones
inmunodominantes de proteínas intactas (es decir, epítopes
inmunógenos) ni a los terminales amino o carboxilo. Péptidos que son
extremadamente hidrófobos y aquéllos que tienen 6 residuos o menos
son generalmente ineficaces para inducir anticuerpos que se fijen a
la proteína mimetizada; usualmente son eficaces péptidos solubles
más largos, especialmente aquéllos que contienen residuos prolina.
Sutcliffe, J.G. et al., supra, en 661. Por ejemplo, 18
de 20 péptidos diseñados de acuerdo con estas líneas orientativas,
que contenían 8-39 residuos que abarcaban el 75% de
la secuencia de la cadena del polipéptido HAI de la hemaglutinina
del virus de la gripe, inducían anticuerpos que reaccionaban con la
proteína HA1 o el virus intacto; y 12/12 péptidos de la polimerasa
de MuLV y 18/18 de la glicoproteína de la rabia inducían
anticuerpos que precipitaban las proteínas respectivas.
Los péptidos y polipéptidos portadores de
epítopes antigénicos de la invención son por tanto útiles para
producir anticuerpos, con inclusión de anticuerpos monoclonales que
se fijan específicamente a un polipéptido de la invención. Así
pues, una elevada proporción de hibridomas obtenidos por fusión de
células de bazo de donantes inmunizados con un péptido portador de
epítope antigénico secretan por regla general anticuerpo reactivo
con la proteína nativa. Sutcliffe, J.G. et al.,
supra, en 663. Los anticuerpos generados por los péptidos o
polipéptidos portadores de epítope antigénico son útiles para
detectar la proteína mimetizada, y los anticuerpos para péptidos
diferentes pueden utilizarse para seguir la pista de diversas
regiones de un precursor proteínico que sufre procesamiento
posterior a la traducción. Los péptidos y anticuerpos
anti-peptídicos pueden utilizarse en una diversidad
de ensayos cualitativos o cuantitativos para la proteína mimetizada,
por ejemplo en ensayos de competición, dado que se ha demostrado
que incluso péptidos cortos (v.g., de aproximadamente 9 aminoácidos)
pueden fijarse y desplazar los péptidos más largos en ensayos de
inmunoprecipitación. Véase, por ejemplo, Wilson, I.A. et
al., Cell 37:767-778 en 777 (1984). Los
anticuerpos antipeptídicos de la invención son útiles también para
purificación de la proteína mimetizada, por ejemplo, por
cromatografía de adsorción utilizando métodos bien conocidos en la
técnica.
Los péptidos y polipéptidos portadores de
epítope antigénico de la invención diseñados de acuerdo con las
líneas orientativas anteriores contienen preferiblemente una
secuencia de al menos 7, más preferiblemente al menos 9 y muy
preferiblemente entre aproximadamente 15 a aproximadamente 30
aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido de la invención. Sin embargo, los péptidos o
polipéptidos que comprenden una porción mayor de una secuencia de
aminoácidos de un polipéptido de la invención, que contienen
aproximadamente 30 a aproximadamente 50 aminoácidos, o cualquier
longitud hasta e incluyendo la secuencia entera de aminoácidos de
un polipéptido de la invención, se consideran también péptidos o
polipéptidos portadores de epítope de la invención y son útiles
también para inducir anticuerpos que reaccionan con la proteína
mimetizada. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del
péptido portador de epítope se selecciona de modo que proporcione
solubilidad sustancial en disolventes acuosos (es decir, la
secuencia incluye residuos relativamente hidrófilos y las
secuencias altamente hidrófobas preferiblemente se evitan); y son
particularmente preferidas secuencias que contienen residuos
prolina.
Los péptidos y polipéptidos portadores de
epítope de la invención puede ser producidos por cualquier medio
convencional para fabricación de péptidos o polipéptidos con
inclusión de medios recombinantes que utilizan moléculas de ácido
nucleico de la invención. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos
portadora de epítope corta puede fusionarse a un polipéptido más
largo que actúa como portador durante la producción recombinante y
la purificación, así como durante la inmunización para producir
anticuerpos antipeptídicos.
Los péptidos portadores de epítope pueden
sintetizarse también utilizando métodos conocidos de síntesis
química. Por ejemplo, Houghten ha descrito un método simple para
síntesis de grandes números de péptidos, tales como
10-20 mg de 248 péptidos de 13 residuos diferentes
que representan variantes de un solo aminoácido de un segmento del
polipéptido HAI que se prepararon y caracterizaron (por estudios de
fijación de tipo ELISA) en menos de 4 semanas. Houghten, R. A.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985). Este
proceso "Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS)" se
describe adicionalmente en la Patente U.S. No. 4.631.211 concedida a
Houghten et al. (1986). En este procedimiento, las resinas
individuales para la síntesis en fase sólida de diversos péptidos
están contenidas en paquetes separados permeables al disolvente, que
permiten el uso óptimo de los muchos pasos repetitivos idénticos
implicados en los métodos de fase sólida. Un procedimiento
completamente manual permite la realización simultánea de
500-1000 o más síntesis. Houghten et al.,
supra, en 5134.
Los péptidos y polipéptidos de la invención
portadores de epítope pueden utilizarse para inducir anticuerpos de
acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por
ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et
al., supra; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F.J. et al.,
J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985). Generalmente,
los animales pueden inmunizarse con péptido libre; sin embargo, el
título de anticuerpos anti-peptídicos puede
reforzarse por acoplamiento del péptido a un portador
macromolecular, tal como hemocianina de lapa perforada (KLH) o
toxoide del tétanos. Por ejemplo, los péptidos que contienen
cisteína pueden acoplarse a un portador utilizando un enlazador tal
como
maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida-éster
(MBS), en tanto que otros péptidos pueden acoplarse a un portador
utilizando un agente enlazador más general tal como aldehído
glutárico. Los animales tales como conejos, ratas y ratones se
inmunizan con péptidos libres o acoplados a un portador, por
ejemplo, por inyección intraperitoneal y/o intradérmica de
emulsiones que contienen aproximadamente 100 \mug de péptido o
proteína portadora y adyuvante de Freund. Pueden ser necesarias
varias inyecciones de refuerzo, por ejemplo, a intervalos de
aproximadamente 2 semanas, a fin de proporcionar un título útil de
anticuerpo antipeptídico que pueda ser detectado, por ejemplo, por
ensayo ELISA utilizando péptido libre adsorbido en una superficie
sólida. El título de anticuerpos anti-peptídicos en
suero procedente de un animal inmunizado puede incrementarse por
selección de anticuerpos anti-peptídico, por
ejemplo, por adsorción al péptido en un soporte sólido y elución de
los anticuerpos seleccionados de acuerdo con métodos bien conocidos
en la técnica.
Los péptidos inmunógenos portadores de epítope
de la invención, es decir, aquellas partes de una proteína que
genera una respuesta de anticuerpos cuando la proteína entera es el
inmunógeno, se identifican de acuerdo con métodos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, Geysen et al., 1984, supra,
describe un procedimiento para síntesis rápida simultánea sobre
soportes sólidos de centenares de péptidos de pureza suficiente para
reaccionar en un ensayo de inmunosorbente unido a enzima. La
interacción de los péptidos sintetizados con anticuerpos se detecta
luego fácilmente sin retirarlos del soporte. De esta manera, un
péptido que lleva un epítope inmunógeno de una proteína deseada
puede ser identificado rutinariamente por una persona con
experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, Geysen et
al., localizaron el epítope inmunológicamente importante en la
proteína de la cubierta del virus de la glosopeda con una
resolución de 7 aminoácidos por síntesis de un conjunto solapante
de todos los 208 hexapéptidos posibles que abarcaban la secuencia
entera de 213 aminoácidos de la proteína. A continuación, se
sintetizaron una serie completa de reemplazamiento de péptidos en el
cual la totalidad de los 20 aminoácidos se sustituyeron
sucesivamente en cada posición dentro del epítope, y se determinaron
los aminoácidos particulares que conferían especificidad para la
reacción con el anticuerpo. Así pues, análogos peptídicos de los
péptidos portadores de epítope de la invención pueden producirse
rutinariamente por este método. La Patente U.S. No. 4.708.781
concedida a Geysen (1987) describe adicionalmente este método de
identificación de un péptido que lleva un epítope inmunógeno de una
proteína deseada.
Adicionalmente, la Patente U.S. No. 5.194.392
concedida a Geysen (1990) describe un método general de detección o
determinación de la secuencia de monómeros (aminoácidos u otros
compuestos), que es un equivalente topológico del epítope (es
decir, un "mimotope") que es complementario a un paratope
particular (sitio de fijación de antígeno) de un anticuerpo de
interés. Más generalmente, la Patente U.S. No. 4.433.092 concedida a
Geysen (1989) describe un método de detección o determinación de
una secuencia de monómeros que es un equivalente topográfico de un
ligando que es complementario al sitio de fijación de ligando de un
receptor particular de interés. Análogamente, la Patente U.S. No.
5.480.971 concedida a Houghten, R.A. et al. (1996) sobre
Mezclas de Oligopéptidos Peralquilados describe oligopéptidos
peralquilados lineales C1-C7-alquilo
y series y bibliotecas de tales péptidos, así como métodos para
utilización de dichas series y bibliotecas de oligopéptidos para
determinación de la secuencia de un oligopéptido peralquilado que se
fija preferentemente a una molécula aceptora de interés. Así,
pueden producirse también rutinariamente análogos no peptídicos de
los péptidos portadores de epítope de la invención por estos
métodos.
La invención se refiere también al uso de la
fosfolipasa de acuerdo con la invención en un número seleccionado
de procesos industriales y farmacéuticos. A pesar de la experiencia
a largo plazo obtenida con estos procesos, la fosfolipasa de
acuerdo con la invención caracteriza cierto número de ventajas
importantes con respecto a las enzimas utilizadas actualmente.
Dependiendo de la aplicación específica, estas ventajas pueden
incluir aspectos como menores costes de producción, mayor
especificidad de sustrato, ser menos antigénicas, menores
actividades secundarias indeseables, mayores rendimientos cuando se
producen en un microorganismo adecuado, intervalos más adecuados de
pH y temperatura, mejores sabores del producto final así como mejor
calidad alimentaria y aspectos legales.
Un aspecto importante de las fosfolipasas de
acuerdo con la invención es que las mismas abarcan un campo total
de pH y temperatura óptimos que son idealmente adecuados para una
diversidad de aplicaciones. Por ejemplo, muchos procesos en gran
escala se benefician de temperaturas de procesamiento relativamente
altas de 50ºC o superiores, v.g. para controlar los riesgos de
infecciones microbianas. Varias fosfolipasas de acuerdo con la
invención satisfacen esta demanda, pero al mismo tiempo no poseen
una estabilidad térmica tal que le permita resistir la
desactivación por un tratamiento térmico adicional. La última
característica permite rutas de producción que producen compuestos
finales, tales como productos horneados como el pan que están
exentos de actividad enzimática residual. Análogamente, muchos
productos alimentarios y piensos tienen valores de pH ligeramente
ácidos, por lo que se prefieren para su procesamiento fosfolipasas
con pH óptimos ácidos o prácticamente neutros. Una fosfolipasa de
acuerdo con la invención cumple asimismo con este requisito.
Las fosfolipasas de la presente invención pueden
utilizarse en cualquier aplicación en la que se desee hidrolizar un
fosfolípido u obtener productos de escisión específicos del mismo.
Por ejemplo, la aplicación de los polipéptidos de acuerdo con la
invención puede producir lisofosfolípidos, diacilgliceroles, colina-
o etanolaminafosfatos, lisofosfatidilcolina,
lisofosfatidiletanolamina y diversos fosfatidatos. Las fosfolipasas
de la presente invención se utilizan preferiblemente un pH óptimo
para su actividad.
Las fosfolipasas de la presente invención pueden
utilizarse para desgomado de una solución o lodo acuoso(a)
de carbohidrato a fin de mejorar su filtrabilidad, particularmente,
un hidrolizado de almidón, especialmente un hidrolizado de almidón
de trigo que es difícil de filtrar y produce filtrados turbios. El
tratamiento puede realizarse utilizando métodos bien conocidos en
la técnica. Véase, por ejemplo,
EP-A-219269 y
EP-A-808903.
Las fosfolipasas de la presente invención pueden
utilizarse en un proceso para reducir el contenido de fosfolípidos
en aceite comestible por tratamiento del aceite con el polipéptido a
fin de hidrolizar una mayor porción del fosfolípido y separar una
fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado del aceite. Un
proceso de este tipo es aplicable para la purificación de cualquier
aceite comestible que contenga fosfolípido, v.g. aceites vegetales
tales como aceite de soja, aceite de colza, y aceite de girasol. Con
anterioridad al tratamiento con fosfolipasa, el aceite se pretrata
preferiblemente para eliminar fango (mucílago), v.g., por refino
húmedo. Típicamente, el aceite contendrá 50-250 ppm
de fósforo como fosfolípido al comienzo del tratamiento con la
fosfolipasa, y el tratamiento puede reducir el contenido de fósforo
hasta por debajo de 5-10 ppm. El tratamiento con
fosfolipasa se conduce por dispersión de una solución acuosa de la
fosfolipasa, preferiblemente como gotitas con un diámetro medio
inferior a 10 \mum. La cantidad de agua es preferiblemente
0,5-5% en peso con relación al aceite. Puede
añadirse opcionalmente un emulsionante. Puede aplicarse agitación
mecánica para mantener la emulsión. El tratamiento con fosfolipasa
puede conducirse a un pH en el intervalo de aproximadamente 3,5 a
aproximadamente 5 para maximizar la eficiencia de la enzima, o puede
utilizarse un pH en el intervalo de aproximadamente 1,5 a
aproximadamente 3 (v.g., 2-3) a fin de suprimir la
hidrólisis alcalina de los triglicéridos (saponificación). El pH
puede ajustarse por adición de ácido cítrico, un tampón de citrato,
o ácido clorhídrico. Una temperatura adecuada es generalmente
30-70ºC (particularmente 30-45ºC,
v.g., 35-40ºC). El tiempo de reacción será
típicamente 1-12 horas (v.g., 2-6
horas). Una dosis de enzima adecuada será usualmente
0,1-10 mg por litro (v.g., 0,5-5 mg
por litro). El tratamiento con fosfolipasa puede conducirse por
lotes, v.g., en un depósito con agitación, o puede ser continuo,
v.g., una serie de reactores de tanque agitado. El tratamiento con
fosfolipasa va seguido por la separación de una fase acuosa y una
fase de aceite. La separación puede realizarse por medios
convencionales, v.g., centrifugación. La fase acuosa contendrá
fosfolipasa, y la enzima puede reutilizarse para mejorar la
economía del proceso. El tratamiento puede realizarse utilizando
cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Véase, por
ejemplo, la Patente U.S. No. 5.264.367,
EP-A-654527 y
JP-A-2-153997.
Los productos horneados se preparan a partir de
una masa que está hecha usualmente de los ingredientes básicos
harina, agua y opcionalmente sal. Dependiendo de los productos
horneados, otros ingredientes opcionales son azúcares, sabores,
etcétera. Para los productos leudados, se utiliza principalmente
levadura de panaderos además de sistemas químicos de leudado tales
como una combinación de un ácido (compuesto generador) y
bicarbonato. Con objeto de mejorar las propiedades de manipulación
de la masa y/o las propiedades finales de los productos horneados,
se realizan esfuerzos continuos para desarrollar adyuvantes de
procesamiento con propiedades mejoradas. Las propiedades de la masa
que deben mejorarse comprenden trabajabilidad, capacidad de
retención de gas, etcétera. Las propiedades de los productos
horneados que pueden mejorarse comprenden volumen de la hogaza,
calidad crujiente de la corteza, textura y suavidad de la miga,
sabor y aroma, así como vida útil. Los adyuvantes de procesamiento
existentes actualmente pueden dividirse en dos grupos: aditivos
químicos y enzimas.
Los aditivos químicos con propiedades
mejoradoras comprenden agentes oxidantes tales como ácido ascórbico,
bromato y azodicarbonato, agentes reductores tales como
L-cisteína y glutatión, emulsionantes que actúan
como acondicionadores de la masa tales como ésteres
diacetil-tartáricos de mono/diglicéridos (DATEM),
estearoil-lactilato de sodio (SSL) o
estearoil-lactilato de calcio (CSL), o que actúan
como ablandadores de la miga tales como monoestearato de glicerol
(GMS), etcétera, materiales grasos tales como triglicéridos (grasa)
o lecitina y otros.
Actualmente, existe tendencia a reemplazar los
aditivos químicos por enzimas. Se considera que las últimas son
compuestos más naturales y por consiguiente mejor aceptados por el
consumidor. Enzimas adecuadas pueden seleccionarse del grupo
constituido por enzimas degradantes del almidón, enzimas degradantes
de arabinosilanos y otras hemicelulosas, enzimas degradantes de la
celulosa, enzimas oxidantes, enzimas de fraccionamiento del
material graso y enzimas degradantes de proteínas.
La presente invención se refiere también a
métodos para preparación de una masa o un producto horneado que
comprenden incorporar en la masa una cantidad eficaz de una
fosfolipasa de la presente invención que mejora una o más
propiedades de la masa o el producto horneado obtenido a partir de
la masa con relación a una masa o un producto horneado en el cual
no se ha incorporado el polipéptido.
La expresión "incorporación en la masa" se
define en esta memoria como adición de la fosfolipasa de acuerdo
con la invención a la masa, a cualquier ingrediente a partir de los
cuales se producirá la masa, y/o cualquier mezcla de ingredientes
de la masa a partir de los cuales debe producirse la masa. Dicho de
otro modo, la fosfolipasa de acuerdo con la invención puede
añadirse en cualquier paso de la preparación de la masa y puede
añadirse en 1, 2 o más pasos. La fosfolipasa de acuerdo con la
invención se añade a los ingredientes de una masa que se amasa y se
hornea para fabricar el producto horneado utilizando métodos bien
conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. No.
4.567.046, EP-A-426211,
JP-A-60-78529,
JP-A-62-111629, y
JP-A-63-258528.
El término "cantidad eficaz" se define en
esta memoria como una cantidad de la fosfolipasa de acuerdo con la
invención que es suficiente para proporcionar un efecto medible en
al menos una propiedad de interés de la masa y/o el producto
horneado.
El término "propiedad mejorada" se define
en esta memoria como cualquier propiedad de una masa y/o un producto
obtenido a partir de la masa, particularmente un producto horneado,
que se mejora por la acción de la fosfolipasa de acuerdo con la
invención con relación a una masa o producto en el cual no se ha
incorporado la fosfolipasa de acuerdo con la invención. La
propiedad mejorada puede incluir, pero sin carácter limitante,
solidez incrementada de la masa, elasticidad incrementada de la
masa, estabilidad incrementada de la masa, pegajosidad reducida de
la masa, extensibilidad mejorada de la masa, sabor mejorado del
producto horneado, anti-enranciamiento mejorado del
producto horneado.
La propiedad mejorada puede determinarse por
comparación de una masa y/o un producto horneado preparados con y
sin adición de un polipéptido de la presente invención de acuerdo
con los métodos de la presente invención como se describe más
adelante en los ejemplos. Las cualidades organolépticas pueden
evaluarse utilizando procedimientos bien establecidos en la
industria de la panadería, y pueden incluir, por ejemplo, el uso de
un panel de testadores de sabor cualificados.
La expresión "solidez incrementada de la
masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa que
tiene generalmente propiedades más elásticas y/o requiere más
aporte de trabajo para moldear y conformar.
La expresión "elasticidad incrementada de la
masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa
que tiene mayor tendencia a recuperar su forma original después de
ser sometida a una cierta deformación física.
La expresión "estabilidad incrementada de la
masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa
que es menos sensible al maltrato mecánico manteniendo mejor por
tanto su forma y volumen.
La expresión "pegajosidad reducida de la
masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa que
tiene menos tendencia a adherirse a las superficies, v.g., en la
maquinaria de producción de la masa, y es evaluada empíricamente
por el panadero testador experto o se mide por el uso de un
analizador de textura (v.g., TAXT2) como se conoce en la
técnica.
La expresión "extensibilidad mejorada de la
masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa
que puede someterse a deformación o estirado incrementados sin
rotura.
La expresión "trabajabilidad mejorada de la
masa" se define en esta memoria como la propiedad de una masa
que es generalmente menos pegajosa y/o más firme y/o más
elástica.
La expresión "volumen incrementado del
producto horneado" se mide como el volumen específico de una
hogaza de pan dada (volumen/peso) determinado típicamente por el
método tradicional de desplazamiento de la colza.
La expresión "estructura mejorada de la miga
del producto horneado" se define en esta memoria como la
propiedad de un producto horneado con paredes de celdillas más
finas y/o más delgadas en la miga y/o una distribución más
uniforme/homogénea de las celdillas en la miga, y es evaluada por
regla general empíricamente por el panadero testador con
experiencia.
La expresión "blandura mejorada del producto
horneado" es la opuesta a "consistencia", y se define en
esta memoria como la propiedad de un producto horneado que se
comprime más fácilmente y es evaluada empíricamente por el panadero
testador experto o medida por el uso de un analizador de textura
(v.g., TAXT2) como se conoce en la técnica.
La expresión "sabor mejorado del producto
horneado" es evaluada por un panel de testadores
cualificados.
La expresión
"anti-enranciamiento mejorado del producto
horneado" se define en esta memoria como las propiedades de un
producto horneado que tienen una tasa reducida de deterioro de los
parámetros de calidad, v.g. blandura y/o elasticidad, durante el
almacenamiento.
El término "masa" se define en esta memoria
como una mezcla de harina y otros ingredientes suficientemente
consistentes para amasado o rebozado. La masa puede ser reciente,
congelada, pre-cortada en barras, o
pre-horneada. La preparación de masa congelada ha
sido descrita por Kulp y Lorenz en Frozen and Refrigerated Doughs
and Batters.
El término "producto horneado" se define en
esta memoria como cualquier producto preparado a partir de una
masa, sea de carácter blando o de carácter crujiente. Ejemplos de
productos horneados, tanto si son de tipo blanco, claro u oscuro,
que pueden producirse ventajosamente por la presente invención son
pan (en particular pan blanco, de harina entera o de centeno),
típicamente en forma de hogazas o bollos, pan francés de tipo
baguette, pasta, pan de pita, tortillas, tacos, tartas, tortitas,
magdalenas, galletas, cortezas de empanada, pan cocido al vapor,
pan crujiente, y análogos.
Las fosfolipasas de la presente invención y/o
enzimas adicionales a utilizar en los métodos de la presente
invención pueden encontrase en cualquier forma adecuada para el uso
en cuestión, v.g., en la forma de un polvo seco, polvo aglomerado,
o granulado, en particular un granulado no polvoriento, líquido, en
particular un líquido estabilizado, o enzima protegida como se
describe en WO 01/11974 y WO 02/26044. Los granulados y polvos
aglomerados pueden prepararse por métodos convencionales, v.g., por
pulverización de la fosfolipasa de acuerdo con la invención sobre
un soporte en un granulador de lecho fluido. El soporte puede estar
constituido por núcleos particulados que tienen un tamaño de
partícula adecuado. El soporte puede ser soluble o insoluble, v.g.,
una sal (tal como NaCl o sulfato de sodio), azúcar (tal como
sacarosa o lactosa), alcohol-azúcar (tal como
sorbitol), almidón, arroz, granos de cereales, o soja. La
fosfolipasa de acuerdo con la invención y/o enzimas adicionales
pueden estar contenidas en formulaciones de liberación lenta.
Métodos para preparación de formulaciones de liberación lenta son
bien conocidos en la técnica. La adición de estabilizadores
nutricionalmente aceptables tales como azúcar,
alcohol-azúcar, u otro poliol, y/o ácido láctico u
otro ácido orgánico de acuerdo con métodos establecidos puede, por
ejemplo, estabilizar las preparaciones líquidas de enzimas.
Las fosfolipasas de acuerdo con la invención
pueden incorporarse también en composiciones que contienen levadura
tales como las descritas en
EP-A-0619947,
EP-A-0 659344 y WO 02/49441.
Para inclusión en pre-mezclas de
harina es ventajoso que el polipéptido de acuerdo con la invención
se encuentre en la forma de un producto seco, v.g., un granulado no
polvoriento, en tanto que para inclusión junto con un líquido, la
misma se encuentra ventajosamente en forma líquida.
Pueden incorporarse también en la masa una o más
enzimas adicionales. La enzima adicional puede ser de cualquier
origen, con inclusión de mamíferos y plantas, y preferiblemente de
origen microbiano (bacteriano, de levadura o fúngico), y puede
obtenerse por métodos utilizados convencionalmente en la
técnica.
En una realización preferida, la enzima
adicional puede ser una amilasa, tal como una
alfa-amilasa (útil para proporcionar azúcares
fermentables por levadura y retardar el enranciamiento) o
beta-amilasa,
ciclodextrina-glucanotransferasa, peptidasa, en
particular, una exopeptidasa (útil en la mejora del sabor),
transglutaminasa, lipasa (útil para la modificación de los lípidos
presentes en la masa o constituyentes de la masa a fin de ablandar
la masa), fosfolipasa, celulasa, hemicelulasa, en particular una
pentosanasa tal como xilanasa (útil para la hidrólisis parcial de
los pentosanos, lo que aumenta la extensibilidad de la masa),
proteasa (útil para debilitación del gluten en particular cuando se
utiliza harina de trigo duro),
proteína-disulfuro-isomerasa, v.g.,
una proteína-disulfuro-isomerasa
como se describe en WO 95/00636, glicosiltransferasa, peroxidasa
(útil para mejorar la consistencia de la masa), lacasa u oxidasa,
v.g., una glucosa-oxidasa,
hexosa-oxidasa, aldosa-oxidasa,
piranosa-oxidasa, lipoxigenasa o
L-aminoácido-oxidasa (útil en la
mejora de la consistencia de la masa).
Cuando deben añadirse una o más actividades de
enzima adicionales de acuerdo con los métodos de la presente
invención, estas actividades pueden añadirse por separado o junto
con el polipéptido de acuerdo con la invención, opcionalmente como
uno o más constituyentes de la composición mejoradora del pan y/o
mejoradora de la masa. Las otras actividades enzimáticas pueden ser
cualquiera de las enzimas arriba descritas y pueden dosificarse de
acuerdo con prácticas de panadería establecidas.
La presente invención se refiere también a
métodos para preparación de un producto horneado que comprenden
hornear una masa obtenida por un método de la presente invención a
fin de producir un producto horneado. El horneado de la masa para
producir un producto horneado puede realizarse utilizando métodos
bien conocidos en la
técnica.
técnica.
La presente invención se refiere también a masas
y productos horneados, respectivamente, producidos por los métodos
de la presente invención.
La presente invención se refiere adicionalmente
a una pre-mezcla, v.g., en la forma de una
composición de harina, para masa y/o productos horneados hechos de
masa, en la cual la pre-mezcla comprende un
polipéptido de la presente invención. El término
"pre-mezcla" se define en esta memoria de modo
que se entienda en su significado convencional, es decir, como una
mezcla de agentes de horneado, que incluye generalmente harina, que
puede utilizarse no sólo en agentes de fabricación industrial de
pan, que incluyen generalmente harina, que pueden utilizarse no
sólo en plantas/instalaciones industriales de fabricación de pan,
sino también en panaderías al por menor. La
pre-mezcla puede prepararse por mezcladura del
polipéptido o una composición mejoradora del pan y/o mejoradora de
la masa de la invención que comprende el polipéptido con un soporte
adecuado tal como harina, almidón, un azúcar, o una sal. La
pre-mezcla puede contener otros aditivos mejoradores
de la masa y/o mejoradores del pan, v.g., cualquiera de los
aditivos, con inclusión de enzimas, arriba mencionados.
La presente invención se refiere adicionalmente
a aditivos de horneado en la forma de un granulado o polvo
aglomerado, que comprenden un polipéptido de la presente invención.
El aditivo de horneado tiene preferiblemente una distribución
estrecha de tamaños de partícula con más del 95% (en peso) de las
partículas comprendidas en el intervalo de 25 a 500 \mum.
En la fabricación de masa y pan, la presente
invención puede utilizarse en combinación con los adyuvantes de
procesamiento definidos anteriormente en esta memoria tales como los
adyuvantes de procesamiento químicos como oxidantes (v.g. ácido
ascórbico), agentes reductores (v.g. L-cisteína),
oxidorreductasas (v.g. glucosa-oxidasa) y/u otras
enzimas tales como enzimas modificadoras de polisacáridos (v.g.
\alpha-amilasa, hemicelulasa, enzimas de
ramificación, etc.) y/o enzimas modificantes de proteínas
(endoproteasa, exoproteasa, enzimas de ramificación, etc.).
Todas las referencias en la parte experimental a
SEQ ID NOs: 6, 9, 12 y 15 deben considerarse como un ejemplo
comparativo.
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Ejemplo
1
Las fosfolipasas codificadas por la secuencia de
nucleótidos que se proporciona en esta memoria se obtuvieron por
construcción de plásmidos de expresión que contenían las secuencias
de DNA, transformación de una cepa de A. niger con este
plásmido y cultivo de las cepas de Aspergillus niger de la
manera siguiente.
Se inocularon esporas recientes
(10^{6}-10^{7}) de cepas de A. niger en
20 ml de medio CSL (matraz de 100 ml, con bafle de separación) y se
cultivaron durante 20-24 horas a 34ºC y 170 rpm.
Después de la inoculación de 5-10 ml de
pre-cultivo de CSL en 100 ml de medio CSM (matraz de
500 ml, con bafle de separación) las cepas se fermentaron a 34ºC y
170 rpm durante 3-5 días.
Se obtuvieron sobrenadantes exentos de células
por centrifugación en tubos Greiner de 50 ml (30 minutos, 5.000
rpm). Los sobrenadantes se prefiltraron sobre un filtro de
microfibras de vidrio Whatman GF/A (150 mm AE) para eliminar las
partículas mayores, se ajustaron a pH 5 con KOH 4 N (en caso
necesario) y se filtraron en condiciones estériles sobre un filtro
de 0,2 \mum (tapón de botella) con succión para eliminar el
material fúngico. El sobrenadante se guardó a 4ºC (o -20ºC).
El medio CSL estaba constituido por (en
cantidades por litro): 100 g de Sólidos de Maceración de Maíz
(Roquette), 1 g de NaH_{2}PO_{4}*H_{2}O, 0,5 g de
MgSO_{4}*7H_{2}O, 10 g de glucosa*H_{2}O y 0,25 g de Basildon
(antiespumante). Los ingredientes se disolvieron en agua
desmineralizada y el pH se ajustó a pH 5,8 con NaOH o
H_{2}SO_{4}; se llenaron matraces de 100 ml con bafle de
separación y bola de espuma con 20 ml de caldo de fermentación y se
esterilizaron durante 20 minutos a 120ºC, después de lo cual se
añadieron a cada matraz 200 \mul de una solución que contenía
5.000 UI/ml de penicilina y 5 mg/ml de estreptomicina después de
enfriar a la temperatura ambiente.
El medio CSM estaba constituido por (en
cantidades por litro): 150 g de maltosa*H_{2}O, 60 g de Soytone
(peptona), 1 g de NaH_{2}PO_{4}*H_{2}O, 15 g de
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,08 g de Tween 80, 0,02 g de Basildon
(antiespumante), 20 g de MES, y 1 g de L-arginina.
Los ingredientes se disolvieron en agua desmineralizada y el pH se
ajustó a pH 6,2 con NaOH o H_{2}SO_{4}. Se llenaron matraces de
500 ml con bafle de separación y bola de espuma con 100 ml de caldo
de fermentación y se esterilizaron durante 20 minutos a 120ºC,
después de lo cual se añadieron a cada matraz 1 ml de una solución
que contenía 5.000 UI/ml de penicilina y 5 mg/ml de estreptomicina,
después de enfriar a la temperatura
ambiente.
ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Paso
1
Los sobrenadantes de los cultivos, obtenidos en
el Ejemplo 1, se ultrafiltraron para eliminar los contaminantes de
peso molecular bajo que podrían interferir con las determinaciones
de la actividad enzimática y los tests de horneado. La
ultrafiltración de 30 ml de sobrenadante se realizó en un sistema
Millipore Labscale TFF equipado con un filtro que tenía un corte de
10 kDa.
Dependiendo de su color, las muestras se lavaron
3-5 veces con volúmenes de 40 ml de tampón de
fosfato 100 mM frío de pH 6,0 que incluía CaCl_{2} 0,5 mM. El
volumen final de la solución de enzima era 30 ml y se hace
referencia al mismo adicionalmente como "ultrafiltrado".
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Paso
2
La concentración de la fosfolipasa en el
ultrafiltrado se calculó a partir de la extinción a 280 nm (A280)
atribuible a la fosfolipasa y el coeficiente de extinción molecular
calculado de la fosfolipasa. La medida del valor A280 se realizó en
un espectrofotómetro Uvikon XL Secomam (Beun de Ronde, Abcoude,
Países Bajos).
El coeficiente de extinción molecular de una
enzima puede calcularse a partir del número de residuos tirosina,
triptófano y cisteína por molécula de enzima (S.C. Gill y P.H. von
Hippel, Anal. Biochem. 182, 319-326 (1989)). Los
coeficientes de extinción molecular de estos aminoácidos son 1280,
5690, y 120 M^{-1}.cm^{-1}, respectivamente. El número de
residuos tirosina, triptófano y cisteína en la fosfolipasa puede
deducirse de las secuencias de proteína seleccionadas del grupo
constituido por SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12 y 15. Los coeficientes de
extinción calculados de las fosfolipasas se resumen en la Tabla
1.
La extinción del ultrafiltrado a 280 nm (A280)
que es atribuible a la fosfolipasa depende de la pureza de la
muestra de enzima. Esta pureza se determinó utilizando HPSEC
(Cromatografía de Exclusión por Tamaño de Alta Resolución) con una
columna TSK SW-XL (300*7,8 mm; intervalo de PM
10-300 kDa). El tampón de elución estaba
constituido por tampón de fosfato de sodio 25 mM de pH 6,0 y se
utilizó a un caudal de 1 ml/min. Se inyectaron muestras de
5-100 \mul. Se midió la absorbancia a 280 nm.
El valor A280 en el ultrafiltrado atribuible a
la fosfolipasa se obtuvo a partir de la relación de la superficie
máxima del pico de fosfolipasa respectivo en el cromatograma y la
superficie total de los picos que absorbían a 280 nm. La
concentración de fosfolipasa en el ultrafiltrado se calculó luego
multiplicando el valor A280 del ultrafiltrado por la relación
arriba descrita y dividiendo por el coeficiente de extinción
calculado (1 mg/ml solución - Tabla 1, columna primera por la
derecha) para cada fosfolipasa.
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Ejemplo
3
Los ultrafiltrados obtenidos en el Ejemplo 2 se
sometieron a las medidas de actividad enzimática siguientes:
- \bullet
- Fosfolipasa A_{1} o A_{2}
- \bullet
- Lisofosfolipasa
- \bullet
- Fosfolipasa C
- \bullet
- Actividad de galactolipasa
- \bullet
- Alfa-amilasa fúngica
Se determinó la fosfolipasa A
espectrofotométricamente utilizando como sustrato
1,2-ditiodioctanoil-fosfatidilcolina.
La fosfolipasa A hidroliza el enlace sulfuro en la posición 1
(PLA1) o la posición 2 (PLA2) liberando con ello ácido
4-tio-octanoico que, en una reacción
subsiguiente, reacciona con 4,4'-ditiopiridina para
formar 4-tiopiridona. La última está en equilibrio
tautomérico con 4-mercaptopiridina que absorbe a 334
nm. La reacción se lleva a cabo en tampón de acetato 0,1 M de pH
4,0 + 0,2% Triton-X100 a 37ºC. Una unidad de
fosfolipasa A (PLA) se define como la cantidad de enzima que libera
1 micromol de ácido 4-tio-octanoico
por minuto en las condiciones de reacción indicadas.
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Se determinó la actividad de lisofosfolipasa con
espectroscopia ^{31}P-NMR utilizando
lisofosfatidil-colina como sustrato. La
lisofosfolipasa hidroliza el enlace éster liberando con ello el
ácido graso del resto glicerol. La glicerolfosfocolina así formada
se cuantifica utilizando NMR.
La reacción se lleva a cabo en tampón de ácido
acético 50 mM de pH 4,5, que contiene adicionalmente 1 mg/ml de
lisofosfatidilcolina y CaCl_{2} 5 mM durante 30 minutos a
55ºC.
Una unidad de lisofosfolipasa (LPC) se define
como la cantidad de enzima que forma 1 micromol de
4-glicerolfosfocolina por minuto en las condiciones
de reacción indicadas.
Se determinó espectrofotométricamente la
actividad de fosfolipasa C utilizando
para-nitrofenilfosforilcolina como sustrato. La fosfolipasa
C hidroliza el enlace éster liberando con ello
para-nitrofenol que absorbe a 405 nm.
La reacción se lleva a cabo en tampón de ácido
acético 100 mM de pH 5,0 que contiene adicionalmente CaCl_{2} 20
mM, 0,25% de Triton X-100 y
para-nitrofenilfosforilcolina 20 mM durante 7 minutos a 37ºC.
La reacción de detiene y el pH se aumenta por adición de 0,75
volúmenes de una solución 1 M de TRIS a 1 volumen de mezcla de
ensayo, después de lo cual se mide la extinción a 405 nm
(\varepsilon_{405nm} = 18500 M^{-1}.cm^{-1}).
Una unidad de fosfolipasa C se define como la
cantidad de enzima que forma 1 micromol de para-nitrofenol
por minuto en las condiciones de reacción indicadas.
La actividad de galactolipasa se determinó por
espectroscopia H-NMR utilizando
digalactosildiglicérido como sustrato, de acuerdo con el método
descrito por Hyrayama y Matsuda (1972) Agric. Biol. Chem. 36, 1831.
La fosfolipasa hidroliza el enlace éster entre los ácidos grasos y
la cadena principal de glicerol, liberando con ello uno o ambos
ácidos grasos.
La reacción se lleva a cabo en tampón de ácido
acético 50 mM de pH 4,5 que contiene adicionalmente CaCl_{2} 4
mM, 0,2% de Triton X-100 y 1 mg/ml de
digalactosildiglicérido (Lipid Products) durante 30 minutos a
30ºC.
Una unidad de galactolipasa se define como la
cantidad de enzima que forma 1 micromol de ácido graso por minuto
en las condiciones de reacción indicadas.
La actividad de la alfa-amilasa
fúngica se midió utilizando tabletas de test Phadebas Amylase
(Pharmacia). Las tabletas Phadebas contienen un sustrato de almidón
insoluble en agua y un tinte azul, unido por reticulación al
sustrato. El sustrato es hidrolizado por la amilasa fúngica,
liberando maltodextrinas teñidas solubles que pasan a la solución.
Se preparó una curva de calibración con una solución que contenía
una actividad de referencia de la alfa-amilasa
fúngica.
A partir de las muestras de referencia y
desconocidas, se prepararon diluciones apropiadas en tampón de ácido
málico 50 mM de pH 5,5. Se incubaron muestras de 5 ml a 30ºC
durante 5 minutos, se añadió una tableta de Phadebas y después de
15 minutos se detuvo la reacción por la adición de 1,0 ml de
hidróxido de sodio 0,5 N. Se dejaron enfriar las mezclas a la
temperatura ambiente durante 5 minutos, después de lo cual se
añadieron 4,0 ml de agua, se agitaron a mano mediante sacudidas y
después de 15 minutos se centrifugaron las muestras a 4700 rpm
durante 10 minutos. La extinción de las capas superiores se midió a
620 nm. El valor DO 620 nm es una medida de la actividad de la
amilasa fúngica:
Una unidad de amilasa fúngica (FAU) se define en
esta memoria como la cantidad de enzima que convierte 1 gramo de
almidón (100% materia seca) por hora en un producto que tiene una
transmisión a 620 nm después de la reacción con una solución de
yodo de concentración conocida en las condiciones de reacción
indicadas.
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Además de las actividades mencionadas, están
también presentes cantidades menores de glucoamilasa y xilanasa,
sin embargo en cantidades tan bajas que estas enzimas no interferían
en los experimentos de horneado descritos en el Ejemplo 4.
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Ejemplo
4
Se hornearon hogazas "pup" a partir de
piezas de masa de 150 gramos obtenidas por mezcla de 200 g de harina
(Kolibri^{TM}/Ibis^{TM} en una relación de 80/20), 1,4 g de
levadura de panaderos seca (Fermipan®), 4 g de sal común, 3 g de
azúcar, 10 mg de ácido ascórbico, 116 g de agua y 2 g de grasa.
Después de mezclar durante 6 minutos y 15 segundos en un mezclador
de púas, la masa se dividió en piezas de 150 gramos y se sometió al
ensayo de desarrollo de burbujas de gas ("proof") durante 45
minutos a 30ºC, se punzonó, se sometió de nuevo al ensayo
"proof" durante otros 25 minutos, se moldeó y se coció. El
ensayo tuvo lugar a una humedad relativa de
90-100%. Después de un ensayo "proof" final de
70 minutos a 30ºC, la masa se horneó durante 20 minutos a
225ºC.
Los diversos efectos (Tabla 3) de las diferentes
fosfolipasas en los experimentos de horneado se compararon con un
control que contenía la misma cantidad de amilasa fúngica que se
añadió de otro modo por la dosificación del ultrafiltrado (para la
actividad de amilasa fúngica en los ultrafiltrados véase la Tabla
2). Esto fue necesario dado que las cantidades de amilasa fúngica
añadidas con las fosfolipasas en particular afectaban al volumen de
la hogaza, no a los restantes parámetros. El volumen de los panes
con la cantidad de control de amilasa fúngica añadida se tomó como
100%.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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El volumen de la hogaza se determinó por medio
del Bread Volume Measurer BVM-3 (RI Cards
Instruments AB, Viken, Suecia). El principio de esta medida está
basado en la reflexión de los ultrasonidos medidos por un sensor
alrededor de un pan giratorio. Se tomó un tiempo de medida de 45
segundos.
La pegajosidad y la extensibilidad de la masa
fueron evaluadas por un panadero cualificado utilizando la escala
representada en la Tabla 3. Se midió el valor medio de 2 hogazas por
objeto.
Después de estos tests, se redondearon las
piezas de masa y se realizó un primer ensayo "proof" durante 45
minutos a 30ºC, y después de ello la masa se punzonó, se moldeó, se
coció, y se sometió al ensayo "proof" durante 75 minutos a
30ºC. La humedad relativa durante los ensayos "proof" se ajustó
a 85%.
Subsiguientemente, se juzgó la estabilidad de la
masa sometida al ensayo "proof" por la presencia de vesículas,
corteza lateral desgarrada y superficies curvas irregulares de la
corteza. Las piezas de masa se hornearon durante 20 minutos a
225ºC. Los volúmenes de hogaza se determinaron por el método
BVM-3: en la tabla se presenta el valor medio de
dos panes horneados a partir del mismo objeto.
La estructura de la miga fue juzgada por un
panadero cualificado utilizando la escala representada en la Tabla
3. Después de guardar las hogazas durante 3 días en bolsas de
polietileno a la temperatura ambiente, se midió la consistencia de
la miga utilizando un Analizador de Textura Stevens. Se analizaron
por el analizador de textura dos rebanadas de 2 cm de espesor del
centro de cada hogaza utilizando una sonda de 1,5 pulgadas (3,8 cm)
de diámetro, una profundidad de compresión de 5 mm (25%) y una tasa
de compresión de 0,5 mm/s. En la tabla se muestra el valor medio de
dos medidas.
El color de la corteza fue juzgado por un
pandero cualificado de acuerdo con la escala representada en la
Tabla 3. Como referencia, se utilizó la receta estándar para pan
enlatado Holandés.
El color de la miga fue juzgado por un panadero
cualificado de acuerdo con la escala representada en la Tabla 3. El
color de la miga de los panes de control se juzgó como normal (3).
Como control positivo, se utilizan los panes de dos objetos con la
misma composición que el control más 0,5% de harina de soja. El
ensayo "proof" y el procedimiento de horneado son iguales que
para el control sin harina de soja. El último se juzga como
"excelente".
La parte superior saliente del pan fue juzgada
por el saliente de la parte superior en la región con la lata de
horneado, siendo tanto más bajo el juicio cuanto más bajos eran los
bordes de la parte superior. Cuanto menor es el saliente, tanto
mejor es el juicio.
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\vskip1.000000\baselineskip
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Ejemplo
5
La eficiencia de horneado de las fosfolipasas se
testó en el tipo de pan francés denominado "batard". La
preparación de batards en un proceso de horneado estándar se
realizó mezclando 3000 g de harina de trigo a aproximadamente 20ºC,
70 g de levadura comprimida, 60 g de sal común, 68 ppm de ácido
ascórbico, 17 ppm de Fermizyme® P_{200}
(\alpha-amilasa fúngica), 30 ppm de Fermizyme®
HS_{2000} (hemicelulasa fúngica), 7 ppm de Bakezyme® P500 y 1680
ml de agua (8-10ºC) en un mezclador espiral (Diosna:
2 minutos en velocidad 1; 100 Wh de aporte en velocidad 2). La
temperatura de la masa era 27ºC. La trabajabilidad de la masa fue
analizada a mano por un panadero. La masa se sometió luego a un
ensayo "proof" a granel de 15 minutos en una cabina de ensayo
"proof" a 32ºC y 90% de RH. Después de ello la masa se dividió
en 6 piezas de 350 g, se redondeó y se sometió al ensayo
"proof" durante 15 minutos a 32ºC y 90% RH. Al final de este
periodo, las piezas de masa se moldearon, se conformaron y se
sometieron a un ensayo "proof" final de 90 minutos a 32ºC y 90%
RH. Las masas sometidas totalmente al ensayo "proof" se
cortaron en la longitud de la pieza de masa y se hornearon en un
horno a 240ºC durante 30 minutos con adición inicial de vapor.
Después de enfriar a la temperatura ambiente, se determinaron los
volúmenes de las hogazas por el método BVM (véase el Ejemplo 4).
Se analizaron la rotura, el desmenuzamiento y la
forma de los panes directamente después del enfriamiento a la
temperatura ambiente por un panadero cualificado utilizando el
registro de la Tabla 5. Después de 16 horas (durante una noche) de
almacenamiento en una caja cerrada a la temperatura ambiente, la
calidad de la miga fue evaluada por un panadero cualificado. El
valor de los panes se dedujo de un solo objeto.
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<110> DSM N.V.
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<120> NUEVAS FOSFOLIPASAS Y USOS DE LAS
MISMAS
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<130> 20950W0
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
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<170> PatentIn version 3.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 3763
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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<400> 1
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1365)
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 454
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 3692
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 894
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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<220>
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<221> CDS
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<222>
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 297
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 3478
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 1902
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<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1902)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 633
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2292
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1863
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1863)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Aspergillus niger
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3637
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1923
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Aspergillus niger
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1923)
\newpage
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 640
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
Claims (21)
1. Un polinucleótido aislado
- -
- que tiene más de 75% de homología con una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 ó 2 o
- -
- que codifica una fosfolipasa que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
2. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la
reivindicación 1 obtenible a partir de un hongo filamentoso.
3. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la
reivindicación 2 obtenible a partir de Aspergillus niger.
4. Un polinucleótido aislado de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende
una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 2.
5. Un polinucleótido aislado de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-3 seleccionado
del grupo constituido por SEQ ID NO: 1 y 2.
6. Un vector que comprende una secuencia de
polinucleótidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5.
7. Un vector de acuerdo con la reivindicación 6,
en donde dicha secuencia de polinucleótidos de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 5 está enlazada operativamente con secuencias
reguladoras adecuadas para expresión de dicha secuencia de
polinucleótidos en una célula hospedadora adecuada.
8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7,
en donde dicha célula hospedadora adecuada es un hongo
filamentoso.
9. Un método para fabricación de un
polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones
1-5 o un vector de acuerdo con las reivindicaciones
6 a 8 que comprende los pasos de cultivar una célula hospedadora
transformada con dicho polinucleótido o dicho vector y aislar dicho
polinucleótido o dicho vector de dicha célula hospedadora.
10. Una fosfolipasa aislada
- -
- con una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o
- -
- con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
11. Una fosfolipasa aislada de acuerdo con la
reivindicación 10 obtenible a partir de Aspergillus
niger.
12. Un método para fabricación de una
fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 que comprende
los pasos de transformar una célula hospedadora adecuada con un
polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 o
un vector de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8, cultivar dicha
célula en condiciones que permiten la expresión de dicho
polinucleótido y purificar opcionalmente el polipéptido codificado a
partir de dicha célula o medio de cultivo.
13. Una célula hospedadora recombinante que
comprende un polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a
5 o un vector de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8 o que
expresa un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 ó
11.
14. Anticuerpos purificados reactivos con una
fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11.
15. Proteína de fusión que comprende una
secuencia de fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación 10 ó
11.
16. Un proceso para la producción de masa que
comprende añadir una fosfolipasa de acuerdo con la reivindicación
10 ó 11.
17. Un proceso para la producción de un producto
horneado a partir de una masa como se prepara por el proceso de la
reivindicación 16.
18. Uso de una fosfolipasa de acuerdo con la
reivindicación 10 ó 11 para la preparación de una masa y/o el
producto horneado de la misma.
19. Uso de una fosfolipasa de acuerdo con la
reivindicación 10 ó 11 para hidrolizar un fosfolípido o para
obtener productos de escisión específicos del mismo.
20. Un proceso para reducir el contenido de
fosfolípidos en aceite comestible por tratamiento del aceite con un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 ó 11 para hidrolizar
una mayor parte del fosfolípido y separar una fase acuosa que
contiene el fosfolípido hidrolizado del aceite.
21. Un método para diagnosticar si un cierto
organismo está infectado con Aspergillus, que comprende los
pasos de:
- -
- aislar una muestra biológica de dicho organismo que se sospecha está infectado con Aspergillus
- -
- hacer reaccionar dicha muestra biológica con anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 14
- -
- determinar si se forman inmunocomplejos.
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