DE69111148T2 - Gärfutter-Enzymbehandlung. - Google Patents

Gärfutter-Enzymbehandlung.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Landwirtschaft, spezifischer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Verbesserung der enzymatischen Behandlung von Silofutter.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Verbesserungen der Silierungstechnik haben das Silieren, nebst der natürlichen und künstlichen Trocknung, zur meist angewendeten Technik der Futterkonservierung gemacht. Es wird geschätzt, dass in Westeuropa 60% (ungefähr 77 Millionen Tonnen Trockensubstanz) des für den Winter konservierten Futters siliert werden. In den USA werden jährlich etwa 80 Million Tonnen (Trockensubstanz) siliert. Die Silierung wird auch in Osteuropa und Kanada breit verwendet.
  • Durch Fermentierung (insbesondere Buttersäurefermentierung) und aerobe Schädigung hervorgerufene Abwässererzeugung und Nährstoffverluste im Silo haben sich mit der zunehmenden Nachfrage nach höherem Nutzeffekt bei der Tierproduktion mehr und mehr als fragwürdig erwiesen. Diese Probleme sind häufig von Umständen abhängig wie der Pflanzentypus, die klimatischen Verhältnisseund die zur Verfügung stehende Technologie. Neuerdings beschlossene Beschränkungen der Milchwirtschaft und in einigen Ländern die Umweltschutzgesetze, welche indirekt die Art und Menge der für die Tierproduktion verwendeten Nährstoffe beschränken, unterstreichen die Notwendigkeit eines Silofutters von hoher Qualität (Spoelstra, S.F. (1991) in: Proceedings of the EGF Conference - "Forage Conservation Towards 2000"; Braunschweig, Deutschland).
  • Gräser (wie englisches Raigras usw.), Getreide (wie Mais, Sorghum, Weizen usw.) und Gemüse (wie Luzerne, Klee usw.) sind die wichtigsten als Silofutter verwendeten Pflanzen. Rübenkraut und Zuckerrübenmaische werden auch in verhältnismässig kleineren Mengen verwendet.
  • Der Mais lässt sich leicht silieren, ist jedoch für aerobe Schädigung anfällig. Das Gras, hauptsächlich winterhartes englisches Raigras, wird häufig in hohem Grad befruchtet und hat deshalb ein niedriges Verhältnis an wasserlöslichen Kohlehydraten und entsprechendes Puffervermögen, so dass es nach Silierung für die Buttersäurefermentierung anfällig wird. Die Buttersäurefermentierung führt zu Verlusten an Trockensubstanz im Silofutter, was zur Herabsetzung des Nährwertes und infolgedessen des Nutzeffektes bei der Tierproduktion führt.
  • Um die unerwünschte Buttersäurefermentierung aus zuschliessen, wird das Gras üblicherweise auf dem Feld bis auf durchschnittlich 500 g TS (Trockensubstanz)/kg verwelken gelassen. Wahlweise werden bei einem Trockensubstanzgehalt unter 350 g TS/kg Zusatzstoffe, wie Enzyme, angewendet.
  • Es sind fortgesetzte Untersuchungen zur Klärung der Frage übernommen worden, ob durch Zugabe von die Zellwand zersetzenden Enzymen, insbesondere von Cellulasen und Hemicellulasen, die Silofutterkonservierung und die Silofutteraufnahme und -verdaulichkeit verbessert werden.
  • Durch die Wirkung der Cellulasen und Hemicellulasen werden wasserlösliche Kohlehydrate aus den Gerüstpolysacchariden der Zellwand der Pflanzen freigesetzt; dadurch werden Substrate für die Erzeugung von Milchsäure durch Fermentierung mittels der im Silofutter vorhandenen Milchsäurebakterien zur Verfügung gestellt. Wahrscheinlich sind diese Enzyme auch für den biolytischen Aufschluss der Zellwand der Pflanzen verantwortlich, wodurch weitere wasserlösliche Kohlehydrate und andere Substanzen aus dem Zell inneren zur Verwendung durch die Milchsäurebakterien freigesetzt werden. Zudem kann die Vorverdauung der Zellwand der Pflanzen währen deren Lagerung als Silofutter dazu führen, dass sie im Rumen rascher zersetzt und dadurch besser verdaulich werden, darüber hinaus kann sie höhere Mengen an freigesetzten Kohlehydraten zur Verfügung stellen und somit den Nährwert für das derart behandeltes Silofutter fressende Tier erhöhen.
  • Die Herabsetzung des pH von Silofutter geht auch auf die Erzeugung von Milchsäure (wie auch von Essigsäure) durch die im Silofutter vorhandenen Milchsäurebakterien zurück. Die Herabsetzung des pH-Wertes, welcher im allgemeinen auf etwa 4,5 sinkt und so tief wie etwa bei 4 liegen kann, erzeugt ein für das Wachstum der Hefen sowie auch von manchen anderen unerwünschten Bakterien wie die Buttersäure erzeugenden Mikroorganismen ungünstiges Umfeld, wodurch das Silofutter konserviert und sein Nährstoffgehalt erhalten wird.
  • Ferner fungieren die Milchsäurebakterien auch als probiotische Substanzen, wodurch die Darmflora der das Silofutter fressenden Tiere günstig erhöht wird.
  • Von den für ihre Verwendung im Silofutter untersuchten Enzympräparaten sind die meisten, wenn nicht alle, rohe Fermentierungsprodukte aus Pilzen. Diese Enzympräparate enthalten mehrere unterschiedliche enzymatische Aktivitäten.
  • Beispielsweise wird in der Ostdeutschen Patentveröffentlichung DD-278359 (am 2. Mai 1990 veröffentlicht) ein aus einem Mutantstamm von Penicillium verruculosum erhaltenes Cellulosepräparat beschrieben, das zur Partial- oder Totalhydrolyse von Cellulose und Hemicellulose in industriellen Verfahren, wie unter anderem in der Silofutterherstellung, anwendbar sein soll. Angeblich soll das Cellulasepräparat hohe cellulolytische Aktivität zusammen mit einer beta-Glukosidase-, Xylanase- und Amylase-Aktivität enthalten.
  • In der PCT-Anmeldung WO 89/01970 (am 9. März 1989 veröffentlicht) wird ein probiotisches Impfmaterial für Silofutter beschrieben, welches Milchsäurebakterien enthält, welche mit einer exogenen DNS transformiert waren, wobei diese DNS für ein zur Zersetzung der Polysaccharide und Oligosaccharide in einer Silofuttercharge geeignetes Enzym codiert und dadurch eine Quelle von wasserlöslichen Kohlehydraten für die Bakterien selber zur Verfügung stellt.
  • In "Chemical Abstracts" (CA) Bd. 87 Nr. 22, vom 28.11.77, Columbus, Ohio, U.S.A., Abstract Nr. 182914c wird die Behandlung von Maiskolben mit hydrolytischen Enzymen beschrieben.
  • In CA Bd. 94 Nr. 11 vom 16.03.81, Abstract Nr. 82520x wird die Behandlung von Weizenstroh mit Enzymen beschrieben.
  • In CA Bd. 93 Nr. 3, vom 21.06.80 Abstract Nr. 24758z wird die Verwendung von zellulolytischen Enzymen in Gegenwart von Cellolignorin Px bei der Silierung von Guza-paya beschrieben.
  • In CA Bd. 110, Nr. 25, vom 25.06.89 Abstract Nr. 230420f wird die Verwendung von Glucanase, Xylanase und sowohl der Endo- als auch der Exocellulase für Reisstroh beschrieben.
  • Durch O. Jorgensen et al. wird in "Enzyme systems for lignocellulose degradation" 1989, Elsevier, Applied Science, London 6b, Seiten 347-355 gelehrt, dass zur Erzeugung eines optimalen Silofutters Hemicellulosen als Teil eines Cellulasekomplexes verwendet werden sollen, welcher Komplex sowohl Endo- als auch Exoaktivitäten inklusive der beta-Glukosidase enthält.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäss vorliegender Erfindung wurde gefunden, dass von den zahlreichen, in den zur Futtersilierung verwendeten Enzympräparaten vorliegenden enzymatischen Aktivitäten die Endoxylanase-Aktivität für die Freisetzung von wasserlöslichen Kohlehydraten besonders verantwortlich ist, was durch die fermentative Wirkung der Milchsäurebakterien zur Konservierung und zur Verbesserung des Nährwertes von Silofutter führt. Darüber hinaus wurde gefunden, dass die Zugabe ausreichender Mengen von Endoxylanase bei Abwesenheit von anderen enzymatischen Aktivitäten dem zu silierenden Futter eine optimale Konservierung und einen optimalen Nährwert des derart behandelten Silofutters ergibt. Es wurde auch festgestellt, dass die Tiere grössere Mengen des so konservierten Silofutters fressen, im Gegensatz zu geschädigtem Silofutter. Diese Faktoren haben eine Erhöhung des Nutzeffektes bei der Tierproduktion zur Folge.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung eine Silofuttermischung zur Verfügung, welche mit Endoxylanase- Aktivität in solcher Menge ergänzt ist, dass aus dem silierten Pflanzenzellmaterial (Futter) wasserlösliche Kohlehydrate wirksam freigesetzt werden, wodurch die Erzeugung von Milchsäure und Essigsäure durch Milchsäurebakterien erhöht wird, was wiederum die Konservierung und den Nährwert des Silofutters verbessert. Die Endoxylanase wird in einer von anderer enzymatischer Aktivität nahezu freier Form zugegeben.
  • Da das zu silierende Futter nicht immer zur Erzielung einer adäquaten Silierung ausreichende Mengen von Milchsäurebakterien enthält, stellt die vorliegende Erfindung auch Silofuttermischungen zur Verfügung, welche zudem ein Impfmaterial einer Milchsäurebakterie enthalten, welches in ausreichender Menge zugegeben wird, um der Silofutterkonservierung beizutragen und als Probiotikum zur Verbesserung der Darmflora des die so behandelte Silofuttermischung fressenden Tieres zu wirken.
  • Es ist auch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Konservierung von Silofutter zur Verfügung zu stellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass dem Silofutter Endoxylanase-Aktivität in solcher Menge zugegeben wird, dass die im Silofutter vorhandene Menge an wasserlöslichen Kohlehydraten zur Erzeugung von Milchsäure und Essigsäure durch Milchsäurebakterien wirksam erhöht wird.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung des Nährwertes von Silofutter zur Verfügung zu stellen, bei welchem dem Silofutter eine Menge an Endoxylanase-Aktivität zugegeben wird, die aus dem silierten Pflanzenzellmaterial wasserlösliche Kohlehydrate wirksam freisetzt, damit sie von dem das Silofutter fressenden Tier verwertet werden. Die im Silofutter vorhandene Endoxylanase liefert auch einen Zusatz an essentiellem Enzym für das Tier selbst.
  • Es ist noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung der in vivo-Verdaulichkeit (Trockensubstanz) von Silofutter bei Tieren, wonach das Tier mit einem Futter gefüttert wird, welches mindestens teilweise aus einem Silofutter besteht, das Endoxylanase-Aktivität in ausreichender Menge enthält, um die Zellwand der Pflanzen mindestens teilweise zu zersetzen und auf diese Weise eine Vorverdauung zu bewirken.
    • Kurze Beschreibung der Figur
  • Figur 1: Elutionskurve bei Hochleistungs-Flüssigchromatographie eines Kulturfiltrates von Aspergillus niger D516813 (CBS 323.90). Später wurde dieser Stamm umklassiert, da er wahrscheinlicher der Art Aspergillus tubigensis angehört.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Gemäss vorliegender Erfindung wird dem Silofutter Endoxylanase in solcher Menge zugegeben, dass ein Silofutter erzeugt wird, welches eine signifikante Steigerung der Menge an wasserlöslichen Kohlehydraten zur Verwendung durch die Milchsäurebakterien oder als Nährstoffe für die das Silofutter fressenden Tiere aufweist; es zeigt auch verbesserte Eigenschaften wie eine erhöhte fermentative Erzeugung von Milchsäure und Essigsäure (wobei Milchsäure in grösserer Menge als Essigsäure erzeugt wird) durch (probiotische) Milchsäurebakterien und die darauffolgende pH-Herabsetzung, welche die Konservierung und den Nährwert der Silofuttermischung erhalten; diese leisten ihren Teil zu einem besseren Nutzeffekt bei der Tierproduktion. Bis zur vorliegenden Erfindung wusste man von den Endoxylanasen nicht, dass sie für eine derart signifikante Wirkung bei der Erzeugung von verbessertem Silofutter spezifisch verantwortlich sind. Man wusste auch nicht, dass ein Endoxylanase-Zusatz zu dem zu silierenden Futter, in einer von anderer enzymatischer Aktivität (insbesondere andere die Zellwand zersetzende enzymatische Aktivität) nahezu freier Form, zu einem Silofutter führen würde, das nicht nur besser konserviert wird, sondern auch einen verbesserten Nährwert hat.
  • Die erfindungsgemässen Silofuttermischungen enthalten mehr als 50 000 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität/kg Futter (Frischgewicht). Die Endoxylanase hat ein pH-Optimum im Bereich von 3,5 bis 6,0, damit mit Sicherheit eine maximale enzymatische Wirkung unter den sauren, bei der Futtersilierung herrschenden pH-Bedingungen erreicht wird. Wie oben erwähnt wurde, wird die Endoxylanase in einer Form zugegeben, welche im allgemeinen von anderer enzymatischer Aktivität und insbesondere von die Zellwand zersetzender enzymatischer Aktivität nahezu frei ist.
  • Auch von kommerziellem Standpunkt aus ist es lohnend, dem zu silierenden Futter eine von anderer enzyma- tischer Aktivität nahezu freie Endoxylanase-Aktivität zuzugeben, stellt es doch einen sparsameren Weg als die Verwendung von Enzymmischungen, welche zur Erreichung der gewünschten Wirkung öfters noch mit anderen enzymatischen Aktivitäten ergänzt werden müssen. Der hier verwendete Ausdruck "von anderen Enzymen nahezu frei" bedeutet, dass eine andere enzymatische Aktivität nicht in solcher Menge vorliegt, dass irgendwelche Wirkung auf das zu silierende Futter ausgeübt wird.
  • Beispielsweise kann die Endoxylanase-Aktivität in grossen Mengen unter Verwendung der rekombinanten DNS- Techniken hergestellt werden, wie in der am 24. Juli 1990 eingereichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 90202020.5 beschrieben wird, deren Offenbarungsgehalt hierin durch Bezugnahme eingeschlossen wird. Wahlweise kann die Herstellung der Endoxylanasen verbessert werden, indem die Fermentierungsbedingungen der die Endoxylanase erzeugenden Mikroorganismen eingestellt werden, zum Beispiel durch Verwendung eines Xylan enthaltenden Ausgangsmediums.
  • Vorzugsweise werden die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Endoxylanasen aus einem Fadenpilz gewonnen, insbesondere aus einem Fadenpilz, den man unter den Gattungen Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neuraspora, Fusarium und Trichoderma und in bevorzugter Weise aus einem Fadenpilz, den man unter den Gattungen Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus tubigensis, Disporotrichum dimorphosporum und Trichoderma reesei auswählt.
  • Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Endoxylanase kann durch Bestimmungsmethoden identifiziert werden, welche für die Erfindung selbst unbedenklich sind, beispielsweise durch eine Stichprobebestimmung. Nach dieser Methode kann ein Kulturfiltrat auf das Vorliegen von Endoxylanase-Aktivität hin geprüft werden, welches durch Züchtung eines zur Erzeugung von Endoxylanase (beispielsweise mit Haferspelzenxylan) angeregtem Mikroorganismus erhalten wurde. Tropfen der eluierten Fraktionen werden einzeln auf einen Agarfilm gelegt, welcher ein Citrat-Phosphatpuffer (siehe Beispiel 1.1 unten) und Haferspelzenxylan enthält. Hierauf wird der Film inkubieren gelassen. Bei Vorliegen von Endoxylanase-Aktivität erscheinen die Stellen der einzelnen Tropfen auf dem Agarfilm für das menschliche Auge klar.
  • Die Endoxylanase-Aktivität kann auch erkannt werden, indem eine Xylan enthaltende Lösung mit einer Enzymlösung behandelt wird, welche möglicherweise Endoxylanase-Aktivität enthält, und die reduzierenden Zucker durch die von Leathers, T.D. et al. (1984) Biotechnol. Bioeng. Symp., 14, 225 beschriebene Methode spektrophotometrisch analysiert werden.
  • Eine Einheit der Endoxylanase-Aktivität wird hier als die Menge Xylose-Aequivalente (uMol) definiert, welche in einer Minute per mg Protein bei einer TemPeratur von 39ºC und einem pH von 3,5 freigesetzt werden. Die Proteinbestimmung wurde nach der Methode von Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem., 72, 248 durchgeführt. Als Proteinstandard wurde Rinder-γ-Immunoglobulin (BIgG) verwendet.
  • Nach seiner Identifizierung kann der Endoxylanase erzeugende Organismus unter den Herstellungsbedingungen der Endoxylanase fermentiert und die gewünschte enzymatische Aktivität kann aus dem Kulturfiltrat des erzeugenden Organismus isoliert und gewünschtenfalls durch übliche, für die Erfindung selbst unbedenkliche Methoden gereinigt werden. Beispielsweise können für die präparative Reinigung einer Endoxylanase aus einem Kulturfiltrat die Methoden der Affinitätschromatographie und/oder der Ionenaustauschchromatographie mit Vorteil verwendet werden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht auch in der Ergänzung von Enzympräparaten des Handels mit Endoxylanase-Aktivität. Vorzugsweise wird eine Endoxylanase-Menge zugegeben, welche in der Endmischung eine Endoxylanase-Aktivität von insgesamt mehr als 50 000 Einheiten/kg Futter (Frischgewicht) ergibt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Silofuttermischungen zur Verfügung gestellt, welche ferner ein Impfmaterial einer Milchsäurebakterie enthalten, welches der Silofutterkonservierung als Zusatz beitragen soll. Die Milchsäurebakterien werden vorzugsweise aus der Gruppe der Gattungen Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus und Leuconostoc ausgewählt. Gemäss vorliegender Erfindung werden die besonders bevorzugten Milchsäurebakterien aus der Gruppe von Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus fermentum und Lactobacillus lactis ausgewählt.
  • Die erfindungsgemässe Zugabe von Endoxylanase zum Silofutter kann bei jedem zur Silierung geeigneten Pflanzenmaterial angewendet werden, wie Gras, Getreide und Gemüse, wie vom Fachmann bekannt ist. Allerdings soll das Futter in der Regel einen Trockensubstanzgehalt (TS) von weniger als 350 TS/kg Futter (Frischgewicht) enthalten, um dem Enzym freien Zugang zum Pflanzenzellmaterial zu gewähren.
  • Die folgenden Beispiele sollen dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung der Ausführung und der Verwendung der Erfindung geben. Bezüglich der angegebenen Zahlen (beispielsweise Mengen, Temperatur, pH usw.) wurde Genauigkeit angestrebt, allfällige experimentelle Fehler und Streuwerte sollen aber in Kauf genommen werden. Wenn nichts anderes angegeben wird, wird die Temperatur in Grad Celsius angegeben und der Druck ist der Normaldruck.
    • Beispiel 1 Reinigung der Endoxylanase aus Aspergillus tubigensis.
  • Erhalten wurde ein Kulturfiltrat durch Züchtung von Aspergillus niger DS 16813 (CBS 323.90, hinterlegt beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Die Niederlande, am 20. Juli 1990 - später umklassiert, da wahrscheinlicher der Art A. tubigensis zugehörend; Kusters-van Someren et al. (1991) Curr. Genet. 19, 21) in einem Medium, welches je Liter enthält: 30 g Haferspelzenxylan (Sigma); 7,5 g NH&sub4;NO&sub3;, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO&sub4;, 15 g KH&sub2;PO&sub4; und 0,5 g Hefeextrakt (pH 6,0). Das Kulturfiltrat wurde auf ein Volumen von ungefähr 35 ml eingeengt, welches dann zur Entfernung der Salze einer Ultrafiltration auf einem Diaflo-Filter PM 10 in einem Modul Amicon von 50 ml unterworfen wurde.
  • Hierauf wurde die überstehende Flüssigkeit auf ein Volumen von 10 ml eingeengt und das verbleibende Material zweimal mit 25 ml von 25 mM Tris-HCl-Puffer von pH 7,0 gewaschen. Nach dem Waschen wurde das verbleibende Material auf ein Volumen von 25 ml gebracht.
  • Dieses Material wurde in Anteilen von 1 ml auf eine Säule Syn Chropak AX 300 (Abmessungen: 10 x 250 mm) eingespritzt und der Hochleistungs-Flüssigchromatographie unter den folgenden Bedingungen unterworfen:
  • Elutionsgeschwindigkeit: 2 ml/Min
  • Elutionspuffer A: 25 mM Tris-HCl pH 7,0
  • Elutionspuffer B: 25 mM Tris-HCl pH 7,0 + 1 M NaCl
  • Elutionsgradient: Dauer
  • Es wurden jeweils Fraktionen von 1 ml gesammelt. Die Ermittlung des eluierten Proteins wurde durch fortwährende Messung der UV-Absorption bei 280 nm durchgeführt. Die Elutionskurve wird in Figur 1 gezeigt.
  • Die Fraktionen wurden auf das Vorliegen von Endoxylanase-Aktivität hin durch eine Stichprobe geprüft. Bei dieser Stichprobe werden 12 ml Citrat-Phosphat- Puffer (hergestellt durch Vermischen von 900 ml 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; und 125 ml 0,5 M Citronensäure, und danach Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf 5,6 unter Verwendung von 0,5 M Citronensäure oder 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4;), welches 0,5% Haferspelzenxylan (Sigma) enthält, zu 180 mg Agar-Agar (Difco) zugegeben und die Mischung wird zum Auflösen des Agar-Agars auf 100ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen auf 60ºC wird die Agar-Agar-Mischung auf einen durch Agarose-Gel gebundenen Film gleichmässig ausgegossen. Tropfen der eluierten Fraktionen werden einzeln auf den Film gelegt und während 30 Minuten bei 30ºC inkubieren gelassen. Bei Vorhandensein von Endoxylanase-Aktivität wird die Stelle der einzelnen Tropfen auf dem Agar-Agar-Film klar.
  • Die Gesamtaktivität an Xylanase in den gesammelten Fraktionen wurde quantitativ, durch Messung der reduzierenden Zucker ermittelt, welche während einer vorgegebenen Zeitdauer in dem durch Leathers et al. (1984) beschriebenen Mikroversuch erzeugt wurden. Es wurde dazu als Substrat Haferspelzenxylan in 50 mM-Natriumacetat bei pH 5,0 verwendet. Die Aktivitätseinheit ist auch jene, die durch Leathers (supra) definiert wurde.
  • Die Exoxylanase-Aktivität in den eluierten Fraktionen wurde nach der durch Poutanen und Puls (1988) beschriebenen Methode ermittelt, wobei 0,3 mM-p-Nitrophenyl-β-D-xylopyranosid (Sigma) als Substrat bei pH 5,0 und 30ºC verwendet wurde.
  • Die Stichprobe hat gezeigt, dass die den Peaks B, F und K (siehe Figur 1) entsprechenden Elutionsfraktionen Endoxylanase-Aktivität beinhalten. Die Gesamtxylanase- Bestimmung hat Aktivität in den Elutionsfraktionen der Peaks B, F, H und K gezeigt. In den Elutionsfraktionen der Peaks B und H wurde das Vorliegen von Exoxylanase- Aktivität gezeigt.
  • Die Elutionsfraktionen der Peaks F (XYL2-Protein) und K (XYL A-Protein) wurden durch wiederholte Ionenaustauschchromatographie weiter gereinigt.
    • Beispiel 2
  • Winterhartes englisches Raigras wird gemäht, während 24 Stunden bis auf einen Trockensubstanzgehalt (TS) von ca 25% getrocknet, in Stückchen von 1 bis 2 cm geschnitten, in einem Laborsilo von 1 Liter siliert und während 3 Monaten bei Raumtemperatur vor der Analyse gelagert.
  • Das Enzympräparat Cellulase ABG-7 wurde in einer Konzentration von 0,2 g Protein/kg Gras (Frischgewicht) zugegeben (entspricht 3200 Einheiten der Endoxylanase- Aktivität/kg Futter; Bestimmung des Proteingehaltes nach der durch Bradford, M.M. (supra) beschriebenen Methode).
  • Cellulase ABG-7 ist ein mittels Trichoderma reesei hergestelltes Enzympräparat des Handels und kann unter dem Namen Maxazym Cl-2000 (Gist-Brocades N.V., Die Niederlande) bezogen werden. Die enzymatischen Aktivitäten dieses Produktes werden unten in der Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1: Enzymatische Aktivitäten von Cellulase ABG-7 Aktivität Gemessenes Produkt Spezifische Aktivität uMole/Min. Mg Protein Carboxymethylcellulase Avicelase Endoxylanase Exoxylanase Exoarabinase Acetylesterase Polygalakturonase Glukuronidase α-Amylase Glukoseäquivalente Xyloseäquivalente p-Nitrophenol Galaktoseäquivalente Glukose
  • Die Ergebnisse des Silierungsversuchs werden unten in der Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2: Durchschnittszusammensetzung (n=3) von Gras, Vergleichssilofutter und enzymbehandeltem Silofutter nach Inkubation mit Cellulase ABG-7 Silofutter Gras Vergleich Cellulase ABG-7 Trockensubstanz (TS) (g/kg) Asche (g/kg TS) Milchsäure (g/kg TS) Ethanol (g/kg TS) Essigsäure (g/kg TS) Rohfaser (g/kg TS) Neutralwaschmittel-Faser (NWF) (g/kg TS) Saureswaschmittelfaser (SWF) (g/kg TS) Saureswaschmittel-Lignin (SWL) (g/kg TS) Gewichtsverlust (g/kg TS) NH&sub3;-N/Gesamt-N (%-Gew. Gesamt-N) * von dem Vergleichswert statistisch verschieden P < 0,05 (T-Test von Student)
  • Die Cellulase ABG-7 hat einen grossen Anteil der Zellwandbestandteile zu fermentierbaren Kohlehydraten hydrolysiert. Dies hat eine erhöhte Silofutterqualität zur Folge, wie durch die Freisetzung von wasserlöslichen Kohlehydraten hervorgeht. Dies wird durch die erhöhte Milchsäurekonzentration und den niedrigeren Rohfasergehalt, den niedrigeren Gehalt an Neutralwaschmittel-Fasern, den niedrigeren Gehalt an Fasern von saurem Waschmittel sowie auch durch die niedrigeren pH- und Ammoniakwerte im Vergleich zum Vergleichssilofutter dargelegt.
    • Beispiel 3
  • Winterhartes englisches Raigras wurde gemäss obenstehendem Beispiel 2 hergerichtet, in Laborsilos von 1 Liter siliert und während drei Monaten bei Raumtemperatur vor der Analyse gelagert.
  • Das Enzym Cellulase ABG-7 (siehe Tabelle 1 oben) wurde in folgenden Konzentrationen zugegeben: 0,005 g Protein (80 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität)/kg Gras, Frischgewicht; 0,025 g Protein (400 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität)/kg Gras, Frischgewicht; 0,050 g Protein (800 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität)/kg Gras, Frischgewicht; 0,075 g Protein (1200 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität)/kg Gras, Frischgewicht; der Proteingehalt wurde nach der durch Bradford, M.M. (supra) beschriebenen Methode bestimmt.
  • Die Ergebnisse werden in der Tabelle 3 wiedergegeben. Tabelle 3 : Durchschnittszusammensetzung (n=3) von Gras und Silofutter Silofutter Gras Vergleichssilofutter Cellulase ABG-7 (g Protein/kg Gras) Trockensubstanz (TS) (g/kg) Asche (g/kg TS) Milchsäure (g/kg TS) Ethanol (g/kg TS) Essigsäure (g/kg TS) Rohfaser (g/kg TS) Gewichtsverlust (g/kg TS) NH&sub3;-N/Gesamt-N (%-Gew. Gesamt-N) * von dem Vergleichswert statistisch verschieden. P< 0,05 (T-Test von Student)
    • Beispiel 4
  • Winterhartes englisches Raigras wurde wie in obigem Beispiel 2 hergerichtet, in Laborsilos von 1 Liter siliert und während 3 Monaten bei Raumtemperatur vor der Analyse gelagert.
  • Zur Erhöhung der Endoxylanase-Aktivität in dem Produkt wurde in diesem Versuch eine gereinigte Endoxylanase aus Aspergillus tubiaensis (spezifische Aktivität: 5000 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität/kg Futter; Proteinbestimmung nach Bradford, supra; siehe Beispiel 1) mit dem Präparat Cellulase ABG-7 kombiniert und dem Gras zugegeben. In diesem dem Gras zugegebenen enzymatischen Kombinationsprodukt betrug die Endoxylanase-Konzentration 0,050 g Protein (250 000 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität)/kg Gras (Frischgewicht) und die Konzentration an zugegebener Cellulase ABG-7 war 0,200 g Protein (3200 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität)/kg Gras (Frischgewicht); der Proteingehalt wurde nach der Methode von Bradford, M.M. (supra) ermittelt.
  • Die Ergebnisse werden in der Tabelle 4 wiedergegeben. Tabelle 4: Durchschnittszusammensetzung (n=3) von Gras und Silofutter Silofutter Vergleich Cellulase ABG-7 Cellulase Endoxylanase Trockensubstanz (TS) (g/kg) Asche (g/kg TS) Milchsäure (g/kg TS) Ethanol (g/kg TS) Essigsäure (g/kg TS) Rohfaser (g/kg TS) Neutralwaschmittel-Faser (NWF) (g/kg TS) Saureswaschmittelfaser (SWF) (g/kg TS) Saureswaschmittel-Lignin (SWL (g/kg TS) Gewichtsverlust (g/kg TS) NH&sub3;-N/Gesamt-N (%-Gew. Gesamt-N) * von dem Vergleichswert statistisch verschieden P < 0,05
  • Ueberraschenderweise hatte der Zusatz von Endoxylanase zum Cellulase ABG-7-Präparat eine viel höhere Milchsäurekonzentration im silierten Gras und infolgedessen einen viel tieferen pH-Wert zufolge.
  • Darüber hinaus wird die Ethanol- und Essigsäure- Fermentierung unterdrückt sowie auch der Gewichtsverlust infolge der Bildung von CO&sub2; und von flüchtigen Fettsauren.
    • Beispiel 5
  • Winterhartes englisches Raigras wurde wie in obigem Beispiel 2 hergerichtet, in Laborsilos von 1 Liter siliert und während 3 Monaten bei Raumtemperatur vor der Analyse gelagert.
  • Dem Gras wurde gereinigte Endoxylanase in Konzentrationen von 0,010 g, 0,050 g und 0,200 g Protein/kg Futter, Frischgewicht (Proteinbestimmung nach der Methode von Bradford, supra).
  • Die Ergebnisse werden in der Tabelle 5 wiedergegeben. Tabelle 5 : Durchschnittszusammensetzung (n=3) von Gras und Silofutter Silofutter Gras Vergleichssilofutter Endoxylanase (Einheiten/kg Gras) Trockensubstanz (TS) (g/kg) Asche (g/kg TS) Milchsäure (g/kg TS) Ethanol (g/kg TS) Essigsäure (g/kg TS) Rohfaser (g/kg TS) Gewichtsverlust (g/kg TS) NH&sub3;-N/Gesamt-N (%-Gew. Gesamt-N) * von dem Vergleichswert statistisch verschieden. P < 0,05 (T-Test von Student)
  • Die Ergebnisse von Tabelle 5 beweisen deutlich die Wirksamkeit eines Zusatzes von Endoxylanase-Aktivität bei der Herstellung eines verbesserten Silofutters. Die Daten veranschaulichen eine wesentliche Steigerung der Milchsäurekonzentration im silierten Gras mit steigenden Mengen an zugegebener Endoxylanase-Aktivität. Es wurde eine geringe Steigerung des Essigsäuregehaltes festgestellt. Dies, zusammen mit dem erhöhten Milchsäuregehalt erklärt den tieferen pH-Wert und damit auch die bessere Silofutterkonservierung. Es wurde keine signifikante Steigerung der Ethanolerzeugung (durch unerwünschte Hefefermentierung) festgestellt. Ferner zeigen die Daten eine signifikante Herabsetzung der Parameter der Zellwand-Biopolymeren (tieferer Rohfasergehalt, tieferer Gehalt an Neutralwaschmittel-Fasern und tieferer Gehalt an Fasern von saurem Waschmittel im Vergleich zur Kontrolle), was zu einer Zunahme der fermentierbaren Zucker führt, weiche für die Milchsäurebakterien und für die das durch Endoxylanase behandelte Silofutter fressenden Tiere verfügbar sind. Die VorVerdauung des Zellwandmaterials hat auch eine erhöhte Verdaulichkeit des silierten Futters zufolge.

Claims (13)

1. Silofuttermischung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mehr als 50 000 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität/kg Futter (Frischgewicht) enthält, wobei besagte Endoxylanase-Aktivität dem Futter in von anderer enzymatischer Aktivität nahezu freier Form zugegeben wird.
2. Silofuttermischung nach Anspruch 1, dadurch ferner gekennzeichnet, dass die Endoxylanase aus einem Fadenpilz gewonnen wird.
3. Silofuttermischung nach Anspruch 2, dadurch ferner gekennzeichnet, dass die Endoxylanase aus einem Fadenpilz gewonnen wird, den man unter den Gattungen Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora, Fusarium und Trichoderma auswählt.
4. Silofuttermischung nach Anspruch 3, dadurch ferner gekennzeichnet, dass die Endoxylanase aus einem Fadenpilz gewonnen wird, den man unter den Arten Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus tubigensis, Disporotrichum dimorphosporum und Trichoderma reesei auswählt.
5. Silofuttermischung nach Anspruch 1, dadurch ferner gekennzeichnet, dass die Endoxylanase ein pH- Optimum im Bereich von 3,5 bis 6,0 hat.
6. Silofuttermischung nach Anspruch 1, dadurch ferner gekennzeichnet, dass sie Impfmaterial einer Milchsäurebakterie enthält.
7. Silofuttermischung nach Anspruch 6, dadurch ferner gekennzeichnet, dass man die Milchsäurebakterie unter der Gruppe auswählt, welche aus Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus fermentum und Lactobacillus lactis besteht.
8. Verfahren zur Konservierung von Silofutter, dadurch gekennzeichnet, dass dem Silofutter mehr als 50 000 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität/kg Futter (Frischgewicht) zugegeben werden, um die in Silofutter vorhandene Menge an wasserlöslichen Kohlehydraten zur Erzeugung von Milchsäure und Essigsäure durch Milchsäurebakterien zu erhöhen, wobei das Verfahren ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die Endoxylanase dem Futter in von anderer enzymatischer Aktivität nahezu freier Form zugegeben wird.
9. Verfahren zur Verbesserung der in vivo-Verdaulichkeit von Silofutter bei Tieren, wonach das Tier mit Silofutter enthaltendem Futter gefüttert wird und dem Silofutter mehr als 50 000 Einheiten der Endoxylanase- Aktivität/kg Futter (Frischgewicht) zugegeben werden, um die Zellwand der Pflanzen mindestens teilweise zu zersetzen, wobei das Verfahren ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die Endoxylanase dem Futter in von anderer enzymatischer Aktivität nahezu freier Form zugegeben wird.
10. Verfahren zur Verbesserung des Nährwertes von Silofutter, wonach dem Silofutter mehr als 50 000 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität/kg Futter (Frischgewicht) zugegeben werden, um die wasserlöslichen Kohlehydrate aus dem silierten Futter freizusetzen, damit sie von dem das Silofutter fressenden Tier verwertet werden, wobei das Verfahren ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass die Endoxylanase dem Futter in von anderer enzymatischer Aktivität nahezu freier Form zugegeben wird.
11. Verwendung von mehr als 50 000 Einheiten der Endoxylanase-Aktivität/kg Futter (Frischgewicht) bei der Herstellung von Silofutter, dadurch ferner gekennzeichnet, dass die Endoxylanase dem Futter in von anderer enzymatischer Aktivität nahezu freier Form zugegeben wird.
12. Mindestens 50 Gew.-% Endoxylanase enthaltende Mischung zur Verwendung als Zugabe zu Silofutter, wobei die Mischung dadurch ferner gekennzeichnet ist, dass sie von anderer enzymatischer Aktivität nahezu frei ist.
13. Silofutter enthaltende Tierfuttermischung, wobei das Silofutter mehr als 50 000 Einheiten Endoxylanase-Aktivität/kg Futter (Frischgewicht) enthält und die Mischung dadurch ferner gekennzeichnet ist, dass die Endoxylanase dem Futter in von anderer enzymatischer Aktivität nahezu freier Form zugegeben wird.
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