CN115232207B - 抗体-溶菌素（SM-ScFv-Fc-Ly）在治疗变形链球菌感染中的应用 - Google Patents

抗体-溶菌素（SM-ScFv-Fc-Ly）在治疗变形链球菌感染中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及抗体‑溶菌素(SM‑ScFv‑Fc‑Ly)在治疗变形链球菌(S.Mutans)感染中的应用。具体地，所述抗体特异性结合SAI/II，所述抗体中重链可变区中CDR的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.:3‑5所示，所述抗体中轻链可变区中CDR的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.:6‑8所示。

Description

抗体-溶菌素(SM-ScFv-Fc-Ly)在治疗变形链球菌感染中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及抗体-溶菌素(SM-ScFv-Fc-Ly)在治疗变形链球菌(S.Mutans)感染中的应用。
背景技术
龋齿是个世界性高发牙齿疾病。
S.Mutans是龋齿主要致病菌。S.Mutans通过细菌表面SAI/II蛋白粘附在牙齿表面，并合成生物膜(biofilm)。生物膜具有抗氧化，耐酸、碱以及耐药等作用，使细菌拮抗多种化学药物，如抗菌素等。此外，S.Mutans通过GTF (glucosyltransferase)，将蔗糖合成非水溶的多糖(Glycan)粘附在牙齿表面。当口腔中有高糖滞留时，牙齿生物膜中的细菌通过酵解高糖，产生酸性代谢物，腐蚀牙釉质，产生龋斑。
抑制S.Mutans对牙齿感染，可降低龋齿发病率。以S.Mutans为靶向的龋齿预防手段目前市场上有4种方式，1)应用高氟牙膏以及儿童的牙龈局部高氟包埋对牙齿感染细菌进行治疗，抑制细菌诱发的龋齿，这种方法已用于临床。但是，缺点是不易推广和高氟对骨骼的副作用。2)抗体介导的免疫被动治疗，预防龋齿发生。以S.Mutans表面抗原SAI/II或GTF为靶点的抗体，在灵长类和人志愿者实验中，能有效的降低图变形链球菌感染和龋齿发生。3)生物牙膏，在2019 年市场上开始销售一种生物牙膏，目的是抑制龋齿相关细菌对牙齿的粘附，生物膜形成，但是，长期疗效和副作用还没有评估。4)S.Mutans疫苗，SAI/II蛋白中的多肽是疫苗的主要抗原来源，但是，目前还在实验室研究阶段。
以抗体介导的免疫治疗S.Mutans感染已有多篇文献报道，如针对SAI/II抗原为靶点的抗体(如Guy’1和Guy’13抗体)。在恒河猴和人志愿者中，给予 GUY‘13抗体制备的漱口水，可抑制SM对牙齿的粘附，降低龋齿的发生率。口腔黏膜局部给予的抗体分布在牙齿表面和牙龈组织液中。临床前研究抗GTF抗体也具有很强的抑制S.Mutans对牙齿的结合和生物膜形成作用。抗体治疗于抗生素相比具有如下优点，1)抗体的靶向作用强，可特异识别、结合致病菌；2) 调动机体免疫系统对致病菌的杀伤作用，不易产生耐药。3)毒副作用小。但是抗体治疗也有不利因素，如分子量大、蛋白异源性诱发过敏，产量低等。因此，抗体改造工程技术也被广泛应用。如小分子量的单链抗体和纳米抗体等。以 SAI/II为靶向制备的单链抗体，在特异识别和结合SAI/II抗原方面与母本抗体没有区别，但是，单链抗体对突变链球菌的凝集效应明显低于母本抗体。将单链抗体表达在食品级的乳酸杆菌表面，可由增加乳酸杆菌与S.Mutans的凝集作用，抑制S.Mutans对大鼠牙齿的感染和龋齿发生率。但是，由于乳酸杆菌表达质粒中有抗生素抗性基因(如amp和Erythroumycin)，限制了该系统临床应用。
溶菌酶，也称为溶菌素，是机体产生的广谱抗菌肽。通过水解细菌壁肽聚糖， b-1,4glycosidic bond促使细菌细胞壁破坏，致使细菌死亡，可抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌生长。此外，溶菌酶通过其表面阳离子与细菌表面阴离子结合，在细菌壁上打孔，导致细菌死亡。也可通过与带负电荷的病毒蛋白结合，与DNA、 RNA、脱辅基蛋白形成复盐，是病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。自然界生物表达三种形式的溶菌酶，分别是c-型溶菌酶(conventional type)，g-型溶菌酶(goose type)和i-型溶菌酶(invertebrate type)。在哺乳动物机体内，溶菌酶以C-型为主，它广泛存在于血，肝脏，泪液，尿液，唾液，牛奶以及黏膜表面，是体内天然的抗细菌感染因子。临床上氯化溶菌酶有外用药膏、口服、肌肉注射、滴眼液等制剂，用于抗菌、抗病毒以及食品防腐剂。溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质。
发明内容
本发明应用基因工程技术将制备的抗SAI/II单链抗体编码cDNA与人IgG1 的Fc片段编码cDNA融合，并克隆到pHB-1表达质粒中pHB-ScFv。将该质粒转染到CHO工程细胞株中，进行ScFv-Fc融合单链抗体表达与分泌，产量高达 2克每升。该单链抗体可特异识别S.Mutans表面SAI/II蛋白，凝集S.Mutans 33382，抑制SM33382对牙齿的粘附，减少生物膜的形成。
为进一步加强ScFv-Fc抗体对S.Mutans的杀伤作用，我们应用基因克隆技术，将表达c-型溶菌酶的cDNA亚克隆到pHB-ScFv-Fc的C-端，构成 pHB-ScFv-Ly-Fc和pHB-ScFv-Fc-Ly两个质粒，表达的蛋白分别称为 SM-ScFv-Ly-Fc)和SM-ScFv-Fc-Ly)。SM-ScFv-Fc-Ly能识别SAI/II抗原，具有细菌凝集作用，抑制S.Mutans形成生物膜，抑制细菌与牙齿的结合和杀菌作用。 SM-ScFv-Ly-Fc能结合SAI/II抗原但是没有上述抑菌活性。
抗体
本发明的第一方面提供了一种抗SAI/II的单链抗体，所述单链抗体包含重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区中CDR的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.:3-5所示，
所述轻链可变区中CDR的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.:6-8所示。
更具体地，所述SAI/II是S.Mutans表面的抗原。
如本发明所述，单链抗体包括构架区(Framework region，FR，常为FR1至 FR4)、被指定为“高变区”的CDR结构域(Complementarity determining reign， CDRs，通常为CDR1、CDR2和CDR3)。如本发明所使用，术语“高变区”或“CDR”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第1-113位所示。
优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第129-234位所示。
优选地，所述重链可变区与轻链可变区通过连接子连接，所述连接子G(G ly，甘氨酸)和/或S(Ser，丝氨酸)组成。
优选地，所述连接子是(GGGGS)n。
优选地，所述n＝3。
也即，所述连接子的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，或者，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第114-128位所示。
优选地，所述单链抗体与SEQ ID NO.:1所示氨基酸有85％以上的序列同源性，更优选地，90％以上(90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％和99％)的序列同源性。
更优选地，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
融合蛋白
另一方面，本发明提供了一种包含前述单链抗体的融合蛋白。
优选地，所述融合蛋白还包括人IgG1的Fc片段。
更优选地，所述人IgG1的Fc片段连接在前述单链抗体的C端(碳端，尾端)。
本发明所述单链抗体、人IgG1的Fc片段和溶菌酶连接所构成的融合蛋白也即本发明所述抗体-溶菌素(SM-ScFv-Fc-Ly)。
优选地，所述融合蛋白还包括溶菌酶的氨基酸序列。
优选地，所述溶菌酶是c型溶菌酶，更具体地，所述溶菌酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.:9所示。
优选地，所述融合蛋白还包括信号肽，如本发明所使用的所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:11所示。本发明所述信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肽链，在本发明具体实施例中简称为sp， signal peptide。
优选地，所述信号肽连接在前述单链抗体的N端(氮端，首端)。
优选地，所述包括信号肽、前述抗体、人IgG1的Fc片段、溶菌酶的氨基酸序列的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:13所示。
多核苷酸
另一方面，本发明提供了编码前述单链抗体或编码前述融合蛋白的多核苷酸。
术语“多核苷酸”在本文中意指2个或更多核苷酸的聚合形式，所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单和双链形式的DNA。
如本发明优选地，所述多核苷酸可以是双链DNA。
优选地，编码前述单链抗体的多核苷酸选自以下任意一种：
1)与SEQ ID NO.:2所示序列有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％以上同源性、
2)与SEQ ID NO.:2所示序列部分互补或完全互补、
3)如SEQ ID NO.:2所示。
优选地，编码前述融合蛋白的多核苷酸选自以下任意一种：
1)与SEQ ID NO.:14所示序列有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％以上同源性、
2)与SEQ ID NO.:14所示序列部分互补或完全互补、
3)如SEQ ID NO.:14所示。
载体
另一方面，本发明提供了一种载体，所述载体包含编码前述单链抗体或编码前述融合蛋白的多核苷酸。
优选地，所述载体包括质粒(表达质粒、克隆载体、小环、微载体、双微小染色体)、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
优选地，所述载体还包括一种或多种调控元件。
优选地，所述调控元件包含启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。
在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
制备方法
另一方面，本发明提供了制备表达本发明所述单链抗体、融合蛋白的细胞的方法，所述方法包括将前述单链抗体、前述融合蛋白、编码前述单链抗体的多核苷酸、编码前述融合蛋白的多核苷酸和前述载体中的一种或多种转化到细胞中。
如本文定义的，“转化”指外源DNA通过其进入宿主细胞的任何方法。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞内的任何已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，且可以包括但不限于，病毒感染、电穿孔、脂质转染、和粒子轰击。
宿主细胞
另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前述单链抗体、前述融合蛋白、编码前述单链抗体的多核苷酸、编码前述融合蛋白的多核苷酸和前述载体中的一种或多种。
优选地，所述宿主细胞包括前述制备方法所制备得到的细胞，所述细胞包括其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体部分复制的稳定转化的细胞，还包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间段的细胞。
应当理解此种术语不仅意指特定的受试细胞，还意指此种细胞的后代。因为由于突变或环境影响可能在随后世代中出现某些修饰，所以此种后代实际上可能不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。
优选地，宿主细胞包括原核细胞、真核细胞、昆虫细胞或选自任何生命界的细胞。
优选地，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。
如本发明具体实施例所应用的，所述动物细胞可以是293细胞(人胚胎肾细胞293，Human Embryonic Kidney Cells 293，又名HEK-293细胞、HEK-293)。可应用于本发明的宿主细胞还包括但不限于：CHO-K1细胞、HEK293细胞、Caco2 细胞、U2-OS细胞、NIH 3T3细胞、NSO细胞、SP2细胞、CHO-S细胞、DG44 细胞、K-562细胞、U-937细胞、MRC5细胞、IMR90细胞、Jurkat细胞、HepG2 细胞、HeLa细胞、HT-1080细胞、HCT-116细胞、Hu-h7细胞、Huvec细胞、Molt 4细胞等细胞系。
药物组合物
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含前述单链抗体、前述融合蛋白、编码前述单链抗体的多核苷酸、编码前述融合蛋白的多核苷酸和前述载体和前述宿主细胞中的一种或多种。
本发明所述药物组合物还可以进一步包含药学上可接受的缓冲液、稳定剂和表面活性剂。
本发明所述缓冲液示例性的可包括但不限于甘氨酸、乙酸/乙酸盐、琥珀酸/ 琥珀酸盐、柠檬酸/柠檬酸盐、抗坏血酸/抗坏血酸盐、酒石酸/酒石酸盐、顺丁烯二酸/顺丁烯二酸盐、乳酸/乳酸盐、碳酸/碳酸氢盐、苯甲酸/苯甲酸盐、组氨酸、磷酸/磷酸盐或tris/tris盐酸盐。
本发明所述稳定剂示例性的可包括但不限于碳水化合物、糖或其水合物、糖醇或其水合物和氨基酸。示例性的，所述碳水化合物、糖或糖醇包括：海藻糖或其水合物、蔗糖、糖精、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇、肌醇、庚七醇、异麦芽酮糖醇、麦芽糖醇、聚葡糖醇、环糊精、羟丙基环糊精和葡萄糖。氨基酸包括：谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、丝氨酸、硒代蛋氨酸、瓜氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、牛磺酸、茶氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、吡咯赖氨酸、组氨酸和丙氨酸。
本发明所述表面活性剂示例性的可包括但不限于聚氧乙烯-脱水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨酯或吐温)、聚乙烯-聚丙二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚，例如聚氧乙烯单月桂基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚[Triton-X]、和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物[泊洛沙姆和普朗尼克]和十二烷基硫酸钠(SDS)。
方法
另一方面，本发明提供了一种检测SAI/II的方法，所述方法包括将前述单链抗体和/或融合蛋白与待检测样品接触的步骤。
优选地，所述检测是非诊断目的的。
优选地，所述待检测样品的来源可以是疑似S.Mutans感染的牙齿。
应用
另一方面，本发明提供了前述单链抗体、融合蛋白、前述编码单链抗体的多核苷酸、前述编码融合蛋白的多核苷酸、前述载体或前述宿主细胞或前述药物组合物在鉴定S.Mutans中的应用。
另一方面，本发明提供了前述单链抗体、融合蛋白、前述编码单链抗体的多核苷酸、前述编码融合蛋白的多核苷酸、前述载体或前述宿主细胞或前述药物组合物在制备治疗S.Mutans感染、抑制S.Mutans粘附牙齿、抑制S.Mutans生物膜形成、凝集S.Mutans、预防龋齿的产品中的应用。
附图说明
图1是抗体滴度的检测结果图。
图2是构建pHB-ScFv-Fc质粒中的实验结果图，A是pHB-ScFv-Fc质粒的结构示意图，B是酶切鉴定结果图，C是不同ScFv对SAI/II抗原的亲和力的检测结果图。
图3是构建pHB-ScFv-Fc质粒中的实验结果图，A是扩增c-型溶菌酶cDNA的结果图，B是pBH-ScFv-Ly-Fc质粒的结构示意图，C是pBH-ScFv-Fc-Ly质粒的结构示意图，D是质粒PCR鉴定结果图。
图4是免疫印迹测定ScFv-Fc、SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc的结果图。
图5是免疫印迹测定ScFv-Fc、SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc蛋白与S.mutans表面SAI/II的结合能力的结果图。
图6是ScFv-Fc、SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc对S.Mutans细菌凝集的影响的检测结果图。
图7是ScFv-Fc、SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc抑制SM细菌生物膜形成的实验结果图。
图8是ScFv-Fc、SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc对SM特异杀菌作用的实验结果图，A是最低抑菌浓度测定的检测结果，B是菌落形成试验的实验结果，C 是三种抗体融合蛋白对牙卟啉单包菌的作用结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1 SM-ScFv-Fc-Ly蛋白制备
应用S.Mutans表达抗原SAI/II对Balb/c小鼠进行免疫。然后应用杂交瘤融合技术，将免疫小鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选杂交瘤单克隆细胞株。测定抗体滴度以及和SAI/II的结合，结果如图1所示。
提取阳性杂交瘤单克隆细胞系中的RNA，应用RT-PCR技术，分别扩增抗体重链和轻链可变区。应用GGGGS连接子将重链和轻链可变区连接，并克隆到 pHB-Fc质粒的HindIII和EcoRI位点，构成pHB-ScFv-Fc质粒，所述Fc即人IgG1 的Fc片段。质粒图谱如图2A所示，图中缩写的含义是Pcmv：cmv启动子；SP：分泌信号肽；ScFv：single chain fragment ofvariable；Fc：Constant fragment of IgG-H。质粒酶切鉴定结果如图2B，说明载体构建成功。
将pHB-ScFv-Fc质粒转染239细胞，细胞分泌表达ScFv-Fc抗体。收取细胞上清中的ScFv-Fc，ELISA测定不同pHB-ScFv-Fc质粒转染细胞上清表达的ScFv 对SAI/II抗原的亲和力图2C。
选择对SAI/II抗原的亲和力最好的抗体进行测序。根据测序结果，本发明所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示，核酸序列如SEQ ID No.:2所示，重链、轻链CDR依次如SEQ ID No.:3-8所示。
应用RT-PCR技术从正常人血白细胞中扩增c-型溶菌酶cDNA(本发明中亦称为溶菌素，英文写做Ly cDNA，Ly即lysozyme的缩写)，其核酸序列如SEQ ID NO.:10所示，PCR结果如图3A。将Ly cDNA克隆到pHB-ScFv-Fc质粒的EcoRI 或XhoI位点，分别产生pHB-ScFv-Ly-Fc(质粒模式图如图3B)、pHB-ScFv-Fc-Ly(质粒模式图如图3C，DNA序列如SEQ ID NO.:14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.:13所示)。PCR鉴定重组质粒pHB-ScFv-Ly-Fc和pHB-ScFv-Fc-Ly结果如图 3D，证明质粒构建成功。
将pHB-ScFv-Ly-Fc以及pHB-ScFv-Fc-Ly两个重组质粒转染悬浮培养的293cells，收细胞上清，免疫印迹测定ScFv-Fc(图2A所示载体所表达的蛋白，构成是：本发明所述单抗-人IgG1的Fc片段)，SM-ScFv-Fc-Ly(图3C所示载体所表达的蛋白，构成是：本发明所述单抗-人IgG1的Fc片段-Ly cDNA)和 SM-ScFv-Ly-Fc(图3B所示载体所表达的蛋白，构成是：本发明所述单抗-Ly cDNA-人IgG1的Fc片段)在293细胞中的表达。ScFv-Fc分子量约50kD， SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc的分子量约70kD(图4)。
免疫印迹结果显示ScFv-Fc、SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc可识别并结合S.Mutans表面抗原SAI/II，纯化的SAI/II蛋白，但是不结合E.coli的蛋白(图 5)。也即本发明所制备的单链抗体对于SAI/II具有特异性结合能力。
实施例2 SM-ScFv-Fc-Ly促进SM细菌凝集
将取200μl SM细菌(OD600＝0.8)，置于载玻片上。分别于PBS(对照)、 10微克ScFv-Fc、SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc蛋白孵育30分钟。应用结晶紫染色，测定细菌凝集块。结果发现三个重组抗体融合蛋白ScFv-Fc、 SM-ScFv-Ly-Fc和SM-ScFv-Ly-Fc都可使细菌发生凝集，且SM-ScFv-Fc-Ly的凝集作用明显优于ScFv-Fc和SM-ScFv-Ly-Fc的凝集作用(图6)。
实施例3 SM-ScFv-Fc-Ly抑制SM细菌生物膜形成
将200微升(OD600＝0.8)的SM33382细菌分别于10微克/毫升的ScFv-Fc、 SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc蛋白在96孔细菌培养皿中孵育、培养过夜。 PBS作为阴性对照。用PBS将培养皿中的细菌洗4次，用结晶紫染色，测OD485。结果如图6所示，与PBS和SM-ScFv-Ly-Fc蛋白相比，ScFv-Fc和SM-ScFv-Fc-Ly 可明显抑制细菌形成生物膜(图7)。
实施例4 SM-ScFv-Fc-Ly对SM特异杀菌作用
取100微升(OD600＝0.8)的SM33382细菌分别于不同浓度的Scfv-Fc、 SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc孵育2小时，PBS作为阴性对照。应用最小抑菌浓度试验(MIC)，我们证明SM-ScFv-Fc-Ly的最低浓度为1.25μg/ml。(图8A)
取等量的细菌涂于HB-broth培养版上-(SM专用培养基)，培养过夜。 SM-ScFv-Fc-Ly可显著抑制细菌在培养皿上的生长，ScFv-Fc和SM-ScFv-Ly-Fc 的抑菌效果与对照PBS处理组相比作用稍弱。实验结果提示SM-ScFv-Fc-Ly具有抑菌作用(图8B)。
为证明SM-ScFv-Fc-Ly作用的特异性，我们将常规寄生在牙周的卟啉单包菌(P.gingivalis)分别于ScFv-Fc、SM-ScFv-Fc-Ly和SM-ScFv-Ly-Fc孵育24小时，测定的OD600结果显示三种抗体融合蛋白都不能有效的抑制卟啉单包菌的生长 (图8C)。
序列表
<110> 河南大学
<120> 抗体-溶菌素（SM-ScFv-Fc-Ly）在治疗变形链球菌感染中的应用
<141> 2022-05-19
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ser Arg Trp Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gln Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Thr Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
130 135 140
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Thr Ser Val Ser Tyr Met
145 150 155 160
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Leu Tyr
165 170 175
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
195 200 205
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Thr Ser Tyr Pro Tyr Thr
210 215 220
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230
<210> 2
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggtgcagc tgcagcagtc tggacctgac ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggata ctccttttcc gaatacaaca tacactgggt gaagcagagc 120
cgttggaaga gccttgagtg gattggatat atttatcctt acaacggtca gacctactac 180
aaccagaaat tcaagaacaa ggctacattg actgtagaca attcctccac ctcagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac acctgaggac tctgcagtct attactgtgc aacctacttt 300
gattattggg gtcaaggtac tacggttact gtttcatcag gtggcggcgg ttccggtggt 360
ggtggatccg gcggtggtgg cagcgacatc gttctcactc agtctccagc aatcatgtct 420
gcatctccag gggagagggt caccataacc tgcagtgcca gcacgagtgt aagttacatg 480
cactggttcc agcagaagcc aggcacttct cccaaactct ggctttatag cacatccaac 540
ctggcttctg gagtccctgc tcgcttcagt ggcagtggat ctgggacctc ttactctctc 600
acaatcagcc gaatggaggc tgaagatgct gccacttatt actgccatca aaggactagt 660
tacccgtaca ccttcggagg ggggacaaag ttggaaataa aa 702
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Tyr Ser Phe Ser Glu Tyr Asn
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gln Thr
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Thr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Ser Val Ser Tyr
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Thr Ser
1
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
His Gln Arg Thr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Leu Ser Val Thr Val Gln Gly Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala
1 5 10 15
Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu
20 25 30
Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg
35 40 45
Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe
50 55 60
Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala
65 70 75 80
Val Asn Ala Cys His Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile
85 90 95
Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly
100 105 110
Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val
115 120 125
Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys Gly Val
130 135
<210> 10
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctttctgtta cggtccaggg caaggtcttt gaaaggtgtg agttggccag aactctgaaa 60
agattgggaa tggatggcta caggggaatc agcctagcaa actggatgtg tttggccaaa 120
tgggagagtg gttacaacac acgagctaca aactacaatg ctggagacag aagcactgat 180
tatgggatat ttcagatcaa tagccgctac tggtgtaatg atggcaaaac cccaggagca 240
gttaatgcct gtcatttatc ctgcagtgct ttgctgcaag ataacatcgc tgatgctgta 300
gcttgtgcaa agagggttgt ccgtgatcca caaggcatta gagcatgggt ggcatggaga 360
aatcgttgtc aaaacagaga tgtccgtcag tatgttcaag gttgtggagt g 411
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgggatggt catgtatcat cctttttctg gtagcaactg caactggagt acattca 57
<210> 13
<211> 626
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35 40 45
Ser Glu Tyr Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ser Arg Trp Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gln Thr Tyr Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Thr
85 90 95
Ser Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Pro Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala
145 150 155 160
Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Thr Ser Val
165 170 175
Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu
180 185 190
Trp Leu Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met
210 215 220
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Thr Ser Tyr
225 230 235 240
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Phe Glu
245 250 255
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
260 265 270
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
275 280 285
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
290 295 300
Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
305 310 315 320
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
325 330 335
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
340 345 350
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
355 360 365
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
370 375 380
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
385 390 395 400
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
405 410 415
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
435 440 445
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
450 455 460
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Glu Leu Ser Val Thr Val Gln Gly
485 490 495
Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly
500 505 510
Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala
515 520 525
Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly
530 535 540
Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp
545 550 555 560
Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser
565 570 575
Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala
580 585 590
Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp
595 600 605
Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys
610 615 620
Gly Val
625
<210> 14
<211> 1881
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgggatggt catgtatcat cctttttctg gtagcaactg caactggagt acattcagag 60
gtgcagctgc agcagtctgg acctgacctg gtgaaacctg gggcctcagt gaagatatcc 120
tgcaaggctt ctggatactc cttttccgaa tacaacatac actgggtgaa gcagagccgt 180
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cagaaattca agaacaaggc tacattgact gtagacaatt cctccacctc agcctacatg 300
gagctccgca gcctgacacc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaac ctactttgat 360
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tggttccagc agaagccagg cacttctccc aaactctggc tttatagcac atccaacctg 600
gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc agtggatctg ggacctctta ctctctcaca 660
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ccgtacacct tcggaggggg gacaaagttg gaaataaaag aattcgagcc caaatcttgt 780
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ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 900
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cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1080
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aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1260
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1320
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ctctccctgt ctccgggtaa actcgagctt tctgttacgg tccagggcaa ggtctttgaa 1500
aggtgtgagt tggccagaac tctgaaaaga ttgggaatgg atggctacag gggaatcagc 1560
ctagcaaact ggatgtgttt ggccaaatgg gagagtggtt acaacacacg agctacaaac 1620
tacaatgctg gagacagaag cactgattat gggatatttc agatcaatag ccgctactgg 1680
tgtaatgatg gcaaaacccc aggagcagtt aatgcctgtc atttatcctg cagtgctttg 1740
ctgcaagata acatcgctga tgctgtagct tgtgcaaaga gggttgtccg tgatccacaa 1800
ggcattagag catgggtggc atggagaaat cgttgtcaaa acagagatgt ccgtcagtat 1860
gttcaaggtt gtggagtgta a 1881

Claims (26)

1.一种抗SAI/II单链抗体，所述单链抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区中CDR的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.:3-5所示，所述轻链可变区中CDR的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.:6-8所示。
2.如权利要求1所述单链抗体，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第1-113位所示。
3.如权利要求1所述单链抗体，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第129-234位所示。
4.如权利要求1所述单链抗体，所述重链可变区与轻链可变区通过连接子连接，所述连接子由G和/或S组成。
5.如权利要求4所述单链抗体，所述连接子是（GGGGS）n。
6.如权利要求5所述单链抗体，所述n=3。
7.如权利要求1所述单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
8.一种包含权利要求1所述单链抗体的融合蛋白，所述融合蛋白还包括人IgG1的Fc片段、c型溶菌酶的氨基酸序列、信号肽；
所述包括信号肽、权利要求1所述单链抗体、人IgG1的Fc片段、溶菌酶的氨基酸序列的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:13所示。
9.编码权利要求1所述单链抗体或编码权利要求8所述融合蛋白的多核苷酸。
10.如权利要求9所述多核苷酸，所述多核苷酸是双链DNA。
11.如权利要求9所述多核苷酸，所述编码权利要求1所述单链抗体的多核苷酸选自以下任意一种：
1）与SEQ ID NO.:2所示序列有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同源性、
2）与SEQ ID NO.:2所示序列部分互补或完全互补、
3）如SEQ ID NO.:2所示。
12.如权利要求9所述多核苷酸，编码权利要求8所述融合蛋白的多核苷酸选自以下任意一种：
1）与SEQ ID NO.:14所示序列有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上同源性、
2）与SEQ ID NO.:14所示序列部分互补或完全互补、
3）如SEQ ID NO.:14所示。
13.一种载体，所述载体包含编码权利要求1所述单链抗体或编码权利要求8所述融合蛋白的多核苷酸；
或者，所述载体表达权利要求1所述单链抗体或权利要求8所述融合蛋白。
14.如权利要求13所述载体，所述载体包括质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
15.如权利要求13所述载体，所述载体上还包括一种或多种调控元件。
16.如权利要求15所述载体，所述调控元件包含启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列或筛选标记基因。
17.制备含有、表达权利要求1所述单链抗体或权利要求8所述融合蛋白的细胞的方法，所述方法包括将权利要求9所述的多核苷酸和/或权利要求13所述的载体转化到细胞中。
18.如权利要求17所述方法，所述转化的方法包括病毒感染、电穿孔、脂质转染或粒子轰击。
19.一种宿主细胞，所述宿主细胞中包含权利要求1所述单链抗体、权利要求8所述融合蛋白、权利要求9所述的多核苷酸、权利要求13所述的载体中的一种或多种；
或者，所述宿主细胞是权利要求17所述方法所制备得到的细胞。
20.如权利要求19所述宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞、原生生物细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞。
21.如权利要求20所述宿主细胞，所述动物细胞包括293细胞、CHO-K1细胞、HEK293细胞、Caco2细胞、U2-OS细胞、NIH 3T3细胞、NSO细胞、SP2细胞、CHO-S细胞、DG44细胞、K-562细胞、U-937细胞、MRC5细胞、IMR90细胞、Jurkat细胞、HepG2细胞、HeLa细胞、HT-1080细胞、HCT-116细胞、Hu-h7细胞、Huvec细胞、Molt 4细胞。
22.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述单链抗体或权利要求8所述融合蛋白。
23.如权利要求22所述药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的缓冲液、稳定剂和表面活性剂。
24.一种检测SAI/II的方法，所述方法包括将权利要求1所述单链抗体或权利要求8所述融合蛋白与待检测样品接触的步骤；
所述检测是非诊断目的的。
25.权利要求1所述单链抗体、权利要求8所述融合蛋白、权利要求9所述的多核苷酸、权利要求13所述的载体、权利要求19所述宿主细胞、权利要求22所述药物组合物在制备鉴定S. Mutans、抑制S. Mutans生物膜形成、凝集S. Mutans的产品中的应用。
26.权利要求1所述单链抗体、权利要求8所述融合蛋白、权利要求9所述的多核苷酸、权利要求13所述的载体、权利要求19所述宿主细胞、权利要求22所述药物组合物在制备治疗S. Mutans感染、抑制S. Mutans粘附牙齿、预防龋齿的产品中的应用。
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