FI100408B - Proteiinien glykosylaation säätelymenetelmiä - Google Patents
Proteiinien glykosylaation säätelymenetelmiä Download PDFInfo
- Publication number
- FI100408B FI100408B FI884991A FI884991A FI100408B FI 100408 B FI100408 B FI 100408B FI 884991 A FI884991 A FI 884991A FI 884991 A FI884991 A FI 884991A FI 100408 B FI100408 B FI 100408B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- gene
- yeast cell
- mnn9
- yeast
- plasmid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 title description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 155
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 85
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 85
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 claims abstract description 41
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 120
- 101150075484 MNN9 gene Proteins 0.000 claims description 53
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 37
- 101000801742 Homo sapiens Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 13
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 13
- 101150053531 MNN1 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 11
- 101100184476 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) MNN26 gene Proteins 0.000 claims description 10
- -1 MNN8 Proteins 0.000 claims description 9
- 101100457678 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MNN10 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 4
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 4
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 claims description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 3
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 claims description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 2
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 claims 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 107
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 78
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 71
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 66
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 43
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 101150071434 BAR1 gene Proteins 0.000 description 27
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 27
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 26
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 26
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 25
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 22
- 101100378536 Ovis aries ADRB1 gene Proteins 0.000 description 22
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 21
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 21
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 19
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 14
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 14
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 14
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 14
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000002585 base Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 11
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 9
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 9
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 9
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 9
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 9
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 9
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 5
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 5
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCO)C=C1 LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010027805 Azocoll Proteins 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 4
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 4
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 4
- 101150109301 lys2 gene Proteins 0.000 description 4
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 4
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 4
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 4
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 4
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 4
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100352919 Caenorhabditis elegans ppm-2 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 108010078692 yeast proteinase B Proteins 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150011585 MAT gene Proteins 0.000 description 2
- 101710084218 Master replication protein Proteins 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 101000708578 Milk vetch dwarf virus (isolate N) Para-Rep C3 Proteins 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101150014925 POT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710112078 Para-Rep C2 Proteins 0.000 description 2
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 2
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100022880 Rab proteins geranylgeranyltransferase component A 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100026115 S-adenosylmethionine synthase isoform type-1 Human genes 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 2
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 description 2
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 101710119961 Trans-acting factor C Proteins 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 235000002864 food coloring agent Nutrition 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 230000005664 protein glycosylation in endoplasmic reticulum Effects 0.000 description 2
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 2
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 2
- SXOUIMVOMIGLHO-AATRIKPKSA-N (E)-3-(indol-2-yl)acrylic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(/C=C/C(=O)O)=CC2=C1 SXOUIMVOMIGLHO-AATRIKPKSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 101100346429 Arabidopsis thaliana MRF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100459439 Caenorhabditis elegans nac-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710174610 Disulfide bond formation protein Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000005702 Galium aparine Species 0.000 description 1
- 235000014820 Galium aparine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229940121672 Glycosylation inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 101150007280 LEU2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150027942 MNN10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150006985 STE2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100219192 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) byr2 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101150032817 TPI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000396377 Tranes Species 0.000 description 1
- 101710194411 Triosephosphate isomerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000005282 brightening Methods 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 101150018117 cobB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003167 genetic complementation Methods 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- CWWARWOPSKGELM-SARDKLJWSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5 Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)OC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=CC=C1 CWWARWOPSKGELM-SARDKLJWSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- DJDSLBVSSOQSLW-UHFFFAOYSA-N mono(2-ethylhexyl) phthalate Chemical group CCCCC(CC)COC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O DJDSLBVSSOQSLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N morin Natural products OC1=CC(O)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 101150089009 sir2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
- C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
Description
100408
Proteiinien glykoeylaation säätelymenetelmiä
Esillä oleva keksintö kohdistuu yleisesti menetelmiin, joilla tuotetaan heterologisia proteiineja tai polypeptideja, ja erityisesti menetelmiin, joilla säädellään proteiinien glykoey laat iota .
Viimeaikaiset edistymiset rekombinantti-DNA-teknologiassa ovat johtaneet sienisolujen käyttöön isäntinä tuotettaessa vieraita polypeptidejä. Eniten käytettyjen sienten joukossa on leivinhiiva <Saccharomyces cerevisiae). Hiivan erityispep-tidejä on käytetty hyväksi kuljetettaessa heterologisia proteiineja hiivasoluista alustaan. Alustaan kuljetettujen hiiva-proteiinien alhainen lukumäärä helpottaa kuljetettujen hetero-logisten proteiinien puhdistamista (Hitzeman et ai., Science 219 :620-625. 1983). Proteiinien kulku hiivan eritysreitin läpi aikaansaa disulfidisidoksen muodostumisen ja glykopro-teiinin glykosylaation, modifikaatiota, joita usein tarvitaan, jotta saataisiin kunnollinen laskostuminen ja/tai täydellinen biologinen aktiivisuus.
Hiivan eritysreitti ohjaa oligosakkaridien ja mannoosiosien siirtoa, kahden tyyppisten sidosten kautta, glykosylaatiokoh-tiin erittymiseen ohjautuvissa proteiineisa (Kukuruzinska et ai., Ann. Rev. Biochem. 915-944, 1987). O-sidottu glyko-sylaatio aloitetaan siirtämällä yksi mannoosiosa glykoprote-iinin Ser- tai Thr-jäännöksille. Ydin-oligosakkaridirakentei-den lisäys polypeptidiketjun Asn-jäännökseen muodostaa N-sidotun glykosidisen sidoksen (Sheckman ja Novick, teoksessa Mol. Biol, of Yeast Saccharomycee: Metabolism and Gene Expression, toimittaneet Strathern et ai., New York, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 361-393, 1982). Akseptoripaikka N-sidotun ydin-oligosakkaridi-rakenteiden lisäämiselle on tri- 100408 2 peptidisekvenssi Αβη-Χ-Thr, jossa X voi olla mikä tahansa aminohappo, vaikka nämä kaikki tripeptidisekvenesit eivät ole isäntiä N-sidotulle glykosylaatioi1e. Tripeptidisekvenssi-akseptoripaikat, jotka on löydetty hiivan glykoproteiineista, näyttävät olevan identtisiä nisäkkäiden glykoproteiineista tunnistettujen paikkojen kanssa, katso Kukuruzinska et ai.,
Ann. Rev. Biochem. .56.:915-944, 1987). Aspergillus nidulans'n on myös osoitettu glykosyloivan vieraita proteiineja näissä tripeptidi-akseptori-sekveneseiesä.
Hiivan on osoitettu glykosyloivan vierasta glykoproteiinia N-sidotuissa akseptori-paikoissa, joita on osoitettu glykosyloi-tavan luonnossa. Esimerkiksi, kudosplasminogeeniaktivaattori1-la (tPA), joka on eristetty Bowes'in melanoomasoluista, on neljä mahdollista N-sidottua glykosylaatiopaikkaa, joista kolme ovat glykosyloidut. tPA, joka ekspressoituu hiivasoluissa, osoittaa glykosylaatiota samoissa kolmessa paikassa. Vasikan prokymosiini, jossa on kaksi mahdollista N-sidottua glykoeylaatiopaikkaa, joista vain yksi on glykosyloitu, eks-preseoituessaan hiivassa osoittaa glykosylaatiota samassa paikassa kuin vasikan soluissa. Hiivan glykoproteiinien N-sitoutunut ydin-oligosakkaridi-rakenne näyttää olevan identtinen nisäkkään glykoproteiinien samankaltaisen oligosakkaridirakenteen kanssa (Ballou, teoksessa Mol. Biol . of Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression, toimittaneet Strathern et ai, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 335-360, 1982).
Ulomman ketjun glykosylaatio on usein lajispesifinen rakenteeltaan, ja tällä rakenteella saattaa olla osuus proteiinien biologisessa aktiivisuudessa. Esimerkiksi, ulomman ketjun oligosakkaridit, jotka ovat kiinnittyneet hiivan tuottamien glykoproteiinien N-sitoutuneisiin ydin-oligosakkaridi-raken-teisiin poikkeavat rakenteeltaan ja sisällöltään nisäkkään tuottamissa glykoproteiineissa olevista ulomman ketjun oligo- 3 100403 sakkarideista. Hiivoissa ovat ulomman ketjun oligosakkaridit, jotka muodostuvat 0( l->6 sitoutuneista mannoosijäännösten muodostamista selkärangoista, joihin mono-, di- ja trimannosyyli-haarat ovat kiinittyneet, liittyneet N-eidottuihin oligosakka-ridi-ydin-rakenteisiin. Hiiva voi glykosyloida vierasta proteiinia tällä tavoin, mikä johtaa ulomman oligosakkaridiket-jun läsnäoloon, joka voi olla selvästi erilaista kuin alkuperäinen materiaali. Tämä eroavaisuus ulomman ketjun oligosakkaridin koostumuksessa voi johtaa biologisen aktiivisuuden vähenemiseen tai häviämiseen niillä proteiineilla, joiden rakennetta tai aktiivisuutta hiivan glykoeylaatio estää.
Vieraiden oligosakkaridi-rakenteiden läsnäolo saattaa aiheuttaa merkittävän ongelman, kun tarkastellaan rekombinanttigly-koproteiinien käyttöä terapeuttisina aineina. Esimerkiksi,
Ballou <J. Biol. Chem. 245:1197. 1970) ja Suzuki et ai., <Jpn. J. Microbiol. 12.:19, 1968) ovat osoittaneet, että so- luseinän glykoproteiinien oligosakkaridiketjut ovat pääasialliset immunogeenit, kun kokonaisia hiivasoluja ruiskutetaan kaneihin tai vuohiin. Soluseinän glykoproteiinien oligosakka-ridiketjujen on osoitettu olevan identtisiä eritettyjen glyko-proteiinien, kuten invertaasi, oiigosakkaridiketjujen kanssa (katso Sheckman ja Novick, ibid.).
Vieraat glykoproteiinit, sisältäen immunoglobuliiniketjut, somatostatiinin, kudosplaeminogeeniaktivaattorin (tPA), Eps-tein-Barr-viruksen <gp350) pää-kuoriproteiinin (Schultz et ai. ,^Gene £4.:113-123, 1987), 0( -1-ant i t ryps i inin (AAT) ja 0( β-haptoglobi inin (Van der Straten et ai . , DNA 5.: 126-136, 1986), ovat ekspressoituneet hiivassa. Tutkimukset hii vasoluista, jotka on transformoitu cDNA-geeneillä, jotka koo-daavat näitä glykoproteiineja, ovat osoittaneet, että proteiinituotteet ovat heterogeenisiä hii1ihydraattiketjujen suhteen. Useimmissa tapauksissa, heterogeeninen tuote koostuu 100408 4 proteiinin hyperglykoeyloitujen muotojen seoksesta. Tämä heterogeenisyys ja hyperglykoeylaatio saattaa tehdä tuotteet sopimattomiksi terapeuttiseen käyttöön. Lisäksi hiivan tuottamien glykoproteiinien heterogeeninen luonne lisää lisävaiheita niiden puhdistamiseksi solujen alustasta.
On kuvattu useita menetelmiä, joita voidaan käyttää yritettäessä vähentää tai poistaa hiivoissa ekspressoituvien glyko-proteiinien hiilihydraattijäännöksiä. Menetelmät ovat glyko-eylaatioinhibiittorien käyttö, tuottamisen jälkeinen degly-kosylaatio ja in vitro -kloonattujen DNA-sekvenssien mutage-neesi. Vaikka näiden menetelmien on osoitettu olevan jonkin verran hyödyllisiä, niillä on ollut vain rajoitetusti menestystä .
Glykosylaatioinhibii11or ia, tunikamysiiniä, voidaan käyttää inhiboimaan hiilihydraatin lisäämistä hiivan tekemiin proteiineihin. Saadut proteiinit eivät voi olla aktiivisia ja niitä ei voida kuljettaa solusta. Lisäksi, hiivasolujen tunikamy-siinikäsittely ei täysin voi inhiboida proteiinien N-sidottua glykosylaatiota, sitä täytyy käyttää hyvin tarkkaan kontrolloiduissa olosuhteissa, eikä sitä voida käyttää pidennetyissä inkubaatioissa. Tunikamysiinikäeite1tyjen solujen proteiinituotteet sisältäisivät siksi glykosyloitujen ja ei-glykosy-loitujen proteiinien seoksen ja vaatisi lisävaiheita tunika-mysiinin poistamiseksi valmisteesta.
Entsymaattista polypeptidien in vitro -deglykosylaatiota käyttämällä endo- p-N-asetyy1iglukoosiaminidaasi H:ta (endo H) kuten Torrentino ja Maley ovat kuvanneet (J. Biol. Chem.
249:811-817. 1974) on käytetty deglykosyloimaan sellaisia hiivan tuottamia proteiineja kuten somatostatiini (Green et ai., J. Biol. Chem. 261: 7558-7565 . 1986), o(- i-antitryp- 2 1 siini (Van der Straten et ai., ibid).), ja β-haptoglobiini 100408 5 (Van der Straten et al., ibid.). Endo H-käsittely, ei-denatu-roivieea olosuhteissa, ei onnistu poistamaan kaikkea hiilihydraattia ja saatu proteiinituote jää heterogeeniseksi luonteeltaan ja täten epäsopivaksi terapeuttiseen käyttöön. Tällä in vitro -glykoeylaatiomenetelmällä on haittapuolena se, että se lisää lisävaiheen proteiinituotteen käsittelyyn ja edellyttää entsyymin täydellistä poistamista proteiinin kaupallisista valmisteista. Nämä ylimääräiset vaiheet lisäävät kaupallisen tuotannon kustannuksia eivätkä välttämättä johda kaikkien o1igosakkaridisivuketjujen poistoon proteiinista.
Toinen lähestymistapa ongelmien, jotka liittyvät hiivan tuottamiin glykoproteiineihin, voittamiseksi on glykosylaatio-paikkojen poistaminen mutageneesi1lä. Haigwood et ai., (EP-227 462, 1987) ja Meyhack et ai. (EP 225 286, 1987) ovat kuvanneet ihmisen mutantteja, joissa on yksi tai kaikki mahdolliset glykosylaatiopaikat muutettu, jotta estettäisiin N-sidottu glykosylaatio. Meyhack et ai. (ibid.) ovat ilmoittaneet, että hiivan tuottama aliglykosyloitu tPA säilyttää biologisen aktiivisuuden. Kuitenkin, sellaiset proteiinit eivät voi olla stabiileja ja olisivat siksi sopimattomia kaupalliseen tuotantoon. Lisäksi, nämä mutaatiot kehitettiin in vitro mutageneesillä jokaiseen mahdolliseen glykosylaatiopaikkaan ja mutageneesi täytyy toistaa jokaisessa geenissä tai cDNA:ssa, ' joka koodaa heterologieta glykoproteiinia, jota eritetään hiivasta. Nämä mutaatiot aiheuttavat muutoksia aminohapposekvenssissä johtaen mutanttiproteiinien tuottoon, joita ei löydetä luonnosta ja joilla saattaa olla muuttunut stabiilisuus, puoliintumisaika tai liukoisuus.
Siksi on tarve parantaa menetelmiä, joilla tuotetaan biologisesti aktiivisia proteiineja hiivasta vähennetyllä glykosy-laatiolla. Tämä keksintö antaa sellaiset menetelmät, joita voidaan käyttää laajasti hiivan erittämille proteiinituotteille. Menetelmillä on myös etuna homogeenisen proteiinituot 6 100408 teen puhdistamiseksi vähemmän vaiheita, mikä johtaa kiinnostavan proteiinin tuotantokustannuksien vähenemiseen.
Lyhyesti sanottuna, tässä keksinnössä esitetään heterologisen proteiinin tai polypeptidin tuotantomenetelmät. Yleisesti, yksi sellainen menetelmä sisältää: (a) hiivasoluun, jolla on virhe geenissä, jonka tuotetta tarvitaan liittämään ulomman ketjun oligosakkaridi-osia glykoproteiineihin, viedään ensimmäinen DNA-rakenne, joka sisältää säädeltävän promoottorin, jota seuraa alaspäin DNA-sekvenssi, joka komplementoi virheen; (b) viedään hiivasoluun toinen DNA-rakenne, joka sisältää toisen promoottorin, jota seuraa alaspäin DNA-sekvenssi, joka koodaa erityssignaalia, ja DNA-sekvenssi, joka koodaa heterologista proteiinia tai polypeptidiä; (c) kasvatetaan hiivasolua ensimmäisen kaltaisissa kasvatusolosuhteissa niin, että DNA-sekvenssi, joka komplementoi virhettä, ekspressoi-tuu; (d) kasvatetaan toisen kaltaisissa kasvatusolosuhteissa niin, että DNA-sekvenssi, joka komplementoi virhettä, ei eks-pressoidu ja DNA-sekvenssi, joka koodaa proteiinia tai polypeptidiä, ekspressoituu; ja (e) eristetään heterologinen proteiini tai polypeptidi.
Erilaisia proteiineja voidaan tuottaa käyttämällä menetelmää, mukaan lukien kudosplasminogeeniaktivaattorin, urokinaasin, immunoglobuliinit, verihiutaleen kasvutekijän, tekijä XIII:n ja niiden analogit.
Eräs toinen tämän keksinnön suoritusmuoto esittää hiivasolun, jolla on virhe geenissä, jonka tuotetta tarvitaan ulomman ketjun oligosakkaridi-osien lisäämiseen glykoproteiineihin, solun, joka on transformoitu ensimmäisellä DNA-rakenteella, joka sisältää säädeltävän promoottorin, jota seuraa alaspäin DNA-sekvenssi, joka komplementoi virheen, ja toinen DNA-rakenne sisältäen toisen promoottorin, jota seuraa alaspäin DNA-sekvenssi, joka koodaa erityssignaalia ja DNA-sekvenssi, joka koodaa heterologista proteiinia tai polypeptidiä.
7 100408 Tämän keksinnön kanssa läheisesti yhteenkuuluva suoritusmuoto esittää hiivasolun, jolla on Mnn9'-fenotyyppi ja kykenee tuottamaan morfologialtaan normaaleja pesäkkeitä osmoottisen stabilisaattorin puuttuessa. Edullisessa suoritusmuodossa hiiva-solulla on pep4-mutaatio tai lisäksi sillä on virhe MNNl-gee-nissä.
Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa esitetään menetelmä heterologisten proteiinien tai polypeptidien tuottamiseksi, tavallisesti (a) hiivasoluun, jolla on Mnn9'-fenotyyppi ja joka kykenee tuottamaan morfologialtaan normaaleja pesäkkeitä osmoottisen stabilisaattorin puuttuessa, viedään DNA-rakenne, joka sisältää promoottorin, DNA-sekvenssi, joka koo-daa erityssignaalia, ja DNA-sekvenssi, joka koodaa heterolo-gista proteiinia tai polypeptidiä; (b) kasvatetaan solua sellaisissa olosuhteissa, että DNA-sekvenssi, joka koodaa proteiinia tai polypeptidiä, ekspressoituu; ja (c) eristetään he-terologinen proteiini tai polypeptidi. Erityisen edullisessa suoritusmuodossa solu saadaan hiivakannasta ZY300. Promoottori voi olla konstitutiivinen tai säädeltävä promoottori.
Nämä ja tämän keksinnön muut suoritusmuodot tulevat selviksi seuraaviin yksityiskohtaisiin kuvauksiin ja liitteenä oleviin piirroksiin tutustumisen jälkeen.
Kuviot IA ja IB kuvaavat keksinnön mukaisia rakenteita Saccharomyces cerevisiae'n modifioiduille ydin-oligosakkarideille, jotka on tuotettu mnn9- ja mnnl mnn9 -mutanteissa. Kuvio IA kuvaa mnn9-mutanttien tuottaman oligosakkaridin 13-man-noosimuodon. Kuvio IB kuvaa mnnl mnn9 -mutanttien tuottamien oligosakkaridien 10-mannoosimuodon. Myös oligosakkaridin 9-man-noosimuoto on kuvattu. (M) on mannoosi; (GlcNAc) on N-asetyyli-glukoosiamiini; (Asn) on Asn-X-Ser- tai Asn-X-Thr-akseptori- 8 100408 paikkojen aeparagiini jäännös; <6> merkitsee 1-^6-sidosta man- noosien välillä; (3) merkitsee 1-^3 sidosta mannoosien välillä; <2) merkitsee 1-^2-s idos ta mannoosien välillä; ja (4) merkitsee 1 4-s idoeta mannoosin ja GlcNAc:n välillä.
kuvio 2 kuvaa pMlll:n rakennetta; kuvio 3 kuvaa pY37:n, pZY48:n ja pZY63:n rakennetta; kuvio 4 kuvaa MNN9-geenin nuk1eotidisekvenssiä ja primäärisen translaatiotuotteen johdettua aminohapposekvenssiä. Viivojen yläpuolella olevat numerot viittaavat nukleotidisekvenssiin; negatiiviset numerot merkitsevät 5' ei-koodaavaa sekvenssiä; kuvio 5 kuvaa pSW24:n rakennetta; kuvio 6 kuvaa pSXRlll;n rakenteen; kuvio 7 kuvaa pZY66:n rakennetta.
Ennen kuin edetään keksinnön käsittelyssä, saattaa sen ymmärtämiselle olla avuksi antaa tiettyjen termien määritelmät, joita käytetään jäljempänä.
DNA-konstruktio: DNA-molekyy1i tai sellaisen molekyylin klooni, joko yksi- tai kaksijuosteinen, jota ihminen on modifioinut, joka sisältää DNA-segmenttejä, jotka on yhdistetty ja asetettu rinnakkain sellaisella tavalla, joka ei kokonaisuutena muuten esiintyisi luonnossa.
Risteytymistyyppiä säätelevä tekijä: DNA-aekvenssi, johon hiivan MAT-geenin tuotteet sitoutuvat, mikä johtaa sekvenssiin sitoutuneiden geenien ekspression repressioon. Termejä "operaattori" ja "operaattorisekvensei" käytetään myös ku-. vaarnaan näitä tekijöitä.
Mnn9 -fenotyyppi; Hiivasolun fenotyyppi, jolle on tunnusomaista uloskuljetettujen tai eritettyjen glykoproteiinien tuottaminen, jotka kulkevat SDS-polyakryyiiamidigeelissä erillisinä ja homogeenisinä yksikköinä. Näiltä glykoproteii- 11 100408 9 neilta puuttuu hyperglykosylaatίο , joka on luonteenomaista villityypin hiivasolujen tuottamille glykoproteiinei11e .
Modifioitu ydin-oligoeakkaridi: Glykoproteiinin N-sidottu hiilihydraattia ivuket ju , jossa on kaksi N-asetyyliglukooeiamiini-(GlcNAc)-jäännöstä kytkeytyneenä 9-13 mannoosijäännökseen. Tyypillisiä modifioituja ydin-oligosakkaridirakenteita on esitetty kuvioissa IA ja IB.
Säädeltävä promoottori: DNA-sekvenssi, joka ohjaa sidotun DNA-sekvensein transkriptiota tasoilla, jotka vaihtelevat vastauksena ulkopuolisiin ärsykkeisiin. Säädeltävät promoottorit ovat yleensä joko "päällä" (maksimaalinen transkriptiotaso) tai "pois" (vähän tai ei transkriptiota), riippuen solun ympäristöstä, vaikka joissakin tapauksissa voidaan saada välissä olevia tasoja.
Erityseignaa1it: DNA-sekvenssi, joka koodaa erittyvää peptidiä. Erittyvä peptidi on aminohapposekvenssi, jolle on luonteenomaista hydrofobisten aminohappojen ydin, joka toimii ohjaamassa valmiin polypeptidin tai proteiinin eritystä solusta. Erittyviä peptidejä on tyypillisesti uudestaan syntetisoitujen proteiinien aminopäässä ja ne lohkaistaan valmiista proteiinista erityksen aikana.
Kuten huomautettiin edellä, tämä keksintö kuvaa menetelmiä, joiden avulla heterologisia glykoproteiineja voidaan erittää sienisoluista ydin-glykosylaation ollessa modifioitu. Tässä kuvatut menetelmät ovat erityisen edullisia siinä, että ne sallivat sellaisten glykoproteiinien, joilla on modifioituja ydin-oligosakkaridi-osia, tuottamisen käyttämällä isäntäsolua, jolla on virhe geenissä, jonka tuotetta tarvitaan liittämään ulomman ketjun oligosakkaridi-osat glykoproteiineihin. Nämä menetelmät eivät ole riippuvaisia kalliimmista glykoproteii-nien tuottamisen jälkeisistä modifikaatiomenetelmistä eivätkä 100408 10 menetelmät ole riippuvaisia glykosylaatiota inhiboivien tekijöiden lisäämisestä soluihin tai solutuotteisiin.
Sienisoluja, mukaanlukien hiivalajit (esim. Saccharomyces epp., Schizosaccharomyces pombe) tai filamenttisia sieniä (esim. Aspergillus epp., Neurospora spp.) voidaan käyttää isäntäeoluina tässä keksinnössä. Saccharomyces cerevisiae -hiivalla esimerkiksi on geeni (MNN7-MNN10), joka antaa hiivalle kyvyn lisätä ulomman ketjun oligosakkaridi-osia eritys-suuntautuneiden proteiinien oligosakkaridi-ydin-rakenteisiin. Mutantit, joilla on virhe näissä geeneissä (mnn7-mnni0> eivät lisää ulompia mannoosi-osia glykoproteiineihin, mistä seuraa glykoproteiineja, joilla on homogeeninen määrä glykoeylaatiota .
Geeni, jota tarvitaan lisäämään ulomman ketjun oligosakkaridi-osia, voidaan tunnistaa usealla tavalla. Erään menetelmän esimerkiksi on kuvannut Ballou et ai. (J. Biol. Chem. 225: 5986-5991, 1980). Tässä menetelmässä vasta-aineita muodostuu hiivasolun pinnassa olevia mannoosi-osia vastaan, mieluummin mnn2-hiivamutanttisolujen pinnassa olevia mannoosi-osia vastaan. Hiivasolut, mieluummin haploidit mnn2-solut, mutageeni-daan. Sitten käytetään vasta-aineita, mieluummin leimattuja vasta-aineita, tunnistamaan populaatiot sellaisten mutage-noitujen solujen joukosta, jotka eivät sido vasta-ainetta.
Sitten nämä mutantit risteytetään keskenään, jotta saadaan geneettisiä komplementaatioryhmiä. Kahden mutaation välinen komplementaatio johtaa diploidiin, jolla on pre-mutagenoidun emäfenotyyppi. Edullinen menetelmä pre-mutagenidun emäfeno-tyypin valikoimiseksi on vastaaineiden käyttö kohdistettuna emokannan mannoosi-osia vastaan. Tällä menetelmällä muodostetaan neljä komplementaatioryhmää (merkitty mnn7-mnnl0). Muiden sienten glykosylaatiomutantteja voidaan eristää käyttämällä tätä mutanttien tunnistamismenetelmää.
11 100408
Vaihtoehtoinen menetelmä on käyttää concanavalin A:n ominaisuuksia, lesitiinin, jolla on suuri spesifisyys oligosakkari-deihin, joilla on kolme tai useampia mannoosijäännöksiä. Mu-tagenoidut solut ajetaan concanavalin A -pylvään läpi. Solut, jotka osoittavat solun pinnan glykoproteiineja, joilla on vähemmän kuin kolme mannoosijäännöstä, eluoituvat pois sellaisesta pylväästä ja ne voidaan eristää effluentista. Samoin, kolmas menetelmä käsittää glykosylaatiomutanttien tunnistamista käyttämällä leimattua concanavalin A:ta, joka sitoutuu soluihin, joilla on solun pinnan sellaisia glykoproteiineja, joilla' on enemmän kuin kolme mannoosijäännöstä ja ei-glykosy-laatiomutantteihin, joilla on sellaisia glykoproteiineja, joissa on mannoosi-osia kolme tai vähemmän.
Neljäs glykosylaatiomutanttien eristämismenetelmä on viedä isäntäsoluun DNA-konstruktio, joka sisältää sekvenssin, joka koodaa erityssignaalia ja jota seuraa heterologinen geeni tai cNDA, joka koodaa glykoproteiinia, mieluummin sellaista gly-koproteiinia, jonka tiedetään olevan voimakkaasti glykosyloi-tu. Transformoitu isäntäkanta mutagenoidaan ja mutagenoidusta populaatiosta etsitään heterologisen proteiinin, jolla on vähentynyt glykosylaatio, tuottoa.
Edullinen menetelmä mnn9-mutanttien valikoimiseksi tuo mukanaan mnn9-solujen odottamattoman reaktion, kun määritetään proteinaasi B:tä. Lyhyesti, solut, jotka ovat PrB* (solut, joilla on aktiivinen proteinaasi B) kasvatetaan kiinteällä rikkaalla kompleksialustalla (kemiallisesti määrittelemätön) sisältäen typpilähteen, epäorgaanisia suoloja, vitamiineja, hiililähteen ja osmoottisen stabilisaattorin, tai selektoi-vissa olosuhteissa kiinteällä synteettisellä alustalla, johon on lisätty osmoottinen stabilisaattori. Kiinteisiin alustoihin kuuluvat sellaiset, jotka sisältävät agaroosia, gelatiinia tai samankaltaisia tekijöitä. Erityisen edullinen kompleksinen rikas alusta on YEPDS (2 % hiiva-ekstrakti, 1 % pep-toni, 2 % glukoosi, 1 M sorbitoli). Rikkaalla kompleksialus- 12 100408 talla kasvaneet pesäkkeet tehdään läpäiseviksi sferoplastoi-malla tai asettamalla alttiiksi liuottimen kaasuille, jotka vaikuttavat membraaneihin aiheuttamatta laajempaa lyysiä. Sopivia liuottimia ovat tolueeni, kloroformi tai muut samankaltaiset liuottimet, jotka yleisesti tunnetaan. Pesäkkeet, jotka ovat kasvaneet synteettisellä alustalla, ovat joko kasvaneet tai siirrostetut suodattimille (synteettisen alustan alhaisen pH:n kompensoimiseksi), kuten nitroselluloosasuodatti-met tai suodatinpaperit, ja lyyeatut asettamalla suodattimet alttiiksi zymolyaasi1le tai mieluummin upottamalla nestetyppeen. Pesäkkeet, jotka ovat kasvaneet tai siirrostetut pape-rieuodattimille voidaan tehdä läpäiseviksi asettamalla alttiiksi liuottimen kaasuille. Suodattimet asetetaan sitten kiinteälle rikkaalle alustalle. Läpäiseviksi tehdyt pesäkkeet peitetään sitten top-agarilla, joka koostuu azocollista, mieluummin noin 10 mg/ml top-agaria pH:n ollessa suurempi kuin 4,0 ja vähemmän kuin 7,4, mieluummin noin 7,0. Maljoja inku-o o boidaan 20-40 C:n lämpötilassa, mieluummin 37 C:ssa 5-8 tuntia. Pesäkkeet, jotka ovat Mnn9 -fenotyyppiä, muodostavat kirkastuman eli halon pesäkkeiden ympärille.
mnn7-mnn9-mutantteja käytetään sitten kloonaamaan vastaavia geenejä. Esimerkin vuoksi MNN9-geeni kloonattiin hiiva-DNA-fragmenttien varastosta, nimenomaan hiivan genomisten DNA-fragmenttien varastosta. Tässä keksinnössä tehdään sellaisten DNA-fragmenttien kirjasto, jotka on kloonattu hiiva-E.co1i-vektori1le, esimerkiksi Nasmyth ja Reed'n kuvaaman menetelmän mukaan (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2119-2123.
1980). Lyhyesti, tehdään genominen hiiva-DNA ja pilkotaan . osittain sopivalla restriktioentsyymillä sellaisten fragment tien tuottamiseksi, jotka ovat noin 5-20kb. Suositut entsyymit ovat neljän emäksen pilkkojia kuten Sau 3A. Tuotetut fragmentit ligoidaan sitten sopivaan hiiva/E.coli shuttle-vekto-riin, joka on linearieoitu sopivalla restriktioentsyymillä.
On parempi defoeforyloida linearieoitu vektori resirkulaation estämiseksi. Sopivia vektoreita ovat YEpl3 (Broach et. ai.,
Il 100408 13
Gene 8.:121-133, 1979), YRp7 (Stinchcomb et al . , Nature 275 39-45, 1979), pJDB2l9 ja pJDB248 (Beggs, Nature 275:104-108.
1978), YCp50 <Kuo ja Campbell, Mol. Cell. Biol. 2:1730-1737, 1983) ja niiden johdannaiset. Tällaisilla vektoreilla on yleensä selektiomarkkeri. Selektiomarkkereihin voi kuulua mikä tahansa dominoiva markkeri, jonka selektoimiseksi on menetelmä. Sellaisia selektoivia markkereita voi olla ravintomarkke-ri, esimerkiksi, LEU2, joka sallii selektion sellaisessa isännässä, jolla on leu2-mutaatio, tai antibioottiresistenssiä koodaava geeni, esimerkiksi kloramfenikolitransasetylaasi (CAT), joka antaa soluille kyvyn kasvaa kloramfenikolin läsnäollessa. Vaihtoehtoisesti "olennainen geeni" voi olla se-lektoivana markkerina (Kawasaki ja Bell, EP-171 142), esimerkiksi Schizoeaccharomyces pombe'n POTl-geeni, joka komplemen-toi tpi 1-mutaation leantäsolussa, sallien solujen kasvaa glukoosin läsnäollessa. On edullista transformoida ligaatioseos E.coli-kantaa, esimerkiksi PR1 (Bolivar et ai., Gene 2;95-113, 1977), hiivan DNA-fragmenttikirjaston lisäämiseksi. Hii va t r ane f ormant t i en selektion helpottamiseksi, plasmidi-DNA tehdään E.coli-transformanttikirjastoeta ja viedään hii-vasoluihin, jotka ovat genotyypiltään mnn9 ja niillä voi olla geneettinen virhe, jonka voi komplementoida hiiva/E. coli -shuttle-vektorilla oleva sopiva markkeri. Trans formanttipe-säkkeet selektoidaan sopivalla selektiomenetelmällä, jolla • nähdään isäntäeolun plasmidi. Transformanteista valikoidaan mnn9 vajavaisuuden komplementaatiota. Valikoimismenetelmiin saattaa sisältyä vasta-aineiden, jotka ovat villityypin hiivasolujen mannooei-osia vastaan, käyttäminen ja mutanttien hii1ihydraattisisä11on määrittäminen. Edullinen menetelmä , mnn9-mutaation kömpiementaation etsimiseksi käyttää edellä ku vattua proteinaasi B-määritystä. Pesäkkeet, joissa on kloonattu MNN9-geeni, tunnistetaan kirkastuman eli halon puuttumisesta .
-- τ’- 100408 14 MNN9-geenikloonien voidaan varmistaa olevan plasmidisyntyisiä, verrattuna revertantteihin, testaamalla plamidin katoamista. Plaemidin katoaminen saadaan aikaan kasvattamalla hiivasoluja ei-selaktoiviesa olosuhteises, jotta nähtäisiin, katoaako Mnn -fenotyyppi plaemidin katoamisen myötä. Positiivisten kloonien DNA eristettiin tunnetuilla menetelmillä (esimerkiksi Harting et ai.. Mol. Cell. Biol. 6:1206-1224, 19Θ6). Restriktiokartoitus voidaan suorittaa, jotta määritettäisiin pienin genomi-insertiofragmetti, jota tarvitaan komplementoi-maan mnn9-vajavaisuutta.
cDNA:ta vastaavat geenit, jotka koodaavat MNN7:ää, MNN8:aa ja MNN10:tä voidaan kloonata käyttämällä hiiva-DNA-fragmenttien kirjastoa kuten kuvattu edellä komplementoimaan isäntäsolun geneettinen vajavaisuus MNN7:ssä, MNN8:ssa ja MNN10:ssä vastaavasti. Kuitenkin, edullinen entsintämenetelmä, jota käytetään tunnistamaan MNN9-geeniklooneja ei saata sopia yhtä hyvin tunnistamaan MNN7-, MNN8- tai MNNlO-geeniklooneja. Tässä tapauksessa, edulliset etsintämenetelmät sisältävät sellaisten vasta-aineiden käytön, jotka on kohdistettu villityypin oligosakkaridi-osia vastaan ja oligosakkaridi määrän määrittämisen (kuten kuvattu Ballou'sea, ibid., 1970 ja Ballou'ssa, ibid., 1980). Positiiviset kloonit voidaan lisäksi luonnehtia kuten kuvattiin MNN9-geenikloonille.
Tämän keksinnön mukaan ulomman ketjun lisäämistä voidaan kontrolloida käyttämällä säädeltävää promoottoria ohjaamaan kloonattujen MNN7-, MNN8-, MNN9- tai MNN10-geenien ekspressiota. Solut, joilla on mnn7-mnnl0-fenotyyppi, kasvavat hitaasti ja ovat poikkeuksellisen herkkiä solulyysaukselle osmoottisen tuen puuttuessa. Näiden geenien säädelty ekspressio aktiivisen solukasvun aikana sallii solujen kasvaa villityypin tavalla ja niillä on villityypin glykoproteiinien glykosylaa-tio ja eoluseinäkomponentit. Säädeltävä promoottori katkaistaan pois päältä, jolloin sallitaan heterologisen proteiinin tai polypeptidin, jolla on vain ydinglykosylaatio, tuottaminen .
100408 15
Ekspressioyksikkö, joka sisältää säädeltävän promoottorin, joka on sulautunut yhteen MNN-geenin kanssa, saattaa olla plaemidisyntyinen, missä tapauksessa ekspressioyksikkö komp-lementoi vastaavan mnn-mutaation isäntäkannaesa. Vaihtoehtoisesti ekspressioyksikkö saattaa olla integroitunut isännän genomiin.
Säädeltävien promoottorien käyttö ohjaamaan sekä heterologi-sen että homologisen DNA:n ekspressiota hiivassa tunnetaan. Sellaisten sekvenssien säätely havainnollistetaan käyttämällä mitä tahansa lukuisista säädeltävistä promoottoreista. Edullisia säädeltäviä promoottoreita käytettäväksi tässä keksinnössä ovat ADH2-promoottori (Young et ai., teoksessa Genetic
Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et c ai., toim., New York, Plenum, s. 335, 1982) ja ADH2-R -promoottori (Russell et ai., Nature 304:652-654. 1983).
Erityisen edullinen promoottori on MFO(l-promoottori (Kurjan ja Herekowitz, Cell .30:933-943, 1982). Muita erityisen edullisia promoottoreita ovat SXR-promoottorit (kuvattu rinnakkaisessa US-patenttihakemus järjestysnumero 889 100, johon tässä viitataan kokonaisuudessaan), jotka yhdistävät yhden tai useamman risteytymistyyppiä säätelevän tekijän ja konstitutiivisen promoottorin (esim. TP I1-promoottori) .
Risteytymistyyppiä sääteleviä tekijöitä voidaan eristää hiiva-geenien ylävirran alueilta, joita tekijöitä ekspressoidaan risteytymistyypille spesifisellä tavalla tai konstruoidaan de novo ja joiden pituus on yleensä noin 20 emäsparista noin 32 emäspariin. Tämän tyyppisiä promoottoreita käytetään hiiva-kannoissa, joissa on konditionaalinen mutaatio geenissä, jota tarvitaan hiljaisen risteytymistyypinlokusten ekspreeeioon. Ilmaisun "konditionaalinen mutaatio" ymmärretään tarkoittavan mutaatiota geenissä, joka mutaatio johtaa aktiivisen geeni-tuotteen vähenemiseen tai puuttumiseen yhdenlaisissa ympäristöllisissä olosuhteissa ja aktiivisen geenituotteen normaaliin 15 100408 tasoon (vi11ityyppi) erilaisissa ympäristöllisissä olosuhteissa. Yleisimmät konditionaaliset mutaatiot ovat lämpötila-®ensitiiviset mutaatiot. Lämpötilasensitiiviset mutaatiot Geeneissä, joita tarvitaan hiljaisen risteytymistyypinlokusten depressioon mukaanlukien sirl-, sir2-, sir3- ja sir4-mutaa-tiot. Lämpötilasensitiivinen mutaatio sir3-8 on erityisen e<3ul 1 inen .
8ir3-8-mutaatio (tunnettu myös ste8:na, Hartwell, J. Cell.
Siol. 85.:811, 1980) on lämpöt i lasens it i ivinen mutaatio, jo- ka estää informaation ekspreseoitumisen HML- ja HMR-lokuksis-o o ®a 25 C:ssa, kun taas 35 C:eea näiden lokusten ekspressio ei ole estynyt ja informaatio ekspressoidaan HML- ja HMR-lokuk-®issa. Rieteytymistyyppiä säätelevät tekijät, joita käytetään ^XR-promoottoreissa, ovat johdetut STE2-geenistä. Nämä tekijät, sijoitettuna promoottoriin, säätelevät kiinnostuksen kohteena olevan geenin ekspressiota riippuen aktiivisen SIR3-9eenituotteen läsnäolosta tai puuttumisesta.
Tässä keksinnössä käytetyillä hiivaisäntäkannoi1la on geneettinen virhe MNN7-, MNN8-, MNN9- tai MNN1O-geeneissä, mikä johtaa solun kyvyttömyyteen lisätä ulomman ketjun oligosakkarideja. Tämä virhe saattaa olla, esimerkiksi, mnn9-mutaatio kuten Ballou et ai. ovat kuvanneet (ibid., 1980) tai, mieluummin geenin hajoaminen, kuten MNN9-geenin hajoaminen. Geenin hajoaminen voi olla luonnollisesti tapahtuva tapahtuma tai in vitro -käsittely, jossa geenin koodieekvenssi on katkaistu, johtaen joko inaktiivisen geenituotteen tuottamiseen tai ei lainkaan geenituotetta. Hajoaminen voi tapahtua DNA-sekvenssi-insertiona koodaavaan sekvenssiin ja/tai joidenkin tai kaikkien koodaavien sekvenssien deleetiona, josta seuraa, ettei tuoteta proteiinia tai epäkypsä translaation lopetus. Geenin hajoaminen, käsittäen DNA-sekvenss in insertion ja alkuperäisen MNN koodaavan sekvenssin deleetion, ei revertoi-du vi11ityypikei kuten on huomattu mnn-pietemutaatioi11a.
100408 17
Geenihajoamisia voidaan tuottaa pääasiallisesti kuten Roth-stein on kuvannut (teoksessa Methods in Enzymology, Wu et ai., toim., 101 : 202-211 ). Rakennetaan plasmidi, joka sisältää DNA-sekvenseejä, jotka ovat homologisia genomin alueen kanssa, jossa on esimerkiksi MNN9-geeni, mieluummin sisältäen koo-daavan sekvenssin ja kloonatun MNN9-geenin sekä 5' että 3' päällekkäiset sekvenssit. Sekvenssi, joka koodaa MNN9-gee-niä, katkaistaan mieluummin viemällä selektoiva markkeri.
Tämä selektoiva markkeri voi katkaista geenin koodaavan sekvenssin, tai se voi korvata jonkin tai geenin koko koodaavan sekvenssin. Selektoiva markkeri voi olla yksi lukuisista geeneistä, joilla on sellainen dominoiva fenotyyppi, jota varten on fenotyypin määritys, jolla tehdään mahdolliseksi deleetio-mutanttien selektio. Suositut selektiomarkkerit ovat sellai-sia, jotka voivat komplementoida isäntäsolun auksotrofiaa, antavat antibioottiresistenssin tai tekevät mahdolliseksi solun käyttää spesifisiä hiililähteitä, käsittäen URA3:n (Botstein et ai., Gene 8:17, 1979), LEU2:n (Broach et ai., ibid.) ja HIS3:n (Struhl et ai., ibid.). URA3-markkeri on erityisen edullinen. Muita sopivia selektoivia markkereita ovat CAT-geeni, joka antaa hiivasoluille kloramfenikoliresis-tensein, tai IacZ-geeni, joka johtaa sinisiin pesäkkeisiin johtuen aktiivisen ^-galaktosidaasin ekspressiosta. Lineaariset DNA-f ragmen111, jotka sisältävät hajotetun MNN-geenin, joka on mieluummin eritetty vektoritragmenteista, viedään isäntäsoluun käyttämällä kirjallisuudessa hyvin tunnettuja menetelmiä (esim. Begga, ibid.). Hiivaisäntäsolu voi olla mikä tahansa lukuisista yleiaesti saatavilla olevista isäntäso-luista, esimerkiksi American Type Culture Collection'sta, Rockville, Md. tai Yeast Stock Center'stä, Berkeley, Kalifornia. Isäntäsolussa voi olla geneettinen virhe, jonka voi komplementoida selektiivinen markkeri, jota käytetään katkaisemaan MNN koodaava sekvenssi. Sopivia hiivakantoja ovat SEY2101 (MATa-ade2-101 leu2-3,112 ura3-52 suc2~A9 gal2) tai ZY100 (MATa-ade2-101 leu2-3,112 ura3-52 suc2-Ä9 gal2Apep4::-CAT). Lineaaristen fragmenttien, jotka sisältävät selektoivat 18 100408 markkerit, integraatio osoitetaan selektiolla tai etsimällä käyttäen domioivaa markkeria ja todistetaan, esimerkiksi Southern-.analyysillä (Southern, J. Mol. Biol. 96:503-517, 1975) ja fenot.yyppitestillä .
On parempi, että isäntäsolulla on vajavaisuus MNNl-geenissä yhtä hyvin kuin vajavaisuus MNN7-, MNN8-, MNN9- tai MNN10-gee-neissä. Vajavaisuus MNNl-geenissä eliminoi terminaalisen OCl->3-sidotun mannoosin kaikissa solun N-eidotuissa glykopro-teiineissa (katso Ballou, ibid., 1982). Tämä mutaatio yhdessä, esimerkiksi, mnn9-mutaation kanssa sallii isäntäsolujen tuottaa glykoproteiineja, joilla on modifioidut ydino1igosak-karidirakenteet, joissa on 9 tai 10 mannoosi-osaa. mnnl-mu-taatio voidaan viedä mnn9-kantaan, mieluummin kantaan, jolla on mnn9-geenin hajoaminen, risteyttämällä se halutun kannan kanssa tai mieluummin katkaisemalla MNNl-geeni kannassa, jossa on mnn9-hajoaminen. MNNl-geenin katkaisemiseksi se täytyy ensin kloonata. MNNl-geeni voidaan kloonata kuten on kuvattu aikaisemmin, käyttämällä hiiva-DNA-fragmettien kirjastoa sopivassa hiiva-ehuttle-vektorissa. On parempi amplifioida kirjasto transfoimalla se ensin E.coli-isäntään, mieluummin RRl-kantaan. Eristetään DNA transformoidusta E.coli:sta ja se transformoidaan hiivaisäntään, joka on mnnl ja jolla saattaa olla geneettinen vajavaisuus, jonka komplementoi hiiva/E.coli-shuttle-vektorilla oleva selektoiva markkeri. MNNl-geenikiOonien tunnistamisen helpottamiseksi transformantit selektoidaan ensin sen toteamiseksi, onko isäntäsolussa plasmidia. Sitten traneformanteieta etsitään sellaiset, jotka komplementoivat mnnl-va javaisuutta . mnnl -.n komplementoimiseksi käytetyt et-sintämenetelmät sisältävät vasta-aineiden käyttämisen, jotka on osoitettu joko villityypin oligosakkaridiosia tai mnnl-so-luissa olevia oligosakkaridiosia vastaan, tunnistamaan trane-formantit, joilla on DNA-sekvenssi, joka antaa isäntäsolulle Mnnl+ -fenotyypin kuvannut Ballou, ibid., 1970 ja Ballou, ibid., 1982). Suosittu menetelmä sellaisten transformanttien etsimiseksi, jotka komplementoivat MNNl:tä, on vasta-ainei-
II
100408 19 den käyttäminen villityypin solujen terminaalisia o<l-^3-si-toutuneita mannoosiyksiköitä vastaan tunnistamaan positiiviset kloonit. MNNl-geenikloonien voidaan varmistaa olevan plasmi-disyntyisiä testaamalla plasmidin katoaminen kytkeytyneenä mnnl+ -fenotyypin katoamiseen kuten on kuvattu aikaisemmin. Restriktiokartoitus voidaan suorittaa määrittämään genomi-insertion pienin fragmentti, jota tarvitaan komplementoimaan mnn1-vajavaisuutta. Kloonatun geenin DNA—sekvenssi voidaan myös määrittää.
Edullisessa suoritusmuodossa hiivaisäntäsolulla, jolla on geneettinen vajavaisuus MNN7:ssä, MNN8:ssa, MNN9:ssä tai MNN10:ssä, on myös konditionaalinen mutaatio geenissä, jota tarvitaan hiljaisen risteytymistyypinlokusten ekspressioon.
Näissä geeneissä olevat mutaatiot sallivat sellaisten promoottorien käytön, joilla on risteytymistyyppiä sääteleviä tekijöitä kuten kuvattu edellä. Erityisen sopiva konditionaalinen mutantti on sir3-8. Hiivakantoja, joilla on sellaisia virheitä kuin sir3-8, on yleisesti saatavilla, kuten Yeast Genetic Stock Center'sta, Berkeley, Kalif., tai niitä voidaan valmistaa käyttämällä mutaation ja selektion stan-darditekiikkoja. sir3-8-mutaatio voidaan viedä kantaan, jolla on geneettinen vajavaisuus MNN7:ssä, MNN8:ssa, MNN9:ssä tai MNN10:ssä risteyttämällä tai käyttämällä mutaation ja selektion standardimenetelmiä. Heterologieen proteiinin tuoton optimoimiseksi on edullista, että isäntäsolulla on mutaatio, kuten pep4-mutaatio (Jones, Genetics .85:23-33, 1977), joka johtaa vähentyneeseen proteolyyttiseen aktiivisuuteen.
Kuten on huomautettu edellä, säädeltävää MNN7-, MNN8-, MNN9-tai MNN10—ekspressioyksikköä, joko plasmidisyntyinen tai integroitunut, käytetään yhdessä toisen DNA—konstruktion kanssa, joka sisältää toisen promoottorin ja erityesignaalia koodaavan sekvenssin liittyneenä heterologiseen geeniin tai kiinnostavaan cDNA:hän. Keksinnön edullinen suoritusmuoto on käyttää säädeltävää promoottoria — joka on erilainen kuin se toinen 20 1 0 0 4 0 8 promoottori, joka ohjaa kloonatun-MNN-geenin ekspressiota jonka käyttö antaa kyvyn vaihdella heterologisen + yeerun t>s 1 cDHA:n ekspressiota estämään sellaisen proteiinituotteen tuottamista, jolla on ulomman ketjun oligosakkaridioeia Edullisia erityssignaaleja ovat hiivageeneistä ΜΡ«1 (Kurjan et ai., US-patentti no 4 546 082; Singh, EP-123 544), PH05 (Beck et ai., WO 86/00637), SUC 2 (Carlson et ai.. Mol. Cell Biol 3.:439-447, 1983), ja BARI (MacKay et ai., US-patentti no 4 613 572; MacKay, WO 87/02670) johdetut.
Ekspressioykeikkö, joka sisältää heterologisen geenin tai kiinnostuksen kohteena olevan cDNA:n, voi olla samalla plas-midilla kuin plasmidisyntyinen säädeltävä MNN-ekspressio-yksikkö ja myöhemmin transformoitu isäntäsoluun. Vaihtoehtoisesti ekspressioykeikkö, joka sisältää heterologisen geenin tai cDNA:n voi olla eri plasmidilla tai integroituneena isäntägenomiin. Integraatio on rekombinaatiotapahtuma, joka tapahtuu homologisessa kohdassa ja johtaa DNA-sekvenssin in-sertioon tähän paikkaan. Näitä ekspressioyksiköitä voidaan käyttää millaisena tahansa yhdistelmänä plaemidisyntyisen tai integroituneen säädeltävän geenin kanssa. Nämä yhdistelmät sallivat MNN-geenin normaalin ekspression ja heikentymättömän solukaevun solujen eksponentiaalisen kasvufaaein aikana ja normaalin glykoproteiinisyntees in. Edullisessa suoritusmuodossa aktiivisen solukaevun aikana kasvuston kasvuolosuhteita säädellään, jotta estettäisiin heterologisen geenin ekspres-soituminen. Kun solut saavuttavat optimaalisen tiheyden, kasvatusolosuhteita muutetaan selektiivisesti, ja silla tavalla estetään MNN-geenin ekspressoituminen ja sallitaan heterologisen proteiinituotteen, jolla on modifioitu ydinglykosylaa-tio, synteesi. Heterologiset proteiinit ja polypeptldit, joita voidaan tuottaa tämän keksinnön mukaan, sisältävät kasvutekijöitä. (Esim. verihiutaleen kasvutekijöitä), kudosplasmmo-geeniaktivaattori , urokinaasi, immunoglobuliimt , plasmmo-geeni, trombiini, tekijä XIII ja niiden analogit.
Il 100408 21 Tämän keksinnön mukaan toinen menetelmä, joka kontrolloi ulomman ketjun oligosakkaridien lisäämistä eritye-ohjattuihin glykoproteiineihin, sisältää ainutlaatuisen ja odottamattoman mnn9-hajoamismutantin eristämisen. Tämä mutantti toimii hiiva-isäntänä, joka kykenee tuottamaan heterologisia glykoproteii-neja, joilla on modifioitu ydin-oligosakkaridi ilman, että kasvuolosuhteita tarvitsee manipuloida. mnn9-hajoaminen tehtiin kuten aikaisemmin kuvattiin. Lyhyesti DNA-konstruktio, joka sisältää MNN9 koodaavan sekvenssin, joka on hajotettu selektoivalla markkerilla (URA3-geenillä>, vietiin SEY2101-kantaan. Transformanteieta selektoitiin sellaiset, jotka pystyivät kasvamaan synteettisellä alustalla, jolta puuttuu uraeiili. Transformanteieta määritettiin Mnn9 -fenotyypin läsnäolo. Tehtiin Southern-analyysi MNN9-geenin hajoamisen varmistamiseksi. Tunnistettiin positiivinen klooni, jolla oli URA3-markkeri ja Mnn9 -fenotyyppi ja antoi kuvion Southern-analyysissä (Southern, J. Mol. Biol . 9§_: 503-517, 1975) osoittaen, että MNN9-geeni on vahingoittumaton. Tästä kannasta johdetun genomisen DNA:n “puised-f ie Id"-gee1ielektroforeesi (Southern et ai,, Nuc . Acide Ree . 1.5:5925-5943, 1987) on osoittanut, että mnn9-hajoamisisolaati1la on kromosomiaber-raatio ainakin kormosomeissa V ja VIII. Kanta, jota merkitään ZY300 (ATCC no 20870) kasvaa nopeammin kuin Ballou'n eristämä mnn9-pistemutaatio (ibid., 1980) tai muut vahvistetut mnn9-* deleetiokannat. Kannan analyysi osoittaa, että se ilmeisesti pystyy kasvamaan ilman osmoottista tukea. Tämän kannan trans-formointi tietyillä hiivaplasmidei11a (esim. YEpl3), jolla on REP3 ja replikaation aloitus, mutta ei REPI tai REP2, on osoittanut, että plasmidit ovat epästabiileja johtuen 2 mikronin plaemidi-variantista, joka on emäkannassa. Hiivavekto-rit, joilla on REPI, REP2, REP3 ja replikaation aloitus tai jotka käyttävät sentromeerifragmenttia ja replikaation aloitusta, ovat stabiileja kannassa. On edullista parantaa kannan 2 mikronin plasmidivariantti ja korvata se villityypin 2-mik-ronin plasmidilla, jolloin kanta voi käyttää YEpl3-tyyppisiä hiivavektoreita.
10G408 22
Vieraan proteiinin tuottamiseksi DNA-konstruktio, joka koostuu promoottorista ja erityssignaalia koodaavasta sekvenssistä, jota seuraa kiinnostuksen kohteena olevaa polypeptidiä tai proteiinia koodaava sekvenssi, viedään ZY300-kantaan. Promoottori voi olla säädelty tai konstitutiivinen promoottori. Saadut proteiinit ovat luonteeltaan homogeenisiä ja niiltä puuttuu hiivojen tunnusomainen hyperglykosylaatio. On edullista viedä ZY300:aan sekä pep4-hajoaminen että mnnl-ha-joaminen. Näiden kloonattujen geenien hajottamiset tapahtuvat samalla lailla kuin aikaisemmin kuvatut geenien hajottamiset.
Sienten transformaatiotekniikat ovat kirjallisuudessa hyvin tunnettuja ja niitä on kuvannut esimerkiksi Beggs (ibid.),
Hinnen et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929-10¾¾ 1978), Russell (Nature 301 : 167-169. 1983) ja Yelton et ai.
(Proc. Nat 1. Acad. Sei. USA 81:1740-1747 r 1984). Isäntäkan-noilla voi olla geneettisiä virheitä geeneissä, joita komple-mentoi vektorilla oleva selektoiva markkeri. Sellaisia geneettisiä virheitä ovat ravintoauksotrofiät, esimerkiksi leu2, jonka voi komplementoida LEU2-geeni ja hiililähteen käyttöön tarvittavien geenien virheet, esimerkiksi tpil, jonka voi komplementoida Schizosaccharomyces pombe'n POTl-geeni. Tietyn isännän ja selektiomarkkerin valinta kuuluu hyvinkin tavanomaisiin taitoihin.
Tämän keksinnön mukaan tuotetut proteiinit voidaan puhdistaa tavanomaisilla menetelmillä. Puhdistettavan spesifisen proteiinin luonne vaikuttaa erityisiin puhdistusprotoko 11iin. Tällainen päättely on tavanomaista taitoa. Yleisesti, solujen kasvatusalusta erotetaan soluista ja proteiini eristetään alustasta. Hyödyllisiä eritystekniikkoja on seostaminen, im-munoadsorptio ja fraktiointi tai erilaiset kromatografiset menetelmät.
11.
10G4Q8 23
Es imerkke iä
Esimerkki 1: S. cerevisiae MNN9-geenin kloonaaminen.
Taulukko 1
Hi ivagenotyypit LB347-1C MAW mnn9 gal2 ZA447 MATa leu2-3, 112 barl-1 gal2 ura3 XV732-1-9A ΜΑΈΧ leu2-3, 112 ura3 mnn9 gal2 XP660-2A MATa leu2-3, 112 barl-1 trpl gal2 XCY1-5D MATa leu2-3, 112 ura3 trpl mnn9 SEY2101 MATa leu2-3, 112 ade2-101 ura3-52 suc2-4l9
gal2 ^PeP4::CAT
ZY100 MATa leu2-3, 112 ade2-101 ura3-52 suc2-Ä9
gal2 Δρβρ4::CAT
ZY300 MATa leu2-3, 112 ade2-101 ura3-52 suc2-&9 gal2 mnn9::URA3::t1-1 ZY400 MATa leu2-3, 112 ade2-101 ura3-52 euc2-£9 ga 12 Δρβρ4 : : CAT Δπιηηθ : : URA3 301G-59a MATa eir3-8 SUP4-3 ade2-l his4-580 lys2 trpl-1 tyri cryl A2 MATc< 1 eu2-3, 112 his3-ll,15 canl 24 100408 XL1-4B MATa leu2-3, 112 trpl-1 ade2-l lys2 eir3-8 XCY15-3C MAW ade2-l leu2-3, 112 Z)mnn9 : : URA3 XCY42-28B MATa sir3-8 mnn9::URA3 leu2-3, 112
trpl-1 ade2-l lye2 pep4: : CAT
LB1-22D MAW mnnl gal2 SUC2 mal CUP1 A. Kannan XCY1-5D rakentaminen S. cerevisiae-kanta, jolla on mnn9-mutaatio ja geneettiset virheet URA3- LEU2- ja TRP1-geeneissä, rakennettiin käyttämällä emäkantoja, jotka on lueteltu taulukossa. Geneettiset menetelmät ja alustat ovat yleisesti tunnettuja. (Katso esimerkiksi: R.K. Mortimer ja D.C. Hawthorne, teoksessa Yeast Genetics, A.H. Rose ja J.S. Harrison toim., London: Academic Press, Inc., Ltd., s. 385-460; ja Hartig et ai., ibid.). LB347-lC-kanta (Tsai et ai., J. Biol. Chem. 259:3805-3811 .
1984) risteytettiin ZA447:n kanssa. Tsygootit eristettiin rieteytymieseoksesta diploidien eristämiseksi. Diploidi pesäke, jota merkittiin XV732, sporuloitiin ja leikeltiin. Itiöiden tetradianalyysi osoitti 2:2-segregaation pienille pesäkkeille, kun itiöt kasvoivat alustalla ilman osmoottista sta-bilisaatiota. (Pieni pesäkekoko ei-osmoottieesti stabilisoidulla alustalla korreloi mnn9-geenin paikalla olon kanssa.)
Itiö, josta kehittyi hyvin pieni pesäke ja jolla oli leusiini-ja urasiiliauksotrofia, valittiin ja sitä merkittiin XV732-1-9-A. Tämä itiö risteytettiin XP660-2A:n kanssa. Diploidit valittiin minimaalialustalla (Taulukko 2), johon oli lisätty 8 mg/1 leusiinia, jotta saataisiin diploidi XCY1. XCY1 sporu-loitiin ja leikeltiin. Itiöille suoritettiin tetradianalyysi. Itiö XCY1-5D (MATc(mnn9 leu2-3 leu2-112 trpl ura3 gall) valittiin isännäksi MNN9-geenin kloonaamiseksi.
Il 25 1 0 0 4 0 8
Taulukko 2 MinD
20 g glukoosi 6.7 g Yest Nitrogen Base ilman aminohappoja <Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 18 g agar
Sekoita kaikki ainekset tislattuun veteen. Lisää tislattua vettä niin, että lopputilavuus on 1 litra. Autoklavoi 15 minuuttia. Vala maljat ja anna jähmettyä.
-LeuDS-maliät 20 g glukoosi 6.7 g Yeast Nitrogen Base ilman aminohappoja (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 40 mg adeniini 30 mg L-arginiini 50 mg L-aspartaatti 20 mg L-hietidiini, vapaa emäs 60 mg L-isoleusiini 40 mg L-lysiini-monohydrokloridi 20 mg L-metioniini 60 mg L-fenyylialaniini 50 mg L-seriini 50 mg L-tyroeiini 40 mg urasiili . 60 mg L-valiini 60,75 mg sorbitoli 18 g agar
Sekoita kaikki ainekset tislattuun veteen. Lisää tislattua vettä niin, että lopputilavuus on 1 litra. Autoklavoi 15 minuuttia. Autoklavoinnin jälkeen lisää 150 mg L-treoniinia ja 40 mg L-tryptofaania. Vala maljat ja anna jähmettyä.
Käytä -LeuDS-maljojen ohjetta, mutta jätä agar pois.
26 100408
-LeuDS
-LeuD-ma1 iät Käytä -LeuDS-maljojen ohjetta, mutta jätä sorbitoli pois.
-LeuD
Käytä -LeuDS-maljojen ohjetta, mutta jätä sorbitoli ja agar pois .
-TrpDS-ma1 iät 20 g glukoosi 6,7 g Yeast Nitrogen Base ilman aminohappoja (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 40 mg adeniini 30 mg L-arginiini 50 mg L-aspartaatti 20 mg histidiini, vapaa emäs 60 mg L-isoleusiini 80 mg L-leusiini 40 mg L-lyeiini-monohydrokloridi 20 mg L-metioniini 60 mg L-fenyylialaniini 50 mg L-seriini 50 mg L-tyrosiini : 40 mg urasiili 60 mg L-valiini 60,75 g sorbitoli 18 g agar 100408 27
Sekoita kaikki ainekset tislattuun veteen. Lisää tislattua vettä niin, että lopputilavuus on 1 litra. Autoklavoi 15 minuuttia. Lisää autoklavoinnin jälkeen 150 mg L-treoniinia.
Vala maljat ja anna jähmettyä.
-ΤγρΡ Käytä -TrpDSrn ohjetta, mutta jätä sorbitoli ja agar pois. YEPDS-maliät 20 g glukoosi 10 g Bacto-peptoni (Difco) 20 g hiivauute (Difco) 60,75 g sorbitoli
Sekoita kaikki ainekset tislattuun veteen. Lisää tislattua vettä niin, että kokonaistilavuus on 1 litra. Autoklavoi 25 minuuttia. Vala maljat ja anna jähmettyä.
YEPDS
Käytä YEPDS-maljojen ohjetta, mutta jätä agar pois.
YEPD-ma1 iät 20 g glukoosi 10 g Bacto-peptoni 20 g hiivauute 18 g agar
Sekoita kaikki ainekset tislattuun veteen. Lisää tislattua vettä niin, että kokonaistilavuus on 1 litra. Autoklavoi 25 minuuttia. Vala maljat ja anna jähmettyä.
Käytä YEPD-maljojen ohjetta, mutta jätä pois agar.
28 100408
YEPP
-UraDS-maliät 20 g glukoosi 6,7 g Yeast Nitrogen Base ilman aminohappoja (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 40 mg adeniini 30 mg L-arginiini 50 mg L-aspartaatti 20 mg L-histidiini, vapaa emäs 60 mg L-isoleusiini Θ0 mg L-leusiini 40 mg L-lysiini-monohydrokloridi 20 mg L-metioniini 60 mg L-fenyy1ialaniini 50 mg L-seriini 50 mg L-tyrosiini 60 mg L-valiini 60,75 g sorbitoli 18 g agar
Sekoita kaikki ainekset tislattuun veteen. Lisää tislattua vettä niin, että lopputilavuue on 1 litra. Autoklavoi 15 minuuttia. Lisää autoklavoinnin jälkeen 150 mg L-treoniinia ja 40 mg L-tryptofaania.
; -Leu-TrnDS
20 g glukoosi 6 j 7 g Yeast Nitrogen Base ilman aminohappoja (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 40 mg adeniini 30 mg L-arginiini 100408 29 50 mg L-aepartaatti 20 mg L-hietidiini, vapaa emäs 60 mg L-isoleueiini 40 mg L-lysiini-monohydrokloridi 29 mg L-metioniini 60 mg L-fenyylialaniini 50 mg L-eeriini 50 mg L-tyroeiini 40 mg urasiili 60 mg L-valiini 60,75 g sorbitoli 18 g agar
Sekoita kaikki ainekset tislattuun veteen. Lisää tislattua vettä niin, että lopputilavuus on 1 litra. Autoklavoi 15 minuuttia. Lisää autoklavoinnin jälkeen 150 mg L-treoniinia.
Vala maljat ja anna jähmettyä.
M9 + CA + amp + W
6 g Na2HP04 H20 3 g KH2P04 0,5 g NaCl 1 g NH4C1 5 g kasaminohappoa 1 ml 1 M MgS04 0,2 ml 0,5 M CaCl2 5 ml 40 % glukoosi 10 ml 1 mg/ml tiamiini B1 ; 2 ml 10 mg/ml L-tryptofaani
Liuota ainekset tislattuun veteen. Lisää tislattua vettä niin, että lopputilavuus on yksi litra. Autoklavoi 25 minuuttia.
Lisää autoklavoinnin jälkeen 100 mg ampisilliinia.
Käytä M< + CA + amp + W)-ohjettaf mutta jätä tryptofaani pois.
30 100408 M9 + CA + amo B. Plaemidin pMlll rakentaminen
Kuten on kuvattu kuviossa 2, sellainen hiiva-shuttle-vektori, jolla on YRp7(Stinchcomb et ai., ibid.)-vektorisekvensei ja hiivasentromeeri CEN3, rakennettiin. 630 emäsparin Bam HI-Sau 3A-fragmentti, jolla on pYe(CEN3)4i:stä johdetut hiivan CEN3 sekvenssit <Clarke ja Carbon, Nature 287:504-509. 1980), ligoitiin pUC8:aan, joka on linearisoitu pilkkomalla Bam-HI:llä ja defosforyloitu bakteerin alkalisella fosfataasi1la. Ligaatioseos transformoitiin E. coli JM83-kantaan. Saaduista transformanteista eristettiin plasmidi-DNA ja leikattiin Bam-HI:llä CEN3-fragmentin osoittamiseksi. Positiiviset kloonit leikattiin Eco Rl :11a ja Bam HI:llä ineertin suunnan osoittamiseksi. Kloonia, jolla oli CEN3-fragmentti oikean suuntaisena, merkittiin ρΜΙΟΙΒ. pMl0lB-plasmidi 1inearisoitiin leikkaamalla Bam HI:llä ja käsiteltiin BNA-polymeraasi I Klenow-fragmentilla kohesiivisten päiden tylpentämiseksi. Linearisoi-tu plasmidi resirkuloitiin. Saatu plasmidi, pM102A, lineari-soitiin leikkaamalla Hinc II:11a ja sitten leikattiin Eco-RI:lla 0,6 kb CEN3-fragmentin eristämiseksi. Hinc II - Eco RI-fragmenttia käsiteltiin DNA-polymeraasi I Klenow-fragmenti1la Eco Rl -kohesiivisen pään täyttämiseksi, jolloin saatiin 0,6 kb fragmentti, jolla oli tylpät päät. pFRT-l-plasmidi, jolla on YRp7, jolla on tuhotulla TRP1-geeni 1lä Eco Rl -paikka 5'-pään ulkopuolella, 1inearisoitiin katkaisemalla Pvu II :11a.
; Lineaarinen pFRT-l-fragmentti ligoitiin 0,6 kb CEN3-fragmen- tin kanssa ja ligaatioseos transformoitiin E. coli RRl-kan-taan. Saaduista traneformanteista eristetty DNA leikattiin Eco RI:lla ineertin paikalla olon varmentamiseksi ja CEN3-in-sertion suunnan määrittämiseksi. (Eräässä suunnassa Eco RI-paikka regeneroidaan ligoimalla Pvu II tylpiksi päiksi.) Saatua plaemidia merkittiin pMlll.
Il 01 100408 C. MNN9-geenin kloonaaminen
Joukkoa hiivakannan Χ21Θ0 (ATCC 26109) genomifragmentteja, jotka on kloonattu pMl11-vektorilie, käytettiin aloitusmateri-aalina MNN9-geenin eristämieekei. Lyhyesti genominen DNA katkaistiin osittain Sau 3A:lla ja saadut genomiset fragmentit kloonattiin pMl11-vektorin Bam HI-paikkaan. Inserttien keskimääräinen koko oli 8 kb.
pmlll:ssä olevan genomisen DNA:n joukko transformoitiin XCY1-5D-kantaan kuten Beggs (Nature 275:104-108. 1978) on kuvannut. Transformanteista selektoitiin sellaiset, jotka kykenivät kasvamaan -TrpDS-maljoilla (Taulukko 2).
Transformanttipesäkkeet reeuspendoitiin ja maljattiin uudelleen käyttämällä MacKay'n kuvaamaa menetelmää (Methods In En-zymology 101:325-343. 1983). Trans formanttipesäkkeet, jotka oli suspendoitu top-agariin, sekoitettiin ja reeuspendoitiin -TrpD:hen (Taulukko 2) + 0,5 M KC1, jotta saataisiin solut vapaiksi top-agarista. Tätä seosta kasvatettiin 2 tuntia o 30 C:ssa ja maljattiin -TrpDS-maljoille. Pesäkkeiden annet- o tiin kasvaa -TrpDS-ma1 joi 1la 30 C:ssa. Pesäkkeet poimittiin alkuperäisille -TrpDS-maljoille hilan muotoon. Alkuperäisten maljojen kopiot tehtiin -TrpDS-ma1 joi 1le ja niiden annettiin ·' kasvaa ennen MNN9-fenotyypin määrittämistä.
Lähes 3 000 positiivista pesäkettä määritettiin MNN9-fenotyypin löytämiseksi käyttämällä seuraavassa osassa D kuvattua menetelmää. Löydettiin 16 pesäkettä, jotka yhdenmukaisesti komplementoivat isäntäkannaeea olevaa mnn9-mutaatiota ja nii-. den kyky tehdä näin liittyi plasmidin läsnäoloon. Plasmidi- DNA eristettiin 16 positiivisestä pesäkkeestä kuten Hartig et ai. ovat kuvanneet (Mol. Cell Biol. 6.:2106-2144, 1986) ja transformoitiin E. coli RRl-kantaan. E. coli-transformanteista eristettiin plasmidi-DNA ja sille tehtiin restrik-tioentsyymianalyysi. Viidellätoista plasmideista oli kaksi yhteistä Xba I-paikkaa.
32 100408
Plasmidia, jolla oli pienin insertti, joka antoi Mnn+ -fenotyypin, kun transformoitiin Mnn9-kantoihin, merkittiin pZY23. pZY23-plasmidi sisältää 6 kb hiivan genomisen DNA-insertin pMlll:ssä. Tehtiin alakloonit pZY23:n genomisesta DNA-inser-tistä ja niitä käytettiin transformoimaan XCY1-5D-kanta komp-lementaation tarkistamiseksi. Kuten on kuvattu kuviossa 3, pZY23:n subklooni tehtiin leikkaamalla pZY23 Cla I:llä ja Bgl II:11a, jotta saataisiin eristettyä 3,1 kb:n fragmentti, jolla on MNN9-geeni. Sitten fragmentti ligoitiin pMlll:een, joka oli linearisoitu leikkaamalla Cla I:llä ja Bgl II :11a. Saatu pZY37-plasmidi on tallennettu E. coli RRl-kantana American Type Culture Co11ection'iin (ATCC no 67 550). Kloonatun in-sertin 2,4 kb Bgl II-Sst I-fragmentin havaittiin olevan riittävä komplementaatioon. Tämä fragmentti subkloonattiin pIC19H: h on (Marsh et ai., Gene 32.:481-486, 1984; ATCC 37 408), jo ka oli linearisoitu leikkaamalla Bam HI:llä ja Set I:llä.
Saatua plasmidia merkittiin pZY48 (kuvio 3).
D. Määritysmenetelmät
Pesäkkeiden valmistus:
Sopivasti kasvaneet solut lyysattiin yhdellä kahdesta seuraa-vasta menetelmästä. Esimmäisessä menetelmässä pesäkkeet, jotka olivat kasvaneet YEPDS:ssä (Taulukko 2), käsiteltiin kloroformilla solujen tekemiseksi läpäiseviksi. Maljat käännettiin (5 minuutiksi huoneen lämpötilassa) paperipyyhkei11e, jotka olivat kloroformilla kyllästetyt. Sitten maljat käännettiin oikeinpäin 30 minuutiksi kloroformin haihtumiseksi ennen määritystä .
Toista menetelmää käytettiin pesäkkeille, jotka vaativat selektiivisiä kasvuolosuhteita synteettisellä alustalla plasmi-din säilymiseksi. Pesäkkeet, jotka olivat kasvaneet synteettisellä alustalla + 1 M sorbitoli, siirrostettiin ensin nitro-selluloosasuodattimille (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.).
il 33 100408
Pyöreät nitroeellulooeaeuodattimet laitettiin synteettisellä alustalla + 1 M sorbitolilla kasvaneiden pesäkkeiden päälle, kunnes suodattimet olivat täysin kastuneet. Sitten suodattimet kuorittiin varovasti pois agarin pinnalta ja kastettiin nestetyppeen 30 sekunniksi. Tämä lyysasi solut tehokkaasti. Sitten suodattimet asetettiin solupuoli ylöspäin YEPD-ma1 joi1-le (Taulukko 2) määritystä varten.
Määritysmenetelmä:
Alusta valmistettiin kuten seuraavassa on kuvattu: ma 1jaa kohti: o 2 ml 2 % agar, sulatettu, pidetty 55 C:sea o
1 ml 0,5 M NaH2P04 pH 7,0, 55 C
0,1 ml 20 % natriumdodekyylieulfaatti, 55 C
o
6,4 ml dH20, 55 C
0,5 ml 2 mg/ml sykloheksimidi (Sigma, St. Louis, Mo.) 100 mg azocoll (Sigma)
Azocoll ei liukene. Seos sekoitettiin ja kaadettiin nopt,. , i maljalla tai suodattimena olevien pesäkkeiden peittämieft, ϊ o
Maljoja inkuboitiin 37 C:ssä 5-8 tuntia. Pesäkkeet, joiii * — oli Mnn9 -fenotyyppi, kykenivät hajottamaan pesäkettä yj^p^ röivän azocollin heti, jolloin mnn9-pesäkkeiden ympäril^e tuli kirkas kehä eli halo.
Esimerkki ?· MNN9-geenin hajottaminen MNN9-geenin hajottamiseksi rakennettiin plaemidi, jossa geeni korvasi MNN9-geenissä olevien ainutlaatuisien Hind ij ja Eco Rl-paikkojen välisen koodausalueen kuten on kuvattu kuviossa 3. pl148-plasmidi, jolla on URA3-geeniä koodaava 1,3 kb Hind 11 I-fragmentti (johdettu YEp24:stä; Boteteip ® t ai., Gene 8.:17, 1979) p IC1 9R-plasmidi 1 la , leikattiin Hind -- τ.
100408 34 III:lla ja Xma I:llä 1,1 kb URA3-fragmentin eristämisekai.
Tämä fragmentti ligoitiin pIC19R:ään, joka oli lineariaoitu leikkaamalla Hind III :11a ja Xma I:llä. Saatu plaemidi pZY61 leikattiin Hind III :11a ja Eco Rl :11a 1,1 kb URA3-fragmentin eristämiseksi. pZY48-plasmidi leikattiin Eco Rl :11a ja Sai I:llä MNN9:n 3'-osaa koodaavan 1,2 kb fragmentin eristämiseksi. Fragmentti liitettiin URA3-fragmenttiin ja pUC13:een, joka oli lineariaoitu leikkaamalla Hind III :11a ja Sai I:llä, kolmeosaisella ligaatiolla. Saatu plaemidi, pZY62, leikattiin Hind III:lla ja Sai I:llä sellaisen 2,3 kb fragmentin eristämiseksi, jolla on URA3-geeni sulautunut MNN9-geenin 3'-osan kanssa. pZY48-plasmidi leikattiin Sst I:llä ja Hind III :11a 0,44 kb MNN9-fragmentin eristämiseksi. Tämä fragmentti liitettiin fragmenttiin pZY63:lta ja pUC13:lta, jotka oli linea-risoitu Sst I:llä ja Sai I:llä, kolmeosaisella ligaatiolla. Saadulla plasmidilla pZY63 oli MNN9-geeni, jonka katkaisi URA3-geeni (Kuvio 3).
Genominen MNN9 hajotettiin SEY2101- ja ZYlOO-kannoissa (Taulukko 1) käyttämällä Rothsteinin (ibid.) kuvaamaa menetelmää. pZY63-plasmidi leikattiin Sst I:llä ja Sai I:llä 2,7 kb fragmentin, jolla on URA3-geenillä katkaistu MNN9 koodaavaa alue, eristämiseksi. Tämä fragmentti transformoitiin SEY2101- ja ZYlOO-kantaan. Transformanteista selektoitiin sellaiset, jotka pystyivät kasvamaan -URADS-maljoilla (Taulukko 2). Sitten transformanteista määritettiin Mnn9 -fenotyypin läsnäolo (Esimerkki I.D.), joka indikoi lineaarisen DNA-fragmentin integraatiota MNN9-lokukseen. Positiivisista pesäkkeistä testattiin URA3-markkerin stabiilisuus kasvattamalla ei-selektiivi- sellä alustalla. Positiiviset kloonit ympättiin 5 ml:aan o YEPDS (Taulukko 2) ja kasvatettiin yön yli 30 C:ssa. Yön yli kasvaneet kasvustot laimennettiin 1 /ui 5 ml:aan tuoretta o YEPDS:ää ja kasvatettiin yön yli 30 C:ssa. Seuraavat yön yli kasvaneet kasvustot laimennettiin 1 yul 10 ml:aan 1 M sorbitolia. Kymmenen ^ul seosta lisättynä 100 ^ul:aan 1 M sorbitolia, maljattiin YEPDS-maljoille. Näitä maljoja inkuboitiin 100408 35 o 30 C:eea 24 tuntia. Pesäkkeet replikoitiin -UraDS:lie URA3-markkerin etabii1isuuden testaamiseksi. Kaikki kloonit olivat stabiileja.
Transformanteille tehtiin Southern blot-analyyei integraatio-tapahtuman vahvistamiseksi. Genominen DNA valmistettiin Davis et ai. (Proc. Natl. Acad, Sei. USA M:2432-2436, 1983) kuvaaman menetelmän mukaan ja leikattiin Eco Ritilä ja Set Itllä. Palat ajettiin 0,7 % agaroosi-gee1 ielektroforeesissa ja siirrettiin nitroselluloosasuodattimelle Southern'n kuvaaman menetelmän mukaan (ibid., 1975). Suodatin paikallistettiin pZY48:n 2,3 kb Hind III - Hind III -fragmentilla, jolla on MNN9 koodaava alue (esimerkki I.C.), johon oli viety alukkeita sattumanvaraisesti Amershamin "random priming kit"'Ha (Amersham, Arlington Hts., 111.). ZYlOO-kannan hajoaminen, jota merkitään ZY400, varmistettiin 1,5 ja 1,55 kb leimattujen fragmenttien läsnäololla Southern blot'lla. Eristettiin klooni kannan SEY2101 hajoamisesta, jota merkittiin ZY300 (ATCC no 20 870), joka ei osoittanut geenihajoamieta. Lisäkokeet vahvistivat Mnn9 -fenotyypin läsnäolon.
Suoritettiin “pulsed-field"-geelielektroforeesi (Southern et ai., ibid., 1987) ZY300:sta ja ZY400:sta johdetulle genomi-selle DNA:lie ja niiden emokannoi1le. Genominen DNA valmistettiin käyttämällä menetelmää, joka oli modifioitu Overhauser'n ja Radio'n ilmoittamasta agaroosihelmi-menetelmästä (BRL Focus 9.:8-9, 1987). Lyhyesti, yön yli kasvaneita kasvustoja o kasvatettiin 15 ml:ssa YEPDS:ää 30 C:ssa. Kasvustot sentrifu- . goitiin, supernatantit heitettiin pois ja pelletit resuspen-
doitiin 5 ml:aan SCE:tä (1 M sorbitoli, 0,1 H Na2~eitraatti pH
5,8, 0,01 M Na-,ΕϋΤΑ pH 8,0). Solususpeneiot siirrettiin 50 ml O . ,
Erlenmeyer-pulloihin. 10 ml 55 C:ssa pidettyä paraffiimoljya o ja 1 ml 55 C:ssa pidettyä 2,5 % vähän hyytyvää agaroosia (Sea Plaque Agarose, FMC Corp. Bioproducts, Rockland, Maine) lisättiin joka pulloon. Solumassoja sekoitettiin voimakkaasti vor-
3 G
100408 texilla maksiminopeudella 1 minuutti kunnes saatiin hieno emulsio. Emulsiot jäähdytettiin nopeasti sekoittamalla jääve-sihauteessa. Jäähtymisen jälkeen emulsiot siirrettiin 50 ml polystryeeniputkiin ja 20 ml TE8:aa (10 mM Tris-HCl, 1 mM ED-TA, pH 8,0) lisättiin. Liuoksia sentrifugoitiin 2500 rpm 5 minuuttia, minkä jälkeen paraffiiniöljy ja supernatantit heitettiin pois. Pelletit, joissa oli agaroosihelmet, resuspen-doitiin 30 ml:aan TE8:aa ja setrifugoitiin kuten edellisessä vaiheessa kuvattiin. Supernatantit heitettiin pois ja lisättiin 5 ml s f eropla s t ipuskur ia (2 ml:aa helmiä varten: 3 ml SCE, 2 ml 0,5 M EDTA (pH 9,0), 1 mg zymolyaasi 60 000:ta (Miles, Elkehart, Ind.), 0,25 ml β -merkaptoetanolia (Sigma, St.
o
Louie, Mo.). Liuoksia inkuboitiin 37 C:ssa 1 tunti pyörivällä rummulla, minkä jälkeen liuokset sentrifugoitiin kuten edellä kuvattiin. Supernatantit heitettiin pois ja korvattiin 1 o ml:lla 0,5 M EDTA:ta (pH 9,0) ja varastoitiin 4 C:esa.
Hiivakromosomit eroteltiin pääasiallisesti kuten Southern et ai. (ibid., 1987) ovat kuvanneet. "Pulsed-field"-geelielektro-foreesi l-%:ssa agaroosigeelissä (Seakem Agarose, FMC Corp. Bioproducts, Rockland, Maine) suoritettiin käyttämällä Roto-geeliä (Moonlight Cat Door Company, Seattle, Wash.). Hiiva-DNA tehtiin näkyväksi värjäämällä etidiumbromidi1la. Värjätyn geelin analyysi paljasti, että ZY300-kannassa on tapahtunut kromosomin uudelleen järjestäytymisiä sisältäen ainakin kromosomit V ja VIII. Geelistä tehtiin Southern blot kuten on kuvattu aikaisemmin, ja paikallistettiin ensin pZY48:sta johdetulla 2,3 kb Hind Ill-Hind III MNN9-fragmenti1la ja sitten pll48:sta johdetulla 1,3 kb Hind Ill-Hind III URA3-fragmen-tilla (Esimerkki 2). Koettimet leimattiin käyttämällä Amershamin "random priming kit'ä" (Amersham, Arlington Hts., 111.). Southern blotin tulokset osoittivat, että sekä ZY300: ssa että ZY400:ssä koko MNN9 koodaava alue kartoittui kromosomille XVI (MNN9:n luonnollinen paikka) ja URA3 kartoittui kromosomeille XVI ja V kuten odotettiin.
11 100408 37
Esimerkki 3: Barrierin ekspressio mnn9-deleetio-kannoieea DNA-konstruktio, joka sisältää BARl-geenin, transformoitiin mnn9-deleetiokantoihin, jotka tuotettiin esimerkissä 2, ja iiden emokantoihin Barrier-proteiinin glykosylaation tutkimiseksi. BARl-geenin tuote, Barrier, on uloskuljetettava proteiini, jonka on osoitettu olevan voimakkaasti glykosyloitu. pSW24-plaamidi, joka sisältää ADH1-promoottorin, aineen P C-terminaalisen osan koodaavaan alueeseen sulautuneen BAR1 koodaavan alueen (Munro ja Pelham, EMBO J: 3.:3087-3093, 1984) ja TPI1-terminaattorin, rakennettiin seuraavasti (Kuvio 5). pZV9-plasmidi, joka sisältää koko BAR1 koodaavan alueen ja siihen liittyneet reunusalueet, leikattiin Sai I:llä ja Bam HI:llä 1,3 kb BAR1-fragmentin eristämiseksi. Tämä fragmentti eubkloonattiin Sai I:llä ja Bam HI:llä leikattuun pUC13:een, jotta saataisiin plasmidi, jota merkitään pZV17 (Kuvio 4), pZV17-plaemidi leikattiin Eco Ritilä BARltn koodaavan alueen 3'-pääosin 0,5 kb:n poistamiseksi. Vektori-BARl-fragmentti ligoitiin uudestaan plasmidin, jota merkitään pJH66, luomiseksi, pJH66-plasmidi linearisoitiin Eco Ritilä ja tehtiin tylppäpäiseksi DNA-polymeraasi Itllä (Klenow frag- 5 ' mentti). Kinaasilla käsiteltyjä Bam HI-1inkkerejä ( CCGGATCC-GG ) lisättiin ja linkkerien ylimäärä poistettiin leikkaamalla Bam HI tila ennen religaatiota. Saatua plasmidia merkittiin pSW8. pSW8-plasmidi leikattiin Sai Itllä ja Bam HI: llä 824 emäsparin fragmentin, joka koodaa aminohappoja 252 Barrier 526:een asti) eristämiseksi. pPM2-plasmidi1la on synteettinen oligonukleotidisekvenssi, joka koodaa aminohappoja 252 Barrier 526:een asti. pPM2-plasmidi, jolla on synteettinen oligonukleotidisekvenssi, joka koodaa M13mp8:ssa aineen P C-terminaalisen osan dimeerimuotoa, saatiin Munrolta ja Pelha-milta. pPM2-plasmidi linearisoitiin leikkaamalla Bam HI:llä ja Sai Itllä ja ligoitiin pSW8:n 824 emäsparin BAR 1-fragmentin kanssa. Saatu plasmidi, pSW14, leikattiin Sai Itllä ja Sma Itllä 871 emäsparin BARl-aineen P-fragmentin eristämiseksi. pZV16-plasmidi, jolla on BAR1-fragmentti, joka koodaa amino- 38 100408 happoja 1-250, leikattiin Xba Iillä ja Sai 1:11a 767 emäeparin BAR1-fragmentin eristämiseksi. Tämä fragmentti ligoitiin 871 emäsparia BARl-aineen P-fragmentin kanssa kolmeosaisessa li-gaatiossa pUC18:n, joka on leikattu Xba I:llä ja Sma I:llä, kanssa. Saatu plasmidi, jota merkataan pSW15, leikattiin Xba Iillä ja Sma Iillä 1,64 kb BARl-aineen Pf ragmentin eristämiseksi. ADHl-promoottori saatiin pRL029:ltä, joka sisältää ADHl-promoottorin ja 116 emäeparin BAR1 5' koodaavan alueen pUC18:ssa (MacKay, WO 87/02670). pRL029-plasmidi leikattiin Sph Iillä ja Xba Iillä 0,42 kb ADH1-promoottorifragmentin eristämiseksi. TP 11-terminaattori (Alber ja Kawasaki, J. Mol. Appi. Genet. 1.:410-434, 1982) annettiin tylppäpäisenä Xba I-
Sph I-fragmenttina, joka sisälsi 0,7 kb TP 11-1erminaattor in (tylpennetty Xba I Eco Rl:iin) liittyneenä pUC18:aan <Eco RI-Sph I). Tämä fragmentti ligoitiin 0,42 kb ADHl-promoottori-fragmentin ja 1,64 kb BARl-aineen P-fragmentin kanssa kolmeosaisessa ligaatiosea plasmidin pSW22 tuottamiseksi. pSW22-plaemidi leikattiin Sph Iillä ja Sma Iillä 2,8 kb ekspres-sioyksikön, joka oli ligoitu Sph Iillä ja Pvu 11:11a lineari-soituun YEpl3:een, eristämiseksi. Saatua plasmidia merkittiin pSW24 (kuvio 5).
pSW24-plasmidi transformoitiin mnn9-deleetiokantoihin pZY300 ja pZY400 ja niiden emäkantoihin SEY2101 ja pZYlOO. Transfor- manteista selektoitiin sellaiset, jotka kykenivät kasvamaan -LeuDS-ma1 joi1la (taulukko 2). Trans formantit ympättiin 5 o mliaan -LeuDSia (taulukko 2) ja inkuboitiin yön yli 30 Cissa.
Viisisataa ^ul yön yli kasvanutta kasvustoa ympättiin 50 o mliaan -LeuDSia ja inkuboitiin 48 tuntia 30 Cissa. Kasvustot sentrifugoitiin ja supernatantit dekantoitiin 250 ml in sent- o rifuugipulloihin. Lisättiin yhtä paljon -20 Cissa pidettyä 95-%:sta etanolia ja seokset sekoitettiin vortekeilla ja in-o kuboitiin -20 Cissa 30 minuuttia. Sitten seokset sentrifgoi-tiin 9000 rpm 30 minuuttia GSA-roottorissa (Sorvali). Superna-tantit heitettiin pois ja proteiinipe11ettien annettiin kui-
II
100408 39 vaa yön yli huoneen lämpötilaeea. Kuivatut pelletit resuspen-doitiin 500 ^ul:aan di^O.
Viisikymmentä ^ul 2X näytepuekuria (taulukko 3) lisättiin jokaiseen reeuspendoituun näytteeseen ja näytteet analysoitiin 10 % polyakryyliamidigeelielektroforeesissa ja siirrettiin nitrosellulooealle käyttämällä Towbin et ai. kuvaamaa menetelmää (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 ‘.4350-4353 . 1979). Nitro-sellulooeasuodatintä paikallistettiin rotan anti-aineen P:llä (Capell, Mavern, Pa.) ja tehtiin näkyväksi käyttämällä piparjuuriperoksidaasi-konjugoituneita vuohen antirotta-vas-ta-aineita. Immunoblotissa nähtiin homogeeninen vyöhyke, jonka tunnisti mnn9-hajoamiskantojen ZY300 ja ZY400 anti-aineen-P-vaeta-aine, osoittaen että näiden kantojen tuottama Bar-rier-proteiini on homogeenista. Emokannat osoittivat heterogeenisen, hyperglykosyloidun vyöhykkeen, jonka tunnisti anti-aineen P-vasta-aine.
pSW24-transformanteista määritettiin Barrier-aktiivisuus seuraavasti. Määritys, jota käytetään osoittamaan transformoitujen hiivasolujen Barrier-tuotantoa, riippuu Barrier'n kyvystä kumota 0{-faktori1le alttiina olevien sensitiivisien a-solu-jen kasvun inhibition. Valmistetaan "ruohomatto" käyttämällä testikantaa, kuten RC629-kantaa (MATOf barl), joka on epätavallisen sensitiivinen cX-faktorille, pehmeässä agarissa, jolla on peitetty agarmalja. Riittävä määrä (^-faktoria <0,05-0,1 yksikköä, kuten Manney on määrittänyt, J. Cell. Biol. 96:1592-1600, 1983) lisättiin pehmeään agariin inhiboimaan solujen kasvua. Transformantit, joista etsittiin Barrier-tuottajia, pilkutettiin pehmeälle agarille. Transformanttisolut, jotka erittivät Barrieria, kumosivat pilkkua välittömästi ympäröivän 0(-faktorin kas vuinhibit ion, antaen täten sensitiivisten solujen toipua. Toipuneet solut havaittiin ripsimäisenä kasvuna normaalisti pehmeäreunaisten transformanttisolujen pesäkkeiden ympärillä. Tämän reunuksen läsnäolo osoitti, että tranfor-manttikannan plasmidi ohjasi Barrier-proteiinin ekspressiota ja eritystä.
40 100408
Transformanttien osoitettiin tekevän aktiivista Barrier-pro-teiinia.
Esimerkki 4: mnn9-deleetiokantojen kudosplasminogeeniakti-vaattori ekspressio.
DNA-konstruktio, jossa oli kudosplasminogeeniaktivaattori (tPA) cDNA, transformoitiin mnn9-deleetiokantaan ZY400 tuotetun proteiinin glykosylaation tutkimiseksi. pDR1498-plasmidi (tallennettu hiivatrasformanttina kantaan E8-11C, ATCC 20 730), jolla on TPI1-promoottori, MF 1-signaalisekvenssi sulautuneena kypsän tPA-cDNA-sekvenssin seriinikodoniin ja TPIl-terminaattori, transformoitiin ZY400-kantaan ja sen emä-kantaan, ZY100. Transformantit selektoitiin niiden kyvyllä kasvaa -LeuDS-maljoilla (taulukko 2).
Transformantit kasvatettiin kuten on kuvattu esimerkissä 3.
48 tunnin kasvatuksen jälkeen 30°C:ssa kasvustot jaettiin 25 ml annoksiin ja sentrifugoitiin. Supernatantit yhdestä sarjasta 25 ml annoksia dekantoitiin ja säilytettiin - 70°C:ssa. Niitä vastaavat pelletit säilytettiin myös -70°C:ssa.
Jäljelle jääville solupelleteille tehtiin solu-uutot seuraa-valla tavalla. Yksi ml fosfaattipuskuroitua suolaa (Phosphate Buffered Saline PBS; saatu Sigmalta, St. Louis, Mo.) +
ImM EDTA lisättiin puoleen kokonaistilavuudesta. Seokset sekoitettiin vortexilla täydellä nopeudella 2,5 minuuttia, kolme kertaa jäähdyttäen vortex-sarjojen välillä jäissä. Lysaa-tit sentrifugoitiin Eppendorf-mikrofugissa (Brinkmann, West-bury, N.Y.) täydellä nopeudella 10 minuuttia 4°C:ssa. Supernatantit, jotka sisältävät liukoista soluproteiinia, poistettiin ja säilytettiin -70°C:ssa. Pelletit pestiin 1 ml:lla 2X TNEN (100 mM Tris-Base, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % NP40, pH säädetty 8,0:ksi). Seoksia sekoitettiin vortexilla ja sentrifugoitiin kuten edellä kuvattiin. Supernatantti, joka sisälsi membraaniproteiinifraktion, poistettiin ja säilytettiin -70°C:ssa.
100408 41
Esimerkki 5: Lämpötilasäädelty MNN9-geeni TP11-promoottori saatiin pTPIClO-plasmidista (Alder ja Kawasaki, J. Mol. Appi. Genet. .1.:410-434, 1982) ja pFATPOT-plas- midilta (Kawasaki ja Bell, EP-171 142; ATCC 20 699). pTPIClO-plasmidi katkaistiin ainoasta Kpn I-paikasta, TPI1 koodaava alue poistettiin Bal-31-eksonukleaasilla ja Eco RI-linkkeri (sekvenssi: GGAATTCC) lisättiin promoottorin 3'-päähän. Leikkaus Bgl II:11a ja Eco RI:llä tuotti TP 11-promoottorifragmen-tin, jolla oli Bgl II ja Eco Rl tarttuvat päät. Tämä fragmentti liitettiin sitten YRp7”-plasmidiin (Stinchcomb et ai., Nature 262:39-43. 1979), joka oli katkaistu Bgl II:11a ja Eco RI:llä (osittain). Saatu plasmidi, TE32, leikattiin Eco RI:llä (osittain) ja Bam HI:llä tetrasykliiniresistenseigeenioeuuden poistamiseksi. Linearisoitu plasmidi resirkuloitiin sitten lisäämällä Eco RI-Bam HI-linkkeriä TEA32-plasmidin tuottamiseksi. TEA32-plasmidi leikattiin Bgl II:11a ja Eco RI:llä ja >4)00 emäsparin osittainen TP11-promoottorifragmentti puhdistettiin geelissä. pIC19H-plasmidi (Marsh et ai., Gene 32: 481-486, 1984) leikattiin Bgl 11:11¾ ja Eco RI:llä ja vekto-rifragmentti puhdistettiin geelissä. TP 11-promoottorifrag-mentti ligoitiin sitten linearisoituun pICI9H:hon ja seosta käytettiin transformoimaan E. coli RR1. Eristettiin plasmidi-DNA ja siitä etsittiin ^900 emäsparin Bgl II-Eco RI-fragmentin läsnäoloa. Selektoitiin oikea plasmidi ja sitä merkittiin pICTPIP.
Sitten TPI1-promoottori subkloonattiin paikkaan, jonka päissä oli sopivat restriktiopaikat. pIC7-plasmidi (Marsh et ai., ibid.) leikattiin Eco RI:llä, fragmentin päät tylpennettiin DNA-polymeraasi I:llä (Klenow-fragmentti) ja linearinen DNA resirkuloitiin käyttämällä T^-DNA-ligaasia. Saatua ligaatio-seosta käytettiin transformoimaan E. coli RR1. Transforman-teista eristettiin plasmidi-DNA ja etsittiin Eco Rl-paikan katoamista. Plasmidia, ajolla oli oikea reetriktiokuvio, merkittiin pIC7RI . pIC7RI -plasmidi leikattiin Hind III :11a ja Nar I : 11ä ja 2500 emäsparin fragmentti puhdistettiin geelissä.
100408 42
Osittainen TPI1-promoottorifragmentti (noin 900 emäsparia) poistettiin plCTPIP:ltä käyttämällä Nar I:tä ja Sph I:tä ja puhdistettiin geelissä. Loput TPIl-promoottorista saatiin pFATPOT-plasmidilta leikkaamalla plasmidi Sph I:llä ja Hind III :11a ja 1750 emäsparin fragmentti, jolla oli osa TPIl-pro- * moottoria, puhdistettiin geelissä. pIC7RI -fragmentti, osittainen TPI1-promoottorifragmentti pICTPIPtltä ja fragmentti pFATPOT:lta yhdistettiin kolmois1igaatiossa pMVRl:n tuottamiseksi. <Kuvio 6) .
Kuten kuviosta 6 näkyy, MATof2-operaattorisekvenssi insertoi-tiin sitten TP 11-promoottori in. pSXRl01-plasmidi rakennettiin ligoimalla pUC9:n 2,7 kb Sai Ι-Bam HI-fragmentti pMVRl-plasmi-dista johdetun TPI1-promoottorin 0,9 kb Xho Ι-Bam HI-fragmen-tin kanssa. pSXR101-plasmidin TPIl-promoottorin Sph I-paikka vaihdettiin sitten ainutlaatuiseen Xho I-paikkaan. pSXR101-DNA leikattiin Sph I:llä ja defosforyloitiin standardimenetelmien mukaan (Maniatis et ai., toim., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982), Sph Ι-Xho I-adaptori (GCTCGAGCCATG) kinaasikäsiteltiin erillisessä reaktiossa, jossa oli 20 pmoolia oligonukleotidiä, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgC^, 5 mM DDT, 0,1 mM spermi- diiniä, 1 mM ATP, ja 5 yksikköä polynukleotidikinaasia o 20 /ul:n reaktiotilavuudessa 30 minuuttia 37 C:ssa. Kinaasi-käsitelty Sph Ι-Xho I-adaptori ligoitiin Sph I:llä leikatun pSXR101:n kanssa ja ligaatioseosta käytettiin transformoimaan E. coli RR1. Plasmidit, joilla oli insertoitunut adaptori, tunnistettiin restriktioanalyyei1lä ja nimettiin pSXRl02 (kuvio 6). Oligonukleotidit, jotka spesifioivat MAT«2-operaatto-ria (elementti 609: 5' TCGAG TCA TGT ACT TAC CCA ATT AGG AAA TTT ACA TGG 3' ja 5' TCGA CCA TGT AAA TTT CCT AAT TGG GTA AGT ACA TGA C 3') kinaasikäsiteltiin kuten kuvattu edellä. pSXRl02-plasmidi leikattiin Xho I:llä ja defosforyloitiin standardimenetelmien mukaan. Tehtiin kolme erillistä ligaa-tiota, plaemidi-DNA-oligonukleotidin mooliset suhteet olivat 1:1, 1:3 ja 1:6, vastaavasti. Saatua ligaatioseosta käytet- 100408 43 t-iin transformoimaan E. coli RR1 . Plasmidit, joilla oli in-®ertoitunut (-neita) oligonukleotidi <-dejä), tunnistettiin Peeäkehybridisaatio1la ja restriktioanalyysillä. Seuranneessa BNA-eekventoinnissa osoitettiin pSXR104:n sisältävän kaksi kopiota MATc(2-operaattoreita.
Seuraavasea vaiheessa pSXRl04-plasmidi leikattiin Bam Hiillä, defosfosforyloitiin standardimenetelmän mukaan (Maniatis et ai., toim. teoksessa Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982), ja ligoitiin 3,2 kb Bam HI-Bam HI-fragmentin kanssa, joka sisältää E. coli IacZ-geenin. Ligaatio-seosta käytettiin transformoimaan E. coli RRl-kantaa. Plasmidia, jolla oli IacZ-fragmentti sopivan suuntaisena, merkittiin pSXRlll.
Kuten kuvattu kuviossa 7, MNN9-geeni asetettiin pSXRl1l-plas-midilla olevan hybridipromoottorin säätelyn alaiseksi. pZY48-plasmidi leikattiin Hind III:lla ja Pst Itllä 0,56 kb MNN9-fragmentin eristämiseksi. Tämä fragmentti leikattiin Dde I: llä 0,36 kb MNN9-fragmentin eristämiseksi. Oligonukleotidit ZC1429 (5' TTA GGC GGT ACG ATA CAA GAG AAA GTG ACA TTG TTT CCT G 3') ja ZC1430 (5' AAT TCA GGA AAC AAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC GTA CCG CC 3') kinaasikäsiteltiin ja liitettiin toisiinsa käyttämällä pääasiallisesti Maniatis et ai. (ibid.) kuvaamia menetelmiä. Kinaasikäeitellyt ja toisiinsa liitetyt oligonukleotidit saavat aikaan adaptorin, jolla on Eco Rl -ko-hesiivinen pää ja jota seuraa 37 emäsparin MNN9 koodaava alue ja Dde I -kohesiivinen pää. ZC1429/ZC1430-adaptori liitettiin pZY48:n Dde Ι-Pst I-fragmenttiin kolmeosaisessa ligaatiossa pUC13:n kanssa, joka oli linearisoitu leikkaamalla Eco Rl :11a ja Pst I : 11ä. Saatua plasmidia, jolla oli ZC1429/ZC1430-adap-tori sulautuneena MNN9-geeniin, merkittiin pZY64.
pZY6 4-plasmidi leikattiin Eco Rl :11a ja Pst I:llä 0,4 kb MNN9-fragmentin eristämiseksi. pZY38-plasmidi, jolla oli 1,5 kb Pet I-Bgl II-fragmentti pZY23:lta ja YEpl3-vektorisekvens- 100408 44 eit, leikattiin Pet I:llä ja Bgl II:11a 1,5 kb MNN9-fragmentin erietämieekei. pSXRl11-plaemidi leikattiin Hind III :11a ja Eco RI:llä 0,9 kb hybridipromoottorifragmentin erietämisekei.
Tämä fragmentti ligoitiin neljäosaisessa ligaatioasa 1,5 kb Pat Ι-Bgl II -fragmentin kanssa pZY38:lta, Eco Rl-Pst II-frag-mentin kanssa PZY64:ltä ja PIC19R:ltä, joka oli linearisoitu leikkaamalla Hind III :11a ja Bgl II:11a. Saatua plasmidia merkittiin pZY65. pZY65 leikattiin Bgl II:11a ja Pvu I:llä. Eristettiin 2,8 kb Bgl II-Bgl I I-fragmentti, jolla oli ekspressio-ykeikkö. pMl11-plasmidi linearisoitiin leikkaamalla Bam HI: llä ja ligoitiin 2,8 kb Bgl 11-fragmentin kanssa, jolla oli pZY65:n ekspreseioykeikko. Saatu ligaatioseos transformoitiin E. coli RRl-kantaan. Traneformanteista eristettiin plasmidi-DNA ja leikattiin Hind III :11a ja Eco Ritilä insertion suunnan määrittämiseksi. Plasmidia, jolla oli ekspressioyksikko oikeaan suuntaan, merkittiin pZY566.
Esimerkki 6: Lämpötilaeäädellyn MNN9-geenin ekspressio A. XCY42-28B-kannan rakentaminen S. cerevieiae-kanta, jolla on sir3-8-mutaatio, deleetio MNN9-geeniesä ja geenettisiä virheitä ainakin LEU2- ja TRPl-gee-neissä, rakennettiin seuraavasti. (Kaikkien kantojen genotyypit on luetteloitu taulukossa 1.) 381G-59A-kanta (Hartwell, J.
Cell Biol. 85.:811-822, 1980) risteytettiin A2-kannan kanssa (Ruby et ai., Meth. Enzymol. 101.253-269. 1983) ja selek- toitiin diploidit ja sporuloitiin. Itiökotelot leikeltiin ja itiötä, jolla oli genotyyppi MATa leu2-3,112 trp-1 ade2-l lys2 sir3-8, merkittiin XL1-4B. Kannat ZY400 ZpSW247 ja ZA447 risteytettiin ja eelektoitiin diploidit solut. Diploidisolut sporuloitiin käyttämällä tavanomaisia menetelmiä ja itiökotelot leikeltiin. Saaduille itiöille tehtiin tetradianalyysi.
Itiö, jolla oli genotyyppi MÄTÄ ade2-l leu2-3,112 mnn9:: URA3, selektoitiin. Itiötä merkittiin XCY15-3C.
45 100408
Kannat XCY15-3C ja XL1-4B risteytettiin XCY42-diploidin tuottamiseksi. Diploidi kanta sporuloitiin ja itiökotelot leikel-tiin. Itiö, jolla oli genotyyppi MATa sir3-8 mnn9::URA3 leu2-3, 112 trpl-1 ade2-l lys2, valittiin. Tätä itiötä merkittiin XCY42-28B (ATCC 20877).
B. trpE-BARl sulautumista vastaan ohjattujen polyklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen
Polyklonaalisia vasta-aineita muodostui trpE-Barrier proteiinia vastaan. trpE-Barrier-proteiini tuotettiin E.coli RRlrssä, joka oli transformoitu pSW242:lla. pSW242-plasmidi rakennettiin seuraavasti. pSW22-plasmidi (esimerkki 3) leikattiin Eco RI:llä 1,47 kb BAR1-fragmentin eristämiseksi. pATHll-plasmidi (Morin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7025-7029, 1985; pATH2:n muunnelma /Dieckmann ja Tzago-loff, J. Biol. Chem. 260:1513-1520, 1985/, jossa E. coli trpE-geeniä seuraa pUC-tyyppisen plasmidin moninkertainen kloonausalue ja vektorisekvenssit) linearisoitiin leikkaamalla Eco RI:llä. Kaksi Eco Rl-fragmenttia liitettiin yhteen li-gaatiolla ja transformoitiin E. coli RRl-kantaan. Transfor-manteista eristetylle plasmidi-DNA:lie tehtiin restriktio-analyysi ja kloonia, jolla oli BAR1-fragmentti oikean suuntaisesti, merkittiin pSW242.
E. coli RR1-transformanttipesäke, jolla oli pSW242-plasmidi, ympättiin 4 ml-.aan M9 + CA + amp + W (taulukko 2) ja kasvatettiin yön yli 37°C:ssa. Yön yli kasvanut kasvusto laimennettiin 1:10 30 ml:aan M9 + CA + amp (taulukko 2) ja kasvatettiin l tunti 30°C:ssa runsaassa ilmastuksessa. Tunnin kuluttua kasvustoon lisättiin 150 μΐ indoliakryylihappoa (10 mg/ml) (Sigma, St. Louis, Mo) 100-%:ssa etanolissa ja sen annettiin kasvaa vielä 2 tuntia 30°C:ssa.
4 6 100408
Taulukko 3
2x nävtepuakuri 36 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 16 ml glyseroli 16 ml 20 % SDS
4 ml 0,5 % bromi feno1isineä (Bromophenol Blue) 0,5 M Trie-HCl :eeä, pH 6,8
Sekoita kaikki ainekset. Lisää välittömästi ennen käyttöä 100 /Ui ^J-merkaptoetanolia jokaiseen 900 ^ul väriseokeeen.
Krakkaus-puskuri 0,01 M natriumfosfaatti, pH 7,2 1 X β-merkaptoetanoli 1 % natriumdodekyy1isulfaatti 6 M urea
We8tern-siirtopuskuri 25 mM Trie, pH 8,3 19 mM glysiini, pH 8,3 20 % metanoli
Western-pu8kuri A
50 ml 1 M Trie, pH 7,4 20 ml 0,25 mM EDTA, pH 7,0 5 ml 10 % NP-40 37.5 ml 4 M NaCl 2.5 g gelatiini
Tri8, EDTA, NP-40 ja NaCl laimennettiin yhden litran lopputi-lavuuteen tislatulla vedellä. Gelatiini lisättiin 300 ml:aan tätä liuosta ja liuosta kuumennettiin mikroaaltouunissa kunnes gelatiini oli liuennut. Gelatiini 1iuos lisättiin takaisin jäljelle jääneeseen ensimmäiseen liuokseen ja sitä sekoitet-o tiin 4 C:ssa kunnes liuos oli jäähtynyt. Puskuria säilytet-o tiin 4 C:ssa.
100408 47
Weetern-puskuri B
50 ml 1 M Trie, pH 7,4 20 ml 0,25 M EDTA, pH 7,0 5 ml 10 % NP-40 58,4 g NaCl 2,5 g gelatiini 4 g N-lauryylisarkoeiini
Trie, EDTA, NP-40 ja NaCl eekoitettiin ja laimennettiin yhden litran lopputilavuuteen. Gelatiini lieättiin 30 ml:aan tätä liuosta ja kuumennettiin mikroaaltouunieea kunnes gelatiini oli liuennut. Gelatiini 1iuos lieättiin takaisin jäljelle jääneeseen alkuperäiseen liuokseen ja lieättiin N-lauryy1isarko- o siinia. Lopullista seosta sekoitettiin 4 C:ssa, kunnes kiinteät partikkelit olivat täysin liuenneet. Puskuria säilytet-o tiin 4 C:saa.
Kasvusto pelletoitiin sentrifugoimalla ja supernatantit heitettiin pois. Solupelletti resuspendoitiin 50 /Ul:aan krak- o kaus-puskuria (taulukko 3) ja inkuboitiin 37 C:ssa 0,5-3 tuntia. Lieättiin yhtä paljon 2x näytepuskuria (taulukko 3) ja näytettä kuumennettiin kiehuvassa vesihauteessa 3-5 minuuttia. Näytteestä tehtiin 10 % SDS-polyakryy1iamidigee1ielektrofo-reesi. Proteiinit siirrettiin nitroeelluloosa1le käyttäen ' pääasiassa Towbin et ai (ibid.) kuvaamaa menetelmää. Nitro- selluloosasuodatin värjättiin upottamalla seokseen, jossa oli 100 ml tislattua vettä, 4 ml jääetikkahappoa ja 4 tippaa vihreää elintarvikeväriä Schilling (McCormick and Co., Inc., Baltimore, Md.>. Vyöhyke, joka vastasi Barrier-proteiinia, leikattiin suodattimesta ja väri poistettiin pesemällä tislatulla vedellä.
Pesty nitroselluloosasuodatin, jolla oli Barrier-proteiini, o kuivattiin 37 C:ssa yhden tunnin ajan ja seuraavakei sekoitettiin Freundin adjuvantin (ICN Biochemicals, Costa Mesa,
Kalif.) ja dimetyy1isulfoksidin kanssa (DMSO). Seos injektoi- 100408 48 tiin ihonalaisesti kolmeen kohtaan Uuden Seelannin valkoisiin kaneihin. Injektiot toistettiin 2,5 kuukauden kuluttua ensimmäisestä injektiosta. Kymmenen päivää viimeisen injektion jälkeen kanista otettiin kaikki veri pois ja annettiin sen koaguloitua. Verihyytymä erotettiin seerumista sentrifugoi- malla. Seerumi siirrettiin uuteen putkeen ja säilytettiin o -20 Ctssa. Nämä polyklonaaliset vasta-aineet, joita merkittiin C-2465, tunnistivat Barrier-proteiinin.
C. BARl:n ekspressoitummen lämpötilaeäädellyssä MNN9-kannas-sa S. cerevisiae-kanta XCY42-28B transformoitiin lämpötilasäädel-lyllä MNN9-ekspreeeiovektori1la pSW24 (esimerkki 3) ja pZY66 (esimerkki 5) tai pSW24:llä ja pMlll:llä käyttäen kirjallisuudesta tunnettuja menetelmiä, katso esimerkiksi Beggs (ibid.).
Trans formanteista selektoitiin sellaiset, jotka kykenivät kas- o vamaan -Leu-TrpDS:1lä (taulukko 2) 25 C:ssa.
Transformantit vedettiin yksittäiepeeäkkeiden saamiseksi -Leu- o
TrpDS-ma1 joi1le ja kasvatettiin 25 C:ssa, 30 C:ssa tai o 35 C:ssä. Transformantti-pesäkkeet ympättiin 5 ml:aan -Leu- o o
TrpDS:tä ja kasvatettiin yön yli 25 C:ssä, 30 C:sea tai o 35 C:ssä riippuen ympin kasvulämpötilasta. Yön yli kasvaneet kasvustot laimennettiin 1:100 50 ml:aan -Leu-TrpDS ja kasva- o o o tettiin noin 48 tuntia 25 C:ssä, 30 C:ssa tai 35 C:ssa.
Solut poistettiin kasvustosta setrifugoima1la ja supernatan- tit dekantoitiin ja säästettiin. Yhtä suuri määrä 95 % etano- o . lia, jota oli pidetty -20 C:ssa, lisättiin jokaiseen superna- o tanttiin ja seoksia pidettiin -20 C:ssa 45 minuuttia. Etanoli- seokset sentrifugoitiin GSA-roottorissa (Sorvali) 90 000 rpm o 30 minuuttia 4 C:ssa saostuman pe 1letoimiseksi. Supernatantit dekantoitiin ja pellettien annettiin kuivaa. Pelletit resus-pendoitiin 500 yul:aan tislattua vettä.
100408 49 50 /Ui 2x näytepuskuria (taulukko 3) lisättiin 50 /ul:aan jokaista reeuependoitua näytettä ja seoksesta tehtiin 10 % poly-akryy1iamidigeelielektroforeesi ja siirrettiin nitroselluloo-salle käyttäen pääasiassa Towbin et ai. kuvaamaa menetelmää (ibid.). Hitroselluloosasuodatin koestettiin kaniinin polyklo-naali-C-2465:1la ja tehtiin näkyväksi piparjuuriperoksidaasi- konjugoidui1la vuohen anti-kani-vasta-aineilla. Immunoblot o osoitti, että 35 C:ssa XCY42-28B£fciSW24, pXY6^7:n tekemä Bar- rier-aineen P-proteiini oli homogeenisenä vyöhykkeenä, jossa oli yhtä paljon glykoeylaatiota kuin XCY42-28BZpSW24, pMllU:eeä, kun se oli kasvanut kaikissa lämpötiloissa. Tämä o osoitti, että 35 C.ssa MNN9-geeni on pois päältä ja proteiinin glykosylaatio tapahtuu kuten samalla tavoin transformoi- o dusea mnn9-kannassa. 30 C:ssa XCY42-2BB£pSW24, pZY6S7:n tuottama Barrier-aineen P-proteiini oli eniten hyperglykosyΙοίο tu ja 25 C:ssa XCY42-28BZpSW24, pZY6§7:n tuottama Barrier-aineen P-proteiini oli erittäin heterogeeninen hyperglykosy-loitu vyöhyke.
Esimerkki 7: mnnl-mutanttien määrittämiemenetelmä
Kanin polyklonaalisia vasta-aineita tehtiin mnn9-kannan tuottamaa Barrier-proteiinia vastaan. XV732-1-9A (esimerkki I.A.), joka oli transformoitu TPI 1-promoottorin , MF«1-s ignaa 1 i sekvenssin ja BARl-koodaussekvenssin sisältävällä pZV100:lla, tuotti Barrier-proteiinia. pZVl00-plasmidi rakennettiin seuraavasti .
TPI1-promoottori on johdettu pM21O-plasmidista (tunnettu myös . pM220:nä, joka on talletettu ATCCissä no 39 853). pM210-plas- midi leikattiin Bgl II:11a ja Hind III:lla 0,47 kb fragmentin eristämiseksi (fragmentti 1).
K1oonausvektori1le pUC13 subk1oonattiin Hind III-Eco Rl-adap-tori, joka koodaa MFO$l-s ignaa 1 ipept idiä ja sen kanssa osa BARl-geenin 5'-koodauseekvenseiä, josta on poistettu oletettu _ Τ' 100408 50 BARl-signaalisekvenssi. pZV16-plaemidi (esimerkki 3) leikattiin Eco Rl :11a ja Sai I:llä 0,67 kb BAR1-fragmentin eristämiseksi. Olig©nukleotidit ZC566 (5' AGC TTT AAC AAA CGA TGG CAC TGG TCA CTT AG 3') ja ZC567 <5' AAT TCT AAG TGA CCA GTG CCA TCG TTT GTT AA 3') kinaasikäaiteltiin ja liitettiin yhteen pääasiassa kuten Maniatis et ai. (ibid.) ovat kuvanneet. Kinaasikäsitelty ja yhteenliitetty ZC566/ZC567-adaptori yhdistettiin 0,67 kb BAR1-fragmentin kanssa kolmeosaisessa ligaa-tiossa pUC13:n kanssa, joka oli linearisoitu Hind III:lla ja Sai I:llä. Saatu ligaatioseos transformoitiin E. coli JM83-kantaan. Saaduista transformanteista eristetyt plasmidi-DNA:t tutkittii leikkaamalla Hind III :11a ja Sai I:llä. Positiivinen klooni merkittiin pZV96-plaemidiksi. pZV96-plasmidi leikattiin Hind III :11a ja Sai I:llä 0,67 kb fragmentin, joka sisältää ZV566/ZC567-adaptori-BARl-fragmentin (fragmentti 2), eristämiseksi.
Loppu BAR1-geenistä saatiin pZV9:stä (esimerkki 3). pZV9-plas-midi leikattiin Sai I:llä ja Bam HI:llä 1,25 kb BAR1-fragmentin eristämiseksi (fragmentti 3). Fragmentit 1 ja 2 (sisältäen TP I 1-promoot tor i-MFiXl-s ignaa 1 isekvenee in ja ZC566/ZC567-BAR1-fragmentin, vastaavasti) liitettiin fragmenttiin 3 (1,25 kb BAR1-fragmentti) ja YEpl3:een, joka oli linearisoitu leikkaamalla Bam HI:llä. Saatu ligaatioseos transformoitiin E. coli RRi:een. Saaduista trans formanteista eristetty plasmidi-DNA leikattiin Bam Hiillä + Hind III:lla ja Bam HI:llä + Sai I:llä rakenteen varmistamiseksi ja insertin suunnan määrittämiseksi. Positiivista kloonia, jolla oli TP 11-promoottori lähimpänä Hind ΙΙΙ-paikkaa YEpl3-vektori1la, merkittiin pXVIOO.
S. cerevisiae-kanta XV732-1-9A transformoitiin pZV100:lla ja transformanteista selektoitiin sellaiset, jotka kykenivät kasvamaan -LeuDS-maljoilla (taulukko 2). Transformanttipesäke ympättiin 10 ml:aan -LeuDS:a (taulukko 2) ja kasvatettiin yön o yli 30 C:ssa. Yön yli kasvanut kasvusto laimennettiin 1:100 o 978 ml:aan -LeuDSia ja kasvustoa kasvatettiin 43 tuntia 30 C: 100408 51 sea. Kasvusto sentrifugoitiin ja eupernatantit dekantoitiin 250 ml :n sentrifugipulloihin. Lisättiin yhtä suuri tilavuus o -20 C:sea pidettyä 95-%:sta etanolia ja seoksia inkuboitiin o -20 C:ssa noin 2 tuntia. Seokset sentrifugoitiin GSA (Sor- o vai)-roottorissa 9000 rpm 30 minuuttia 4 C:ssa. Supernatant it heitettiin pois ja proteiinipe1letit ilmakuivattiin. Pelletit resuspendoitiin 6 ml:n kokonaistilavuuteen lx näytepusku-ria <3 ml dl^O ja 3 ml 2x näytepuskuri ^taulukko 2.7).
Näyte analysoitiin 10-%:ssa polyakryyliamidigeelielektroforee-eisea ja siirrettiin nitroselluloosalle käyttäen Towbin et ai. (ibid.) kuvaamaa menetelmää. Nitrose1luloosasuodatin värjättiin upottamalla liuokseen, jossa oli 100 ml tislattua vettä, 4 ml jääetikkahappoa ja 4 pisaraa vihreää elintarvikeväria Schilling. Vyöhyke, joka vastasi Barrier-proteiinia, leikattiin pois suodattimesta ja väri poistettiin pesemällä tislatulla vedellä. Pesty nitroselluloosa-Barrier-vyöhyke kuivat-o tiin 37 C:ssa yhden tunnin ajan ja sekoitettiin seuraavaksi Freundin adjuvantin (ICN Biochemicals, Costa Mesa, Kalif.) ja dimetyylisulfoksidin kanssa (DMSO.-Seos injektoitiin ihonalaisesti kolmeen kohtaan Uuden Seelannin valkoisiin kaneihin. Injektiot toistettiin yhteensä kolme kertaa noin yhden kuukauden välein. Kymmenen päivää viimeisen injektion jälkeen kanin koko veri poistettiin ja sen annettiin koaguloitua. Ve- rihyytymä eristettiin seerumista sentrifugoimalla. Seerumi o siirrettiin uuteen putkeen ja varastoitiin -20 C:een. Nämä polyklonaaliset vasta-aineet tunnistivat Barrier-proteiinin ja proteiinissa olevat sokeriosat.
Teetikantapesäkkeet kasvatettiin YEPDS:llä ja saadut pesäkkeet replikoitiin nitroeelluloosasuodattimille. Suodattimet pestiin kolme kertaa viisitoista minuuttia Western-puskuri A:ssa (taulukko 3). Sitten suodattimet pestiin Western-pusku-ri-A:eea (taulukko 3) viisi minuuttia. Suodattimet siirrettiin tuoreeseen Western-puskuri A:han ja inkuboitiin yksi tunti. Sitten suodattimet pestiin Western-puskuri A:sea viiden 100408 52 minuutin ajan. Suodattimille lisättiin 1:500 laimennettua kanin polyklonaa1ista anti-Barrier<mnn9)-vasta-ainetta ja inkuboitiin kauemmin kuin yksi tunti. Vaeta-ainey1imäärä poistettiin pesemällä kolme kertaa viisi minuuttia Western-puskuri A:11a. Suodattimille lisättiin 1:1000 laimennettua vuohen anti-kani-piparjuuriperoksidaasi-konjugoitunutta vasta-ainetta ja inkuboitiin ainakin yksi tunti. Ylimäärä konju-goituneesta vasta-aineesta poistettiin huuhtelemalla tislatulla vedellä ja pesemällä kolme kertaa kymmenen minuuttia Western-puskuri B:llä (taulukko 3) ja lopuksi huuhtelemalla tislatulla vedellä. Määrityksen annettiin kehittyä lisäämällä piparjuuriperoksidaasisubstraattia (BioRad, Richmond, Kalif,), jonka annettiin kehittyä kunnes oli muodostunut tarpeeksi väriä. Pesäkkeet, jotka olivat hieman värjäytyneitä vastaainei-den kanssa, olivat mnnl-pesäkkeitä.
Esimerkki 8: mnnl- ja mnnl mnn9-kantojen rakentaminen S. cerevisiae-kannat, joilla oli mnnl- ja mnnl mnn9-mutaatiot rakennettiin seuraavasti. ZY400 (taulukko 1) risteytettiin LBl-22D:n (taulukko 1, Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, Kalif.) kanssa, ja selektoitiin diploidi ja merkittiin XV803. XV803-diploidit solut sporuloitiin ja itiökotelot leikeltiin. Itiöistä etsittiin mnn1-mutaatiota käyttämällä mnnl-etsintäme-• netelmää. ^mnn9::URA3-markkeri arvioitiin itiöiden kasvusta YEPD:llä (mnn9-mutantit kasvoivat huonosti alustalla, jolla ei ollut osmoottista tukea). Itiötä, joka genotyyppi oli MATö( leu2-3, 112 Ämnn9::URA3 mnnl, merkittiin XV803-1B. Toista itiötä, jonka genotyyppi oli MAT* leu2-3, 112 mnnl Äpep4::CAT, merkittiin XV803-16C.
Esimerkki 9: BARl:n ekspressoituminen mnnl mnn9-kannassa BARl-geenin ekspressoitumista tutkittiin mnnl mnn9-kannoissa. Kannat XV803-1B, XV803-16C, XY100 ja ZY400 transformoitiin pSW24:1lä. Transformanteista selektoitiin sellaiset, jotka 100408 53 kykenivät kasvamaan -LeuDS-maljoilla (taulukko 2). Transfor- manttipesäkkeet vedettiin yksittäisiksi pesäkkeiksi tuoreil- o le -LeuDS-maljoi1le ja annettiin 30 C:ssa. Trans formanttipe- säkkeet ympättiin 50 ml:aan -LeuDS:a (taulukko 2) ja kasvatet-o tiin 30 C:esa noin 48 tuntia. Kasvusto kerättiin ja solut poistettiin kasvualustasta sentrifugoimalla. Supernatantit de- kantoitiin GSA-pulloihin ja yhtä suuri tilavuus 95 % etanolia, o jota oli pidetty -20 C:sea, lisättiin. Seoksia inkuboitiin o -20 C:sea ja seuraavaksi sentrifugoitiin GSA-roottorissa 9000 o rpm 30 minuuttia 4 C:ssa. Supernatantit heitettiin pois ja saostumat ilmakuivattiin. Saostumat resuependoitiin 4 ml:aan tislattua vettä ja saostettiin uudelleen lisäämällä 4 ml kylmää 95-%:sta etanolia. Seoksia inkuboitiin ja sentrifugoitiin, kyten edellä kuvattiin. Supernatantit heitettiin pois ja pel-lettit ilmakuivattiin.
Proteiinisaostumat resuependoitiin 150 ^ulraan tislattua vettä. Näytteet laimennettiin 150 ^ulilla 2x näytepuskuria (taulukko 3), ja 100 /ui:sta jokaista näytettä tehtiin 10 X po-lyakryyliamidigeelielektroforeesi. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosalle Towbin et ai. (ibid.) menetelmällä ja Bar-rier-proteiini tehtiin näkyväksi käyttämällä aineen P-vasta-ainetta, kuten kuvattiin esimerkissä 3. Tulokset osoittivat, että mnnl mnn9-kakeoismutantieta tehty Barrier-proteiini kulki * nopeammin kuin mnn9- tai mnnl-mutantista eristetty Barrier- proteiini, osoittaen että kaksoismutantista tehdyssä Barrier-proteiinissa oli vähemmän sokeriosia kuin mnn9-mutantieta tehdyssä proteiinissa.
Esimerkki 10: MNNl-geenin kloonaaminen MNNl-geeni kloonataan käyttämällä edellä kuvattua vasta-aineen eteimismenetelmää. Plasmidikirjasto, jossa on satunnainen seos hiivan kokonais-DNA-fragmentteja kloonattuna YEpl3-vektorille (Nasmyth ja Reed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2119-2123, 1980) transformoidaan XV803-16C-kantaan, ja 100408 54 transformoidaan XV803-16C-kantaan, ja transformanteieta selek-toidaan sellaiset, jotka kykenevät kasvamaan -LeuDS-maljoilla (taulukko 2). Trans formantit resuspendoidaan -LeuD:iin (taulukko 2) MacKay'n menetelmällä (ibid., 1983) ja lasketaan. Suspensiot laimennetaan ja maljataan -LeuD-maljoille (taulukko 2) tiheydellä noin 1200 solua/malja (jos kaikki solut ovat o eläviä). Maljoja inkuboidaan 30 C:ssa, kunnes pesäkkeet ovat kasvaneet. Pesäkkeet replikoidaan nitroselluloosasuodattimille ja seulotaan esimerkissä 7 kuvatulla määritysmenetelmällä. Pesäkkeet, jotka värjäytyvät tummiksi kanin polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa, sisältävät plasmideja, jotka komple-mentoivat mnnl-mutaatiota ja antavat isäntäsolun tehdä villi-tyypin glykosyloituja proteiineja. Positiivisista pesäkkeistä eristetään plasmidi-DNA kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä (esim. Hartig et ai., ibid.) ja transformoidaan E. co-1itransformantteihin. E. coli-transformanteista eristetään plasmidi-DNA ja sille tehdään restriktioentsyymianalyysi.
Edellä kuvatusta on ymmärrettävä, että vaikkakin tässä on kuvattu keksinnön spesifisiä suoritusmuotoja havainnollistaviin tarkoituksiin, voidaan sitä muunnella poikkeamatta keksinnön hengestä. Niinpä keksintöä rajoittavat oheen liitetyt patenttivaatimukset .
Claims (15)
1. Hiivasolu, jolla on virhe geenissä, jonka tuotetta tarvitaan ulomman ketjun oligosakkaridiosien lisäämiseksi glyko-proteiineihin, tunnettu siitä, että solu on transformoitu ensimmäisellä DNA-konstruktiolla, joka käsittää säädeltävän promoottorin ja siitä alavirtaan seuraavan mainittua virhettä komplementoivan DNA-sekvenssin, ja toisella DNA-konstruktiolla, joka käsittää toisen promoottorin ja seuraavana alavirtaan DNA-sekvenssin, joka koodaa erityssignaalia ja DNA-sek-venssin, joka koodaa heterologista proteiinia tai polypepti-diä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että hiivasolu on Saccharomyces-lajin tai Schizosaccharo-myces-lajin hiivasolu.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että geeni on selektoitu ryhmästä, joka koostuu MNN7-, MNN8-, MNN9- ja MNN10-geeneistä.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että solulla on lisäksi virhe MNN1-geenissä.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että solulla on konditionaalinen mutaatio geenissä, jota • tarvitaan hiljaisen risteytymistyypin lokusten ekspressoitu- miseen ja mainittu säädeltävä promoottori sisältää risteytymistyypin säätelyelementin.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että konditionaalinen mutaatio on sir3-8-mutaatio.
7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että säädeltävä promoottori lisäksi käsittää TPIl-pro-moottorin.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että toinen promoottori on säädeltävä promoottori. 100408 ___ . 1.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen DNA-konstruktio ovat yhdellä ainoalla plasmidilla.
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että ensimmäinen DNA-konstruktio on integroitunut solun genomiin.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että toinen DNA-konstruktio on integroitunut solun genomiin.
12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että että virhe on pistemutaatio.
13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että virhe on geneettinen deleetio.
14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen hiivasolu, tunnettu siitä, että proteiini tai polypeptidi on selektoitu ryhmästä, joka koostuu kudosplasminogeeniaktivaattorista, urokinaasis-ta, immunoglobuliineistä, verihiutaleen kasvutekijästä, plas-minogeenistä, trombiinista ja tekijä XIII:sta.
15. Menetelmä heterologisen proteiinin tai polypeptidin val- * mistamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan jonkin patenttivaatimuksista 1-14 mukaista hiivasolua ensimmäisissä kasvatusolosuhteissa niin, että DNA-sekvenssi, joka komplementoi virhettä geenissä, jonka tuotetta tarvitaan ulomman ketjun oligosakkaridiosien lisäämiseksi glykoproteiineihin, ekspressoituu; kasvatetaan solua toisissa kasvatusolosuhteissa niin, että mainittua virhettä komplementoiva DNA-sekvenssi ei ekspres-soidu ja heterologista proteiinia tai polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi ekspressoituu; ja eristetään heterologinen proteiini tai polypeptidi. 100408
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11609587A | 1987-10-29 | 1987-10-29 | |
| US11609587 | 1987-10-29 | ||
| US07/189,547 US5135854A (en) | 1987-10-29 | 1988-05-03 | Methods of regulating protein glycosylation |
| US18954788 | 1988-05-03 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI884991A0 FI884991A0 (fi) | 1988-10-28 |
| FI884991L FI884991L (fi) | 1989-04-30 |
| FI100408B true FI100408B (fi) | 1997-11-28 |
Family
ID=26813889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI884991A FI100408B (fi) | 1987-10-29 | 1988-10-28 | Proteiinien glykosylaation säätelymenetelmiä |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0314096B1 (fi) |
| JP (1) | JPH02419A (fi) |
| AT (1) | ATE100142T1 (fi) |
| AU (1) | AU625392B2 (fi) |
| CA (1) | CA1325781C (fi) |
| DE (1) | DE3887082T2 (fi) |
| DK (1) | DK599788A (fi) |
| FI (1) | FI100408B (fi) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2022109A1 (en) * | 1989-07-31 | 1991-02-01 | Cheryl A. Schulman | Enhanced expression of heterologous proteins in recombinant hosts in a non-growth media |
| CA2022108A1 (en) * | 1989-07-31 | 1991-02-01 | Cheryl A. Schulman | Enhanced growth and expression of heterologous proteins in recombinant hosts containing mutations in cell wall and/or plasma membrane biosynthesis |
| WO1991018988A1 (en) * | 1990-06-08 | 1991-12-12 | Zymogenetics, Inc. | Barrier protease |
| IL101653A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Multiple hepatitis b virus surface proteins which form particles |
| IL101651A0 (en) * | 1991-04-29 | 1992-12-30 | Merck & Co Inc | Hepatitis b virus surface proteins with reduced host carbohydrate content |
| WO1994001132A1 (en) * | 1992-07-07 | 1994-01-20 | Merck & Co., Inc. | VACCINE COMPRISING MIXED preS1+preS2+S AND CORE PARTICLE |
| DE4301932A1 (de) * | 1992-08-07 | 1994-02-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Hefewirtsstämme mit Defekten in der N-Glycosylierung |
| SE9301583D0 (sv) * | 1993-05-07 | 1993-05-07 | Kabi Pharmacia Ab | Yeast strain and methods for expressing heterologous proteins in yeast |
| KR100820367B1 (ko) | 2000-06-30 | 2008-04-07 | 프랜더스 인터유니버시티 인스티튜트 포 바이오테크놀로지 (브이아이비) | 피히아 파스토리스에서의 단백질 글리코실화 변형 |
| WO2003091431A1 (fr) * | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Methylotrophe produisant une chaine de sucre de type mammifere |
| US7507573B2 (en) | 2003-11-14 | 2009-03-24 | Vib, Vzw | Modification of protein glycosylation in methylotrophic yeast |
| WO2006026992A1 (en) * | 2004-09-07 | 2006-03-16 | Novozymes A/S | Altered structure of n-glycans in a fungus |
| CN100351381C (zh) * | 2005-09-02 | 2007-11-28 | 中山大学 | 一种新的类凝血酶基因及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3537176C2 (de) * | 1984-10-18 | 1994-06-09 | Zymogenetics Inc | Gewebeplasminogenaktivator und Verfahren zu seiner Herstellung |
-
1988
- 1988-10-26 EP EP88117834A patent/EP0314096B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-26 AU AU24356/88A patent/AU625392B2/en not_active Ceased
- 1988-10-26 DE DE88117834T patent/DE3887082T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-26 AT AT88117834T patent/ATE100142T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-28 DK DK599788A patent/DK599788A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-10-28 CA CA000581625A patent/CA1325781C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-28 FI FI884991A patent/FI100408B/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-10-29 JP JP63272004A patent/JPH02419A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0314096B1 (en) | 1994-01-12 |
| DK599788D0 (da) | 1988-10-28 |
| FI884991A0 (fi) | 1988-10-28 |
| JPH02419A (ja) | 1990-01-05 |
| CA1325781C (en) | 1994-01-04 |
| EP0314096A2 (en) | 1989-05-03 |
| DK599788A (da) | 1989-04-30 |
| AU2435688A (en) | 1989-05-11 |
| EP0314096A3 (en) | 1989-11-15 |
| DE3887082D1 (de) | 1994-02-24 |
| AU625392B2 (en) | 1992-07-09 |
| ATE100142T1 (de) | 1994-01-15 |
| DE3887082T2 (de) | 1994-04-28 |
| FI884991L (fi) | 1989-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5135854A (en) | Methods of regulating protein glycosylation | |
| JP2704115B2 (ja) | 形質転換細胞を選択する方法 | |
| FI95285B (fi) | 2 m-plasmidivektori, menetelmä sen valmistamiseksi sekä sen käyttö | |
| KR0181179B1 (ko) | 피치아 파스토리스 산성 인산효소 유전자의 디앤에이 단편 및 이를 사용하는 방법 | |
| Roberts et al. | Membrane protein sorting in the yeast secretory pathway: evidence that the vacuole may be the default compartment. | |
| JP2664123B2 (ja) | スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子 | |
| JP2795850B2 (ja) | 酵母発現ベクター | |
| FI100408B (fi) | Proteiinien glykosylaation säätelymenetelmiä | |
| US5284746A (en) | Methods of producing hybrid G protein-coupled receptors | |
| FI107939B (fi) | Kluyveromyces isäntäkantana | |
| US5077204A (en) | Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use | |
| CZ284251B6 (cs) | Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce | |
| EP0329501A1 (fr) | Séquence ars efficace chez yarrowia lipolytica et procédé pour sa préparation | |
| FI88407C (fi) | Dna-molekyl, transformerade jaestceller och foerfarande foer framstaellning av human-lysozym | |
| JP2710470B2 (ja) | 突然変異菌株の検出法 | |
| HUT50500A (en) | Process for expressing hiv-bonding proteines | |
| JP2757562B2 (ja) | 低グリコシル化組換えグルコースオキシダーゼ | |
| FI110006B (fi) | Hiivamutantit, joilla on vajavaisuus N-glykosylaatiossa | |
| JP2001516577A (ja) | ピキア・メタノリカにおける染色体の突然変異誘発 | |
| Gill | Approaches to the study of protein secretion in yeast | |
| JP2003509024A (ja) | ピチア・メタノリカグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ２プロモーター及びターミネーター | |
| JPH06253858A (ja) | げっ歯類アポリポプロテインｅを有する融合遺伝子、それを挿入したプラスミドおよびその用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: ZYMOGENETICS, INC. |