JPH02419A - タンパク質のグリコシル化の調節方法 - Google Patents

タンパク質のグリコシル化の調節方法

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JPH02419A
JPH02419A JP63272004A JP27200488A JPH02419A JP H02419 A JPH02419 A JP H02419A JP 63272004 A JP63272004 A JP 63272004A JP 27200488 A JP27200488 A JP 27200488A JP H02419 A JPH02419 A JP H02419A
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yeast
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ビビアン　エル．マッカイ
Susan K Welch
スーザン　ケー．ウェルチ
Carli L Yip
カルリ　エル．イップ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 一般的には、本発明は異種性タンパク質またはポリペプ
チドの産生方法に関し、より詳細には、タンパク質のグ
リコジル化の調節方法に関する。
（発明の背景） 組換えＤＮＡ技術の近年の進歩は、異種性ポリペプチド
産生用宿主として真菌細胞の使用をもたらした。最も広
範囲に利用できる真菌としては、パン酵母〔サツカロミ
セス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｐｌへ競ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）］が挙げられる。酵母細胞から培地中に異種
性タンパク質を輸送する酵母分泌タンパク質が開発され
てきた。輸送異種性タンパク質の精製を促進するために
少量の天然酵母タンパク質が培地中に輸送されている　
（旧ｔｚｅｍａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　　２１９　：　
６２０〜６２５．１９８３）。酵母の分泌経路を経るタ
ンパク質通過物には、多くの場合に生理活性の適当な維
持および／または完全な生理活性を達成するために必要
な変性、ジスルフィド結合の形成および糖タンパク質の
グリコジル化が施される。
酵母の分泌経路は、分泌に向けられたタンパク質のグリ
コジル化部位に、２つの結合様式を介するオリゴサツカ
ライドおよびマンノース成分の転移を司どる　（Ｋｕｋ
ｕｒｕｚｉｎｓｋａら、＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ。
皿：９１５〜９４４．１９８７）。〇−結合性グリコシ
ル化は、糖タンパク賞上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基への
１個のマンノース成分の転移により開始される。
ポリペプチド頂上のＡｓｎ残基へのコアオリゴサンカラ
イド構造の付加は、Ｎ−結合性グリコシル結合を構築す
る　（ＳｈｅｃｋｍａｎおよびＮｏｖｉｃｋ、　１ｎＳ
ｔｒａｔｈｅｒｎ　ら、編、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、ｏｆ　
Ｙｅａｓｔ　５ａｃｃｈａ−ｐシ１弦汀ｅｔｈａｂｏｌ
ｉｓｍ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　ｒｅｓｓｉｏｎ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　３６１〜３９３
ページ、１９８２）。Ｎ−結合性コアオリゴサツカライ
ド構造の付加のための受容体部位は、たとえ次のすべて
のトリペプチドがＮ−結合性グリコシル化に対するホス
トとならないとしても、Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒまたは八ｓ
ｎ　−Ｘ−Ｔｈｒ（（旦し、Ｘはいかなるアミノ酸であ
ってもよい）のトリペプチド配列を有する。このトリペ
プチド配列受容体は、哺乳類糖タンパク質中で同定され
たこれらの部位との一致を示す酵母糖タンパク質中に見
い出された（Ｋｕｋｕｒｉｚｉｎｓｋａ　　ら、Ａｎｎ
、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５６　：　９１５〜９４
４、１９８？　、参１ｔＵ。また、アスペルギルス・ニ
デユランス　（匙ｌ工口」↓ｕｓ　　ｎ１ｄｕｌａｎｓ
）　　もこれらのトリペプチド受容体配列において異種
性タンパク質をグリコジル化することが判明している。
酵母は、自然界でグリコジル化されることが明らかにな
っているＮ−結合性受容体部位において異種性垢タンパ
ク質をグリコジル化することが判明している。例えば、
ボウズ（Ｂｏｎｅｓ）メラノーマ細胞から単離された組
織プラスミノーゲン活性化因子は、４箇所の潜在的なＮ
−結合性グリコシル化部位を有し、そしてこれらのうち
３箇所がグリコジル化される。２箇所の潜在的なＮ−結
合性グリコシル化部位を含有するウシのプロキモシンは
、ウシの細胞と同じ部位でグリコジル化を示す酵母を用
いて発現させた場合、そのうちの１箇所だけがグリコジ
ル化される。前記Ｎ−結合性を有する酵母糖タンパク質
のコアオリゴサツカライド構造は、哺乳類の糖タンパク
質における類似のオリゴサツカライド構造と同一である
ことを示す（Ｂａｌｌｏｕ。
ｉｎ　５ｔｒａｔｈｅｒｎら、編、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、
ｏｆ　Ｙｅａｓｔ　５ａｃｃｈａｒｏＩＩｌｃｅｓ　：
　Ｍｅｔｈａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘ　
ｒｅｓｓｉｏｎ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　３３５〜３６０
ページ、１９８２）。
アウターチェーン（ｏｕｔｅｒ　ｃｈａｉｎ）グリコジ
ル化は、しばしば構造中の種特異性を示し、この構造が
タンパク質の生理活性の重要な役割を演する。
例えば、酵母産生糖タンパク質上のＮ−結合性コアオリ
ゴサツカライド構造に結合した外側鎖オリゴサツカライ
ドは、構造中で分岐し、哺乳類産生糖タンパク賞に存在
するアウターチェーンオリゴサツカライドとよく一致す
る。酵母では、七ノージーおよびトリアンノシル分技が
結合するところにマンノース残基がα、１→６結合した
骨核から成るアウターチェーンオリゴサツカライドは、
Ｎ−結合性オリゴサツカライドコア構造に連結する。
酵母は、このようにして異種性タンパク質をグリコジル
化する可能性があり、原物質の外側のオリゴサツカライ
ド鎖から著しく相違し得るそれらの存在をもたらしてい
る。アウターチェーンオリゴサツカライド組成のこの相
違は、これらのタンパク質の高次構造または活性が酵母
グリコジル化により妨害されるため生理活性の減少また
は欠失をもたらすであろう。
異種性オリゴサンカライド構造の存在は、療法剤として
組換え糖タンパク質の使用を考慮する場合に、難問を提
起する可能性がある。例えば、酵母細胞の全体をラビッ
トまたはヤギに注射した場合には細胞壁オリゴサツカラ
イド鎖が主として免疫原になることが示されている　（
Ｂａｌｌｏｕ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、　　２４５　：　１１９７．１９７０、およ
び５ｕｚｕｋｉら、展Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．１２　
：　１９．１９６８）。細胞壁に存在するオリゴサツカ
ライドは、インベルターゼのような分泌糖タンパク質に
存在するオリゴサツカライドと同一であることが明らか
にされている（前述の、５ｈｅｃｋｌｌｌａｎおよびＮ
ｏｖｉｃｋらの文献を参照）。
酵母で発現されている異種性糖タンパク質としては、免
疫グロブリン、Ｍｉ織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ
　ＰＡ）　、エプスタイン・バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒ）ウィルスの主要な外皮タンパク（ｇｐ３５０
）　　（Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｇｅｎｅ　５４　：　Ｉ１
３〜１２３．１９８７）、およびα２βハプトグロビン
（Ｖａｎ　ｄｅｒ　５ｔｒａｔｅｎら、ＤＮＡ　５：１
２６〜１３６．１９８６）が挙げられる。これらの糖タ
ンパク質をコードするｃＤＮＡ遺伝子で形質転換された
酵母細胞の研究は、タンパク質生産物が糖側鎖に関して
は異種性であることを示した。殆んどの場合に、異種性
生成物はタンパク質の高次グリコジル化生成物の混合物
から成る。この異種性および高次グリコジル化は、前記
生成物の療法上の使用を不適合にするであろう。さらに
、酵母産生糖タンパク質の前記異種性は、分泌細胞培養
物からそれらを精製するための追加の工程を増やす。
酵母で発現される糖タンパク質から糖残基を減少するか
または除去する試みにの中で使用され得る数種の方法が
公表されている。これらの方法には、グリコジル化阻害
剤の使用、生産後の脱グリコジル化およびクローン化Ｄ
ＮＡ配列の生体外変異が包含される。これらの方法がい
くらか有用であることを示すとしても、それらは、はん
の限定された成功をもたらすにすぎない。
グリコジル化阻害剤ツニカマイシンの使用は、酵母産生
タンパク買上へのサツカライドの付加を阻害し得る。し
かし、こうして得られるタンパク質は、活性を示さずそ
して細胞から輸送されない可能性がある。さらに、酵母
細胞のツニカマイシン処理は、タンパク質のＮ−結合性
グリコシル化を十分には阻害せず、非常に厳密に制御さ
れた条件下で実施せねばならず、かつ長期のインキュベ
ーションに使用することができない。従って、ツニカマ
イシン処理細胞に由来するタンパク質生成物は、グリコ
ジル化されたタンパク質とグリコジル化されていないタ
ンパク質の混合物を含み、調製物からツニカマイシンを
除去するための追加の工程が必要であろう。
Ｔｏｒｒｅｎ　ｔｉｎｏおよびＭａｌｅ３１により公表
されるようなエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニナ
ーゼＨ（エンドＨ）を用いるポリペプチドの生体外酵素
膜グリコジル化（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４９　
：　８１１〜８１１゜１９７４）が、ソマトスタチン（
Ｇｒｅｅｎら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌｌ。
血：　７５５８〜７５６５．１９８６）、α−１−アン
チトリプシン（Ｖａｎ　ｄｅｒ　５ｔｒａｔｅｎら、同
誌）、およびα２βハプトグロビン（Ｖａｎ　ｄｅｒ　
５ｔｒａｔｅｎら、同誌）のような酵母産生タンパク質
の脱グリコジル化に使用されている。酵母産生ｔＰＡの
変性しない条件下でのエンドＨ処理は、糖のすべてを除
去するためには役に立たず、その結果タンパク質生成物
はもとの異種性が残存するため、療法上の使用には適さ
ない。生体外脱グリコジル化のこの方法は、タンパク質
生成物の加工およびそのタンパク質の市販の製品から酵
素を完全に除去するに要する追加の工程が増加する欠点
を有する。これらの余分な工程は、製品原価を高め、そ
して必ずしもそのタンパク質からすべてのオリゴサツカ
ライド側鎖の除去をもたらさないであろう。
酵母産生糖タンパク質に関連する前記問題点解決に対す
る他の試みとしては、変異を用いるグリコジル化部位の
除去が挙げられる。潜在的なグリコジル化部位の１つま
たは全部を改変し、Ｎ−結合性グリコシル化を防いだヒ
ト組繊プラスミノーゲン活性化因子の変異が公表されて
いる（Ｈａｉｇｗｏｏｄら、ＥＰ　２２７，４６２．１
９８？、およびＭｅｙｈａｃｋら、ＥＰ２２５．２８６
．１９８７）。前記文献でＭｅｙｈａｃｋらは、酵母産
生の低グリコジル化ｔＰＡが生理活性を維持することを
報告している。しかしながら、かかるタンパク質は、安
定でないようであり、そのため市販用の製品としては適
さない。さらに、これらの変異は、各潜在性グリコジル
化部位での生体外変異誘発により生じ、そして酵母から
分泌される異種糖タンパク質をコードする各遺伝子また
はｃＤＮＡ上で前記変異誘発を繰り返さねばならない。
このような変異は、アミノ酸配列の変化を起こし、天然
に存在せず、かつ、安定性、半減期または熔解性が変化
した変性タンパク質をもたらす。
（発明が解決しようとする課題） 従って、当該技術分野では、減少したグリコジル化を伴
う酵母に由来する生理活性タンパク質の産生方法を改良
する必要性が存在する。そこで、本発明は、酵母分泌タ
ンパク質生成物に広範囲に適用し得る前述の方法を提供
することを目的とする。また、本発明の方法は、均一な
タンパク質生成物の精製のための少ない工程の有利な方
法をも提供し、この方法は、目的のタンパク質の製造原
価の低減をもたらす。
（課題を解決するための手段） 前述したように、本発明は、異種性タンパク質またはポ
リペプチドの産生方法を開示する。一般に、かかる方法
の一つは、 （ａ　）　糖タンパク質へのアウターチェーンオリゴサ
ツカライド成分の付加のために必要とされる生成物の遺
伝子に欠陥を有する真菌細胞に、調節プロモーター及び
その下流に続（前記欠陥を補完するＤＮＡ配列を含んで
なる第一のＤＮＡ構成物を導入すること、 （ｂ）第二のプロモーター及びその下流に続く分泌シグ
ナルをコードするＤＮＡ配列および異種性タンパク質ま
たはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなる
第二のＤＮＡ構成物を導入すること、 （ｃ）前記欠陥を補完するＤＮＡ配列が発現するような
第一の増殖条件下で前記真菌細胞を培養すること、 （ｄ）前記欠陥を補完するＤＮＡ配列が発現せず、且つ
前記異種性タンパク質またはポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列が発現するような第二の増殖条件下で前記真
菌細胞を培養すること、ならびに （ｅ）前記異種性タンパク質またはポリペプチドを単離
することを含んでなる。好ましい真菌細胞としては、ア
スペルギルス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ）および酵母が
挙げられる。
本発明の方法を利用して産生ずることができる各種のタ
ンパク質としては、組織プラスミノーゲン活性化因子、
ウロキナーゼ、免疫グロブリン、血小板由来成長因子、
プラスミノーゲン、トロンビン、ファクターＸＩＩＩ、
およびそれらの類似物が挙げられる。
本発明の他の態様は、娠タンパク質へのアウターチェー
ンオリゴサツカライドの付加のために必要とされる生成
物の遺伝子に欠陥を有する真菌細胞であって、該細胞に
、調節プロモーター及びその下流に続く前記欠陥を補完
するＤＮＡ配列を含んでなる第一のＤＮＡ構成物、なら
びに第二のプロモーター及びその下流に続く分泌シグナ
ルをコードするＤＮＡ配列および異種性タンパク質また
はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでなる第
二のＤＮＡ構成物により形質転換された前記細胞を開示
する。
本発明に関連する態様としては、表現型Ｍｎｎ９を有し
、かつ浸透圧の安定の不存在下で正常な形態のコロニー
を生じ得る酵母細胞を開示する。好ましい態様では、こ
の酵母細胞は、ｍ変異、またはさらにＭＮＮＩ遺伝子の
欠陥を有する。
本発明の好ましい態様では、一般に、 （ａ）表現型Ｍｎｎ９−を有し、かつ浸透圧の安定の不
存在下で正常な形態のコロニーを生じ得る酵母細胞に、
プロモーター、分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列お
よび異種性タンパク質またはポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を導入すること、 （ｂ）前記タンパク質またはポリペプチドをコードする
前記ＤＮＡ配列を発現するような条件下で前記細胞を培
養すること、ならびに （Ｃ）前記異種性タンパク質またはポリペプチドを単離
することを含んでなる。特に好ましい態様では、前記細
胞が酵母ＺＹ３００株に由来する。前記プロモーターは
、構成的プロモーターであるか、または調節プロモータ
ーであることができる。
本発明のさらに他の態様は、糖タンパク質へのアウター
チェーンオリゴサンカライド成分の付加のために必要と
される生成物の遺伝子に欠陥を有する酵母株の同定方法
を開示する。一般に、この方法は、 （ａ）固体培地上でプロテイナーゼＢ活性を有する酵母
細胞を培養してコロニーを形成すること、（ｂ）このコ
ロニーを透過性にすること、（Ｃ）この透過性にされた
コロニーを、アゾコール（ａｚｏｃｏｌ　ｌ）を含んで
なる組成物であって、４．０より高く、且つ７．４より
低いｐＨを有する該組成物で重層すること、 （ｄ）表現型Ｍｎｎ９−を示すコロニーの周囲に明瞭な
ハローを形成するのに十分な条件下で前記コロニーをイ
ンキュベーションすること、ならびに（ｅ）前記コロニ
ーの周囲の明瞭なハローの有無を測定し、それらから糖
タンパク質へのアウターチェーンオリゴサツカライド成
分の付加のために必要とされる生成物の遺伝子に欠陥を
示す酵母株を同定することを含んでなる。
本発明の他の態様では、糖タンパク質へのアウターチェ
ーンオリゴサンカライド成分の付加のために必要とされ
る生成物の遺伝子の欠陥を補完するＤＮＡ配列のクロー
ニング方法を開示する。
般的にこの方法は、 （ａ）前記遺伝子の欠陥を有する酵母細胞のＤＮＡ断片
ライブラリーで形質転換すること、（ｂ）固体培地上で
前記酵母細胞を培養し、コロニーを形成すること、 （Ｃ）コロニーを透過性にすること、 （ｄ）この透過性にされたコロニーを、アゾコールを含
んでなる組成物であって、４．０より高く、且つ７．４
より低いｐＨの該組成物を重層すること、（ｅ）表現型
Ｍｎｎ９−を示すコロニーの周囲に明瞭なハローを形成
するのに十分な条件下で前記コロニーをインキュベーシ
ョンすること、（ｆ）明瞭なハローを示さないコロニー
を選択すること、ならびに （ｇ）選択されたコロニーから前記欠陥を補完するＤＮ
Ａ配列を単離することを含んでなる。
本発明のこれらの態様およびその他の態様は、次の詳細
な説明および添付の図面により明らかとなるであろう。
（実明実施の最良の形態） 本発明を説明する前に、本明細書で使用される特定の語
の定義を示し、それらの理解を助ける。
ＤＮ、〜構１１Ｍとは、ヒトの介入を通して変性された
一本鎖かもしくは二本鎖のいずれかのＤＮＡ分子または
かかる分子のクローンであり、全体として天然に存在し
ない状態で組み合わされそして並列されたＤＮＡセグメ
ントを包含するものをいう。
人（ｍａｔｉｎ　　ｔ　　ｅ）　　　　　とは、酵母Ｍ
ＡＴ遺伝子生成物がそれに結合しその配列に結合する遺
伝子の発現の抑制をもたらすＤＮＡ配列をいい、「オペ
レーター」および「オペレーター配列」の語もまた前記
の要素の記述に使用される。
Ｕ型とは、５ＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル上で別個の均一なものとして移動する輸送または
分泌される塘タンパク質の産生により特徴付けられる酵
母細胞の表現型である。これらの糖タンパク質は野生型
の酵母細胞により産生される糖タンパク質特徴的な高グ
リコジル化を欠いている。
コアオリゴサツカライドとは、９〜１３個のマンノース
残基に連結した２個のＮ−アセチルグルコサミン（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）を含む糖タンパク質のＮ−結合性糖側鎖をい
う。代表的な変性コアオリゴサツカライドの構造は、第
１Ａ図および第１Ｂ図として図示される。
訓■プユよ二ｌ：ｔは、外的刺激に応答して変化するレ
ベルで、連結されたＤＮＡ配列の転写を指令するＤＮＡ
配列をいう。調節プロモーターは、ある場合には中間的
なレベルが得られるかも知れないが、一般的に、ｒオン
（ｏｎ）Ｊ　（最大の転写レベル）となるか、または「
オフ（Ｏｆｆ）」（転写が少ないかもしくは存在しない
）となり、細胞の環境により異なるものである。
分１宸ヨ（Ｌ火とは、分泌ペプチドをコードするＤＮＡ
配列をいう。なお、分泌ペプチドとは、細胞からの成熟
ポリペプチドまたはタンパク質の分泌を司どる作用を有
する疎水性アミノ酸のコアにより特徴付けられるアミノ
酸配列をいう。典型的には、分泌ペプチドは、新たに合
成されたタンパク質のＮ−末端に見い出され、分泌過程
で成熟タンパク質から開裂される。
前述のごとく、本発明は、異種性糖タンパク質を変化し
たコアグリコジル化を伴って真菌細胞から分泌させるこ
とができる方法を開示する。具体的には、本明細書に記
載される前記方法は、糖タンパク質へのアウターチェー
ンオリゴサンカライド成分の付加のために必要とされる
生成物の遺伝子に欠陥を有する宿主細胞の使用により、
変性コアオリゴサツカライド成分を含有する糖タンパク
質の産生を可能とする点で有利である。これらの方法は
、糖タンパク質の産生後の変性のためのかなり高価な方
法に依存することな〈実施できるだけでなく、細胞また
は細胞生成物にグリコジル化阻害剤を添加することなく
前記方法が実施できる。
本発明の宿主細胞として使用し得る真菌細胞としては、
酵母菌株〔例えば、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍ匹競）Ｓｐ凱、シゾサツカロミセス・ボムベ（Ｓｃｈ
ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　　侭口狙）　）　
、または糸状状真菌（例えば、アスペルギルス（ハ匹ユ
辷迦）ｓｐｐ１、ニュロスポラ　（籾■並匹昆）ｓｐｐ
、　）が挙げられる。例えば、酵母サツカロミセス・セ
レビシェ（Ｓａｃｃａｒｏｍ　ｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）は、酵母細胞が分泌を司どるタンパク質のオ
リゴサツカライドコア構造に、アウターチェーンオリゴ
サツカライドを付加することを可能にする遺伝子（皿〔
庫蕉利）を担う。これらの遺伝子（Ｌ姐−＃且）の欠陥
を有する変異株は、糖タンパク質にアウター・マンノー
ス成分を付加せず、均一量のグリコジル化を有する糖タ
ンパク質をもたらす。
アウターチェーンオリゴサツカライド成分の付加のため
に必要とされる遺伝子は、種々の方法で同定することが
できる。例えば、−の方法は、Ｂａ　ｌ　Ｉｏｕらによ
って公表されている（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
％匝：　５９８６〜５９９１．１９８０）。この方法で
は、酵母細胞表面上に存在するマンノース成分に対する
、好ましくは酵母面変異細胞表面上に存在するそれらの
マンノース成分に対する抗体が産生される。
酵母細胞、好ましくは一倍体ｍｎｎ２細胞は、変異誘発
される。次に、抗体、好ましくは標識された抗体を使用
し、変異誘発された細胞の中から抗体と結合しない集団
を同定する。次いで、これらの変異細胞を相互に交雑さ
せ遺伝的に補完された群を樹立する。２種の変異細胞間
の補完は、変異誘発される前の親の表現型を有する二倍
体をもたらす。
前記変異誘発される前の親の表現型についてスクリーニ
ングするための好ましい方法は、親株のマンノース成分
に対して向けられる抗体を使用することである。この方
法により、４つの補完群（ｍｎｎ７−ｍｎｎ　１０と称
する）が樹立される。グリコジル化変異株の他の真菌は
、変異株同定のこの方法を用いて分離することができる
。
別法としては、３個以上のマンノース残基を含有するオ
リゴサンカライドに対して高い特異性を有するレクチン
、コンカナバリンＡの特性を利用する方法が挙げられる
。変異誘発された細胞をコンカナバリンＡのカラム上に
通過させる。マンノース残基が３個より少ない細胞表面
塘タンパク質を示す細胞は、かかるカラムから溶出され
、この溶出物から単離することができる。同様に、第三
の方法は、マンノース残基が３個より多いい細胞表面糖
タンパク質を示す細胞に結合でき、マンノース残基が３
個以下の糖タンパク質を示すグリコジル化変異株とは結
合しない標識化コンカナバリンＡを用いてグリコジル化
変異株を同定することから成る。
グリコジル化変異株を分離する第四の方法としては、宿
主細胞に、分泌シグナルをコードする配列及びこれに続
く糖タンパク質をコードするｃＤＮＡ又は異種性遺伝子
を含んで成るＤＮＡ構成物を導入するものが挙げられる
。この形質転換宿主株を変異誘発し、こうして変異誘発
された集団は、減少したグリコジル化を伴う異種タンパ
ク質の生成物を分泌する。
ｍｎｎ９変異株をスクリーニングする好ましい方法とし
ては、ブロテイナーゼＢをアッセイした場合にｍｎｎ９
細胞の予期できない応答を用いるものが挙げられる。詳
細には、ＰｒＢ”である細胞（プロテイナーゼＢ活性を
存する細胞）を、窒素源、無機塩、ビタミン、炭素源、
および浸透圧安定剤を含んでなる固体複合培地（化学的
に定義されていない）で増殖させるか、または浸透圧安
定剤を給供した固体合成培地の選択条件下で増殖せしめ
る。
これらの固体培地は、寒天、アガロース、ゼラチンまた
は類似物を含む。特に好ましい複合培地としては、ＹＥ
ＰＤＳ　（２％の酵母エキス、１％のペプトン、２％の
グルコース、１Ｍのソルビトール）が挙げられる。複合
培地上で増殖したコロニーを、スフェロプラスト化によ
るか、または徹底的な細胞溶解を起さないように膜に作
用する溶媒の蒸気にさらすことにより透過性にする。適
当な溶媒としては、トルエン、クロロホルムまたは当該
技術分野で一般的に知られている他の類似の溶媒が挙げ
られる。合成培地上で増殖したコロニーは、そのままか
またはフィルター、例えばニトロセルロース・フィルタ
ーもしくは濾紙に移しく合成培地の低いｐＨを補うため
）、次いでそのフィルターを酵素剤にさらすかまたは好
ましくは液体窒素に浸すことにより細胞溶解する。濾紙
上で増殖したままか、または濾紙に移されたコロニーを
、溶媒蒸気にさらすことにより透過性にすることができ
る。
次に、このフィルターを固体合培地上に置く。その後、
アゾコール（ａｚｏｃｏｌｌ）を、好ましくは上層寒天
（ｔｏｐ　ａｇａｒ）　ｌ　ａ／当たり約１０ｍｇ含ん
でなり、そしてｐＨ４，０〜７．４、好ましくは約ｐＨ
７，０を有する上層寒天により前記透過性コロニーを重
層する。
このプレートを、２０°Ｃ〜４０℃、好ましくは３７°
Ｃの温度で、３時間〜２４時間、好ましくは５〜８時間
の範囲内でインキュベーションする。
表現型Ｍｎｎ９−を示すコロニーは、その周囲に明瞭な
ハローを形成する。
次に、ｍｎｎ７−　ｍｎｎ９変異株を使用して、対応す
る遺伝子をクローニングする。例として、遺伝子型が、
酵母ＤＮＡ断片のプールから、より具体的には、ゲノム
酵母ＤＮＡ断片のプールからクロニングされた。本発明
の範囲内には、例えば、ＮａｓｍｙｔｈおよびＲｅｅｄ
により公表されている方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７　：　２１１９〜２１２３
．１９８０）によって調製される酵母／Ｅ・コリー（Ｅ
、　ｃｏｎ）ベクターにクローン化されているＤＮＡ断
片のライブラリーも入る。詳細には、ゲノム酵母ＤＮＡ
を調製し、次いで適当な制限酵素で消化して、約５ｋｂ
〜約２０ｋｂを有する断片を生じさせる。好ましい酵素
としては、５ａｕ３Ａのような“４塩基切断”するもの
が挙げられる。次に、適当な制限酵素で消化して線状に
された適当な酵母／Ｅ・コリーシャトルベクターに前記
で得た断片を連結する。線状にしたベクターは再環化を
避けるために脱リン酸化することが好ましい。適当なベ
クターとしては、ＹＥｐ１３　（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅ
ｎｅ　８　：　１２１〜１３３．　１９７８）。
ＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ　ら、　Ｎａｔｕｒｅ
　　２７５　　：　　３９〜４５．　　１９７８）。
ｐＪＤＢ２１９およびｐＪＤＢ２４８　（Ｂｅｇｇｓ、
　Ｎａｔｕｒｅ　　２７５：１０４〜１０８．１９７８
）、ＹＣｐ５０　（ＫｕｏおよびＣａｍｐｂｅｌｌ。
Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　　３　：１７３（１〜
１７３７．１９８３）ならびにそれらの誘導体が挙げら
れる。かかるベクターは、一般に、選択マーカーを含ん
でいる。選択マーカーとは、選択する方法が存在する何
等かの優性マーカーが含まれるであろう。かかる選択マ
ーカーとしては、栄養要求性マーカー、例えば、ＬＥＵ
２　（このものは、Ｉｅｕ２変異を担う宿主株での選択
を可能にする）、または抗生物質耐性をコードする遺伝
子、例えば、クロラムフェニコールトランスアシラーゼ
（ＣＡＴ）（このものは、クロラムフェニコールの存在
下で細胞の増殖を可能にする）を挙げることができる。
他方、これらは、選択マーカーとして「必須遺伝子Ｊ　
　（ＫａｗａｓａｋｉおよびＢｅ１ｌ、　ＥＰ　１７１
．１４２）　、例えばスキゾサッ力ロミセス・ボムベ（
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　崩ｅ）の遺
伝子型（このものは、宿主細胞の皿変異を補完し、グル
コースの存在下での細胞の増殖を可能にする）を含んで
いてもよい。前記連結混合物でＥ・コリー株、例えば、
ＲＲ１（Ｂｏｌｉｖｅｒら、Ｇｅｎｅ２：９５〜１１３
．１９７７）を形質転換し、酵母ＤＮＡ断片のライブラ
リーを増幅することが好ましい。酵母の形質転換体の選
択を促進するために、前記Ｅ・コリー形質転換体ライブ
ラリーからプラスミドＤＮＡを調製し、次いで、遺伝子
型が旦皿でありかつ酵母／Ｅ・コリーシャトルベクター
上に存在する適当なマーカーにより補完される欠陥遺伝
子を含んでいるであろう酵母細胞に導入する。形質転換
体コロニーは、宿主細胞中のプラスミドの存在について
の適当な選択方法により選択される。次に、これらの形
質転換体を、ｍｎｎ９欠陥の補完についてスクリーニン
グする。スクリーニング方法としては、野生型の酵母細
胞のマンノース残基に対して向けられる抗体の使用、お
よび変異株のｔＪ！量の測定が挙げられる。好ましいの
は、前述のプロテイナーゼＢアッセイを利用してｍｎｎ
９変異の補完についてスクリーニングする方法である。
クローン化した遺伝子皿楓を含有するコロニーは、明瞭
なハローの不存在により同定される。
ＭＮＮ９ｉ１伝子のクローンは、プラスミドの脱落試験
により、復帰変異によるのではなくプラスミド担持性（
ｐｌａｓｍｉｄ　ｂｏｒｎｅ）であることが確認される
。
プラスミドの脱落は、非選択的な条件下で酵母細胞を増
殖せしめ、プラスミドの脱落に伴い表現型Ｍｎｎ　”が
失われるか否かを決定することにより達成される。前記
陽性のクローンからＤＮＡを、当該技術分野で既知の方
法（例えば、Ｈａｒｔｉｇら、Ｍｏｌ、Ｃｅ１１．Ｂｉ
ｏｌ、　　６　：１２０６〜１２２４．１９８６）を用
いて調製する。制限部位のマツピングは、ｍｎｎ９の欠
陥を補完するために必要なゲノム挿入部の最小の断片を
決定することにより実施できる。また、このＤＮＡ配列
は、前記クローン化された遺伝子についても決定するこ
とができる。
ＭＮＮ７　、　ＭＮＮ８およびＭＮＮ　１０をコードす
るｃＤＮＡの遺伝子は、宿主細胞において、それぞれＭ
ＮＮ７　、　ＭＮＮ８またはＭＮＮ　１０における遺伝
的欠陥を補完するために前述のような酵母ＤＮＡ断片ラ
イブラリーを用いてクローン化するこ・とができる。し
かながら、ＭＮＮ９遺伝子のクローンの同定に用いられ
る好ましいスクリーニング方法は、ＭＮＮ７　、　ＭＮ
Ｎ８またはＭＮＮＩＯ遺伝子のクローンを同定するため
に、同じように適当であるとは限らない。この場合の好
ましいスクリーニング方法としては、野生型のオリゴサ
ツカライド成分に対して向けられた抗体の使用およびオ
リゴサツカライド含有量の測定（Ｂａｌｌｏｕの公表し
た前述の文献、１９７０および同、１９８０）が挙げら
れる。陽性のクローンは、聾遺伝子クローンについて記
載したようにさらに特徴付けることができる。
本発明に従えば、アウターチエイングリコジル化を調節
プロモーターの使用を介して制御し、クローン化された
ＭＮＮ７　、　）ＩＮＮ８　、　ＭＮＮ９または？ＩＮ
Ｎ　１０遺伝子の発現を誘導することができる。ｍｎｎ
７　　ｍｎｎｌＯ表現型を示す細胞は、浸透圧支持の非
存在下で増殖が遅くなり、細胞溶解に対して異常に敏感
になる。活発な細胞増殖の間のこれらの遺伝子の調節さ
れた発現が、糖タンパク質および細胞壁成分の野生型グ
リコジル化を伴い、野生型と同様に前記細胞が増殖する
ことを可能にするであろう。次に、調節プロモーターは
、単にコアグリコジル化のみを伴う異種性蛍白質または
ポリペプチドの産生可能にするようにターンオフされる
。前記クローン化されたＭＮＮ遺伝子に融合した調節プ
ロモーターを含んでなる発現単位は、プラスミド担持性
であることができ、この場合には、該発現単位は宿主菌
株のｍｎｎ変異を補完し得るであろう。また別の場合に
は、前記発現単位は宿主のゲノムにに組込まれていても
よい。
酵母における異種および同種ＤＮＡ配列の両方の発現を
誘導する調節プロモーターの使用は、当該技術分野でよ
く知られている。かかる配列の調節は、多数ある調節プ
ロモーターのいずれかの一つを使用して行われている。
本発明の使用に好ましい調節プロモーターとしては、赳
収プロモーター（Ｙｏｕｎｇら、　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃＥｎ　ｊｎｅｅｒｉｎ　　ｏｆ　）’ｌ１ｃｒｏｏｒ
　ａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ＋Ｈｏ１
ｌａｅｎｄｅｒら、馬、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：　Ｐｌｅ
ｎｕｍ、　　３３５ページ、１９８２）、およびＡＤＨ
２−Ｒ’プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔｕｒ
ｅ　　３０４　：　６５２〜６５４．１９８３）が挙げ
られる。
特に好ましいプロモーターとしては、ＭＦｏｔ１プロモ
ーター（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｉｖｉｔｚ、
　Ｃｅ旦　皿：９３３〜９４３．１９８２）が挙げられ
る。また別の特に好ましいプロモーターとしては、ＳＸ
Ｒプロモーター（米国特許出願番号第８８９．１００号
明細書に記載されている。なお、該明細書の内容はここ
で引用することにより本明細書の内容となる）が挙げら
れ、このものは１又は複数の接合型（ｍａｔｉｎｇ　ｔ
ｙｐｅ）調節要素と構成的プロモーター（例えば、Ｊプ
ロモーター）を組み合わせている。
接合型（ｍａｔｉＢ　ｔｙｐｅ）調節要素は、接合型に
特有の態様で発現される酵母遺伝子の上流領域から単離
することができ、または新たに構築することができ、一
般に約２０塩基対（ｂ、ρ、）〜約３２ｂ、ｐ。
の長さを有する。この型のプロモーターは、サイレント
接合型遺伝子座の発現のために必要な遺伝子の条件変異
（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む
酵母株で使用される。「条件変異」の語は、ある環境条
件下で前記活性遺伝子生成物の減少または欠失をもたら
し、相違する環境条件下でその活性遺伝子生成物の正常
（野生型）の濃度をもたらす遺伝子の変異を意味するも
のと理解される。最も普通の条件変異は、温度感受性変
異である。温度感受性変異は、此、牡Ｃ，ゴおよび旦且
変異を含む、サイレント接合型遺伝子座の発現のために
必要な遺伝子中に存在する。温度感受性変異ｓｉｒ３〜
工が特に好ましい。
前記ｓｉｒ３−８変異（ｓｔｅ８としても知られている
、Ｈａｒｔｎｅｌｌ、　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　　
瑣し８１１．１９８０）は、２５゛ｃではＨＭＬおよび
ＨＭＲ遺伝子座における情報の発現を遮断するが、一方
、３５°Ｃではこれらの遺伝子座の発現が遮断されず、
そのためＨＭＬおよびＨＭＲ遺伝子座における情報が発
現されるような温度感受性変異である。ＳＸＲプロモー
ターで使用される接合型調節要素は、５ＴＥ２遺伝子に
由来する。プロモーター中に置かれる要素は、活性５Ｉ
Ｒ３遺伝子生成物の有無に依存して注目の遺伝子の発現
を調節するであろう。
本発明で使用される酵母宿主株は、凹、凹ＭＮＮ９また
はＭＮＮ　１０遺伝子の中に遺伝的欠陥（ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　ｄｅｆｅｃｔ）を含み、アウターチェインオリゴサ
ツカライド成分の付加について細胞の無力化をもたらす
。例えば、この欠陥は、Ｂａ１ｌｏｕら（前述、１９８
０）に記載されるような肌皿変異、または好ましくは遺
伝子の断裂（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）、例えば凹遺伝子
の断裂（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）であり得る。遺伝子の
断裂は、遺伝子をコードしている配列が中断される自然
現象であるかまたは生体外遺伝子操作で生じ、不活性な
遺伝子生成物の産生をもたらすか、または全く遺伝子生
成物の産生をもたらさない。この中断は、あるＤＮＡ配
列の遺伝子をコードしている配列への挿入および／また
はそのコード配列の幾らかもしくは全ての欠失の形をと
り、タンパク質の産生を全くもたらさないか、又は完結
前の翻訳の終止をもたらす。ＤＮＡ配列の挿入および元
来のＭＮＮコード配列の欠失を含む遺伝子の断裂は、ｍ
ｎｎ点変異に見られるような野生型への復帰をしないで
あろう。
遺伝子の断裂は、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎが公表するように
必ず生ずる可能性がある（ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚ　ｍｏ−通、向ら、曙、■は：２０２〜２１１
）。例えば、好ましくはクローン化ＭＮＮ９遺伝子のコ
ード配列並びに５′及び３′の両方のフランキング配列
を含んで成る遺伝子ＭＮＮ９を含有するゲノム中の領域
と相同性を示すＤＮＡ配列を含んで成るプラスミドが構
築される。遺伝子ＭＮＮ９をコードしている配列は、好
ましくは選択マーカーの挿入により断裂される。
この選択マーカーは、前記遺伝子をコードしている配列
を中断するか、または該遺伝子をコードしている配列の
一部もしくは全部と置換してもよい。
選択マーカーは、そのための表現型アッセイが存在する
優性表現型を示すことによって欠失変異株の選択を可能
とする幾つかの遺伝子の１つであってもよい。好ましい
選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完するか、
抗生物質耐性を提供するか、または細胞が特定の炭素源
を利用することを可能にするものであって、例えばＩＪ
ＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｒｎら、Ｇｅｎｅ　　８　：１７
．１９７８）、　　ＬａＯ２（Ｂｒｏａｃｈら、前掲）
およびＨＩＳ３　（Ｓｔｒｕｈｌら、前掲）が挙げられ
る。
このうち、ＵＲＡ３マーカーが特に好ましい。他の好ま
しい選択マーカーとしては、ＣＡＴ遺伝子（酵母細胞に
クロラムフェニコール耐性を付与する）、またはＩａｃ
Ｚ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ活性の発現により青色
のコロニーをもたらす）が挙げられる。好ましくは前記
ベクター断片から単離される中断されたＭＮＮ遺伝子が
含んでなる線状ＤＮＡ＠片を、文献（例えば、Ｂｅｇｇ
ｓ、前掲）でよく知られている方法を用いて宿主細胞中
に導入する。
酵母宿主細胞は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクシボンＣＡｍｅｒｊｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ、　Ｍｄ、）またはイースト・ジェネテインク・ス
トック・センター（Ｙｅａｔ　Ｇｅｎｅ仁ｉｃ　５ｔｏ
ｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　Ｃａ１ｉ
ｆ、）から一般に入手し得る数多くの宿主細胞のいずれ
かの一つであることができる。宿主細胞は、ＭＮＮコー
ド配列を断裂するために使用された選択マーカーにより
補完される遺伝子的欠陥を担持することができる。好ま
しい酵母株としては、５ＥＹ２１０１　（？ＩＡＴａａ
ｄｅ２−１０１　１ｅｕ２　３．１１２’　　ｕｒａ２
−５２　５ｕｃ２−Δ９匹）またはＺＹｌｏｏ（ＭＡＴ
ａ　　ａｄｅ２　１０１　１ｅｕ２　３月２　　ｕｒａ
３　５２　５ｕｃ２−Δ９Ｌ■Ａｅ　４：撞ＡＴ）が挙
げられる。選択マーカーを含んでなる直鎖断片の組込み
は、優性マーカーを用いる選別またはスクリーニングに
より検出され、そしてサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、
　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　　９８　：　５０３〜５１
７．１９７５）および表現型試験により確認される。
宿主細胞としては、■…遺伝子ならびに匹。
ＭＮＮ８　、　ＭＮＮ９またはＭＮＮ　１０遺伝子に欠
陥を有するものが好ましい。ＭＮＮＩ遺伝子の欠陥では
、細胞のＮ−結合塘タンパク質のすべてにおいて末端α
１→３結合したマンノースが除去されている（Ｂａｌｌ
ｏｕの前記総説、１９８２、を参照）。この宿主細胞は
、例えばｍｎｎ９変異との組み合わせにより、９または
１０個のマンノース成分を有する変性コアオリゴサツカ
ライド構造を含有する糖タンパク質を宿主細胞が産生ず
ること可能にする。Ｕ…変異をｍｎｎ９株に、好ましく
はｍｎｎ９遺伝子断裂を担持する株に導入することがで
き、これはこの株を所望の株とクロスすることにより、
あるいは好ましくはｍｎｎ９断裂を担持する株中のＭＮ
ＮＩ遺伝子を破壊することにより行うことができる。Ｍ
ＮＮＩ遺伝子を断裂するには、まず最初にその遺伝子を
クローン化しなければならない。ＭＮＮＩ遺伝子は、適
当な酵母シャトルベクター中の酵母ＤＮＡ断片ライブラ
リーを用いて、前述のようにクローン化することができ
る。
これには、最初に前記ライブラリーでＥ・コリ宿主、好
ましくはＲＲＩ株を形質転換することにより該ライブラ
リーを増幅することが好ましい。形質転換されたＥ・コ
リからＤＮＡを調製し、そしてこれを用いて、ｍｎｎ１
でありかつ前記酵舟／Ｅ・コリーシャトルベクター上に
存在する選択マーカーにより補完される遺伝的欠陥を有
していてもよい酵母宿主を形質転換する。ＭＮＮＩ遺伝
子クローンの同定を容易にするためには、まず最初に宿
主細胞中に前記プラスミドが存在する形質転換体を選ぶ
。次に、この形質転換体をｍｎｎ１欠陥の補完について
スクリーニングする。ｍｎｎ１の補完のスクリーニング
方法としては、野生型オリゴサツカライド成分かまたは
匹細胞上に存在するオリゴサツカライド成分のいずれか
に対する抗体を使用して、宿主細胞にＭｎｎ１十表現型
を付与するＤＮＡ配列を有する形質転換体を同定するこ
とを含む（Ｂａｌｌｏｕ、前述、１９７０、およびＢａ
１ｌｏｕ、前述、１９８２）　、　ＭＮＮＩＮＮ性の形
質転換体をスクリーニングするために好ましい方法とし
ては、陽性クローンを確認するために野生型細胞の末端
αｌ→３結合したマンノース単位に対して向けられる抗
体を使用する方法が挙げられる。皿遺伝子のクローンは
、前述したように表現型Ｍｎｎ１＋の脱落を伴うプラス
ミドの脱落について試験することにより、プラスミド担
持であること確認することができる。制限部位のマツピ
ングは、肌１の欠陥を補完するために必要なゲノム挿入
部の最小の断片を決定して行うことができる。このＤＮ
Ａ配列はまた、クローン化した遺伝子について決定する
ことができる。
好ましい態様においては、ＭＮＮ７　、　ＭＮＮ８　、
　ＭＮＮ９もしくはＭＮＮ　１０に遺伝子上の欠陥を有
する酵母宿主細胞はまた、サイレント接合型遺伝子座の
発現のために必要な遺伝子中にも条件変異を含む。これ
らの遺伝子の変異は、前述したように接合型調節要素を
含有するプロモーターの使用を可能にする。
特に好ましくい条件変異は、ｓｉｒ３　８である。
ｓｉｒ３−８のような欠陥を有する酵母株は、例えば、
イースト・ジエネテインク・ストック・センター（Ｙｅ
ａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、
　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　Ｃａ１ｉｆ、）から広範囲に入
手することができるか、または変異および選択の常法を
用いて調製することもできる。ｓｉｒ３　８変異は、交
雑または変異および選択の常法を用いることにより、範
訂２囚刈、■楓、もしくはＭＮＮ　１０の遺伝子上に欠
陥を含有する株に導入することができる。異種性タンパ
ク質の産生を最大にするには、宿主細胞が、例えば、タ
ンパク質分解活性の減少をもたらす諷１変異（Ｊｏｎｅ
ｓ堕肘１弧　邸：２３〜３３．１９７７）のような変異
を伴うことが好ましい。
前述したように、調節された餅科、　？ｌＮＮ３　、聾
図またはＭＮＮ　１０発現単位は、このものがプラスミ
ドに担持されているか取込まれたものであるかにかかわ
らず、第二のプロモーターおよび目的の異種性遺伝子ま
たはｅＤＮＡに融合する分泌シグナルをコードする配列
を含んでなる第二のＤＮＡ構成物と耕み合わせて使用さ
れる。本発明の好ましい態様は、第二のプロモーターと
してクローン化されたＭＮＮ遺伝子の発現を司どるもの
と相違する調節プロモーターを使用することである。こ
の使用は、アウターチェインオリゴサツカライド成分を
含有するタンパク質生成物の産生を妨げるために異種性
遺伝子またはｃＤＮＡの発現性を変化される能力を付与
する。好ましい分泌シグナルとしては、酵母ＭＰ、　ｌ
　（Ｋｕｒｊａｎら、米国特許第４．５４６，０８２号
明細書；Ｓｉｎｇｈ　、ヨーロッパ特許公開第１２３，
５４４号公報）、ＰＨ０５（Ｂｅｅｋら、国際公開、Ｗ
ｏ　８６１００６３７号公報）、５ＵＣ２（Ｃａｒ　１
ｓｏｎら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　３　：　４
３９〜４４７１９８３）およびＢＡＲＩ　（Ｍａｃｋａ
ｙら、米国特許第４．６１３，５７２号明細書；　Ｍａ
ｃｋｅｙ、国際公開、ｗｏ　８７１０２６７０号公報）
の各遺伝子を挙げることができる。
目的の異種性遺伝子またはｅＤＮＡを含んでなる発現単
位は、プラスミドに担持された調節される発現単位と同
一のプラスミド上に担持されていてもよく、次いで宿主
細胞が形質転換される。他方、異種性遺伝子またはｅＤ
ＮＡを含んでなる発現単位は、別個のプラスミド上に存
在するか、宿主のゲノムに組込まれていてもよい。組込
みは、相同性部位で生ずる組換え現象であって、その部
位でＤＮＡ配列の挿入をもたらす。これらの発現単位は
、プラスミドに担持されているか、または組込まれてい
る調節されるＭＮＮ遺伝子とのいずれかの組み合わせで
使用することができる。これらの徂み合わせは、正常な
塘タンパク質の合成を伴いながら、細胞の対数増殖期間
を通じて細胞の増殖に害与えることなく、ＭＮＮ遺伝子
の正常な発現を可能にする。好ましい態様では、細胞が
活発に増殖する間中、異種性遺伝子が発現されないよう
に培養物の増殖条件が調節される。細胞が最高濃度に達
した時に、増殖条件を選択的に改変し、これによって−
ＭＮＮ遺伝子の発現を止め、変性コアグリコジル化を伴
う異種性タンパク質生成物が合成されることを可能にす
る。本発明に従って産生され得る異種性タンパク質およ
びポリペプチドとしては、成長因子（例えば、血小板由
来成長因子）、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロ
キナーゼ、免疫グロブリン、プラスミノーゲン、トロン
ビン、ファクターＸＩＩＩおよびこれらの類似物が挙げ
られる。
本発明に従えば、分泌に向けられた糖タンパク質へのア
ウターチエイン・オリゴサツカライドの（１加を調節す
るだめの他の方法は、独特かつ予期し得ない懸１断裂変
異株の分離を包含する。この変異株は、培養条件を操作
することを要しないで変性コアグリコジル化を含む異種
性糖タンパク質を産生じ得る酵母宿主を提供する。ｍｎ
ｎ９の断裂は、前述のように行われた。具体的には、選
択マーカー　（［ＩＲＡ３遺伝子）により中断された凹
をコートしている配列を含んでなるＤＮＡ構成物が５Ｅ
Ｙ２１０１に導入された。形質転換体は、ウラシルの存
在しない合成培地でのそれらの増殖能で選択された。
形質転換体は、Ｍｎｎ９−表現型の存在についてアッセ
イされた。サザン分析は、ＭＮＮ９遺伝子の断裂を確認
するために実施された。Ｕ　ＲＡ　３マーカーおよび表
現型Ｍｎｎ９−の残存ならびに邪遺伝子が完全であるこ
とを表すサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　、Ｊ、Ｍｏ
ｌ。
Ｂｉｏｌ、　９８　：　５０３〜５１７．１９７５）の
パターンを示す陽性のクローンが同定された。この閑株
に由来するゲノムＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳
動（ＳＨｔｈｅｒｎら、Ｎｕｃ、Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、
　１５　：　５９２５〜５９４３１９８７）は、ｍ断裂
単離体が少なくとも染色体Ｖおよび■を包含する染色体
変性を受けているこ七を示した。ＺＹ３００と称される
株（ＡＴＣＣ２０８７０）は、Ｂａ１ｌｏｕにより分離
されているｍｎｎ９点変異株（前述、１９８０）または
ｍｎｎ９の断裂株と確認されている他の株よりも早く増
殖する。この株の分析は、浸透圧支持の不存在下でそれ
が明らかに増殖し得ることを示す。盟と複製起点を含む
が亘旦または亘浮を含まない特定の酵母プラスミド（例
えばＹＥｐ１３）による前記株の形質転換は、これらの
プラスミドが親株に存在する変異２ミクロンのプラスミ
ドのために不安定であることを示した。ＩＩＥＰＩ　、
　ＲＥＰ２　。
ＲＥＰ３および複製起点を有するか、動原体断片および
複製起点を利用する酵母ベクターは、前記菌株中で安定
である。その株から変異２ミクロンのプラスミドを除去
して野生型２ミクロンのプラスミドでそれを置換し、そ
の株がＹＥｐ１３型の酵母ベクターを利用できるように
するのが好ましい。外来タンパクの産生のために、プロ
モーターおよび分泌シグナルをコードする配列並びにこ
れに続く目的のポリペプチドまたはタンパク質をコード
する配列を含んでなるＤＮＡ構成物が、ＺＹ３００株に
導入される。プロモーターは、調節プロモーターである
か構成的プロモーターであってもよい。得られるタンパ
ク質は、均一であり、そして特徴的な酵母の高グリコジ
ル化を欠いている。ＺＹ３００中には、匹吋断裂および
肌社断裂の両方が導入されることが好ましい。これらの
クローン化遺伝子の断裂は、前述の遺伝子断裂と同様に
実施される。
真菌の形質転換技術は、文献でよく知られており、そし
て例えば、Ｂｅｇｇｓ　（前述）　、Ｈｉｎｎｅｎら（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｔ、ＵＳＡ　７５
　：　１９２９〜１９３３．１９７８）、Ｒｕ５ｓｅｌ
ｌ（Ｎａｔｕｒｅ　　３０１　：　１６７〜１６９．１
９８３）、およびＹｅｌｔｏｎら、　　（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　’８１　　：　
　１７４０〜１７４７．１９８４）に公表されている。
宿主株は、ベクター上に存在する選択マーカーにより補
完される遺伝子の遺伝的欠陥を有してもよい。かかる遺
伝的欠陥としては、栄養要求性、例えば、スキゾサッ力
ロミセス°ボムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ　
ｃｅｓ匹刃狙）の匹■遺伝子により補完され得る並置が
挙げられる。特定の宿主および選択マーカーの選定は、
当業者のレベル内のものである。
本発明により産生されるタンパク質は、常法により精製
することができる。具体的な精製手順は、精製される個
々のタンパク質の特性によって決定されるであろう。か
かる決定も、当業者のレベル内にある。一般に、細胞培
養物を細胞から分離し、次いで培養物からタンパク質を
単離する。有用な単離技術としては、沈殿、免疫吸着お
よび分画または種々のクロマトグラフ法が挙げられる。
■ 皿上　Ｓ　セレビシェＭＮＮ９の′　　　のクローニン
ＬＢ３４７−ＩＣ Ａ４４７ ＸＶ７３２−Ｌ９八 ＸＰ６６０−２Ａ ＸＣＹＩ−５０ ＳＥＹ２１０１ 第１１ 酵母の遺伝子型 復馴。ｍｎｎ９　　Ｂ３旦 阻ａ　　ＩＣ皿」ユ肥 ＭＡＴ、　　Ｉｅｕ２Ｊ、１１２ 復ぼａ　」４」ユ肥 黒ａ　旦吐」ｄ肥 複馴ａ　　Ｉｅｕ２−３，１１２ ｓｕｃ２−Δ９　■肥 ｂａｒｌ−１− ｕｒａ３　　ｍｎｎ９ ｂａｒＬｌ　　江飢 犯四１　江且 ａｄｅ２−１０１ Ａ１叶土二辺馴 ｒａ３ 幻Ｕユ 幻す塁 町口旧 ｕｒａ３−５２ Ｙ１００ Ｙ３００ Ｙ４００ ３８１Ｇ−５９ａ ＬＩ−４Ｂ ＸＣＹＩ５−３Ｃ ＸＣＹ４２−２８Ｂ ＬＢＩ−２２０ 第ニー１０ｍ 酵母の遺伝子型 ＭＡＴａ　　ｄ　　ｆｆｉ　ｄ ｓｕｃ２−Δ９　■丘　Ａ月以匡舌虹 ＭＡＴａ　　１ｅｕ２−３ユ１２　　ａｄｅ２−１０１
　　ｕｒａ３−５２ｓｕｃ２−Δ９　　１ｇｊ１」−？
、　　ｍｎｎ９：：［ＩＲＡ３：：ｔｌ−１ＭＡＴａ　
　Ｉｅｕ２−３１１２　　ａｄｅ２−１０１　　ｕｒａ
３−５２ｓｕｃ２−Δ９面Ａｅ　４：瓜ＡＴ　　６ｍｎ
ｎ９：：ＵＲＡ３ＭＡＴａ　　ｓｉｒ３−８　５ＵＰ４
−３　　ａｄｅ２−１　　ｈｉｓ４−５８０ＭＡＴａ　
　畑画シＬ土１２　　℃ＩＬ」　復桓に」　ｈ婬１ｒ３
−８ ルけ、　　ａｄｅ２−１　　１ｅｕ２−３土Ｕ　Δｍｎ
ｎ９　：　：　ＵＲＡ３ＭＡＴａ　　ｓｉｒ３−８　６
ｍｎｎ９：：ＵＲＡ３　１ｅｕ２−３土ＵＡ、肛」二五
吋（医１説 飢則突然変異並びにＵＲＡ３　、　ＬＢＩ２及び■■遺
伝子中の遺伝的欠陥を有する旦、セレビシェ株を、前記
表に列挙された親株を用いて作製した。使用される遺伝
的方法及び培地は、−船釣に当業界に既知である。（た
とえば、Ｒ，に、Ｍｏｒｔｉｆｆｌｅｒ及びり、Ｃ。
１１ａｗｔｈｏｒｎｅ、　　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、　Ａ、）１．Ｒｏｓｅ及びＪ、Ｓ。
Ｈａｒｒｉｓｏｎ、出版者、Ｌｏｎｄｏｎ　：　Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。
Ｉｎｃ、、　Ｌｔｄ、、　３８５〜４６０ページ；及び
Ｉｌａｒｔｉｇ７ｊ　ｅ　、、藍を参照のこと。）　　
ＬＢ３４７−１ｅ株（Ｔｓａｉ笠ζ１、Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、　２５９　：　３８０５〜３８１１．１９８
４）を、ＺＡ４４７とクロスせしめた。二倍体を単離す
るために前記接合混合物から接合体が得られた。ＸＶ７
３２と命名された二倍体コロニーを胞子形成し、そして
切開した。胞子の四分子分析は、胞子が浸透圧安定性を
有さない培地上で増殖される場合、小コロニについて２
：２の分離比を示した。（浸透圧的に安定化されていな
い培地上での小コロニーの大きさは、ｍｎｎ９遺伝子の
存在と相関関係を示した。）ロイシン及びウラシル栄養
要求性を有するひじように小さなコロニーに発達した胞
子を選択し、そしテＸＶ７３２−１−９Ａと命名した。
コノ胞子をＸＰ６６０２Ａとクロスせしめた。二倍体を
、８０ｍｇ／ｆのロイシンを補充された最少培地（第２
表）上で選択し、二倍体ＸＣＹＩを得た。ＸＣＹＩを胞
子形成し、切開した。四分子分析が、その胞子に対して
行なわれた。胞子ＸＣＹＩ−５０（ＭＡＴαｍｎｎ９　
１ｅｕ２−３　１ｅｕ２二土浮　江飢　ｕｒａ３　　ｇ
ａｌｌ）を、朋楓遺伝子をクロニングするための宿主株
として選択した。
１１表 ｉｎＤ グルコース２０ｇ１ アミノ酸を含まないイースト・ニトロゲン・ベース（Ｙ
ｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ）（Ｄｉｆｃｏ
　ＬａｂｏｒａＬｏｒｉｅｓ。
デトロイト、ミシガン）６．７ｇ、及び寒天１８ｇ。
これらのすべての成分を蒸留水中で混合する。
１留水を添加し、最終体積をｉｆにする。１５分間オー
トクレーブ処理する。プレートに注ぎ、そして固化せし
める。
ＬｅｕＤＳ　プレート グルコース２０ｇ。
アミノ酸を含まないイースト・ニトロゲン・ペース　（
Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　デトロイト
、ミシガン）６．７ｇ。
アデニン４０■、 Ｌ−アルギニン３０ｍｇ、 Ｉ、−アスパラギン酸５０ｍｇ。
Ｌ−ヒスチジン−フリー塩基２０■、 Ｉ、−イソロイシン６０ｍｇ、 Ｌ−リシン−モノ塩酸塩４０ｍｇ、 Ｌ−メチオニン２０ｍｇ、 Ｉ７−フェニルアラニン６０■、 Ｌ−セゾン５０ｍｇ。
Ｌ−チロシン５０ｍｇ、 ウラシル４０ｍｇ、 Ｌ−バリン６０ｍｇ。
ソルビトール６０．７５ｇ、及び 寒天１８ｇ。
これらのすべての成分を蒸留水中で混合する。
蒸留水を添加し、最終体積を１１にする。１５分間オー
トクレーブ処理する。オートクレーブの後、Ｌ−）レオ
ニン１５０ｍｇ及びＬ−）リブトファン４０ｍｇを添加
する。プレートに注ぎ、そして固化する。
ＬｅｕＤＳ ＬｅｕＤＳプレートのための処方を使用する（但し、寒
天を除外する）。
−ＬｅｕＤプレート ＬｅｕＤＳプレートのための処方を使用する（但し、ソ
ルビトールを除外する）。
ｅｕＤ ＬｅｕＤＳプレートのための処方を使用する　（但し、
ソルビトール及び寒天を除外する）。
−ＴｒＤＳ　プレート グルコース２０ｇ１ アミノ酸を含まないイースト・ニトロゲン・ベース　（
Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、
ミシガン）６．７ｇ。
アデニン４０ｍｇ、 Ｌ−アルギニン３０ｍｇ、 Ｌ−アスパラギン酸５０ｍｇ、 Ｌ−ヒスチジン−フリー塩基２０ｍｇ、Ｌ−インロイシ
ン６０ｍｇ、 Ｌ−ロイシン８０■、 Ｌ−リシン−モノ塩酸塩４０■、 Ｌ−メチオニン２０■、 Ｌ−フェニルアラニン６０ｍｇ、 Ｌ−セリン５０ｍｇ、 Ｌ−チロシン５０■、 ウラシル４０■、 Ｌ−バリン６０■、 ソルビトール６０．７５　ｇ、及び 寒天１８ｇ０ これらのすべての成分を蒸留水中で混合する。
蒸留水を添加し、最終体積を１１にする。１５分間オー
トクレーブ処理する。オートクレーブの後、Ｌ−１−レ
オニン１５０＋ｎｇを添加する。プレート上に注ぎ、そ
して固化する。
二に飢 −ＴｒｐＤＳのための処方を使用する（但し、ソルビト
ール及び寒天を除外する）。
ＹＥＰＤＳ　プレート グルコース２０ｇ、 Ｂａｃ　ｔｏ−ペプトン（Ｄｉｒｃｏ）　　１０　ｇ、
酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）　　２０　ｇ、ソルビトール
６０．７５ｇ、及び 寒天１８ｇ。
これらのすべての成分を蒸留水中で混合する。
蒸留水を添加し、合計体積を１１にする。２５分間オー
トクレーブ処理する。プレート上に注ぎ、そして固化す
る。
亘旦竪 ＹＥＰＤＳプレートのための処方を使用する（但し、寒
天を除外する）。
ＹＥＰＤプレート グルコース２０ｇ１ Ｂａｃ　ｔｏ−ペプトン１０ｇ。
酵母エキス２０ｇ、及び 寒天１８ｇ。
これらのすべての成分を蒸留水中で混合する。
蒸留水を添加し、合計体積を１１にする。２５分間オー
トクレーブ処理する。プレート上に注ぎ、そして固化す
る。
用柱 ＹＥＰＤプレートのための処方を使用する（但し、寒天
を除く）。
［１ｒａＤＳプレート グルコース２０ｇ、 アミノ酸を含まないイースト・ニトロゲン・ベース　（
Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、
ミシガン）６．７ｇ、 アデニン４０ｍｇ、 Ｌ−アルギニン３０ｍｇ、 Ｌ−アスパラギン酸５０ｍｇ。
Ｌ−ヒスチジン−フリー塩基２０ｍｇ、Ｌ−イソロイシ
ン６０ｍｇ、 Ｌ−ロイシン８０ｍｇ。
Ｌ−リシン−モノ塩酸塩４０ｍｇ。
Ｌ−メチオニン２０ｍｇ、 Ｌ−フェニルアラニン６０ｍｇ、 Ｉ−−セリン５０ｍｇ。
Ｌ−チロシン５０ｍｇ、 Ｌ−バリン６０ｍｇ、 ソルビトール６０．７５ｇ、及び 寒天１８ｇ。
これらのすべての成分を蒸留水中で混合する。
蒸留水を添加し、最終体積を１１にする。１５分間オー
トクレーブ処理する。オートクレーブの後、Ｌ−トレオ
ニン１５０ｍｇ及びＬ−）リブトファン４０ｍｇを添加
する。プレート上に注ぎ、そして固化する。
−Ｌｅｕ−Ｔｒ　ＤＳ グルコース２０ｇ、 アミノ酸を含まないイースト・ニトロゲン・ペース（Ｄ
ｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト　ミ
シガン）６．７ｇ、 アデニン４０ｍｇ、 Ｌ−アルギニン３０ｍｇ、 Ｌ−アスパラギン酸５０ｍｇ、 Ｌ−ヒスチジン−フリー塩基２０ｍｇ、Ｌ−イソロイシ
ン６０ｍｇ。
Ｌ−リシン−モノ塩酸塩４０ｍｇ、 Ｌ−メチオニン２０ｍｇ、 Ｌ−フェニルアラニン６０ｍｇ。
し−セリン５０■、 Ｌ−チロシン５０■、 ウラシル４０ｍｇ、 Ｌ−バリン６０■、 ソルビトール６０．７５ｇ、及び 寒天１８ｇ。
これらのすべての成分を蒸留水中で混合する。
蒸留水を添加し、最終体積を１１にする。１５分間オー
トクレーブ処理する。オートクレーブの後、Ｌ−トレオ
ニン１５０■を添加する。プレート上に注ぎ、そして固
化する。
Ｍ　＋ＣＡ＋ａｍ　＋Ｗ ＮａｚＨＰＯ，’　Ｒ２０６ｇ　。
ＫＨ２ＰＯ４３ｇ　１ ＮａＣｊ７０．５　ｇ　。
ＮＨ４Ｃｌ１　ｇ。
カサミノＭ５　ｇ。
１ＭのＭｇ５０４１　ｍｌ、 ０．５ＭのＣａＣｊｌ！ｚｏ、２ｍ／、４０％のグルコ
ース５ｍｇ。
１■／ｄのチアミンＢ１１０ｄ、及び １０■／−のＬ−トリプトファン２ｍｌ。
これらの成分を蒸留水中に溶解する。蒸留水を添加し、
最終体積を１１にする。２５分間オートクレーブ処理す
る。オートクレーブの後、アンピシリン１００■を添加
する。
珈ユ９目１旺 Ｍｇ＋ＣＡｆａｍｐ＋Ｗのための処方を用いる（但し、
トリプトファンを除く）。
Ｂ、ブースミドＭｌｌｌの　１′ 第２図に示されるように、ＹＪ？ｐ７　（Ｓｔｉｎｃｈ
ｃｏｍｂ’ｊｌ−ｅ、、ｍ）ベクター配列及び酵母セン
トロメア囮を含む酵母シャトルベクターを作製した。
ｐＹｅ（ＣＥＮ３）４１（Ｃ１ａｒｋｅ及びＣａｒｂｏ
ｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　　２８７　：５０４〜５０９．１
９８０）に由来する酵母ＣＥＮ３配列を含有する６３０
ｂｐのＲａｍ　Ｈｌ　−５ａｕ　３Ａ＠片を、Ｂａａ　
ＨＪによる消化により線状化され、そして細菌性アルカ
リホスファターゼにより脱リン酸化されたｐｕｃｓ中に
連結した。その連結混合物を用いてＥ・コリ株ＪＭ８３
を形質転換した。その得られた形質転換体からプラスミ
ドＤＮＡを調製し、そしてＢａｎ＋　Ｈｌにより切断し
、囮フラグメントの存在を決定した。
陽性クローンをＥｃｏ　Ｒ１及びＢａａａ　）ＩＩによ
り消化し、その挿入部の方向を決定した。正しい方向に
■皿回片を有するクローンをｐＭｌｏｌＢと命名した。
プラスミドｐＭ１０１８をＲａｍ　ｔｌｌによる消化に
より線状化し、そしてＤＮＡポリマラーゼＩのフレノウ
フラグメントにより処理して接着端を平滑末端化した。
その線状化されたプラスミドを再環状化した。その得ら
れたプラスミドｐＭ１０２Ａを、ＨｉｎｃＩＩによる消
化により線状化し、そして次にＥｃｏ　ＲＩにより切断
し、０．６Ｋｂの凹フラグメントを単離した。Ｈｉｎｃ
ｎ−Ｅｃｏ　ＲＩフラグメントをＤＮＡポリマラーゼＩ
のフレノウフラグメントにより処理し、Ｅｃｏ　Ｒ１接
着端をフィルインし、平滑末端を存する０、６ＫｂのＣ
ＥＮ３フラグメントを得た。ＴＲＰＩ遺伝子の５′末端
に対して遠位の破壊されたＥｃｏ　Ｒ１部位を有するＹ
Ｒｐ７を含んでなるプラスミドｐＦＲＴ　−１を、Ｐｖ
ｕ　Ｉ［による消化により線状化した。そのρＦＩ？Ｔ
−１線状断片を、０．６ＫｂのＣＥＮ３断片に連結し、
そしてその連結混合物を用いて旦ニュユ株ＲＲＩを形質
転換した。その得られた形質転換体から調製されたＤＮ
ＡをＥｃｏ　Ｒ１により消化し、挿入部の存在を確認し
、そしてＣＥＮ３挿入部の方向を決定した。（１つの方
向においては、Ｐｖｕ　ｎ平滑末端への連結によりＥｃ
ｏ　ＲＩ部位が再生される。）その得られたプラスミド
をｐＭｌｌｌと命名する。
Ｃ，ＭＮＮの゛　　のクローニング ベクターｐＭ１１１中にクローン化されたＸ２１８０株
（ＡＴＣＣ２６１０９）からの酵母ゲノム断片のプール
を、凹遺伝子を単離するための出発材料として使用した
。簡単に言えば、ゲノムＤＮＡをＳａｕ　３Ａにより部
分的に切断し、そしてその得られたゲノム断片をベクタ
ーｐＭＩ１１　（ＤＢａｍＢａｍ中部位中−ン化した。
挿入部の平均サイズは８Ｋｂであった。
ｐＭｌｌｌ中のゲノムＤＮＡのプールを、Ｂｅｇｇｓ（
Ｎａｔｕｒｅ　　２７５　：　１０４〜１０８．１９７
８）により記載されているようにしてＸＣＹＩ−５Ｄ株
中に形質転換した。
形質転換体を、−ＴｒｐＤＳプレート（第２表）上で増
殖するそれらの能力により選択した。
その形質転換コロニーを再懸濁し、そしてＭａｃｋａｙ
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　　　１０
１　：　３２５〜３４３．１９８３）により記載されて
いる方法を用いて再プレートした。形質転換体コロニー
を上層寒天に再懸濁し、混合し、そして−ＴｒｐＤ　（
第２表）＋０．５ＭのＫ（Ｊ’中に再懸濁して前記寒天
上部から細胞を除去した。
この混合物を、３０°Ｃで２時間増殖せしめ、そして−
ＴｒｐＤＳプレート上にプレートした。コロニーを３０
°Ｃで−ＴｒｐＤＳプレート上で増殖せしめた。
次に、コロニーを、グリッド構成をなすマスターＴｒｐ
ＤＳプレート上に移した。そのマスタープレートのレプ
リカを−ＴｒｐＤＳプレート上に作製し、そして増殖せ
しめ、その後ＭＮＮ９の表現型を決定した。
およそ３，０００の陽性コロニーを、下記のセクション
Ｄに記載の方法を用いて、ＭＮＮ９表現型の存在につい
てアッセイした。１６のコロニーが、宿主株中に存在す
る肌ｉ突然変異に確実に補完することが見出され、そし
てそのようにするそれらの能力は、プラスミドの存在と
関連した。プラスミドＤＮＡを、ｌｌａｒｔｉｇ−なヨ
【２、　（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　　６　：２
１０６〜２１１４．１９８６）により記載されているよ
うにして前記１６の陽性コロニーから単離し、そして１
−株ＲＲＩ中に形質転換した。プラスミドＤＮＡを旦ニ
ュユ形賞転換体から単離し、そして制限酵素分析にかけ
た。１５のプラスミドが２つの共通Ｘｂａ　１部位を示
した。
ｍｎｎ９株中に形質転換される場合、Ｍｎｎ十表現型を
回復する最小挿入部を有するプラスミドを、ｐＺＹ２３
と命名した。プラスミドｐＺＹ２３は、ｐＭＩＩＩ中の
６Ｋｂの酵母ゲノムＤＮＡ挿入部を含有した。
ρＺＹ２３中に存在するゲノムＤＮＡ挿入部のサブクロ
ーンを構成し、そして補完性を調べるためにそれを用い
てＸＣＹＩ　−５Ｄ株を形質転換した。第３図に示され
るように、ｐＺＹ２３をＣ１ａ　ｒ及びＢｇｌ　ｆｆに
より消化することによって、ｐＺＹ２３のサブクローン
を構成し、ＭＮＮ９遺伝子を含有する３、ＩＫｂの断片
を単離した。次に、その断片を、Ｃ１ａ　Ｉ及びＢｇｌ
　ＩＴによる消化により線状化されたｐＨ１１１中に連
結した。その得られたプラスミドｐＺＹ３７を、Ａｍｅ
ｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ　に１株ＲＲＩ形賞転換体として寄託した（ＡＴ
ＣＣＮｏ、６７５５０）。クローン化された挿入部の２
．４　ＫｂのＢｇｌ　−５ｓｔ　Ｉ断片は、補完のため
に十分であることが見出された。この断片を、Ｂａｌ１
旧及び５ｓｔＩによる消化により線状化されたｐＨ１１
１中 ４８６、１９８４　；　ＡＴＣＣ３７４０８）中にサブ
クローン化した。この得られたプラスミドをｐＺＹ４８
　（第３図）と命名した。
Ｄ、ｌｊ」とじ伝火 コロニーの調製： 適切に増殖した細胞を、２種の方法の１つにより溶解し
た。第１の方法においては、ＹＥＰＤＳ　（第２表）中
で増殖したコロニーをクロロホルムにより処理し、細胞
を透過性にした。そのプレートを、クロロホルムにより
飽和されたペーパータオル上に逆さにした（室温で５分
間にわたって）。次に、そのプレートを３０分間垂直に
置き、アッセイする前、クロロホルムを藤発せしめた。
第２の方法が、プラスミドを維持するために合成培地上
での選択的増殖条件を必要とするコロニーのために使用
された。合成培地＋ＬＭのソルビトール上で増殖したコ
ロニーを、まずニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ。
Ｎ、Ｉ＋、）に移した。円形のニトロセルロースフィル
ターを、そのフィルターが完全に湿潤するまで、合成培
地＋ＩＭのソルビトール上で増殖されたコロニーの上部
に置いた。次に、そのフィルターを寒天の表面から注意
深くはぎ取り、そして３０秒間液体窒素中に浸した。こ
れにより細胞を効果的に破壊した。次に、フィルターを
、アッセイするためにＹＥＰＤプレート（第２表）上に
細胞側を上にして置いた。
アッセイ方法： 基質を下記のように調製したニ ブレート当たり：２％寒天２ｍ７を溶融し、５５°Ｃで
保持し、０．５ＭのＮａＨｚＰＯｎ（ｐＨ７，０）　１
−を添加しく５５℃）、２％ドデシル硫酸ナトリラム０
．１−を添加しく５５°Ｃ）、蒸留水６．４−を添加し
く５５°Ｃ）、２ｍｇ／−のシクロヘキシイミド（Ｓｉ
ｇｍａ、　　セントルイス、ミズーリ）０、５　ａ／を
添加し、そしてアゾコール（Ｓｉｇｍａ）１００−を添
加した。
アゾコールは溶解しない。その混合物を撹拌し、そして
プレート又はフィルター上のコロニー上に上層としてす
ばやく注いだ。
そのプレートを３７℃で５〜８時間インキュベートした
。Ｍｎｎ９−表現型を示すコロニーは、そのコロニーの
すぐ囲りのアゾコールを分解することができ、ｍｎｎ９
コロニーの囲りに透明なハローをもたらした。
ＪＭ２−　庫ｙ覇し６λ１裂 ＭＮＮ９遺伝子を断裂するために、第３図に示すように
ＭＮＮ９遺伝子中のユニーク旧ｎｄＩ［［部位とＥｃｏ
　Ｒ１部位との間のコード領域を１ＩＲＡ３遺伝子が置
換しているプラスミドを作製した。プラスミドｐ［ｃ１
９Ｒ中にＵＲＡ３遺伝子（ＹＥｐ２４に由来する；　Ｂ
ｏｔｓｔｅｉｎｒ、（５、、釦匹　８　：　１７．１９
７９）をコードする１、　３　ＫｂのＨｉｎｄＩ［［断
片を含んで成るプラスミドｐＨ４８を、ＨｉｎｄＩ［Ｉ
及びＸ＋ｎａ　Ｉにより消化し、１．ＩＫｂのＵＲＡ３
断片を単離した。この断片を、旧ｎｄｌｌｌ及びＸｍａ
　Ｉによる消化により線状化されたρＩＣｌ９Ｒ中に連
結した。
この得られたプラスミド、ｐＺＹ６１を旧ｎｄｌｌｌ及
びＥｃｏ　ＲＩにより消化し、１．ＩＫｂの朋断片を単
離した。プラスミドｐＺＹ４８をＥｃｏ　ＲＩ及び５ａ
ｌｌにより消化し、ＭＮＮ９の３′部分をコードする１
、２Ｋｂの断片を単離した。この断片を、此易断片及び
ｐＵｃ１３（ｌＩｉｎｄ［［及び５ａｌｌによる消化に
より線状化されている）と３部分連結により連結せしめ
た。その得られたプラスミドｐＺＹ６２を、旧ｎｄｌ［
［及び５ａｉｌにより消化し、ＭＮＮ９遺伝子の３′部
分に融合された１ＩＲＡ３遺伝子を含んで成る２、３Ｋ
ｂの断片を単離した。プラスミドｐＺＹ４８を５ｓｔｌ
及び旧ｎｄｌｌ［により消化し、０．４４ＫｂのＭＮＮ
９断片を単離した。この断片を、ｐＺＹ６３及びｐＵｃ
１３　（Ｓｓｔ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉにより線状化されて
いる）からの断片と３部分連結により連結した。得られ
たプラスミドｐＺＹ６３は、ＵＲＡ３遺伝子により断裂
された邪遺伝子を含んで成る（第３図）。
ゲノムＭＮＮ９を、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ（前記）により
記載された方法を用イテ、５ＥＹ２１０１及びＺＹ１０
０株（第１表）中で断裂した。プラスミドｐＺＹ６３を
５ｓｔＩ及び５ａｌＩにより消化し、ＵＲＡ３遺伝子に
より断裂されたＭＮＮ９コード領域を含む２．７Ｋｂの
フラグメントを単離した。このフラグメントを、酵母株
５ＥＹ２１０１及びＺＹ１００中に形質転換した。その
形質転換体を、ＵＲＡＤＳプレート（第２表）上で増殖
するそれらの能力に対して選択した。次に形質転換体を
、［で線状ＤＮＡフラグメントの組込みを示すＭ　ｎ　
ｎ　９−　表現型（例１．Ｄ）の存在についてアッセイ
した。陽性クローンを、非選択性培地上での増殖により
ＵＲＡ３マーカーの安定性について試験した。
陽性クローンをＹＥＰＤＳ　（第２表）５−中に接種し
、そして３０　’Ｃで一晩増殖せしめた。その−晩の培
養物ＩＩを新しいＹＥＰＤＳ５ｍＺ中に希釈し、そして
３０°Ｃで一晩増殖した。その２番目の一晩の培養物１
μｌをＩＭのソルビトール１０ｍＩ中に希釈した。
ＩＭのソルビトール１００μ！に添加された前記混合物
１ＯＩｌｌをＹＥＰＤＳプレート上に培養した。これら
のプレートを３０°Ｃで２４時間インキュベートした。
［ＩＲＡ３マーカーの安定性について試験するために、
コロニーを−ＵｒａＤＳ上にレプリカ培養した。
クローンのすべては安定していた。
サザンプロット分析を、組込み現象を確かめるために形
質転換体に対して行なった。ゲノムＤＮＡを　Ｄａｖｉ
ｓｇ＋シテ−０、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ８０　：　２４３２〜２４３６．１９８３
）によって記載された方法により調製し、そしてＥｃｏ
　Ｒ１及び５ｓｔｌにより切断した。消化物を０．７％
アガロースゲル中で電気泳動し、そして５ｏｕｔｈｅｒ
ｎ　（ｌ、１９７’５）により記載された方法に従って
ニトロセルロースフィルター上にフ゛ロットした。へｍ
ｅｒｓｈａｍランダムフ゛ライミングキット　（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｔｓ、、　　イ
リノイ）によりランダムにプライムされたＭＮＮ９のコ
ード領域（例１．Ｃ，）を含有する、ｐＺＹ４８からの
２．３Ｋｂのｌ１ｉｎｄ　ｍ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメ
ントにより、前記フィルターをプローブした。ＺＹ１０
０中での断裂体（ＺＹ４００と命名された）を、サテン
法に基づいて１．５及び１．５５Ｋｂのラベルされたフ
ラグメントの存在により確かめた。遺伝子の断裂を示さ
ない５ＥＹ２１０１株中での断裂体から、クローン（Ｚ
Ｙ３００と命名された。　ＡＴＣＣ取得番号２０８７０
）を単離した。さらなる実験はＭｎｎ９−表現型の存在
を確めた。
パルス−フィールドゲル電気泳動（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ広
−ど−０、前記、　、１９８７）を、ＺＹ３００及びＺ
Ｙ４００並びにそれらの親株に由来するゲノムＤＮＡに
対して行なった。ゲノムＤＮＡを、０ｖｅｒｈａｕｓｅ
ｒ及びＲａｄｉｃ（ＢＲＬ　Ｆｏｃｕｓ　　９　：　８
〜９．１９８７）により報告されたアガロースビーズ方
法の変法を用いて調製した。
簡単には、−晩の培養物を、ＹＥＰＤＳ　１５−中にお
いて３０°Ｃで培養した。その培養物を遠心分離し、そ
の上清液を除去し、そしてそのペレットをＳＣＥ　（Ｉ
Ｍのソルビトール、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ５−８＋　０．０１ＦのＮａＪＤＴＡ、　ｐＨ８，０
）　　５ｍｌ中に再懸濁した。その細胞懸濁物を、５０
−の三角フラスコに移した。５５°Ｃで維持されたパラ
フィン油１０ｍ１及び５５゛Ｃで維持された２、５％低
ゲル化アガロース（Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ　Ａｇａｒｏ
ｓｅ、　ＦＭＣＣｏｒｐ。
Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、ロックランド、メイン）１−
を、それぞれのフラスコに添加した。その細胞スラリを
、細かなエマルジョンが得られるまで、最大回転速度で
１分間激しく混合した。そのエマルジョンを、撹拌しな
がら、氷−水浴中で急速に冷却せしめた。
冷却の後、そのエマルジョンを５０−のポリスチレン管
に移し、そして２０−のＴＥ　８　（１０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｊ２，１ｍＭのＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０）を添
加した。その溶液を２５００ｒｐｍで５分間、遠心分離
し、そしてその後、パラフィン油及び上清液を除去した
。アガロースビーズを含むペレットを、３０ｍ１のＴＥ
Ｂ中に再懸濁し、そして前記段階に記載されたようにし
て遠心分離した。上清液を除き、そしてスフ二ロプラス
トａｔ街液〔ビーズ２−に関して：５ＣＥ３ａｔ／、０
．５ＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ９，０）　２　ｆｆ１７．１
　ｍｇのチモリアーゼ６０，０００（旧１ｅｓ、　Ｅｌ
ｋｈａｒｔ、　Ｔｎｄ、）、　　０．２５ａ／のβ−メ
ルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ
、　ＭＯ，）　）を添加した。その溶液を、回転ドラム
上で１時間３７“Ｃでインキュベートし、そしてその後
、その溶液を前記のようにして遠心分離した。上清液を
除き、そして０．５ＭのＥＤＴＡ　（ｐＨ９，０）　１
−を補充し、そして４°Ｃで貯蔵した。
酵母の染色体を、Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ　ｆｌ　ｅ　、、
（前記０．１９８７）により実質的に記載されているよ
うにして分離した。１％アガロースゲル中、パルスフィ
ールドゲル電気泳動（Ｓｅａｋｅｍ　Ａｇａｒｏｓｅ、
　ＦＭＣＣｏｒｐ。
Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　ロックランド、メイン）を
、Ｒｏｔｏｇｅｌ（Ｍｏｏｎｌｉｇｈｔ　Ｃａｔ　Ｄｏ
ｏｒ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　　シアトル、ワシントン）を
用いて行なった。酵母のＤＮＡを、臭化゛エチジウムに
よる染色により可視化した。その染色されたゲルの分析
は、ＺＹ３００株が少なくとも染色体■及び■が関与し
た染色体転位を受けたことを示した。サザンプロットを
、前記のようにしてゲルから製作し、そしてまず、ｐＺ
Ｙ４Ｂに由来する２、３Ｋｂの旧ｎｄ　Ｉ［［−Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩ　Ｍｎｎ９フラグメントにより、そして次に
ｐＨ４８に由来する１、　３　Ｋｂの１ｌｉｎｄｌ−ｔ
（ｉｎｄ　ｍ　ＵＲＡ３フラグメントによりプローブし
た（例２）。そのプローブはＡｍｅｒｓｈａｍランダム
プライミングキット　（Ａｍｅｒｓｈａｍ＋　Ａｒｌｉ
Ａｒｌｌｎ　Ｈｔｓ、、　　イリノイ）を用いてラベル
化した。サザンブロノトの結果は、ＺＹ３００及びＺＹ
４００の両者において、ＭＮＮ９のコード領域のすべて
が染色体ＸＶｒ　（ＭＮＮ９のための天然の部位）にマ
ツピングされ、そして［ＩＲＡ３が予定通りに染色体Ｘ
ＶＩ及びＶにマツピングされていることを示した。
ｍ　　ｍｎ口９　　　にお番るバリアーのＢＡＲＩ遺伝
子を含んで成るＤＮＡ構成物を、例２において生成した
ｍｎｎ９欠失株及び親株に形質転換してバリアー（Ｂａ
ｒｒｉｅｒ）タンパク質のグリコジル化を試験した。Ｂ
ＡＲＩ遺伝子生成物であるバリアー（Ｂａｒｒｉｅｒ）
は高度にグリコジル化することが示されている搬出され
るタンパク質である。ＡＤＨＩプロモーター、物質Ｐ　
（Ｍｕｎｒｏ及びＰｅｌｈａｍ、　ＥＭＢＯＪ、　３：
３０８７−３０９３．１９８４）のＣ−末端部分のコー
ド領域に融合しているＢＡＲＩコード領域及び迂」、タ
ーミネータ−を含んで成るプラスミドｐｓ１１２４を次
のようにして（第５図）作製した。完全なりＡＲＩ　１
−ド領域及びその関連するフランキング領域を含んで成
るプラスミドｐＺＶ９を５ａｌｌ及びＢａｍ　ＩＩＩに
より切断して１．３ｋｂ　ＢＡＲＩ断片を単離した。こ
の断片を、５ａｉｌ及びＢａＩＩ＋旧により切断された
ｐＵｃ１３にサブクローニングしてｐＺＶ１７と称する
プラスミドを生成せしめた（第４図）。プラスミドｐＺ
Ｖ１７をＥｃｏ　Ｒ１で消化してＢＡＲＩコード領域の
最も３′側の０．５ｋｂを除去した。ベクター−ＢＡＰ
Ｉ断片を再連結してｐ　Ｊ　Ｈ６６と称するプラスミド
を形成した。プラスミドｐＪＨ６６をＥｃｏ　Ｒ１によ
り線状化し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片）により平滑末端とした。キナーゼ処理され
たＢａＩＩＩＩＩＩリンカ−（５’　−ＣＣＧＧＡＴＣ
ＣＧＧ−３’　）を添加し、そしてＢａｍ旧により消化
して過剰のリンカ−を除去した後に再連結した。生ずる
プラスミドをｐＳＷ８と命名した。プラスミドｐＳＷ８
を５ａｌｌ及びＲａｍ旧により切断してバリアーのアミ
ノ酸２５２から５２６までをコードする８２４ｂ、断片
を単離した。バリアーのアミノ酸２５２から５２６まで
をコードする合成オリゴヌクレオチド配列を含有するプ
ラスミドｐＰＭ２゜Ｐ１１３ｍｐ８中の物質ＰのＣ−末
端部分のダイマー形をコードする合成オリゴヌクレオチ
ド配列を含有するプラスミドｐＰＭ２をＭｕｎｒｏ及び
Ｐｅｌｈａｍから入手した。プラスミドｐＰ？＋２をＢ
ａｍ旧及び５ａｉｌを用いる消化により線状化し、そし
てｐＳＷ８からの１ｌ１２４ｂｐ皿断片に連結した。生
ずるプラスミドｐｓＷ１４をＳａｌ　Ｉ及びＳｍａ　Ｉ
により消化して８７１ｂｐ　ＢＡＲＩ−物質Ｐ断片を単
離した。皿のアミノ酸１から２５０までをコードする断
片を含んで成るプラスミドｐＺＶ１６をＸｂａ　Ｉ及び
５ａｉｌ切断して７６７ｂｐ　ＢＡＲＩ断片を単離した
。この断片を８７１ｂｐ　ＢＡＲＩ−物質Ｐ断片と、Ｘ
ｈａ　Ｉ及びＳｍａ　Ｉにより切断されたｐＵｃ１８と
共に三部分連結した。ｐｓＷ１５と称する、生ずるプラ
スミドをＸｂａ　Ｉ及びＳｍａ　（により消化して１．
６４ｋｂ　ＢＡＲＩ−物質Ｐ断片を単離した。赳■プロ
モーター及びｐＵｃ１８　（ＭａｃＫａｙ、　Ｗｏ　８
７１０２６７０）中の臥■の５′コード領域の１１６ｂ
ｐを含んで成るｐＲＬＯ２９からＡＤＨＩプロモーター
を得た。プラスミドｐＲＬＯ２９をＳｐｈ　Ｉ及びＸｂ
ａ　Ｉにより消化して０．４２ｋｂ　ＡＤＨＩプロモー
ター断片を単離した。ＴＰＩＩターミネータ−（Ａｌｂ
ｅｒ及びＫａｗａｓａｋｉ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　　１．
Ｇｅｎｅｔ、上：４１０−４３４．１９８２）を、ｐＵ
ｃ１８（Ｅｃｏ　Ｒ１−５ｐｈ　Ｉ　）に連結されたＴ
ＰＩＩターミネータ−（平滑末端化されたＸｂａ　Ｉ　
−Ｅｃｏ　Ｒ１）０．７ｋｂを含有する平滑末端化され
たＸｂａ　Ｉ　−５ｐｈ　Ｉ断片として得た。この断片
を、０．４２ｋｂ赳■プロモ一ター断片及び１．６４ｋ
ｂ　ＢＡＩ？１−物質Ｐ断片と三部分連結により連結し
てプラスミドｐｓＷ２２を生成せしめた。プラスミドｐ
ＳＷ２２をＳｐｈ　ｒ及びＳｍａ　Ｔにより消化して２
．８ｋｂ発現ユニットを単離し、これを、Ｓｐｈ　Ｉ及
びＰνｕＩＩによる消化によって線状化されたＹＥｐ１
３に連結した。生ずるプラスミドをｐｓＷ２４と命名し
た（第５図）。
プラスミドｐＳＷ２４を肌荊欠失株ｐＺＹ３００及びｐ
ＺＹ４００並びにこれらの親株５ＥＹ２１０１及びｐＺ
Ｙｌｏｏに形質転換した。形質転換体を、−ＬｅｕＤＳ
プレート（第２表）上で増殖する能力について選択した
。形質転換体を５−の−ＬｅｕＤＳ（第２表）に接種し
、そして３０°Ｃにて一夜インキユベートした。５００
Ｉｉの一夜培養物を５０ｍ１の−ＬｅｕＤＳに接種し、
そして３０°Ｃにて４８時間インキュベートした。培養
物を遠心し、そして上清を２５０　＠ｌの遠心ビンにデ
カントした。−２０°Ｃで保持された同容量の９５％エ
タノールを加え、そして混合物を渦動撹拌し、そして−
２０°Ｃにて３０分間インキュベートした。
次に、混合物を９．　ＯＯＯｒｐｍにて３０分間ＧＳＡ
　（ツルパル）ローター中で遠心した。上清を廃棄し、
そしてタンパク質のペレットを室温にて一夜乾燥した。
乾燥したベレットを５００　ｐｌの蒸留水に再懸濁した
。
５０１１！の２×サンプル緩衝液（第３表）を再懸濁さ
れたサンプルの各々に添加し、そしてサンプルを１０％
ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、そしてＴｏｉ
ｌｂｉｎ等（Ｐｒｏｃ、　Ｓａｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
口ＳＡ匹：　４３５０−４３５３．１９７９）により記
載された方法を用いてニトロセルロースに移した。ニト
ロセルロースフィルターをラット抗−物質Ｐ　（Ｃａｐ
ｅｌｌ、　Ｍａｌｖｅｒｎ、　Ｐａ）によりプローブし
、そして西洋ワサビパーオキシダーゼ接合ヤギ抗−ラッ
ト抗体を用いて可視化した。イムノプロットは、ｌｌ１
ｎｎ９欠損株ＺＹ３００及びＺＹ４００中の抗−物質Ｐ
抗体により認識される均質種を示し、これらの株により
生産されるバリアータンパク質が均一であることが示さ
れた。親株は、抗−物質Ｐ抗体により認識される不均質
な超グリコジル化種を示した。
ｐｓＷ２４形質転換体を次に様にしてバリアー活性につ
いて測定した。形質転換された酵母細胞によるバリアー
生産の検出のために使用される測定は、α−ファクター
に暴露された惑受性主細胞の増殖の阻害を逆転させるバ
リアーの能力に頬る。α−ファクターに異状に感受性で
あるＲＣ６２９（ＭＡＴａｂａｒｌ）のごとき試験株を
用いて、寒天プレート上の軟寒天中にラウン（ｌａｗｎ
）を調製した。十分な量のα−ファクター（０，０５−
０，１ユニント、Ｍａｎｎｙ。
Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　　９６　：　１５９２　１
６００．１９８３）を上層に加えて細胞の増殖を阻害し
た。バリアーの生産についてスクリーニングされるべき
形質転換体を前記ラウン上にスポットした。形質転換さ
れた細胞によるバリアーの分泌がスポットの近傍の周囲
のα−ファクター増殖阻害を逆転せしめ、これによって
怒受性細胞の回復が可能となった。回復された細胞は、
形質転換された細胞のコロニーの通常平滑な縁の周囲の
周辺増殖として観察された。この周辺の存在により、形
質転換された株中のプラスミドがバリアータンパク質の
発現及び分泌を指令することが示された。形質転換体は
活性なバリアー蛋白質を生産することが示された。
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）　ｃＤＮＡ
を含んで成るＤＮＡ構成物をｍｎｎ９欠失株ＺＹ４００
に形質転換して、生産されたタンパク質のグリコジル化
を試験した。ＴＰＩＩプロモーター、成ＰＬＰＡ　ｃＤ
ＮＡ配列のセリンコドンに融合したＭＦα１シグナル配
列及びＴＰＩＩターミネータ−を含んで成るプラスミド
ｐＤＲ１４９８（酵母形質転換体Ｅ８−１１Ｃ株、＾Ｔ
ＣＣ＃２０７３０として寄託されている）をＺＹ４００
株及びその親株ＺＹ１００に形質転換した。
形質転換体を、−１，ｅｕＤＳプレート（第２表）上で
増殖するその能力について選択した。
形質転換体を例３に記載したようにして増殖せしめた。
３０°Ｃにて４８時間の増殖の後、培養物を２５−のア
リコートに分け、そして遠心した。
−セットの２５ｍ１アリコートからの上清をデカントし
、そして−７０″Ｃにて保存した。これらのそれぞれの
ペレットも７７０°Ｃにて保存した。
残った細胞ベレットに対して次の様にして細胞抽出を行
った。１ｍＺのリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ　：Ｓｉｇ
ｍａ、セントルイス、Ｍ、から得られる）＋１ｍＭεＤ
ＴＡを全容量の半分に加えた。混合物を全速で２．５分
間渦動撹拌し、渦動撹拌の間に氷上でサンプルを冷却し
ながらこれを３回行った。細胞溶解物をエッペンドルフ
小遠心管（Ｂｉｎｋｍａｎｎ、　　ウェストハレー、　
Ｎ、Ｙ）中で最高速度で１０分間４°Ｃにて遠心した。
可溶性細胞タンパク質を含んで成る上清を取り出し、そ
して−７０°Ｃにて貯蔵した。ベレットを１ｍｌの２　
ＸＴＮＥＮ　（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩基、２００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５％ＮＰ４０
．　　ｐＨ８，０に調整）で洗浄した。混合物を渦動撹
拌し、そして前記のようにして遠心した。膜タンパク質
両分を含んで成る上清を取り出し、そして−７０°Ｃに
て貯蔵した。
斑ｉ　　　で　　　れるＭＮＮ９　” ＴＰＩＩプロモーターをプラスミドｐＴＰＩｃ１０　（
Ａｌｄｅｒ及びＫａｗａｓａｋｉ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　
　１．Ｇｅｎｅｔ、土：　４１０−４３４゜１９８２）
　、及びプラスミドｐＦＡＴＰＯＴ（Ｋａｗａｓａｋｉ
及びＢｅ１ｌ、　ＨＰ　１７１，１４２　；　ＡＴＣＣ
２０６９９）から得た。プラスミドｐＴＰＩｃ１０をユ
ニークＫｐｎ　Ｔ部位で切断し、ＴＰＩＩコード領域を
Ｂａ１−３１エキソヌクレアーゼで除去し、そしてこの
プロモーターの３′末端にＥｃｏ　Ｒ１リンカ−（配列
：　ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を付加した。
Ｂｇｌｌｌ及びＥｃｏ　Ｒ１による消化がＢｇｌ■及び
Ｅｃｏ　ＲＩ接着末端を有するＴＰＩＩプロモーターを
もたらした。
次にこの断片を、ＢｇｌｌＩ及びＥｃｏ　Ｒ１（部分的
）により切断されたプラスミドＹＲｐ１“（Ｓ　ｔｉｎ
ｃｈｃｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ　　２８２　：　３９　
４３．１９７９）に連結した。生ずるプラスミドＴＥ３
２をＥｃｏ　Ｒ１（部分的）及びＣａｍ旧により開裂せ
しめてテトラサイクリン耐性遺伝子の部分を除去した。
次に、線状化されたプラスミドをＥｃｏ　ＲＩ　　Ｂａ
ｍ旧リンカ−の付加により再環化してプラスミドＴＥＡ
３２を得た。プラスミドＴＥＡ３２をＢｇｌ　Ｉｔ及び
Ｅｃｏ　Ｒ１で消化し、そして約９ｏｏｂｐの部分的Ｔ
ＰＩＩプロモーター断片をゲル精製した。プラスミドｐ
ｌｃ１９Ｈ（Ｍａｒｓｈ等、Ｇｅｎｅ　３２　：　４８
１−４８６．１９８４）をＢｇｌ　ｆｆ及びＥｃｏ　Ｒ
ｒで切断し、そしてベクター断片をゲル精製した。次に
、基プロモーター断片を線状化されたｐＩｃ１９Ｈに連
結し、そしてこの混合物を用いてＥ・コリＲＲＩを形質
転換した。プラスミドＤＮＡを調製し、そして約９ｏｏ
ｂｐのＢｇｌ　ＩｆＥｃｏ　Ｒ１断片の存在についてス
クリーニングした。
正しいプラスミドを選択し、そしてｐｌｃＴｒ’ＩＰと
命名した。
次にＴＰＩＩプロモーターをサブクローニングしてその
末端に便利な制限部位を設けた。プラスミドｐｌｃ７（
Ｍａｒｓｈ等、前掲）をＥｃｏ　Ｒ１で消化し、断片の
末端をＤＮＡポリメラーゼｌ　　（ＫＪｅｎｏｗ断片）
により平滑末端にし、そしてこの線状ＤＮＡを７４　Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて再環化した。得られる連結混合物
を使用してＥ・コリＲＲＩを形質転換した。形質転換体
からプラスミドＤＮＡをｇＩｉ製し、そしてＥｃｏ　Ｒ
１部位の喪失についてスクリーニングした。
正しい制限パターンを有するプラスミドをｐｌｃ７ＲＩ
”と命名した。プラスミドｐｌｃ７Ｒビを旧ｎｄＩ［［
及びＮａｒ　Ｉで消化し、そして２５００ｂｐ断片をゲ
ル精製した。部分的ＴＰＩＩプロモーター断片（約９０
０ｂｐ）をｐｌｃＴＰＩＰからＮａｒ　Ｉ及びＳｐｈ　
Ｉを用いて取り出し、そしてゲル精製した。罪プロモー
ターの残りをプラスミドｐＦＡＴＰＯＴから次の様にし
て得た。ことプラスミドをｓｐｈ　Ｉ及び旧ｎｄｌｌｌ
で消化し、そして理旦プロモーターの部分を含む１７５
０ｂｐ断片をゲル精製した。ｐｌｃ７ＲＩ”断片、ｐＩ
ｃＴＰＩＦからの部分的ＴＰＩＩプロモーター断片、及
びｐＦＡＴＰＯＴからの断片を三部分連結により連結し
てｐＭＶＲｌ　（第６図を生じさせた。
第６図に示すように、次にＭＡＴα２オペレーター配列
をＴＰＩＩプロモーターに挿入した。ｐＵｃ９の２．７
ｋｂのＳａｌ　ｒ　　Ｂａｎ　ＨＴ断片をプラスミドｐ
ＭνＲ１由来のせ旦プロモーターの０．９ｋｂのＸｈｏ
　Ｉ　−Ｂａｍ　［断片と連結することによりプラスミ
ドｐｓＸＲＬＯ１を作製した。次に、プラスミドｐｓＸ
Ｉ？１０１　中のＴＰ１１プロモーターのｓｐｈ　１部
位をユニークＸｈｏ　１部位に変えた。ｐｓＸＲｌｏｌ
　ＯＮ八をＳｐｈ　ｒで開裂せしめ、そして標準的方法
（Ｍａｎｉａｔｉｓ等編集、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１
゜ｎｉｎ　　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２）に従って脱リン酸化し
た。Ｓｐｈ　ＩＩ　　　ＸｈｏＩアダプター（ＧＣＴＣ
ＧＡＧＣＣＡＴＧ）を、２Ｑ　ｐ　ｍｏｄｅのこのオリ
ゴヌクレオチド、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７
，６）、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ２ｚ　、　　５ｍＭ　ＤＴ
Ｔ、　０．１ｍＭスペルミジン、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰ、及
び５ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼを含有する別
個の反応混合物中２０ＩＪｌの反応容積にて３７゛Ｃに
て３０分間キナーゼで処理した。このキナーゼ処理され
たＳｐｈ　１−Ｘｈｏｌアダプターをｓｐｈ　Ｉで切断
したｐｓＸＲｌｏｌと連結し、そしてこの連結混合物を
用いてＥ・コリＲＲ１を形質転換した。挿入されたアダ
プターを有するを制限酵素分析により同定し、そしてｐ
ｓｘＲｌ、０２と命名した（第６図）。阻α２オペレー
ターを特定するオリゴヌクレオチド（因子６０９：５　
　’　　−ＴＣＧＡＧ　　ＴＣＡ　　ＴＧＴ　　ＡＣＴ
　　ＴＡＣＣＣＡ　　ＡＴＴ　　ＡＧＧ　　ＡＡ＾ＴＴ
Ｔ　ＡＣＡ　ＴＧＧ−３’　、及び５　’　−ＴＣＧＡ
　ＣＣＡ　ＴＧＴ　ＡＡＡＴＴＴ　ＣＣＴ　ＡＡＴ　Ｔ
ＧＧ　ＧＴＡ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　ＴＧＡ　Ｃ−３’　）
を前記のようにしてキナーゼ処理した。プラスミドｐＳ
ＸＲ１０２をＸｈｏ　Ｉで切断し、そして標準的方法に
より脱リン酸化した。プラスミドＤＮＡ対オリゴヌクレ
オチドのモル比をｔ：ｔ、ｉ：３、及び１：６として３
種類の独立した連結を行った。生ずる連結混合物を使用
してＥ・コリＲＲＩを形質転換した。挿入されたオリゴ
ヌクレオチドを有するプラスミドをコロニーハイブリダ
イゼーション及び制限酵素分析により同定した。次のＤ
ＮＡ配列決定により、ｐｓＸＲＩ０４が２コピーのル［
α２オペレーターを含有していることが示された。
次の段階において、プラスミドｐｓＸＲ１０４をＢａｍ
旧で切断し、標準的方法（ＭａｎｉａＬｉｓ等編集、Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｉｎｇ　：八Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ、　　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、　１９８２）に従って脱リン酸
化し、そしてＥ・コリＩａｃ　Ｚ遺伝子を含有する３、
　２ｋｂＢａＩＩＩＩＩ−Ｒａｍ旧断片に連結した。こ
の連結混合物を使用してＥ・コリＲＲＩ株を形質転換し
た。適切な方向にＩａｃ　Ｚ断片を含有するプラスミド
をｐＳχＲ１１１と称する。
第７図に示すように、ＭＮＮ９遺伝子をプラスミドｐｓ
ＸＲ１１１中に存在するバイブリドプロモーターの制御
のもとにおいだ。プラスミドｐＺＹ４８を旧ｎｄｌ及び
ＰｓｔＩにより消化して０．５６ｋｂ　ＭＮＮ９断片を
単離した。この断片をＤｄｅ　Ｉで切断して０．３６ｋ
ｂのＭＮＮ９断片を単離した。オリゴヌクレオチドＺＣ
１４２９（５’　−ＴＴＡ　ＧＧＣＧＧＴ　ＡＣＧ　Ａ
ＴＡ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＧＴＧＡＣＡ　ＴＴＧ
　ＴＴＴ　ＣＣＴ　Ｇ−３’　）　、及びＺＣ１４３０
（５’ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＡＡＣＡＡＴ　ＧＴＣ
ＡＣＴ　ＴＴＣＴＣＴ　ＴＧＴ　ＡＴＣＧＴＡ　ＣＣＧ
　ＣＣ３’　）をキナーゼ処理し、そしてＭａｎｉａｔ
ｉｓ等（前掲）により本質的に記載されている方法によ
りアニールした。このキナーゼ処理されそしてアニール
されたオリゴヌクレオチドは、Ｅｃｏ　Ｒ１接着末端、
これに続＜３７ｋｂの？１ＮＮ９コード領域及びＤｄｅ
　Ｉ接着末端を有するアダプターを形成する。ＺＣ１４
２９／ＺＣ１４３０アダプターを、Ｅｃｏ　ＲＩ及びＰ
ｓｔｌによる消化によって線状化されたｐＵｃ１３と共
に、三部分連結によりｐＺＹ４８からのＤｄｅ　Ｉ−Ｐ
ｓｔｌ断片に連結した。聾楓遺伝子に融合したＺＣ１４
２９／ＺＣ１４３０アダプターを含んでなる生ずるプラ
スミドをｐＺＹ６４と命名した。
プラスミドｐＺＹ６４をＥｃｏ　Ｒ１及びＰｓｔｌで消
化して０．４　ＭＮＮ９断片を単離した。ｐＺＹ２３か
らの１．５ｋｂのＰｓｔ　Ｉ　　　Ｂｇｌ　ｆ［断片及
びＹＥｐ１３ベクター配列を含んで成るプラスミドｐＺ
Ｙ３８をＰｓｔＩ及びＢｇｌＩＩで消化して１，５ｋｂ
　ＭＮＮ９断片を単離した。プラスミドｐｓＸＲ１１１
を旧ｎｄｌｌ［及びＥｃｏ　Ｒ１で消化して０．９ｋｂ
バイブリドプロモ一ター断片を単離した。この断片を、
ｐＺＹ３８からの１．５ｋｂのＰｓｔ　Ｉ　−Ｂｇｌ　
ＩＩ断片、ｐＺＹ６４からのＥｃｏ　Ｒ１−Ｐｓｔ　Ｉ
断片、並びに旧ｎｄＩＩＩ及びＢｇｌ　Ｉｆを用いる消
化により線状化されたｐｌｃ１９Ｒと共に、四部付連結
により連結した。得られるプラスミドをｐｚｙ６ｓと称
する。プラスミドｐＺＹ６５をＢｇｌｌＩ及びＰｖｏ　
Ｉと称する。発現ユニットを含有する２、８ｋｂのＢｇ
ｌ　Ｕ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片を単離した。プラスミドル
旧１１をＢａｍ　ＨＩによる消化によって線状化し、そ
してｐＺＹ６５からの発現ユニットを含んで成る２、８
ｋｂのＢｇｌ　Ｕ断片と連結した。生ずる連結混合物を
Ｅ・コリＲＲＩ株に形質転換した。プラスミドＤＮＡを
形質転換体から調製し、そして１１ｉｎｄ［ｌ及びＥｃ
ｏ　Ｒ１で切断して挿入部の方向を決定した。正しい方
向で発現ユニットを有するプラスミドをｐＺＹ５６６と
命名した。
■旦　　　によ　　　されるＭＮＮ９　’　　　のｓｉ
ｒ３　８変異、ＭＮＮ９遺伝子中の欠失、並びに少なく
とも国遺伝子及びＴＲＰＩ遺伝子の遺伝的欠陥を有する
Ｓ、セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を
次の様にして作製した。すべての株の遺伝子形が第１表
に挙げである。３８１Ｇ−５９Ａ株（Ｈａｒｔｗｅｌｌ
。
Ｊ、Ｃｅ１１．旧ｏ１．　８５　：　８１１　８２２．
１９８０）をＡ２株（Ｒｏｂｙ等、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ　
ｎ＋ｏ１．　１０１　：２５３−２６９．１９８３）と
クロス（ｃｒｏｓｓ）　　シ、そして二倍体を選択して
胞子を形成せしめた。子のうを切開し、そして遺伝子型
ＭＡＴａ、　　１ｅｕ２−３　１１２　　旦且り二Ｌａ
ｄｅ２−１冗　ｓｉｒ３−８を有する胞子をＸＬＩ−４
８と命名した。ＺＹ４００　（ｐＳＷ２４　）株及びＺ
Ａ４４７株をクロスし、そして２倍体株を選択した。二
倍体細胞を常法に従って胞子形成せしめ、そして子のう
を切開した。
得られた胞子について四分子分析（ｔｅｔｒａｄ　ａｎ
ａｌｙｓｉｓ）を行った。遺伝子型ＭＡＴｃｒ　ａｄｅ
２−１　１ｅｕ２−３　１１２　６ｍｎｎ９：：ＵＲＡ
３を有する胞子を選択した。
この胞子をＸＣＹ１５−３Ｃと称する。
ＸＣＹ１５−３Ｃ株及びＸＬＩ−４Ｂ株をクロスして二
倍体ＸＣＹ４２を生じさせた。この二倍体株を胞子形成
せしめ、そして子のうを切開した。遺伝子型ＭＡＴａｓ
ｉｒ３−８　　　６ｍｎｎ９：：ロＲＡ３　　１ｅｕ２
　　３．　１１２　　１Ｌ旦に１上　ａｄｅ２　１　　
皿を有する胞子を選択した。
達ＩＥ−バリアータンパク白に対するポリクローナル抗
体を生じさせた。ｔｒｐＥ−バリアータンパク質が、ｐ
ＳＷ２４２により形質転換されたＥ・コリＲＲＩから生
産された。プラスミドｐ！Ｖ２４２は次の様にして作製
した。プラスミドｐＳＷ２２　（例３）をＥｃｏ　Ｒｒ
で消化して１゜４７ｋｂ　ＢＡＲＩ断片を単離した。プ
ラスミドｐＡＴＨ１１（Ｍｏｒｉｎ　等、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２　：　７０２５
　７０２９．１９８５　；　ｐＡＴＨ２（Ｄｉｅｃｋｍ
ａｎｎ及びＴｚａｇｏｌｏｆｆ、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、　　２６０　：　１５１３　１５２０゜１９８
５）　、Ｅ・コリセ１Ｅ遺伝子に続いてマルチクロニン
グ領域及びｐＵＣ型のプラスミドのベクター配列が存在
する。〕をＥｃｏ　ＲＩを用いる消化によって線状化し
た。２個のＥｃｏ　ＲＩ断片を連結し、そしてＥ・コＩ
Ｊ　ＲＲ１株に形質転換した。形質転換体から調製され
たプラスミドＤＮＡを制限酵素分析によりスクリーニン
グし、そして適当な方向にＢＡＰＩ断片を含有するクロ
ーンをｐＳＷ２４２と命名した。
プラスミドｐＳＷ２４２を有するＥ・コリＲＲＩの形質
転換体コロニーを４ｍ／のＭ９＋ＣＡ＋ａｍｐ＋Ｗ（第
２表）に接触し、そして３７°Ｃにて一夜増殖せしめた
。−夜培養物を３０ｍ１のＭ９＋ＣＡ＋ａｍｐ＋Ｗ（第
２表）中にｌ：１０で稀釈し、そして激しく通気しなが
ら３０°Ｃにて１時間増殖せしめた。１時間後、この培
養物に１００％エタノール中１０ｍｇ／＋ｎｌのインド
ールアクリル酸（シグマ、セントルイス、ＭＯ）１５０
μｌを加え、そしてこれを３０°Ｃにてさらに２時間培
養した。
ｌ聚 ２×サンプル緩衝液 ３６　ｒｎｌ　　Ｏ，５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　、　
ｐＨ６，８１６−グリセロール １６ｍ１２０％５ＯＳ ４　ａ／　　０．５　Ｍ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ
６，８）中０．５％ブロモフェノールブルー すべての成分を混合する。使用の直前に、１００Ｉのβ
−メルカプトエタノールを９００μｌずつの色素混合物
に加える。
クー・・キング　ｉ ０、ＯＩＭ　　リン酸ナトリウム、ｐＨ７，２１％　　
β−メルカプトエタノール １％　　ドデシル硫酸ナトリウム ６Ｍ　　尿素 ウェスタン　′−′°゛ ２５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ、Ｉ）Ｈ８，３ １９ｍＭ　　グリシン、ｐＨ８，３ ２０％　メタノール ウェスタン緩衝液 ５０ａ／　　ＩＭ　　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，４２０ｔｒｉ
　　０．２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ７，０５ｄ　
１０％　ＮＰ　−４０ ３７，５Ｉｎ／４　Ｍ　　ＮａＣｌ ２．５ｇ　ゼラチン Ｔｒｉｓ　、　ＥＤＴＡ　、　ＮＰ−４０及びＮａｆＪ
は蒸留水により１１の最終溶量に稀釈した。３００１１
１／のこの溶液にゼラチンを添加し、そしてゼラチンが
溶液に溶解するまでマイクロウェーブオーブン中で加熱
した。
ゼラチン溶液を最初の溶液の残りに添加し、そして４°
Ｃにて冷却するまで撹拌した。緩衝液を４°Ｃに貯蔵し
た。
培養物を遠心によりペレット化し、そして上清を廃棄し
た。この細胞ペレットを５０４のクランキング緩衝液（
第３表）に再懸濁し、そして３７°Ｃにて０．５〜３時
間インキュベートした。等容量の２×サンプル緩衝液（
第３表）を加え、そしてそしてこのサンプルを沸騰水浴
中で３〜５分間加熱した。サンプルを１０％５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル中で電気泳動した。タンパク質を
、Ｔｏｗｂｉｎ等（前掲）により本質的に記載されてい
る方法を用いてニトロセルロースに移行せしめた。ニト
ロセルロースフィルターを、１００−の蒸留水、４ＩＩ
Ｌ／の氷酢酸及び４滴のシリング（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ
）グリーン食品着色剤（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ　ａｎｄ　
Ｃｏ、Ｉｎｃ、＋バルチモア、　Ｍｄ、）の溶液に浸漬
することにより染色した。
バリアータンパク質に相当するバンドをフィルターから
切り取６、そして蒸留水で洗浄することにより染色を除
去した。バリアータンパク質を含有する脱染色したニト
ロセルロースフィルターを３７°Ｃにて１時間乾燥し、
そして次にフロイントのアジュバント（ＩＣＮ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ。
カリホルニア）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
と混合した。この混合物をニューシーラント・ホワイト
ラビットに３ケ所で皮下注射した。注射を、最初の注射
の後２．５ケ月反復した。最終注射の１０日後、ラビッ
トから全血を取り出し、そして凝固せしめた。血液凝固
物を遠心により血清から分離した。血清を新しいチュー
ブに取り、そして２０°Ｃにて貯蔵した。Ｃ−２４６５
と称するこれらのポリクローナル抗体はバリアータンパ
ク質を認識した。
Ｃ３によ　　　　　るＭＮＮ９　　に　しるＢＡＲＩの
■ Ｓ、セレビシェ−ＸＣＹ４２−２８Ｂ株を温度調節ＭＮ
Ｎ９発現ベクターρ！Ｖ２４　（例３）及びｐＺＹ６６
　（例５）又はｐＳＷ２４及びｐ旧１１により、例えば
Ｂｅｇｇｓ　（前掲）の文献において知られている方法
を用いて形質転換した。形質転換体を、２５°Ｃにて−
Ｌｅｕ−ＴｒｐＤＳ（第２表）上で増殖するそれらの能
力について選択した。
形質転換体を、単一コロニを得るために−ＬｅｕＴｒｐ
Ｓプレート上でストリークし、そして２５°Ｃ１３０°
Ｃ又は３５°Ｃにて増殖せしめた。形質転換体コｏニー
を５ｎｔ／の−Ｌｅｕ　−ＴｒｐＤＳ中に接種し、そし
て、接種の増殖温度に依存して２５°ｃ、３０°Ｃ又は
３５°Ｃにて一夜増殖せしめた。この−夜培養物を５０
−の−Ｌｅｕ　−ＴｒｐＤＳ中に１：１００で稀釈し、
そして２５　”Ｃ、３０°Ｃ又は３５°Ｃにて約４８時
間増殖せしめた。
遠心により細胞を培養物から除去し、そして上清をデカ
ントし、そして貯蔵した。−２０°Ｃに維持された９５
％アルコール等容量を各上清に加え、そしてこの混合物
を一２０°Ｃにて４５分間保持した。エタノール混合物
をＧＳＡ　（ツルパル）ロークー中で９０００Ｏｒｐｍ
にて３０分間４°Ｃで回転させて沈澱をペレット化した
。上清をデカントし、そしてペレットを乾燥した。この
ベレットを５００μ！の蒸留水に再懸濁した。
５０μ！の２×サンプル緩衝液（第３表）を５０ｐ！の
各再懸濁サンプルに加え、そしてこの混合物を１０％ポ
リアクリルアミドゲル中で電気泳動し、そしてＴｏｗｂ
ｉｎ等（前掲）により本質的に記載されている方法を用
いてニトロセルロースに移した。
ニトロセルロースフィルターをラビット・ポリクローナ
ルＣ−２４６５によりプローブし、そして西洋ワサビ・
パーオキシダーゼ接合ヤギ抗−ラビット抗体を用いて可
視化した。イムノプロットが示すところによれば、３５
°Ｃにおいて、ＸＣＹ４２−２８Ｂ（ｐＳ讐２４．　ｐ
ＺＹ６６：ｌにより作られるバリアー−物質Ｐタンパク
質は、すべての温度において増殖したＸＣＹ４２−２８
Ｂ　　（ｐＷ４２．　ｐＭｌｌ）と同じ量のグリコジル
化を存する均一な種として存在する。これは、３５゛Ｃ
において７遺伝子はターンオフされ、そしてタンパク質
のグリコジル化は、同様に形質転換されたｍｎｎ９株に
おいて見出されるように行われることを示した。３０°
Ｃにおいて、ＸＣＹ４２−２８８（ｐＳ讐２４．　ｐｚ
ｙ６６）により生産されるバリアー−物質Ｐタンパク質
はほとんど超グリコジル化され、そして２５°Ｃにおい
て、ＸＣＹ４２−２８８（ｐＳＷ２４．　ｐＺＹ６６）
から生産されるバリアー−物質Ｐタンパク質は非常に不
均一な超グリコジル化種であった。
Ｍ〔Ｕ　ｍｎｎ１　　ゝ　　　の　　　法ｍｎｎ９株か
ら生産されたバリアータンパク質に対してラビットポリ
クローナル抗体を生じさせた。
ＴＰ１１プロモーター、肚α１シグナル配列及びＢＡＲ
Ｉコード配列を含んで成るｐＺＶｌｏｏにより形質転換
されたＸＶ７３２−１−９Ａ　（例１．　Ａ、）カラハ
！Ｊ　７−り７パク質を製造した。プラスミドｐＺＶ１
００は次の様にして作製した。
■旦プロモーターをプラスミドｐＭ２１０　（ｐＭ２２
０としても知られており、ＡＴＣＣＮα３９８５４とし
て寄託されている。プラスミドｐＭ２１０をＢｇｌＩＩ
及び旧ｎｄＩ［Ｉで消化して０．４７ｋｂ断片（断片１
）を単離した。
肝α１シグナルペプチドをコードするｔｌｉｎｄＴＩＩ
−Ｅｃｏ　Ｒ１アダプターを、仮の凹シグナル配列が欠
失したＢＡＲＩ遺伝子の５′−コード配列の部分と共に
クローニングベクターｐＵｃ１３にサブクローニングし
た。プラスミドｐＺＶ１６　（例３）をＥｃｏ　Ｒ１及
びＳａｌ　Ｉにより消化して０．６７ｋｂ　ＢＡＲＩ断
片を単離した。オリゴヌクレオチドＺＣ５６６（５’　
−ＡＧＣＴＴＴ　ＡＡＣＡＡＡ　ＣＧＡ　ＴＧＧ　ＣＡ
ＣＴＧＧ　ＴＣＡ　ＣＴＴ　ＡＧ−３’　）　、及びＺ
Ｃ５６７（５’　−ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡＧ　ＴＧＡ　
ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＴＣＧＴＴＴ　ＧＴＴ　ＡＡ
−３’　）をＭａｎｉａｔｉｓ等（前掲）に記載されて
いるようにしてキナーゼ処理し、そしてアニールした。
キナーゼ処理しそしてアニールしたＺＣ５６６／ＺＣ５
６７アダプターを、旧ｎｄｌ］ｉ及び５ａｌＩによる消
化によって線状化されたρＵＣ’１３と共に、三部分連
結により０．６７ｋｂ　ＢＡＲＩ断片と連結した。
生ずる連結混合物を用いてＥ・コリＪＭ８３株を形質転
換した。得られた形質転換体から調製されたプラスミド
ＤＮＡを旧ｎｄｌ［Ｉ及び５ａｌｌを用いる消化によっ
てスクリーニングした。陽性クローンをプラスミドｐＺ
Ｖ９６と命名した。プラスミドｐＺＶ９６を１１ｉｎｄ
Ｉ［［及び５ａ１１により消化して、ＺＶ５６６／ＺＣ
５６７アダプターー臥財断片を含む０．６７ｋｂ断片（
断片２）を単離した。
ｆｉ伝子の残りをｐＺＶ９　（例３）から誘導した。
プラスミドｐＺＶ９をＳａｌ　Ｉ及びＢａｍ　ｔｌＴで
消化して１．２５ｋｂの皿断片（断片３）を単離した。
断片１及び２（それぞれ理旦プロモーターーＭＦα１シ
グナル配列及びＺＣ５６６／ＺＣ５６７−ＢＡＲＩ断片
を含む）を断片３　（１，２５ｋｂ　ＢＡＲＩ断片）及
びＢａｍ旧により消化して線状化されたＹＥｐ１３に連
結した。生ずる連結混合物をＥ・コリＲＲＩに形質転換
した。得られた形質転換体から調製されたプラスミドＤ
ＮＡをＢａｍ　ＨＩ＋Ｈｉｎｄｎｌ、及びＢａｍ　）ｌ
Ｉ＋Ｓａｌ　ｌにより消化して構成を確認し、そして挿
入の方向を決定した。
ＹＥｐ１３ベクター上の１ｌｉｎｄＩ［ｒ部位の近くに
ＴＰＩＩプロモーターを有する陽性クローンをｐＺＶＩ
ｏｏと命名した。
ｓ、セレビシェ−ＸＶ７３２−１−９４をｐｚｖｉｏｏ
ニより形質転換し、そして形質転換体を−ＬｅｕＤＳプ
レート（第２表）上で増殖するそれらの能力について選
択した。形質転換体コロニーを１０−の−ＬｅｕＤＳ　
　（第２表）中に接種し、そして３０°Ｃにて一夜増殖
せしめた。−夜培養物を９７８艷の−ＬｅｕＤＳ中にｌ
：１００に稀釈し、そして培養物を３０°Ｃにて４３時
間増殖せしめた。培養物を遠心し、そして上清を２５０
　ｍ！遠心管にデカントした。
−２０°Ｃに維持された同容量の９５％エタノールを添
加し、そして混合物を一２０°Ｃにて約２時間インキュ
ベートした。混合物をＧＳＡ　（ツルパル）ローター中
で９，０ＯＯｒｐＩ１１．４°Ｃにて３０分間遠心した
。上清を廃棄し、そしてタンパク質ペレットを空気乾燥
した。このペレントを、合計６ｍｌの１×サンプル緩衝
液〔３−の蒸留水及び３ｔｄの２×サンプル緩衝液（第
２表）］中に再懸濁した。
サンプルを１０％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動
し、そしてＴｏｗｂｉｎ等（前掲）により記載された方
法を用いてニトロセルロースに移した。
このニトロセルロースフィルターを、１００ｍ／の蒸留
水、４ｄの無水酢酸、及び４滴のシリンググリーン食品
着色料の溶液中に浸漬することにより染色した。バリア
ータンパク質に相当するバンドをフィルターから切り取
り、そして蒸留水洗浄により染色を除去した。脱洗色さ
れたニトロセルロース−バリアーバンドを３７′Ｃにて
１時間乾燥し、そして次にフロイントのアジュバント　
（ＩＣＮ　８ｉ。
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｃｏ５ｔａ　？Ｉｅｓａ、　　
カリホルニア）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
と混合した。この混合物をニューシーラントホワイトラ
ビットに３ケ所で皮下注射した。約１ケ月間融で３回注
射を反復した。最終注射の１０日後、ラビットがら全血
を採取し、そして凝固せしめた。遠心により血液凝固物
を血清から分離した。血清を新らしいチューブに取り出
し、そして−２０“Ｃにて貯蔵した。これらのポリクロ
ーナル抗体はバリアータンパク質及び該タンパク買上に
存在する糖成分を認認した。
試験株のコロニーをＹＥＰＤＳ上に増殖せしめ、そして
生成したコロニーをニトロセルロースフィルター上にプ
レートした。このフィルターをウェスタン移行緩衝液（
第３表）中での３回の１５分間洗浄にかけた。フィルタ
ーを新鮮なウェスタン緩衝液Ａに移し、そして工時間イ
ンキュベートした。
次に、フィルターをウェスタン緩衝液Ａにより５分間洗
浄した。ラビット・ポリクローナル抗−バリアー（ｍｎ
ｎ９）抗体のＩ：５００稀釈物をフィルターに加え、そ
して１時間以上インキュベートした。
ウェスタン緩衝ＭＡ中で１５分間ずつ３回洗浄すること
により過剰の抗体を除去した。ヤギ抗−ラピント西洋ワ
サビパーオキシダーゼ−接合抗体の１　：　１０００稀
釈物をフィルターに加え、そしてこれを１時間以上イン
キュベートした。蒸留水ですすぎ、次にウェスタン緩衝
液Ｂ（第３表）により１０分間ずつ３回洗浄しそして最
終的に蒸留水ですすぐことにより、過剰の接合抗体を除
去した。
西洋ワサビ基質（バイオラド、リッチモンド、カリホル
ニア）の添加により、十分に発色するまで発色せしめた
。抗体により淡く発色したコロニがｍｎｎ１コロニーで
あった。
！ｌｌ！Ｊ８．　　ｍｎｎ１　　　びｍｎｎ１　　ｍｎ
ｎ９　　の顧変異を有するＳ、セレビシェ−株、及びｍ
ｎｎ１　　ｍｎｎ９変異を有するＳ、セレビシェ−株を
次の様にして作製した。ＺＹ４００（第１表）をＬＢＩ
−２２０（第１表、Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔ
ｏｃｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、パークレー　力リホルニア）
とクロスさせ、そして二倍体を選択し、そしてＸＶ８０
３と命名した。ＸＶ８０３二倍体細胞を胞子形成せしめ
、そして子のうを切開した。弓スクリーニング法を用い
て匹変異の存在について胞子をスクリーニングした。Ｙ
ＥＰＤ上での胞子の増殖により６ｍｎｎ９：　：ＵＲＡ
３マーカーをスコアーした（飢社変異体は浸透圧支持が
ない培地上であまり増殖しない）。遺伝子型がＭＡＴ　
αＩｅｕ２−３　１１２　６ｍｎｎ９：：ロＲＡ３　　
ｍｎｎ１である胞子をＸＶ８０３−１８と命名した。遺
伝子型が阻αＩｅｕ２−２．１１２ｍｎｎ１　　Δｐｅ
ｐ４　二ＣＡＴである他の胞子をＸν８０３−１６Ｃと
命名した。
尉■ｍｎｎ１　　ｍｎｎ９　　にお番るＢＡＲＩの朋遺
伝子の発現をｍｎｎ１　　ｍｎｎ９株において試験した
。ＸＶ８０３−１８株、ＸＶ８０３−１６Ｃ株、ＸＹ１
００株及びＺＹ４００株をｐＳＷ２４により形質転換し
た。形質転換体を、　ＬｅｕＤＳプレート（第２表）上
で増殖するそれらの能力について選択した。単一コロニ
を得るために、形質転換体コロニーを新鮮なＬｅｕＤＳ
プレート上にストリークし、そして３０°Ｃにて増殖せ
しめた。形質転換体コロニーを５〇−の−ＬｅｕＤＳ　
（第２表）に接種し、そして３０°Ｃにて約４８時間増
殖せしめた。培養物を収得し、細胞を遠心により培養媒
体から除去した。上清をＧＳＡビンにデカントし、そし
て−２０°Ｃに保持された等容量の９５％エタノールを
添加した。混合物を一２０°Ｃにてインキュベートし、
次にＧＳＡＳ−ローター中００Ｏｒｐｍで４°Ｃにて３
０分間遠心した。上清を廃棄し、そして沈澱を空気乾燥
した。
沈澱を４ｍ１の蒸留水に再懸濁し、４ｍ７の冷９５％エ
タノールの添加により再沈澱せしめた。混合物をインキ
ュベートし、そして上記の様にして遠心した。上清を廃
棄し、そしてペレットを空気乾燥した。
タンパク質の沈澱を１５０μｌの蒸留水に再懸濁した。
サンプルを１５０１１！の２×サンプル緩衝液（第３表
）で稀釈し、次に１００μｌのの各サンプルを１０％ポ
リアクリルアミドゲル中で電気泳動した。
タンパク質をＴｏｗｂｉｎ等（前掲）の方法によりニト
ロセルロースに移行せしめ、そして例３に記載したよう
に物質Ｐ抗体を用いてバリアー蛋白質を可視可した。こ
の結果が示すところによれば、ｍｎｎ１ｍｎｎ９二重変
異体から作られたバリアータンパク質はｍｎｎ９変異体
又は弓変異体から作られたタンパク質に比べて速く移動
し、二重変異体から作られたバリアータンパク質はｍｎ
ｎ９変異体から作られたタンパク質に比べて少ない糖成
分を含有するであろう。
５町」」ユ■ＮＮ１′　　云　のクローニング上記の抗
体スクリーニング法を用いてＭＮＮ遺伝子をクローニン
グする。ベクターＹＥｐ１３（Ｎａｓｍｙｔｈ及びＲｅ
ｅｄ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩ
ＳＡ　　７７　：　２１１９−２１２３、１９８０）中
にクローン化された全酵母ＤＮＡ断片のランダム混合物
を含有するプラスミドのライブラリーをＸν８０３−１
６Ｃ株に形質転換し、そして形質転換体を−ＬｅｕＤＳ
プレート（第２表）上で増殖するそれらの能力について
選択する。形質転換体を、Ｍａｃｋａｙ　（前掲、１９
８３）の方法により、ＬｅｕＤ　（第２表）に再懸濁し
、そして計数する。
プールを稀釈し、そして約１２００細胞／プレート（細
胞がすべて生存しているとすれば）の密度でＬｅｕＤプ
レート（第２表）上にプレートする。このプレートを、
コロニーが増殖するまで３０’Ｃにてインキュベートす
る。コロニーをニトロセルロースフィルターにレプリカ
し、そして例７に記載した測定法によりスクリーニング
する。ラビットポリクローナル抗体により暗い染色を示
すコロニーは、ｍｎｎ１変異を補完しそして宿主が野生
型グリコジル化タンパク質を生産することを可能にする
プラスミドを含有するであろう。プラスミドＤＮＡは、
文献（例えば、Ｈａｒｔｉｇ等、前掲）において知られ
ている方法により陽正クローンから単離され、そしてＥ
・コリ形質転換体に形質転換される。
プラスミドＤＮＡはＥ・コリ形質転換体から単離され、
そして制限酵素分析にかけられる。
以上、本発明を例により具体的に記載したが、本発明の
木質を逸脱することなく、種々の変異を行うことができ
よう。
【図面の簡単な説明】
第１Ａ図および第１Ｂ図は、それぞれｍｎｎ９およびｍ
ｎｎｔ　ｍｎｎ９変異株の産生ずるサツカロミセス・（
！　レヒシｘ　（５ａｃｃ加耶連匹弘ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）　ｉ性コオリゴ糖の構造を図示したものである。 なお、第１Ａ図は、ｍｎｎ９変異株によって産生される
オリゴ糖の１３個のマンノースの形態を図示し、第１Ｂ
図は、旦ｎｌ　　ｍｎｎ９変異株の産生ずるオリゴ糖の
１０個のマンノースの形態を図示するものである。 また、オリゴ糖の９個のマンノースの形態も示されてい
る。図式中で、（Ｍ）はマンノースを示し、（ＧＩｃＮ
Ａｃ）はＮ−７セチルグルコサミン（八ｓｎ）は＾ｓｎ
ーＸーＳｅｒまたはへｓｎ−ＸＴｈｒ受容体部位のアス
パラギン残基を示し、（６）はマンノース間の１→６結
合を示し、（３）はマンノース間の１→３結合を示し、
そして（４）はマンノースとＧＩｃＮＡｃ間のｌ→４結
合を示す。 第２図は、ｐ？１１１１の構築を図示する。 第３図は、ｐＹ３７　、　ｐＺＹ４８およびｐＺＹ６３
の構築を図示する。 第４図は、ＭＮＮ９遺伝子の核酸配列およびそれから誘
導される一次翻訳生成物のアミノ酸配列を図示するもの
であり、列の上の数字は核酸配列の参照のためのもので
あり、マイナスの数字は５′非コ一ド配列を示す。 第５図は、ｐＳＷ２４の構築を図示する。 第６図は、ｐｓＸＲｌｌｌの構築を図示する。 第７図は、ｐＺＹ６６の構築を図示するものである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、糖タンパク質へのアウターチェインオリゴサッカラ
    イド成分の付加のために必要な生成物の遺伝子に欠陥を
    有する真菌細胞であって、調節プロモーター及びその下
    流に続く前記欠陥を補完するＤＮＡ配列を含んで成る第
    一ＤＮＡ構成物、並びに第二プロモーター及びその下流
    に続く分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列及び異種性
    タンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
    含んで成る第二ＤＮＡ構成物、により形成転換されてい
    る真菌細胞。 ２、前記真菌細胞が酵母細胞である、請求項１に記載の
    細胞。 ３、前記遺伝子が￥ＭＮＮ７￥遺伝子、￥ＭＮＮ８￥遺
    伝子、￥ＭＮＮ９￥遺伝子及び￥ＭＮＮ１０￥遺伝子か
    ら成る群から選択されたものである、請求項２に記載の
    酵母細胞。４、前記細胞がさらに￥ＭＮＮ１￥遺伝子に
    欠陥を有する、請求項３に記載の酵母細胞。５、前記細
    胞がサイレント接合型遺伝子座の発現のために必要な遺
    伝子中に条件変異を含有し、そして前記調節プロモータ
    ーが接合型調節因子を含んで成る、請求項２に記載の酵
    母細胞。 ６、前記条件変異がｓｉｒ３−８変異である、請求項５
    に記載の方法。 ７、前記調節プロモーターがさらにＴＰＩ１プロモータ
    ーを含んで成る、請求項５に記載の酵母細胞。 ８、前記第二プロモーターが調節プロモーターである、
    請求項１に記載の細胞。 ９、前記第一ＤＮＡ構成物及び第二ＤＮＡ構成物が単一
    のプラスミド中に含有されている、請求項１に記載の細
    胞。 １０、前記第一ＤＮＡ構成物が前記細胞のゲノムに組み
    込まれている、請求項１に記載の細胞。 １１、前記第二ＤＮＡ構成物が前記細胞のゲノムに組み
    込まれている、請求項１に記載の細胞。 １２、前記欠陥が点変異である、請求項１に記載の細胞
    。 １３、前記欠陥が遺伝子欠失である、請求項１に記載の
    細胞。 １４、前記タンパク質又はポリペプチドが組織プラスミ
    ノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、免疫グロブリン、
    血小板由来増殖因子、プラスミノーゲン、トロンビン、
    ファクターＸIII及びこれらの類似体から成る群から選
    択されたものである、請求項１に記載の細胞。 １５、異種性タンパク質又はポリペプチドの製造方法で
    あって、 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の真菌細胞を、糖
    タンパク質へのアウターチェインオリゴサッカライドの
    付加のために必要な生成物の遺伝子中の欠陥を補完する
    ＤＮＡ配列が発現される第一の増殖条件下で培養し； 前記欠陥を補完するＤＮＡ配列が発現されず、そして前
    記異種性タンパク質又はポリペプチドをコードする前記
    ＤＮＡ配列が発現される第二の増殖条件下で前記細胞を
    培養し；そして 異種性タンパク質又はポリペプチドを単離する；ことを
    含んで成る方法。 １６、Ｅタンパク質へのアウターチェインオリゴサッカ
    ライドの付加のために必要な生成物の遺伝子中の欠陥を
    有する酵母株の同定方法であって、活性プロテイナーゼ
    Ｂを有する酵母細胞を固体培地上で培養してコロニーを
    生成せしめ； 該コロニーを透過性にし； 該透過性にされたコロニーに、４．０より高く且つ７．
    ４より低いｐＨを有しアゾコールを含んで成る組成物を
    重層し； Ｍｎｎ９＾−表現型を示すコロニーの周囲に明瞭なハロ
    ーが形成されるのに十分な条件下で前記コロニーをイン
    キュベートし；そして コロニーの周囲の明瞭なハローの存在を検出し、そして
    それにより糖タンパク質へのアウターチェインオリゴサ
    ッカライド成分の付加のために必要な生成物の遺伝子に
    欠陥を有する酵母株を同定する； ことを含んで成る方法。 １７、Ｅタンパク質へのアウターチェインオリゴサッカ
    ライドの付加のために必要な生成物の遺伝子中の欠陥を
    補完するＤＮＡ配列のクローニング方法であって、 前記遺伝子に欠陥を有する酵母細胞をＤＮＡ断片のライ
    ブラリーにより形質転換し； 該酵母細胞を固体培地上で培養してコロニーを形成せし
    め； 該コロニーを透過性にし； 該透過性にされたコロニーに、４．０より高く且つ７．
    ４より低いｐＨを有しアゾコールを含んで成る組成物を
    重層し； Ｍｎｎ９＾−表現型を示すコロニーの周囲に明瞭なハロ
    ーが形成されるのに十分な条件下で前記コロニーをイン
    キュベートし； 明瞭なハローを示さないコロニーを選択し；そして 選択されたコロニーから前記欠陥を補完するＤＮＡ配列
    を単離する； ことを含んで成る方法。
JP63272004A 1987-10-29 1988-10-29 タンパク質のグリコシル化の調節方法 Pending JPH02419A (ja)

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