FI107938B - Menetelmä hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI107938B
FI107938B FI20000025A FI20000025A FI107938B FI 107938 B FI107938 B FI 107938B FI 20000025 A FI20000025 A FI 20000025A FI 20000025 A FI20000025 A FI 20000025A FI 107938 B FI107938 B FI 107938B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
globin
alpha
beta
sequence
hemoglobin
Prior art date
Application number
FI20000025A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20000025L (fi
Inventor
Gary L Stetler
Steven J Hoffman
Douglas L Looker
Mary S Rosendal
Michael Wagenback
Original Assignee
Baxter Biotech Tech Sarl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baxter Biotech Tech Sarl filed Critical Baxter Biotech Tech Sarl
Publication of FI20000025L publication Critical patent/FI20000025L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI107938B publication Critical patent/FI107938B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6445—Haemoglobin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

107938
Menetelmä hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin valmistamiseksi Tämä patenttihakemus on jakamalla erotettu suoraa-5 laisesta patenttihakemuksesta FI-915 279.
Viitteet liittyvistä patenttihakemuksista Hoffman ja Nagai, US-patentti 5 028 588, jonka nykyään omistaa Somatogenetics International, Inc., koskee matalan happiaffiniteetin omaavien mutanttihemoglobiinien 10 käyttöä veren substituentteina ja alfa- ja beeta-globiinin ekspressiota muissa kuin punaisissa verisoluissa. Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö liittyy hemoglobiinin kaltaisen proteiinin solunsisäiseen kokoamiseen biologisesti ak-15 tiiviseen oleellisesti liukoiseen muotoon ekspressoimalla yhtä aikaa alfa- ja beeta-globiinin kaltaisia polypeptide-jä bakteeri- tai hiivasoluissa. Keksinnön kohteena on menetelmä hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin valmistamiseksi, jolla on reversiibeli hapensitomisaktiivi-20 suus.
·»· : Lisäksi kuvataan hemoglobiinin kahden alfa-alayksi- • · .···. kön geneettistä yhteenliittämistä niin, että muodostetaan • * uusi polypeptidi di-alfa-globiini, jota voidaan pitää • · ** osittain koottuna välimuotona, joka johtaa hemoglobiinin ·1 25 kaltaiseen proteiiniin, ja tämän yhdisteen käyttämistä • · *···* sellaisten synteettisten hemoglobiinien tuottamisessa, joilla on kohonnut suonen sisäinen puoliintumisaika ver- « '"*· rattuna peruskudoksesta vapaisiin hemoglobiineihin. Tässä **": kuvataan myös analogista polypeptidiä di-beeta-globiinia.
3 0 Selvitys esityksen taustatiedoista • · ·
Aina ei ole käytännöllistä transfusoida potilasta • · **y* luovutetulla verellä. Näissä tapauksissa on punasolusubs- : tituutin käyttö toivottavaa. Tuotteen täytyy kuljettaa 02:a • * · • · • · • · · 2 107938 tehokkaasti aivan kuten punasolut tekevät. ("Plasman laajentajat", kuten dekstraani ja albumiini, eivät kuljeta happea.) Kaksi substituenttityyppiä, joita on tutkittu eniten, ovat hemoglobiiniliuokset ja fluorihiiliemulsiot. 5 A. Hemoglobiinin rakenne ja toiminta
Hemoglobiini (Hgb) on veren happea kuljettava osa. Hemoglobiini kiertää verenkierrossa pienten tumattomien solujen, joita kutsutaan erytrosyyteiksi (punaiset verisolut) , sisällä. Hemoglobiini on proteiini, joka rakentuu 10 neljästä yhteenliittyneestä polypeptidiketjusta ja sisältää prosteettisia ryhmiä, joita kutsutaan hemiryhmiksi. Erytrosyytti auttaa pitämään hemoglobiinin sen pelkisty-neessä toimivassa muodossa. Hemiryhmän rauta-atomi on altis hapettumiselle, mutta voi jälleen pelkistyä erytrosyy-15 tin jommankumman kahden entsyymisysteemin, sytokromi b5- ja glutationipelkistyssysteemin, vaikutuksesta.
Noin 92 % normaalin aikuisen ihmisen hemolysaatista on Hgb A:ta (jota merkitään nimellä alfa2-beeta2, koska se sisältää kaksi alfa- ja kaksi beetaketjua). Alfaketju si-2 0 sältää 141 aminohappoa. Hemiryhmän (ferroprotoporfyriini • · · · .·. : IX) rauta-atomi on sitoutunut His 87 aminohapon ("proksi- • · .···. maalinen histidiini") imidatsoliryhmään kovalenttisesti.
• ·
Beetaketju on 146 jäännöksen pituinen ja hemiryhmä on si- • · *** toutunut siihen His 92 aminohapon kohtaan. Apohemoglobiini • · ···* 25 on hemiryhmästä vapaa hemoglobiinianalogi; se on olemassa • · *···' pääasiallisesti alfa-beeta-globiinidimeerinä.
Erotetut hemistä vapaat alfa- ja beeta-globiinit on *:**· valmistettu hemoglobiinin hemiryhmän sisältävistä alfa- ja beeta-alayksiköistä. Erotetut hemistä vapaat globiiniket- ♦·] 30 jut laskostuvat hyvin erilaisesti, vaikka hemiä sisältävät • · · alayksiköt ovat erittäin samanlaisia sekundaarirakenteel- • · • · • · · ♦ · • · · ♦ · · ··· # 1 • · • * • · · 3 107938 taan ja laskostumisen perusominaisuuksiltaan. Tämä osoittaa, että prosteettisen hemiryhmän sitoutumisella globii-nialayksikköön on hyvin erilaiset vaikutukset alfa- ja beeta-globiinissa. Yip et ai., J. Biol. Chem., 247: 7237 -5 44 (1972).
Ihmisen luonnollinen hemoglobiini on rakennettu kokonaisuudessaan erotetuista hemivapaista alfa- ja beeta-globiineista ja hemiryhmästä. Hemiryhmä lisätään suositeltavasta ensin alfa-globiinialayksikköön. Sitten hemiryhmän 10 sitonut alfa-globiini liitetään yhteen hemivapaan beeta- globiinialayksikön kanssa. Lopuksi hemiryhmä lisätään puoliksi täytettyyn globiinidimeeriin ja saadaan tetrameeri-nen hemoglobiini. Yip et ai., PNAS (USA), 74: 64 - 68 (1977).
15 Fraktioimattomista kanin retikulosyyttihemolysaa- teista valmistetuissa soluvapaissa systeemeissä globiinia syntetisoidaan aktiivisesti noin viiden minuutin ajan ja sitten proteiinisynteesi äkillisesti loppuu. Hemiryhmän lisäys ennen tätä estää tai viivyttää synteesiaktiivisuu-2 0 den loppumista johtuen hemiryhmän vaikutuksesta inhibito- * · · · : riseen proteiiniin, joka tunnetaan nimellä "hemisäädelty • · .···. inhibiittori" (HRI) . Hemiryhmän puutoksella on vakavampia • · vaikutuksia alfaketjun synteesiin kuin beetaketjun syntee- • · **] siin, koska alfa-globiinin mRNA on tehottomampi kuin bee- « ·"’ 25 ta-globiinin mRNA polypeptidiketjun synteesin aloitukses-• · *···' sa. On arveltu, että alfaketjut irrotetaan niiden syntee- sikohdalta ainoastaan vapaiden beetaketjujen läsnä olles- sa, jotka välittömästi liittyvät yhteen vapautettujen al- faketjujen kanssa muodostaen alfa-beeta-globiinidimeerit.
;·| 3 0 Nämä yhdistyvät sitten hemiryhmän kanssa muodostaen tetra- • · · meerisen hemoglobiinin. Winterhalter ja Huehns, J. Biol.
*;1 Chem., 239: 3699 (1964). Tiedetään varmasti, että hemiryh- • · • · · • · · • · · · · · • · • · • · · 4 107938 män lisäys alfa-beeta-globiinidimeereihin (apohemoglobii-ni) johtaa nopeaan hemoglobiinin muodostumiseen.
Ihmisen alfa- ja beeta-globiinigeenit ovat kromosomeissa 16 ja 11, vastaavassa järjestyksessä. Bunn ja 5 Forget, supra, sivulla 172. Molemmat geenit on kloonattu ja sekvenssoitu, Liebhaber et ai., PNAS 77: 7054 - 58 (1980) (alfa-globiinin genominen DNA); Marotta et ai., J.
Biol. Chem., 252: 5040 - 53 (1977) (beeta-globiinin cDNA);
Lawn et ai., Cell 21: 647 (1980) (beeta-globiinin genomi-10 nen DNA).
Hemoglobiinimolekyylin neljällä alayksiköllä (kaksi alfa-globiinia ja kaksi beeta-globiinia Hgb A:n tapauksessa) on yhteisvaikutteinen hapensitomisominaisuus ja tämä yhteisvaikutteisuus edesauttaa suuresti tehokasta hapen-15 kuljetusta. Yhteisvaikutteisuus, joka saavutetaan niin sa notulla hemi-hemi-interaktiolla, sallii hemoglobiinin muutella sen affiniteettia hapelle. Hemoglobiini sitoo rever-siibelisti jopa neljä moolia happea per mooli Hgb:ia.
Happea kuljettavia yhdisteitä verrataan tavallises-20 ti sellaisella keinolla, joka tunnetaan nimellä hapen dis- ··· · ;**J sosiaatiokäyrä. Tämä käyrä saadaan, kun tietyn hapenkanta- • · .···. jän happikyllästys tai happimäärä esitetään graafisesti • · · ,···. hapen osapaineen funktiona. Hgb: lie kyllästysprosentti 'IV. kohoaa osapaineen mukaan sigmoidisen suhteen mukaisesti.
• · ::: 25 p50 -arvo on se osapaine, jossa happea kuljettava liuos on — • · *·* puoliksi kyllästynyt hapella. Se on näin ollen hapen si- toutumisaffiniteetin mittari; mitä korkeampi P50-arvo, sitä * * heikommin happi on kiinni.
♦ ··
Kun hapen dissosiaatiokäyrä happea kuljettavalle j*. 30 liuokselle on sellainen, että P50-arvo on pienempi kuin ,···. kokoverelle, sen sanotaan olevan "vasemmalle siirtynyt".
• · *·* Hemoglobiinin affiniteettia hapelle alentaa 2,3- • · : difosfoglyseraatin (2,3-DPG), kloori-ionien ja vetyionien • · · ·...♦ läsnäolo. Hengittävä kudos vapauttaa hiilidioksidia vereen 35 ja alentaa sen pH:ta (se on, se kohottaa vetyionikonsen- 5 107938 traatiota) aiheuttaen näin hapen irtoamisen hemoglobiinista ja sallien sen diffundoitumisen yksittäisiin soluihin.
Hemoglobiinin kyky muuttaa happiaffiniteettiaan, joka kohottaa hapen kuljetustehokkuutta ympäri kehoa, 5 riippuu metaboliitin 2,3-DPG:n, läsnäolosta. Erytrosyytin sisällä 2,3-DPG on läsnä konsentraationa, joka on lähes yhtä suuri kuin hemoglobiinin konsentraatio. 2,3-DPG:n poissa ollessa "tavanomainen" hemoglobiini sitoo hapen hyvin tiukasti ja vapauttaa ainoastaan vähän happea hen-10 gittävälle kudokselle.
Ikääntyneet erytrosyytit vapauttavat pieniä määriä vapaata hemoglobiinia veriplasmaan, jossa sen nopeasti sitoo poistoproteiini-haptoglobiini. Hemoglobiini-hapto-globiinikompleksi poistetaan verestä ja hajotetaan pernan 15 ja maksan toimesta.
B. Veren substituutit, yleistä
Yllä olevien ajatusten perusteella on selvää, että vapaa luonnollinen hemoglobiini A injektoituna suoraan verenkiertoon ei pidä yllä tehokasta hapenkuljetusta kehos-20 sa. Elintärkeä allosteerinen säätelijä 2,3-DPG ei ole läs- :*·.· nä riittävissä konsentraatioissa plasmassa, jotta hemoglo- • · biini vapauttaisi paljon happea laskimon happipaineessa.
• · · .···, Siitä huolimatta tavanomaisen hemoglobiinin liuok- siä on käytetty punaisten verisolujen substituentteina. 25 Klassinen menetelmä hemoglobiiniliuoksien valmistamiseksi • · *“ käyttää hyväkseen vanhentunutta verta. Punasolut hajote taan ja soluroskat poistetaan jättäen jäljelle sen, joka * * toivottavasti on "peruskudosvapaata hemoglobiinia” (SFH).
··· Tässä lähestymistavassa on havaittu useita peruson-30 gelmia. Liuos täytyy vapauttaa kaikista punasolumembraanin « .*··. myrkyllisistä komponenteista, ilman että täytyy turvautua • · ·* vaivalloisiin ja aikaa vieviin menetelmiin, jotka tekevät • ♦ ♦ i suurimittakaavaisen tuotannon huonoksi. DeVenuto, "Ap- ♦ ♦♦ praisal of Hemoglobin Solution as a Blood Substitute", 35 Surgery, Gynecology and Obstetrics, 149: 417 - 436 (1979).
6 107938
Toiseksi, kuten odotetaankin, sellaiset liuokset ovat "vasemmalle siirtyneitä" (matalampi P50-arvo) verrattuna kokovereen. Gould et ai., "The Development of Polymerized Pyridoxylated Hemoglobin Solution as a Red Cell 5 Substitute", Ann. Emerg. Med. 15: 1416 - 1419 (3.12.1986).
Kolmanneksi, SFHtn puoliintumisaika verenkierrossa on ainoastaan noin 2-4 tuntia. Tämä johtuu siitä, että happea sisältävä Hgb osittain eroaa dimeeriksi (alfa-beeta), joka on riittävän pieni suodattuakseen munuaisten 10 välityksellä.
Lopuksi, SFH:lla on korkea kolloidinen osmoottinen paine (COD). Näin ollen SFH:n anto annoksena, jolla olisi sama happea kuljettava kapasiteetti kuin yksiköllä pakattuja punasoluja, ei ole viisasta, koska korkea osmoottinen 15 paine (60 mmHg) voisi aiheuttaa massiivisen veden kulkeu tumisen soluista verenkiertoon näin kuivattaen potilaan kudokset. Tämä syy rajoittaa SFH:n annoksen sellaiseen, joka antaa lopullisen konsentraation, joka on noin 6 - 8 g Hgb:ia/dl.
· 20 Yrityksessä säilyttää haluttu P50-arvo, tutkijat ’/·( lisäsivät 2,3-DPG:tä hemoglobiiniliuokseen. Valitettavasti 2,3-DPG poistettiin nopeasti verenkierrosta. Sitten tiede- ·»· miehet käyttivät muita orgaanisia fosfaatteja, erikoisesti • 1« pyridoksaalifosfaattia. Kuten 2,3-DPG, nämäkin yhdisteet
• M
.···, 25 stabiloivat Hgb:n "T-tilaa" muodostaen suolasillan kahden « · beetaketjun N-päiden välille. Pyridoksyloidun hemoglobii-. nin P50-arvo oli 20 - 22 torria verrattuna SFH:n 10 torriin ja kokoveren 28 torriin. Samalla, kun tämä oli parannus • 1 ·;·* SFH:hon verrattuna, pyridoksyloitu Hgb on "korkea-affini- 30 teettinen" verrattuna kokovereen.
• C. Hemoglobiinialayksiköitten kemiallinen yhteen- • · · . liittäminen • · « • · < *·*.* Hemoglobiinin ominaisuuksia on muutettu yhteenliit- • · *···* tämällä spesifisesti kemiallisesti alfaketjut alfal-ketjun 35 Lys99:n ja alfa2-ketjun Lys99:n väliltä. Walder, US-pa- 7 107938 tentti 4 600 531; Snyder et ai., PNAS (USA) 84: 7280 - 84 (1987); Chaterjee et ai., J. Biol. Chem., 261: 9927 - 37 (1986). PS0-arvo oli 29 mmHg:aa ja yhteenliittäminen ehkäisi munuaiserityksen, mutta puoliintumisaika plasmassa ko-5 hosi ainoastaan 2 - 3-kertaisesti.
Tämä kemiallinen yhteenliittäminen suoritettiin antamalla bis(3,5-dibromisalisyyli)fumaraatin reagoida deok-sihemoglobiini A: n kanssa inositoliheksafosfaatin läsnä ollessa. Tällä reaktiolla on matala saanto (10 - 20 %). 10 Lisäksi tarvitaan puhdistus muista kohdista modifioitunei-den johdannaisten poistamiseksi (neljässä ketjussa on 42 muuta lysiinijäännöstä ja aminopään aminoryhmää, joissa kilpaileva reaktio voi tapahtua).
Lisäongelma "diasporiini" yhteenliitosaineen käy-15 tössä on se, että se voi osallistua sivureaktioon, joka tuottaa karsinogeenista halofenolia.
Tässä kuvataan hemoglobiinianalogissa alfa-globii-nien N-pään väliini ja C-pään arginiini on yhdistetty aminohappo- tai peptidilinkkerin avulla, ilman että täytyy 20 turvautua erikoisiin kiinnitysaineisiin.
• · ::: : Beetaketjut on myös liitetty yhteen kemiallisesti.
• ·
Kavanaugh et ai., Biochemistry, 27: 1804 - 8 (1988) . Kava- ··· o
'·...: naugh panee merkille, että beetaketjujen N-päat ovat 16 A
***’; päässä toisistaan T-tilassa ja 20 Ä päässä toisistaan < · » 25 R-tilassa. DIDS-sillan muodostaminen T-tilassa olevan he- • · « .···. moglobiinin N-päiden välille esti siirtymisen R-tilaan « · · näin alentaen molekyylin 02-affiniteettia, mikä ei ole yl- . lättävää. Samalla, kun Kavanaugh-analogilla on toivotut • · ... hapensitomis- ja munuaisten kautta poistumisominaisuudet, • · •y* 30 se saadaan myös matalalla saannolla.
: ·.. D. Geeniekspressio, yleistä
Geeniekspressio pitää sisällään DNA:n transkription • · · .*. lähetti-RNA:ksi ja lähetti-RNA:n transloimisen proteiinik- » · · *y.: si. Transkriptioprosessi alkaa, kun entsyymi, DNA:sta • · *···* 35 riippuvainen RNA polymeraasi, kiinnittyy DNA:han. Tämän 8 107938 entsyymin sitoutumiskohtaa kutsutaan usein "promoottoriksi" ja entsyymin sitoutumista promoottoriin voi säädellä useat eri transkription repressorit tai indusoijät. RNA polymeraasi liukuu pitkin DNA molekyyliä muodostaen lähet-5 ti-RNA-transkriptin. Kun se kohtaa toisen säätelyelemen-tin, "terminaattorin", entsyymi putoaa pois ja mRNA-trans-kripti on muodostunut.
Ribosomit, solun proteiinitehtaat, käyttävät lä-hetti-RNA:ta templaattina vastaavan proteiinin rakentami-10 seksi. Ribosomin sitoutumiskohta sisältää niin kutsutun Shine-Dalgarno-sekvenssin (SD) ja sopivasti sijoittuneen aloituskodonin (starttikodonin). Aloittaen spesifisestä RNA-tripletistä, joka tunnetaan aloituskodonina, siirtäjä-RNA:t sitoutuvat vastaaviin lähetti-RNA:n kodoneihin. Ku-15 kin siirtäjä-RNA on kaksitoiminen; se sitoutuu lähetti-RNA:n kodoniin komplementaarisen antikodonin välityksellä samalla pitäen vastaavaa aminohappoa paikallaan niin, että se liitetään kasvavaan polypeptidiketjuun. Ketju putoaa pois, kun ribosomi kohtaa yhden kolmesta spesifisestä 20 tripletistä, jotka tunnetaan "lopetus"-kodoneina. Se osa ··· · '** ) alkuperäistä geeniä, joka vastaa lähetti-RNA:n sekvenssiä • · · aloituskodonista viimeiseen kodoniin ennen lopetuskodonia, • » *···* on koodittava sekvenssi. On olemassa myös 5’-pään sekvens- • · · si, joka alkaa promoottorista ja 31-pään sekvenssi, joka • · · 25 loppuu terminaattoriin.
• · · E. Polykistroninen ekspressio
On mahdollista, että yksittäisellä lähetti-RNA-·;··· transkriptillä on yksi promoottori, mutta kaksi tai useam- pia pareja aloitus- ja lopetuskodoneita, jotka määrittävät • · » 30 erillään transloitavia sekvenssejä. Kukin sellainen sek- • · : ** venssi on "kistroni" ja kistroneita vastaavat polypeptidit • · · • · '...· yhteisekspressoidaan näin ollen yhden promoottorin sääte- : .'· lyn alaisuudessa.
• · » • · · · .··*. Suurin osa bakteerioperoneista on polykistronisia, • · · 35 se tarkoittaa, että useat eri geenit transkriptoidaan yh- 9 107938 tenä lähetti-RNA:na niiden operoneista. Esimerkit sisältävät laktoosioperonin, jossa on kolme yhteenliitettyä geeniä (IacZ, IacY ja IacA) ja tryptofaanioperonin, jossa on viisi liittynyttä geeniä (trpE, trpD, trpC, trpB ja 5 trpA). Näissä operoneissa lähetti-RNA:n synteesi alkaa promoottorista ja transkriptissa koodittavat alueet on erotettu vaihtelevan pituisilla kistronien välisillä alueilla. (Operoni on ryhmä geenejä, joita säädellään yhtenä transkriptionaalisena geneettisenä yksikkönä). 10 Translaatiotehokkuus vaihtelee kistronista kistroniin. Kastelein et ai., Gene, 23: 245 - 54 (1983).
Kun kistronien väliset alueet ovat pidempiä kuin ribosomin ulottuvuus (noin 35 emästä), yhden kistronin lopetuskodonissa tapahtuvaa eroamista seuraa siitä riip-15 pumaton aloitus seuraavassa kistronissa. Kun kistronien väliset alueet ovat lyhyempiä tai jos kistronit ovat päällekkäin meneviä, terminoituvan ribosomin 30S alayksikkö voi epäonnistua eroamaan polykistronisesta mRNA:sta sen sitoutuessa välittömästi seuraavaan translaation aloitus-20 kohtaan. Lewin, Gene Expression, 143 - 148.
• · ::: : Toisin kuin bakteerien mRNA:t, eukaryoottien mRNA:t ovat yleensä luonteeltaan monokistronisia. Lewin, Gene
IM
Expression, 157.
Synteettisiä polykistronisia operoneja on rakennet- :1· 25 tu ja ekspressoitu sekä prokaryooteissa että eukaryooteis- • · · .*·*. sa.
• ·
Lee et ai., Nucleic Acids Res., 12: 6797 (1984) kuvaavat spesifisen synteettisen polykistronisen operonin • · ... tapauksen, jossa kaikki kistronit ekspressoivat samaa po- • · *;· 30 lypeptidiä. Tämä homopolykistroninen rakenne muodostet- • * ♦ '·· tiin geeniannosvaikutuksen maksimoimiseksi.
Schoner et ai., PNAS, 83: 8506 - 10 (1986) trans-
• M
. ^ loivat synteettistä kaksikistronista mRNA:ta E. coli -bak-
III
***.* teerissä. Ensimmäinen kistroni oli lyhyt keinotekoinen AU- ♦ · 35 rikas sekvenssi, kun taas toinen kistroni oli nisäkkään 10 107938 geeni (bGH). Havaittiin, että translaation "läpilukua" tapahtui, jos ensimmäisen kistronin lopetuskodonia seurasi toisen kistronin SD-sekvenssi ja jos se sijaitsi lähellä toisen kistronin aloituskodonia. Schoner'in tarkoitus oli 5 ratkaista hänen epäonninen Met-bGH:n korkean tason eks-pressio, jossa käytettiin geenin luonnollisia kodoneja, joka johtui luultavasti paikallisten sekundaarirakenteiden aiheuttamasta translaation inhibitiosta. Ensimmäinen kis-troni rakennettiin niin, että se suosi ribosomin sitoutu-10 mistä (sijoittamalla SD-sekvenssi ja AUG-aloituskodoni sellaiselle AU-rikkaalle alueelle, joka oli vapaa paikallisesta sekundaarirakenteesta). Katso myös Schoner et ai., Meth. Enzymol. , 153: 401 - 416 (1987), joka paljastaa, että bGH:n ylituotto tällä menetelmällä liittyi proteiini-15 granuloiden muodostumiseen.
Saito et ai., J. Biochem. , 101: 1281 - 88 (1987) ekspressoivat synteettistä somatomediini C geeniä E. co-li -bakteerissa käyttäen kahden kistronin systeemiä. He muodostivat teorian, että somatomediini C:n, joka on emäk-20 sinen polypeptidi, epästabiilisuus voitaisiin ratkaista ; kompleksoimalla se happaman polypeptidin kanssa. Näin oi- • · : ·.: Ien he rakensivat kaksikistronisysteemin, joka pystyi eks- pressoimaan molempia polypeptidejä. Ensimmäisen kistronin * · · .**·. lopetuskodoni meni päällekkäin toisen kistronin aloitusko- I·» .···. 25 donin kanssa. Transformantit akkumuloivat somatomediini .···. C:tä korkeina tasoina. Somatomediini C saatiin kuitenkin • · talteen liukenemattomien pellettien muodossa (katso sivu 1282).
• · · · ·
Nisäkässolujen ribosomit kykenevät samalla tavalla • · ···* 30 aloittamaan translaation uudelleen lopetuskodonin alavir-rassa olevasta aloituskodonista. Näin ollen, Boel et ai., ·***; FEBS Lett., 219: 181 (1987) ekspressoivat kaksikistronista • · · . transkriptioyksikköä nisäkässoluissa (CHO). Tämä yksikkö • * ♦ ••j · ohjasi sekä ihmisen haiman polypeptidin esiasteen että • · *···* 35 selektoitavan merkkigeenin (hiiren DHFR) synteesiä.
11 107938 CODON, W088/05486, kuvaa kaksikistronisen mRNAin tuoton, joka koodittaa sekä haluttua proteiinia (esim. kudoksen plasminogeeniaktivaattoria) että selektoitavaa fenotyyppiä (esim. neomysiiniresistenssiä). Yhteinen pro-5 moottori oli kummassakin esimerkissä Harvey'n jyrsijän sarkoomaviruksen johdannainen ja kaksikistroninen mRNA transloitiin sopivissa eukaryoottisissa soluissa.
GENENTECH, EP-patenttihakemus 117 058, esittää kaksikistronisen ekspressiovektorin ekspression selkärankais-10 isäntäsoluissa, jossa vektorissa yksi kistroni koodittaa haluttua proteiinia (esim. HbsAg) ja toinen koodittaa toista proteiinia (esim. DHFR), jonka synteesi on ympäristön säätelyn alainen (esim. metotreksaatilla).
F. Fuusiogeenit ja -proteiinit, yleistä 15 Geenit voidaan fuusioida yhteen poistamalla ensim mäisen geenin lopetuskodoni ja liittämällä se lukuraamiin toisen geenin kanssa. Geenien osia voidaan myös fuusioida ja täyte-DNA-sekvenssejä, jotka pitävät lukuraamin yllä, voidaan lisätä fuusioitujen sekvenssien väliin. Fuusiogee-20 nin tuote on yksi polypeptidi eikä useita polypeptidejä, : kuten polykistronisen operonin ekspressiossa. Erilaisia • · geenejä on fuusioitu yhteen eri tarkoituksia varten. Näin ollen, Gilbert, US-patentti 4 338 397, insertoi rotan pre- '"i proinsuliinigeenin E. coli -bakteerin penisillinaasigee- • * ——— .*··. 25 nin fragmentin taakse. Hänen tarkoituksensa oli ohjata E.
• * · .···. coli -transformantteja erittämään fuusiogeenin ekspressio- tuote. Fuusiogeenejä on muodostettu myös niin, että ei- . antigeenistä polypeptidiä voidaan ekspressoida valmiiksi • · * · · • · ... konjugoituna immunogeeniseen kantajaproteiiniin. Esillä • · ···’ 30 oleva keksintö kuitenkin pitää sisällään kahden saman gee-:*·.. nin kopion yhteen liittämisen.
:***: Linkkeri-DNA-sekvenssien käyttö kahden eri dna- ··· .*. sekvenssin yhteen liittämiseksi on tunnettu. Näitä link- • « « ♦ · · **·.* keri sekvenssejä käytetään muodostettaessa restriktiokohtia « « *···* 35 DNA:n katkaisua varten tai koodittamaan peptidejä, joilla 12 107938 on sellainen ainutlaatuinen ominaisuus, joka tehostaa koodi tetun fuusioproteiinin tai sen fragmentin puhdistusta.
Katso esim. Rutter, US-patentti 4 769 326.
Pisum sativum -siementen lektiini syntetisoidaan 5 yksittäisenä 275 aminohapon pituisena preproproteiinina, joka sisältää signaalisekvenssin, jota seuraa ensin beeta-ketju ja sitten alfaketju. Signaalisekvenssi poistetaan endoplasmisessa retikkelissä ja proteiinikappaleissa tuloksena syntynyt "prolektiini" katkaistaan 187 aminohapon 10 pituiseksi beetaketjuksi ja 58 aminohapon pituiseksi alfa-ketjuksi. (Lisäprosessointi johtaa lyhentymiseen karboksi-päistä.) Samalla kun herneen siemenisolaatti on näin ollen heterodimeeri havaittiin, että katkaisematon luonnollisesti esiintyvä "prolektiini" myöskin sitoo hiilihyd-15 raatteja ja että tätä "prolektiiniä" voidaan ekspressoida E. coli -bakteerissa ja saada talteen toimivassa muodossa.
Stubbs et ai., J. Biol. Chem., 26: 6141 - 44 (1986).
Toth, US-patentti 4 774 180, esittää polyproteiinin ekspressoimisen. Tämä polyproteiini tehtiin fuusioidusta . 20 DNA-sekvenssistä, joka koodittaa sekä ensimmäistä polypep- • · *“ | tidiä, joka katalysoi glysiinin reaktiota ATP:n kanssa, • · · *· *· jossa muodostuu glysyyli-adenylaattia ja toista polypepti- *..·* diä, joka saa glysyyli-adenylaatin reagoimaan tRNAGly:n • · · ·...· kanssa niin, että saadaan glysiinillä varattu tRNA. Nämä • · · :,,.ϊ 25 kaksi polypeptidiä ovat glysiini-tRNA-syntetaasin alfa- ja --- • · · beeta-alayksiköt, jolla syntetaasilla on kvaternaarinen alfa2beeta2-rakenne. Kahta alayksikköä koodittaa E. coli -·...: bakteerin genomissa yksi kaksikistroninen geeni. Toth .···. liitti alfaketjua koodittavan alueen beetaketjua kooditta- 30 van alueen kanssa yhteen linkkerin avulla, joka linkkeri • · ’ '* kooditti kuutta aminohappoa. Katso myös Toth ja Schimmel, • · · J. Biol. Chem., 261: 6643 - 46 (toukokuu 1986).
• Ladner, US-patentti 4 704 692, kuvaa eksperttisys- ·· · · .***. teemin sellaisten linkkerisekvenssien löytämiseksi, joita *φ· 35 voidaan käyttää kahden luonnollisesti aggregoituvan, mutta 13 107938 kemiallisesti erotettavan polypeptidiketjun muuttamiseksi yhdeksi polypeptidiketjuksi, jolla on samanlainen konfor-maatio laskostumisen jälkeen. Tämä systeemi perustuu tietokantaan, joka sisältää aminohapposekvenssit, joiden kol-5 miulotteiset rakenteet tunnetaan. Tietokannasta etsitään aminohapposekvenssiehdokkaita, jotka ovat ulottuvuudeltaan samanpituisia kuin ketjujen välinen sidottava alue. Sitten peptidiehdokkaiden suunta ja orientaatio tarkistetaan. Algoritmi olettaa, että nämä peptidit säilyttävät saman pi-10 tuuden ja orientaation riippumatta niiden viereisistä alueista.
Ladner, W088/06601, esittää hypoteettisen lähestymistavan dimeeristen repressoriproteiinien "pseudodimee-risten" analogien valmistamiseksi. Olennaisesti, aminohap-15 polinkkerisekvenssiä käytetään muuttamaan dimeerinen molekyyli yhdeksi ketjuksi. Ladner'in mukaan tämä linkkerisek-venssi voidaan suunnitella suoraan US-patentin 4 704 692 menetelmän mukaisesti; vaihtoehtoisesti linkkerisekvenssiä koodittava DNA on sattumanvaraisen emäsjärjestyksen sisäl- ^ 20 tävä oligonukleotidi ja in vivo -selektiota käytetään löy-♦ · « · *!1 | tämään sellainen pseudodimeeri, jonka linkkerisekvenssi • · · *tt1 sallii molekyylin laskostumisen oikein ja sitoutumisen • · *···1 sekvenssispesifisesti DNA:hän.
• · ·
Hallewell et ai., J. Biol. Chem., 264: 5260 - 68 * · · *...· 25 (1989) valmistivat CuZn-superoksididismutaasin analogin, ί.,.ί Kukin dismutaasimolekyyli on kahden samanlaisen alayksikön dimeeri; kupari-ioni ja sinkki-ioni ligandoidaan alayksik-·;··· köön. Dimeeri-interaktio CuZn-superoksididismutaasissa on .·1·. niin vahva, että alayksiköitä ei ole saatu erotettua inak-
• M
30 tivoimatta entsyymiä. Entsyymi on konformaatioltaan mer- • · • 2 kittävän samanlainen immunoglobuliinien kanssa; Hallewell • · et ai. liittivät kaksi ihmisen superoksididismutaasigeeniä j‘; joko suoraan tai sellaisen DNA:n välityksellä, joka koo- ··· · 2 .·2. dittaa ihmisen immunoglobuliini IgAl:n 19-jäännöksen pi- i»· 35 tuista sarana-aluetta ja ekspressoivat fuusioituja geenejä 14 107938 transformoidussa isännässä. Kun yritettiin ekspressöida suoraan liitettyjä geenejä, tapahtui rekombinaatiota, joka poisti yhden peräkkäin olevista geeneistä joistain plasmi-dimolekyyleistä. Hallewell et ai. olettivat, että suora 5 liitos väänsi dimeeriä niin, että se aiheutti hydrofobisten alueiden esiintuloon, jolla sitten oli myrkyllinen vaikutus. Tämä olisi muodostanut selektiopaineen, joka suosi geenideleetiota. Mitään rekombinaatiota ei havaittu IgAl-linkkerirakenteen suhteen.
10 Valitettavasti ei voida olettaa, että peptidilink- kerisekvenssin sisältävä pseudodimeerinen fuusioproteiini laskostuu sopivasti niin, että se olisi toiminnallisesti samanlainen kuin sen emoheterodimeeri.
G. Liukoisten proteiinien ekspressio 15 Yritykset tuottaa heterologisia proteiineja trans formoiduissa soluissa johtaa joskus osan tai koko proteiinin saostumiseen liukenemattomina inkluusiokappaleina, jotka tunnetaan myös valoa taittavina kappaleina. Katso esim. Paul et ai., Eur. J. Cell Biol., 31: 171 - 174 .·. 20 (1983) (ihmisen proinsuliini/E. coli -bakteerin trpE-fuu- • M · *” ! sioproteiini); Denefle et ai., Gene, 56: 61 - 70 (1987) (angogeniini); Langley et ai., Eur. J. Biochem., 163: • · *···1 313 - 321 (1987) (naudan kasvuhormoni); Petrov et ai., *···1 Biology of the Cell, 61: 1 - 4 (1987) (kalsitoniini); • · · 25 Richardson et ai., Biochim. Biophys. Acta, 950: 385 - 94 • · · ·...· (1988) (risiinin B-ketju); Davis et ai., Biochemistry, 26: 1322 - 26 (1987) (kasvaimen nekroositekijä); Lee et ai., ·;··: Biochim. Biophys. Res. Commun., 151: 598 - 607 (1988) ·’2; (gamma-interferoni); Meng et ai., J. Chromatogr., 443: • · · 30 183 - 92 (1988)(somatomediini C); Tsuji et ai., Biochem- • · istry, 26: 3129 - 34 (1987) (interleukiini-2). Termi "va- • · *···’ loa taittava" viittaa kykyyn havaita nämä kappaleet faasi- kontrastimikroskoopilla. Tavallisesti tällä liukenematto- 2 • · · · maila proteiinilla on ainoastaan pieni osa odotetusta bio- • · · 35 logisesta aktiivisuudesta jäljellä johtuen ehkä väärästä 15 107938 laskostumisesta. On ehdotettu, että inkluusiokappaleet muodostuvat, kun osittain laskostuneet proteiinimolekyylit reagoivat toistensa kanssa nopeammin kuin ne voivat las-kostua niiden luonnolliseen aktiiviseen konformaatioon. 5 Kruger et ai., Biopharm, 40 (maaliskuu 1989); Haase-Pet-tingell ja King, J. Biol. Chem. , 263: 4977 - 83 (1988). "Tekijät, jotka ottavat osaa inkluusiokappaleiden muodostumiseen rekombinanttibakteereissa, jäävät epäselviksi eikä ole helppoa ennustaa uuden E. coli-bakteerissa ekspres-10 soidun eukaryoottisen geenin tuotteen fysikaalista tilaa". Petrov, supra.
Samalla, kun näiden inkluusiokappaleiden muodostus johtaa rekombinanttiproteiinin rikastumiseen ja on näin ollen joskus toivottavaa, se myöskin tekee tarpeelliseksi 15 aggregaattien liuottamisen ja proteiinin biologisen aktiivisuuden uudelleen muodostuksen. Petrov, supra sivulla 4 oleva selittävä huomautus, "joskus nämä esteet tuntuvat olevan kriittisimpiä kohtia yhdistelmä-DNA-teknologiassa" .
On tehty yrityksiä liuottaa ja renaturoida näitä 20 proteiineja. Wetzel, US-patentti 4 599 197; Builder, US-‘I1 1 patentti 4 620 948; Olson, US-patentti 4 511 503; Jones, • 1 i | ” US-patentti 4 512 922. Sellaiset yritykset voivat kuiten- « · '···1 kin olla työläitä ja onnistumisensa suhteen epävarmoja.
« · 1
Katso Giantini ja Shatkin, Gene, 56: 153 - 160 (1987).
• · · 25 Kuten Weir ja Sparks, Biochem. J., 245: 85 - 91 (1987) • · · lt><! ovat maininneet, "proteiinit vaihtelevat merkittävästi renaturaation optimiolosuhteiden suhteen; erilaiset teki- ····· jät, kuten pH, suolakonsentraatio ja -tyyppi, denaturoivan .1·. aineen poistonopeus, kohdeproteiinin ja kontaminanttien • · · 30 konsentraatiot voivat vaikuttaa suuresti autenttisen pro- • · : 2 teiinin saamiseen". Nämä ongelmat vältetään, jos haluttu • · · • · proteiini ekspressoidaan liukoisessa muodossa.
Gatenby et ai., Eur. J. Biochem., 168: 227 - 31 2 • · · · 16 107938 karboksylaasientsyymiä. Tämän entsyymin alayksikkörakenne on L8S8, jossa L on suuri alayksikkö ja S on pieni alayksikkö. Luonnossa sitova proteiini ilmeisesti pitää L-ala-yksikön liukoisessa muodossa ennen sen kokoamista S-alayk-5 sikön kanssa. Yrityksiä koota aktiivinen korkeamman kasvin RuBPCaasi-entsyymi E. coli -bakteerissa on estänyt liukenemattoman inaktiivisen L-alayksikköaggregaatin muodostuminen.
H. Ihmisen alfa- ja beeta-globiinien bakteerieks- 10 pressio
Nagai ja Thorgerson (Nature, 309: 810 - 812, 1984) ekspressoivat E. coli -bakteerissa hybridiproteiinia, joka sisälsi lambda cll-proteiinin 31 aminopään jäännöstä, Ile-Glu-Gly-Arg-linkkerisekvenssin ja ihmisen täydellisen bee-15 ta-globiiniketjun. He katkaisivat hybridin juuri linkkeri-sekvenssin jälkeen veren hyytymistekijällä Xa näin vapauttaen beeta-globiiniketjun. Myöhemmin Nagai et ai., PNAS (USA), 82: 7252 - 55 (1985) ottivat yhdistelmä-DNA-mene-telmällä saadun ihmisen beeta-globiinin, luonnollisesta 20 lähteestä peräisin olevan alfa-globiinin ja hemiryhmän • · · · * lähteen ja onnistuivat tuottamaan ihmisen aktiivisen hemo- • · · *#>· globiinin. Koska alfa-globiini oli peräisin erytrosyyteis- • « *···* tä, lopullinen tuote voi sisältää ei-toivottavia erytro- »M f · syyttimebraanin osia.
Ml 25 Sen jälkeen julkaistiin tehokas bakteeriekspressio- ί,.,ί systeemi ihmisen alfa-globiinille. Julkaisu GB 8711614, joka on rekisteröity 16.5.1987; katso haettavana oleva ·:··· sarjanumero 07/194 338 ja W088/09179. Tämä johti ihmisen .·**. kokonaan synteettisen hemoglobiinin tuottoon niin, että M· #>* 30 liukenemattomat globiinialayksiköt ekspressoitiin erillään • · • ** erillisissä bakteerisolulinjoissa ja ketjut laskostettiin • *i uudelleen in situ hemiryhmän hapettuneen kofaktorin kanssa • saaden tetrameerinen hemoglobiini. Tämä menetelmä on työ-··· · .·*·. läs ja saannoltaan matala. Se vaatii denaturoivien liuot- • · ·«· 35 timien (urean ja guanidiinin) käyttöä ja ferri-ionin ke- 17 107938 miallisen pelkistyksen ferroionitilaan (katso esimerkki). Yksi esillä olevan keksinnön aihe on päästä eroon näistä haitoista.
Samalla, kun ihmisen alfa- ja beeta-globiinine-5 ja voidaan ekspressoida erillään E. coli -bakteerissa, Walder, Proceedings, Biotech USA 1988 (San Francisco, 14. - 16.11.1988) varoittaa sivulla 360, "eristetyt alfa-ja beeta(globiini)ketjut ovat epästabiileja ja pyrkivät saostumaan". Jos ihmisen alfa- ja beeta-globiinineja ei 10 tuoteta liukoisessa muodossa, ne täytyy liuottaa denaturoivilla aineilla ja sitten laskostaa uudelleen aktiivisuuden takaisin saamiseksi. Lisäksi, kun villityypin alfa-globiinigeeniä ekspressoidaan E. coli -bakteerissa, alfa-globiini akkumuloituu ainoastaan hitaasti. Ei ole varmaa, 15 johtuuko tämä epätehokkaasta translaatiosta vai isännän proteaasien toiminnasta, mutta WO 88/09179 esittää, että tämä ongelma voidaan ratkaista fuusioimalla lyhyt alue beeta-globiinigeenistä alfa-globiinigeeniin niin, että tuotetaan hybridiproteiini. Tämä hybridiproteiini täytyy 20 sitten katkaista esim. proteaasilla globiinin vapauttami- ::: : seksi. Jos proteaasi ei ole täysin selektiivinen (johtuen • · :.*·· ehkä muiden proteaasien kontaminaatiosta), haluttu katkai- : : sutuote ei ehkä ole ainoa saatu. Joka tapauksessa se tuote ’**: pitää erottaa muista E. coli -bakteerin polypeptideistä ja • · · .***. 25 kaikista proteaasiin liittyvistä kontaminanteista.
• · · .···. Kaskelotin myoglobiinia on ekspressoitu E. coli • · — - -bakteerissa, joka osoittaa, että bakteerit voivat sisäl- . lyttää prosteettisia hemiryhmiä sellaiseen proteiiniin, • · ... joka ekspressoidaan kloonatusta eukaryoottisesta geenis- • · ·;·’ 30 tä. Springer ja Sligar, PNAS (USA) 84: 8961 - 65 (1987).
: Walder sanoo, "jää nähtäväksi, voidaanko hemoglobiinia :***: valmistaa samalla tavalla, jos sekä alfa- että beetaketjut • · · . ’. ekspressoidaan samassa solussa". Samalla, kun myoglobiinin • · ♦ *;*.* (yksiketjuinen proteiini) ja erillisten alfa- ja beeta- • · *···* 35 globiinialayksikköjen välillä on korkea tertiaarirakenteen 18 107938 samankaltaisuustaso, hemoglobiini on heterotetrameerinen proteiini, primaarisilla globiinisekvensseillä ei ole kuin 27 % homologia ja myoglobiinilla tiedetään nyt olevan merkittävästi suurempi stabiilisuus kuin sekä alfa- että bee-5 ta-globiinilla. Näin ollen ei voida ennustaa, että alfa-ja beeta-globiinin yhteisekspressio samassa solussa johtaisi toimivan hemoglobiinin kokoamiseen solun sisässä, joka toimiva hemoglobiini vaatii sopivan alfa- ja beeta-ketjujen laskostumisen ja hemiryhmän sisällyttämisen.
10 I. Ihmisen geenin ekspressio hiivassa, yleistä
Useita ihmisen proteiineja on ekspressoitu transformoiduissa hiivasoluissa, erikoisesti Saccharomyces ce-revisiae -kannassa, joko sytoplasmisesti tai erittämällä ^ viljelyalastaan. King et ai., Biochem. Soc. Transac., 16: 15 1083 - 1086 (1988). Mutta onnistuminen ei ole taattu. Thim et ai., FEBS Lett., 212: 307 - 312 (1987) kokivat vaikeuksia oikein yhteenliittyneen insuliinin saamisessa hiivasoluista, joihin oli insertoitu koskematon proinsuliinia koodittava geeni. He ratkaisivat tämän ongelman rakenta-20 maila modifioidun proinsuliinigeenin, joka kooditti B- ja >t.‘. A-ketjuja, jotka oli liitetty yhteen heksapeptidikäsivar- • · · · .·. : rella. Tämän geenin tuote katkaistiin ja kaksi ketjua las- • ·» ,···. kostuivat ja liittyivät yhteen oikealla tavalla solujen • « ... toimesta.
• · *'* 25 Richardson et ai., Biochim. Biophys. Acta, 950: • « ··;’ 385 - 94 (1988) ekspressoivat heterodimeerisen risiinipro- • » ’···' teiinin B-ketjua E. coli -bakteerissa. He julkaisivat, et tä oli vaikeaa saada aikaan hiivan alfa-tekijän "leader"- *·**♦ sekvenssi/risiini B-ketju -fuusioproteiinin korkean tason * · · ’"'I 30 eritys. Mitään yrityksiä ei tehty risiinin A- ja B-ketju- ;·. jen yhteisekspressoimiseksi ja kokoamiseksi.
• it ‘...^ Murakami et ai., DNA, 6: 189 - 97 (1987) julkaisi- • · *;* vat hemiä sisältävän fuusioentsyymin tuoton transformoi- • » : duissa hiivasoluissa.
♦ ♦· • · • » • · · 19 107938
Horwitz et ai., PNAS (USA), 85: 8678 - 82 (marraskuu 1982) kuvasivat sellaisten hiivakantojen valmistuksen, jotka erittävät toimivia kimeerisiä hiiren variaabelialue/ ihmisen IgGl vakioalue -vasta-aineita viljelyalustaan. He 5 kuvaavat julkaisuaan ensimmäiseksi julkaisuksi, jossa eritetään vierasta multimeeristä tai heterodimeeristä proteiinia hiivassa. Mutta katso myös Carlson, Mol. Cell. Biol., 8: 2638 - 46 (kesäkuu 1988), joka esittää raskas-ja kevytketjujen cDNA:den transkription ja translaation 10 polypeptideiksi, jotka yhtyvät ja sitoutuvat antigeeniin.
Beggs et ai., Nature, 283: 835 (1980) yrittivät ekspressoida kanin kromosomaalista beeta-globiinigeeniä S. cerevisiae -kannassa. Nämä hiivasolut eivät kuitenkaan kyenneet silmukoimaan oikein intronin sisältävää globiinin 15 mRNA-transkriptia.
Mitään myönnytyksiä ei ole tehty, että mitkään tässä lainatut viitteet olisivat alan prioriteetteja. Työn kuvaus ja julkaisupäivämäärän lainaus perustuvat ainoastaan julkaistuihin tietoihin ja patentinhakijat varaavat 20 oikeuden kysyä näiden tietojen tarkkuutta.
Keksinnön yhteenveto j Tämän keksinnön aiheena on ratkaista edellä maini- .···. tut alan aiempien menetelmien puutokset. Patentinhakijat • I'.' ovat esimerkiksi saaneet aikaan tetrameerisen hemoglobii- 25 nin ensimmäisen täydellisen ekspression ja kokoamisen so- luissa, jotka eivät tuota hemoglobiinia luonnossa. Alan ’···* aiemmat työt ovat liittyneet alfa- ja beeta-globiinin erilliseen ekspressioon ja niiden solun ulkopuolella ta-pahtuvaan yhdistämiseen hemiryhmän kanssa hemoglobiinin • · · ' 30 muodostamiseksi.
;·| Esillä olevan keksinnön keskeinen ominaisuus on *... alfa- ja beeta-globiinin kaltaisten polypeptidien solun • · *** sisällä tapahtuva kokoaminen ja solun sisällä tapahtuva • · ·.· · hemiryhmän sisällyttäminen niin, että muodostetaan biolo- 3 5 gisesti toimiva hemoglobiinin kaltainen proteiini. Tämä 20 107938 solun sisällä tapahtuva kokoaminen saadaan aikaan ekspres-soimalla alfa- ja beeta-globiinin kaltaisia polypeptidejä samassa solussa niin, että ne laskostuvat yhteen ja sisällyttävät itseensä hemiryhmän. Tämän keksinnön tärkeä omi-5 naisuus on liukenemattomien globiiniaggregaattien, erikoisesti beeta-globiinin, muodostumisen oleellinen aleneminen verrattuna siihen, joka havaitaan, kun globiineja ekspres-soidaan erillään E. coli -bakteerissa tai S. cerevisiae -hiivassa. Yhteisekspressio voidaan saada aikaan geeneis-10 tä, jotka ovat kahdessa erillisessä, mutta yhteensopivassa plasmidissa samassa solussa, tai samassa plasmidissa olevasta kahdesta erilaisesta operonista tai yhdestä polykis-tronisesta operonista. Keksinnön mukaiselle menetelmälle tällaisen hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin 15 valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.
Yhdessä suoritustavassa alfa- ja beeta-globiinin kaltaisia polypeptidejä yhteisekspressoidaan bakteerisoluissa. Vastaavat geenit voidaan sisällyttää samaan syn-20 teettiseen operoniin (se on, niitä ohjaa yksi promoottori) tai sijoittaa erillisiin operoneihin, joissa on erilliset promoottorit (jotka voivat olla samoja tai erilaisia).
• · .*··. Suositeltavasti alfa- ja beeta-globiinin ekspressiota te- »·· .···. hostetaan sijoittamalla "ribosomin syöttö" -sekvenssi, • · 25 joka kuvataan tässä tämän jälkeen, kunkin globiinigeenin eteen. Tämä on erikoisen edullista alfa-globiinin tapauk-···" sessa, jota on vaikeampi tuottaa suurina määrinä.
Toisessa suoritustavassa alfa- ja beeta-globiinin **”· kaltaisia polypeptidejä yhteisekspressoidaan hiivasoluis- 30 sa. On saatu aikaan parannuksia sekä alf a-globiinin saan- ;·. nossa että beeta-globiinin liukoisuudessa.
• · · Tässä esitetään myös uusien välimuotojen, di-alfa- • · *!* globiinin ja di-beeta-globiinin (ja niiden mutanttien) • · : tuotto, joita välimuotoja voidaan ekspressoida solussa ja • · · : : 35 koota yhteen toistensa kanssa tai beeta- tai alfa-globii- 21 107938 nin kaltaisten polypeptidien kanssa, vastaavassa järjestyksessä, hemoglobiinin kaltaiseksi proteiiniksi. Samalla, kun solun sisällä tapahtuvaa kokoamista ei välttämättä vaadita, di-alfa- ja di-beeta-globiineja voidaan pitää 5 erikoisen soveltuvina toimivan hemoglobiinin solun sisällä tapahtuvaa kokoamista varten, koska esim. di-alfa-globii- nin ekspressio on analoginen joissakin suhteissa kahden alfa-globiinialayksikön solun sisällä tapahtuvalle kokoamiselle niin, että se eroaa aiemmin keskustellusta kokoa-10 misesta siten, että yhteen liittyminen saadaan aikaan eks-pressoimalla kovalenttista peptidilinkkeriä mieluummin kuin alayksiköiden ei-kovalenttisella reaktiolla keskenään. Di-alfa- ja di-beeta-globiinin kaltaisia polypeptide jä voidaan ekspressoida suositeltavasti bakteerisoluissa 15 tai hiivasoluissa.
Näistä keksinnön tai siihen liittyvistä näkökohdista keskustellaan nyt yksityiskohtaisemmin.
Hemoglobiinin kaltaisten proteiinien ekspressio hiivassa 20 Patentinhakijat ovat havainneet, että on mahdollis- ta tuottaa ihmisen hemoglobiinia (tai sen mutantteja) hii-vassa, erikoisesti Saccharomvces cerevisiae -kannassa.
• · .···. Hiivan ekspressiosysteemin käyttö poistaa tarpeen erottaa • ••# hemoglobiini bakteerin endotoksiineista. Olemme myös ha- «I 25 vainneet, että alfa- ja beeta-globiineja, joissa on oikea • · N-pään aminohappo, voidaan saada aikaan, ilman että ensin • · *···" ekspressoidaan globiinia selektiivisesti katkaistavan fuu- sioproteiinin osana. Uskomme, että tämä johtuu siitä, että ’·*’· hiivan metionyyliaminopeptidaasientsyymi kykenee poista- • · · *>>t! 30 maan N-pään metioniinin Met-alfa-globiinista ja Met-beeta- globiinista niin, että toivottu N-pään aminohappo tulee [... esiin (väliini) . Muutetun happiaffiniteetin sisältävien • · *1* mutanttien, joista on keskusteltu patentissa WO88/09179, • · ·.· : tuotto on erikoisen mielenkiinnon kohteena. Sellaisia mu- : 35 tantteja voidaan tuottaa globiinigeenien kohdennetulla mutageneesillä, jonka jälkeen kloonataan ja ekspressoidaan hiivassa.
22 107938
Suositeltavassa suoritustavassa ekspressiota säädellään "gal-gap49"-hybridipromoottorilla, joka määritellään tässä myöhemmin.
alfa- ja beeta-globiinigeenien yhteisekspressio 5 hiivasoluissa
Suositeltavassa suoritustavassa alfa- ja beeta-globiinigeenit ekspressoidaan molemmat samassa hiivasolussa. Beeta-globiinigeenin ekspressio yksinään johtaa beeta-globiinin tuottoon suurimmaksi osaksi liukenemattomana 10 vaikeasti uutettavana proteiinina, joka muodostaa vähemmän kuin 2 % solun kokonaisproteiinista. Alfa-globiinigeenin ekspressio yksinään johtaa alfa-globiinin tuottoon hyvin alhaisina tasoina (alle 0,5 % solun kokonaisproteiinista). Kummassakaan tapauksessa hemiryhmä ei mene proteiiniin 15 sisälle. Kuitenkin, kun alfa- ja beeta-globiinigeenejä yhteisekspressoidaan, transformoidut hiivasolut laskostavat alfa- ja beeta-globiiniketjut yhteen ja ottavat sisään hemiryhmät niin, että saadaan toimiva ihmisen rekombinant-tihemoglobiini liukoisessa muodossa, joka akkumuloituu 20 niin, että sitä on noin 10 % solun kokonaisproteiinista, ilman että geeneihin toimivasti liitetyissä promottoreis- ♦ · · · ·'· ! sa tehdään mitään muutoksia.
• · · • · .“·. Alfa- ja beeta-globiinigeenit voivat puolestaan .···, olla eri plasmideissa tai samassa plasmidissa isäntäso- • · 25 lussa.
• · **.* Alfa- ja beeta-globiinigeenien polykistroninen yh- • · ·· teisekspressio bakteerisoluissa
Patentinhakijat ovat translatorisesti liittäneet * * alfa- ja beeta-globiinigeenit pieneen "ribosomin syöttö" • · · 30 -geeniin, joka koodittaa pientä käyttöpeptidiä, joka joh- taa ribosomin suoraan halutun alfa- ja beeta-globiinin .···. lähetin ATG-kodoniin ja näin tehostaa translaatiotehok- • « *!' kuutta. He ovat myös sijoittaneet alfa- ja beeta-globiini- • · : geenit samaan operoniin niin, että ne transkriptoidaan • · · 35 yhdeksi polykistroniseksi mRNA-transkriptiksi. Sitten glo- 23 107938 biinit transloidaan erillisinä polypeptidiketjuina, jotka transformoidut solut sen jälkeen laskostavat yhteen ja lisäävät solunsisäisesti hemiryhmän muodostaen hemoglobiini tetrameerin. Patentinhakijoiden menetelmä ratkaisee on-5 gelman, joka liittyy saostettujen alfa- ja beeta-globii-nien erilliseen puhdistukseen.
Ihmisen hetero-oligomeerisen proteiinin polykistro-nista ekspressiota liukoisessa aktiivisessa muodossa hete-rologisessa isännässä ei ole aiemmin julkaistu. On erikoi-10 sen huomattavaa, että tämä oli nisäkkään proteiini, jota ekspressoitiin prokaryoottisessa isännässä (bakteeri). On huomattava vielä lisäksi, että tämä proteiini sisältää prosteettisia ryhmiä, joka lisää edelleen vaikeuksia oikean translaation jälkeisen prosessoinnin saavuttamiseksi. 15 Yhdessä suoritustavassa yhteisekspressoidaan Met- FX-alfa-globiinia ja Met-FX-beeta-globiinia, joissa FX osoittaa "leader"-peptidiä, jossa on tunnistuskohta faktori Xa:n katkaisuaktiivisuudelle. FX-alfa-globiini ja FX-beeta-globiini yhtyvät muodostaen mutanttihemoglobiinin, 20 jolla on reversiibeli hapen sitomisaktiivisuus vaikka sil-: lä on korkeampi affiniteetti hapelle kuin luonnollisella hemoglobiinilla. Vaihtoehtoisesti FX-"leader"-sekvenssi • · :***. tai muu fuusioitu "leader"-sekvenssi voidaan katkaista • · · **·. niin, että saadaan luonnollisen Hgb:n kopio.
* * * _ .·*·, 25 Toisessa suoritustavassa yhteisekspressoidaan Met- * » VV. alfa-globiinia ja Met-beeta-globiinia. Tämä poistaa kat- kaisuvaiheen käyttötarpeen.
Kolmannessa suoritustavassa yhteisekspressoidaan ‘ ' des-val-alfa-globiinia ja des-val-beeta-globiinia. Luon- * · · *...· 30 nolliset alfa- ja beeta-globiinit molemmat alkavat valii-nilla. Väliini voidaan kuitenkin korvata metioniinilla, • · · .···. jolla on samanlainen hydrofobisuus.
• · *·* Lisäsuoritustavoissa on muutettu yksi tai useampi • · » · * ·.: : luonnollisten geenien kodoneista niin, että tuotetaan sei- • · « 35 lainen alfa- ja/tai beeta-globiinin kaltainen proteiini, 24 107938 joka eroaa ominaisuuksiltaan luonnollisista proteiineista yhden tai useamman aminohapon suhteen (insertiot, delee-tiot tai substituutiot).
Di-alfa- ja di-beeta-globiinit 5 On valmistettu uusi proteiini, di-alfa-globiini, joka sisältää kaksi alfa-globiinin aminohapposekvenssiä, jotka on kovalenttisesti liitetty yhteen peptidisidoksin suositeltavasti yhden tai useamman aminohapon pituisen välittävän linkkerin välityksellä. Yllättävästi, nämä "ge-10 neettisesti yhteenliitetyt" alfa-globiiniketjut kykenivät laskostumaan oikein ja yhdistymään beeta-globiinin ja he-miryhmän kanssa muodostamaan toimivan hemoglobiinianalo-gin. Termi "geneettisesti yhteenliitetty" viittaa tuotto-menetelmään. Kaksi globiinigeenikopiota fuusioidaan yhteen 15 suositeltavasti DNA-välisekvenssin avulla, joka sekvenssi koodittaa aminohappolinkkeriä niin, että rakenne suoraan koodittaa haluttua di-alfa-globiinia. Termiä "analogi" käytetään sen vuoksi, että luonnollisessa hemoglobiinissa alfal- ja alfa2-alayksiköt ovat ei-kovalenttisesti sitou-20 tuneet yhteen. Di-beeta-globiinin samanlainen valmistus on : myös kuviteltu.
:*·.· "Geneettisesti yhteenliitetty j en" hemoglobiinien • · :***· valmistus välttää ne huonot puolet, joita on kemiallisessa • · · .*·*. yhteenliittämisessä. Jälkimmäinen on epätehokas ja vaatii • · « .···. 25 usein hemoglobiiniliuoksen deoksigenaation ja toisen mole-• · 'V. kyylin (esim. inositoliheksafosfaatin tai 2,3-DPG:n) läs- • · näolon kilpailevien reaktioiden estämiseksi.
Suositeltavassa suoritustavassa di-alfa-globiini ja/tai beeta-globiini sisältävät mutaatioita, jotka alen-...· 30 tavat hemoglobiinianalogin hapen sitomisaffiniteettia •\4 liuoksessa niin, että saavutetaan kokoveren hapensitomis- ominaisuudet.
• « • « ·
Di-alfa-hemoglobiini omaa edullisesti oleellisesti • · · :·! ·' pidemmän puoliintumisajan verenkierrossa kuin tavanomainen • · · ·...' 35 (des-val) rekombinanttihemoglobiini. Ihmisillä puoliintu- 25 107938 misaika ylittää suositeltavasta 9 tuntia annoksella, joka on ainakin 1 mg/kg kehon painoa. Tämän voidaan odottaa vastaavan noin 3 tunnin puoliintumisaikaa rotilla, joille on annettu verrattavissa oleva annos.
5 Di-alfa- ja di-beeta-globiineja voidaan ekspressoi- da sekä bakteereissa että hiivassa.
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1: Kaaviokuva sellaisten plasmidien, jotka ekspressoivat FX-alfa-globiinia (pDL II-62m), FX-beeta-10 globiinia (pDL II-10a) ja FX-hemoglobiinia (pDL II-66a), rakentamisesta.
Kuvio 2: Kaaviokuva plasmidin pDL III-la (2a), joka sisältää kaksikistronisen Des-Val-alfa-globiinigeenin Tac-promoottorin säätelyn alaisuudessa ja polykistronisen di-15 alfa/beeta yhteisekspressioplasmidin pDL III-47a (2b), rakentamisesta.
Kuvio 3: Kaaviokuva Met-alfa- ja Met-beeta-globii-nien yhteisekspressioplasmidin pDL III-13e rakentamisesta.
Kuvio 4: Oligonukleotidit synteettisten FX-alfa- ja 20 FX-beeta-globiinigeenien rakentamiseksi. Yläjuoste kuva- * taan 5' - 3' suuntaan ja alajuoste 3' - 5' suuntaan.
J Alueet, joilla komplementaariset synteettiset oligonukleo- tidit menevät päällekkäin on esitetty alueina, joilla mo-lemmat juosteet kuvataan samankokoisilla kirjaimilla. .···. 25 Pstl-kohta, joka yhdistää FX-alfan ja FX-beetan, on pääl-.···, lekkäin menevillä alueilla oligonukleotideissa SJH I-35a ja SJH I-36b.
. Kuvio 5: Synteettinen geeni Met-FX-alfa- ja Met- ’ FX-beeta-globiinin ekspressoimiseksi. Alue A sisältää ai- • 30 fa-globiinigeenin ja alue B sisältää beeta-globiinigeenin.
Faktori X:n sekvenssin ja kahden Shine-Dalgarno-sekvenssin .***. (SD 1 ja SD 2) sijainnit molemmilla alueilla on osoitettu.
• · ·
Valitut restriktioentsyymien tunnistuskohdat löytyvät • · · ··* · myös. Transloitavat aminohapposekvenssit ribosomin "syöt- • · • · • · » 26 107938 tö"-alueella ja Met-FX-alfa- ja beeta-globiinille on -annettu .
Kuvio 6: FX-hemoglobiinin eluutioprofiili ja absor-banssispektri.
5 Kuvio 7: Oligonukleotidit mutanttihemoglobiinien (eroavat aminohapposekvenssiltään tavanomaisesta hemoglobiinista) rakentamiseksi.
Kuvio 8: Oligonukleotidit sellaisten plasmidien, jotka eivät koodita faktori Xa:n substraatin tunnistuskoh-10 taa, rakentamiseksi.
Kuvio 10: Des-FX-Hgb:n hapen sitominen.
Kuvio 11: Plasmidit pDL III-14c ja pDL III-38b. Kuvio 12: Kuvaa sellaisen suositeltavan synteettisen geenin sekvenssin, joka ekspressoi (des-Val)-alfa-15 (GlyGly)-alfa-ja des-Val-beeta-globiinia. A kuvaa alueen (EcoRI - PstI), joka sisältää ribosomin Shine-Dalgarno-sitoutumissekvenssit (SD 1 ja SD 2), sekvenssin, joka ekspressoi oktapeptidiä (Met...Glu), joka toimii kotranslato-risena liitossekvenssinä ja sekvenssin, joka koodittaa 20 kahta lähes identtistä alfa-globiinin kaltaista polypepti- ::: : diä ja välissä olevaa Gly-Gly-linkkeriä. Ensimmäinen alfa- • · ·,*·· globiinisekvenssi alkaa "Met-Leu"-ryhmällä, se tarkoittaa, • · · : : että se sisältää keinotekoisen metioniinin eikä sisällä * ♦ « valiinia, joka on normaalisti ensimmäinen kypsän alfa-glo- • · · 25 biinin jäännös ja jatkuu toisella jäännöksellä, joka on .***. leusiini. Toinen alfa-globiinisekvenssi alkaa "Val-Leu"- ryhmällä juuri alleviivatun "Gly-Gly"-linkkerin jälkeen. Aloitus- ja lopetuskodonit on alleviivattu. B kuvaa analo- • · ... gista aluetta (PstI - Hindlll), joka sisältää koodittavan • · **· 30 alueen des-Val-beeta-globiinille. A ja B on liitetty yh-• · • teen Pstl-kohdasta niin, että ne muodostavat yhden poly- : kistronisen operonin.
• · ·
. \ Kuvio 13: Kuvaa lopullisen ekspressiovektorin pDL
• · · ***.’ III-47a rakenteen. "PTac" on Tac-promoottori ja "ampisil- • · • · ··· 27 107938 liini" on ampisilliiniresistenssigeeni. Kuvio 13a esittää plasmidin pDL III-47a Xbal-BamHl-fragmentin.
Kuvio 14: Plasmidi pSGE0.0E4.
Kuvio 15: Plasmidi pSGEl.lE4.
5 Kuvio 16: Plasmidi pDL IV-67a.
Kuvio 17: Plasmidi pJR VI-54a.
Kuvio 18: Plasmidi pDL di-alfa/beeta/beeta.
Kuvio 19: Kaaviokuva, joka esittää eri ekspressio-vektorien rakentamisen, jotka käyttävät lambda PL-promoot-10 torin säätelyä eri polykistronisille globiinioperoneille.
Kuvio 20: GAL-GAP-promoottorin nukleotidi sekvenssi, jossa on kuvattu restriktioentsyymien tunnistuskohdat. Alue Sphl - EcoRV sisältää synteettisen GALX . 10 -säätelyalueen (M. Johnston ja R. Davis, 1984. Molecular and 15 Cellular Biology, 4: 1440 - 1448). UAS on alueella, joka on numeroitu 29 - 63 tässä kuviossa. Alue EcoRV - Xbal sisältää GAP491-geenin transkription konsensusaloitus-alueen, jossa transkription aloitus tapahtuu noin kohdalta 395. (L. McAlister ja M.J. Holland. 1983. J. Biol. Chem., 20 260: 15019-15027; J. Holland et ai. 1983. J. Biol. Chem., 258: 5291-5299.) • « ·.*·· Kuvio 21: Kaaviokuvat, jotka esittävät beeta-glo- biiniekspressiokasetin (21a ja 21b) rakentamisen.
Kuvio 22: Kaaviokuvat, jotka esittävät beeta-glo- .*··. 25 biiniekspressiovektorin pGS4988 (22a) ja alfa-globiinieks-• · « .···. pressiovektorin pGS4688 (22b) rakentamisen.
• »
Kuvio 23: Kaaviokuvat (23a ja 23b), jotka esittävät . alfa-globiiniekspressiokasetin ja vektorien pGS289 ja ... pGS389 rakentamisen alfa- ja beeta-globiinien yhteiseks- • * ·;·’ 30 pressiota varten samasta plasmidista. Huomaa, että alfa- ja beeta-globiinit ekspressoidaan eri promoottoreista.
Kuvio 24: Hiivassa tuotetun rekombinanttihemoglo- * · · . biinin ja ihmisen luonnollisen hemoglobiinin absorptio- • · « ::i.: spektrit.
• · • · • · · 28 107938
Kuvio 25: Kaaviokuva (25a), joka esittää di-alfa/ beeta-hemoglobiinin hiivaekspressiovektorin rakentamisen ja plasmidin pGS3089 kartan (25b).
Kuvio 25: Plasmidin pGS3089RGV des-beeta kartta.
5 Suositeltavien suoritustapojen yksityiskohtainen kuvaus
Tavanomaisen hemoglobiinin rakenne on hyvin tunnettu. Liitämme tässä viitteeksi koko tekstin julkaisuista Bunn ja Forget, toim., Hemoglobin: Molecular, Genetic and 10 Clinical Aspects (W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA: 1986) ja Fermi ja Perutz, "Hemoglobin and Myoglobin", teoksessa Phillips ja Richards, Atlas of Molecular Structures in Biology (Clarendon Press: 1981).
Polypeptidin primaarirakenne määritetään sen amino-15 happosekvenssistä ja tunnistamalla kaikki yksittäisten aminohappojen sivuketjujen modifikaatiot.
Noin 92 % normaalin aikuisen hemolysaatista on Hgb A:ta (merkitään alfa2 beeta2, koska se sisältää kaksi alfa- ja kaksi beetaketjua). Alfaketju sisältää 141 amino-20 happoa (katso kuvio 11). Hemiryhmän (ferroprotoporfyriini • · n: : IX) rauta-atomi on sitoutunut kovalenttisesti his 87 jään- • · V*: nöksen ("proksimaalinen histidiini") imidatsoliryhmään.
IM
Beetaketju on 146 jäännöksen pituinen (katso kuvio 12) ja hemiryhmä on sitoutunut siihen kohtaan his 92.
ti· - ;***. 25 Muut tunnistetut hemoglobiinilaj it ovat Hgb A2 (a2 • · · .***. a2 δ2), Hgb Ala, Hgb Alb ja Hgb Alc kuin myös harvinaiset la- ··♦ jit Hgb F (a2 gamma2), Hgb Gower-1 (zeeta2 epsilon2), Hgb Gower-2 (a2 epsilon2), Hgb Portland (zeeta2 gamma2) ja Hgb • · ... H (beeta4) ja Hgb Bart (gamma.,). Ne eroavat Hgb A:sta eri- ·” 30 laisella polypeptidiketjujen valikoimalla.
• · • *·· Polypeptidiketjujen alueet voidaan stabiloida las- ♦ * * : : kostamalla ne toiseen kahdesta yleisestä konformaatiosta, *« · ·* ; alfa-heliksiksi ja beeta-levyksi. Luonnollisessa tilas- « · · ’!!.* saan noin 75 % henoglobiinimolekyylistä on alfa-helik- • « • · ·“ 35 simuodossa. Alfa-heliksialueet on erotettu toisistaan 29 107938 alueilla, joissa ketju on vähemmän laskostettu. On tavallista tunnistaa kunkin ketjun alfa-helikaaliset alueet kirjaimilla, esim. alfaketjun proksimaalinen histidiini on F8 (heliksin F jäännös 8). Ei-helikaaliset alueet tunnis-5 tetaan kirjainpareilla, jotka osoittavat, mihin helikaali-siin alueisiin ne liittyvät. Näin ollen, ei-helikaalinen alue BC sijaitsee heliksin B ja heliksin C välissä. Kun verrataan tietyn hemoglobiiniketjun kahta muunnosta, voi olla valaisevaa yrittää asettaa helikaaliset alueet alek- 10 käin yritettäessä löytää rakennehomologioita. Ihmisen tavanomaisen hemoglobiini A0:n alfa- ja beetaketjujen aminohapposekvenssin ja helikaalijäännösten merkintätapaa varten katso julkaisua Bunn ja Forget, supra, ja tässä olevaa taulukkoa 1.
15 Hemoglobiinimolekyylin tertiaarirakenne viittaa niiden aminohappojäännösten steerisiin suhteisiin, jotka jäännökset sijaitsevat kaukana toisistaan lineaarisessa sekvenssissä, kun taas kvaternaarinen rakenne viittaa tapaan, jolla alayksiköt (ketjut) ovat pakkautuneet yhteen.
20 Hemoglobiinimolekyylin tertiääri- ja kvaternaarirakenne on ::· : erotettu hemoglobiinikiteiden röntgendiffraktioanalyysil- • · ;t*·· lä, joka sallii molekyylin kaikkien atomien kolmiulottei- sen kohdan laskemisen.
• · · ’"j Oksigenoimattomassa ("deoksi"- tai "T"-, joka tar- • * .***. 25 koittaa "jäykkää"-muotoa) muodossaan hemoglobiinin alayk- .··♦. siköt (alfal, alfa2, beetal ja beeta2) muodostavat tetra- • · hedronin, jolla on kaksinkertainen symmetria-akseli. Ak-. seli kulkee veden täyttämässä "keskusonkalossa". Alayksi- köt reagoivat toistensa kanssa Van Der Vaals'in voimien, • · ···* 30 vetysidosten ja ioni-interaktioiden (tai "suolasiltojen" ) : välityksellä. Alfalbeetal- ja alfa2beeta2-pinnat pysyvät :***: suhteellisen liikkumattomina oksigenaation aikana. Päin- ··· . vastaisesti alfalbeeta2-pinnalla (ja alfa2beetal) on huo- • * ♦ **'.* mättävää liikkumista. Oksigenoidussa ("oksi"- tai "R", « · • i ♦ · « 30 107938 joka tarkoittaa "vapautunutta" muotoa) muodossa alayksikköjen väliset etäisyydet suurenevat.
Luonnollisen oksihemoglobiinin ja deoksihemoglobii-nin tertiääri- ja kvaternaarirakenteet on riittävän hyvin 5 tunnettuja niin, että lähes kaikki atomit vetyatomeita lukuunottamatta voidaan sijoittaa 0,5 Ä tarkkuudella tai tarkemmin. Ihmisen deoksihemoglobiinia varten katso Fermi et ai., J. Mol. Biol., 175: 159 (1984) ja ihmisen oksihe- moglobiinia varten katso Shaanan, J. Mol. Biol., 171: 31 10 (1983), jotka molemmat on lisätty tähän viitteiksi.
Samalla, kun hemoglobiinirakenteen analyyseillä on taipumus keskittyä alfa-beeta pinnoille, tiedetään, että yhden alfa-alayksikön aminopään ja toisen alayksikön kar-boksipään välimatka on noin 5,6 Ä deoksimuodossa ja 3,3 Ä 15 oksimuodossa.
Tämän patenttihakemuksen yhteydessä hemoglobiinin kaltainen proteiini on happea sitova proteiini, jossa on useita prosteettisia hemiryhmiä ja jonka P50-arvo on ainakin noin 0,8 kPa eli 6 torria, kun mitataan, kuten US-pa-2 0 tentin 5 02 8 58 8 taulukkoa 1 varten) ja joka koostuu <p.‘. useista polypeptideistä, joista kukin on ihmisen alfa- ·»« i .·, : (tai di-alfa) globiinin kaltainen tai ihmisen beeta- (tai
• I
t'./ di-beeta) globiinin kaltainen polypeptidi. Ihmisen alfa- • · globiinin kaltainen polypeptidi on luonnollinen ihmisen • · • · ·** 25 alfa-globuni tai sen mutantti, joka eroaa luonnollisesta • · *···' sekvenssistä yhden tai useamman susbtituution, deleetion <·* • · *...* tai insertion suhteen samalla, kun siinä on jäljellä aina kin 75 % homologiaa ihmisen alfa-globiinin kanssa ja joka * ·:··: edelleen kykenee ottamaan sisäänsä hemiryhmän ja liitty- ·”*; 30 mään yhteen beeta-globiinin kanssa. Beeta-globiinin kai- • · · täinen alayksikkö määritellään samoin. Eläinten hemoglo- • ·« blinien tai niiden mutanttien alayksiköt, jotka ovat riit- • · •y* tävän homologisia ihmisen alfa- tai beeta-globiinille, « « : sisällytetään termiin "ihmisen alfa- tai beeta-globiinin ;***; 35 kaltainen polypeptidi". Esimerkiksi naudan hemoglobiinin 31 107938 alayksiköt kuuluvat näiden termien piiriin. Alfa- ja bee-ta-globiinin kaltaisiin polypeptideihin voidaan viitata yhteisesti nimellä "globiinit".
Tämän patenttivaatimuksen yhteydessä di-alfa-glo-5 biinin kaltainen polypeptidi on sellainen, joka sisältää oleellisesti kaksi alfa-globiinin kaltaista polypeptidi-sekvenssiä peptidisidoksilla yhteen liitettynä ensimmäisen alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin normaalin C-pään ja toisen alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin normaalin 10 N-pään väliltä. Nämä kaksi sekvenssiä voivat olla suoraan yhteen liitettyjä tai liitettyjä yhden tai useamman aminohapon pituisen peptidilinkkerin välityksellä. Tähän ei sisällytetä sellaisia alfa-globiiniketjuja, jotka on liitetty yhteen N- ja C-päistä muilla keinoin kuin peptidisidok-15 silla (esim. DIDS.-llä). Di-alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin täytyy kyetä laskostumaan yhteen beeta-globiinin kanssa ja ottamaan sisäänsä hemiryhmä muodostaakseen toimivan hemoglobiinin kaltaisen proteiinin. Di-beeta-globii-nin kaltainen polypeptidi määritellään samoin. Di-alfa- ja 20 di-beeta-globiinin kaltaisiin polypeptideihin voidaan vii-tata yhteisesti nimellä "pseudodimeeriset globiinin kai- ·«· · ; täiset polypeptidit" .
' · · "Met-FX-alfa-globiini" on alf a-globiinin kaltainen • · polypeptidi, joka sisältää N-pään metioniinin, olidopep- ···1 25 tidin, joka toimii faktori Xa:n tunnistuskohtana (esim.
♦ · *···2 Ile-Glu-Gly-Arg) ja alf a-globiinin kaltaisen sekvenssin ··· (esim. Val-His-Leu-Thr-Pro. . .) , joka voi vastata villityy- pin alfa-globiinin tai sen tässä kuvatun mutantin sekvens- *:··: siä. Termi "Met-FX-alfa-globiini" lyhennetään joskus ni- ·“1; 30 meksi "FX-alfa-globiini". "FX-beeta-globiini" on vastaa- ·· · valla tavalla määritelty beeta-globiinin kaltainen poly- • · peptidi.
• · ’···' "Met-alf a-globiini" on alf a-globiinin kaltainen polypeptidi, jolla on ylimääräinen N-pään metioniini . Toi- ·§· · ·***· 3 5 nen aminohappo on väliini, joka on ensimmäinen aminohappo 2 · 32 107938 kypsässä villityypin alfa-globiinissa. Met-beeta-globiini on määritelty samoin. "Des-FX-alfa-globiini"-geeni (tai "des-FX-beeta-globiini") on Met-alfa-globiinigeeni, joka saadaan katkaisemalla FX-kodonit pois Met-FX-alfa-globii-5 nigeenistä. Huomaa, että termiä "Met-Hgb" käytetään viittaamaan metionyyli-Hgb:hen, joka muodostuu metionyyli-al-fa-globiinista ja metionyyli-beeta-globiinista.
"Des-Val-alfa-globiini" (tai "dVal-alfa-globiini") on alfa-globiinin kaltainen polypeptidi, jossa metioniini 10 on korvattu valiinilla, joka aloittaa kypsän villityypin alfa-globiinin sekvenssin. Des-Val-beeta-globiini on määritelty samoin. Des-Val-alfa/alfa-globiini (di-des-Val-alfa-globiini) on "di-alfa-globiini", jossa "Des-Val-al-fa"-sekvenssi on liitetty sopivan peptidilinkkerin väli-15 tyksellä alfa-globiinin kaltaiseen sekvenssiin, joka alkaa valiinilla.
Alfa- ja beeta-globiinin kaltaisten ketjujen ei tarvitse vastata täsmällisesti "tavanomaisen" hemoglobiinin alfa- ja beeta-globiinien sekvenssejä. Mieluummin voi-20 daan sisällyttää mutaatioita, jotka muuttavat hemoglobii-. nin happiaffiniteettia tai stabiilisuutta tai jotka hei- M· « pottavat yksittäisten ketjujen ekspressiota ja kokoamista.
• · .···. Esimerkin valossa, ei rajoittavassa mielessä, on valmis- tettu useita mutanttihemoglobiineja tämän keksinnön mukai- ::: 25 sella menetelmällä. Oppaana lisämutaatioiden tekemiselle • · **) toimii US-patentti 5 028 588, joka on liitetty tähän viit- * · *···* teeksi.
DNA-sekvenssit, jotka koodittavat yksittäisiä alfa- ’·’*· (tai di-alfa) ja beeta- (tai di-beeta) globiiniketjuja, ··· 30 voivat olla alkuperältään genomisia, cDNA:ta tai synteet-tisiä tai niiden yhdistelmiä. Koska genomiset globiinigee- • · · *... nit sisältävät introneita, genomista DNA:ta täytyy joko • · ekspressoida isännässä, joka kykenee silmukoimaan oikein • · ·,· · esilähetti-RNA:n, tai se täytyy modifioida poistamalla 35 intronit. Ainakin osittain synteettisen geenin käyttö on 33 107938 suositeltavaa monista syistä. Ensiksi, kodonit, jotka koodi ttavat haluttuja aminohappoja, voidaan valita siten, että saadaan sekvenssiin sopiviin kohtiin yksittäisiä tai lähes yksittäisiä restriktioentsyymien tunnistuskohtia 5 näin tehostaen sekvenssin nopeaa muuttamista kasettimuta-geneesillä. Toiseksi, kodonien valinta voidaan tehdä niin, että optimoidaan ekspressio valitussa isännässä. E. coli -bakteerin kodonien käyttöä varten katso Königsberg et ai., PNAS, 80: 687 - 91 (1983). Hiivan kodonien käyttöä 10 varten katso seuraava osa. Lopuksi, lähetti-RNA-transkrip-tin muodostamat sekundaarirakenteet voivat häiritä transkriptiota tai translaatiota. Jos näin on, nämä sekundaari-rakenteet voidaan poistaa muuttamalla kodonivalintoja.
Tietysti, jos käytetään linkkeriä alayksikköjen ge-15 neettiseksi yhteenliittämiseksi, linkkeriä koodittaa normaalisti synteettinen DNA. Samalla, kun di-alfa-globiinia ja beeta-globiinia voidaan ekspressoida erikseen ja sitten yhdistää toisiinsa ja hemiryhmään in vitro, ne sijoitetaan suositeltavasti yhteen plasmidiin.
20 Esillä oleva keksintö ei ole rajoittunut minkään : tietyn isäntäsolun, vektorin tai promoottorin käyttöön.
• · ϊ/·{ Suositeltavat isäntäsolut ovat kuitenkin bakteeri- (eri- koisesti E. coli) ja hiivasoluja (erikoisesti S. cerevi-··· — — — - siae). Valitun promoottorin täytyy olla toimiva halutussa • · · .···. 25 isäntäsolussa. Se on suositeltavasti indusoitava promoot-• · · .···. tori, joka induktion aikana saa aikaan korkean transkrip- • · tionopeuden. Suositeltava bakteeripromoottori on Tac-pro- . moottori, trp/lac-hybridi, jonka on täysin kuvannut ... DeBoer, US-patentti 4 551 433, ja joka on kaupallisesti • · •y* 30 saatavissa Pharmacia-LKB'lta. Muut promoottorit, joita voidaan käyttää, sisältävät lämpöherkät lambda PL- ja PR-promoottorit kuin myös lac-, trp-, trc-, pIN- (lipopro- « · · . teiinipromoottorin ja lac-operaattorin hybridi), gal- ja **// lämpöshokkipromoottorit. Käytetyn promoottorin ei tarvitse « · *···* 35 olla identtinen minkään luonnollisesti esiintyvän promoot- 34 107938 torin kanssa. Neuvoja promoottorien suunnittelemiseksi on annettu sellaisissa promoottoritutkimuksissa, kuten Harley ja Reynolds, Nucleic Acids Res., 15: 2343 - 61 (1987) ja siinä lainatuissa papereissa. Promoottorin sijainti suh-5 teessä ensimmäiseen rakennegeeniin voidaan optimoida. Katso Roberts et ai., PNAS (USA), 76: 760-4 (1979). Yhden promoottorin käyttö on suositeltavaa. Sopivat hiivaeks-pressiosysteemit on kuvattu yksityiskohtaisesti muualla tässä patenttihakemuksessa.
10 Käytetyn vektorin täytyy olla sellainen, jossa on replikaation aloituskohta, joka toimii isäntäsolussa. Siinä on suositeltavasti myös yksittäisiä restriktioentsyy-mien tunnistuskohtia globiinigeenien ja haluttujen säätelyalueiden insertiota varten ja tavanomainen selektiomerk-15 kigeeni. Vektoria voidaan modifioida niin, että siihen lisätään tai siitä poistetaan restriktioentsyymien tunnistuskohtia sen tekemiseksi sopivammaksi lisämanipulaatioil-le.
Alfa- ja beeta-globiiniketjuja voidaan ekspressoi-20 da joko suoraan tai osana fuusioproteiineja. Kun ekspres-soidaan fuusioproteiineina, jälkimmäinen voi sisältää koh- • · · • t · « .·, : dan, josta ne voidaan katkaista vapauttaen alfa- ja beeta-
• I I
globiinit ylimääräisestä polypeptidistä. Jos näin, voi- • » daan lisätä faktori Xa entsyymille herkkä kohta, kuten • · ·;·’ 25 ovat esittäneet Nagai ja Thorgenson, EP-patenttihakemus • · *···* 161 937, joka on liitetty tähän viitteeksi. Vaihtoehto!- • · · • · ’...· sesti alfa- ja beeta-fuusioproteiinit voidaan syntetisoi da, laskostaa ja liittää hemiryhmä saaden hemoglobiiniana-·:·*: logi.
·*’*: 30 Alfa- ja beeta-globiinialayksikköjen suora ekspres- ./ sio on suositeltavaa. Faktori Xa on verijohdannainen. Sen
• M
vuoksi faktori Xa:n valmisteet voivat sisältää ei-toivot- • · ’·;* tavia vereen liittyviä aineita tai etiologisia aineita.
• · :: j Joka tapauksessa hemoglobiini täytyy erottaa faktori 35 Xa:sta.
• · · 35 107938
Nagai ja Thorgerson, EP->patenttihakemus 161 937, joka on liitetty tähän viitteeksi, esittävät fuusiogeenien rakentamisen, jossa juuri ennen haluttua polypeptidiä koodi ttavaa DNA:ta sijaitsee DNA, joka koodittaa faktori 5 Xa:n, joka on seriiniproteaasi, katkaisukohtaa. Jotkin tietyt peptidisekvenssit, jotka faktori Xa katkaisee, on esitetty alla (joissa katkaisukohtaa merkitään merkillä " = " ):
Ile-Glu-Gly-Arg=Val-His-Leu-Thr CII FxB-globiini 10 Ile-Glu-Gly-Arg=Thr-Ala-Thr-Ser ihmisen protrombiini Ile-Glu-Gly-Arg=Thr-Ser-Glu-Asp naudan protrombiini Ile-Asp-Gly-Arg=Ile-Val-Glu-Gly ihmisen protrombiini
Ile-Glu-Gly-Arg=Ile-Val-Glu-Gly naudan protrombiini Ala-Glu-Gly-Arg=Asp-Asp-Leu-Tyr ihmisen antitrombiini
15 III
Yllä olevassa listassa "CIIFXbeeta-globiini" viittaa hybridifuusioproteiiniin, joka sisältää lambdaCII-proteiinin 31 aminopään jäännöstä, faktori Xa:n tunnistus-sekvenssin "Ile-Glu-Gly-Arg" ja ihmisen beeta-globiinin 20 täydellisen aminohapposekvenssin (joka alkaa "Val-His-Leu- . Thr-Tutkittaessa esillä olevan keksinnön kuviota 4 • · · · on ilmeistä, että esimerkin 1 FX-alfa- ja FX-beeta-globii- • · .*··. nit vastaavat luonnollista globiinia, jonka edessä on ryh mä "Met-Ile-Glu-Gly-Arg".
» 25 Bakteerin raRNA:ssa kohta, josta ribosomi sitoutuu • · lähettiin, on polypuriinijakso, joka sijaitsee 4-7 emäs- » · ’···* tä ylävirtaan aloituskodonista (AUG). Tämän jakson konsen- sussekvenssi on 5'...AGGAGG...3' ja sitä nimitetään taval-lisesti Shine-Dalgarno-sekvenssiksi. Shine ja Dalgarno, * : 30 Nature, 254: 34 (1975). SD-sekvenssin ja translaation aloituskodonin tarkka välimatka ja tämän välillä olevan • « —1
• M
alueen emässekvenssi vaikuttavat translaation tehokkuuteen • · « ·
*;* ja ne voidaan optimoida empiirisesti. Shepard et ai., DNA
1: 125 (1985); DeBoer et ai., DNA 2: 231 (1983); Hui et 35 ai., EMBO J., 3: 623 (1984).
• · · 36 107938
Lisäksi SD-sekvenssiä itseään voidaan modifioida ekspression muuttamiseksi. Hui ja DeBoer, PNAS (USA), 84: 4762 - 66 (1987). Sellaiset vertailevat tutkimukset ribo-somin sitoutumiskohdista, kuten Scherer et ai., Nucleic 5 Acids Res., 8: 3895 - 3907 (1987), voivat antaa neuvoja sopivista emäsmuutoksista. Jos hemoglobiinia aiotaan eks-pressoida muussa isännässä kuin E. coli -bakteerissa, pitää muodostaa sellainen ribosomin sitoutumiskohta, jota se isäntä suosii. Zaghbil ja Doi, J. Bacteriol., 168: 1033 -10 35 (1986).
Voidaan käyttää mitä tahansa isäntää, joka tunnistaa valitun promoottorin ja ribosomin sitoutumiskohdan ja jolla on kyky syntetisoida ja sisällyttää hemiryhmä. Bakteeri- ja hiivaisäntiä suositellaan.
15 Solun sisällä koottu hemoglobiini voidaan ottaa talteen tuottavista soluista ja puhdistaa millä tahansa alalla tunnetulla menetelmällä.
Alfa- ja beeta-globiinien polykistroninen yhfceis-ekspressio ja niiden kokoaminen hemoglobiiniksi 20 Eräässä suoritustavassa alfa- ja beeta-globiinigee- nien ekspressiota ohjaa yksi ainoa promoottori ja geenit • · · « : on sijoitettu niin, että transkriptoituu polykistroninen • · · lähetti-RNA-transkripti, josta erilliset alfa- ja beeta- » » globiinipolypeptidit sen jälkeen transloidaan. Esillä ole- • · • · ”· 25 va keksintö sisältää kuitenkin alfa- ja beeta-globiinigee- • · ’···* nien yhteisekspression eri promoottoreista, se tarkoittaa, että isäntä transkriptoi erilliset alfa- ja beeta-globiinien lähetti-RNA:t.
*”*: Yhden promoottorin käyttöä suositaan teoreettisilla ·’*’: 30 perusteilla. Ideaalisesti alfa- ja beeta-globiinia eks-• · · pressoidaan stoikiometrisesti samat määrät. Samalla, kun • · · *... yhden promoottorin käyttö ei varmista saman määrän tuot- • · ***** toa, se poistaa yhden epätasapainottavan vaikutuksen -erot : :*: transkriptiossa, jotka johtuvat eroista promoottorien vah- :***: 35 vuuksissa ja luoksepäästävyydessä. Jos erot promoottorien ·· · 37 107938 vahvuuksissa minimoitaisiin käyttämällä kahta identtistä promoottoria samassa plasmidissa, plasmidin stabiilisuus alenisi, koska olisi olemassa alttius homologisten alueiden rekombinaatiolle. Huomautamme kuitenkin, että prelimi-5 naarisissa kokeissa olemme yhteisekspressoineet alfa- ja beeta-globiineja eri promoottoreista.
Toinen oikeutus yhden promoottorin käytölle on rep-ressorin sitoutumiskohtien määrän minimoiminen.
Alfa- ja beeta-globiinigeenit sijoitetaan suositellet tavasti niin, että ribosomi transloi alfa-globiinikistro-nin ensin. Perussyy on se, että on olemassa joitain perusteita uskoa, että alfa-globiini vaikuttaa beeta-globiinin laskostumiseen. Silti geenien sijainnit voidaan muuttaa niin, että beeta-globiini syntetisoidaan ensin, kuten on 15 esitetty esimerkissä 6.
Polykistronisen mRNA-transkriptin stabiilisuutta, sen translaatiotehokkuutta alfa- ja beeta-globiiniksi ja globiiniketjujen laskostumista tetrameeriseksi hemoglobiiniksi voidaan modifioida vaihtelemalla kistronien välisten 20 alueiden (alue, joka sijaitsee yhden kistronin lopetusko- . donin ja seuraavan kistronin aloituskodonin välissä) pi- • · • · · *** * tuutta ja emässekvenssiä, vaihtelemalla toisen kistronin *· tahdistusta ensimmäisen kistronin suhteen ja vaihtelemalla • · *...* yhden kistronin ribosomin sitoutumiskohtaa ja sekvenssiä > · · ...· 25 suhteessa edeltävään kistroniin.
♦ ♦ · ♦ ϊ Suositeltavassa suoritustavassa alfa- ja beeta- globiinigeeniä kumpaakin edeltää lyhyt "syöttö"-kistroni tai "ribosomin syöttökistroni", joka tehostaa seuraavan globiinikistronin translaatiota. Kuviossa 4 alue A sisäl-.···, 30 tää kaksi kistronia ja Shine-Dalgarno-sekvenssin ennen kumpaakin kistronia. Ensimmäinen Shine-Dalgarno-sekvenssi • « i **· (SD l) sitoo ribosomin, joka sitten transloi ensimmäisen • ·· kistronin, joka on lyhyt oktapeptidiä koodittava kistroni.
: .·. (Tämä kistroni on nimeltään "syöttökistroni" tai "riboso- [···[ 35 min syöttökistroni".) Toinen kistroni on globiinigeeni, • · ·· · 38 107938 tässä tapauksessa FX-alfa-globiinigeeni. Toisen kistronin tehostamiseksi tarkoitettu Shine-Dalgarno-sekvenssi (SD 2) sijaitsee todellisuudessa ensimmäisessä kistronissa. Tästä johtuen näiden kahden sanotaan olevan "translatorisesti 5 yhteenliitettyjä". Alue B on rakenteeltaan samanlainen, paitsi että toinen kistroni koodittaa FX-beeta-globiinia. A- ja B-alueiden välillä on 43 emäksen pituinen kistronien välinen alue. Alueiden A ja B syöttökistronit vastaavat sen kaksikistronisen ekspressiosysteemin ensimmäistä kis-10 tronia, joka on nimeltään pCZ144 julkaisussa Schoner et ai., Meth. Enzymol., 153: 401 - 16 (1987). Esillä oleva keksintö ei kuitenkaan ole rajoitettu erityiseen "aloi-tuskistroniin”, jonka Schoner et ai. ovat kuvanneet; muitakin syöttökistroneita, jotka sallivat seuraavan kistro-15 nin korkean tason translaation uudelleen aloituksen, voidaan käyttää.
Neuvoja kistronien välisten sekvenssien ja SD-sek-venssien sijainnin suunnittelemiseksi voidaan saada vertaamalla saman polykistronisen operonin spontaanien tai 20 säädeltyjen mutanttien translaatiotehokkuutta, kuten ovat . esimerkiksi tehneet Schoner et ai., PNAS, 83: 8506 - 10 IM · : (1980). On myös mahdollista katsoa eri operoneiden kistro- • · .···, nien välisten alueiden konsensusominaisuuksia. McCarthy et • · #···# ai., EMBO J., 4: 519 - 26 (1985) ovat tunnistaneet E. coli • · III 25 -bakteerin atp-operonissa translaatiota tehostavan kistro-• · • · nien välisen sekvenssin.
• · *···* Esillä olevan keksinnön on tarkoitettu alentavan tai poistavan hemoglobiinin tai sen osapolypeptidien si- ♦ joittumista inkluusiokappaleisiin. Sen mukaisesti keksin- • « « 30 nön lisäominaisuus on se, että toimiva hemoglobiini löyde- « tään oleellisesti (suositeltavasta yli 80 %) solun liukoi- • · · % ··· sesta fraktiosta. On ilmeistä, että tämän keksinnön avulla • · *1* yli 90 % toimivasta hemoglobiinista voidaan ohjata tällä • · ; tavoin, kun alfa2 beeta2 -hemoglobiini kootaan alfa- ja 35 beeta-globiiniketjuista, jotka yhteisekspressoidaan tetra- • · ♦ 39 107938 kistronisesta operonista, kuten tässä on kuvattu. Di-alfa, beeta2-hemoglobiinin suhteen lähes 100 % on liukoista, kun ekspressio indusoidaan 25 °C:ssa ja vähemmän liukoinen, kun induktio tehdään korkeammissa lämpötiloissa. Nämä pro-5 sentit heijastavat prosentteja kaikista niistä di-alfa- ja beetaketjuista, jotka löydetään solun liukoisesta fraktiosta eikä todellista solusta saatua proteiinisaantoa. Ekspressio hiivassa
Esillä olevan keksinnön toinen suoritustapa koskee 10 hemoglobiinin kaltaisten molekyylien tuottoa hiivassa.
Suositeltava isäntämme ihmisen rekombinanttihemoglobiinin ekspressiota varten hiivassa on Saccharomyces cerevisiae. Muita home- tai hiivakantoja voidaan kuitenkin käyttää tähän tarkoitukseen, kuten Aspergillus- tai Pichia-kanto-15 ja. Jotta hiiva olisi sopiva isäntä, sen täytyy kyetä olemaan transformoitavissa rekombinanttivektoreilla, joko replikoituvilla tai integroituvilla tyypeillä. Tämä sallii tutkittavan geenin halutun DNA-sekvenssin insertion. Sen täytyy myös kyetä korkeaan solutiheyteen viljeltäessä so-20 pivassa tilavuudessa niin, että se tuottaa riittävästi so- ♦ : lumassaa halutun geeni tuotteen eristämiseksi halutuista raektioastioista, joissa kasvua voidaan ideaalisesti hei- • · posti säädellä useiden parametrien avulla, jotka sisäl- ·*·. tävät ravinteen formulaation, sekoituksen ja hapen siirron ··· .···. 25 ja lämpötilan. On myös toivottavaa kyetä indusoimaan pro- 4 » teiinisynteesin ekspressio käsittelemällä alustaa, lämpö- • · *** tilaa tai lisäämällä tai kuluttamalla pois tiettyjä kemi kaaleja. Lopuksi, ollakseen sopiva isäntä, hiivan täytyy kyetä tuottamaan rekombinanttiproteiineja suositeltavasti • · · • · ...* 30 niin, että niitä on yli 1 % solun kokonaisproteiinista.
• Tämä sallii halutun rekombinanttiproteiinin helpomman .···, eristyksen.
• « • · · S. cerevisiae -kantaan viitaten mahdollisesti käy- • · « ··’ ’· tettävät haploidit kannat sisältävät seuraavat: • · · « « • · • · · 40 107938 BJY3501 Matalfa pep4::HIS3 prbl-delta 1.6R his3 200
ura3-52 canl GAL
GSY112 Kuten yllä, mutta Leu2::HISG
GSY112 cir° Kuten yllä, mutta parannettu 2 μ plasmidis- 5 ta BJY3505 Mata pep4::HIS3 prbl-delta 1.6R HIS3 lys2-
208 trpl-101 ura3-52 gal2 canl GSY113 Kuten yllä, mutta leu2::HISG
RSY330 Matalfa pep4-3 prbl-1122 hist7 ura3-52 10 trpl-289 canl gall BJY2168 Mata prcl-407 prbl-1122 pep4-3 leu2 trpl ura3-52 BJY1991 Matalfa prbl-1122 pep4-3 leu2 trpl ura3- 52 15 RSY334 Matalfa regl-501 pep4-3 prbl-1122 ura3-52 leu2-3, 112 gall RSY214 Matalfa pep4-3 prbl ura3-52 Tähän mennessä sellaiset kannat, kuten GSY112, GSY113 ja RSY334, ovat olleet parhaita hemoglobiinin tuot-20 tajia. Sellaiset kannat, kuten RSY334, joka sisältää regl- • · · 501-mutaation, voivat olla erikoisen tärkeitä, koska niis- sä glukoosin aiheuttama repressio ei liity galaktoosilla tapahtuvaan induktioon, joka sallii indusoimisen matalam- • · · .**·. millä galaktoositasoilla glukoosin läsnä ollessa. Koska • * · .···, 25 tällä kannalla on gall-mutaatio, se ei voi metaboloida • « • · * S··% galaktoosia, joten galaktoosikonsentraatio säilyy vakiona • · ja jatkaa toimintaansa indusoijana.
. Diploidit kannat, jotka muodostetaan risteyttämällä [ * mitkä tahansa yllä olevat yhteensopivat kannat tai saman- ...* 30 laiset yhteensopivat kannat, voivat myös olla käyttökel- poisia, koska niillä tuntuu olevan nopeammat kasvunopeudet .***. kuin haploideilla kannoilla.
• · » . \ Esimerkiksi seuraavat diploidit kannat, jotka yh- • · · teisekspressoivat alfa (tai di-alfa) ja beeta-globiineja, • ♦ 35 on kuvattu esimerkeissä: 41 107938 BJY350 (pGS4988) x RSY330 (pGS4688) BJY3505 (pGS4988) x BJY1991 (pGS4688)
Muita risteytyksiä voidaan samalla tavalla käyttää 5 esillä olevan keksinnön suorituksessa.
Kantojen, joilta puuttuvat proteaasit, käyttö voi myös olla edullista.
Hiivan ekspressiosysteemit voidaan jakaa kahteen pääluokkaan: (1) systeemit, jotka on suunniteltu proteii-10 nin erittämiseksi ja (2) systeemit, jotka on suunniteltu proteiinien sytoplasmista ekspressiota varten. Erityssys-teemien edut ovat: (1) Proteiini on usein helpompi puhdistaa viljely-alustasta kuin kokosolu-uutoksista.
15 (2) Jos proteiinilla on elintärkeitä disulfidisi- doksia, ne muodostuvat todennäköisemmin, jos proteiini kulkee eritysreitin läpi. Tämän ajatellaan johtuvan osaksi proteiinidisulf idi-isomeraasin läsnäolosta endoplasmisessa retikkelissä ja vähemmän pelkistävästä ympäristöstä kuin 20 sytoplasmassa.
r (3) Eritys voi myös olla edullista, jos ensimmäinen • * · « ·*·,· aminohappo (aloittavan metioniinin jälkeen) muodostaa sei- • i ,···. laisen dipeptidisekvenssin, jota metionyyliaminopeptidaasi
IM
··». prosessoi huonosti. Erityssignaalisekvenssin lisäys voi 25 sallia signaalipeptidaasin aiheuttaman prosessoinnin eri- • i “I tyksen aikana, joka johtaa proteiiniin, jolla on proteii- « a • · ·** nin aminopäässä autenttinen aminohappo.
Erityssysteemin huonot puolet ovat: a • ’ (1) Ekspressiotaso on yleisesti paljon alempi kuin • •a *...· 30 se, joka voidaan saada sytoplasmisella ekspressiolla. Tämä j·.^ tuntuu osaksi johtuvan rajoittavasta eritysnopeusvaihees- a .·**. ta.
a a «’ (2) Kaikki proteiinit eivät ole erittyviä.
• a • · a M : (3) Usein, erikoisesti S. cerevisiae -kannalla, • * a 35 väärin prosessoidut proteiinin muodot akkumuloituvat ja 42 107938 nämä voivat olla vaikeita puhdistaa pois oikein prosessoiduista muodoista.
Yleisimmin hiivalla käytetty eritysekspressiosys-teemi on hiivan alfa-faktorin erityssignaalisekvenssit ja 5 alfa-faktoripromoottori. Yleiskatsausta varten katso A.J. Brake. Yeast Genetic Engineering, toim. P. Barr, A. Brake ja P. Valenzuela. Butterworth Publishing, Boston 1989. Useisiin eri promoottoreihin liitettyä invertaasisignaali-sekvenssiä on myös käytetty heterologisten proteiinien 10 ekspressoimiseksi hiivassa. Katso G. Stetler et ai., Biotechnology, 7: 55 - 60 (1989), R. Smith et ai., Science, 229: 1219 - 1229 (1985).
Sytoplasmisen ekspression edut ovat: (1) Ekspressiotasot voivat olla melko korkeita 15 niin, että on julkaistu proteiinien ekspressioita, jotka ovat > 20 % solun kokonaisproteiinista, tavallisesti liukoisena proteiinina.
(2) Joitain proteiineja ei voida tehokkaasti erittää .
20 (3) Proteiinit, jotka sisältävät glykosylaatiokoh- . tia, glykosyloidaan hiivasta eritettyinä hiivalle ominai- « · ·*·· sella sokerirakenteella. Koska nämä erittäin hydrofiiliset • · · '· *: translaation jälkeiset modifikaatiot sijaitsevat proteii- • · · nien pinnalla, ne muodostavat proteiinille antigeenisuut- • · · 25 ta. Jos proteiini toimii ilman hiilihydraattisivuketjuja, • · * voi olla edullista tuottaa proteiini ilman niitä mieluum-:***; min kuin hiivaspesifisen modifikaation kanssa (katso esim.
• t»
Travis et ai. 1985. J. Biol. Chem., 260: 4384 - 4389).
(4) Joillain proteiineilla on muita spesifisiä mo- • · #···# 30 difikaatioita, jotka esiintyvät ehkä ainoastaan sytoplas- massa, esimerkiksi aminopään asetylaatio, modifikaatiot • · : ’* lipideillä, ehkä hemiryhmän sisällyttäminen ja niin edel- • · « leen.
: .·. Tällä hetkellä suositellaan sytoplasmista ekspres- • · · • « · · ,···. 35 siota, koska hiivasolu laskostaa globiiniketjut yhteen ja • · 43 107938 sisällyttää hemiryhmän tuottaen hemoglobiinin in vivo. On kuitenkin mahdollista ekspressoida erikseen ja erittää alfa- ja beeta-globiiniketjut ja koota hemoglobiini in vitro.
5 Globiinigeenit täytyy sijoittaa sopivan promootto rin säätelyn alaisuuteen. Yleisesti käytetyt hiivapromoot-torit sijoittuvat yleensä kahteen laajaan ryhmään: säädellyt ja konstitutiiviset. Laajasti käytetyt konstitutiiviset promoottorit sisältävät GAP-, PGK- (fosfoglyseraatti-10 kinaasi) ja alfa-faktoripromoottorin. Säädeltyjä promoottoreita on myös käytetty ja nämä sisältävät hiivan metal-litioneiinipromoottorin (säädellään kuparilla), Gall-10-promoottorin, GAL7-promoottorin (säädellään galaktoosilla ja glukoosilla), ADHII-promoottorin (säädellään etanolilla 15 ja glukoosilla), PH05-promoottorin (fosfaattisäätely) ja useita hybridipromoottoreita, kuten PH05-GAP, GAL-PGK, ADHII-GAP ja GAL-CYC1.
Säädeltyjen promoottoreiden käyttö voi olla tärkeää plasmidin stabiilisuuden kannalta. Usein rekombinanttipro-20 teiinien ekspressio korkeina tasoina inhiboi isäntäorga-, nismin kasvua. Tämä huono puoli voi johtaa sellaisen solu- t · » **' * populaation akkumuloitumiseen, jossa on ainoastaan muutama » ♦ « '· ]· kopio plasmidia läsnä, alenemiseen kasvunopeudessa ja ko- .·’ konaisekspressiotasojen putoamiseen. Pitämällä geeni re- • · ·...· 25 pressoidussa tilassa ja indusoimalla myöhään fermentaa-« · · tiossa voidaan pitää yllä korkeat kasvunopeudet ja selek-
«M
: tio korkeaa plasmidin kopiolukua vastaan voidaan välttää.
On jonkin verran vaikeaa saada tarkkaa tietoa hii- • ...j vapromoottorien suhteellisista vahvuuksista, koska tämän .*··. 30 asian ainoa todellinen mitta perustuisi mRNA:n synteesin • « · kinetiikkaan. Suurin osa olemassa olevista tiedoista mit-: ** taa ainoastaan lopullista proteiinikonsentraatiota, joka on saatu. Koska proteiinin stabiilisuudessa voi olla suu- • j*· ria eroja, on tarpeellista verrata samaa proteiinia ja • · · · .···. 35 mRNA:ta useilla promoottoreilla samanlaisissa vektoreissa.
• · · 44 107938 Tällaisen tutkimuksen suorittivat Verbakel et ai., Gene, 61 s 207 - 215 (1987). He vertasivat GAPDH-, CYC1-, GAL7-, PH05- ja PGK-promoottoreita ja mittasivat beeta-galakto-sidaasi/polioviruksen VP2-proteiinin fuusion ekspressiota. 5 CYC1 johti ekspressiotasoon, joka oli 0,14 % solun koko-naisproteiinista (TCP); GADPH, 0,22 % TCP; PH05, 0,26 % TCP; PGK, 0,9 % TCP ja GAL7, 0,96 % TCP.
Käyttäen GAL-GAP-hybridipromoottoriamme olemme saaneet sellaiset hemoglobiinin ekspressiotasot, jotka edus-10 tavat -> 15 % solun kokonaisproteiinista. Tämä mitä todennäköisemmin johtuu kohonneesta promoottorin vahvuudesta yhdessä erittäin stabiilin proteiinituotteen ja ehkä pidentyneen puoliintumisajan sisältävän mRNA:n kanssa.
GAL-GAP-hybridipromoottorin käyttö on suositelta-15 vaa. Molemmat elementit (GALUAS ja GAP:n transkription aloituskohta) ovat hyvin ymmärrettyjä. GAL:n säätelyalueen transkriptiosäätelymekanismien tutkimukset ovat olleet melko laajoja. Galaktoosisäätelyalue sisältää viisi geeniä, jotka koodittavat entsyymeitä, joita tarvitaan galak-20 toosin käyttämiseksi. Neljää näistä geeneistä (GAL1, GAL7, . GAL10 ja GAL2) ekspressoidaan ainoastaan galaktoosin läs- • · ··· j nä ollessa. Galaktoosi-induktio ei tapahdu glukoosin läs- *· ”· nä ollessa ellei hiivakannassa ole REGl-geenin mutaatiota.
• · · ·...· GAL1-, GAL7-, GAL10- ja GAL2-geenejä säädellään ainakin ί,.,ί 25 kahdella muulla geenillä, GAL80:lla ja GAL4:llä. GAL4 on : : transkription aktivaattoriproteiini, joka aktivoi mRNA:n :***; synteesin GAL1-, GAL7-, GAL10- ja GAL2-geenien ylävirran # · · aktivaattorisekvensseistä (UASgal). Vaikka GAL4-geeniä eks- ....: pressoidaan konstitutiivisesti, se on toiminnallisesti ,···, 30 hiljainen galaktoosin poissa ollessa. GAL4:n aktiivisuu- *** den repressiota galaktoosin poissa ollessa pidetään yllä • · : ·· GAL80-geenituotteen avulla. GAL80-proteiini ilmeisesti • · ♦ reagoi fyysisesti GAL4:n kanssa niin, että se estää trans- : .·. kription aktivaation. Galaktoosi tai galaktoosijohdannai- • · 1 • · · · 45 107938 nen luultavasti estää tämän interaktion sallien GAL4-vä-litteisen induktion.
S. cerevisiae -kannan haploideilla kannoilla on kolme erilaista geeniä, jotka koodittavat glyseraldehydi-5 3-fosfaattidehydrogenaasientsyymiä (GAP). Nämä geenit ovat nimeltään TDH1, TDH2 ja TDH3 ja kukin on läsnä yhtenä kopiona per haploidi genomi. TDH3-geeni tuottaa noin 60 % solun GAP-entsyymistä ja TDH1 ja TDH2 tuottavat noin 12 % ja 28 %, vastaavassa järjestyksessä (McAllister, L. ja 10 M.J. Holland, 1985. J. Biol. Chem., 260: 15019 - 16027). Holland'in ryhmä (Holland et ai. 1981. J. Biol. Chem., 256: 1385 - 1395 ja Holland et ai. 1983. J. Biol. Chem., 258: 5291 - 5299) on kloonannut ja karakterisoinut S. cerevisiae -kannan kolme GAP-geeniä. Kloonit ovat nimeltään 15 pGAPll, pGAP63 ja pGAP491. pGAP491 vastaa TDH3-geeniä ja on sen vuoksi korkeimmin ekspressoituva. Tätä promoottoria on käytetty ekspressoitaessa useita erilaisia proteiineja hiivassa, jotka proteiinit sisältävät seuraavat:
Proteiini Viite 20 Alfa-interferoni (1)
Hepatiitti-B-antigeeni (1) • · : Taumatiini (2) • « *. *: Hepatiitti-B-antigeeni (3) • · · HIVIII-käänteiskopioi jaentsyymi (4) 25 Ihmisen SOC (5) : : Alfal-antiproteaasi (6) (1) Bitter, G. ja K.M. Eagan. 1984. Gene, 32: 263 - 274.
(2) Edens, L et ai. 1984. Cell, 37: 629 - 633.
....; (3) Kitano, K. et ai. 1987. Biotechnology, 5: 281 - 283.
* · 30 (4) Hallewell, R.A. et ai. 1987. Biotechnology, 5: 363 - 366.
• * : ’·· (5) Barr, P.J. et ai. 1987. Biotechnology, 5: 486 - 489.
(6) Travis, J. et ai. 1985. J. Biol. Chem., 260: 4384 - : !*. 4389.
• · » • · · * • * * • « 46 107938 Tätä promoottoria käytetään tavallisesti 600 - 850 emäsparin pituisena fragmenttina ja se on oleellisesti säätelemätön. Pidemmässä muodossaan tämä on erittäin vahva promoottori. Meidän käyttämämme muoto sisältää ainoastaan 5 noin 200 emäsparia translaation aloituskohdan 5'-puolelta. Tämä muoto ilman mitään lisättyjä tehostajasekvenssejä on oleellisesti vähemmän aktiivinen kuin promoottorin pidempi muoto [Edens, L. et ai., Cell, 37: 629 (1984)]. GAL-tehos-taja-alueen lisäyksemme tuo mukanaan sekä säätelyn että 10 korkeat ekspressiotasot. Ainoastaan GAP491-promoottorilla alfa- ja beeta-globiineja tuotettiin tasoilla, jotka olivat vähemmän kuin 0,2 % solun kokonaisproteiinista; GAL-GAP491-hybridipromoottorilla ekspressio nousi 7-10 %:iin solun kokonaisproteiinista.
15 Monet muutkin hybridipromoottorit ovat erikoisen mielenkiintoisia:
GAL-SIGMA
Vahva galaktoosilla säädeltävä promoottori, jossa on sigman transkription aloituskohta.
20 SIGMA-GAP
Vahva peptidihormonilla säädeltävä promoottori, :·: : jossa on GAP491-geenin transkription aloituskohta.
GAL-EF III
{...: Vahva galaktoosilla säädeltävä promoottori, jossa ♦ · · • 25 on pidennysfaktori Ill-geenin transkription aloituskohta.
:***: SIGMA-EF III
«« «
Vahva peptidihormonilla säädeltävä promoottori, • · · jossa on pidennysfaktori Ill-geenin transkription aloitus-kohta.
• · ... 30 Voidaan helposti suunnitella muita promoottorisys- Ί* teemejä, jotka myös toimivat. Nämä sisältävät, mutta eivät • · • *·· ole rajoittuneet, useat konstitutiiviset promoottorit.
• m · : Esimerkiksi hiivan pariutumisfaktori alfan (MFalfa) pro- j .·. moottori tai pariutumisf aktori a: n (MF a) promoottori, • « · *11." 35 fosfoglyseraattikinaasin (PGK) promoottori, heksokinaasi • · • ♦ · 47 107938 l:n, heksokinaasi 2:n, pyruvaattikinaasin, trioosifosfaat-ti-isomeraasin, fosfoglyseraatti-isomeraasin, fosfoglyse-raattimutaasin, fosfofruktoosikinaasin tai aldolaasin promoottoreita voidaan kaikkia käyttää. Lyhyesti, kaikki hy-5 vin ekspressoivat hiivan promoottorit voivat toimia eks-pressoitaessa hemoglobiinia hiivassa. Laajaa joukkoa erilaisia luonnollisesti esiintyviä säädeltyjä promoottoreita voidaan myös käyttää, esimerkiksi: GAL1-10, GAL7, PH05, ADHII on kaikkia käytetty tuotettaessa heterologisia pro-10 teiineja hiivassa. Joukkoa erilaisia synteettisiä tai puolisynteettisiä hiivan promoottoreita, kuten GAL-PGK, GAL-MFalfa-1, GAL-MFal, GAL-SIGMA, voidaan myös käyttää. ADHII:n säätelysekvenssit voidaan myös liittää vahvoihin transkription aloituskohtiin, jotka ovat peräisin erilai-15 sista promoottoreista. PH05:n säätelysekvenssiä tai sigma-elementin säätelysekvenssejä voidaan myös käyttää rakennettaessa vahvoja hybridipromoottoreita. Hiivan promoot-toreiden lisäksi on ajateltavissa, että voidaan käyttää vahvaa prokaryoottista promoottoria, kuten T7-promootto-20 ria. Tässä tapauksessa T7-polymeraasi voidaan sijoittaa tiukasti säädellyn hiivapromoottorin säätelyn alaisuuteen.
• · ·** · Faagin polymeraasin induktio sellaisissa hiivasoluissa, • · · ’. *: joissa on hemoglobiinigeenit T7-promoottorin säätelyn • · · *...· alaisuudessa, sallii geenien transkription tällä erittäin « · · 25 tehokkaalla faagin polymeraasilla.
*: Koska useimmat yllä kuvatuista hiivan säätelysek- vensseistä toimivat kohteina proteiineille, jotka ovat • I f transkription positiivisia säätelijöitä on ajateltavissa, että nämä proteiinit voivat rajoittaa transkriptiota sel- m·*·' 30 laisissa tapauksissa, joissa kohdesekvenssi on läsnä mone- *1* na kopiona. Sellainen tapaus voi sattua sellaisten vekto- • · : ’·· reiden, kuten pCIB, pClT, pCIU tai pCln kohdalla, joita voi olla yli 200 kopiota per solu. Positiivisen säätelijän : .·. (esim. GAL4) yliekspressio voi johtaa tehostuneeseen eks- • · · 35 pressioon. On mahdollista rakentaa kanta, jossa GAL4-geeni 48 107938 on muutettu niin, että siitä on poistettu sen promoottori ja promoottori on korvattu GAL7- tai GALlO-promoottorilla, jotka molemmat transkriptoidaan tehokkaammin kuin GAL4-promoottori. Tässä tapauksessa positiivinen transkription 5 aktivaattoriproteiini GAL4 voi ekspressoitua kohonneina tasoina sinä aikana, kun hemoglobiinin ekspressio indusoidaan.
Korkeampien eukaryoottien ribosomin sitoutumiskohtien konsensussekvenssin on määritellyt Kozack (Cell, 44: 10 283 - 292 (1986)) olevan G^CCAUGG. Poikkeamilla tästä sek venssistä, erikoisesti -3 kohdassa (A tai G), on suuri vaikutus tietyn mRNA:n translaatioon. Käytännössä kaikki korkeasti ekspressoidut nisäkäsgeenit käyttävät tätä sekvenssiä. Korkeasti ekspressoidut hiivan mRNA:t toisaalta 15 eroavat tästä sekvenssistä ja käyttävät sen sijaan sekvenssiä AAAAAUGU [Cigan ja Donahue, Gene, 5_9: 1 - 18 (1987)]. Ribosomin sitoutumiskohta, jota me käytämme alfa-ja beeta-globiinien ekspressoimiseksi, vastaa korkeampien eukaryoottien ribosomin sitoutumiskohtaa. Tämän keksinnön 20 aiheena on systemaattisesti muuttaa tätä RBS:ää niiden , muutosten vaikutusten testaamiseksi, jotka muutokset teke- • · ··· · vät siitä enemmän hiivan RBS:ää muistuttavan. On kuitenkin » · · '· '· korostettava, että muutosten kohdilla -2, -1 ja +3 yleensä « · · ‘h..’ on havaittu vaikuttavan ainoastaan vähän translaatiotehok- 25 kuuteen hiivassa ja nisäkkäissä.
«M
^ Geenien solunsisäiseen ekspressioon S. cerevisiae -kannassa vaikuttaa pääasiassa geeniin liittyneen promoottorin vahvuus, plasmidin kopioluku (plasmidissa oleville geeneille), transkription terminaattori, isäntäkanta ja .··*. 30 geenin kodonikäyttö. Kun halutaan geeni tuotteen erittyvän, ·’ erityssignaalisekvenssit tulevat merkittäviksi. On huomau- ·“ ** tettava, että monikopioisilla plasmideilla eritystehokkuus « · · voi alentua vahvoilla promoottorirakenteilla. Ernst, DNA, : !*. 5: 483 - 491 (1986).
• « # • · · · • · · • · • 4 «»· 49 107938
Useita erilaisia kromosomin ulkopuolisia replik-oi-tuvia vektoreita (plasmideja) on saatavissa hiivasolujen transformoimiseksi. Käyttökelpoisimmat monikopioiset kromosomin ulkopuoliset hiivavektorit ovat sukkulavektoreita, 5 jotka käyttävät täyspitkää 2 μ plasmidia, joka on yhdistetty E. coli -bakteerin plasmidiin. Näissä vektoreissa on geenit, jotka sallivat plasmidin ylläpidon sopivissa hii-vamutanteissa ja antibioottiresistenssimerkkigeenit, jotka sallivat selektion E. coli -bakteerissa. Täyspitkän 2 μ 10 plasmidin käyttö, verrattuna vektoreihin, jotka sisältävät ainoastaan osan 2 μ plasmidin sekvenssistä, johtaa yleensä paljon korkeampaan plasmidin stabiilisuuteen erikoisesti sellaisissa hiivakannoissa, jotka on parannettu endogeeni-sestä 2 μ plasmidista. Tässä kuvattu pC-vektorien ryhmä on 15 tämän tyyppisiä vektoreita.
Kannat voidaan rakentaa myös sillä tavalla, että GAL-GAP-hemoglobiiniekspressiokasetit integroidaan kromosomeihin käyttäen hiivan integroituvia vektoreita. Vaikka hemoglobiinigeenien kopioluku onkin matalampi kuin plas-20 midivektorien tapauksessa, ne ovat melko stabiileja eivätkä ehkä tarvitse ollenkaan selektiota pysyäkseen isäntäni ' solussa. Hiivan integroituvat vektorit sisältävät vektorin • ·
Yip5 (Struhl et ai., PNAS, 76: 1035 - 39, 1989), Yipl "’· (Id.) ja pGT6 (Tchumper ja Carbon, Gene, 10: 157 - 166, : ’: 25 1980). Tietoja varten näistä ja muista hiivavektoreista :1: katso Pouwels et ai., Cloning Vector, I - VI, et seq.
ι·* .*··. (Elsevier, 1985).
Μ·
Alfa- ja beeta-globiinigeenit voidaan viedä sisään erillisissä plasmideissa tai molemmat samassa plasmidissa.
• · ... 30 Yhden plasmidin systeemin etu kahden plasmidin systeemiin verrattuna on teoreettinen. Ajatellaan yleisesti, että on • · • *♦· olemassa yläraja plasmidien kokonaiskopiolukumäärälle per :1: solu. Jos se on esimerkiksi 1 000, kahden plasmidin sys- . teemissä voisi olla ainoastaan 500 kopiota alfaketjun • » · 35 plasmidia ja 500 kopiota beetaketjun plasmidia. Yhdessä • « • · • · « 50 107938 plasmidissa, jota on 1 000 kopiota per solu, on 1 000 kopiota sekä alfa- että beetaketjun geeniä. Kopioiden lukumäärä voi olla kuitenkin vailla merkitystä, jos muut tekijät ovat rajoittavia. Tosiasiassa monet ryhmät pitävät pa-5 rempana käyttää kantoja, jotka sisältävät geenit integroituina kromosomin eri lokuksiin. Sellaiset kannat ylläpitävät erittäin stabiilisti vieraan geenin eivätkä tarvitse erikoisalustaa plasmidiselektion ylläpitämiseksi.
Korkeasti ekspressoiduilla hiivageeneillä on hyvin 10 korkea kodonikäyttö. Geeneillä, jotka koodittavat esimerkiksi glysera. iehydi-3-fosfaattidehydrogenaasia ja ADH-I-entsyymiä, käyttävät 90-%risesti 25 kodonin ryhmää. Erittäin korkeasti ekspressoiduilla hiivageeneillä (> 1 % ko-konais-mRNA:sta) on hiivan kodonikäyttöindeksit, jotka 15 ovat > 0,90. Kohtalaisesti ekspressoiduilla geeneillä (0,1 - 0,05 % kokonais-mRNA:sta) käyttöindeksit ovat 0,6 -0,8 ja geeneillä, joita ekspressoidaan alhaisilla tasoilla (> 0,05 % solun kokonaisproteiinista) on kodonikäyttöindeksit 0,10 - 0,50 [Bennetzen ja Hall, J. Biol. Chem. , 20 257: 3026 - 3031 (1982)]. Ihmisen alfa-globiini cDNArn ko- donien laskettu arvo on 0,23. Samanlainen arvo voidaan h: : laskea beeta-globiinin cDNArlle. Koska on olemassa erit- • * :.*·· täin korkea korrelaatio tavallisimmin käytettyjen kodonien • * · välillä, on mahdollista, että hemoglobiinin ekspressiota ; 25 ihmisen cDNArsta hiivassa voi rajoittaa sopivien tRNA-molekyylien saatavuus. Jos näin on, geenin täydellinen • · · .***. synteesi käyttäen kaikista suosituimpia hiivan kodoneita voi parantaa ekspressiotasoja. On melko mahdollista, että suurin negatiivinen vaikutus epäsuotuisan kodonin käytöstä ... 30 tapahtuu silloin, kun jos käytetyssä cDNArssa on paljon *;* sellaisia kodoneita, joille on ainoastaan vähän vastaavia • · • *·· tRNA-molekyyle j ä. Sellaisessa tapauksessa hemoglobiinin : *: korkean tason ekspressio voi kuluttaa täysin loppuun sei- • · · . \ laisten tRNA-molekyylien varaston alentaen ei ainoastaan • · · *11/ 35 hemoglobiinin translaatiota vaan myös hiivaproteiinien, * » • « « 51 107938 jotka sattuvat käyttämään sitä kodonia, translaatiota. Alfa-globiinin ihmisen cDNA:n tapauksessa tavallisimmin käytetty leusiinikodoni on CTG (14 kappaletta 21 kappaleesta) , tätä kodonia ei koskaan käytetä korkeasti eks-5 pressoiduissa hiivageeneissä (Guthrie ja Abelson, The
Molecular Biology of the Yeast Saccharomvces. toim. Stratern, Jones ja Broach, 1982, Cold Spring Harbor, NY). Matala kodonikäyttöindeksi ja harvinaisten hiivakodonien läsnäolo globiinin cDNA:ssa on ollut meille riittävä kan-10 nustin niin, että syntetisoimme modifioidun muodon alfa-ja beeta-globiinigeeneistä käyttäen hiivan suosimia kodo-neita.
"Di-alfa"- ja "di-beeta"-hemoglobiinit
Esillä olevassa hakemuksessa esitetään lisäksi 15 joissain suoritustavoissa yhdistelmät, joissa (a) yksi molekyyli di-alfa-globiinin kaltaista polypeptidiä muodostaa kahden molekyylin kanssa beeta-globiinin kaltaista polypeptidiä "di-alfa"-hemoglobiinin kaltaisen proteiinin; (b) kaksi molekyyliä alfa-globiinin kaltaista polypeptidiä 20 muodostaa yhden molekyylin kanssa di-beeta-globiinin kaltaista polypeptidiä "di-beeta"-hemoglobiinin kaltaisen proteiinin tai (c) yksi molekyyli di-alfa-globiinin kai- * · · « ,·. : täistä polypeptidiä muodostaa yhden molekyylin kanssa di- ... beeta-globiinin kaltaista polypeptidiä "di-alfa/di-beeta"- 25 hemoglobiinin kaltaisen proteiinin.
• · l” On lisäksi huomattava, että delta-, gamma- ja epsi- lonketjuilla on huomattavaa homologiaa beetaketjun kanssa • · ja että zeetaketjulla on huomattavaa homologiaa alfaketjun kanssa. Sen vuoksi di-delta-, di-gamma-, di-epsilon- ja 30 di-zeetapolypeptidejä voidaan käyttää muiden kuin Hgb Al:n ·***; tyyppisten uusien hemoglobiinien valmistukseen.
Di-alfa-linkkeri (jos sellaista käytetään) sisältää • ·« suositeltavasta 1-3 aminohappoa, jotka voivat olla samo- *·’/’ ja tai erilaisia. Mono-Gly-linkkeri on erikoisen suositel- • · • t « • · · • · · · • · · • · • · • « · 52 107938 tava. Sellaisen linkkerin suunnittelussa on tärkeää tietää se, että on toivottavaa käyttää yhtä tai useampaa sellaista aminohappoa, joka joustavasti liittää yhteen kaksi alayksikköä muuttaen ne yhden di-alfa-globiinipolypeptidin 5 domeeneiksi.
"Di-beeta"-mutanttien valmistus kuvataan myös. Yhden beeta-alayksikön N-pään ja toisen beeta-alayksikön C-pään välimatka on 18,4 Ä deoksimuodossa ja 5,2 Ä oksimuo-dossa. Di-beeta-linkkeri sisältää suositeltavasti 4-9 10 aminohappoa, jotka voivat olla samoja tai erilaisia.
Linkkerin pitäisi olla sellainen, joka epätodennä-köisesti muodostaa sekundaarirakenteen, kuten alfa-helik-sin tai beetalevyn. Tietyillä aminohapoilla on suurempi taipumus osallistua sellaisiin rakenteisiin. Katso Chou ja 15 Fasman, Biochemistry, 13: 222 - 245 (1974), joka on lii tetty tähän viitteeksi. Aminohapot on alla asetettu alenevan osallistumisen mukaiseen järjestykseen. Suositeltavat linkkerin aminohapot on lihavoitu. Glysiini on sopivin aminohappo tähän tarkoitukseen. Suositeltavimmat di-alfa-20 linkkerit ovat Gly tai Gly-Gly.
.*. Alf a-heliksin Beeta- levyn • · · « ·. : muodostan at muodostan at • · · * · • · · 25 Glu (1; 53) Met (1,67)
Ala (1,45) Vai (1,65) ::: Leu g, 34) Ha Ile (1,60) H5
His (1,24) Cys (1,30)
Met (1,20) Tyr (1,29) ’···* Gin (1,17) Phe (1,28)
Vai (1,14) Gin (1,23) o n Trp (1,14) . Leu (1,22) * ’ Phe (1.12) ha Thr (1,20)
Lys (1,07) Trp (1,191 h β *:* Ile (1,00) Ala (0,971 16
Asp (0,98) Arg (0,90)
Thr (0,82) Glv (0,81) : Arg (0,79) Asp (0,80) i/3
Ser (0,79) Lys (0,74) : Cvs f 0,77) ia Ser (0,72)
Asn (0,73) His (0,71)
Tvr (0,61) ba Asn (0,65)
Pro (0,59) Pro ro.62^ bQ
Glv (0.53) Ba Glu (0,26) Ββ 53 107938 (Kirjainsymbolit ovat Haifa, vahva alfa-heliksin muodostaja; halfa, alfa-heliksin muodostaja; Ialfa, heikko alfa-heliksin muodostaja; ialfa, yhdentekevä alfa-heliksin muodostuksessa; balfa, alfa-heliksin murtaja ja Balfa, 5 vahva alfa-heliksin murtaja. Beeta-symbolit ovat samanlaisia. Trp on bbeeta, jos se sijaitsee lähellä beetalevy-alueen C-päätä).
Polypeptidiketjun alfa-heliksi sisältää keskimäärin 3,6 jäännöstä per kierre. Pallomaisissa proteiineissa kes-10 kimääräinen pituus on noin 17 A vastaten 11 jäännöstä tai 3 heliksin kierrettä. Alfa- ja beeta-globiineissa heliksit vaihtelevat pituudeltaan 7 aminohaposta 21 aminohappoon (A.A.). Beetalevy sisältää 2,3 jäännöstä per kierre; keskimääräinen pituus on noin 20 A tai 6 jäännöstä.
15 Chou ja Fasman määrittävät alfa-heliksin ytimen heksapeptidiksi, joka sisältää neljä heliksiä muodostavaa jäännöstä eikä enempää kuin yhden heliksin murtajan ja beetalevyn ytimen pentapeptidiksi, joka sisältää kolme beetalevyn muodostavaa jäännöstä eikä enempää kuin yhden 20 levynmurtajan.
Aminohapposekvenssi di-alfa-linkkerin läheisyydessä : on seuraava; :1.! Jäännös numero 138 139 140 141 1 2 3 4 AA Ser Lys Tyr Arg-(XXX)n Vai Leu Ser Pro 25 Heliksin Not H21 HC1 HC2 HC3 ΝΑΙ NA2 AI A2 .1··. Heliksin pot. 079 107 061 079 114 134 079 059 .···. Levyn pot. 072 074 129 090 165 122 072 062 (Huomaa: heliksin- ja levynmuodostuspotentiaalit on . kerrottu sadalla typografisista syistä).
* · · · · 30 Di-alfa-linkkeri on suositeltavasti ainoastaan 1 - • · · • « ···1 3 aminohapon pituinen. Näin ollen se voi muodostaa alfa- heliksin ainoastaan yhdessä linkkerin "päiden" kanssa. Yhden tai kahden jäännöksen pituinen linkkeri, vaikka • · · . 1, koostuisi vahvat sekundaarirakennetaipumukset sisältävistä • · · 35 aminohapoista, ottaa epätodennäköisestä alfa-heliksi- tai • · • «
• M
54 107938 beetalevyrakenteen ottaen huomioon esimerkiksi Arg 141:n ja Ser 3:n hajottavan vaikutuksen. Jos linkkeri on kolmen jäännöksen pituinen, on suositeltavaa, ettei useampi kuin yksi jäännös ole vahva alfa-heliksin muodostaja ellei 5 linkkeri sisällä myös vahvaa alfa-heliksin murtajaa.
Aminohapposekvenssi di-beeta-linkkerin läheisyydessä voi muodostaa ankarampia rajoituksia.
143 144 145 146 1234
His Lys Tyr His-(XXX) Vai His Leu Thr
10 H21 HC1 HC2 HC3 NAI NA2 NA3 AI
124 107 061 124 114 124 134 082 071 074 129 071 165 071 122 120
Di-beeta-linkkeri on pitempi (suositeltavasti 4 -9 aminohappoa) ja siksi herkempi sekundaarirakenteen muo-15 dostumiselle. On suositeltavaa, että Väli:n vieressä oleva aminohappo on alfa-heliksin murtaja ottaen huomioon ryhmän Val-His-Leu taipumuksen alfa-heliksiin. Yleisemmin, on toivottavaa, että linkkeri ei sisällä (tai ei yhteistyössä proksimaalisesti liitettyjen aminohappojen kanssa muodos-20 ta) alfa-heliksin tai beetalevyn ydintä.
Aminohappoja, joilla on suuri taipumus alfa-helik-; sin muodostukseen, voidaan käyttää linkkerissä, jos niiden yhteydessä on "heliksin murtaja" aminohappoja. Samalla ;***· tavalla beetalevyn muodostus voidaan estää "levyä hajot- • · · 25 tavilla" aminohapoilla.
• · · .···. Sekundaarirakenteen ennustuksella käyttäen Chou'n « · #···# ja Fasraan' in lähestymistapaa on tietysti rajoituksensa ja • · lopullinen testi linkkerin hyväksyttävyydestä on se, onko di-alfa- tai di-beeta-hemoglobiinilla haluttu affiniteetti 30 hapelle vai ei. Erikoisesti polyalaniinilinkkeri, huoli- • · matta sen oletetusta taipumuksesta alfa-heliksin muodos- tukseen, voi hyvinkin olla arvokas, koska alaniiniryhmä on .**·. tiivis ja sen vuoksi linkkeri olisi melko joustava ellei • · · • sekundaarirakennetta muodostu.
• · * · · • « · • # · · 1 · « • · • « • · · 55 107938
Erikoisen suositeltavassa suoritustavassa di-alfa-ja di-beeta-globiinigeenit yhdistetään yhdeksi polykis-troniseksi operoniksi. Polykistronisen operonin käyttö ei kuitenkaan ole tarpeellista esillä olevan keksinnön suo-5 rittamiseksi ja alfa- (tai di-alfa) tai beeta- (tai di-beeta) globiinigeenit voidaan ekspressoida eri promoottoreista, jotka voivat olla samoja tai erilaisia.
Samalla, kun esillä olevan keksinnön suositeltava "geneettisesti yhteenliitetty hemoglobiini" on sellainen, 10 joka sisältää di-alfa- ja/tai di-beeta-globiinin, muutkin globiiniketjut voidaan liittää geneettisesti yhteen ja käyttää niitä muiden hemoglobiinilajien kuin Hgb AI:n (al-fa2beeta2) tuotossa.
Lisätyt patenttivaatimukset lisätään tähän viittee-15 nä suositeltavien suoritustapojen luettelosta. Kaikki lainatut viitteet sisällytetään viitteinä siinä määrin, joka on tarpeellista tässä tämän jälkeen vaaditun keksinnön suorittamiseksi.
Tässä patenttihakemuksessa kuvatuilla tavoilla 20 olemme tehneet seuraavat saavutukset, jotka ovat: (1) Met-FX-alfa-globiinin ekspressio E. coli -bak- « • 'I l teerissä kaksikistronisesta operonista, joka sisältää :*·.· syöttökistronin ja Met-FX-alfa-globiinigeenin, jotka mo- • · **‘; lemmat transkriptoidaan Tac-promoottorista. (Esimerkki 2) • · · .*··. 25 (2) Met-FX-beeta-globiinigeenin ekspressio E. coli mmm .···. -bakteerissa samoilla tavoilla. (Esimerkki 2) • · (3) Met-FX-alfa-globiinin ja Met-FX-beeta-globiinin • « yhteisekspressio E. coli -bakteerissa tetrakistronisesta operonista, joka sisältää syöttökistronin, FX-alfa-globii- • · · · * 30 nigeenin, kistronien välisen sekvenssin, toisen syöttökis- • · · • · ...* tronin ja FX-beeta-globiinigeenin, joita kaikkia säädel- ϊ*·># lään yhdestä Tac-promoottorista. Alfa- ja beeta-globiinit .·*·. koottiin solun sisällä toimivaksi FX-hemoglobiiniksi. FX- • · hemoglobiini muutettiin entsymaattisesti Hgbrksi. (Esi- ··* · 35 merkki 3) • » « • · • ♦ ·· · 56 107938 (4) FX-hemoglobiinimutanttien yhteisekspressio kuten yllä olevassa osassa (3), joissa mutanteissa beeta-globiinialayksiköissä oli Beth Israel-, Cheverly-, Provi-dence/MSR-, Kansas- tai beeta67 Vai -> Ile -mutaatiot. (Esi- 5 merkki 4) (5) Met-alfa-globiinin ja Met-beeta-globiinin yhteisekspressio kuten yllä olevassa osassa (3) ja solun sisällä tapahtuva kokoaminen Met-Hgb:ksi (a.k.a. Des-FX-Hgb). (Esimerkki 5) 10 (6) Des-Val-alfa-globiinin ja Des-Val-beeta-globii- nin yhteisekspressio, kuten yllä olevassa osassa (3). (Esimerkki 6) (7) Yhteisekspressio, kuten yllä olevassa osassa (6), mutta käyttäen Des-Val-beeta-globiinigeeniä, joka 15 edeltää Des-Val-alfa-globiinigeeniä operonissa. (Esimerkki 6) (8) (Des-Val)-alfa-(Gly-Gly)-alfa-globiinin ja bee-ta-globiinin yhteisekspressio, kuten yllä olevassa osassa (3), ja kokoaminen solun sisässä di-alfa-hemoglobiiniksi.
20 (Esimerkki 8) (9) (Des-Val-alfa-(Gly-Gly)-alfa-globiinin ja bee- j ta-globiinimutantin (Nagai, Arg-Nagai tai Kansas) yhteis- • · ? ekspressio, kuten yllä olevassa osassa (8), ja kokoaminen :1; solun sisässä di-alfa-mutanttihemoglobiiniksi. (Esimerkki .·*·. 25 9 ) « · · .···. (10) Des-Val-alf a-globiinin ja Presbyterian-mutaa- • · · .···, tion sisältävän Des-Val-beeta-globiinin yhteisekspressio, • · kuten yllä olevassa osassa (3), ja kokoaminen solun sisäs-. sä Des-Val-mutanttihemoglobiiniksi. (Esimerkki 11) 30 (11) (Des-Val)-alfa-(Gly-Gly)-alfa-globiinin ja • ♦ ···* Presbyterian-mutaation sisältävän beeta-globiinin yhteis- ♦*·.. ekspressio, kuten yllä olevassa osassa (8). (Esimerkki 11) ·1· (12) Di-alf a-globiinin ja di-beeta-globiinin eks- • ♦ ♦ . *. pressio eri promoottoreista samasta plasmidista. (Esimerk- : 35 ki 12) • · · • · • i • · » 57 107938 (13) Suunniteltu hypoteettinen menetelmä di-alfa-globiinin ja kahden beeta-globiinikopion yhteisekspressoi-miseksi samasta operonista. (Esimerkki 13) (14) Suunniteltu hypoteettinen menetelmä di-beeta-5 hemoglobiinin yhteisekspressoimiseksi. (Esimerkki 14) (15) Suunniteltu hypoteettinen menetelmä eri promoottorien säätelyn alaisena samassa plasmidissa olevien alfa-globiinin ja beeta-globiinin yhteisekspressoimiseksi. (Es imerkki 16) 10 (16) Suunniteltu hypoteettinen menetelmä eri pro moottorien säätelyn alaisena eri plasmideissa olevien alfa-globiinin ja beeta-globiinin yhteisekspressoimiseksi. (Esimerkki 17) (17) Alfa- ja beeta-globiinin yhteisekspressio S. 15 cerevisiae -kannassa. (Esimerkki 19) (18) Di-alfa- ja beeta-globiinin yhteisekspressio S. cerevisiae -kannassa. (Esimerkki 23) (19) Lambda PL -promoottorin säätelyn alaisena olevien Des-Val-alfa-globiinin ja Des-Val-beeta-globiinin 20 rakentaminen E. coli -bakteerissa.
(20) Lambda PL -promoottorin säätelyn alaisena ole-vien di-alfa-globiinin ja Des-Val-beeta-globiinin yhteis- « · 1 « .·. : ekspressio E. coli -bakteerissa.
* e !··. (21) Alfa- ja beeta-globiinin yhteisekspressio eri il! 25 plasmideista diploideissa S. cerevisiae -kannoissa.
« (22) Di-alfa-globiinin ja Presbyterian-mutaation • · ’···1 sisältävän beeta-globiinin yhteisekspressio S. cerevisiae • · '··2 3 -kannassa.
(23) Vektorien valmistus -Gly- tai -Pro-linkkerit #i2: 30 sisältävien di-alfa-globiinien ekspressoimiseksi.
’) t! (24) Eri kantojen ja induktiolämpötilojen arviointi ./ di-alfa-hemoglobiinien ekspressoimiseksi E. coli -baktee- • · 1 *... rissa.
• · • · ··· · • · · • ♦ · • · Φ · ··♦ ♦ · 2 • · 3 58 107938 (25) Alfa- ja beeta-mutanttiglobiinin yhteiseks-pressio S. cerevisiae -kannassa ja kokoaminen muodostamaan matalan affiniteetin sisältävät hemoglobiinimutantit.
Odottamaton ja yllättävä muutos hemoglobiinin ha-5 pensitomisominaisuuksissa havaittiin korvattaessa N-pään väliini metioniinilla. Kuten esimerkissä 11 on kuvattu, verestä puhdistetun hemoglobiini A0:n P50-arvo on 4,03 ja N = 2,7. E. coli -bakteerissa tuotetun Des-FX-hemoglobii-nin, joka on samanlainen hemoglobiini kuin A0, paitsi että 10 siinä on alfa- ja beetaketjujen N-päissä lisättynä metio-niini, P50- ja N-arvot ovat oleellisesti samat. (Esimerkki 7.) Näin ollen metioniinin lisäyksellä ilman viereisen väliini jäännöksen muutosta on vähän tai ei mitään vaikutusta hapensitomiseen. Toisaalta, E. coli -bakteerissa tuotetul-15 le des-Val-hemoglobiinille, joka on hemoglobiini, jossa on normaali N-pään väliini kussakin ketjussa korvattu metioniinilla, havaittiin kaksi kertaa korkeampi P50-arvo 7,04. Yhteisvaikutus, mitattuna N:llä, oli kuitenkin tälle molekyylille sama kuin muille. Samanlainen vertailu tehtiin 20 kahdelle hemoglobiinille, jotka sisälsivät kumpikin yh-teenliitetyn alfaketjun ja kummankin sisältäessä Pres- # ·*. byterian-mutaation, joista toinen tuotettiin E. coli -bak- ·«· · i*. · teerissä (esimerkki 11) ia toinen hiivassa. E. coli -bak- r ·· 4···# teerissä tuotettu hemoglobiini rakennettiin Des-Val-alfa- • · ΙΣΙ 25 ketjulla, se tarkoittaa, että N-päässä oli normaali valii-• · • · **· ni korvattu metioniinilla. Hapensitoutuminen karakterisoi- • · ···* tiin arvoilla P50 = 33 ja N = 2,4. (Esimerkki 11.) Vastaava • · *···* hiivan koodittava alue alkaa normaalin valiinikodonin edessä olevasta lisämetioniinikodonista. Koska tämä aloi- *ί**ί 30 tusmetioniini poistetaan translaation jälkeen in vivo, puhdistetulla hemoglobiinilla on normaali N-pään väliini.
··] Tälle molekyylille P50 = 23 - 25 ja N = 2,5. Näin ollen • ♦· *... kahdessa melko erilaisessa tapauksessa N-pään valiinin • · *”* korvaaminen N-pään metioniinilla kohotti P50-arvoa. Fysio- • · ·.· j 35 logisissa olosuhteissa odotetaan, että E. coli -bakteeris- ··· ♦ · ♦ · ··· 59 107938 sa tuotettu yhteenliitetty Presbyterian-hemoglobiini kuljettaa 20 - 30 % enemmän happea kuin hiivassa tuotettu samanlainen hemoglobiini, jolla on muutettu N-pää.
Seuraavissa esimerkeissä on viitattu hyvin suureen 5 määrään erilaisia plasmideja. Näiden plasmidien keskeisten suhteiden esille tuomiseksi on laadittu taulukko vektoreista (katso taulukko 100).
Esimerkki 1 FX-alfa-globiinin (pDLII-62m) ja beeta-globiinin 10 (pDLIl-10a) ekspressiovektoreiden rakentaminen
Materiaalit ja menetelmät
Jollei muuta ole ilmoitettu, kaikki elektroeluu- tiot, fenolikloroformiuutot, etanolisaostukset (EtOH), alkali-SDS-plasmidipuhdistukset, agaroosielektroforeesit 15 ja DNA:den käsittelyt suoritettiin oleellisesti, kuten on kuvattu teoksessa Maniatis et ai. ("Molecular Cloning",
Cold Spring Harbor, New York, 1982).
Seuraavia lyhenteitä ja määritelmiä käytetään: ety- leenidiamiinitetraetikkahappo(EDTA); natriumdodekyylisul- 20 faatti (SDS); polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE); : dimetyylisul f oksidi (DMSO); ditiotreitoli (DTT); isopro- • · ;.1·· pyyli-beeta-D-tiogalaktopyranosidi (IPTG); 2 x YT-alusta *: (16 g Bactotryptonia, 10 g Bacto-hiivauutetta, 5 g NaCl:ia per litra vettä); SDS-PAGE-latauspuskuri (0,125 M Tris- • » .2. 25 HC1, pH 6,8, 20 % v/v glyseroli, 2 % SDS, 2 % 2-merkapto-··♦ .·1·. etanoli, 0,01 % bromifenolisini); fosfaatilla puskuroitu • ♦ • · · TB-alusta (24 g hiivauutetta, 12 g tryptonia, 4 ml glyse- rolia, 17 ml 1 M KH2P04:ää, 72 ml 1 M K2HP04:ää per litra
... vettä); Tris-EDTA-puskuri (TE: 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM
• 1 ·3’ 30 EDTA); Tris-boraatti-EDTA-puskuri (TBE: 0,089 M Tris, : 0,089 M boorihappo, 0,002 M EDTA); Tris-asetaatti-EDTA-
:2; puskuri (TAE: 0,04 M Tris, 0,04 M etikkahappo, 0,001 M
• · · EDTA).
• · · • · ♦ • · · ♦ · · • ♦ 2 • · · 3 • · 60 107938
Proteiinielektroforeesi suoritettiin menetelmällä, jonka on kuvannut Laemmli, UK (Nature, 1970, 227, 680 -685), 15 % SDS-polyakryyliamidigeeleissä.
E. coli JM109 -kannan solut tehtiin kompetenteiksi 5 seuraavasti: 200 ml 2 x YT-alustaa ympättiin 2 ml:11a yli yön kasvanutta E. coli JM109 -kantaa. Sitten 200 ml viljelmää inkuboitiin ravistellen 37 °C:ssa yksi tunti. Solut kerättiin sentrifugoimalla 6 000 kierrosta minuutissa 4 minuutin ajan kääntyväputkisessa Beckman JS13.1 -rootto-10 rissa (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA). Solut suspendoitiin uudelleen yhteensä 50 ml:aan puskuria, joka oli 45 mM MnCl2, 60 mM CaCl2, 40 mM KOAc, pH 6,2, 15 % sakkaroosi (w/v), 1,3 % RbCl (w/v) ja 7,5 % (v/v) glyseroli. Kun oli sentrifugoitu, kuten yllä, solut suspendoitiin uu-15 delleen 20 ml:aan samaa puskuria ja inkuboitiin 0 °C:ssa 30 minuuttia. Solut jaettiin yhden millilitran eriin ja säilytettiin -80 °C:ssa, kunnes käytettiin.
Jollei muuta ole ilmoitettu, kaikki restriktioent-syymidigestiot suoritettiin valmistajan ehdottamissa olo-20 suhteissa. DNA konsentraatiot määritettiin Beers'in lain j mukaan käyttäen 260 nm mittausabsorbanssia (A260) käyttäen : ·.: vettä viitestandardina. Synteettisille oligonukleotideille :***: käytettiin seuraavia ekstinktioarvoja: E260 = 0,05 ml/pg/cm .·". ja kaksijuosteiselle DNA:lie E260 = 0,02 ml/pg/cm.
.···. 25 Globiinigeenin synteesi
• M
Kukin globiinigeeni rakennettiin 14 erillisestä • · oligonukleotidista, jotka vaihtelivat pituudeltaan 50 - 85 emäspariin. FX-alfa-globiinigeeni syntetisoitiin oligonuk-leotideista SJH I-33a-f, SJH I-34a-f ja SJH 35a,b; FX-bee- • «
·.·* 30 ta-globiinigeeni syntetisoitiin oligonukleotideista SJH
·*♦.. I-36a-f, SJH Ia-f ja SJH I-38a,b. Kunkin globiinigeenin edessä on lyhyt syöttögeeni, kuten aiemmin on kuvattu. Oligonukleotidit syntetisoitiin Biosearch 8600 -laitteella • · · : käyttäen beeta-syaanietyylifosforiamidiittikemiaa 1 000 Ä 35 CPG-pylväissä (0,2 mmoolia) (Beaucage, S.L. ja Caruthers, 61 107938 M.H., Tet. Lett., 1981, 22, 1859 - 1862). Näiden oligonuk-leotidien sekvenssit on annettu kuviossa 4.
Jollei muuta ole ilmoitettu, oligonukleotidit katkaistiin pylväistä irti käyttäen seuraavaa menetelmää: 5 noin 0,5 ml tuoretta, konsentroitua NH40H:ta vedettiin pylvääseen 1 ml ruiskulla. NH40H:n annettiin reagoida 20 minuuttia, sitten puserrettiin ulos lasipulloon (tilavuudeltaan noin 4 ml). Tämä menetelmä toistettiin 2 kertaa, pullo täytettiin yli 75 % tilavuudesta NH40H:lla ja kuumennet-10 tiin 55 °C:ssa yli yön. Näytteet lyofilisoitiin, suspen-doitiin uudelleen 0,1 ml:aan H20:ta ja konsentraatio arvioitiin mittaamalla A250.
200 pg kutakin oligonukleotidia puhdistettiin urea-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Tämän suorittami-15 seksi oligonukleotidiin lisättiin sama tilavuus 2 x la-tauspuskuria (90 % formamidi (v/v), 0,5 x TBE, 0,05 % (w/v) bromifenolisini, 0,05 % (w/v) ksyleenisyanoli). Näytettä kuumennettiin 95 °C:ssa 10 minuuttia ja ladattiin 10-%:iseen akryyliamidigeeliin, joka sisälsi 7 M ureaa ja 20 1 x TBE-puskuria. Elektroforeesia ajettiin 800 voltilla ;.· · noin 2 tuntia. Täyspitkää oligonukleotidia tarkasteltiin * ·
silmin ultraviolettivalossa. Se alue geelistä leikattiin sitten irti ja inkuboitiin 3 ml puskuria, joka oli 100 mM
* · · *'*. Tris, pH 7,8, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 60 °C:ssa yli yön.
.*·*. 25 Oligonukleotidiliuos lisäpuhdistettiin käänteisfaa- .···. sikromatograf iällä seuraavasti: C18 Sep-Pak -patruuna • » (Waters Associates) pestiin 10 ml:11a 100-%:ista metano- . lia, jonka jälkeen se pestiin 10 ml:11a H20:ta. Oligonuk- [ leotidiliuos laitettiin pylvääseen, pestiin 20 ml H20:ta ja • · ...* 30 elucitiin 3 x 1 ml määrillä liuosta, joka oli 50 mM tri-·*·.. etyyliammoniumasetaatti, pH 7,3/metanoli (1:1). Puhdistet- m .***. tu oligonukleotidi lyofilisoitiin, pestiin 100-%:isella * ♦ · etanolilla, kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 0,1 • · · ··" * ml:aan H20:ta. Konsentraatio määritettiin mittaamalla A260.
• · • · • · · 62 107938
Synteettinen FX-beetageenin sekvenssi (sisällytetty kuvioon 5) rakennettiin seuraavasti: 100 pmoolia seuraavia oligonukleotideja kinasoitiin 3 erillisessä reaktiossa. Reaktio 1 sisälsi oligonukleotidit SJH I-36b, c, d, e ja 5 f. Reaktio 2 sisälsi oligonukleotidit SJH I-37a, b, c ja e. Reaktio 3 sisälsi oligonukleotidit SJH I-37d, f ja SJH I-38a. Kun sopivat oligonukleotidit oli yhdistetty, liuokset lyofilisoitiin kuiviksi ja suspendoitiin uudelleen 16 yl:aan H20:ta. Sitten lisättiin 2 μΐ 10 x kinaasipuskuria 10 (0,5 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M MgCl2) , 0,5 μΐ 100 mM DTT: ia ja 1 μΐ 1,0 mM ATPrtä. Reaktio aloitettiin lisäämällä 1 μΐ (2 yksikköä) T4 polynukleotidikinaasia (IBI, Inc., New Haven, CT). Kun oli inkuboitu 37 °C:ssa yksi tunti, reaktioita kuumennettiin 95 °C:ssa 10 minuutin ajan kinaasin 15 inaktivoimiseksi. Kolme reaktiota yhdistettiin ja lisättiin 100 pmoolia oligonukleotideja SJH I-36a ja SJH I-38b. Kun oli lisätty 10 μΐ liuosta, joka oli 100 mM Tris, pH 7,8, 100 mM MgCl2, oligonukleotidien sallittiin hybridisoi-tua inkuboimalla 65 °C:ssa 30 minuutin ajan, 37 °C:ssa 30 20 minuutin ajan ja 15 °C:ssa yksi tunti. Hybridisoituneet . oligonukleotidit ligoitiin lisäämällä ATP:tä (lopullinen * · t » konsentraatio 1 mM) ja DTT:tä (lopullinen konsentraatio • · 10 mM) ja 4 μΐ (20 yksikköä) T4 DNA ligaasia (IBI; Inc., • · · .*··. New Haven, CT) ja inkuboimalla 15 °C:ssa yksi tunti. Pie- * « .···, 25 net määrät tästä ligaationseoksesta kloonattiin sitten suoraan vektoriin Ml3mpl9 (katso alla).
• · • · *** FX-alfa-globiinin rakentamista varten oligonukleo tidit puhdistettiin, kinasoitiin, hybridisoitiin ja ligoitiin samalla tavalla. Ennen ligaatiota vektoriin M13mpl9, ...* 30 täysipitkä FX-alfa-globiinigeeni puhdistettiin elektrofo-·\φ reesilla 0,8 % agaroosissa 1 x TAE-puskurissa ja elektro- .*··. eluoitiin dialyysiletkuun käyttäen 0,5 x TBE-puskuria elektroeluutiopuskurina ja menetelmällä, jonka ovat kuvan- • · · h· : neet Maniatis et ai. Eluoitu DNA uutettiin fenolilla, :...: 35 saostettiin Et0H:lla ja suspendoitiin uudelleen 20 plraan 63 107938 TE-puskuria. Pieniä määriä käytettiin vektoriin M13mpl9 kloonausta varten.
Faagivektorit
Kloonausta varten 2-, 5- tai 10-kertainen mooliyli-5 määrä kutakin FX-alfa- ja FX-beeta-globiinigeenisekvenssiä yhdistettiin 200 ng:n kanssa kahdella restriktioentsyymil-lä katkaistua geelipuhdistettua vektoria M13mpl9-RF (New England Biolabs, Inc., Beverly, MD) ja ligoitiin yli yön 15 °C:ssa 50 pl:ssa ligaatiopuskuria (IBI, Inc., New 10 Haven, CT), joka sisälsi 2 yksikköä T4 ligaasia. FX-alfa-globiini kloonattiin vektorin M13mpl9 Xmal/Pstl-kohtiin. FX-beeta-globiini kloonattiin vektorin M13mpl9 Pstl/Hind- III-kohtiin.
E. coli JM109 -kanta transformoitiin Ml3mpl9 ligaa-15 tioseoksella, joka sisälsi FX-alfa- tai FX-beeta-globiini- geenisekvenssit, käyttäen seuraavaa transformaatiomenetel-mää: 9 μΐ DMS0:ta lisättiin 0,25 ml:aan kompetentteja E. coli JM109 -soluja ja soluja inkuboitiin jäissä 10 minuuttia. Lisättiin pienet määrät FX-alfa- tai FX-beeta-globii-20 nin ligaatioreaktioita ja inkuboitiin jäissä 40 minuuttia . : : ja 42 eC:ssa 3 minuuttia. Kuhunkin transformaatioseokseen :*·.· lisättiin 100 μΐ yli yön kasvanutta JM109-viljelmää, jon- « « .***. ka jälkeen lisättiin 60 μΐ liuosta, jossa oli 50 μΐ 2 % ···. (w/v) 5-bromi-4-kloori-3-indolyyligalaktopyranosidia dime- .·«·. 25 tyyliformamidissa ja 10 μΐ 100 mM isopropyylitiogalakto- • · II.” sidia. Lisättiin 2,5 ml sulatettua B-yläagaria (10 g Bac- • · to-tryptonia, 8 g NaCl:ia, 6 g agaria per litra vettä) ja seos kaadettiin B-ala-agaria (10 g Bacto-tryptonia, 8 g NaCl:ia, 12 g agaria per litra vettä) sisältävälle maljal- • · · ...* 30 le. Kun oli inkuboitu yli yön 37 °C:ssa, värittömät pla- ^ kit (se tarkoittaa kloonit, jotka sisälsivät insertoidun ♦ .···. DNA:n) poistettiin maljoilta käyttäen steriilejä siirto- • · • · • pipettejä ja ympättiin 1 ml:aan yli yön kasvanutta JM109- • · · !·*· ’ viljelmää, joka oli laimennettu 1:100 2 x YT-alustaan.
• · « • · • · • · » 64 107938
Bakteriofagiklooneja kasvatettiin 37 °C:ssa 6-8 tuntia ja sentrifugoitiin mikrosentrifugissa 5 minuuttia. Solupelleteistä puhdistettiin plasmidin M13mpl9 RF-muoto käyttäen alkali-SDS-menetelmää ja suspendoitiin uudelleen 5 20 μΐ:aan TE-puskuria, joka sisälsi 20 pg/ml DNaasi-ent- syymistä vapaata RNaasi-entsyymiä (Sigma, St. Louis, MO). Pienet määrät (1 - 3 μΐ) RF-valmisteista digestoitiin 10 -20 yksiköllä kutakin sopivaa restriktioentsyymiä (katso yllä) ja analysoitiin 0,8 % agaroosielektroforeesigeeleis-10 sä (katso yllä).
M13mpl9-klooneja, jotka sisälsivät oikean kokoiset insertit, kasvatettiin suuremmissa määrissä yksijuosteisen faagi-DNA:n saamiseksi sekvenssointia varten. 35 ml 2 x YT-alustaa ympättiin 0,3 ml:11a yli yön kasvanutta JM109- 15 viljelmää. Kun oli kasvatettu 1 tunti 37 °C:ssa, 35 ml viljelmä ympättiin 200 pl:lla sopivaa faagia sisältävää supernatanttia. Viljelmää inkuboitiin 6 tuntia 37 °C:ssa ja viljelmän supernatantti kerättiin sentrifugoimalla 9 000 kierrosta minuutissa 10 minuutin ajan JS13.1-root- 20 torissa. Faagi saostettiin 31 ml:sta supernatanttia lisää- ;.· · mällä 5 ml 4 M NaCl:ia ja 40 % (w/w) polyetyleeniglykoli :\j 6000:tta ja sentrifugoimalla uudelleen, kuten yllä. Faagi- :***; pelletti suspendoitiin uudelleen 0,4 ml:aan TE-puskuria, • · · uutettiin fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholilla [50:49:1 *· · .···. 25 (v/v)] kolme kertaa, kloroformi/isoamyylialkoholilla [49:1 • · (v/v)] kerran ja saostettiin etanolilla. DNA pelletti suspendoitiin uudelleen 20 pl:aan TE-puskuria ja määritettiin spektrofotometrisesti mittaamalla A260 . Yhdessä sekvenssoin-tisarjassa käytettiin 1 pg faagi-DNA:ta.
» · ···* 30 Sekvenssointi suoritettiin Sanger'in dideoksimene- telmällä (Sanger, F.S. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, ' ' .***. 1977, 74, 5463 - 5467) käyttäen M13 -20 ja M13 -40 univer- • · · saalialukkeita (New England Biolabs, Beverly, MA) ja gee- • · · •*j · nispesifisiä alukkeita (FX-alfa-globiinille käytettiin 35 seuraavia alukkeita: alfa-1 5 ' -CGTATGTTCCTGTCTTT-3 '; alfa- 65 107938 2 5'-ACAAACTGCGTGTTGAT-3'; FX-beeta-globiinille käytettiin seuraavia alukkeita: beeta-1 5'-GCTGGTTGTTTACCCGT-3'; bee-ta-2 5'-ACCCGGAAAACTTCCGTC-3' ) .
Ekspressiovektorit pDLII-62m ja pDLII-10a 5 Ml3mpl9-vektorista katkaistiin sopivat sekvenssit ja kloonattiin ekspressiovektoriin pKK-223-3 (Pharmacia/ LKB, Piscataway, NJ) Tac-promoottorin (Brosius, J. ja Holy, A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1984, 81, 6929-6933) säätelyn alaisuuteen. Alfa-globiinia koodittava DNA-sek-10 venssi poistettiin katkaisemalla EcoRI- ja Pstl-entsyy-meillä. Globiinin sisältävä fragmentti puhdistettiin geelissä ja ligoitiin EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä katkaistuun geelipuhdistettuun vektoriin pKK-223-3 käyttäen menetelmiä, jotka on kuvattu yllä. E. coli JM109 -solut trans-15 formoitiin ligaatioreaktiolla, joka sisälsi halutun FX-alfa-globiinisekvenssin (pDL II-62m) (kuvio 1) ja selek-toitiin kasvattamalla 2 x YT-alustalla, joka sisälsi ampi-silliinia (100 pg/ml). Yksittäiset kloonit seulottiin halutun insertin läsnäolon suhteen (antoi plasmidin pDL II-20 62m) puhdistamalla plasmidit alkali-SDS-puhdistuksella ja : suorittamalla restriktioanalyysi EcoRI- ja Psti-entsyy- ·*·.· meillä käyttäen yllä kuvattuja menetelmiä. FX-beeta-glo- • · ;**. biinisekvenssin kloonaus ekspressiovektoriin pKK-223-3, • · · ···, joka antoi plasmidin pDL II-10a (kuvio 1), suoritettiin • · · .···. 25 samoin, paitsi että restriktioanalyysi ja kloonaus suori-• · tettiin PstI- ja Hindlll-entsyymeillä.
Esimerkki 2
Synteettisten FX-alfa- ja FX-beeta-globiinien erillinen ekspressio • · · ...* 30 Yksittäisten FX-globiinigeenituotteiden ekspression J*· vahvistamiseksi E. coli JM109 -kloonit, jotka oli trans- • ·· -- - ' »» .·**. formoitu joko plasmidilla pDL II-62m tai pDL II-10a, ym- • · · pättiin 2 ml:aan TB-alustaa, joka sisälsi ampisilliinia • · ♦ ··· : (100 pg/ml). Ymppiä kasvatettiin 37 °C:ssa 3-4 tuntia, • · · • · 35 sitten jaettiin kahteen 1 ml osaan. Toinen osista indusoi- 66 107938 tiin lisäämällä IPTGitä (lopullinen konsentraatio 1 mM) ja kasvatettiin lisää 3-4 tuntia. Solut kerättiin sentri-fugoimalla, suspendoitiin uudelleen 0,5 ml:aan SDS-PAGE-latauspuskuria ja kuumennettiin 85 °C:ssa 10 minuuttia.
5 Solun kokonaisproteiiniseos ajettiin elektroforeesissa 15-%:isissä SDS-polyakryyliamidigeeleissä käyttäen autenttista hemoglobiinia molekyylipainostandardina.
Esimerkki 3 FX-alfa- ja FX-beeta-globiinigeenituotteiden poly-10 kistroninen yhteisekspressio samasta operonista (PDLII-66a) ja FX-hemoglobiinin muuttaminen hemoglobiiniksi FX-alfa- ja FX-beeta-globiinien yhteisekspression aikaansaamiseksi yhdestä polykistronisesta operonista FX-15 beeta-globiinisekvenssi plasmidista pDL II-10a katkaistiin irti Hindlll- ja Pstl-entsyymeillä, geelipuhdistettiin ja ligoitiin Pstl/Hindlll-entsyymeillä katkaistuun ja geeli-puhdistettuun pDL II-62m plasmidiin. Ligaatio- ja transformaatio-olosuhteet olivat samanlaiset kuin yllä kuvatut. 20 Huomaa, että kutakin globiinikistronia edeltää "syöttökis-•J : troni", kuten aiemmin kuvattiin, niin että Tac-promootto- :*·.· rilla ohjatussa koko operonissa oli neljä kistronia. Kloo- • « nit tarkastettiin yksittäin sekä FX-alfa- että FX-beeta- ·»· .*·*. globiinigeenien läsnäolon suhteen digestoimalla plasmidit • · · .···. 25 EcoRI-entsyymillä ja erottamalla fragmentit 0,8 % agaroo- sissa tehdyllä elektroforeesilla. Plasmidit, jotka sisälsivät molemmat geenit (pDL II-66a, kuvio 1) tuottivat noin . 1,0 kiloemäksen pituisen fragmentin EcoRI-digestion jäl keen .
··· * · ···* 30 Klooneja, jotka sisälsivät plasmidin pDL II-66a, ·*·.. kasvatettiin 2 mlrssa TB-alustaa, joka sisälsi ampisil- ♦ .***. liinia (100 pg/ml), 4 tuntia 37 °C:ssa. Viljelmä jaet- ···
. \ tiin kahteen 1 ml osaan, joista toinen indusoitiin 1 mM
• · · ··* : IPTGrllä. Inkubointia jatkettiin 4 tuntia. Solun kokonais- • · 35 proteiiniuutokset sekä indusoimattomista että indusoiduis- 67 107938 ta klooneista tarkasteltiin SDS-PAGE-elektroforeesilla FX-alfa- ja FX-beeta-globiinin yhteisekspression varmistamiseksi .
Sen määrittämiseksi, johtiko molempien geenituot-5 teiden yhteisekspressio tetrameerisen FX-alfa-globiini2 FX-beeta-globiini2 -proteiinin muodostumiseen, suoritettiin seuraavat kokeet. Kaksi litraa TB-alustaa, joka sisälsi ampisilliinia (100 pg/ml), ympättiin 20 ml:11a yli yön kasvanutta E. coli -kloonia, joka ekspressoi FX-alfa/FX-10 beeta-globiinia, ja kasvatettiin 37 °C:ssa niin, että sen optinen tiheys 600 nm:ssa (OD600 ) oli 2,1. Viljelmä indusoitiin IPTGrllä (lopullinen konsentraatio 2,5 mM) ja kasvatettiin OD600-arvoon 3,5.
Solut (40 g) kerättiin sentrifugoimalla 10 000 x g 15 ja suspendoitiin 80 ml lyysispuskuria (50 mM Tris-HCl, pH
8,0, 25 % sakkaroosi, 1 mM EDTA). Lisättiin kymmenen mil-lilitraa lysotsyymiliuosta (18 mg/ml lyysispuskurissa) ja seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia. MgCl2:ia, MnCl2:ia ja DNaasi I -entsyymiä (Sigma, St. Louis, MO) lisättiin 20 niin, että lopulliset konsentraatiot olivat 10 mM, 1 mM ja ;.· | 10 pg/ml, vastaavassa järjestyksessä. Soluja inkuboitiin : ·.; huoneenlämpötilassa 1 tunti ja lysaattiin lisättiin sama :***; tilavuus liuosta, joka oli 1 % deoksikoolihappo, 1 % • · ·
Nonidet P40, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA.
• · · .·*♦. 25 Partikkelimainen materiaali poistettiin sentrifu- • » .···. goimalla 10 000 x g 10 minuuttia. Supernatanttia (noin * · 200 ml) kuplitettiin hiilimonoksidilla 5 minuuttia ja dia- . lysoitiin yli yön 4 litraa vastaan 10 mM NaP04-puskuria, [ * pH 6,0. Soluvapaa uutos kirkastettiin sentrifugoimalla • · ·«·* 30 10 000 x g 10 minuuttia. Supernatanttiin lisättiin 20 g DE-52-resiiniä (Whatman, UK). Suspension pH säädettiin .***. 7, Oraan ja ioninvaihtoresiini poistettiin sentrif ugoi- • · · . ·. maila. Supernatantin pH säädettiin uudestaan 6,0:aan ja * · · ···· supernatantti ladattiin CM-selluloosapylvääseen (2,5 x • ·
*···* 35 15 cm), joka oli tasapainotettu 10 mM NaP04-puskurissa, pH
68 107938 6,0, 4 °C:ssa. Pylväs pestiin kahdella patsastilavuudella 10 mM NaP04-puskuria, pH 6,0, jonka jälkeen suoritettiin lineaarinen gradientti 10 mM NaP04-puskurista, pH 6,9 20 mM NaP04-puskuriin, pH 9,0 (400 ml kokonaistilavuus). Fraktiot 5 36-42 sisälsivät punaisen liuoksen ja ne yhdistettiin; pieni määrä tästä liuoksesta tutkittiin 650 nmrsta 400 nm:iin, joka paljasti samanlaisen spektrin, joka on kar-boksihemoglobiinilla (kuvio 6). Pieni määrä samasta huipusta analysoitiin SDS-PAGE-elektroforeesilla käyttäen 10 hemoglobiinia molekyylipainostandardina ja sen havaittiin sisältävän kaksi proteiinirintamaa, joiden molekyylipainot olivat noin 15 500 ja 16 200. Kuten odotettua, nämä rintamat kulkivat hiukan hitaammin kuin autenttinen hemoglobiini (alfan molekyylipaino = 15 100; beetan molekyylipa!-15 no = 15 850) johtuen ehkä faktori xa:n tunnistussekvenssin aiheuttamasta viiden aminohapon pidennyksestä. Tällä perusteella materiaali nimettiin FX-hemoglobiiniksi.
FX-hemoglobiinia (2,0 mg) digestoitiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia 3 ml:ssa liuosta, joka oli 20 mM HEPES, 20 pH 7,4, 0,1 M NaCl, 10 mM CaCl2, joka sisälsi 2 mg tryp- l siiniä (Sigma, St. Louis, MO, 10 000 yksikköä/mg). SDS- PAGE-elektroforeesi varmisti FX-hemoglobiinin muutoksen * * :***; materiaaliksi, joka kulki samalla nopeudella luonnollisen • · « .*··. hemoglobiinin kanssa.
• « ·
.···, 25 Esimerkki 3A
• · ··· #···φ FX-globiinituotteiden jakaantuminen E. coli -eks- • * pressiossa . 100 ml viljelmät E. coli -klooneja, jotka ekspres- * * soivat FX-alfa-globiinia (plasmidi pDL II-62m), FX-beeta- ♦ ♦ ...* 30 globiinia (plasmidi pDL ll-10a) ja FX-hemoglobiinia (plas-·*·.. midi pDL II-66a), aloitettiin yli yön kasvaneiden viljel- mien 1 ml:n ympillä. Kun oli kasvatettu 4 tuntia, proteii- • · · .·, niekspressio indusoitiin lisäämällä IPTG:tä niin, että • « · ··· · lopulliseksi konsentraatioksi tuli 1 mM. Inkubointia jät- • · *···’ 35 kettiin 3 tuntia lisää. Solut kerättiin sentrifugoimalla, 69 107938 punnittiin ja lyysattiin, kuten yllä on kuvattu, paitsi että DNaasi-käsittely tehtiin 30 minuuttia jäissä. Näytteet sentrifugoitiin 5 000 x g 10 minuuttia ja superna-tanttien (jotka edustivat liukoisten proteiinien fraktio-5 ta) lopullinen tilavuus tehtiin 2 ml:ksi H20:lla ja jäädytettiin -80 °C:ssa. Pelletit (jotka edustavat liukenemattomien proteiinien tai inkluusiokappaleiden fraktiota) pestiin kahdesti 5 ml:11a liuosta, joka oli 0,5 % Triton X-100, 1 mM EDTA, suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan H20:ta 10 ja jäädytettiin -80 °C:ssa.
Proteiinien jakaantumisen analyysi suoritettiin SDS-PAGE:lla ja Western-blottauksella. Primaarinen vasta-aine oli kanin anti-ihmis-hemoglobiini IgG. Western-blot-tausmenetelmä suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaises-15 ti (Proto Blot Western Blot AP System, Promega Corp., Madison, WI) . Liukoisten ja liukenemattomien proteiinien näytteet, joiden määrät olivat 60 pg solun märkäpainoa, analysoitiin FX-alfa- ja FX-beeta-globiinia ekspressoivis-ta klooneista. Koska FX-hemoglobiinikloonissa oli suurempi 20 ekspressiotaso, analysoitiin materiaalia määrä, joka oli . ainoastaan 15 pg solun märkäpainoa.
• · * · **tj Kuten taulukosta 11 nähdään, proteiinien jakaantu- • · .·*·. minen vaihteli. FX-alfa-globiini oli havaittavissa ainoas- • * · ·*·, taan liukoisessa fraktiossa, kun taas FX-beeta-globiini 25 jakaantui solun liukenemattoman ja liukoisen fraktion kes- • a ken. FX-hemoglobiini, joka stabiloi kunkin erillisen ala- » i *·’ yksikön, löydettiin ainoastaan liukoisesta fraktiosta ja konsentraationa, joka oli ainakin 2,6 kertainen verrattuna * * yksittäin ekspressoituihin alayksiköihin. Nämä tulokset • · · *...· 30 osoittavat, että FX-beeta-globiini on täysin liukoinen, kun sen sallitaan yhdistyä FX-alfa-globiinin kanssa.
Esimerkki 4 • ·
Tetrameerisen FX-alfa/FX-beeta-mutanttihemoglobii-: nin ekspressiovektorin rakentaminen ja ekspressio ·«· 35 Hemoglobiini Beth Israel: Plasmidi pDL II-10a di- gestoitiin Sacl- ja Spel-restriktioentsyymeillä, puhdis- 70 107938 tettiin geelissä ja eristettiin elektroeluutiolla. Sellaiset oligonukleotidit, joissa oli Beth Israel -hemoglobiinille sopiva kodonin muutos (beeta102 asn - ser) (kuvio 7) syntetisoitiin, kuten yllä on aiemmin kuvattu, niin että 5 ne ylsivät Sacl-restriktiokohdasta Spel-restriktiokohtaan. Yksittäisten oligonukleotidien puhdistus ja määrän määritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu. Komplementaariset oligonukleotidit hybridisoitiin kuumentamalla 95 °C:ssa 10 minuuttia, jonka jälkeen annettiin hitaasti 10 jäähtyä huoneenlämpötilaan 2 tunnin aikana. Sitten pieni määrä hybridisoitua seosta yhdistettiin Sacl/Spel-entsyymeillä digestoidun geelissä puhdistetun plasmidin pDL II-10a kanssa niin, että moolisuhteet olivat samat kuin mitä käytettiin alkuperäisessä FX-alfa- ja FX-beeta-kloonauk-15 sessa. Lisättiin T4 DNA -ligaasia (2 yksikköä) ja seosta inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa. E. coli JM109 -kanta transformoitiin tällä ligaatioseoksella, kuten aiemmin on kuvattu. Yksittäiset kloonit eristettiin ja plasmidit puhdistettiin ja sekvenssoitiin käyttäen aluket-20 ta beeta-1 (vida supra). Plasmidisekvenssointi suoritet-, tiin Sequenase-käyttöpakkauksella (United States Biochemi- IM · : cal Corp. , Cleveland, OH) seuraten valmistajan ohjetta.
« · ,···. Sitten sopivasti mutatoitunut beeta-globiinisekvenssi kat- • · kaistiin Hindlll- ja Pstl-entsyymeillä, puhdistettiin gee- • ·
Iti 25 Iissä ja kloonattiin plasmidiin pDL II-62m, kuten yllä on • · • · kuvattu.
• · ’···* Muut hemoglobiinimutantit: Synteettiset geenit, jotka koodittivat hemoglobiini Cheverly- (beeta45 phe -> ***** ser), hemoglobiini Providence/MSR- (beeta82 lys -> asp) ja
Ml *,,,Σ 30 hemoglobiini beeta67 vai -» ile- ja hemoglobiini Kansas-pro- ;·. teiinia (beeta102 asn -* thr), valmistettiin samalla tavalla, • ··
#···# paitsi että synteettiset oligonukleotidit ulottuivat SacII
• · *!* -> Bglll-, Sali -> Spel-, Ncol -* Kpnl- ja Sad -» Spel -res- • · : triktiokohtien yli, vastaavassa järjestyksessä (kuvio 7).
• M
35 Mutanttioligonukleotidien synteesi-, restriktioentsyymidi- 71 107938 gestio-, geelipuhdistus- ja ligaatio-olosuhteet olivat samanlaisia kuin hemoglobiini Beth Israel -proteiinin tapauksessa käytetyt. Kaikki mutaatiot kloonattiin ensin plasmidiin pDL II-10a, sopivat kloonit sekvenssoitiin ja 5 mutatoitu beeta-globiinigeeni jatkokloonattiin PstI- ja HindiII-entsyymeillä digestoituun plasmidiin pDL II-66a. Plasmidin sekvenssointi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu. E. coli -solut transformoitiin, viljeltiin ja indusoitiin, kuten aiemmin on kuvattu. FX-hemoglobiinimutantit 10 puhdistettiin esimerkin 3 menetelmällä. Puhdistettujen hemoglobiinien hapensitominen on esitetty taulukossa 9. Esimerkki 5
Synteettisen Met-alf a/Met-beeta-hemoglobiinin tuotto 15 Des-FX-alfa- ja Des-FX-beeta-globiinigeenien raken taminen
Vahvistimme, että E. coli -bakteeri voi tuottaa tetrameerista fuusiohemoglobiinia. Faktori Xa:n substraatin tunnistuskohtaa koodittavien DNA-sekvenssien poistami-20 sen kunkin peptidin N-päästä pitäisi johtaa synteettisen ί.: : hemoglobiinin (FX-vapaa; "des-FX") tuottoon, joka sisäl- • · tää N-pään metioniinin ainoana ylimääräisenä jäännöksenä.
Plasmidi pDL Il-62m digestoitiin EcoRI-ja Pstl-entsyymeil- ·***: lä FX-alfa-globiinigeeniä sisältävän sekvenssin irrottami- .***. 25 seksi. Sitten FX-alfa-globiinigeeni puhdistettiin geelis-• · · .**·. sä. Plasmidi pGEM-1 (Promega Corp. ) linearisoitiin EcoRI- ··· ja Pstl-entsyymeillä, puhdistettiin geelissä ja FX-alfa-globiinigeeni ligoitiin plasmidiin, kuten on aiemmin ku- • · ... vattu. Kloonit (FX-alfa-pGEM), jotka sisälsivät FX-alfa- • · ·;· 30 globiinigeenin palsmidissa pGEM-1, tunnistettiin digestoi- • * • *·· maila puhdistetut plasmidit EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä, jonka jälkeen suoritettiin agaroosigeelielektroforeesiana- . lyysi. FX-alfa-pGEM digestoitiin Ndel- ja Eagl-entsyymeil- • · · *11.' lä faktori Xa:ta koodittavan sekvenssin poistamiseksi (ku- *·** 35 vio 5). Oligonukleotidit, jotka sisälsivät luonnollista 72 107938 alfa-globiinia koodattavan sekvenssin, syntetisoitiin sellaisilla päillä, jotka olivat yhteensopivia Ndel- ja Eagl-restriktiokohtien kanssa (kuvio 8). Synteesin jälkeen oli-gonukleotidit puhdistettiin, hybridisoitiin ja ligoitiin, 5 kuten yllä on kuvattu, pGEM-des-FX-alfa-sekvenssi (pDL II-83a) varmistettiin dideoksisekvenssoimalla plasmidi käyttäen T7-promoottorialuketta (Promega Corp., Madison, WI). Sitten klooni, joka sisälsi oikean sekvenssin, digestoi-tiin EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä. Des-FX-alfa-globiinigee-10 ni puhdistettiin geelissä, kloonattiin EcoRI/Pstl-diges-toituun geelissä puhdistettuun plasmidiin pKK-233-3 plas-midin pDL II-86c muodostamiseksi. E. coli JM109 -kanta transformoitiin ligaatioseoksilla ja yksittäisten kloonien des-FX-alfa-globiinin ekspressio määritettiin analysoimal-15 la indusoitujen viljelmien ymppien solujen kokonaispro-teiiniuutokset (katso yllä). Des-FX-alfa-globiini, päinvastoin kuin FX-alfa-globiini, kulkee autenttisen alfa-globiinin kanssa yhtä suurella nopeudella SDS-PAGE:ssa.
Des-FX-beeta-globiinisekvenssi valmistettiin samal-20 la tavalla käyttäen FX-beeta-globiinigeeniä, joka oli ir- * : rotettu plasmidista pDL II-10a PstI- ja HindiII-entsyy- • · !/·· meillä. Sitten tämä geelissä puhdistettu beeta-globiini- :***: sekvenssi ligoitiin plasmidiin pGEM-1, joka oli digestoitu :***: samoilla kahdella entsyymillä. Sellainen pGEM-l-plasmidi, ·*» .·'·. 25 joka sisälsi FX-beeta-globiinigeenin, digestoitiin Ndel-• · · .···. ja SacII-entsyymeillä, puhdistettiin geelissä ja sitä käy tettiin rakennettaessa des-FX-beeta-globiinigeeni. Halutun . sekvenssin sisältävät oligonukleotidit (kuvio 20) synteti- • · ... soitiin, puhdistettiin, hybridisoitiin ja ligoitiin Ndel- • · ···* 30 ja SacII-entsyymeillä katkaistuun plasmidiin pGEM-FX-beeta plasmidin pGEM-des-FX-beeta (pDL Ill-6f) muodostamiseksi, ·***; kuten yllä on kuvattu. Kun oli varmistettu, että sekvenssi • · · , *. oli oikea, des-FX-beetageeni poistettiin PstI- ja Hindin- • · t ·*/ entsyymeillä ja puhdistettiin geelissä. Sitten des-FX- • ·
’···’ 35 beeta ligoitiin des-FX-alfaa sisältävään plasmidiin pDL
73 107938
II- 86c käyttäen Pstl/Hindlll-kohtia. Kloonit, jotka sisälsivät sekä des-FX-alfa- että beeta-globiinigeenit (pDL
III- 13e) (kuvio 9), varmistettiin puhdistettujen plasmi-dien EcoRI-digestiolla (katso yllä) ja seulottiin ekspres- 5 sion suhteen vertaamalla IPTG:llä indusoituja ja indusoi-mattomia viljelmiä. Des-FX-hemoglobiini kulkee samalla nopeudella luonnollisen hemoglobiinin kanssa SDS-PAGE:ssa. Met-hemoglobiinin (Des-FX-Hgb) karakterisointi Rekombinanttimetionyyli-hemoglobiinilla on erilai-10 set reaktio-ominaisuudet kuin hemoglobiini A0:lla kloori-ja fosfaatti-ionien läsnä ollessa (taulukko 10) ja vety-ionikonsentraation muutoksissa (kuvio 10). Syyn tähän ajatellaan johtuvan molempien globiinien N-päässä olevasta lisäaminohaposta, metioniinista. Alfa-ketjun N-pään amino-15 ryhmä on tärkeä fosfaatti-ionin aiheuttamalle P50-arvon muutokselle. N-pään aminoryhmän syrjäyttäminen paikaltaan tai sen elektronisen tilan muuttaminen metioniinin lisäyksellä voi muuttaa näitä vaikutuksia.
Inositoliheksafosfaatti-ionin läsnä ollessa havait-20 tu P50-arvon kohoaminen on vailla merkitystä mille tahansa :.· j liuoksessa olevalle hemoglobiinille, koska plasmasta löy- : detty monofosfaatti-ionikonsentraatio ei ole tarpeeksi • · korkea, jotta se kohottaisi P50-arvoa merkittävästi. Plas- » * · *·*. masta ei löydy yhtään inositoliheksafosfaatti-ionia. Se .···, 25 P50-arvon kohoaminen, joka tarvitaan, jotta liuoksessa ole-• · #···> va hemoglobiini luovuttaa tehokkaasti hapen, saadaan ai- • · kaan parhaiten sisällyttämällä mutaatioita, jotka muodostavat hapelle alemman affiniteetin sisältävän hemoglobiinin.
···* 30 Mitä tulee kloori-ionin aiheuttamaan P50-arvon muu- toksen suuruuteen, se ei ole fysiologisesti tärkeää. Vai- ·*’*. kutus, joka on mielenkiintoinen sen biokemiallisten meka- • · · . *. nismien suhteen, ei lisää merkittävästi liuoksessa olevan • · · hemoglobiinin hapenluovutuskapasiteetin määrää. Joillain *...* 35 eläinten hemoglobiineilla on erittäin pienet kloorivaiku- 74 107938 tukset. Jälleen, kloorin vaikutuksen on ajateltu välittyvän alfa-globiinin N-pään aminoryhmän välityksellä; metio-nyyli-hemoglobiinilla tämä vaikutus voi olla muuttunut johtuen steerisestä muutoksesta tai siitä, että metionii-5 nin aminoryhmän pKa on erilainen kuin valiinin vastaava.
Hemoglobiinin P50-arvo muuttuu normaalisti dramaattisimmin vetyionikonsentraation mukaan. Niin sanottuun "Bohrin vaikutukseen" on ajateltu osaksi ottavan osaa alfa-globiinin N-pään aminoryhmä. Useilla ihmisen mutantti-10 hemoglobiinimolekyyleillä on osoitettu olevan muuttuneet Bohrin vaikutusmuutokset ilman mitään fysiologisia puutoksia. On edullista, että liuoksessa useisiin erilaisiin lääketieteellisiin ja biokemiallisiin sovellutuksiin käytettävällä hemoglobiinimolekyylillä on rajoitettu Bohrin 15 vaikutus kuin myös fosfaatti- ja kloorivaikutukset. Bohrin vaikutusta ajatellen on metionyyli-hemoglobiinille olemassa useita sovellutuksia, joissa sitä voidaan käyttää emäk-sisemmillä pH-alueilla, esim. kudosviljelyssä, elimen per-fuusiossa. Kuvio 10 esittää alustavan kokeen, joka osoit-20 ti, että P50-arvo on todellisuudessa suurempi metionyyli- :.· · hemoglobiinille kuin hemoglobiini A0:lle korkeammissa pHtssa kuin 7,8. Kuviosta 10 voidaan havaita, että esitet-täessä P50-arvo graafisesti pH:n funktiona, kulmakerroin :***: Met-Hgb:lle on matalampi kuin Hgb A0:lle, se tarkoittaa, .1·1. 25 että Bohrin vaikutus on pienempi. Myöhemmät kokeet antavat .···. olettaa, että ero Bohrin vaikutuksessa Met-Hgb:n ja Hgb A0:n välillä on pienempi kuin kuviossa 10 esitetty.
. Pääasiallisin etu käytettäessä sellaista hemoglo biinimolekyyliä, jolla on vakiintuneet P50-arvon muutokset ...1 30 suhteessa pH:hon, klooriin ja fosfaattiin on se, että ·1·.. käyttäjä tietää formulaation hapenluovutuskapasiteetin ·1’1· tarvitsematta välittää sen spesifisistä käyttöolosuhteis- •’λ • · · • · « · · • · 75 107938
Esimerkki 6
Luonnollisen kokoisen synteettisen hemoglobiinin (Des-Val-Hgb) syntetisoiminen
Des-Val-alfa- (pDL II-91f) ja Des-Val-beeta- (pDL 5 III-la) globiinigeenien rakentaminen DNA-sekvenssit, jotka koodittavat globiinigeenejä, joissa N-pään valiinikodoni kussakin geenissä on korvattu ATG-kodonilla (metioniini), rakennettiin samalla tavalla kuin des-FX-kloonit, paitsi että sisällytetyt oligonukleo-10 tidit (kuvio 8) olivat sellaisia, jotka koodittivat aminohapposekvenssejä "met-leu.. ." ja "met-his..." alfa- ja beeta-globiinigeeneille, vastaavassa järjestyksessä. Kun oli varmistettu oikea sekvenssi vektorissa pGEM-1 oleville sekä des-val-alfa (pDL II-91f) että des-val-beeta (pDL II-15 95a) -geeneille, des-val-alfa-globiinigeeni kloonattiin
EcoRI/Pstl-entsyymeillä katkaistuun vektoriin pKK-223-3 (katso yllä) niin, että muodostettiin plasmidi pDL III-la. Des-val-beeta-globiinigeeni plasmidista pDL II-95a kloonattiin sitten plasmidiin pDL III-la käyttäen PstI/ 20 Hindlll-restriktiokohtia.
:,· · Erikoisemmin, des-val-alfa-siirtovektori valmistet- * · tiin plasmidista pDL II-62m seuraavasti. Plasmidi pDL II-62m digestoitiin EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä FX-alfa-glo-biinigeenin sisältävän fragmentin irrottamiseksi. Sitten 25 FX-alfa-globiinigeeni puhdistettiin geelissä. Plasmidi • · · ,···. pGEM-1 (Promega Corp. ) linearisoitiin EcoRI- ja Pstl-ent- • · syymeillä, puhdistettiin geelissä ja FX-alfa-globiinigeeni . ligoitiin plasmidiin, kuten aiemmin on kuvattu. Oli tar- • « ... peellista jatkokloonata plasmidiin pGEM-1, koska plasmi- * · ·;·’ 30 dissa pKK-223-3 olevat ylimääräiset restriktiokohdat esti-: ·.. vät FX:ää koodittavan sekvenssin poistamisen suoraan yk- sittäisistä FX-alfa- ja FX-beeta-globiinigeeneistä. Kloo- • · · . *. nit, jotka sisälsivät FX-alfa-globiinigeenin plasmidissa pGEM-1, tunnistettiin digestoimalla puhdistetut plasmidit *···' 35 EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä, jonka jälkeen suoritettiin 76 107938 agaroosigeelielektroforeesianalyysi. Plasmidi FX-alfa-pGEM-1 digestoitiin Ndel- ja Eagl-entsyymeillä FX-alfaa koodattavan sekvenssin poistamiseksi ja sellaiset oligo-nukleotidit, jotka sisälsivät luonnollista alfa-globiinia 5 koodittavat DNA-sekvenssit, joissa N-pään väliini oli korvattu metioniinilla, syntetisoitiin niin, että niiden päät olivat yhteensopivia Ndel- ja Eagl-restriktiokohtien kanssa. Syntetisoinnin jälkeen oligonukleotidit puhdistettiin, hybridisoitiin ja ligoitiin, kuten on kuvattu yllä. Plas-10 midin pGEM-des-val-alfa (plasmidi pDL II-91f) sekvenssi varmistettiin plasmidin dideoksisekvenssoinnilla käyttäen T7-aluketta (Promega Corp., Madison, Wisconsin). Klooni, joka sisälsi oikean des-val-alfa (pDL II-91f) -sekvenssin, digestoitiin sitten EcoRI- ja Pstl-entsyymeillä. Des-val-15 alfa-globiinigeeni puhdistettiin geelissä ja ligoitiin
EcoRI/Pstl-entsyymeillä digestoituun geelissä puhdistettuun vektoriin pKK-223-3 niin, että muodostettiin plasmidi pDL III-la.
Des-val-beeta-globiinisiirtovektori valmistettiin 20 samalla tavalla käyttäen FX-beeta-globiinigeeniä plasmi-:.· j dista pDL II-10a. FX-beeta irrotettiin plasmidista pDL II- 10a PstI- ja Hindi-entsyymeillä. Tämä geelissä puhdistettu beeta-globiinisekvenssi ligoitiin sitten plasmidiin pGEM- • · » ;“*· 1, joka oli katkaistu samoilla kahdella entsyymillä. Sei- .*··. 25 lainen pGEM-klooni, joka sisälsi FX-beeta-globiinigeenin, «»· .···. digestoitiin Ndel- ja SacII-entsyymeillä, puhdistettiin « · geelissä ja käytettiin rakennettaessa des-val-beeta-glo- . biinigeeni. Oligonukleotidit, jotka koodittivat des-val- beetan koko haluttua sekvenssiä syntetisoitiin, puhdistet- ···’ 30 tiin, hybridisoitiin ja ligoitiin Ndel- ja SacII-entsyy- ·*·.. meillä katkaistuun plasmidiin pGEM-FX-beeta niin, että
·***» muodostettiin plasmidi pGEM-des-val-beeta (plasmidi pDL
• · · . *. II-95a). Kun oli varmistettu, että sekvenssi oli oikea • · » des-val-beeta-globiinille, geeni poistettiin PstI- ja • « *··♦* 35 HindiII-entsyymeillä ja puhdistettiin geelissä.
77 107938
Plasmidien pDL III-14c ja III-38b (polykistroniset des-val-alfa/des-val-beeta-geenikloonit) valmistus
Plasmidi pDL lll-la, joka sisälsi Des-Val-alfa-globiinigeenin, digestoitiin PstI- ja HindiII-entsyymeillä 5 ja puhdistettiin geelissä. Des-Val-beeta-globiinigeeni poistettiin plasmidista pDL II-95a käyttäen samaa menetelmää. Ligaation ja transformaation jälkeen yksittäiset kloonit, jotka sisälsivät Des-Val-alfa/des-val-beeta-glo-biinia yhteisekspressoivan plasmidin pDL III-14c, analy- 10 soitiin Des-Val-hemoglobiinin tuoton suhteen IPTG-induk-tiolla ja SDS-PAGE:11a.
Sitten rakennettiin ja analysoitiin plasmidi pDL
III-38b, joka sisälsi Des-Val-beeta-globiinigeenin Des-Val-alf a-globiinigeenin 5'-puolella.
15 Plasmidi pDL lll-la, joka sisältää des-val-alfa- globiinigeenin, linearisoitiin Smal-restriktioentsyymillä. Sitten plasmidia käsiteltiin bakteerin alkalisella fosfa-taasilla 51-päiden fosfaattiryhmien poistamiseksi, uutettiin fenolilla, saostettiin etanolilla ja suspendoitiin 20 uudelleen TE-puskuriin, kuten yllä. Des-val-beetageenin : sisältävä klooni pGEM-1 digestoitiin HindiII-entsyymillä, uutettiin fenolilla, saostettiin etanolilla ja suspendoi- « * tiin uudelleen ligaatioseokseen, joka sisälsi 50:1 molaa- • « · ··*. risen suhteen Hindlll-Smal-linkkeriä verrattuna plasmi- « · · .···. 25 diin. Sitten tämä ligaatioseos digestoitiin Smal-entsyy- • t I!* millä ja beeta-globiinifragmentti, jossa nyt oli Smal-res- • 9 ’** triktiokohdat sekä 5'- että 3'-päissä, puhdistettiin gee lissä ja lisättiin ligaatioreaktioon, joka sisälsi yllä olevan plasmidin pDL lll-la linearisoidun muodon saaden • · · 30 näin plasmidi pDL m-38b. Alfa- ja beeta-globiinigeenien j*.## orientaatiot plasmideissa pDL III-14c ja pDL III-38b var- .···. mistettiin restriktioanalyysillä.
• · E. coli JM109 -kannan solut transformoitiin plasmi- ϊ·ί ' deilla pDL III-14c ja pDL lll-38b ja kasvatettiin 2 x YT- • · · 35 alustassa, joka sisälsi ampisilliinia. Pesäkkeet indusoi- 78 107938 tiin IPTGrllä, kuten yllä. Yksittäiset kloonit analysoitiin niiden kyvyn suhteen tuottaa des-val-alfa- ja des-val-beeta-globiinipolypeptidejä SDS-PAGE:lla ja Western-blottauksella. Ei ollut mitään olennaista eroa immunoreak-5 tiivisen des-val-alfa- tai des-val-beeta-globiinin eks-pressiossa orientaatiosta alfa -> beeta (pDL III-14c) tai orientaatiosta beeta -» alfa (pDL III-38b).
Esimerkki 7
Des-FX- ja Des-Val-rekombinanttihemoglobiinien ana-10 lyysit ja toimintaominaisuuksien vertailu JM109-soluja, jotka ekspressoivat joko des-FX-hemo-globiinia (dFX-hgb) tai des-Val-hemoglobiinia (dV-hgb), kasvatettiin 10 litran fermentorissa OD600-arvoon 15 ja sitten indusoitiin lisäämällä IPTG:tä 300 pM:ksi. Indu-15 sointiaika oli 6 tuntia. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja jäädytettiin -80 °C:ssa, kunnes käytettiin.
Hemoglobiinin puhdistamiseksi noin 200 g soluja suspendoitiin uudelleen 350 ml:aan 50 mM natriumfosfaat-tipuskuria (NaPi), pH 7,0, joka sisälsi 200 yksikköä apro-20 tiniinia/ml ja 20 pg DNaasi I-entsyymiä/ml. Sitten solut j · j lyysattiin lisäämällä 1 mg lysotsyymiä/ml ja vietiin neljä kertaa Dynomill-laitteen läpi. Soluroskat poistettiin • t ;***· sentrifugoimalla 10 000 kierrosta minuutissa Beckman JA14 « · · .···. -roottorissa 4 °C:ssa 40 minuuttia. Supernatantti lisät- • · • · · ,···. 25 tiin 200 ml: aan hemoglobiinia sitovaa resiiniä, joka oli tasapainotettu 10 mM NaPi-puskurilla, pH 7,0. pH säädettiin 7,0:aan 10 M NaOH-liuoksella tai konsentroidulla fos-forihapolla. Sitten resiini laitettiin 5 x 30 cm kokoiseen kromatografiapylvääseen ja annettiin asettua. Sitten • · 30 pylväs pestiin 2,5 pylvään tilavuudella 10 mM NaPi-pusku- • \# ria, pH 7,0, joka sisälsi 100 yksikköä aprotiniinia/ml.
• .*··. Hemoglobiini eluoitiin pylväästä 20 mM Tris-HCl-puskuril- • la, pH 7,5, joka sisälsi 100 yksikköä aprotiniinia/ml.
m · · ϊ·ί ! Tämä osittain puhdistettu hemoglobiini suodatettiin sitten • « · 35 0,2 mikronin suodattimen läpi ja ladattiin 1,6 x 10 cm 79 107938
Mono-Q anioninvaihtopylvääseen, joka oli tasapainotettu 20 mM Tris-HCl-puskurilla, pH 8,0. Hemoglobiini eluoitiin käyttäen lineaarista gradienttia, joka oli 0 - 0,4 M NaCl 20 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 8,0. Sitten materiaali la-5 dattiin 1,6 x 10 cm Mono-S kationinvaihtopylvääseen. Hemoglobiini eluoitiin lineaarisella gradientilla, joka oli 10 mM NaPi-puskuri, pH 7,0 - 10 mM NaPi-puskuri, pH 8,5, 160 mM NaCl. Hemoglobiinin pääasiallinen huippu kerättiin, konsentroitiin konsentraatioon noin 100 mg/ml ja käytet-10 tiin analyysiin.
Rekombinanttihemoglobiinin toiminta arvioitiin käyttäen Hemox-analysaattoria 25 °C:ssa 50 mM HEPES-pus-kurissa, pH 7,4, joka oli 0,1 M Cl'-ionien suhteen. Saatiin seuraavat hapensitomistulokset: 15
NÄYTE P50 N
A0 4,03 2,7 dFX-hgb 3,43 2,6 dV-hgb 7,04 2,8 20 • · ’ Merkittävää näissä tuloksissa ovat seuraavat asiat: • · # « 1) Ylimääräisen aminohapon metioniinin lisäys alfa- • · ja beeta-globiinien N-päihin (dFX-hgb) tuntuu alentavan • · · *·*. hiukan molekyylin P50-arvoa, mutta sillä on ainoastaan vä- • · * .···. 25 hän vaikutusta yhteisvaikutukseen (N).
« · 2) Alfa- ja beeta-globiinien N-päiden valiinien • · korvaaminen metioniinilla (dV-hgb) kohottaa molekyylin , P50-arvoa, mutta sillä ainoastaan vähän vaikutusta yhteis vaikutukseen (N).
• » · 30 Esimerkki 8
Des-Val-alfa/alfa- (di-alfa) ja Des-Val-beeta-glo- .***. biinin polykistroninen yhteisekspressio • · · '·' Kokonaissynteesisuunnitelma plasmidin (pDL III- • « · 47a), joka yhteisekspressoi di-alfa-globiinia ja beeta- • · 35 globiinia, valmistamiseksi on annettu alla. Lähtömateriaa- 80 107938 lit ovat kaupallisesti saatavat siirtovektorit M13mpl9-RF, pKK-223-3 ja pGEM-1 ja synteettiset oligonukleotidit, jotka on kuvattu esimerkeissä.
Mukavuuden vuoksi käsittelymme alkoivat plasmideil-5 la pDL II-62m ja pDL II-10a. Plasmidi pDL II-62m saatiin kloonaamalla "FX-alfa-globiini"-geeni plasmidiin pKK-223-3 alavirtaan Tac-promoottorista. Plasmidi pDL II-10a valmistettiin insertoimalla "FX-beeta-globiini"-geeni samalla tavalla.
10 Kuten kuviossa 14 on kuvattu yksityiskohtaisemmin, "FX-alfa-globiini"-operoni koodittaa kahta kistronia, joista ensimmäinen ekspressoi "syöttö"-oktapeptidiä ja toinen alfa-globiinia, jota edeltää ryhmä Met-Ile-Glu-Gly-Arg. Jälkimmäiset neljä aminohappoa muodostavat faktori 15 X:n katkaisuaktiivisuuden tunnistuskohdan. "FX-beeta-glo-biini"-operoni rakennettiin samalla tavalla.
Koska faktori X:n tunnistuskohtaa ei tarvittu tässä, geneettistä materiaalia käsiteltiin niin, että "FX"-kodonit poistettiin. (Tämä olisi voitu välttää syntetisoi-20 maila halutut di-alfa-globiini- ja des-val-beeta-globiini-:.· · geenit suoraan mieluummin kuin käyttäen FX-alfa- ja FX- beetageenejä plasmideista pDL ii-62m ja pDL Il-10a. ) FX-alfa-globiinigeenikasetti irrotettiin ja kloonattiin plas- • · · ·*'** midiin pGEM-1 saaden plasmidi pGEM-FX-alfa. Samalla taval- • · · .·**. 25 la FX-beetageeni plasmidista pDL II-10a siirrettiin plas- ,···, midiin pGEM-1 saaden plasmidi pGEM-FX-beeta.
• ·
Tunnistuskohtaa (FX) koodittava sekvenssi voitiin . nyt poistaa plasmideista pGEM-FX-alfa ja pGEM-FX-beeta saaden plasmidit pDL li-91f ja pDL II-95a, vastaavassa • · ···* 30 järjestyksessä. Plasmidin pDL n-91f des-val-alfa-globii- ·*♦.. nigeeni kloonattiin uudestaan plasmidiin pKK-223-3 muodos- ;***j taen plasmidi pDL III-la, jossa geeni oli toiminnallisesti • ♦ * . *, liitetty plasmidin pKK-223-3 Tac-promoottoriin. Plasmidin • « ♦ •**t* pDL II-95a des-val-beeta-globiinigeeni puhdistettiin ja • · *...* 35 insertoitiin plasmidin pDL III-la des-val-alfa-globiini- 81 107938
geenin alavirtaan niin, että muodostettiin yksi transkrip-tioyksikkö, joka pystyi koodittamaan polykistronista alfa-globiini/beeta-globiini mRNA:ta, katso plasmidi pDL III-14c. Lopuksi synteettiset oligonukleotidit, jotka sisälsi-5 vät haluttua di-alfa-linkkeriä koodattavan sekvenssin ja toisen kopion alfa-globiinigeenistä, insertoitiin plasmi-diin pDL III-14c niin, että muodostettiin plasmidi pDL
III-47a, jossa Tac-promoottori säätelee di-alfa-globiini-geenin ja des-val-beeta-globiinigeenin transkriptiota.
10 Plasmidin pDL III-47a (di-alfa/beeta-globiinikloo- ni) valmistus
EagI- ja Pstl-restriktiofragmentti, joka sisälsi suurimman osan plasmidin pDL ll-91f alfa-globiinigeenistä, puhdistettiin geelissä ja ligoitiin synteettiseen link-15 keri-DNA:han, joka sisälsi alfa-globiinigeenisekvenssin
BstBI-kohdasta sen karboksipäähän, glysiinilinkkerin ja alfa-globiinin aminopään Eagl-kohtaan asti (kuvio 12). Kun tämä ligaatioseos oli digestoitu Pstl-entsyymillä, tuloksena syntynyt fragmentti kloonattiin BstBl/Pstl-katkais-20 tuun plasmidiin pDL III-14c niin, että muodostettiin plas- , j*· midi pDL III-47a (kuvio 13).
« · « · ; Di-alfa/beeta-hemoglobiinin ekspressio • · .···. Yksittäiset E. coli -kloonit analysoitiin Western- « · 1« blottauksella yhdessä monomeerisen beeta-globiinin kanssa *” 25 olevan dimeerisen alfa-globiiniproteiinin tuoton suhteen.
• t • * 4 ··· Sopivan plasmidirakenteen olemassaolo varmistettiin diges- • · ’···* toimalla EcoRI-entsyymillä ja ajamalla 0,8 % agaroosigee- lielektroforeesi. Di-alfa-rakenteissa läsnä oleva EcoRI- ’·”· fragmentti on pituudeltaan noin 1 450 emäsparia.
30 Geneettisesti yhteenliitetyn hemoglobiinin ekspres- ··. sio saatiin aikaan käyttäen IPTG-indusointimenetelmää ja • · · rekombinanttihemoglobiinin S-Sepharose -puhdistusta. E.
• · coli -solut (400 ml) kasvatettiin ODfinn-arvoon 3,0 ja indu- • · ; soitiin 1 mM IPTG:llä. Solujen annettiin jatkaa kasvuaan • » · 35 toiset 4 tuntia ja sitten kerättiin sentrifugoimalla. So- 82 107938
lupelletti suspendoitiin uudelleen 10 mM natriumfosfaat-tipuskuriin, pH 6,0, joka oli 1 mM bentsamidiinin, 1 mM EDTA:n ja 0,1 % Triton X-100:n suhteen. Sitten solususpen-sio sonikoitiin, sentrifugoitiin 15 000 x g 15 minuuttia 5 ja supernatantti ladattiin S-Sepharose-pylvääseen, joka oli tasapainotettu 10 mM natriumfosfaattipuskurilla, pH
6,0. Kun näyte oli ladattu pylvääseen, pylväs pestiin 10 patsaan tilavuudella 10 mM natriumfosfaattipuskuria, pH 6,8. Di-alfa-hemoglobiini eluoitiin pylväästä 10 mM nat-10 riumfosfaattipuskurilla, pH 7,4, joka oli 30 mM NaCl:n suhteen. Hemoglobiinin tuoton varmistus suoritettiin puhdistetun materiaalin näkyvän valon spektroskopialla, SDS-PAGE:lla ja Western-blottauksella.
Esimerkki 9 15 Matalan affiniteetin sisältävien di-alfa-mutantti- hemoglobiinien valmistus
Di-alfa-rekombinanttihemoglobiinin happiaffinitee-tin alentamiseksi beeta-globiinipolypeptideihin sisällytettiin useita mutaatioita käyttäen synteettisiä oligonuk-20 leotideja. Näiden mutanttien insertoimiseksi käytetyt res- , triktiokohdat esitetään taulukossa 3. Nagai- (beeta Vai • · · · .‘.j 67 -> Ile) ja Arg-Nagai- (myös beeta Lys 82 -» Arg) mutaa- • · .·♦·. tioiden insertoimiseksi des-Val-beeta-plasmidi pDL II-95a t···' digestoitiin Ncol- ja Kpnl-restriktioentsyymeillä ja puh- • · 25 distettiin geelissä. Oligonukleotidit, jotka ulottuivat näiden kahden restriktiokohdan yli ja sisälsivät sopivat • · '»··' kodonimuutokset, syntetisoitiin, puhdistettiin, hybridi- soitiin ja ligoitiin geelissä puhdistettuun plasmidiin.
*·’* Kun oli varmistettu oikean sekvenssin läsnäolo, des-Val- • · · '..,ί 30 beeta-mutanttihemoglobiinigeeni irrotettiin PstI- ja « ··. Hindlll-entsyymeillä, puhdistettiin geelissä ja kloonat- • · · ,···, tiin plasmidiin pDL III-47a. Beeta-globiinigeeni, joka • · *!* sisälsi Kansas-mutaation (beeta Asn 102 -♦ Thr), rakennet- • i i tiin samalla tavalla käyttäen Sacl- ja Spel-restriktiokoh- ·«« » · « t • · · 83 107938 -tia. Mutatoidut kodonit kaikille näille beeta-globiinimu-taatioille esitetään taulukossa 3 pienillä kirjaimilla. Esimerkki 10
Di-alfa-hemoglobiinien karakterisointi 5 Hapensitominen
Hapensitomismittaukset suoritettiin 37 °C:ssa He-mox-analysaattorissa (Southampton, PA). Liuokset olivat 50 mM bis-Tris, pH 7,4, 0,1 M NaCl ja 60 pM di-alfa-hemo-globiinin hemiekvivalenttia. Liuokset mitattiin 120 ja 1,5 10 torrin happipaineiden välillä. P50-arvot on annettu taulukossa 4.
Puoliintumisaika in vivo
Valmistettiin di-alfa-hemoglobiini (villityyppi), joka sisälsi gly-gly-linkkerin alfaan ja alfa2:n välissä, 15 kuten on aiemmin kuvattu. Proteiini formuloitiin 20 mM NaP04-puskuriin, pH 7,4 konsentraatioksi 95 mg/ml. Di-alfa-hemoglobiini infusoitiin koiraspuolisiin Sprague-Dawley-rottiin (388 - 426 g) annoksena, joka oli 875 mg/kg, kes-kuslaskimokatetrin välityksellä 20 - 30 sekunnissa. Veri-20 näytteet otettiin aikapisteinä 2, 30, 80, 90, 120, 150, • · !·ί ί 180, 210 ja 240 minuuttia heparinoituihin pulloihin. Veri « t .*·; sentrifugoitiin punaisten verisolujen poistamiseksi ja
Ml plasman hemoglobiini määritettiin mittaamalla absorbanssi • · · ’ : 540 nm:ssä. Jäljelle jääneen hemoglobiinin prosenttiosuus 25 ajan funktiona määritettiin vertaamalla 2 minuutin aika- ··· ·’**. pisteeseen, jonka oletettiin olevan homogeenisesti sekoit- ·»« tunut näyte. Sama koe toistettiin ei-yhteenliitetyllä des-vai-hemoglobiinilla konsentraationa 100 mg/ml. Tuloksista • ♦ otettiin keskiarvot kullekin näytteelle ja esitettiin *1* 30 graafisesti jäljelle jääneen hemoglobiinin prosenttiosuu-• · • ’·· tena infuusion jälkeisen ajan funktiona. Mitatut puoliin- ··· tumisajat olivat 205 minuuttia ja 104 minuuttia di-alfa- : [·, hemoglobiinille ja des-val-hemoglobiinille, vastaavassa • · · järjestyksessä.
• · ·· · 84 107938
Esimerkki 11 .···.
• #
Villityypin Des-Val-alfa-globiinin ja di-alfa-glo- .*!!.
♦ · t biinin yhteisekspressio Presbyterian-mutaation si- * • · · sältävän Des-Val-beeta-globiinin kanssa • 5 Plasmidi pSGE0.0-E4 on esitetty kuviossa 14 ja se sisältää seuraavat modifikaatiot verrattuna muihin plas- .··· * · midista pKK-223-3 peräisin oleviin ekspressiovektoreihin.
1) Plasmidi sisältää nyt toimivan tetrasykliinire- * sistenssigeenin.
• · 10 2) Plasmidiin on sisällytetty lacl-geeni, joka *···* • # φ koodittaa lac-repressoriproteiinia. Lac-repressoripro- φ · · teiini repressoi Tac-promoottoria, kunnes se indusoidaan • · · IPTGrllä. Repressorigeeni insertoitiin plasmidiin sellais- ·...· ten E. coli -solulinjojen transformaation sallimiseksi, - , # 15 joilla ei ole sisäisiä lac-repressorigeenejä. j j*i
Des-Val-beeta-globiinigeeni, joka sisältää Presbyterian-mutaation, rakennettiin insertoimalla komplementaarinen synteettisten oligonukleotidien pari plasmidin pSGEO.0-E4 SacI-Spel-restriktiokohtiin.
20 Seuraavia oligonukleotideja (Pres-A ja Pres-B) käy tettiin rakennettaessa Presbyterian-mutaatio dVal-beeta-globiiniin.
Pres-A 5’ CCACTGCGACAAACTGCACGTTGACCCGG (jatkuu alla) 25 Pres-B 3' TCGAGGTGACGCTGTTTGACGTGCAACTGGGCC (jatkuu alla)
Sad
Pres-A AAAACTTCCGTCTGCTGGGTaaaGTA 3'
Pres-B TTTTGAAGGCAGACGACCCAtttCATGATC 5’
Spel 30
Kun oli digestoitu kahdella restriktioentsyymillä, plasmidi puhdistettiin geelissä villityyppiä koodittavan DNA-fragmentin poistamiseksi. Sitten hybridisoidut oligo-nukleotidit ligoitiin plasmidiin. Kun oli transformoitu 35 JM109-solut, valittiin yksittäiset pesäkkeet ja analysoi- 85 107938 tiin alfa- ja beeta-globiinien tuoton suhteen IPTG-indu- ;***: • · « soinnilla ja SDS-PAGE: 11a. Dideoksisenvenssointia käytet- : • · · tiin varmistettaessa Presbyterian-mutaation läsnäolo.
• ·
Mutanttihemoglobiini tuotettiin, puhdistettiin ja *···' 5 analysoitiin, kuten on kuvattu esimerkissä 7 yllä. Saatiin **·.: seuraavat tulokset: .*** • · « · · • t
NÄYTE P50 N
A 4,03 2,7 · · 10 dV-hgb 7,04 2,8 • · dV-hgbPres 33,0 2,5 *···* • · • · • · · • · ·
On huomattava, että Presbyterian-mutaatio, joka • · johtaa beetan asparagiinin 108 muuttumiseksi lysiiniksi, 15 alentaa molekyylin affiniteettia hapelle 10-kertaisesti, : :** mutta ei vaikuta molekyylin yhteisvaikutukseen.
Presbyterian-mutaatiota on yhteisekspressoitu myös yhden glysiinilinkkerin sisältävän di-alfa-globiinin kanssa käyttäen plasmidia pSGEl.l-E4 (kuvio 15). Alla esitetyt 20 tulokset osoittavat, että alfal:n karboksipään liittämisellä alfa2:n aminopäähän ei ole mitään vaikutusta hapen-sitomiseen ja yhteisvaikutukseen.
NÄYTE P50 N
25 dV-hgbPres 33,0 2,5 di-alfa/Pres 33,0 2,4
Esimerkki 12
Kaks ipromoot tori systeemin rakentaminen di-alfa-glo-30 biinin ja beeta-globiinin yhteisekspressoimiseksi Tässä esimerkissä di-alfa-globiinigeeni on toiminnallisesti liitetty yhteen promoottoriin ja beeta-globii-nigeeni toiseen promoottoriin, mutta molemmat geenit sijaitsevat samassa vektorissa. Vertaa esimerkit 15 ja 17, 35 infra.
86 107938
Oligonukleotidit (katso alla), jotka koodittavat ,···§ • ·
Tac-promoottorin (syn pTAC) komplementaaristen juosteiden .*!!.
• · · sekvenssiä ja sopivia restriktioentsyymikohtia, synteti- ’ • « · soitiin, puhdistettiin geelissä ja hybridisoitiin. Huomaa, !tti! 5 että sekvenssikomplementaarisuus Xbal-kohdassa suunnitel- '·. : • « tiin niin, että se poisti tämän restriktiokohdan, kun se t··· « ·
ligoitiin autenttiseen Xbal-kohtaan. Tämä tehtiin syn pTAC
• · -sekvenssin tulevien käsittelyjen helpottamiseksi.
Syn pTAC -sekvenssi • ··
10 BamHI PstI
• · ·
5’ GATCCTGCAGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGG 3’ GACGTCTCGACAACTGTTAATTAGTAGCCGAGCATATTACACACC
• · · • · · • · ' • · • · ·
Xbal kömpi. ··.*: 15 AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAC 3' : TTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGGATC 5'
Plasmidi pDL III-47a (kuvio 13) digestoitiin BamHI-ja Xbal-restriktioentsyymeillä ja plasmidi, joka nyt si-20 sälsi inserttinä ainoastaan osan beeta-globiinigeenistä Xbal-kohdasta Hindlll-kohtaan (kuvio 13a), puhdistettiin geelissä.
Sitten syn pTAC-sekvenssi ligoitiin plasmidiin niin, että muodostettiin plasmidi pDL IV-64a ja transfor-25 moitiin JM109-solut. Yksittäiset transformantit eristettiin ja analysoitiin IPTG-indusoinnilla ja SDS-PAGE:lla toimivan Tac-promoottorin läsnäolon varmistamiseksi.
Plasmidi pDL III-47a digestoitiin PstI- ja Hindlll-restriktioentsyymeillä ja puhdistettiin geelissä beeta-30 globiinia koodattavien sekvenssien poistamiseksi. Plasmidi pDL IV-64a digestoitiin samoilla entsyymeillä ja syn pTAC/ beeta-sekvenssiä koodittava fragmentti puhdistettiin geelissä. Syn pTAC/beeta-fragmentin ligointi Pstl/Hindlll-entsyymeillä katkaistuun plasmidiin pDL III-47a muodosti 35 plasmidin pDL IV-67a (kuvio 16). Yksittäiset transforman- 87 107938 • · · tit seulottiin di-alfa- ja beeta-globiinin tuoton suhteen IPTG-indusoinnilla ja SDS-PAGE: 11a. ϊ.ί · •
Syn pTAC -sekvenssin säätelyn alaisena oleva dVal- .···.
• · beeta-globiinigeeni ligoitiin myös toiseen kohtaan plas- • · 5 midissa pDL III-47a. Syn pTAC/beeta -sekvenssi poistettiin • · · plasmidista pDL IV-62a digestoimalla Hindu- ja Pstl-ent- *...· syymeillä. Restriktiokohtien epätasaiset päät täytettiin ···!·
T4-polymeraasilla ja ligoitiin tasapäisinä plasmidin pDL
III-47a PvuII-kohtaan niin, että muodostettiin plasmidi j“*; • · · 10 pJR VI-54a (kuvio 17). IPTG-indusointi ja SDS-PAGE suori- .···.
• · · tettiin, kuten aiemmin on kuvattu. .···.
• ·
Indusointikokeiden tulokset SDS-PAGE :11a arvioitui- III
• · na osoittivat, että di-alfa- ja beeta-globiinien ekspres- .**1 sion säätely erillisillä promoottoreilla aiheutti pienen * • · · 15 kohoamisen kummankin proteiinin ekspressiossa. Samalla tavalla toisen beeta-globiinigeenin insertiolla erillisen promoottorin säätelyn alaisuuteen oli vähän vaikutusta proteiinien tuottoon.
Esimerkki 13 20 Hypoteettinen menetelmä toisen translationaalisesti liitetyn beeta-globiinigeenin insertoimiseksi dial f a/beeta- ekspres sioplasmidi in
Plasmidi pDL III-47a (kuvio 13) digestoidaan HindIII-ja PstI-entsyymeillä ja HindiII/PstI-fragmentti 25 puhdistetaan geelissä. Sitten restriktiokohtien epätasaiset päät täytetään T4-polymeraasilla. Sama plasmidi digestoidaan HindiII-entsyymillä ja päät täytetään T4-polyme-raasilla. Sitten beeta-globiinigeeni ligoidaan tasapäisenä plasmidiin (kuvio 18). Kun on transformoitu, yksittäiset 30 kloonit voidaan analysoida restriktioanalyysillä insertoi-dun beeta-globiinigeenin läsnäolon ja orientaation varmistamiseksi. IPTG-indusointia ja SDS-PAGE:a voidaan käyttää di-alfa- ja beetag-globiinien tuoton arvioimiseksi.
88 107938
Esimerkki 14 :: • · «
Hypoteettinen menetelmä di-beeta-globiinin ekspres- ; ;*· • · soimiseksi • · « ·
Di-beeta-globiinigeeni, joka on samanlainen yllä • ♦ · 5 kuvatun di-alfa-globiinigeenin kanssa, voidaan rakentaa /* • · · seuraavasti. Plasmidi pDL II-95a on plasmidi, joka sisäl- : .
tää des-val-beeta-globiinigeenin vektorissa pGEM-1 (Pro- mega Corp., Madison, WI). Plasmidi pDL II-95a digestoidaan
PstI- ja BspMII-restriktioentsyymeillä ja iso lineaarinen .···.
• * 10 DNA-sekvenssi eristetään puhdistamalla geelissä. Erillinen IV.
• · plasmidi pDL II-95a digestoidaan PstI- ja Nhel-restriktio- • · entsyymeillä ja puhdistetaan pieni Pstl-Nhel-fragmentti *···* • · geelissä. Oligonukleotidit, jotka koodittavat di-beeta- '···*
linkkeriä, joka sisältää beetaan C-pään aminohapot ja bee- : V
• · · · 15 ta2:n N-pään aminohapot liitettynä yhteen vaihtelevan pi-tuisella linkkeripeptidillä (katso esimerkki 15) syntetisoidaan, puhdistetaan geelissä ja hybridisoidaan, kuten on kuvattu aiemmin. Geneerinen sekvenssi sellaiselle oligo-nukleotidille, joka yhdistää beetaan C-pään histidiinin ja 20 beeta2:n N-pään valiinin, on seuraava:
Nhel
BspMII
His Vai 25 5’ CTAGCTCACAAATACCAC ( XXX )nGTTCACCTGACT 3' 3 ' GAGTGTTTATGGTG( XXX )nCAAGTGGACTGAGGCC 5 ' jossa "XXX" osoittaa sen aminohapon (niiden aminohappojen) kodonia (kodoneita), joka (jotka) liittää (liittävät) yh-30 teen kaksi beeta-globiinipeptidiä. Koska beeta-globiinin kaksi päätä ovat noin 18 A etäisyydellä toisistaan deoksi-tilassa, odotetaan että "n" voisi olla välillä 5-9. Yllä olevassa esimerkissä oligonukleotidi ulottuu Nhel-restrik-tiokohdan yli, beetaan karboksipään histidiinin yli, di-35 beetan luomiseen käytettävää aminohappolinkkeriä koodit- 89 107938 tavan vaihtelevan pituisen sekvenssin yli, beeta2:n amino- .···, • · pään valiinin yli ja beeta2-geenissä olevan BspMII-restrik- ♦ · * tiokohdan yli. ’ ···
Di-beeta-polypeptidiä koodittavan plasmidin raken- Σ..,Σ 5 tamiseksi ligoidaan fosforyloimaton di-beeta-linkkeri-DNA, **. : jossa on päissä Nhel- ja BspMII-restriktiokohdat, Pstl/ .··· • ♦
Nhel-fragmenttiin. Pstl-kohtien ligoitumisen tuloksena syntyneet dimeeriset muodot digestoidaan ligaation jälkeen Pstl-entsyymillä sellaisten fragmenttien muodostamiseksi, • · 10 jotka sisältävät ainoastaan Pstl- ja BspMlI-päät. Sitten *···* • ·· nämä fragmentit jatkokloonataan Pstl/BspMII-katkaistuun *...· ··· plasmidiin. Transformaation jälkeen kloonit, jotka sisäl- Σ...Σ ♦ · · tävät di-beeta-rakenteen, varmistetaan Pstl- ja Hindlll- : : restriktiofragmenttianalyysillä. Linkkerialue senvenssoi- ··.*; • · 15 daan ja sopivat rakenteet jatkokloonataan ekspressioplas- · ·*: midiin, joka sisältää joko di-alfa-globiinigeenin tai yhden alfa-globiinigeenin. E. coli transformoidaan tavalla, joka on kuvattu aiemmin ja testataan hemoglobiinin tuoton suhteen, kuten on kuvattu aiemmin.
20 Esimerkki 15
Hypoteettinen menetelmä linkkerien muodostamiseksi mutatoimalla ja selektoimalla Tässä hypoteettisessa esimerkissä linkkeri saadaan linkkeriä koodittavan DNA-sekvenssin mutatoinnilla ja toi-25 mivien linkkerien selektoimisella. Oligonukleotidit, jotka ulottuvat alfaan BstBI-kohdasta alfa2:n Eagl-kohtaan syntetisoidaan niin, että kuusi nukleotidia, jotka muodostavat suositeltavan glysiini-glysiinilinkkerin, satunnaistetaan. Satunnaistamalla nämä nukleotidit oligonukleotidi-30 seoksessa on läsnä kaikkien aminohappoyhdistelmien kodo-nit. Oligonukleotidien puhdistuksen ja hybridisaation jälkeen niitä käytetään rakennettaessa di-alfa/beeta-yhdis-telmäekspressiogeenit, kuten yllä on kuvattu.
Eri di-alfa/beetaplasmidit sisältävät kloonit seu-35 lotaan sitten kohonneiden rekombinanttihemoglobiinituot- 90 107938 totasojen suhteen käyttäen yhtiössä kehitettyä menetelmää. .***.
« · · E. coli -kloonit järjestetään nitroselluloosasuodattimil- j :·; • · · le, jotka on laitettu 2 x YT-ampisilliinimaljojen päälle, • · · jotka maljat sisältävät 1 mM IPTG:tä. Kun on inkuboitu yli '...* 5 yön 37 °C:ssa, maljat laitetaan muovipussiin, jossa ilma on korvattu hiilimonoksidilla (CO). CO:n sitoutuminen so- .*** • · • · · lunsisäiseen rekombinanttihemoglobiiniin tuottaa erotet- . .
····· tavan punaisen värin E. coli -pesäkkeisiin. Pesäkkeet, jotka tuottavat vahvimman punaisen värin, analysoidaan « · 10 edelleen. ***** • · · • ♦ Tässä kokeessa tehdään se oletus, että tietyt ami- '···' • · · nohappoyhdistelmät di-alfa-linkkerissä sallivat yksittäis- *...’ • · · ten liitettyjen alfa-globiiniketjujen stabiilimman laskos- • « tumisen ja siksi johtavat korkeampiin solun sisäisen re- ·*.: 15 kombinanttihemoglobiinin tuottotasoihin. Tämä kohonnut · ·*· » tuottotaso johtaa vahvempaan punaiseen väriin sopivissa E. coli -klooneissa.
Kun on selektoitu useita klooneja, jotka tuottavat korkeampia rekombinanttihemoglobiinin tasoja, yksityiskoh-20 taisempia analyysejä tehdään yksittäisillä klooneilla optimaalisen di-aminohappolinkkerin määrittämiseksi. Analyysit sisältävät tuotetun rekombinanttihemoglobiinin määrien, happiaffiniteetin ja proteiinin stabiilisuuden määrityksen. Lopuksi niiden kloonien, joiden havaitaan tuot-25 tavan paraslaatuisen rekombinanttihemoglobiinin, DNA sen-venssoidaan linkkerin muodostavien aminohappojen määrittämiseksi .
Esimerkki 16
Hypoteettinen menetelmä sellaisten plasmidien syn-30 tetisoimiseksi, jotka plasmidit sisältävät alfa- ja beeta-globiinigeenit kahden erillisen promoottorin säätelyn alaisena samassa plasmidissa
Ennakoidaan, että rekombinanttihemoglobiinia voidaan ekspressoida rakenteista, joissa eri globiinigeenit 35 ovat erillisten promoottorien säätelyn alaisuudessa. Tämä 91 107938 tilanne muodostaa kaksi erillistä mRNActa; toisessa on .···.
• « kaksikistroninen sekvenssi, joka koodittaa alfa-globiini- ; ;·; • ♦ · geeniä ja toisessa kaksikistroninen sekvenssi, joka koo- • ♦ * dittaa beeta-globiinigeeniä. Sellaisen ekspressiosysteemin *...· 5 rakentamiseksi, jossa sekä alfa- että beeta-globiinigeenit **·.· ovat erillisten promoottorien säätelyn alaisuudessa samas- .··· • · sa plasmidissa, täytyy aluksi käyttää seuraavaa menetelmää. Plasmidi pDL III-la, joka sisältää des-val-alfa-glo- biinigeenin, digestoidaan BamHI-restriktioentsyymillä, an- ...
• « 10 netaan reagoida bakteerin alkalisen fosfataasin kanssa, *·♦·* • · uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja suspendoidaan *···* ·♦· uudestaan TE-puskuriin. Plasmidi pJR IIII 50-a, joka on *...· ··· ekspressioplasmidi pKK, joka sisältää des-val-beeta-raken- « · teen, digestoidaan sitten BamHI- ja Pvul-restriktioentsyy-15 meillä Ptac-promoottorin, des-val-beeta-sekvenssin, trans- : ;** kription terminaatiosekvenssin ja osan ampisilliiniresis-tenssigeenistä sisältävän fragmentin irrottamiseksi plas-midista. Kun tämä fragmentti on puhdistettu geelissä, PvuI-BamHI-linkkeri syntetisoidaan ja ligoidaan insert-20 tiin. Sitten insertti katkaistaan uudestaan BamHI-entsyymillä, jotta saadaan muodostettua insertin 5'- ja 3'-päihin yhteensopivat BamHI-kohdat. Sitten tämä insertti kloonataan BamHI-entsyymillä linearisoituun plasmidiin pDL III-la, joka johtaa sellaisen plasmidin muodostumiseen, 25 jossa yhden Ptac-promoottorin säätelyn alaisuudessa oleva translationaalisesti liitetty des-val-beeta-globiinigeeni on sijoittunut erillisen Ptac-promoottorin säätelyn alaisuudessa olevan translationaalisesti liitetyn des-alfa-glo-biinigeenin 3'-puolelle. Restriktioentsyymikartoitusta 30 käytetään beeta-globiinin sisältävän insertin orientaation varmistamiseksi. E. coli JM109 -solut transformoidaan plasmidilla, joka sisältää erilliset Ptac-globiinirakenteet ja kasvatetaan alustassa, joka sisältää ampisilliinia plasmidin sisältävien kloonien eristämiseksi. Plasmidin 35 sisältävät kloonit indusoidaan sitten IPTG:llä ja des-val- 92 107938 alfa-globiinin, des-val-beeta-globiinin ja des-val-he-moglobiinin ekspressio testataan SDS-PAGE-analyysillä, Western-blottauksella käyttäen anti-hemoglobiinivasta-ai-neita ja eristämällä des-val-hemoglobiini standardeilla 5 kromatografisilla menetelmillä.
Vaihtoehtoisesti molempien globiinigeenien yhteis-ekspressio saavutetaan erillisissä vektoreissa olevista DNA-sekvensseistä, jotka ovat erillisten promoottorien säätelyn alaisuudessa.
10 Esimerkki 17
Hypoteettinen menetelmä sellaisten vektorien rakentamiseksi, jotka sisältävät alfa- ja beeta-globii-nigeenit erillisten promoottorien säätelyn alaisuudessa ja eri vektoreissa
15 E. coli -kloonit, jotka sisältävät plasmidin pDL
III-la, joka on pKK-223-3 plasmidi, joka sisältää kaksi-kistronisen syöttögeeni/des-val-alfa-rakenteen Ptac-promoottorin säätelyn alaisuudessa, transformoidaan plasmidilla, joka sisältää kaksikistronisen syöttögeeni/des-val-beeta-20 rakenteen saman promoottorin säätelyn alaisuudessa, mutta sellaisen geenin kanssa, joka muodostaa lisäantibiootti- • *♦ · .·. : resistenssin tetrasykliinille. Tämä voidaan rakentaa seu- • · • · t···' rasvalla tavalla: Plasmidi pJR IV-50a sisältää des-val- • > beeta-globiinigeenin Ptac-promoottorin säätelyn alaisuudes- • « 25 sa. Tämä plasmidi katkaistaan PvuII-entsyymillä sellaisen • · '···* lineaarisen plasmidin muodostamiseksi, jolla on tasaiset • * *···’ päät. Tämä ligoidaan fosforyloidun Notl-käsivarren (New
England Biolabs) kanssa. Ligaatioseosta käytetään trans- **"· formoitaessa E. coli. Sitten valmistetaan plasmidi-DNA ja • * · 30 plasmidit, jotka sisältävät NotI-kohdan, tunnistetaan di- j·. gestoimalla Not I-entsyymillä ja ajamalla agaroosigeeli- • · · *... elektroforeesi. Tämä plasmidi sisältää Ptac:des-val-beeta- ♦ · *1* globiinisekvenssin. Resistenssigeeni kanamysiiniantibioo- * * ;.· · tille on kaupallisesti saatavissa (Pharmacia) ja se sisäl- » · · 35 tää EcoRI-restriktiokohdat molemmissa päissään. Päät muu- 93 107938 tetaan tasaisiksi käsittelemällä T4 DNA -polymeraasilla menetelmän mukaisesti, jonka ovat kuvanneet Maniatis et ai. Tuloksena syntynyt fragmentti ligoidaan 50-kertaisen ylimäärän kanssa fosforyloitua Notl-käsivartta (25 °C, 60 5 minuuttia). Ligaatioreaktio tehdään 0,01 M EDTA:n suhteen, kuumennetaan 70 °C:seen 20 minuutiksi ja saostetaan etanolilla. Saostunut DNA liuotetaan 100 pl:aan Notl-puskuria ja käsitellään 100 uksiköllä NotI-entsyymiä (37 °C) 2 tuntia. Fragmentti puhdistetaan agaroosigeelielektroforee-10 silla. Notl-kohdat saanut kanamysiiniresistenssigeeni ligoidaan sitten Notl-entsyymillä linearisoituun pJR IV-50a -plasmidiin, jotta saadaan plasmidi, jossa on des-val-beeta-globiinigeeni Ptac-promoottorin säätelyn alaisuudessa ja kanamysiiniresistenssi. E. coli JM109 -kloonit, jotka 15 sisältävät plasmidin pDL III-la, joka sisältää des-val-alfa-globiinin Ptac-promoottorin säätelyn alaisuudessa ja ampisilliinresistenssin, transformoidaan kanamysiiniresis-tentin plasmidin kanssa, joka sisältää des-val-beeta-glo-biinigeenin ja kloonit selektoidaan sekä ampisilliini-20 että kanamysiiniresistenssin suhteen. Muita antibiootti-.·. resistenssigeenejä voidaan käyttää yhtä hyvin. Erillisten • •I # · promoottorien säätelyn alaisuudessa olevien alfa- ja bee- ·· ta-globiinipolypeptidien ekspressio analysoidaan sitten IPTG-indusoinnilla, SDS-PAGE:lla ja Western-blottauksella.
··* 25 Jos kohtaamme ongelmia plasmidin pysyvyydessä so- • « *♦··* lussa, voimme käyttää samaa strategiaa pIN-plasmidien *·> ·...* kanssa, joita on käytetty ekspressoitaessa polypeptidejä erillisistä plasmideista E. coli -bakteerissa (McNally et *:**: ai., PNAS 85, 7270, 1988).
·*’*; 30 Yksi mahdollinen ongelma, jonka voimme kohdata sei- » · · ./ laisia plasmideja rakennettaessa, joissa alfa- ja beeta- • »* *... globiinigeenit ovat erillisten, mutta samanlaisten pro- « · *** moottorien säätelyn alaisuudessa, on homologisen rekombi- • « j naation mahdollisuus plasmidien identtisten sekvenssien 35 välillä, esim. promoottorialueella. Tämä voi johtaa tär- 94 107938 keän DNA-sekvenssin osan deleetioon. Sen vuoksi on suositeltavaa käyttää erilaisia ei-homologisia promoottoreita kullekin eri globiinigeenille, esim. Ptac- ja Ptrc- tai lambda PL -promoottoria sopivassa isännässä (joka sisältää 5 cl857-geenin).
Esimerkki 18
Di-alfa-beeta-globiinirakenteen synteesi ja kokoaminen PL-säädellyssä vektorisysteemissä
Aiemmissa esimerkeissä globiinigeenit olivat Tac-10 promoottorin säätelyn alaisuudessa ja alfa- (tai di-alfa) ja beeta-globiinigeenit olivat kukin translationaalisesti liitetty ribosomin syöttökistroniin, kuten on esittänyt Schoner et ai. Tässä esimerkissä käytetään lambda PL -promoottoria ja erilaista translationaalista liitossekvenssiä 15 (katso alla).
Translationaalinen liitossekvenssi SD2 Met Sfi_ 5' AAT AAG GAG GAA TAA CAT ATG CTG TCT CCG GCC GAT (j atk. ) 20 3' TTA TTC CTC CTT ATT GTA TAC GAC AGA GGC CGG CTA (jatk. ) : Eagi AAG GCC CCA AGC TTG GGG 3' :***: TTC CGG GGT TCG AAC CCC 5'
Hindin
Ml ;··*; 25 .···. pL-ekspressiosysteemillä on erilainen translatio naalinen liitossekvenssi verrattuna pTac-systeemiin. Sek- . venssit, jotka koodattavat kahta SD-sekvenssiä ja trans- • · ... laation lopetuskodonia, lisättiin N-proteiinia kooditta- • · ···* 30 vien sekvenssien 3'-päähän toimimaan translationaalisena • · | liitossekvenssinä. Sen jälkeen olevat globiinia kooditta- vat sekvenssit ovat samanlaisia verrattuna pTac-systee- • · · . *. missä käytettyihin.
« « · ***.* Käyttäen pFL-lambdavektoria, joka on saatavissa « « '···* 35 Pharmacia'lta, koottiin plasmidirakenne, jota käytettiin 95 107938 muodostettaessa geneettisesti yhteenliitetty tetrameerinen ihmisen hemoglobiini (villityyppi) E. coli -kannoissa N99Ci+ ja N4830-1 (cl857). Nämä bakteerikannat saatiin
Pharmacia'lta ja ne voidaan indusoida lisäämällä naladik-5 siinihappoa (40 pg/ml) tai mitomysiini C:tä (10 pg/ml) silloin, kun läsnä on villityypin Ci+ repressoria, tai lämpökäsittelyllä sellaisella kannalla, joka sisältää cl857-repressorigeenin (Mott et ai., PNAS, 82, 88, 1985 ja Gottesmann, M.E. et ai., J. Mol. Biol., 140, 57, 1980).
10 Kaaviomainen esitys kloonausstrategiasta on esitetty kuviossa 19.
Eagl-kohdan poistaminen pPL-lambdavektorista Eagl-kohdan poistaminen pPL-lambdavektorista oli tarpeellista, jotta kyettiin kloonaamaan di-alfa-geenin 15 sekvenssi, koska molemmat alfa-rakennegeenit sisältävät
Eagl-kohdan, joka sijoittuu 6 emäsparia koodittavan sekvenssin sisäpuolelle. pPL-lambdavektori digestoitiin Eagl-entsyymillä ja päät täytettiin käyttäen T4 DNA polymeraa-sia. BamHI-käsivarsi (5' CCCGGATCCGGG 3') (Pharmacia) li-20 goitiin tasapäisenä EagI-entsyymillä digestoituun pPL- : lambdaplasmidiin standardeilla menetelmillä. Tämä poisti • » ·.*·: Eagl-kohdan halutusta rakenteesta. Tuloksena syntynyt seos • · · ϊ.,.ϊ digestoitiin EagI-entsyymillä sellaisten plasmidien pois- tamiseksi, jotka vielä sisälsivät Eagl-kohdan. E. coli :1: 25 N99C1+ -solut transformoitiin tuloksena syntyneellä plas- • · · midilla pPL-lambda-E. Kloonit, jotka sisälsivät halutun • · · plasmidin, tunnistettiin restriktiodigestioanalyysillä.
Synteettisen kotranslationaalisen liitossekvenssin • ·
... sisällyttäminen plasmidiin pPL-lambda-E
• · **· 30 Ennen globiinigeenien insertoimista vektoriin oli • · • *·· tarpeellista sisällyttää synteettinen translationaalinen :]**: liitossekvenssi plasmidin pPL-lambda-E Hpal-kohtaan. Tämä . tehtiin digestoimalla plasmidi pPL-lambda-E Hpal-entsyy- *“.* millä, jonka jälkeen suoritettiin tasapäisen kotranslatio- • ♦ » ♦ 35 naalisen liitossekvenssin ligaatio vektorin Hpal-kohtaan.
96 107938
Liitosskevenssin ligaatio tasaisiin päihin tuhosi Hpal-kohdan. Ligaatioseosta käsiteltiin Hpal-entsyymillä kaikkien jäljelle jääneiden Hpal-kohdan sisältävien plasmidien digestoimiseksi. E. coli N99Ci+ -solut transformoitiin tu-5 loksena syntyneellä reaktioseoksella. Kloonit seulottiin digestoimalla EcoRI- ja Hindlll-restriktioentsyymeillä sellaisten kloonien tunnistamiseksi, jotka sisälsivät ko-translationaalisen liitossekvenssin sopivassa orientaatiossa. Halutun orientaation sisältävässä plasmidissa ha-10 varttiin 522 emäsparin ja 4762 emäsparin pituiset DNA-fragmentit. Liitossekvenssin orientaation varmistamiseksi tuloksena syntynyt plasmidi senvenssoitiin käyttäen alu-ketta (5' CAATGGAAAGCAGCAAATCC 3'), joka on komplementaarinen sekvenssille, joka sijaitsee 30 emäsparia ylävir-15 taan translationaalisesta liitossekvenssistä. Haluttu plasmidi nimettiin plasmidiksi pPL-lambda-E+TC.
pPL-lambdan säätelyn alaisuudessa olevat des-val-alfa- ja beetageenit sisältävän ekspressioplasmidin rakentaminen 20 Des-val-alfa- ja beeta-globiinigeenit saatiin plas- j midista pDL III-14c digestoimalla Eagl- ja HindiII-entsyy- meillä, jonka jälkeen haluttu 942 emäsparin pituinen alue :***: puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Puhdistettu .*··. alfa- ja beeta-globiinigeenit sisältävä fragmentti kloo- • « ♦ .···, 25 nättiin Eagl- ja Hindlll-entsyymeillä katkaistuun plasmi- IV,' diin pPL-lambda-E+TC. Ligaatioseosta käytettiin E. coli N99Ci+ -solujen transformoimiseen ja kloonit seulottiin halutun plasmidin pPL-alfa/beeta läsnäolon suhteen EcoRI- (4758 ja 1468 emäsparia) ja PstI- ja Hindlll- (4005, 1775, ...* 30 520 emäsparia) entsyymeillä, jotka varmistivat haluttujen ·*·># restriktiokohtien läsnäolon. Lisävarmistus saatiin sek- .*··. venssoimalla yllä kuvatulla 20 emäsparin pituisella aluk- • · • · · keella, jolla varmistettiin kotranslationaalisen liitos- • ♦ ♦ ··· · sekvenssin ja des-val-alfa-globiinigeenin välissä oleva • · «
'...· 35 sekvenssi ja toisella alukkeella (5’ ACCCGGAAAACTTCCGTC
97 107938 3'), jolla varmistettiin des-val-beetan ja pPL-vektorin välissä oleva sekvenssi.
pPL-lambdan säätelyn alaisuudessa olevat di-alfa-ja beeta-globiinigeenit sisältävän ekspressioplas-5 midin rakentaminen RGV-ristilinkkeri, joka koodittaa alfa-globiinin karboksipään osaa liitettynä yhden glysiinijäännöksen välityksellä toisen alfa-globiiniketjun luonnolliseen amino-pään osaan, valmistettiin fosforyloimalla erikseen 5'-päät 10 oligonukleotideista 5' CGAAATAACGTGGTGTTCTGTCTGC 3' ja 3' TTTATGGCACCACAAGACAGACGCCGG 5’ T4-kinaasilla, jonka , jälkeen suoritettiin hybridisaatio. Tämä kaksijuosteinen oligonukleotidi kloonattiin puhdistetun des-val-alfa- ja beeta-globiinifragmentin Eagl-päähän, joka fragmentti oli 15 valmistettu plasmidista pDL III-14c digestoimalla se Eagl-ja Hindlll-entsyymeillä, kuten yllä on kuvattu. Tästä li-gaatiosta muodostunut lineaarinen DNA-sekvenssi, joka nyt sisälsi epätasaiset päät, jotka koodittivat BstBI- ja Hindlll-restriktiokohtien sekvenssejä, puhdistettiin aga-20 roosigeelielektroforeesilla ja kloonattiin BstBI- ja :.· · Hindlll-entsyymeillä digestoituun plasmidiin pPL-alfa/bee- • · ί/.i ta. Uusi plasmidi, joka nimettiin plasmidiksi pPL-dialfa/ beeta, sisälsi kotranslationaalisen liitossekvenssin ylä- virtaan sekvenssistä, joka sisälsi di-alfa-globiinin lii- .···. 25 tettynä glysiini jäännöksen välityksellä, jonka jälkeen • · · .··♦. seurasi kotranslationaalinen liitossekvenssi beeta-globii- • · nigeenisekvenssin vieressä, kaikki yhden PL-promoottorin . säätelyn alaisuudessa. Nämä kloonit tunnistettiin seuloin* maila pienimittakaavaisia plasmidipuhdistuksia digestoi- • · ·;·’ 30 maila Eagl-restriktioentsyymillä. Kloonit, joissa ei ollut :**.. toista alf a-globiinigeeniä, ainoastaan linearisoituivat digestiossa, kun taas kloonit, jotka sisälsivät toisen • · * , *, geenin, vapauttivat 431 emäsparin ja 6 222 emäsparin pi- « · · ••jj tuiset DNA-fragmentit.
φ · • · • · · 98 107938 ROP-replikaatio-origomutaation sisältävän ekspres-sioplasmidin pSGE0.1-L0 rakentaminen
Plasmidi pPL-dialfa/beeta digestoitiin PvuII-ent-syymillä ja käsiteltiin sitten T4 DNA -polymeraasilla epä-5 tasaisten päiden täyttämiseksi. Sitten linearisoitu plasmidi ligoitiin tasapäisenä Notl-käsivarren (Promega Corp., Madison, WI) (5' TTGCGGCCGCAA 3’) kanssa. Sitten ligaatio-seosta käsiteltiin PvuII-entsyymillä kaikkien jäljelle jääneiden PvuII-kohdan sisältävien plasmidien poistamisek-10 si. E. coli -solut transformoitiin plasmidilla pSGEO.l-LO ja positiiviset kloonit tunnistettiin yhden ainoan Notl-restriktiokohdan läsnäolon avulla.
Lambda Pt -promoottorin säätelyn alaisuudessa olevan hemoglobiini SGE0.1:n ekspressio E. coli -baktee-15 rissa E. coli N99C1+ ja E. coli N4830-1 transformoitiin plasmidilla pSGEO.l-LO ja kasvatettiin agarmaljoilla, jotka sisälsivät ampisilliinia, kuten on kuvattu aiemmin.
Nämä E. coli -kannat sisältävät cI+-repressorigeenin ja 20 lämpöherkän cI857-repressorigeenin, vastaavassa järjestyk- « « ··' ’ sessä.
« ·
Kannan N99Ci+ ymppi kasvatettiin 37 °C:ssa TB-alus- • * · tässä OD600-arvoon noin 1,0 ja indusoitiin naladiksiinih- apolla (40 yg/ml). Viljelmiä inkuboitiin 4-6 tuntia :***: 25 37 °C:ssa ennen kuin solut kerättiin. Hemoglobiini tuotto ~ • · · arvioitiin kokosoluproteiinin SDS-PAGE-analyysillä ja * · ·
Western-blottausanalyysillä. Näillä menetelmillä SGE0.1:tä .,,,· arvioitiin tuotettavan tasolla noin 0,02 % kokosolupro- • · ... teiinista tässä solulinjassa. Hemoglobiini (57 yg) eris- '!* 30 tettiin Mono-Q-kromatografiällä ja sen osoitettiin sisäl- • · : '·♦ tävän normaalin hemoglobiinin kaltaisen optisen spektrin.
Kannan N4830-1 ymppiä inkuboitiin 30 °C:ssa TB- ; *·. alustassa OD600-arvoon 1,0 ja indusoitiin lisäämällä riittä- • · · “1/ västi esilämmitettyä (65 °C) TB-alustaa niin, että ympin *” 35 lämpötila nousi 42 °C:seen. Sitten viljelmää inkuboitiin 99 107938 42 °C:ssa 4-6 tuntia. Kokosoluproteiinin analyysi SDS-PAGE:lla paljasti, että SGE0.1:tä syntetisoitiin tasolla 0,4 % kokosoluproteiinista, joka vastasi 0,18 mg proteiinia per gramma märkäsolutahnaa. SGE0.1 puhdistettiin 2 5 litran valmisteesta, kuten on kuvattu muualla, ja se johti 7,6 mg määrän eristykseen puhdasta materiaalia. SGE0.1 (7,6 mg) eristettiin ja sen P50-arvo oli 7,08 (Hemox-analy-saattori, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 37 °C) ja sillä oli luonnollista hemoglobiinia vastaava optinen spektri.
10 Esimerkki 19
Hemoglobiinin tuotto hiivassa
Kaikki restriktioentsyymit ja DNA:ta modifioivat entsyymit hankittiin BRL'stä, New England Biolabs'sta, IBI'sta, Pharmacia'lta tai Boehringer-Mannheim'lta. Käy-15 tetyt entsyymikonsentraatiot olivat valmistajan suosittelemia reaktiohin, joissa tapahtui täydellinen reaktio 30 minuutissa. Puskurit ja olosuhteet näiden entsyymien käyttämiseksi olivat entsyymien mukana tulleita ellei toisin ole mainittu. Plasmidi-DNA puhdistettiin E. coli-DH5alfa 20 -kannasta, kuten ovat kuvanneet Birnboim ja Doly (Nucleic :.i i Acids Research 1979, 7: 1513 - 1520). DNA:n elektroforee- • · sianalyysit suoritettiin agaroosigeeleissä käyttäen Tris- • · · ϊ,.,ϊ asetaatti-elektroforeesipuskuria (Maniatis et ai., Mole- ·**’: cular Cloning, Cold Spring Harbor, NY, 1982). DNA tehtiin ;***· 25 silminnähtäväksi värjäämällä geelit etidiumbromidilla, • · · .*··. jonka konsentraatio oli 0,5 pg/ml, ja valottamalla geelejä • · · ultraviolettivalossa. DNA-fragmentit puhdistettiin agaroo-sigeeleistä käyttäen käyttöpakkausta, joka hankittiin BIO- • · ... 101'stä. DNA-fragmentit puhdistettiin akryyliamidigeeleis- • · *;* 30 tä murskaamalla irrotettu haluttua DNA: ta sisältävä geeli- • · • *·· pala 3,25 M ammoniumasetaattiin ja inkuboimalla yli yön :***: 37 °C:ssa. Geelifragmentit poistettiin sentrifugoimalla «·· .*. (12 000 x g, 15 minuuttia) ja DNA saostettiin 2 tilavuu- • · · della liuosta, jossa oli 95 % etanolia ja 5 % isopropano- • · ***** 35 lia. Saostuma kuivattiin tyhjiössä ja liuotettiin 0,1 x 100 107938 TE-puskuriin (1 x TE on 10 raM Tris-HCl, pH 7,8, 1 mM Na3-EDTA). DNA: n akryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin, kuten ovat kuvanneet Maniatis et ai. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, NY, 1982) Tris-asetaatti-elektroforee-5 sipuskurissa. Bakterilogiset kasvualustat ja DNA:n trans-formaatiomenetelmät ovat kuvanneet R.W. Davis et ai. (Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980, sivut 140 - 141). S. cerevisiae -hiivan transformaatio lineaarisella tai rengasmaisella 10 DNA:11a suoritettiin, kuten ovat kuvanneet H. Ito et ai. [J. Bacteriology 153: 163-168 (1983)]. Transformantit se-lektoitiin SD-alustassa, josta puuttui urasiili tai tryp-tofaani (SD-ura, SD-trp) riippuen plasmidissa olevasta selektiomerkkigeenistä (F. Sherman et ai., Methods in 15 Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1979). Kaikki muut käytetyt hiiva-alustat ovat, kuten ovat kuvanneet Sherman et ai. (ibid.).
Galaktoosilla säädellyn promoottorin synteesi ja kokoaminen . 20 Tämä synteettinen promoottori sisältää kaksi toi- « · ··· : minnallista osaa, säätelevän sekvenssin ja sekvenssin, • « · *. “ joka sallii tehokkaan mRNA-synteesin aloituksen. Yksi va- • · · litsemistamme säätelyalueista sisältää nukleotidisekvens-sin, joka muodostaa positiivisen transkriptiosäätelyn ga-25 laktoosin läsnä ollessa (M. Johnston ja R. Davis, 1984. Molecular and Cellular Biology 4: 1440 - 1448; L. Guarente • · · et ai., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 79: 7410-7414).
Transkription aloituskohta on peräisin S. cerevisiae -hii-• · — .···. van glyserolialdehydi-3-fosfaattidehydrogenaasigeenin 30 (GAP491) (L. McAlister ja M.J. Holland, J. Biol. Chem.
• · • *·· 260: 15019 - 15027, 1983; J.P. Holland et al.,J. Biol.
Chem., 258: 5291 - 5299, 1983) konsensussekvenssistä.
: .·. Kuviossa 1 esitetyt synteettiset oligonukleotidit • · · syntetisoitiin Biosearch 8600 DNA -syntetisaattorilla.
* · 35 Kukin oligonukleotidi katkaistiin kantajapylväästään 28 % 101 107938 NH4OH:lla. Suojausryhmät poistettiin inkuboimalla katkaistua oligonukleotidia 28 % NH4OH:ssa 65 °C:ssa -» 16 tuntia. Kaikki oligonukleotidit puhdistettiin preparatiivisella polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 10 % akryyliamidi-5 levygeeleissä (19:1 akryyliamidi:bis-akryyliamidi), jotka sisälsivät 7 M ureaa. Oligonukleotidit eluoitiin akryyli-amidipaloista inkuboimalla (16 tuntia) 37 °C:ssa liuoksessa, joka oli 50 mM ammoniumasetaatti (pH 7,4), 2,5 mM mag-nesiumasetaatti, 0,25 mM EDTA ja 0,25 % SDS. Akryyliamidi-10 fragmentit poistettiin sentrifugoimalla (14 000 x g, 10 minuuttia) ja oligonukleotidi saostettiin vesifaasista lisäämällä NaCl:ia loppukonsentraatioksi 0,25 M ja 3 tilavuutta 100-%:ista etanolia. Saostetut oligonukleotidit kerättiin sentrifugoimalla (14 000 x g, 30 minuuttia), pes-15 tiin kahdesti 80-%:isella etanolilla, kerran 100-%:isella etanolilla ja pelletit kuivattiin. Pelletit liuotettiin 0,1 x TE-puskuriin. 2 x 10"10 moolia (kutakin) oligonuk-leotideja 1-5 (taulukko 5) fosforyloitiin 0,02 ml:ssa liuosta, joka oli 0,066 M Tris-HCl (pH 7,6), 0,01 M MgCl2, 20 0,002 M ditiotreitoli (DTT), 0,001 M spermidiini ja jossa • J : oli 10 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia. Fosforylaatio- reaktiot suoritettiin 37 °C:ssa 30 minuuttia ja lopetet- • · .***. tiin kuumentamalla 96 °C:seen 5 minuutiksi. 2 x 10'10 moo- * · • · · .···. lia oligonukleotideja 1-6 (taulukko 5) lisättiin fosfo- .···. 25 ryloituihin oligonukleotideihin lopullisessa tilavuudessa « · 0,04 ml liuoksessa, joka oli 0,07 M Tris-HCl (pH 7,6), • · *’* 0,01 M MgCl2. Oligonukleotidien 1-6 (taulukko 5) seosta kuumennettiin 96 °C:ssa 5 minuuttia, 75 °C:ssa 20 minuut-tia, 55 eC:ssa 30 minuuttia, 37 °C:ssa 60 minuuttia ja • · · *...: 30 25 °C:ssa 15 minuuttia. T4 DNA -ligaasia (10 yksikköä), DTT:tä (lopullinen konsentraatio 0,002 M) ja ATP:tä .···. (0,001 M) lisättiin ja seosta inkuboitiin 4 °C:ssa 16 tun- « · • · · • tia. Tuloksena syntyneet 210 emäsparin pituiset oligonuk- t . · ··’ J leotidit sisälsivät 5’-pään, joka oli yhteensopiva Sali- M· 35 restriktioendonukleaasin kohdan kanssa ja 3'-pään, joka 102 107938 oli yhteensopiva Xbal-kohdan kanssa. Koska oligonukleoti-dit, jotka sisälsivät intaktin oligonukleotidin kaksi päätä, ei oltu fosforyloitu, ne eivät voineet ligoitua toisiinsa. Tämä oligonukleotidi kloonattiin vektoriin pSK+ 5 (Stratagene, Inc.) (kuvio 21a), joka oli digestoitu Xbal-ja Sali-entsyymeillä. Ligaatioseos sisälsi 50 ng Xbal- ja Sali-entsyymeillä digestoitua vektoria pSK(+) ja 5 piko-moolia ligoitua oligonukleotidia 0,01 ml:n tilavuudessa. E. coli DHSalfa -solut transformoitiin osalla ligaatio-10 reaktiota ja kloonit, jotka sisälsivät insertit, tunnistettiin seulomalla valkoiset pesäkkeet LB-ampisilliini-agarmaljoilla (0,15 mg/ml), joihin oli lisätty X-gal:ia (4 pg/ml). Positiivinen tunnistus suoritettiin valmistamalla DNA näistä eritetyistä pesäkkeistä ja digestoimalla 15 Xbal- ja Sali-entsyymeillä. Restriktiodigestit analysoitiin ajamalla agaroosigeelielektroforeesi ja tunnistettiin kolme kloonia, jotka sisälsivät odotetun kokoisen (noin 250 emäsparia) fragmentin. Kaikkien kolmen kloonin DNA-sekvenssi määritettiin ja yksi valittiin käytettäväksi 20 edelleen ja sille annettiin nimi pGS2488 (kuvio 21a).
: Synteettisen galaktoosin ylävirran aktivaattorisek- • · ’/·· venssin (GAL^) kokoaminen
Taulukossa 6 esitetyt oligonukleotidit syntetisoi- }*”; tiin ja puhdistettiin, kuten yllä on kuvattu. Oligonukleo- ··· .***. 25 tidit 2-5 fosforyloitiin, hybridisoitiin oligonukleoti-• · · .*··. dien 1-6 kanssa ja ligoitiin, kuten on kuvattu GAP:n • · kokoamisen yhteydessä. Tällä menetelmällä muodostetulla . täysipitkällä oligonukleotidilla on fosforyloimattomat • · ... päät, jotka ovat yhteensopivia Sphl- ja Sall-restriktio- • · ···* 30 entsyymien muodostamien kohtien kanssa. Kun oligonukleoti-i di ligoidaan Sali-kohtaan, tuloksena syntynyt kahden frag- :***; mentin yhtymiskohta ei kuitenkaan enää sisällä katkaista- 4|« . *. vissa olevaa Sali-kohtaa.
• · » *“.* GALUÄS"sekvenssi sisältyy SphI-Sall-fragmenttiin.
• · ’···’ 35 Tämän fragmentin kloonaaminen plasmidiin pGS2488 vaati, 103 107938
että muutimme tämän plasmidin Kpnl-kohdan Sphl-kohdaksi. Plasmidia pGS2488 modifioitiin katkaisemalla se Kpnl-ent-syymillä. Kpnl-entsyymillä digestoitua plasmidia inkuboi-tiin niin, että läsnä oli 2 yksikköä T4-polymeraasia 0,05 5 ml:ssa puskuria, joka oli 50 pM kunkin deoksiribonukleoti-ditrifosfaatin (A, G, C, T), 0,033 M Tris-asetaatin (pH
7,9), 0,066 M kaliumasetaatin, 0,01 M magnesiumasetaatin, 0,5 mM DTT:n suhteen ja jossa oli 100 pg naudan seerumial-bumiinia (BSA)/ml. Na3EDTA:ta lisättiin konsentraatioksi 10 0,015 M ja seos uutettiin kerran fenoli-kloroformilla. DNA
seostettiin etanolilla. Kuiva pelletti liuotettiin 0,008 ml:aan T4 DNA -ligaasipuskuria, jossa oli 50 ng fosfory-loituja SphI-käsivarsia (New England Biolabs) ja 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Seosta inkuboitiin 1 tunti 25 °C:ssa 15 ja sitä käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Plasmidi-DNA valmistettiin 12 transformantista ja testattiin restriktioentsyymidigestiolla ja agaroosigeeli-elektroforeesilla SphI-kohdan läsnäolon ja Kpnl-kohdan poissaolon suhteen. Sellainen klooni, jolla oli nämä omi-20 naisuudet sisältävä plasmidi, tunnistettiin ja plasmidi J.i : nimettiin plasmidiksi pGS2888 (kuvio 21b).
• · *.**: Tämän hybridipromoottorin rakentamisen seuraava • · · vaihe oli GALUÄS-sekvenssin sisältävän Sphl-Sali-fragmentin kloonaaminen plasmidiin pGS2888. Plasmidi pGS2888 diges- ·*“: 25 toitiin Sphl- ja Sali-entsyymeillä, uutettiin fenoli-klo-• · · roformilla ja saostettiin etanolilla. 50 ng Sphl- ja Sali- • · · entsyymeillä digestoitua plasmidia pGS2888 inkuboitiin niin, että läsnä oli 25 ng hybridisoitua, ligoitua GALUÄS- • · ... seosta 0,005 ml:ssa 1 x ligaasipuskuria, joka sisälsi 10 *;* 30 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Ligaatioseosta inkuboitiin yli ·· | *·· yön 4 °C:ssa ja osaa käytettiin transformoitaessa E. coli : J DH5alfa -solut. Ampisilliiniresistentit kloonit eristet- . tiin ja valmistettiin plasmidi-DNA. Plasmidi-DNA (diges- • · ♦ ***.* toitiin Xbal- ja SpHi-entsyymeillä) analysoitiin agaroosi- • · • · *·' 35 geelielektroforeesilla. Plasmidi, joka sisälsi odotetun 104 107938 kokoisen fragmentin (noin 500 emäsparia), tunnistettiin.
Tämän plasmidin mahdollisen GALUÄS-sekvenssin sisältävän osan sekvenssi määritettiin ja plasmidi nimettiin plasmi-diksi pGS4788 (kuvio 21b). Synteettisen GAL-GAP-promootto-5 rin (pGGAP) täydellinen sekvenssi on esitetty kuviossa 20.
pGGAP-beeta-globiinin ekspressiokasetin rakentaminen
Plasmidia pLCHFX-beeta-globiini (K. Nagai, M.
Perutz ja C. Payart, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82: 10 7252 - 7255) käytettiin ihmisen beeta-globiinin cDNArn lähteenä. Beeta-globiinin cDNA:n koodittava alue voidaan irrottaa ApaLI-Hindlll-fragmenttina, josta puuttuu ainoas- _ taan ensimmäiset neljä nukleotidia beeta-globiinin koodattavalta (transloitavalta) alueelta. Plasmidi pLCFX-beeta-15 globiini (5 pg) digestoitiin ApaLI- ja Hindlll-entsyymeillä ja 550 emäsparin pituinen fragmentti, joka sisälsi cDNA:n, puhdistettiin akryyliamidigeelielektroforeesilla. Beeta-globiinin cDNA:n sisältävä ApaLI-Hindlll-fragmentti kloonattiin Xbal- ja HindiII-entsyymeillä digestoituun . 20 pUCl9-vektoriin käyttäen seuraavaa adaptorisekvenssiä I · *)· ) (syntetisoitiin ja puhdistettiin, kuten yllä on kuvattu): • · · • · • · • · ·
Xbal Ncol ApaLI
• · · YHla/b5 ' -CTAGAACCATGG 25 TTGGTACCACGT-5 ' • · · ·** • · ♦ · • · ·
Kaksi oligonukleotidia sekoitettiin (12,6 pg kum- paakin), lisättiin NaCl:ia konsentraatioksi 0,25 M ja li- .···. sättiin kolme tilavuutta etanolia (vedetöntä). Saostetut 30 oligonukleotidit kerättiin sentrifugoimalla (14 000 x g, : ’* 15 minuuttia) ja pelletti pestiin kahdesti 80-%:isella ··· etanolilla, kerran vedettömällä etanolilla ja kuivattiin « : tyhjiössä. Adaptorisekvenssit liuotettiin 1 ml:aan 0,1 x • · · • · · · ,···. TE-puskuria. 50 ng beeta-globiinin cDNA:ta sisältävää • · 35 Xbal-HindiII-fragmenttia ja 12,5 ng etanolisaostettua 105 107938 (fosforyloimatonta) YHla,b-oligonukleotidia ligoitiin 0,010 ml:ssa T4 DNA ligaasi-puskuria, joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Ligaatioseosta inkuboitiin 4 °C:ssa 16 tuntia ja osaa käytettiin transformoitaessa E. 5 coli DH5alfa -solut. Transformantit selektoitiin LB-ampi-silliinimaljoilla, jotka sisälsivät 4 pg X-gal:ia/ml. Plasmidi-DNA valmistettiin 12 valkoisesta pesäkkeestä. DNA digestoitiin Ncol- tai ApaLI-entsyymeillä ja analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Neljä näistä pesäkkeistä 10 sisälsi plasmidit, joilla oli odotetut restriktiofragmen-tit ja yksi nimettiin plasmidiksi pUC19beeta-globiini (ku-vio 21a). Plasmidi pSUC2-6sigma [G. Stetler et ai., Biotechnology 7: 55 - 60 (1989)] (kuvio 21a) digestoitiin
HindHI- ja Xbal-entsyymeillä ja suuri fragmentti puhdis-15 tettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Beeta-globiinin cDNA:n sisältävä Xbal-HindiII-fragmentti puhdistettiin myös (agaroosigeelielektroforeesi) plasmidista pUC19beeta-globiini. 10 ng geelissä puhdistettua Xbal- ja Hindlll-entsyymeillä digestoitua plasmidia pSUC2-6sigma sekoitet-20 tiin 16 ng kanssa plasmidista pUC19beeta-globiini peräisin : olevaa Xbal-Hindlll-fragmenttia 0,01 ml:ssa ligaasipusku- • · V*: ria, joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Ligaatio- »i · seosta inkuboitiin 25 °C:ssa 1 tunti ja osaa käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Transformantit :**’· 25 selektoitiin LB-ampisilliinialustalla ja kolmea käytettiin
IM
plasmidi-DNA:n valmistuksessa. Nämä analysoitiin digestoi- • · t maila EcoRI-entsyymillä ja analysoitiin agaroosigeelielek-troforeesilla. Kaksi näistä sisälsi plasmidit, joilla oli • · ... odotetut restriktiofragmentit ja yksi nimettiin plasmidik- • · *;* 30 si pGS1188 (kuvio 21b). Tämä plasmidi sisältää beeta-glo-• · j *·· biinin sigma-promoottorin transkriptiosäätelyn alaisuudes- :*]*: sa ja sisältää MFalfal-geenin 3’-puoleiset transkription . ^ terminaatiosignaalit ja polyadenylaatiosignaalit.
» · · *1*.’ Sigma-promoottorin korvaaminen pGGAP-sekvenssillä ·**' 35 Plasmidi pGS1188 digestoitiin Sphl- ja Ncol-entsyy- meillä ja vektori ja beeta-globiinin cDNA erotettiin sig- 106 107938 ma-promoottorista agaroosigeelielektroforeesilla ja puhdistettiin, kuten on kuvattu aiemmin. Plasmidi pGS4788 (10 pg) digestoitiin myös Sphl- ja Ncol-entsyymeillä ja tämän digestion tuottama noin 500 emäsparin fragmentti 5 (sisältää pGGAP-sekvenssin) puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. 50 ng geelissä puhdistettua beeta-glo-biinin sisältävää vektoria inkuboitiin 50 ng kanssa Ncol-Sphl-fragmenttia, joka sisälsi pGGAP-promoottorin, 0,01 ml:ssa 1 x ligaasipuskuria, jossa oli 10 yksikköä T4 DNA 10 -ligaasia. Seosta inkuboitiin 1 tunti 25 °C:ssa ja osaa ligaatioseoksesta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Selektoitiin ampisilliiniresistentit kloonit. 12 näistä klooneista eristetty plasmidi-DNA analysoitiin digestoimalla Sphl- ja Ncol-entsyymeillä sellaisten 15 plasmidien tunnistamiseksi, jotka sisältävät noin 500 emäsparin GGAP-promoottorin. Beeta-globiinin cDNA:n läsnäolo varmistettiin digestoimalla Xbal- ja Sali-entsyymeillä, jonka jälkeen suoritettiin agaroosigeelielektroforee-sianalyysi. Plasmidi, joka sisälsi odotetut fragmentit, 20 tunnistettiin ja nimettiin plasmidiksi pGS3588 (kuvio ; 21b). Tämän fragmentin j atkokloonauksen helpottamiseksi • · '•/•l hiivavektoriin, plasmidin pGS3588 Smal-kohta muutettiin
Xhol-kohdaksi seuraavasti: 1 pg plasmidia pGS3588 diges- • · · ·'**; toitiin Smal-entsyymillä, digest! uutettiin kerran fenoli- ··· .·*·. 25 kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Seostettu DNA ~ • · ♦ .···. liuotettiin T4 DNA -ligaasipuskuriin yhdessä 100 ng kans- • · sa fosforyloitua Xhol-linkkeriä ja 10 yksikön kanssa T4 . DNA -ligaasia (lopullinen tilavuus 0,01 ml). Ligaatiota inkuboitiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia ja osaa ligaatio- • · ···* 30 seoksesta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa j*·.. -solut (ylimääräisiä linkkereitä ei poistettu ennen trans- ·***: formaatiota). Eristettiin ampisilliiniresistentit kloonit ·♦· .ja valmistettiin plasmidi-DNA. Plasmidit, jotka sisälsivät • · · • · · ***/ Xhol-lisäkohdan, tunnistettiin digestoimalla Xhol-entsyy- • · *···* 35 millä ja agaroosigeelielektroforeesianalyysillä. Plasmidi, 107 107938 joka sisälsi pGGAP-beeta-globiinin ekspressiokasetin, tunnistettiin ja nimettiin plasmidiksi pGS3888 (kuvio 21b). Alfa-globiinin ekspressiokasetin rakentaminen Saimme ei-täyspitkän cDNA-kloonin (p-alfa-MRC) K. 5 Nagai'lta (MRC, Cambridge). Alfa-globiinia koodittavan cDNAzn muuttamiseksi niin, että se voitiin ekspressoida pGGAP-promoottorista, syntetisoitiin kaksi oligonukleoti-dialuketta (oligonukleotidien synteesi ja puhdistus suoritettiin, kuten yllä on kuvattu).
10 aifa-1: 5'-GAATTCCATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACC3'.
_ alfa-2: 5'-CTGCAGTCGACTTAACGGTATTTGGAGGTCAGCACGGTGCT-3’.
Näitä kahta oligonukleotidia käytettiin alukkeina 15 polymeraasiketjureaktiossa (PCR) (R.K. Sakai et ai., 1985, Science 230: 1350 - 1354) käyttäen Perkin Elmer-Cetus PCR -käyttöpakkausta ja plasmidia p-alfa-MRC templaattina. Alfa-globiinin cDNA (8,3 pg/ml), joka oli 0,018 ml:ssa H20:ta, denaturoitiin lisäämällä 0,005 ml 10 M NaOHria. 20 Seosta inkuboitiin 25 °C:ssa 5 minuuttia. Denaturoitu DNA
• »
!#i ! seostettiin lisäämällä 0,003 ml 3 M natriumasetaattia (pH
• · 5,2) ja 0,075 ml vedetöntä etanolia. Seostettu DNA pestiin ··· kahdesti 80-%:isella etanolilla, kerran 100-%:isella eta- ·***: nolilla ja kuivattiin. Kuivattu pelletti liuotettiin :***: 25 liuokseen, jossa oli 0,005 ml 20 μΜ oligonukloeotidia ai-·*· .*··. fa-1, 0,005 ml 20 μΜ oligonukleotidia alfa-2, 0,010 ml «·· 10 x Taq polymeraasipuskuria (Perkin Elmer-Cetus), 0,0005 ml Taql polymeraasia (Perkin Elmer-Cetus), 0,663 ml H20:ta, • · ... 0,016 ml kaikkia neljää deoksiribonukleotiditrifosfaattia • · *;· 30 (kukin 1,25 mM). Kun liuosta oli kuumennettu 94 °C:ssa 1 ·· • *·· minuutti, lisättiin Taql polymeraasia. Kun entsyymi oli lisätty, vesipohjaisen liuoksen päälle lisättiin 0,100 ml ; \# paraffiiniöljyä. Reaktioseoksella tehtiin käsin 25 sykliä • * * “!.* seuraavissa lämpötiloissa: 37 °C, 2 minuuttia, 68,5 °C, 3 • « *·** 35 minuuttia ja 94 °C, 1 minuutti. 25:nnen syklin jälkeen 108 107938 reaktioseosta inkuboitiin 37 °C:ssa 2 minuuttia ja 68,5 °C:ssa 10 minuuttia. Osa (0,005 ml) reaktioseoksesta analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla ja se paljasti odotetun kokoisen (noin 430 emäsparia) rintaman. PCR:llä 5 amplifioidun DNA-fragmentin tulee sisältää 5'-puoleisen pidennyksen, joka sisältää ATG-kodonin translaation aloitukselle optimaalisen sekvenssirungon sisällä (M. Kozack, 1986, Cell, 44: 283 - 292). 3'-pään tulee sisältää pidennyksen, joka sisältää translaation lopetuskodonin ja Sall-10 restriktioendonukleaasikohdan. PCR-amplifikaatioreaktio uutettiin fenoli-kloroformilla ja saostettiin etanolilla.
Kuiva pelletti liuotettiin 0,05 ml:aan 1 mM Tris-HCl-pus-kuria (pH 7,8). Osa tästä materiaalista (0,025 ml, 1,25 pg) digestoitiin Ncol- ja Sali-entsyymeillä ja puhdistet-15 tiin akryyliamidigeelielektroforeesilla (5 %). Geelipala, joka sisälsi fragmentin, eluoitiin murskaamalla geelipala 0,3 ml: aan 2,5 M ammoniumasetaattia (pH 7,4) ja inkuboi-malla sitä 37 °C:ssa 16 tuntia. Akryyliamidifragmentit poistettiin sentrifugoimalla ja DNA saostettiin lisäämällä 20 0,75 ml etanolia. Pelletti kerättiin ja liuotettiin 0,020 • ·
··1 2 · ml: aan 1 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,8), joka oli 0,1 mM
• · EDTA:n suhteen. Tämä fragmentti kloonattiin Ncol- ja Sali- ··· ·...· entsyymeillä digestoituun ja agaroosigeelissä puhdistet- ··· tuun plasmidiin pGS3888. 50 ng Ncol- ja Sall-entsyymeil-25 lä digestoitua plasmidia pGS3888 inkuboitiin (2 tuntia, - ·3; 25 °C) 50 ng kanssa geelissä puhdistettua PCR:llä ampli-
«M
fioitua NcoI-Sall-fragmenttia, joka sisälsi alfa-globiinin ....· cDNA:n, 0,01 ml:ssa ligaasipuskuria, jossa oli 10 yksikköä • » e...# T4 DNA -ligaasia. Osaa tästä reaktioseoksesta käytettiin » *!1 30 transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut ja ampisilliini- ·· • 1·· resistentit kloonit selektoitiin LB-ampisilliinialustalla.
• ♦ ·
Plasmidi-DNA valmistettiin 12 yksittäisestä eristetystä 1·. pesäkkeestä ja digestoitiin Ncol- ja Sali-entsyymeillä.
• t · 2 "1/ Restriktiodigestiot analysoitiin akryyliamidigeelielektro- 3 • · 35 foreesissa (5 %), kaikki 12 sisälsivät odotetun kokoisen 109 107938 fragmentin. Yksi näistä nimettiin plasmidiksi pGS4088 (kuvio 22). Plasmidin pGS4088 alfa-globiini-insertti sekvens-soitiin täydellisesti sen varmistamiseksi, ettei PCR-amp-lifikaatio ollut muodostanut yhtään mutaatioita.
5 Hiivan ekspressioplasmidin, joka yhteisekspressoi alfa- ja beeta-globiinigeenejä yhdestä plasmidista, rakentaminen
Plasmidien pGS3888 ja pGS4088 alfa-globiinin ja beeta-globiinin ekspressiokasetit kloonattiin yhteen plas-10 midiin sellaisella tavalla, joka sallii niiden irrottamisen yhtenä NotI-fragmenttina. Tämä NotI-fragmentti kloonattiin sitten korkean kopioluvun omaavaan hiivan plasmi-diin pCIN niin, että muodostettiin plasmidi, joka sisälsi ja ekspressoi sekä alfa- että beeta-globiiniketjuja, jotka 15 olivat erillisten (vaikkakin identtisten) promoottorien säätelyn alaisuudessa. Yksityiskohdat on esitetty alla. Notl-kohdan muodostaminen plasmidiin pSK(+) Plasmidia pSK(+) (Stratagene, Inc.) (kuvio 23a) modifioitiin digestoimalla 100 ng puhdistettua plasmidi- . 20 DNA:ta Kpnl-entsyymillä. Kun digestio oli täydellinen, DNA • · •j* · saostettiin etanolilla ja kuiva pelletti liuotettiin 0,05 » · · *ϊ ml:aan T4 DNA -polymeraasipuskuria, joka sisälsi 10 yk- • Il sikköä T4 DNA -polymeraasia. Reaktioseosta inkuboitiin tmi 37 eC:ssa 20 minuuttia, lisättiin Na3EDTA:a (10 mM) ja näy-
:^*Σ 25 tettä kuumennettiin 70 °C:ssa 10 minuuttia. Digestoitu DNA
:***: saostettiin etanolilla ja kuiva pelletti liuotettiin 0,01 ··· ml:aan 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,8), joka oli 1 mM EDTA:n suhteen. Osa tästä materiaalista (20 pg) liuotet- « · ,···, tiin 0,005 ml:aan ligaasipuskuria, joka sisälsi 10 yksik- ’!* 30 köä T4 DNA -ligaasia ja 50 ng fosforyloituja Notl-linkke- ·· : *·· reitä. Ligaatioseosta inkuboitiin 25 °C:ssa 2 tuntia ja ··· osaa käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut.
• ,·, Ampisilliiniresistentit pesäkkeet selektoitiin LB-ampisil- • · · "·/ liinialustalla. Plasmidi-DNA eristettiin, digestoitiin • · 35 NotI-entsyymillä ja analysoitiin akryyliamidigeelielektro- 110 107938 foreesilla (5 %). Plasmidin, joka sisälsi Notl-lisäkohdan, odotettiin muodostavan uuden noin 90 emäsparin pituisen fragmentin. Sellainen plasmidi tunnistettiin ja nimettiin plasmidiksi pSN(+) (kuvio 23a).
5 pGGAP-alfa-globiinin ekspressiokasetin kloonaus plasmidiin pSN(+)
Plasmidi pSN(+) digestoitiin Sali-entsyymillä, uutettiin fenoli-kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Seostettu DNA liuotettiin (50 pg/ml) 1 mM Tris-HCl-pusku-10 riin (pH 7,8), joka oli 0,1 mM EDTA:n suhteen. Plasmidi pGS4088 digestoitiin XhoI-entsyymillä ja noin 1 100 emäs-parin pituinen fragmentti, joka sisälsi alfa-globiinin , ekspressiokasetin, eristettiin agaroosigeelistä. Puhdistettu fragmentti liuotettiin (20 pg/ml) 0,1 x TE-pusku-15 riin. 25 ng Sali-entsyymillä digestoitua plasmidia pSN(+) sekoitettiin 50 ng kanssa geelissä puhdistettua alfa-glo-biinifragmenttia 0,01 ml:ssa ligaasipuskuria, joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Ligaatioseosta inkuboitiin 1,5 tuntia 25 °C:ssa ja osaa käytettiin transformoitaessa 20 E. coli DH5alfa -solut. Eristettiin ampisilliiniresisten- * · :·: · tit kloonit. 100 transformanttia siirrettiin ruutumuotoon • · ·. *i tuoreille maljoille. Ruuduista tehtiin kopiot nitrosellu- • · · ·...· loosasuodattimelle pesäkehybridisaatiota varten (R.W.
• · ·
Davis et ai., Adv. Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, 25 NY, 1980). Hybridisaatiokoetin oli oligonukleotidi 4 (tau- ~ • ♦ · :1. lukko 6). Tämä oligonukleotidi (20 pM) leimattiin 32P- • · · ATPrllä 0,02 ml:ssa reaktioseosta, joka oli 0,050 M Tris-HC1 (pH 7,6), 0,01 M MgCl2, 0,005 M DTT, 0,0001 M spermi- • · ^...^ diini, 0,0001 M EDTA, 50 pM 32P-ATP ja jossa oli 10 yksik- *** 30 köä T4 -polynukleotidikinaasia. Reaktioseosta inkuboitiin • *·· 2 tuntia 37 °C:ssa, inkorporoitumaton ATP poistettiin • · · sentrifugipylväskromatografiällä (BIORAD) käyttäen val- ; [·. mistajan ohjeita. Suodattimia inkuboitiin (37 °C) hybri- • · · *!!.* disaatioliuoksessa (6 c SSC, 50 % formamidi, 2 % SDS, 20 « ♦ • ♦ -- 35 pmoolia P-leimattua koetinta) 16 tuntia. Suodattimet pes- 111 107938 tiin 4 kertaa (15 minuuttia kerta) liuoksella, joka .oli 1 x SSC, 0,1 % SDS 55 °C:ssa; kahdesti (5 minuuttia kerta) liuoksessa, joka oli 0,2 x SSC, 0,1 % SDS 50 °C:ssa ja kahdesti (5 minuuttia kerta) 0,2 x SSC:ssä. Suodattimista 5 valmistettiin autoradiografiat. Pesäkkeitä, jotka muodostivat hybridisaatiosignaalin, käytettiin plasmidi-DNA:n valmistukseen. Tämä DNA digestoitiin EcoRI-entsyymillä ja tämän digestion tuottamat fragmentit analysoitiin agaroo-sigeelielektroforeesilla. Plasmidi, joka sisälsi oikean 10 kokoisen fragmentin, tunnistettiin ja nimettiin plasmidik-si pGS4888 (kuvio 23a).
pGGAP-beeta-globiinin ekspressiokasetin kloonaus plasmidiin pGS4888
Plasmidin pGS4888 rakentaminen vaati Xhol-fragmen-15 tin (pGGAP-alfa-globiini) kloonauksen Sali-kohtaan. XhoI-kohdan yhtyminen Sali-kohtaan tuhoaa sekä XhoI- että Sall-restriktioendonukleaasien tunnistuskohdat muodostaen sellaisen plasmidin pGS4888, jossa on ainoastaan yksi Xhol-kohta. XhoI-fragmentti plasmidista pGS3888 puhdistettiin 20 agaroosigeelielektroforeesilla ja kloonattiin Xhol-entsyy- • · : millä digestoituun plasmidiin pGS4888 oleellisesti, kuten • · on kuvattu plasmidin pGS4888 rakentamisessa. Pesäkehybri- • · · Σ,.,ϊ disaatiot suoritettiin käyttäen plasmidista pGS3888 peräi- sin olevaa NcoI-Sall-fragmenttia (joka sisältää beeta-glo- ;1: 25 biinin cDNA:n) hybridisaatiokoettimena. Tämä fragmentti • · · .1. puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja leimattiin • · · radioaktiiviseksi alfa32P-dCTP:llä käyttäen Amersham'in Random Oligonucleotide Labelling -käyttöpakkausta. Suodat- • · timet hybridisoitiin, pestiin ja autoradiografiat tehtiin, *;* 30 kuten on kuvattu plasmidin pGS4888 rakentamisessa. Plas-♦ · • *·· midi-DNA valmistettiin pesäkkeistä, jotka muodostivat hyb- ridisaatiosignaalin ja digestoitiin joko Ncol- tai Ncol- . ja SphI-entsyymeillä. Nämä digestiot sallivat sellaisten • · · plasmidien tunnistamisen, jotka sisälsivät sekä alfa- että • · 35 beeta-globiinin ekspressiokasetit ja paljasti alfa- ja 112 107938 beeta-globiinien transkriptioyksikköjen orientaation toisiinsa. Plasmidi, joka sisälsi molemmat transkriptioyksi-köt, tunnistettiin ja nimettiin plasmidiksi pGS189 (kuvio 23b).
5 Plasmidin pCIN rakentaminen
Plasmidia pCIU modifioitiin niin, että siihen muodostettiin Notl-kohta. pClU-DNA:ta (100 pg) digestoitiin Sali-entsyymillä, uutettiin fenoli-kloroformilla ja seostettiin etanolilla. Sall-päät modifioitiin T4 DNA polyme-10 raasilla muodostaen "tasaiset" päät ja lisättiin fosfory-loidut Notl-linkkerit. Menetelmät näiden modifikaatioiden suorittamiseksi olivat oleelliset samat kuin ne, joita ^ käytettiin muodostettaessa plasmidi pSN(+) (kuvattu yllä). Näiden käsittelyjen tuloksena syntynyt plasmidi ni-15 mettiin plasmidiksi pCIN (kuvio 23b). Tämä plasmidi pCIN digestoitiin NotI-entsyymillä, uutettiin fenoli-kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Noin 2,4 kiloemäksen pituinen fragmentti (joka sisältää alfa- ja beeta-globiinin ekspressiokasetit) puhdistettiin NotI-entsyymillä diges- . 20 toidun plasmidin pGS189 DNArsta agaroosigeelielektroforee-• ·
··* | silla. 50 ng NotI-entsyymillä digestoitua plasmidia pCIN
• · · '· Ί sekoitettiin 50 ng kanssa geelissä puhdistettua plasmi- ·*· *...* dista pGS189 peräisin olevaa 2,4 kiloemäksen pituista • · t :...· fragmenttia 0,01 ml:ssa ligaasipuskuria, joka sisälsi 25 10 yksikköä T4 DNA ligaasia. Reaktioseosta inkuboitiin 25 °C:ssa 2 tuntia ja osaa käytettiin transformoitaessa E.
• · * coli DH5alfa -solut. Ampisilliiniresistentit pesäkkeet selektoitiin LB-ampisilliinimal joilla ja valmistettiin .···. plasmidi-DNA. Puhdistettu DNA digestoitiin EcoRI-entsyy- ’** 30 millä ja analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla sel- : *** laisten plasmidien tunnistamiseksi, jotka sisälsivät alfa- • · · ’...· ja beeta-globiinigeenit ja insertin orientaation määrittä- « : .·. miseksi suhteessa vektoriin. Kaksi plasmidia tunnistet- • « · it* · .···. tiin, jotka edustivat kahta mahdollista orientaatiota ja • · • · · 113 107938 ne nimettiin plasmideiksi pGS289 (kuvio 23b) ja pGS389 (kuvio 23b).
Ihmisen rekombinanttihemoglobiinin ekspressio Saccharomyces cerevisiae -hiivassa 5 S. cerevisiae -kannat GSY112 (MATalfapep4::HlS3prbl 1.6R his3 200 ura3-52 leu2::hisG canl cir°) ja RSY334 (MAT-alfa- regl-501 pep4-3 prbl-1122 ura 3-52 leu2-3, leu2-112) transformoitiin plasmideilla pGS289 tai pGS389 menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Ito et ai. [J. Bacterilogy 153: 10 163-168 (1983)]. Transformantit selektoitiin hiivan SD- ura-alustalla. Yksittäiset erillispesäkkeet poimittiin _ ja vedettiin viivoiksi SD-alustalle, josta puuttui ura- siili ja leusiini. Tästä selektiivisestä alustasta (SD-ura, -leu) peräisin olevia pesäkkeitä käytettiin ympät-15 täessä 2 ml SD-ura, -leu -alustaa, viljelmiä inkuboitiin 30 °C:ssa 24 tuntia ja niitä käytettiin ympättäessä 20 ml viljelmät alustalle, joka oli YP + 3 % etanoli, näitä inkuboitiin 24 tuntia lisää ja lisättiin galaktoosia konsen-traatioksi 2 %. Näytteet kerättiin 4, 8, 24, 28, 32 ja 48 . 20 tuntia induktion jälkeen. Solut kerättiin sentrifugoimalla « · ·;* j ja pestiin 1 ml:lla 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,8), joka • · · *· “ oli 1 mM EDTA:n suhteen, ja suspendoitiin uudelleen SDS- • · · *...· PAGE-näytepuskuriin (2 x 108 solua/ml). Näytteitä keitet- • · · :...· tiin 10 minuuttia ja liukenematon materiaali poistettiin ill 25 sentrifugoimalla, 0,005 ml näytteet analysoitiin SDS- PAGE:lla (12,5 %), jonka jälkeen siirrettiin nitrosellu- loosalle. Alfa- ja beeta-globiiniketjut värjättiin käyt- ....: täen kaupallisesti saatavaa kanin anti-ihmis hemoglobiini- .···. vasta-ainetta ja immunoblottauskäyttöpakkausta, jotka hän- ’·* 30 kittiin Promega'lta. Käytetyt menetelmät olivat Promega'n • · : *** ohjeiden mukaiset. Immunoblottaus osoitti, että molempia • · · ·...· ketjuja syntetisoidaan ja että plasmidi pGS289 tuottaa : hiukan vähemmän materiaalia kuin plasmidi pGS389. Ilmeinen • · ·
Ml * .···. puutos alfaketjun (alempi rintama) ja beetaketjun väli- • · 35 sessä stoikiometriassa johtuu erosta vasta-aineen immuno- 114 107938 reaktiivisuudessa kahdelle ketjulle. Tämä osoitettiin vertaamalla Coomassie brilliant blue -värillä värjättyjä ihmisen puhdistetun hemoglobiinin ja rekombinanttihemoglo-biinin geelejä immunoblotattuihin näytteisiin.
5 Esimerkki 20
Ihmisen hiivassa syntetisoidun rekombinanttihemo-globiinin karakterisointi
Kantaa RSY334 (pGS389) kasvatettiin 100 ml:ssa SD-leusiinialustaa OD600-arvoon 2,4. Tätä käytettiin ympättäes-10 sä 1 litra YPE-alustaa. Tätä viljelmää ravisteltiin 30 °C:ssa 24 tuntia, jona aikana lisättiin 50 ml 40 % ga-laktoosia. Inkubointia jatkettiin ja solut kerättiin 24 tuntia myöhemmin (OD600-arvossa 9). Solupelletti suspendoi-tiin uudelleen 100 ml:aan 0,01 M Tris-HCl-puskuria (pH 15 7,18), joka oli 0,001 M EDTA:n suhteen, ja solususpension läpi kuplitettiin hiilimonoksidia 3 minuuttia. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja CO-käsittelyn jälkeen ne olivat selvästi punaisia. Solupelletti (19 g) suspendoitiin uudelleen 19 ml:aan lyysispuskuria (0,01 M NaP04, pH 6,0,
. 20 0,020 M DTT, 1 % Triton X-100, 0,001 M PMSF, 0,005 M
• · ··· · bentsamidiini ja 0,06 mM leupeptiini) ja kuplitettiin hii- • · · "· '! limonoksidilla 2 minuuttia. Solususpensiota sonikoitiin • · · *...* Branson 250 -sonikaattorilla, joka oli varustettu 0,5 tuu- • · · man hajotuskärjellä. Sonikointiaika oli 2 minuuttia (0,5 • · · ί 25 sekunnin pulssit) täydellä teholla. Tämä toistettiin 4 kertaa niin, että sonikointijaksojen välillä oli 2 minuu- ·»· tin jäähdytysajat. Soluroskat poistettiin sentrifugoimalla ....: (27 000 x g, 15 minuuttia) ja supernatantti säästettiin .·*·. (0 °C). Pelletti suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan lyysis- *·* 30 puskuria. Uudelleen suspendoitu pelletti sonikoitiin mik- : ** rokärjellä, kuten yllä (70 % maksimitehosta). Soluroskat poistettiin sentrifugoimalla, kuten on kuvattu yllä ja : supernatantti yhdistettiin ensimmäiseen. Yhdistetyt liuok- • · · · .···. set kirkastettiin sentrifugoimalla (38 000 x g, 20 minuut- • · 35 tia), joka tuotti kirkkaan punaisen liuoksen. Tämä ladat- 115 107938 tiin (kun pH oli säädetty 6,0:aan 10 mM fosforihapolla) 5 ml:n S-Sepharose-nopeavirtauspylvääseen, joka oli tasapainotettu 0,01 M natriumfosfaatilla (pH 6,0). Kaikki pylvääseen kiinnittynyt punainen materiaali ja pylväs pestiin 5 20 ml:11a 0,01 M natriumfosfaattia (pH 6,0). Pylväs eluoi- tiin 0,05 M natrimufosfaatilla (pH 7,5), joka oli 0,1 M NaCl:n suhteen, ja kerättiin 1 ml:n fraktiot. Punainen väri eluoitui kahdessa fraktiossa. Tämän materiaalin puhtaus analysoitiin SDS-PAGE:lla ja se tuntui olevan -» 50 % 10 puhdasta ensimmäisen kromatografiavaiheen jälkeen. Tämä materiaali dialysoitiin 10 mM natriumfosfaattia (pH 6,0), joka oli 0,001 M EDTA:n suhteen, vastaan 16 tuntia 0 °C:ssa ja kromatografoitiin uudelleen Mono-S FPLC-pyl-väässä (pH 6,8 - 9,0, 0,02 M natriumfosfaattigradientti).
15 Tämän huippufraktio oli -* 85 % puhdasta. Absorptiospektri saatiin skannaamalla Mono-S-puhdistettua materiaalia 400 -650 nM Shimadzu-spektrofotometrillä (kuvio 24, yläosa). Saatu spektri oli identtinen ihmisen hemoglobiinin spektriin verrattuna (kuvio 24, alaosa), joka osoitti, että . 20 proteiini oli laskostunut ja ottanut sisäänsä hemiryhmän.
• · * Kahdesta huippufraktiosta talteen saadun hemoglobiinin • · · ’· *· määrän määritettiin ekstinktiokoeffisientin (1,23 x 104 « · · • · *...* A450/M) perusteella olevan noin 20 mg.
• »t ..· Esimerkki 21 • · 25 Vektoreiden rakentaminen alfa- ja beeta-globiinien :[**: ekspressoimiseksi erillisistä hiivaplasmideista
Sen lisäksi, että kehitettiin yksi hiivavektori, ....: joka sisälsi sekä alfa- että beeta-globiinien ekspressio- .···. kasetit, kehitimme myös systeemin, joka käyttää erillisiä *·* 30 plasmideja molemmille kahdelle globiini-cDNA:lie. Kaksi • · : ** plasmidia sisältävät kumpikin kaksi hiivageeniä, joita • · · käytetään säilyttämään plasmidi hiivassa. Molemmissa on : LEU2-geeni ja toisessa (pGS4688) on URA3-geeni ja toisessa .···. (pGS4988) on TRPl-geeni. Käyttämällä isäntää, joka sisäl- • » 35 tää mutaatiot URA3-, LEU2- ja TRP1-geeneissä, molemmat 116 107938 plasmidit (toinen, jossa on alfa-globiinin ja toinen, jossa on beeta-globiinin ekspressiokasetti) voidaan ylläpitää. Näiden vektoreiden rakentaminen on kuvattu alla.
Plasmidin pClT rakentaminen 5 Plasmidi pCIU (5 pg) digestoitiin BamHI- ja Sali- entsyymeillä ja suurin fragmentti puhdistettiin agaroosi-geelielektroforeesilla. Plasmidi YRp7 (10 pg) (J. Strat-hern, E. Jones ja J. Broach, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor, NY, 1981) diges-10 toitiin Bglll- ja Sali-entsyymeillä ja fragmentti, joka sisälsi TRP1-geenin, puhdistettiin agaroosigeelielektrofo-reesilla. 25 ng geelissä puhdistettua BamHI- ja Sali-entsyymeillä digestoitua plasmidia pCIU sekoitettiin 50 ng kanssa Bglll-Sall-fragmenttia ligaasipuskurissa, joka si-15 sälsi 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Reaktioseosta inkuboi-tiin 25 °C:ssa 1,5 tuntia ja osaa ligaatioseoksesta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Tetra-sykliiniresistentit pesäkkeet selektoitiin LB-tetrasyklii-nialustalla. Plasmidi-DNA valmistettiin 15 transformantis- . 20 ta, digestoitiin EcoRI-entsyymillä ja analysoitiin agaroo- • · *** * sigeelielektroforeesilla. Yksi eristetty klooni, jolla oli • · · *· odotetut EcoRI-restriktiofragmentit, valittiin ja nimet- *...* tiin plasmidiksi pClT (kuvio 22a).
• · ·
Beeta-globiinin ekspressiokasetin kloonaus plasmi-25 diin pClT —-
100 ng plasmidia pClT digestoitiin Sali-entsyymillä, uutettiin fenoli-kloroformilla, saostettiin etanolilla ....: ja liuotettiin 0,01 ml:aan 10 mM Tris-HCl-puskuria (pH
.···. 7,8), joka oli ImM EDTArn suhteen. Plasmidi pGS3888 diges- **’ 30 toitiin Xhol-entsyymillä ja noin 1,2 kiloemäksen pituinen • · : *·· XhoI-fragmentti, joka sisälsi beeta-globiinin ekspressio- ··· kasetin, puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla.
: .·. 10 ng Sali-entsyymillä digestoitua plasmidia pClT sekoi- • st IM · ,···. tettiin 60 ng kanssa XhoI-fragmenttia, joka sisälsi beeta- • · 35 globiinin ekspressiokasetin, 0,01 ml:aan ligaasipuskuria, 117 107938 joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Reaktioseosta inkuboitiin 25 °C:ssa 30 minuuttia. Osaa tästä materiaalista käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. 100 ampisilliiniresistenttiä transformanttia poimittiin ja 5 täplitettiin LB-ampisilliiniagarille. Niitä inkuboitiin 5 tuntia 37 °C:ssa ja peitettiin nitroselluloosasuodattimel-la. Plasmidit, jotka sisälsivät XhoI-fragmentin, tunnistettiin pesäkehybridisaatiolla käyttäen Xhol-fragmenttia hybridisaatiokoettimena, kuten yllä on kuvattu. Pesäkkei-10 tä, jotka muodostivat signaalin autoradiografiassa, käytettiin plasmidi-DNA:n valmistukseen. Puhdistettu DNA di-gestoitiin EcoRI-entsyymillä ja analysoitiin agaroosigee-lielektroforeesilla odotettujen restriktiofragmenttien läsnäolon suhteen. Kaksi kloonia, jotka sisälsivät halutun 15 Xhol-insertin, tunnistettiin ja insertin orientaatio määritettiin plasmidi-DNA:n EcoRI- tai SphI-digestien agaroo-sigeelianalyysillä. Molemmat eristetyt kloonit sisälsivät halutun insertin samassa orientaatiossa ja toinen nimettiin plasmidiksi pGS4988 (kuvio 22a).
. 20 Alfa-globiinin ekspressiokasetin kloonaus plasmi- « ·
; diin pCIU
• ti *. ” XhoI-fragmentti plasmidista pGS4088, joka sisälsi • · · :...: alfa-globiinin ekspressiokasetin, puhdistettiin agaroosi- « · · geelielektroforeesillä ja talteen otettu fragmentti liuo-25 tettiin (100 ng/0,01 ml) 1 mM Tris-HCl-puskuriin pH 7,8, joka oli 0,1 mM EDTA:n suhteen. 25 ng geelissä puhdistet- • · · tua fragmenttia sekoitettiin 10 ng kanssa SalI-entsyymi1-....: lä digestoitua (fenoli-kloroformilla uutettu, etanolilla .···. saostettu) plasmidia pCIU 0,01 ml: aan ligaasipuskuria, ”* 30 joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA ligaasia. Reaktioseosta • · : ’** inkuboitiin 25 °C:ssa 1,5 tuntia ja osaa käytettiin trans- «·· formoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Ampisilliiniresisten- : .·. tit pesäkkeet selektoitiin LB-ampisilliinimaljoilla. Plas- • ♦· · .···, midi-DNA valmistettiin 12 transformantista, digestoitiin • · 35 Hindlll-entsyymillä ja analysoitiin agaroosigeelielektro- 118 107938 foreesilla. Kaksi mahdollista orientaatiota eristettiin ja nimettiin plasmideiksi pGS4488 (kuvio 22b) ja pGS4688 (kuvio 22b).
Alfa- ja beeta-globiiniketjuja erillisistä plasmi-5 deista ekspressoivien diploidien kantojen rakenta minen S. cerevisiae RSY330 (MAalfa pep4-3 prbl-112 hist7 ura3-52 trpl-289 canl gall) transformoitiin (Ito et ai.) plasmidilla pGS4488 tai pGS4688. Trp*-trans formant it selek-10 toitiin SD-trp-alustalla ja vedettiin erillispesäkkeiksi.
S. cerevisiae BJY1991 (MATalfa prbl-112 pep4-3 leu2-3,112 trpl-101 ura3-52 gal2 canl) transformoitiin plasmidilla ..
pGS4988. URA+-transformantit selektoitiin SD-ura-alustalla ja vedettiin erillispesäkkeiksi. Nämä kannat testattiin 15 kummatkin alfa- ja beeta-globiinin tuoton suhteen seuraavasti: (1) Yksittäiset pesäkkeet poimittiin selektiiviseltä SD-alustalta ja käytettiin ympättäessä 2 ml selektiivistä SDS-alustaa (liuosmainen). Viljelmiä inkuboitiin 24 tuntia 30 °C:ssa ja laimennettiin 25 ml:aan tuoretta se- . 20 lektiivistä SD-alustaa ja inkuboitiin lisää 24 tuntia.
• · **· j Solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudel- • · · ’· leen 25 ml:aan YP-galaktoosia (2 %) ja inkubointia jatket- • · *...' tiin lisää 24 tuntia. Solut kerättiin (8 000 x g, 10 mi- • · · nuuttia) ja pelletti pestiin 50 ml:lla 0,010 M Tris-HCl- 25 puskuria (pH 7,8), joka oli 0,001 M EDTA:n suhteen. Pelle- — : : tit liuotettiin kuumentamalla 96 °C:ssa 10 minuuttia SDS- • · · PAGE-näytepuskuriin ja roskat poistettiin sentrifugoimalla (15 000 x g, 10 minuuttia). Kirkastetut supernatantit 1 x .···. 106 solusta analysoitiin kukin SDS-polyakryyliamidigeeli- .* 30 elektroforeesilla ja Western-immunoblottauksella, kuten ·· 4 · ! '* yllä on kuvattu. Beeta-globiini oli helposti tunnistetta- • · « ·...· vissa kannan BJY3505 (pGS4988) uutoksista. Kykenimme myös : .*. tunnistamaan alfa-globiinin kanssa ristireagoivaa mate- ··« · .···. riaalia, vaikka signaalin vahvuus olikin huomattavasti • · 35 heikompi. Tetrameerisen hemoglobiinin tuotto vaatii sekä 119 107938 alfa- että beeta-ketjujen läsnäolon, ideaalisesti näitä ekspressoitaisiin samassa solussa. Koska kannat BJY3505, BJY1991 ja RSY330 ovat haploideja, ne kukin voidaan pa-riuttaa vastakkaisen pariutumistyypin omaavan hiivakannan 5 kanssa. Kannat RSY330 ja BJY1991 ovat molemmat pariutumis-"tyyppiä alfa, kun taas kanta BJY3505 on pariutumistyyppiä a. Kantojen BJY3505 (pGS4988), RSY330 (4688) tai BJY1991 (4688) tai RSY330 (pGS4688) pariutumiset tehtiin ja di-ploidit selektoitiin vetämällä SD-minimialustalle ilman 10 mitään lisäaminohappoja tai muita ravinteita. Kumpikaan plasmidia sisältävistä emokannoista ei kykene kasvamaan tällä alustalla, diploidit kuitenkin voivat kasvaa. Koska diploidit ovat homotsygoottisia TRP1- ja URA3-geenien mutaatioiden suhteen, molemmat plasmidit täytyy olla läsnä, 15 jotta solut voivat kasvaa näiden ravinteiden poissa ollessa. Nämä diploidit kannat analysoitiin alfa- ja beeta-glo-biinien synteesin suhteen, kuten on kuvattu yllä. Saatiin mitä yllättävin tulos. Vaikka alfa-globiinia ja beeta-glo-biinia syntetisoidaan matalilla tasoilla haploideissa kan- , 20 noissa, yhteisekspressio diploidissa kannassa johtaa • · ··· ; oleelliseen kohoamiseen molempien ketjujen tasoissa. Li- • · * *: säksi, kun oli indusoitu (24 tuntia) galaktoosilla, solu- ·...· pelletit kehittivät selvän vaaleanpunaisen värin. Nämä • · · tulokset antavat olettaa, että: (a) alfa-ja beeta-globii-:*]*: 25 nin yhteisekspressio stabiloi nämä kaksi proteiinia ehkä johtuen niiden interaktiosta keskenään ja (b) proteiini • · · ilmeisesti laskostuu ja ottaa sisälleen hemiryhmän.
Esimerkki 22 • ·
Hiivasta peräisin olevan hemoglobiinin hapensito- « 30 misominaisuudet • · : ’·* Hiivasta peräisin olevan hemoglobiinin P50-arvo on • ·· ί.,.ί lähes identtinen hemoglobiini A0:n vastaavaan. Riippuen : ,·, siitä, miten mittaamme sen, P50-arvo vaihtelee noin 5-10 • · · \···[ torriin fosfaattivapaassa liuoksessa. 25 °C:ssa se on noin • · '” 35 4 - 6 torria 50 mM BisTris-puskurissa, pH 7,4, joka on 120 107938 0,1 M NaCl:n suhteen. Samassa liuoksessa 37 °C:ssa P50-arvo on 8,5 - 11.
Esimerkki 23
Di-alfa-hemoglobiinin ekspressio S. cerevisiae 5 -hiivassa
Menetelmät
Jollei muuta ole ilmoitettu, kaikki entsyymit (res-triktioendonukleaasit, T4 DNA -ligaasi, T4 DNA -polyme-raasi, T4 -polynukleotidikinaasi) hankittiin New England 10 Biolabs'lta, Pharmacia'lta, BRL'ltä, Stratagene'Itä tai Boehringer Mannheim'lta. Restriktioentsyymejä ja T4 DNA -ligaasia käytettiin valmistajien mukaisissa puskureissa. ^
Nukleiinihappojen etanolisaostus suoritettiin lisäämällä 0,5 tilavuutta 7,5 M ammoniumasetaattia ja 2 ti-15 lavuutta etanoli-isopropanolia, jossa suhteet olivat 20:1. Pelletti kerättiin sentrifugoimalla 14 000 x g 15 minuutin ajan, pestiin kahdesti 80-%:isella etanolilla, kerran 95-%:isella etanolilla ja kuivattiin tyhjiössä. Fenoliuu-tot suoritettiin lisäämällä fenoli:kloroformi:isoamlyyli- ,·. 20 alkoholiseosta, jossa suhteet olivat 50:49:1. Faasit ero-• · · **/ j tettiin sentrifugoimalla 14 000 x g ja vesipohjainen faasi kerättiin. Plasmidi-DNA puhdistettiin E. coli DH5alfa - • · ···* soluista, kuten ovat kuvanneet Birnboim ja Doly (Nucleic *···* Acids Research 1979, 7: 1513 - 1520). DNA:n elektroforeet- • · · 25 tinen analyysi suoritettiin agaroosigeeleissä käyttäen • · · ·...· Tris-asetaattielektroforeesipuskuria (Maniatis et ai.,
Molecular Cloning, Cold Spring Harbot, NY, 1982). DNA teh- *:**: tiin silmin näkyväksi värjäämällä geelit liuoksella, jossa ·***· oli etidiumbromidia 0,5 pg/ml ja valottamalla geelejä uit- ··· ..* 30 raviolettivalossa. DNA-fragmentit puhdistettiin agaroosi- • · *..]* geeleistä käyttäen B10-101'ltä hankittua käyttöpakkausta.
• · ’···* DNA-fragmentit puhdistettiin akryyliamidigeeleistä murs- : kaarnalla geelipala 3,25 M ammoniumasetaattiin ja inkuboi- ··♦ · :***; maila yli yön 37 °C:ssa. Geelipalat poistettiin sentrifu- ··« 35 goimalla (14 000 x g, 15 minuuttia) ja DNA saostettiin 121 107938 etanolilla. Sakka liuotettiin TE-puskuriin (10 mM Tris-HC1, pH 7,8, 1 mM Na3EDTA). DNA:n akryyliamidigeelielektro-foreesi suoritettiin, kuten on kuvattu teoksessa Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 5 NY, 1982. Bakteriologiset kasvatusalustat ja DNA:n trans-formaatiomenetelmät olivat, kuten ovat kuvanneet R.W. Davis et ai., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1980. S. cerevisiae -hiivan kasvatusalustat ovat kuvanneet F. Sherman et ai., Methods in 10 Yeast Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1979. S. cerevisiae -hiivan transformaatio lineaarisella tai rengasmaisella DNA:11a suoritettiin, kuten ovat kuvanneet H. Ito et ai., J. Bacteriology, 153: 163 - 168, 1983.
15 PstI- ja Spel-kohtien poistaminen plasmidista PGS4888
Synteettisen linkkerin suunnitteleminen kahden al- fa-globiiniketjun liittämiseksi yhteen sallii 30 emäsparin pituisen sekvenssin, joka sisältää kahta alfa-globiinia . 20 koodattavien sekvenssien liitoskohdan, viereisten PstI- ja • · ··· · Spel-kohtien mukaan ottamisen. Koska aikomuksenamme on • · t '· "S testata useita erilaisia linkkerisekvenssejä, nämä kohdat ·«« sallivat suhteellisen lyhyiden synteettisten oligonukleo- • · · tidien, jotka koodittavat erilaisia linkkerisekvenssejä, • 25 suoran kloonauksen. PstI- ja Spel-kohtien poistaminen vek- :***: torisekvenssistä on sen vuoksi tarpeellista niin, että *· · kohdat koodattavalla alueella ovat käytettävissä. Yksi pg plasmidia pGS4888 digestoitiin Pstl-entsyymillä ja saos- tettiin etanolilla. Kuiva pelletti suspendoitiin uudelleen *Γ 30 50 pl:aan liuosta, joka oli 33 mM Tris-asetaatin, pH 7,9, ··
; *·* 66 mM kaliumasetaatin, 10 mM magnesiumasetaatin, 0,5 mM
·«· :...· DTT:n ja 50 μΜ kunkin dNTP:n suhteen (T4 polymeraasipus- * : kuri). Lisättiin kaksi yksikköä T4 DNA -polymeraasia ja • · · ·.· reaktioseosta inkuboitiin 15 minuuttia 37 °C:ssa. Lisät- • « • * 35 tiin Na3EDTA:a niin, että loppukonsentraatio oli 12,5 mM ja 122 107938 reaktioseosta kuumennettiin 65 °C:ssa 15 minuuttia, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. Kuiva pelletti liuotettiin 14 plraan T4 DNA ligaasipuskuria (BRL) ja lisättiin 1 μΐ (10 yksikköä) T4 DNA -ligaasia. Ligaatioseos-5 ta inkuboitiin 4 eC:ssa 16 tuntia. Osaa ligaatioreaktiosta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut ja transformantit selektoitiin LB-ampisilliinimaljoilla. Plasmidi-DNA valmistettiin 12 transformantista. DNA analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla Pstl-entsyymillä 10 digestoiduista näytteistä. Viidestä transformantista oli hävinnyt PstI-kohta ja yksi näistä nimettiin plasmidiksi pGS1889. Tämän plasmidin Spel-kohta poistettiin, kuten yllä on kuvattu sen jälkeen, kun plasmidi pGS1889 oli di-gestoitu Spel-entsyymillä. Tunnistettiin plasmidi, josta 15 oli hävinnyt sekä PstI- että Spel-kohta ja se nimettiin plasmidiksi pGS1989.
Strategia kahden alfa-globiinin cDNA-kopion yhteen-liittämiseksi
Fragmentti, joka sisältää alfa-globiinia kooditta-20 van alueen 5'-pään 363 emäsparin pituisen osan, voidaan • « : irrottaa plasmidista pGS4888 NcoI-ApaLI-fragmenttina. Toi- nen fragmentti, joka sisältää nukleotidit 109 - 3' -pään »·» :...· puoleinen transloimaton alue, voidaan poistaa Fokl-Sall- « · · ϊ.,.ϊ fragmenttina. Nämä kaksi fragmenttia voidaan sitten liit- 25 tää yhteen muodostamaan yhden translaatioyksikön, joka ·***; koodittaa kahta alfa-globiinin cDNArn peräkkäin olevaa • · · kopiota, käyttäen synteettistä oligonukleotidiadaptorisek-venssiä (taulukko 8). Näiden fragmenttien puhdistus ja • · ... kokoaminen on kuvattu alla.
• · *Γ 30 Plasmidi pGS4888 digestoitiin peräkkäin ApaLI- ja ·· : *·· Ncol-entsyymeillä ja noin 365 emäsparin pituinen fragment- «·♦ ·...· ti (alfaketju 1) puhdistettiin akryyliamidigeelielektro- : .·. foreesilla. Toinen noin 351 emäsparin pituinen fragmentti • · « (alfaketju 2) valmistettiin digestoimalla peräkkäin FokI- • « 35 ja Sali-entsyymeillä, jonka jälkeen suoritettiin akryyli- 123 107938 amidigeelielektroforeesi. Syntetisoitiin neljä oligonuk-leotidia (taulukko 8) ja koottiin noin 173 emäsparin pituiseksi linkkeriksi (RGGV), joka sisälsi ApaLI- ja Fokl-päät. Oligonukleotidien synteesi, puhdistus ja kokoaminen 5 tapahtui, kuten on kuvattu aiemmin. Tämä adaptorisekvenssi koodittaa aminohapposiltaa, joka yhdistää alfaketju l:n karboksipään alfaketju 2:n aminopäähän kuin myös osia alfaketju l:n 3’-päästä ja alfaketju 2:n 5*-päästä. Alfa-ketju l:n karboksipään arginiinijäännös erotetaan tässä 10 rakenteessa alfaketju 2:n aminopään valiinista kahdella glysiinijäännöksellä. "Diglysiinisiltaosan" vieressä on Hpal-, Spel- ja Pstl-kohdat. Nämä kohdat sallivat substi-tuoimisen erilaisilla siltarakenteilla käyttämällä noin 30 emäsparin pituisia adaptorisekvenssejä liitettäessä kaksi 15 alfaketjua ekspressiokasettiin. Tämä suoritettiin neljä-vaiheisella ligaatiolla, kuten alla on kuvattu.
Plasmidi pGS1989 digestoitiin peräkkäin Ncol- ja Sali-entsyymeillä ja suuri fragmentti, joka sisälsi plas-midivektorin ja pGALGAP-sekvenssin, puhdistettiin agaroo-20 sigeelielektroforeesilla (gpl989). 50 ng fragmenttia • · •·ί ί gpl989 sekoitettiin 200 ng kanssa geelissä puhdistettua • · V·: ApaLI-NcoI-fragmenttia, joka sisälsi alfaketju l:n, ja ·*« i,,.· 200 ng kanssa geelissä puhdistettua Fokl-Sall-fragmenttia, :<w: joka sisälsi alfaketju 2:n. Lisättiin 20-kertainen mooli- .-***: 25 ylimäärä synteettistä ApaLI-Fokl-adaptorisekvenssiä (adap-«»· ·’**· torisekvenssin 5'-päät eivät olleet fosforyloituja). Li- ··· gaatioreaktio suoritettiin 20 μΐ tilavuudessa 4 tunnin ajan 23 °C:ssa. Osaa tästä reaktioseoksesta käytettiin • « ... transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut ja selektoitiin * · — - ... — ° *1* 30 ampisilliiniresistentit pesäkkeet. Transformantit täpli-·· • *·· tettiin nitroselluloosasuodattimille ja seulottiin hybri- !β##ί disoimalla 32P-leimatun oligonukleotidin AL2as (taulukko ; ]·, 8) kanssa. Viittä pikomoolia oligoa AL2-as inkuboitiin • i · 20 plrssa liuosta, joka sisälsi 2 yksikköä T4-polynukleo-*" 35 tidikinaasia ja oli 50 mM Tris-HCl-puskurin (pH 7,6), 124 107938 10 mM MgCl2:n, 6 mM DTT:n, 0,1 mM spermidiinin, 0,1 mM EDTA:n ja 10 pM gamma32P-ATP:n (7000 Ci/mM) suhteen, 2 tunnin ajan 37 °C:ssa. Suodattimia käsiteltiin, kuten ovat kuvanneet Maniatis et ai. ja hybridisaatio suoritettiin 5 37 °C:ssa liuoksessa, joka oli 5 x SSC, 50 % formamidi, 100 pg hiivan tRNA:ta/ml ja 2 % SDS, 16 tunnin ajan. Suodattimet pestiin peräkkäin 2 x SSC:llä ja 1 x SSCrllä 55 °C:ssa 15 minuutin ajan (kaksi kertaa kummassakin, kaikki pesunesteet sisälsivät 1 % SDSrää). Kuivatut suo-10 dattimet valotettiin röntgenfilmille ja pesäkkeitä, jotka antoivat hybridisaatiosignaalin, käytettiin plasmidi-DNA:n valmistukseen. Plasmidi-DNA analysoitiin restriktioentsyy-midigestiolla sellaisten plasmidien tunnistamiseksi, jotka sisälsivät insertin, joka vastasi kooltaan kahta alfaket-15 jua (NcoI-Sall-digesti) ja jotka sisälsivät ainoastaan yhden PstI-, Spel- ja Hpal-kohdan. Tällä tavalla tunnistettu plasmidi nimettiin plasmidiksi pGS2189 (kuvio 25).
XhoI-fragmentti plasmidista pGS3888, joka fragmentti sisälsi beeta-globiinin ekspressiokasetin, puhdistet-. 20 tiin agaroosigeelielektroforeesilla. Xhol-entsyymillä di- ·** * gestoitu plasmidi pGS2189 (50 ng) yhdistettiin 150 ng « · · • *· kanssa geelissä puhdistettua plasmidin pGS3888 inserttiä
*···* 1 pl:ssa ligaasipuskuria, joka sisälsi 10 yksikköä T4 DNA
··· ·...· -ligaasia. Osaa tästä seoksesta käytettiin transformoi- ··· 25 taessa E. coli DH5alfa -solut ja selektoitiin ampisillii- '' ··· i##>i niresistentit pesäkkeet. Plasmidi-DNA eristettiin ja ana lysoitiin digestoimalla XhoI-, BamHI- tai Ncol-entsyymeil-....i lä. Useita sellaisia plasmideja tunnistettiin, jotka tuot- .···. tivat odotetun kokoiset restriktiofragmentit, jotka kaikki ··· • 30 sisälsivät insertin orientaatiossa, joka on esitetty ku-• · ϊ ** viossa 25. Yksi näistä nimettiin plasmidiksi pGS2989.
···
Vaikka tämä plasmidi sisältää yhteen liitetyt alfa-globii- : nigeenit ja beeta-globiinigeenin erillisten promoottorien «·· · .···. säätelyn alaisuudessa, se ei kykene replikoi tumaan S. ce- • · ··· 35 revisiae -hiivassa. Koko ekspressiokasetti, joka sisältää 125 107938 kaksi geeniä (di-alfa- ja beeta-globiini), voidaan puhdistaa Notl-fragmenttina. 10 pg plasmidia pGS2989 digestoi-tiin PvuI- ja Notl-entsyymeillä ja NotI-fragmentti puhdistettiin geelissä. Digestio PvuI-entsyymillä suoritettiin, 5 jotta alennettiin niiden vektorisekvenssien kokoa, jotka muuten olisivat kulkeneet yhdessä halutun NotI-fragmentin kanssa. 200 ng geelissä puhdistettua NotI-fragmenttia yhdistettiin 50 ng kanssa NotI-entsyymillä digestoitua plasmidia pCIN 10 pl:ssa ligaatiopuskuria, joka sisälsi 10 10 yksikköä T4 DNA ligaasia. Reaktioseosta inkuboitiin 4 °C:ssa yli yön ja osaa käytettiin transformoitaessa E. coli DH5alfa -solut. Ampisilliiniresistentit transforman-tit selektoitiin ja valmistettiin plasmidi-DNA. DNA diges-toitiin Ncol-Sall-, PstI- tai Notl-entsyymeillä sellaisten 15 plasmidien tunnistamiseksi, jotka sisälsivät di-alfa-, beeta-globiinin ekspressiokasetin ja insertoidun fragmentin orientaation määrittämiseksi. Useita sellaisia plas-mideja tunnistettiin, jotka sisälsivät oikean insertin, joista plasmideista kaikilla oli insertoitunut fragmentti 20 samassa orientaatiossa. Yksi näistä nimettiin plasmidiksi . pGS3089 (kuvio 25). Tätä plasmidia käytettiin transformoi- • 1 2 3 4 ::: : taessa kannat GSY112 ja RSY334.
• · ·
Ekspressio ja puhdistus *···1 S. cerevisiae -kannat GSY112 (pGS3089) ja RSY334 • ·« — .....
'...· 25 (pGS3089) kasvatettiin kyllästyspisteeseen SD-urasiili- ··· alustassa ja laimennettiin 2 litraan YPD-alustaa (kaikkia viljelmiä inkuboitiin 30 °C:ssa). 24 tuntia ymppäyksen jälkeen (YPD-viljelmän) lisättiin galaktoosia 1 %:ksi ja ·:··Σ viljelmiä inkuboitiin toiset 24 tuntia. Hiilimonoksidia .···. 30 kuplitettiin viljelmän läpi ja solut kerättiin sentrifu-• · · goimalla. Seos, jossa oli 1:1 (paino:tilavuus) soluja ja • t
ί '1 hajotuspuskuria (10 mM natriumfosfaatti (pH 7,2), 1 mM
• · · *...· EDTA, 1 mM EGTA ja 5 mM DTT), hajotettiin "Bead-Beater"- ;1. kojeessa (Biospec Products, Bartlesville, OK). Roskat 2 • · · · 3 .1··. 35 poistettiin sentrifugoimalla (10 000 x g, 30 minuuttia).
4 126 107938
Liukoisen fraktion pH säädettiin 6,Oraan fosforihapolla ja kromatografoitiin S-Sepharose-pylvään (nopeavirtaus) läpi, joka pylväs oli tasapainotettu 10 mM natriumfosfaatissa, pH 6,0. Ladattu pylväs pestiin 10 mM Tris-HCl-puskurilla, 5 pH 6,7 ja hemoglobiini eluoitiin pesemällä 20 mM Tris-HCl-puskurilla, pH 7,5. Kirkkaanpunainen rintama kerättiin ja pH säädettiin 8,Oraan lisäämällä NaOHria. Tämä materiaali kromatografoitiin sitten Q-Sepharose-pylväässä (nopea-virtaus), joka oli tasapainotettu 20 mM Tris-HCl-puskuris-10 sa, pH 8,0. Hemoglobiini eluoitiin NaCl-gradientilla (0 -0,4 M). Lopullinen kromatografiavaihe suoritettiin Seph-acryl S-200-pylväässä, joka oli tasapainotettu 5 mM NaP04-puskurissa, pH 7,4, joka oli 0,1 M NaClrn suhteen. Kukin puhdistussysteemin vaihe analysoitiin SDS-polyakryyliami-15 digeelielektroforeesilla (Laemmli, UK, 1970, Nature 227r 680 - 685) ja värjäämällä Coomassien brilliant blue-väril-lä. Puhdistettu proteiini sisältää rintaman, joka kulkee yhdessä monomeerisen beeta-globiinin kanssa ja rintaman, joka kulkee odotetussa alfa-globiinidimeerin kohdassa. 20 Tämä materiaali kulkee yhdessä ihmisen tetrameerisen hemoglobiinin kanssa, kun analysoidaan kokoerotukseen perustuki : valla kromarografiällä (Progel TSK G3000 SWXL HPLC-pyl- • » :.1·· väs). Tämä proteiini on väriltään punainen ja sitoo 02ra ♦ ♦♦ i...i niin, että 50 % sitoutumisaffiniteettiarvo (P50) on 8 - 10 :2: 25 torria, joka osoittaa, että se on ottanut sisäänsä hemi- « · » :2· ryhmän ja kykenee reversiibeliin 02-sitomiseen.
♦ · « .3·. Puhdistettu proteiini erotettiin alfa- ja beetaket- ··« juihin käänteisfaasi-HPLCrllä ja kummankin ketjun 10 ami- ....· nopään jäännöksen sekvenssi määritettiin. Sekvenssi sopi • ♦ ... 30 yhteen ihmisen alkuperäisen hemoglobiinin vastaavan kanssa T1 osoittaen, että aloitusmetioniini oli tehokkaasti poistet- • · • ’·· tu sekä alfa-globiinidimeeristä että beeta-globiinidimee- : ristä.
• · · * • · • · · • · · ··· · · · • · 2 • · · 3 • » 127 107938
Esimerkki 24
Matalan affiniteetin sisältävien geneettisesti yh-teenliitettyjen hemoglobiinimutanttien rakentaminen ja ekspressio hiivassa 5 Vektorin rakentaminen kohdennettua mutageneesia varten
Beeta-globiinin ja sen GALGAP-promoottorin sisältävä XhoI-fragmentti eristettiin plasmidista pGS2989 prepa-ratiivisella agaroosigeelielektroforeesilla ja ligoitiin 10 Xhol-entsyymillä digestoidun Phagescript-vektorin (RF-muo-to, hankittiin Stratagene, Inc.'lta) kanssa. E. coli XL1-Blue -bakteerit transformoitiin DNA ligaatioseoksella ja faagia sisältävät insertit tunnistettiin (valkoiset plakit alustalla, joka sisälsi X-gal:ia). Yksittäiset plakit 15 eristettiin ja DNA valmistettiin ja analysoitiin digestoi-malla Xhol-entsyymillä ja ajamalla agaroosigeelielektro-foreesi. Tämä rakenne nimettiin plasmidiksi Mp-beeta-glo-biini.
Yksijuosteisen templaatin valmistus 20 Kyllästettyä E. coli XLl-Blue -bakteerin (kaupalli- . sesti saatavana Stratagene'1ta, 11099 North Torrey Pines • · "1 | Road, La Jolla, CA 92037) viljelmää käytettiin ympättäessä • · · *· 1· 4 ml 2 x YT-lihalientä. Tätä viljelmää inkuboitiin 2 tun- • 1 · w tia 37 °C:ssa ja sitten infektoitiin yksittäisellä Mp-bee- »♦ · 25 ta-globiini-faagiplakilla ja inkubointia jatkettiin 6-8
• M
tuntia. Solut poistettiin sentrifugoimalla ja heitettiin : 2: pois. Faagi saostettiin 1,6 mlrsta kirkastettua alustaa lisäämällä 320 μΐ 3,5 M ammoniumasetaatissa olevaa kylmää ....: 30-%:ista PEG 8000:aa, jonka jälkeen inkuboitiin jäissä 30 .···. 30 minuuttia. Faagi kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoi- [·’ tiin uudelleen 0,1 ml:aan 10 mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0, '· " joka oli 1 mM EDTArn suhteen (TE). DNA eristettiin uutta- • · · maila kahdesti fenoli/kloroformilla. DNA (joka oli vesi- : .1. faasissa) saostettiin lisäämällä NaCl:ia konsentraatioksi • · · • · · · · · • · • · 2 • · · 128 107938 0,5 M ja kaksi tilavuutta 95 % etanolia. DNA-pelletti liuotettiin 20 μΐ vettä.
In vitro mutageneesireaktiot 200 ng templaatti-DNA:ta sekoitetaan 20-kertai-5 sen mooliylimäärän kanssa sopivaa fosforyloitua oligonuk-leotidia 10 pl:ssa 20 mM Tris-HCl-puskuria, pH 7,4, joka on 2 mM MgCl2:n, 50 mM NaCl:n suhteen ja kuumennetaan 70 °C:seen 5 minuutiksi. Hybridisaatioreaktion annetaan jäähtyä hitaasti (40 minuuttia) 40 °C:seen ja sitten 10 30 °C:seen (15 minuuttia). Viimeisen hybridisaatiovaiheen
jälkeen seos siirretään jäihin 5 minuutiksi. Tähän seokseen lisätään 1 μΐ synteesipuskuria (4 mM kunkin dNTP:n suhteen, 7,5 mM ATP, 175 mM Tris-HCl, pH 7,4, 37,5 mM
MgCl2, 215 mM DTT), 0,5 μΐ T4 geeni 32:n proteiinia (2 pg/ 15 ui), 1 μΐ T4 DNA ligaasia (3 yksikköä) ja 1 μΐ T4 DNA po-lymeraasia (1 yksikkö). Seosta inkuboidaan 37 °C:ssa 90 minuuttia (jonka jälkeen 5 minuuttia huoneenlämpötilassa). Reaktio lopetetaan lisäämällä 90 μΐ liuosta, joka on 0,1 M Tris-HCl-puskurin (pH 8,0) ja 0,1 M EDTA:n suhteen. Noin 20 0,1 μΐ reaktioseoksesta käytettiin transfektoitaessa E.
coli XLl-Blue -solut (solut valmistettiin transformaatioon • · · [V I menetelmällä, jonka on kuvannut D. Hanahan, 1983, J. Mol.
*:./ Biol. 166: 557).
• « ··· Mutanttigeenin sisältävän faagin seulonta • « *···* 25 Noin 50 - 100 plakkia poimittiin tuoreille maljoil- • · *...* le, joille oli levitetty sopiva isäntäkanta (XLl-Blue) ««· määrätyssä järjestyksessä. Kun oli inkuboitu 6-8 tuntia 37 °C:ssa, maljojen päälle asetettiin nitroselluloosasuo- *:*·: dattimet ja ne valmistettiin hybridisaatiota varten oleel- ·*“. 30 lisesti, kuten ovat kuvanneet Davis, R.W. et ai. (Advanced ···
Bacterial Genetics: A Manual of Genetic Engineering. Cold • ·
Spring Harbor Laboratory, New York, 1980). Mutagenisoi- • · *···’ van oligonukleotidin kanssa käytettävä hybridisaatioläm- : pötila määritettiin oligonukleotidin emäskoostumuksen pe- 35 rusteella. Oligonukleotidi leimattiin gamma-32P-ATP: llä ja ··· 129 107938 polynukleotidikinaasilla (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Hybridisaatiot suoritettiin > 6 tuntia 2 -5 °C täydellisesti yhteensopivan oligonukleotidin lasketun 5 Tm-lämpötilan alapuolella liuoksessa, joka oli 6 x SSC, 2 % SDS, 100 pg hiivan tRNA:ta/ml, käyttäen 105 cpm leimattua oligonukleotidia/ml. Tm-lämpötila laskettiin käyttäen kaavaa: 4 °C kutakin GC-paria kohti + 2 °C kutakin AT-pa-ria kohti olettaen Na+-konsentraation olevan 1 M. Suodat-10 timet pestiin samassa lämpötilassa kuin hybridisoitiin liuoksessa, joka oli 5 x SSC, 2 % SDS ja valotettiin rönt-^ genfilmille. Plakkeja, jotka antoivat positiivisen hybri- disaatiosignaalin, käytettiin valmistettaessa yksijuostei-nen DNA, kuten on kuvattu yllä. Yksijuosteista DNA:ta käy-15 tettiin templaattina senvenssointireaktioissa (Sanger, F. ja Coulson, A.R. 1975, J. Mol. Biol., 94: 441) sen varmistamiseksi, että mutanttisekvenssi oli todella läsnä.
Mutageneesiin käytetyt oligonukleotidit 8N108K-"Presbyterian" 5'-AGGCTCCTGGGCAAGGTGCTGGTCTGT-3' 20 BE90K-"Agenogi" 5’-GCCACACTGAGTAAGCTGCACTGTGAC-3' . BV67I-(No Alias) 5'-CATGGCAAGAAAATCCTCGGTGCCTTT-3 ’ • · ί BN102T-"Kansas" 5 ' -GTGGATCCTGAGACTTTCAGGCTCCTG-3 * • · · *· ’· Kloonaus hiivan ekspressiovektoreihin • · *···* Faagin RF-DNA valmistettiin faagilla infektoiduista > · · ...: 25 soluista, joiden oli varmistettu sisältävän mutanttisek-• ·· venssin ja muutetun beeta-globiinigeenin sisältävä Xhol-fragmentti puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Tämä fragmentti kloonattiin plasmidin pGS3089 johdannai-seen, joka oli muutettu muuttamalla di-alfa-liitosryhmä .···. 30 diGly-muodosta yhden glysiinin sisältäväksi sillaksi ja josta johdannaisesta beeta-globiinigeeni oli poistettu, ja • ♦ : ** joka oli nimetty plasmidiksi pGS3889desbeeta (kuvio 26).
• · · *...·’ Tämä muodosti yhden ainoan XhoI-kohdan, johon muutettu ; .*. beeta-globiinin ekspressiokasetti voitiin insertoida, joka ··· · .···, 35 salli yhteisekspression alfa-globiinidimeerin kanssa. Täi-• · • · · 130 107938 lä tavalla muodostettuja ekspressioplasmideja (pGS3889 "Presbyterian"-mutaatiolle, pGS5189 "Ahenogi"-mutaatiolle, pGS5689 "Kansas"-mutaatiolle ja pGS4989 "beetaV67I"-mutaatiolle, jotka kaikki ovat identtisiä plasmidille pGS3089 5 lukuun ottamatta mutaatiota spesifioidussa kodonissa) käytettiin transformoitaessa S. cerevisiae -kannat GSY112 ja RSY334.
Hiivassa ekspressoidun geneettisesti yhteenliitetyn matalan affiniteetin sisältävän mutanttiproteiinin 10 ominaisuudet
Soluja, jotka sisälsivät plasmidin pGS3889 (yksi gly-silta, beetaN108K eli "Presbyterian"-mutaatio) kasvatettiin ja hemoglobiini puhdistettiin, kuten aiemmin on kuvattu. Tämä materiaali, kun sitä analysoitiin toiminnan 15 suhteen, oli oleellisesti "oikealle siirtynyt" verrattuna villityypin beetaketjun kanssa yhteenliitettyyn proteiiniin (P50 = 23 - 25 mutantille, N = 2,5).
Esimerkki 25
Kannan valinnan ja induktiolämpötilan valinnan vai- 20 kutus di-alfa-hemoglobiinin ekspressioon E. coli . -bakteerissa • · • · · *** 1 Taulukko 100 sisältää di-alfa/beeta-fermentaatioi- • · · den vertailut. Se esittää myös induktiolämpötilojen ver- • · ’···’ tailut. Sarake, jonka merkintä on "mg di-A+B" on kokonais- ··» *...· 25 milligrammamäärä di-alf a- ja beeta-polypeptidejä per fer-• · · mentaatio. Viereinen sarake, jonka merkintä on "mg/0D-L", • · · yksinkertaisesti esittää ensimmäisen sarakkeen luvun perustuen solutiheyteen. Kaksi saraketta, jotka on merkitty ·:··· RHGBrllä, esittävät läsnä olevan toimivan rekombinanttihe- .1·1. 30 moglobiinin kokonais- ja solutiheydellä korjatun saannon. ···
Viimeinen sarake osoittaa, että lopullisen toimivan hemo- • · • ” globiinin saannon suhteen kanta JM109 on suositeltava.
··« • ·
Ilman, että sitoutuisimme mihinkään teoriaan, uskomme että ·1· tällä erolla on tekemistä eri kannoissa ekspressoituvien *»· · .··1. 35 proteaasien kanssa. On kiintoisaa huomata, että kahdesta ·«· 131 107938 parhaasta JM109 kasvatuksesta yksi induktio tapahtui 30 °C:ssa ja yksi 37 °C:ssa niin, että molemmissa tuotettiin karkeasti samanlaiset määrät lopullista toimivaa hemoglobiinia.
5 Esimerkki 26
Yhdellä glysiini- tai proliinijäännöksellä yhdistettyjen geneettisesti yhteenliitettyjen alfa-glo-biinidimeerien rakentaminen
Syntetisoitiin seuraavat synteettiset adaptorisek-10 venssit di-alfa-globiinisillan muuttamiseksi ja ne puhdistettiin, kuten on kuvattu aiemmissa osissa.
TSKYRPVLSPÄ 5’-A ACT AGT AAG TAC AGA CCT GTT TTG TCT CCT GCA-3' RPV 15 3'-T TGA TCA TTC ATG TCT GGA CAA AAC AGA GG-5'
Hpal PstI
TSKYRGVLSPA 5'-A ACT AGT AAG TAC AGA GGT GTT TTG TCT CCT GCA-3' RGV 3'-T TGA TCA TTC ATG TCT CCA CAA AAC AGA GG-5’
20 Hpal PstI
» • · j RPV- ja RGV-oligonukleotidien komplementaariset « t i ** ” parit yhdistettiin (2,4 pg kutakin oligonukleotidia) • it 0,05 ml:ssa vettä. Kaksi adaptorisekvenssiparia saostet- ··· 25 tiin (erikseen) lisäämällä 2 μΐ 4 M NaClria ja 0,158 ml ··· 100-%:ista etanolia, jonka jälkeen sentrifugoitiin. Pelle- ;***: tit pestiin 80-%:isella ja 100-%:isella etanolilla ja kui- ··· vattiin. Adaptorisekvenssit liuotettiin 24 pl:aan TE-pus-kuria.
• · .···. 30 RBGV- ja RPV-adaptori sekvenssi en kloonaus ^*·* Plasmidi pGS2989 digestoitiin peräkkäin Hpal- ja : *· Pstl-entsyymeillä ja vektori puhdistettiin agaroosigeeli- ··· elektroforeesin jälkeen. Sitten digestoitu plasmidi ligoi- : .·. tiin 10-kertaisen mooliylimäärän kanssa joko RGV- tai RPV- .···, 35 adaptorisekvenssiä (näitä adaptorisekvenssejä ei fosfory-« · *·· 132 107938 loitu), kuten aiemmin on kuvattu. Osaa ligaatioseoksesta käytettiin transformoitaessa E. coli DH5 -solut. Transfor-mantit selektoitiin LB-maljOilia, jotka sisälsivät ampi-silliinia. Kloonit, jotka sisälsivät uuden adaptorisek-5 venssin, tunnistettiin pesäkehybridisaatiolla suodattimille. Hybridisaatiokoettimet olivat joko RPV- tai RGV-sek-venssien yläjuosteet (kuten kuvattu yllä). Nämä koettimet leimattiin gamma-32P-ATP:llä ja T4 polynukleotidikinaasil-la. Suodattimet hybridisoitiin sopivilla koettimilla (105 10 cpm/ml) 37 °C:ssa liuoksessa, joka oli 6 x SSC, 50 % form-amidi, 2 % SDS ja 150 pg hiivan tRNA:ta/ml. Suodattimia inkuboitiin > 12 tuntia ja pestiin 4 kertaa liuoksella, joka oli 2 x SSC, 2 % SDS (250 ml, 20 minuuttia kerta) ja valotettiin röntgenfilmille. Pesäkkeitä, jotka tuottivat 15 autoradiografiasignaalit, käytettiin valmistettaessa plas- midi-DNA, joka senvenssoitiin käyttäen seuraavaa aluketta: 5'-AAGCTTCAGCACCGTATTCA-3' (alfa2seql). Tämä aluke suunniteltiin spesifisesti niin, että se minimoi homologian vastaavaan sekvenssiin dimeerin alfal-alayksikössä ja niin, 20 että se maksimoi homologian niille sekvensseille, jotka sijaitsevat lähellä di-alfa-dimeerin alfa2-alayksikön 5'- • · · * päätä. Tämä sallii sekvenssin määrityksen niin, että sitä • i · I// luetaan alfa-alueelta sen sekvenssin yli, joka yhdistää • · *···* kaksi alfa-domeenia, ilman ettei tule taustasekvenssiä, ··· • · 25 joka luetaan läheltä alfal-domeenin 5 ’-päätä olevasta sa- ...
♦ ·· ·...· manlaisesta sekvenssistä. Tällä tavoin rakennetut plasmi- ··· ί.,.ί dit nimettiin plasmideiksi pGS2989RPV (yksi proliinilii- tossekvenssi) tai pGS2989RGV (yksi glysiiniliitossekvens-·:··: si).
.**·. 30 Kloonaus hiivan ekspressioplasmideihin ··· ..· Notl-fragment it joko plasmidista pGS2989RPV tai • · pGS2989RGV, joka fragmentti sisältää hemoglobiinin eks- • * *·..* pressiokasetin, puhdistettiin agaroosigeelielektroforee- • ;*j silla ja jatkokloonattiin plasmidiin pCIN, joka oli diges- ·· · · 35 toitu Notl-entsyymillä. Plasmidi-DNA eristettiin ampisil- ··· 133 107938 liiniresistenteistä transformanteista ja analysoitiin di-gestoimalla Notl-entsyymillä ja ajamalla agaroosigeeli-elektroforeesi. Nämä plasmidit nimettiin plasmideiksi pGS3089RPV tai pGS3089RGV. Näistä muodostettiin toinen 5 sarja plasmideja niin, että helpotettiin eri beeta-ketju- mutanttien substituoimista. Nämä plasmidit muodostettiin digestoimalla XhoI-entsyymillä ja ligoimalla uudestaan itsensä kanssa kiinni laimeissa olosuhteissa (< 1 pg/ml). Tämä suosii beetaketjun ekspressiokasetin poistumista. 10 Ampisilliiniresistenteistä transformanteista eristettiin plasmidi-DNA ja rakenteet varmistettiin digestoimalla NotI- ja XhoI-entsyymeillä (nämä plasmidit nimettiin plasmideiksi pGS3089RGV-desbeeta, katso kuvio 26, ja pGS3089RPV-desbeeta).
15 Viite-esimerkki
Rekombinanttialfa-globiinin ja rekombinanttibeeta-globiinin rakentaminen hemiryhmän kanssa ja kemiallinen pelkistys keinotekoisen hemoglobiinin saamiseksi 20 Seuraava menetelmä antaa esimerkin tavanomaisista menetelmistä keinotekoisen hemoglobiinin valmistamiseksi.
• · · *** 1 Lyofilisoidut rekombinanttialfa- ja beeta-globiinit • · · •#2 (100 mg kumpaakin) liuotettiin erikseen liuokseen, joka *···1 oli 8 M urea/50 mM Tris-HCl, pH 8,01, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, i·· ...1 25 laimennettiin konsentraatioon ja inkuboitiin huoneenlämpö-• · 1 ·...· tilassa 3-4 tuntia. Sitten alfa-globiini laimennettiin ··· konsentraatioon 0,3 mg/ml jäähdytetyllä liuoksella, joka oli 20 mM K2HP04, pH 5,7, 1 mM EDTA, 1 mM DTT. Hemi (25 mg) ····· liuotettiin konsentraatioksi 2,4 mg 0,1 M K0H:lla, laimen- .1··. 30 nettiin samalla tilavuudella 1 M KCN:ää; tästä liuoksesta • · 1 tehtiin sitten fosfaattipuskurin varastoliuoksella sellai- • ·
• 2 nen, että hemikonsentraatio oli 0,1 mg/ml ja se oli 20 mM
• · K2HP04:n, pH 6,7, suhteen. Tässä liuoksessa oleva hemi li- ;1j sättiin 2,8-kertaisena mooliylimääränä jäähdytetyn alfa- ··· · 2 .···. 35 globiinin joukkoon ja lisättiin samanlainen moolimäärä *♦· 134 107938 beeta-globiinia ja liuos dialysoitiin 4 °C:ssa yli yön liuosta vastaan, joka liuos oli 0,1 M K2HP04, pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 mM KCN. Keinotekoisen hemoglobiinin liuos konsentroitiin ultrasuodatuksella käyttäen PM-10-membraania 5 (Amicon) ja siirrettiin 200 ml:n kierrekorkkiseen kumisen väliseinän sisältävään koeputkeen. Hemoglobiiniliuoksesta poistettiin happi tyhjiössä ja huuhdeltiin N2-kaasulla ja sitten liuos kyllästettiin CO:11a. 100 mM natriumditio- niittiliuos valmistettiin anaerobisesti 20 ml:n kierre-10 korkkisessa kumisen väliseinän sisältävässä koeputkessa. Hemoglobiinilluokseen lisättiin 4,5 ekvivalenttia ditio-niittia ruiskulla ja seosta inkuboitiin jäissä 15 minuuttia. Hemoglobiiniliuos geelisuodatettiin 10 mM natriumfos-faattipuskuria, pH 6,0, vastaan 4 x 40 cm Sephadex G-25-15 pylväässä (hieno). Värillinen liuos ladattiin sitten 2 x 10 cm-52-pylvääseen (Whatman), joka oli tasapainotettu samalla puskurilla ja kromatografia suoritettiin lineaarisella gradientilla, joka oli 500 ml 10 mM natriumfosfaat-tipuskuria, pH 6,0 ja 500 ml 70 mM natriumfosfaattipusku-20 ria, pH 6,9. CO poistettiin hemoglobiinista fotolyysillä , happivirtauksen alla. Tällä tavoin valmistettu keinotekoi- • f • » · * nen hemoglobiini eristetään fuusiopeptideistä ainoastaan • · · noin 25 % saannolla, mutta se omaa luonnollisen hemoglo- • · biinin hapensitornisominaisuudet.
• · · • » • · ··· ·-—· • · · • 9 • · «·« • · · • · • · • · · • · • · · • · ··« • « • · • ·· • · · • · • · 135 107938 -HMOJMtgSSWctiWHJ-lUSiii-lW-P (O-HXjXJf-lrHrH >iiHrH(0£! 0) Q) U Φ >1 <L·
w>KftEH<OOvJ<<>EHWJEHWiJS
+J
Φ <u
+J
c ^ a) (0 M g H (0 r-t -r-\ £ £ r-i rH W >i i—t JC H Ä 0) tD V-liH >1 <0 M C)OK^EhOUC>J<EhHEhWJEhO^> (Ö <d e
*H
u ft fi
ω --twiJMOd3tn>-in3r-ic:to3Ci>iWrH
M
•H
V.
X
in rH MWS^OiJ3M^r-l(0X;^|Q)MfH>,rel <a (0-ho)X3^h-h>,Q)<>Eh<iJHO^>
.5 OHf\]r)r}1inVOf^CO
£ 0¾. rHCjn^LOVDr^COO^rHrHrHiHrHrHf—IrHf—I
*H «H
J2 0 t—I 1
tr· -H
w c ,Μ <» -H H CN n OfHCNn^in
5 ,T{i<<i<rH<Nn^1inVOrs-COCJ>rHrHcHrH<-HrH
H
* * · • · · ·#« ·
• « H
• · · ·· n • · 8
• · Λί nJ
*···1 5 3^ωΜ3εΓ«^Φ0)ΓΗ>-ΐ4-)α.(0ω<ΐ)^}-( ·2 3 φ Φ QJX;>iX^J-lX;HrHfO<l)(UMr-l>ir-lQ)x; i (0 tsi to i4EHH5EHO«<EHHH>cnSEHi«dJMW.E-t »»· £1 • 1 · iHWfÖfOP1>fWr-l>irö #e# 1H C3 Ih O (0 04 ΙΛ G Π3 rH r1H 0 rH (0 H rl
• · ro <D(Di-4r-(cn>ix:w>^c<;EHO^>u)C
*··1 £> »-3c/30-triJrt2i-3EHrtJ
OHCJn^lil^hCOOl ö rH CNJCO^intöf^COdir-lrHr-if-lr-ir-ti-tr-ir-ifH
• · ··· ,rj
• · (D
• ri4
*** ή h cn OHtNn^rinvoH
• ♦ r{ < »<H04n^tnVOr^COCnf-irHrHHrHrHHCQ
··· • 1 • · «1« • · * · « • · · ··· · ··
• I
• · 2 · 136 107938 C -H 3 3 (0 >. >ι 3 rö 3 >t O1 3 3 Η H M O Λ M G tr>
to ίΰ iH f-H rH fH rH rH - r—I 0) rH )-l 0) 0) (0 (0 SH J-t M ,3 Ή M
<>OU<UUU<^OCi3>3>>E-iC1<E-<9hOC
CrH3afö>-<>i3>-!3>.tn33>Hr-i^ o o, m c tn W<ClrHWrHrHtHrH.C<D.-<Ma)a)«J(Ö>i>-)>-4.C>-lk <>α-<-<οϋθ6^>-:ια<>-5μ4>>^αιΕ-ι^!3<
CrHQJflrH>1>13tÖD>ltri33r-(r-tUOCLl^-lC:Cr> tO(OIOrH(OrHiHrHrHO).H)-(Q)a)iO<C>i^H.c:-H S-t <><<>οοο<:^ο<κ3ι-3>>ΕΗα<Ε-ιε-ιο<: CHa3H>n>i3rtJ3>i^33fHr-ti-ioaMC tn
to (0 10 rH (0 »—)<—l rH rH 0) rH M 0) 0) (0 (0 £11 V-i —( M
<><α>οοο<>-αο<»-ί^>>Ε-<α<ΕΗΕΗυ< (TiOHrMro-iTLn^Dr^cocriOHrjn^tnvor^ oo en o i-ttMtMCMCNfMtNtNtNCNjcNnnnnnronnnn·^·
O r| CM Π LO
rHtNn-^invOt^COOii-HrHrHi-IrHrHHrHiMn-ciinVD
cQCQiDiBcQcacQcQcQmmcQmaampQuoouuu • · • · · • · · · • · • · · * · · • ·
·2 rH r—i W «C 1H rH ,£ rH ΧΞ (D rH M QJXl (1) QJ 1H &H rH £J £>t .C
.···. 0<<ΗΜθΕΗθΕΗ^υ<^ίΧ(-3^2:θΜϋΕΗι-3Ε-< • · • · ·
t0(0>i3M>-i(03i033tn-PQ)3>-ia)OS-(i-il0G '...· »-1 H H H >1 I—I iH iH rH 0) rH 1-1 Q)X1 0) 0) £3 11 £ £ >1 .C
... 33<OOHO<OCt-3U)<S&<iJt0)ala,E-i&Hr3EH
» ·
*··.1 OtHfMn^intor^ooiTiOiHojn-crtnvoo-cocriOrH
ojror^rNJfMOJOJrJrNrvjnronnnnnnnnH-H· • · ··· • · ...1 o H c\! n rr in Ώ . HOOnH'LO^DO'COCTiHHHHHHrHiHrSin'itn'Xi ;·. cacdcQcQCQCQcaincamracQCQmoamuuoooo • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · · · · · • · • · 2 ·»· 137 107938 Χί.βωω.β.ΗΙΛΦαίφ^φΗΓΗφΓ-ίΙΛ^ί^Πί^Ή-ΗΓΗ &ια4<ωβ<θ(<^ΜΐΛΡΜω<:Η^ϋ<Λ^>κΐ<Χϋ
QjQjftMai^cs^s-itOMnjaJ+J^cowr-iMmw^ £ £ tfl O £l .H U) 0) 0) 0) r-H 0) H H Q>iHt/l M >, (0 >i -Η -H r-l Λθι<:ω&ιθ<^οον2<αοι<Η^!θ'<Α<^>)-3<π:ο
Qio^j-idj^cuSJ-i^o&iOf-ia-JNCotnHWrtStn^ £ £ Η Ο ΐ H W 0) 0) (I) U U rH (0 O iH W Xl >i (Ö >i r-H -H rH
Cii&40WCiHC)rt:iJWwa4C<«C>S0<(^vJ>f-3<£C 0 (UOSJ-iQJ^iaiSS-i^ioafO^-P^cowiHtnmtn^
Xt Si r-t Φ JZ r-i U) Q) 0> £5 M WH <0 0)γ-Η Ui (J > Λ > rH ·Η r-l
ftCuocnfta<<tJwHOH1<<;>su<CL.>4>iJ'<ffiO
r-iCNj n'tfinvop'COCiOi—(f'Jnrrtn'iir^oocnOi-irvjn-ij· Η-Η’Η-Η-Η’Η'Η'Η’Η'ΐηιηιηιηιηιηιηιηιηιηνονο'.Ο'βίο iHcMc-iH-cnior^co r'QQQQQQDQt-iiNnTrinvor^rHojn'i'invor^co
UUCJaUOUUUQQQQQQQWiywwtaUWW
• · • · · • · · · • · • · · *· majoina) a. o tn ο >,>-ιπ3Π3σ>πΐω>, .***. >,Χ:Μ·ΗΧ: Ui 0) -H U ΓΗΦ·Η.Ηα)Μ·Η·Η.Η
'...· &h cm o-, rc ex. e iJ s o. ucn<oJC^KU
»·· -·—· *.··1 MO)OU)<U CL, D M W >i>-l(OCMtn>iUJ>, ··· S Ji ei -H JC W 0) (1) "H i—I Ci .—I t (0 i—I Ή Ή :: B e. ie κ ft 1£ .j w κ uwco>Joko • · · ,···, <n n h· in ld h co oi o iHoin^inior-cocn h· h· h· h· h· h· h1 h· in ininininininmintn • · ··· HcMnxriniDr^co σ\ *: r- w w ω w Hwww tyr-icMn^inuor^co ·;· uuuuo uuuu uwwwwwwww • · • · ♦ · · • · · • 1 • ♦ • · • · · * · · • 1 · · · · • · • 1 ·»» 138 107938 tnwr-in^^oiHOjioaJwc-pacrJ tnotocufow >i>i«OOXJ<U-j:HWrHH>iUia)WW<D >1 M Ι-H x: r-t >1
M
xi Η inwrHiij-i^a^iarciciJwtn^ci.a^ tn Μ α> rct c
>1>1(0<1)X:Q)0»HWHH>1-H<1)WW<L· >( iH X2 x: H r-H
^^>Χ1Ε-ιΜ^Ο-<-<Η^Κι-5<<:ι-ί XI O &-< CU <=C O
MtniHSSHnJtDUaS^StdlflS&CS V) >ι >-l Φ M C
>,>,feorH^ix;a)tnr-HQ)r-i-HQ)ww(i) >, x: x: φ .h xtxi>x0<a<wctj)xirf::r:xi<<x! x e> h λ to o ^(öojj-i&^dnjmdacs w >ι s-ι q> jo m
WMr-H3r-lnHX:(l)WrHQ)rH-Ha)WtnO >i rH XI Xt rH XI
>i>i.<o(uo<;ftw<c5>j<E>J<:<c^ x u h (¾ <: e-i j ^ ^ cTvOHrjnttmvDr^coc^OrH oj r> -s1 in vo r- inion-ooiDr^r^t^-n-r^r^t^r^r^r^coco cococoaDcoco « Φ w m
Or-iojm-ttinior^oocnoHnjn^ttn νο h to CTtl—irHtHr—irHt—ir—ir-irHt—(¾ H OJ Π WWWWWWWWWWWWWWWtdW W W W 6u Cn fti • · • · · • · · · • · : 2·ϊ ^inrHrH(Oro^>iarorHtn^a)aacD >, >, <o 3 >-i w O ί>Ί f0 (0 Ή I-H (13 H 10 rH (¾ t>1 (D rH (/) {/) rH <-H rH r-H Q) Q) i>1l ;2. wt-3>><<>u<<>JwH<<;H oucJiOf-i ·«1 :3: yicnrHtoaiOSV-tCiCrHtönMaaxJ o c to 3 χ φ ··· >,>i(0i-it0r-iQ)x;t/i^Hro^H-H(0tnma) m w >-( φ φ >-h .···. x)X)>c<<;h}e-<<c<<><3:>i<<c£: & c < xi w < • ·
··· Or-IrMf-l^iniDlOCOCTiOHtNn-tfiniO r^COCTiOHtM
101010101010101010101-1--1^1--1^^1^ t— t— t— co co co • · • · · • •Ml OHnin-crinOr- cocriOXmm^in id r- co ··· CTttHrHr-HrHrHT—IrHrHrHr-ICNXiiXXiXiX X fx-ι [x< γΗ ΓΊ ΟΊ : wwwwwHtawtqwtqwwwwMw ω pq w χ, x< tx • · « • • · • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · ♦ • · · · · 1 • · 2 • · 3 ··« 139 107938 Q)QJiH(U-H>,U)>,a)-H(flU)UiHt/lJC>ia)a><HW«JQ)(e iJtnO>JKO. <^^X><AU)<Ai4tJJO<>S>
3^l33WWCXU)3M^IDU03C<l)W33>iCrHi3iH
Q)<l>r-IQ)-H>iW>,<l)-H(dW^rHW£;>iO QJiHW(Ö<U(0
3S-j3öwwatnDu)rnaosc<i)iT'33>1CrH3rH
<U(UrHQ)-H>iW>,aj-H(ÖWi-lrHW.c:ka)a)r-ll/}(Ö<UlC
^ωυι-ίΚα<ι^^Κ><Λϋ<Λ<^ι^Ο<>ι-}> 3^33wtnau)0M.Hao3C(ucn33>iC<HDrH ΦΦΗ(1)·Η>ι1()>,Ι1) -H fOMMrHWx:kQ)a)i-(WfÖ Q)(Ö
eoCTtOHfvjrtTiinyjr^cocriOHfsjn-itinvDi^cocriOH
COCOCTiOlChCTiCriCriatCriaiCriOOOOOOOOOOr-lrH
rHr-lrHr-lr—li—li—IrHr-lc-lr—IrH
Hooo^rin ΟγΗγμπ
^ιηνο^ωσ^ϋΟϋΟϋΗΓΜη-ψιηνοΓ'ωσιΗΓΗτΗΗ feink.CufcjtiHluCukiCufciOUOOUOOUtJJUCDOU
• · ♦ · ·
*"1 3^3Dwrav-i<i)3cr>^tao-HC(Uwaautnw3D
*. ·: ^υ30^Κι<ΗΜ»-ί<><&)><&<^μ3^ϋ3Χυ>-3ν4 ·“1: 3 3 U W W 3 3 ^^cxncnrotncnscrif-faoi-icaimcuajaj-HSNaJcu α)Φυ)ω·ΗΜ·Η>ι(ΐ)^π3ΐη^(θωχ;>,ι-ΐ>-3ϋ)π:υι-3^ : : κ)ω<^ιχ<ΚΗ3ι-5<><:α,><0<Η3 *·· o h cn n in vo .···. roii-invor'-cocnOrHojnrt'invDr'-coovooooooo
COCOCOCOCOOOCOCTlCriCriCri<T>CnOVCnCriCTVrHrHrHiHrHt-ltH
• · · • · • · ·»· • T-icMn^,in Oi-ncvin
*ϊ”ϊ '^invor^rocriOOUCJtDHCMn'a'invor'CocrvHi-irHiH
t.futitutifciUifctKCuCuOOOOOUlJOOOCJOC) • · 1 • · ··« • · • 1 • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · · · · · • · • · • · · 140 107938
ϋiίS^¾Wϊ>1ί?:3<1, ^Orf^CrtlOCUCWDH
HHu<EHKQ<at-3oai E-fCuu>a<<Enu»-:)t-5>
w, ^03rHCf05-tacu)-ulH
H^JChKCUUiJOCU E-<0<O>O<;wEhOJS>
ί2Γΐ!^^ΡΕ:?ί>^υ1:3<ΰ ^OC4JC(T3(O^CWMrH
^ W JS i-H <—r J3 .Ci-liHOJrHrHrH^r-l^rÖrcJ
u>i-Pr<c<OHOtJe)a< {hcuoso<«:e-iuh3>>
WrH3<öt/)w<D>iW3a) >-ioOrHC<öro^-ic:wr-<,H
U>M<KK(l,C5i-PU(li E-iCUCLi>CJ?i<ri;EHU>-;l>> 22522r'‘00CP'Or_l(N f^^invor-coiTiOi-ifNiforj· !Z)!lJ'Ij'Ijr"ir1rHr''r'Jr'5r'1 f^CN)(M(N03rNtMnr>nnn
t-li-lrHrHrHr-(HrHrSt-l^ r-IHHr-1<—IrHrHr-lr—IrHHrH
<·ιηνθΓ^ιχισιΗΓνίη^ΐΛ Q Q
HfNn-rrinvOr^COi-li-lt-ir-! uuuoooe>oe>ue> kskkkskkkxkk • · • 1 2 3 « • · · · * «
***: ^(osnjwiflrtjaacnaiD
>&-ΐι^<<<:α<α.<:<αι Ε-ι<ο<:ι:<:<&-ι<:μ3α..-3 ... E-<a(fcc>:r:,<c/3(j<<i-3cn1j) *···1 coCTiOHtMnrrinuJt^cocn
... 222i^rjr1'i'iH'H H'-HtNrgcNtNrsjtMOJrgrgcN
. . Ήι—1<—(t-<r-<r—(γΗι-ΗγΗγΗγΗ HHHH-HrHrHrHrHtHHH
* 1 « • · ^rinvor^cooNi-iiNcn^in , _.
.... uuuoooouomei κπκκκχκΕΚΉΚΧ • · • · · · • · · • · • · • · · 2 • · ♦ t · · 3 · • · · • · • · • · · 141 107938
*-i(ar-i<tia)ra:3<öMWMW <D d Γθ r—I I—I r-1 QJ <—I d >< ϊ>ί -rH
(0
rH
< l-i >1 >-1
JS d f0 d CU r—I 0) 0) Q) M >1 -H
E^u><w<;>-qww<:£-<K
<0>id<öGi03(eWU)l-iW rl H Γϋ d W d ID rl ·γΙ >i >ί ·Η ----- «>^rHrac(0d(0wwi-iw
d d (Öd U)d O) d d >, >i -H
invor^cocriOdcNdri-invo nnddd^^rr^Tjrr-ci· r—I d x—I d d d d d d d d d nrtfinvor^cocrioddcvjr·)
dddddddfNJiNUOO
κεκκκχκεκκκκ • · • · · • · · · .1. ! Jjddljl-ldSlVJSllflMCr' *. ·: d)rord(U(3jra(i)x:d>,>,^ ... M>>WW>JE-<OiJE-i< • · ···1 n3i-id>-il-iddV-i5-iW>-iCri ··· d ai <o <u js m w s; a> >t >< y< i i <ϋ)>ΜΕ-ι>ι-5Ε-ιεΛι-3Ε-<<< • · · .·2. odfMd'TinvDr'COcnod ·...· ddnririnriddn-irrs· ... dddddddddddd • · • · • · · *·2ί n-'fincot'-cob'iOddcNn
dddddddCNCNUOO
.1·1. EKKEEEKEEXKK
• · · • · • · • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · · · · · • · • · 2 • · ·
Taulukko 2 142 107938
Di-alfa-globlinigeenlen muodostamiseen käytettyjen oligonukleotidien sekvenssit 5 a1 (Arg) -Gly-Met (Leu) a2 -linkkeri
BstBl Eagl
CGAAATACCGTGGTATGCTGTCTCC
TTTATGGCACCATACGACAGAGGCCGG
a1 (Arg)-Gly-Gly-(Vai) a2-linkkeri 10
BstBl Eagl
CGAAATACCGTGGTGGTGTTCTGTCTCC . TTTATGGCACCACCACAAGACAGAGGCCGG
a1 (Arg)-Gly-(Vai) a2-linkkeri 15 BstBl Eagl
CGAAATACCGTGGTGTTCTGTCTCC
TTTATGGCACCACAAGACAGAGGCCGG
a1 (Arg)-Gly-Gly-(Leu) a2
BstBl Eagl
CGAAATACCGTGGTGGTCTGTCTCC
20 TTTATGGCACCACCAGACAGAGGCCGG
a1 (Arg)-(Vai)a2 • : BstBl Eagl
: CGAAATACCGTGTTCTGTCTCC
TTT AT G G C AC AAG A C AG AG G C CGG
• · • · ··· • ♦ ·♦· ··» ♦ ♦ • ♦ • · · • · · • ♦ • · • · · • t • · · • ·
Ml • • · • · · • · · • · • ·
IM
• ♦ • · · • I I ··♦ ♦
IM
• ♦ • ·
IM
143 107938 4J •H to to .
c
<D
£ o u ω < < w B Eh
^ HU Ηϋ H
P. COO COO <UO
.¾ ftrtj Eh ft4-> (0 0j Eh 0 w<eh kcpo wc •h - < eh υ O' o +| O O O O C Eh
2 Eh C Eh C Eh C
® O O O O O O
,y O O O O O O
P C Eh C Eh C Eh g C Eh < H ' C Eh
g, O O O O Eh C
•h C Eh C Eh O O
h o o o o o o O o o o o o o
„ Eh rt) Eh C Eh C
5 o o o o o o o o o o o o
>, <1 eh C EH Eh C
~ -μ o o o o o o +i EH C Eh C EH <
O O O O O O
tL O O O O U O
,Jd O O O C O O
λ: Eh C Eh O Eh C
_ O O O C EH < g Eh C Eh Ο 0 O' S O O O O O O'
μ Ο Ο Ο Ο (0 -P
•H O O O Eh C Eh e C EH CO C Eh
5 O O O C O O
t; Eh C Eh O O O
O O O O C O O
Ό Eh C Eh O O O
0 O O O C O O
2 Eh C Eh C C Eh
e Eh C . H C O O
C Eh C Eh C Eh C
(U O O O O Eh C
Ό O O O O O O
Eh C Eh < O O
• .2 O O O O C Eh .:: π oo oo oo *·· 1 rfl OOO'OO oo
: je Eh C U Eh c Eh C
*.·: +| oo coo oo ... I U O' A 0 O' <! Eh
• · -H -P (0 I 4-)(0 C EH
’...1 c (0 4-) I (0 4-) . C Eh
... ·η C Eh W C Eh O O
:: -ri C EH >1 C Eh C Eh
··· § C Eh H C Eh OO
.···. X C Eh < Eh O O
·· tp <0Eh<siCEh OO
··· I C Eh co C Eh Eh C
.1·1. 5 Eh< n Eh C OO
·...1 % 001^00 C Eh
O 0) rUJ 0) rH O MHOO
CQ Ή O Eh H O Eh ÄOOO
•H U C 1rl U < 4J 10 C
. - ASO A S O A W O
ro j J ! Eh
.···. O H rH C
: x ro (0 w *:1 -¾ > > to *· r-l N S- rj . . 3 «Ο Ό o : to <TL <a - ... Eh CQ.
• · • · • · · • · • » · • · · • ♦ · · · · • · • · • · ·
Taulukko 4 144 107938
Hemoglobiinin kaltaisten proteiinien P50-arvot
Hemoglobiini Pe n des-vai Hgb 10,2 5 di-alfa (arg-gly-met) Hgb 9,0 di-alfa beta67vai—>ile Hgb 16, 0 di-alfa beta67 vai—>ile/ beta82lys—>arg Hgb 16,0 di-alfa (arg-gly-gly-val) Hgb 16 j0 10
Taulukko 5 pGÄP-sekvenssin syntetisoimiseen käytetyt synteettiset oligonukleotidit -w-
15 1 TCGACTGAAA AAAAAGGTTT AAACCAGTTC CCTGAAATTA TTCCCCTACT
TGACTAATAA GTATATAAAG
2 CAATACCTAC CGTTTATATA CTTATTAGTC AAGTAGGGGA ATAATTTCAG GGAACTGGTT TAAACCTTTT TTTTCAG
3 ACGGTAGGTA TTGATTGTAA TTCTGTAAAT CTATTTCTTA AACTTCTTGA ATTCTACTTT TATAGTTAGT CTTTTTTTTA GTTTT
20
4 AAGTTCTTGG TGTTTTAAAA CTAAAAAAAA GACTAACTAT AAAAGTAGAA AGAAGTTTAA GAAATAGATT TACAGAATTA CAAT
• ·
:·: | 5 AAAACACCAA GAACTTAGTT TCGAATAAAC ACACATAAAT AAACCATGGT
taact • · • · · 25 ··» • · ···
• M
• · « · • t ·
• M
• ·
• I
• · · • · ··· • · « ·♦ • ♦ • ♦♦ • · « ♦ ··· « ♦ · • · · ♦ · · ·· ♦ · 1 ·· • · « · ♦ ··
Taulukko 6 145 107938
Galaktoosin ylävirran aktivaattorin syntetisoimi-seen käytetyt synteettiset oligonukleotidit
1 CGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTC
5 TCCTCCGTGCGTCCTCGTC TTCACCGGTCGC
2 AGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCTTCGGAGGGCTGTCACCCGCTCGGGG CTT CTAAT C CG TA CG CATG
3 GTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAAT AAAGATTCTACAATACTAGCTTTT ATGGTTATGAAGAGGAAAAT
10 4 ATAACCATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCG
GCGCGAGGCACATCTGCGTT TCAGGAACGCGACCGGTGAAGAC
5 TGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTCAAATGAACGAAATCAAATTA ACAACCAGATATC
6 TCGAGATATCTGGTTGTTAATTTGATTCGTTCATTTGAGGTTTGTGG
15 GGCCAGGTTACTGCCAATTTTCCTCTTC
Taulukko 7
Hiivan kodonikäyttö
Ala GCU, GCC
20 Ser UCU, ucc
Thr ACU, ACC ·
Vai GUU, GUC
. Ile AUU, AUC
• · • t ·
.\ : Asp GAC
U Phe UUC
'···; Tyr UAC
:::Zi3 cys ugu
Asn AAC
.···. His CAC
• · • · ·
Arg AGA
*** Glu GAA
Leu UUG
....:30 Lys AAG
* ' Gly GGU
·*“: Gin CAA
*.*· Pro CCA
·· • · • ** Met AUG (Ei vaihtoehtoisia kodoneita) J ; Trp UGG (Kuten edellinen) : .·. 35 • · ♦ .···. Lähde: Bennetzen ja Hall, J. Biol. Chem., 257:3026-31 • · • f#
Taulukko 8 146 107938
Kahta peräkkäistä alfa-globiinidimeeriä koodittavan geenin rakentamiseen käytetyt oligonukleotidit
AL-1SS
5 5'-tgcacgcttctttggacaagttcttggcttctgtttctactgtgttaactagtaagt acagaggtggtgttttgtctcctgcagacaagactaac-3'
AL-2SS
51-gttaaggctgcttggggtaaggttggtgctcacgctggtgaatacggtgctgaagcttt ggaaaggatgttcttgtct-3'
AL-1AS
5'-tgcaggagacaaaacaccacctctgtacttactagttaacacagtagaaacagaagcca agaacttgtccaaagaagcg-3'
AL-2AS
15 51-ggaaagacaagaacatcctttccaaagcttcagcaccgtattcacccagcgtgagcacc aaccttaccccaagcagccttaacgttagtcttgtc-31
Huomaa· NcoI-ALPHA-l-ApaLl; FoKl-ALPHA-2-Sall; ApaLI-RGGV-Fokl Taulukko 9 20 FX-hemoglobiinista ja tryptisellä digestiolla muo dostetun rekombinanttimutanttihemoglobiinin happi- . affiniteetti • « • * ♦ *** l Happiaffiniteetti mitattiin Hemox-Analyzer-lait- • ♦ · *#/ teessä 37 °C:ssa 50 mM Bis-Tris-liuoksessa, pH 7,4, joka • · *...*25 oli 0,1 M NaCl:n suhteen. Liuokset olivat 60 μΜ hemin suh-·«* *..,* teen ja ne mitattiin 130 ja 1,2 torrin happipaineiden vä- - C: iillä.
Eso
Hgb A0 9,5 ....:30 rHgb A„ 9,2 .···. Hgb Providence 10,2
Hgb Kansas 11,3 : ’** Hgb (beeta67 val-»ile) 22,4 • ·· • · • · ··· m * · • · · • · · ··· · ··· • · • * • · · 147 107938
Arvo Hgb Ac:lle on "tietysti liuoksessa olevalle vapaalle hemoglobiinille. Kokoveren P50-arvo on paljon korkeampi .
Taulukko 10 5 NaCl:n ja inositolin vaikutukset hapen sitoutumi seen hemoglobiini A0:aan ja des-FX-rekombinanttihe-moglobiiniin ^50 ^*50 0,1 M NaCl 0 M NaCl 2,2 mM IHP 0 M IHP 10 Hgb A0 6,6 2,8 51,1 6,6 des-FX-Hgb 4,9 3,9 5,5 4,9
Taulukko 11 FX-alfan, FX-beetan ja FX-hemoglobiinin jakautumi-15 nen E. coli -solussa milligrammaa proteiinia per OD-litra E. coli-bakteeria Liukoinen Liukenematon FX-alfa 36 0 20 FX-beeta 21 21 FX-hemoglobiini 188 0 » • * • · · ··· · • · • » · ·· • · • Il • ·
B
tll ··· 9 • · ··· ··· • « • · ··· ··· a « 9 · ·♦· • « ··· • · ··« 9 99 9 9 • ·· • 999 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 999 9 · • · ··· 148 107938 ά o to OovDHt—tMHvoincoOrHcnnosnrHoovo >; +-~ »v. »·* ·>. . .-. .- *««. *» ·— ».
OOOHnHr-lr-InHOOOOr-lOOJOOJO
CQ
CQ
y>
g OOinOOOOOOOJOHOOOOOf-OO
ooinincriaMöH^Hic-ih^oinM^Oco jg ojrj-nojnvoiniN ^ h m h in m h
v-Q
φ O in tn in k ud 03
Sto' id ίο n <i cmuT ^ OOSHcHfOCM 03
τ~ί *H
3 X -H 5
Ai 4J ± T oooo oo Ö0Ö ---- -- iS jj Q -i N N <# OtJ* £jc n o e1 in ^ n SL2 m π't o on g 2 r-ι 0)
*r-J
H Q
H O
. 5- ^onHnvonmmo^inooiD'i'Ooooir) :.? : :¾ Ϊ iDfflhHioinHmoi^onMoincod'f'f'i
.. i-H rH rH HNNNNNHri HH
:Λ: J
•a ·...· § ··· ,n3 ^ oooooooooooooooooooo
Tj » or-r^r^r-r^Lninor-or-cTr-cTocroor·- • · 2 omnconrocNCNronnrommmcnronroro *···* 2 ... Ό
• · G
...* H
• .
* * ^ 3 (Π OMJi OMMliDlONOOMO ^ ^ ... - 2 HHOOOHOOOOi-IOHHOjHHHinin • « • · • · · • · · • · • · » · · « · * * * Cx3
ί E OHoinMnOooHintowoH
... K riiniDMDHHHHHNnKinnnfi'finin • · • · ···
Taulukko 200 149 107938
Bakteeri- ja hiivavektorit Määritelmät: ROP, geeni, joka säätelee plasmidin kopiolukua 5 ROP+ = matala kopioluku ROP- = korkea kopioluku AR, plasmidien selektioon käytetty ampisilliiniresistenssi TR, plasmidien selektioon käytetty tetrasykliiniresistens-si 10 TS, tetrasykliinille herkkä, TR-geeni ei toimi FX-A, FX-alfa-geeni FX-B, FX-beeta-geeni DFX-A, des-FX-alfa-globiinigeeni DFX-B, des-FX-beeta-globiinigeeni 15 DV-A, des-Val-alfa-globiinigeeni DV-B, des-Val-beeta-globiinigeeni RV-di-alfa, di-alfa-geeni, joka ei sisällä aminohappolink-keriä (R = arginiini; V = väliini) RGV-di-alfa, di-alfa-geeni, joka sisältää yhden glysiinin 20 linkkerin (G), jota seuraa väliini .·. RGM-di-alfa, di-alf a-geeni, joka sisältää yhden glysiinin • · · • · · * j linkkerin, jota seuraa metioniini (M) • ♦♦ l,/ RGGV-di-alfa, di-alfa-geeni, joka sisältää kahden glysii- *** nin linkkerin *·;* 25 RGGGV-di-alfa, di-alf a-geeni, joka sisältää kolmen glysii-• · *··.* nin linkkerin • · · *...· LACI, geeni, joka koodittaa repressor iproteiinia, joka säätelee TAC-promoottoria *t**t LAC+ = plasmidissa repressorigeeni ·1; 30 LAC- = plasmidissa ei repressorigeeniä ···
Kaikki alla luetellut bakteeriplasmidit, jotka si- • · · *... sältävät alfa-, di-alf a- ja/tai beetageenit, sisältävät • · **;·* myös translationaaliset liitossekvenssit- pPL-ekspressio- j#j : systeemi liittää translationaalisesti lambda N -proteiini- :1; 35 geenin globiinigeeniin.
·· · 150 107938 pKK223-3
Emoplasmidi, jota on kaupallisesti saatavissa Pharmacia LKB'Itä, 800 Centennial Ave., P.O. Box 1327 Piscata-way, N.J. 08855-1327; kaikki muut luetellut plasmidit ovat 5 peräisin tästä emoplasmidista. Siinä on TAC-promoottori, jonka jälkeen seuraa useita restriktiokohtia sisältävä alue geenin insertion helpottamiseksi.
AR, TS, R0P+, LAC- 1. pDL II-62m
10 Plasmidi pKK223-3, jossa on FX-A
AR, TS, R0P+, LAC- 2. pDL II-10a
Plasmidi pKK223-3, jossa on FX-B AR, TS, R0P+, LAC-15 3. pDL II-66A
Emoplasmidit ovat numerot 1 ja 2, sisältää sekä FX-A:n että FX-B;n yhdessä operonissa AR, TS, ROP+, LAC-
4. pGEM FX-A
20 Emoplasmidit ovat numero 1 ja pGEMl, joka on kau- . pallisesti saatavissa Promega Corporation'lta, 2800 * ** * : Woods Hollow Rd., Madison, WI 53711.
.···, pGEMl, jossa on FX-A
• t • · ·
··· AR
• · 25 5. pgem fx-b • · ;;** Emoplasmidit ovat numero 2 ja pGEMl • ·
*···’ pGEMl, jossa on FX-B
AR
6. pDL II-83a • · · *...ϊ 30 Emoplasmidi on numero 4, sisältää DFX-A:n ;·*. 7. pDL III-6f • · · ]···. Emoplasmidi on numero 5, sisältää DFX-B:n
’*:** AR
• · • · · • · · ··· · 1 • · • · ·· · 151 107938 8. pDL II-86c
Emoplasmidit ovat pKK223-3 ja numero 6, sisältää DFX-A:n AR, TS, ROP+, LAC-5 9. pDL III-13e
Emoplasmidit ovat numerot 7 ja 8
Plasmidi pKK223-3, jossa on sekä DFX-A että DFX-B AR, TS, R0P+, LAC- 10. pDL II-91f 10 Emoplasmidi on numero 4, sisältää DV-A:n
AR
11. pDL II-95a
Emoplasmidi on numero 7, sisältää DV-B:n AR
15 12. pDL III-la
Emoplasmidit ovat pKK223-3 ja numero 10, sisältää DV-A:n AR, TS, R0P+, LAC-
13. pDL III-14C
20 Emoplasmidit ovat numerot 11 ja 12, sisältää DV- .·. A:n ja DV-B:n • · · j AR, TS, ROP+, LAC- 14. pDL III-47a • · *** Emoplasmidi on numero 13, sisältää RGM-di-alfan ja ···’ 25 DV-B:n : AR, TS, ROP+, LAC- ♦ ··
15. pDL III-82A
Emoplasmidi on numero 13, sisältää RGGV-di-alfan ja *:·1 2: DV-B:n ·3: 30 AR, TS, ROP+, LAC- ··· 16. pDL IV-8a • · • · · *... Emoplasmidi on numero 13, sisältää RGV-di-alfan ja • · *···1 DV-B:n : ar, ts, rop+, lac- ··· » ' ' ’ · · • · 2 • · 3 M» 152 107938 17. pDL IV-47b
Emoplasmidi on numero 13, sisältää RV-di-alfan ja DV-B: n AR, TS, R0P+, LAC- 18. pDL IV-66a 5 Emoplasmidi on numero 13, sisältää RGGGV-di-alfan ja DV-B:n AR, TS, ROP+, LAC- 19. pDL IV-3a
Emoplasmidi on numero 15 10 ROP-geeni on inaktivoitu insertoimalla Notl-linkke- ri ROP-geenin sisällä olevaan PvuII-kohtaan AR, TS, R0P-, LAC- 20. pDL IV-38a ~
Emoplasmidi on numero 15, sisältää Nagai-mutaation 15 DV-B:ssä AR, TS, ROP+, LAC- 21. pDL IV-58f
Emoplasmidi on numero 20 ROP-geeni on inaktivoitu, kuten numerossa 19 20 AR, TS, ROP-, LAC- t .*. 22. pDL IV-59a • · · .·. : Emoplasmidit ovat numero 21 ja pBR322, joka on kau- • · .···. pallisesti saatavissa useilta eri valmistajilta.
• * VV. Sisältää toimivan TR-geenin, joka rakennettiin seu- '/,] 25 raavalla tavalla: • · *··;* Plasmidin pBR322 EcoRI-kohta muutettiin BamHI-koh- • » ’···’ daksi insertoimalla BamHI-linkkeri. Tämä salli TR- geenin 5'-pään poistamisen plasmidista pBR322
BamHI-fragmenttina. Sitten tämä fragmentti inser- *>##ϊ 30 toitiin BamHI-kohtaan, joka sijaitsee TAC-promoot- ;·. torin ja plasmidin pKK223~3 inaktiivisen TR-geenin • · · liitoskohdassa. Tämän fragmentin insertoiminen ak- • · 'V tivoi uudelleen TR-geenin, jos fragmentti inser- • · :.· : toituu sopivaan orientaatioon. Pesäkkeiden selektio • · · • · • ♦ ·· · 153 107938 tetrasykliinimaljoilla varmistaa sopivassa orientaatiossa olevan fragmentin läsnäolon.
AR, TR, ROP-, LAC- 23. pjR v-83a 5 Emoplasmidi on numero 11, sisältää Presbyterian- mutaation (asnl08 - lys) sisältävän DV-B:n AR, TS, R0P+, LAC- 24. pjR VI-29a
Emoplasmidit ovat numerot 15 ja 23, sisältää RGGV-10 di-alfan ja Presbyterian-mutaation sisältävän DV- B:n AR, TS, ROP-, LAC- 25. pjR VI-53b
Emoplasmidi on numero 24 15 Tehty TR:ksi insertoimalla BamHI-fragmentti AR, TR, ROP+, LAC- 26. pjR VI-61a
Emoplasmidi on numero 25
Tehty R0P-:ksi insertoimalla Notl-linkkeri PvuII- 20 kohtaan . AR, TR, ROP-, LAC- ;*·,· 27. pDL V-4a • ·
Emoplasmidit ovat numerot 16 ja 26, sisältää RGV- • · · ···. di-alfan ja Presbyterian-mutaation sisältävän DV- ··* 25 B:n J « ar, ts, rop-, lac- • · *·*·' 28. pDL V-lOa
Emoplasmidi on numero 27 * * Insertoitiin BamHI-fragmentti plasmidin muuttami- • · · 30 seksi TR:ksi AR, TR, ROP-, LAC- !···. 29. pDL V-16d • · ’·* Emoplasmidi on numero 28, sisältää LACI-geenin in- : sertoituna NotI-kohtaan. LACI-geeni saatiin käyt- ··« 35 täen seuraavaa menetelmää: 154 107938
Polymeraasiketjureaktion (PCR) alukkeita, jotka sisälsivät Notl-kohdat 5'-päissään, käytettiin lacl-geenin amplifioimiseen. Kun oli puhdistettu geelistä, geeni insertoitiin plasmidin pDLV-la 5 NotI-kohtaan AR, TR, ROP-, LAC+
Useita muita plasmidirakenteita on suunniteltu, jotka helpottavat toisen, oman TAC-promoottorin säätelyn alaisuudessa olevan, beeta-globiinigeenin insertoimista. 10 30. pDL IV-64a
Emoplasmidi on numero 14, sisältää beeta-globiinin synteettisen TAC-promoottorin säätelyn alaisuudessa AR, TS, ROP+, LAC- 31. pDL IV-67a 15 Emoplasmidit ovat numerot 14 ja 30, sisältää di- alfan yhden TAC-promoottorin säätelyn alaisuudessa ja DV-B:n toisen TAC-promoottorin säätelyn alaisuudessa. DV-B on di-alfan vieressä AR, TS, ROP-, LAC-20 32. pJR VI-54a · Emoplasmidit ovat numerot 14 ja 30, sisältää di- • · i,'·· alfan ja DV-B:n yhden TAC-promoottorin säätelyn alaisuudessa ja toisen DV-B:n toisen TAC-promootto-rin säätelyn alaisuudessa. Toinen DV-B on insertoi-
«M
·*". 25 -tu plasmidin PvuII-kohtaan.
AR, TS, ROP-, LAC- 33. pPL lambda
Pharmacia LKB'ltä (katso yllä) kaupallisesti saata- • » ... va plasmidi, joka sisältää lambdan pL-promoottorin • · **·’ 30 ja N-proteiinia koodittavan alueen, joita voidaan ·· • käyttää fuusiorekombinanttiproteiinien tai transla- tionaalisesti liitettyjen rekombinanttiproteiinien 1·« . *. ekspressoimiseksi.
• · · ··· · «·« • · • * ··* 155 107938 34. pPL-alfa/beeta
Emoplasmidit ovat numerot 13 ja 33, sisältää DV-A:n ja DV-B:n AR, ROP+ 5 35. pPL-di-alfa/beeta
Emoplasmidi on numero 34, sisältää RGV-di-alfan ja DV-B:n AR, ROP+
36. pSGEO,1-LO
10 Emoplasmidi on numero 35 ROP-geeni on inaktivoitu insertoimalla Notl-linkke-ri ROP-geenin PvuII-kohtaan.
AR, ROP- 37. pKS+ 15 Kaupallisesti saatavana Stratagene'Itä, La Jolla, CA.
38. pGS2488
Peräisin plasmidista numero 37, insertoitu GAP491-geenin synteettinen transkription aloituskohta.
20 39. pGS2888
Peräisin plasmidista numero 38, Kpnl-kohta on muu- : tettu SphI-kohdaksi.
• · 40. pGS4788 • · · : ,.· Peräisin plasmidista numero 39, johon on insertoitu • · 25 synteettinen GALUÄS-sekvenssi GALGAP-hybridipromoot- :***: torin muodostamiseksi.
j***j 41. pLC IIFX-beeta-globiini • · ·
Plasmidi saatavana Kiyoshi Nagai'lta, Medical Re-search Council, Lontoo, Englanti; sisältää beeta- • · 30 globiinigeenin.
*:** 42. pUC19 • · • 1 2♦· Plasmidi kaupallisesti saatavana Bethesda Research
Laboratories'1 ta, Gaithersburg, Maryland.
• « i · · • · 1 • · · · ·· • · • · 2 · 156 107938 43. pSUC2-6sigma
Plasmidin ovat kuvanneet Stetler et ai., Biotechnology, 7: 55 - 60 (1989).
44. pUC19-beeta-globiini 5 Peräisin plasmideista numerot 41 ja 42.
45. Plasmidi pGS1188
Beeta-globiinigeeni (plasmidista numero 44) on sigma-promoottorin ja MFX-terminaattorin säätelyn alaisuudessa (molemmat plasmidista numero 43).
10 46. Plasmidi pGS3588
Peräisin plasmideista numerot 45 ja 40; sigma-promoottori korvattu plasmidin numero 40 GALGAP-pro-moottorilla.
47. Plasmidi pGS3888 15 Peräisin plasmidista numero 46, Smal-kohta on muu tettu XhoI-kohdaksi.
47a. Plasmidi p-alfa-MRC
Plasmidi on saatavana K. Nagai'lta, MRC; sisältää alfa-globiinigeenin.
20 48. Plasmidi pGS4088
Peräisin plasmidista numero 47, insertoimalla alfa-i globiinigeeni on korvattu beeta-globiinigeeni.
:,’*i 49. Plasmidi pSN(+)
Peräisin plasmidista numero 37, Kpnl-kohta muutettu 25 NotI-kohdaksi.
• · » ·*": 50. Plasmidi pGS4888 • · · .·*·. Peräisin plasmidista numero 49, insertoitu pGGAP- • · · alfa-globiinin ekspressiokasetti plasmidista numero ....: 48.
... 30 51. Plasmidi pGS189 * · *** Peräisin plasmidista numero 50, insertoitu pGGAP- « * • *·· beeta-globiinin ekspressiokasetti plasmidista nume- ro 47. Näin ollen plasmidi sisältää sekä GALGAP- • · « . alfa-globiini- että GALGAP-beeta-globiinioperonit.
• · · • · ♦ · • · · • · • · ΜΦ 157 107938
52. Plasmidi pCIU
Plasmidin ovat kuvanneet Stetler et ai., Biotechnology, 7: 55 - 60 (1989).
53. Plasmidi pCIN
5 Peräisin plasmidista numero 52, lisätty Notl-kohta.
54. Plasmidi pGS289
Peräisin plasmidista numero 53, insertoitu alfa-globiinin ja beeta-globiinin ekspressiokasetit.
55. Plasmidi pGS389 10 Kuten edellä mainittu, mutta insertin orientaatio päinvastainen.
56. Plasmidi pYRp7
Plasmidin ovat kuvanneet Strathern et ai., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, (Cold 15 Spring Harbor, 1981). TRPl-geenin lähde.
57. pCIT
Peräisin plasmideista numerot 52 ja 56. Plasmidin numero 52 Ura3-geeni korvattu plasmidin 56 Trpl-geenillä.
20 58. pGS4988
Peräisin plasmidista numero 57, insertoitu beeta- • · •·: · globiinin ekspressiokasetti plasmidista numero 47.
*.**: 59. Plasmidi pGS4488 • · · : ..· Peräisin plasmidista numero 52, insertoitu alfa- I · 25 globiinin ekspressiokasetti plasmidista numero 48.
:***: 60. Plasmidi pGS4688 ·♦·
Kuten edellä mainittu, mutta insertin orientaatio • · · päinvastainen.
61. Plasmidi pGS4888 • · .···. 30 Peräisin plasmidista numero 49, insertoitu GGAP- my alfa-globiinin ekspressiokasetti plasmidista numero :’*·· 48.
62. Plasmidi pGS1889 « : .·. Peräisin plasmidista numero 61, Pstl-kohta poistet- • · » • · · · 35 tu.
• · ··· 158 107938 63. Plasmidi pGS1989
Peräisin plasmidista numero 62, Spel-kohta poistettu.
64. Plasmidi pGS2189 5 Peräisin plasmideista numerot 61 ja 63. Koodittaa di-alfa-globiinia, jossa on RGGV-linkkeri.
65. Plasmidi pGS2989
Peräisin plasmideista numerot 64 ja 47, sisältää di-alfa-globiinigeenin ja beeta-globiinigeenin.
10 66. Plasmidi pGS3089
Peräisin plasmidista numero 53, insertoitu plasmi-din 65 ekspressiokasetti.
66a. Phagescript
Faagi on kaupallisesti saatavana Stratagene’ltä.
15 67. Faagi Mp-beeta-globiini
Peräisin plasmidista Phagescript, insertoitu plas-midin numero 65 GALGAP-promoottori ja beeta-globii-nigeeni.
67a. Plasmidi pGS3089 RGV des-beeta 20 Peräisin plasmidista numero 66, beeta-globiinin ekspressiokasetin sisältävä Xhol-fragmentti poisti : tettu.
• · *. 1 2: 68. Plasmidi pGS3889 • · ·
Plasmidi numero 66 yhdessä "Presbyterian"-mutaation • I 25 (beetaN108K) kanssa.
»I· ' ' ~ :3: 69. Plasmidi pGS5189
Plasmidi numero 66 yhdessä "Agenogi"-mutaation • · · (beetaE90K) kanssa.
....: 70. Plasmidi pGS5689 • · ^...^ 30 Plasmidi numero 66 yhdessä "Kansas"-mutaation (bee- 'Γ taN102T) kanssa.
• 1·· 71. Plasmidi pGS4989
Plasmidi numero 66 yhdessä "beetaV67l"-mutaation • ’· kanssa.
• · • · · • · · · · · • · 2 • · 3 • · · 159 107938
72. Plasmidi pGS2989 RPV
Plasmidi numero 64 yhdessä RPV-di-alfa-linkkerin kanssa.
73. Plasmidi pGS2989 RGV
5 Plasmidi numero 64 yhdessä RGV-di-alfa-linkkerin kanssa.
74. Plasmidi pGS3089 RGV
Plasmidi numero 53 yhdessä plasmidin numero 73 hemoglobiinin ekspressiokasetin kanssa.
10 75. Plasmidi pGS3089 RPV
Plasmidi numero 53 yhdessä plasmidin numero 72 hemoglobiinin ekspressiokasetin kanssa.
Taulukko 300 15 Taulukko bakteerikannoista
Kanta Saatavuus Ekspressio
1 BL21 Brookhaven TAC
2 JM109 Kaupallinen TAC
3 SCSI Kaupallinen TAC
20 4 JM110 ATCC TAC
5 LE392 ATCC TAC
♦
: 6 23722 ATCC TAC
•Y‘j 7 W3110 ATCC TAC
8 AG-1 Kaupallinen TAC
. 25 9 DH1 ATCC TAC
• · ·
10 NM554 Kaupallinen TAC
• · ·
.···. 11 N99cl+ Kaupallinen PL
• ·
12 N4830-1 Kaupallinen PL
• 1 • · « « 4 4 • · · * · • 1 • · · • · • · • t · «
» » I
• ♦ ♦ • · · · • · · • · • ·

Claims (22)

107938
1. Menetelmä hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäpro-teiinin valmistamiseksi, jolla on reversiibeli hapensito- 5 misaktiivisirus, tunnettu siitä, että a) otetaan yhdistelmäisäntäsolu, joka ei luonnostaan tuota ihmisen hemoglobiinin kaltaista proteiinia, jolloin isän-täsolu on transformoitu i) ekspressoituvalla DNA-sekvenssillä, joka sisä-
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • · · 25 tunnettu siitä, että ekspressoituva DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin, edelleen sisältää toisen sekvens- • · · sin, joka koodittaa alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin, ja mahdollisesti linkkerin DNA-sekvens s in, joka koodittaa • · 30 linkkerin aminohapposekvenssin, jolloin ensimmäinen ja *11 toinen alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin sekvenssit ja • · • ’·· mikäli sisällytettynä, linkkerin aminohapposekvenssi eks- i#<>: pressoidaan yhtenä di-alfa-globiinin kaltaisena polypepti- ; ]·, diketjuna. • · · • · · · · · • · • · • · · 107938
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekspressoituva DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa beeta-globiinin kaltaisen polypeptidin, edelleen sisältää toisen sekvens- 5 sin, joka koodittaa beeta-globiinin kaltaisen polypeptidin, ja mahdollisesti linkkerin DNA-sekvenssin, joka koodittaa linkkerin aminohapposekvenssin, jolloin ensimmäinen ja toinen beeta-globiinin kaltaisen polypeptidin sekvenssit ja mikäli sisällytettynä, linkkerin aminohapposekvens-10 si ekspressoidaan yhtenä di-beeta-globiinin kaltaisena polypeptidiketj una.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on hiivasolu.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiinvasolu on Saccharomvces cerevisiae -solu.
6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään yksi ekspressoitu-20 vista DNA-sekvensseistä on promoottorin GALGAP kontrollin alaisena.
:·· ; 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me- • · • · · *. *: netelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on bak- t·· ? teerisolu. . : 25
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, • · · ' tunnettu siitä, että bakteerisolu on Escherichia • · · ·”*; coli -solu. • · ·
9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vähintään yksi ekspressoitu- • · ... 3 0 vista DNA-sekvensseistä on TAC-promoottorin kontrollin Ί* alaisena. • · • *·· 10. Jonkin patenttivaatimuksen 1 tai 3-9 mukainen :[**: menetelmä, tunnet tu siitä, että ekspressoituva . *.e DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka kooodittaa • · · *“.* 35 alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin ja ekspressoituva • · ·· · 107938 DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa beeta-globiinin kaltaisen polypeptidin, ovat yhdessä ainoassa DNA-molekyylissä.
10 Itää sekvenssin, joka koodittaa alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin sekvenssin, ja ii) ekspressoituvalla DNA-sekvenssillä, joka sisältää sekvenssin, joka kodittaa beeta-globiinin kaltaisen polypeptidin, ja 15 b) viljellään isäntäsolu olosuhteissa, joissa se ekspres-soi alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin ja beeta-globiinin kaltaisen polypeptidin, ja joissa alfa-globiinin kaltainen polypeptidi ja beeta-globiinin kaltainen polypepti-di liittyvät keskenään ja hemiin isäntäsolun sisällä hemo- 20 globiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin muodostamiseksi, ja • · | c) eristetään hemoglobiinin kaltainen yhdistelmäproteiini ’· isäntäsolusta. • · ·
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että DNA-molekyyli on plasmidi.
12. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekspressoituva DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin ja ekspressoituva DNA-sekvenssi, 10 joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa beeta-globiinin kaltaisen polypeptidin ovat samassa plasmidissa.
13. Jonkin patenttivaatimuksen 10 - 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekspressoituva DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa alfa-15 globiinin kaltaisen polypeptidin, ja ekspressoituva DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa beeta-globiinin kaltaisen polypeptidin, ovat yhteisen promoottorin kontrollin alaisina.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että yksittäinen DNA-molekyyli si- . sältää polykistronisen sekvenssin, joka on yhteisen pro- • Φ ···j moottorin kontrollin alaisena, jolloin ekspressoituva DNA- • · · *· *· sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka kooditta alfa- ··♦ globiinin kaltaisen polypeptidi on polykistronisen sek- ··» 25 venssin kistroni A, ja ekspressoituva DNA-sekvenssi, joka ~ sisältää sekvenssin, joka koodittaa beeta-globiinin kal- :***; täisen polypeptidin, on polykistronisen sekvenssin kistro- ♦ ♦ · ni B.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, • · 30 tunnettu siitä, että polykistronisessa sekvenssis- *** sä kistroni A edeltää kistronia B.
• « • *·· 16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, • ·« tunnettu siitä, että polykistronisessa sekvenssis- j *·, sä kistroni B edeltää kistronia A. • ♦ · ··· · ♦ ♦♦ ♦ · • · • ♦ · 107938
17. Jonkin patenttivaatimuksista 14 - 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkukistroni edeltää kutakin kistroneista A ja B.
18. Jonkin patenttivaatimuksen 10 - 12 mukainen me-5 netelmä, tunnettu siitä, että ekspressoituva DNA- sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin, ja ekspressoituva DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa beeta-globiinin kaltaisen polypeptidin, ovat eri promoottorien 10 kontrollin alaisina.
19. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekspressoituva DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa alfa-globiinin kaltaisen polypeptidin, ja ekspressoituva DNA- 15 sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa beeta-globiinin kaltaisen polypeptidin, ovat eri DNA-molekyy-leissä.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekspressoituva DNA-sekvenssi, 20 joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa alfa-globiinin . kaltaisen polypeptidin, ja ekspressoituva DNA-sekvenssi, • ♦ *·· · joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa beeta-globiinin • * · '· *i kaltaisen polypeptidin, ovat eri promoottorien kontrollin ·· · : ,.· alaisina. : · ..J 25
21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekspressoituva DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa alfa-globiinin • · · kaltaisen polypetidin, ja ekspressoituva DNA-sekvenssi, joka sisältää sekvenssin, joka koodittaa beeta-globiinin • · 3. kaltaisen polypeptidin, ovat saman promoottorin kontrollin *1* alaisina.
• · • *·· 22. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen • · · Σ>#>ϊ mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hemoglo- ;*·. biinin kaltaisella yhdistelmäproteiinilla on happiaffini- • · · *ll.‘ 35 teetti, joka on pienempi kuin ihmisen normaalihemoglobii- *·*·* nin A,,. 107938
FI20000025A 1989-05-10 2000-01-05 Menetelmä hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin valmistamiseksi FI107938B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34962389A 1989-05-10 1989-05-10
US34962389 1989-05-10
US37416189A 1989-06-30 1989-06-30
US37416189 1989-06-30
US37911689A 1989-07-13 1989-07-13
US37911689 1989-07-13
US9002654 1990-05-10
PCT/US1990/002654 WO1990013645A1 (en) 1989-05-10 1990-05-10 Production in bacteria and yeast of hemoglobin and analogues thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI20000025L FI20000025L (fi) 2000-01-05
FI107938B true FI107938B (fi) 2001-10-31

Family

ID=27407902

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI915279A FI105104B (fi) 1989-05-10 1991-11-08 Di-alfa-globiinin tai di-beeta-globiinin kaltainen polypeptidi, sitä koodaava yhdistelmä-DNA ja sen käyttö
FI20000025A FI107938B (fi) 1989-05-10 2000-01-05 Menetelmä hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin valmistamiseksi

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI915279A FI105104B (fi) 1989-05-10 1991-11-08 Di-alfa-globiinin tai di-beeta-globiinin kaltainen polypeptidi, sitä koodaava yhdistelmä-DNA ja sen käyttö

Country Status (18)

Country Link
EP (3) EP1380645A2 (fi)
JP (1) JP3013902B2 (fi)
KR (1) KR920701434A (fi)
AT (2) ATE142692T1 (fi)
AU (1) AU635744B2 (fi)
CA (1) CA2050601C (fi)
DE (2) DE69028448T2 (fi)
DK (1) DK0402300T3 (fi)
ES (2) ES2204926T3 (fi)
FI (2) FI105104B (fi)
GR (1) GR3021106T3 (fi)
HU (1) HUT61591A (fi)
IE (1) IE970086A1 (fi)
IL (1) IL94361A (fi)
NO (2) NO304027B1 (fi)
NZ (1) NZ233642A (fi)
SG (1) SG47987A1 (fi)
WO (1) WO1990013645A1 (fi)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6022849A (en) * 1987-05-16 2000-02-08 Baxter Biotech Technology Saarl Mutant recombinant hemoglobins containing heme pocket mutations
US6204009B1 (en) 1988-05-16 2001-03-20 BAXTER BIOTECH TECHNOLOGY SàRL Nucleic acids encoding mutant recombinant hemoglobins containing heme pocket mutations
US5545727A (en) * 1989-05-10 1996-08-13 Somatogen, Inc. DNA encoding fused di-alpha globins and production of pseudotetrameric hemoglobin
US5599907A (en) * 1989-05-10 1997-02-04 Somatogen, Inc. Production and use of multimeric hemoglobins
US5844090A (en) * 1994-05-09 1998-12-01 Somatogen, Inc. Modified hemoglobin-like compounds
US6150506A (en) * 1989-05-10 2000-11-21 Baxter Biotech Technology Sarl Modified hemoglobin-like compounds and methods of purifying same
WO1991013158A1 (en) * 1990-02-28 1991-09-05 Delta Biotechnology Limited Protein production in yeast
JPH07504645A (ja) * 1990-04-16 1995-05-25 アペックス　バイオサイエンス　インコーポレーテッド 酵母での組換えヘモグロビンの発現
US6172039B1 (en) 1990-04-16 2001-01-09 Apex Bioscience, Inc. Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
US5610137A (en) * 1990-12-20 1997-03-11 The Uab Research Foundation Transgenic, cross-linked hemoglobin
EP0668909B1 (en) * 1990-12-20 2001-10-10 The University Of Alabama Research Foundation Transgenic, cross-linked hemoglobin
US5714345A (en) * 1990-12-24 1998-02-03 Pharmaceutical Proteins Limited Increased expression of a gene by a second transferred mammary gland specific sequence transgenic
GB9028062D0 (en) * 1990-12-24 1991-02-13 Agricultural & Food Res Production of transgenic animals
WO1993008831A1 (en) * 1991-10-30 1993-05-13 Strohtech, Inc. Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
DE69226197T2 (de) * 1991-11-08 1999-02-11 Somatogen, Inc., Boulder Hämoglobine als arzneimittelabgabesystem
FR2688784B1 (fr) * 1992-03-18 1995-06-30 Pasteur Merieux Serums Vacc Transporteur d'oxygene.
UA40613C2 (uk) 1993-03-31 2001-08-15 Про-Нейрон, Інк. Поліпептид, що має активність інгібітора проліферації стовбурових клітин(варіанти), фармацевтична композиція (варіанти), фармацевтична композиція для інгібування ділення стовбурових клітин у ссавців, фармацевтична композиція для лікування захворювань,які включають гіперпроліферативні стани, фармацевтична композиція для диференціального захисту нормальних стовбурових клітин, відмінних від лейкозних, спосіб очистки поліпептиду
US6610654B2 (en) 1993-03-31 2003-08-26 Wellstat Therapeutics Corporation Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
US5939391A (en) * 1993-03-31 1999-08-17 Pro-Neuron, Inc. Hemoglobin alpha chain peptide fragments useful for inhibiting stem cell proliferation
US5554638A (en) * 1993-05-24 1996-09-10 Duke University Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders
US5612310A (en) * 1993-05-24 1997-03-18 Duke University Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders
US5840851A (en) * 1993-07-23 1998-11-24 Plomer; J. Jeffrey Purification of hemoglobin
US5665869A (en) * 1993-11-15 1997-09-09 Somatogen, Inc. Method for the rapid removal of protoporphyrin from protoporphyrin IX-containing solutions of hemoglobin
US6140071A (en) * 1994-01-27 2000-10-31 Somatogen, Inc. Proteins with mutations to decrease N-terminal methylation
US5631219A (en) * 1994-03-08 1997-05-20 Somatogen, Inc. Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin
US6242417B1 (en) 1994-03-08 2001-06-05 Somatogen, Inc. Stabilized compositions containing hemoglobin
WO1997004110A1 (en) * 1995-07-14 1997-02-06 Somatogen, Inc. Methods for increasing protein expression
US5824511A (en) * 1995-08-01 1998-10-20 University Technology Corporation Method for enhancing the production of hemoproteins
US6812207B1 (en) 1995-10-23 2004-11-02 William Marsh Rice University Hemoglobin mutants that reduce heme loss
US6114505A (en) * 1995-10-23 2000-09-05 William Marsh Rice University Hemoglobin mutants that reduce heme loss
AU1083497A (en) * 1995-11-30 1997-06-19 Somatogen, Inc. Method for control of functionality during cross-linking of hemoglobins
WO1997023631A2 (en) * 1995-12-22 1997-07-03 Somatogen, Inc. Globins containing binding domains
JP2000504934A (ja) 1995-12-22 2000-04-25 バクスター バイオテク テクノロジー エス．アー．アール．エル． 結合ドメインを含むグロビン
US5861483A (en) 1996-04-03 1999-01-19 Pro-Neuron, Inc. Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
US6136565A (en) * 1996-10-18 2000-10-24 Baxter Biotech Technology Sarl Methods of reducing the levels of protoporphyrin IX in recombinant hemoglobin preparations
EP1950298A3 (en) 1997-05-02 2008-12-24 Baxter Biotech Technology S.A.R.L. Hemoglobin mutants with increased soluble expression and/or reduced nitric oxide scavenging
DE10036491A1 (de) 2000-07-25 2002-02-07 Roche Diagnostics Gmbh Expression von Alkalischer Phosphatase in Hefe
IL157378A0 (en) 2001-03-09 2004-02-19 Genentech Inc Process for production of polypeptides
US7504377B2 (en) 2006-10-23 2009-03-17 Ikor, Inc. Nitric oxide-blocked cross-linked tetrameric hemoglobin
US7494974B2 (en) 2006-10-24 2009-02-24 Ikor, Inc. Carboxymethylated cross-linked tetrameric hemoglobin
WO2009014450A1 (en) * 2007-07-24 2009-01-29 Sanare As Novel peptides with anti-tumor activity
EP2058398A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-13 Nipro Corporation Production of recombinant human hemoglobin using pichia yeast
US10752672B1 (en) * 2019-02-01 2020-08-25 Cheer Global Limited Recombinant hemoglobins and methods of preparation and use thereof
KR20220137895A (ko) * 2020-01-10 2022-10-12 주식회사 인트론바이오테크놀로지 대장균을 사용한 돼지 미오글로빈의 제조 방법
EP4090677A4 (en) * 2020-01-10 2024-01-10 Intron Biotechnology, Inc. A method for preparing bovine myoglobin using escherichia coli
CN116203144B (zh) * 2022-05-11 2023-10-27 重庆医科大学附属儿童医院 测定血红蛋白中各型珠蛋白链比率的方法及其应用
IL321137A (en) * 2022-11-30 2025-07-01 Kangma Healthcode Shanghai Biotech Co Ltd Recombinant hemoglobin

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3924943A (en) 1974-06-11 1975-12-09 Xerox Corp Segmented biased transfer member
US4769326A (en) 1980-02-29 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Expression linkers
US4338397A (en) 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US4551433A (en) 1981-05-18 1985-11-05 Genentech, Inc. Microbial hybrid promoters
US4511503A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4599197A (en) 1982-12-22 1986-07-08 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4512922A (en) 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4620948A (en) 1982-12-22 1986-11-04 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
GB8412517D0 (en) 1984-05-16 1984-06-20 Nagai K Recombinant fusion proteins
US4598064A (en) 1984-06-27 1986-07-01 University Of Iowa Research Foundation Alpha-alpha cross-linked hemoglobins
US4600531A (en) 1984-06-27 1986-07-15 University Of Iowa Research Foundation Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield
US4774180A (en) 1986-02-26 1988-09-27 Massachusetts Institute Of Technology Construction and application of polyproteins
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
GB8701001D0 (en) 1987-01-19 1987-02-18 Gordon D G Ceiling tiles
WO1988006601A1 (en) 1987-03-02 1988-09-07 Genex Corporation Gene repressors
GB8711614D0 (en) 1987-05-16 1987-06-24 Medical Res Council Proteins
EP0561245A1 (en) * 1987-05-16 1993-09-22 Somatogenetics International, Inc. Blood substitutes comprising recombinant hemoglobin

Also Published As

Publication number Publication date
SG47987A1 (en) 1998-04-17
AU5675690A (en) 1990-11-29
NO315568B1 (no) 2003-09-22
DE69034091D1 (de) 2003-09-04
DK0402300T3 (da) 1996-09-30
FI915279A0 (fi) 1991-11-08
EP0402300A2 (en) 1990-12-12
IL94361A (en) 1995-07-31
ATE246246T1 (de) 2003-08-15
DE69034091T2 (de) 2004-04-22
NO914387L (no) 1991-11-08
IL94361A0 (en) 1991-03-10
DE69028448D1 (de) 1996-10-17
NO973848D0 (no) 1997-08-21
NO304027B1 (no) 1998-10-12
CA2050601A1 (en) 1990-11-11
HUT61591A (en) 1993-01-28
EP0700997B1 (en) 2003-07-30
EP0402300B1 (en) 1996-09-11
EP0402300A3 (en) 1991-01-30
HU905111D0 (en) 1992-02-28
ES2093640T3 (es) 1997-01-01
FI20000025L (fi) 2000-01-05
JP3013902B2 (ja) 2000-02-28
FI105104B (fi) 2000-06-15
KR920701434A (ko) 1992-08-11
ES2204926T3 (es) 2004-05-01
DE69028448T2 (de) 1997-02-06
EP0700997A1 (en) 1996-03-13
WO1990013645A1 (en) 1990-11-15
ATE142692T1 (de) 1996-09-15
GR3021106T3 (en) 1996-12-31
NO914387D0 (no) 1991-11-08
JPH05503627A (ja) 1993-06-17
NO973848L (no) 1997-08-21
CA2050601C (en) 2000-09-19
EP1380645A2 (en) 2004-01-14
IE970086A1 (en) 2000-02-23
AU635744B2 (en) 1993-04-01
NZ233642A (en) 1992-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI107938B (fi) Menetelmä hemoglobiinin kaltaisen yhdistelmäproteiinin valmistamiseksi
US5744329A (en) DNA encoding fused di-beta globins and production of pseudotetrameric hemoglobin
EP0625202B1 (fr) Serum-albumine humaine, preparation et utilisation
US5739011A (en) DNA for the production of multimeric hemoglobins
US6828125B1 (en) DNA encoding fused di-alpha globins and use thereof
JPS6192569A (ja) オキシドリダクタ−ゼの製造法
FI87800C (fi) Foerfarande foer framstaellning av glukagon i jaest
US6172039B1 (en) Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
FI88407B (fi) Dna-molekyl, transformerade jaestceller och foerfarande foer framstaellning av human-lysozym
JPH07504645A (ja) 酵母での組換えヘモグロビンの発現
WO1993008831A1 (en) Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
WO1991013158A1 (en) Protein production in yeast

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired